TW524973B - Extracellular recording electrode - Google Patents

Description

524973 A7 B7 五、發明説明（彳） 技術領域 本發明與用於細胞外記綠的多重電極有關，其在電氣生 理子領域内非常有用’並且用於測量神經單位活動所產生 的電位改變。 背景技藝 近來，神經元對電子裝置的適用性已經過蓬勃的研究以 及醫學上的研究。在處於活動狀態下的神經元内會產生活 動電位，神經元離子穿透性的變化會導致細胞内與細胞外 離子濃度的改變，負貴用於產生活動電位。因此，若測量 到神經元周圍離子濃度改變伴隨的電位變化，就可以監測 到神經元的活動。 一般會藉由微操縱器或這類裝置的幫助，將用於測量細 胞外電位的玻璃或金屬（例如白金）電極放置在細胞周圍， 來達成上述利用細胞活動的電位測量。另外，在細胞内會〜 插入類似的電極，以便測量細胞内的電活動。這些傳統技一 術^有下列缺點：需要有電極製備這方面的技術、電極具 有咼阻抗因而讓訊號容易遭受外來雜訊的干擾以及若將電 極插入細胞内會引起細胞或組織受傷。因此，傳統電極並 不適合用於長時間監測。 爲了避免這種問題，發明者研發出一種多重電極，包含 複數個由絕緣基板上的導電材料製成之微電極，以及一其 上可培養細胞或組織的導線圖（日本專利特許公開出版品、 第6 78889號以及日本專利特許公開出版品第 號）運用此夕重私極’就可在不傷害細胞或組織的情況 -4 - 本紙張尺度適用中國國冬標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 524973 A7 B7 五、發明説明（2 ) 下長時間監測神經細胞的活動。

在上述的多重電極内，電極最上方的表面包含使用電解 液鍍上多孔白金黑色物（日本專利特許公開出版品第心 78889唬）或使用沉積法鍍金（日本專利特許公開出版品第卜 296595)的細胞。在白金黑色物電鍍的情況下，雖然非常 谷易將電極的阻抗調整到特定程度，例如大約5〇 kQ或以 下，不過電極的強度相當低，因此電極的重複使用性不 高。在用沉積法形成金的情況下，強度就有所改善，但難 以將阻抗降低到大約50 kQ或以下。 發明揭露事項 本發明在於解決上述問題，本發明的目的在於提供一種 具有阻抗頻率特性適合記錄細胞電予訊號的細胞外記錄電 極，該電極具有低阻抗、不易受外來雜訊干擾以及容易重 複使用。 & 瓢 本發明發現在細胞外記綠電極的生產中，只要將用於在― 最上層表面形成導電材料的電流密度最佳化，則可獲得表 面粗糙的多孔導電材料表面因而增加表面積，如此該多孔 導電材料將具有用於細胞外記綠電極的較佳特性。本發明 完全以上述發現爲基礎。 本發明提供一種用於測量細胞電器生理學特性的多重電 極’該多重電極包含在基板上提供的複數個微電極，以及 用於將電子訊號提供給微電極或從微電極擷取電子訊號之， 線路邵分。該微電極在其表面上具有一多孔導電材料，該 導電材料係由下列各物組成之群中選出，包括金、氮化 -5- 本紙張尺度適用中國國家標i(CNS) A4規格(2]；〇x 297公ΪΓ 524973 A7 _ B7 X"、發明説明（3~~) ~ 鈥、氧化銀以及鎢，並且每個微電極的阻抗都爲5〇 咬 以下。 该多孔性導電材料最好是金，並且由電流密度爲1 〇至 5·0 A/dm2的電流通過1〇至360秒來形成。 本發明也提供一種用於測量細胞電器生理學特性的多重 電極’該多重電極包含在基板上提供的複數個微電極，以 及用於將電子訊號提供給微電極或從微電極擴取電子訊號 之線路部分。由等效電路（具有大體上與該微電極的阻抗 相同之阻抗）的靜電容量計算得出之微電極表面積大於等 於微電極投射面積10倍並小於等於200倍，並且該微電極 的阻抗爲50 kD以下。 「微電極的投射面積」一詞在此表示在導電材料形成之 前微電極最上層表面的整個區域。 由氣體吸收法所測得的微電極表面積最好小於等於微電一 極投射面積的5 X 105倍。 — 在本發明的一個具體實施例内，該微電極以矩陣形式配 置在基板上，線路部份包含連接到微電極的導線以及連接 到導線末端的接點，並且以絕緣層覆蓋該導線至少一表 面0 在本發明的一個具體實施例内，可利用蚀刻方式，像是 RIE (反應離子蝕刻）或ICPRIE (感應耦合電漿RIE)，來提 供該多孔導電材料。 〜 本發明也提供一種包含上述多重電極的整合式細胞安裝 裝置，該整合式細胞安裝裝置具有一用於將細胞或組織放 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 524973 A7 B7 五、發明説明 置在多重電極基板上的細胞安裝區域。 本發明也提供一種細胞電位測量裝置，包含上述的整合 式細胞安裝裝置、一連接到該微電極用於處理輸出訊號 (由細胞或組織的電器生理活動所產生）的輸出訊號處理器 以及一選擇性將電子刺激提供給細胞或組織的刺激訊號提 供裝置。

本發明也提供一種細胞電位測量系統，包含上述的細胞 電位測量裝置、一用光監測細胞或組織的光監測裝置以及 /或一用於控制細胞或組織培養環境的細胞培養裝置。 圖式簡單説明 圖1 a爲顯示在比較範例内，在微電極表面上用電解液以 1 ·0 A/dm2電流密度形成的鏡金層之顯微照片，其放大率爲 2500倍，圖式内的縮尺爲5〇 μιη。 訂 圖lb爲顯示依照本發明在微電極表面上用電解液以1 ·5 - A/dm2電流密度形成的鍍金層之顯微照片，圖式内的縮尺-一 爲 50 μιη。 圖1C爲顯示依照本發明在微電極表面上用電解液以2.0 A/dm2電流密度形成的鍍金層之顯微照片，圖式内的縮尺 爲 50 μηι 〇 圖2a爲顯示與恆等電流刺激有關，在比較範例内以1 ·〇 A/dm2的電流密度通過電解液來形成的鍵金微電極上，細 胞電位變化反應的電腦螢幕顯示之64頻道列印圖，刺激訊-號供應至第29頻道。 圖2b爲顯示在缺乏細胞時圖2a内所示的鍍金微電極雜訊 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 524973 A7 ___ B7 五、發明説明（5~厂 ~ 程度的電腦螢幕顯示之64頻道列印圖。 圖2c爲顯示與恆等電流刺激有關，依照本發明以j 5 A/dm2的電流密度通過電解液來形成的鍍金微電極上，細 胞電位變化反應的電腦螢幕顯示之64頻道列印圖。 圖2d爲顯示在缺乏細胞時圖2C内所示的鍍金微電極雜訊 程度的電腦螢幕顯示之64頻道列印圖。 圖2e爲顯示與恆等電流刺激有關，依照本發明以2.〇 A/dm2的電流密度通過電解液來形成的鍍金微電極上，細 胞電位變化反應的電腦螢幕顯示之料頻道列印圖。 圖2f爲顯示在缺乏細胞時圖2e内所示的鍍金微電極雜訊 程度的電腦螢幕顯示之64頻道列印圖。 圖3爲顯示本發明的微電極阻抗特性圖。 圖4a爲顯示本發明的微電極等效電路之圖式。 圖4b爲顯示本發明的微電極等效電路之圖式。 圖5爲顯示本發明的微電極等效電路之阻抗特性圖。 圖ό爲顯示本發明的微電極等效電路之阻抗特性圖。 圖7爲顯示比較範例的微電極阻抗特性圖。 圖8爲顯示比較範例的微電極等效電路之阻抗特性圖。 圖9爲顯示比較範例的微電極阻抗特性圖。 圖10爲顯示比較範例的微電極等效電路之阻抗特性圖。 圖11爲本發明的電鍍鍍金微電極與傳統產品在可重複使 用能力方面的使用壽命測試結果圖。 執行本發明的最佳模式 此後將詳細說明本發明的功能。 -8 - 524973 A7 B7 五、發明説明（6 ) (用於微電極的多孔導電材料之生產） 依照本發明的細胞外記錄用多重電極包含複數個絕緣基 板上的微電極，而細胞則置於微電極上來測量細胞的電活 動0 本發明的多重電極特別包含一位於微電極最上層表面上 的多孔導電材料，此微電極的阻抗爲5〇 或以下，該微 電極的阻抗較好是35 kQ或以下、更好是25 或以下，最 好是10 kQ或以下。此處所用的阻抗定義成在5〇mV的端子 間電壓上以1 kHz的頻率測得之値。本發明内阻抗的最低 限制値並未特別設限，但在本發明的指示中是越低越好。 吾人相信這種低阻抗遍佈於電極上提供的導電材料之多 孔結構内，此處的多孔性也就是導電材料表面的粗糙或有 許多微小突起與凹陷之程度。當使用顯微鏡放大觀察時， 本發明的多孔導電材料表面看起來像是由直徑大約〇. 〇丨_ 2 5 — μιπ的小粒子緊密膠合起來的。當電極的最上層表面具有這一 種多孔結構時，表面積就可顯著增加。結果，就可達到傳 統沉機法所產生平滑金表面所無法獲得的低阻抗。 田如上面説明的，由電極最上層表面的表面積可定義電極 最上層表面的多孔結構，例如藉由精通此技藝的人士所熟 知〈使用氣體吸收的ΒΕΤ法，可定義電極最上層表面的表 面積、。另外，可用根據代表微電極與溶液間之介面模式的 電路之等效電路的靜電容量來計算阻抗。 — 本發明的多孔導電材料可用過電流密度下的電解電鍵來 生產’該過電流密度較佳是12A/dm2範圍内的電流密度、 I紙張尺度適用中國國家標準(cnsTI^：_(210 X 297公董)---------- 524973 A7 B7

五、發明説明（7

更佳是1.0至5.0 A/dm2,最好是h4至21 A/dm2。這可與使 用大約1 ·0 A/dm2電流密度的傳統導電材料之工業電解電鍍 相比較。請注意，即是使用超過3 〇 A/dm2的電流密度，還 是可進行多孔導電材料的電鍍。若電流密度過大，則表面 會過度粗糙而難以維持所要的微電極形狀（例如方形）。在 本發明内，在代表性的經歷10_ 360秒（最好是3〇_24〇秒）過 電泥密度之電流通過後可產生導電材料鍍金。若電流的通 過時間過短，則不足以在微電極表面上形成導電材料電 鍍。若電流的通過時間過長，微電極上導電材料的成長就 會不平均，如此有部份導電材料電鍍就會迅速成長而其他 則緩慢成長’並且電極的形狀就不像方形。 上述的電解電鍍情況僅供説明，因此可根據所使用的電 解電鍍裝置或操作程序的需求，在可達到上述低阻抗的範 圍内進行選擇性修改。 、

另外’本發明的多孔導電材料可用蝕刻方法獲得，例〜 如，使用氧化劑以及溶解劑的化學蝕刻、在使用酸當成主 要成份的電解液内用直流或交流電讓電解液導電的化學蝕 刻或這類的蚀刻方法，藉此增加表面積。 本發明微電極的最上層表面具有上述的多孔結構，進一 步，最上層表面的材料例如是金，藉以達到高強度以及低 阻抗特性。因此’微電極的循環使用效率極高，導致極高 的成本效盈。相較於傳統電極内使用的重白金黑色物之電〜 解電鍍，該電鍍具有低阻抗，但其強度卻也相當低，如此 便禁不起重複使用。尤其是，當進行與稍後將說明的範例 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公董)

5内條件相同的使用壽命測試之 加率在20個；^ p、 不么明弘極的阻抗增 較佳^〈後相對於原來的阻抗只有观或以下、 馬:〇/°或以下並且更佳是15%或以下。 上1^孔導電材料位於本發明的微電極最上層表面之 多孔二:電材料的下層電極材料可爲任何可充分黏貼到 的材料，多孔導電材料的下層電極材料範例 ^ =又限有，較佳是利用無電或電解液電鍍的鎳、通 吊{用操電電鍍的金等等。這些底層的厚度並不設限，例 如鎳W的厚度大約是3_至7_埃，而在鎳電鏡層上 d可& ί、厚度大約是300至700埃的無電金電鍍層。 發明的多重電極内，在基板上將以置於矩陣形式内 万格交又處上之方式提供複數個微電極。在此配置中，複 數個愁極的間隔都相等。因Α，相鄰神經細胞的細胞本體 都可放在相鄰的電極上，以偵測細胞本體之間的電子訊號 轉換。 —每個微電極都對外提供電子訊號，另外，將電子訊號從 每個微電極擷取到外面的線路部份都連接到每個電極。具 代表性的是，線路部份包含一導線，該導線連接到每個微 包極並且從電極往基板週邊延伸。該線路部份可進一步包 含一連接到導線末端（通常位於基板週邊）的接點。線路部 份的材料範例較佳是包含銦錫氧化物（Ι1Γ0)。請注意到， 上述阻抗是微電極與線路部份的總體特性値，事實上，上 述線路部份的組抗値與電極最上層表面的材料與尺寸所定 的値比起來是微不足道的。因此，電極下層以及線路部份 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公愛) 524973 A7 _______ _ B7 _ 五、發明説明（9 ) 的材料選擇大體上是不會影響阻抗的。 具代表性的是，導線的表面會覆蓋一絕緣層，該絕緣層 只提供於導線上，但較佳是在基板上除了微電極以及新鄭 接點以外的整個上表面之上。絕緣層的範例較佳是包含較 容易處理的聚丙烯樹脂或感光聚醯酸。 (多重電極的架構） 有關本發明的多重電極之詳細設計，只要不干擾上述多 孔導電材料的形成與功能，任何已知的多重電極之結構特 色（例如日本專利特許公開出版品第6-78889號）都可使用。 此後，將顯示多重電極的代表性範例結構。此處所說明的 具體實施例在考量到許多因素之後可選擇性進行修改，像 是要測量的神經細胞特性、要測量的資料性質等等。 多重電極内包含的基板較佳是由透明絕緣材料所製成， 以便在培養細胞之後進行觀測。這種材料的範例包含··像 是石夕玻璃、鉛玻璃以及硼砂玻璃的玻璃、像是石英、聚甲 基丙晞酸鹽或異量分子聚合物的無機基材以及像是聚苯乙 晞和聚乙烯對苯二甲酸的透明有機基材。最好使用具有機 械強度並且透明的無機基材。 基板上提供的電極之材料範例包含有，銦錫氧化物 (ιτο)、氧化錫、Cr、Au、Cu、Ni、A1以及pt。在此之 中，最好是ITO與氧化錫。IT0具有透明特性並且特別合適 的高導電性。通常藉由在部份電極材料（具有所要的位置 以及形狀）的最上層表面上提供多孔導電材料電鍍層就玎 產生上述的微電極。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公爱) 524973 A7 ___B7 五、發明説明（1〇 ) 通常複數個微電極的間隔都相等，就是相鄰電極之間的 距離都完全相等。相鄰電極之間的距離可在從大約10到 1000 0111的圍内。具代表性的是，電極的形狀大體上是 方形或圓形，其邊緣或直徑在從大約2〇到2〇〇 μχη的範圍 内。就以上述的設定來說，若要測量的神經細胞之細胞本 體（就是細胞本體、樹突與軸突）位於電極上，則非常有可 能其他細胞本體（與之前細胞本體的樹突相連）會位於相鄰 的電極上。

裝 、連接到彳政屯極的導線可遇上述相同的電極材料所製 成。在此情況下，最好也是ΙΤ〇。通常，這種電極材料會 沉積在基板上。之後，將使用光致蝕刻劑進行蝕刻，藉以 形成微電極最底層上所要的整合圖樣，以及包含一導線的 線路部份。在此情況下，微電極最底層和線路部份的厚度 大約是500至5000埃。 該導線配置成大體上是從該微電極往外輻射延伸，在結 合此大體上輻射狀的配置後，複數個微電即將特別配置成 其中心位於8 Χ 8方格的個別交叉點上。 覆盖導線的絕緣層材料範例包含透明樹脂，像是聚醯酸 (Ρ I)樹脂以及環氧樹脂，而最好是感光樹脂，像是負感光 聚醯酸（ΝΡΙ)。例如，當使用感光樹脂當成絕緣層時，可 利用由光蝕刻形成的圖樣再微電極上絕緣層部份内形成一 開口’而只露出此電極。如上述的，該所提供的絕緣層將 大體上覆盍絕緣基板的整個表面，除了相鄰的電極以及與 外接電路的接點以外。如此便可有效率的生產。 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐） 524973 A7

(用於測量細胞電位的裝置與系統） 有關利用本發明多重電極來測量神經細胞或這類細胞 多種系統組件之詳細設計，只要不干擾上述多孔導 的形成與功能，任何已知的多重電極之結構特色（例如日 本專利特許公開出版品第8-622〇9號）都可使用。 通常，本發明的多重電極會額外提供有助於在多重電極 上進行細胞培養的結構，以及選擇性提供有助於多重電極

處理的結構。此結果多重電即可提供當成整合式細胞安 裝置。 訂

爲了在多重電極上進行細胞培養，透過基板上的絕緣層 提供可固定培養媒介的結構構件（大體上將絕緣層整個覆 蓋起來）。例如，由聚苯乙烯製成的圓柱形框架可用將複 數個微電極圍繞起來的方式固定在基板上，藉此獲得上述 的固定結構。在此情況下，聚苯乙烯框架的内側可定義出一 細胞固定區域。在製備固定結構之前或之後都可在微電極一 的表面上形成本發明的多孔導電材料。 爲了幫助在測量細胞時多重電極的處理，例如可使用印 刷電路板，該印刷電路板具有連接到微電極上接點的導線 圖’用來扮演將電路連接延長到外面的角色，該連接是從 微電極建立到該接點。具有適當形狀的固定器（像是將微 電極夾起來的兩部份分離固定器）都可用於將印刷電路板 與多重電極固定而還保有之間的連接。 - 整合式細胞安裝裝置可進一步與刺激訊號提供裝置和輸 出訊號處理器結合，藉以獲得用來刺激多重電極上細胞的 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 524973 A7 ___— B7 五、發明説明（12 ) 細胞電位測量裝置，並處理對刺激做出回應的輸出訊號。 此刺激訊號提供裝置可將刺激訊號提供給複數個微電極 之中任何一對電極。當細胞對刺激訊號做出回應時，其他 電極就會偵測到引起的電位改變，並將對應到此改變的輸 出訊號輸出给訊號處理器，該輸出訊號透過適當的處理轉 給顯示裝置或這類裝置。請注意，在此也可同時接收到在 未收到刺激訊號而細胞内產生的自發性電位。 利用具有適當測量軟體的單一部電腦就可實現此刺激訊 號提供裝置以及輸出訊號處理器，電腦螢幕上的測量軟體 提供一用來設定刺激條件和這類情沉的參數設定視窗、一 用於記錄從細胞偵測到的電位變化並透過多個頻道即時顯 示之記錄視窗，以及一用於分析記錄資料的資料分析視 窗。最好是，來自電腦的刺激訊號可透過D / A轉換器轉換 給多重電極，而來自細胞的輸出訊號則透過A / D轉換器轉 換給電腦。 細胞電位測量裝置可進一步與光監測裝置以及細胞培養 裝置結合’藉此獲得用於長期培養神經細胞，以及可穩定 並精確測量神經細胞的電器生理活動之細胞電位測量系 統。其中光監測裝置可包含一倒轉顯微鏡，可進一步包含 一用於顯微鏡的S I T攝影機，包含高解析度顯示幕以及影 像分類裝置。對於細胞培養裝置來說，任何可控制培養環 境溫度、培養媒介的循環、空氣與二氧化碳的混合氣體之 供應等等的裝置或組合都可使用。 範例 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 524973 A7 ___B7 7、發明説明了 Π " 此後將藉由圖式範例來説明本發明，但是本發明並不受 限於這些範例。 (範例1) 平面多重電極的表面會在許多電流密度下鍍上電解金電 鏡層（每個電極具有50 X 50 μηι的中央部份會置於8 X 8方格 的任一交又點上，因此微電極的整個表面（投射面積a) was 50 x50 x 64 = 160000 μιη2) 〇 尤其疋’將以1 .〇 A/dm2、1.5 A/dm2和2·0 A/dm2的電流密 度來形成電解金電鍍層，微電極（具有以個別電流密度所 开> 成的金電鍍層）的阻抗將在1 kHz頻率、50 mV中間端子 電壓以及計算出五次測量結果平均的條件下進行測量，結 果顯示在表格1内。當電流密度增加時，每個微電極的平 均阻抗都會降低。 表格1 ··電流密度以及平均阻抗 電流密度（A/dm2) 平均阻抗（kQ) 1.0 336.39 ± 78.59 1.5 22.07 土 1.95 2.0 16·56 ± 2.34 在此將以光學顯微鏡來觀察微電極的鍍金表面，顯微相 片顯示於圖la至lc内。圖la、lb和lc爲分別用1.〇 A/dm2、 1·5 A/dm2和2.0 A/dm2電流密度所獲得的電鍍表面之顯微相 片。在1.0 A/dm2電流密度的情況下，將獲得大致上平順的 電嫂表面。相較之下，當電流密度增加時，鍍金表面的多 孔性就會更加顯著，並且電極表面的面積就會增加。 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 524973 A7 B7 五、發明説明（14 ) (範例2) 在此將確實使用範例1内所獲得的微電極表面以及老鼠 hippocampus (腦部）切片’來測量唤起的電位以及噪訊等 級。Hippocampus切片來自於老鼠，五歲大的雌性 c57black6老鼠，用Fluothane麻醉並砍下頭部取出腦部，取 下的腦部立刻放入冰鎮的Ringer溶液冷卻。然後只解剖腦 部包含hippocampus的區塊，之後會利用手術刀切割獲得的 腦部區塊，讓切片有250 μιη的厚度，該切片會放置在微電 極上並進行測試。 在供應具有雙極脈衝（其中脈衝寬度爲100 μ sec)的10 μΑ 持續電流來測量唤起電位以及雜訊等級。如此將在刺激產 生5 msec之前以及刺激產生45 msec之後測量64個電極的回 應，然後顯示在具有64頻道的電腦螢幕上。結果顯示於圖 2a至2f内。圖2a、2c和2e顯示在與上述持續電流刺激有關-的鍍金微電極上細胞之電位改變反應（即是唤起電位）。圖一 2a顯示以ΐ·〇 A/dm2的電流密度進行電解電鍍所獲得的電極 之唤起電位。圖2c顯示以1.5 A/dm2的電流密度進行電解電 鏡所獲得的電極之唤起電位。圖2e顯示以2.0 A/dm2的電流 密度進行電解電鍍所獲得的電極之唤起電位。 圖2b、2d和2f顯示發生在圖2a、2c和2e内個別鏡金微電 極内之雜訊等級。 從圖2a、2c和2e可看見，由較高電流密度所獲得具有多 孔鏡金層的電極對於供應的刺激訊號有清晰的反應，並可 用較有政的方法將持績電流刺激供應給電極，這可與用1 〇 -17-

524973 A7 B7 五、發明説明（15 ) A/dm2電流密度的電解電鍍（圖2c和2e)所獲得之鍍金層（圖 2a)相比較。尤其是，具有以丨.5 A/dm2電流密度所獲得的 電鏡層之微電集會具有低阻抗値以及滿足的表面狀態。 至於雜訊等級，用2.0 A/dm2電流密度獲得的電鍍層（圖2f) 具有最低的雜訊値，並且用1 ·5 A/dm2電流密度獲得的電鍍 層（圖2d)具有第一低的雜訊値。相較之下，用1.0 A/dm2電 流密度所獲得的電鍍層（圖2b)具有相當程度的雜訊，並且 難以精確測量神經細胞的電位改變。 (範例3) 平面微電極表面（塗上以許多種電流密度所獲得的電解 電鏡金電鍍層）的頻率特性會與這些傳統產品做比較，具 有分別以2.0 A/dm2和1.5 A/dm2電流密度所獲得的多孔鍍金 表面之電極擁有與傳統電極（具有利用電解電鍍獲得的白 金黑色物電鍍層）類似的頻率特性，不過，以丨·〇 A/dm2電 流密度所獲得的金電鍍層其頻率特性則顯著比傳統產品的 頻率特性還差。 (範例4) 利用下列方法測量或計算微電極的表面積。 1 ·利用氣體吸收法進行側量 具有在範例1内以1.5 A/dm2電流密度獲得的多孔鍍金表 面之微電極表面積可藉由使用CO氣體的氣體吸收法來測 量’以要測量的樣品而τ，將使用在1 3 rnm X 1.3 mm X 1.1 mm 玻璃基板上提供的64鍍金微電極（此後稱爲鍍金微電極區 塊）。要用氣體吸收法測量的話，用單一個微電極當成樣 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 524973 A7 B7 五、發明説明（16 品會太小。此外，將如上述利用傳統方法（電解電鍍）取代 鍍金，在玻璃基板上提供64個鍍上白金黑色物的微電極 (此後稱爲白金黑體電鍍微電極區塊），用來當成比較樣 品。請注意，每個樣品區塊的重量爲〇·_ g。測量結果顯 示在表格2内。 … 鍍金微電極區塊

鍍金微電極區塊或白金黑體電鍍微整個表j 積將寫成： 表格2 ·具有鏡金表面的電極表面積之測量結果 白金黑體電鍍微電極區塊 (比較範例） 裝 S, (S - s ) + a s 訂 其中S ’代表鍍金微電極區塊或白金黑體電鍍微電極區塊 (此後稱爲微電極區塊）的整個表面積；s代表在13mmx 1.3 mm X M mm玻璃基版上形成電鍍層之前微電極區塊的 總表面積；s代表電鍍之前微電極的表面積（投射面積）， S·代表鍍金微電極區塊或白金黑體電鍍微電極區塊的整個 表面積；as代表微電極電鍍後其表面積的因數來增 加，以及S-s即是除了未改變的微電極以外之微電極區塊 表面積，並且電鍍只增加微電極的表面積。α的値 下： a = (S’-S)/s + 1. 在此案例中，S的値就是丨·^^〖.hmx丨丨_長方 -19- 本紙張尺度適用中_家標準(CNS)A4規格⑽χ 董) 524973 A7 ______B7____ 五、發明説明（17 ) 平行六邊型的表面積，即是7.41 mm2。s的値（投射面積）爲 每個尺寸爲50 μηι X 50 μπι的64個電極之表面積，即是0.16 mm2。因此，依照表格2内所示的s ·測量結果，所計算出來 的白金黑體電鏡微電極之値爲504955。請注意’鏡金電極 的α値（增加的表面積）會低於氣體吸收法的偵測限制，並 且估計少於455。 2.计鼻微電極的表面積 2 · 1 ·鍍金電極的阻抗特性 具有在範例1内以1 ·5 A/dm2電流密度獲得的多孔鍍金表 面之微電極的阻抗可藉由將頻率連續從1 Hz改變到100 kHz 來測量’在此測量中，將使用0.3 mmcj)白金導線當成反向 電極，並且在1.4 wt% NaCl水溶液内進行測量。偏壓爲零 伏特’並且測量電壓的幅度爲5〇 mV。結果顯示在圖3内。 圖3是顯示阻抗測量結果的預示圖式，精通此技藝的人士 一 就會知道，在此會以測量阻抗Z的對數（即是1〇g | z |)與相〜 位角度（Θ )該頻率f的對數關係來連結點畫。根據此預示圖 式’測量系統可用等效電路來表示，藉此測量微電極表面 積的量。 包含彳政電極的測量系統經過評估會等於實際上包含在 I Τ Ο電路圖部份與溶液之間產生的電容、微電極介面上產 生的黾阻等等，除了溶液的電阻以外，微電極表面内雙電 子層的電容（非常複雜的串聯與並聯）之電路。例如，圖乜 顯示包含微電極的側量系統之等效電路。如4a内所示的整 個等效電路之合成阻抗z可由下式代表： -20-

524973 A7 ______B7____ 五、發明説明（18 ) z郁(R2十⑵2R2R3Ct(R3Ci+(R2+R3)C2> (lM2R2R3CtC2)2+[i〇{R3Cl+(R2+R3)C2}]2 卡(R2+R3){R；sCl+(R2+R3)C2}-R2R3Ct (卜似2日2只3。1〇2) ““田 其中Ri代表I T 0電路圖樣部份（並未與溶液接觸）的電阻； R2代表Iτ〇電路圖樣部份的電阻以及溶液的電阻；r3代表 微電極表面的電阻；Ci代表微電極表面的雙電子層之電 容；c2代表ITO電路圖樣部份以及通過絕緣膜的溶液間產 生的電容，並且ω = 2πί (ω :角頻率以及f:頻率）。上述合 成阻抗的絕緣値丨Z |以及相位㊀分別由I Z I =(ZRe2+ Z ! m 2)1/2 以及0=tair〖（-ZIm/ZRe)(其中zRe爲Z的眞實部份並且Z Im是Z 的想像部份）來表示。 在此，藉由改變尺1、112、（：1和（：2來選擇尺1、112、113、（：1-和c2 (提供與圖3内所示預示圖式最類似的預示圖式）的組-合，如此可模擬圖4a内所示的等效電路。圖5爲預示圖 式，其中 Ri=200Q、R2=5kQ、Ι13=5ΜΩ、（^=0.01 pF 以 及C2= 100 pF。很明顯的圖5内所示的結果與圖3内所示的 實際測量結果一致。 在此，在包含微電極的測量系統内，R3»Ri、R3»r2並 且。因此，若假設尺3->〇〇並且C2—〇，貝1J上述方程式 [I ]可簡化爲： r|2〇c!%z=Ri+R2-】士=^_+]^7 …[1] -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 524973

若1^+112=11並且CfC，則包含微電極的測量系統則大概 就是圖4b内所示的簡單電路圖。此後，將使用圖4b内所示 的等效電路進一步進行分析。 圖4b内所示的整個等效電路之合成阻抗z可用 kR+GoC)·1來表示，其中R代表電路圖樣的電阻；c代表 微電極表面的雙電子層電阻以及ω=2πί (ω代表角頻率並且 f代表頻率）。上述合成阻抗的絕對値| ζ |以及相位㊀可分 別由 IzI^r^+o/coc)2)1。與e = tairl (-0)(：/11)來表示。 藉由改變R和C的値來選擇R*c (提供與圖3内所示預示 圖式最類似的預示圖式）的組合，如此可模擬圖4b内所示 的等政電路。圖6爲預示圖式，其中R==5 並且c=〇.〇i yF。 很明顯的圖6内所示的結果與圖3内所示的實際測量結果一 致。 接下來，圖7是顯示用來當成控制，並且沒有鍍金表面一 的械篆極的貫際測量阻抗値之圖式。其測量條件與測量具一 有上述鍍金表面的多重電極阻抗（圖3)之條件一樣。 接下來，圖8顯示利用圖4b内所示等效電路的模擬所獲 得之等效電路合成阻抗結果，其中R==5 並且C = 25〇pF。 很明顯的圖8内所示的結果與圖7内所示的實際測量結果一 致。 在此，假設微電極（具有鏡金表面）的雙電子層之電容爲 CA，以及在進行鍍金處理之前的微電極雙電子層之電容爲 Cb 依知、上述的模擬結果’微電極的靜電容量ca與cB分 別爲〇.〇1 與250 pF，如此可獲得Ca = 40Cb的關係二如 22·

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一般來說，靜電容量（^由（^=8(^3/(1(“：眞空的介電常 數；ε,:介電材料的相對介電常數；s :電極的表面積以 及d:介電材料的厚度）。靜電容量Cap之値會與電極表面 積成比例，因此，上述關係指示具有鍍金表面的微電極表 面積比在鍍金之前增加4〇倍。 圖9疋顯示以類似於具有鏡金表面的微電極之方法來實 際測量具有白金黑體電鍍表面的微電極阻抗値之圖式。其 測量條件與測量具有鍍金表面的微電極阻抗（圖3)之條件 一樣。接下來，圖10顯示利用圖4b内所示等效電路的模擬 所獲得之合成阻抗結果，其中r = 5 k Ω並且C= 0.05 μ F。很 明顯的圖10内所示的結果與圖9内所示的實際測量結果一 致。 類似地，假設微電極（具有鍍金表面）的雙電子層之電容 爲匸八，以及在進行鍵金處理之前的微電極雙電子層之雪容 爲CB。依照上述的模擬結果，微電極的靜電容量Ca與q 分別爲0.01 pF與0·05 pF，如此可獲得Ca = 2〇〇Cb的關係。 此關係指示具有鍍金表面的微電極表面積比在鏡金之前增 加200倍。 依照此模擬’爲了獲得50 k Ω或以下的阻抗（此爲微電極 的阻抗限制），與投射面積比較起來要使用金電鍍層增加 表面積10個因數以上。 (範例5) 一以1.5 A/dm2電流密度進行電解所產生具有多孔鍍金層 的平面多重電極要進行使用壽命測試，以便與傳統電極 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 524973 A7 B7 五、發明説明（21 ) (白金黑體電鍍層）做比較。在使用壽命測試中，將重複進 行類似典型激烈實驗的實.驗。AM，將重複進行範例2 内説明的實驗。在實驗結束後，電極會使用膠原蛋白膦 (20 u/ml)裡一整夜’然後在剝除細胞切片樣品之後用蒸餾 水清洗。接著，測量微電極的阻抗。圖⑽在每個實驗結 束後阻抗改變的圖式。依照此結果”遗著使用次數的增加 而產生的阻抗增加與變化要小於傳統電鍍層（白金黑體電 鍍層）的變化與增加。 相較足下，傳統具有利用電解的白金黑體電鍍表面之阻 抗會在使用17到18次之後顯著增加，如圖u内所示。如上 述的二與傳統產品比較起來，具有多孔鍍金表面的電極具 有較高的可循環性，並且可穩定測量到電極的電位變化。' 雖然本發明以參考上述範例來說明，但本發明並不受限 於這些範例。根據精通此技藝人士的知識，本發明可在不 悖離本發明領域的情況下進行許多具體實施例的修改、改 良與改變。 工業上的應用能力 依照本發明，用於細胞外記錄的多重電極（具有高強度） 可長時間1己綠神經細胞的電活動，並且重複使用。多重電 極内包含的複數個微電極利用到多孔金電鍍層，所以都2 有相當低的阻抗並且不降低強度。因此，就可輕易將持續 電流刺激供應到多重電極，並且多重電極最適合用來監控 電刺激下培養細胞的回應。 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Μ規格(_x 297公爱)

Claims (1)

1. 524973 第0901164〇5號專利申請案 益、银(〇s < 中文申請專利範圍修正本(9!年10月）p_H、‘_ 六、申請專利範圍 1. 一種用於測量細胞的電生理特性之多重電極，該電極 包含： 在基板上所配置之複數個微電極，以及用於將電氣訊 號提供給該微電極或從微電極擷取電氣訊號之線路部 分， 其中該微電極在其表面上具有一多孔導電材料，該導 電材料係選自由金、氮化鈦、氧化銀以及鎢組成之群 組，且每個微電極的阻抗都為50 kQ或以下。 2 .如申請專利範圍第1項之多重電極，其中該多孔性導電 材料為金，其係以電流密度為1.0至5.0 A/dm2的電流通 電10至360秒而形成。 3. —種用於測量細胞的電生理特性之多重電極，該電極 包含： 在基板上所配置之複數個微電極，以及用於將電氣訊 號提供給該微電極或從微電極擷取電氣訊號之線路部 分， 其中由實質上具有與該微電極相同阻抗特性之等效電 路的靜電容量所計算出之微電極表面積係大於或等於 該微電極投射面積之10倍並小於200倍，且每一微電極 的阻抗都為50 1<Ω或以下。 4 .如申請專利範圍第3項之多重電極，其中由氣體吸收法 所測得的微電極表面積小於或等於微電極投射面積的5 X 105 倍。 5 .如申請專利範圍第1至4項中任一項之多重電極，其中 O:\72\72279-911015.doc - 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 524973 六、申請專利範圍 卩修正丨 — 铺夕 該微電極以矩陣形+斯罢+ 1 ^ 平彤式配置在基板上，該線路部份 ^接導線以及連接到導線末端的電氣: ”，，占並以、、、巴緣層覆蓋該導線至少一表面。 6. 如申請專利範園第卜3及4項中任_項之多重電極，尤 中利用蝕刻方式形成該多孔導電材料。 八 7. 如申請專利範圍第5項之多重電極，其 來提供該多孔導電材料。 』万式 :種整合式細胞安裝裝置，其係包含如申請專利範圍 第⑴項中任-項之多重電極，其中該整合式細胞= 裝置包含:細胞安裝區域，其係用於將細胞或組織 置在多重電極的基板上。 一種細胞電位測量裝置，其包含： 一如申請專利範圍第8項之整合式細胞安裝裝置； 一連接到該微電極之輸出訊號處理器，其係用於處 由細胞或組織的電生理活動所產生的輸出訊號；以及 -選擇性將電氣刺激提供給細胞或組織的刺激訊號 供裝置。 10· —種細胞電位測量系統，其包含： 一如申請專利範圍第9項之細胞電位測量裝置； 一光學性監測細胞或組織用之光學監測裝置；及/或 用於控制細胞或組織培養環境之細胞培養裝置。 8 放 9· 理 提 O:\72\72279-911015.doc -2 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)