TW420717B - Monoclonal antibody against marijuna metabolites, hybridoma producing the antibody and the use thereof in the detection of the drug abuse of marijuna - Google Patents

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420717 A7 B7 五、發明説明（i ) 發明之領域 本發明係關於一種專一於大麻代謝物之單株抗體，產生 該抗體之融合瘤，及其用以檢測對大麻類濫用之用途。 發明之背景 大麻之主要作用於中樞神經及心臟血管系統，主要活性 成分爲d - 9 - THC-羧酸。其對中樞神攀系統之影響，會造 成間接之記憶受損、對耗費神經之工作執行能力降低，亦 . ^ 可造成神.經分裂之狀況發生。另外，其於心臟血管系統 上，會造成心跳加速，易發生心绞痛，狹心症，及免疫力 降低。大麻藥物之耐藥性在低劑量及不常使用的情形下並 不顯著，但其發生在高劑量及持續、長期使用之狀態下， 且可能會因突然中止而產生禁斷狀況，而大部分之耐藥性 是由於中樞神經系統之功能性及藥理性調整，而非代謝分 .解加速之現象。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 大麻植物最富藏之三種成分包括大麻酿' (Cannabinol CBN) ’ 大麻二酴（Cannabiadiol，CBD)及四氫大麻，驗（Tetrahydrocannabinol， THC-羧酸）異構物。四氳大麻酚之異構物中，具有大麻部 分大部分之經神性之作用之化學成分爲β - 9 - THC -羧酸， 又稱爲L - β - 9 - THC -羧酸，另一成分β-8 - THC作用與其相 似，但含量少，β - 9 - THC作用約爲β - 8 - THC之20倍。 β - 9 - THC -羧酸在在體内很快地會轉變爲仍具活性的代 謝物11 -羥基-d - 9 - THC，其作用與β - 9 - THC -羧酸相似， 且進一步代謝成爲極性化，無活性之代謝產物，經由尿 液、糞便排除。較常見之代謝物爲11 -羥基-9 - THC - 9 -羧 _47492-l.DOC_~ 4 ~；_ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） A7 420717 B7 五、發明説明（2 ) 酸，其爲可經由膽排泄之代謝物，且可能會被再吸收。然 而，仍有極微量未被代謝的Θ - 9 - THC -羧酸可於尿中被發 現。β - 9 - THC -羧酸及代謝物11 -羥基-d - 9 - THC之血中濃 度達到高峰後急速下降，並快速分佈於末梢脂肪組織而進 行缓慢代謝。c? - 9 - THC -羧酸及代謝物在人體血液中可維 持數天甚至一周後，此與其可由尿液中測得之實際情形， 結果一致α f . 大麻濫.用情形相當廣泛，大麻長期使用後，雖不會像其 他成癮性藥物會使障害表面化，且其發病頻率較低，但一 旦對其無警戒心進而濫用，易成爲其他成瘾藥物濫用之藥 引，奠定多種藥物混合濫用之基礎，故研發可檢測大麻之 檢驗試劑有其必要。 ' 濫用藥物篩檢分爲兩大步驟：初步篩檢及進一步之確認 (Drug of Abuse Testing Market, Theta Corp. 1991)初步篩檢需具有高敏 感度，使用方便，並適合處理大量樣品之特性，經篩檢後 之陽性樣品再由具高特.異性及精確性之方法，如氣相層析 / 質譜儀（J. Chromatography，617:265, 1993)，力π 以確認，目前市 售用來篩檢大麻類藥物濫·用之分析方法包括薄層層析 (TLC)，高效能液相層析（HPLC)，氣机一質譜層析（GC / MS) 及免疫分析（Immmioassay)。其中以利用多株或單株抗體發展 出之免疫試劑爲佳，除具高特異性及敏感度外，使用方 便，反應快速，且樣品不需經過任何前處理之步驟，利於 大量篩檢。本發明提供針對大麻及其代謝物具有高特異性 之單株抗體，並研發完成檢驗試劑。 _47492-l.DOC_~ 5 ~_；_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----^-------------—1T (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印— 420717 五、 發明説明（

瘤 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 - 爱-盟之概述 本發明之·一目的爲提供一種對大麻及其代謝物具專—性 之單株抗體。 本發明之另一目的爲提供—種分泌該單株抗體之融合 〇 本發明更有另一目的爲提供檢測大麻濫用之方法及套 本發明之目的、優點及特徵可由下列之説明而爲明瞭。 屬式之簡單説明 · 圖一爲大麻直接競爭型ELISA之標準抑制曲線。 圖二爲大麻簡易層析免疫測試片於不同濃度大麻之測試 結果。 發明之詳細説明 本發明對大麻代謝物具專一性之抗體，係由融合瘤細胞 株產生的抗體。 、 本發明可利用習知技術，使用大麻之主要代謝物d _ 9 _ THC -幾酸爲抗原，以b細胞融合方式製得b細胞融合瘤。 特定言之，其方法包括利用習知之細胞融f合劑，如 醇（PEG)，將鼠源骨髓瘤細胞株與產生對抗大麻抗體的B淋 巴細胞融合，以HAT篩選融合瘤細胞株，再用間接酵素鈐 合酶連免疫吸附分析法（ELISA)及競爭型ELISA分析融合瘤培 養基液中抗體之專一性，再選取對& _ 9 _ THC _羧酸具專_ 性之單株融合瘤細胞株。然後將該融合瘤細胞株注入小白 鼠腹腔中以生產腹水，增生專一性抗體。

47492-l.DOC 本紙張尺度通用宁國國家標準（CNS ) A4祕（21〇χ297公釐） {請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)

420717 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

C0R

五、發明説明（4 ) 免疫分析的特異性及敏感性取決於抗體的特性，而是否. 能產生專一性抗體，免疫原的設計及製造爲主要關键。尤 其是分子量小於1000道爾頓的藥物如夫麻，由於其分子量 小，在免疫原上屬於半抗原，單獨存在時不會刺激免.疫系 統產生免疫反應，一般需將小分子半抗原物與大分子量具 免疫原性的載體蛋白質結合，藉著載體的免疫原性協助半 抗原產生免疫力。故小分子半抗原與載體結合體的設計、 結合及製.備.方法等均會影響抗體的品質及專一性。 本發明利用β - 9 - THC -羧酸衍生物與載體蛋白質之結合 體（conjugate)做爲免疫原，該d - 9 - THC -瘦酸衍生物具有以 下通式： X = 0 或N ; η = 2 - 4 ;且 m = 1 - 3。 474QP-1.nor - Ί - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） ---------r,i 装-----—1T (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 420717 五、發明説明（5 ) 載體蛋白質可使用例如白蛋白、球蛋白、血藍質、鐵蛋 白質等，在本發明之一具體實施例中，係應用《-9 - THC-COO -氮代氳氧基環丁二亞醯胺與牛血白蛋白之結合體當 做免疫原。 利用本發明產生之單株抗體可發展製成酵素免疫分析套 組及/或方法，用以檢測大麻濫用情形。如直接或間接競 爭型之酵素免疫分析套組及/或方法，尤其是分析檢驗片 (One Step CJiromatographic Dip Stick)，方便性高。 直接競爭型免疫分析法是將β-9 - THC-COO -氮代氫氧基 環丁二亞醯胺與牛血白蛋白之結合體粘附在固相支持物之 表面。測試時，不同標準濃度之- 9 - THC -羧酸或待測樣 品，與已連接有訊號（如酵素，螢光劑，放射元素等）的抗 d-9-THC-羧酸之單株抗體之複合物，一起置入反應。由 於β - 9 - THC -羧酸會與有限之β - 9 - THC-COO -氮代氫氧基環 丁二亞醯胺與牛血白蛋白之結合體相互競爭與抗β-9-THC -羧酸抗體一訊號複合物結合，故藉已知標準濃度的β -9 - THC -羧酸所產生訊號強弱而建立標準曲線，可檢測待 tT' 測尿液樣品β - 9 - THC -羧酸是否存在及其含量。 直接競爭型免疫分析套組之具體實例，包括⑴固相支撑 物質，⑵- 9 - THC -羧酸之衍生物與載體之結合體，⑶β -9 - THC -羧酸標準品，⑷抗β - 9 - THC -羧酸之單株抗體一訊 號複合物，及⑸呈色物質。固相支·撑物質可爲微滴盤 (microtiter plate)、微球體（beads)及紙（paper)，係由適宜蛋白質 固定的材料構成，適用之材料可爲例如聚乙晞、聚苯乙 _47492-l.DOC_；_" 8 ~_;_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) W衣 _ 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 420727 經濟部中央椟準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 婦、硝化纖維、耐龍等。訊號可使用例如螢光物，如鑭系-勞光物；冷光標記物（luminescents)，如生物冷光標記物及化 予冷光標記物；放射性元素；及酵素，如過氧化氫酵素、 鹼性磷酸酯酵素、卢半乳糖酵素等。該分析方法及反應 條件係利用習知技術（Antibody : A Laboratory Manual Harlow &

Dayid Lane，1988)。 實施本明之較佳具體實例爲簡易層析式免疫分析檢驗 片’其可_包括⑴樣品择觸區，⑵抗d _ 9 _ THC -幾酸·—指示 劑區，⑶反應測試區，及⑷液體回收區。該檢驗片是由可 提供毛細現象並吸附液體之材質之多孔性載體物質所構 成，例如滤紙、硝化纖膜、对龍膜、破璃纖維膜等。指示 劑可使用例如有顏色乳膠顆粒，例如聚苯乙烯、聚乙晞甲 苯、聚苯乙缔一丙烯酸及聚丙烯醛等材料的聚合物；金屬 膠質溶液，例如矽膠溶液，及染料膠質溶液，該等原料皆 係商業化產品。 樣品接觸區位於檢驗片之一端，與待測樣品相接觸，將 吸附之樣品依毛細現象向另一端移動，以致濕透整個檢驗 片。指TF劑區接近樣品接觸區，該區以乾燥形式聚集有抗 d - 9 - THC -叛酸的單株抗體與具高穩定性、不需特殊儀 器、用肉眼即可判讀的指示劑的結合體。測試區位於指示 劑區之上方’遠區固定有顯色反應物，如^ -羧 酸一載體抗原結合體，可與抗4 _ 9 _ THC -羧酸抗體—指示 劑發生反應，而顯現出—肉眼判讀之訊號變化。 反應測試時，將檢驗片之樣品接觸區端與已知標準濃度 -—47州-·).·_一 本度適用中國國---- --------------—1T (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 20717 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（7 ) 之<5· _ 9 - THC -瘦酸尿液及待測樣品相接觸。尿液依毛細現· 象向上浸濕，並回溶抗體一指示劑結合體。若尿液中含有 J _ 9 _ THC _瘦酸，貝”會與測試區上的J _ 9 THC _叛酸一載體 抗原相互競爭有限的抗β - 9 - THC -羧酸一指示劑結合體， 故樣品中β - 9 - THC -羧酸含量愈高，測試區陽性訊號愈 弱。由測試區反應之有無及強弱，可判定尿液中是否含有 d-9-THC-.羧酸及其含量。 ► 爲了使本發明的目的、方法、特徵及原理更清楚明瞭， 茲以下列實例配合附圖作詳細敘述，但此等實例並非用以 限制本發明範園。本説明書中之英文簡窝名詞係如下定 義·· HAT :次黃 ρ票呤（Hypoxanthine) / 胺基蝶呤（Aminopterin) / 胸 腺核苷。

Tg :牛甲狀腺球蛋白 FCS :胎牛血清 ‘ DMSO :二甲基亞颯 PBS :磷酸鹽缓衝溶液 TMB :四甲基聯苯胺（Tetramethyl benzidine) BSA :牛血清白蛋白 實例一：融合瘤（3402 - 13.9)的製造 Θ - 9 - THC-COO -氮代氳氧基環丁二亞醯胺一牛血清白蛋白 之製備方法 取14 mg之d - 9 - THC-COO -氮代氳氧基環丁二亞醯胺溶於 2.8 ml DMSO中，再取2.55 ml之溶液加入20 ml牛血清白蛋白 _47492-l.DOC _- 10 __·_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） ---------i—----—IT ../IV L (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 420717 at _____B7 五、發明説明（8 ) (100 mg/ 0.05 Μ碳酸鈉溶液）中，於冰浴中攪拌反應。隔夜 後’反應用50 mM (pH 7.4 )之磷酸緩衝液充分透析後，凍晶 保存。 融合瘤之製備方法 取d - 9 - THC-COO -氮代氫氧基環丁二亞醯胺與牛血清白 蛋白之結合體（- 9 - THC — BSA，莫耳數比爲30)與弗氏佐 劑（Freund's . adjuvant)(第一次免疫使用完全佐劑，後續之免疫 皆使用不完全佐劑）之1 : 1 (v/v)乳化液，經皮下注射入 BALB / C 小鼠（每隻使用 125 " g β - 9 - THC—BSA)，一週一次， 連續4次。然後每四週再補強一次（每隻40夕g β - 9 - THC— BSA)，共進行5次。進行細胞融合的前三天，再用靜脈注 射（不含佐劑）追加一次。三天後，將脾臟細胞與鼠源骨髓 瘤細胞FO細胞株（ATCC CRL 1646)，用50%之聚乙二醇-400 (PEG 400)，以1 : 3忠例，進行融合。融合後_，將細胞懸 浮於RPMI培養基（HAT，20% FCS)中，稀釋成1 X 105 FO細胞， 植入96孔培養盤中（0.2 ml /孔）。10天後，以吸附有β - 9 -THC -羧酸一牛曱狀腺蛋白結合體（d-9 - THC - COOH— Tg， 莫耳比爲30)之ELISA盤測試細胞培養上清液。選取具β - 9 -THC -羧酸專一性的融合瘤，以限制稀釋法予以單株化。用 此方法選出單株細胞之鼠源融合瘤細胞株3402 - 13.9，測其 分泌的單株抗體，知其爲IgG2a，Kappa輕鍵。此株融合瘤 (於含10% DMSO及90% FCS中）可以儲存於-70°C及液態氮中， 及使用標準之哺乳動物細胞培養技術（含10%胎牛血清之 RPMI 1640補充以200 mM穀胺醯胺及50 μΜ 2 -硫基乙醇）予以 47492~1.DOC__ _- 11 -___ 本紙浪尺度適用國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,装. -訂 17 A7 B7 五、發明説明（9 ) 培養。此株融合瘤已於民國八十六年七月九曰寄存食品工 業發展研究所之菌種保存及研究中心，經編號爲CCRC 960065 。 實例二：檢測大麻濫用的直接競爭ELISA法 抗原附著盤的製備方法 將d - 9 - THC-COO -氮代氳氧基環丁二亞醯胺一牛血清白 蛋白抗原用碳酸鹽缓衝液（pH = 9·6)稀釋2.5 pg / ml。取200微 升，附著.於96孔聚苯乙烯微孔盤之每孔表面上，於4°C過 夜培養。用0.05% Tween 20 - PBS沖洗3次，然後拍乾。每一微 孔中加入250 μΐ的0.1%脱脂奶粉-PBS，於4°C過夜阻斷。用 0.05% Tween 20 - PBS洗兩次，拍乾後備用。 抗d - 9 - THC 羧酸單株抗體一過氧化氫酵素結合體之製備 方法 先將過氧彳匕氫酵素（1.0 mg / ml)溶於去.離子水中，以100 mM 之過破酸鋼於室溫下氧化20分鐘。然後50 mM醋酸鋼溶液 (pH 4.5)透析除去過碘酸鈉。同時準備0.5 mg的抗d - 9 - THC -羧酸單株抗體，其先於0.2 Μ之碳酸鈉缓衝溶液下透析。取 以過破酸納處理過之過氧化氫酵素1.0 mg，加入0.5 mg之抗 d - 9 - THC -羧酸單株抗體（過氧化氫酵素與單株抗體莫耳數 比2比1 )於室溫反應2小時後，然後再加入20 mM硼氫化 鈉，於4°C過夜還原。將反應物用0.1 Μ醋酸鈉溶液（pH = 8.2) 透析24小時，每8小時換一次透析溶液，分裝儲存於-20°C 備用。 測試時，兮別取50 μΐ配製於陰性尿液中的β - 9 - THC -羧酸 47492-l.DOC - 12 - . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ---------------—訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 420 717 B7 五、發明説明（10 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 標準品（〇, 25, 50, 75及100 ng / ml)及表二及表三所列藥物（濃度 詳見表二及表三），加入附著d-9 - THC -羧酸-牛血清白蛋 白的微孔中，再加入150 μΐ之抗d - 9 - THC -羧酸單株抗體一 過氧化氫酵素結合體。混合後，置於室溫下震盪反應10分 鐘。然後將反應液丟棄，以0.05% Tween 20 - PBS充滿，然後 丟棄。重覆洗5次後，加入100 # 1過氧化氳酵素受質TMB，

I 於室溫下反應10分鐘後，加入100 A 1之2N HC1以中止反應。 測定 〇〇450 / 650 値。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表一爲β - 9 - THC -羧酸標準濃度的吸光値，及6個重覆測 試之變異係數（coefficient of variation，cv)及抑制百分比。可知每 一濃度的cv均小於10%。抑制百分比代表抗體對特定物質 的相對敏感度，其計算方法'爲（1 - 0D測試/ ODthccooh) ’其 中ODTHeeQQH爲不含β - 9 - THC -羧酸之陰性控制液之OD，而 OD測試爲含有不同濃度之THC-COOH或其他非β - 9 - THC -羧 酸之藥物（詳見表二及表三）之OD。圖一爲使用本發明直接 競爭ELISA，大麻所產生的標準抑制曲線。如用不含β - 9 -THC -羧酸陰性對照組變異係數10%的2倍標準偏差> 20%代 表明顯差異的話，則β - 9 - THC -羧酸直接競爭免疫套组之 敏感度可達2.5 ng / ml。 表二所列的118種非d - 9 - THC -羧酸之藥物，於100 pg / ml 測試時均不會產生> 20%抑制。添加不同濃度表三所列藥物 時，由所測得之濃度計算交叉反應百分比，發現除β - 9 - THC -羧酸外，3402 - 13.9單織技體亦可檢測到β - 8 - THC及其 \ 餘大麻類（見表三）。 _47492-l.DOC_~ 13 ~_；_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 420717 A7 B7 五、發明説明（u) 利用本發明的直接競爭ELISA套組測試I68個樣品，其中 44個氣相層析/質譜儀確認爲陽性’其餘確認爲&性斗 ELISA用2 5〇 ng / ml判爲陽性，則本試劑與氣相層析/ ^ 儀所得結果之準確性98.81%、敏感性1〇()()ΰ/ 質故 98.39%，其結果詳見表四 及專 (请先閲讀背面之泣意事項存填寫本買〕 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 上/於 —---------1)1----^——K----! 47492-l.DOC - 14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0'犬297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 420717 at ^_-_ 五、發明説明（12) 表一<y - 9 - THC -羧酸標準品於不同濃摩之六重複測試 ng/ml OD 平均 %Β/Βο CV 250 0.106 0.102 0.105 0.107 0.103 0.127 0.108 4.5 8.6 100 0.439 0.417 0.417 0.470 0.537 0.469 0.458 19:1 9.9 50 1.809 1.936 1.688 1.650 1.862 1.784 1.788 74.6 6.0 25 2.314 2.324 2.092 1.999 2.232 2.194 2.193 91.5 5.8 10 2.454. 2.464 2.251 2.192 2.347 2.297 2.334 97.4 4.7 5 2.501 2.605 2.434 2.205 2.365 2.344 2.409 100.5 5.7 0 2.563 2.675 2.305 2.232 2.326 2.279 2.397 100.0 7.5 ---------11 (請先閲讀背面之ίΐ·意事3!-再填寫本頁) -訂 .doc 15 本紙張又度適财_家標準（CNS ) A4規格（2lGx297公瘦） 420' 7 A7 B7 五、發明説明（13) 表 二與本發明大麻直接競爭型酵素免疫檢驗試劑不具交 叉反應之藥物 ---抑制百分比小於20%之藥物（i〇〇pg/ml) 對乙醯胺基驗(acetaminophen) ♦ cimetidine ----------)ulI —.-I—IT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 乙醅嗎啡(acetylmorphine) 胺茶驗(aminophyline) aminotriplyline 安非他命(amphetamine) 抗壞血酸(ascorbic acid) 天冬胺酸(aspartic acid) 阿托品(atropine) 阿斯巴甜(aspartam) 去水嗎啡(apomorphine) 巴比妥(barbital) 苯甲酸(benzoic acid) 权丁'^(buprenorphine) 咖啡驗(caffeine) 大麻二酿-(cannabidiol) 卡比沙明(carbinoxamine) 氯徽素(chloramphenicol) chlordiazepoxide 氯苯吡丙胺順丁烯二酸鹽 (chlorpheniramine maleate) 氣丙嗦(chlorpromazine) 檸檬酸(citric acid) 古柯驗(cocaine) 去氧麻黃驗(deoxyephedrine) 去曱丙咪**秦(despramine) 去曱西泮(desmethyldiazepam) dextromethorphan 二乙胺苯酮(diethylpropion) 二氳可待因(dihydrocodeine) 苯海拉明(diphenhydramine) 地利洛讲(dirprenorphine) 麻黃驗(ephedrine) 腎上腺素(epinephrine) 紅黴素(erythromycin) 乙基對-胺基苯甲酸酯 (ethyl-p-aminobenzoate) EDTA二納鹽 (EDTA disodium salt) 非諾洛芬(fenoprofen) 慶大黴素(gentamycin) D-(+)-葡萄糖(D-(+)-glucose) 16

47492-1.DOC 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 420717 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（14) r ] ♦ 愈創甘油醚(guaiphenesin) ♦ 晞丙嗎>#(nalorphine) 1 ♦ homotropine ♦ 納洛嗣(naloxone) 1 I ♦ 對-#呈基甲基安非他命 ♦ 納酮(naltrexioiie) 請 先 閲 讀 背 1 1 (p-hydoxymethamphetamine) ♦ 煙醯胺(nicotinamide) 1 1 ♦ 氫可待酮(hydrocodon) ♦ (+)尼古丁 (X+)nicotin) 面 之 注- I ♦ 氫嗎啡酮(hydromorphone) ♦ 去甲嗎•(nonnorphine) 意 事 1 1 ♦ ♦ haloperidol 羥基酚乙胺 ♦ ♦ 去甲替林(nortriptyline) 諸司咳平(noscapine) ；* 再 填 寫 本 頁 / 、 (、裝 ♦ ibuprofen ♦ •粟驗(papaverine) 1 I ♦ 丙咪嗓 HCl(imipramine HC1) ♦ 青黴素 G(penicillin G) I 令 p 引p乘美辛(indomethacin) ♦ 戊吐星(pentazocine) I ♦ 苯氧丙驗胺(isoxsuprine) ♦ 對乙縫胺基苯乙醚(phenacetin) ΊΤ ♦ 氣胺酮(ketamine) ♦ 苯環己旅遗(phencyclidine) 1 ♦ 拉貝洛爾(labetalol) ♦ 苯乙耕(phenelzine) 1 ♦ 利多卡因(lidocain) ♦ 苯巴比妥(phenobarbital) 1 1 ♦ 碳酸carbonate) ♦ 苯丁胺(phentermine) .1 1 ♦ 氯幾安定(lorazepam) ♦ 苯腎上滕素(phenylephrine) I ♦ 1-甲基安非他命 ♦ 苯乙胺(phenylethylamine) I (1-methamphetamine) ♦ 苯丙醇胺(phenylpropanolamine) 1、 ♦ 美芬丁月安(mephentermine) ♦ prazosin 1 ♦ 氳經嗎嗔鲷(oxymorphone) ♦ 潑尼松(prednisone) « 1 | ♦ (+)美沙酮((+)methadone) ♦ 去氧苯比妥(primidone) 1 1 ♦ p塞ρ比二胺HCl(methapyrilene HC1) ♦ 普魯卡因胺(procainamide) 1 1 ♦ 甲基麻黃驗(methylephedrin) ♦ 普魯卡因(procaine) 1 1 47492-l.DOC -17 — 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央榇準局員工消費合作杜印製 42071? 五、發明説明（15) ♦異丙"^(promethazine) ♦丙氧芬(propoxyphene) ♦僞麻黃驗(pseudoephedrine) ♦ 金難納驗(quinine) ♦雷尼替丁 (ranitidine) ♦柳酸(salicylic acid) ♦鍵徽素(streptomycin) ♦番木繁驗(strychnine) ♦廉糖(sucrose) ♦乙酿確·胺(sulfacetamide) ♦續胺二_ (sulfadiazine) ♦場胺二甲氧淀(sulfadimethoxine) ♦續胺甲喊淀(sulfamerazine). ♦續胺二甲 p密淀(sulfamethazine) ♦項胺甲 p塞二峻(sulfamethizole) ♦續胺甲異崎峻(sulfamethoxazole) ♦ 績胺甲氧p比嗪 (sulfamethoxypyridazine) ♦ 磺胺間曱氧嘧啶 (sulfamonomethoxine) ♦橫胺(sulfanilamide) ♦ _ 績胺硝苯(sulfanitran) ♦_ 確胺'^'^^(sulfaquinoxaline)

_47492-1.DOC A7 B7__一 ♦續胺 p塞峻(sulfathiazole) ♦苯績峻酉同(sulfinpyrazone) ♦績胺異崎嗅(sulfisoxazole) ♦特普他林(terbutaline) ♦四環黴素(tetracycline) ♦四氳峻'^(tetrahydrozoline) ♦茶驗(theophylline) ♦ tripleleimamine ♦ 去甲可待因(norcodeine) ♦路胺(tyramine) ♦ (+)溴苯吡丙胺順丁烯二酸鹽 ((+)bromphenkainine maleeate) ♦ (+)2,5-二甲氧基-4-甲基安非他命 ((+)2,5 -dimethoxy-4-methylamphetamine) ♦ 4-dimethylaminoantiprme ♦ DL-b-羥基乙胺 (DL-b-hydroxyphenethylamine) ♦ (+)3,4-亞曱二氧安非他命 ((+)3 ,'4-methylenedioxy-amphetamine) -18 - -----------)!/#-------tr (请先閲讀背面之注意事項鼻填寫本貫〕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0><297公釐） 420717 A7 __B7_ 五、發明説明（16) 表三與本發明大麻直接競爭型酵素免疫檢驗試劑具交叉. 反應之藥物

測試化合物 所加濃度(ng/ml) 所測濃度 %交叉反應性 8-THC 1,000.0 2343.2 234.3 500.0 1178.7 235.7 250.0 780.9 312.4 125.0 451.4 361.1 62.5 275.0 440.0 31.3 219.0 699.7 20.0 44.0 220.0 10.0 149.2 1492.4 8-THC-C00H 1,000.0 436.7 43.7 500.0 247.3 49.5 250.0 100.3 40.1 125.0 20.7 16.6 8yS-<y 9-THC 1,000.0 237.3 23.7 500.0 42.3 8.5 250.0 17.2 6.9 8^-ll-:.-d9-THC 1,000.0 537.3 53.7 500.0 48.3 9.7 11--羥基-d 9-THC 1,000.0 137.5 13.8 500.0 117.2 23.4 250.0 30.8 12.3 cy 9-THC (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1,000.0 584.3 58.4 500.0 326.6 65.3 250.0 255.2 102.1 125.0 162.6 13.0 62.5 102.9 164.6 31.3 68.6 219.2 20.0 44.1 220.5 10.0 28.4 ’ 284.0 19 -

47492-1.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 大麻盼 100,000.0 37.3 50,000.0 '28.3 25,000.0 20.3 ii ο· ο* ο* Α7 Β7 420717 五、發明説明（17 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表四大麻G C / M S測試結果與大麻直接競爭型E LI S A定 性測試比對結果 檢體數目：168 > ELISA + _ GC/MS + 44 0 2 122 敏感性： 100.00% 專一性： 98.39% 準確性： 98.81% 實例三：檢測大麻濫用的簡易層析式免疫分析法 抗β - 9 - THC -羧酸抗體（3402 - 13.9)—膠體金結合體之製備方 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 法 取240 ml之膠體金置於乾淨之500 ml血清瓶中，用20mM之 Na2C03調整pH至7.5。加入0.72 ml之抗Θ - 9 - THC -羧酸抗體 (3402 - 13.9)，攪拌反應3分鐘。再加入24 ml之10% BSA _磷 酸鹽緩衝液，並攪拌反應5分鐘後，於室溫下靜置2小時。 加入12克之trehalose，於室溫下混合溶解均勻，再加入0.24 ml 之10% Triton X - 100混合均勻，即完成抗d - 9 - THC -羧酸抗體 47492-l.DOC - 20 . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210 X 297公釐） 五、發明説明（18) (3402 - 13.9) —膠體金結合體之製備。儲存於4°C。 簡易層析式免疫檢.驗測試片之製備 將孔隙5 μιη的硝化纖維（Schleider & Schnell)赏成長寬爲30公 分X 2.0公分之薄片。在距寬邊（2.0公分）之頂端約0.75公分 (控制區處）及1.25公分（測試區處），分別用噴槍（36 psi之壓 力）將難抗老鼠IgG的抗體（1 mg / ml)及β - 9 - THC -羧酸一牛血 清白蛋白（p.3 mg/ml)噴於該二處，使成約0.8毫米寬度之線 狀。置於室溫下風乾30分鐘後，再將其置於含有阻斷缓衝 液（0.25% 酪素，0.01% Triton X - 100，3% Trehalose - PB (20 mM)中。 於室溫阻斷30分鐘後，取出置於20°C，30%濕度恆溫濕室 中乾燥30分鐘。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事务再填寫本頁) 剪取一長寬30公分X 7公分，單面有膠的塑膠背板。在距 寬邊（7公分）頂端的4.2公分至6.2公分處，附著上述已製備 好的硝化纖維膜。由頂端至3公分處，粘附30公分X 2.4公 分的滤紙（Whatman)。於下方樣品接觸區，黏附一張30公分 X 1公分抗大麻抗體一膠體金結合體條片，每沿背板下緣覆 蓋一層4.2公分X 30公分對折玻璃纖維膜。於恆溫（20°C)恆溫 (30%)室過夜乾燥後，切成0_8公分X 7公分之小薄片。 測試時，使其端之樣品接觸區浸泡於約200 〃 1含有d - 9 -THC -羧酸濃度分爲0, 25, 50, 75及100 ng / ml之尿液中，另有一 不含d - 9 - THC -羧酸之尿液作爲對照组3 - 5分鐘後，若控制 區及測試區均出現紅色訊號，則反應爲陰性，表示樣品中 不含所欲偵測之大麻：若只有控制區顯現紅色訊號，而測 試區未顯現紅色訊號，則反應爲陽性，表示樣品中含有欲 _47492-l.DOC____~ 2 1 ~_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 420717 Μ Β7 五、發明説明（ 19 檢測的大麻。測試結果如圖二 50ng/ml。 利用本發明的大麻簡易層析式簡易測試片套組測試168個 樣品，其中44個氣相層析/質譜儀確認爲陽性，其餘確認 爲陰性，則本試劑與氣相層析/質譜儀所得結果之準確性 爲9S.S1%、敏感性爲1〇0%及特異性爲98 39%，其結果詳見表 顯示此測試片之敏感度爲 五 諳 先 閱 % 背 面 之 注* 意 事 項*」 再（)1、 表五:::=測…與大麻簡易免疫測試片定性 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 檢體數目：168

專一性 準確性 本發明可視需要進行各種修改或變化形式，其亦涵蓋於 本發明範疇内。本發明涵蓋所附申請專利範圍所定義之本 發明之精神及範圍内之所有之修飾、類似及改變。

訂

Claims (1)

1. Ο λ, ^ ry 心υ 17447號專利申請案 中文申請專利範圍修正本(88年9月）

   申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 1. 一種融合瘤，其係產生專一於大麻代謝物5 - 9 - THC -羧 酸衍生物之抗體，其係鼠源融合瘤細胞株3402 - 13.9於民 國八十六年七月九日寄存於食品工業發展研究所之菌種 保存及研究中心，寄存編號CCRC960065。 2. 根據申請專利範圍第1項之融合瘤，其中該5 - 9 - THC -致酸衍生物具有以下通式 COR

   C5H11 其中 R 表-〇-〇 或-X - (CH2)n- X - C(O) - (CH2)m- C(O)— 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 X = O 或 N ; n = 2 - 4 ；且 且 m = 1 - 3。 3.根據申請專利範圍第2項之融合瘤，其中該（5 - 9 - THC -羧酸衍生物係6 - 9 - THC-COO -氮代氫氧基環丁二亞醯 胺。 4 一種抗5 - 9 - THC -羧酸之單株抗體，其係由根據申請專 利範圍第1項之融合瘤所製造。 〕：\47\47492-l.D〇C 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） i2 Α8 Β8 C8 D8 κ、申請專利範圍 5. 根據申請專利範圍第1項之單株抗體，其可用於檢測大 麻及其代謝物。 6. —種檢測疑含大麻樣品中大麻含量之方法，其包括下列 步驟： ⑻提供一由融合瘤34〇2_139所分泌之抗5_9_THC_羧酸 單株抗體： (b) 提供一訊號產生之物質’其能操作性地與抗^ _ 9 _ THC -羧酸抗體結合而產生訊號； (c) 使d- 9 - THC -羧酸抗原粘附在支撐物質上形成抗原一 支撐物質共軛體； (d) 使樣品或d-9-THC-羧酸標準液與抗原—支撐物質競 爭並與抗5 - 9 - THC -羧酸單株抗體—訊號結合體共軛 結合，並測量由訊號產生之物質所產生之訊號。 7-根據申凊專利範圍第6項之方法，其中該占_ 9 _ THC _叛 酸衍生物一抗原之結合體具有如下通式之3 _ 9 _ THC _叛 酸衍生物： (請先閱讀背面之注意事項再1^\本頁) 訂 泉 -濟部中夬樣準局員H消費合作社印製 COR

   1 C5H11 其中： _ 0：\47\47492-l.DOC 本^國國家標準（CNS )祕祕（21〇)<297公 4 9η

   、申請專利範圍 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 R 表一或-X - (CH2)n- X - C(0) - (CH2)m- C(〇) - j x = 0 或 N ; n = 2 -4 ； JL m= 1 - 3。 8·根據申請專利範圍第7項之方法，其中該-羧 酸衍生物係心9_THC-C00_氮代氫氧基環丁二亞醯胺。久 9.根據申請專利範圍第6項之方法，其中用以篩選該融合 $之載m蛋白質係選自白蛋白、球蛋白、血藍質、鐵蛋 白質。 央 讥根據申請專利範園第6項之方法，其中用以製備該融合 瘤之骨髓瘤細胞為鼠骨髓瘤細胞F〇細胞株，B細胞株 係得由以大麻衍生物係5 _ 9 _ THC_c〇〇 _氮代氫氧基環丁 二亞醯胺一牛血清白蛋白免疫之鼠。 U. —種用於檢測大麻及其代謝物之套組，其包括根據申請 專利範圍第4項之單株抗體。 !2_根據申請專利範圍第1 1項之套組，其為直接競爭型 ELISA套組。 13.根據申請專利範圍第1 2項之套组，其包括⑴固相支撐 物質，⑵根據申請專利範圍第4項之抗5 _ 9 - THC -羧酸 單株抗體一訊號複合物，⑶5 _ 9 _ THC _羧酸標準品，⑷ <5 - 9 - THC -羧酸衍生物—抗原結合體，及⑸呈色物質。 14根據申請專利範園第1 3項之套組，其中該固相支撐物 O:\47\47492-l.DOC 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公疫) f請先閱讀背面之注意事項再C本頁〕 7Ψ. C本一 二11 .卑 ά 申μ專利範園 Α8 Β8 C8 D8 經 濟 部 中 矣 標 準 為 員 工 消 費 人 η 社 印 製 質為微滴盤、微球體或紙。 15·根據申請專利範圍第13項之套組，其中該訊號選自榮 光物冷光標記物、放射性元素及酵素。 16. ，據h青專利範圍第15項之套組，其中該酵素選自過 氧化氫酵素、鹼性磷酸酯酵素、半乳糖酵素。 17. 根據中請專利範圍仏項之套組’其係層析式免疫檢 驗片。 i8•根據申請專利範圍第17項之套組’其包括⑴樣品接觸 區，⑵根據申請專利範圍第4項之單株抗體—指示劑 ⑤，⑶反應測試區’及⑷液體回收區。 19. T據申請專利範園第1 7项之套組，其中該檢驗片由可 提供毛細胞現象並吸附液體之材質之多孔性載體物質所 構成。 20_根據申請專利範圍第！ 9項之套组，其中該檢驗片選自 應紙、硝化纖維膜、时龍膜、玻璃纖維膜。 21. 根據申請專利範園第丨8項之套組，其中該指示劑選自 有色乳膠顆粒、金屬膠質溶液、非金屬膠溶液及染料膠 質溶液。 ’ 22. 根據申請專利範園第2〖項之套組 粒係選自聚苯乙烯、聚乙浠甲苯' 聚丙烯酸的聚合物。 23. 根據申請專利範圍第2 1項之套組 液係金膠質溶液。 24·根據申請專利範圍第2 1項之套组 _£：\47\47492-l.nnr ’其中該有色乳勝顆 聚來乙稀' -丙錦酸及^ 其中該金屬膠質溶 其中該非金屬膠質 (請先閔讀背面之注意事項再""'本頁) J— It · 、1Τ -柬 •―-------------------- - 4 - 本'''氏張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4见( 210Χ25»7公釐 A8 420717 S D8 χ、申請專利範圍 溶液係矽膠溶液。 25. 根據申請專利範圍第1 8項之套組，其中該反應測試區 含大麻代謝物（5 - 9 - THC -羧酸衍生物一載體抗原結合 體。 26. 根據申請專利範圍第2 5項之套组，其中該載體抗原為 白蛋白、球蛋白、血藍質、鐵蛋白質。 27. —種偵測尿液中大麻及其代謝物5 - 9 - THC -羧酸之方 法，該方法係利用根據申請專利範圍第8項之單株抗體 或根據申請專利範圍第1 1 - 2 6項中任一項之套組檢測尿 液。 (請先閔讀背面之注意事項再^丨心本頁) 、va •泉 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 O:\47\47492-1.DOC - J - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）