TW202410888A - 補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮於治療老化相關症狀的用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於一種用以治療一個體之老化相關症狀的方法，該方法係對該個體投予一有效量之補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮，其中該老化相關症狀是肌肉強度喪失、肌肉無力、運動協調性喪失、失去平衡、皮膚皺紋，或不良的血液生化參數。

Description

補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮於治療老化相關症狀的用途

本揭示內容整體上是關於生物醫藥的技術領域。更具體來說，本揭示內容是關於補骨脂寧(corylin)或新補骨脂異黃酮(neobavaisoflavone)，以及其於治療老化相關症狀(symptoms associated with senescence)的用途。

老化是一種功能性衰退，在所有物種中都會發生，部分原因可能是由於組織和器官中累積了老化細胞，進而使得生物功能惡化，並可能促發與老化相關的病理現象。與老化相關的分子機制發生失調(dysregulated)，例如DNA修復能力喪失、染色體不穩定、端粒侵蝕等，均會引發細胞老化，然後老化的細胞會產生一種與老化相關的分泌表現型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)，會進一步觸發周圍組織的老化進程。因此，老化細胞會惡化個體的器官功能並引發與老化相關的疾病，甚至會增加個體的死亡風險。儘管細胞老化對個人的健康具有重大影響，而抗老化藥物的開發可有助於促進健康老化(healthy aging)並用於治療與老化相關的疾病，然迄今為止，還沒有開發出許多的抗老化藥物；僅有少數具有抗老化活性的化合物曾有過記載。

另一方面，根據幾部傳統中藥(traditional Chinese medicine，TCM)藥典的記載，例如，本草綱目(the Compendium of Materia Medica)、千金要方(Qianjinyaofang)、神農本草(Shennong Materia Medica)，以及黃帝內經(Huangdi Neijing)等，許多傳統中藥(TCM)具備抗老化的活性。然而，由於這些傳統中藥中的關鍵化合物尚未被鑑定出，因此該些化合物的潛在抗老化活性還未獲得驗證。惟隨著化合物之純化技術的進步以及抗老化藥物之體外篩選平台的建立(例如，母系富集程式(the mother enrichment program，MEP)，現今得以從該些傳統中藥中發現出有潛力的抗老化藥物。如本文所述，上述的傳統中藥之一，補骨脂( Psoralea corylifolia)，就非常值得注意，因為它(特別是 P. corylifolia的正己烷可溶性部分)在抗老化活性方面具有巨大的潛力。

有鑑於此，相關領域亟需從補骨脂中鑑定出具有抗老化特性的活性物質，其中該活性物質可作為候選化合物，以用於開發出適用於改善細胞老化的藥物，和/或用於治療與老化相關的疾病。

下文呈現出本揭示內容的簡單概要，以利讀者對於本揭示內容有基本的理解。本概要並非是對於本揭示內容的廣泛性概觀，也非是用以鑑別本揭示內容的關鍵性/決定性元件，或用以勾勒本揭示內容的範圍。它唯一的目的在於，以一種簡化的形式呈現出本揭示內容的某些概念，以作為後續呈現出更多詳細說明的序幕。

如在本文中所實施和廣泛描述的，本揭示內容的其中一態樣是關於一種用以治療一個體之老化相關症狀的方法，特別是有關肌肉、平衡力，或皮膚方面的症狀，或因血液生化學異常(anomaly)所引起的症狀；本揭示內容方法係一種用以增加一個體之肌肉強度或運動協調性(motor coordination)；減少肌肉無力、失去平衡(loss of balance)，或皮膚皺紋；或改善一血液生化參數(blood biochemical parameter)的方法，包含對該個體投予一有效量之補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮。

例示性之改善的血液生化參數可以是指，與未投予補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮相比，具有較低的空腹血糖(fasting blood glucose)值、較低的總膽固醇(total cholesterol)值、較低的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)值、相同或較高的高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)值、較低的三酸甘油脂(triglyceride，TG)值、較低的天門冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase，AST)值，或較低的肌酸酐(creatinine)值中的任一種。

依據本揭示內容的某些實施方式，該補骨脂寧和該新補骨脂異黃酮是對該個體約分別投予1-10毫克/公斤和1-10毫克/公斤的用量。

較佳地，可藉由本揭示內容方法來治療的個體是一哺乳動物，舉例來說，可以是人類、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、猴子、豬、狗、貓、馬、綿羊、山羊、乳牛，以及兔子。依據本揭示內容的一較佳實施方式，所述個體是人類。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I. 定義

為方便起見，本說明書、實施例和所附申請專利範圍中所使用的特定專有名詞集中在此。除非本說明書另有定義，否則此處所使用的科學和技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解和慣用的意義相同。並且，在與上下文不相衝突的情況下，本說明書所使用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型，而所使用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，在本說明書與申請專利範圍中，單數形式「一」(a、an和the)包括複數參考值，但依據上下文而另有指示者除外。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」(at least one)與「一或多」(one or more)等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。除非另有說明，否則本揭示內容的實踐會採用生物化學、分子生物學等領域的常規技術，這些技術均屬於本領域的技術範圍內。這類技術已在公開文獻中有詳細闡釋。

如本文在說明書和申請專利範圍中所使用之「和/或」(and/or)一詞，應當理解為，意指「任何一個或兩者」如此結合的元件，亦即，該些元件在某些情況下會聯合(conjunctively)存在，而在其他情況下會分開(disjunctively)存在。用「和/或」所列出的多個元件應當以相同的方式解釋，亦即，「一或多個」如此結合的元件。除了由「和/或」子句所具體標示出的元件之外，其他元件可任選地存在，無論其是否與該些有被具體標示出的元件相關或不相關。因此，作為一個非限制性的實施例，當「和/或」與開放式語言(例如，「包含」(comprising))合併使用時，「A和/或B」可以是指，在一實施方式中，僅有A (可任選地包括除了B之外的元件)；在另一實施方式中，僅有B (可任選地包括除了A之外的元件)；在再另一實施方式中，有A和B兩者(可任選地包括其他元素)等。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已經盡可能精確地呈現出具體實施例中的相關數值。然而，任何數值在本質上不可避免地會含有因個別測試方法所致的標準差。在此處，「約」一詞通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實施例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如，用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例等)均經過「約」的修飾。據此，除非另有相反指示，否則本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，並且可視需求而更動。至少，應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

「與老化相關的症狀」一詞，是指任一種與老化(例如，在特定年齡)相關的身體惡化(physical deterioration)、疾病，或障礙(disorder)有關的臨床表現；這類症狀可能是由於肌肉功能失常(dysfunction)(例如，肌肉強度降低或肌肉無力症狀加重)、平衡力(例如，運動協調性降低或失去平衡)，或皮膚(例如，皮膚皺紋增加)，或者可能是由於血液生化學變異(aberration)(例如，較高的空腹血糖值、總膽固醇值、低密度脂蛋白值、三酸甘油脂值、天門冬胺酸轉胺酶值，或肌酸酐值；或是較低的高密度脂蛋白值)。本文所使用之與老化相關的症狀可能至少有部分原因是由於細胞老化的緣故，並可能進一步演變成與老化相關的疾病，例如高血壓、肌少症(sarcopenia)、關節炎(例如，退化性關節炎、類風濕性關節炎、代謝性關節炎、感染性關節炎，或僵直性脊椎炎(spondylitis ankylosans))、骨質疏鬆症，或神經退化性疾病(例如，阿茲海默症、血管型失智症、路易氏體失智症、額顳葉失智症、帕金森氏症、亨丁頓氏症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化症、脊髓性肌萎症)，該些症狀或疾病均可以使用本揭示內容方法來治療。

「減少」(decreased)或「減量」(reduced)的值或量通常是指「具有統計上的顯著意義」(statistically significant)減少的值或量，並且可以包括，舉例來說，相對於控制組來說，具有5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或100％的減少(包括介於兩者之間的所有整數和範圍)。減少或減量的值或量還可能包括，相對於控制組來說，具有2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1,000倍、10,000倍，或大於10,000倍的減少(包括介於兩者之間的所有整數和範圍)。本文描述了比較性和「具有統計上的顯著意義」的值或量的其他實例。本文所使用之「減少」(decrease)，可以是指「抑制」(inhibit)、「減量」(reduce)、「遏制」(curb)、「減弱」(abate)、「縮減」(diminish)、「變少」(lessen)，或「降低」(lower)等。

「增加」(increased)或「增量」(enhanced)的值或量通常是指「具有統計上的顯著意義」(statistically significant)增加的值或量，並且可以包括，舉例來說，相對於控制組來說，具有5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或100％的增加(包括介於兩者之間的所有整數和範圍)。增加或增量的值或量還可能包括，相對於控制組來說，具有2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1,000倍、10,000倍，或大於10,000倍的增加(包括介於兩者之間的所有整數和範圍)。本文描述了比較性和「具有統計上的顯著意義」的值或量的其他實例。本文所使用之「增加」(increase)，可以是指「激動」(agonize)、「增量」(enhance)、「膨脹」(inflate)、「升高」(escalate)、「擴展」(expand)、「增大」(augment)、「擴大」(enlarge)，或「上升」(raise)等。

「具有統計上的顯著意義」(statistically significant)一詞是指實驗結果不太可能(unlikely)是偶然發生的。統計上的顯著性可藉由任一種本領域所熟知的方法來確定。常用的顯著性度量(measure)包括p值，亦即，如果虛無假設(null hypothesis)為真，則觀察到的事件發生的頻率或機率。如果獲得的p值小於顯著性的值，則拒絕虛無假設。在單純的情況下，顯著性的值定義為p值小於0.05。「顯著」(significant)一詞涵蓋並包括在「具有統計上的顯著意義」(statistically significant)一詞的意義內。

「個體」(subject)或「病患」(patient)一詞是指可以用本揭示內容藥學組合物和/或方法來治療的動物，包括人類物種。除非明確指出一種性別，否則「個體」或「病患」一詞意指男性和女性二者。據此，「個體」或「病患」一詞包含任一種可能受益於施用補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮的哺乳動物。例示性之「個體」或「病患」包括，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、乳牛、馬、狗、貓、鳥，以及家禽。在一例示性的實施方式中，該個體是人類。

本文所使用之「老年」(aged)動物是指一種會展現出至少一種與正常老化相關的表現型的成年動物。一種動物會被視為「老年」的確切年齡是取決於該動物的物種和/或品系(strain)，以及所提到的表現型，並且可由本領域技術人員容易地確定。

本文所使用之「治療」(treatment和treating)一詞可以是指一種治癒性或姑息性(palliative)措施。具體來說，本文所使用之「治療」一詞，是指對一個體施用(application)或投予(administration)本揭示內容補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮，或包含它們的藥學組合物，該個體罹患一種與老化相關的症狀或疾病，或罹患一種次生性疾病或病症，繼發於該與老化相關的症狀或疾病，以期部分地或完全地減輕(alleviate)、改善(ameliorate)、緩解(relieve)、延遲發作、抑制進展、降低嚴重性，和/或降低發生率在一或多種與老化相關的症狀或特徵上。

「投予」(administered、administering，或administration)一詞在本文中可交替使用，是指直接施用本揭示內容補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮，或含有補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮的本揭示內容藥學組合物。

本文所使用之「一有效量」(an effective amount)一詞是指一有效的量，在必要的劑量和時間內，對一個體之與老化相關的症狀或疾病的治療可達到欲求的治療結果。為了治療的目的，有效量也可以是指一種其中成分的任一種毒性或有害作用被治療上有益作用超過的量。具體的有效量或足量會因多種因素而有所差異，這類因素例如待治療的特定病症、病患的身體狀況(例如，病患的體重、年齡，或性別)、待治療的哺乳動物或動物的種類、治療的持續時間、並行療法的性質(若有的話)，以及所採用的具體製劑和化合物或其衍生物的結構等。一有效量可以表示成，舉例來說，活性成分的總質量(例如，以公克、毫克，或微克為單位)，或活性成分的質量與體重的比率(例如，以毫克/公斤(mg/kg)為單位)。或者是，有效量可以是以活性成分(例如，本揭示內容補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮)的濃度來表示，例如，體積莫耳濃度(molar concentration，M)、質量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、質量分率(mass fraction)，以及混合比(mixing ratio)。本領域技術人員可以依據動物模式所確定的劑量來計算藥物(例如，本揭示內容補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮)的人體等效劑量(human equivalent dose，HED)。舉例來說，HED可以是按照美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)所發布的行業指南「估計成人健康志願者治療在初始臨床試驗中的最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算用於人類個體的最大安全劑量。

「藥學組合物」(pharmaceutical composition)一詞是指一種其形式可允許其中所含活性成分的生物學活性為有效的製劑，並且不包含對一待施用該組合物的個體具有不可接受之毒性的附加成分。一般來說，該活性化合物(即補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮)的量約佔該藥學組合物總重量的0.01-99％(重量％)；較佳地，該活性化合物的量約佔該藥學組合物總重量的至少0.1％(重量％)；更佳地，該活性化合物的量約佔該藥學組合物總重量的至少1％(重量％)；再更佳地，該活性化合物的量約佔該藥學組合物總重量的至少5％(重量％)；又再更佳地，該活性化合物的量約佔該藥學組合物總重量的至少10％(重量％)；再又再更佳地，該活性化合物的量約佔該藥學組合物總重量的至少25％(重量％)。為了在臨床上使用本發明，可將本揭示內容藥學組合物配製成適用於預期給藥途徑的製劑。

本文所使用之「藥學上可接受的載體」(pharmaceutically acceptable carrier)一語是指藥學上可接受的材料、組合物，或載劑(vehicle)，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、載體(carrier)、溶劑，或封裝材料，其涉及從一個器官或身體的其中一部分攜帶或運輸主體藥劑(subject agent)到另一器官或身體的另一部分。每種載體在與該製劑的其他成分相容的意義上，必須是「可接受的」。該藥學製劑含有本發明化合物以及一或多種藥學上可接受的成分。載體可以是固體、半固體，或液體，如膠囊劑、乳膏劑，或稀釋劑的形式。該些藥學製劑亦為本發明的進一步客體(object)。

II. 發明詳述

本揭示內容至少有部分基於以下發現：補骨脂寧和新補骨脂異黃酮能夠個別改善人體的身體機能，例如，促進肌肉健康和改善平衡、增強皮膚抵抗力、強化循環系統健康等，據此，補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮可增強一個體的活力(vitality)，並最終賦予該個體具有恢復活力(rejuvenized)的特性。

1. 本揭示內容組合物

據此，本揭示內容的第一態樣是提供一種用以治療如本文所述之與老化相關的症狀或疾病的組合物。該組合物包含補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮，以及一藥學上可接受的載體。所述補骨脂寧和新補骨脂異黃酮分別具有下列式(I)和式(II)的化學結構： (I)、                                                  (II)。

本揭示內容組合物所包含的補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮可從天然草藥中萃取或藉由化學合成來獲得。所述天然草藥包括，但不限於，補骨脂( Psoralea corylifolia(babchi))、阿伯提補骨脂( Psoralea abbottiiC.H.Stirt.)、腺補骨脂( Psoralea aculeataL.)、相鄰補骨脂( Psoralea affinisEckl. & Zeyh.)、阿拉塔補骨脂( Psoralea alata(Thunb.) T.M.Salter)、狹葉補骨脂( Psoralea angustifoliaL’Hér.)、無葉補骨脂( Psoralea aphyllaL.)、阿波雷亞補骨脂( Psoralea arboreaSims)、腋花補骨脂( Psoralea asarina(P.J.Bergius) T.M.Salter)、腋脈補骨脂( Psoralea axillarisL.f.)、阿祖羅補骨脂( Psoralea azuroidesC.H.Stirt.)、艷麗補骨脂( Psoralea brilliantissimaC.H.Stirt., Muasya & A.Bello)、白内補骨脂( Psoralea cataractaC.H.Stirt.)、密花補骨脂( Psoralea congestaC.H.Stirt. & Muasya)、晚膳補骨脂( Psoralea diturneraeA. Bello, C.H. Stirt. & Muasya)、秀麗補骨脂( Psoralea elegansC.H.Stirt.)、劍葉補骨脂( Psoralea ensifolia(Houtt.) Merr.)、窄葉補骨脂( Psoralea fascicularisDC. (同，裂葉補骨脂( Psoralea tenuifoliaThunb.)，或刺葉補骨脂( Psoralea thunbergianaEckl. & Zeyh.))、絲葉補骨脂( Psoralea filifoliaEckl. & Zeyh.)、弗萊塔補骨脂( Psoralea fletaC.H.Stirt.)、卷毛補骨脂( Psoralea floccosaC.H.Stirt., Muasya & A.Bello)、福布斯補骨脂( Psoralea forbesiaeC.H.Stirt., A.Bello & Muasya)、巨大補骨脂( Psoralea giganteaDludlu, Muasya & C.H.Stirt.)、光滑補骨脂( Psoralea glabraE.Mey.)、白葉補骨脂( Psoralea glaucescensEckl. & Zeyh.)、灰葉補骨脂( Psoralea glaucinaHarv.)、星點補骨脂( Psoralea gueinziiHarv.)、疊補骨脂( Psoralea imbricata(L.f.) T.M.Salter)、緊迫補骨脂( Psoralea imminensC.H.Stirt.)、交枝補骨脂( Psoralea implexaC.H.Stirt.)、絨毛補骨脂( Psoralea intonsaC.H.Stirt., Muasya & A.Bello)、伊倫巴補骨脂( Psoralea ivumbaC.H.Stirt., A.Bello & Muasya)、卡倫補骨脂( Psoralea karooensisC.H.Stirt., Muasya & Vlok)、珍珠補骨脂( Psoralea keetiiSchönland ex H.M.L.Forbes)、串葉補骨脂( Psoralea kougaensisC.H.Stirt., Muasya & A.Bello)、重瓣補骨脂( Psoralea laevigataL.f.)、疏花補骨脂( Psoralea laxaT.M.Salter)、瑪格麗特補骨脂( Psoralea margaretifloraC.H.Stirt. & V.R.Clark)、單葉補骨脂( Psoralea monophylla(L.) C.H.Stirt.)、蒙大拿補骨脂( Psoralea montanaA.Bello, C.H.Stirt. & Muasya)、錐頭補骨脂( Psoralea muiriiC.H.Stirt. & Muasya)、馨香補骨脂( Psoralea odoratissimaJacq.)、寡葉補骨脂( Psoralea oligophyllaEckl. & Zeyh.)、齒瓣補骨脂( Psoralea oreophilaSchltr.)、巴瑞帝卡補骨脂( Psoralea peraticaC.H.Stirt.)、皮納塔補骨脂( Psoralea pinnataL.)、普露托補骨脂( Psoralea plautaC.H.Stirt.)、尖鱗補骨脂( Psoralea pullataC.H.Stirt.)、密枝補骨脂( Psoralea ramulosaC.H.Stirt.)、鋪地補骨脂( Psoralea repensP.J.Bergius)、積雪補骨脂( Psoralea restioidesEckl. & Zeyh.、根切補骨脂( Psoralea rhizotomaC.H.Stirt. & Muasya)、硬葉補骨脂( Psoralea rigidulaC.H.Stirt.)、粗紋補骨脂( Psoralea semotaC.H.Stirt.)、花面補骨脂( Psoralea sordidaC.H.Stirt. & Muasya)、美麗補骨脂( Psoralea speciosaEckl. & Zeyh.)、大花補骨脂( Psoralea suaveolensC.H.Stirt., A.Bello & Muasya)、裂葉補骨脂( Psoralea tenuifoliaL.)、細柳葉補骨脂( Psoralea tenuissimaE.Mey.)、三花補骨脂( Psoralea trifloraThunb.)、特魯拉塔補骨脂( Psoralea trullataC.H.Stirt.)、漆補骨脂( Psoralea usitataC.H.Stirt.)、范柏克利亞補骨脂( Psoralea vanberkeliaeC.H.Stirt., A.Bello & Muasya)、疣狀補骨脂( Psoralea verrucosaWilld. ex Spreng.)，以及莖補骨脂( Puerariae caulis(galman))。較佳地，可經由任一種本領域所熟知的萃取方法從補骨脂( Psoralea corylifolia(babchi))中萃取出補骨脂寧或新補骨脂異黃酮。較佳地，可藉由將上述任何草本植物與萃取劑(例如，乙醇、正己烷、乙酸乙酯等)混和，以獲得補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮，並持續混和一段足夠的時間，以製備粗萃取物。

此外或可替代地，該粗萃取物可進一步純化以製得實質上純的補骨脂寧和新補骨脂異黃酮。一般來說，可將該粗萃取物藉由管柱層析法(例如，高效液相層析法(high performance liquid chromatography，HPLC)、矽膠層析法(silica gel chromatography))、薄層層析法(thin-layer chromatography)等)來純化。在一操作實施例中，該粗萃取物是經由矽膠層析法以製得實質上純的補骨脂寧和新補骨脂異黃酮。

接下來，藉由以下方法來鑑定所純化的化合物，包括，但不限於，化學分析(例如，滴定分析、重量分析，或顯微光譜法)、光譜法分析(例如，旋光光譜法(optical rotation spectroscopy)、原子光譜法，或分子光譜法)、質譜法、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)質子光譜法、層析法(例如，管柱層析法、離子交換層析法、凝膠層析法、親和力層析法、HPLC，或薄層層析法)、紅外線光譜法，或其組合(例如，液相層析法-質譜法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS))。在一操作實施例中，是藉由NMR質子光譜法鑑定出該補骨脂寧和新補骨脂異黃酮。

依據目的的不同，所述包含補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮的組合物可作為藥品(包括營養補充劑)、化妝品，或保健功能食品的形式來使用。

依據本揭示內容的某些實施方式，該組合物是用作藥品(或營養補充劑)，在此情況下，藥學組合物可以進一步包含通常用於製造藥學組合物的適當的載體、賦形劑，以及稀釋劑。此外，藥學組合物可製成散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、噴霧劑、外用劑、栓劑等劑型來使用；以依據慣常方法所製成的無菌注射液。可包括在藥學組合物中的載體、賦形劑，以及稀釋劑包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠(acacia rubber)、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂，以及礦物油。在做成製劑的情況下，可使用賦形劑或稀釋劑(例如，填充劑、增量劑、結合劑、潤濕劑、崩解劑，以及界面活性劑)來製備。口服固體製劑包括片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等。該些固體製劑在製劑中包括至少一種賦形劑，例如，澱粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等。此外，除了簡單的賦形劑之外，還使用了硬脂酸鎂或滑石粉等潤滑劑。口服液體製劑包括混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑等。除了常用作簡單稀釋劑的水和液體石蠟之外，各種賦形劑，例如，潤濕劑、甜味劑、芳香劑，以及防腐劑，都可涵蓋在製劑中。用於腸胃外給藥(例如，注射給藥)的製劑，包括無菌水溶液劑、非水性溶劑、混懸劑、乳劑、凍乾製劑，以及栓劑。非水性溶劑和混懸劑可包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄欖油)，以及可注射的酯類(例如，油酸乙酯)。作為栓劑的基質，可使用混合脂肪酸甘油酯(WITEPSOL)、聚乙烯二醇(macrogol)、聚山梨醇酯-61(TWEEN-61)、可可脂、月桂脂，以及甘油明膠。

依據本揭示內容的某些實施方式，該組合物是用作化妝品，在此情況下，除了活性成分之外，化妝品組合物中還可以包括常用的成分，舉例來說，安定劑、增溶劑、常用輔助劑(例如，維生素、色素，以及芳香劑)，以及載體。此外，化妝品組合物可製成任一種本領域慣常製備的製劑，例如，溶液劑、混懸劑、乳液劑、糊劑、凝膠劑、乳膏劑、洗劑(lotion)、粉劑、肥皂、含界面活性劑的清潔劑、油劑。其可以配製成粉底、乳液粉底、蠟粉底、噴霧等，但不限於此。當製劑為糊劑、乳膏劑，或凝膠劑的情況下，可使用動物油、植物油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍膠(tragacanth)、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧(silicone)、膨潤土(bentonite)、矽石(silica)、滑石、氧化鋅等來作為載體成分。此外，當製劑為粉劑或噴霧劑的情況下，乳糖、滑石、矽石、氫氧化鋁、矽酸鈣，或聚醯胺粉末可用作載體成分，特別是在噴霧劑的情況下，可使用附加的推進劑，例如，氯氟烴(chlorofluorohydrocarbon)、丙烷/丁烷，以及二甲醚。此外，當製劑為溶液劑或乳液劑時，可使用溶劑、增溶劑或乳化劑作為載體成分，例如，可使用水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、3-丁二醇油的脂肪酸酯、甘油脂族酯、聚乙二醇，或山梨醇酐。並且，當製劑是混懸劑時，液體稀釋劑，例如，水、乙醇、丙二醇，以及乙氧基化異硬脂醇(ethoxylated isostearyl alcohol)、懸浮液，例如，聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂、黃蓍膠等可用作載體成分。此外，當上述配方為含有界面活性劑的清潔劑時，可使用脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇醚硫酸鹽、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌胺酸鹽、脂肪酸醯胺醚硫酸鹽、烷基醯胺甜菜鹼、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇醯胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等作為載體成分。

依據本揭示內容的某些實施方式，該組合物作為保健功能食品使用時，除了活性成分之外，還可以加入常用於保健功能食品中的成分，舉例來說，當製成保健功能飲料時，另可加入檸檬酸、寡糖、牛磺酸、濃縮果汁等。

2. 本揭示內容組合物的用途

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以增加一個體之肌肉強度或運動協調性；減少肌肉無力、失去平衡，或皮膚皺紋；或改善一血液生化參數(即，與老化相關的症狀或疾病)的方法，包含對該個體投予一有效量之上述組合物，其中包含補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮；以及一藥學上可接受的載體。

該藥學組合物是約以0.01至1,000毫克/公斤體重的劑量來施用於該個體，例如，對該個體施用0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.30.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950，或1,000毫克/公斤體重的劑量；較佳地，對該個體約施用0.1至100毫克/公斤體重的劑量。依據本揭示內容的某些實施方式，本發明組合物是約以1-10毫克/公斤的劑量來施用於該有需要的個體。在一操作實施例中，本發明組合物是約以5毫克/公斤的劑量來施用於該個體。該劑量可以是以單分等分(aliquot)來施用，或者以多於一分等分來施用。本領域技術人員或臨床從業人員可依據病患的身體狀況或疾病的嚴重程度，來調整劑量或治療方案。

當可理解，在一個體罹患與老化相關的疾病的情況下，本揭示內容方法可對該個體單獨施用，或者與一種附加療法(例如，外科手術、物理治療(physical therapy或physiotherapy)、按摩、光療，或熱療)，或與一種對於治療與老化相關的症狀或疾病具有助益的附加藥物合併施用。視預期的治療目的的不同，本揭示內容方法可在施用該附加療法或該附加藥物的之前、同時，或之後來施用於該個體。

所述附加藥物可以是一抗高血壓藥物，例如，阿利吉崙(aliskiren)、阿米洛利(amiloride)、氨氯地平(amlodipine)、阿替洛爾(atenolol)、芐氟噻嗪(bendroflumethiazide)、布美他尼(bumetanide)、坎地沙坦(candesartan)、卡托普利(captopril)、可尼丁(clonidine)、迪太贊(diltiazem)、多薩坐辛(doxazosin)、呋塞米(furosemide)、聯胺肼(hydralazine)、氫氯苯噻(hydrochlorothiazide)、拉貝洛爾(labetalol)、賴諾普利(lisinopril)、洛沙坦(losartan)、甲基多巴(methyldopa)、美托洛爾(metoprolol)、米諾地爾(minoxidil)、硝苯地平(nifedipine)、尼莫地平(nimodipine)、苯氧苄胺(phenoxybenzamine)、苄胺唑啉(phentolamine)、普萘洛爾(propranolol)、雷米普利(ramipril)、螺甾內酯(spironolactone)、樟磺咪芬(trimetaphan)、纈沙坦(valsartan)，或維拉帕米(verapamil)；一抗發炎藥物，例如，阿巴西普(abatacept)、阿維A (acitretin)、阿達木單抗(adalimumab)、阿法西普(alefacept)、阿那白滯素(anakinra)、蒽酚(anthralin)、阿普司特(apremilast)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巴瑞替尼(baricitinib)、貝利單抗(belimumab)、貝那利珠單抗(benralizumab)、貝皮質醇(betamethasone)、比美珠單抗(bimekizumab)、布拉茲庫單抗(brazikumab)、布羅達單抗(brodalumab)、鈣泊三烯(calcipotriene)、鈣泊三醇(calcipotriol)、促鈣三醇(calcitriol)、卡那單抗(canakinumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、氯倍他索(clobetasol)、煤焦油(coal tar)、秋水仙素(colchicine)、環孢菌素(cyclosporine)、二胺苯碸(dapsone)、地蒽酚(dithranol)、地塞米松(dexamethasone)、杜匹盧單抗(dupilumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、依那西普(etanercept)、氟洛皮質醇(fluocinolone)、葛利木單抗(golimumab)、古塞庫單抗(guselkumab)、羥氯喹(hydroxychloroquine)、氫皮質酮(hydrocortisone)、英夫利昔單抗(infliximab)、伊克珠單抗(ixekizumab)、來那西普(lenercept)、美柏利單抗(mepolizumab)、胺甲喋呤(methotrexate)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、米利珠單抗(mirikizumab)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)、奧馬珠單抗(omalizumab)、普賴松(prednisone)、培拉珠單抗(perakizumab)、匹美克莫司(pimecrolimus)、瑞妥盧單抗(remtolumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、利羅那西普(rilonacept)、利莎珠單抗(risankizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、沙利姆單抗(sarilumab)、司庫奇尤單抗(secukinumab)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、他克莫司(tacrolimus)、他扎羅汀(tazarotene)、替達珠單抗(tildrakizumab)、托西珠單抗(tocilizumab)、托法替尼(tofacitinib)、視網酸(tretinoin)、烏帕替尼(upadacitinib)、優特克單抗(ustekinumab)、維多珠單抗(vedolizumab)，或烏那珠單抗(vunakizumab)；一抗骨質疏鬆藥物，例如，阿巴洛肽(abaloparatide)、阿崙膦酸鹽(alendronate)、阿法骨化醇(alfacalcidol)、抑鈣素(calcitonin)、鈣(calcium)、氯膦酸鹽(clodronate)、地諾單抗(denosumab)、艾地骨化醇(eldecalcitol)、依替膦酸鹽(etidronate)、伊班膦酸鹽(ibandronate)、米諾膦酸鹽(minodronate)、單氟磷酸鹽(monofluorophosphate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、副甲狀腺素(parathyroid hormone)、雷洛昔芬(raloxifene)、利塞膦酸鹽(risedronate)、羅莫索單抗(romosozumab)、氟化鈉(sodium fluoride，NaF)、特立帕肽(teriparatide)、維生素D3(vitamin D3)，或唑來膦酸(zoledronic acid)；一用以治療神經退化性疾病的藥物，例如，阿昔洛韋(acyclovir)、阿杜卡單抗(aducanumab)、金剛烷胺(amantadine)、阿樸嗎啡(apomorphine)、貝可芬(baclofen)、碳度巴(carbidopa)、單挫林(dantrolene)、多奈哌齊(donepezil)、恩他卡朋(entacapone)、膦甲酸(foscarnet)、加蘭他敏(galantamine)、左旋多巴(levodopa)、美金剛(memantine)、噴昔洛韋(penciclovir)、普拉克索(pramipexole)、雷沙吉蘭(rasagiline)、利鲁唑(riluzole)、卡巴拉汀(rivastigmine)、羅匹尼羅(ropinirole)、希利治林(selegiline)、他克林(tacrine)、丁苯那嗪(tetrabenazine)、替扎尼定(tizanidine)，或托卡朋(tolcapone)。

需要注意的是，在本揭示內容方法的治療期間，可以是以不同的劑量、時間間隔、經由不同的途徑對該個體施用不同的療法或治療劑。劑量和時間間隔可能因如上文所述的因素而異，並視從業人員的專業考慮而定；並且所述途徑可以是經由口服、腸內、口腔、鼻腔、經皮、經黏膜、靜脈內、腹膜內、動脈內、皮內、皮下，以及肌肉內等途徑來給藥。

基本上，可藉由本揭示內容方法來治療的個體是一哺乳動物；較佳地，該個體是人類。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情況下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料與方法

1. 補骨脂的萃取和分離

將補骨脂乾果(5.4公斤)用乙醇在室溫下萃取四次(每次11公升)，接著用乙醇在70°C下萃取4小時，共5次(每次11公升)。將合併後的粗萃取物(1.4公斤)在H ₂O (842.38公克)和正己烷(557.62公克)之間依序分區(partitioned)。將該正己烷層藉由矽膠層析法，並使用正己烷和乙酸乙酯的混合物來分離，其中當正己烷：乙酸乙酯 = 5：1時可洗提出補骨脂寧和新補骨脂異黃酮。

2. 細胞培養

將HUVEC培養在M199培養基中，並補充4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES)、內皮細胞生長補充劑(endothelial cell growth supplement，ECGS；Millipore)、肝素、NaHCO ₃、L-麩醯胺、丙酮酸鈉，以及20％之胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；終濃度)。將HaCaT細胞培養DMEM中，並補充10％之FBS和2毫體積莫耳濃度(mM)之穀醯胺。使細胞生長在37°C下，含5％之CO ₂的大氣中，並定期繼代(passage)，以使細胞維持在低於90％的匯合度(confluency)。將細胞持續增殖直至老化，收集每一代的細胞以進行後續分析，並在繼代培養時同時確定其代數。族群倍增(PD)係以下式估算：PDL = 3.32 (log (收穫時的總活細胞數/接種時的總活細胞數)。

3. 西方墨點法分析

收集細胞並使其在含有1％之Triton X-100和蛋白酶抑製劑混合物的RIPA裂解緩衝液中裂解，並使用蛋白檢測套組來測量總蛋白濃度。將具有相同總蛋白量的裂解物樣本中的蛋白，以月桂基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide，SDS-PAGE)(10％之聚丙烯醯胺凝膠)來分離，並藉由免疫墨點法來分析。將抗-p21和抗-β-肌動蛋白(β-actin)的初級抗體用於檢測相應的蛋白。接著將與山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯的抗-小鼠IgG的二級抗體與膜一起反應，並依據製造商的使用操作說明，以化學發光反應來使蛋白呈色(visualized)。藉由軟體來進行蛋白定量。

4. 與老化相關的 (SA)-β-gal 染色

收集、洗滌HUVEC (具有90％之匯合度)，並用2％之甲醛和0.2％之戊二醛固定5分鐘。接著，將細胞進行染色，使細胞與一染色溶液(含40毫莫耳/公升之檸檬酸、磷酸鈉(pH 6.0)、1毫克/毫升之5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-gal，Sigma)、5毫莫耳/公升之亞鐵氰化鉀、5毫莫耳/公升之鐵氰化鉀、150毫莫耳/公升之NaCl，以及2毫莫耳/公升之MgCl ₂)在37°C下反應18小時。實驗結果係以顯微鏡觀察具有SA-β-gal陽性之細胞，並在至少三個獨立視野中計數超過300個細胞。

5.  DNA 斷裂分析

將HaCaT細胞接種到12孔盤(7 × 10 ⁴個細胞/孔)中，並與100微體積莫耳濃度(μM)之補骨脂寧或100 μM之新補骨脂異黃酮，或不加藥，培養24小時，接著將細胞照射UVB (30毫焦耳/公尺2(mJ/m ²))。將經照射的細胞收集、洗滌，並與1％之瓊脂糖凝膠溶液140微升(μl)在35°C下混和，然後施於載玻片上。將載玻片置於4°C下1小時以固化凝膠，浸入裂解緩衝液中至少1小時，然後浸入電泳液中40分鐘，接著在25伏特(V)下進行凝膠電泳20分鐘。將載玻片浸入中和溶液中5分鐘，用30微升之含DAPI的封固劑封片，並在螢光顯微鏡下觀察。實驗結果係以軟體OPEN COMET來進行分析，以量化細胞中的DNA斷裂和修復情形。

6. 細胞凋亡分析

將HaCaT細胞接種到12孔盤(7 × 10 ⁴個細胞/孔)中，並與5 μM之補骨脂寧或20 μM之新補骨脂異黃酮，或不加藥，培養4小時，接著將細胞照射UVB (14毫焦耳/公尺 ²) 4次。24小時後，將經照射的細胞收集、洗滌，並用4％之聚甲醛(paraformaldehyde)固定，然後在室溫下浸入0.5％之結晶紫溶液15分鐘。將細胞洗滌、風乾、照相，並浸入含有0.1％之冰醋酸的50％之乙醇中，以去除結晶紫染料。用微量盤讀取儀讀取550奈米的吸光度。

7. 細胞內 NAD ⁺ 含量

將HaCaT細胞接種到6公分的培養皿(4 × 10 ⁵個細胞/培養皿)中，並與5 μM之補骨脂寧或20 μM之新補骨脂異黃酮，或不加藥，培養24小時，接著收集細胞。將收集的細胞用250微升之用丁醇飽和的1 M之冰甲酸萃取，在冰上作用30分鐘。接著，將62.5微升之100％之TCA (重量/體積)加到每個樣本中，並將樣本在冰上再作用15分鐘。以14,000 ×g離心5分鐘使樣本沉澱，並將上清液轉移到另一個微量試管中。然後用125微升之20％之TCA洗滌沉澱物，並離心，將上清液與上述上清液合併。將合併的上清液用於以下測試。在分析的部分，將每個上清液樣本分成兩個樣本：實驗組(ADH組)樣本和控制組樣本，將各樣本都加到乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)的反應緩衝液(即，150微升之上清液，以及345微升之360 mM之Tris (pH 9.7)、240 mM之離胺酸、0.24％(體積/體積)之EtOH)中；將控制組加入5微升之ddH ₂O，而ADH組加入5微升之5毫克/毫升之ADH)。在30°C下反應20分鐘後，測量各樣本在340奈米的吸光度。每個上清液樣本中細胞的NAD ⁺值係由實驗組樣本(即乙醇ADH催化組)的值相對於對應的控制組樣本(即加水組，作為NADH基礎值)的值來確定。

8. 動物實驗

所有動物實驗步驟均符合相關規定，並依據長庚大學實驗動物照護和使用研究準則所核准的程序(程序#CGU15-150)來進行。將C57BL/6J雄性小鼠(34週齡)飼養在23±1°C、於45-65％的濕度下，並提供12小時/12小時的明/暗循環。在達到40週齡後，將小鼠任意分為兩組：第I組(HFD)，餵食脂肪含量為54％之HFD (n = 30)；以及第II組(HFD/C)，餵食含有補骨脂寧的HFD (1公克之補骨脂寧/1公斤之HFD)(或補骨脂寧的劑量為50毫克/公斤)(n = 30)。測試飼料的組成總結在表1中。

表1 測試飼料的組成

公克 / 公斤之飼料 組成	HFD	HFD/C
酪蛋白	254	254
纖維素	61	61
蔗糖	321	321
大豆油	10	10
無鹽乳酪	290	290
AIN-93G礦物質混合物	44.5	44.5
AIN-93維生素混合物	12.5	12.5
L-胱胺酸	4	4
酒石酸氫膽鹼	3	3
補骨脂寧	–	1
千卡/公克	5.016
CHO卡路里/總卡路里(％)	25.7
脂肪卡路里/總卡路里(％)	54.0
蛋白卡路里/總卡路里(％)	20.3

9. 藥物動力學分析

在補骨脂寧灌食(oral gavage)後1、3、6、9、12，以及15小時收集C57BL/6J雄性小鼠(n = 4)的血液樣本，然後從中分離出血清樣本。將各血清樣本(100微升)與冰冷的乙腈(150微升)在4°C下混和1小時，然後以15,000 ×g在4°C下離心15分鐘。離心後，收集上清液(150微升)，並加入150微升之ddH ₂O。將所得混合物以LC/FTMS系統進行分析。

10. 抬頭行為

使用OxyletPro系統(HFD：n = 6；HFD/C：n = 9)來對C57BL/6J雄性小鼠(在餵食含或不含補骨脂寧的HFD於35週後(即75週齡時))的抬頭行為進行分析。在監測代謝率之前，將小鼠單獨關籠24小時以適應上述系統。

11. 旋轉棒測試

將81週齡的C57BL/6J雄性小鼠進行旋轉棒測試。使小鼠習慣3天，在此期間將它們置於恆速(4每分鐘轉數(rpm))的旋轉棒上，並且每天必須在旋轉棒上停留1分鐘。每天測試包括五次試驗，各試驗之間休息10分鐘。加速試驗起始於旋轉棒的初始轉速4 rpm，並在5分鐘內加速到最大轉速40 rpm (HFD：n = 7；HFD/C：n = 5)。恆速試驗起始於旋轉棒轉速4 rpm，最長持續到200秒(HFD：n = 10；HFD/C：n = 8)。其間記錄持續時間，並計算每次試驗的平均持續時間。

12. 血清參數分析

為了確定空腹血糖值，使102週齡(n = 9)的C57BL/6J雄性小鼠禁食16小時。以切割尾尖來獲得血液樣本，並以ACCU-CHEK (Roche)來測量血糖。

將C57BL/6J雄性小鼠犧牲，在犧牲前(102週齡)(n = 5)收集其全血，以用於血清生化學檢測。以特定的試劑套組(Fortress Diagnostics)來測量血清LDL、TG，以及總膽固醇的值。以特定的試劑套組(Randox)來測量血清葡萄糖和高密度脂蛋白(HDL)的值。使用分析儀(Fuji Dri-Chem 4000i；Fujifilm，Tokyo，Japan)來測量血清AST和肌酸酐的值。

13. 統計分析和實驗再現性 (reproducibility)

以GraphPad Prism 6執行製圖和統計分析。所有的數值均以平均值±標準差來表示，並在圖式或圖式說明中提供精確的p值。在西方墨點法、SA-β-gal染色、抬頭行為，以及旋轉棒測試等實驗的部分，以學生式t檢定來確定其顯著性。在HUVEC之PDL的部分，以二因子變異數分析(two-way ANOVA)(多重比較)來確定其顯著性。各實驗至少進行三次獨立重複試驗。在小鼠模式存活曲線的部分，以葛漢-畢士羅-魏克生(Gehan-Breslow-Wilcoxon)檢定來確定其顯著性。

實施例 1 補骨脂寧和新補骨脂異黃酮的分離和鑑定

按「材料與方法」章節所述的程序，從補骨脂中萃取和純化出補骨脂寧和新補骨脂異黃酮。以NMR質子光譜法個別確認了所純化的化合物的身分(即補骨脂寧和新補骨脂異黃酮)。

補骨脂寧的NMR質子光譜如下：補骨脂寧：白色粉末；化學式：C ₂₀H ₁₆O ₄；MP: 245-255°C; UV λmax(MeOH) nm: 305, 247; IR νmax(KBr) cm-1: 3235, 2927, 1625, 1495, 1375, 1274, 1184 ESI-MS m/z: 321[M+1]+, 343 [M+Na]+, 359 [M+K]+; 1H-NMR (acetone-d6, 400 MHz) δH: 9.62 (1H, s, OH-7), 8.19 (1H, s, H-2), 8.06 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5), 7.38 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-6’), 7.32 (1H, s, H-2’), 7.01 (1H, dd, J = 8.8, 2.0 Hz, H-6), 6.91 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.77 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5’), 6.44 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-1’’), 5.77 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-2’’), 1.43 (6H, s, CH3, H-4’’,5’’); 13C-NMR (acetone-d6, 100 MHz) δC: 175.1 (C=O), 162.7 (C-7), 158.2 (C-9), 153.2 (C-4’), 152.9 (C-2), 131.3 (C-3’’), 130.1 (C-6’), 128.0 (C-5), 127.5 (C-2’), 125.3 (C-1’), 124.4 (C-3), 122.4 (C-4’’), 121.3 (C-3’), 118.1 (C-10), 116.1 (C-5’), 115.1 (C-6), 102.7 (C-8), 76.6 (C-2’’), 27.8 (C-5’’, 6’’)。

新補骨脂異黃酮的NMR質子光譜如下：新補骨脂異黃酮：白色粉末；化學式：C ₂₀H ₁₈O ₄；MP: 180-195°C; UV λ _max(MeOH) nm: 308, 259, 249; IR ν _max(KBr) cm ^-1: 3362, 3125, 2968, 2923, 1625, 1381, 1092, 858 ESI-MS m/z: 323 [M+1] ⁺; ¹H-NMR (DMSO- d ₆ , 400MHz) δ _H: 9.58 (1H, br.s, OH), 8.35 (1H, br.s, OH), 8.12 (1H, s, H-2), 8.08 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-5), 7.38 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-1’), 7.30 (1H, dd, J=8.0, 2.0 Hz, H-4’), 7.00 (1H, dd, J= 8.8, 2.0 Hz, H-6), 6.91 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-8), 6.88 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-5’), 5.40 (1H, t, J= 7.2 Hz, H-2’’), 3.38 (2H, d, J= 7.2 Hz, H-1’’), 1.75 (3H, s, CH ₃), 1.73 (3H, s, CH ₃)。

實施例 2 補骨脂寧和 / 或新補骨脂異黃酮對改善細胞老化的功效

2.1 族群倍增程度 (PDL)

以監測群體倍增程度(PDL)來研究實施例1的補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮對哺乳類細胞老化的影響。結果發現到，補骨脂寧可增加HUVEC的PDL (第1A圖)。

此外，據報導，p21和SA-β-gal為代表哺乳類細胞中複製衰竭(replicative exhaustion)的特徵，因此在此探究了補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮對p21和SA-β-gal表現的影響。參照第1B-1C圖，說明在晚期的HUVEC (即在PDL9的HUVEC)(而非在前/中期的HUVEC (即在PDL5的HUVEC))，在沒有給予補骨脂寧的情況下，p21的表現量增加，表示細胞處於細胞週期停滯的狀態；而在具有補骨脂寧的情況下，p21的表現量降低。此外，與沒有補骨脂寧的控制組相比，補骨脂寧還會導致在晚期的HUVEC (即在PDL9的HUVEC)中的SA-β-gal陽性老化細胞的數量減少(第1D圖)。總結上述，這些數據顯示，補骨脂寧可改善哺乳類細胞之細胞老化的情形。

2.2  DNA 斷裂和細胞凋亡

除了自然老化之外，生活中還有一些常見的因素，例如，紫外線(UV)照射等，可能會引起細胞老化，因此在本實施例中，以監測DNA斷裂和細胞凋亡的程度，來研究實施例1的補骨脂寧和新補骨脂異黃酮是否可防止由UVB所引發的細胞老化。實驗結果提供於第1E-1F圖中。

結果發現到，補骨脂寧和新補骨脂異黃酮都可完全抑制由UVB所引發的DNA斷裂(第1E圖)，說明預處理補骨脂寧或新補骨脂異黃酮可有效地防止細胞受到由UVB所引發的DNA斷裂。且第1F圖的結果明顯展示了補骨脂寧或新補骨脂異黃酮在UVB照射的壓力下顯著增加了細胞的存活率，說明對細胞預處理補骨脂寧或新補骨脂異黃酮可有效減少由UVB照射所造成的細胞凋亡。

2.3 細胞內 NAD ⁺ 含量

一些研究表明，細胞內NAD ⁺含量增加有助於改善與老化相關的疾病。有了這些知識，本實施例研究了補骨脂寧或新補骨脂異黃酮對細胞中的NAD ⁺含量的影響。實驗結果提供於第1G-1H圖中。

結果發現到，補骨脂寧和新補骨脂異黃酮都可個別提高細胞中的NAD ⁺含量，證明了補骨脂寧和新補骨脂異黃酮都可減緩細胞的老化程度。

實施例 3 補骨脂寧可延緩小鼠的老化進程

3.1 老年小鼠的存活率

本實施例檢測了補骨脂寧於延緩小鼠老化進程的能力。為此目的，使老年C57BL/6J小鼠(40週齡)在餘生中任意採食HFD或添加0.1％(重量/重量)之補骨脂寧的HFD (HFD/C)。實驗結果如第2A至2C圖所示。

如第2A圖所示，HFD組和HFD/C組小鼠的存活曲線在4週後(即44週齡)開始出現分歧，並且該分歧持續發散直到實驗結束。該實驗結果證實，與HFD組小鼠相比，HFD/C組小鼠總體展現出更高的存活率。到102週齡時，在餵食HFD的控制組中有63.3％的小鼠死亡，而在餵食HFD/C的實驗組中只有43.3％的小鼠死亡。該實驗結果證實，補骨脂寧補充劑可顯著延長餵食高脂飼料的老年小鼠的壽命。值得注意的是，在整個實驗過程中，兩組小鼠的體重和攝食量的軌跡並沒有出現分歧(第2B-2C圖)，表明延長壽命的益處是由於補骨脂寧(而非藉由減少熱量攝取)所帶來的。經由追蹤灌食補骨脂寧後在血液循環中的含量，來密切監測小鼠體內補骨脂寧的藥物動力學。表2總結在整個過程中的補骨脂寧平均血清含量的實驗結果，其中補骨脂寧的平均血清含量在灌食補骨脂寧後1小時達到0.68 μM，並在15小時仍維持在0.26 μM。按上述實驗結果，依據小鼠的攝食量來計算出補骨脂寧的每日劑量為50毫克/公斤體重，即平均體重為40公克的小鼠，每天大致攝食2公克之添加補骨脂寧(0.1％(重量/重量))的HFD。

這些數據表明，補骨脂寧補充劑可延緩老化進程，進而延長老年小鼠的壽命，即使在代謝壓力下亦是如此。

表2 在整個過程中的補骨脂寧平均血清含量

	灌食後的時間 ( 小時 )
	1	3	6	9	12	15
血清含量 (μM)	0.68 ± 0.05	0.50 ± 0.17	0.49 ± 0.14	0.54 ± 0.26	0.39 ± 0.18	0.26 ± 0.13

3.2 老年小鼠的身體變化

本實施例驗證了補骨脂寧對與年齡相關的身體失調的有利功效。以觀察抬頭行為(包括垂直活動力和行為)和旋轉棒測試(包括恆速或加速的旋轉棒)，以說明補骨脂寧對餵食HFD的老年小鼠之與年齡相關的身體機能失常的有利功效。實驗結果揭示於第2D至2F圖中。

結果發現到，與餵食HFD的小鼠相比，餵食HFD/C的小鼠表現出活動力有增加的情形(第2D圖)。旋轉棒測試揭示了實驗動物的肌肉強度和平衡等身體機能，用於檢查老年小鼠的運動協調性。依據第2E和2F圖，餵食HFD/C的小鼠表現出比餵食HFD的小鼠有更好的運動技能(即，具有更長的持續時間)，無論是在恆速或加速的旋轉棒測試中。

總結上述，這些實驗結果表明，補骨脂寧可改善與年齡相關的身體機能衰退(decline)。

3.3 老年小鼠的代謝變化

本實施例藉由監測包括空腹血糖、總膽固醇、LDL，以及和TG等幾個代謝參數，來檢測老年小鼠的代謝變化，以反映出在老化過程中與老化相關的病理風險。為此目的，收集了HFD/C組和HFD組(102週齡)中的每隻老年雄性小鼠的血液，並分析了其空腹血清參數。實驗結果提供於第3A-3F圖和表3中。

在血脂參數的部分，與餵食HFD的小鼠相比，餵食HFD/C的小鼠空腹血糖值、總膽固醇值、LDL值，以及TG值均有降低(第3A-3D圖，表3)。這些實驗結果證實，補骨脂寧可經由改善血脂參數來對抗老化，進而改善老年小鼠的整體健康狀況。

表3 餵食HFD和餵食HFD/C的小鼠的血清參數

	HFD	HFD/C	p 值
空腹血糖 ( 毫克 / 公合 (dl))	153.1 ± 5.9	125.4 ± 6.3	0.0058
總膽固醇 ( 毫克 / 公合 )	184.4 ± 17.37	110.9 ± 9.50	0.0037
LDL ( 毫克 / 公合 )	139.3 ± 7.82	107.7 ± 7.2	0.0151
HDL ( 毫克 / 公合 )	100.6 ± 8.25	92.7 ± 9.9	＞ 0.05
TG ( 毫克 / 公合 )	41.63 ± 6.5	26.06 ± 1.57	0.0486
AST ( 單位 / 公升 )	313.4 ± 38.4	139.7 ± 23.7	0.0006
肌酸酐 ( 毫克 / 公合 )	3.3 ± 0.6	0.5 ± 0.1	0.0001

此外，還評估了關於肝腎功能的標記：AST (肝損傷標記)和肌酸酐(腎功能標記)，而實驗結果提供在第3E-3F圖和表3中。

注意到，與餵食HFD的老年小鼠相比，餵食HFD/C的老年小鼠AST和肌酸酐值較低，說明補骨脂寧還可經由防止與老化相關的器官功能衰退來幫助延緩老化。

綜上所述，本揭示內容公開的數據表明，本揭示內容補骨脂寧和新補骨脂異黃酮在許多方面個別反映出具有抗老化特性，因此，補骨脂寧或新補骨脂異黃酮可用作一種用以治療與老化相關的症狀或疾病的潛力治療劑。

當可理解，上文有關實施方式的敘述僅作為例示性的實施方式，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可對其進行各種更動與修飾。上文的說明書、實施例和實驗數據對本揭示內容作為例示性之實施方式中的結構和使用方式做出完整的描述。儘管上文已描述本揭示內容中各樣的實施方式有一定程度的特性，或參照一或多個個別的實施方式，本發明所屬領域技術具有通常知識者仍可在不悖離本揭示內容精神和範圍情況下，對已揭示的實施方式進行眾多修改。

無

在參閱以下的詳細說明、申請專利範圍和附隨圖式後，本揭示內容和其他特徵、態樣和優點將更明顯易懂，其中：

第1A-1H圖是依據本揭示內容的實施方式，闡述補骨脂寧或新補骨脂異黃酮對細胞老化的影響。第1A圖為評估人類臍帶靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)於特定治療下，其族群倍增程度(population doubling level，PDL)的變化情形。第1B圖為闡述在PDL5或PDL9的HUVEC，於處理或不處理補骨脂寧後，其p21表現量的西方墨點法結果。第1C圖為總結第1B圖結果的散佈圖。第1D圖為闡述在PDL5或PDL9的HUVEC，於處理或不處理補骨脂寧後，其與老化相關的β半乳糖苷酶(senescence-associated (SA)-β-gal)-陽性的比率(％)的散佈圖結果。第1E-1F圖為闡述補骨脂寧或新補骨脂異黃酮對紫外線B (ultraviolet B，UVB)所誘發的DNA斷裂(第1E圖)和細胞凋亡(第1F圖)的影響的實驗結果。第1G-1H圖說明補骨脂寧(第1G圖)或新補骨脂異黃酮(第1H圖)對細胞內NAD ⁺量的影響；

第2A-2F圖闡述補骨脂寧對餵食高脂飲食(high-fat diet，HFD)的老年小鼠身體機能的影響。第2A-2C圖為餵食含或不含補骨脂寧的HFD的小鼠於存活率(第2A圖)、體重(第2B圖)，以及攝食量(第2C圖)的實驗結果。第2D圖是餵食含或不含補骨脂寧的HFD的小鼠於抬頭行為的實驗結果。第2E-2F圖是餵食含或不含補骨脂寧的HFD的小鼠於恆速旋轉棒測試(第2E圖)或加速旋轉棒測試(第2F圖)中的持續時間(latency to falling)的實驗結果；以及

第3A-3F圖說明補骨脂寧對餵食HFD的小鼠的血液生化參數的改善功效，其中所述血液生化參數為空腹血糖(第3A圖)、總膽固醇(第3B圖)、低密度脂蛋白(LDL)(第3C圖)、三酸甘油脂(TG)(第3D圖)、天門冬胺酸轉胺酶(AST)(第3E圖)，以及肌酸酐(第3F圖)。

Claims (4)

1. 一種用以增加一個體之肌肉強度或運動協調性(motor coordination)；減少肌肉無力、失去平衡(loss of balance)，或皮膚皺紋；或改善一血液生化參數(blood biochemical parameter)的方法，包含對該個體投予一有效量之補骨脂寧(corylin)和/或新補骨脂異黃酮(neobavaisoflavone)。
2. 如請求項1所述之方法，其中與一未接受補骨脂寧和/或新補骨脂異黃酮的控制組個體相比，該改善的血液生化參數為較低的空腹血糖(fasting blood glucose)值、較低的總膽固醇(total cholesterol)值、較低的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)值、相同或較高的高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)值、較低的三酸甘油脂(triglyceride，TG)值、較低的天門冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase，AST)值，或較低的肌酸酐(creatinine)值中的任一種。
3. 如請求項1所述之方法，其中該補骨脂寧和該新補骨脂異黃酮的投予量約分別為1-10毫克/公斤和1-10毫克/公斤。
4. 如請求項1所述之方法，其中該個體為人類。