TW457130B - Apparatus and method for multiple synthesis of organic compounds on polymer support - Google Patents

Description

A7 B7 457130 五、發明説明t1 ) 技術範圍 本發明係關於化合物多重合成的裝置及方法，該化合物 基本上係由例如藉重複沖洗、去保護作用和偶聯反應形成 的重複結構單位所構成。更特定而言，本發明係針對如肽 類有機化合物的多重合成系統，其使用自動機器人來操縱 多重合成的工作。 關於微縮膝片（Microfiche)附錄 微縮膠片附錄包括兩個（2)微縮跟片和一百二十個（12〇) 框，並構成本專利説明書的一部份。該微縮膠片附錄含有 一個$出實施本發明的程式。所列出之程式受到著作權保 護。然而著作權所有人不反對在專利和商標辦事處檔案或 記錄中，在出現任何所列出之程式時複製它的，但無論如 何在其他方面仍保留全部的著作權利。 發明背景 對許多申請案而言是極欲有機化合物，例如肽類的合成 系統。例如，大量肽類的合成和收集，將有助於發展能阻 斷、促進或其他影響涉及認知和結合之細胞反應的藥劑。 這些藥劑將會被用來治療或诊斷各種疾病。更特定而言， 可利用♦成的肽來作爲診斷和治療的藥劑。 須知妝合成系統已經設計並建造。Houghten. R.A.，Proc. Natl Acad. Sci.，82: 5 13 1-5 135 (1985)，使用一種•'茶袋”法 ’其在聚丙晞網孔小包中使用標準B〇c胺基酸樹脂，附帶 有標準沖洗、去保護作用、中和作用，並連合Merrifield, R B., J. Amer. Chem Soc.. 85: 2149-2154 (1963)原始固相程 -4- 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） _ - - — I! ! 1 1 i I I _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁

,1T 經濟部中央標準局眞工消費合作社印掣 457130 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(:2 ) 序的偶合計劃。 雖然有些肽合成系統已經自動化供多重肽的合成，但它 們通常顯示出不佳的”展延”時間，不能有效率操縱多重合 成的工作。例如，得自 Gilson, USA和 Advanced Chem Tech 的市售肽合成系統能夠合成多重肽序列D然而，這些自動 合成系統在所有肤類的合成循環中，逐一地或連續地進行 每個步驟。更特定而言，這個定時計劃包括逐一沖洗所有 的肽、逐一使所有肽去保護，然後逐一使所有肽偶聯。例 如，對第一個肽開始偶聯，然後當完成那些首先開始的偶 聯步-之後，才開始第二個肽的偶聯反應。這樣的定時計 劃在肽合成步驟之間，導致特別長的延遲或展延時間。逐 一沖洗所有的肽消耗時間。此外在偶聯期間，·該系統在等 待偶聯反應結束時是停機的。儘管偶聯反應耗時不超過2 小時’但先前技藝自動合成系統的效率卻受到嚴重的限制 〇 再者，前项技藝之自動肽合成系統嚴重缺乏彈性，一旦 已經開始一组肽的合成’便不能再開始附加的肽類，即使 是迫切需要的肽亦然。此外，先前技藝系統缺乏彈性去執 行一種矽上的偶聯反應’這典型是非-肽化合物所需要的 0 發明概述 . 一種克服前項技藝缺點的新穎合成系統，係藉著使用依 照新穎之時間安排計劃運轉的全自動機器人來實現，而能 有效率操縱多重合成的工作。藉著同時而非在連續之基礎 -5- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 、-'° 干 Ϊ I - > Α7 Β7 4571 30 五、發明説明t3 ) - 上進行多重有機化合物合成循環中的不同步驟，而實現該 新穎之時間安排計劃° 有利地是，該新穎的時間安排計劃對於在待合成化合物 之名單中迅速添加想要的化合物、改變待合成化合物的順 序或刪除先前進入的化合物提供了彈性。更重要的是，這 樣的時間安排方式或計劃減少了 "展延"時間-在完成先前 合成的那些步驟之前’已經開始了下一個化合物合成的新 合成步驟。 在例示的具體實施例中，該新穎合成系統包括電腦控制 下運轉的工業機器人系統，以完成在所選定之化合物，例 如肽類的各個循環内的合成步樣。每個合成循環包括五個 不同的步膝：沖洗、添加去保護試劑、去保護作用、添加 偶聯試劑和偶聯反應。因爲去保護作用和偶聯反應不涉及 任何的機器人活動，雖然在化學上是有活性的，但它們屬 於被動的合成步驟；其他的步驟則是主動的合成步骤。 重要的是’藉著使機器人系統在一個化合物合成的被動 合成步騍期間，進行下一個化合物合成作用的合成循環之_ 主動合成步驟’而實現了新穎的時間安排計劃。 在本發明的較佳具體實施例中係使用固相肽合成，其利 用第—組含有作爲固態支撑體之樹脂的塑膠注射筒來充當 反應容P此外’第二組塑膠注射筒則含有胺基酸。該機 器人系統裝設有可置於複數注射筒中任何—個位置的抓握 手臂’以便根據新穎的時間安排計劃，選擇性地從想要的 注射筒中抽吸及配送溶劑及試劑，而將預先決定之胺基酸 ,____ - 6 - 衣紙張尺纽i巾關家----；- H. - - ' -1- - I— n ! —I I I i 二 n _ TV ^-s (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 "457130 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 衣固態支撑體上。 圖片説明 可藉著閲讀下列敘述並連同 完整的理解，丨中以同樣地=圖片而獲得本發明更 中. J來標示相同的零件，且其 圖1爲根據本發明原理的人 圖^敘述流程圖，；之塊狀圖解' 更特定之代表時間安排計劃1 <合成系統的運轉， 關1之合成系統㈣間安排計劃的圖表。. 本發明係關於由重複結構單位 客舌me .、， 構成〈化合物’如肽類的 " ，M重複結構單位由重複的沖洗、去保護作 =和偶聯反應所形成。該裝置或合成系統係使用有新顆之 時間安排計劃來運轉的全自動機器人系統，以便有效率操 縱多重合成的X作藉著同時而非在連續之基礎上進行多 重，機化合物之不同合成循環中的不同㈣，而實現了該 新穎之時間安排計劃，如同下文中更詳細討論。 本發明之原理並未喪失任何普遍性或實用性，使用以 Fm〇c/tB^化學爲實例來描述的本發明之全部運作，適用於 肽的Merrifield固相合成作用。然而應能解瞭到，本發明 同樣適用於任何其他有關於化合物之固相合成的化學，而 該化合物大體上是由重複結構單位所組成的，諸如聚合物 或像是例如 Borchardt等人，J. Am. Chem. Soc., 116: 373 (1994) ; Chen等人’ J. Am. Chem. Soc.. 116: 2661 (1994); 本紙張尺度適用中國國家橾隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） {請先閱讀背而之注意事11再填寫本頁)

-—^1 II ^^^1 ^n— —Ji in 一 Ί II ·1 ^^^^1 —ί —- ^^^1 I - - ^^^1 n^l ^^^1 -- —i^i ^^^1 » ··-.-.*

.I —i - II— I I 4 5 7 13 0 Α7 Β7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明—(.5 ) ： Simon等人，PNAS，89: 9367 (1992) ; Nikolaiev等人，Pept. Res.，6: 161-70 (1993);以及 Lebl等人，第 5册：541-548， Techniques In Protein Chemistry，Academic Press，San Diego (1994) 中描述的有機化合物，均併入文中供參考。 然而在描述本發明之前，簡單地討論肽合成之基本原理 將會是有益的。肽合成涉及胺基酸的偶聯反應，並可藉著 熟諳此藝者熟悉的技術來完成°參見例如Stewart和Young ，Solid Phase Synthesis，第二版，Pierce Chemical Co.， Rockford, IL (1984)，其併入文中供參考。 在固態支撑體上的肽合成法通常涉及由羧基或C-終端建 造一個肽，其中該C-終端之胺基酸經由其經保護之α -胺 基而被附接在固相聚合物上。然後切掉保護墓團，並將下 一個也被保護的胺基酸經由肽鍵偶聯到附接在固態支撑體 上的胺基酸之π-胺基上。重複使前一個胺基酸去保護和 使另一個胺基酸偶聯的循環，直到合成想要的肚爲止。胺 基酸上任何有反應性的支鏈均以可抵抗偶聯反應和Ν α -去 保護程序的化學基團保護之。而且可在合成作用結束時移 除這些支鏈保護基團。 爲了俸聯胺基以使合成鏈生長，必須活化被阻擋之胺基 酸的羧基。可使用許多活化方法，包括例如預先形成的對 稱酐（PSA)、預先形成的混合酐（ΡΜΑ)、醯基氯、.活性酯， 以及鼓酸原位活化作用。 本發明之合成系統包括以介面與電腦相連的全自動機器 人系統，以便完成各個想要合成之肽的合成循環。參閱圖 -8 - 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 4571 30 A7 ________ B7__ 五、發明説明6 ) 1 ’圖解説明化合物多重合成系統的較佳具禮實施例之塊 狀圖，更特定言之即指肽類，根據本發明之原理適用標準 的Fmoc/tBu化學。

合成系統10包括一個工業機器人系統2〇，如得自CRC

Plus, Inc., Harrington, Canada的 Model A251，其介面與 ibM 個人電腦25相連。電腦25包括像中央處理單元、程式和随 機處理記憶體、定時和控制電路、輸入和輸出介面裝置之 類的硬體’及其他運轉中央處理單元必需的數位輔助系統 ’ Ή們都是此項技藝中已熟知和瞭解的。因此爲了簡潔起 見，夺中不討論此電腦硬體。 機器人系統2 0被規劃成經由使用預先設計之步驟，來完 成不同的機械操縱，該步骤典型地由利用該機器人系統遞 送之軟體程式所提供。另外，這類預先設計的步驟也可由 第二者軟體程式來提供，像是Total Control F〇r Windows, Hudson Control Group Inc.，Springfield, New Jersey。熟諳此 藝者將迅速地注意到其他的電腦工具，微電腦控制工具或 其他自動控制工具，包括其他的程式軟體，可藉著其他方 式提供以便完成機械操縱。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1^- ^^^1 l^i 1 11 m ^ii «1^ —18 J3 ’T (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 自動機器人系統20裝設有可在程式控制之下沿著軌道35 移動的抓握手臂30，它可拾起複數注射筒中任何一個，並 將其置於（X，Y，Z)任何預先設定的位置上。爲了使預先 設定之胺基酸偶聯至固態支撑體，利用該抓握手臂選擇性 地從擔任反應容器的想要注射筒中，抽吸及配送溶劑和試 劑。更特定T之’每個注射筒具有一個可由抓握手臂移動 ,___ -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 457130 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明-(.7 ) . 的柱塞，以便能以熟諳此藝者已知的方式來抽吸或配送試 劑。參見例如Krchnak, V., Vagner, J.，"在低壓、連續流動 的條件下，監視顏色之固相多重肽的合成作用（Color-Monitored Solid-Phase Multiple Peptide Synthesis "Under Low-Pressure Continuous Flow Conditions) » Peptide Res. 3, 182 (199〇)，其併入文中供參考。此外，該抓握手臂提供一個 搖動注射筒内容物的方法。在每個注射筒中試劑的含量， 也可以藉著檢查在想要注射筒中柱塞的位置而輕易地定出 。要確定已經正確地抓住注射筒並置於適當之處，最好是 使用半學感應器36來探測注射筒的運動，以便對合成系統 提供反饋。 可選擇適當的固態支撑體，如聚苯乙烯或聚乙二醇/聚 苯乙烯樹脂。經保護的胺基酸可由許多地方輕易地獲得， 如 Bachem (Torrance， California)、 Advanced ChemTech (Louisville，Kentucky)，或 Propeptide (Vert-le-Petit，France) o 重要的是，電腦25也控制了合成循環中各個步驟何時開-始，以便實行本發明新穎的時間安排計劃，在該計劃中同 時進行多重肽合成循環中的不同步驟，而非以連續之基礎 來進行。 更特定言之，合成系統1 0包括容納作爲固態支撑體之樹 脂的第一组塑膠注射筒40，在此稱之爲"樹脂注射筒組"。 在較佳的具體實施例中，使用得自Rapp-Polymere， Tubingen，Germany的 RAM-TentaGel (0.21毫莫耳 /克）來當 _ -10- 本&張尺度適用中國國家插準（CNS ) A4規格UI0X297公釐) ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 457 1 30 五、發明説明"( 8 ) , 作樹脂。 第一組塑膠注射筒40被安置在進入架50上，分別夹持例 如三十個10毫升和三十個2.5毫升的注射筒。合成系統10 也包括容納胺基酸溶液的第二組塑膠注射筒60，在此稱之 爲胺基酸注射筒组"。同樣的’第二組注射60筒被安置在 架子70上，分別挾住例如一百個1 〇〇毫升和一百個2.5毫升 的注射筒。藍子6 5則容納已冗成合成的肽。第一和第二组 注射筒的數目和大小，將依據合成不同肽的數目、肽的長 度和所需要之不同胺基酸的數目而定。 塑野注射筒40、60 ’最好是以諸如聚丙烯之類的材料來 製造’這種材料對在固相肤合成中使用的所有溶劑及試劑 ’包括三氟乙酸，均具有足夠的化學惰性。其他材料包括 Kevlar、特氟龍（Teflon)或轉玻璃。 每個擔任反應容器的塑膠樹脂注射筒40，均在底部裝有 玻璃料（未顯示）。應該明瞭可以使用各種其他能夠保留固 相並移除過量試劑及溶劑的容器與工具。例如可使用裝填 有玻璃料或濾紙的管柱或井孔來當作另一種反應容器，其 與本發明之合成系統是可相容的。另外，將該管柱或井孔 以某種方式連接到一個眞空源，而得以使其與反應容器分 離。此外，保留固柙的玻璃料或工具不必完全裝滿反應容 器。更確切地説，它可以是附帶的，或是只在從固相中移 除溶液期間，需要保留該固相時才存在。 利用四個1〇毫升的活塞寶浦系統90，如Hamiu〇n MicroLab 900，Reno Nevada將適當的溶劑和試劑，從溶劑 _ -11- ^紙張尺度適i中®7國家¥準（CNS ) A4規格（210X;公釐） -------- --------裝------訂------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局負工消費合作社印裝 457 彳 30 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明飞.9 儲藏槽導入到遞送杯80中。使用工業級的溶劑和試劑，諸 如二曱基甲醯胺（DMF)、六氫吡啶/DMF、DIC/DMF。三個 活塞幫浦遞送溶劑和試劑至遞送杯80，而第四個活塞繁浦 則從混合胺基酸和偶聯試劑的杯子80中移除廢物和沖洗溶 液。 遞送杯80包括第一個杯子丨〇〇，它用於所有的沖洗並接 受經保護之胺基酸和偶聯試劑，還有第二個杯子11〇，用 它來接受去保護試劑。 熟諳此藝者將會迅速地注意到可利用更獨立的操縱站， 依據砰裏所想要的特殊反應，如配送 '抽吸、搖動、加熱 、冷卻或甚至是使其迴流，來操縱這些注射筒。在這些例 子中，機器人系統20將僅需將適當之注射筒童於想要的操 縱站這將會減少進行主動合成步驟所需的時間，因爲最 消耗時間的工作，將被分配給多重且獨立的操縱站。 :用上述的合成系統’藉著操縱注射筒來合成多重肽， =以在合成循環㈣可重複地將想要的胺基酸附接在固 j體上。熟諳此藝者將會注意到在試劑容器與反應容 4疋在’昆口至與反應容器之間’都沒有諸如管類 或瓣膜之類的物理連接。如 .m ^ m 運接如此可在相同或不同的肽合成中 使用不同的試劑和反應條件。 每個合成循環包括下列—毕 λ , 系歹〗的基本操作或步驟：沖洗 聯反痗BE1 , *作用、加入偶聯試劑，以及偶 聯反應。明钱混合合成循環，每 酸’便斜想要肽的合成創造了人成朴㈣ 1 σ成冲劃。然而上述合成步 本紙張又度適 -12- —；----------^------1Τ {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 57 1 30 a? -- Β7 五、發明説明-(—10 ) _ 骤中’只有沖洗、加入去保護試劑和加入偶聯試劑這三個 直接需要使用機器人系統20。這些步骤在這裏被稱爲·_主 動合成步驟"’雖然它們在化學上是被動的，並在下文中 更詳細地討論。 在沖洗期間中’將機器人系統2〇置於一個從架予40、轉 鼓120或支持位置125中選出的樹脂注射筒處，然後將其中 的任何液體配送至液態廢物槽i 30中。隨後利用活塞幫浦 系統90將預先設定量之沖洗液體送至第一個杯子1 〇〇中， 然後利用選定的樹脂注射筒，將其與預先設定量之空氣一 起抽呼起來。最後使機器人系統2〇搖動選定的樹脂注射筒 ’經過一段預先設定的時間，以確保有效的混合。 加入去保護試劑同樣需要使用機器人系統2〇。機器人系 統20將想要的樹脂注射筒置於液態廢物槽上方，並配送其 中的任何液體。随後利用選定的樹脂注射筒，將預先設定 量的去保護混合物送至第二個杯子11〇中，然後將其與預 先設定量之空氣一起抽吸起來。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 - ^^^1 - I - ϋ^ί ^^^1 UK '1SJ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在最後加入偶聯試劑時也需要使用機器人系統2〇。將機 奋人系統20置於在支持位置125的選定樹脂注射筒之處。 然後使機器人系統20選擇並置於特定之胺基酸注射筒的位 置，將預先設定量的想要胺基酸配送至第一個杯子1〇〇中 。將特定的胺基酸注射筒再放回架子4〇上。然後將預先設 定量夂活化劑送至第一個杯子1〇〇中，並利用位在支持位 置125上的特定樹脂注射筒將其與預先設定量之空氣—起 抽吸起來。然後將特定的樹脂注射筒置於轉鼓12〇上。接 .-___ -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) ------：- A7 B7 457 1 30 五、發明説明1: 11 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 下來機器人系統20配送預先設定量的沖洗溶劑至第—個杯 子100中，然後再將其抽吸起來。後面的轉動和沖洗步驟 ’代表性地重複數次，最好是三次。 在去保護和偶聯反應期間，放置在2.5毫升或1〇.〇毫升轉 動架上的注射筒，各容納高達18個注射筒，以確保有效的 混合。 爲了更徹底地瞭解容許更有效率操縱多重合成工作的時 間安排計劃’討論該時間安排計劃的基本原理是有益的， 尤其是關於圖2Α和2Β之流程圖。 首年’使用者先登記待合成之化合物的序列。接著，若 必需試劑是可購得的，該系統將啓動使想要的合成開始__ 否則使用者會被告知缺乏。更特定言之，對4每個想要合 成作用，該系統決定合成序列所需的特定合成步驟，包括 主動和被動兩者，並決定何時進行那些合成步驟—也就是 它們在合成循環中的時間安排或暫時性的關係。 經濟部中夹標隼局負工消費合作社印製 熟諳此藝者將會迅速地注意到，這些合成步驟是序列特 有的，也就是它們與想要的合成作用有獨特的相互關係。 在此將這些合成步驟叫作"序列獨特之時間安排計劃,，。當 考慮開始新的合成作用時，將新近想要合成的"序列獨特 之時間安排计劃”與已經開始的那些序列的序列獨特之步 骤或時間安排計劃比較後者的序列獨特之步驟被稱爲，, 累積停留之時間安排計劃"，因爲它們是所有目前已經開 始之合成個別的"序列獨特之時間安排計劃"的编幕物η 更特定言之，上述的比較需要該系統區劃出新近想要的 _;_ - 14- 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS )A4規格（210X ~~----- A7 B7 五、發明説明χ 12 :::主動合成步驟’其關於目 =驟，是在何時發生的。接著若試劑是可=王動 非在進行新近相要土人# "々’除 ,,^ μ w成作用的主動合成步驟與已崚門』 ::之間有時間調整上的衝突，則系統將開始發 “作用之啓動。應瞭解到新近想要的合成作：的：近 獨特之時間安排舛創...^ x吓用的序列 劃,.卜 M割，會被加至1積停留的時間安排計 '而，S存在著時間調整上的衝突時，系統會嘗試著 確定是否可使新近想要的合成延遲或"改變時間,，， 何已經開始之合成作用的下—個主動合成步碟啓^ A止，以便排除時間調整上的衝突。除非系統能夠解決時 間調整上的衝突，否則系統將不會開始新近想要的合成作 用，但是將更換前進以完成目前在進行中之合成作用接著 需要的主動合成步驟。一旦已經進行主動合成步驟，系統 就得更新"累積停留之時間安排計劃"，然後在任何進行中 之合成作用的下一個被動合成步驟期間内，再次試圖解決 這個時間調整上的衝突β重複進行時間安排計劃，直到已 經開始所有想要的合成作用爲止。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 下文爲對於根據上文討論之時間安排計劃原理的多重肽 同時合成，其合成声驟的説明描述。應該記得在多重合成 中的每個合成計劃，是一個預先設定步驟或程序的連續循 環順序°就這個説明描述而言，一個合成循環包括下列的 合成步驟：（i)以二甲基甲醯胺（DMF)沖洗樹脂三次，每次三 十（3 0)秒；（ii)利用百分之五十（50%)的六氫吡啶/DMF使胺 15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） 457130 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明(」3) ： 基酸去保護十（10)分鐘；（iii)以二甲基甲醯胺（DMF)沖洗樹 脂五（5)次，每次三十（3〇)秒；以及（iv)使用三（3)莫耳過量 的DIC/HOBt經過活化的Fmoc保護之胺基酸偶聯兩（2)小時 〇 在結束每個肽最後的合成循環之後，藉著沖洗或是若合 適則藉著沖洗、去保護和沖洗來結束合成作用。 將根據上述解釋之合成循環運轉的機器人系統30置於第 一個樹脂注射筒（肽合成1號）處、操縱柱塞來抽吸二甲基 甲醯胺（DMF)4々沖洗溶液’然後搖動該樹脂注射筒。以沖 洗溶，沖洗樹脂需時三十（3〇)秒a最好是重複沖洗三次。 随後利用第一個樹脂注射筒從遞送杯中抽吸已經由活塞幫 浦配送的去保護試劑。後面的步騍就是”加入去保護試劑" 步驟。重複沖洗和加入去保護試劑花費大約五（5)分鐘。 在去保護作用期間，持續約十（1〇)分鐘，該合成系統可 有利地指揮機器人系统對第二樹脂注射筒或是下—個肽合 成作用開始沖洗並加入去保護試劑（肽合成2號）。然而， 因爲沖洗和加入去保護試劑僅花費不到五分鐘，所以在完 成第一個樹脂？王射筒的去保護作用之前，仍然得停留至少 五分鐘Υ要確保在步驟之間的停頓時間減到最少，該合成 系統進一步指揮機器人系統對第三個樹脂注射筒開始另— 個沖，並加入去保護試劑（肽合成3號）。 /决定是否對連續的樹脂注射筒開始其他沖洗和加入去保 遵試劑（下一個肽合成作« h 风乍用），係由程式自動控制’該程式 則藉著比較上述的序列猫沾、 斤歹j獨特足時間安排計劃與累積停留之 I - . - I- -I f^i ^—ϊ- (請先閱婧背而之注意事項卉填寫本頁) 中國i家 CNS) 16- 4 5 7 1 3 0 A7 ____B7 經濟部中央標丰局員Η消費合作社印製 五、發明説明（· 14) 時間安排計劃來控制。實際上，如果最低的去保護停留時 間長得足以完成該工作，便開始沖洗和加入去保護試劑。 一旦已經完成第一個樹脂注射筒的去保護作用，合成系 統便和揮機器人系統定位在第—個樹脂注射筒處，以便利 用一甲基甲醯胺（DMF)來沖洗樹脂三十秒。在將該樹脂注 射筒置於暫時容納處之後，最好重複這樣的沖洗五次。接 著定位於含有待偶聯的想要胺基酸之胺基酸注射筒處，並 將預先設定的量配送至遞送杯中，然後使該杯接受DIC溶 液。利用第一個樹脂注射筒從遞送杯中抽吸胺基酸溶液， 以便垮聯孩胺基酸β後面的步驟便是"加入偶聯試劑"之步 驟。同樣地，沖洗和加入偶聯試劑的時間約費時五（5)分 鐘。在偶聯期間中’合成系統有利地指揮機器人系統對第 一個樹脂注射器開始偶聯反應（肽合成2號），然後接著對 第三個樹脂注射筒開始偶聯反應（肽合成3號）。 同樣地，決定是否對連續的樹脂注射饵或肽合成作用開 其他/中洗和加入偶聯試劑，係由程式自動控制，該程式 藉著比較上述的序列獨特之時間安排計劃與累積停留之時 間文排汁劃來控制。實際上，如果最低的偶聯反應停留時 1長得足以疋成該工作’便開始沖洗和加入偶聯試劑。 一旦已經開始全部三個樹脂注射筒的偶聯反應，也就是 —個肽的合成作用，合成系統將抓取第四個樹脂注射筒（ =成4號）’其開始沖洗和去㈣作用。合成系統在最低 ^田的偶聯時間期滿之前，會對於儘量多的樹脂注射筒（ 肽u成作用）開始沖洗和去保護作用。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 ί冰 A7 B7 457130 五、發明説明飞:15 重複該程序直到聚集最短長度的肽序列爲止。此時若需 要可使用額外的樹脂注射筒，以便合成新的肽序列。 所合成肽的最大量受到注射筒大小的限制。例如利用含 有大約500毫克樹脂10毫升注射筒（〇 5毫莫耳/克樹脂），可 期望合成0.25毫莫耳的肽（約300毫克的粗製十肽）。 熟諳此藝者將會迅速地注意到，在上文的説明描述中， 每個肽合成作用的偶聯時間是相同的—最早開始偶聯的將 在隨後開始偶聯之前結束。在這種狀況下，每個肽合成新 近開始的合成循環將依序跟隨在前一個循環之後。當然應 该明，到’如果想要則可以使用不同的偶聯時間。然而， 時間安排計劃的原則不改變—如果時間允許，該系統便在 前一個肽合成的被動步驟期間，開始下一個肽合成的主動 合成步驟。 下列的程式使包括時間安排計劃的本發明基本原理得以 實施，其包含於微縮膠片附錄中。 參閲圖3，則解释利用上述固相肽合成計劃，在十二個 肽之多重合成作用的沖洗，加入去保護試劑、去保護作用 加入偶聯試劑及偶聯反應之間的時間安排計劃或暫時性的 關係。基於以上的討論’熟諳此藝者將會迅速地注意到， 在被動合成步驟（去保護作用和偶聯反應）期間内，在下— 個肽合成之合成循環中的主動合成步驟，會與煎一個肽合 成同時開始。例如’參閲圖3，在第一個肽合成（肽合成1 號）的去保護作用期間内，開始了第二個和第三個肽合成 作用（肽合成2和3號）的沖洗和加入去保護試劑。 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〖〇χ 297公疫） .1,--------裴------訂------喊 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經濟部中央樓準局員工消費合作社印製 457 1 30 a? ----—-~_ 67 五、發明説明（：16) 應孩明瞭在開始每個化合物的合成作用前，在每個想要 的肤合成I合成計劃中，各種參數變數必須是特定的，包 括待配送之落劑或試劑的種類和用量，以及相同的沖洗步 驟及/或反應步驟之時間長度。因爲抽吸也在加入去保護 試劑和加入偶聯試劑時進行，所以使樹脂與溶劑能夠充份 ί昆合所需的空氣體積也必須是特定的。 除了各種參數變數必須是特定的或是從現存的合成計劃 中取回的以外，合成系統亦必須利用其他資訊來開始，包 括在肽合成計劃中所包含之溶劑及試劑的分派工作和身份 ;分¥用來計算相對應之試劑和胺基酸溶液體積的試劑及 胺基酸濃度（毫莫耳/毫升）；注射筒的大小；在注射筒中樹 脂的含量；以毫莫耳/克取代樹脂；每個胺基酸注射筒的 位置和内容物，最好是藉著三到五個字母碼來確認，包括 其濃度和使用體積；想要合成的肽序列利用三到五個字母 的辨識碼；以及每個肽自己的辨識碼和㈣。較佳的是系 j對使用者提示資訊。然而，也可以另外在開始肽合成之 前，將這些資訊輸入或儲存在檔案或資料庫中。 一登記待合成序列的順序，建立它們合成的優先權，並建 立—個合成行列a有利的是，任何化合物均可以任何優先 万式來登記。此外，额外的序列可與必要的合成計劃一起 加至合成行列中。若需要也可加入額外的試劑。 二以上的資訊中，系統計算胺基酸和試劑的含量是否足 以製備所有的肽α除非有足夠合成使用的胺基酸和試劑， 否則合成系統將不會開始合成’而改以"未準備好"來顯示 _ -__-19· i 張尺 (叫 Α4 規格(2!0><29在 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 丁 . Α7 Β7 457 130 五 '發明説明飞.17 其現況。重要的是，上述的時間安排計劃容許有效率地操 縱多重合成工作’ ®爲在多重肚合成系統中’需要利用機 器人系統的主動合成步驟，與不同合成循環的被動合成步 驟同時進行。而且因爲合成資源對每個完成的合成作用而 言是可立即利用的，所以新肽的合成不需等待整組想要的 肤完全合成，便可以開始。較佳的是，可根據需要從已經 獲得優先權之肽等待名單上端取得新的肽合成。有利的是 ’可在任何時侯更改優先等待名單，包括加入或刪除任何 肽兩者’以滿足不同的狀況。此外，可以停止目前正在合 成的，何肽，而不會影響其他肽的合成。 有利的是，因爲在試劑容器與反應容器之間，或是在混 合主與反應容器之間都沒有物理連接，所以在相同或不同 的肽合成作用中’可以使用不同的試劑和反應條件。當然 ’這種容許圖書館方式之合成的彈性，需要各式各樣的結 構單元試劑。 1 錢 欲測試上述新6肽合成系統的可靠性和生產量，根據本發 明之基本原理，利用RAM TentaGel樹脂合成五種不同的肽_ 醯胺類（IKRKR，VRYGI，AAAGY，FPRGR，VYFAW)。並 使用混:合物K(82. 5%的三氟乙酸、5%對甲苯酚、5%茴香 硫醚、2· 5%乙烷二硫醇和5%水）仗支鏈去保護，並從樹脂 上切開該肽。由該實驗練習的結果，以分析級梯度HPLC 示跡及利用質譜儀的分子峰値分析爲基礎，指出其爲高純 度的粗製物質。 明瞭各種其他的修改，亦對熟諳此藝者顯而易見的，並 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2i〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 130 A7 B7 五、發明説明（.18 ) 不違背本發明之範園與精神。例如，本發明之基本原理可 同樣地適用於任何涉及諸如沖洗、去保護作用和偶聯反應 之類重複程序的化學--尤其是固相合成，包括但不限於在 Borchardt等人，J. Am. Chem. Soc., 116: 373 (1994) ； Chen 等人，J. Am. Chem. Soc.，116: 2661 (1 994) ; Simon等人， PNAS, 89: 9367 (1992) ; Nikolaiev等人，Pept. Res., 6: 161-70 (1993);以及 Lebl等人，第 5册：541-548，Techniques In Protein Chemistry, Academic Press, San Diego (1994)中描述 的有機反應。 因4，並不企圖以文中陳述之説明來限制文中的申請專 利範圍，寧可將申請專利範園解釋爲包括所有屬於本發明 、可申請專利之新穎事物的部件，包括所有^於本發明、 如同其同等物一樣由熟諳此藝者來處理的部件。 II. I I - -- - I -- 1 I I I I -I— I— T -I 1 n . . I.....I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 尺 張 紙 本 準 一標 一家 國 I國 一中 用 適 一雜 -錄 踩------r--,

Claims (1)

1. 4571 第8510191¾¾專利申請案 中文_請專利範圍修界夺(87年3月） βϋ Α8 ! 68 ! C8 . D8 ! β.· /. 申請專利範圍 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裳 1·—種有機化合物多重物錄m』人上 . 莖物種的固相合成系統，各有機化合 、:二重複合成循理的合成步驟形成，該系統包括： / 丁程式7的g m程式指令係與各別該多重物 種之合成㈣㈣Μ成猶财相互關連； 電腦的自動機器人，該自動機器人運轉而诱發 ::各個該多重物種之合成循環來進行的該合成步驟； “式扎7提供並由電腦執行的時間安排計劃，用 少兩個要同時完成的不同物種的合成步驟，該 =間女排計割係決定於該合成循環中該至少兩個不同物 種的合成步驅時間是否足以啓 少兩個不同物種之另-的合成步驟。 2. =1請專利範園第1項之系統，其中該物種分別具有相 =列獨特之時間安排計劃，目前在合成中的物種’ 序列獨特〈時間安排計劃的編幕物則 2時間安排計劃，該系統更進一步包括決定在新二 物種的序m轉之時間安排計心要 訐到 > 門θ τ ‘ 丨只系積知邊艾時間安排 間’疋否有時間調整上之衝突的方法。 3·根據申請專利範圍第1項之系统，並由"人Λ 洗、加入去保護試劑、去保嘆作用成步躁包括沖 聯反應的步骤3 ^曼作用、加入偶聯試劑及偶 4.根據申請專利範圍第1ιΜ之系統，其中 動和被動合成步驟，該時 匕括王 第一個八士士 ^ 文邵寸里'丨扣導弟—個物種的 〇成中的孩主動步戰’使其與第二個物種的第二 (请先聞讀背面之注意事項洱丨寫J,4kar ) .I 1 I -I HI II ----装. 線 本紙張咖 45713〇 經濟部中央揉準居負工消费合作社印装 AS B8 C8 m 六、申請專利範圍 個合成中的該被動步驟同時進行。 5·根據申請專利範園第1項之系統’其中該有機化合物包括 肽類。 6.根據申請專利範固第1項之系統’其更進一步地包括了： 第一组複數的注射筒，每個注射筒含有用來使化合物重 覆偶聯到固態支撑體上的樹脂’以便合成第一個物種； 以及 第二组複數的注射筒，每個注射筒含有想要的化合物， 在一個該合成循環期間中，將該想要的彳匕合物偶聨到固 態支撑體上。 7-根據申請專利範圍第6項之系統，其中待偶聯的該化合物 是用於肽合成的胺基醆3 8. 根據申請專利範圍第7項之系統，其中該固相合成爲 Merrifield固相肽合成。 9. 根據申請專利範園第6項之系統，其中該自動機器人包括 回應該電腦的抓握手臂，該抓握手臂選擇性地置於定位 並操縱得自第一组和第二組複數注射筒的注射筒，並藉 此抽吸或配送在該合成循環中需要的溶劑和試劑。 10·根據申請專利範圍第1項之系統，其更進一步地包括含有 合成菽有機化合物多重物種所需之參數變數的資料庫， 該货料庫含有每個該多重物種之重複合成循環的獨特序 列。 11. 一種多重肽的固相合成系統，每個肽係由重複合成循環 的合成步驟形成，該系統包括· -2 本纸張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（21〇X297公聲 ---------1------IT------# (請先閲讀背面之注意事項声寫本頁) 457130 A8 Β8 CB · _—____ D8 六' 申請專利範圍 第一组注射筒，每個均裝有固態支撑體； 第二組注射筒，每個裝有所欲的胺基酸，該第—組注 射筒擔任反應容器，以便將得自第二组注射筒的所欲胺 基酸偶聯到固態支撑體上； 進行程式指令的電腦，該程式指令係與爲了多重肽合 成而預先設定之合成循環有相互關係；以及 回應is電腦的自動機器人，該自動機器人連接到該第 一和第二组注射筒來運轉，抽吸及配送試劑，以便誘發 該重複合成循環根據所欲的肽合成來進行，藉此重複偶 聯想要的胺基酸至固態支撑體上，該重複合成循環包括 沖洗、加入去保護試劑、去保護作用、加入偶聯試劑及 偶聯反應的合成步骤， 根據時間安排計劃進行該重複合成循環，其中該沖洗 、加入去保護試劑或加入偶聯試劑，係與不同肽合成的 該去保護作用或偶聯反應同時進行。 12. 根據申請專利範圍第η項之系統，其中該第一组注射筒 係用聚两埽製造。 13. 根據申请專利範圍第1 1項之系統，其中該第一组注射筒 每個都包含有固相保留裝置。 經濟部中央榇準局負工消費合作社印繁 (請先閲讀背面之注意事項再々寫本頁) 14_根據申請專利範圍第1 3項之系統，其中該固相保留裝置 爲玻璃料。 15·根據申請專利範圍第u項之系統，其中該固態支撑體包 括選自聚苯乙烯和聚乙二醇的樹脂。 1C根據申請專利範圍第11項之系统，其中該自動機器人包 -3- i紙張尺度適用中國國家樣车（CN7yA4規格（27^7iF) 45713〇 ABCD 經濟部中央揉準局貞工消費合作社印製 六、申請專利範圍 括連結該機器人運轉的手臂，以便操縱該第一和第二组 中的每個注射筒。 17. 根據申請專利範園第1 6項之系統，其中該第一和第二组 _注射筒中每個均包括連結於其上運轉的柱塞，該柱塞可 由該自動機器人的手臂來移動，並藉此抽吸或配送試劑 18. 根據申請專利範圍第丨7項之系統，其中在每個該注射筒 中試劑的内含量，係由相同注射筒之栓塞位置來決定。 19. 根據申請專利範圍第丨1項之系統，其更進一步地包括對 該第一和第二组注射筒移動有反應的光學感應器，該光 學感應器確認該第一和第二组注射筒是否置於適當之處 〇 20. 根據申請專利範圍第丨丨项之系統，其中該肽合成係使用 Fmoc/tBu化學。 21‘根據申請專利範圍第〗丨項之系統，其更進一步地包括活 塞幫浦和遞送杯，該活塞幫浦遞送溶劑及試劑至該遞送 杯，而該第一和第二组注射筒再由該遞送杯中配送或抽 吸該溶劑或試劑。 二·根據申請專利範圍第1}項之系統，其更進一步地包括含 有多重肽合成所需之參數變數的資料庫。 種有機化合物多重物種之固相自動合成的方法，該有 機化口物係藉著重複合成循環之合成步驟而形成，該方 法包括下列步驟： )使物種之合成循環中的合成步驟開始； *紙張尺度適^ 裝-- (請先閱讀背面之注意事項异寫本頁) 訂 I I I . In - - - -. I I I mu —^ϋ 經濟部中央#準局貝工消費合作社印製 457130 A8 B8 C8 ' __DS 六、申請專利範圍 b) 決定步碟a)的該合成步聲，其所需時間是否足以使 不同物種的合成循環中之合成步驟開始，且若是如此 c) 使該不同物種之合成循環中的合成步驟開始；並 d) 重複步驟a)、b)及c) ’直到合成該多重物種爲止。 24. 根據申請專利範圍第2S項之方法，其中爲了合成多重肽 ’該合成步驟包括沖洗、去保護作用和偶聯反應3 25. 根據申請專利範圍第24項之方法，其中該去保護作用和 偶聯反應係以擔任反應容器之複數注射筒進行。 26. —種多重肽自動固相合成的方法，該多重肽係由冲洗、 加入去保護劑、去保護作用、加入偶聯試劑及偶聯反應 之重複循環形成，以便可將胺基酸重複偶聯至固態支律 體上’該方法包括下列步騾： a) 使第一組注射筒分別裝滿樹脂固態支撑體： b) 使第二組注射筒分別裝滿所欲的胺基酸； d) 以第一種溶液沖洗該第一組注射筒中的一個； e) 將去保護溶液加至步驟d)的注射筒中，開始去保護 作用； 若芫成重複進行步驟d)和e)的時間少於去保護作用 所需的時間，便與步驟e)之去保護作用同時重複進行那 些步驟，否則進行步驟g); g) 將偶聯溶液加至步驟d)的注射筒中，開始偶聯反應 ，藉此偶聯所欲的胺基酸至固態支撑體上：且 h) 若芫成重複進行步骤f)和g)的時間少於偶聯反應所 需的時間’便與步驟g)之偶聯反應同時重複進行那些步 -5- 本紙張尺度顧帽g]家料（⑽）纟4祕（加χ297公瘦} ---------^------ΐτ------^ (請先閏讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 4571 0 經濟部中央橾準局負工消費合作社印裳 A8 BS C8 D8 κ、申請專利範圍 躁’否則進行步驟d)和e)，直到偶聯反應時間期滿爲止 〇 27‘根據申請專利範圍第26項之方法，其中重複步驟a)到h)直 到合成肤爲止。 28.根據申請專利範圍第26項之方法，其更進一步地包括在 加入偶聯溶液之前，沖洗每個該步驟d)之第一组注射筒的 步驟。 29·根據申請專利範園第26項之方法，其中經由使用機器人 而使該系統爲自動的，該機器人藉著操纖注射筒抽吸及 配送試劑，來加入偶聯和去保護溶液。 3〇.根據申請專利範圍第2 6項之方法，其中該第一種溶液爲 —甲基曱酿胺。 31‘根據申請專利範圍第26項之方法，其中該去保護溶液爲 六氫吡啶/DMF。 32. 根據申請專利範圍第26項之方法，其中該偶聯溶液爲 DlC/HOBt溶液。 33. 根據申請專利範圍第2 6項之方法，其更進一步地包括以 交互影響之方式提示使用者參數變數的步驟，藉此形成 合成多重肽所需的資料庫，該資料庫包括每個多重肽的 獨特胺基酸序列= 34. 根據申請專利範圍第26項之方法，其更進一步地包括對 待合成肽之名單加入或删除肽序列的步骤。 35. —種有機化合物多重物種之固相自動合成的方法，該有 機化合物係由重複合成循環的合成步驟所形成，該方法 -6 - 本紙張尺度適元*^國家標準（CNS } A4洗格（2Γ〇Χ297公釐） ^ ---------^------.π------^ (請先閱讀背面之注_項再琪寫本頁) 30 30 A8 B8 C8 D8 、申请專利範圍 包括下列步碟： 排4畫?疋與待合成之所欲物種有關的序列獨特之時間安 請 先 讀 背 面 之 注 意 事 項 I裝 页 個：孩序列獨特之時間安排計劃包括所欲物種的每 個合成步驟暫時在何時發生； 母 )‘決：目前正在合成之物種的累積停留時間 劃，孩累積停留乏^ . 、田〈時間文排計劃包括目前正在合成之物 種的每個合成步驟暫時在何時發生； =決^該序和特之時料排㈣與該累積 排計劃之間’是否有時間調整上㈣突存在，當 .^ 成步驟不能與目前正在合成 足物種的合成步驟同時 衝突。 U時進仃時，便出現了時間調整上的 訂 %根據申請專利範圍第 K万法，其更進—步地包括使 传合成乙所欲物種的人出pEf & & )σ成開始時間改變的步驟，以便解 決時間调整上的衝突s 37.根據申請專利範圍第35項之 .^ L 3<万去，其中當待合成之想要 物種的主動合成步驟，暫時 線 y 、 質呷與目則正在合成之物種的任 何王動合成步骤同時發味眭 ^ 甓生時，便出現了時間調整上的衝 大。 經濟部中央袜準局貝Η消費合作社印装 38- 根據申請專利範圍第35項乏 貝疋万去，其中該有機化合物包 括肚類。 39- 根據申請專利範圍第35项之古法 小。貝夂万法，其更進—步地包括輸 入合成該有機化合物所需之參數變數的步驟。 本紙張从適奸国國家標準（CNS) -7-