TW474814B

TW474814B - Pharmaceutical compositions useful in treating traveller's diarrhea and related conditions initiated by enterotoxigenic E. coli

Info

Publication number: TW474814B
Application number: TW085103958A
Authority: TW
Inventors: Louis D Heerze; Glen D Armstrong
Original assignee: Synsorb Biotech Inc
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 2002-02-01
Also published as: EP0831914A1; IL117655A; IL117655A0; NZ337148A; AU713668B2; US5627163A; AU4873296A; WO1996039190A1; ZA962847B; CA2210193A1; NZ302632A; JPH11506458A

Description

474814 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明範圍本發明係關於旅者腹瀉之治療’其包括由致腸毒性大腸桿菌（E T E C)所引起之政瀉。更明確地，本發明係關於中和及除去與ETEC相關之大腸样菌熱-不安定性毒素（LT)° 本發明亦關於預防E T E C，其爲旅者腹瀉之致病因子，之群落於腸道。參考文獻下列文獻在本案之相關部份中以角形括孤（□)中所列數目引據於本案中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 1. Peltola, H., et al., Prevention of traveller's diarrhoea by oral B subunit/whole-cell cholera vaccine lancet: 338, 1285-1289 (1991). 2. Ericsson, CD et al., Travelers* Diarrhea: Approaches to prevention and treatment. Clin· Infect. Dis: 16，616-626 (1993). 3. Spangler, Brenda D., ^Structure and Function of Cholera Toxin and the Related Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin" Microbiological Reviews, 56, No. 4:622-647 (1992). 4. Huilan, S., et al., Etiology of acute diarrhoea among children in developing countries- a multicenter study in five countries., J. Clin. Microbiol. 31: 851-856 (1993). ____________- 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474814 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（2 ) 5. Wolf, MK, ct 7\\.t Charactcrir^tiou of enterotoxigenic nschcridiia coli isolated from U.S. troops deployed to the middle east., J. Clin. Microbiol. 31: 851-856 (1993). 6. Bourgeois, AL, et al., Etiology of acute diarrhea among United Stales military personnel deployed to South America and West Africa, Am. J. Trop. Med. Hyg. 48: 243-248 (1993). 7. Orlandi, Palmer Λ., et al., MThe Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Binds to Polylactosaminoglycan-Containing Receptors in CaCo-2 Humaia Intestinal Epithelial Ccll3M, Biochemistry, 33:12886-12895 (1994). 8. Fishman, Peter H., et alM MGangliosidcs as Receptors for Bacterial EnterotoxinsM, Advances in Lipid Research, 25:165-187 (1993). 9. Bartus, H., et alM Indications that the erythrocyte receptor involved in enterotoxigenic Escherichia coli attachment is a sialoglycoconjugate J Clin. Microb· 21: 951-954 (1985). 10. 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Shida,K et al., Escherichia coli heat-labile enterotoxin binds to glycosylated proteins with lactose by aminocarbonyl reaction, Microbiol. Immunol. 38:273-279 (1994). 15. Sixma, TK et al.? Lactose binding to Iicat-iabilc cntcroloxin from Π. coli., Nature 355:561-564(1992). 16. Merrit, EA et al., Galactose-binding site in Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT) and cholera toxin (C^r)» Mol. Microbiol. 13:745-753 (1994). 17. Uesaka et al.，Simple method of purification of Escherichia coU heat-labile enterotoxin and cholera toxin using immobilized galactose Microb. Path. 16: 71^76 (1994). 18. Lemieux，RU, et al.，"The properties of a ’synthetic’ antigen ，related to the blood-group Lewis AM, J. Am. Chem. Soc., 97:4076-83 (1975). 19· Lemieux，R.U.，etal.，"Glycosi.de-Ether-Ester Compounds"，U.S. Patent No. 4,137,401, issued January 30, 1979. 20· Lemieux, R.U., et aIM "Artificial Oligosaccharide Antigenic Determinants", U.S. Patent No. 4,238,473, issued December 9, 1980. 21. Lemieux, R.U., et al., MSyntliesis of 2-Amino-2-Deoxyglycoses and 2-Amino-2-Deoxyglycosides from glycalsM, U.S. Patent No. 4,362,720, issued December 7, 1982.______- 6 -_ 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） —--^------裝------訂------ -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474814 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 22. Cox,D.，etal.”A，NewSynthesisof4-0-〇i-D-GaIactopynino:syl-D-Galacto-Pyranosc", Carboliy. Res., 62: 245-252 (1978). 23. Dalimdn, J., et al., "Synthesis of space arm, lipid, and clhyl glycosides of the trisaccharide portion [a-D-Gal-(l-4)-^-D-Gal(l-4)-/3-D-Glc] of the blood group ρΛ antigen: preparation oi ncoglycoproteins", Carbohydrate Research, 127: 15-25 (1984). 24. Garegg, P. J·，et al.，”Λ Synthesis of 8-Mcthoxyciirbonyloct-1-yl 0-〇f-D~Galactopyranosy 1-( l-3)-0-)3-D-Galactopyranosy 1-(1-4)-2-Acctamido-2-Deoxy-/3-D-GlUcopyranosidcM, Carboliy. Res., 136: 2U7-213 (1985). 25. Garegg, P. J.t ct al,, MSyrUhcsis of 6- and 61 -dcoxy dcrivalivcs of metliyl 4-0-〇f-D-galactopyranosyl-j8-D-galactopyranoside for studies of inhibiUon of pyelonephritogenic fimbriated E. coli adhesion to urinary epithelium-cell surfaces", Carbohy. Res., 137: 270-275 (1985). 26. . Jacquinet, J. C·, et al·，"Synthesis of Blood-group Substances, Part 1L Synthesis of the Trisaccharide O-a-D-Galactopyranosyl-(l-3)-0-/3-D-galactopyranosyl-(l-4)-2-acelamido-2-deoxy-D-glucopyranose", J.C.S. Perkin, I: 326-330 (1981). 27. Koike, Kv et al., MTotai Synthesis of Globotriaosyl-E and Z-Cexamides and Isoglobotriaosyl-E-Ceramide,M Carbohydr. Res., 163: 189-208 (1987). 28. Schaubach, R·, et al·，"Tumor-Associated Antigen Synthesis: Synthesis of the GaI-a-(l-3)-Gal-i3-(l-4)-GlCNAc Epitope. A specific Determinant for Metastatic Progression?," Liebigs Ann. Chem., 607-614 (1991). —一一__- 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X29*7公釐） I—.—^------裝------訂------ « - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474814 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 - A7 B7_· _五、發明説明（5 ) 29. RatclilTc，R,M.，ct al,，"Sialic Acid Glycosides, Antigens， Immunoadsorbents, and Methods for Their Preparation", U.S. Patent No. 5,079,353, issued January 7, 1992. 30. Okamoto, K., et al., HGlycosidation of Sialic Acid,M Tetrahedron, 47: 5835-5857 (1990). 31. Abbas, S.A., et aLT "Tumor-Associated Oligosaccharides I: Synthesis of Sialyl-Lewis* Antigenic Determinant", Sialic Acids, Froc. Japan-German Symp. Berlin 22-23 (1988). 32. Paulsen, 11 Advances in Selective Chemical Syntheses of Complex Oligosaccharides", Aagew. Chem. Int. Ed. ling., 21:155-173 (1982). 33. Schmidt, ”New Methods for the Synthesis of Glycosides and Oligosaccharides - Are There Alternatives to the Koenigs-Knorr Metliod?M Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 25:212-235 (1986). 34. Fugedi, P.7 et al., MThioglycosides as Glycosylating Agents in Oligosaccharide Synthesis", Glycoconjugate J., 4:97-108 (1987). 35. Kameyama, Λ., et al.t "Total synthesis of sialyl Lewis X", Carbohydrate Res., 209: cl-c4 (1991). 36· Ekborg, G., et al., "Synthesis of Three Disaccharides for the Preparation of Immunogens bearing Immunodeterminants Known to Occur on Glycoproteins"? Carbohydrate Research, 110: 55-67 (1982). 37· Dahm6n, J.T et al., "2-Bromoethyl glycosides: applications in the synthesis of spa^er-arin glycosides/ Carbohydrate Research, 118: 292-jOl (1983).— ____________- 8 ~________________... _ ---------------------- 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇 X 297公釐） ----^------裝------訂----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474814 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7___五、發明说明（6 ) ' 38. Rana, S. S.t ct al., ''Synthesis of Phenyl 2-AccUimido-2-Dc<^xy-3-0-a-L-Fucopyianosyl-/3-D-Glucopyranoside and Related Compounds", Carbohydrate Research, §1： 149-157 (1981). 39. Amvam-Zollo, P., et al., "Streptococcus pneumoniae Type XIV Polysaccharide: Synthesis of a Repeating Branched Tetrasaccharide with Dioxa-Type Spacer-Arms'1, Carbohydrate Research, 150:199-212 (1986). 40. Paulsen, 11., ,fSynlhcsc von oligosaccliarid-dcterininantcn nut amid-spacer vom typ des T-antigens", Carbohydr. Res., 104:195-219 (1982). 41. Chemyak, A. Y., et al., MA New Type of Carbohydrate-Containing Synthetic Antigen: Synthesis of Carbohydrate-Containing Polyacrylamide Copolymers having the Specificity of 0:3 and 0:4 Factors of SalraonellaH, Carbohydrate Research, 128: 269-282 (1984). 42. Femandez-Santana, V.t etal.7 HGlycosides of Monoallyl Diethylene Glycol· Λ New type of Spacer group for Synthetic Oligosaccharides", J. Carbohydrate Chemistry, 8(3), 531-537 (1989). 43· Lee，R.T·，et al.; "Synthesis of 3-(2-Aminoethylthio) PropylGlycosides", Carbohydrate Research, 37: 193-201 (1974). 44. Armstrong, GD, et ai；, "Investigation of shiga-like toxin binding to chemically synthesized oligosaccharide sequences'1, J. Infect. Dis., 164:1160-7 (1991). 45. Heerze, LD et al., Oligosaccharide sequences attached to an inert support (SYNSORB) as potential therapy for antibiotic-associated diarrhea and pseudomembranous colitis, J. Infect. Dis., 169:1291-1296 (1994). (請先閱讀背面之注意事項再填寫本育) .裝---- 訂费 ____________- 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4琴格（210 X 297公釐） 474814 經濟部中央操準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 46. U.S. Patent Application Serial No. 08/195,009, filed February 14, 1994, by Heerze，et al·，for TREATMENT OF ANTIBIOTIC ASSOCIATliD DIARRHEA (allowed). 47. U.S. Patent Application Serial No. 08/126,645, filed September 27, 1993 by Armstrong, et al., for DIAGNOSIS AND TREATMENT OF BACTERIAL DYSENTERY. 48. U.S. Patent Application Serial No. 07/996,913, filed December 28, 1992, by Armstrong, for DIAGNOSIS AND TREATMENT OF BACTHRIAL DYSENTERY. 以上出版品，專利及專利申請書之揭示在本文中以參考文獻方式全部被纳入，正如每個單一的出版，專利及專利申請書之語文相同地被專一且個別地包括於本文中。發明背景腹瀉是旅者拜訪較不開發或熱帶國家時最常見的健康問題Π，2]。雖然旅者腹瀉中已和許多腸性病原有關連，與此· 疾病相關之最常見微生物爲致腸毒性大腸桿菌（ETEC )，其爲過半數報告病例之病因[3 ]。ETEC分離株亦爲開發中熱帶國家中年幼小孩及嬰兒之大多數腹瀉病例的致病因子[4 ] 。此外，由ETEC所引起之腹瀉是軍事人員在配置到較不開發國家時主要關心的事[5，6 ]。引起腹瀉之ETEC分離株具有數種毒性因子，其在疾病過程中扮演重要的角色。它們包括兩種腸毒素，熱-不安定性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A*規格（21〇χ”了公釐） -----------裝------訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 474814 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製

五、發明説明（8 ) 毒素（LT)與熱-安定性毒素（ST)以及稱爲菌毛的細菌表面黏附素，其促使有機體群落於腸道。兩種毒素並非引起腹离所必需。一些臨床的ETEC分離株已被顯示能製造L T或 ST ’然而其它分離株則具有兩種毒素。擁有lt之菌株傾向與旅者腹瀉之較嚴重病例相關，而僅製造ST之etec菌株則引起較溫和之腹瀉。由引起腹瀉中有關連的ETEC所製造之三種因子中，兩種是經由與'細胞表面寡醣受體之特異性交互作用所媒介。腸毒素LT使用神經結甞脂〇]^1(/5 Gal(1_3)/? [a NeuAc(2-3)] Gal( 1-4) Glc-神經醯胺）以結合至宿主細胞並經由刺激腺甞酸環化酶活性而謗發腹瀉[7，8 ]。兩種困毛型被發現於ETEC之外膜中。與病原性大腸桿菌株有關之最重要的菌毛型被稱爲群落因子抗原（C F A)或大腸桿囷表面抗原（CS),其負責促使有機體群落於腸黏膜。數種潛在的寡醣受體已針對CFA進行鑑定且包括缺乏唾液酸基的gnu糖脂結構p Gal(1_3)e㈤财……点Gai(i_4) AGlc-神經醯胺）以及包含搪共軛物之數種唾液酸[9，1〇了。此外，GalNAc(l-4)Gal雙糖序列已被顯示爲一針對表現 C S 3菌毛之致腸毒性太腸桿菌的結合序列[1 1 ]。其它菌毛，第1型’ -般被發現於大腸桿菌株中，但似乎^引起腹簿上並未扮演主要角色。第1型菌毛使用含甘露糖之寡醣結構作爲受體。與ETEC感染有關的其它毒素，s 丁，爲一小型聚肽’其可經由蛋白質-蛋白質交互作用而與其宿主細胞受體相互作用並經由增加細胞中環化GMp的水平而誘發本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4^Τ^Γ〇><297^"ρ-- (請先閱讀背面之注意事項存填寫本買) .装. ΪΤ

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In ii - -I 474814 五經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 、發明説明（9 ) 腹瀉。針對旅者腹瀉t通用治療爲利用如鹼式柳酸鉍，氯苯哌醯胺（Loperamide)之藥劑或如Kaopectate之藥劑，與再水化治療组合以開始治療。主要治療包含從腸道非特異性除去攻擊因子（如毒素）。只有在使人苦惱或無力之症候群被報告之中等至嚴重病例中才建議抗微生物治療。抗生素在減輕疾病之臨床症狀上並非時常有效且與抗生素抵抗性相關的問題可能產生。治療是在牽涉到自腸道特異性除去致腸母性大fe杯菌及/或L T活性時爲需要的。此將導致更加快速的復原及/或減輕罹患腹涛之個體的症狀。大腸桿菌熱-不安定性腸毒素（LT)已被發現表現一種類植物凝集素活性，其促使它結合至上皮細胞上的一種寡醣受體。數種寡醣序列已被鑑定爲LT的潛在受體。數種糖脂類及其衍生物類可作爲LT的受體且包括GMl(y5Gal(l-3) 々 GalNAc(l-4)[ a NeuAc(2-3)] /5 Gal(l-4)/? Glc-神經酸胺）。其它已被顯示結合L T之神經結嘗脂包括 [12,13]GDlb(^ Gal (1-3)/5 GalNAc(l-4)[ λ NeuAc(2-3)· α NeuAc(2-3)] AGal(l-4)；5 Glc-神經醯胺）及GM2(/5 GalNAc Π 4) [ a NeuAc (2 - 3 ) ] /3 Gal ( 1 - 4) /? G1 c -神經醯胺）。被顯示結合之L T之神經結苷脂G M 1的其它衍生物包

括[12] : /?Gal(l-3)y5GalNH2(l-4)[aNeu-NH2(2-3)]A

Gal ( 1 - 4 ) /? G 1 c -神經醯胺；Gal ( 1 - 3 )々 GalNAc ( 1 - 4 )[ a NeuAcR( 2-3) ] /? Gal (l-4)/?Glc-神經酿胺’其中R爲唾1 液酸之曱基酯；々Gal(l-3)卢 GalNAc(l-4)[iv(C7) 12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐） I. 裝訂 I * (請先閲讀背面毛注意事項再填寫本頁) 474814 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（10 )

NeuAc(2-3)]A Gal (1-4)/5 Glc_神經醯胺；以及^GalU-3 )卢 GalNAc (1 - 4) [ a NeuAc R (2 - 3 ) ] /? Gal (1 - 4) G1 c -神經醯胺，其中R爲乙醇胺醯胺。除了糖脂受體外，L T可使用糖蛋白類作爲受體以供毒素之結合。L T已被顯示使用終止於聚乳糖胺（卢Gal (1 - 4)万 GlcNAc _)序列之糖蛋白類[7 ]。L· T亦具有結合至終止於乳糖（々Gal (卜4) /5 G1 c)之糖蛋白類的能力[1 4 -1 6 ]。此外’高:度純化之LT製備物已利用半乳糖親和性管柱而得到[1 7 ]。综觀以上，可治療旅者腹瀉之化合物爲需要的。較佳的化合物應爲非侵襲性施用，例如口服，且應特異性地從腸道除去毒素及/或有機體。璧1明摘述本發明提供组合物及方法以供致腸毒性大腸桿菌所引起之旅者腹瀉的治療。本發明亦提供組合物及方法以供由致腸毒性大腸桿菌結合至胃腸道中宿主細胞寡醣.受體所引起之旅者腹瀉及相關. 症侯.群的治療。 —方面，本發明提供一種治療個體中由L T媒介之腹瀉的方去’该方法包括將有效份量之組成物，其包含經由一種非肽基相容性連結臂而以共價方式連接至醫藥上可接受的固形’惰性支持物之寡醣序列，施用至需要該治療之個體 ’其中該寡醣序列結合L T，且其中該組合物能夠自胃腸道被排出。本紙^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝- 474814 A7 B7 五、發明説明（11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製進步方面本發明提供一種有利於治療由L T啓始之旅 :腹滴及相關情況之醫藥組合物，該组合物包括經由非肽基相谷性連結臂而共價方式連接至醫藥上可接受固形，惰性支持物之寡聰序列’其中該寡醋序列結合^與醫藥上可接受載體，其中該組合物能夠自胃腸道被排出。在進一步方面，本發明提供一種治療個體中旅者腹瀉之万法，該方法包括將有效份量之組合物，其包含經由非-肽基相容性結合臂共價鍵結方式連結至醫藥上可接受固形、惰性支持物之寡醣序列，施予至需要該治療之個體，其中該寡醣序列結合致腸毒性大腸桿菌且其中該組合物能夠將微生物自胃腸道消除。進一步方面，本發明提供一種治療個體之旅者腹瀉的方法，琢方法包括將有效份量之組合物，其包含經由—種非肽基相容性連結臂而共價方式連接至醫藥上可接受固形，惰性支持物之寡醣序列，施用至需要該治療之個體，其中該寡醣序列結合致腸毒性大腸桿菌；並提供一醫藥上可接受載劑，且其中該組合物能夠自胃腸道消除微生物。進一步方面，本發明提供一種結合並除去得自疑似含有該毒素及/或有機體之檢體中LT&/或致腸毒性大腸^菌的方法’該方法包括將該檢體與經由非肽基相容性連結臂而共價方式連接至醫藥上可接受固形，惰性支持物之寡酷序列進行接觸，其中該寡醣序列結合LT及/或敌腸毒性大腸桿菌’在該毒素及/或有機體被吸收至該支持物之條件下；且將含有吸收毒素及/或有機體之支持物與檢體分 -14 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4规格（2丨〇'〆297公釐） ; ^ 冬------1T----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474814 A7 B7五、發明説明（12 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製繪圖簡述圖1證明純化之熱-不安定性毒素（L T)細胞張性之中和作用，其使用包含不同寡醣序列之S YNSORB表盤。數種 SYNSORB被發現能有效地中和L T活性。圖2説明L T活性之濃度依賴性中和作用，其使用 S YNSORB 16，19，41，72，75 及88。所有測試之 S YNSORB #可在20毫克/毫升或更高之濃度時能有效中和大於約7 5 %之L T細胞張性。圖3證明SYNSORB結合至大腸桿菌H10407 (078H12)及 H10407P-之效果。結果顯示H 1 0407可群落於SYNSORB 1 6，4 1，5 7及8 8之表面。結果亦顯示大腸桿菌之結合至 SYNSORB是由CF A菌毛所媒介，如H10407P-無法比 Chromosorb P更加有效地結合至SYNSORB所證明。圖4證明SYNSORB結合至兩種致腸毒性大腸样菌（Ο6Η16) 分離株之效果。結果顯示0 6血清型大腸桿菌結合至數種測試之SYNSORB。圖5證明SYNSORB結合至致腸毒性大腸桿菌（078H10)之效果。結果顯示078H10血清型大腸样菌結合至數種測試之 SYNSORB 。發明詳述 A.定義如本文中所使用之下列專有名詞具有以下意義：專有名詞”旅者腹瀉”意指突然開始之腹瀉，往往伴隨腹 __ - 15- _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 五、發明説明（13 ) ~ ~~~*---- j二痛"區吐及在旅者偶而發生之錢，通常是在旅行的弟週期間。逆種腹湾最常由致腸毒性大腸桿菌所引起。專有名詞，，生物相容性”意指相關於人類组織或體液之化于惰性6生物相容性材料爲非_致敏性的。專有名詞”相容性連接臂.，意指適合隔開寡酷結構與生物相谷_性固形支持物Ώ . 、又疗物乏4分，且其在一功能基能夠結合至 t持物的父互功旎基且其它功能基能夠結合至寡醣結構的交互功能基時具有生物功能。本發明中較佳之相容性連接 $爲非-肤基間隔臂。、專有名詞”固形支持物"意指寡醣序列可能經由相容性連接臂對其結合之-種惰性，固形材料。當用途爲活體内時固形支持物將爲生物相容性的。專有名詞"S YNSORB ”意指共價偶合至Chr〇m〇s〇rb P (TM) (Manville Corp.，Denver，c〇1〇rad〇)，其爲一種衍生的矽石顆粒，之人工合成8·曱氧基羰基辛基寡醣結構[18]。專有名詞"熱-不安定性毒素"或"LT”意指—種致腸毒性大腸桿菌的腸毒素，其啓始旅者腹瀉及相關情況。此毒素. 具有類植物凝集素活性。經濟部中央標準局員工消費合作杜印製爲了此申請書之目的，所有的糖類均使用傳統的三個字母命名法加以引用。除非另有所解，所有的糖類被假設爲 D -形式’除了果糖以外，.其爲L -形式。進而所有的糖類爲吡喃糖形式。 B .人工合成用以合成寡醣結構之化學方法可經由此技藝中已知之方 -------- - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2l0x297公釐） 474814 A7 B7 五、發明説明（14 經濟部中央擦準局員工消費合作社印製法加以完成。這些材料—如金 ^使用適當保護之㈣單酷類 /采^特殊方法—般針對欲進行合成之每個單-結構進行改變且使合適。一‘_般而士 .. , ^ D，王部或部分的寡醣配糖物之化學合成首先牽涉到還κ撼飞留X.、 ^ ^ , 或早醣之端基異構碳原子上配地甘说从土包天然發生或化學修飾醣結構（糖基供給者）之適當保護形式 y式馬選擇性地在還原單位之端基異構中心進行修飾以導入包本、匕13固化物類，二氯乙醯亞胺酸真基，硫配糖物等離去基團。然後供給者在此技蔹中^的催化條件下與糖為基或合適形式之碳水化絲接又者進仃反應，孩接受者在欲建立配糖性連結之位置上擁有一個游離經基團。大多數不同的糖菩配基部分在此技藝中爲已知且可以適當構形連接至還原單位之端基異構中心 0 相容性保護基g之合適用途，其在竣水合物合成之技藝中烏人所熟知，將促使合成結構之選擇性修飾或額外糖單位或糖block之進一步連接至接受者結構。、形成配糖性連結後，糖類配糖物可被用來增進額外糖單位之偶合作用或在選擇位置上之化學修料用$，傳统的去保護作用之後，使用於酵素性合成。—般而言，天然發生或化學修飾糖單位的化學偶合至糖類配糖物:經由^用文獻中詳細證實之已建立化學加以完成[19_35]。本發明疋寡醣結構對其結合之固形支持物可爲薄片或顆粒形式。大多數不同的生物相容性固形支持物材料爲此技 -17· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（2ΐ〇χ撕公羡 (請先閱讀背面之注意事 1· 項再填. 裝-- :寫本頁)

、1T ---- 474814 Α7 Β7 五、發明説明（15 :、μ例g石，如多孔性破璃之人工合成料 |類，切土之生體合成性石夕酸鹽類，如冑嶺土之含石夕酸鹽礦物類，以及如聚苯乙埽，聚丙埽，與聚糖類之I工合成聚合物類。由無機材料所製成之固形支持物爲：佳。固形支持物具有自約10至5⑼微米之顆粒大小對於活體内使^爲較佳。尤其是，⑽至2⑼微米之顆粒大小爲較佳。寡醣結構爲共價結合或非共價（被動地）吸收於固形支持 W此共價結合可能經由支持物上之功能基與寡醣結構 1谷性連結臂間的反應。意外地發現到㈣結構之通過相谷性連接臂附著至生物相容性固形支持物提供了 —種不管固形支持物而可有效去除毒素之產物。在間接結合中使 =的連接邵分爲適當長度（至少—個竣原子）之有機性雙功肥分子爲較佳，其僅作爲隔開寡醣結構與固形支持物之表面。本發明之組合物以下式代表爲較佳： (春醣- Y」R)n_固形支持物 Ί---:------0^---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製其中寡聽代表至少2個糖單位之寡醣基團，該基團結合 LT及/或致腸毒性大腸桿菌，γ爲氧，硫或氮，尺爲^ 個竣原子之㈣配基連接臂，_支持物爲如上所定義且η馬大於或等於1的整數。R爲自I至UH固竣原子之糖配基較佳。包含約個糖單位之寡醣序列可被使用具有約1至3個糖單位之序列爲較佳的。n爲—整數使得 ) A4^m ( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4/4S 丄 4 A7 --_____B7 五、發明説明（16 ) 克纽合物包含約〇.25至2.5〇微莫耳之寡醣較佳。許多糖嘗配基連接臂爲此技藝中已知。例如，包含對.硝基苯基團（及_oc6h4Pno2)之連接臂f被揭示[36]。在合成期間之適當時間’硝基團被還原成胺基團，其可以N-三氟乙醯胺基之形式被保護。在偶合至支持物之前，該三氟乙醯胺基團被除去因而露出胺基團。包含硫之連接臂曾被揭示[3 7]。明確地説，該連接臂係衍生自2-溴乙基團，其在與硫代親核物質之取代反應中被顯示導致連接臂具有不同的末端功能基圑，例如_ 0CH2CH2SCH2C02CH3 及-〇CH2CH2SC6H4-pnh2 。這些末‘功能基團促進與固形支持物上互補性功能基團之反應，因此形成一共價連接至固形支持物。該反應在此技藝中已爲熟知。 6-二氟乙醯胺基-己基連接臂（_〇_(CH2)6_NHC〇CF3)曾被揭示[38]，其中三氟乙醯胺基保護基團可被除去，露出以供進行偶合初級胺基團以供進行偶合。其它已知連接臂之例證包括7 -甲氧基羰基_3,6_二氧庚基- 連接臂[39](-0CH2CH2)20CH2C02CH3) ; 2_(4 -甲氧基羰基丁烷羧基胺基）乙基[4〇](-〇ch2CH2NHC(0) (CH2)4C02CH3);烯丙基連接臂[4i](_〇ch2CH = C2) ，其經由與一合適單體之自由基共聚合作用而產生共聚物 ;其它的烯丙基連接臂[42]爲已知（_〇(cH2CH20)2 C H 2 C H = C Η 2 )。此外，烯丙基連接臂可在2 -硫代胺基乙烷[4 3 ]存在下進行衍生作用以提供作爲連接臂-〇 c η 2 C Η 2 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） ----：------0^.------1Τ----- * * (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 474814 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（17 CH2SCH2CH2NH2。其它合適的連接臂亦曾被揭示[19-2 1，23，24]。用以將寡醣基圑共價附著至固形支持物之特定連接並非重要的。較佳地，糖苷配基連接臂爲一厭水性基團且最佳地，糖. 贫配基連接臂爲選擇自包含_(Ch2)8C(：c〇_，_ (CH2)5〇CH2CH2CH2-及-(CH2)8CH20-之一组厭水性基團。我們曾發現到共價附著至生物相容性固形支持物，如 Chr〇mosorb P (TM) (s YNS0RB)之人工合成寡醣序列可被用來結合L T。這些組合物有利於治療旅者腹瀉。 SYNSORB對於那些組合物而言特別有利，因爲其爲非毒性且可抵抗機械及化學分解作用。在使用大鼠之研究中（其爲一用於前臨床研究之廣泛接受模式，因爲它們爲人類反應之預報），SYNSORB曾被發現未受影響地通過大鼠胃腸道。它們被發現在口服施用後可完全地且快速地被排除（99% 在7 2小時内被排除）。此外’ SYNSORB上高密度之寡醣部分特別有利於結合 LT，因爲此毒素被認爲擁有多重寡酷結合位置⑴]。 SYNSORB上高密度之寡醣結合子亦有利於結合大量的致腸毒性大腸桿菌。非肽基連接臂被製備以供本發明之相容性連接臂之用途爲較佳。㈣類之使用並非理想的，因⑽肽類包括連接至相同蛋白質之數種往往不同的寡醣類。醣肽類亦很難大 -20- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ2ξ>7公慶） --—— I.~~ ^ '1TI * w (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 474814 A7 B7 五、發明説明（18 量製得且需要昂貴及繁瑣的純化。相同地，BSa或Hs a共軛物之使用並非理想的，例如由於口服給予時在胃腸道中可疑慮的穩定度。包含LT或致腸毒性大腸桿菌結合單位之寡醣基團經由— 非肤基間隔臂而共價連接至一惰性固形支持物可促進有效

結合且除去得自罹患旅者腹瀉病人之小腸，欲進行分析LT 及/或致腸毒性大腸样菌存在之檢體上的或微生物。當暴瞻具有附著（以非衍生性形式）之相容性連接臂進行合成時’高度純化組合物可能達到，其可偶合至不同的固形支持物。 C .醫藥組合物此發明之方法爲經由使用包括一或多個寡醣結構之醫藥組合物而達成，該寡醣結構結合L τ及/或附著至固形支持物之致腸毒性大腸桿菌。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -Ί ：私衣-- f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁j φ 當使用於口服施用時，其爲較佳的，這些組合物可以許多方式進行調製。液體或半固體形式將爲較佳的。包括如水芩液體醫藥上惰性載劑之.組合物可被考慮用於口服施用。其它醫藥上相容性液體或半固體亦可被使用。該液體及半固體之用途已爲嫻於此技藝者所熟知。可與如蘋果沙司，冰淇淋或布丁之半固體食物進行混合之..且&物亦爲較佳的。不具有討厭的味道或回味之調配物，例如S YNSORB，爲較佳的。鼻胃管亦可被使用來輸送組合物直接至胃部。固體組合物亦可被使用，且可選擇性地及方便地使用於 -21 - 卜紙張尺度適用中關家縣（CNS )从祕qx297公瘦） 474814 經濟部中央標準局J工消費合作社印製 A7 I------B7__五、發明説明（19 ) 包含醫藥上惰性載體之調配物中，該載劑包括如乳糖，澱粉，·糊精或硬脂酸鎂之傳統固體載劑，其方便地以錠劑或膠囊形式存在。SYNSORB本身在不加入惰性醫藥載劑類時亦可被使用，尤其供膠囊形式之用途。劑量被選擇以提供LT之中和以及自患病者胃腸消除毒素及/或致腸毒性大腸桿菌。較佳之劑量約爲自〇 25至丨25 微莫耳寡醣/公斤體重/天，更佳之劑量約爲〇·5至丨〇微莫耳寡醣/公斤體重/天。使用s YNS〇RB組合物，這意謂大約0_5至1.0克SYNSORB/公斤體重/天，其得到胃腸中 ISYNSORB濃度約爲20毫克/毫升。施用被預期爲每天3 至4次，達一週之期間或直到臨床症狀復原爲止。此劑量水平及施用計畫可視使用之特殊寡醣結構及例如個體年齡及狀況之因素而有差異。完全除去L τ活性之最佳時間被發現約爲3 7°C 1小時，其使用於j毫升檢體中2 〇毫克 SYNSORB之濃度。相似的條件可被用以自胃腸有效地除去腸致腸毒性大腸桿菌。本發明之含寡醣組合物在高達7天期間之施用將有利於治療旅者腹瀉。同時，預防性施用將有利於防止致腸毒性大腸样菌在胃腸之群落以及接下來的疾病發展。如先前所討論的，口服施用爲較佳，但調配物亦可考慮用於其它施用方法，如經直腸。這些調配物之利益可能視使用的特殊組合物及接受治療之特殊個體而不同。這些調配物可包含一液體載劑，其可爲油狀，水性，乳化的或包含適合於施用模式之特定溶劑類。 —-~~ ---------- ~ 22 - 國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事 1· 項再填· 裝-- :寫本頁)

、1T 4 474814 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A 7 B7 五、發明説明（2〇 ) 組合物可以單位劑量形式，或以多重或次單位劑量進行調製。針對先前所描述之預期劑量，口服施用之液體組合物應包含約1微莫耳寡醣/毫升較佳。 D .方法我們已發現到大腸样菌之熱-不安定性毒素（LT)可被結合毒素之特定寡醣序列所中和。尤其是，經由非肽基相容性連接臂共價方式附著至固形支持物之人工合成寡醣被發現能有效f和L T。該組合物之實例爲一些S YNSORB，其結合且中和L T活性。我們亦發現到致腸毒性大腸桿菌可結合至特定的寡醣序列，其經由非肽基相容性連接臂共價方式附著至固形支持物。該组合物之實例爲一些S YNSORB，其結合至致腸毒性大腸桿菌且阻止有機體附著至腸道中的宿主細胞受體。我們已測試經由8 -甲氧基羰基辛基（M C 0 )間隔臂附著至 C hr omo sorb Ρ之數種寡醋序列中和LT並結合致腸毒性大腸桿菌之能力。試驗之結構，亦稱爲S YNSORB，呈現於表1 中。如圖1及2及表2中所顯示，受試之SYNSORB在中和至少約50% LT活性之能力上有所差異。圖3-5證明 SYNSORB結合致腸毒性大腸桿菌之能力。附著至本發明中有利的固形支持物之寡醣序列包括結合 L T的那些。一個寡醣對於L T的結合親和力可經由簡單的活體外試驗直接地加以偵測，舉例來説，如以下實施例1 中所述。爲了本發明之目的，寡醣序列附著至結合L T之固形支持物意指那些在中國倉鼠卵巢（C Η Ο )細胞分析中降低 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） ^---：------裝-- , - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -曹 474814 A7 B7 五、發明説明（21 經濟部中央標準局員工消費合作社印製細胞毒性達至少50%之組合物，其使用實施例部分中所述之試驗。附著至本發明中有利的固形支持物之其它寡酷序列爲那些與不包含任何附著的寡醣序列（eh·。— p)之對照組支持物比較下明顯地結合致腸毒性大腸桿菌較佳者（Θ 0‘05，其使用適當的標準統計學方法，例如wiic〇x〇n或 Student’s T -試驗。裏g庚斜射祐姐主u 券聰针對致細毒性大腸捍菌之結合親和力爲依據於:以下實施例4中所概述者進行測定。、由困難梭狀桿菌所製造之類志贺菌毒素（slt)及毒素A 4結合至化學合成寡醣序列已進行研究[44_48]。 SLT爲一群細胞毒素，其有以下兩部分所组成：丨個a次單位及-個B寡聚體。b寡聚體爲毒素的結合部分，其促使它結合至宿主細胞受體。SLT毒素結合至包含“ Gal(l-4) AGal決定位之醣脂受體。A次單位具有酵素活性（n_糖甞酶），其使得哺乳動物細胞中的28S核醣體RNA脱嘌呤化。此酵素活性廢止了毒素-感染細胞表現蛋白合成的能力。 SLT作用的位置爲發現於督臟及腸系膜血管的内皮細胞· ，且SLT可引起導致腎衰竭及血色素出現於尿中之破壞作用。SLT是溶血性-尿毒症候群的致病因子。S；LT亦可能部分地牵涉到出血性腸炎（赤痢）。由困難梭狀桿菌所製造之毒素A爲一種腸毒素，其引發液體分泌，黏膜破壞及腸發炎。它可作爲人類嗜中性球的化學引謗劑。毒素A爲一種單一蛋白質。它可引起活化並導致單核細胞中激素之釋出。這些發炎效果可在謗發假膜 -24- &紙張尺度朝f關家標準（CNS ) A4規格（21Qx297公瘦） -----批衣-- * * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

，1T if 4/4δ丄幷 Α7 Β7 五、發明説明（22 ^ =人中所見到的腸性發炎中扮演重要角色。母素A似乎結合至一醣蛋白受體，該結構仍未被測定。 =機制尚未芫全了解，但毒素A被認爲經由受體-媒介之 A作用而進入细胞並影響細胞的肌動蛋白細胞骨架。毒梵體被認爲是連接至一鳥糞嘌呤調控蛋白。毒素a爲製迻困難杈狀桿菌-相關性腹瀉及假膜性腸炎中的第一步。相反地’大腸桿菌熱-不安定性毒素（LT)爲具有潛在 A D P -核搪-基轉移酶活性之a次單位與辨識受體位置之五聚物B ’人早心所组成的雜六聚物[1 ] ^當納入細胞時，A次單位經過蛋白溶解性切割及接下來的還原成A肽而被代謝。 A】肤活化腺苷酸環化酶，其引起升高的細胞内環化aMp 水平。此導致水分喪失及電解質進入小腸腔，以及腹瀉。 LT具有使用醣蛋白以及醣脂兩種受體之能力。LT之主要受體爲神經節苷脂G Μ 1，但L T亦辨識含有終止於万 Gal( 1-4) GalNAc序列之寡醣結構之醣蛋白[3,7, 1 3]。 LT亦有能力結合至終止於乳糖（々Gal(丨_4)卢Gle)之醣蛋白[14·16]〇定義L T之寡醣結合特異性的先前研究已鑑定出數種針對毒素結合之結構需求[13]。終止於/5 GalCl-3)^ GalNAc (1 - 4) [ a NeuAc (2 - 3 ) ] /? Gal 序列之寡醣已被顯示對於結合爲重要的。此外，L T亦辨識G Μ 2神經節苷脂（万 GalNAc ( 1-4) [ π NeuAc (2-3)] yS Gal (1-4)/? Glc-神經驢胺）以及缺乏唾液酸基的GM1醣脂（/5 Gal(1-3)/? GalNAc (1 - 4) /? Gal (1 - 4) y? G1 c -神經驢胺）[1 3 ]。L T 結合 25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） ·'^ 裝訂 •-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製丄 r ------ p 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（23 A7 B7 之最小需求似乎爲末端半乳糖糖化物[丨7 ]。選擇用於毒素中和研究之S YNSORB包括將G M丨之選擇性結構特徵納入之碳·水化合物以及未知有結合至L τ之其它寡醣。使用純化之L T，包含許多寡醣結構之一表盤s YNS〇RB ( 表1)針對吸收毒素活性之能力進行篩選。中和作用之程度爲經由測量相對於未處理對照組檢體之已與S YNs〇rb進行培育之毒素溶液在c Η 0細胞分析中終點效價之降低加以決定。得自.最初的篩選實驗之結果（圖i)顯示S yns〇rb 1 6 ’ 19 ’ 41 ’ 72，75 及 88，其包含寡醣序列 y?Gal(l-4)yS Glc(SYNSORB 16)，/? Gal(SYNSORB 19)，/5 Gal(l-3) 点 GalNAc(SYNSORB 4 1)，々 Gal(l-3)/5 Gal(SYNSORB 72) ’ /5 Gal( 1-3 )/5 GalNAc( 1-4)0 GalNAc( 1-4)/3 Gal (SYNSORB 75)或〇rNeuAc(2-3)A Gal(SYNSORB 88)，被發現在2 0毫克/毫升之濃度中和純化之L τ活性分別達9 6 % ，8 0%，96%，9 8%，9 9%及 9 6%(n = 2)。SYNSORB 5 7 典法吸收毒素活性。圖1中的結果亦顯示Chromosorb P似乎沒有結合至L T。 . 本發明中亦爲有利的其它寡醣序列爲包括末端々Gal ( 1 - 3 ) 点Gal(l-4)卢Gal(l)基團者。 SYNSORB 16，19，41，72，75 及 8 8 吸收 LT 活性之能力爲經由不同量的SYNSORB與L T進行培育而測定。圖2中的結果顯示這些SYNSORB以20毫克/毫升之濃度室溫下使用達1小時可有效地中和大於9 5 %之毒素活性。一旦針對SYNSORB 16，41，75及8 8之最佳結合條件被 -26- 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事_

!· -項再填U 裝-- I寫本頁) 訂 it 474814 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 -五、發明説明（24 ) 決定，.這些條件被使用以中和來自致腸毒性大腸桿菌臨床分離株之多黏菌素萃取物的LT活性。表2中的結果顯示 S YNSORB具有能力可有效地吸收毒素活性而不管ETEC菌株，即使各菌株間針對個別S YNSORB之相對親和力有所差異，其顯示由個別分離株所製造之LT可能有少許不同。因此，我們已發現到中和L T之能力是直接相關於附著至惰性支持物之寡醋序列。數種經相容性連接臂附著至固形支持物之不同寡醣序列被發現到具有中和LT活性之能力。這些序列，以及亦結合L T之其它序列，可被用來治療旅者腹瀉。用於完全除去 LT活性之最佳時間被發現約爲3 7°C下1小時，其使用於1毫升檢體中2 0毫克SYNSORB之濃度。由於每公克SYNSORB 包含大約0.25至1.0微莫耳寡醣，欲在每日劑量中給予之寡醣總量將分布自7.5至30微莫耳，其使用4公升之胃腸體積〇旅者腹瀉之治療可伴隨口服施用組合物，其含有經相容係連接臂（如SYNSORB)共價方式結合至一固形支持物之寡-醣序列。例如，SYNSORB曾被發現完整地通過大鼠的胃。然後它接觸到腸道中的L T。接下來含有L T對其結合之完整SYNSORB的除去使得LT從病人中除去。負責致腸毒性大腸桿菌附著至腸内上皮細胞之主要毒性因子爲群落因子抗原（CFA)菌毛。數種針對CFA之潛在的寡醣受體已被鑑定且包括缺乏唾液酸基的G Μ 1醣脂結構（卢 Gal ( 1 - 3 ) /? GalNAc (1 - 4) /? Gal (1 - 4) /5 G1 c -神經醯胺） __-27 -_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474814 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（25 以及數種包含醣化共軛物之唾液酸[9，10]。由於CFA菌毛使用如LT之類似寡醣類(醣脂類)供結合，針對細菌附；研究所選擇之SYNSORB(表”包括碳水化合物類，其相當於 GM1神經節苷脂結構中發現到的選擇序列，以防止致腸毒性大腸桿菌之群落。母結合至S YN S 0 R B表面之致腸毒性大腸桿菌的量爲經由將已與致腸毒性大腸捍菌培養物（1 χ 1〇5群落形成單位（CFU) /毫升）進行培育之SYNSORB懸浮液倒覆於培養皿而加以測定。對照组培育是利用致腸毒性大腸桿菌與Chr_s〇rb P芫成，其不含有任何附著的寡醣序列。使用不表現A 菌毛之大腸桿菌分離株（EEU 351，H10407P-)之額外對照組被納入以證明致腸毒性大腸捍菌之結合至s yns〇rb表面係由菌毛所媒介。圖3 - 5中的結果顯示SYNSORB 1 6，4 1 ，57，72，75及88可作爲一或多種血清型之致腸毒性大腸桿菌的結合位置。所有六種這些SYNSORB包含先前未被顯示可結合至致腸毒性大腸桿菌之寡醋序列。因此’我們已發現結合致腸毒性大腸桿菌之能力是直接. 相關於附著至惰性支持物之寡醣序列。圖3 _ 5中的結果顯示 /? Gal( 1-4) Glc，点 Gal(l-3)GalNAc，0 βαΙΝΑί^Ι- Α) yS Gal 或 α NeuAc (2 - 3 ) /? Gal 連結對於致腸毒性大腸桿菌結合之重要性。此外，我們已發現擁有々Gal (丨_ 3 )々Gal 序列之寡醣亦可有效地結合致腸毒性大腸桿菌。因此，包含々Gal (1 - 4 )々Gal (2)之寡醣序列將有利於本發明之方法及組合物。 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） J ^ 0^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

*1T "+/叶Ο丄Η· "+/叶Ο丄Η· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 五、發明説明（2e ) — --—-- 旅者腹腐或相關情況之治療可伴隨口服施用組合物，其 :有、.工相=性連接臂（如s yns〇rb )共價方式結合至一固形 =物：寡醣序列。例如，SYNSORB曾被發現完整地通過 =风的^]。然後它接觸到腸道中的致腸毒性大腸桿菌有機接下來含有致腸毒性大腸捍菌對其結合之完整 NSORB的除去使得有機體從病人中除去。此$ b 治療形式在引起疾病而不製造任何LT之致腸毒性大腸桿菌株所產生的旅者腹瀉病例中爲高度令人滿意的。本發=足另一方面爲快速有效結合生物學檢體中存在之生理子k度之LT及/或致腸毒性大腸桿菌，因此允許這些檢體中LT及/或有機體之存在及/或量的分析。典型地，生物學檢體將爲一糞便檢體。檢體可使用標準的萃取技術進行萃取及製備。然後檢體或萃取物與毒素_結合之寡醣序列，其經相容性連接臂共價方式結合至一固形支持物，在檢體中任何LT均被吸收之條件下進行接觸。熱-不安定性毒素（LT)及/或致腸毒性大腸桿菌可直接在含寡醣支持物的表面上，使用任何適當的偵測系統進行. 測量。例如，放射活性，加生物活素或螢光標幟之單株性或多株性特異於L T之抗體可被用以決定結合至支持物之 LT的量。類似於標準免疫分析技術，用以偵測特異性結合複合體之形成術的相當多方法爲此技藝中所熟知的。 E.實施例下列方法被使用來施行以下實施例中的研究。純化的L T爲得自Sigma Chemicals。 ______-29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐）衣------#--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 4/牝丄4 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製五、發明説明（27 惡Jllj豢性大腸桿菌臨床分離株之粗製LT萃取物之製備致腸毒性大腸桿菌被培養於CFA洋菜培養皿上37 °C過夜。大腸桿菌之多黏素萃取物爲經由將細菌懸浮於1毫升含有0.1¾克多黏菌素B硫酸鹽之磷酸鹽缓衝食鹽水（pBS)加以製備。混合物進行培育達3 〇分鐘後，萃取物於Eppend〇rf 微離心機中以14,000 rpm離心達1〇分鐘。產生之上清液被移除並使用於SYNSORB中和實驗。里且織培~養細胞分析熱不安定性腊羞素（L τ)活性 LT(細胞張力活性可經由使用中國倉鼠卵巢細胞（CH〇) 加以測量，CHO被維持於HamsF12培養基，其補充有1〇% 胎牛血清（FBS)，5% C〇2之大氣中3rc下。·欲進行試驗足LT檢體在Hams培養基中進行！： 5稀釋並過濾無菌通過 0.22微米之注射過濾器。欲進行試驗之檢體於培養基中進仃1列的5倍稀釋且100微升之每種稀釋液被加至含有長滿之單層CHO細胞的孔洞中並在37〇c/5% c〇2培育達24 小時。每個檢體進行分析兩次。細胞張力效果在2 4小時培同後可經由與不含有毒素之對照組孔洞作比較而容易可見_ 。24小時之後，細胞以95〇/〇甲醇進行固定並利用Geimsa染色法染色。含有來自中和實驗檢體之LT以類似的方式進行處理除了中和百分比是經由含有與不含有s YNS〇RB的檢體之終點稀釋作比較而決定外。用以測量LT效果之另一細胞株爲人類結腸腺癌町29細胞株。廷些細胞生長於含有17 mM葡萄糖之如如“心 Modified Eagle Medium(DMEM)加上 1〇%胎牛血清。含本纸張尺度適财目目^#^(CNsTA4iir —Ί Γ 0^-- Λ A (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,δτ -Φ. 寸/寸U丄寸/寸U丄 A7 B7 五、發明説明（28 =於培養基中進行系列的…倍稀釋並加至含有Μ 孔洞中。多形性空胞形成在Μ小時培育後可經由與不含有任何毒素之對照組孔洞作比較而容易可見。 ΛΪ把例係提供以説明本發明不欲在任何方面被解釋爲限制本發明之範轉。實施例1 含寡醣之固形#梏物古包含純化lt(2毫克於i毫升PBS中）之溶液被加至於i 5 ^升微離〜4官中包含不同寡醣序列之各種s yns〇rb (份里刀布自17.8至20.7宅克）並培育於末端相接之迴轉裝置上 A 1皿中達1小時。培育之後，s yns〇rb被允許沉澱至試管甩部且上清液被小心地除去。上清液之系列性5倍稀釋進行製備且細胞張力終點如上述進行測定。syns〇rb存在下終點的還原程度是經由與不加SYNSORB之對照組作比較而測疋。使用的另一個對照组爲Chr〇m〇s〇rb，其缺乏任何的碳水化合物結合子。圖1中的結果顯示，並證明數種寡醣結構被發現能有效地中和L T活性。實施例2 i^lAYNSORB 16，19 , 41，72，75 及 88 時 L T活性之濃度依賴性中和作用最大的L T中和作用所需之synSORB 1 6，1 9，4 1，7 5 及88份量是經由將包含2微克]^1[之1毫升純化LT溶液加至於1.5毫升微離心試管中前-稱重份量之每種synsorb。本紙張尺度適用中國國家標牟（CNS ) M規格（210X297公釐 J— τ -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 it 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -31 - 474814 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（29 ) SYNSORB檢體爲使用1〇，20及40毫克份量進行試驗。檢體在末端相接之迴轉裝置上37進行培育達丨小時。僅包含L T之對照組檢體亦進行試驗。每個檢體中和之份量是經由將得自含有與不含有 SYNSORB之檢體的c Η Ο細胞分析之終點效價作比較而測定。結果，其顯示於圖2中，證明約2 〇毫克之每種試驗 SYNSORB能夠中和至少7 5 %之溶液中L Τ活性。實施例3 針對中和得自致腸毒性大腸桿菌臨床分離株之LT的能力篩選含寡醣之固形支持物得自致腸毒性大腸桿菌臨床分離株之多黏菌素萃取物（1 宅升）被加至不同的SYNSORB(份量分布自20.0至22.5毫克），其包含不同的寡醣序列於i.5毫升微離心試管中，並在末 ^相接之迴轉裝置上室溫進行培育達丨小時。培育之後， SYNSORB被允許沉澱至試管之底部且小心除去上清液。系列的3或5倍上清液稀釋進行製備且細胞張力或細胞毒性終點如上述進行測定。S YNS〇RB存在下終點之降低程度是經. 由與不加SYNSORB之對照组作比較而測定。使用的另一個對照组的Chromosorb ,其缺乏任何的碳水化合物結合子。顯tf於表2中之結果證明使用2 〇毫克/毫升濃度之 SYNSORB對於得自致腸毒性大腸桿菌之多黏菌素萃取物的粗製LT活性之中和作用。表2中之結果顯示數種寡醣結構被發現能有效地中和L T活性。本紐歧適财目目( 1--J------裝------訂------ *" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474814 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（3〇 ) 實施例4 使用S YNSORB及致腸毒性大腸桿菌之結合實驗結合實驗是經由將於0.5毫升PBS，其包含0.5% (w/v)甘露糖，之大約1〇5 CFU致腸毒性大腸桿菌與SYNSORB 16 ，41，57，72，75 或 8 8(20 毫克）及 Chromosorb 室溫下進行培育達3 0分鐘而達成。不表現C F A菌毛之對照组分離株 EEU 35 1，Η10407 P -被納入以證明致腸毒性大腸桿菌之結合至S YNS0RB表面是由菌毛所媒介。利用P B S (約2 0毫升）徹底清洗SYNSORB以除去非-附著之有機體後，SYNSORB 再懸浮於1毫升之0.5% (w/v)羧基曱基纖維素中且兩種稀釋之懸浮液進行倒覆於胰消化黃豆瓊脂培養狐上。2 4小時之後該培養孤進行計數以決定結合之致腸毒性大腸桿菌的數目0 圖3 - 5中之結果顯示致腸毒性大腸桿菌能有效地結合至 SYNSORB之表面。此結果亦顯示數種寡醣結構被發現能有效地結合這些大腸桿菌。對SYNSORB之結合係相關於 SYNSORB上所發現之寡醣序列，因爲結合至SYNSORB及-Chromosorb P之有機體間有著明顯的差異。圖3 - 5中之結果代表至少4次測定之平均値。施行本發明不同具體實施例之上述模式之修飾對於嫻於此技藝者爲顯而易見的，其依照本文中陳述之本發明敎授。上述實施例不欲限制，僅爲本發明之示範，藉由以下申請專利範圍所定義之範疇。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _-33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474814 A7 B7 五、發明説明（31 ) 表1. 使用於熱-不安定性毒素中和研究之S YN S ORB SYNSORB 編號結構編號俗名寡醣結構* 16 1 乳糖 Gal( 1-4)/5 Glc 19 2 β Gal 41 3 - β Gal(l-3)/? GalNAc 57 4 - β GalNAc(l-4)^ Gal 75 5 β Gal(l-3)；5 GalNAc(l-4)^ Gal 88 6 - ^NeuAc(2-3)/? Gal 72 7 - Gal(l-3)卢 Gal * 全部的寡醣均經由一疏水性8個碳之間隔臂被連結至 Chromosorb P。NeuAc是唾液縮之縮寫。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表2. 得自致腸毒性大腸桿菌臨床分離株之熱-不安定性毒素之中和作用分離株编號血清型 SYNSORB 16* SYNSORB 41* SYNSORB 75* SYNSORB 88* EEU 320 〇7 8 Hi i H10407 89 89 89 89 EEU 324 〇7 8 Hi 2 408-3 75 75 75 75 EEU 346 〇6h16 75 75 100 100 EEU 348 〇6h16 88 75 100 100 EEU 351 OvsHu H10407-P- 88 75 50 75 * 分離株（n = 2)之中和百分比經濟部中央標準局員工消費合作社印製 * *中和實驗是使用中國倉鼠卵巢（CHO)或人類結腸腺癌 (Η T 2 9 )组織培養細胞加以完成。致腸毒性大腸桿菌臨床 ___-34-_ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 474814 A7 B7 五、發明説明（32 ) 分離株之多黏菌素萃取物進行製備且與SYNSORB室溫下一起培育達1小時。中和百分比是經由將經過SYNSORB處理之萃取物與未經處理之檢體所得到之終點稀釋效價作比較而測定。所有的實驗_均重覆進行兩次。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（.CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims

474814 修正本 +月曰補充 90.11, -9 Α8 Β8 C8 D8 第85103958.號專利申請案中文申請專利範圍修正本(9〇年η月）六、申請專利ϋ 1. 一種用於治療由致腸毒性大腸桿菌引發之旅者腹瀉及相關症狀之醫藥組合物，該組合物包括： a)經由一種非肽基相容性連結臂而以共價方式連接至醫藥上可接受固形、惰性支持物之寡醣序列，其中該寡醋序列係結合至少一種血清型之致腸毒性大腸桿菌；以及 b) —種醫藥上可接受之載劑，其中該組合物能夠自胃腸道被排出。 2_根據申請專利範圍第i項之组合啪，其中該寡醣序列具有1至3個糖單位。 3.根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該寡醣序列係選自包括 pGal(l-4)pGlc，pGal(l-3)pGalNAc，pGalNAc(l-4)pGal， pGal(l-3)pGalNAc(l-4)pGa卜 ctNeuAc(2-3)pGal 及 0Gal(l-3)pGal 所組成之群。 4 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中經由一種非肽基相容性連結臂而以共價方式連接至醫藥上可接受固形，惰性支持物之該寡醣序列係選自pGal(l-4)pGlc，pGal(l-3)PGalNAc ’ pGalNAc(l-4)pGal ，pGal(l-3)pGalNAc(l-4)pGal ， aNeuAc(2_3)pGal 及 pGal(l-3)pGal 所組成之群。 5. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該連結臂為 -(CH2)gC(0)- ° 6. —種用以自疑似包含致腸毒性大腸桿菌之檢體中結合及除去該有機體之方法，該方法包括： a)將該檢體與經由非肽基相容性連結臂而以共價方式本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 474814 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍連接至醫藥上可接受固形、惰性支持物之寡醣序列進行接觸，其中該寡醣序列係結合至少一種血清型之致腸毒性大腸桿菌，在其中該有機體被吸收至該支持物之條件下；且 b)將含有被吸收有機體之支持物與檢體分開。 7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該寡醣序列具有1 至3個糖單位。 8. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該寡醣序列係選自 0Gal(l-4)pGlc，0Gal(l_3)pGalNAc，-pGalNAc(l-4)pGaI，pGal(l-3)pGalNAc(l-4)0Gal，ccNeuAc(2-3)pGaI 及 pGal(l-3)pGal 所組成之群。 9. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中經由一種非肽基相容性連結臂而以共價方式連接至醫藥上可接受固形，惰性支持物之該寡醣序列係選自0Gal(l-4)pGlc，pGal(l-3)pGalNAc，pGalNAc(l-4)pGal - pGal(l-3)pGalNAc(l-4)pGal > aNeuAc(2-3)0Gal 及 0Gal(l-3)pGal 所組成之群。 10. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該連結臂為 -(CH2)8C(0)-。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)