TW394844B - In-vitro angiogenesis assay - Google Patents
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Description
,B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 1 加 偏 好 血 管 為人類來 源 ，更加偏好為人類胎盤來源。 血 管 可 Μ經由標 準 技術加Κ冷凍如那些已為嫺於此技 藝 者 所 熟 知 的如在一 7 0 D下含有D M S 0之培養基中。 上 述 套 組為供作 稍 早所述本發明之方法中所使用。本 發 明 亦 擴 及 在以上方 法 中使用時之套組。 本 發 明 藉由參考 Μ 下非限制性圖形Μ及實施例加Κ進 — 步 描 述 0 圖 示 簡 DO 里 說 明 圖 1為包埋於纖維蛋白凝膠中人類胎盤血管片段之活體 外 血 管 增 生 之圖形表 示 。在（Α)中血管增生反應為手工記 錄 於 0至3 之 任意比例 上 如材料與方法中所描述。每次將&個 培 養 物 之 平 均值士標 準 誤差打點。在（Β)中血管增生反應 為 m •tuC 由 基 於 電腦之數 位 影像之像素分析。 圖 2顯示使用包埋於一纖維蛋白凝膠中之人類胎盤血管 片 段 之 活 體 外血管增 生 之顯微鏡照相。血管增生在14天培 養 後 ( A) X 2 5 Κ 及 ( Β) Χ200倍放大顯示.。圖2Α中之血管 增 生 反 應 為 人工評分 為 3 〇 圖 3為圖形表示並證明該試驗可應用於測驗不同化合物 抑 制 血 管 增 生之能力 0 在整個試驗中Μ化合物之使用是Μ 下 列 濃 度 肝素Μ及 低 分子董（LMW)肝素一1G0微克/毫 升 蘇 拉 明 (surami η) 一 1 0微克/毫升Μ及1 Q Q微克/毫 升 如 顯 示 DMS0- 0 5%，氫可體松（Hydro) — 10 - 5 Μ 以 及 鉾 — 20 a Μ 〇 ” C 〇 n t 〃意指一控制培養物其中不加入 化 合 物 0 數 據表示血 管 增生，如藉由數位影像分析，在培 -1 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α·4規格（2丨OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（/ ) 本發明相關於一種供作測定血管增生之方法，一種篩 選物質之血管增生之調節活性之方法，Μ及一種在腫瘤Μ 及其類似物之情況中決定適當治療組合之方法。 發明背景 血管增生，或新血管之發育，為組織發育Μ及傷口癒 合之基本特徵（1)。沒有血液供應之適當發育，組織無法 存活；循環糸統對於氧氣與養份之供應給予組織以及對於 代謝副產物之去除為必需的。 在成人中，除了傷口癒合期間外血管增生為相當少發 生的。然而*在成人中有一些〃血管增生一依賴性疾病" 其中血管增生具有非常重要性（1一 3)。其中最重要的是 血管增生與固形腫瘤，增生性視網膜病Μ及風溼性闞節炎 相關。血管增生抑制劑之發展可提供一個控制這些疾病的 方法，但目前針對血管增生之試驗均很麻煩，耗時且往往 建立於活體内糸統上。三種最常使用的模式為兔子角膜袋 ，倉鼠頰囊以及小雞绒毛膜尿囊膜（CAM)試驗（1- 4)。 在各糸統中血管增生性物質必須被植入角膜，頰囊或CAM中 Μ誘發血管增生。所有三種試驗受困於需要人為地誘發血 管增生，對於血管增生性物質及抑制劑必須之持鑛釋出型 聚合性賦形藥（5) ，Κ及與建立試驗相闞之技術複雜性， 包括使用活動物，以及测量結果。兔子角膜試驗具有在許 多研究機構中道德上不予接受之額外不便。 由於這些不方便而非常需要針對血管増生，特別是人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 袈· -'Φ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___ B7_ 五、發明説明（i ) 管it生之生理學上有關聯之活體外試驗。以前的活體 夕卜試驗往往需要建立内皮細胞之長期培養以及經由放置细 胞於细胞外母質（matrices)上（6— 8)或將细胞曝露於 不同的血管增生性剌激（9 一 11) Μ誘發微血管之形成。該 試驗為極度不自然且可能不代表生理學反應，特別當內皮 細胞已被活化，其使用前已在生長因子存在下培養相當時 期。 本發明之活髏外試驗代表一血管增生性反應其反映一 正常的生理性反應，即血管破壊後之新一血管形成。在一 具體事實中，本發明之試驗提供實質利益超過先前描述之 步驟，其需要經常大量體積的更換培養基（12)。這是因 為*在一具體事實中，小型化試驗之使用使得其適合於試 驗前一及抗一血管增生性物質。進一步地，該試驗之全部 成本（即勞力成本♦培養基及姐織培養瓶花費）戲剌化地 降低，當其施行一方便的24或4 8槽版式，允許經由光學顯 微鏡快速檢査Μ及定量。此外在其全部的具體事實中該試 驗為道德上可接受的因為其避免活動物之使用。進而其提 供直接訊息關於特別的血管增生性調節物質對於特別種類 之效果，因為來自該種類之血管組織可Κ被使用於試驗中 。舉例來說，該試驗可Κ直接測定一特別物質在人類中是 否具有調節能力因為人類組織可以被使用於此試驗中。 在漸漸導入本發明的工作中，發明者發現到埋入纖維 蛋白血塊中的人類胎盤血管之小片段在培養7 - 14天後表琨 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ---------.装—. 广 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
I 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（1 ) 出自血管片段生長出一血管之複雜網路。該試驗是在2 4或 48槽培養盤中施行伴隨小體積的培養基（0 ♦ 5至1毫升/檐 )且很少更換培養基（每通兩次）。預期是生理性凝膠而 非纖維蛋白將產生相似的反應。 經由本發明者發現之血管增生反應似乎為完全自動的 ，不需要加入血管增生性因子至培養中，而且並不希望被 理論所束縛·推測其代表一嚴重血管之傷口癒合反應。 發明總述 本發明之第一方面中提供一種得到血管增生之方法其 包括將一血管片段與一生理性凝膠Μ及適當養份一起培養 一段時間足夠使得新血管組織生長，其中該片段是培養於 小型化規模且其中該養份很少更換。 在本發明之相關方面中提供一種測定血管增生之方法 其包括將一血管片段與一生理性凝膠Μ及適當養份一起培 養一段時間足夠使得新血管組镟生長，並檢査該片段Κ測 定新血管組織是杏生長，其中該片段培養於小型化規模且 其中該養份很少更換。 在本發明之另一方面中提供一種測定血管增生之方法 其包括將得自人類組織之一檢體之血管片段與一生理性凝 膠Μ及適當養份一起培養一段時間足夠使得新血管組織生 長，並檢査該片段Μ測定新血管組織是否生長。 在本發明之另一方面中提供一種試驗物質之血管增生 調節活性之方法其包括將得自一生物檢體之血管片段與一 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衮. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ B7 五、發明説明（/) 生理性凝膠，適當養份以及至少一懷疑具有血管增生調節 活性之物質一起培養一段時間並在足Μ使得新血管組孅生 長之條件下，檢査該片段之新血管組織生長並與控制組比 較該生長。 依然在本發明之另一方面中提供一種測定一物質阻礙 新血管組織生長及/或誘發新血管組織退化之能力之方法 其包括將一血管片段與一生理性凝膠Μ及適當養份一起培 養一段時間足夠使得新血管組織生長，施用該物質至該片 段，Κ及將該片段與適當養份一起培養一段時間，之後檢 査該片段Κ測定新血管組織生長之胆礙及/或新血管組織 之退化是否已發生。 依然在本發明之另一方面中提供一種測定是否一血管 增生性實體將對抗-血管增生性治療有所反應之方法，該 方法包括將得自該實體之血管片段與一生理性凝膠，適當 養份Μ及至少一種抗一血管增生劑之有效量一起培養一段 時間並在足Μ使得新血管組纖生長之條件下，檢査該片段 之新血管組織生長並與控制組比較該生長。 在本發明之另一方面中提供一套組其包括隔間化形式 中一主要隔間或隔間群改良Μ容納一生理性凝膠供作血管 Η段之培養，其中該主要隔間或隔間群為選擇性地改良Μ 包含一或更多的生理性凝膠前趨物，次要隔間或隔間群改 良Μ包含養份或營養培養基供作加至生理性凝膠Κ支持血 管片段，Κ及選擇性地冷凍血管片段之生長。 -6- 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐〉 ---------.〜装------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__- --7 "— 五、發明説明（^ ) 發明詳述 在本發明之一方面中提供一種得到血管增生之方法其 包括將一血管片段與一生理性凝膠Μ及適當養份一起培養 一段時間足夠使得新血管組織生長，其中該片段培養於小 型化規模且其中該養份很少更換。 在一相關方面中*本發明提供一測定血管增生之方法 其包括將一血管片段與一生理性凝膠Κ及適當養份一起培 養一段時間足夠使得新血管組織生長，並檢査該片段Μ測 定新血管組織是否已生長*其中該Η段培養於小型化規橫 且其中該養份很少更換。 此中使用之專有名詞〃生理性凝膠"表示一凝膠其模 擬，或部分模擬有機體中之生理環境其允許血管增生產生 。偏好生理性凝膠為纖維蛋白，膠原蛋白或基質原膠（ matrigel)或其類似物。最偏好凝膠為纖維蛋白。 此中使用之專有名詞〃小型化規模〃表示使用小體積 之培養基。對於小型化規模之適合之培養血管包含小盤其 可Μ使用約0. 5至1毫升或更少之液體體積，相對於較大糸 統其典型地使用數十毫升。偏好0· 5至1毫升或更少之體積 被使用於本發明之培養中。偏好外源性因子，其提供血管 增生性剌激，不加至培養基。 此中使用相闞養份更換之專有名詞"很少〃意指一養 份更換之發生比每隔兩天更不頻繁。在本發明之方法中偏 好養份更換為每週二次*更偏好每四天一次。 -7- 本紙張適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X25»7公釐） (#先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) '装.
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（> ) 方法中使用之血管片段可衍生自小靜脈或動脈來源且 偏好為小尺寸的。舉例來說*具有約1至2毫米直徑及2至5 公分長度之血管為適合於製造片段，其偏好為1至2毫米之 長度。偏好血管片段為新鮮分離的。或者可Μ使用冷凍血 管片段。 偏好方法中使用之血管片段為衍生自人類組纖，例如 ，人類組纖其為易於得到的如胎盤Μ及固形腫廇。本發明 之方法亦能夠被用來試驗非人類血管片段中之血管增生將 ，自然地，被理解。 偏好方法中使用之血管片段為培養前不含殘餘之血液 凝塊。此可Μ藉由將血管片段浸泡於任何適合於此目的之 鑀衝液中達成。 偏好方法中使用之生理性凝膠為新鮮製備的。更加偏 好在血塊形成前將血管片段加至生理性凝膠之前趨物。更 加偏好血管片段為埋入且被凝膠包圍。 養份為偏好Κ液體培養基供應如培養基199其選擇性地 包含20%胎牛血清且亦可包含，額外地，抗生素Κ抑制微 生物之生長。或者培養基可Μ為基本上不含血清之培養基 。此中使用之專有名詞〃基本上不含血清〃表示所有血清 為不存在的培養基且沒有血清成份或最少量來自血清或其 它來源之成份其為血管增生所必需。那些 於此技藝者將 熟悉於適合之培養基。 方法中之血管片段是培養於適合的條件下Κ促使新血 -8- I-------—I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（I) 管組織之生長。那些 於此技藝者將熟悉於各種適合條件 其可K被用來培養該片段。偏好血管片段為生長於約37°c 達約2至3週。 血管片段之檢査可Μ經由任何方便的方法施行。偏好 血管片段之檢査為經由亮視野或相位差光學顯微鏡庵行。 此可Μ使用一倒立顯微鏡達成。 該Η段之反應（血管增生或相反）可Κ被手工地或經 由基於電腦影像分析照片，視覺影像或培養物之數位影像 加Μ定量。偏好反應為經由自動化方法加Μ定量如經由ΝΙΗ IMAGE程式。該定量提供快速Μ及正確之反應評估。此外* 該試驗糸统特別適於篩選人類血管增生之抑制劑或加強劑 。那些 於此技藝者將熟悉於定量該片段之反應之各種方 法0 在第二方面中*本發明提供一種測定血管增生之方法 其包括將得自一人類組織檢體之血管片段與一生理性凝膠 Μ及適當的養份一起培養達一段時間足夠使得新血管組織 生長*並檢査該片段Κ測定新血管姐濰是否已生長。 偏好在方法中使用之組織為胎盤組继，或另一自其可 分離血管之組織。 偏好血管片段培養於小型培養容器中其包含培養瓶。 偏好培養基很少更換，如每週二次。偏好生理性凝膠為纗 維蛋白，膠原蛋白或基質凝膠（matrigel)。更加偏好為 纖維蛋白。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁). 裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（f ) 在前人的技藝中曾需要加入促進血管增生之藥劑至培 養基。然而在本發明之方法中，發現該藥劑是不需要的。 因此在偏好之方面中，額外的血管增生藥劑並不加至培養 基。 在本發明之第三方面中提供一種筛選具有血管增生調 節活性之物質之方法其包括將得自一生物檢體之血管片段 與一生理性凝膠，適當養份Μ及至少一懷疑具有血管增生 調節活性之物質一起培養一段時間並在足Κ使得新血管組 纖生長之條件下，檢査該片段之新血管組纖生長並與控制 組比較該生長。 專有名詞"篩選〃意指試驗或分析物質。 專有名詞〃血管增生調節"意指一物質之能力Κ改變 血管片段之正常血管增生活性並包含血管增生活性之抑制 及增強。此方法可Κ應用來試驗化合物或物質其為可能之 血管增生性抑制劑或可能之血管增生性增強劑。 專有名詞〃生物檢體〃意指任何檢體其基本上衍生自 一動物組纖其意欲在該處試驗一物質對於該特定組織及/ 或動物種類是否有血管增生調節活性。偏好生物檢體為衍 生自人類組織。 任何物質或物質之聯合其有疑似血管增生調節活性可 經由本發明筛選。此包含化合物類之純化製備物Μ及各種 萃取物如植物或動物組織萃取物或可Μ來自一微生物。因 此，該物質可能必須使其變成一適合形式Μ供施用至血管 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ---------—装------訂 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明説明（1 ) 片段。那些 於此技藝者將熟悉於使該物質變成適合形式 Μ供施用之各種方法。 如上所述，血管片段可衍生自靜脈或動脈來源。偏好 來自一血管之片段被應用作為控制組Μ及Κ潛在血管增生 調節活性被篩選出來之培養物。 偏好生理性凝膠為纖維蛋白，膠原蛋白或基質凝膠（ matrigel)。更加偏好該凝膠為纖維蛋白。 偏好當本方法被應用來試驗化合物之血管增生增強作 用時培養基基本上為不含血清（如先前所定義）。 在一相關方面*本發明提供一種測定一物質阻止新血 管組纖生長及/或誘發新血管組織退化之能力之方法其包 括將一血管片段與一生理性凝膠Μ及適當養份一起培養一 段時間足夠使得新血管組織生長，施用物質至該片段，並 將該片段與適當養份一起培養一段時間，之後檢査該片段 以測定新血管組織生長之阻礙及/或新血管組織之退化是 否已發生。 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 I---------]装------訂 (諳先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 偏好血管片段為在雎用物質前培養一段時間足Μ建立 一良好之血管增生性反應，如，舉例來說，施用前14天。 然後此反應之程度偏好加Μ定量Μ及記錄。 偏好在施用物質後，血管片段培養一段時間足夠允許 清楚的新血管生長之阻止及/或退化，如，舉例來說，施 用物質後7至14天。之後將新血管生長之情況與記錄之反應 Μ及偏好之一控制組相比較。 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___B7_ 五、發明説明（f 〇 ) 偏好生理性凝膠為纖維蛋白，膠原蛋白或基質凝膠（ matrigel)。更加偏好該凝膠為纖維蛋白。 在本發明之第四方面提供一種方法供測定一血管增生 性實體是否將對抗一血管增生性治療有反應，該方法包括 將得自該實體之血管片段與一生理性凝膠，適當養份Μ及 至少一種抗一血管增生劑之有效量一起培養一段時間足夠 使得新血管組織生長，檢査該片段之新血管組織生長並與 控制組比較該生長。 專有名詞〃血管增生性實體"包含腫瘤（尤其是轉移 的Μ及侵犯性腫瘤）Μ及來自帶有其它血管增生一依賴性 疾病之病人之試驗組織如風溼性關節炎Κ及增生性視網膜 病。 專有名詞〃抗一血管增生劑〃意指任何化合物或物質 其抑制血管増生。此可Μ為一蛋白質的或非蛋白質的分子 且包含腎上腺皮質固醇，抗一生長因子抗體Μ及抗一血管 增生性蛋白質如第四血小板因子。 偏好生理性凝膠為纖維蛋白，膠原蛋白或基質凝膠（ matrigel) 〇 在本發明之第二，第三K及第四方面中使用之培養條 件偏好在如上所述之本發明之第一項具體事實中所偏好之 相同條件下施行。 在本發明之第五方面中提供一套組其包括，隔間化形 式中一主要隔間或隔間群改良容納一生理性凝膠供作血管 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (讀先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂 A7 B7 五、發明説明㈠\) 片段之培養，其中該主要隔或隔間群為選擇性地改良κ包 含一或更多的生理性凝膠前趨物，次要隔間或隔間群改良 Μ包含養份或營養培養基K支持血管片段K及選擇性地冷 凍血管之生長。 專有名詞〃隔間〃意指一容器之特定分割或一分開之 容器。 偏好的是，套組提供一小型化規模之主要隔間或隔間 群使得可能僅需使用少許體積之培養基。偏好該隔間或隔 間群為經改良Μ接受0* 5至1毫升之培養基且為多槽盤之形 式如一微槽盤如，但不受限於，一 24或48槽盤。 偏好套組額外地包括更多的隔間或隔間群其為經改良 Μ包含一主要的生理性凝膠前趨物如纖維蛋白原或一膠原 蛋白或基質凝膠（matrigel)前趨物。其可Μ為冷凍乾燥 形式或懸浮液。 偏好含有第三個隔間或隔間群其為經改良Κ包含其它 相瞄之生理性凝膠前趨物如凝血酵素其可Κ為冷凍乾燥形 式或懸浮液。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I.-------;'丨装------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 偏好第二個隔間為經改良以包含適當的培養基如培養 基199(或其成份）或一基本上不含血清之培養基（其中物 質被篩選針對血管增生增強活性）。 冷凍血管，尤其是血管片段，可形成套組之一部分。 該血管可Μ為靜脈的或動脈的來源且偏好為直徑1至2毫米 。偏好血管為ΚΝ段形式提供，偏好為長度1至2毫米。更 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210X297公釐） ,B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 1 加 偏 好 血 管 為人類來 源 ，更加偏好為人類胎盤來源。 血 管 可 Μ經由標 準 技術加Κ冷凍如那些已為嫺於此技 藝 者 所 熟 知 的如在一 7 0 D下含有D M S 0之培養基中。 上 述 套 組為供作 稍 早所述本發明之方法中所使用。本 發 明 亦 擴 及 在以上方 法 中使用時之套組。 本 發 明 藉由參考 Μ 下非限制性圖形Μ及實施例加Κ進 — 步 描 述 0 圖 示 簡 DO 里 說 明 圖 1為包埋於纖維蛋白凝膠中人類胎盤血管片段之活體 外 血 管 增 生 之圖形表 示 。在（Α)中血管增生反應為手工記 錄 於 0至3 之 任意比例 上 如材料與方法中所描述。每次將&個 培 養 物 之 平 均值士標 準 誤差打點。在（Β)中血管增生反應 為 m •tuC 由 基 於 電腦之數 位 影像之像素分析。 圖 2顯示使用包埋於一纖維蛋白凝膠中之人類胎盤血管 片 段 之 活 體 外血管增 生 之顯微鏡照相。血管增生在14天培 養 後 ( A) X 2 5 Κ 及 ( Β) Χ200倍放大顯示.。圖2Α中之血管 增 生 反 應 為 人工評分 為 3 〇 圖 3為圖形表示並證明該試驗可應用於測驗不同化合物 抑 制 血 管 增 生之能力 0 在整個試驗中Μ化合物之使用是Μ 下 列 濃 度 肝素Μ及 低 分子董（LMW)肝素一1G0微克/毫 升 蘇 拉 明 (surami η) 一 1 0微克/毫升Μ及1 Q Q微克/毫 升 如 顯 示 DMS0- 0 5%，氫可體松（Hydro) — 10 - 5 Μ 以 及 鉾 — 20 a Μ 〇 ” C 〇 n t 〃意指一控制培養物其中不加入 化 合 物 0 數 據表示血 管 增生，如藉由數位影像分析，在培 -1 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α·4規格（2丨OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（\，） 養14天後。垂直條紋表示平均值之標準誤差（n=4)。 圖4為圖形表示並證明該試驗可應用於測驗多株抗體對 抗血管增生性生長因子aFGF，bFGFM及VEGF抑制血管增生 之能力。數據為如圖3之表示。在試驗中使用之控制組抗體 如柱狀圖註解中K山羊Ig及兔子Ig表示。 圃5為圖形表示並證明該試驗可應用於測驗不同濃度之 bFGF，aFGFM及VEGF在血清飢餓培養中增強人類血管增生 之能力。數據為如圖3之表示。注意在5 0微毫克/毫升VEGF 時激發血管相當的〃回枯〃。 實施例1:血管增生試驗 A ·材料與方法 血管片段之製備 血管，直徑約1至2毫米且長度約2至5公分，為切除自 出生後6小時内之人類胎盤表面。將血管放置在含有2· 5微 克/奄升兩性徽素之Hanl s BSS中並利用銳利的解剖鑷 子以及虹膜切除剪切割成為1至2毫米長度的片段。血管片 段在使用前去除殘餘血塊並浸泡於Hank' s BSS中。血管 、之解剖及切開是藉著放大燈之幫助施行（Maggy lamp *
New bound，Balmain，NSW，Australia)。自靜脈 Μ 及動 脈來源之血管得到相似的血管增生反應，但對於各個試驗 而言，僅使用來自一種血管之血管片段。 血管增生試驗 試驗是在 24 或 48 槽培養盤中施行（Costar， -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α·4規格（210X297公釐） ---------jll衣------訂 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/^ )
Cambridge* MA)。在24槽格式中加人30// 1之牛凝血酵 素（50 MIH 單位 / 奄升於 0，15 M NaCl 中；Sigma Chemical C ο . ，S t · L o u i s，Μ 0)至每個槽中接著加入 1 ‘0 毫升/槽之於培養基199中之3 mg/毫升牛缴維蛋 白（Sigma)。將凝血酵素Μ及纖維蛋白快速混合並在血塊 形成之前快速地將血管片段放在槽的中央。通常纖維蛋白 凝膠在 30秒內產生且理想地該血管片段應在凝膠中維持 懸浮狀。凝膠形成後接著加入1·0毫升/槽補充20%胎 牛血清（FCS)之培養基 199，0.2毫升6—胺基己酸*1^ -戍二醯胺Μ及抗生素（健他徽素Κ及兩性徽素）。在48 槽格式中所有的試劑體積均減半。血管培養於37υ之潮溼 環境中達 14至21天伴隨每週更換培養基兩次。血管增 生最初人工地加Μ定量，利用 0至3之隨意比例其中0 =無生長，1=稀疏的* 2=中等的而 3=密集的微血管生 長。血管增生之更精確評估是經由Dycam數位相機得到培 養物之數位影像之基於電腦之影像分析而達成，其使用 NIH影像軟體。 免疫化組織化學 包含血管增生反應（即新血管生長）之纖維蛋白凝膠 在4t：下於PBS中之4%聚甲醛中固定一整夜供作免疫組織化 學之製備。固定的凝膠K石臘包埋並經3«組織切片及放在 聚一 L 一雛胺酸包覆之顯微鏡載玻片上。切片K微波處理3 分鐘並Μ於0 · 1% CaCl2之0 . 1%胰蛋白酶進行部分切割 1 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------g}裝------訂-----i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（丨/) κ使抗原暴露出來。之後將切片與抗體反應並使用山葵過 氧化氫酶連结縮羊F(aM ) 2抗一老鼠Ig( Amersham， Amersham，Herts，ϋ· Κ·)作為偵測系統。將切片在銀增 強作用下與對二胺基聯苯反應並K蘇木素作對比染色。使 用之抗體為單株老鼠抗一人類第八因子相關抗原（Dako， Denmark)，一種抗-人類內皮细胞 mAb (Gibco，Grand Island，NY) Μ及一種CD31—特異i»Ab (選殖株20G5)製造 於 John Curtin School of Medical Research ° B ·结果 典型人類血管增生試驗之结果說明於圖1中。在培養6 至8小時後可偵測到微篛的血管增生且血管增生此反應在14 至2 0天達到高原期。在圖1A中試驗之定量是經由一人工評 分方法K及藉由圖1B中較少主觀性，基於電腦之影像分析 方法。 纖維母細胞有時會污染培養物但通常僅Μ軍曆出現於 培養槽之底部因為，不像內皮细胞，纖維母细胞不能侵入 纖維蛋白凝膠（13)。纖維母细胞之自然發展可Μ被忽視 假使血管片段為懸浮於纖維蛋白凝膠中而非與培養槽之塑 膠基底接觸。為了抑制血塊收縮以及產生之纖維母细胞污 染而將纖維蛋白分解抑制劑，e —胺基己酸，包含於培養 基中。 Μ來自人類胎盤之動脈Μ及靜脈二者得到相比較之血 管增生反應。事實上，切下之血管可Κ貯存於Hank' -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------!}装------訂----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（|έ ) sBSS中且在埋入纖維蛋白凝膠中時仍可被按置而具有良好 的血管增生反應。然而，與新鮮分離之血管相比較下其反 應傾向延遲1至2天。血管增生在缺乏外源性生長因子下發 生且，事實上*加入內皮细胞生長補充+肝素對於血管增 生並無可偵測之效果。雖然反應相當有差異，微弱的血管 增生反應偶而亦可在無血清之培養基中觀察到。低血清培 養基（參考實施例3)之使用允許偵測可加強血管增生之因 Ο 典型的14天血管增生反應說明於圖2A中。血管之密集 與複雜網路穿透進入纖維蛋白凝膠中相當距離。在高度放 大下血管之分支可Μ被清楚地辨識。血管增生檢艚之免疫 組織化學染色顯示所有血管均為第八因子相闞抗原陽性， 此一反應清楚地證明生長的是血管。該血管亦與一鲟人類 內皮细胞特異之BAb (Gibco)反應Μ及對CD31之roAb反應， 其為一僅表現於内皮細胞，血小板K及一些白血球上之抗 原。在電子顯微鏡下血管增生性檢體之檢査亦顯示具有典 型内皮形態之细胞。 實施例2:血管增生抑制性物質之篩選 A ·材料與方法： 相似於實施例1除了K懷疑有血管增生抑制活性之分開 少量加至個別的槽中。將進行測驗血管增生調節活性之物 質溶解於適當的溶液中（如水* DMS0)並在含有20%胎牛 血清之培養基199中稀釋。緊接著在血管片段埋入纖維蛋白 -1 8 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ .泉_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7___ 五、發明説明（j) 凝膠中之後，將含有測驗物質之〇· 5至1· 0毫升之培養基 加入每個槽中。每4天加入含有测驗物質之新鮮培養基。一 組的控制培養物接受含有適當溶解溶液但不加人拥I賴i物質 之培養基。 培養14至21天之後*如實雎例1中，血管增生加K定量 並與控制培養物作比較。在抗-血管增生性物質之例子中 ，將可観察到與控制培養物相較下血管之生長減少。 同時，在一些例子中物質可經由將測試物質加至建立 之血管增生反應（即培養14天之後）並在接下來的7至14天 中顯微地探测血管之〃回枯测試其誘發新近形成血管 退化之能力。 下列物質被測驗： 肝素（10 0微克/毫升） 低分子量肝素（100微克/毫升） 蘇拉明（suramin) ( 1 0 0微克/毫升& 1 0微克/毫升） ) 3-氫可體松（ΙΟ—5 M) 3-氫可體松（10-5 Μ) K及肝素（100微克/毫升） 多株中和抗體對酸性纖維母细胞生長因子（aFGF) 多株中和抗體對鹼性纖維母细胞生長因子（bF6F) 多株中和抗體（aFGF) Μ及（bFGF)之混合物 多株中和抗體對血管内皮生長因子（VEGF) B ·結果 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） ----------------Ί.裝------訂-----'.X /.I. (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明説明（〖^) 此實施例證明本發明對於分析已知之血管增生性抑制 劑為有效的。 圖3說明許多物質，其可擁有抗一血管增生活性，抑制 活體外血管增生反應之能力。肝素Κ及低分子量肝素（100 微克/毫升），其通常單獨地並不會抑制血管增生（1) · 在此試驗中顯示圼現一微小但重要的血管增生抑制作用。 然而，此抑制效果在其它試驗中無法再現。相反地*蘇拉 明在100微克/毫升時實質上完全地抑制血管增生然而在10 微克/毫升時此化合物之抑制活性則喪失。這些數據與其 它顯示活體外蘇拉明（suramin)擁有抗一血管增生活性之 研究（14)互相一致。氫可體松單獨地，類似肝素，通常 有少許的或沒有抗一血管增生活性（1)。圖3中敘述之實 驗中氫可體松，在10 - 5 Μ之相當高濃度下，與DM S0 (0· 5 %)稀釋劑控制組相比較時部分抑制血管增生。然而*肝 素與氫可體松之结合幾乎完全地抑制血管增生反應。該结 果曾在活内被證明其中肝素與類固醇協同作用以引起生長 中微血管之退化（1)。最後，鋅之生理性濃度（20WM) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 被包含於此試驗中因為有一些二價陽離子已被報告能調節 血管增生（1)。此實驗證明鋅，在生理性濃度下，對於血 管增生反應沒有影響。 本發明可用以測定那一些物質，特別是生長因子•可 引發血管增生效果。 酸性纖維母细胞生長因子（aFGF) Μ及鹼性纖維母细 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） A7 B7 五、發明説明（fj) 胞生長因子（bFGF)之生長因子類為已知最強力之血管增 生性因子之一 （1)。較新近的血管內皮生長因子（VEGF) 已被確認為重要的血管增生性因子，尤其是在胚胎發生期 K及固形腫瘤中（1)。因此*本發明可用來測定那一些生 長因子是在活體外試驗中誘發觀察到之血動性血管増生（ 圖4)。與控制組抗體相比較下，發規到對抗bFGFM及aFGF 之多株中和抗體部分抑制血管增生，Μ抗一 bFGF抗體較具 抑制性。相反地，對抗VEGF之中和抗體對於血管增生反應 沒有影響。瑄些數據顯示bFGFM及aFGF，而非VEGF，在上 述之活體外血管増生試驗中扮演重要角色。 實施例 3:血管增生增強性物質之篩選 A ·材料與方法 相似於實施例1除了培養物為血濟飢餓Μ減少自動性血 管增生。此步驟牽涉到在最初24小時將培養物維持於含有 20%胎牛血清之培養基中且之後接著的13至2 0天將檢體培 養於不含血清之培養基中伴隨每3至4天更換培養基。將懷 疑擁有血管増生增強活性之物質之分開少量加至各別的槽 中如實施例2中所敘述。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Β ♦结果 圖5證明不同濃度之血管增生性生長因子bFGF · aFGFK 及V E G F在血清飢餓培養中增強血管増生之能力。發琨到三 種生長因子各Μ稍微不同劑量反應曲線均能增強活體外血 管增生反應，雖然所有的生長因子在〇· 5微奄克/毫升誘 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（v^) 發最大反應而在5〇微毫克/毫升為最低反應。雖然在圖5中 不明顯，在50微毫克/毫升之VEGF餺發血管之實質"回枯 〃如內皮细胞中形態改變所顯示。 雖然圖5中說明之試驗是使用"血清飢餓#之培養條件 加Μ施行，當測驗增強血管增生性物質時能夠使用供作内 皮细胞存活之含有最小量血清成份之培養基。 以上實例證明本發明可被應用作為測驗已知具有血管 增生調節能力之物質。此外物質，其血管增生調節性質為 已知，亦可被測驗。 將被測驗之物質之實際結構或組成並不重要。該物質 可Μ是一相當小的分子如低分子畺肝素，或甚至一更簡單 之非蛋白性分子一直到一複雜分子或分子之混合物如多株 或單株來源之抗體。亦構想植物萃取物，粗製的或精製的 ，植物鹼類或來自其它有機體如微生物Μ及海洋之物質可 ΚΜ本發明之方法加Μ測試。 經由何種機制該物質運用其血管増生調節效果並不重 要。該機制可能是經由一特定生長因子或可Κ經由抑制或 促進细胞之移動作用或抑制或促進管狀形成其為血管增生 所必須。 實施例4:測定一血管增生性實體是否將對血管増生性 治療有所反應 本實施例集中於測定也管增生性實體如一轉移性或侵 犯性腫瘤之適當治療中本發明之用途。 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------;')}裝------tT-----,-> (諸先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（y\) 得自病人之一腫瘤檢體可經由標準的組镟培養技術冷 凍解凍處理人類組織或組織培養Μ製造一腫瘤萃取物之後 產生該檢體之萃取物。之後該檢體根據實施例2加以測試以 決定萃取物是否為血管增生性。該萃取物可以之後進一步 經由標準的生物化學或免疫學親和性步驟處理以分離至少 其部分成份，並進一步根據實施例2加Μ篩選Κ測定那一個 或那一些物質為血管增生性。一旦得到此訊息則可選擇適 當的抗一血管增生性治療組合。 除了提供一種供作選擇適當之腫瘤治療組合之方法， 根據本發明腫瘤Μ及其它血管增生性實體可用以分離先前 未確認之血管增生增強劑Κ供某些治療中之應用。 參考文獻 1 · Folkman，J · and Brem，Η ♦ ( 1 99 2)
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Patel，S ♦ ( 1 987) ♦ Role of plasminogen， pi asntin and plasminogen activators in the migration of fibroblasts into plasma clots · J · Cell· Physiol • 132 ， 501° 14 · La Rocca， R * V · Stein » C. A · » Danesi * R ‘ ， Jamis — Dow » C.A. ， Weiss » G · H · and ， C. E· ( 1 9 9 0 ) · Suramin in adrenal cancer : modulation of steroid hormone production > -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------II (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-'° 泉 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（v^) cytotoxicity in vitro and clinical antitumour effect · J · Clin· Endocrinol ♦ Metab · 71， 497 -26- ----：-----、>装------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉
Claims (1)
- 修正 補充年/] a RR ί9 η·> 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1* —種測定血管增生之方法，其包括將一獲得自胎盤 組織的血管片段與一包括纖維蛋白凝膠及適當養份之培養 基一起培養一段時間，且於足夠使得新血管組織生長的狀 況下，其中該片段培養於1毫升或者更少的培養體積中且其 中該養份很少更換，同時並檢査該片段Μ決定新血管組鳒 是否已經生長。 2·根據申諳專利範圍第1項之方法，其中該片段為人 類來源。 3·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中並不加入 額外的血管增生劑至培養基。 4·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中含有適當 養份之培養基為體積0* 5至1毫升。 5*根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中養份更換 是Κ頻率少於每兩天一次施行。 6·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中的片段為 直徑1至2微米且長度少於5公分，偏好長度1至2微米。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 7* —種試驗物質之血管增生調節活性之方法，其包括 將得自一胎盤組織Μ及一包括纖維蛋白凝膠之培養基，適 當養份Μ及至少一懷疑具有血管增生調節活性之物質一起 培養一段時間並在足Κ使得新血管組诚生長之條件下，其 中該片段培養於1毫升或者更少的培養體積中且其中該養份 很少更換，同時檢查該片段之新血管組繩生長並與控制組 比較該生長。 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 修正 補充年/] a RR ί9 η·> 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1* —種測定血管增生之方法，其包括將一獲得自胎盤 組織的血管片段與一包括纖維蛋白凝膠及適當養份之培養 基一起培養一段時間，且於足夠使得新血管組織生長的狀 況下，其中該片段培養於1毫升或者更少的培養體積中且其 中該養份很少更換，同時並檢査該片段Μ決定新血管組鳒 是否已經生長。 2·根據申諳專利範圍第1項之方法，其中該片段為人 類來源。 3·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中並不加入 額外的血管增生劑至培養基。 4·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中含有適當 養份之培養基為體積0* 5至1毫升。 5*根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中養份更換 是Κ頻率少於每兩天一次施行。 6·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中的片段為 直徑1至2微米且長度少於5公分，偏好長度1至2微米。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 7* —種試驗物質之血管增生調節活性之方法，其包括 將得自一胎盤組織Μ及一包括纖維蛋白凝膠之培養基，適 當養份Μ及至少一懷疑具有血管增生調節活性之物質一起 培養一段時間並在足Κ使得新血管組诚生長之條件下，其 中該片段培養於1毫升或者更少的培養體積中且其中該養份 很少更換，同時檢查該片段之新血管組繩生長並與控制組 比較該生長。 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 8 ♦根據申諳專利範圍第7項之方法，其中該血管增生 諷節活性是抑制血管增生。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 9 ♦根據申請專利範圍第7項之方法，其中該血管增生 調節活性是增強或促進血管增生活性。 10·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該培養條件 包括體積約0 ♦ 5至1 * 0毫升。 11*根據申請專利範圍第？項之方法，其中該片段之檢 査是經由自動化方法達成，偏好經由片段影像之電腦分析 0 12 ♦根據申請專利範圍第7至9項中任一項之方法，其 中該物質之複數型式為與片段之複數型式分開培養。 13 ♦根據申諳專利範圍第7項之方法，其中該片段為直 徑約1至2毫米且長度少於5公分，偏好長度為1至2毫米。 14·根據申諳專利範圍第7項之方法，其中該生物檢體 為人類來源。 15 ♦根據申請專利範圍第11項之方法，其中該提供條 件包含一基本上不含血清之培養基。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 16 ♦—種測定物質誘發新血管組織之退化之方法，其 包括將一獲得自胎盤組織的血管片段與一包含纖雄蛋白凝 膠之培養基K及適當養份一起培養一段時間，且足使得新 血管組織生長的狀況下，其中該片段培養於1毫升或者更少 的培養體積中且其中該養份很少更換’施用該物質至該片 段，K及將片段與適當養份一起培養一段時間’且於同樣 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 的狀況下，之後檢査該片段K測定新血管組绷之退化是否 己發生。 17·根據申請專利範圍第16項之方法，其中該片段為 人類來源。 18*根據申請專利範圍第16項之方法，其中該片段為 直徑1至2毫米且畏度少於5公分，偏好長度為1至2毫米。 ♦根據申請專利範圍第16項之方法，其中該片段之 檢査為經由自動化方法偏好經由片段影像之電腦分析達成 0 20* —種使用於根據申請專利範圍第7或16項之.方法中 之套組，其包括隔間化形成一第一隔間或隔間群，其適羯 於容納一包括纖維蛋白凝膠之培養基供作血管片段之培養 ，該片段係來自1毫升或者更少之培養體積的胎盤組纖， 其中該第一隔間或隔間群為選擇性地適用於包含一或更多 的凝膠前驅物，及第二隔間或隔間群，其適用於包含養份 或營養培養基供作加入至包括纖維蛋白凝膠之培養基中以 支持血管片段之生長。 21·根據申請專利範圍第2 (3項之套組，其中該第一隔 間或隔間群為適用於K容納.0 ♦ 5至1 * 0毫升之培養基。 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -.;'· 1 1.1 I n* ϋ n I 言 f
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