TW202430541A - 針對神經膠質瘤的肽疫苗及其用途 - Google Patents

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立峰 張
吳海陽
徐偉
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大陸商廣東天科雅生物醫藥科技有限公司
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Abstract

本發明提供了一種用於刺激針對神經膠質瘤H3K27M突變的免疫反應的肽疫苗藥物組成物和使用方法。所述肽疫苗的長度為至少12個胺基酸殘基，在施用後能夠刺激CD4 T細胞反應，任選地還能夠刺激CD8 T細胞反應。

Description

針對神經膠質瘤的肽疫苗及其用途
本發明係有關於針對神經膠質瘤的肽疫苗及其用途。
瀰漫性內因性腦橋神經膠質瘤(DIPG)是一種罕見而糟糕的腦腫瘤，主要影響兒童，大多在4至7歲之間確診。在美國，每年約有200-300名兒童被診斷為DIPG。DIPG患者的中位生存期為診斷後9-12個月。腫瘤所處的位置——腦橋——包含維持基本生命機能的神經。因此，無法經由手術切除腫瘤。目前，放射療法是治療DIPG的唯一有效的方法。四十多年來，患者的生存期一直沒有提高。
組蛋白H3尾部的離胺酸27(K27)被甲硫胺酸殘基(M)取代的點突變，或H3K27M，已被確定為DIPG的驅動突變(Schwartzentruber J等人, 2012；Wu G等人, 2012)。據估計，60-70%的DIPG腫瘤攜帶H3K27M的雜合突變。所有H3K27M都發生在兩種組蛋白H3變體(H3.1和H3.3)中，其中發現H3.3突變的發生頻率更高(約70%)(Argersinger DP等人, 2021；Zhang X等人, 2019)。另外值得注意的是，除DIPG外，還確定H3K27M突變與其他小兒腦腫瘤(例如，小兒高度神經膠質瘤)以及包括神經膠質瘤、急性髓樣白血病(AML)和黑色素瘤等其他數種成人癌症相關(Lowe BR等人, 2019)。
此前，已經開發出針對H3K27M的肽疫苗來治療DIPG(WO2016179326A1)。該肽疫苗基本上包含10個胺基酸(10-AA)長的肽——(R/A)MSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 4)，該肽是限制於HLA-A*02的表位，因此該肽疫苗被設計為特異性地觸發CD8 T細胞反應或細胞毒性T細胞反應。然而，在上述技術的疫苗設計中有意排除了另一種重要的T細胞反應，即CD4 +T細胞反應或T輔助細胞介導的免疫反應(其對於抗腫瘤免疫具有深刻影響)，因為該肽短至10個胺基酸，只能觸發HLA I類限制的反應。已經表明，被MHC I類結合的CD8 +T細胞表位在8至11個殘基的範圍內(Rosa DS等人, 2010；Hemmer B等人, 2000)，而CD4 +T淋巴細胞通常識別12-16個胺基酸的肽(Rosa DS等人, 2010；Hemmer B等人, 2000)或13-17個胺基酸的肽(Chicz RM等人, 1992；Sercarz EE等人, 2003)。
在第一方面，本公開提供了一種藥物組成物，它基本上是一種肽疫苗組成物。所述藥物組成物包含肽(即肽疫苗)，該肽具有至少12個胺基酸殘基的長度並且包含4-AA肽段RMSA(SEQ ID NO: 26)。所述藥物組成物在按照其治療有效方案施用於受試者後，能夠刺激所述受試者中針對組蛋白3(H3)K27M突變(H3K27M)的CD4 T細胞反應。因此，與WO2016179326A1中公開的10-AA肽疫苗只能刺激針對H3.3K27M突變的CD8 T細胞反應相比，本公開提供的肽疫苗能夠刺激針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應。
在此，所述肽疫苗中的4-AA肽段RMSA(SEQ ID NO: 26)基本上對應於4-AA區域RKSA(SEQ ID NO: 30)的“K27M”突變形式(如文獻中所引用的)，該4-AA區域對應於人組蛋白3.1(即，H3.1)變體(SEQ ID NO: 22)和人組蛋白3.3(即，H3.3)變體(SEQ ID NO: 24)的位置27-30。因此，根據肽疫苗的序列，本文提供的肽疫苗能夠刺激受試者中針對H3.1 K27M突變和H3.3 K27M突變兩者的CD4 T細胞反應。
根據一些實施方案，所述藥物組成物在施用後進一步能夠刺激受試者中針對H3K27M突變的CD8 T細胞反應。換言之，所述肽疫苗的一些實施方案在施用後能夠既刺激CD4 T細胞反應又刺激CD8 T細胞反應。
根據所述藥物組成物的一些實施方案，所述肽包含10-AA區段RMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 25)。在此，根據受試者中目標腫瘤組織的不同突變H3基因型，所述肽疫苗可包含10-AA區段RMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 5)，從而能夠刺激該受試者中針對H3.3K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應，或者包含10-AA區段RMSAPATGGV(SEQ ID NO: 29)，從而能夠刺激該受試者中針對H3.1K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應。
進一步根據所述藥物組成物的一些實施方案，所述肽包含18-AA區段KQLATKAARMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 1)。根據受試者中目標腫瘤組織的不同突變H3基因型，所述肽疫苗可包含18-AA區段KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)，從而能夠刺激該受試者中針對H3.3K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應，或者包含18-AA區段KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)，從而能夠刺激該受試者中針對H3.1K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應。
進一步根據一個具體實施方案，所述藥物組成物中的所述肽由18-AA的KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)組成。如下文闡述的實施例所詳細說明的，這種18-AA肽疫苗當配製成包含聚ICLC佐劑的藥物組成物並施用於患者時，能夠刺激針對 H3.3K27M突變的CD4和CD8 T細胞反應兩者。
根據另一個具體實施方案，所述藥物組成物中的所述肽由18-AA的KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)組成，其被設計為刺激類似的針對H3.1K27M突變的T細胞反應。
在如上所述的任何實施方案中，所述藥物組成物可進一步包含佐劑。根據一些實施方案，該佐劑包括toll樣受體(TLR)促效劑，其可以任選地包括TLR3、TLR4、TLR7/TLR8和TLR9中任一種的配體。任選地，使用TLR3配體作為包含肽疫苗的藥物組成物的佐劑，如聚I:C(聚核糖肌苷酸:聚核糖胞苷酸)。進一步任選地，所述聚I:C的某些衍生物具有改善的穩定性、安全性和/或佐劑性，如聚ICLC和聚I:C12U。任選地，還可以使用其他TLR配體，非限制性實例可包括單磷醯脂質A(MPL，作為TLR4配體)或其衍生物、咪喹莫特(imiquimod)和瑞喹莫德(resiquimod)(均作為TLR7/8配體)、cpG ODN(TLR9配體)。這類佐劑的更多實例和相關資訊可參見第US20110038888A1號美國專利申請、Toussi DN和Massari P, 2014，其公開內容經由引用而整體併入。根據另外一些實施方案，所述佐劑包括TLR促效劑以外的外源物質，其可包括卡介苗(BCG)疫苗，但還可包括具有不同性質和材料特性的物質。
在此任選地，使用聚ICLC作為佐劑，並且在所述藥物組成物中，聚ICLC與所述肽的重量比可以大約為1:0.5至1:5(例如，1:1、1:2、1:3、1:4)。
進一步任選地，所述藥物組成物可以配置為具有包含大約0.5 mg聚ICLC和大約0.5-2 mg所述肽的劑量形式。
進一步任選地，所述藥物組成物可以配置成適合對受試者進行皮下注射的製劑。
在第二方面，進一步提供了使用第一方面提供的藥物組成物刺激有需要的受試者中的免疫反應的方法。
如本文所用的，“受試者”是指患有癌症的人類個體，並且該癌症的特徵在於在癌組織/細胞中具有組蛋白H3中的K27M突變。受試者的非限制性實例可包括患有神經膠質瘤、DIPG、急性髓樣白血病(AML)、黑色素瘤的人類個體(Lowe BR等人, 2019)，但是受試者的其他實例還可包括其他癌症，只要癌組織/細胞含有H3K27M即可。還應當指出，儘管目前僅在組蛋白H3的兩個變體(即H3.1和H3.3)中鑑別到K27M突變，但本文公開的藥物組成物及其使用方法還應被解釋為涵蓋其他H3變體(例如，H3.2，SEQ ID NO: 23)或其他H3突變，只要該變異或突變H3含有K27M即可。
在此，所述方法基本上包括以下步驟：按治療有效方案向受試者施用根據如以上第一方面所述的任一實施方案的藥物組成物，從而在所述受試者中誘導免疫反應。在此，所述免疫反應包括針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應，並且任選地，所述免疫反應進一步包括針對H3K27M突變的CD8 T細胞反應。
根據所述方法的一些實施方案，在施用步驟之前，所述方法進一步包括以下步驟：確定所述受試者中H3的突變變異型。
在此，如果確定H3的突變變異型為H3.3，則在施用步驟中，所述藥物組成物中的所述肽包含RMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 5)。進一步任選地，所述藥物組成物中的所述肽包含KQLATKAARMSAP STGGV(SEQ ID NO: 2)。進一步任選地，所述肽的長度為18 AA，並且由KQLATKAARMSAP STGGV(SEQ ID NO: 2)組成。
在此，如果確定H3的突變變異型為H3.1，則在施用步驟中，所述藥物組成物中的所述肽包含RMSAP ATGGV(SEQ ID NO: 29)。進一步任選地，所述藥物組成物中的所述肽包含KQLATKAARMSAP ATGGV(SEQ ID NO: 27)。進一步任選地，所述肽的長度為18 AA，並且由KQLATKAARMSAP ATGGV(SEQ ID NO: 27)組成。
在上述方法的任何實施方案中，所述癌症可包括神經膠質瘤、急性髓樣白血病(AML)或黑色素瘤中的至少一種。任選地，所述癌症可包括神經膠質瘤，並且進一步任選地，所述癌症包括DIPG。
在上述方法的任何實施方案中，所述受試者攜帶HLA-A*02等位基因。
在上述方法的任何實施方案中，所述受試者攜帶HLA-DRB1*07:01等位基因或HLA-DRB1*01:01等位基因中的至少一種。
在上述方法的任何實施方案中，所述治療有效方案包括經由皮下注射向受試者施用所述藥物組成物。
在第三方面，本公開進一步提供了表現T細胞受體(TCR)或其功能片段的T細胞。
在此，所述TCR或其功能片段能夠與肽/MHC II複合物結合，其中所述肽/MHC II複合物中的肽具有至少12個胺基酸殘基的長度並且包含RMSA(SEQ ID NO: 26)。
根據所述T細胞的一些實施方案，所述TCR或其功能片段進一步能夠與在所述肽與MHC I之間形成的複合物結合。
在此任選地，所述肽包含RMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 25)。進一步任選地，所述肽包含KQLATKAARMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 1)。
在此，根據所述T細胞的一些實施方案，所述肽包含KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)，並且進一步任選地，所述肽的長度為18 AA，並且由KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)組成。在此任選地，所述TCR或其片段不能與由一種第二肽與MHC II複合物之間形成的複合物相結合，並且所述第二肽包含胺基酸序列KQLATKAAR K SAP STGGV(SEQ ID NO: 6)。
在此，根據所述T細胞的其他一些實施方案，所述肽包含KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)，並且進一步任選地，所述肽的長度為18 AA，並且由KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)組成。在此任選地，所述TCR或其片段不能與由一種第二肽與MHC II複合物之間形成的複合物相結合，並且所述第二肽包含胺基酸序列KQLATKAARKSAPATGGV(SEQ ID NO: 28)。
根據所述T細胞的一些實施方案，所述TCR對於所述T細胞而言是異源的。在此任選地，所述TCR經由載體如逆轉錄病毒載體轉導或轉染到所述T細胞中。
表1中列出了此處以及本申請其他地方引用的所有序列。 表1. 本申請中引用的序列
序列 長度 SEQ ID NO 注釋
KQLATKAARMSAP(S/A)TGGV 18 SEQ ID NO: 1 H3.1和H3.3 (K27M)
KQLATKAARMSAPSTGGV 18 SEQ ID NO: 2 H3.3 (K27M)；"KQ-RMS"
KQLATKAARKSAPSTGGV 18 SEQ ID NO: 6 H3.3 (不含K27M)；"KQ-RKS"
KQLATKAARMSAPATGGV 18 SEQ ID NO: 27 H3.1 (K27M)
KQLATKAARKSAPATGGV 18 SEQ ID NO: 28 H3.1 (不含K27M)
KQLATKAARMSAPATGGV 18 SEQ ID NO: 3 H3.1 (K27M)
(R/A)MSAP(S/A)TGGV 10 SEQ ID NO: 4 H3.1和H3.3 (K27M)
RMSAP(S/A)TGGV 10 SEQ ID NO: 25
RMSAPSTGGV 10 SEQ ID NO: 5 H3.3 (K27M)；"RMS"
RKSAPSTGGV 10 SEQ ID NO: 7 H3.3 (不含K27M)；"RKS"
RMSAPATGGV 10 SEQ ID NO: 29 H3.1 (K27M)
RMSA 4 SEQ ID NO: 26 H3.1和H3.3中的突變型4-AA核心區域
RKSA 4 SEQ ID NO: 30 H3.1和H3.3中的野生型4-AA核心區域
KQLATKAARMSA 12 SEQ ID NO: 8
KQLATKAARMSAP 13 SEQ ID NO: 9
KQLATKAARMSAPS 14 SEQ ID NO: 10
KQLATKAARMSAPST 15 SEQ ID NO: 11
KQLATKAARMSAPSTG 16 SEQ ID NO: 12
KQLATKAARMSAPSTGG 17 SEQ ID NO: 13
QLATKAARMSAP 12 SEQ ID NO: 14
ATKAARMSAPST 12 SEQ ID NO: 15
KQLATKAARMSA 12 SEQ ID NO: 16
TKAARMSAPSTG 12 SEQ ID NO: 17
ATKAARMSAPSTG 13 SEQ ID NO: 18
LATKAARMSAPST 13 SEQ ID NO: 19
TKAARMSAPSTGG 13 SEQ ID NO: 20
AARMSAPSTGGV 12 SEQ ID NO: 21
martkqtarkstggkaprkqlatkaar k sapatggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqssavmalqeaceaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera 136 SEQ ID NO: 22 H3.1 (野生型)；NP_003522.1； 劃下底線並且字體加粗的“K”代表H3.1K27M突變的殘基
martkqtarkstggkaprkqlatkaarksapatggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqssavmalqeaseaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera 136 SEQ ID NO: 23 H3.2 (野生型)；NP_066403.2；
martkqtarkstggkaprkqlatkaar k sapstggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqsaaigalqeaseaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera 136 SEQ ID NO: 24 H3.3 (野生型)；NP_005315.1；劃下底線並且字體加粗的“K”代表H3.3K27M突變的殘基
定義
如本文所用的，術語“約”或“大約”當與數字一起使用時，是指在所列數字的1%、5%或10%以內的任何數字。
如本文所用的，術語“瘤形成”、“增生”和“腫瘤”通常被統稱為“癌症”，“癌症”是超過100種以細胞不受控制的異常生長為特徵的疾病的總稱。如本文所用的，“腫瘤”還包括正常的、良性的或惡性的組織塊。
如本文所用的，術語“肽”是指本領域技術人員已知的經由醯胺鍵(或肽鍵)連接的胺基酸的聚合物。肽可以是經由共價醯胺鍵連接的4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個胺基酸的聚合物。在一些實施方案中，肽是經由共價醯胺鍵連接的6至8、8至10、10至15、10至20、10至25、10至30、10至40、10至50或25至25個胺基酸的聚合物。在某些實施方案中，肽是經由共價醯胺鍵連接的50至65、50至75、50至85、50至95、50至100、75至100個胺基酸的聚合物。如本文所用的，該術語可指經由共價醯胺鍵連接的單條肽鏈。該術語還可以指經由諸如離子接觸、氫鍵、凡得瓦接觸和疏水性接觸等非共價相互作用締合的多條肽鏈。本領域技術人員將會認識到，該術語包括已修飾的肽，例如經由諸如訊息肽切割、二硫鍵形成、醣基化(例如，N-連接的醣基化)、蛋白酶切割和脂質修飾(例如，S-棕櫚醯化)等轉譯後加工所修飾的肽。
如本文所用的，術語“保守置換”是指將一個類別的胺基酸替換為同一類別的另一個胺基酸。在特定實施方案中，保守置換不改變肽的結構或功能，或者結構和功能都不改變。用於保守置換目的的胺基酸的類別包括疏水性的(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性親水性的(Cys、Ser、Thr)、酸性的(Asp、Glu)、鹼性的(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、構象破壞性的(Gly、Pro)和芳香族的(Trp、Tyr、Phe)。
如本文所用的，術語“免疫反應”是指在人類受試者中發生的、據稱用於對抗癌症的反應。免疫反應可包括先天性免疫反應和適應性免疫反應；前者包括諸如嗜中性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞等免疫細胞，以及細胞介素和補體，而後者包括諸如樹突細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞，以及刺激抗原特異性免疫反應的抗體。
術語“T細胞反應”是指由T細胞介導的一種類型的適應性免疫反應，其通常包括在體外或體內由肽誘導的、針對特定抗原的特異性增殖和效應子功能活化。T細胞有兩大亞型：CD8 +T細胞(即殺手T細胞、細胞毒性T細胞或效應T細胞)和CD4 +T細胞(即輔助性T細胞)，因此T細胞反應包括CD4 T細胞反應和CD8 T細胞反應。
術語“CD8 T細胞反應”、“CD8 +T細胞反應”或類似術語是指由CD8 +T細胞或CD8 +淋巴細胞介導的一種類型的T細胞反應。CD8 +T細胞通常用來破壞受病毒感染的細胞和腫瘤細胞，並且通常經由結合與所有具核細胞表面上存在的MHC I類分子締合的短肽(長度為8-11 AA)來識別其靶標。CD8 +T細胞還產生若干關鍵細胞介素，包括TNFα、IL-2和IFNγ，這些細胞介素能夠影響其他細胞、特別是巨噬細胞和NK細胞的效應子功能。
術語“CD4 T細胞反應”、“CD4 +T細胞反應”或類似術語是指由CD4 +T細胞或CD4 +淋巴細胞介導的另一種類型的T細胞反應。CD4 +T細胞通常協助其他淋巴細胞，包括B細胞的成熟以及細胞毒性T細胞和巨噬細胞的活化。當經由抗原呈遞細胞(APC)表面上表現的MHC II類分子向CD4 +T細胞呈遞較長的肽抗原(長度為12-16 AA)時，CD4 +T細胞變為活化的，使得它們快速分裂並分泌調節或幫助免疫反應的細胞介素(例如IFNγ、IL-2等)。在本文中，術語“抗原呈遞細胞”是指樹突細胞(DC)、單核細胞/巨噬細胞、B淋巴細胞或其他表現必要MHC/共刺激分子的細胞類型，它們有效地允許T細胞識別所呈遞的肽。
術語“MHC”是指“主要組織相容性抗原”。在人類中，MHC基因被稱為HLA(“人類白血球抗原”)基因。雖然沒有一貫遵循的慣例，但一些文獻用HLA指代HLA蛋白分子，而用MHC指代編碼HLA蛋白的基因。因此，當在本文中使用時，術語“MHC”和“HLA”是等同的。人類的HLA系統在小鼠中具有等同物，即H2系統。研究最深入的HLA基因是九個所謂的經典MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。在人類中，MHC分為以下三個區域：I類、II類和III類。A、B和C基因屬於MHC I類，而6個D基因屬於II類。MHC I類分子由包含3個結構域(α1、2和3)的一條多型鏈組成，與細胞表面的β2微球蛋白締合。II類分子由2條多型鏈組成，每一條包含2條鏈(α和β)。
I類MHC分子幾乎在所有具核細胞上都表現。在I類MHC分子背景中呈遞的肽片段被CD8 T淋巴細胞(細胞毒性T淋巴細胞或CTL)識別。CD8 +T細胞或淋巴細胞經常成熟為細胞毒性效應細胞，其可裂解攜帶刺激抗原的細胞。II類MHC分子主要在活化的淋巴細胞和抗原呈遞細胞上表現。CD4 +T淋巴細胞(輔助T淋巴細胞或HTL)經由識別由通常存在於抗原呈遞細胞如巨噬細胞或樹突細胞上的II類MHC分子呈遞的獨特肽片段而被活化。CD4 +T淋巴細胞增殖並分泌細胞介素，所述細胞介素經由產生IL-4和IL-10支持抗體介導的反應，或者經由產生IL-2和IFNγ支持細胞介導的反應。
功能性HLA的特徵在於深結合溝，內源的以及外來的潛在抗原性肽與該溝結合。該溝的特徵進一步在於明確的形狀和物理化學性質。HLA I類結合位點是封閉的，因為肽末端被約束在該溝的末端內。它們還參與具有保守HLA殘基的氫鍵網絡。鑑於這些限制，被結合的肽的長度被限制在8-10個殘基。與HLA I類結合位點不同，II類位點在兩端都是開放的。這允許肽從實際結合區域延伸，從而在兩端“懸出”。因此，II類HLA可結合不同長度的、通常超過12個胺基酸殘基的肽配體。
如本文所用的，術語“佐劑”是指這樣的外源物質，當與特定疫苗(例如本文公開的肽疫苗)同時施用於受試者時，其可以增強受試者對該疫苗的免疫反應，也稱為“免疫佐劑”。可與本文公開的肽疫苗同時使用的佐劑並無限制，可包括具有各種性質和來源的外源物質，如礦物鹽、基於油和基於水的乳劑、聚合物、微粒、脂質體、皂苷、微生物產物和細胞介素。本公開中的佐劑的作用機制也沒有限制，可包括非特異性作用(即，免疫部位的抗原儲庫)，以及免疫細胞的特異性活化，從而導致宿主的先天性和適應性反應得到改善。
如本文所用的，術語“聚I:C”是指聚肌苷酸:聚胞苷酸，也可縮寫為聚(I:C)或類似用語，其通常以鈉鹽形式使用來刺激免疫反應。術語“聚ICLC”或聚I:CLC或類似用語是指聚I:C與穩定劑羧甲基纖維素和聚離胺酸的混合物。
如本文所用的，術語“治療有效方案”是指為了治療和/或控制以具有H3K27M突變為特徵的癌症，在有需要的受試者中施用包含肽疫苗的藥物組成物的給藥劑量、時機、頻率、方式和持續時間的方案，並且所述施用的給藥劑量、時機、頻率和持續時間被配置為足以刺激該受試者中針對H3K27M突變的免疫反應(例如，CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應)的水平。
除非特別說明或根據上下文顯而易見，否則如本文所用的，術語“或”應理解為包含性的。
除非特別說明或根據上下文顯而易見，否則如本文所用的，術語“一個”、“一種”和“該”應理解為單數或複數。
除非特別說明或根據上下文顯而易見，否則如本文所用的，術語“大約”、“約”、“左右”或類似用語應理解為在本領域的正常公差範圍內，例如，在平均值的2個標準偏差以內。“約”可被理解為在所述值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%以內。除非根據上下文顯而易見，否則本文提供的所有數值均可理解為由該術語修飾。
術語“包含”包括“包括”以及“由...組成”，例如，“包含” X的組成物可以完全由X組成，或者可以包括其他成分，例如X+Y。
術語“基本上”不排除“完全地”，例如，“基本上不含” Y的組成物可以完全不含Y。必要時，可從本發明的定義中省略“基本上”一詞。
本文提及的所有參考文獻、專利或專利申請均特此經由引用而整體併入。
本公開提供了一種肽疫苗，其可用於刺激已施用包含該肽疫苗的藥物組成物的、攜帶體細胞突變的受試者中針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應。由於該肽疫苗能夠刺激針對這種與人類神經膠質瘤、特別是小兒和成人DIPG密切相關的臨床關鍵突變的顯著T細胞反應，因此該肽疫苗具有治療該疾病的潛力。
在第一方面，提供了一種藥物組成物，其包含具有至少12個胺基酸殘基(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30個等)的長度並且包含4-AA肽段RMSA(SEQ ID NO: 26)的肽(即，肽疫苗)。該藥物組成物在按照其治療有效方案施用於受試者後，能夠刺激受試者中針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應。此外，任選且優選地，該藥物組成物進一步能夠刺激CD8 T細胞反應。
換言之，根據一些實施方案，所述包含肽疫苗的藥物組成物只能刺激針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應，而不能刺激針對H3K27M突變的CD8 T細胞反應；而根據另外一些實施方案，所述包含肽疫苗的藥物組成物能夠刺激針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應和CD8細胞反應兩者。
因此，與WO2016179326A1中公開的10-AA肽疫苗只能刺激針對H3.3K27M突變的CD8 T細胞反應相比，本公開提供的藥物組成物中的肽疫苗能夠區別性地刺激針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應。
在本文中，H3可以是H3.1或H3.3，其野生型序列分別在SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 24中列出。攜帶H3.1K27M突變或H3.3K27M突變的受試者可從該肽疫苗中獲益，該受試者可能患有神經膠質瘤(例如，DIPG)、急性髓樣白血病(AML)和黑色素瘤等中的至少一種。
根據一些實施方案，所述肽包含10-AA區段RMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 25)。在此，根據受試者中目標腫瘤組織的不同突變H3基因型，所述肽疫苗可包含10-AA區段RMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 5)，從而能夠刺激該受試者中針對H3.3K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應，或者可包含10-AA區段RMSAPATGGV(SEQ ID NO: 29)，從而能夠刺激該受試者中針對H3.1K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應，或者可包含以上兩種肽，其中之一包含SEQ ID NO: 25的10-AA區段，而另一種包含SEQ ID NO: 29的10-AA區段。
進一步根據所述藥物組成物的一些實施方案，所述肽包含18-AA區段KQLATKAARMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 1)。根據受試者中目標腫瘤組織的不同突變H3基因型，所述肽疫苗可包含18-AA區段KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)，從而能夠刺激該受試者中針對H3.3K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應，或者包含18-AA區段KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)，從而能夠刺激該受試者中針對H3.1K27M突變的CD4 T細胞反應，以及任選地，CD8 T細胞反應，或者包含以上兩者。
進一步根據一個具體實施方案，所述藥物組成物中的肽由18-AA序列KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)組成，該序列特異性靶向H3.3K27M，其實驗數據將在下文實施例1中更詳細地介紹。根據另一個具體實施方案，所述藥物組成物中的肽由18-AA序列KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)組成，該序列特異性靶向H3.1K27M。
應當指出，根據不同的需要，所述藥物組成物可包含一種如上所述的肽，或者可包含多種如上所述的肽的組合。
所述藥物組成物可以配製成允許向有需要的受試者施用的劑量形式。因此，除肽疫苗外，該藥物組成物還可包含佐劑，例如，該佐劑可包括聚ICLC。該藥物組成物可以配製成允許經由皮下注射施用，但是也可以配製成允許本領域技術人員所知的其他施用方式。
在第二方面，進一步提供了使用如以上第一方面所述的藥物組成物的方法。這樣的方法可以涉及使用該藥物組成物刺激有需要的受試者中的免疫反應，特別是T細胞反應，該受試者可能患有癌症(例如，DIPG、神經膠質瘤、AML或黑色素瘤等)並且可能攜帶H3K27M突變。
在此，所述方法基本上包括以下步驟：按治療有效方案向受試者施用根據如以上第一方面所述的任一實施方案的藥物組成物，從而在所述受試者中誘導免疫反應。在此，該免疫反應包括針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應，並且任選地，該免疫反應進一步包括針對H3K27M突變的CD8 T細胞反應。
在本文公開的方法中待施用於受試者的藥物組成物中的肽疫苗可包含4-AA RMSA(SEQ ID NO: 26)，或進一步任選地可包含10-AA RMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 25)，或進一步任選地可包含18-AA KQLATKAARMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 1)，即18-AA KQLATKAARMSAP STGGV(SEQ ID NO: 2)或18-AA KQLATKAARMSAP ATGGV(SEQ ID NO: 27)之一。
在所述方法中，受試者可能攜帶HLA-A*02等位基因，因此除CD4 T細胞反應外還允許刺激CD8 T細胞反應。然而，對於可能攜帶HLA-A*02以外的HLA等位基因的其他受試者，也可能能夠刺激CD8 T細胞反應。
在所述方法中，受試者可能攜帶HLA-DRB1*07:01等位基因或HLA-DRB1*01:01等位基因中的至少一種，以獲得明確的CD4 T細胞反應，但是也可能攜帶其他等位基因，從而也具有CD4 T細胞反應。
在所述方法中，所述包含肽疫苗的藥物組成物可以經由皮下注射來施用，但也可以經由其他給藥途徑施用。
在第三方面，本公開進一步提供了表現T細胞受體(TCR)或其功能片段的T細胞。在此，該TCR或其功能片段能夠與肽/MHC II複合物結合，其中所述肽/MHC II複合物中的肽具有至少12個胺基酸殘基的長度並且包含4-AA區段RMSA(SEQ ID NO: 26)，或進一步任選地包含10-AA區段RMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 25)，或進一步任選地包含18-AA KQLATKAARMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 1)。根據所述T細胞的一些實施方案，所述TCR或其功能片段進一步能夠與在所述肽與MHC I之間形成的複合物結合。
在此，根據所述T細胞的一個具體實施方案，所述肽包含KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)，並且進一步任選地，所述肽的長度為18 AA，並且由KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)組成。在此任選地，所述TCR或其片段不能與由一種第二肽與MHC II複合物之間形成的複合物相結合，並且所述第二肽包含胺基酸序列KQLATKAARKSAPSTGGV(SEQ ID NO: 6)。因此，所述TCR與H3.3變體的K27M突變肽特異性結合，但不與其野生型肽結合，從而賦予了特異性刺激針對H3.3K27M突變而非野生型H3.3的CD4 T細胞反應的能力。
根據所述T細胞的另一個具體實施方案，所述肽包含KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)，並且進一步任選地，所述肽的長度為18 AA，並且由KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)組成。在此任選地，所述TCR或其片段不能與由一種第二肽與MHC II複合物之間形成的複合物相結合，並且所述第二肽包含胺基酸序列KQLATKAARKSAPATGGV(SEQ ID NO: 28)。因此，所述TCR與H3.1的K27M突變形式特異性結合，但不與野生型形式結合，從而賦予了特異性刺激針對H3.1K27M突變而非野生型H3.1的CD4 T細胞反應的能力。
根據所述T細胞的一些實施方案，所述TCR對於所述T細胞而言是異源的。在此任選地，所述TCR經由載體如逆轉錄病毒載體轉導或轉染到所述T細胞中。
下面提供了一個具體實施例(實施例1)，用於測試所述肽疫苗的一個具體實施方案(即，18-AA KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2))在施用於DIPG患者後誘導或刺激免疫反應，特別是針對H3.3K27M突變的CD4 T細胞反應和/或CD8 T細胞反應的能力。
實施例1
1.1. 肽疫苗設計：
為了設計肽疫苗，首先基於免疫表位數據庫(Immune Epitope Database，IEDB，www.iedb.org)對HLA結合和抗原呈遞進行了計算預測。具體來說，使用MHC-II結合預測模組(IEDB推薦2.22)進行預測。使用‘12-18’作為‘選擇長度’，以便讓演算法預測長度從12AA到18AA的含有H3K27M突變的所有表位。如果對於HLA等位基因有任何對應的預測器，則‘IEDB推薦2.22’使用組合了NN-align、SMM-align、CombLib和Sturniolo的共識方法，否則使用NetMHCIIpan。預測後，記錄最小預測得分(表2中列出的百分位數排名)，以表示某個表位與相應HLA等位基因結合的特異性。得分越小，表位與HLA等位基因結合的特異性越強。預測結果總結於表2中。 表2. II 類HLA 結合和抗原呈遞的計算預測
等位基因 肽 百分位數排名
HLA-DRB1*07:01 KQLATKAA RMSA (SEQ ID NO: 8) 9.2
HLA-DRB1*07:01 KQLATKAA RMSA P (SEQ ID NO: 9) 12
HLA-DRB1*07:01 KQLATKAA RMSA PS (SEQ ID NO: 10) 13
HLA-DRB1*07:01 KQLATKAA RMSA PST (SEQ ID NO: 11) 15
HLA-DRB1*07:01 KQLATKAA RMSA PSTG (SEQ ID NO: 12) 17
HLA-DRB1*07:01 KQLATKAA RMSA PSTGG (SEQ ID NO: 13) 18
HLA-DRB1*07:01 QLATKAA RMSA P (SEQ ID NO: 14) 18
HLA-DRB1*1:01 ATKAA RMSA PST (SEQ ID NO: 15) 14
HLA-DRB1*1:01 KQLATKAA RMSA (SEQ ID NO: 16) 14
HLA-DRB1*1:01 TKAA RMSA PSTG (SEQ ID NO: 17) 14
HLA-DRB1*1:01 ATKAA RMSA PSTG (SEQ ID NO: 18) 17
HLA-DRB1*1:01 LATKAA RMSA PST (SEQ ID NO: 19) 17
HLA-DRB1*1:01 TKAA RMSA PSTGG (SEQ ID NO: 20) 17
HLA-DRB1*1:01 AA RMSA PSTGGV (SEQ ID NO: 21) 17
注：各序列中共有的4-AA核心區段以粗體和劃下底線字體表示。
如預測結果所示，含有點突變的各種表位被預測為對II類HLA分子具有高親和力，並且所有表位都具有攜帶K27M突變(即4-AA區段的第2位為M殘基)的核心4-AA區段(R M SA，SEQ ID NO: 26)。應當指出，所選的一些II類HLA分子是人類群體中的高頻分子，如HLA-DRB1*01:01和HLA-DRB1*07:01。
基於以上這些預測結果，設計了一系列候選肽疫苗。除以上列出的高排名候選肽(即百分位數排名＜=15，包括SEQ ID NO: 8-11和15-17)外，還選擇了設計為具有18個胺基酸(即KQLATKAA R MSAPSTGGV (SEQ ID NO: 2)，點突變殘基M位於肽疫苗從N末端起的第10位)的更長的候選肽疫苗。隨後使用這種18-AA候選肽疫苗進行了一系列實驗。
1.2. 對肽疫苗的實驗測試
1.2.1 患者招募：
選擇年齡在5歲及以上的新診斷的DIPG患者。簽署同意書後，向腫瘤活檢顯示具有HLA-A*02亞型和H3.3K27M基因分型結果的患者給予疫苗治療。
1.2.2 疫苗施用：
首先將肽疫苗製備成合適的藥物組成物，設計了三種劑量形式(劑量#1、#2和#3)(見表3)，它們均顯示出良好的安全性譜。最後，使用表示為“劑量#3”的劑量製劑的肽疫苗對患者進行實驗。 表3. 疫苗配方與劑量探索
肽 聚 ICLC 溶液
劑量#1 0.5mg 0.5mg 溶解於生理鹽水中，總體積為1ml
劑量#2 1mg 0.5mg
劑量#3 2mg 0.5mg
簡言之，在順形放射治療完成兩週後，經由皮下注射(以表2中的劑量製劑劑量#3)施用肽疫苗。第一次注射疫苗的日期被定義為第1天(D1)。在D3、D15、D29、D57、D85進行注射，此後每8週注射一次，直至疾病進展。從不同時間點採集外周血樣品，並用於藥物動力學(PK)和藥效學(PD)研究以及TCR選殖工作。用於TCR選殖的血液樣品採集自第五次和第六次疫苗注射後的患者。
TCR選殖中使用的所有PBMC樣品都採集自接受疫苗接種劑量#3的患者。來自患者EN17的用於TCR選殖的PBMC樣品在患者接受第六次疫苗注射後採集。來自患者EN10的用於TCR選殖的PBMC樣品在患者接受第六次疫苗注射後採集。來自患者EN23的用於TCR選殖的PBMC樣品是組合PBMC樣品，來自患者接受第三次和第四次疫苗注射後的患者PBMC樣品。
1.2.3 在接種疫苗的患者的外周血樣品中檢測到的CD4和CD8 T細胞反應
從接種疫苗的DIPG患者採集外周血樣品，並經由Ficoll梯度收集外周血單核細胞(PBMC)。用相應的肽刺激PBMC樣品2-3週，之後將細胞接種到IFN-γ檢測ELISpot板中，並用相應的肽再次刺激。IFN-γ訊息的增強被視為存在抗原特異性T細胞(圖1)。然後由10× Genomics對樣品進行單細胞RNA定序。基於轉錄譜挑選出候選TCR，將其引入原代人類T細胞中，並經由脈衝引入(pulsing)相應的肽來進行驗證(圖2和圖3)。在本技術公開中，我們使用這些數據來說明我們的疫苗接種方法確實引發了強烈的腫瘤抗原特異性免疫反應。
表4中總結了本公開(包括附圖和說明書)中使用的下列術語和/或縮寫。 表4. 實施例1中使用的術語和縮寫的說明
術語 / 縮寫 說明
EN-10；EN-17；EN-23 這是三名接種疫苗的不同DIPG患者的標識符。這些標識符還用於標記PB樣品
KQ-RMS或KQ 攜帶點突變的長肽(18 AA)( KQLATKAA RMSAPSTGGV，SEQ ID NO: 2)
KQ-RKS 不含點突變的長肽(18 aa)( KQLATKAA RKSAPSTGGV，SEQ ID NO: 6)
RMS或RM 攜帶點突變的短肽(10 aa)( RMSAPSTGGV，SEQ ID NO: 5)
RKS 不含點突變的短肽(10 aa)( RKSAPSTGGV，SEQ ID NO: 7)
注：劃下底線的胺基酸殘基代表每個術語/縮寫中的關鍵字母。
更詳細地，我們使用特定的培養條件來培養PBMC樣品。培養物中包括抗原肽和合適的抗原呈遞細胞。經由這樣，我們試圖特異性地刺激抗原特異性T細胞的擴增。2-3週後，將細胞接種到IFN-γ檢測ELISpot板中，並用相應的肽再次刺激。活化後，T細胞回應於抗原刺激而釋放IFN-γ。IFN-γ的分泌可經由ELISpot來檢測。一個斑點可解釋為檢測到一個分泌IFN-γ的細胞。圖1顯示了IFN-γ ELISpot結果。結果顯示，PBMC樣品(EN-17；EN-23)對長肽(KQ)的刺激有反應，但對短肽(RM)的刺激沒有反應。因此，針對上述長肽的刺激能夠特異性監測到T細胞反應。這些最可能是CD4 T細胞反應。
1.2.4 TCR選殖和實驗程序：
以下是TCR選殖實驗程序的簡要說明。簡言之，在不同的時間點從接種疫苗的患者採集PB樣品。從血液樣品中分離PBMC。使分離的PBMC經受針對T細胞擴增和抗原刺激最佳化的培養條件。使用分別經培養擴增的自體B細胞或DC細胞作為抗原呈遞細胞(APC)來呈遞長肽抗原(MHC II類抗原)。同時，B細胞和DC也適合呈遞短肽(MHC I類抗原)。使患者的T細胞擴增並被肽抗原刺激數週。為了監測T細胞隨時間推移的狀態，在不同的時間點收集一小部分經培養的T細胞。對收集的細胞進行第二輪抗原刺激，並經由ELISpot和FACS測定T細胞反應。對顯示出明顯T細胞活化訊息的樣品進行單細胞轉錄組定序。從單細胞轉錄組數據分析中選出候選TCR，並分別進行下游功能驗證。為了對每個候選TCR進行功能驗證，使用逆轉錄病毒載體經由病毒轉導將TCR引入具有合適HLA亞型的選定PBMC樣品中。來自轉導的PBMC樣品的T細胞(CD4 +和CD8 +T細胞)表現作為外來轉基因的候選TCR。使轉導的PBMC樣品擴增並對其進行抗原刺激。使用FACS分析來檢查T細胞反應。在FACS分析中，分別對CD4 +T細胞和CD8 +T細胞進行門控，以特異性地檢查每種類型的免疫反應。更多細節在下文提供。
首先，選擇在再次刺激後IFN-γ訊息增強的合適的樣品(EN-17和EN-23 PSG2_KQ)，並對其進行下游單細胞RNA-Seq分析。更具體而言，在開始時對(接種疫苗後的)PBMC樣品進行刺激並擴增2-3週。然後用ELISpot進行檢查。在該ELISpot實驗中經再次刺激後IFN-γ增強的樣品，即EN-17和EN-23 PSG2-KQ樣品，隨後進行單細胞RNA定序。
分析單細胞數據後，基於轉錄譜選擇候選TCR，並對其進行功能驗證實驗。更具體而言，將候選TCR經逆轉錄病毒(病毒骨架pMP71)引入原代人類T細胞中。將相應的肽脈衝到經TCR轉導的T細胞中，並使用流式細胞術分析來監測反應。作為一個示例，圖2顯示了EN-17 C27——從EN-17 PBMC樣品的CD4 T細胞選殖的候選TCR——的功能驗證結果。對CD4 T細胞和CD8 T細胞分別進行門控和研究。CD134(OX40)是CD4 T細胞的活化標誌物。具體來說，CD4 T細胞回應於抗原刺激而上調CD134的細胞表面表現。CD107a、CD137和CD69是另外三種T細胞活化標誌物。CD4和CD8 T細胞都回應於抗原刺激而上調CD107a和CD137和CD69的表現。
圖2顯示，EN-17 C27(從CD4 T細胞選殖的TCR)被驗證為H3K27M抗原特異性TCR。它對短肽(RMS或RKS，圖2A)的刺激 沒有反應。它對攜帶點突變的長肽(KQ-RMS)的刺激有特異性反應，但對沒有點突變的長肽(KQ-RKS)的刺激沒有反應(圖2A)。
EN-17 C27是作為外來TCR引入PBMC細胞中的CD4 TCR。CD4和CD8 T細胞都能被逆轉錄病毒載體轉導。當EN-17 C27被引入CD8 T細胞中時，它仍能與其同源抗原(由II類HLA呈遞的KQ-RMS)相互作用。然而，在這種情況下，這種相互作用 無法被CD4分子加強，因為宿主細胞是CD8 T細胞。此外，CD8分子對TCR和抗原的相互作用也沒有幫助。這是對候選TCR的良好測試。對其抗原具有高結合親和力的良好候選TCR可獨立於CD4或CD8而觸發T細胞反應。數據顯示，EN-17 C27可獨立於CD4而觸發CD8 T細胞反應(圖2B)。
這些數據表明，EN-17 C27是具有高抗原結合親和力的H3K27M抗原特異性CD4 TCR。到目前為止，我們已從接種疫苗的患者樣品中選殖出7個抗原特異性CD4 TCR(6個來自患者EN-17，1個來自患者EN-23)。同時，我們只選殖了2個CD8 TCR。與CD4 TCR相比，選殖的CD8 TCR在功能上較弱(圖3)。
圖3顯示了選殖的兩個CD8 TCR的功能驗證結果。這兩個TCR均選殖自一個患者樣品EN-10。這兩個TCR只能在CD4 T細胞中觸發弱反應(數據未示出)。因此，它們對抗原具有低結合親和力。EN-10 C01無法區分具有或沒有點突變的肽抗原(圖3A)，但EN-10 C04對突變肽具有特異性(圖3B)。令人感興趣的是，C01對長肽顯示出的反應優於對短肽的反應(圖3)。由於CD8 TCR只能識別8-12 aa的抗原肽。最初設計的短肽疫苗(RMS)可能不是用來觸發C01反應的最佳抗原肽。長肽(KQ-RMS)中與“RMS”不同的子區域可能充當EN-10 C01的同源抗原。這表明，與先前的肽設計相比，長肽設計不僅將CD4 T細胞納入免疫反應中，而且提供更好的抗原來觸發CD8反應。
1.2.5 結論：
與我們的疫苗設計一致，在接種疫苗的患者的外周血中既檢測到CD8 T細胞反應也檢測到CD4 T細胞反應。重要的是，與CD8 T細胞相比，在CD4 T細胞中檢測到更強的免疫反應。這些數據表明，所述肽疫苗可在DIPG患者中刺激抗癌免疫。此外，與CD8 T細胞反應相比，由長肽疫苗觸發的CD4 T細胞介導的免疫反應可能在癌症治療中發揮更重要的作用。 參考文獻Schwartzentruber J等人, Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature2012年1月29日;482(7384):226-31. Wu G等人, Somatic histone H3 alterations in pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas and non-brainstem glioblastomas. Nat Genet2012年1月29日;44(3):251-3. Argersinger DP等人, New Developments in the Pathogenesis, Therapeutic Targeting, and Treatment of H3K27M-Mutant Diffuse Midline Glioma. Cancers2021, 13(21), 5280. Zhang X等人, Oncohistone Mutations in Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Trends Cancer2019年12月;5(12):799-808. Lowe BR等人, Histone H3 Mutations: An Updated View of Their Role in Chromatin Deregulation and Cancer. Cancers. 2019年5月; 11(5): 660. Rosa DS等人, CD4 +T Cell Epitope Discovery and Rational Vaccine Design. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis第58卷, 第121–130頁 (2010) Hemmer B等人, Minimal peptide length requirements for CD4 +T cell clones—implications for molecular mimicry and T cell survival. International Immunology, 2000年3月; 12(3): 375-383. Chicz RM等人, Predominant naturally-processed peptides bound to HLA-DR1 are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size. Nature, 1992, vol. 358 (764-768). Sercarz EE等人, MHC-guided processing: binding of large antigen fragments. Nat. Rev. Immunol, 2003, vol. 3 (621-629) Toussi DN和Massari P, Immune Adjuvant Effect of Molecularly-defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines 2014年6月; 2(2): 323-353.
(無)
圖1顯示了IFN-γ ELISpot結果。簡言之，對來自EN-17和EN-23這兩名DIPG患者的外周血單核細胞(PBMC)樣品進行了培養及抗原刺激。培養擴增和抗原刺激後，對於每個樣品將20,000個細胞收集到每個孔中進行ELISpot測定，以檢測分泌IFN-γ的細胞。PSG1：肽刺激組1。細胞用相應的肽僅刺激一次，並擴增2-3週。PSG2：肽刺激組2。在培養擴增開始時用相應的肽刺激細胞，然後在ELISpot測定前用抗原肽再次刺激細胞。PHA：植物血凝素，用於ELISpot的陽性對照抗原。NCG：陰性對照組(無肽刺激)。KQ：攜帶點突變的長肽(18 aa)。RM：攜帶點突變的短肽(10 aa)。
圖2A和圖2B顯示了EN-17 C27 TCR驗證結果。簡言之，EN-17 C27是從CD4 T細胞選殖的候選TCR。用攜帶候選TCR的逆轉錄病毒載體轉導選定的PBMC樣品。然後對轉導的PBMC細胞進行不同的肽刺激，並使用FACS檢查T細胞反應。對CD4 T細胞和CD8 T細胞分別進行門控(gate)和研究。所有FACS結果均以相同格式顯示，其中T細胞活化標誌物沿X軸示出，而SSC(即側散射，與細胞的顆粒度有關，因此是FACS分析中每個單獨細胞的光學量度)沿Y軸示出。( A)CD4 T細胞反應。(B )CD8 T細胞反應。
圖3A和圖3B顯示了EN-10 C01和C04 TCR驗證結果。簡言之，EN-10 C01和C04是從CD8 T細胞選殖的兩種候選TCR。用攜帶候選TCR的相應逆轉錄病毒載體轉導選定的PBMC樣品。然後對轉導的PBMC細胞進行不同的肽刺激，並使用FACS檢查T細胞反應。僅示出了CD8 T細胞反應。CD4 T細胞反應較弱(數據未示出)。所有FACS結果均以相同格式顯示，其中T細胞活化標誌物沿X軸示出，而SSC沿Y軸示出。 (A)EN-10 C01。( B)EN-10 C04。
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Claims (44)

  1. 一種藥物組成物，其包含一種肽，其中所述肽具有至少12個胺基酸殘基的長度並且包含RMSA(SEQ ID NO: 26)，其中所述藥物組成物在按治療有效方案施用於受試者後，能夠刺激所述受試者中針對組蛋白3(H3)K27M突變(H3K27M)的CD4 T細胞反應。
  2. 如請求項1所述的藥物組成物，其中所述藥物組成物在按治療有效方案施用於所述受試者後，進一步能夠刺激所述受試者中針對H3K27M突變的CD8 T細胞反應。
  3. 如請求項1或請求項2所述的藥物組成物，其中所述肽包含RMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 25)。
  4. 如請求項3所述的藥物組成物，其中所述肽包含胺基酸序列KQLATKAARMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 1)。
  5. 如請求項4所述的藥物組成物，其中所述受試者中的H3具有H3.3變異型，其中所述肽具有胺基酸序列KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)。
  6. 如請求項4所述的藥物組成物，其中所述受試者中的H3具有H3.1變異型，其中所述肽具有胺基酸序列KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的藥物組成物，其進一步包含佐劑。
  8. 如請求項7所述的藥物組成物，其中所述佐劑包括toll樣受體促效劑。
  9. 如請求項8所述的藥物組成物，其中所述toll樣受體促效劑是聚I:C。
  10. 如請求項9所述的藥物組成物，其中所述toll樣受體促效劑是聚ICLC。
  11. 如請求項10所述的藥物組成物，其中所述聚ICLC與所述肽的重量比大約為1:0.5至1:5。
  12. 如請求項11所述的藥物組成物，其中所述聚ICLC與所述肽的重量比大約為1:4。
  13. 如請求項1-12中任一項所述的藥物組成物，其中所述藥物組成物的劑量形式包含大約0.5 mg聚ICLC和大約0.5-2 mg所述肽。
  14. 如請求項13所述的藥物組成物，其中所述藥物組成物的劑量形式包含大約0.5 mg聚ICLC和大約2 mg所述肽。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的藥物組成物，其中所述藥物組成物被配置為用於向受試者皮下注射的製劑。
  16. 一種刺激患有癌症的受試者中的免疫反應的方法，其中所述癌症的特徵在於在組蛋白H3中具有K27M突變，所述方法包括以下步驟： 按治療有效方案向所述受試者施用如請求項1-10中任一項所述的藥物組成物，從而在所述受試者中誘導免疫反應。
  17. 如請求項16所述的方法，其中所述免疫反應包括針對H3K27M突變的CD4 T細胞反應。
  18. 如請求項17所述的方法，其中所述免疫反應進一步包括針對H3K27M突變的CD8 T細胞反應。
  19. 如請求項16-18中任一項所述的方法，其在施用步驟之前進一步包括確定所述受試者中的H3的突變變異型的步驟。
  20. 如請求項19所述的方法，其中H3的突變變異型被確定為H3.3，其中： 在施用步驟中，所述藥物組成物中的所述肽包含RMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 5)。
  21. 如請求項20所述的方法，其中所述藥物組成物中的所述肽包含KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)。
  22. 如請求項21所述的方法，其中所述藥物組成物中的所述肽由KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)組成。
  23. 如請求項19所述的方法，其中H3的突變變異型被確定為H3.1，其中： 在施用步驟中，所述藥物組成物中的所述肽包含RMSAPATGGV(SEQ ID NO: 29)。
  24. 如請求項23所述的方法，其中所述藥物組成物中的所述肽包含KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)。
  25. 如請求項24所述的方法，其中所述藥物組成物中的所述肽由KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)組成。
  26. 如請求項16-25中任一項所述的方法，其中所述癌症包括神經膠質瘤、急性髓樣白血病(AML)或黑色素瘤中的至少一種。
  27. 如請求項26所述的方法，其中所述癌症包括神經膠質瘤。
  28. 如請求項27所述的方法，其中所述癌症包括DIPG。
  29. 如請求項16-28中任一項所述的方法，其中所述受試者攜帶HLA-A*02等位基因。
  30. 如請求項16-28中任一項所述的方法，其中所述受試者攜帶HLA-DRB1*07:01等位基因或HLA-DRB1*01:01等位基因中的至少一種。
  31. 如請求項16-29中任一項所述的方法，其中所述治療有效方案包括經由皮下注射向所述受試者施用所述藥物組成物。
  32. 一種表現T細胞受體(TCR)或其片段的T細胞，其中所述TCR能夠與肽/MHC II複合物結合，其中所述肽/MHC II複合物中的肽具有至少12個胺基酸殘基的長度並且包含RMSA(SEQ ID NO: 26)。
  33. 如請求項32所述的T細胞，其中所述TCR或其片段進一步能夠與在所述肽與MHC I之間形成的複合物結合。
  34. 如請求項32或請求項33所述的T細胞，其中所述肽包含RMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 25)。
  35. 如請求項34所述的T細胞，其中所述肽包含胺基酸序列KQLATKAARMSAP(S/A)TGGV(SEQ ID NO: 1)。
  36. 如請求項35所述的T細胞，其中所述肽包含胺基酸序列KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)。
  37. 如請求項36所述的T細胞，其中所述肽由胺基酸序列KQLATKAARMSAPSTGGV(SEQ ID NO: 2)組成。
  38. 如請求項36或請求項37所述的T細胞，其中所述TCR或其片段不能與由一種第二肽與MHC II複合物之間形成的複合物相結合，其中所述第二肽包含胺基酸序列KQLATKAARKSAPSTGGV(SEQ ID NO: 6)。
  39. 如請求項35所述的T細胞，其中所述肽包含胺基酸序列KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)。
  40. 如請求項39所述的T細胞，其中所述肽由胺基酸序列KQLATKAARMSAPATGGV(SEQ ID NO: 27)組成。
  41. 如請求項39或請求項40所述的T細胞，其中所述TCR或其片段不能與由一種第二肽與MHC II複合物之間形成的複合物相結合，其中所述第二肽包含胺基酸序列KQLATKAARKSAPATGGV(SEQ ID NO: 28)。
  42. 如請求項32-41中任一項所述的T細胞，其中所述TCR對於所述T細胞而言是異源的。
  43. 如請求項42所述的T細胞，其中所述TCR經由載體轉導或轉染到所述T細胞中。
  44. 如請求項43所述的T細胞，其中所述載體是逆轉錄病毒載體。
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