TW487576B - Method of attenuating virus by using brain membrane receptor preparation (MRP) - Google Patents

Description

487576 A 7 ____B7_ _ 五、發明説明（I ) 本發明的背景資料 發明的頜城 本發明關於病毒疫苗學，免疫學和蛋白化學領域。更專 一地，本發明關於一新式的病毒減毒方法。 相關技藝的描沭 疫苗接種是降低由感染性疾病造成人類死亡率和疾病 率的最好方法。疫苗對於根絕或控制世界上許多種主要感 染性疾病，如天花、黃熱病、脊髓灰質炎和麻疹有重大貢 獻。特別是可刺激不同宿主免疫反應武器的活減毒疫苗已 被成功硏發。這些活疫苗是源自於天然病毒，然後轉種在 不正常宿主而得到的變異種，如黃熱1 7 0病毒轉種在雞 組織（Monath，1 990 )。然而，此方法是憑經驗，花費昂 貴，且需長時間不可硏發出一投予人類的有效疫苗。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 除非病毒的接觸蛋白質可結合至細胞表面上做爲特殊 病毒接受體的分子，否則它無法感染一易感染細胞。接受 體在全宿主的專一細胞或組織上的表現，是主要決定病毒 進入宿主途徑，病毒在宿主擴散的型式和產生致病性的因 子(Marsh and Helenius,1989,Lentz,1989 ;Dimmock and Peimrose,1 995)。有許多因素決定病毒的宿主範圍和組織向 性，包括宿主細胞接受位置的本性、數目和分布，它可能 是多效價並且由許多接受體單位組成（PaulS0n，1 985 ;Mims， 1 986) 0 日本腦，炎（Japanese encephalitis，JE)是一種由日本腦炎 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS) A4規格（210X 297公釐） ^ 487576 A7 _____ B7 五、發明説明& ) 病毒所造成的疾病。此病毒是一種由蚊子傳播的黃病毒。 此疾病是流行於亞洲國家（Huang, 1 982 )並且是世界上最 普遍的流行性病毒腦炎。此病毒對於腦，特別是神經元具 有一組織向性。日本腦炎病毒屬於黃病毒科（Flavivindae )中的黃病毒屬（flavivirus) (Westaway et al.，1985)。病 毒基因組由一單股、正鏈RNA所構成，長度爲1 〇 9 8 6核苷酸，含有一長的開放讀錄，在5 /端編碼出3個結 構蛋白質[蛋白殻（capsid，C)，膜（membrane，Μ)和包膜（ envelope，Ε)蛋白質〕，3 >端編碼出7個非結構性蛋白 質（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A， N S 4 B和N S 5 )。此病毒造成的神經性疾病，其死亡 率達到5 0 %，並且7 0 %生存者會顯現出神經性損害。 沒有任何治療法可預防此疾病。因此，使用疫苗來控制此 疾病（1 )。由於病毒的神經向性和毒性潛能性轉換，因 此很困難去製造活減毒疫苗。目前，我們對於日本腦炎病 毒的減毒和毒力的分子基礎所知有限。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 先前技藝是缺乏有效的病毒減毒方法。本發明滿足此 長期等待的需要。 本發明的槪要 目前，我們對於日本腦炎（J E )病毒的減毒和毒力 的分子基礎並未完全了解。減毒和毒力已使用二個系統檢 • — —-—— 〜 ·. . 驗：/第—個系統是將野生型S A 1 4株轉種於初級倉鼠腎 臟細胞培_養基，以產生活減毒疫苗的減毒程序。S A 1 4 ...--------------------------------------* --..........- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）.g - 487576 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ 五、發明説明6 ) 基因組和它的四個疫苗衍生物不同於7個一般胺基酸（E 1 3 8 7 E - 176，E - 315，E- 439 ’ NS2B — 63 ，NS3 — 1〇5 和 NS4B — 1〇6) °第二個系統係進行野生型P 3株的分析，此株是目前被 確認最具毒力的菌株。比較P 3株和其他野生型株的基因 組發現1 6個單一胺基酸的確認，包括在包膜（E )蛋白 質上涉及P 3株毒力表現型的9個胺基酸。抗老鼠腦膜接 受體製劑變異種顯示·· E - 3 Q 6和E - 4 0 8參與接受 體結合。總括來說，到目前的硏究顯示：E蛋白質)是決定 老鼠減毒或日本腦炎病毒毒力表現型的關鍵因子。 我們選取三個日本腦炎病毒P 3株里異種以進行抗老 風月& 膜接受體製劑（membrane receptor preparation，MRP) 結合試驗。這些M R P R變異種與它們的母株病毒相比，其 於小鼠的神經元侵襲性減弱大於2 〇 〇倍，神經元毒力減 弱大於1 0 〇 〇倍。所有減毒老鼠腦M R P R變異種經過腦 內（intracerebrdUi.c·)或腹膜內（intraperitοneaί，i·p·)接種 小鼠後，可在小鼠血淸內複製，其中經由i · c ·接種， 我們可在小鼠腦部偵測到複製現象。在所有老鼠腦M R P R 變異種的包膜（E )蛋白質基因上，我們發現與生長於蚊 子C 6 - 3 6細胞的P 3病毒或純化並在猴子腎臟Vei*o細 胞繁殖的P 3病毒的E蛋白質相比，有二個一般胺基酸突 變’分別爲E — 3 6 0和E - 4 0 8殘基。這些胺基酸被 認爲由於改變了日本腦炎病毒結合至老鼠腦部上的細胞接 受體’而與減毒作用有關連。日本腦炎人類腦M R P R變異 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） • 6 - 576 ΑΊ B7 老鼠神經元毒力減弱 。同樣地，黃熱病猴子腦M R P R變 減弱8，〇 〇 〇倍，Langate病毒（ R變異種對小鼠神經元毒力減弱達到 發展的方法學已適用於病毒毒力的 具阻斷與細胞接受體交互作用的病 酸的試劑之用。 體實例，它提供一種篩選病毒疫苗 選無法與腦膜接受體製劑結合的病 :(a )製備一腦膜接受體製劑； 病毒和含有過量膜接受體的該膜接 毒一膜接受體製劑懸浮液；（c ) 上淸液；（d )測定存在該上淸液 (e )分離個別的抗膜接受體製劑 有效做爲病毒疫苗候選者。 進一步槪念，特徵和益.處，將在下 述。 \ 卜 b- \ h L η ί： i. t 土 五、發明説明g ) 種的產生，造成病毒對 5 ’〇〇〇，〇〇〇 倍 異種對小鼠神經元毒力 黃病毒）老鼠腦M R P 1 6 ，〇〇〇倍。此所 減毒作用，並且可確認 毒接觸蛋白 在本發 候選者的方 毒變異種， (b )混合 受體製劑， 離心該懸浮 的殘餘病毒 結合病毒變 其他關 列較佳的具 質上的胺基 明的一個具 法。它係篩 其步驟如下 一有興趣的 以形成一病 液以形成一 感染力；和 異種，此可 於本發明的 體實例中描 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖片的主要敘述 關於本發明以上所引述的特色、益處和目標以及其他 方面，都將淸楚在附加圖表中說明。這些圖片形成專利說 明書的一部分。然而必需注意，附加的圖片說明和本發明 的較佳具體實例並不因而限制它們的範圍。 第l·、圖顯示S A - 1 4衍生苗病毒的轉種經歷。 本纸張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X 297公t ) _Ί · 487576 經滴部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明) 第2圖顯示E蛋白質的外主轄區的構造模型（從1 7 修飾得來）。方格A :俯視。方格B :側視。 本發明的詳細描述 在本發明，一'種具局神經兀母力的頁病毒一日本腦炎 ，被做爲觀察病毒接觸蛋白質一細胞接受體交互作用的模 型系統。我們已建立一種新式篩選具病毒疫苗候選者潛力 的方法。 本發明的一個目標是篩選無法與老鼠腦膜接受體製劑 (M R P R )結合的日本腦炎病毒變異種。 本發明的另一目標是評估M R P R變異種在小鼠體內的 神經元毒力和神經元侵襲性的減毒作用。 本發明進一目標是分析負責M R P R變異種的毒力減毒 作用的基因突變。病毒接觸蛋白質上與細胞接受體結合的 胺基酸的確認是一種欲了解產生活減毒疫苗的途徑，並且 可做爲了解病毒的細胞/組織向性的分子基礎。 本發明關於篩選病毒疫苗候選者的方法，其係選取無 法與腦膜接受體製劑結合的病毒變異種，其包含步驟如下 :(a )製備一腦膜接受體製劑；（b )混合一有興趣的 病毒與含有過量膜接受體的該膜接受體製劑，以形成一病 毒一膜接受體製劑懸浮液；（c )離心該懸浮液以形成一 上淸液；（d )測定存在該上淸液的殘餘病毒感染力；和 (e )分離個別的抗膜接受體製劑結合病毒變異種，其可 有效做爲、病毒疫苗候選者。該腦膜較適宜選自老鼠腦膜和 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格UIOXM7公漦）.8 . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 487576 A7 _____ B7 五、發明説明) 人類腦膜構成的族群。當根據此所描述的方法製備，該腦 膜接受體製劑具有的蛋白質濃度約爲每m 1含2 0 - 4〇 m g濕的腦。對於日本腦炎病毒存在該上淸液的殘餘病毒 感染力的較佳測定法是：感染單層Vero細胞並計算產生的 溶菌斑。該個別的抗膜接受體製劑結合變異種溶菌斑分離 後，病毒最好被繁殖放大。將利用此所描述的方法所產生 的變異種與新鮮的腦膜接受體製劑反應，並且藉由變異種 缺乏與新鮮腦膜接受體製劑結合的能力確認這些變異種是_ 真的變異種。這些變異種最好是減弱神經元侵襲性和神經 元毒力。雖然本質上任何病毒都可使用本發明方法減毒， 代表性病毒包括黃熱病，登革一 4和1 a n g a t。 利用專利說明書所發表的技術，對於此方面具一般技 巧的人士皆可基於與接受體結合的病毒接觸蛋白質的三度 空間結構上負責細胞接受體位置的胺基酸確認，而設計抗 病毒化合物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印1i 利用專利說明說所發表的技術，對於此方面具一般技 巧的人士皆可使用一個組織產生一個M R P R變異種，然後 使用來自第二種組織的M R P R突變種進行接續的篩選以設 計接續的突變種。利用此方法，我們可設計對多重組織具 減毒的變異種，而此變異種是可期待的，因爲一些病毒在 不同組織顯現出疾病潛力。 下列實施例將說明本發明的各種具體實例，但並不意 謂將限制本發明。 -9 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487576 I I 正士修^ 曰 A7B7 mm 五、發明說明σ ) 實施例1 ： J E病毒毒力的分子決定素 正如大多數的病毒，日本腦炎病毒也具有株變種。P 3株被確認是一高毒性株，J a〇A r 9 8 2和Nakayama 株具中級毒力，而SA1 4具低毒力（第I表） 第I表 野生型J E病毒株經由不同涂徑接種斷乳小鼠的毒力比較 致死率 病毒 腦內 P3 0.0001 Nakayama 0.1 JaOArS982 0.1 SA14/USA 2 NT:未檢測

P

L D 鼻內 NT 800 NT >5,000,000 腹膜內 50 10,000 3,000,000 >5,000,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例2:包膜蛋白質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 E蛋白質是病毒的主要構造蛋白質，並且被認爲編碼 病毒接觸蛋白質，即與細胞接受體交互作用的病毒蛋白質 。因爲SA 1 4疫苗中，7個胺基酸取代反應中的4個是 在E蛋白質，因此減毒作用有部分可能是由於改變疫苗的 細胞向性。此推論可由免疫組織化學硏究獲得支持。利用 免疫組織化學法我們發現：在小鼠腦部有非常少數的神經 元含有SA 1 4 — 1 4 一 2病毒抗原，並且經過野生型母 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 487576 Α7 Β7 五、發明説明) 株s A 1 4 ( 9 )感染後，並無顯示任何細胞病理特徵。 以抗日本腦炎病毒單株抗體抗中和反應（M A b R ) 變異種做的硏究顯示：在E — 5 2 + E - 3 6 4 + E -367 (10)或 E — 270 或 E-333 (11)的突 變都減弱對小鼠神經元侵襲性，但在神經元毒力方面則無 減弱情形。對於其他黃病毒的抗單株抗體中和反應變異種 的實驗發現：下列病毒突變種具有減弱的神經元侵襲性（ 但在神經元毒力則無減弱）一如墨累山谷腦炎病毒（Murr ay

Valley encephalitis virus)(12)的 E — 2 7 7 ，跳躍病病毒（ louping ill virus ) (π)的E- 3 0 8 (相同於日本腦炎病毒 的E — 3 0 5 )和中歐壁1¾傳播腦炎（central European tick-borne encephalitis-CE TBE)病毒（1 4 )的 E — 3 8 4 (相同於日本腦炎病毒的E - 3 8 4 )。其他二個 涉及日本腦炎病毒突變作用的硏究顯示：E — 1 3 8減弱 對老鼠神經元毒力，並且涉及與S A 1 4系列疫苗的E — 1 3 8相同的取代反應（即以G 1 u取代L y s ) (15 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ，1 6 )。 爲了更詳細說明日本腦炎病毒與老鼠腦部的交互作用 ，我們使用標準藥理學技術從老扇脑部製備膜受體。老鼠 腦膜接受體製劑已被用做製造抗老鼠腦膜受體製劑結合變 異種（M R P R )。從P 3株所產生的三個抗老鼠腦膜接受 體製劑結合變異種，並不會結合至新鮮的老鼠腦部 M R P，_•並且對老鼠神經元侵襲性和神經元毒力都減弱（ -11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 487576 A7 B7 五、發明説明自) 第1 I表）。所有三個變種都在E 一 306和E408發 生胺基酸取代。對於P 3株來說’這二個殘基都是唯一的 ，並且在其他日本腦炎病毒株發現，M R P R突變種誘發殘 基的逆轉。 第I I表 母株J E p 3病毒和老鼠腦：M R p R變異種經過腦 或腹膜內接種對老鼠的神經元毒力_ 病毒 接種途徑 腹膜內 腦內 pfu/LDso p f u / L D 5 〇 AST+SEM 母株 P3 50 <0.0001 6.5± 0.3 老鼠 MRPRI >50,000 5 · 6 8.0土 1.2 腦 MRPrII >50,000 0.8 8.0± 1.2 變異種 MRPrIII >50,000 10.0 8 · 6 ± 1.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 #AST± SEM:平均存活時間土 SEM，其計算係來自老鼠經 i · c ·途徑接種1 0 ρ i u病毒 實施例3 ··病毒和細胞 野生型日本腦炎病毒株Ρ 3病毒係由Yale Arbovirus Research Unit 的 Robert Shope 博士提供。猴子腎臟（Vero) 細胞和白斑蚊（Aedes albopictus ) C 6 — 3 6細胞係分別 生長於3 7 °C和2 8 °C的添加1 〇 %加熱減活的胎牛血淸 (fetal e'alf serum,FCS ;Sigma ) ，穀醯胺（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-12 4 .16 487576 A7 B7 皆犟 、發明説明（1〇 ) jjigma)和抗生素的Eagle’s最低需求培養基（Eagle’s minimal essential medium,EMEM;Sigma)。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例4 =老鼠腦部膜接受霞_的製備 老鼠腦係收集自中3 - 4週大的雌性balb/ C小鼠。老 鼠膜接受體製劑（membrane receptor preparations，MRPs) 的製備法係根據做爲神經傳導物接受體結合試驗所使用的 方法（Middlemiss and Frozard，1 983 )。其主要步驟爲將 腦部快速切開，稱重並在Tns緩衝液（5 0 m Μ，p Η 7 · 6 )中均質。將均質物離心（3 5 · 6〇0 g，1 0 分鐘），再把沈澱小塊懸浮於相同體積的Tns緩衝液，然後 重覆此程序兩次。再第二和第三次離心之間，將均質物置於 37°C反應10分鐘。把最終的沈澱小塊懸浮於Tris緩衝液（ 5〇m Μ，p Η 7 · 6 )使最終的蛋白質濃度約爲2 0 — 4 0 m g濕的腦部/m 1 ，並貯藏於一 7 0 t。 實施例5 :老鼠腦部M R P逃避（M R P R )變異種病毒的 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 製造 將分裝的冷凍膜接受體製劑和病毒從- 7 0 °C冰箱拿 出，並快速於3 7 °C解凍並保存在冰上（4 °C )。將 1〇0 m 1病毒加至9 0 0 v 1含有過量膜接受體的老鼠 腦膜接受體製劑，並混合。控制組病毒樣品也以相同方式 製備，但是是與900// 1 ，Tds緩衝液（5 0 m Μ，Tns ，ρ Η 7· · · 6 )混合，而非膜接受體製劑。將樣品置於3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297^^1 ΓΪΤΊ " "" ' 487576 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（11 ) 7 °c振盪反應3 0分鐘。然後把病毒一膜接受體製劑懸浮 液和控制組病毒一 Tds緩衝液樣品於1 3，0 〇 0 r · p m離 心1 0分鐘，以去除膜物質和結合的病毒。存在於上淸液 的殘餘病毒的感染力測試係將其感染單層V e r 〇細胞’ 於 3 7 °C反應5天後，計算產生的溶菌斑。將個別的M R P R 變異種溶菌斑挑起，並於V e r 〇細胞繁殖。將產生的病 毒變異種與新鮮膜接受體製劑進行結合試驗。這些病毒變 異種缺少與新鮮老鼠腦膜接受體製劑結合的能力，因此確 認它們是真的M R P R變異種。 ΚΜΜΛ^:老鼠致病性硏究 3 — 4週大的NIH — Swiss雌性異系交配白鼠係購自 Hadan Indianapolis，IN。將老鼠經由腦內途徑接種2 0 A 1病毒或經腹膜內（i · p ·)途徑接種1 〇 〇 // 1病 毒’每個劑量組含有8隻老鼠。毒力硏究係測量L D 5 〇和 平均存活時間（a v e r a g e s u 1· v i v a 1 t i m e，A S T )。感染力試驗 則在1 · c ·或i · p ·接種後2或7天，將老鼠犧牲， 然後將腦和血淸取出進行溶菌斑試驗，以了解其感染力。 實施例7 :免疫原性硏究 3 - 4週大的N I Η — S w i s s雌性異系交配白鼠係購自 Harlan，Indianapolis，IN。每一種MR P & 變異種病毒經由 1 · P .··途徑接種在四隻小鼠身上，其劑量爲1 〇 3 p f u 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公楚） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

487576 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 病毒。接種後1 5天將老鼠犧牲，經由心臟採血方式收集 血液。收集血淸部分並貯存在- 2 Ο T：。中和反應試驗則 依照Wilis等人所述的方法（1 9 9 2 )。 貫施例8 ·病母R N A基因組的定序和分析 RT - P CR，選殖和病毒RNA的定序如前述（ Nietal · ，1 9 9 4 )。核酸資料的電腦分析和推測的胺基 酸序列的完成係使用MICR〇GENIE(Queen and korn，1 984) PCGENE和 Genetic Computer Group (Devereux et al·，1984) 〇 實施例9 : M R P R變異種的產生和確認 將生長於c 6 - 3 6細胞的日本腦炎病毒P 3株（ P 3 / C 6 — 3 6 )與老鼠腦，猴子腦或猴子肝臟膜接受 體製劑，於3 7 °C反應3 0分鐘，並依照上述方法離心、 計算上淸液產生的溶菌斑日本腦炎P 3病毒結合至老鼠腦 膜和猴子膜接受體製劑，並不結合至猴子肝臟膜接受體製 劑（第I V表。P 3 / C 6 — 3 6病毒完全結合至猴子膜 接受體製劑。爲了篩選抗老鼠腦膜接受體製劑（M R P R ) 變異種，將P 3 / C 6 - 3 6病毒與過量的老鼠腦膜接受 體製劑相混合，可使其感染力降低1 0 3 · 6 (第V表）。 我們選取三個逃避與老鼠腦膜接受體製劑結合的P 3病毒 溶菌斑，並在V e r 〇細胞繁殖。 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格U10X 297公釐）.15- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

487576 Α7 Β7 _ 五、發明説明（13 ) 第I I I表 Ρ 3病毒與老鼠腦、猴子腦和猴子肝臟膜接受體製劑的結 合 試 驗 感染力 結合 結合率 Log i〇pfu 指數 (%) 緩 衝 液 6.1 老 鼠 腦 MRP 2.5 3.6 99.97 猴 子 腦 MRP >1.0 >5.1 >99.99 猴 子 肝 臟MRP 6.0 0.1 8.33 # 感 染 力： 經 過病毒與 Μ R P 或緩衝液反應 ，形成病毒 Μ R Ρ 複合物 沈澱小塊 之 外 ， 存在於上淸液的感染病毒。 結 合 指 數： 於 緩衝液的 1 〇 S 1 〇感染力。 經 過溶 菌 斑純化反 應 和 在 V e I· 〇細胞繁殖，三個 Μ R Ρ R變異種都無法結合至; 訴鮮的老鼠腦膜 :接受體製劑 第 V 表 )， 此 更確認了 它 們 是 真的M R P R變 丨異種。同時 我 們 也 將使 用 做爲產生 Μ R P R變異種的P 3 / C 6 — 3 病 毒 的 溶菌 斑 純化並在 V e r 〇細胞中繁殖 ，以測定 (請先閲讀背面之注意事項 4 項再填- 裝— :寫本頁} 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ V e r 〇細胞轉種對P 3病毒表現型的影響。此P 3 / V e r 〇病毒結合至老鼠腦膜接受體製劑的模式相似於 P3/C6 - 36病毒（第V表）。 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（21〇x 297公釐）-16 - 487576 A7 B7 五、發明説明（/V) 第IV表 P3病毒老鼠腦部M R P R變異種無法結合至老鼠腦膜接受體 製劑（M R P )的確認 病毒株 感染力（Logiopfu)_結合指數結合率（％)

病毒病毒 緩衝液 MB MRP (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ΝΑ:不適合 MB MR:老鼠腦膜接受體製劑 結合指數 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 母株 P3/C6-36 6.1 2.5 3.6 99.97 P3/Vero 7.3 3.6 3.7 99.98 P3老鼠腦 MRPrI 5.6 6.0 -0.4 ΝΑ 變異種 MRPrII 6.0 6.6 -0.6 ΝΑ MRPrIII 6.7 7.3 -0.6 ΝΑ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）- / 7 - 487576 A7 __ 五、發明説明（15 ) 實施例1 0:野生型〗E病毒P3株和其變異種的致病性^ 將異系交配的NIH— Swiss小鼠以i · c ·或i · Ρ方 式接種母株的P3/C6-36或P3/Ve r 〇病毒’ 或其中一種的M R P R變異種。測定其p f u / L D 5 〇値 和ASTC土SEM。比較母株卩3/〇6—36和？3 / V e !· 〇病毒的結果發現：將溶菌斑純化並在V e τ 〇 細胞繁殖對於P 3病毒的毒力僅有一點點影響，即經由i • c ·或i · p ·接種（第V表），我們計算得到的二者 LD5Q並無明顯差異，即使P3/Ve r 〇病毒的毒力較 P 3 / C 6 - 3 6病毒爲低。我們比較經由i · P ·接種 途徑，三個老鼠腦M R P R變異種與母株P 3病毒相比’其 被病毒至少2 0 0倍（即神經元侵襲性）（第V I表）° 而且，經由i · c ·接種小鼠，所有三個老鼠腦M R P R變 異種與其母株病毒相比，其神經元毒力至少被減弱5〇0 倍（第I I表）。感染老鼠腦M R P R變異種的小鼠平均存 活時間也較感染母株P 3病毒的小鼠爲長（第V I I表） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經滴部中央標準局負工消費合作社印¾ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公釐） -18 - 487576 A7 B7 五、發明説明（/厶） 第V表 母株J E P3 / C 6 — 3 6或P 3 / Vero病毒和老鼠t M R P R變異種經由腦內或腹膜內接種法對老鼠的 Λ. f請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} •裝· -訂 經滴部中央標準局員工消費合作社印製 病毒 接種途徑 腹膜內 腦內 pf u/LD5〇 pf u/LDso AST土 SEM 母株 P3/C6-36 50 <0.0001 6·5 ± 0.3 P3/Vero 280 0.0004 6·0± 0.3 老鼠腦 MRPrI >50,000 5.6 8·0± 1.2 變異種 MRPrII >50,000 0.8 0.8 ± 0 · 6 MRPrIII >50,000 10.0 8·6± 1·〇 # * A S T 土 s E M ··平均存活時間土平均値的標準誤差 ，其計算値是來自經i · c •途徑接種1 0 P f U病毒的 小鼠 *: M R P R I /老鼠腦 :M R P R :病毒感染的老鼠腦 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 487576 A7 B7五、發明説明（7 )第V I表J E病毒母株P 3和其M R P R變異種經由i · c ·或 1 · P ·接種其病毒感染力_ _ 接種 i. c. i.P Day2 Day7 Day2 Day7 月撞 血淸 月撞 血淸 腦 血淸 腦 血淸 母株 P3/C6-36 6·4±0.2* 4·0±0.3 NA# ΝΑ <2.0 6.1土 0.9 3.4土 0.2 2.8土 1.0 P3/Vero 5.8±0.2 2.9±0.2 ΝΑ ΝΑ <2.0 5.6土 0.5 2.9土 0.5 2.2土 0.1 變異種 MRPkI 4.2±0·5 2.0土0.7 2.7土0.9 2.0 <2.0 3.0土 0.4 <2.0 2.0 土 0.3 MRPKII 4·6±0.4 <2.0 3.1土0.3 <2.0 <2.0 4.6± 0.5 <2.0 2.1土 0.6 RPHIII 4·7±0.1 2.0土0.7 3.0±0.6 <2.0 <2.0 2.9 ± 0.3 <2_0 <2.0 #N A :由於小鼠因感染死亡而無法獲得數據*感染力以log pfu/ml(平均値土 S.E.M.)表示，每一樣品組有3隻小鼠 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. "口 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487576 A7 B7 五、發明説明（Μ) 第VII表 由逃避的老鼠gl-M R p R病毒變異種引起的中和反應抗體效 價 中和反應 抗體效價 nirpri 320 160 160 40 MRPrII 320 160 160 160 MRP_III >320 320 160 160 中和反應效價：取血淸的最高倍稀釋以中和5〇%同質均撃病 毒。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 血 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 準 標 一家 |國 國 I中 用 一適一从一说 I本

S N C

格 I規 4 A X ο Ι- ΙΑ 487576 A7 B7 五、發明説明（19 ) t施J 1 1 : M R P R變異種經由1 •和i ϋ .涂徑 撞A的感染力測定 老鼠經i · c ·接種1 p f u病毒或經i · p ·接種 1〇0 0 p f U病毒後的第2天和第7天被犧牲、，以測定 是否M R P R變異種可在老鼠血液中和腦部複製。所有三個 老鼠腦M R P R變異種可在感染的老鼠體內複製（第 V I I I表），M R P R變異種經由i · c ·接種後的第2 天，其在腦部和血淸中的感染力低於它的母株病毒。然而 ’所有經i · c ·途徑接種母株P 3病毒的小鼠’在感染 後第7天都死亡。在i · p ·接種後第2和第7天’ M R P R變異種在血淸的感染力明顯低於其母株病毒。 (請先閱讀背面之注意事項苒填寫本頁) !裝· 、11 經漪部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇Χ 297公楚）-22 - 487576 A7 B7 五、發明説明（^ ) 第V I I I表

P 3 / C 6 — 3 6或P 3 / v e !· 0和老鼠腦M R P R變異 種的E蛋白質序列的胺基酸改變的比較 位置 P^/Cl-3 6 P3/Vero MRPr突變種 E-46 T I T E-1 29 A T T E-209 R K K E-306 G G E E-351 A V V E-387 E G G E-408 L L S E-475 A A A (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1¾487576 A7 B7 :音 」上本頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 畔、發明説明幻） kMMl 2 · M R P R變異種的免疫原性 N I Η — Swiss小鼠以老鼠腦M R P R變異種接種’在1 P ·接種後的1 5天.，所有感染的小鼠體內都會被誘發中和性抗 體（第V I I表）。 實施例1 3 :老鼠和人腦M R P R變異種，野生型母株_ P ： ，病毒和P 3溶菌斑純化並於V e r 〇細胞繁殖的病毒的 薇_脊酸和胺基酸序列變化的比較 爲了觀察母株P 3病毒和其M R P R變異種的遺傳性差 異和接受體接觸主轄區，我們將P 3病毒和M R P R變異種 的前膜（pre-membxrane，prM )，膜（memb\rane，M )和包膜 (£1^61〇?6，£)蛋白質基因選殖並定序。？3/又6 1*0病毒 與P 3/C6 — 3 6病毒相比較，在p rM，Μ和E蛋白 質基因上有1 3個核苷酸不同（資料未顯示），造成在Ε —46 ，Ε — 129 ，Ε-20 9 ，Ε — 351 和 Ε — 3 8 7 5個胺基酸位置改變（第V I I I表），此可能 是造成P3/Ve I· 〇病毒比P3/C6 — 36病毒有減 弱毒力的原因。這些胺基酸改變並不認爲是造成M R P R變 異種病毒減毒的原因。 這三個老鼠腦M R P R變異種在p r Μ，Μ和E蛋白質 基因上都有相同的核苷酸序列。它們與Ρ 3 / C 6 — 3 6 病毒相比，有2 3個核苷酸序列不同；與Ρ 3 / V e r 〇 病毒相比，有2 0個核苷酸序列不同（資料未顯示）。然 而，這些老鼠腦M R P R變異種與母株P 3 / C 6 - 3 6和 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ~〇4 - ' —1 —ΊΤ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. -口 487576 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明k ) P 3 / v e r 〇病毒相比，只有二個胺基酸序列改變，爲 E — 3〇6 (G— E)和 E — 4 0 8 (L— S)殘基（第 v 1 I I 表）。 亶..施麗1 4 : E蛋白質二級結構分析 我們利用在PC GENE的Novotny和GGBS Μ程式分析母株 和MRPR變異種的Ε蛋白質中環繞Ε — 3 0 6和Ε — 4〇8區域的二級結構。Novotny程式顯示：當E — 3 0 6 殘基由甘胺酸突變成榖胺酸時，帶電荷殘基輪廓、α螺旋 傾向、Θ薄板傾向和反轉傾向改變；當Ε — 4 0 8殘基由 絲胺基取代亮胺酸時，忌水性輪廓、α螺旋傾向、/3薄板 傾向和反轉傾向改變。GGBSM程式顯示：當殘基Ε — 3 0 6 (G— Ε)或E — 408 (L— S)改變時，卷曲（ coil)、延伸和螺旋輪廓皆改變（資料未顯示）。 病毒結合至宿主細胞表面接受體是病毒複製循環的第 一步，並且直接參與許多病毒的組織向性和致病性（Fields & Greene ,1 982 )。雖然它們扮演極重要角色，但對與病毒 結合的宿主細胞接受體的功能和確認卻所知不多。雖然黃 病毒的E蛋白質被認爲參與病毒結合至細胞接受體，而在 細胞向性上扮演一重要角色，但對於黃病毒而言，並沒有 任何細胞接受體已被確認。目前，C h e η等人發現：表現的 登革一 2病毒的Ε蛋白質可結合至Ve r 〇 ，CHO，內 皮和膠質細胞。重組型E蛋白質可抑制登革病毒感染 V e r 〇 ·細胞。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •I裝' ,ιτ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -25- 487576 Α7 Β7 經漓部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明) 在活體進行與病毒結合的細胞接受體觀察實驗是困難 的。因爲動物組織的操作和無法對大部份病毒純化至足夠 量的病毒去進行物理結合試驗。本發明提供一種選取變異 種的程序，它係藉由選擇無法結合至膜接受體製劑（ M R P s )的病毒而產生（第I I和I I I表）。我們利 用曰本腦炎病毒結合至老鼠腦部M R P s爲模型進行實驗 。利用日本腦炎病毒無法結合至猴肝臟M R Ρ的能力（第 I I表）和老鼠腦變異種無法結合至新鮮老鼠腦M R Ρ的 結果顯示此程序的專一性。所有三種老鼠腦M R P R變異種 與野生型母株P 3病毒相比較，在神經元侵襲性和神經元 毒力二者都明顯減弱（第I V表）。此顯示M R P R變異種 的篩選可做爲一種產生疫苗候選者的新式方法。 病毒製劑在其接受體接觸主轄區發生突變（以黃病毒 爲例即在E蛋白質）後，經過變異種的篩選，我們可得到 神經元毒力減毒的日本腦炎P 3株老鼠腦M R P R變異種。 此種變異種在組織向性已改變。只有在殘基E - 3 0 6和 E - 4 0 8位置的二個一般胺基酸取代被確認（第V I I 表）。這二個取代明顯改變E蛋白質的二級結構。因此，’ 這二個胺基酸在老鼠腦M R P R變異種的減毒作用扮演一重 要角色。 E - 3 0 6參與減毒表現型的結果是與對黃病毒的先 前硏究得到的結果一致，並且藉由使用M R P以產生減毒 病毒變異種確認。野生型日本腦炎病毒的其他四種減毒衍 生物已被報導。二個實驗群報導抗單株抗體中和反應變異 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 9. 、-口 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） .26 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487576 A7 ______ B7 ____ 五、發明説明$4 ) ： 種（MAbR)的突變位置在e — 2 7 0和E - 3 3 3或E —52 ’ E — 3 6 3和E — 3 6 6。所有這些變異種有降 低的老鼠神經元侵襲力，但神經元毒力則無降低。源自 S A 1 4病毒的活疫苗系列，在E蛋白質有4個胺基酸取 代，分別爲 E — 138，E— 176，E — 315 和 E — 4 3 5。這些疫苗對老鼠神經元毒力和人類神經元侵襲力 二者都減毒。Samiyoshi等人（15)曾建議在E — 1 3 8的突 變是對老鼠神經元毒力減毒作用的主要決定因子。 將以上突變種以及本發明的老鼠M R P R變異種的胺基 酸取代周詳標示於壁蝨傳播腦炎病毒（tick-born encephalitis，TBE)( —種與日本腦炎病毒相關的黃病毒）的一 E蛋白質三度空間結構假設模型（Rey et ai.，l 995 )，我們 發現許多突變是聚集在E蛋白質的第三主轄區，顯示第三 主轄區對病毒毒力是重要的，可能是做爲與老鼠細胞接受 體。接觸的病毒接觸主轄區。此一結果與R e y等人（ 1 9 9 5 )的假設一致，並且其他黃病毒的硏究也支持此 一觀點。對於跳躍病病毒的M A b R變異種（E - 3 0 8， E-310 和 E — 311; Jiang等人· ，1 9 9 3 ;

Gao等人，1994) ，TBE病毒的MAbR變異種（ E - 387)和登革病毒的MAbR變異種（E - 383 ’ E — 38 4 和 E-385 ; Hiramatsu等人· ，1 9 9 6 ; E — 3 9 0 ’Sanchez等人，1 9 9 6 )所有的變異種對於 老鼠神經元毒力都是減毒，並且這些突變都位於E蛋白質 的第三主·轄區。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） .27 - --.----··--丨 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 487576 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明扛） M R P變異種的殘基E — 4 0 8胺基酸取代是位於黃 病毒Ε蛋白質的幹區域，此區域連接外主轄區至膜固著區 域。膜轉移α -螺旋幹區域最近被假設做爲Ε蛋白質在低 pH値誘導的寡染色組重排的重要元素。Ε — 408取代 改變α螺旋和病毒誘發的膜融合。 第I I表顯示老鼠腦M R P R變異種與它們的的母株相 比，其神經元侵襲力更減弱。M R P R變異種在經過1 . p •途徑接種後的第2和第7天，可在血淸中發現，但在腦 中並無發現，顯示P 3病毒變異種可在血管中複製，但無 法穿透血腦障壁。老鼠腦M R P R變異種的神經元侵襲力的 減毒機制需要進一步探索觀察。 本發明顯示日本腦炎病毒老鼠腦M R P R相當容易從接 種在含有過量M R P的母株病毒的活體外試驗中篩選得到 。篩選得到的病毒M R P R變異種在老鼠身上有一減毒的表 現型。本發明建議，從病毒之標的組織篩選M R P R變異種 是一種製造減毒病毒株的有潛力途徑，並且可想像地，連 續從不同組織使用M R P s可篩選製造具多重突變的減毒 變異種。因此，本發明提供一種相當便宜且快速篩選病毒 _ I I ----一一*»—·.·**··* · ^ ^ ,.r.^ .. -----·" ·'·' - **' .... 疫苗候選者的新式方法Λ ___________________— ——一一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210乂29*7公釐） -28- 487576 A7 B7 五、發明説明（>^) 第I X表 黃熱病病毒和Langat病毒的膜接受體變異種 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 病毒 株 MRP$ 致死性 黃熱病 FNV - 0.08 MK-I >1 00 MK-II >100 MK-IV 80 Langat TP21 - 1.3 HU-1 16 MS,pH7.0 16,000 MS-II <1000 MS-I 2000 HU-ΜΙ 126 # : 3 - 4週大小鼠經過腦內接種後的致死性。數字是 p f u/LDso $ : M R P = membrane receptor preparation,膜接受體 製劑， Μ K :猴腦，M S :老鼠腦，H U :人腦。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ 487576 A7 _B7_ 五、發明説明（V) : 第X表 牛長於C 6 — 3 6或v e r 〇細胞的母株J E P 3病毒和 它的逃避老鼠和人腦膜接受體製劑（M R P R )變異種經由 腦內和腹膜內接種小鼠後的神經元毒力 病毒 接種途徑 ip pfu/LD50 i c pfu/LD50 A S T 土 S E M# 母株 C6-36 50 <0.1 6.5 土 0.3 Ve ro 280 0.0004 6.0土 0.3 老鼠 MRPrI >50,000 5.6 8.0 土 1.2 腦 MRPrI I >50,000 0.8 8.0 土 0.6 變異種 MRPrI II >50,000 10.0 8.6 土 1.0 HBG1 MRPrI >5,000 >100,000 >14 變異種 MRPrI I >5,000 >100,000 >14 HBW2 MRPrI >5,000 >100,000 >14 變異種 1 :HBG: :人腦灰質，2 :人腦白質； #: AST 土 SEM:平均存活時間土平均値的標準誤差其計算値 係來自經i.c.途徑接種10pfu病毒的小鼠；*M R P R I /老 鼠腦。從感染M R P R I病毒的老鼠腦回數的病毒； i · c · : i n t r. a c e r e b r a I ·腦內；i · p : i n t r a p e r i t ο n e a I，腹 膜內 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X；297公釐） 裝 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 487576 ΑΊ _______Β7 五、發明説明紅） ^~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第X表顯示本發明方法並不限於老鼠腦M R p S使用 人腦M R P s所產生的M R P R s，其對於老鼠神經元毒 力減母達5 ’ 0〇0 ’ 〇〇〇，〇〇〇倍。而且，本方法 並不限於日本腦炎病毒。黃熱病病毒的猴腦MR p R變異 種經過腦內接種年幼小鼠後，對於老鼠神經元毒力見減毒 作用；

Langat病毒的老鼠腦和人腦M R P R變異種經過腦內接種年 幼小鼠後’對於小鼠神經兀毒力具減毒作用。 以下參考資料爲本文所引述：

Anderson，R·，King，A.D. and Innis，B丄· 1992. Correlation of E proteins binding with cell susceptibility to dengue 4 virus infection. JL Gen. Virol. 73: 2155-2159·

Cao, J.X·，Ni，H·，Sil，B.K·，Ryman，K.D·，and Barrett，A.D.T· 1995· Passage of Japanese encephalitis virus in HeLa cells results in mutations in the structural protein genes and attenuation of virulence in mice. J. Gen. Virol. 76: 2757-2764. 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487576 A7 B7 _ 五、發明説明)

Cecilia, D. & Gould, E. A. 1991. Nucleotide changes responsible

I for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants. Virology 181: 70-77.

Chen, Y., Maguire, T. and Marks, R. M. 1996. Demonstration of binding of dengue virus envelope protein to target cells. J. Virol. 70: :8765-8772·

Devereux J., Haeberli, P., and Smithies, O. 1984. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucl. Acid. Res. 12: 387-395·

Fields, B.N. and Greene, M.I. 1982. Genetic and molecular mechanisms of viral pathogenesis: implications for prevention and treatment. Nature 300: 19-23.

Gao, G.F., Hussain, M.H., Reid, H.W., and Gould, E.A. 1994. :Identification of naturally occurring monoclonal antibody escape variants of louping ill virus. J. Gen. Virol· 75, 609-614.

Guirakhoo, F., Heinz, F.X., Mandl, C.W., Holzmann, H. & Kunz, C. 1991. Fusion activity of flaviviruses: comparison of mature and immature (prM-containing) tick-borne encephalitis virions. J. Gen. Virol· 72: 1323-1329. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Heinz, F.X., Auer, G., Stiasny, K., Holzmann, H., Mandl, C. Guirakhoo, F·，and Kunz, C. 1994. The interactions of the flavivirus envelope proteins: implications for virus entry and release. Arch. Virol· 9: 339-348.

Hiramatsu, K·，Tadano, M., Men, R. and Lai, C.J. 1996. Mutation analysis of a neutrolization epitope on the dengue type 2 virus 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 32 · 487576 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（30 ) ' envelope protein; Monoclonal antibody resistant DEN2/DEN4 chimeraes exhibit reduced mouse neurovirulence. Virology 224: 437-445. Huang C.H. 1982. Studies of Japanese encephalitis in China. Adv· Virol· Res· 27: 71-101· Ikmura, T. and Ohyama, A. 1988. Association between the pH-dependent conformational change of West Nile flavivirus E protein and virus-mediated membrane fusion. J. Gen. Virol· 69: 1247-1254. Jiang, W.R., Lowe, A., Higgs, S., Reid, H., and Gould E.A. 1993. Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistance mutatants with reduced neurovirolence. J· Gen· Virol· 74, 931-935. Lentz, T. L. 1990. The recognition event between virus and host cell receptor: a target for antiviral agents. J. Gen. Virol· 71: 751-766. Middlemiss, D.N. and Frozard, J.R. 1983. 80 HDPAT discrimination between subtypes of 5-HTj recognition site. Euro. J. Pharmacol. 90: 151-153. Mims, C.A. 1986. Virus receptors and cells tropism. J. Infect· 12: 199-203· Monath, T.P. Ballinger, M.E., Miller, B.R. and Salaun, JJ. 1989. Detection of yellow fever viral RNA by nucleic acid hybridisation and viral antigen by immunochestry in fixed human liver. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 40: 663-668. Monath, T. P. 1990. Flavivirus. p. 763-814. in t,Virologyn. B.N. Fields, D.M. Knipe, et al, eds. Raven press New York, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -33- 487576 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_____五、發明説明) Ni, H., Bums, N. J., Chang, G. J., Zhang, M. J., Wills. M. R., Trent, D. W·，Sanders, P. G. and Barrett, A. D. T. 1994. Comparison of nucleotide and deduced amino acid sequence of the 5’ non-coding region and structural protein genes of the wild-type Japanese encephalitis virus strain SA14 and its attenuated vaccine derivatives. J. Gen. Virol· 75: I 1505-1510. Olmsted, R.A., Baric, R.S., Sawyer, B.A. and Johnston, R.E. 1984. j Sindbis virus mutants selected for rapid Growth in cell culture display attenuated virulence in animals. Science 225: 424-426. Paulson, J.C. 1985. Interaction of animal viruses with cell surface receptors. Vol. 2，p. 131-219. In: The receptors, Edited by Conn, P.M. Orlando: Academic Press. Rey，F.A., Heinz, F.X·，Mandl，C·，Kunz，C & Harrison，S.C. 1995. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature 375: 291-298. Sanchez I. J·，& Ruiz B. H. 1996. A single nucleotide change in the E protein of dengue 2 Mexican strain affects neurovirulence in mice. J. Gen. Virol· 77: 2541-2545· Stiasny, K. Allison, S.L., Marchler-Bauer, A., Kunz, C. and Heinz F.X. 1996. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the E protein glycoprotein of tick-borne encephalitis virus. J. Virol· 70: 8142-8147. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H. & Trent, D. W. 1992. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro cDNA templates. J. Virol. 66: 5425-5431. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X^97公釐） _ 34 - 487576 A7 B7 五、發明説明丨v) Westway, E. G., Brinton, M. A., Gaidamovich, S. Y., Horzinek, M. C., Igarashi, A., Kaarianen, L., Lvov, D. K., Portfield, J. S., Russell, P. K. and Trent, D. W. (1985). Flaviviradae. Intervirology 24: 183-192. Wills, M. R., Sil, B. K., Cao, J. X. and Barrett, A. D. T. 1992. Antigenic characterization of the live attenuated Japanese encephalitis vaccine virus SA14-14-2: a comparison with isolates of virus covering a wild geographic area. Vaccine 10: 861-872 Yu, Y. X., Wu, P. F., Ao, J., Liu L. H. and Li Η. M. 1981. Selection of a better immunogenic and highly attenuated live vaccine virus strain of Japanese Encephalitis. I. Some biological characteristics of SA14-14-2 mutant. Chinese J. Microbiol. Immunol. 1: 77-84 Yu, Y. X., Zhang, G. M., G., Y. P., Ao, J. and Li Η. M. 1988. Safety of a live attenuated Japanese Encephalitis virus vaccine (SA14-14-2) for children. Am. J. Trop. Med, Hvg. 39: 214-217 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）. 487576 B7 五、發明説明幻） ' 下列被引述的文章請參考其編號。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1. Tsai TF, Yu YX. Japanese encephalitis vaccines. In: Plotkin SA, Mortimer EA Jr, eds. Vaccines. 2nd ed. Philadelphia: WB Saunders, 1995: 671-713 2. Ni et aL, J Gen Virol 1996;77:1449-1455. 3. Eckels et 2l\.,Vaccine 1988;6:513-518 4. Aihara et al.,Virus Genes 1991; 5:95-109. 5. Nitayaphan et ^Virology 1990; 177: 541-552. 6. Ni et al., J Gen Virol 1994;75:1505-1510. 7. Ni et al., J Gen Virol 1995;76:409-413. 8. Chen et alM Am J Trop Med Hyg 1982;31:403407. 9. Hase et al., Arch Virol 1993;130:131-143. 10. Hasegawa et zX.yirology 1992; 191:158-165. ：11. Cecilia et dl^Virolo-y 1991; 181:70-77. ;12. McMinn et al., Virology 1995; 211:10-20. 13. Jiang et al., J Gen Virol 1993;74:931-935. 14. Holzmann et al., J Virol 1990;64:5156-5159. 15. Sumiyoshi et al., J Inf Dis 1995; 171:1144-51. 16. Chen et al., Virology 1996; 223: 79-88. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 17. Rey et al., Nature 1995;375:291-298. 18. Jan et al., J Gen Virol 1995;76:573-580. 19. Falgout et alM JVirol 1993; 67:2034-2042. 20. Wallner et al., J Gen Virol 1996;77:1035-1042. 本紙浪尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） -$厶- 487576 A7 ______B7 五、發明説明ί 3〇 本專利說明書所提及的任何專利或文章都是熟於本發 明技藝人士的指引。這些專利和文章都列爲本文之參考資 料。 熟於本技藝的人士將讚賞本發明十分盡心去實現以上 所提及的目標並得到其成果和益處。本實施例伴隨的方法 、程序、處理、分子和此所描述的專一性化合物是目前較 佳的具體實例代表，它們並不因此而限制本發明範圍。熟 於此技藝人士所做的改變和其他應用都將包含在本申請專 利範圍所定義的精神之內。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）-37 ·

Claims (1)

1. 487576 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 修正^ 日觀1 公 告 本 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 附件1 A : 第 871 00027 號 專 利 甲 Ξ主 δ円 案 中 文 串 請 專 利 範 圍 修 正 本 民 國 90年 10月 修正 1 · 一種 飾 選 病 毒 疫 苗 候 選 者 之 方 法 9 其係 篩選 無法結 合至腦膜接受 Mitt 體 製 劑 的 病 毒 變 異 種 9 所包含 的步 驟爲 : (a )製 備 腦 膜 接 受 體 製 劑 該 腦 膜 係 選自 鼠腦 膜或 猴 腦膜； (b )混 合 病 毒 和含有 過 量 膜 接 受 體 的 上述 膜接 受體 製 劑，以形成病 毒 — 膜 接 受 體 製 劑 懸 浮 液 ，其牛 1該病毒係選自 黃熱病病毒、 曰 本 腦 炎 病 毒 、 登 革 — 4 病 毒 及langat病毒； (c )離 心 該 懸 浮 液 以 形成 — 上 淸 液 > (d )測 定 該 上 淸 液 中 的 殘 餘 病 毒 感 染 力； 和 (e )分 離 不 與 個 別 膜 接 受 體 製 劑 結 合 的病 毒變 異種 > 其可有效做爲 病 毒 疫 田 候 選 者 〇 2 .如申 請 專 利 範 圍 第 1 項 之 方 法 9 其 中該 腦膜 接受 體 製劑含有的蛋 白 質 濃 度 約 爲 2 0 — 4 〇 m g 濕腦 基（ wett b rain )/毫升 〇 3 .如申 請 專 利 範 圍 第 1 項 之 方法 其 中存在於 該上 淸 液的殘餘病毒 感 染 力 的 測 定係 感 染 單 層 細 胞 並.計 算產 生的 溶 菌斑。 4 .如申 Ξ主 日円 專 利 範 圍 第 1 項 之 方 法 9 其 中該 不與 個別 膜 接受體製劑結 合 之 變 異 種 溶 菌 斑 和 病 毒 被 放大。 5 ·如申 三主 δ円 專 利 範 圍 第 1 項 之 方 法 5 其 中所 產生 的變 異 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   487576 A8 B8 C8 D8 六 申請專利範圍 fg與新鮮的腦膜接受體製劑培養，並且由於該變異種缺乏與 鮮的腦膜接受體製劑結合的能力而確認這些變異種是真的 變異種^ 6 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該變異種對神 ，經元侵襲性和神經元毒力減毒。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 私紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）