TW553951B - Method of forming immobilized polysaccharide - Google Patents

Description

553951 五、發明說明（1) 詳細說明： 發明之技術領域： 本發明是關於一種形成固定化之多醣類的方法，特別 是關於一種形成固定有透明質酸的聚胺基甲酸酯膜的方 法’做為促進傷口癒合之用。 發明背景：

按，多醣類（polysaccharide)是一組複雜的碳水化合 物，一般而言，其分子量介於1E4至2E7daltons之間，可 視為由X個單聽分子的結合再消去X個水分子而得。例如褐 藻酸（Alginate)、甲殼素（Chi tin)、肝素（Heparin)、軟 骨素（Chondroitin Sulfate; CS)、角蛋白（Keratan Sulfate; KS)、去乙醯殼多醣（Chi t〇san)、透明質酸 (hyaluronic acid)專等都屬於多酶類，在生化科技及醫 學工程上皆有廣泛的應用。其中所述褐藻酸是一種藻膠 鹽。甲殼素又稱為幾丁質，{一種白色或無色的無定形多 聽類，是構成甲殼綱動物、昆蟲、及其他無脊椎動物堅硬 外AX的要素。肝素是一種酸性黏多醣，作用與抗凝血腌和 抗血小板因子類似，可存在於各種，組織中，尤其以肝臟中 最多。軟骨素是一種硬如角、類似明膠狀的蛋白質物質， 可從軟骨的膠原成分中獲得。角蛋白是一種存在於表面構 造2指甲、羽毛等）的硬蛋白，不溶於蛋白質溶劑，含 硫所3之主要胺基酸為胱胺酸和精胺酸。去乙醯殼 多醣是一種在范·維賽林（wisselingh)試驗中所產生的物

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553951 五、發明說明（2) 質，用濃氫氧化鈉於1 6 0°C處理殼多醣2 0分鐘，便可產生 去乙醢殼多·。 透明質酸是一種帶多負電的生物高分子，多存在於動 物體内的軟結締組織（soft connective tissue)中，例如 眼睛的水晶體、臍帶、和皮下組織等等。近年來，亦有從 細胞培養液（bacterial culture broths)及細胞間液 (intercellular matrix)中成功提煉出來。其結構為重複 性雙醣單元[D-glucuronic acicKl-^ -3)N-acetyl-D-glucosamine(lyS -4)]所組成。

一般而言，透明質酸的分子量介於6E4至1.2E7道爾 頓（Dal tons)之間。透明質酸依其分子量之大小分成兩大 類，一為醫藥用的透明質酸，其分子量需大於75〇,〇〇〇道 爾頓（Daltons);另一用途為化妝品用，其分子量介於5(] 〇〇〇至100, 〇〇〇道爾頓（Dal tons)之間。在物性方面，透明 質酸具有顯著的黏彈性質、良好的保濕性、以及易分解# 特性、，因此在醫藥及化妝品上皆有廣泛的應用。 透明質酸充滿在細胞間質與結締組織間，且潤滑、咳 細⑯等功㊣，因此在•學上有相當廣；的應用，

月=應用於關節疾病的.治療，用以增加物 二！!1!痛。近來也將其應用在外科手術之中，用。 避免、、、口締組織的黏著與增長。由於 _ 且具優良黏彈性的高分子，在丨9 7'〇年、馱為一问又7 a 質酸注入眼睛前房鞏固其形狀，=外科醫師便將透明 受到機械性傷害。近來又發現在；=膜在白内障：則 你災進傷口癒合上，透明賀

553951 五、發明說明（3) 酸扮演一相當重要的角色。 當傷口癒合時，透明質酸與纖維蛋白（f i b r i η)鍵結形 成一個支持細胞的基材，並調節纖維母細胞（fibroblast) 的增生與遷移。肉芽組織（granulation tissue)形成數天 後，纖維母細胞會至傷口處開始製造膠原蛋白 (collagen)。隨後，透明質酸分解酵素會使透明質酸分解 成具誘使血管生成功能之低分子量的透明質酸，來修補傷 口。剛出生嬰兒之透明質酸的濃度為一生中最高的時期， 所以幼時傷口易完全復原’但年紀越大則越困難，均與透 明質酸的濃度有關。透明質酸在傷口的癒合上已有商品化 的產品’如Connectivina，其濃度為〇· 2%透明質酸（Mw: 〇. 9 - 1. 6 E 5 )，係由雞冠中所純化出來。 傳統上將透明質酸應用在促進傷口癒合時，一般是將 其平鋪或灑在患部，以期能促進傷口的癒合。但由於透明 ^酸為一高度水合之生物性高分子，將其塗佈在傷口時極 易因水合作用而流失掉，致使其促進傷口癒合的功效 折扣。 ^ 因此.’如何降低透明質酸的水溶性（water l°lub ) ’使其不易因水合作角而流失，以強化其促 傷口癒5的功效’便成為醫學工程界一項相當重要的課 發明之簡要說明： 本發明之主要目的是提供一種形成固定化之多醣類的

553951 五、發明說明（4) 方法。 本發明之次要目的是提供一種固定化的透明質酸。 本發明之再一目的是提供一種固定有透明質酸的聚胺 基甲酸酯膜。 本發明揭露一種形成固定化之多醣類的方法’首先提 供透明質酸，並對所述透明質酸的還原終端進行開環反 應。接下來對所述透明質酸的還原終端進行氧化反應，以 將所述還原終端修飾成醛基。後續提供聚胺基甲酸酯膜， 並對所述聚胺基甲酸酯膜進行電漿胺基化處理。接下來將 還原終端已被修飾為醛基之透明質酸溶解成一溶液，並將 該溶液滴至所述已胺基化之聚胺基甲酸酯膜上，最後加入 NaCNBH3，使所述透明質酸和聚胺基曱酸酯膜交互連結而 形成共價鍵。 利用本發明方法所形成之固定化的透明質酸，其與做 為基板之具生物相容性的高分子膜形成共價鍵結，使其水 合作用大幅降低。利用此固定有透明質酸的生物相容性之 高分子膜做為促進傷口癒合的貼片，不僅具有促進傷口癒 合的功效，更因其極低的水合作用可以緩和且持久地作用

在傷口上。不僅可使傷口加速癒合·，更可使癒合後的傷口 相當地平整。 較佳者’可使用短鍵的透明質酸（〇1 i go Η A)來取代所 述長鍵的透明質酸。 較佳者’使所述透明質酸和聚胺基甲酸酯膜交互連結 而形成共價鍵之後，更包含將所獲得之固定有透明質酸的

第7頁 553951 五、發明說明（5) ' " L ^基甲酸醋膜置入培養皿中並加入BDDE溶液。接下來滴 於14 、文的乳氧化鈉溶液與BDDE混合溶液，反應時間介 驟，吉夺至18小時之間’再將水分抽乾。重複上述兩步 到所述聚胺基甲酸酯膜上含有每平方公分1 0毫克的 透明質酸衍生物。 而妒較佳者’使所述透明質酸和聚胺基甲酸醋膜交互連餘 聚y成共價鍵之後，更包含將所獲得之固定有透明質酸的 上胺基甲酸酯暝置入培養皿中，並在所述聚胺基甲酸酯膜 滴入一特定量的透明質酸。接下來將所述聚胺基甲酸酯 、、置入電焚反應器中，以氮氣電漿進行轟擊，使所加入的 透明質酸與聚胺基甲酸酯膜形成共價鍵。 首先請參考圖一，其為本發明形成固定化之多醣類之 方法的流程圖。首先提供一多醣類（步驟1〇1)，並使其產 生駿基（步驟102)。同時提供一具生物相容性之高分子膜 (步驟1 0 3 )’並使其胺基化（步驟1 〇 4 )。接下來將所述具醒1 基的多醣類放置到所述已胺基化之高分子膜上（步驟 105)，最後使所述具醛基的多醣類和已胺基化之高分子膜 形成共價鍵結（步驟1 0 6 )。 其中所述多醣類係選自下列群組：褐藻酸 (Alginate)、甲殼素（Chitin)、肝素（Heparin)、軟骨素 (Chondroitin Sulfate; CS)、角蛋白（Keratan Sulfate; KS)、去乙醯殼多醣（Chitosan)、透明質酸（hyaluronic

第8頁 553951 五、發明說明（6) 二。是其中/Λ褐Λ酸广種藻膠鹽。甲殼素又稱為幾 動物、昆蟲、&其他無脊椎動物堅硬的；構成甲殼綱 -種酸性黏多，，作用與抗凝血梅=二f素。肝素是 可存在於各種組織中，尤其以肝臟/C類似你 硬如角、類似明膠狀的蛋白質物質 $ =骨素是一 :獲得。，蛋白是-種存在於表面構；1二!：膠以 主要：Ϊ/ 質溶劑，含硫量高，其中所含之 #胺基馱為胱胺酸和精胺酸。去乙醯殼多醋3一在 汜·維赛林（Wissel ingh)試驗中所產生的物 疋 贫 化鈉於1 6 〇t處理殼多醣2 0分鐘，便可產生， ^ :體^質酸是一種帶多負電的生物以子去乙多醯二動 的軟結締組織（S〇ft _ective…中，例如 眼目月的水晶體、臍帶、和皮下組織等等。 接 明質酸 備（步I 飾，在 明質酸 2 0 2 )， 進行氧 例將透 酸與所 下來請參考圖二，其為本發明的一個實施例中使透 產生醛基之方法的流程圖。首先進行透明質酸的製 裝201)。後續針對透明質酸的還原終端進行化學修 不影響其他重複性雙膽下做·局部修舞。首先針對透 的還原終端（reducing end)進行開環反應（步驊 使碳鏈得以旋轉’再對還原終端已開環之透明質酸 化反應’使透明質酸產生駿基（步驟2 〇 3 )。本實施 明質酸的還原終端變成醛基，使得後續要將透明質 述具生物相容性之1%分子膜形成共價鍵結時，有最

553951 五、發明說明（7) " 一 佳的鍵結強度與鍵結數量。 在進打透明質酸的製備中，首先準備透明質酸，並將 其溶解於酸性溶液中。接下來加入酵素，使其與所述透明 質酸的溶液起反應，再以凝膠過濾層析法（GFC)進行分離 與純化。

在本發明的一個實施例中，準備的透明質酸介於4〇毫 克至8 0毫克之間，並將其溶解於4 〇毫克至8 〇毫克之酸性溶 液NaCl/NaCH3C00溶液中。在本發明的另一個實施例中， 準備的透明質酸為60毫克之間，並將其溶解於6〇毫克之酸 性溶液NaCl/NaCH3COO溶液中。其中所述NaC1/NaCH3C〇〇 溶液的pH值介於5· 0至6· 〇之間，其最佳酸鹼度為pH5. 5 ; NaCl/NaCH3COO溶液的濃度介於〇1〇肘至〇·2〇Μ之間，其最 佳濃度0 · 1 5 Μ。所述酵素係牛精子透明質酸酵辛，使用詈 介於m。單位至75。。單位之間，最佳的質使，量素為二里 位；加入牛精子透明質酸酵素的反應時間介於4〇小時至8〇 小時之間，最佳之反應時間為6 〇小時。

在所述開環反應的過程中，首先將所述透明質酸溶於 四蝴酸鈉（sodium borate; Na2B407)的溶液中，待其完全 〉谷解後’於至溫中加入棚氮化納（s·odium borohydride; NaBH4) ’以針對所述透明質酸的還原終端進行開環反應。 其中所述四硼酸鈉的濃度介於〇 · 〇㈣至〇 · 〇 7M之間，最佳濃 度為〇· 05M;其酸鹼度介於ΡΗ8· 5至pH9. 0之間，最佳酸驗 度為P Η 8 · 8。所述開環反應的反應時間介於1 〇小時至1 4小 時之間’最佳反應時間為1 2小時。終止上述開環反應的方

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五、發明說明（8) 法是在溶液中加入酸性物質，例如冰醋酸’將溶液的酸驗 度調整至ρΗ4· 〇至ΡΗ5· 0之間。接下來進行純化程序，首先 將開環後之透明質酸溶液通入陽離子樹脂層析管，於室溫 下收集濾液，再加入無水甲醇數毫升。接下來利用旋轉濃 縮法及冷凍乾燥法得一初產物。最後以凝膠過濾層析法將 鹽類除去再利用乙醇進行沈殿步驟。 在所述氧化反應的過程中，首先將已開環之透明質酸 溶於間二氮茂（imidazole;C3H4N2)中，待溶解後，加入固 定比例的過碘酸鈉（NaI〇4)以將所述透明質酸反應為醛

基。其中所述間二氮茂的濃度介於〇· 〇3M至0· 05M之間，最 佳濃度為0· 04M;其酸鹼度介於ΡΗ6· 0至ρΗ6· 7之間，最佳 酸驗度為ρΗ6· 5。所述氧化反應係在冰點左右進行，其反 應時間介於5 0分鐘至7 〇分鐘之間，最佳反應時間為w、 時。接下來進行純化程序，首先將氧化後之透明質酸溶只 加入4毫升的乙二醇，攪拌2 0分鐘，並利用旋轉濃縮法及 冷凍乾燥法得一初產物。最後以凝膠過濾層析法將鹽類段 去’再利用乙醇進行沈澱步驟。

在本發明的另一個實施例中，亦可利用濃度較高的5 碘酸鈉（NaI04)，僅需一個步驟便使透明質酸產生醛基。 在本實施例中，透明質酸產生醛基的部分不盡然會在還^ 終端，而可能產生在重複性雙醣鏈的任何部份。後續亦3 將本實施例的透明質酸與所述具生物相容性之高分子膜男 成共價鍵結，其優點是製程較簡單，不但節省時間也節^ 成本。

553951 五、發明說明（9) 其中所述具生物相容性之高分子膜係選自下列群組： 聚乙烯（Polyethylene; PE)及聚丙烯（PP)、聚四氟乙烯 (Polytetrafluoroethylene)、聚醯胺（Polyamide)、聚 酯類（Polyesters)、聚碳酸醋（p〇ly Carbonates)、聚甲 基丙稀酸曱醋（PolymethylMethacrylate)、聚醚類 (polyethers)、聚丙烯睛（Polyacrylonitrile; PAN)、聚 胺基曱酸酯（PU)、聚甲基丙烯酸氫氧基乙酯（Poly (HEMA))、以及聚甲基丙烯曱酯等等。 在本發明中、，使具生物相容性之高分子膜胺基化的方 法，是利用氮氣電漿進行處理。在本發明的第一實施例 中，首先準備大小為1公分X 1公分或1公分X 3公分的聚胺 基甲酸酯膜，置入0. 0 0 5%Tr it on 100中以超音波洗淨槽清 洗2 0分鐘，再以三次水清洗數次，以無菌抽氣櫃將水分抽 乾。接下來將所述聚胺基甲酸酯膜置於電漿反應器中之電 極板上，抽真空至〇. 01 torr。20分鐘後，通入氨氣’使 反應器中之真空度維持在〇· 03 torr至0· 07 torr之間， 最佳的真空度為0.05 torr。待真空度穩定之後’將電漿 反應器的功率調整至2 0瓦至4 0瓦之間，以進行電衆處理持 續6分鐘至1 4分鐘；其中最佳功率爲3 0瓦，電漿處理的時 4 間以1 0分鐘為最佳。當反應時間終了 ，關掉電衆反應器的 電源功率並持續保持真空，使該聚胺基曱酸酯膜在氨氣的 環境下靜置3 0分鐘，即完成聚胺基甲酸酯膜之電渡胺基化 處理。 接下來，在將所述具醛基的多醣類放置刻所述已胺基

第12頁 553951 五、發明說明（ίο) 化之高分子膜上的步驟中，係先將還原終端已被修飾為酸 基之透明質酸溶解成一溶液，並將該溶液數毫升滴至裝有 已胺基化之聚胺基曱酸酯膜的適當容器内’在室溫下反應 3小時。上述將透明質酸溶解的步驟，是將還原終端已被 修飾為醛基之透明質酸以每毫升4毫克的比例溶於四硼酸 納（sodium borate; Na2B407)的溶液中’待其完全溶解。 其中所述四硼酸鈉的濃度介於0 . 0 3 Μ至〇 . 〇 7 Μ之間，最佳濃 度為0.05Μ;其酸鹼度介於ρΗ8·5至ρΗ9·0之間，最佳酸鹼 度為ρΗ8.8。 接下來在使所述具醛基的多醣類和已胺基化之高分子 膜形成共價鍵結的步驟中，是在滴有具醛基之多醣類溶液 之所述已胺基化之高分子膜上加入一還原劑，例如 NaCNBH3或H2/Pd，使具醛基的透明質酸和已胺基化之聚胺 基甲酸酯膜交互連結（cross-linking)而形成共價鍵結。 最後再經淨化處理，將透明質酸固定在聚胺基甲酸酯上的 方法於焉完成。 所述進行共價鍵結的步驟是本發明的重點之一，其反 應時間介於20小時至30小時之間，最佳之反應時間為24小 時。在此進行共價鍵結的步驟中，_還原終端已被修飾為醛 基之透明質酸和已胺基化之聚胺基甲酸酯膜之間充分地反 應而形成共價鍵。如此一來，透明質酸的水合程度便大為 降低，不再會因水合作用而流失掉。 在所述淨化處理中，首先將透明質酸溶液吸出，依序 加入2%的醋酸清洗二次，加入三次水清洗三次，加入丨肘的

第13頁 553951 五、發明說明（11) -- 乳化納溶液清洗二次，再加入三次水清洗五次。最後吸出 液體’再以無菌抽氣櫃將所含水分抽乾。 在本發明的第二實施例中，首先進行與第一實施例完 全相同的步驟’將所獲得之固定有透明質酸之聚胺基甲酸 酯膜置入24well=培養皿中，加入1%BDDE後，再滴以5〇〇 微升’濃度為10宅克/¾升透明質酸的〇· 5%氫氧化鈉溶液 與2· 5微升的BDDE混合溶液，反應時間介於14小時至18小 時之間，最佳的反應時間為丨6小時，再利用無菌抽氣櫃將 水分抽乾。重複上述步驟直到聚胺基甲酸酯膜上含有每平 ，公分1 0毫克的透明質酸衍生物。再利用旋轉洗淨器以無 菌水清洗七次，每次1小時，再利用無菌抽氣櫃將水分抽 乾。隨後再加上3 0 0微升濃度為10毫克/毫升的透明質酸水 溶液，使聚胺基曱酸酯膜持續含有每平方公分1 〇毫克的透 明質酸衍生物。 在本發明的第三實施例中，首先進行與第一實施例完 全相同的步驟’將所獲得之固定有透明質酸之聚胺基甲酸 酯膜置入24wel 1的培養皿中，在聚胺基曱酸酯膜滴入與第 二實施例相同之每平方公分1 〇毫克的透明質酸，再利用無 菌抽氣櫃將水分抽乾。接下來，將_所述聚胺基甲酸酯膜置 入電漿反應器中，以氮氣電漿進行轟擊，使所加入的透明 質酸與聚胺基曱酸酯膜形成共價鍵。其中所述氮氣電漿的 功率介於2 0瓦至4 0瓦之間’反應時間介於5分鐘至1 5分鐘 之間，再靜置2 0分鐘至4 0分鐘。其中最佳之氮氣電衆功率 為3 0瓦，最佳反應時間為10分鐘’最佳靜置時間為30分

第14頁 553951 五、發明說明（12) 鐘0 在本發明的第四實施例中，製程的步驟與第一實施例 完全相同’唯以短鍵的透明質酸（〇1 ig〇 ha)取代第一 例中的長鍵透明質酸。 & —在本發明的第五實施例中，製程的步驟與第三實施例 完全相同’唯以短鍵的透明質酸（ο 1 i go HA)取代第三實施 例中的透明質酸。 利用本發明之方法所形成的固定化之透明質酸，具有 下列的優點：

一、利用本發明方法所形成之固定化的透明質酸，其 與做為基板之具生物相容性的高分子膜形成共價鍵結，使 其水合作用大幅降低。利用固定有透明質酸之具生物相容 性的高分子膜做為促進傷口癒合的貼片，不僅具有促進傷 口癒合的功效，更因其極低的水合作用可以緩和且持久地 作用在傷口上。不僅可使傷口加速癒合，更可使癒合後的 傷口相當地平整。 二、培養細胞：利用Clone tics公司的normal human dermal fibroblast (NKDF)細胞進行細胞的培養，發現本 發明第一、第二、第三、第四、及·第五實施例所形成之固镰 定化的透明質酸對細胞的增生皆具有一定的功效，其中又 以第三實施例所形成之固定化的透明質酸對細胞增生的功 效最佳。 三、促進傷口癒合：在天竺鼠背部的傷口上，利用本 發明第二、第三、及第五實施例所形成之固定化的透明質

第15頁 553951 五、發明說明（13) 酸進行傷口癒合的試驗，顯示利用本發明方法所形成之固 定化的透明質酸對傷口癒合的功效都遠較傳統之透明質酸 為佳，其中又以第三實施例所形成之固定化的透明質酸對 傷口癒合的功效最佳。此外，利用本發明第五實施例所形 成之固定化的透明質酸可使傷口的周圍有放射狀的血管增 生，顯示短鍵的透明質酸（〇1 i go Η A)特別具有使血管增生 的功效。 本發明係透過具體實施例加以敘述，說明本發明的原 則和精神，應可瞭解本發明並不侷限於所揭露的具體實施 例，因此，在本發明之原則和範圍底下所作任何相關細節 上之變化，都應視為本發明的進一步實施例。 «

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第16頁 553951 圖式簡單說明 圖式說明： 圖一為為本發明形成固定化之多醣類之方法的流程 圖。 圖二為本發明的一個實施例中使透明質酸產生醛基之 方法的流程圖。 « 1Ι·Ι1Ι 第17頁

Claims (1)

1. 553951 六、申請專利範圍 丨5.如申請專利範圍第3項之形成固定化之透明質酸的方 法，其中所述NaCl / NaCH3COO溶液的濃度介於0.10M至 ； 0· 20M之間。 " 丨6.如申請專利範圍第2項之形成固定化之透明質酸的方 I 法，其中所述開環反應係首先將所述透明質酸溶於四硼 丨 酸納（sodium borate; Na2B407)的溶液中，待其完全 溶解後，於室温中加入·氫化鈉（sodium ! borohydride ； NaBH4)，以針對所述透明質酸的還原終 | 端進行開環反應。 I i I I 7.如申請專利範圍第6項之形成固定化之透明質酸的方 法，所述其中所述四硼酸鈉的濃度介於0.03M至0.07M之 ' 間，其酸鹼度介於pH8. 5至pH9. 0之間。 I 8.如申請專利範圍第6項之形成固定化之透明質酸的方 法，其中所述開環反應的反應時間介於1 〇小時至1 4小時 之間。 9.如申請專利範圍第6項之形成固定化之透明質酸的方 法，其中所述終止開環反應的方法是在溶液中加入冰醋 酸，將溶液的酸鹼度調整至pH4. 0至pH5. 0之間。

   第19頁 553951 六、申請專利範圍 _ I 0 ·如申請專利範圍第2項之形成固疋^之透明質酸的方 法，其中所述氧化反應係先將己開/衣之透明質酸溶於間 \ 二氮茂（imidazole ; C3H4N2)中，、待溶解後，加入固定 丨比例的過碘酸鈉（NaI04)以蔣所述透明質酸反應為酸 !基。 i II ·如申請專利範圍第1 0項之#成固疋化之透明質酸的 方法，其中所述間二氮茂的濃度介於0· 0^至0· 05Mi 間，酸鹼度介於ρΗ6·0至ρΗ6·7之間0 | 12.如申請專利範圍第1 〇項之形成固定化之透明質酸的 !方法，其中所述氧化反應係在冰點左右進行’其反應時 I | 間介於50分鐘至70分鐘之間。 1 1 3 ·如申請專利範圍第1項之形成固定化之透明質酸的方 法，其中所述具生物相容性之高分子膜係選自下列群 組：聚乙稀（Polyethylene; ΡΕ)及聚丙稀（ΡΡ)、聚 I 四氟乙烯（Polytetrafluoroethylene)、聚醯胺 (Polyamide)、聚自旨類（Polyesters)、聚碳酸酉旨 (Polycarbonates)、聚曱基丙稀酸曱酯 i (PolymethylMethacrylate)、聚醚類（Polyethers 丨 ）、聚丙烯睛（Polyacrylonitrile; PAN)、聚胺基曱 酸酯（Ρϋ )、聚曱基丙烯酸氫氧基乙酯（Poly ( HEMA ) i )、以及聚曱基丙烯曱酯等等。

   第20頁 553951 六、申請專利範圍 1 4.如申請專利範圍第1項之形成固定化之透明質酸的方 法，其中所述具生物相容性之高分子膜係聚胺基曱酸酯 (PU )膜。 1 5.如申請專利範圍第1 4項之形成固定化之透明質酸的 方法，使具生物相容性之高分子膜胺基化的方法，是利 用氮氣電漿進行處理。 1 6.如申請專利範圍第1 5項之形成固定化之透明質酸的 方法，其中所述進行電漿胺基化處理的方法係包含： a. 將所述聚胺基甲酸酯膜置於電漿反應器中之電極板 上，並抽真空； b. 通入氨氣；以及 c. 進行電漿處理。 1 7.如申請專利範圍第1 6項之形成固定化之透明質酸的 方法，當進行電漿處理時，所述電漿反應器的功率調整 至2 0瓦至4 0瓦之間。 1 8,如申請專利範圍第1 7項之形成固定化之透明質酸的 方法，其中所述電漿處理的反應時間介於6分鐘至1 4分 鐘之間。

   第21頁 553951 六、申請專利範圍 1 9.如申請專利範圍第1 8項之形成固定化之透明質酸的 方法，在所述反應時間終了之後，更包含關掉電漿反應 器的電源功率並持續保持真空，使該聚胺基曱酸酯膜在 氨氣的環境下靜置的步驟。 20. 如申請專利範圍第1項之形成固定化之透明質酸的方 丨 I 法，其中所述將所述具醛基的透明質酸放置到所述已胺 基化之高分子膜上的方法，係先將還原終端已被修飾為 | 醛基之透明質酸溶解成一溶液，並將該溶液數毫升滴至 裝有已胺基化之聚胺基曱酸酯膜的適當容器内，在室溫 下反應3小時。 ! I | 21. 如申請專利範圍第2 0項之形成固定化之透明質酸的 i 方法，其中所述將透明質酸溶解的方法，是將還原終端 | 已被修飾為醛基之透明質酸以每毫升4毫克的比例溶於 | 四删酸鈉（sodium borate; Na2B407)的溶液中，待其 丨 完全溶解，其中所述四硼酸鈉的濃度介於0.0 3M至0.0 7M 之間，其酸鹼度介於ρΗ8·5至ρΗ9·0之間。 2 2.如申請專利範圍第1 4項之形成固定化之透明質酸的 丨 方法，其中所述使所述具醛基的透明質酸和已胺基化之 聚胺基甲酸酯（PU )膜形成共價鍵結的方法，是在滴有 具醛基之透明質酸溶液之所述已胺基化之聚胺基甲酸酯 (PU )膜上加入一還原劑。

   第22頁 553951 六、申請專利範圍 2 3.如申請專利範圍第2 2項之形成固定化之透明質酸的 方法，其中所述還原劑是N a C Ν Β Η 3。 2 4.如申請專利範圍第2 2項之形成固定化之透明質酸的 方法，其中所述還原劑是H2/ Pd。

   25.如申請專利範圍第2 2項之形成固定化之透明質酸的 方法，使所述透明質酸和聚胺基甲酸酯膜形成共價鍵結 之後，更包含： a.將所獲得之固定有透明質酸的聚胺基曱酸酯膜置入培 養孤中並加入1，4 - 丁二醇二縮水甘油醚（1，4一 i Butanediol Diglycidyl Ether; BDDE)溶液； i b.滴以透明質酸的氫氧化鈉溶液與1，4 -丁二醇二縮水甘 油醚（1，4— Butanediol Diglycidyl Ether; BDDE I )混合溶液，反應時間介於1 4小時至1 8小時之間，再 丨 將水分抽乾； I

   ! c.重複步驟a及步驟b，直到所述聚胺基曱酸酯膜上含有 一特定量的透明質酸衍生物。 I | | 26.如申請專利範圍第2 5項之形成固定化之透明質酸的 丨 方法，其中所述特定量的透明質酸衍生物為每平方公分 1 0毫克。

   第23頁 553951 丨六、申請專利範圍 丨 I 27.如申請專利範圍第2 2項之形成固定化之透明質酸的 丨 I 方法，使所述透明質酸和聚胺基曱酸酯膜形成共價鍵結 I 之後，更包含： I ! a.將所獲得之固定有透明質酸的聚胺基曱酸酯膜置入培 I ; ； 養JHI中，並在所述聚胺基甲酸酯膜上滴入一特定量的 |、 透明質酸；以及 b.將所述聚胺基甲酸酯膜置入電漿反應器中，以氮氣電 ^ 漿進行轟擊，使所加入的透明質酸與聚胺基曱酸酯膜 I 形成共價鍵。 f 28.如申請專利範圍第2 7項之形成固定化之透明質酸的 方法，其中所述氮氣電漿的功率介於20瓦至40瓦之間， 反應時間介於5分鐘至15分鐘之間，再靜置20分鐘至40 丨 丨 分鐘。 | I ; I ! ' ! 丨29.如申請專利範圍第2 5項或第2 7項之形成固定化之 | | 透明質酸的方法，其中所述透明質酸係短鍵的透明質酸 丨 （ο 1 i go HA ) ° 丨 • 丨30.如申請專利範圍第2 2項之形成固定化之透明質酸的 丨 I 方法，其中所述共價鍵結的反應時間介於2 0小時至3 0小 丨^ !時之間。 丨 ! ! ! |， 丨31. —種固定有透明質酸的聚胺基甲酸酯膜，其特徵在

   第24頁 553951 :六、申請專利範圍 於，所述透明質酸係以共價鍵鍵結在所述聚胺基曱酸酯 膜上。 丨32.如申請專利範圍第3 1項之固定有透明質酸的聚胺基 ! 曱酸酯膜，其中所述透明質酸係長鍵的透明質酸。 33.如申請專利範圍第3 1項之固定有透明質酸的聚胺基 甲酸酯膜，其中所述透明質酸係短鍵的透明質酸。