TW202405010A - 抗人類ｓｅｍａ７ａ抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種功能性抗人類SEMA7A抗體等。本發明是有關於一種具有特定的CDR序列之針對人類SEMA7A的抗體或其抗體片段。

Description

抗人類ＳＥＭＡ７Ａ抗體
本發明是有關於一種針對人類SEMA7A的抗體或其片段、以及其用途。
人類SEMA7A(Semaphorin 7A)是一種GPI (glycosylphosphatidylinositol)錨定蛋白，全長由604個胺基酸組成，具有sema結構域及Ig-like結構域。SEMA7A參與免疫及神經系統的調節。已知Plexin C1及整合素β1是SEMA7A的受體，其中與整合素β1結合時，透過mitogen-activated protein (MAP)激酶路徑對軸突伸長及神經元萌發產生顯著的作用。此外，已知在活化的T細胞所表現之SEMA7A是透過α1β1整合素誘導單核球/巨噬細胞產生發炎性細胞激素(例如參照非專利文獻1)。進一步地，由於SEMA7A基因剔除小鼠表現出對接觸性過敏反應、實驗性自體免疫腦脊髓炎的發病抵抗性，這暗示者藉由透過α1β1整合素活化巨噬細胞以促進局部的發炎反應。
此外，已知SEMA7A與多種疾病有關。例如，已知在特發性肺纖維症(IPF)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)等之纖維症、克隆氏病、及過敏性皮膚炎等之發炎性疾病、類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、及薛格倫氏症候群等之自體免疫疾病、肺癌及乳癌等之各種癌症中，表現有SEMA7A的mRNA與蛋白質(例如，參照非專利文獻2)。
在肺癌的治療中，EGFR酪胺酸激酶抑制藥(EGFR-TKI)是優異的分子標靶用藥，但由於外顯子19的缺失突變(Del19)等之EGFR活性型基因突變，而使30%~40%的患者對治療表現出抵抗性而成為問題。例如在非專利文獻3中，如使用小鼠纖維母細胞(NIH3T3)、肺癌患者檢體之研究所示，SEMA7A在EGFR活性型基因突變的下游被誘導表現。此SEMA7A被鑑定為參與EGFR-TKI之治療抵抗性的分子。這件事從將CRISPR-Cas9系統所製作的SEMA7A基因剔除肺腺癌細胞株移植到免疫不全的小鼠中，因SEMA7A沒有表現而增加對EGFR-TKI的感受性中得到證明。
已知在乳癌細胞中，因SEMA7A的表現而使細胞增殖亢進(例如，參照非專利文獻4)。這件事從移植因短鏈髮夾RNA(shRNA)而使SEMA7A基因減弱(knock down)之乳癌細胞株的異體移植(Xenograft)模型中，因腫瘤的形成速度顯著降低而得到證明。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1] K Suzuki et al., Nature, vol.446, pp.680-684, 2007 [非專利文獻2] T Worzfeld et al., Nature Reviews Drug Discovery, vol.13, pp.603-621, 2014 [非專利文獻3] Y Kinehara et al., JCI Insight, vol.3 (24), 2018 [非專利文獻4] SE Tarullo et al., Oncogene, vol. 39, pp.2772-2785, 2020
[發明所欲解決之課題]
一般來說，當使用小鼠等之囓齒類來製作抗體的情況下，對於從哺乳類之間取得高度相似性的分子之抗體是困難的。亦即，當試圖以該分子(源自人類的分子)作為標靶，而使用囓齒類來製作抗體的情況下，存在有難以生產抗體的問題。
SEMA7A的受體之Plexin C1、整合素β1藉由與SEMA7A的sema結構域進行結合而表現出生理活性。亦即，為了使抗SEMA7A抗體具有功能性，較佳為結合於sema結構域而阻礙或抑制與Plexin C1、整合素β1之相互作用。其中，從相對於人類sema結構域的相似性的觀點來看，食蟹猴的相似性高達99.1%、小鼠的相似性高達90.1%、大鼠的相似性高達91.1%。因此，如此一來，針對SEMA7A的抗體被認為是不容易取得，進一步要製作具有阻礙或抑制上述相互作用之功能的抗體被認為是困難的。實際上本發明者等人已確認市售之針對SEMA7A的單株抗體之功能性的有無，具有明確之功能性的抗體並不存在。
在這種狀態下，期待能夠取得及開發具有功能性之抗人類SEMA7A抗體等。 [用以解決課題之手段]
本發明鑑於上述情況而作出，提供以下所示的抗人類SEMA7A抗體及其抗體片段、以及其用途(醫藥組成物等)等。
[1] 一種抗體，其為針對人類SEMA7A的抗體，其中 重鏈可變區域(VH)的互補性決定區域(CDR)1、CDR2及CDR3的胺基酸序列分別依序由： 序列編號(SEQ ID NO)10、11及12所示的胺基酸序列； 序列編號18、19及20所示的胺基酸序列； 序列編號22、23及24所示的胺基酸序列； 序列編號26、27及28所示的胺基酸序列； 序列編號30、31及32所示的胺基酸序列； 序列編號34、35及36所示的胺基酸序列； 序列編號38、39及40所示的胺基酸序列；或 序列編號42、43及44所示的胺基酸序列所構成；且 輕鏈可變區域(VL)的CDR1、CDR2及CDR3的胺基酸序列分別依序由序列編號14、15及16所示的胺基酸序列所構成。
[2] 一種抗體，其為針對人類SEMA7A的抗體，其中 重鏈可變區域(VH)的胺基酸序列由序列編號9、17、21、25、29、33、37或41所示的胺基酸序列所構成；且 輕鏈可變區域(VL)的胺基酸序列由序列編號13所示的胺基酸序列所構成。 [3] 如上述[1]或[2]所述的抗體，其為與人類SEMA7A的sema結構域結合的抗體。 [4] 如上述[1]~[3]中任一項所述的抗體，其中，抗體為人類抗體。
[5] 如上述[1]~[4]中任一項所述的抗體，其具有阻礙或抑制人類SEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用的活性。 [6] 如上述[1]~[5]中任一項所述的抗體，其中抗體為具有抗腫瘤活性者。 [7] 如上述[1]~[6]中任一項所述的抗體，其係用於治療或預防腫瘤者。
[8]如上述[6]或[7]所述的抗體，其中，腫瘤為選自由人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、及人類軟骨肉瘤所構成的群組中的至少1種。 [9] 如上述[1]~[5]中任一項所述的抗體，其係用於發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療或預防者。 [10] 如上述[9]所述的抗體，其中發炎性疾病為選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種；以及 自體免疫疾病為選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。
[11] 一種抗體片段，其源自於如上述[1]~[10]中任一項所述的抗體。 [12] 一種抗體或抗體片段-藥物複合體，其係藥物接合至如上述[1]~[10]中任一項所述的抗體、或接合至如上述[11]所述的抗體片段而得者。 [13] 如上述[12]所述的複合體，其中藥物是為有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性的化合物。
[14] 一種醫藥組成物，其包含如上述[1]~[10]中任一項所述的抗體、如上述[11]所述的抗體片段、及/或如上述[12]或[13]所述的複合體。 [15]如上述[14]所述的醫藥組成物，其係用於腫瘤的治療或預防者。 [16]如上述[15]所述的醫藥組成物，其中腫瘤為選自由人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、及人類軟骨肉瘤所構成的群組中的至少1種。
[17]如上述[14]所述的醫藥組成物，其係用於發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療或預防者。 [18] 如上述[17]所述的醫藥組成物，其中發炎性疾病為選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種；以及 自體免疫疾病為選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。 [19] 如上述[14]所述的醫藥組成物，其係用於阻礙或抑制人類SEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用者。
[20] 一種腫瘤的治療或預防方法，其包含將如上述[14]~[16]中任一項所述的醫藥組成物投予對象。 [21] 如上述[20]所述的方法，其中，腫瘤為選自由人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、及人類軟骨肉瘤所構成的群組中的至少1種。 [22] 一種發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療或預防方法，其包含將如上述[14]、[17]及[18]中任一項所述的醫藥組成物投予對象。 [23] 如上述[22]所述的方法，其中發炎性疾病為選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種；以及 自體免疫疾病為選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。
[24] 一種阻礙或抑制人類SEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用的方法，其包含將如上述[14]或[19]所述的醫藥組成物投予對象。 [25] 一種套組，其包含如上述[1]~[10]中任一項所述的抗體、如上述[11]所述的抗體片段、及/或如上述[12]或[13]所述的複合體，用於腫瘤的治療、預防或診斷。 [26] 如上述[25]所述的套組，其中腫瘤為選自由人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、及人類軟骨肉瘤所構成的群組中的至少1種。
[27] 一種套組，其包含如上述[1]~[10]中任一項所述的抗體、如上述[11]所述的抗體片段、及/或如上述[12]或[13]所述的複合體，用於發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療、預防或診斷。 [28] 如上述[27]所述的套組，其中發炎性疾病為選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種；以及 自體免疫疾病是選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。 [發明的效果]
根據本發明，可以提供結合人類SEMA7A，較佳為結合其sema結構域之高活性的功能性抗體。本發明之抗人類SEMA7A抗體可以阻礙或抑制人類SEMA7A與Plexin C1、整合素β1之間的相互作用；例如作為治療及預防藥物，對於特發性肺纖維症(IPF)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)等之器官纖維症；克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎等之發炎性疾病；類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群等之自體免疫疾病；以及肺癌、乳癌、口腔癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤等之各種癌症可以發揮效果。
以下，將詳細說明本發明。本發明的範圍不受這些說明所拘束，在不損害本發明的主旨的範圍內，除了以下的實例以外，也可以適當變更實施。 注意的是，本說明書包含本案主張的優先權基礎之日本專利申請第2022-054142號說明書(2022年3月29日申請)及日本專利申請第2022-173382號說明書(2022年10月28日申請)的全部內容。此外，本說明書引用的全部刊物，例如先前技術文獻、以及公開公報、專利公報及其他專利文獻，均作為參照而併入本說明書。
1. 對人類SEMA7A的抗體(抗人類SEMA7A抗體) (1) 抗原的調製 人類SEMA7A(以下也稱為hSEMA7A)的胺基酸序列(序列編號46)的資訊，例如在Uniprot的網站(https://www.uniprot.org/)的「Primary(citable)accession number：O75326」公告；或是在NCBI(GenBank)的網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的「Accession number：NP_003603」、「Accession number：O75326」公告。注意的是，編碼hSEMA7A的胺基酸序列的鹼基序列(序列編號45)的資訊，在NCBI(GenBank)的網站的「Accession number：NM_003612」公告。
作為抗原，可以使用包含hSEMA7A的胺基酸序列的全部或一部分的多肽或胜肽(以下簡稱為胜肽)。作為包含hSEMA7A的胺基酸序列的一部分的胜肽，沒有特別限定，但例如較佳為包含hSEMA7A的胞外結構域的胜肽，更佳為包含sema結構域的胜肽。該sema結構域是由hSEMA7A的胺基酸序列(序列編號46)中第53個至第490個胺基酸所構成的結構域。 作為抗原之胜肽的製作方法，可以是化學合成或使用大腸桿菌等通過基因工程技術合成，並且可以使用發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知的方法。 進行胜肽的化學合成時，可以通過胜肽合成的習知方法來進行。此外，該合成可以適用固相合成法及液相合成法中任一者。也可以使用市售的胜肽合成裝置(例如CEM Japan：平行型自動胜肽合成裝置MultiPep 2等)。
通過基因工程合成胜肽時，首先要設計及合成編碼該胜肽的DNA。該設計及合成例如可以將包含全長hSEMA7A基因的載體等作為模板，使用設計為可合成所期望之DNA區域的引子，並藉由PCR法來進行。此外，基於該胜肽的胺基酸序列，可以在5'末端插入Kozak轉譯起始序列、在3'側插入轉譯終止密碼子的DNA以進行基因合成(利用GENEWIZ公司的服務等)。然後，將該DNA與適當的載體連接，藉此得到用於蛋白質表現的重組載體，藉由將該重組載體以使目標基因可以表現的方式導入宿主中而得到轉形體。(Molecular cloning 4th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012))。
將在宿主微生物中可以自律地增殖的噬菌體或質體用作載體。進一步地，也可以使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體的製作可以通過以適當的限制酶切斷經純化的DNA，將其插入適當的載體DNA的限制酶切位點等以將其與載體連結。作為用於轉形的宿主，只要可以表現目標基因即不受到特別限制。例如可列舉：細菌(大腸桿菌、枯草桿菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆蟲細胞或昆蟲。山羊等哺乳動物也可作為宿主。將重組載體導入宿主的方法是習知的。然後，培養前述轉形體，從該培養物中採取用作抗原的胜肽。所謂的「培養物」是指(a)培養上清液，(b)培養細胞或培養菌體或其碎屑之任一者。
培養後，當目標胜肽在菌體內或細胞內生產的情況下，則藉由使菌體或細胞破碎來提取胜肽。或者，當目標胜肽在菌體外或細胞外生產的情況下，可以直接使用培養液，或藉由離心分離等除去菌體或細胞。之後，藉由使用一般用於胜肽分離純化之生物化學的方法，例如硫酸銨沉澱、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等之單獨使用或適當組合，可以分離純化目標胜肽。
也可以藉由使用無細胞合成系之 in vitro轉譯以獲得作為抗原之胜肽。在此情況下，可以使用兩種方法：以RNA為模板的方法及以DNA為模板的方法(轉錄/轉譯)。作為無細胞合成系，可以使用市售的系統，例如可以使用Expressway TM系統(Invitrogen公司)、PURESYSTEM(註冊商標；Post Genome Research Institute)、TNT系統(註冊商標；Promega公司)等。 如上述所獲得的胜肽亦可與適當的載體蛋白質，例如牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)、人類甲狀腺球蛋白、雞的γ球蛋白等結合。
此外，抗原可以是由在hSEMA7A的胺基酸序列(序列編號46)或其部分序列中，缺失、取代或添加1個或複數個胺基酸的胺基酸序列所構成之胜肽。例如，可以使用由hSEMA7A的胺基酸序列或其部分序列中的1個或複數個(較佳為1個或數個(例如1個~10個，進一步較佳為1個~5個))的胺基酸缺失、1個或複數個(較佳為1個或數個(例如1個~10個，進一步較佳為1個~5個))的胺基酸被其他胺基酸取代、或者添加有1個或複數個(較佳為1個或數個(例如1個~10個，進一步較佳為1個~5個))之其他胺基酸的胺基酸序列所構成的胜肽。
作為用於導入細胞等之基因，可列舉：編碼hSEMA7A蛋白質或其部分片段、或編碼其突變型的蛋白質或其片段之基因。作為這樣的基因，例如可以使用具有如序列編號45所示的鹼基序列或其部分的序列者。 此外，作為用於導入細胞等之基因，也可以使用編碼與序列編號45所示的鹼基序列互補的序列，且在嚴格的條件下雜交並具有與hSEMA7A相同活性的蛋白質之鹼基序列、或其部分序列。
所謂的「嚴格的條件」是指雜交後的清洗時的條件，其中緩衝液的鹽(鈉)濃度為10~500mM，溫度為42℃~72℃。較佳為上述鹽濃度為50~300mM，溫度為55~68℃的條件。 為了將突變導入基因，可以藉由Kunkel法、Gapped duplex法等之習知手段，例如使用利用定點突變法而用於將突變導入的套組，如GeneArt™ Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司製造)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：takara bio公司製造)來進行。
(2) 多株抗體的製作 將調製的抗原投予哺乳動物以進行免疫。哺乳動物沒有特別限制，例如可列舉：大鼠、小鼠及兔子等，其中較佳為小鼠。 投予每隻動物的抗原量可以根據佐劑的有無而適宜地設定。作為佐劑，可列舉：佛氏完全佐劑(FCA)、佛氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑等。免疫主要可以藉由靜脈內、腳掌、皮下、腹腔內等注射的方式來進行。此外，免疫的間隔沒有特別限定，可以是從數天至數週的間隔，較佳為1週的間隔進行1~10次免疫，較佳為進行2~3次免疫。然後，在最終的免疫日後3~7天，使用酵素免疫測定法(ELISA或EIA)、放射性免疫測定法(RIA)等來測定抗體價，可以在欲顯示所期望之抗體價的當天採血，以獲得抗血清。關於上述抗體的採取方法中，當需要純化抗體的情況下，可以適當選擇或組合使用硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等習知的方法，藉此進行純化。之後，以ELISA法等來測定抗血清中的多株抗體的反應性。
(3) 單株抗體的製作 (3-1)抗體產生細胞的採取 本發明的抗hSEMA7A抗體較佳為單株抗體，但本發明不限於此。 將調製的抗原投予哺乳動物以進行免疫，例如大鼠、小鼠及兔子等。投予每隻動物的抗原量可以根據佐劑的有無而適宜設定。佐劑如同上述。免疫手法也如同上述。然後，在最終免疫日後1~60天，較佳為1~14天，採取抗體產生細胞。作為抗體產生細胞，可列舉：脾臟細胞、淋巴節細胞及末梢血細胞等，但其中較佳為淋巴節細胞及脾臟細胞。
(3-2) 細胞融合 為了獲得融合瘤(抗體產生細胞株)，將抗體產生細胞及骨髓瘤細胞進行細胞融合。作為與抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞，可以使用小鼠等動物之一般可以獲得的株化細胞。作為所使用的細胞株，較佳為具有藥劑選擇性，具有在未融合的狀態將無法在HAT選擇培養基(包含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷)中生存，只有在與抗體產生細胞融合的狀態才能生存的性質者。 作為骨髓瘤細胞，例如可列舉：P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63-Ag8.U1(P3U1)、P3/NS I/1-Ag4-1 (NS1)及Sp2/0-Ag14(Sp2/0)等之小鼠骨髓瘤細胞株。骨髓瘤細胞的選擇可以藉由適宜考慮與抗體產生細胞的相容性來進行。
接著，將骨髓瘤細胞及抗體產生細胞進行細胞融合。細胞融合是在不含血清之DMEM及RPMI-1640培養基等之動物細胞用培養基中，將1×10 6~1×10 7個/mL之抗體產生細胞與2×10 5~2×10 6個/mL之骨髓瘤細胞進行混合。抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的細胞比(抗體產生細胞：骨髓瘤細胞)沒有特別限制，但通常較佳為1:1~10:1，更佳為3:1。接著，在細胞融合促進劑的存在下進行融合反應。作為細胞融合促進劑，例如可以使用平均分子量為1,000~6,000道爾頓(D)的聚乙二醇等。又，亦可使用利用電刺激(例如，電穿孔)的市售之細胞融合裝置來使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞進行融合。
(3-3) 融合瘤的篩選與選殖 從細胞融合處理後的細胞中篩選目標融合瘤。作為其方法，是將細胞懸浮液，以例如含有胎牛血清之RPMI-1640培養基等來適當稀釋後，接種於微量滴定盤上，每孔加入選擇培養基，之後適當地更換選擇培養基以進行培養。其結果，從在選擇培養基中培養開始後約14天前後可以獲得生育出的細胞來作為融合瘤。 接著，從經增殖的融合瘤的培養上清液中，篩選是否存在與hSEMA7A反應的抗體。融合瘤的篩選可以按照常規方法進行，沒有特別限制。例如，可以採取作為融合瘤之生育的孔中所包含的培養上清液的一部分，並通過ELISA、EIA、以及RIA等來進行篩選。 融合細胞的選殖可以藉由極限稀釋法等來進行。藉由流式細胞儀等來判定與hSEMA7A表現出強烈反應性的抗體，並選擇產生此的融合瘤以樹立殖株。
(3-4) 單株抗體的採取 培養經樹立的融合瘤，並作為從所得之培養物中採取單株抗體的方法，可以採用通常的細胞培養法、或腹水形成法等。所謂的「培養」是指將融合瘤在培養皿或培養瓶中使其生育，或者是將融合瘤如下述般在動物的腹膜內增殖的意思。 在細胞培養法中，融合瘤是在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基、MEM培養基或無血清培養基等的動物細胞培養基中，在通常的培養條件(例如37℃、5% CO 2濃度)下培養7~14天後，可從其培養上清液中取得抗體。
在腹水形成法的情況下，將與源自骨髓瘤細胞的哺乳動物之同種系動物的腹腔內投予約1×10 7個融合瘤，使融合瘤大量增殖。然後，較佳為在2~3週採取腹水。 在上述抗體的採取方法中，在需要純化抗體的情況下，可以適當選擇或組合使用硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等習知的方法，藉此進行純化。
(3-5)具有功能性之殖株的篩選 (3-5-1)本發明的抗hSEMA7A抗體，例如較佳為具有阻礙或抑制hSEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用(較佳為結合)的活性的抗體。 其中，hSEMA7A與整合素β1之間的相互作用之阻礙或抑制活性(%)例如可以藉由下述算式來算出。 阻礙或抑制活性(%)=100-(添加抗體時的發光強度/不添加抗體時的發光強度)×100 此外，hSEMA7A與Plexin C1之間的相互作用的阻礙或抑制活性(%)例如可以藉由下述算式來算出。 阻礙或抑制活性(%)=100-(添加抗體時的OD450/不添加抗體時的OD450)×100
(3-5-2)本發明的抗hSEMA7A抗體例如較佳為具有抗腫瘤活性的抗體。 其中，所謂的「抗腫瘤活性」是指使腫瘤細胞(癌細胞)死滅之活性或抑制腫瘤成長的活性。作為抗腫瘤活性，較佳為例如可列舉：癌細胞增殖抑制活性、腫瘤血管新生抑制活性。此外，作為本發明的抗體之發揮抗腫瘤活性的人類腫瘤(腫瘤細胞)的種類，可列舉已確認hSEMA7A的表現之習知的各種人類腫瘤，沒有特別限定。具體地，作為該人類腫瘤，可列舉：人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、人類軟骨肉瘤、人類胃癌、人類胰臟癌、人類皮膚癌、人類卵巢癌、人類大腸癌、人類膀胱癌、人類肝癌、人類食道癌、前列腺癌、以及人類膽道癌等之各種人類腫瘤中的1種或2種以上，更佳為人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、以及人類軟骨肉瘤。此外，作為人類肺癌，可列舉：非小細胞肺癌，更佳為觀察到EGFR(上皮生長因子受體)基因中的活化突變的非小細胞肺癌。進一步地，作為上述腫瘤的種類，可以是復發性癌症、轉移性癌症，本發明的抗體也可以對這些腫瘤表現出優異的抗腫瘤活性。
在 in vivo對抗腫瘤活性的確認，例如可以使用經皮下移植所期望的腫瘤細胞的荷癌小鼠(荷癌動物治療模型)，藉由將上述獲得的抗體投予此小鼠來進行。在此情況下，抗體的投予可以在腫瘤細胞移植後立即進行(prevention模型)，也可以在確認經移植之腫瘤已達到預定的體積後再進行(treatment模型)。投予的方法沒有特別限制，例如可以是每3天、1週、10天或2週投予一次，或者以5~20mg/kg體重的劑量投予至腹腔內單次(僅一次)等。在prevention模型的情況下，可以根據腫瘤形成頻率及腫瘤體積來評價抗腫瘤活性的有無及程度。在treatment模型的情況下，可以根據腫瘤體積來評價抗腫瘤活性的有無及程度。
荷癌動物模型中的腫瘤成長抑制活性較佳為在較低的劑量下顯示，例如，對於荷癌動物模型，投予的劑量較佳為20mg/kg體重以下(較佳為10mg/kg體重以下，更佳為5mg/kg體重以下，進一步較佳為1mg/kg體重以下)。 其中，腫瘤成長抑制活性(%)例如可以藉由下述算式來算出。 腫瘤成長抑制活性(%)= 100 - [(抗體投予組的腫瘤體積或腫瘤重量)÷(對照組的腫瘤體積或腫瘤重量)] × 100
(3-5-3)本發明的抗hSEMA7A抗體較佳為例如可用於治療或預防腫瘤的抗體、可用於治療或預防發炎性疾病及/或自體免疫疾病的抗體。 其中，作為腫瘤，可以同樣適用上述各種人類腫瘤的說明。 作為發炎性疾病，沒有特別限制，較佳為例如可列舉：選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種。 作為自體免疫疾病，沒有特別限制，較佳為例如可列舉：選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。
(3-5-4)本發明的抗hSEMA7A抗體，例如，其對表現有hSEMA7A的細胞內具有優異的內化活性。細胞內之內化活性可以藉由以羅丹明等螢光來標記抗體，並藉由使用螢光顯微鏡等觀察向細胞內的移動行為及抗體的定位來進行評價。該活性之計算方法，例如可以參照圖12A的說明。
(3-6)抗hSEMA7A抗體的抗原決定位 本發明中抗hSEMA7A抗體的抗原決定位(抗原決定基)只要是作為抗原之hSEMA7A的至少一部分區域即可，較佳為hSEMA7A的胞外結構域的至少一部分區域，更佳為sema結構域的至少一部分區域。識別前述區域(結合前述區域或包含前述區域的部分)之抗hSEMA7A抗體，例如，可以藉由如下述之抗hSEMA7A抗體的特性更有效地發揮而有用。 此外，可以與本發明的抗hSEMA7A抗體結合(識別)的抗原決定位區域進行結合的抗體也包含在本發明中。
本發明的抗hSEMA7A抗體的解離常數(Kd值)沒有特別限定，較佳為1.0×10 -10M以下，更佳為1.0×10 -11M以下，進一步較佳為1.0×10 -12M以下。其中，抗體的結合能力(親和性)，例如可以藉由SCATCHARD解析、被稱為Biacore的表面電漿子共振感測器來測定解離常數(Kd值)、解離速率常數(Kdiss[1/Sec])，結合速度常數(Kass[1/M.Sec])。作為Biacore裝置，例如可列舉：Biacore 3000、Biacore 2000、Biacore X、Biacore J、Biacore Q(均來自Biacore公司)等。抗體因解離常數(Kd值)越小而結合能力(親和性)越高此點而較佳。Kd值藉由Kdiss及Kass之2個的參數來決定，例如可以藉由式：Kd[M]=Kdiss/Kass來表示。
(4) 基因重組抗體、以及抗體片段 (4-1) 基因重組抗體 本發明的抗hSEMA7A抗體的較佳態樣之一可列舉是基因重組抗體。作為基因重組抗體沒有特別限制，但例如可列舉：嵌合抗體、人型化抗體(人源化抗體)、以及人抗體(完全人抗體)等。 嵌合抗體(即人型嵌合抗體)是將源自小鼠之抗體可變區域、與源自人類之恆定區進行連結(接合)的抗體(參照Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984)等)，當製作嵌合抗體的情況下，為了獲得如上述般連結的抗體，可以容易地藉由基因重組技術構築而獲得。
當製作人源化抗體時，從小鼠抗體的可變區域將互補性決定區域(CDR)移植到人類的可變區域，由源自於人類之架構區(FR)、源自於小鼠之CDR所構成，製作再構成之可變區域(即所謂的CDR嫁接(CDR移植))。接著，將這些人源化之再構成的人類可變區域連結至人類恆定區。如此般製作人源化抗體的方法是本技術領域眾所周知的(參照Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)；日本專利特表平4-502408號公報(特許第2828340號公報；奎因等人)等)。
人抗體(完全人抗體)一般在V區域的抗原結合部位之高變異區(Hyper Variable region)、V區域的其他部分、以及恆定區的結構，具有與人類的抗體相同結構。然而，高變異區可以是源自其他動物。製作人抗體的技術也是已知的，並且已經確立藉由基因工程技術製作人類共通之基因序列的方法。人抗體例如可以藉由使用具有包含人抗體的H鏈及L鏈之基因的人類染色體片段之人抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727 等)、從人抗體資料庫篩選之取得源自噬菌體展現之人抗體的方法(參照Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002)109 (3), 427-431等)而取得。
此外，人抗體使用人ADLib技術(記載於WO 2015/167011的資料庫)，可以使用從與所期望的抗原(在本發明中為hSEMA7A)特異性結合之植株所產生(經進一步純化)的抗體、改變該抗體的胺基酸序列(特別是VH、VL的胺基酸序列，較佳為VH、VL中的至少1個之CDR序列)的抗體(較佳為經胺基酸取代的抗體)。
作為本發明的抗hSEMA7A抗體，例如較佳為可列舉： VH的CDR1、CDR2及CDR3的胺基酸序列分別依序由： 序列編號10、11及12所示的胺基酸序列； 序列編號18、19及20所示的胺基酸序列； 序列編號22、23及24所示的胺基酸序列； 序列編號26、27及28所示的胺基酸序列； 序列編號30、31及32所示的胺基酸序列； 序列編號34、35及36所示的胺基酸序列； 序列編號38、39及40所示的胺基酸序列；或 序列編號42、43及44所示的胺基酸序列所構成；且 VL的CDR1、CDR2及CDR3的胺基酸序列分別依序由：序列編號14、15及16所示的胺基酸序列所構成的抗體等。
並且作為本發明的抗hSEMA7A抗體之更佳態樣，例如較佳為可列舉： VH的胺基酸序列由序列編號9、17、21、25、29、33、37或41所示的胺基酸序列所構成，並且 VL的胺基酸序列由序列編號13所示的胺基酸序列所構成的抗體等。
上述的嵌合抗體、人源化抗體及人抗體，較佳為抗體Fc區域中結合有N-糖苷之複合型糖鏈於該糖鏈的還原末端之N-乙醯葡糖胺上不鍵結有岩藻糖的糖鏈，具體來說，可列舉於抗體分子之Fc區域具有該岩藻糖的1位不與結合有N-糖苷之複合型糖鏈的還原末端之N-乙醯葡糖胺的6位進行α鍵結的糖鏈的基因重組抗體分子所構成之抗體。只要是如此般的抗體，即可以提升ADCC活性。注意的是，此點(抗體Fc區中結合有N-糖苷之複合型糖鏈的特徵)，對於上述多株抗體及單株抗體也是同樣較佳的。
(4-2) 抗體片段 本發明的抗hSEMA7A抗體的片段(部分片段)也包含在本發明的抗體中。其中，本發明的抗體片段與本發明的抗hSEMA7A抗體同樣，具有與hSEMA7A(較佳為sema結構域)結合的活性(即能夠與hSEMA7A結合)。較佳地，具有上述之阻礙或抑制SEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用(較佳為結合)的活性、具有抗腫瘤活性。進一步較佳地，其可以用於上述之腫瘤的治療或預防、發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療或預防。
作為該抗體的片段，是指抗hSEMA7A多株抗體或抗hSEMA7A單株抗體的部分區域(亦即，源自本發明之抗hSEMA7A抗體的抗體片段)，例如，Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv(variable fragment of antibody)、單股抗體(H鏈、L鏈、H鏈V區、以及L鏈V區等)、scFv、diabody(scFv二聚物)、dsFv(二硫醚安定化V區)，以及至少包含一部分互補性決定區域(complementarity determining region：CDR)的胜肽等。
Fab是將抗體分子以蛋白質分解酵素之木瓜蛋白酶處理而獲得之片段中，將H鏈的N末端側約一半與L鏈全體以雙硫鍵進行結合，是分子量約5萬之具有抗原結合活性的抗體片段。或者，可以將編碼抗體的Fab的DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，藉由將該載體導入原核生物或真核生物中使其表現以製造Fab。 F(ab') 2是將抗體分子以蛋白質分解酵素之胃蛋白酶處理而獲得之片段中，比Fab之透過鉸鏈區的雙硫鍵所結合的抗體片段略大，是分子量約10萬之具有抗原結合活性的抗體片段。此外，也可以將後述的Fab進行硫醚鍵結合或雙硫鍵結合來製作。
Fab'是將上述F(ab') 2之鉸鏈區的雙硫鍵切斷，是分子量為約5萬之具有抗原結合活性的抗體片段。或者，可以將編碼抗體的Fab'片段之DNA，插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該載體導入原核生物或真核生物中表現以製造Fab'。 scFv是使用適當的胜肽連接子(P)將一條重鏈可變區域(VH)及一條輕鏈可變區域(VL)連結，成為VH-P-VL或VL-P-VH之胜肽，是具有抗原結合活性的抗體片段。scFv可以藉由取得編碼抗體的VH及VL之cDNA，構築編碼scFv之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體導入原核生物或真核生物使其表現來製造。
diabody是scFv經二聚化之抗體片段，具有雙價抗原結合活性的抗體片段。雙價抗原結合活性可以相同，也可以是一方為不同之抗原結合活性。diabody可以藉由取得編碼抗體VH及VL的cDNA，以胜肽連接子(P)的胺基酸序列長度成為8個殘基以下的方式構築編碼scFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體導入原核生物或真核生物使其表現來製造。
dsFv是將VH及VL中各一個胺基酸殘基以半胱胺酸殘基進行取代，透過該半胱胺酸殘基之間的雙硫鍵結合而成之胜肽。取代為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可以按照Reiter等所示的方法(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)，基於對抗體的立體結構來預測而選擇。dsFv可以藉由取得編碼抗體VH及VL的cDNA，構築編碼dsFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體導入原核生物或真核生物使其表現來製造。
包含CDR的胜肽由包含VH的CDR(CDR1~3)及VL的CDR(CDR1~3)中的至少1區域以上所構成，較佳為包含所有VH的CDR、及包含所有VL的CDR，更佳為包含所有VH及VL的CDR(共6區域)。作為CDR的胺基酸序列，較佳為可列舉：上述之VH及VL的CDR1~3的各種胺基酸序列。包含複數個CDR的胜肽可以是直接或透過適當的胜肽連接子來結合。包含CDR的胜肽可以藉由構築編碼抗體VH及VL的CDR之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體導入原核生物或真核生物使其表現來製造。此外，包含CDR的胜肽也可以藉由Fmoc法(茀基甲基氧羰基法)及tBoc法(第三丁氧羰基法)等之化學合成法來製造。
作為本發明的抗體片段，可以是結合有N-糖苷之複合型糖鏈、該糖鏈的還原末端之N-乙醯葡糖胺不鍵結有岩藻糖的糖鏈之抗體Fc區，包含保持原狀之上述抗體Fc區的一部分或全部的抗體片段，或者，也可以是將上述之抗體片段、與結合有N-糖苷之複合型糖鏈、該糖鏈的還原末端之N-乙醯葡糖胺不鍵結有岩藻糖的糖鏈之抗體Fc區的一部分或全部進行融合之蛋白質。只要是如此般的抗體片段，由於可以飛躍性地提升ADCC活性而較佳。 以下，在本說明書的記載中，上述抗體片段也包含在本發明的抗hSEMA7A抗體。
2. 多核苷酸、重組載體及轉形體 本發明也可以提供編碼上述之本發明的抗hSEMA7A抗體、其抗體片段的多核苷酸(基因、DNA)。具體而言，該多核苷酸較佳為包含編碼上述之本發明的抗hSEMA7A抗體、抗體片段的實例之各胺基酸序列的鹼基序列的多核苷酸。此外，本發明的多核苷酸可以是僅由編碼本發明之抗hSEMA7A抗體、抗體片段的多核苷酸所構成，也可以是包含該多核苷酸作為其一部分，其他部分包含基因表現所必需之習知的鹼基序列(轉錄啟動子、SD序列、Kozak序列、終止子等)，並不受到限制。
作為編碼本發明的抗hSEMA7A抗體、抗體片段的多核苷酸，轉譯後的各個胺基酸所對應之密碼子沒有特別限制，可以是包含人類等哺乳動物轉錄後一般所使用的密碼子(較佳為使用頻率較高的密碼子)所表示的核苷酸DNA，或者也可以是包含大腸桿菌、酵母等微生物、植物等一般所使用的密碼子(較佳為使用頻率較高的密碼子)所表示的核苷酸DNA。 本發明中也可以提供包含上述之本發明的多核苷酸之重組載體、包含該重組載體的轉形體。
用作重組載體而整合於表現載體中的多核苷酸(基因、DNA)可以視需求在上游預先連結轉錄啟動子、SD序列(當宿主是原核細胞時)及Kozak序列(當宿主是真核細胞時)，可以在下游連結終止子，其他也可以連結增強子、剪接訊號、poly A加成訊號、選擇標記等。注意的是，該多核苷酸可以從一開始就包含上述轉錄啟動子等之基因表現所必需的各要素，也可以在表現載體原本就包含上述要素的情況下使用該表現載體，各要素的使用態樣沒有特別限定。
作為將該多核苷酸整合至表現載體的方法，例如可以採用使用限制酶的方法、使用拓撲異構酶的方法等習知的利用基因重組技術的各種方法。此外，作為表現載體，例如為質體DNA、噬菌體DNA、逆轉錄轉位子DNA、逆轉錄病毒載體、人工染色體DNA等，只要是能保持編碼本發明之抗hSEMA7A抗體、其抗體片段的多核苷酸(基因、DNA)即可，沒有特別限制，可以適當選擇使用適合宿主細胞的載體。
接著，將構築的上述重組載體導入宿主得到轉形體，藉由培養轉形體可以表現本發明之抗hSEMA7A抗體、其抗體片段。注意的是，本發明中的「轉形體」是指向宿主導入外源基因，例如包含藉由向宿主導入質體DNA等(轉形)而導入外源基因，以及，藉由將各種病毒及噬菌體感染宿主(轉導)而導入外源基因。 作為宿主，只要在導入上述重組載體後能夠表現本發明之抗hSEMA7A抗體、其抗體片段即可，沒有特別限定，可以適當選擇，但例如可列舉：人類、小鼠等的各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母、植物細胞等之習知的宿主。
當動物細胞作為宿主時，例如使用人類纖維母細胞、人類胎兒腎細胞、HEK293細胞、293F細胞、CHO細胞、猴細胞COS-7、Vero、小鼠L細胞、大鼠GH3、人類FL細胞等。此外，也可以使用Sf9細胞、Sf21細胞等之昆蟲細胞。 當細菌作為宿主時，例如使用大腸桿菌、枯草桿菌等。 當酵母作為宿主時，例如使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。 當植物細胞作為宿主時，例如使用煙草BY-2細胞等。
獲得轉形體的方法沒有特別限制，可以考慮宿主及表現載體的類型之組合來適當選擇。但例如較佳為可列舉：電穿孔法、脂轉染法、熱衝擊法、PEG法、磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、以及感染DNA病毒、RNA病毒等之感染各種病毒的方法。 在所得之轉形體中，重組載體中所含的多核苷酸的密碼子類型可以與所使用之宿主的密碼子類型一致，也可以不一致，沒有特別限制。
3. 抗體或抗體片段-藥物複合體 本發明可以提供作為使用上述本發明之抗hSEMA7A抗體、其抗體片段的免疫軛合物等，包含該抗體或抗體片段、藥物(較佳為藥物接合至該抗體或抗體片段)之抗體或抗體片段-藥物複合體。 作為上述藥物，沒有特別限制，但例如較佳為具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性的化合物，具體而言，例如可列舉： - 微管蛋白抑制劑及/或微管聚合抑制劑(更具體地說，Auristatins類(MMAE、MMAF等)、Maytansines類(DM1、DM4等)、Tubulysins類、cryptophycin類、rhizoxin等)； - 抗生素(更具體地說，Calicheamicin類、Doxorubicin、anthracycline類等)； - DNA合成抑制劑(更具體地說，Duocarmycin類、PBD (Benzodiazepine)類、IGNs(indolinobenzodiazepine)等； - 拓撲異構酶I抑制劑(更具體地說，Canptothecin類似物(SN-38、DXd等)等)； - RNA聚合酶II抑制劑(更具體地說，Amanitin類等)；以及 ・RNA剪接體抑制劑(更具體地說，spliceostatin類、thailanstatin類等)等。 此外，作為表現出抗腫瘤活性的藥物，例如也可以使用被光能激發並表現出毒性的化合物。注意的是，利用基因重組技術，將作為具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性的物質之蛋白質毒素，在基因上與抗體基因或抗體片段基因連結，作成一個蛋白質(融合蛋白質)並使其表現所獲得的產物一般稱為免疫毒素。
作為具有抗腫瘤活性的物質，例如可列舉：艾黴素、卡奇黴素、絲裂黴素C、Auristatin E、吡咯并苯二氮(PBD)、放射性同位素(RI)等。作為具有殺細胞活性的物質，例如可列舉：皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、綠膿桿菌外毒素、白喉毒素、放射性同位素(RI)等。其中，較佳為使用皂草毒蛋白及綠膿桿菌外毒素。注意的是，具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性的RI，沒有特別限制，但例如可列舉： 90Y、 111In、 125I、 3H、 35S、 14C、 186Re、 188Re、 189Re、 177Lu、 67Cu、 212Bi、 213Bi、 211At、 198Au、 224Ac、 126I、 133I、 77Br、 113mIn、 95Ru、 97Ru、 103Ru、 105Ru、 107Hg、 203Hg、 94mTc、 121mTe、 122mTe、 125mTe、 165Tm、 167Tm、 168Tm、 111Ag、 197Pt、 109Pd、 32P、 33P、 47Sc、 153Sm、 177Lu、 105Rh、 142Pr、 143Pr、 161Tb、 166Ho、 199Au、 57Co、 58Co、 51Cr、 59Fe、 18F、 75Se、 201Tl、 225Ac、 76Br、 86Y、 169Yb、 166Dy、 212Pb及 223Ra等。
作為製作抗體或抗體片段-藥物複合體的方法，沒有特別限制，但例如可列舉：藉由雙硫鍵、腙鍵而將抗體或抗體片段與藥物偶合的方法。 如上所述，由於本發明之抗hSEMA7A抗體、其抗體片段對表現hSEMA7A的細胞內之內化活性優異，因此預先使用具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性的物質與該抗體或抗體片段進行複合化(接合)，藉此可以將這些物質直接及高度選擇性地作用於細胞(特別是腫瘤細胞)。本發明的抗體或抗體片段-藥物複合體具有優異的將藥劑送達至目標腫瘤細胞的能力。
此外，本發明也可以提供在抗體-藥劑複合體中，使用上述抗體片段代替抗體之抗體片段-藥劑複合體。對於抗體片段-藥劑複合體的詳細說明，可以同樣適用上述的抗體-藥劑複合體的說明。 以下，在本說明書的說明中，本發明的抗體-藥物複合體也包含抗體片段-藥物複合體。
4. 醫藥組成物等 本發明的抗hSEMA7A抗體、及抗體-藥物複合體(以下也稱為本發明的複合體)可用作醫藥組成物中所含的有效成分。 由於本發明的抗hSEMA7A抗體可以具有如上所述的抗腫瘤活性，本發明的抗hSEMA7A抗體及本發明的複合體較佳為用於腫瘤的治療及/或預防。因此，該醫藥組成物作為腫瘤的治療用及/或預防用，進一步作為診斷用之醫藥組成物是有用的。亦即，本發明之抗hSEMA7A抗體及本發明的複合體，作為腫瘤治療劑及腫瘤診斷劑中所含的有效成分是有用的。注意的是，在本發明中，上述腫瘤的治療，包含腫瘤的成長阻礙及成長抑制的含義，具體來說，例如只要是腫瘤治療劑，即可作為包含腫瘤的成長阻礙劑及成長抑制劑的型態。 此外，本發明之抗hSEMA7A抗體及本發明的複合體，較佳為用於如上所述的發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療用及/或預防用。因此，該醫藥組成物作為發炎性疾病及/或自體免疫疾病之治療用及/或預防用，進一步地作為診斷用的醫藥組成物是有用的。亦即，本發明的抗hSEMA7A抗體及本發明的複合體，作為發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療劑及診斷劑中所含的有效成分是有用的。 進一步地，本發明的醫藥組成物可以是用於阻礙或抑制hSEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用(較佳為結合)的組成物。
本發明的醫藥組成物較佳為提供包含本發明之抗hSEMA7A抗體等作為有效成分，進一步包含藥學上可接受的載體之醫藥組成物的形態。此外，本發明的醫藥組成物也可以與具有已知抗腫瘤活性的化合物(例如，順鉑)及/或具有殺細胞活性的化合物併用。併用的態樣例如可以是本發明的醫藥組成物進一步包含該化合物的態樣、也可以是與該化合物組合使用的態樣，沒有特別限定。藉由如此併用可以進一步獲得更高的抗腫瘤效果。
關於本發明之醫藥組成物的適用對象之人類腫瘤，可以同樣適用於上述說明。作為適用對象之腫瘤，可以是復發癌、轉移癌，本發明的醫藥組成物(進而，本發明的抗hSEMA7A抗體、本發明的複合體)可以作為用於復發癌、轉移癌的治療劑、預防劑及診斷劑是有效的。 此外，作為本發明的醫藥組成物的適用對象之發炎性疾病及自體免疫疾病，可以同樣適用於上述說明。
所謂的「藥學上可接受的載體」，可列舉：賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩解劑、穩定劑、保存劑、緩衝劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味劑、增稠劑、調味劑、增溶劑或其他的添加劑等。藉由使用1種以上如此般的載體，可以調製注射劑、液劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑或糖漿劑等形態的醫藥組成物。這些醫藥組成物可以經口服或非經口服來投予。作為非經口服投予之其他形態包含：將包含1個以上的活性物質藉由常規方法調配而成的注射劑等。在注射劑的情況下，可以藉由溶解或懸浮於生理食鹽水或市售的注射用蒸餾水等的藥學上可接受的載體中而製造。
特別是，當將本發明之源自抗hSEMA7A抗體的抗體片段(其中的低分子的抗體片段)投予至生物體內的情況下，除了上述之外，可以使用膠體分散系。膠體分散系因具有增強化合物(抗體片段)於生物體內之安定性的效果、將化合物有效率地輸送至特定的臟器、組織或細胞的效果而被期待。膠體分散系只要是通常使用的種類即可，沒有特別限制，但可列舉：包含聚乙二醇、高分子複合體、高分子凝集體、奈米膠囊、微球、珠粒、以及水中油系的乳化劑；微胞、混合微胞及微脂體之脂質作為基底之分散體系，較佳為具有將化合物有效率地輸送到特定的臟器、組織或細胞的效果之複數個微脂體、人工膜的囊泡(Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem.et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698)。
本發明的醫藥組成物的投予劑量可根據患者的年齡、性別、體重及症狀、治療效果、投予方法、處理時間、或醫藥組成物中所含有之本發明的抗hSEMA7A抗體、本發明的複合體的種類等而不同。通常，每一成人，每一次可以投予600μg至6000mg的範圍，但範圍不受限於此。
例如，在藉由注射劑來投予的情況下，對人類患者，可以採用每1次投予每1kg體重之100μg~100mg的劑量，平均每1日投予1次~數次，較佳為3日、1週、10日或2週投予1次，或可以投予單次(總投予次數為1次)的態樣。作為投予的形態，可列舉：靜脈注射、皮下注射、皮內注射、肌肉注射或腹腔注射等，但較佳為靜脈注射。此外，注射劑可以根據場合調製成非水性的稀釋劑(例如聚乙二醇、橄欖油等之植物油、乙醇等之醇類等)、懸浮劑或乳濁劑。此類注射劑的無菌化可以藉由使用過濾器的過濾滅菌、與殺菌劑的調配等來進行。注射劑可以製造成即用的形態。亦即，可以藉由冷凍乾燥法等製成無菌的固體組成物，在使用前溶解於無菌的注射用蒸餾水或其他溶劑而使用。
注意的是，本發明提供一種用途，本發明的抗hSEMA7A抗體及/或本發明的複合體用於製造阻礙或抑制腫瘤或發炎性疾病及/或自體免疫疾病(以下也稱為腫瘤等)的治療、預防及/或診斷，或hSEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用(較佳為結合)的醫藥(藥劑)。 此外，本發明提供一種抗hSEMA7A抗體及/或本發明的複合體，其為腫瘤等的治療用、預防用及/或診斷用，或用於阻礙或抑制hSEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用(較佳為結合)。 進一步地，本發明提供一種治療、預防及/或診斷腫瘤等的方法，其特徵在於，使用本發明的抗hSEMA7A抗體及/或本發明的複合體(亦即，將其投予至對象(患者))；或本發明提供一種阻礙或抑制hSEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用(較佳為結合)的方法；此外，本發明提供一種抗hSEMA7A抗體及/或本發明的複合體的用途，其用於治療、預防及/或診斷腫瘤等、或用於阻礙或抑制hSEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用(較佳為結合)。
5. 腫瘤的診斷用或檢測用套組等 本發明提供一種抗hSEMA7A抗體及本發明的複合體的形態，其係除了用於治療及/或預防腫瘤等的套組、或者是用於阻礙或抑制hSEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用(較佳為結合)的套組的形態以外，也是用於診斷或檢測腫瘤等的套組的形態。關於作為診斷或檢測之對象的腫瘤、發炎性疾病、及自體免疫疾病等的具體例，可以同樣適用於上述說明。
該診斷及檢測，例如可以藉由將本發明的抗hSEMA7A抗體及/或本發明的複合體，與從生物體採取的試樣(以下稱為生體試樣)進行反應，並檢測經反應的抗體等的訊號而進行。注意的是，由於hSEMA7A已被確認在各種腫瘤細胞中表現，因此hSEMA7A也可以用作各種腫瘤標記。 檢測到的抗體等的訊號，成為生體試樣中的抗原量(即hSEMA7A的量)的指標。使用本發明的抗體等進行腫瘤等之診斷及檢測，首先，將從作為檢體之受試者採取的生體試樣，例如作為檢查對象之組織碎片或血液等，與本發明的抗體等進行抗原抗體反應而使其結合。接著，藉由基於結合之抗體量的測定結果，測定生體試樣中目標抗原的量。該測定可以按照已知的免疫學的測定方法來進行，例如可以使用免疫沉澱法、免疫凝集法、標記免疫測定法、免疫比懸浮法、西方墨點法、流式細胞法等。在標記免疫測定法中，抗體訊號可以藉由使用標記抗體直接檢測到的標記量來表示之外，也可以相對於作為標準液之已知濃度或已知抗體價的抗體來表示。亦即，可以藉由測定儀來測定標準液及檢體，以標準液的值為基準來相對表示生體試樣中的抗體等訊號。作為標記免疫測定法，例如可列舉：ELISA法、EI法、RIA法、螢光免疫測定(FIA)法、化學發光免疫測定法(Luminescence immunoassay)等。其中，特別較佳為ELISA法，因為其簡便且靈敏度高。
如上述所獲得之檢測結果可以作為評價或診斷腫瘤等的狀態的指標。例如，將檢測結果超過預定的基準值評價為陽性，將預定的基準值以下評價為陰性，在陽性的情況下，可以判斷可能存在任一種腫瘤等疾病，並且可以評價腫瘤等的狀態。其中，所謂的腫瘤等的狀態是指，罹患腫瘤等的有無或其進展程度，可列舉：腫瘤等的發症的有無、進展程度、惡性程度、復發的有無等，也可列舉腫瘤轉移的有無等。
在進行上述評價時，作為腫瘤等的狀態可以選擇1個，也可以選擇組合複數個狀態進行評價。腫瘤等的有無的評價，可以藉由基於所獲得的檢測結果，以預定的基準值作為邊界來判斷是否罹患腫瘤等。腫瘤等的惡性程度，是表示腫瘤等的症狀進展到什麼程度的指標。在腫瘤的情況下，可以基於檢測結果，依病期(Stage)分類及評價，或者也可以依早期癌、進行性癌分類及評價。例如，檢測結果可以作為指標來評價早期癌或進行性癌。腫瘤的轉移可以依檢測結果作為指標，根據新生物是否在原發巢的位置之外的部位出現來進行評價。腫瘤等的復發可以藉由檢測結果是否在間歇期或緩解後再次超過預定的基準值來進行評價。
本發明的套組除了包含本發明的抗hSEMA7A抗體、本發明的複合體以外，也可以包含標記物質、或固定有抗體或其標記的固定化試劑等。所謂的抗體的標記物質是指，藉由酶、放射性同位素、螢光化合物、及化學發光化合物等進行標記的物質。除了上述的構成成分以外，本發明的套組也可以包含用於實施本發明的檢測之其他試劑，例如在標記物質為酶標記物質的情況下，可以包含酵素基質(發色性基質等)、酵素基質溶解液、酵素反應停止液、或者檢體用稀釋液等。此外，也可以包含各種緩衝液、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反應容器(微量離心管等)、阻斷劑(Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat血清等的血清成分)、洗滌劑、界面活性劑、各種板材、疊氮化鈉等之防腐劑、及實驗操作手冊(說明書)等。
以下，列舉實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明不限於此。 [實施例1]
1. 重組人類SEMA7A胞外結構域蛋白質的表現與純化 設計下述序列：針對人類SEMA7A(hSEMA7A)蛋白質的胺基酸序列(序列編號46)的第45位至第643位的胺基酸，在其C末端側插入6×His標籤。將此設計的胺基酸序列基於哺乳類的密碼子表對鹼基序列進行變換，藉由基因合成於5'末端插入Kozak轉譯起始序列、於3'側插入轉譯終止密碼子之DNA序列來合成(GENEWIZ)。將合成的DNA插入pEF1/V5-His A (Thermo Fisher Scientific)的限制酶KpnI識別序列及XbaI識別序列之間來製作表現載體。
將製作的表現載體的質體，使用聚乙烯亞胺法暫態轉染(transient transfection)FreeStyle293細胞(Thermo Fisher Scientific)後，在37℃、5% CO 2恆溫箱中培養5天。回收培養上清液並通過0.22μm的過濾器過濾，使其結合至HisTrap excel管柱(GE Healthcare)。接著，在20mM磷酸緩衝液/300mM NaCl/pH 7.5緩衝液中，藉由20mM至500mM的咪唑的濃度梯度來溶離。分取每1mL的溶離區分，以SDS-PAGE法回收認為是約75kDa的條帶的區分。回收的蛋白質用作純化的重組hSEMA7A胞外結構域蛋白質(以下稱為hSEMA7A-ECD)。
2. 基因庫的培養 將源自雞的B細胞的細胞株DT40細胞作為宿主之人類基因庫的培養方法依以下的方法來進行。在39.5℃、5% CO 2存在下進行培養，使用培養基IMDM(Life Technologies)，並添加10% FBS (Biosera)及1% Penicillin-Streptomycin。以下，如無特殊說明，CS(-)培養基均指上述的培養基。所謂的CS/FK506含有培養基是指，在CS(-)培養基添加5%雞血清(Life Technologies)及1μM FK506 (Cayman)。
3. 藉由ADLib系統選擇單株抗體 使用的資料庫是如WO 2015/167011中所記載的人類資料庫及Kappa人類資料庫(Human bioKI Lib mix)的混合物。向以CS/FK506含有培養基懸浮的資料庫中以最終濃度成為30nM的方式添加生物素化的hSEMA7A-ECD抗原，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，以CS/FK506含有培養基清洗兩次，並以CS/FK506含有培養基重新懸浮。添加1/50量的Anti-Biotin MicroBeads UltraPure (Miltenyi Biotec)及1/2000量的Goat Anti-Human IgG-PE (SouthernBiotech)，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，添加1/1000量的Streptavidin Alexa Fluor 647 Conjugate (Life Technologies)，並在4℃下倒轉混合的同時反應10分鐘。反應終了後，以autoMACS Pro Separator(Miltenyi Biotec)進行管柱濃縮，以FACS Aria Fusion(Becton Dickinson)測定未吸附於管柱的區分(陰性區分)以設定排序範圍。之後，載入陽性區分全部的試樣，並在分注有每個培養基的96 well plate中將陽性細胞集團以成為1細胞/well的方式實施分選。
4. 藉由抗原固相ELISA的篩選 以D-PBS(-)(Nacalai Tesque)稀釋至2.5μg/mL的hSEMA7A-ECD抗原溶液及陰性對照抗原(hHER2-His)溶液20μL，分注至MAXISORP 384 IMMUNO PLATE(NUNC)，在4℃反應一晚使其固相化。以微量盤專用小型離心機(GYRO mini GM-01，MICRONIX)進行離心以除去溶液，加入45μL的阻斷溶液(包含1% BSA(SIGMA)的PBS)，於室溫反應1小時。以GYRO mini進行離心以去除溶液，加入25μL的培養上清液，室溫反應1小時。以GYRO mini進行離心以去除溶液，加入以阻斷溶液進行2000倍稀釋的Goat anti-Human IgG-Fc HRP-conjugated (BETHYL)25μL，室溫反應30分鐘。以清洗溶液(包含0.05% Tween20(Wako)的PBS)清洗5次，加入25μL的TMB(Nacalai Tesque)，反應10分鐘。添加25μL的1N硫酸(Wako)以停止反應，並使用微量盤分析儀(TECAN)測定450nm的吸光度。
5. 抗體序列解析 關於如上述4項所述，與hSEMA7A-ECD產生特異性反應的抗體之DT40細胞，其免疫球蛋白基因可變區域的序列之解析依下述方式實施。 將DT40細胞擴大培養，並使用Wizard SV Genomic DNA Purification System(Promega)提取其基因組DNA。藉由PCR法將提取的DNA擴增其中的抗體基因。使用識別重鏈、輕鏈之可變區域上游及恆定區下游的引子進行擴增。使用的各引子及其序列如下。
用於擴增重鏈5'： SEQ3777F(AAGCAATTAAGTCGAGGCTGACGA(序列編號47)) 用於擴增重鏈3'： CH2a_620R(CCGCAAATGATGGACCGACC(序列編號48)) 用於擴增κ/λ輕鏈5'： Primer05(CCCACACCTCAGGTACTCGT(序列編號49)) 用於擴增κ/λ輕鏈3'： VL7 SEQ R7(CGCCAAGTCCAAGAAAAACCCCCA(序列編號50))
將所得的DNA片段以CH2a 620R及VL7 SEQ R7擴增，並進行DNA序列解析。 對於得到的抗體序列的結果，按照Kabat等人的方法(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991)來決定CDR區。解析的抗體株(抗體名：pre-AM)的重鏈可變區域(VH)及輕鏈可變區域(VL)的胺基酸序列及其各CDR區的胺基酸序列如下述表1以各序列編號來顯示。
6. 藉由Affinity maturation(AM)提升親和性 將產生與hSEMA7A-ECD具有特異性反應的抗體之DT40細胞，在39.5℃、5% CO 2的存在下進行培養，培養基使用IMDM(Life Technologies)，並添加10% FBS(Biosera)、1% Penicillin-Streptomycin、10μM A66(SIGMA)來使用。培養2~3週後，向以CS/FK506含有培養基懸浮的DT40細胞中以最終濃度成為10nM的方式添加生物素化的hHER2-His抗原，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，以CS/FK506含有培養基清洗兩次，並以CS/FK506含有培養基重新懸浮。接著，添加1/500量的Streptavidin Alexa Fluor 488 Conjugate (Life Technologies)，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，以CS/FK506含有培養基清洗兩次，並以CS/FK506含有培養基重新懸浮。接著，以最終濃度成為1~10nM的方式添加hSEMA7A-EDC Alexa Fluor 647 Conjugate以及1/2000量的Goat Anti-Human IgG-PE (SouthernBiotech)，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，以CS/FK506含有培養基清洗兩次，並以CS/FK506含有培養基重新懸浮。懸浮液以FACS Aria Fusion (Becton Dickinson)進行測定，分選範圍設定為包含親和性提升的上位約0.1%的集團。之後，在分注有CS/FK506含有培養基的96 well plate中，將陽性細胞集團以成為1細胞/well的方式實施分選。
在上述第6項(藉由Affinity maturation(AM)提升親和性)所分選出被認為提升親和性的DT40細胞，藉由流式細胞儀進行篩選。 在分選的單殖株充分生育後，向以CS(-)培養基懸浮的DT40細胞中以最終濃度成為10nM的方式添加生物素化的hHER2-His抗原，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，以CS(-)培養基清洗兩次，並以CS(-)培養基重新懸浮。接著，添加1/500量的Streptavidin Alexa Fluor 488 Conjugate(Life Technologies)，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，以CS(-)培養基清洗兩次，並以CS(-)培養基重新懸浮。接著，以最終濃度成為1~10nM的方式添加hSEMA7A-EDC Alexa Fluor 647 Conjugate以及1/2000量的Goat Anti-Human IgG-PE(SouthernBiotech)，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，以CS(-)培養基清洗兩次，並以CS(-)培養基重新懸浮。藉由FACS CantoII(Becton Dickinson)測定懸浮液並篩選與原始殖株相比具有因hSEMA7A-EDC而提升染色度的殖株。
篩選後，將親和性提升的殖株進行前述的抗體序列解析，並鑑定抗體序列中導入的突變位點(圖1A、圖1B、圖1C)。所獲得的殖株抗體(抗體名：HC1~HC8)的VH及VL的胺基酸序列及其各CDR區的胺基酸序列，如前述表1以各序列編號來顯示。
7. 抗體的親和性測定 對於各序列組的代表殖株，調製培養上清液並使用SPR法(Biacore T200，GE Healthcare)測定與抗原的親和性。使用Human Antibody Capture Kit(GE Healthcare)將anti-human IgG Fc抗體固定在CM5晶片(GE Healthcare)上後，捕獲培養上清液中的抗體。與4~100 nM的hSEMA7A-EDC反應240秒，然後解離300秒。與作為再生液之3M的MgCl 2反應30秒以完成一個循環。使用緩衝液HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05 % (v/v) surfactant P20(pH 7.4)(GE Healthcare))，以流速為30μL/min進行測定。
對各SPR感測圖譜藉由Langmuir 1:1 binding model進行擬合，算出結合速度常數kon、解離速度常數koff，並由KD=koff/kon的公式決定KD值。抗SEMA7A抗體(HC1~ HC8)的KD值如圖5所示。
8. 初代培養人類HSC中的ADCC活性 首先比較處於正常狀態的靜止型HSC、及被認為參與病態的活性型HSC的細胞表面上的SEMA7A的表現量。活性型HSC可以藉由以1ng/mL的hTGF-β1(R&D)對靜止型HSC處理一晚而獲得。接著以最終濃度成為1µg/mL的方式使同型控制組抗體及抗SEMA7A抗體(HC2)在4℃下反應30分鐘，反應終了後以CS(-)培養基清洗兩次。接著，添加1/2000量的Goat Anti-Human IgG-PE(SouthernBiotech)，並在4℃下倒轉混合的同時反應30分鐘。反應終了後，以CS(-)培養基清洗兩次，並以CS(-)培養基重新懸浮。以FACS CantoII(Becton Dickinson)測定懸浮液以比較SEMA7A的表現量。其結果，SEMA7A在靜止型HSC中幾乎不表現，但在活性型HSC中確認SEMA7A的強力表現誘導(圖2)。
ADCC分析是按照ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit(Promega)的步驟準則來實施。首先如上述般，將靜止型HSC及活性型HSC以6×10 3cells/well的方式接種在CellBIND 384孔板(CORNING)中，並將抗SEMA7A抗體(HC1~HC8)的連續稀釋系列以最終濃度成為4~1000ng/mL的方式來添加。接著將ADCC Bioassay Effector Cell以1.2×10 4cells/well來添加，並在37℃反應6小時。反應終了後，添加Bio-Glo™ Luciferase Assay Buffer，遮光的同時在室溫反應15分鐘。以EnspireAlpha平板讀數儀(ParkinElmer)測定反應溶液的發光，以評價抗SEMA7A抗體的ADCC活性。其結果，在靜止型HSC中未觀察到ADCC活性，但在針對活性型HSC任一的抗SEMA7A抗體(HC1~HC8)中均觀察到顯著的ADCC活性(圖3)。此外，抗SEMA7A抗體對活性型HSC的ADCC活性的強度，因抗體的不同變體而不同，按活性較強的順序為HC6＞ HC2＞HC1≒HC3≒HC4≒HC5＞HC7≒HC8。
9. 使用第二種免疫毒素的抗SEMA7A抗體的細胞毒性活性 以抗SEMA7A抗體(HC1~HC8)觀察到較強的內化活性(圖7)。接著，評價作為抗SEMA7A抗體的抗體藥物複合體(ADC)的可能性。首先，將等量之480nM的IgGs Anti-Mouse IgG Fc-PBD Antibody with Cleavable Linker (Moradec)與160nM的抗SEMA7A抗體及同型控制組抗體進行混合，在室溫培育1小時(注意的是，PBD為吡咯并苯二氮)。將ADC化的抗體以2倍稀釋重複進行9次以調製稀釋系列。接著將MDA-MB-231細胞(ATCC)以500 cells/well接種在CellBIND 384孔板(CORNING)，並添加ADC化抗體的稀釋系列。之後，在37℃、0%CO 2存在下培養7天後，添加CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)，並以EnspireAlpha平板讀數儀(ParkinElmer)測定活細胞數。其結果，觀察到抗SEMA7A抗體特異性的細胞毒性活性(圖4)。
10. 本發明之新穎抗SEMA7A抗體與市售抗體的結合親和性的比較 用於比較的市售的抗SEMA7A小鼠單株抗體的殖株名及獲得來源如下述表2所示。
對於市售的各抗SEMA7A小鼠單株抗體，使用SPR法(Biacore T200，GE Healthcare)測定與抗原的親和性。使用Mouse Antibody Capture Kit(GE Healthcare)將anti-mouse IgG Fc抗體固定在CM5晶片(GE Healthcare)後，捕獲培養上清液中的抗體。與4~100nM的hSEMA7A-EDC進行反應240秒，然後解離300秒。與作為再生溶液之10mM的Gly-HCl(pH 1.7)反應30秒以完成1循環。緩衝液是使用HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%(v/v)surfactant P20(pH 7.4) (GE Healthcare))，流速為30μL/min來進行測定。
對各SPR感測圖譜藉由Langmuir 1:1 binding model進行擬合，算出結合速度常數kon、解離速度常數koff，並由KD=koff/kon的公式決定KD值。結果如圖5所示，除了3A5G1以外，其他的親和性弱到無法檢測。此外，抗SEMA7A抗體(HC1~HC8)的親和性比可以測定之3A5G1的親和性強約100倍以上。
11. 抗SEMA7A抗體的Plexin C1-SEMA7A結合抑制活性的比較 以D-PBS(-)(Nacalai Tesque)稀釋至1.25μg/mL的hPlexin C1溶液(R&D)25μL，分注至MAXISORP 384 IMMUNO PLATE (NUNC)，在4℃反應一晚使其固相化。以微量盤專用小型離心機(GYRO mini GM-01，MICRONIX)進行離心以除去溶液，加入45μL的阻斷溶液(包含1% BSA(SIGMA)的PBS)，於室溫反應1小時。以GYRO mini進行離心以去除溶液，同時加入25μL的抗SEMA7A抗體及同型控制組抗體的稀釋系列與25μL的10nM生物素化hSEMA7A-Fc(R&D)，室溫反應1小時。以GYRO mini進行離心以去除溶液，加入以阻斷溶液進行5000倍稀釋的High Sensitivity Streptavidin-HRP(Thermo Fisher Scientific)25μL，室溫反應30分鐘。以清洗溶液(包含0.05% Tween20(Wako)的PBS)清洗5次，加入25μL的TMB(Nacalai Tesque)，反應10分鐘。添加25μL的1N硫酸(Wako)以停止反應，並使用微量盤分析儀(TECAN)測定450nm的吸光度，結果如圖6所示。市售的抗SEMA7A抗體中，3A5G1是唯一顯示Plexin C1-SEMA7A結合抑制活性的抗體，但其活性非常弱，弱至無法算出IC 50。另一方面，本發明之新穎抗SEMA7A抗體(特別是HC1、HC2、HC4、HC6、HC8)實質上具有可以100%抑制Plexin C1-SEMA7A結合的活性，其係相較於市售抗體為壓倒性強之抑制活性。
12. 全長hSEMA7A穩定表現之Ba/F3細胞的構築 設計下述序列：針對UniProt編號O75326的第1位至第666位的胺基酸序列(序列編號46)，在第640位的C末端側插入c-Myc標籤。將此胺基酸序列基於哺乳類的密碼子表對鹼基序列進行變換，藉由基因合成於此序列的5'末端插入Kozak序列以及於3'末端插入轉譯終止密碼子之DNA序列來合成(GENEWIZ)。將合成的DNA插入pCDNA3.1+(Thermo Fisher Scientific)的KpnI/XhoI識別序列之間來製作表現載體。
藉由限制酶PvuI將質體線狀化，並將2μg的線狀化質體藉由Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V(Lonza)導入2×10 6個源自小鼠B細胞的細胞株Ba/F3細胞。基因導入後，將細胞接種在96 well板，並以最終濃度成為1μg/mL的方式添加G418(Nacalai Tesque)。6天後，從孔中回收顯示具有G418抗性之增殖的群落，並使用抗c-Myc抗體(Santa Cruz Biotechnology)藉由流式細胞儀確認hSEMA7A的表現。並將源自經確認的群落的細胞進行極限稀釋。回收增殖的細胞，並使用抗hSEMA7A抗體(Abnova)藉由流式細胞儀確認hSEMA7A的表現，最後選擇源自單殖株的細胞株。將此細胞作為Ba/F3-hSEMA7A細胞株並用於以下的實驗。
13. 抗SEMA7A抗體之內化活性的比較 首先，將等量的480nM AcidiFluor ORANGE 標記的anti-human/mouse IgG Fc Fab抗體、與160nM抗SEMA7A抗體及同型控制組抗體進行混合，並在室溫培育10分鐘。將此調製的抗體複合體與Ba/F3-hSEMA7A細胞在37℃反應1小時。反應終了後，以FACS CantoII(Becton Dickinson)測定懸浮液以比較各抗體的內化活性。其結果，本發明之新穎抗SEMA7A抗體(HC1~HC8)均表現出強烈的內化活性，但市售的抗SEMA7A抗體未表現出任何內化活性(圖7)。
14. 抗SEMA7A抗體的抗原特異性的比較 從副作用的觀點考慮，保證抗體的抗原特異性非常重要。因此，使用與hSEMA7A的sema結構域高度相似性的hSEMA4F、hSEMA5A、hSEMA6C，比較本發明之新穎抗SEMA7A抗體及市售的抗SEMA7A抗體的抗原特異性。
首先以D-PBS(-)(Nacalai Tesque)稀釋至2.5μg/mL的hSEMA7A-ECD、hSEMA4F-GST(Abnova)、hSEMA5A-His(SINO BIO)、hSEMA6C-GST(Abnova)以及陰性對照抗原(hHER2-His、GST)溶液20μL，分注至MAXISORP 384 IMMUNO PLATE(NUNC)，在4℃反應一晚使其固相化。以微量盤專用小型離心機(GYRO mini GM-01，MICRONIX)進行離心以除去溶液，加入45μL的阻斷溶液(包含1% BSA(SIGMA)的PBS)，於室溫反應1小時。以GYRO mini進行離心以去除溶液，加入25μL的10μg/mL抗SEMA7A抗體，室溫反應1小時。以GYRO mini進行離心以去除溶液，加入以阻斷溶液進行2000倍稀釋的Goat anti-Human IgG-Fc HRP-conjugated(BETHYL)25μL，室溫反應30分鐘。以清洗溶液(包含0.05% Tween20(Wako)的PBS)清洗5次，加入25μL的TMB(Nacalai Tesque)，反應10分鐘。添加25μL的1N硫酸(Wako)以停止反應，並使用微量盤分析儀(TECAN)測定450nm的吸光度。結果如圖8所示，確認本發明之新穎抗SEMA7A抗體(HC1~HC8)全部都具有hSEMA7A特異性。另一方面，在市售的抗SEMA7A抗體中，已確認親和性較弱且不具有Plexin C1-SEMA7A結合抑制活性的C-6、D-4、1G1及1D5G8具有hSEMA7A特異性，而3A5G1會交叉結合hSEMA4F、hSEMA5A、hSEMA6C，且3D3也會交叉結合hSEMA4F、hSEMA6C。因此，相較於市售的抗SEMA7A抗體，本發明之新穎抗SEMA7A抗體(HC1~HC8)明顯具有優異的抗原特異性。
15. 抗SEMA7A抗體之等電點(pI)的測定 pI是影響抗體醫藥的藥物動態(PK)的重要係數。一般來說，由於高pI(9.5以上)預想會導致PK較不良好，因此需要導入突變以進行改變。為了預測抗SEMA7A抗體的PK，使用pH 5.6的緩衝液及pH 10.2的緩衝液並藉由梯度分析法來算出每個抗體的pI。其結果，HC1~HC5的pI為9.5以下，預想PK是處於良好的範圍內(圖9)。
16. 抗SEMA7A抗體的熱安定性的評價 將適量的SYPRO Orange螢光色素與已稀釋至0.5mg/mL的HCl~HC8進行混合。作為抗SEMA7A抗體的比較對象，對8種已上市的抗體醫藥品(Herceptin, Humira, Lucentis, Poteligio, Avastin, Atezolizumab, Nivolumab, Synagis)進行相樣的操作。作為Fab區的熱改質曲線的中間點之Tm值，是由使用程式設為以3℃/分鐘的速度將溫度從30℃上升至99℃的RT-PCR裝置連續讀取螢光而算出。結果如圖10所示，從結果表明抗SEMA7A抗體相較於上市抗體具有不遜色的Tm值，並且整體具有較高的熱安定性。
17. 抗SEMA7A抗體之抗體產量的評價 為了估算抗SEMA7A抗體的抗體產量，使用Expi293 Expression System進行小規模的抗體表現、純化。將轉染的Expi293的培養基以Protein A管柱進行親和純化，以BCA法測定抗體濃度。其結果，發現HC1及HC2具有特別高的抗體產量(圖11)。
18. 抗SEMA7A抗體之內化活性的經時變化 圖7是使抗SEMA7A抗體與細胞在37℃反應1小時，並僅確認有無內化活性。因此，評價這次細胞表面上的SEMA7A之多少比例會因隨時間經過的內化而消失。按照圖12A所示的評價方法及內化活性的計算方法來評價，發現抗SEMA7A抗體(HC2)的內化活性在1小時內達到停滯期，已使細胞表面上的約90%的SEMA7A內化(圖12B)。因此，判明HC2是屬於高內化活性類別的抗體。
19. 各種癌症組織之SEMA7A的表現解析 為了調查SEMA7A在三陰性乳癌(TNBC)、骨肉瘤、軟骨肉瘤、非小細胞肺癌(NSCLC：EGFR野生型(EGFR WT)、EGFR突變型(EGFR Mut))中的表現強度及頻率，從US Biomax公司及TriStar Technology Group公司購入組織微陣列以進行表現解析。首先進行載玻片的脫石蠟化、並與小鼠單株抗SEMA7A抗體(殖株：C-6)進行反應。之後，與HRP標記的二次抗體進行反應，最後以DAB溶液進行顯色。按照圖13A的指標將染色結果分類為分數0至分數3+，並算出其頻率。其結果，TNBC、骨肉瘤、軟骨肉瘤較多傾向於分數2+。就NSCLC中有無EGFR突變的差異而言，明顯在具有EGFR突變的患者會傾向於較強的SEMA7A表現強度(圖13B)。
20. 各癌細胞株之SEMA7A的表現解析 關於經免疫組織染色之確認表現SEMA7A的TNBC、骨肉瘤、軟骨肉瘤、NSCLC，從ATCC公司獲得每個癌細胞株，並以FACS進行SEMA7A表現的解析。具體而言，使用作為TNBC細胞株之「MDA-MB-231」，作為骨肉瘤細胞株之「U-2 OS」及「143B」，作為軟骨肉瘤細胞株之「SW1353」，以及作為NSCLC細胞株之「SK-MES-1」(EGFR WT)及「H1975」(EGFR Mut)。 解析方法是將各癌細胞株與抗SEMA7A抗體(HC2)在4℃反應30分鐘，然後用PE標記的抗hIgG Fc抗體進行檢測。其結果，作為軟骨肉瘤細胞之SW1353具有最強表現，而其餘細胞株具有中等程度的表現量(圖14)。
21.各癌細胞株之HC2第二種免疫毒素的細胞毒性活性 使用確認有SEMA7A表現的癌細胞株，為了驗證抗SEMA7A抗體(HC2)之作為ADC的可能性，使用PBD結合之第二種免疫毒素來調查細胞毒性活性。將等量的80nM抗SEMA7A抗體及240nM PBD結合之二次抗體(IgGs Anti-Mouse IgG Fc-PBD Antibody with Cleavable Linker (Moradec))進行混合，並在室溫培育1小時。將該混合液製作3倍稀釋系列，並投予各癌細胞株。投予1週後，添加CellTiter-Glo並在室溫下靜置10分鐘，以EnspireAlpha平板讀數儀(ParkinElmer)測定發光。如圖15所示，對於這次測試的4種癌細胞株，HC2表現顯著的細胞毒性活性。綜上所述，證明HC2也是適用於ADC的抗體。
22. 各癌細胞株之PBD直接標記的抗SEMA7A抗體的細胞毒性活性 接著，使用PBD直接標記的抗SEMA7A抗體之ADC化抗體進行細胞毒性分析。分析中使用的抗體之抗體藥物比(DAR; Drug to Antibody Ratio)，同型控制組抗體為3.2、HC1為3.0、HC2為3.1。將各ADC的3倍稀釋系列(0~40nM)投予至接種有各癌細胞株500 cells/well的平板。投予1週後，添加CellTiter-Glo，在室溫下靜置10分鐘，以EnspireAlpha平板讀數儀(ParkinElmer)測定發光。其結果，在所有5種類型的癌細胞株都確認顯著的細胞毒性活性(圖16)。 [產業上的可利用性]
根據本發明，可以提供結合人類SEMA7A，較佳為結合其sema結構域的高活性的功能性抗體。本發明之抗人類SEMA7A抗體可以阻礙或抑制人類SEMA7A與Plexin C1、整合素β1之間的相互作用，例如可以作為治療及預防藥物來對於特發性肺纖維症(IPF)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)等之器官纖維症、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎等之發炎性疾病、類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、及薛格倫氏症候群等之自體免疫疾病、以及肺癌、乳癌、口腔癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤等之各種癌症發揮效果。 [序列表非關鍵詞文字]
序列編號1~44：重組胜肽 序列編號47~50：合成DNA
[圖1A]是顯示製作抗SEMA7A抗體的重鏈時導入了CDR突變的部位的圖。 [圖1B]是顯示製作抗SEMA7A抗體的輕鏈時導入了CDR突變的部位的圖。 [圖1C]是顯示抗SEMA7A抗體的重鏈中導入了CDR突變的組合的圖。 [圖2]是顯示藉由流式細胞儀對靜止型HSC及活性型HSC的細胞表面的SEMA7A蛋白質表現量之觀察結果的圖。 [圖3]是顯示對於初代培養的人類HSC之抗SEMA7A抗體的ADCC活性的圖。 [圖4]是顯示使用第二種免疫毒素(Second immunotoxin)的抗SEMA7A抗體的細胞毒性活性的圖。 [圖5]是顯示本發明的新穎抗SEMA7A抗體、與市售的抗SEMA7A抗體之結合親和性的比較結果的圖。 [圖6]是顯示抗SEMA7A抗體之Plexin C1-SEMA7A結合抑制活性的比較結果的圖。 [圖7]是顯示抗SEMA7A抗體之內化(internalization)活性的比較結果的圖。 [圖8]是顯示抗SEMA7A抗體之對於訊號素家族(SEMA4F、SEMA5A、SEMA6C、SEMA7A)的反應性的比較結果的圖。 [圖9]是顯示抗SEMA7A抗體的等電點(pI)的圖。 [圖10]是顯示抗SEMA7A抗體之Fab的Tm值的圖。 [圖11]顯示抗SEMA7A抗體之抗體產量。 [圖12A]是顯示內化活性的算出方法的概略圖。圖中的「MFI」表示Mean Fluorescence Intensity(平均螢光強度)。 [圖12B]是顯示抗SEMA7A抗體之內化活性的經時變化的圖。 [圖13A]是顯示各種癌症中SEMA7A表現解析結果的圖。 [圖13B]是顯示NSCLC中EGFR突變對SEMA7A表現量的變化的圖。 [圖14]是顯示各癌細胞株中SEMA7A表現解析的結果的圖。 [圖15]是顯示各種癌症中HC2之第二種免疫毒素的細胞毒性活性的圖。 [圖16]是顯示各癌細胞株中HC1-PBD及HC2-PBD的細胞毒性活性的圖。
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Claims (28)

  1. 一種針對人類SEMA7A的抗體，其中 重鏈可變區域(VH)的互補性決定區域(CDR)1、CDR2及CDR3的胺基酸序列分別依序由： 序列編號10、11及12所示的胺基酸序列； 序列編號18、19及20所示的胺基酸序列； 序列編號22、23及24所示的胺基酸序列； 序列編號26、27及28所示的胺基酸序列； 序列編號30、31及32所示的胺基酸序列； 序列編號34、35及36所示的胺基酸序列； 序列編號38、39及40所示的胺基酸序列；或 序列編號42、43及44所示的胺基酸序列所構成；且 輕鏈可變區域(VL)的CDR1、CDR2及CDR3的胺基酸序列分別依序由序列編號14、15及16所示的胺基酸序列所構成。
  2. 一種針對人類SEMA7A的抗體，其中 重鏈可變區域(VH)的胺基酸序列由序列編號9、17、21、25、29、33、37或41所示的胺基酸序列所構成；且 輕鏈可變區域(VL)的胺基酸序列由序列編號13所示的胺基酸序列所構成。
  3. 如請求項1或2所述的抗體，其為與人類SEMA7A的sema結構域結合的抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗體，其中，抗體為人類抗體。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗體，其具有阻礙或抑制人類SEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用的活性。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的抗體，其中抗體為具有抗腫瘤活性者。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的抗體，其係用於治療或預防腫瘤者。
  8. 如請求項6或7所述的抗體，其中，腫瘤為選自由人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、及人類軟骨肉瘤所構成的群組中的至少1種。
  9. 如請求項1至5中任一項所述的抗體，其係用於發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療或預防者。
  10. 如請求項9所述的抗體，其中發炎性疾病為選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種；以及 自體免疫疾病為選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。
  11. 一種抗體片段，其源自於如請求項1至10中任一項所述的抗體。
  12. 一種抗體或抗體片段-藥物複合體，其係藥物接合至如請求項1至10中任一項所述的抗體或如請求項11所述的抗體片段者。
  13. 如請求項12所述的複合體，其中藥物為具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性的化合物。
  14. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1~10中任一項所述的抗體、如請求項11所述的抗體片段、及/或如請求項12或13所述的複合體。
  15. 如請求項14所述的醫藥組成物，其係用於腫瘤的治療或預防者。
  16. 如請求項15所述的醫藥組成物，其中腫瘤為選自由人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、及人類軟骨肉瘤所構成的群組中的至少1種。
  17. 如請求項14所述的醫藥組成物，其係用於發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療或預防者。
  18. 如請求項17所述的醫藥組成物，其中發炎性疾病為選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種；以及 自體免疫疾病為選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。
  19. 如請求項14所述的醫藥組成物，其係用於阻礙或抑制人類SEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用者。
  20. 一種腫瘤的治療或預防方法，其包含將如請求項14至16中任一項所述的醫藥組成物投予對象。
  21. 如請求項20所述的方法，其中，腫瘤為選自由人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、及人類軟骨肉瘤所構成的群組中的至少1種。
  22. 一種發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療或預防方法，其包含將如請求項14、17及18中任一項所述的醫藥組成物投予對象。
  23. 如請求項22所述的方法，其中發炎性疾病為選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種；以及 自體免疫疾病是選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。
  24. 一種阻礙或抑制人類SEMA7A與Plexin C1及/或整合素β1之間的相互作用的方法，其包含將如請求項14或19所述的醫藥組成物投予對象。
  25. 一種腫瘤之治療、預防或診斷用套組，其包含如請求項1至10中任一項所述的抗體、如請求項11所述的抗體片段、及/或如請求項12或13所述的複合體。
  26. 如請求項25所述的套組，其中腫瘤為選自由人類乳癌、人類肺癌、人類口腔癌、人類骨肉瘤、及人類軟骨肉瘤所構成的群組中的至少1種。
  27. 一種發炎性疾病及/或自體免疫疾病的治療、預防或診斷用套組，其包含如請求項1~10中任一項所述的抗體、如請求項11所述的抗體片段、及/或如請求項12或13所述的複合體。
  28. 如請求項27所述的套組，其中發炎性疾病為選自由特發性肺纖維症(IPF)、克隆氏病、過敏性皮膚炎、及間質性肺炎、以及包含非酒精性脂肪肝炎(NASH)之器官纖維症所構成的群組中的至少1種；以及 自體免疫疾病是選自由類風濕性關節炎、多發性硬化症(MS)、全身性硬皮病、以及薛格倫氏症候群所構成的群組中的至少1種。
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