TW202426482A - 豬用單劑雙價次單位疫苗組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於一種豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其包含雙價抗原、CpG佐劑及雙相佐劑。雙價抗原係由哺乳類細胞表現系統生產的可溶性CSFV-E2重組蛋白及可溶性PCV2-ORF2重組蛋白所組成。上述豬用單劑雙價次單位疫苗組成物僅須單次接種，即可提供有效對抗CSFV及PCV2的免疫保護力，毋需補強免疫。

Description

豬用單劑雙價次單位疫苗組成物
本發明係有關一種動物用疫苗組成物，特別是有關於一種針對豬瘟病毒與豬環狀病毒的豬用單劑雙價次單位疫苗組成物。
典型豬瘟 (Classical swine fever; CSF)又稱古典豬瘟，是一種感染豬隻的高傳染性疾病。一般而言，豬隻高燒、厭食、腹瀉、神經症狀、全身紅斑、大量死亡、母豬流產或產下死豬崽，是一種感染豬隻的高傳染性及高致病性疾病。
CSFV 於1903年首次被發現後，流行於世界各地，包括亞洲、非洲、歐洲、中南美洲等地區，一旦爆發疫情常造成養豬產業重大的經濟損失，影響全球經濟，因此列為世界動物衛生組織 (OIE)表A (List A)的疾病之一，屬必須通報之動物傳染病。東亞例如台灣自日據時代即有豬瘟肆虐，據文獻指出1948 年豬瘟發生率曾達81.3%。此病毒流行的國家必須使用常規疫苗接種來預防和控制病源傳播，如果疫苗使用得當，即能限制豬瘟傳播。2017年181個OIE會員國中，已有32個國家被認為沒有豬瘟病毒的散播。若開發出保護效力較佳的E2次單位疫苗，可望產生具有保護作用的豬瘟中和抗體，將足以取代傳統的活毒疫苗，進而向無豬瘟病毒的國家邁進。
典型豬瘟的病原為典型豬瘟病毒 (Classical Swine fever virus; CSFV)，屬於黃病毒科 (Flavivirdae)瘟疫病毒屬(Pestivirus)。CSFV套膜上的結構蛋白E1蛋白和E2蛋白都屬於醣蛋白，是參與入侵宿主細胞的重要角色。因此，在開發CSFV次單位疫苗時，經常選擇E2蛋白作為抗原的重要決定位。
目前疫苗為控制所有疾病之最佳策略。防治豬瘟之疫苗主要分為兩種：活毒 (減毒)疫苗及次單位 (死毒)疫苗。活毒疫苗廣泛用於豬瘟流行地區，以現階段東亞台灣豬瘟疫苗的開發而言，豬瘟組織疫苗已逐步取代傳統的兔化豬瘟疫苗。舉例而言，大豐疫苗科技股份有限公司代工生產且已上市的拜耳E2疫苗(Bayovac CSF E2™)，其包含桿狀病毒感染昆蟲細胞生產的CSFV-E2抗原與油包水型佐劑(water-in-oil adjuvant)。以拜耳E2疫苗免疫動物時，每頭每次施打的劑量為2 mL，間隔3週進行補強免疫 (合計施用60 μg的CSFV-E2抗原)。
E2次單位疫苗除了產生具有保護作用的豬瘟中和抗體，更可以滿足DIVA (differentiate infected from vaccinated animal，能區分出受野外病毒感染與疫苗接種之動物)對疫苗接種的要求。以目前市售E2次單位疫苗(例如拜耳E2 次單位疫苗)為例，其包含桿狀病毒感染昆蟲細胞生產之E2重組蛋白以及油包水型佐劑。在免疫動物時，市售E2次單位疫苗每次使用劑量為2 mL (含60 μg 之E2重組蛋白)，間隔3週後再補強免疫。
市售E2次單位疫苗除了有效增加豬隻抗體之外，也克服習知活毒疫苗無法滿足DIVA的缺點，進而用於區別診斷試劑中，藉此鑑別野外病毒之感染，加速豬場內潛在豬瘟病毒的清除，有助於台灣對豬瘟清除之推行。
然而2005年的文獻指出，台灣近二十年間流行的豬瘟病毒隻基因亞群從3.4亞群轉變成2.1a亞群，亟需提升豬瘟疫苗之免疫保護力。另一種常見的豬隻病原─第二型環狀病毒 (PCV2)，主要引起豬隻環狀病毒相關疾病 (Porcine circovirus-associated disease，PCVD)，包括皮膚炎及腎病症候群(PDNS)、豬呼吸道疾病複合症 (PRDC)、繁殖障礙、增殖性壞死性肺炎 (PNP) 及肉芽腫性腸炎等，為豬隻重要的病毒性疾病，對全球養豬產業造成極大的衝擊，如何有效預防與控制該症是重要的課題。
PCV2為環狀病毒科(Circoviridae)的環狀病毒屬 (Circovirus)，是最小且具病原性的無封套之單股環狀DNA病毒，目前已鑑定出PCV2的八種基因型。
東亞台灣於1997年開始有類似 PCV2病例報告，約 70-80 %衰弱仔猪受到 PCV2感染，2002年王等調查PCV2盛行率為71 %。目前沒有特定的治療方式適用於 PCV2感染的豬隻，儘管大部份為混合感染。PCVAD爆發初期，使用抗生素治療比沒治療的猪隻死亡率還要高，甚至病毒可藉由針頭傳播比抗生素治療還要嚴重，需要藉由疫苗才能有效控制PCV2的疫情。
目前市售的PCV2疫苗有百靈佳(Boehringer Ingelheim, Petersurg, VA)生產的PCV不活化疫苗 (商品名為Ingelvac CircoFLEX®，以下簡稱百靈佳疫苗)以及英特威/先靈保亞(Intervet Inc/Schering-Plough Animal Health; Kenilworth, NJ)生產的PCV次單位疫苗(商品名為Porcilis® PCV vaccine，以下簡稱英特威疫苗)。百靈佳疫苗是將表現PCV2 ORF2外鞘(capsid)蛋白的桿狀病毒，經不活化處理後所製成的次單位疫苗，在仔豬3週齡時經由肌肉注射一次劑量(single shot)進行接種。英特威/先靈保亞(Intervet/Schering-Plough Animal Health)也是利用桿狀病毒表現的PCV2 ORF2外鞘蛋白所製成的次單位疫苗，在仔豬3週齡或更大的豬隻經由肌肉注射一次劑量進行接種。
然而，豬隻感染PCV2後會造成免疫抑制，增加CSFV感染機會。先前研究證實PCV2的感染確實會干擾兔化豬瘟減毒疫苗 (Lapinized Philippines Coronel，LPC)的效力。
有鑑於此，亟需開發一種多價劑型的疫苗，藉此減少現場 CSFV及 PCV2同時發生的可能性，減少現有使用LPC疫苗防治CSFV出現的漏洞，降低野外CSFV入侵豬場的風險並提高清除CSFV的機會，進而解決習知技術的種種問題。
因此，本發明之一態樣是提供一種豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其包含雙價抗原、CpG佐劑以及雙相佐劑，而雙價抗原係由哺乳類細胞表現系統生產的E2重組蛋白E2重組蛋白及ORF2重組蛋白所組成。上述單劑雙價次單位疫苗組成物僅須單次接種，不需補強免疫即具有完整免疫保護力。
根據本發明之上述態樣，提出一種豬用單劑雙價次單位疫苗組成物。此豬用雙價次單位疫苗組成物包含雙價抗原、CpG佐劑以及雙相佐劑，且此豬用雙價次單位疫苗組成物對受試對象的有效施用次數為一次。在一實施例中，前述雙價抗原可由E2重組蛋白E2重組蛋白及ORF2重組蛋白所組成，E2重組蛋白之胺基酸序列可例如序列識別號(SEQ ID NO):1所示，ORF2重組蛋白是由例如SEQ ID NO:2所示之核酸序列所編碼，且CpG佐劑之核酸序列可例如為SEQ ID NO:3所示。
在上述實施例中，前述E2重組蛋白可例如為源自於豬瘟病毒株2.1a亞群，而前述ORF2重組蛋白可例如為源自於第二型豬環狀病毒。
在上述實施例中，前述雙價抗原可例如為由哺乳類細胞表現系統所生產。
在上述實施例中，前述E2重組蛋白可例如由SEQ ID NO:4所示之核酸序列所編碼。
在上述實施例中，前述E2重組蛋白之有效劑量可例如為25μg/mL至50μg/mL，而前述ORF2重組蛋白之有效劑量可例如為25μg/mL至75μg/mL。
在上述實施例中，前述CpG佐劑與雙價抗原蛋白之重量比可例如為1:1至1：2。
在上述實施例中，前述雙相佐劑可例如為水包油包水(W/O/W)佐劑。
在上述實施例中，前述雙相佐劑之有效劑量可例如為50體積%。
應用本發明之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其可利用哺乳類細胞表現系統生產出可溶性雙價抗原後，結合CpG佐劑及雙相佐劑所得之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，僅須單劑接種即可提供有效免疫保護力，毋需補強免疫，藉此減少現場CSFV及PCV2同時發生的可能性。
可以理解的是，前述的概括說明及下述的詳細說明僅為例示，旨在對要求保護的發明提供進一步的解釋。
倘若引用文獻對一術語的定義或用法，與此處對該術語的定義不一致或相反，則適用此處對該術語的定義，而不適用該引用文獻對該術語的定義。其次，除非上下文另有定義，單數術語可包括複數，而複數術語亦可包括單數。
如前所述，本發明是提供一種豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其可利用哺乳類細胞表現系統生產出可溶性雙價抗原，結合CpG佐劑及雙相佐劑以製得。
本文所稱之「重組蛋白」、「重組抗原」、「蛋白質」、「胜肽」及「多肽」是可互換的，指的是胺基酸的聚合物，通常藉由肽鍵或二硫鍵連接在一起。「胜肽」亦可用於其中一個或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸及其聚合物、或者對應於天然存在的胺基酸之類似物或模擬物的胺基酸聚合物。「胜肽」更包括經修飾的胺基酸聚合物，例如，具有碳水化合物殘基之醣蛋白，或被磷酸化的胜肽。胜肽、多肽及蛋白質可利用液相合成、固相合成或利用基因工程、重組細胞、原核表現系統、真核表現系統產生。在一實施例中，本文所稱之雙價抗原係由哺乳類細胞表現系統生產的豬瘟病毒E2 (CSFV-E2)重組蛋白及豬環狀病毒ORF2 (PCV2-ORF2)重組蛋白所組成。在一些例子中，E2重組蛋白及ORF2重組蛋白可例如為獨立的重組蛋白。
此處所稱之「胺基酸」與「殘基」是可互換的，當與胜肽併用時，指的是天然存在及合成的胺基酸、胺基酸類似物、胺基酸模擬物及化學上與天然存在的胺基酸相似的非天然存在的胺基酸。
此處所稱之「豬瘟病毒」，其病毒株種類並無特別限制，可例如豬瘟病毒2.1a亞群；此處所稱之「豬環狀病毒」，其病毒株種類並無特別限制，可例如第二型豬環狀病毒。然而在其他實施例中，前述豬瘟病毒及豬環狀病毒亦可使用其他病毒株，端視實際需求而定。
此處所稱之「E2重組蛋白」可例如為全長的E2重組蛋白，如序列識別號(SEQ ID NO):1所示之胺基酸序列，或者由如SEQ ID NO:4所示之核酸序列所編碼之胺基酸序列，其胺基酸序列由N端至C端依序為信號肽(有利於轉譯後的E2蛋白分泌到培養液中)、序列修飾之E2蛋白(HS2 strain，約342 a.a.)、蛋白酶切割位點(有利於切除組胺酸標籤)以及組胺酸標籤(His tag，有利於純化蛋白)。SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列可依據Pan (2005)等人公開之豬瘟病毒(Classical swine fever virus) 2.1a亞群(subgroup 2.1a)病毒株的基因序列 (AY526726.1)，擷取E2之基因片段(相當於第1201-2294個核苷酸)，修飾成適合經由哺乳類細胞表現系統生產之序列。在一些具體例中，為了方便構築重組質體，E2重組基因序列之兩端可選擇性添加限制酶切位，其中限制酶切位之種類並無特別限制，端視要構築的質體序列而定，可例如Bam HI及Not I之限制酶切位。另外，為了方便後續純化蛋白，E2重組蛋白之C端可選擇性添加蛋白酶切割位點(有利於切除組胺酸標籤)及組胺酸(His)標籤[His tag；或稱聚組胺酸(polyhistidine)]，其中His標籤可包含但不限於6至10個組胺酸殘基。因此，上述所得的E2重組蛋白為可溶性蛋白。
此處所稱之「ORF2重組蛋白」可例如SEQ ID NO:2所示之核酸序列所編碼，其於PCV2野生型ORF2基因的核定位訊息序列中導入多個位點突變。由於未經修飾的PCV2野生型ORF2基因在哺乳類細胞表現系統的表現量不佳，因此本發明於PCV2野生型ORF2基因的核定位訊息序列中的第12-14、16、18、34-35、37、39-41個胺基酸中導入位點突變，並進行密碼子優化。前述的位點突變可包括但不限於鹼基的缺失、鹼基的替換或鹼基的插入，但上述位點突變並不包含導入終止密碼子(stop codon)。哺乳類細胞表現系統的後轉譯修飾可賦與ORF2具有正確的三級結構及折疊，不僅可保有原始蛋白抗原性，又可提升其重組抗原蛋白的產量。因此，上述所得的ORF2重組蛋白為可溶性蛋白。
在一些實施例中，上述CSFV-E2重組蛋白可利用習知方法或下述方法製造。首先，對原核轉形細胞進行蛋白表現步驟，其中原核轉形細胞可包含第一重組質體，其含有如SEQ ID NO:4所示核酸序列之重組基因，以表現如序列識別號(SEQ ID NO):1所示之胺基酸序列之CSFV-E2重組蛋白。為了後續純化重組蛋白，上述重組基因的3’端可選擇性添加編譯His標籤的核酸序列。在一些例子中，前述編譯His標籤的核酸序列可例如由市售質體提供，並設計成與上述重組基因的3’端連接。有關His標籤的核酸序列乃本發明所屬技術領域之通常知識，在此不另贅述。
接著，抽取前述原核轉形細胞之第一重組質體，以限制酶切下E2重組基因後，構築至適用於哺乳類細胞表現系統的第二重組質體中，並將第二重組質體轉染哺乳類細胞，大量表現E2重組蛋白並分泌至細胞培養液後，回收並純化可溶性E2重組蛋白。
在上述實施例中，回收E2重組蛋白後，可選擇性對CSFV-E2重組蛋白進行習知的管柱純化步驟，以獲得純化之CSFV-E2重組蛋白。
大體而言，上述CSFV-E2重組蛋白之生產量在每公升細胞培養液中可得到至少300毫克(mg)至600 mg的CSFV-E2重組蛋白，或約400 mg至500 mg的CSFV-E2重組蛋白。
在一些實施例中，上述PCV2-ORF2重組蛋白可利用跟CSFV-E2重組蛋白相同的方法製造。不同處在於，利用哺乳類細胞大量表現PCV2-ORF2重組蛋白後，回收轉染的哺乳類細胞並純化可溶性ORF2重組蛋白。上述PCV2-ORF2重組蛋白之生產量在每公升細胞培養液中可得到至少60 mg至100 mg的PCV2-ORF2重組蛋白，或約70 mg至90 mg的PCV2-ORF2重組蛋白，大幅提升雙價抗原的產量。
上述可溶性CSFV-E2重組蛋白與可溶性PCV2-ORF2重組蛋白可組成可溶性雙價抗原，結合CpG佐劑及雙相佐劑後可製得之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，僅須單劑接種即可提供有效免疫保護力。此處所述之「單劑接種」係指以豬用單劑雙價次單位疫苗組成物對受試對象的有效施用次數為一次，毋需補強免疫，又無副作用，更可有效簡化接種流程。
在一些實施例中，上述豬用單劑雙價次單位疫苗組成物的CSFV-E2重組蛋白之有效劑量可例如為每劑可例如為2mL，每劑含有25μg/mL至50μg/mL，前述PCV-ORF2重組蛋白之有效劑量可例如為25μg/mL至75μg/mL。在一些具體例中，CSFV-E2重組蛋白之有效劑量可例如為25μg/mL，PCV-ORF2重組蛋白之有效劑量可例如為50μg/mL。
在另一些實施例中，前述CpG佐劑之核酸序列並無特別限制，可例如SEQ ID NO:3所示之序列。CpG佐劑之序列及製備方法係參考專利公告號 US10,117,929B1，此處一併納入本文的參考文獻。簡言之，將含有 CpG佐劑之序列的大腸桿菌轉型株經大量培養後，利用習知方法萃取 DNA並測量其 DNA濃度。在一些具體例中，前述CpG佐劑於豬用單劑雙價次單位疫苗組成物中的有效劑量可例如為50 μg/mL或100 µg/2 mL。
在上述實施例中，前述CpG佐劑與雙價抗原蛋白之重量比可例如為1:1至1：2，可有效達成單劑接種。倘若前述CpG佐劑與雙價抗原蛋白之重量比低於1：2或高於1:1，則單劑接種難以提供有效免疫保護力。
在其他實施例中，前述雙相佐劑並無特別限制，可例如為水包油包水(W/O/W)佐劑。在上述實施例中，前述雙相佐劑於豬用單劑雙價次單位疫苗組成物中的有效劑量可例如為50體積%。
可以理解的是，下述特定的重組蛋白序列、特定的配方、特定的使用劑量、特定的檢測方式、觀點、例示及實施例僅供舉例說明，並非做為本發明的限制條件。在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的主要特徵可用於各種實施例。因此本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可輕易確定本案的必要技術特徵，對本發明作各種更動及潤飾，以適用不同的用途及條件。
實施例：製備豬瘟病毒E2重組蛋白及環狀病毒第2型ORF2重組蛋白
1.1豬瘟病毒E2重組基因之構築
豬瘟病毒E2重組蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示，是依據Pan (2005)等人公開之豬瘟病毒(Classical swine fever virus) 2.1a亞群(subgroup 2.1a)病毒株的基因序列 (AY526726.1)，擷取E2之基因片段(相當於第1201-2294個核苷酸)，修飾成適合經由哺乳類表現系統表現之序列後，並於兩端設計帶有Bam HI及Not I之限制酶切位，5'端加上訊號胜肽基因序列(protein-tyrosine phosphatase，PTP，約63 b.p.；有利於轉譯後的E2蛋白分泌到培養液中)的基因序列，3端加上人鼻病毒3C蛋白酶(human rhinovirus3C protease；HRV 3C protease)切割位點(cleavage site)序列(約8 a.a.)及組胺酸標籤(His tag，約8 a.a.)後，委由基龍米克斯生物科技公司合成，並命名為PTP-E2 ，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
1.2環狀病毒第 2型之 ORF2重組基因之構築
環狀病毒第 2型之 ORF2是由如SEQ ID NO:2所示之核酸序列所編碼，是依據 2019年分離病毒株 PCV2d (GenBank: MN510433.1) 序列，擷取 ORF2之片段 (Nucleotide positions 1030-1734)，修飾成適合經由哺乳類表現系統表現之序列，委由基龍米克斯生物科技公司合成，並命名為PTP-PCV2d。
二種病原之序列片段修飾成適合經由哺乳類表現系統之序列，由生技公司基龍米克斯合成，合成此修飾基因命名為 PTP-E2 (SEQ ID NO:4) 及PTP-PCV2d (SEQ ID NO:2)。
2.E2重組蛋白與ORF2重組蛋白的表達與純化
此實施例使用市售哺乳類細胞表現系統，例如市售CHO細胞表達系統(ExpiCHO™ 表達系統，Thermo Fisher Scientific)，生產E2重組蛋白與ORF2重組蛋白。
2.1 E2重組蛋白的表達與純化
在轉染前，將細胞密度達6×10 6細胞/mL的CHO細胞培養在37°C、8 %二氧化碳濃度中。接著，取1μg/μL的PTP-E2/pcDNA3.4質體DNA，依照市售轉染套組(ExpiCHO Transfection kit，金萬林，A29129) 指引，將PTP-E2/pcDNA3.4質體DNA轉染至CHO細胞。在轉染後第14天，以2000 g之轉速離心15分鐘，分離細胞並取出上清液 (培養液的部分)。之後，將硫氨酸(Sigma, CAS no. A4915)加入上清液進行沈澱，以獲得20-40 % 的沈澱物。然後，上述沈澱物以100mL緩衝液 A [含50 mM三羥甲基胺基甲烷 (Tris)及500 mM氯化鈉(NaCl)]回溶，其酸鹼值為pH 7.5。接下來，上述回溶物經 0.45 μm的過濾膜的過濾後，進行管柱純化步驟，將培養液注入Ni-NTA管柱中，再利用流洗液(含有50mM之Tris、500mM之氯化鈉及250mM咪唑)將E2重組蛋白流洗出來，以獲得高純度的E2重組蛋白。
2.2 ORF2重組蛋白的表達與純化
在轉染前，將細胞密度達 6×10 6細胞/mL的CHO細胞培養在 37°C、8%二氧化碳濃度中。接著，取1μg /μL的PTP-PCV2d/pcDNA3.4質體DNA，依照市售轉染套組(ExpiCHO Transfection kit，金萬林，A29129) 指引，將PTP-PCV2d/pcDNA3.4質體DNA轉染至CHO細胞。在轉染後第12天，以2000 g之轉速離心15分鐘，分離細胞並丟棄上清液 (培養液的部分)。之後，將細胞以100mL緩衝液 A (含50 mM Tris及500 mM NaCl)回溶，其酸鹼值為pH 7.5。接下來，以 -80°C與37°C的溫度，來回處理細胞三次。然後，利用市售設備(超音波細胞破碎機，尚偉)對上述回溶物進行超音波振盪共10回，每回間隔為開啟(on)10秒與關閉(off)30秒。之後，上述回溶物以 12000 g之轉速離心20 分鐘(Thermo，中量低溫離心機)，取上清液經 0.45 μm的過濾膜(cellulose acetate filter，型號11106-47-N，Satorius)的過濾後，進行管柱純化步驟，將培養液注入Ni-NTA管柱中，再利用流洗液(含50mM之Tris、500mM之氯化鈉及250mM咪唑)將ORF2重組蛋白流洗出來，以獲得高純度的ORF2重組蛋白。
2.3 驗證重組蛋白的表達
利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)膠體電泳及蛋白質轉漬(Transfer)之西方墨點法(Western blot)分析第2.1節及第2.2節所得的重組蛋白，其結果如圖1A(SDS-PAGE：E2)、圖1B[Western blot：E2，利用抗-E2抗體(WH303)檢測]、圖1C(SDS-PAGE：ORF2)、圖1D(Western blot：ORF2，利用抗-PCV2 ORF2抗體檢測)所示。
請參閱圖1A至圖1D，其係顯示根據本發明一實施例利用哺乳類細胞表現的CSFV-E2重組蛋白及PCV2-ORF2重組蛋白的SDS-PAGE之膠體影像(圖1A、圖1C)與西方墨點法(圖1B、圖1D)之呈色影像。
圖1A及圖1B的結果顯示，CSFV-E2重組蛋白及PCV2-ORF2重組蛋白順利表達於上清液中，如圖1A及圖1C的箭頭101 (E2單體，E2 monomer，46 kDa)、箭頭103 (E2雙體，E2 dimer，92 kDa)、箭頭105 (ORF2單體，ORF2 monomer)所示。圖1B及圖1D的結果顯示，哺乳類細胞表現的重組蛋白確認為E2重組蛋白(其序列如SEQ ID NO:1所示)及ORF2重組蛋白(其序列如SEQ ID NO:2所示之核酸序列所編碼)。
另外，利用市售蛋白質測定套組(BCA Protein Assay，台灣進階，23225)檢測純化後的重組蛋白濃度，E2重組蛋白的蛋白濃度為450mg/L細胞培養液，ORF2重組蛋白的蛋白濃度為80mg/L細胞培養液。
3. 佐劑配製
3.1 製備CpG佐劑
CpG佐劑之序列(如SEQ ID NO:3所示)及製備方法係參考專利公告號US10,117,929B1，此處一併納入本文的參考文獻。簡言之，將含有CpG佐劑之序列的大腸桿菌轉型株經大量培養後，利用習知方法萃取DNA並測量其DNA 濃度。在應用時，CpG佐劑在疫苗組成物中的使用濃度一般為100µg/2mL。
3.2雙相佐劑
此實施例係選用法國SEPPIC公司生產之Montanide ISA 206 (water-in oil-water emulsions W/O/W)佐劑做為雙相佐劑。在應用時，按照製造商提供的使用說明書，雙相佐劑在疫苗組成物中的使用濃度一般為50體積%。
4. CSFV/PCV2 雙價疫苗組成物的配方及劑量
A組：以CSFV/PCV2雙價疫苗[含有哺乳類系統所表現的重組 E2蛋白 (50 µg/dose) 及 ORF2蛋白 (100 µg/dose) 加入ISA206及 CpG佐劑所配製之次單位疫苗]，免疫1次。
B組：施打生理食鹽水 (市售0.9 % NaCl，Saline)，做為未免疫組或CSFV病毒的陽性對照組。
C組：以CSFV/PCV2雙價疫苗[含有哺乳類系統所表現的重組 E2蛋白 (50 µg/dose) 及ORF2蛋白 (100 µg/dose) 加入ISA206及 CpG佐劑所配製之次單位疫苗]，免疫1次。
D組：施打生理食鹽水 (0.9 %)，做為未免疫組或PCV2病毒的陽性對照組。
CSFV/PCV2 雙價疫苗，每劑量為2 mL，含 E2蛋白50 μg、ORF2 100 μg、CpG 100 μg及 ISA206 (每劑量之50 %)。在第5節的試驗期間配製6個劑量(doses)，共含CSF-E2 (240 µL，1.25 μg/µL)、PCV2-ORF2 (5,310 µL，0.113 μg/µL)、PBS (408 µL)、CpG (42 µL，14.29μg/µL)、ISA206 (6,000 µL)。
5. 雙價疫苗組成物之驗證與應用
5.1安全性試驗
此實施例使用20頭初代無特定病原 (Specific pathogen free，SPF) 4週齡豬隻，飼養於動科所的動物舍，豬隻皆為剖腹生產、未吃初乳且 CSFV及 PCV2抗體陰性，並依體重及性別隨機分成A、B、C、D等四組，每組各5頭。A、B、C、D四組使用的疫苗組成物配方如第4節所述。觀察豬隻健康，在呈現穩定狀況後分別進行以下各項試驗處理。
各組之安全性及有效性試驗設計如表1所示。A組及B組是在疫苗安全性試驗後，攻毒 CSFV進行有效性試驗。每次免疫的劑量為2mL。C組及D組是在疫苗安全性試驗後，攻毒 PCV2進行有效性試驗。
疫苗或生理食鹽水施打於豬隻頸部左側，每日觀察並記錄臨床症狀。於每次免疫前、免疫後12、24及 48小時及免疫後4週量取體溫 (直腸溫度) 並觀察注射部位變化；豬隻於免疫前及免疫後 4週量取體重(結果如圖2C所示)；於每次免疫前、免疫後2週及4週採血(結果如圖3A至圖4B所示)。疫苗施打期間合計觀察28日，豬隻必須在健康良好且無發燒 (直腸溫度＜ 40.5 °C) 下，進行攻毒試驗。
表1
組別 頭數 處理*
疫苗免疫 病毒接種
A 5 以CSFV/PCV2雙價疫苗免疫 ** CSFV
B 5 注射生理食鹽水 CSFV
C 5 以CSFV/PCV2雙價疫苗免疫 PCV2
D 5 注射生理食鹽水 PCV2
表1圖號*係指豬隻先飼養於財團法人農業科技研究院動物科技研究所(動科所)正壓動物房進行疫苗免疫。免疫4週後，第A組及第B組的豬隻運送至家衛所負壓動物房進行豬瘟病毒 (CSFV) 攻毒，第C組及第D組的豬隻則移至屏科大負壓房進行豬第2型環狀病毒 (PCV2) 攻毒。
表1圖號**代表CSFV/PCV2雙價疫苗每一劑量含CSFV E2蛋白50 μg及PCV2 ORF2蛋白100 μg。
另外，豬隻健康狀況則根據表2的臨床評分表進行評估後，取總積分的平均值為臨床指數，其中積分的平均值的下限為0分，上限為3，其結果如圖2B所示。
表2
編號 特徵 標準 積分
1 活力 好奇、馬上能站起 0
較慢、但能自行站起 1
疲倦的、被迫時才會站起，但又會躺下 2
不動、站不起來 3
2 身體緊繃程 放鬆、背部挺直 0
度 只有站起時會僵硬、拱背，其餘正常 1
拱背、走路僵硬 2
痙攣 3
3 身體型態 胃飽足、身體圓胖 0
空胃 1
空胃、身體瘦弱 2
消瘦的、脊椎與肋骨可見、與身體相比頭部比例較大 3
4 呼吸(接近 頻率每分鐘 10-15下 0
豬之前測 頻率每分鐘大於 20下 1
量) 頻率每分鐘大於20下、胸部呼吸起伏明顯 2
頻率每分鐘大於30下、張口呼吸 3
5 走路 協調良好 0
步履蹣跚 1
運動失調、後肢跛行、可走路 2
無法走路 3
6 皮膚 淡粉紅色、毛平坦 0
(特別是耳 有變紅區域 1
朵鼻子、腿 紫色、皮膚冰冷、少許瘀斑 2
與尾巴) 黑紅色、無感覺、大區域出血 3
7 眼睛/結膜 淡粉紅色 0
變紅、清澈分泌物 1
發炎、混濁分泌物 2
發炎、化膿分泌物、血管明顯 3
8 食慾 愛吃 0
餵食時進食缓慢 1
餵食時不吃，但會嚐食物 2
完全不吃，對食物無興趣 3
9 排便 軟便、量正常 0
減少排便量、較乾 1
少量排便、乾便或有纖維包覆或下痢 2
無排便、水便或血便 3
10 餵食殘餘物 空飼料槽 0
飼料槽大多空 1
只吃部分食物 2
沒吃 3
5.2有效性試驗
將第5.1節之A組及B組合計10頭豬隻委由行政院農業委員會家畜衛生試驗所(家衛所)的負壓動物房進行CSFV攻毒試驗；C組及D組合計 10頭豬隻則由屏科大負壓動物房進行 PCV2攻毒試驗。
5.3攻毒試驗
A組及B組的豬隻每頭頸部右側接種2 mL ALD株CSF病毒液 10 5.41FAID 50(50% fluorescent antibody infectious dose，50%螢光抗體感染劑量)。攻毒後 4、7、10及 14天進行採血及量取體溫；犧牲前量取體重。於攻毒後14天進行犧牲、拍照、記錄及採樣。
C組及D組的豬隻每頭頸部右側接種 2 mL (10 6TCID 50/mL) PCV2病毒液並連續 3天鼻腔接種 2 mL (10 6TCID 50/mL) PCV2病毒液。攻毒前量體溫，攻毒後 2、3、4、5、6、7週進行採血及量取體溫；犧牲前量取體重。於攻毒後7週進行解剖、拍照、記錄及採樣。
上述採樣所得的血清樣本進行病毒核酸及抗體力價分析。上述採樣所得的臟器樣本進行核酸力價測定。
6. 檢測方法
6.1 CSFV及 PCV2血清學檢測
血清 ELISA及中和抗體檢測方法係根據行政院農委會公告的「豬瘟檢驗方法」(網址: https://www.baphiq.gov.tw/ws.php?id=16531)進行。
上述採樣所得的檢體進行前處理後，使用市售套組(IDEXX豬瘟病毒抗體檢測套組；IDEXX CSFV antibody test kit, IDEXX Laboratories, Inc., USA)，依照廠商建議的方法進行ELISA。然後，利用市售檢測儀器(SPECTRO star nano, BMG LABTECH, Germany)進行檢測，並依據上述套組之判定標準進行判讀，其中抗體力價阻擋百分比(blocking %)大於或等於(≥)40者定義為陽性，阻擋百分比小於或等於(≤)30者定義為陰性，阻擋百分比大於30且小於40者(30 ＜ blocking % ＜ 40)則再次檢測確認。
另外，上述採樣所得的檢體進行前處理後，使用市售套組[BioChek豬第2型環狀病毒抗體檢測套組；PCV2 antibody test kit (ELISA), BioChek, Netherlands]，依照廠商建議的方法進行ELISA。然後，利用市售檢測儀器(SPECTRO star nano, BMG LABTECH, Germany) 進行檢測，並依據上述套組之判定標準進行判讀，其中樣本與陽性比值(sample-to-positive ratio，S/P ratio)大於或等於(≥)0.500者定義為陽性，S/P比值小於0.49者定義為陰性。
6.2 CSFV及PCV2 核酸檢測
CSFV及PCV2 核酸檢測方法亦根據第6.1節所述的「豬瘟檢驗方法」進行。
CSFV病毒核酸萃取及定量可採用習知方式進行。首先，前述採樣所得的檢體(血清或組織乳劑)利用市售核酸萃取套組(例如MagNA Pure 24 Total NA Isolation Kit, Roche Molecular Systems, Inc., USA)萃取出CSFV病毒核酸後，利用市售即時反轉錄酶PCR套組(Real-time reverse transcriptase PCR Kit，例如QuantiTect Probe RT-PCR Kit, Qiagen, Germany)，依照廠商建議的方法，進行CSFV病毒定量。簡言之，將已知濃度 (TCID 50/mL) 的豬瘟病毒血液萃取核酸並進行序列稀釋，換算濃度至 10 1至10 8TCID 50/mL 做為定量標準品建立標準曲線，而定量結果以 Log 10TCID 50/mL 表示。
PCV2病毒核酸萃取及定量亦可採用習知方式進行。上述採樣所得的檢體(血清或組織乳劑)利用前述市售核酸萃取套組萃取出PCV2病毒核酸後，先利用 PCR大量增殖PCV2外殼蛋白(capsid protein，cap)基因體(Genbank編號：AY713470.1)第294-477個核苷酸(184 bp，如SEQ ID NO:5所示)，將此核酸片段構築於 pGEM®-T Easy載體上 (pGEM®-T Easy Vector System, Promega, USA)，並轉型至大腸桿菌( Escherichia coliDH5α) 勝任細胞中，以含有 50 μg/mL ampicillin之培養基進行篩選。之後，利用市售試劑 (QIAprep® Spin MiniprepKit, USA) 萃取質體DNA後，進行核酸定序及確認。然後，此 PCV2重組質體可做為定量標準品。質體DNA先以分光光度計(SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, Germany) 測量其 260 nm的吸光值，計算出其濃度 (μg/mL)，並換算為質體複製數(Plasmid copy number)，再以 10倍序列稀釋至濃度為 10 1至10 10複製數(copies)/µL作為定量檢測的標準品。
取 200 μL的血清或組織乳劑，以市售DNA萃取套組(例如AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量製備套組，AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit, Axygen® ; Corning, USA) 萃取出病毒核酸後，利用市售試劑 (PowerUp SYBR Green Master Mix, Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 進行即時反轉錄酶PCR，以定量病毒。
前述即時定量PCR檢測 PCV2 病毒核酸之步驟如下：取 2 μL之 DNA 樣本進行定量反應，並取 PCV2 重組質體及陰性樣本分別作為定量標準品與陰性對照。定量 PCR反應如下: 0.5 μM正反向引子 (正向引子：5’-ACATCGAGAAAGCGA AAGGA-3’，如SEQ ID NO:6所示；反向引子: 5’-ACGTTACAGGGTGCTGCTCT-3’；如SEQ ID NO:7所示) 及 2X conc. Master Mix (PowerUp SYBR Green Master Mix, Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)，以 QuantStudioTM 3 Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 進行定量PCR反應，反應條件如下：50 °C 2分鐘→ 95 °C 2分鐘 (1循環)；95 °C 15秒→ 60 °C15秒→ 72 °C 1分鐘 (共40循環)。最後，進行解離曲線反應 (Melt curve stage)，反應條件如下：95 °C 15秒→ 60 °C 1分鐘→ 95°C 15秒 (1循環)。PCR 反應完成後以市售軟體(例如 QuantStudio™ Design and Analysis desktop Software, ver.v1.5.1) 進行分析，並藉由標準曲線推算樣品病毒量。
6.3統計分析
上述實施例是應用市售統計軟體 SAS (ver. 9.4) 以廣義線性模型(Generalized linear models，GLM) 檢測樣本平均數之間是否不同，並以 P＜ 0.05 表示具顯著差異。
7. 疫苗有效性判定
CSFV E2次單位疫苗的效力係依據台灣「動物用藥品檢驗標準」第八十四節豬瘟 E2次單位不活化疫苗檢驗標準之第182-8條(網址：http://www.coa.gov.tw)評估。簡言之，免疫豬隻經觀察 28日後，肌肉注射豬瘟強毒株 (ALD株) 5× 10 5.0FAID 50至8 × 10 5.0FAID 50，觀察 14日，須無任何不良反應或呈輕微反應而健存。對照豬經肌肉注射豬瘟強毒 (ALD株) 後，14日內須呈典型急性豬瘟病症而斃死。
PCV2 ORF2次單位疫苗的效力則依據下述方式評估。豬隻攻毒後至少觀察 7週，除第一週外每週採血，免疫 (C組) 豬隻其血清中之 PCV2核酸濃度必須至少三次顯著( P＜ 0.05) 低於未免疫 (D組) 豬隻。
8. 雙價疫苗之驗證結果
8.1豬隻
於進豬時，免疫 (Vaccinated；施打 P-2V1CSFV/PCV2雙價疫苗；A及 C組) 及未免疫 (Non-vaccinated；施打生理食鹽水；B及 D組) 豬隻之平均體重 分別為 3.6 ± 0.1 kg及 3.5 ± 0.1 kg。為預防仔豬出現營養性下痢，所有豬隻於進豬後逐步任食至早晚兩餐給予充分飼料，且所有豬隻於健康狀況良好下開始進行試驗。
8.2 豬隻免疫 CSFV/PCV2雙價疫苗之安全性試驗
(1)體溫變化
豬隻體溫變化以平均直腸溫度表示。請參閱圖2A，其係顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後的平均直腸溫度之折線圖。
圖2A的結果顯示，未免疫 (B組及 D組)與免疫(A組及 C組)的豬隻在注射疫苗或生理食鹽水前之平均直腸溫度 (°C) 分別為 40.1 ± 0.21及 40.0 ± 0.2。注射疫苗免疫後 12、24及 48小時，A組及 C組的豬隻平均直腸溫度皆維持於 40.5 °C 以下之正常範圍，無明顯上升。相較之下，未免疫 (B組及 D組) 的豬隻則有發燒的症狀。
(2) 臨床症狀
請參閱圖2B，其係顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後的平均臨床指數(clinical score)之折線圖。在圖2B中，臨床指數0代表正常；臨床指數1代表症狀輕微；臨床指數2代表症狀中等；臨床指數3代表症狀嚴重)。不同組別的數據標示的字母若為不同者(如a與b)，代表兩組間具有統計上的顯著差異；不同組別的數據標示的字母若為相同者(如a與a)，則代表兩組間不具有統計上的顯著差異。
圖2B的結果顯示，免疫 (A組及 C組) 及未免疫 (B組及 D組) 的豬隻在注射疫苗或生理食鹽水後，至病毒接種前，四組豬隻皆未出現任何明顯臨床症狀。
(3) 增重
免疫 (A組及 C組) 及未免疫 (B組及D組) 豬隻在注射疫苗或生理食鹽水當日之平均體重 (kg) 分別為 4.3 ± 0.2 及 4.2 ± 0.11，兩組間無顯著差異 (P ＞ 0.05)。免疫及未免疫豬隻在免疫後至病毒接種前之平均增重分別為 11.19 (kg) 分別為 6.9 ± 0.2及7.1 ± 0.2，兩組間亦無顯著差異 (P ＞ 0.05)。
8.3 豬隻免疫 CSFV/PCV2雙價疫苗後進行 CSFV攻毒之有效性試驗
(1) 體溫變化
請再參閱圖2A，如圖2A所示，於CSFV攻毒後至犧牲前，以雙價疫苗免疫(A組)的豬隻平均直腸溫度 (°C) 皆低於 40.5 °C，無臨床症狀且活動正常。於CSFV攻毒後4、7及10天，未免疫(B組)之豬隻的平均直腸溫度(°C)分別上升至 41.3 ± 0.2°C、41.0 ± 0.3°C及 41.2 ± 0.3°C；於攻毒後 14天 (犧牲當日)，豬隻因逐漸惡病質(cachexia)，其平均直腸溫度降至 39.8 ± 0.5 °C。另外，未免疫 (B組) 豬隻之臨床症狀於攻毒後第 4天開始出現，病情持續惡化，至第7天呈現明顯沉鬱、畏冷且不願意移動，部分豬隻呈現神經症狀。
(2) 臨床症狀
請再參閱圖2B，如圖2B所示，於CSFV攻毒後4至14天，免疫組與未免疫組之間的臨床指數皆具明顯差異 ( P＜ 0.05)。
(3) 增重
請參閱圖2C，其係顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後的平均增重。圖2C的結果顯示，免疫 (A組)的豬隻於攻毒至犧牲期間之平均增重 (kg) 為9.1 ± 1.0 kg，顯著高於未免疫 (B組，-1.0 ± 0.55 kg，且具有統計上的顯著差異( P＜ 0.05)。
(4) 病毒學
(4.1)血清CSFV ELISA抗體力價
請參閱圖3A至圖3B，其係分別顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後，進行CSFV攻毒的CSF抗體力價(圖3A)及進行PCV2攻毒的CSF抗體力價(圖3B)之折線圖。
圖3A至圖3B的結果顯示，所有豬隻 (圖3A：A組及B組；圖3B：C組及D組) 於免疫前皆無 CSFV ELISA抗體[阻擋百分比 (Blocking %) ≤ 30)]。免疫(A組及C組)的豬隻於雙價疫苗注射後2週，其血清平均 CSFV ELISA抗體力價[阻擋百分比(Blocking %)]上升至62.7 ± 2.5%，抗體陽性 [阻擋百分比(Blocking %) ≥ 40]的豬隻為100 %，雙價疫苗注射後 4週 (攻毒前) 其平均抗體力價再上升至 83.1 ± 1.7%，豬隻的抗體陽性率為100 % (10/10)。未免疫 (B組及 D組)的豬隻血清CSFV ELISA抗體則皆為陰性 (0 %; 0/10)。免疫 (A組及C組) 及未免疫 (B組及D組)的豬隻間之平均CSFV ELISA抗體力價在免疫後2及4週皆具顯著差異( P＜ 0.05)，如圖3A所示。
豬隻進行 CSFV攻毒後，免疫(A組)及未免疫(B組)的豬隻之血清CSFV ELISA抗體平均力價皆呈現持續上升，免疫(A組)的豬隻在攻毒後4、7、10及14天其血清 CSFV ELISA抗體平均力價分別為 86.2 ± 2.5%、93.0 ± 0.6%、92.8 ± 1.1%及94.6 ± 0.6%，皆較未免疫(B組)的豬隻之 3.0 ± 1.6、13.0 ± 3.1、20.3 ± 7.3及27.2 ± 5.7為高且具有顯著差異 ( P＜ 0.05)。免疫(A組)的豬隻在攻毒後之抗體陽性率皆為100 % (5/5)，未免疫(B組)的豬隻在攻毒後10及14天有同一頭 (20 %; 1/5) 呈現陽性，如圖3A所示。
接受PCV2攻毒的豬隻，在攻毒後2至7週，免疫 (C組)的豬隻之血清 CSFV ELISA抗體平均力價維持在 87.6 ± 1.3至 88.5 ± 1.0之間，陽性率皆為 100 % (5/5)；未免疫 (D組) 的豬隻之抗體平均力價則維持在 0.0 ± 0.0至 10.2 ± 3.3之間皆為陰性。免疫(C組)及未免疫(D組)的豬隻間之平均 CSFV ELISA抗體力價在攻毒後2至7週皆具顯著差異 ( P＜ 0.05) ，如圖3B所示。
(4.2) 血清CSFV中和抗體力價
請參閱[圖3C]至[圖3D]係分別顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後，進行CSFV攻毒的CSFV中和抗體力價(圖3C)及進行PCV2攻毒的CSFV中和抗體力價(圖3D)之折線圖。
圖3C至圖3D的結果顯示，所有豬隻 (圖3C：A組、B組；圖3D：C組及D組) 於免疫前其血清中皆無 CSFV中和抗體。免疫 (A組及 C組)的豬隻於雙價疫苗注射後 2週，其血清平均 CSFV中和抗體力價(Log 2)上升至0.9 ± 0.5，抗體陽性率為 30 % (3/10)；疫苗注射後 4週 (攻毒前) 其中和抗體平均力價(Log 2)再上升至5.4 ± 0.3，豬隻抗體陽性率則為100 % (10/10) ；未免疫(B組及D組)的豬隻之血清 CSFV中和抗體則皆為陰性。免疫(A組及C組)及未免疫 (B組及D組)的豬隻間之中和抗體平均力價在免疫後4週具顯著差異 ( P＜ 0.05)。
豬隻進行CSFV攻毒後，免疫 (A組) 的豬隻在攻毒後，其血清之 CSFV中和抗體平均力價(Log 2)持續上升，在攻毒後 4、7、10及 14天分別為 6.9 ± 0.6、9.4 ± 0.3、12.1 ± 0.5 及 11.3 ± 0.3，豬隻抗體陽性率皆為 100 % (5/5) ；未免疫 (B組) 豬隻則在攻毒後 4至 14天其血清 CSFV中和抗體仍皆為陰性。免疫 (A組及C組)及未免疫 (B組及D組)的豬隻間之中和抗體平均力價在攻毒後 4至 14天皆具顯著差異 (P ＜ 0.05)，如圖3C所示。
接受 PCV2攻毒的豬隻，在攻毒後2至7週，免疫 (C組) 豬隻之血清 CSFV 中和抗體平均力價(Log 2)上升至 5.7 ± 0.5至 6.5 ± 0.3之間，陽性率皆為 100 %；未免疫 (D組)的豬隻之血清 CSFV中和抗體仍皆為陰性。免疫(C組)及未免疫 (D組)的豬隻間之平均 CSFV中和抗體力價在攻毒後2至7週皆具顯著差異( P＜ 0.05)，如圖3D所示。
(4.3)血清學 ELISA抗體力價
請參閱圖3E至圖3F，其係分別顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後，進行CSFV攻毒的PCV2抗體力價(圖3E)及進行PCV2攻毒的PCV2抗體力價(圖3F)之折線圖。
圖3E至圖3F的結果顯示，所有豬隻 (A組、B組、C組及 D組) 於免疫前皆無 PCV2 ELISA抗體 (S/P ratio ＜ 0.499)。免疫 (A組及C組)的豬隻於疫苗注射後 4週其血清抗體陽性 (S/P ratio ≥ 0.500) 率為 100 %，平均抗體力價 (S/P ratio)為 1.2 ± 0.1。免疫(A組及C組)及未免疫 (B組及D組)的豬隻間之平均 PCV2 ELISA抗體力價在免疫後 4週具顯著差異 ( P＜ 0.05)。
豬隻進行 PCV2攻毒後，免疫 (C組) 及未免疫 (D組)的豬隻之血清 PCV2 ELISA抗體平均力價皆呈現持續上升，免疫(C組)的豬隻之血清 PCV2 ELISA抗體平均力價維持在 1.9 ± 0.0 至 2.2 ± 0.0 之間，陽性率皆為 100 % (5/5)；未免疫(D組)的豬隻之抗體平均力價維持在 0.9 ± 0.1 至2.0 ± 0.0 之間，陽性率亦皆為 100 % (5/5)。免疫(C組)的豬隻在攻毒後2至6週其血清PCV2 ELISA抗體力價皆顯著較未免疫(D組)者高 (P ＜ 0.05)，如圖3E所示。
接受 CSFV攻毒的豬隻，在攻毒後 4、7、10及 14天，免疫(A組)的豬隻之血清 PCV2 ELISA抗體平均力價維持在 1.4 ± 0.1至1.5 ± 0.2之間，陽性率皆為100 % (5/5)；未免疫 (B組) 豬隻之血清 PCV2 ELISA抗體皆仍為陰性 (0 %; 0/5)。免疫(A組)及未免疫(B組)的豬隻間之平均PCV2 ELISA抗體力價在攻毒後 4至 14天皆具顯著差異( P＜ 0.05)，如圖3F所示。
(4.4)血清病毒核酸力價
請參閱圖4A及圖4B，其係分別顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後，進行CSFV攻毒的血清中CSF病毒負荷量(圖4A)及進行PCV2攻毒的血清中PCV2病毒負荷量(圖4B)之折線圖。
圖4A及圖4B的結果顯示，所有豬隻 (圖4A：A組、B組；圖4B：C組及D組) 於免疫前及病毒攻毒前其血清中皆未檢出CSFV核酸或PCV2核酸。
接受 CSFV攻毒的免疫 (A組) 及未免疫 (B組) 豬隻，於 CSFV攻毒後 4至 14天其血清亦皆未檢出 PCV2核酸。進行CSFV攻毒的豬隻中，免疫(A組)的豬隻中，僅一頭在攻毒後第 4天檢測出病毒核酸力價為2.5 (換算為Log10 TCID50/mL)；但未免疫 (B組)的豬隻其血清中 CSFV核酸力價在攻毒後 4、7、10及 14天分別為 4.6 ± 0.3、7.2 ± 0.2、8.1 ± 0.2及7.8 ± 0.1；兩組間具顯著差異 (P ＜ 0.05)，如圖4A所示。
進行 PCV2攻毒的豬隻，於攻毒後 2、3、4及 5週之 4次採血，免疫 (C組) 豬隻血清病毒核酸平均濃度 (Log 10copies/mL) 顯著低於未免疫 (D組) 豬隻，兩組 4次採血分別為 0.0 ± 0.0、0.0 ± 0.0、0.9 ± 0.9、0.0 ± 0.0及 5.2 ± 0.2、6.0 ± 0.2、5.6 ± 0.4、5.7 ± 0.2。接受 PCV2攻毒的免疫 (C組) 及未免疫 (D組)的豬隻，於 PCV2攻毒後之 2至7週，其血清亦皆未檢出PCV2核酸，如圖4B所示。攻毒後 6及 7週，免疫及未免疫組間之平均病毒核酸濃度雖無顯著差異 (P ＞ 0.05)，但免疫 (C組) 豬隻血清病毒核酸檢測全部為陰性，未免疫 (D組) 豬隻則分別有 2 (40 %) 及 1 (20 %) 頭為陽性，其病毒核酸平均濃度分別降至 1.8 ± 1.1及 0.9 ± 0.9，如圖4B所示。
(4.5) 組織與淋巴結病毒濃度
進行 CSFV攻毒的豬隻，免疫(A組)之豬隻的腦、扁桃腺、肺、脾、肺門淋巴結、腸繫膜淋巴結、鼠蹊淋巴結及迴盲瓣之病毒核酸濃度 (Log 10TCID 50/mL) 分別為 0.0 ± 0.0、4.7 ± 0.5、0.0 ± 0.0、1.2 ± 0.7、3.0 ± 0.8、3.1 ± 0.8、2.5 ± 0.7及 3.1 ± 0.8，皆低於未免疫 (B組) 豬隻之6.5 ± 0.3、7.2 ± 0.1、7.0 ± 0.2、7.3 ± 0.3、7.2 ± 0.2、7.3 ± 0.2、7.3 ± 0.2及 7.3 ± 0.2，且具有統計上的顯著差異 ( P＜ 0.05)。接受CSFV攻毒的免疫(A組) 及未免疫(B組)的豬隻，其臟器皆未檢出PCV2核酸。
進行PCV2攻毒的豬隻，免疫(C組)之豬隻的肺、脾、肺門淋巴結、腸繫膜淋巴結及鼠蹊淋巴結之病毒核酸濃度 (Log 10copies/g tissue) 分別為 6.7 ± 0.3、6.3 ± 0.2、7.4 ± 0.4、5.6 ± 0.5及 6.3± 0.4，皆低於未免疫 (D組) 豬隻之 8.6 ± 0.1、9.4 ± 0.2、9.1 ± 0.4、8.8 ± 0.3及9.1 ± 0.3，且具有統計上的顯著差異 ( P＜ 0.05)。接受PCV2攻毒的免疫(C組)及未免疫(D組)的豬隻，其所有採樣臟器皆未檢出CSFV核酸。
(5)疫苗安全性
所有免疫豬隻無明顯外觀病變及臨床症狀。
(6) 豬隻免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後進行 PCV2攻毒之有效性試驗
(6.1) 疫苗施打後以 CSFV攻毒之免疫有效性
(6.1.1)體溫變化與臨床症狀
免疫(A組)的豬隻於 CSFV攻毒後 14天內體溫正常、無特徵性臨床症狀及明顯組織病變。未免疫(B組)的豬隻則呈現高體溫、沉鬱、畏冷及神經症狀。
(6.1.2) 增重
免疫(A組)及未免疫(B組)的豬隻於攻毒至犧牲期間之平均增重 (kg)分別為9.1 kg及-1.0 kg，具有統計上的顯著差異。
(6.1.3) 血清抗體力價
豬隻於免疫後 4週其血清 CSFV中和抗體陽性率為 100 %，抗體平均力價 (Log2) 達 5.4。以 CSFV攻毒後其抗體平均力價上升至 6.9以上；以 PCV2攻毒的豬隻，在攻毒後 2-7週，免疫豬隻之抗體力價皆維持在 5.7以上。未免疫豬隻在試驗全程其中和抗體皆為陰性。應用 CSFV ELISA (Blocking %) 進行抗體檢測，免疫豬隻於注射後 2週陽性率即達 100 %，抗體平均力價為 62.7而至免疫後 4週抗體平均力價為 83.1；未免疫豬隻只有一頭於 CSFV攻毒後抗體呈現陽性。
(6.1.4) 血清及組織病毒力價
豬隻以 CSFV攻毒後，免疫的豬隻血清皆未檢出 CSFV核酸；但未免疫的豬隻可檢出高核酸力價，換算成 Log 10TCID 50/mL為 4.6-8.1。免疫之豬隻的腦、肺及各淋巴組織之病毒核酸濃度較未免疫的豬隻至少降低 2.5至6.5 Log 10TCID 50/mL。
(6.2) 疫苗施打後以 PCV2攻毒之免疫有效性
(6.2.1) 體溫變化與 臨床症狀
免疫(C組)及未免疫 (D組)的豬隻於 PCV2攻毒前平均體溫(°C) 分別為 38.9 ± 0.1°C 及 39.6 ± 0.1°C。豬隻於 PCV2攻毒後，免疫(C組)及未免疫(D組)的豬隻之體溫(°C)皆維持在 40.5 °C以下，免疫的豬隻無明顯特徵性臨床症狀，未免疫的豬隻則陸續出現輕微毛髮蓬鬆，但平均體溫皆維持在 40.5 °C以下。
(6.2.2) 增重
免疫(C組)的豬隻於攻毒至犧牲期間之平均增重(kg)為 31.2 ± 1.8 kg，未免疫(D組)的豬隻為26.8 ± 2.3 kg，兩組間在統計上不具顯著差異 ( P＞ 0.05)。
(6.2.3) 血清抗體力價
未免疫(D組)的豬隻血清 PCV2 ELISA抗體於攻毒前皆為陰性。免疫(C組)的豬隻於免疫後 4週其血清抗體陽性率為 100 %，抗體平均力價為 1.2 (S/P ratio)。以PCV2攻毒後，兩組豬隻之血清 PCV2 ELISA抗體皆呈現持續上升，陽性率皆為 100 %，但免疫(C組)的豬隻在攻毒後 2至 4週其抗體力價，皆高於未免疫(D組)的豬隻，且具有統計上的顯著差異。
(6.2.4) 血清及組織病毒力價
豬隻以 PCV2攻毒後 2、3、4及 5週之 4次採血，免疫(C組)的免疫豬隻之血清病毒核酸濃度皆顯著低於未免疫(D組)的豬隻；攻毒後 6及 7週，免疫(C組)的豬隻皆為陰性，但未免疫(D組)的豬隻亦呈極低濃度，兩組間在統計上不具有顯著差異。免疫(C組)之豬隻的肺、脾及各淋巴結之病毒核酸濃度，皆低於未免疫(D組)的豬隻，且具有統計上的顯著差異。
上述實施例證實，CSFV/PCV2雙價疫苗可安全使用於5週齡豬隻，經單劑接種後，即可提供有效免疫保護力，毋需補強免疫，並可顯著提升豬隻 CSFV及 PCV2之中和或 ELISA抗體力價，且有效的抑制體內病毒增殖與臨床症狀。
綜言之，本發明以特定的胺基酸序列、特定的製造方法、特定的組成、特定的分析模式或特定的評估方法僅用於例示說明單劑豬瘟病毒與豬環狀病毒雙價次單位疫苗組成物豬用單劑雙價次單位疫苗組成物。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，在不脫離本發明的精神及範圍內，其他的胺基酸序列、其他的製造方法、其他的組成、其他的分析模式或其他的評估方法亦可用於單劑豬瘟病毒與豬環狀病毒雙價次單位疫苗組成物豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，並不限於上述。
舉例而言，可溶性雙價抗原之CSFV-E2重組蛋白及PCV2ORF2重組蛋白可使用其他序列進行表現、其他序列的CpG佐劑及/或雙相佐劑製得，以優化製程及量產。所得的可溶性雙價抗原可視實際需求，應用於豬用單劑雙價次單位疫苗組成物之外，亦可應用於快篩試劑或生物晶片或其他市售的檢驗產品。
上述實施例證實，CSFV/PCV2雙價疫苗可安全使用於5週齡豬隻，經單劑接種後，即可提供有效免疫保護力，毋需補強免疫，並可顯著提升豬隻 CSFV及 PCV2之中和或 ELISA抗體力價，且有效的抑制體內病毒增殖與臨床症狀。
根據上述實施例，本發明的豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其優點在於哺乳類細胞表現系統生產出可溶性雙價抗原後，結合CpG佐劑及雙相佐劑所得之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，僅須單劑接種即可提供有效免疫保護力，毋需補強免疫，藉此減少現場CSFV及PCV2同時發生的可能性，減少現有使用LPC疫苗防治CSFV出現的漏洞，降低野外CSFV入侵豬場的風險並提高清除CSFV的機會。
雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但其他實施例亦有可能。因此，本發明後附請求項之精神及範圍不應限於這裡包含的實施例所述。
101,103,105:箭頭
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下： [圖1A]至[圖1D]係顯示根據本發明一實施例利用哺乳類細胞表現的CSFV-E2重組蛋白及PCV2-ORF2重組蛋白的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)之膠體影像(圖1A、圖1C)與西方墨點法(圖1B、圖1D)之呈色影像。 [圖2A]係顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後的平均直腸溫度之折線圖。 [圖2B]係顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後的平均臨床指數(clinical score)之折線圖。 [圖2C]係顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後的平均增重。 [圖3A]至[圖3F]係分別顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後，進行CSFV攻毒的CSF抗體力價(圖3A)、進行PCV2攻毒的CSF抗體力價(圖3B)、進行CSFV攻毒的CSFV中和抗體力價(圖3C)、進行PCV2攻毒的CSFV中和抗體力價(圖3D)、進行CSFV攻毒的PCV2抗體力價(圖3E)及進行PCV2攻毒的PCV2抗體力價(圖3F)之折線圖。 [圖4A]及[圖4B]係分別顯示根據本發明一實施例之豬隻在免疫CSFV/PCV2雙價疫苗後，進行CSFV攻毒的血清中CSF病毒負荷量(圖4A)及進行PCV2攻毒的血清中PCV2病毒負荷量(圖4B)之折線圖。
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Claims (10)

  1. 一種豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，包括： 一雙價抗原，其中該雙價抗原係由E2重組蛋白E2重組蛋白及ORF2重組蛋白所組成，該E2重組蛋白之一胺基酸序列為如序列識別號(SEQ ID NO):1所示，且該ORF2重組蛋白是由如SEQ ID NO:2所示之一核酸序列所編碼； CpG佐劑，其中該CpG佐劑之一核酸序列為如SEQ ID NO:3所示；以及 雙相佐劑，且 其中該豬用單劑雙價次單位疫苗組成物對一受試對象的一有效施用次數為一次。
  2. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該E2重組蛋白是源自於豬瘟病毒2.1a亞群。
  3. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該ORF2重組蛋白是源自於第二型豬環狀病毒。
  4. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該雙價抗原為由哺乳類細胞表現系統所生產。
  5. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該E2重組蛋白是由如SEQ ID NO:4所示之一核酸序列所編碼。
  6. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該E2重組蛋白之一有效劑量為25μg/mL至50μg/mL。
  7. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該ORF2重組蛋白之一有效劑量為25μg/mL至75μg/mL。
  8. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該CpG佐劑與該雙價抗原蛋白之一重量比為1:1至1：2。
  9. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該雙相佐劑為水包油包水(W/O/W)佐劑。
  10. 如請求項1所述之豬用單劑雙價次單位疫苗組成物，其中該雙相佐劑之一有效劑量為50體積%。
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