TW202400794A - 細胞療法構築體之非病毒遞送 - Google Patents

Abstract

本揭露提供基於轉位子之系統，用於將細胞治療產品（諸如CAR及TCR）引入目標免疫細胞。相較於習知基於病毒載體之技術，基於轉位子之系統可攜帶更大的有效負載(payload)、簡化多基因編輯、並可降低該有效負載中同源序列之間非所欲之重組。本揭露亦提供縮短的自體程序，其可在數天內、一天內、甚或數小時內完成。即使沒有免疫細胞的活化、富集、或擴增，所產生的細胞群體相較於採用病毒載體的冗長自體程序仍可實現更高的體內治療效果。

Description

細胞療法構築體之非病毒遞送

無

細胞療法採用經富集或經修飾人類免疫細胞以靶向及殺滅患者之癌細胞。為了增加免疫細胞靶向及殺滅特定癌細胞之能力，已開發出方法來工程改造免疫細胞以表現將免疫細胞對準特定目標癌細胞之構築體。包括能夠與特定腫瘤抗原交互作用之結合域的嵌合抗原受體(CAR)及經工程改造T細胞受體(TCR)讓免疫細胞能夠靶向及殺滅表現該特定腫瘤抗原之癌細胞。

製備CAR或TCR細胞的主要挑戰在於將編碼序列轉移至目標免疫細胞。目前，絕大多數的CAR T細胞產生皆仰賴於藉由病毒載體來轉移。反轉錄病毒基因與可誘導型啟動子之組合可提高轉導率，並產生相對大數目之含CAR T細胞。

基於載體的鼠類白血病病毒(MLV)係最常用的γ反轉錄病毒載體。然而，MLV的使用一直以來與T細胞相關的白血病有關。衍生自另一反轉錄病毒家族的載體，即慢病毒(Lentivirus)，顯示出更佳的整合效率。慢病毒載體能夠靶向未分裂的細胞，而此對基於MLV之載體而言一直以來係主要的挑戰。

病毒載體通常用於產生CAR T細胞，但仍然存在重大挑戰。例如，病毒載體先天上與致癌及誘發突變的可能性有關。此外，在現行的《優良藥品製造規範》(Good Manufacturing Practice, cGMP)實驗室中，使用病毒受到嚴格的規定限制。同樣重要的是，慢病毒/反轉錄病毒的轉導亦受到病毒殼大小的限制，因此對轉殖基因的大小具有限制。此外，轉殖基因的大小可受限於所關注之基因及/或多個基因表現在生理學上對病毒載體本身之影響，包括轉殖基因對病毒所引起之潛在基因毒性。

又一項重大挑戰係來自高度複雜的自體細胞工程改造及產生程序，其通常需要至少一週的時間，且甚至可能長達數週。在該過程期間，從患者身上收集的淋巴球必須運到加工中心，同時產生出的細胞必須經冷凍保存，接著運回予患者以進行植入。此種高度複雜的過程必然導致高成本，且在臨床應用上有所限制。

本揭露於各種實施例中提供基於轉位子之系統，用於將細胞治療產品（諸如CAR及TCR）引入目標免疫細胞。相較於習知基於病毒載體之技術，基於轉位子之系統可攜帶更大的有效負載(payload)，並可降低該有效負載中同源序列之間非所欲之重組。在某些態樣中，基於轉位子之系統將多基因編輯簡化至單一步驟轉染。本揭露亦提供縮短的自體程序，其可在數天內、甚或在同一天內完成。在某些態樣中，該縮短的自體程序可在4小時內完成。即使沒有免疫細胞的活化、富集、或擴增，所產生的細胞群體相較於採用病毒載體的冗長自體程序仍可實現更高的體內治療效果。

此種縮短的程序能夠很容易地併入封閉的自動化裝置，並於較佳地點（例如臨床現場）而非在集中的製造現場進行。此對習知自體技術而言係不切實際的。習知技術所需的兩種運輸方式得以省略。同樣重要的是，運輸所需的冷凍/解凍步驟亦可排除，此將進一步改善患者護理及產品的品質。

根據本揭露之一實施例，提供一種轉位子，其包含編碼多肽之轉殖基因，該多肽包含第一嵌合抗原受體(CAR)及第二CAR，其中該第一CAR及該第二CAR各自包含：單鏈片段(scFv)、跨膜域、及基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。

在一些實施例中，該轉位子係DNA轉位子，其選自由睡美人(Sleeping Beauty)轉位子、piggyBac轉位子、及Tc Buster轉位子所組成之群組，或係反轉錄轉位子，諸如R2轉位子。在一些實施例中，該轉位子係睡美人轉位子。

在一些實施例中，該轉殖基因的長度至少係5000個核苷酸。在一些實施例中，該轉殖基因的長度至少係6000、7000、8000、9000、或10,000個核苷酸。在一些實施例中，該轉殖基因的長度大於10kb。

在一些實施例中，該轉殖基因中用於每個ITAM的編碼序列係經密碼子最佳化，使其與12個或更長之連續核苷酸中的其他者不具有序列同一性。在一些實施例中，該轉殖基因中用於每個ITAM的編碼序列係經密碼子最佳化，使其與9個或更長之連續核苷酸中的其他者不具有序列同一性。

在一些實施例中，該ITAM係蛋白質的細胞質信號傳導序列，該蛋白質係選自由TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d所組成之群組。在一些實施例中，該ITAM係CD3ζ。

在另一實施例中，亦提供一種細胞，其包含如本揭露之轉位子。在一些實施例中，該細胞係T細胞、NK細胞、NKT細胞、單核細胞、巨噬細胞、周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)、或其前驅細胞（例如iPSC）。

在一些實施例中，該細胞進一步包含轉位酶。在一些實施例中，該轉位酶係選自由piggyBac ^®轉位酶、piggy-Bac ^®樣轉位酶、Super piggyBac ^®(SPB)轉位酶、piggyBat轉位酶、睡美人轉位酶、超活性睡美人(SB100X)轉位酶、Helitron轉位酶、Tol2轉位酶、TcBuster轉位酶、或超活性TcBuster轉位酶所組成之群組。在一些實施例中，該轉位酶係睡美人轉位酶SB100X。

另一實施例提供一種製備經轉染淋巴球的方法，其包含自供體對象獲取包含T細胞的一樣本；使用轉位子培養該樣本，以將該等T細胞進行轉染，從而產生經轉染T細胞；及在採集該等T細胞之前，培養包含該等經轉染T細胞的該樣本少於96小時，以產生一經採集樣本，其中該經採集樣本中至少40%的T細胞係初始(naïve) T細胞。在一些實施例中，該經採集樣本中至少50%的T細胞係初始T細胞。

在一些實施例中，該等初始T細胞之特徵在於CD45RA+及CCR7+。在一些實施例中，該等初始T細胞進一步之特徵在於CD62L ⁺、CD27 ⁺、及CD28 ⁺。

在一些實施例中，該等T細胞在該轉染前未經活化。在一些實施例中，該等T細胞在該轉染前未經富集。

在一些實施例中，該轉殖基因的長度至少係5000個核苷酸。在一些實施例中，該轉殖基因的長度至少係6000個核苷酸。在一些實施例中，該轉殖基因的長度大於10kb。在一些實施例中，該轉位子包含編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)的轉殖基因。

在另一實施例中，提供一種製備表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)的淋巴球的方法，其包含：獲取一生物樣本，其包含來自人類對象的淋巴球；向該等淋巴球引入轉位酶及轉位子，該轉位子包含編碼包含該CAR或該TCR之多肽的轉殖基因；及採集包含該轉位酶及該轉位子的淋巴球，其中對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後之96小時內。

在一些實施例中，該轉位酶及該轉位子係經由實體遞送方法（諸如電穿孔、核轉染(nucleofection)、脂質轉染(lipofection)、超聲波、或磁轉染(magnetofection)）引入該等淋巴球。在一些實施例中，該轉位酶及該轉位子係經由電穿孔引入該等淋巴球。轉位酶可以DNA、mRNA或蛋白質的形式遞送至細胞中。

在一些實施例中，對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後之48小時內。在一些實施例中，該方法進一步包含對經採集之該等淋巴球進行冷凍保存，或將經採集之該等淋巴球注射於患者，其中該冷凍保存或該注射發生於獲取該生物樣本後之48小時內。

在一些實施例中，該方法不包括淋巴球活化。在一些實施例中，該方法不包括淋巴球富集。在一些實施例中，該方法不包括淋巴球擴增。在一些實施例中，對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後之36小時內。

在一些實施例中，該等淋巴球係NK細胞。在一些實施例中，該等淋巴球係NKT細胞。在一些實施例中，該等淋巴球係T細胞。在一些實施例中，將該轉殖基因整合至基因體中之該等T細胞的至少40%在採集時係初始T細胞。在一些實施例中，該等初始T細胞係CD45RA ⁺及CCR7 ⁺。

在一些實施例中，該多肽進一步包含第二CAR，且該第一CAR及該第二CAR各自包含：單鏈片段(scFv)、跨膜域、及基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。在一些實施例中，該多肽包含總共三或四個CAR，每個CAR包含scFv、跨膜域、及ITAM。在一些實施例中，該轉位子包含二或更多個轉殖基因，其等共同編碼二、三、四或更多個CAR。

在一些實施例中，該轉位子係DNA轉位子，其選自由睡美人轉位子、piggyBac轉位子、及TcBuster轉位子所組成之群組，或係反轉錄轉位子。在一些實施例中，該轉位子係睡美人轉位子，且該轉位酶係睡美人轉位酶。在一些實施例中，該轉殖基因的長度至少係5000個核苷酸。在一些實施例中，該轉殖基因的長度大於10kb。

在一些實施例中，經受轉染之該樣本包含至少25×10 ⁶個細胞。在一些實施例中，經受轉染之該樣本包含至少50×10 ⁶個細胞。在一些實施例中，該轉染係於體積為0.5 mL至2 mL的溶液中進行。在一些實施例中，該轉染導致該樣本中至少40%的T細胞或淋巴球經轉染。

相關申請案之交互參照

本申請案主張2022年5月27日申請之美國臨時專利申請案第63/346,547號，及2023年3月24日申請之美國臨時專利申請案第63/492,110號之優先權，二者特此以引用方式全文併入本文中。 定義

為了能更輕易理解本揭露，以下先定義某些用語。下列用語及其他用語之額外定義係在本說明書中各處闡述。

除非有具體陳述或自上下文中明顯可知，如本文中所使用，用語「或(or)」係理解為涵括性的且同時涵蓋「或(or)」與「及(and)」。

在本文中，將使用用語「及/或(and/or)」之處認為是具體揭露兩個指定特徵或組分之各者（包含或不包含另一者）。因此，如用於諸如「A及/或B」之詞組中的用語「及/或」在本文中係意欲包括A及B；A或B；A（單獨）；及B（單獨）。同樣地，如用於諸如「A、B、及/或C (A, B, and/or C)」之詞組中的用語「及/或(and/or)」係意欲涵蓋下列態樣之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A（單獨）；B（單獨）；及C（單獨）。

除非特定陳述或從上下文顯而易見，否則用語「約(about)」係指藉由所屬技術領域中具有通常知識者所判定之特定值或組成之可接受誤差範圍內之一值或組成，其將部分取決於該值或組成如何測量或判定，即，測量系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含(comprising essentially of)」可意指根據所屬技術領域中之實踐之一或多個標準差內。「約」或「基本上包含」可意指至多10%之範圍（即±10%）。因此，「約」可理解為在10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、或0.001%內大於或小於所述值。例如，約5 mg可包括在4.5 mg與5.5 mg之間的任何量。此外，特別是關於生物系統或程序，用語可意指至多一個數量級或至多5倍之值。除非另外說明，否則在本揭露中提供特定值或組成時，應假設「約」或「基本上包含」之意義係在該特定值或組成之可接受誤差範圍內。

「投予(administering)」係指使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何各種方法及遞送系統將藥劑實體引入至對象，諸如本文所揭示之經修飾之T細胞。用於本文所揭示之配方的例示性投予途徑包括靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、脊椎、或其他腸胃外投予途徑，例如藉由注射或輸注。片語「腸胃外投予(parenteral administration)」意指除腸內及局部(topical)投予以外的投予模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴內(intralymphatic)、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊椎內、硬膜外、及胸骨內注射及輸注、以及體內電穿孔。在一些實施例中，配方經由非腸胃外途徑投予，例如經口。其他非腸胃外途徑包括局部、上皮或黏膜投予途徑，例如，鼻內、陰道內、直腸、舌下、或局部。亦可執行投予，例如一次、多次、及/或經過一或多個延伸週期。

用語「同種異體(allogeneic)」係指衍生自一個個體之任何材料，其接著引入相同物種之另一個體，例如同種異體T細胞移植。

用語「抗體(antibody)」(Ab)包括但不限於特異性結合至抗原之醣蛋白免疫球蛋白。一般而言，且抗體可包含至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈，其等藉由二硫鍵或其抗原結合分子互相連接。各H鏈包含重鏈可變區（在本文中縮寫為VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定域，CH1、CH2、及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（在本文中縮寫為VL）及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域，CL。VH及VL區可進一步細分成高度變異區，稱為互補決定區(CDR)，其中散布稱為架構區(FR)之更具保守性的區。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，以下列順序從胺基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合域。Ab之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統之第一組分(C1q)。一般而言，人類抗體係大約150 kD之四聚體藥劑，由兩個同一之重(H)鏈多肽（各自約50 kD）及兩個同一之輕(L)鏈多肽（各自約25 kD）組成，其等彼此締合成一般稱為「Y形狀」結構。重鏈及輕鏈藉由單一二硫鍵彼此相連或連接；其他兩個二硫鍵將重鏈鉸鏈區彼此連接，使得二聚體彼此連接並形成四聚體。天然產生之抗體亦經醣化，例如在CH2域上。

「抗原結合分子(antigen binding molecule)」、「抗原結合部分(antigen binding portion)」、「抗原結合片段(antigen binding fragment)」、或「抗體片段(antibody fragment)」係指包含衍生分子之抗體之抗原結合部分（例如CDR）之任何分子。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括但不限於形成自抗原結合分子之Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體、及多特異性抗體。肽體(peptibody)（亦即，包含肽結合域之Fc融合分子）係合適抗原結合分子之另一實例。在一些實施例中，抗原結合分子結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中，抗原結合分子結合至涉及過度增生性疾病之細胞上的抗原或結合至病毒或細菌抗原。在某些實施例中，抗原結合分子係嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。

用語「可變區(variable region)」或「可變域(variable domain)」可互換使用。可變區一般係指抗體之一部分，通常係輕鏈或重鏈之一部分，一般係成熟重鏈中胺基端的約110至120個胺基及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其在抗體之間的序列差異很大，且係用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列之變異性集中在稱為互補決定區(CDR)之區中，而可變域中更高度保守的區稱為架構區(FR)。不希望受任何特定機制或理論束縛，咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之交互作用及特異性。在某些實施例中，可變區係人類可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及人類架構區(FR)。在特定實施例中，可變區係靈長類（例如非人類靈長類）可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及靈長類（例如非人類靈長類）架構區(FR)。

用語「VL」及「VL域(VL domain)」可互換使用以指抗體或其抗原結合分子之輕鏈可變區。

用語「VH」及「VH域(VH domain)」可互換使用以指抗體或其抗原結合分子之重鏈可變區。

CDR之一些定義係通常使用：Kabat編號、Chothia編號、AbM編號、或contact編號。AbM定義係Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體所使用之兩者之間之妥協。Contact定義係基於可用複雜晶體結構之分析。

用語「自體(autologous)」係指任何衍生自相同個體之材料，該材料之後會再重新引入至該個體。例如，本文所述之經工程改造之自體細胞療法(eACT ^™)方法涉及自患者收集淋巴球，接著將其工程改造以表現例如CAR構築體，接著投予回同一位患者。

「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」或「CAR」係指經工程改造以包含結合模體之分子及活化免疫細胞（例如T細胞，諸如初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞、或其組合）在抗原結合時之手段。CAR亦稱為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。在一些實施例中，CAR包含結合模體、胞外域、跨膜域、一或多個共刺激域、及胞內信號傳導域。已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體之T細胞可稱為CAR T細胞。「胞外域(extracellular domain)」（或「ECD」）係指多肽之部分，其當多肽存在於細胞膜中時，應理解為位於細胞膜外之胞外空間中。

「T細胞受體」或「TCR」係指存在於T細胞表面上之抗原識別分子。在正常T細胞發展期間，四個TCR基因α、β、γ、及δ之各者可重新排列導致高度不同之TCR蛋白質。

用語「異源(heterologous)」意指來自非天然存在之序列的任何來源。例如，作為共刺激蛋白質之一部分包括的異源序列係非天然存在之胺基酸，亦即與野生型人類共刺激蛋白質不一致。例如，異源核苷酸序列係指野生型人類共刺激蛋白質編碼序列以外的核苷酸序列。

用語「同一性(identity)」係指聚合分子之間的整體相關性，例如在核酸分子之間（例如DNA分子及/或RNA分子）及/或多肽分子之間。與兩個所提供之多肽序列之間的同一性百分比計算的方法係已知的。例如可藉由比對二個序列以用於最佳比較目的來執行兩個核酸或多肽序列之同一性百分比之計算（例如可在第一及第二序列中之一或兩者中引入間隙以用於最佳比對，且可出於比較目的忽略非同一性序列）。接著比較對應位置處之核苷酸或胺基酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之對應位置同一之殘基（例如核苷酸或胺基酸）佔據時，則分子在彼位置處係同一的。兩個序列之間的同一性百分比係序列共有的相同位置數目之函數，其可選地考慮間隙數目及各間隙之長度，可能需要引入間隙以達到兩個序列之最佳比對。可使用數學演算法（諸如BLAST（基本局部比對搜尋工具））實現序列之比較或比對及兩個序列之間的同一性百分比之判定。在一些實施例中，若其序列係至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），則聚合分子視為彼此「同源」。

免疫療法之免疫細胞可來自所屬技術領域中已知之任何來源。例如，免疫細胞可體外分化自造血幹細胞群體，或免疫細胞可獲自對象。免疫細胞可得自例如周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積水、脾臟組織、及腫瘤。此外，免疫細胞可衍生自所屬技術領域中可用之一或多種免疫細胞系。免疫細胞亦可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何數量之技術，諸如FICOLL ^™分離及/或血球分離來自對象收集之血液之單位獲取。免疫細胞療法單離免疫細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號，其以全文以引用方式併入本文中。

「患者(patient)」包括任何罹患癌症（例如，淋巴瘤或白血病）之人類。用語「對象(subject)」及「患者」在本文中可互換使用。

用語「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」係指分子或組成物當向接受者投予時，對其接受者無害，或對其接受者的益處超過任何有害效應。關於用於調配如本文所揭示之組成物的載劑、稀釋劑、或賦形劑，醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑必須與組成物之其他成分相容且對其接受者無害，或對接受者的益處必須超過任何有害效應。用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」意指醫藥上可接受之材料、組成物、或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、或溶劑包封材料，其涉及將藥劑自身體之一個部分攜帶或運輸至另一部分（例如自一個器官至另一個）。在醫藥組成物中存在之各載體在與配方之其他成分相容之情況下必須係「可接受(acceptable)」，且對患者無害，或必須對接受者的益處超過任何有害效應。可用作醫藥上可接受之載劑之材料的一些實例包含：糖，諸如乳糖、葡萄糖、及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油、及黃豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇、及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；洋菜；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無致熱原的水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酐；及醫藥配方中採用的其他非毒性相容物質。

用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指其中活性劑與一或多種醫藥上可接受之載劑調配在一起之組成物。在一些實施例中，活性劑以適於治療方案中投予之單位劑量存在，該治療方案展示當向相關對象或群體投予時達成預定治療效果之統計顯著機率。在一些實施例中，醫藥組成物可經調配以固體或液體形式投予，包含但不限於適用於以下形式：口服投予，例如灌劑（水性或非水性溶液或懸浮液）、錠劑，例如用於經頰、舌下、及全身性吸收者、丸劑、散劑、顆粒劑、施用於舌頭之糊劑；腸胃外投予，例如藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射作為例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放配方；局部施用，例如作為乳膏、軟膏或控制釋放貼片、或施用至皮膚、肺或口腔之噴霧；陰道內或直腸內，例如作為栓劑、乳膏或泡沫；舌下；眼；經皮膚；或經鼻、肺及其他黏膜表面。

用語「降低(reducing)」及「減少(decreasing)」在本文中可互換使用，並且指示任何小於原始者之改變。「降低」及「減少」係相對用語，需要測量前後之間的比較。「降低」及「減少」包括完全耗盡。

用語「參考(reference)」描述與其進行比較之標準或控制。舉例而言，在一些實施例中，將所關注之藥劑、動物、個體、群體、樣本、序列、或值與作為藥劑、動物、個體、群體、樣本、序列、或值之參考或對照相比較。在一些實施例中，將所關注之測試、測量或判定與參考或對照實質上同時測試、測量及/或判定。在一些實施例中，參考或對照係歷史參考或對照，該歷史參考或對照可選地實施在有形介質中。通常，參考或對照係在與評估對象相當的條件或情況下判定或表徵的。當存在足夠的相似性以證明對所選擇之參考或對照的依賴及/或比較是合理的。

用語「縮短的自體程序(shortened autologous process)」係指在小於7天、小於5天、小於3天、小於1天、小於18小時、小於12小時、小於6小時、小於4小時、或小於兩小時內完成的基於轉位子之CAR T細胞製造程序。

治療劑（例如經工程改造之CAR T細胞）之「治療有效量(therapeutically effective amount)」、「有效劑量(effective dose)」、「有效量(effective amount)」、或「治療有效劑量(therapeutically effective dosage)」係任何量，當單獨或與另一治療劑組合使用時，保護對象免受疾病之發作或促進疾病回歸，表現為疾病症狀之嚴重程度降低、疾病無症狀期之頻率及持續時間增加，或預防由於疾病折磨造成的損害或殘疾。促進疾病回歸之治療劑之能力可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類對象中、在預測人類功效的動物模型系統中、或藉由在體外檢定中檢定藥劑之活性。

用語「轉導(transduction)」及「轉導(transduced)」係指藉由病毒載體將外來DNA引入細胞中之程序（參見Jones et al., 「Genetics: principles and analysis,」 Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)）。在一些實施例中，載體係反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾司坦-巴爾(Epstein Barr)病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體、或其任何組合。

用語「轉染(transfection)」及「經轉染(transfected)」係指藉由非病毒載體將外來DNA引入細胞中之程序。在一些實施例中，非病毒載體係轉位子。在一些實施例中，轉位子係選自piggyBac ^®(PB)轉位子、piggy-Bac ^®樣轉位子、piggyBac轉位子、睡美人轉位子、Helraiser轉位子、Tol2轉位子、或TcBuster轉位子。在某些進一步的態樣中，轉位子可藉由對應轉位酶整合至細胞的基因體中。在某些態樣中，轉位酶可係但不限於piggyBac ^®轉位酶、piggy-Bac ^®樣轉位酶、Super piggyBac ^®(SPB)轉位酶、piggyBat轉位酶、睡美人轉位酶、超活性睡美人(SB100X)轉位酶、Helitron轉位酶、Tol2轉位酶、TcBuster轉位酶、或超活性TcBuster轉位酶。Helitron轉位酶可係Helibatl轉位酶。

對象之「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指向對象進行之任何類型之干預或過程，或向對象投予活性劑，目的係反轉、緩解、改善、抑制、減緩或預防症狀、併發症或病況之發作、進展、發展、嚴重程度或再發、或與疾病相關聯之生物化學指示。在一個實施例中，「治療(treatment)」或「治療(treating)」」包括部分緩解。在另一實施例中，「治療」包括完全緩解。在一些實施例中，治療可係未展現出相關疾病、病症及/或病況之徵象之對象，及/或僅展現出疾病、病症及/或病況之早期徵象之對象。在一些實施例中，此類治療可係展現出相關疾病、病症及/或病況之一或多種建立徵象之對象。在一些實施例中，治療可係已診斷患有相關疾病、病症及/或病況之對象。在一些實施例中，治療可係已知具有一或多個敏感性因子之對象，該一或多個敏感性因子與相關疾病、病症及/或病況之發展風險增加的統計學上相關。

用語「載體(vector)」係指經修飾以包含或合併所提供核酸序列之接受者核酸分子。一種類型之載體係「質體(plasmid)」，其係指額外DNA可連接之環狀雙股DNA分子。另一種類型之載體係病毒載體，其中額外DNA區段可連接至病毒基因體中。某些載體能夠在其等被引入的宿主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起源之細菌載體及游離基因(episomal)哺乳動物載體）。其他載體（例如非游離基因哺乳動物載體）在引入宿主細胞中後可整合至宿主細胞之基因體中，且藉此與宿主基因體一起複製。此外，某些載體包含直接表現可操作性地連接至其之插入基因之序列。此類載體在本文中可稱為「表現載體(expression vector)」。標準技術可用於載體之工程改造，例如，見於Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))，其以引用方式併入本文中。 非病毒載體

如前所述，以病毒載體產生CAR及TCR細胞涉及加工成本、先天之安全風險、及編碼序列之大小限制。咸信，反轉錄病毒載體僅能攜帶長度小於6千鹼基(kilobase, KB)的有效負載，而慢病毒載體可攜帶略長於7.5 KB的有效負載。此對於一般CAR或TCR編碼序列而言可能足夠，但對於雙順反子(bi-cistronic)的編碼序列而言則幾乎不夠，更遑論進一步提高一般CAR或TCR之效果及安全性所需的增強元件。

許多非病毒方法正在研究當中。然而，本發明人在本文中展示，轉位子系統可克服基於病毒載體之系統所面臨的各種挑戰。首先，轉位子系統可克服病毒載體在有效負載大小方面的實體限制。數項經測試之DNA轉位子可支援大於10 kb的有效負載，允許併入可能有助於提升治療細胞產品的多個CAR及/或增強元件。在某些態樣中，基於轉位子之系統將多基因編輯簡化至單一步驟轉染。

其次，當二或更多個CAR一起使用時，其等很可能共享長串相似的序列。例如，雙順反子CAR中的兩個CAR可能包括相同的基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)，諸如CD3ζ。此種同源性可引起重組，導致CAR中之任一或兩者的缺失或截短。在慢病毒系統中確實已觀察到此種重組。隨著基因工程的複雜性增加，出現重組問題的風險亦會增加。

如實例1所示，即使藉由密碼子最佳化及序列搖擺(sequence wobbling)使CD3ζ的兩個複製體之間的同源性最小化，在慢病毒轉導後仍有大量重組，如表現蛋白的多種變體所表示。然而，在實例1中使用轉位子系統，導致此種重組降低，並完全消除最具破壞性的重組（例如變體V1及V15，有大的截短/缺失；例如參見表1）。

同時，轉位子系統可作為病毒載體的替代方案，提供類似的轉染效率、細胞存活率、及整合穩定性（例如參見 表 2 至表 8）。

然而，習知基於病毒載體之自體細胞療法的又一挑戰，在於與其相關之長加工時間及高成本。典型基於慢病毒載體之自體細胞療法程序大約需要7至10天。此種習知程序的關鍵步驟包括T細胞活化、T細胞富集及擴增。然而，本發明人得以開發出一種基於轉位子的程序，其可以在24小時內完成，無需T細胞活化、T細胞富集或擴增。

令人驚訝的是，如此大幅加速的程序，即使在較低劑量下，相較於習知基於慢病毒載體於較高劑量下之7天程序仍可實現更大的體內效果（ 實例 4 及實例 5）。該等實例中所示之資料（例如 表 9 及表 14）表明，縮短的程序導致採集更高濃度的初始T細胞，其有助於改良治療效果。

同樣重要的是，如 表 12 及表 13所示，此等轉位子的轉染所引起的細胞死亡相對較少，且經轉染T細胞能夠迅速擴增。

在 實例 8中，針對「睡美人」與TcBuster（另一轉位子系統）進行比較。結果顯示，兩種轉位子系統皆可產生高效率的CAR-T細胞。使用睡美人及TcBuster轉位子系統（或用慢病毒載體）所製備的CAR-T細胞，皆可在Nalm6動物模型中有效抑制腫瘤生長至少20天。

基於此等成功的程序開發，本發明人亦能夠開發出在起始材料中利用50×10 ⁶至100×10 ⁶個細胞（適用於數十億個細胞）的大規模程序（相較於此，試驗性小規模研究中則係5×10 ⁶個）。有趣的是，較大的規模不僅未降低程序的效果或品質，且亦實際上使細胞存活率及轉染效率顯著提高。

因此，根據本揭露之一實施例，提供一種轉位子，其包括編碼一或多個多肽之轉殖基因，該多肽包括嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。在某些態樣中，轉殖基因編碼二、三、四、五、六、七、八、九、或十個不同多肽，其中一或多個多肽係嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。

在一些實施例中，轉殖基因的長度至少係500個核苷酸。在一些實施例中，轉殖基因的長度至少係600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000 6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、或20,000個核苷酸。在某些進一步的實施例中，轉殖基因的長度可大於20,000個核苷酸。在一些實施例中，轉殖基因的長度不超過10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、20,000、25,000、或30,000個核苷酸。

在一些實施例中，轉殖基因包括兩個共享同源性的片段。在一些實施例中，同源性係指至少70%的序列同一性。在一些實施例中，同源性係指至少75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的序列同一性。在一些實施例中，兩個片段分別位於不同的CAR或TCR序列中。

此種片段的一實例係基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。ITAM一般見於非催化性之酪胺酸磷酸化受體的細胞質尾端，該等受體係主要見於免疫細胞上的細胞表面蛋白。其係啟動各種信號傳導途徑及後續活化免疫細胞之必要組分。ITAM之非限制性實例包括蛋白質的細胞質信號傳導序列，諸如TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d。特定實例係CD3ζ。

此種同源性亦可見於CAR或TCR序列的其他部分中，諸如但不限於連結子、胞外鉸鏈、跨膜域、胞內信號傳導域，甚至係抗原結合序列。

在一些實施例中，同源片段經過密碼子最佳化，以在不改變編碼蛋白質的情況下降低序列同一性。在一些實施例中，同源片段經過密碼子最佳化，使其不共享30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8個或更長連續核苷酸的序列同一性。在一些實施例中，同源片段經過密碼子最佳化，使其不共享15個或更長連續核苷酸的序列同一性。在一些實施例中，同源片段經過密碼子最佳化，使其不共享12個或更長連續核苷酸的序列同一性。在一些實施例中，同源片段經過密碼子最佳化，使其不共享10個或更長連續核苷酸的序列同一性。在一些實施例中，同源片段經過密碼子最佳化，使其不共享9個或更長連續核苷酸的序列同一性。在一些實施例中，同源片段經過密碼子最佳化，使其不共享8個或更長連續核苷酸的序列同一性。

在一些實施例中，轉殖基因編碼第一CAR（或TCR）及第二CAR（或TCR），其等可選地經由蛋白酶裂解位點（例如自裂解位點）或核醣體跳躍序列串接。在一些實施例中，第一CAR及該第二CAR各自包括單鏈片段(scFv)、跨膜域、及基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。

在一些實施例中，轉殖基因編碼第三CAR（或TCR）。在一些實施例中，轉殖基因進一步編碼第四CAR（或TCR）。第二CAR、第三或第三CAR（或TCR）中每一者皆可在蛋白酶裂解位點（例如自裂解位點）或核醣體跳躍序列處經裂解，以形成單獨的CAR (TCR)。

在一些實施例中，轉位子包括二、三或四個CAR（或TCR）的編碼序列，但其等不必串接。反之，每個編碼序列可具有自身的啟動子或其他必要的調節序列。 轉位子

本技術所使用之轉位子可係所屬技術領域中已知之任何轉位子，諸如piggyBac ^®(PB)轉位子、piggy-Bac ^®樣轉位子、piggyBat轉位子、睡美人轉位子、Helraiser轉位子、Tol2轉位子、或TcBuster轉位子。

轉位子可藉由對應轉位酶整合至細胞的基因體中。此種整合可係暫時或穩定的整合。轉殖基因表現可係暫時或穩定的轉殖基因表現，其取決於測量時間。轉位酶可係但不限於piggyBac ^®轉位酶、piggy-Bac ^®樣轉位酶、Super piggyBac ^®(SPB)轉位酶、piggyBat轉位酶、睡美人轉位酶、超活性睡美人(SB100X)轉位酶、Helitron轉位酶、Tol2轉位酶、TcBuster轉位酶、或超活性TcBuster轉位酶。Helitron轉位酶可係Helibatl轉位酶。

當轉位子係piggyBac ^®轉位子時，轉位酶可係piggyBac ^®轉位酶或Super piggyBac ^®轉位酶。當轉位子係piggy-Bac ^®樣轉位子時，轉位酶可係piggy-Bac ^®樣轉位酶。當轉位子係睡美人轉位子時，轉位酶可係睡美人轉位酶。當轉位子係Helraiser轉位子時，轉位酶可係Helitron轉位酶。當轉位子係Tol2轉位子時，轉位酶可係Tol2轉位酶。當轉位子係TcBuster轉位子時，轉位酶可係TcBuster轉位酶或超活性TcBuster轉位酶。

在一實施例中，轉位子係睡美人轉位子。睡美人轉位子可包括在任一末端側接反向重複序列(inverted repeat)的核酸，該等反向重複序列可由具有睡美人轉位酶活性的酵素加以辨識。所稱「辨識」係指睡美人轉位酶能夠與反向重複序列結合，並接著將側接反向重複序列的轉位子整合至目標細胞的基因體中。本標的方法之睡美人轉位子中可見的代表性反向重複序列包括於WO 98/40510及WO 99/25817所揭示者。特別值得關注的係由轉位酶所辨識的反向重複序列，該轉位酶與WO 99/25817之SEQ ID NO:1共享至少約80%的胺基酸同一性。

在一些實施例中，轉位子的每個反向重複序列包括至少一個正向重複序列(direct repeat)。轉位子元件係線性核酸片段，其可作為線性片段使用或環狀化（例如在質體中）。替代地，亦可使用載體，諸如環狀質體、微環質體、及奈米質體。在某些態樣中，編碼轉位子的主鏈可係100 bp至4 kb之間之任何長度。攜帶所關注之基因的轉位子可以各種DNA格式（質體、質體替代物、線性DNA或ds/ss DNA）遞送。在某些實施例中，每個反向重複序列中有兩個正向重複序列。例如，正向重複序列之實例可見於WO 98/40510。微環質體係超螺旋DNA分子，其長度約係4,000 bp（例如介於3000 bp與5000 bp之間）。在一實施例中，質體係線性質體。在一實施例中，質體係環狀質體。在一實施例中，質體係奈米質體。在一實施例中，質體係微環質體。如實例所示，微環質體有助於實現高轉染效率。

睡美人轉位子可藉由對應的轉位酶整合至目標基因體，諸如WO 2017/158029中所述之SB10及SB100X。 CAR 及 TCR 序列

本文亦提供CAR及TCR序列之實例。CAR包括抗原結合部分，其通常係衍生自抗體的單鏈片段(scFv)。CAR可係單特異性、雙特異性、或多特異性。在某些態樣中，基於轉位子之系統將多基因編輯簡化至單一步驟轉染。另外，本揭露之轉位子所攜帶的構築體（或有效負載）可包括二或更多個CAR分子。特定實例係雙順反子CAR，其中兩個CAR經由可消化連結子或核醣體跳躍序列連接。同樣地，雙順反子TCR亦可包括於有效負載中。在某些態樣中，本揭露之轉位子所攜帶的構築體（或有效負載）可編碼三個CAR。在某些態樣中，本揭露之轉位子所攜帶的構築體（或有效負載）可編碼四或更多個CAR。在某些進一步的態樣中，本揭露之轉位子所攜帶的構築體（或有效負載）可進一步編碼多肽，該等多肽會增強表現一或多個CAR之T細胞的細胞毒性潛力。

在某些實施例中，編碼雙順反子、三順反子、或四順反子CAR的構築體包括靶向第一抗原的第一CAR及靶向第二抗原的第二CAR。第一抗原及第二抗原可選自5T4、α胎兒蛋白、B細胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD56、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、C型凝集素樣分子1 (CLL-1)、EGFRvIII、上皮性腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2之組合、HER2-HER3之組合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1包膜醣蛋白gp41、HIV-1包膜醣蛋白gp120、IL-11Rα、κ鏈、λ鏈、黑色素瘤相關抗原、間皮素(mesothelin)、MUC-1、經突變p53、經突變ras、前列腺特異性抗原、ROR1、VEGFR2，或其等之組合。

在一些實施例中，靶向第一CAR、第二CAR、第三CAR、或第四CAR的抗原係以下中之一者：2B4 (CD244)、4-1BB、5T4、A33抗原、腺癌抗原、腎上腺素受體β3 (ADRB3)、A激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)、α胎兒蛋白(AFP)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、雄性激素受體、B7H3 (CD276)、β2整合素、BAFF、B淋巴瘤細胞、B細胞成熟抗原(BCMA)、bcr-abl（由斷點簇集區(BCR)及Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1 (Abl)所組成之致癌基因融合蛋白）、BhCG、骨髓基質細胞抗原2 (BST2)、CCCTC結合因子（鋅指蛋白質）樣（BORIS或印記位點調節物兄弟）、BST2、C242抗原、9-0-乙醯基-CA19-9標記、CA-125、CAEX、鈣網蛋白、碳酸酐酶9 (CAIX)、C-MET、CCR4、CCR5、CCR8、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD7、CD10、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23（IgE受體）、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30 (TNFRSF8)、CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD51、CD52、CD56、CD63、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD96、CD97、CD100、CD123、CD125、CD133、CD137、CD138、CD150、CD152 (CTLA-4)、CD160、CD171、CD179a、CD200、CD221、CD229、CD244、CD272 (BTLA)、CD274 (PDL-1、B7H1)、CD279 (PD-1)、CD352、CD358、CD300分子樣家族成員f (CD300LF)、癌胚抗原(CEA)、密連蛋白6 (CLDN6)、C型凝集素樣分子-1（CLL-1或CLECL1）、C型凝集素域家族12成員A (CLEC12A)、巨細胞病毒(CMV)感染之細胞抗原、CNT0888、CRTAM (CD355)、CS-1（亦稱為CD2子集1、CRACC、CD319、及19A24）、CTLA-4、週期蛋白B l、染色體X開讀框61 (CXORF61)、細胞色素P450 1B 1 (CYP1B1)、DNAM-1 (CD226)、橋粒芯蛋白4、DR3、DR5、E-鈣黏素新表位、上皮生長因子受體(EGFR)、EGF1R、上皮生長因子受體變體III (EGFRvIII)、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)、突變型延伸因子2 (ELF2M)、內皮唾液酸蛋白、上皮細胞黏附分子(EPCAM)、A型蝶素受體2 (EphA2)、蝶素B2、受體酪胺酸蛋白質激酶erb-B2,3,4 (erb-B2,3,4)、ERBB、ERBB2 (Her2/neu)、ERG（跨膜絲胺酸蛋白酶2 (TMPRSS2) ETS融合基因）、ETA、位於染色體12p上之ETS易位變體基因6 (ETV6-AML)、IgA受體之Fc片段（FCAR或CD89）、纖維母細胞活化蛋白α (FAP)、FBP、Fc受體樣5 (FCRL5)、胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)、纖連蛋白外域B、Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)、葉酸結合蛋白(FBP)、葉酸受體1、葉酸受體α、葉酸受體β、Fos相關抗原1、岩藻醣基、岩藻醣基GM1；GM2、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)、GITR (TNFRSF 18)、GM1、神經節苷脂GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、GP 100、globoH糖神經醯胺(GloboH)之六醣部分、醣蛋白75、磷脂肌醇聚醣-3 (GPC3)、醣蛋白100 (gplOO)、GPNMB、G蛋白偶聯受體20 (GPR20)、G蛋白偶聯受體C型家族5成員D (protein-coupled receptor class C group 5, member D, GRC5D)、A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)、人類上皮生長因子受體2 (HER-2)、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMWMAA)、人類乳突狀瘤病毒E6 (HPV E6)、人類乳突狀瘤病毒E7 (HPV E7)、突變之熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)、人類分散因子受體激酶、人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)、HVEM、ICOS、胰島素樣生長因子受體1（IGF-1受體）、IGF-I、IgGl、免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)、IL-6、介白素11受體α (IL-11Ra)、IL-13、介白素-13受體次單元α-2（IL-13Ra2或CD213A2）、胰島素樣生長因子I受體(IGF1-R)、整合素α5β1、整合素ανβ3、腸羧基酯酶、κ-輕鏈、KCS1、激酶插入域受體(KDR)、KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、KIR-L、KG2D配體、KIT (CD117)、KLRGI、LAGE-la、LAG3、淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)、白血球免疫球蛋白樣受體子家族A成員2 (LILRA2)、豆莢蛋白(legumain)、白血球相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)、路易士(Y)抗原、LeY、LG、LI細胞黏附分子(LI-CAM)、LIGHT、LMP2、淋巴球抗原6複合物、LTBR、基因座(locus) K 9 (LY6K)、Ly-6、淋巴球抗原75 (LY75)、黑色素瘤癌睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2 (MAD-CT-1)、MAGE、黑色素瘤相關抗原1 (MAGE-A1)、T細胞辨識之MAGE-A3黑色素瘤抗原1（MelanA或MARTI）、MelanA/MARTl、間皮素、MAGE A3、黑色素瘤凋亡抑制劑ML-IAP)、黑色素瘤特異性硫化軟骨蛋白多醣(MCSCP)、MORAb-009、MS4A1、黏蛋白1 (MUCl)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC16、黏蛋白CanAg、II型密拉氏管抑制物質(MIS)受體、v-myc禽骨髓瘤細胞病毒致癌基因神經母細胞瘤衍生性同源物(MYCN)、N-羥乙醯神經胺酸、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶V (Na17)、神經細胞黏附分子(NCAM)、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E配體、NKR-P IA、NPC-1C、NTB-A、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、NY-ESO-1、致癌胎兒抗原(h5T4)、嗅覺受體51E2 (OR51E2)、OX40、漿細胞抗原、poly SA、前頂體素結合蛋白sp32 (OY-TES l)、p53、p53突變體、泛連接蛋白3 (PANX3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)、成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)、前列腺癌腫瘤抗原1（PCTA-1或半乳糖凝集素8）、PD-1H、血小板衍生生長因子受體α (PDGFR-α)、PDGFR-β、PDL192、PEN-5、磷脂絲胺酸、胎盤特異性蛋白1 (PLAC1)、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌細胞、前列腺蛋白(prostein)、蛋白酶絲胺酸21（睪素或PRSS21）、蛋白酶3 (PR1)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、蛋白酶體（前體、巨蛋白因子）次單元β型、晚期糖化終產物受體(RAGE-1)、RANKL、Ras突變體、Ras同源物家族成員C (RhoC)、RON、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、腎遍在蛋白1 (renal ubiquitous 1, RU1)、腎遍在蛋白2 (RU2)、肉瘤易位斷點、由T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)、SAS、SDC1、SLAMF7、唾液酸基路易士黏附分子(sLe)、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、音蝟因子(SHH)、精子蛋白17 (SPA17)、階段特異性胚胎抗原4 (SSEA-4)、STEAP、sTn抗原、滑膜肉瘤X斷點2 (SSX2)、存活素、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、TCR5y、TCRa、TCRB、TCRγ交替讀框蛋白(TARP)、端粒酶、TIGIT TNF-α前驅物、腫瘤內皮標記1 (TEM1/CD248)、腫瘤內皮標記7相關蛋白(TEM7R)、肌腱蛋白C、TGF-β2、TGF-β、轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)、促血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)、TIM1、TIM2、TIM3、Tn Ag、TRAIL-R1、TRAIL-R2、酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)、促甲狀腺激素受體(TSHR)、腫瘤抗原CTAA16.88、酪胺酸酶、ROR1、TAG- 72、尿溶蛋白2 (UPK2)、VEGF-A、VEGFR-1、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、及波形蛋白、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)蛋白(WT1)、或X抗原家族成員1A (XAGE1)。

在一個實施例中，第一抗原及第二抗原分別係CD19及CD20。表A中提供抗CD19及抗CD20抗體及片段之實例序列，以及其等之雙順反子版本。 表 A. 實例抗原結合序列

名稱	序列
抗CD20 v01 VH/VL	SEQ ID NO:1 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGSWYSNWFDPWGQGTMVTVSS SEQ ID NO:2 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQDRSLPPTFGGGTKVEIK
抗CD20 v02 VH/VL	SEQ ID NO:3 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGIHWNWIRQPPGKGLEWIGDIDTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLGQESATYLGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:4 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLYTYPFTFGGGTKVEIK
抗CD20 v03 VH/VL	SEQ ID NO:5 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIK
抗CD20 v04 VH/VL	SEQ ID NO:7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKEYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYSGHTYYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGPHYDDWSGFIIWFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRFPPTFGQGTKVEIK
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抗CD20/抗CD19雙順反子CAR v01	SEQ ID NO:26 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAALDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIKAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
抗CD20/抗CD19雙順反子CAR v02	SEQ ID NO:27 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIKGGGGSGKPGSGEGGSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGKPGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSAAALDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

本揭露的CAR除了抗原結合分子外，亦可包括鉸鏈、跨膜域，及/或胞內域。在一些實施例中，胞內域可包括共刺激域及活化域。

鉸鏈可係定位於結合模體與跨膜域之間的抗原結合系統之胞外域。鉸鏈亦可稱為胞外域或「間隔子」。鉸鏈可有助於受體表現、活性、及/或穩定性。鉸鏈亦可提供接近目標抗原之靈活性。在一些實施例中，鉸鏈域係定位於結合模體與跨膜域之間。

在一些實施例中，鉸鏈係、來自、或衍生自（例如包含所有或片段的）免疫球蛋白樣鉸鏈域。在一些實施例中，鉸鏈域來自免疫球蛋白或衍生自免疫球蛋白。在一些實施例中，鉸鏈域係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、或IgM、或其片段之鉸鏈。

在一些實施例中，鉸鏈係、來自、或衍生自（例如包含所有或片段的）CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A（B細胞抗原受體複合物相關α鏈）、CD79B（B細胞抗原受體複合物相關β鏈）、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、或鐸配體受體、或其片段或組合。

在一些實施例中，鉸鏈係、來自、或衍生自（例如包含所有或片段的）CD8α之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鍊係、來自、或衍生自CD28之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈係、來自、或衍生自CD8α之鉸鏈的片段或CD28之鉸鏈的片段，其中該片段不是整個鉸鏈。在一些實施例中，CD8α鉸鏈之片段或CD28鉸鏈之片段包含排除CD8α鉸鏈或CD28鉸鏈之N端、或C端、或兩者之至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或至少20個胺基酸的胺基酸序列。

「跨膜域(transmembrane domain)」係指當在細胞表面或細胞膜存在於分子中時，具有存在於膜中之屬性的域（例如跨越一部分或所有細胞膜）。不需要跨膜域中之每一胺基酸存在於膜中。舉例而言，在一些實施例中，跨膜域特徵在於蛋白質之指定段或部分實質上位於膜中。可使用多種演算法分析胺基酸或核酸序列以預測蛋白質子細胞定位（例如跨膜定位）。程式psort (PSORT.org)及Prosite (prosite.expasy.org)係此類程式之例示性。

跨膜域可衍生自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白，諸如T細胞受體之α、β、或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD8α、CD8β、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、TNFSFR25、CD154、4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD276 (B7-H3)、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96 (Tactile)、CD5、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83結合之配體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1；CD1-1a/CD18)、MHC第1型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、SLAM (SLAMF1; CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6 (NTB-A; Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。

胞內域（或細胞質域）包含一或多個信號傳導域，其在目標抗原與結合模體結合後造成且/或介導胞內信號，該胞內信號例如活化一或多種免疫細胞效應功能（例如天然免疫細胞效應功能）。在一些實施例中，胞內域之信號傳導域介導免疫細胞之正常效應功能中之至少一者活化。T細胞之效應功能例如可係細胞溶解活性或輔助活性，其包含細胞介素之分泌。在一些實施例中，胞內域之信號傳導域介導T細胞活化、增生、存活、及/或其他T細胞功能。胞內域可包含為活化域的信號傳導域。胞內域可包含為共刺激信號傳導域的信號傳導域。

胞內信號傳導域在抗原與免疫細胞結合時可轉導信號係眾所周知。例如，已知T細胞受體(TCR)之細胞質序列在TCR結合至抗原之後起始信號轉導（參見例如Brownlie et al., Nature Rev. Immunol.13:257-269 (2013)）。

在某些實施例中，合適的信號傳導域包括但不限於4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD5、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83結合之配體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、Ly108)、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1; CD1-1a/CD18)、MHC第1型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、SLAM (SLAMF1; CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6 (NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。

CAR亦可包括共刺激信號傳導域，例如以增加信號傳導效力。參見美國專利第7,741,465、及6,319,494號，以及Krause et al. and Finney et al. (supra), Song et al., Blood 119:696-706 (2012)；Kalos et al., Sci Transl.Med. 3:95 (2011); Porter et al., N.Engl. J.Med. 365:725-33 (2011), and Gross et al., Annu.Rev. Pharmacol.Toxicol.56:59-83 (2016)。透過單獨TCR產生的信號可能不足以完全活化T細胞，且二級或共刺激信號可增加活化。因此，在一些實施例中，信號傳導域進一步包含活化一或多種免疫細胞效應功能（例如本文所述之天然免疫細胞效應功能）的一或多個額外信號傳導域（例如共刺激信號傳導域）。在一些實施例中，可使用此類共刺激信號傳導域之一部分，只要該部分轉導效應功能信號即可。在一些實施例中，本文所述之細胞質域包含T細胞輔助受體（或其片段）之一或多個細胞質序列。此類T細胞共受體之非限制性實例包含CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1)、MYD88、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及與CD83結合之配體。例示性共刺激蛋白質具有天然存在於T細胞上之共刺激蛋白質之胺基酸序列，其共刺激蛋白質之完整天然胺基酸序列係描述於NCBI參考序列：NP 0.1。在某些情況下，CAR包括4-1BB共刺激域。在某些情況下，CAR包括CD28共刺激域。在某些情況下，CAR包括DAP-10共刺激域。

在一些實施例中，CAR進一步包括ITAM。含有特別用於本揭露之初級細胞質信號傳導序列之ITAM的實例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d者。在一些實施例中，ITAM包括CD3ζ。 受體之轉染、整合及表現

本揭露的轉位子可引入目標細胞，具體而言，係免疫細胞，以產生經工程改造細胞。目標細胞較佳的係免疫細胞，諸如T細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞、或其前驅細胞。

將轉位子整合至目標細胞的基因體中需要對應轉位酶的表現。本技術所使用之轉位子可係所屬技術領域中已知之任何轉位子，諸如piggyBac ^®(PB)轉位子、piggy-Bac ^®樣轉位子、piggyBat轉位子、睡美人轉位子、Helraiser轉位子、Tol2轉位子、或TcBuster轉位子。

當轉位子係piggyBac ^®轉位子時，轉位酶可係piggyBac ^®轉位酶或Super piggyBac ^®轉位酶。當轉位子係piggy-Bac ^®樣轉位子時，轉位酶可係piggy-Bac ^®樣轉位酶。當轉位子係睡美人轉位子時，轉位酶可係睡美人轉位酶，諸如SB10或SB100X。當轉位子係Helraiser轉位子時，轉位酶可係Helitron轉位酶。當轉位子係Tol2轉位子時，轉位酶可係Tol2轉位酶。當轉位子係TcBuster轉位子時，轉位酶可係TcBuster轉位酶或超活性TcBuster轉位酶。

轉位酶可作為編碼轉位酶的多核苷酸引入目標細胞中，藉由允許其在目標細胞中表現的啟動子加以調控。

在一些實施例中，轉位子及轉位酶係藉由所屬技術領域中已知方法（諸如電穿孔、核轉染、脂質轉染、超聲波、及磁轉染）引入目標細胞。在一些實施例中，轉位子及轉位酶係藉由電穿孔引入目標細胞。在一些實施例中，含有所關注之插入物之核酸轉位子主鏈與編碼轉位酶之核酸的分子拷貝數比係1:1。在某些進一步的態樣中，含有所關注之插入物之核酸轉位子主鏈與編碼轉位酶之核酸的分子拷貝數比的範圍係介於1:1與1:32之間的任何比。在一些實施例中，含有所關注之插入物之核酸轉位子主鏈與編碼轉位酶之核酸具有相符的拷貝數。在某些態樣中，含有所關注之插入物之核酸轉位子主鏈與編碼轉位酶之核酸的比係1:4、1:8、或1:16。

在整合至目標基因體後，來自轉位子的轉殖基因可經轉錄及轉譯以產生受體蛋白。如所附之實驗性實例所示，此種經整合轉殖基因具有高度穩定性。 細胞製備程序

先前揭示之基於轉位子的技術使本發明人得以開發出一種細胞療法程序，其相較於習知技術大幅縮短。此程序較佳的係自體細胞療法程序，但亦適用於異源(allogenic)細胞。

在一實例中，該程序涉及(1)獲取及/或富集自供體對象獲取之淋巴球之群體；(2)使用本揭露之轉位子及對應轉位酶轉染淋巴球之群體；及(3)採集經轉染淋巴球。在一些實施例中，將經採集之淋巴球投予於患者，諸如供體。在一些實施例中，經採集之淋巴球係經冷凍保存。

在另一實施例中，該程序涉及自供體對象獲取包含淋巴球（例如T細胞）的一樣本；使用轉位子培養樣本，以將淋巴球進行轉染，從而產生經轉染淋巴球；及在採集淋巴球之前，培養包含經轉染淋巴球的樣本，以產生經採集樣本，其中經採集樣本中至少40%的淋巴球係初始細胞。

在一些實施例中，經採集樣本中至少41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、或65%的淋巴球係初始細胞。在一些實施例中，經採集樣本中至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、或65%的T細胞係初始T細胞。

在一些實施例中，初始T細胞之特徵在於具有一或多個標記，諸如CD45RA ⁺、CCR7 ⁺、CD62L ⁺、CD27 ⁺、CD28 ⁺、CD127 ⁺、CD132 ⁺、CD25 ^-、CD44 ^-、CD45RO ^-、及HLA-DR ^-。在一實施例中，初始T細胞之特徵在於CD45RA ⁺及CCR7 ⁺。在一實施例中，初始T細胞之特徵在於CD45RA ⁺、CCR7 ⁺、CD62L ⁺、CD27 ⁺、及CD28 ⁺。在一實施例中，初始T細胞另外之特徵在於CD127 ⁺、CD132 ⁺、CD25 ^-、CD44 ^-、CD45RO ^-及/或HLA-DR ^-。

在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於4天內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於3天內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於2天內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於36小時內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於24小時內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於18小時內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於12小時內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於8小時內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於6小時內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至採集經轉染淋巴球）係於4小時內完成。

在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至植入或冷凍保存經轉染淋巴球）係於4天內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至植入或冷凍保存經轉染淋巴球）係於3天內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至植入或冷凍保存經轉染淋巴球）係於2天內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至植入或冷凍保存經轉染淋巴球）係於36小時內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至植入或冷凍保存經轉染淋巴球）係於24小時內完成。在一些實施例中，整個程序（自獲取供體之淋巴球至植入或冷凍保存經轉染淋巴球）係於18小時內完成。

如於實驗性實例中所觀察，此種改良之自體程序無需淋巴球活化、T細胞富集或擴增。

「淋巴球活化(lymphocyte activation)」或「淋巴球刺激(lymphocyte stimulation)」係指使用一或多種刺激劑來刺激淋巴球群體，以產生經活化之淋巴球群體的程序。一或多種合適之淋巴球刺激劑之任何組合可用於產生經活化之淋巴球群體，包括但不限於：靶向T細胞刺激或共刺激分子的抗體或其功能片段（例如抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD28抗體或其等功能片段）、T細胞細胞介素（例如任何分離、野生型或重組的細胞介素，諸如：介白素1(IL-1)、介白素2(IL-2)、介白素4(IL-4)、介白素5(IL-5)、介白素6(IL-6)、介白素7(IL-7)、介白素12(IL-12)、介白素15(IL-15)、介白素21(IL-21)、介白素23(IL-23)、腫瘤壞死因子α(TNFα)）、或任何其他合適的有絲分裂原（例如十四烷醯佛波醋酸酯(tetradecanoyl phorbol acetate, TPA)、植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)、刀豆球蛋白A(concanavalin A, conA)、脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)、美洲商陸有絲分裂原(pokeweed mitogen, PWM)）或T細胞刺激或共刺激分子之天然配體。

在一些實施例中，淋巴球活化採用抗CD3抗體（或其功能片段）、抗CD28抗體（或其功能片段）或抗CD3及抗CD28抗體之組合來刺激淋巴球群體。

因此，在一實施例中，在所揭示之程序中，不使淋巴球與任何活化淋巴球之外源性藥劑（如上述列舉者）接觸。

「淋巴球富集(lymphocyte enrichment)」或「淋巴球選擇(lymphocyte selection)」係指選擇用於細胞混合物之淋巴球子集的程序。在某些態樣中，CD3+ T細胞可選自細胞混合物。在某些態樣中，CD4+及CD8+ T細胞可選自細胞混合物。該選擇程序可使用抗體（例如抗CD3+抗體、抗CD4+抗體、抗CD8+抗體）或本領域已知之用於選擇細胞亞型的任何其他手段加以執行。

「淋巴球擴增(lymphocyte expansion)」係指在適當的溫度（例如37℃）下培養淋巴球，並充分供應養分及其他條件（例如CO ₂），使其積極分裂及增殖的程序。在一些實施例中，本揭露的程序不包括淋巴球擴增。在一些實施例中，本揭露的程序包括在時間上縮短的淋巴球擴增，其不超過1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、36小時、或48小時。

較佳地，在一些實施例中，每個步驟皆係於封閉系統中執行。較佳地，每個步驟係於不含人類或動物血清的培養基中進行。

本程序中產生之經轉染淋巴球可合適於治療疾病。在一些實施例中，經採集之淋巴球（諸如T細胞）包括足夠比例的初始T細胞。

在一些實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的經採集之淋巴球係經轉染淋巴球。在一些實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的經採集之淋巴球將轉殖基因整合至其等基因體中。

在一些實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的經採集之T細胞係經轉染T細胞。在一些實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的經採集之T細胞將轉殖基因整合至T細胞的基因體中。

在一些實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的經採集之NK細胞係經轉染NK細胞。在一些實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的經採集之NK細胞將轉殖基因整合至NK細胞的基因體中。

如實例8所示，本文揭示之細胞製造程序的各種實施例可以大規模進行。在一些實施例中，大規模的程序使用樣本進行轉染，該樣本包括至少10×10 ⁶個細胞。在一些實施例中，樣本包括至少15×10 ⁶個細胞、20×10 ⁶個細胞、25×10 ⁶個細胞、30×10 ⁶個細胞、35×10 ⁶個細胞、40×10 ⁶個細胞、45×10 ⁶個細胞、50×10 ⁶個細胞、60×10 ⁶個細胞、70×10 ⁶個細胞、80×10 ⁶個細胞、90×10 ⁶個細胞、100×10 ⁶個細胞、110×10 ⁶個細胞、120×10 ⁶個細胞、130×10 ⁶個細胞、140×10 ⁶個細胞、150×10 ⁶個細胞、200×10 ⁶個細胞、250×10 ⁶個細胞、300×10 ⁶個細胞、400×10 ⁶個細胞、500×10 ⁶、600×10 ⁶個細胞、700×10 ⁶個細胞、800×10 ⁶個細胞、900×10 ⁶個細胞、1000×10 ⁶個細胞、1500×10 ⁶、或2000×10 ⁶個細胞。

在一些實施例中，大規模程序中的轉染（例如電穿孔）係於樣本具有至少0.01 mL，或至少0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1 mL、1.1 mL、1.2 mL、1.3 mL、1.4 mL、1.5 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、10 mL、12 mL、15 mL、18 mL、20 mL、22 mL、25 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、或100 mL之體積的情況下進行。在一些實施例中，大規模程序中的轉染（例如電穿孔）係於樣本具有不大於200 mL、150 mL、100 mL、90 mL、80 mL、70 mL、60 mL、50 mL、40 mL、30 mL、25 mL、20 mL、15 mL、12 mL、10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1.9 mL、1.8 mL、1.7 mL、1.6 mL、1.5 mL、1.4 mL、1.3 mL、1.2 mL、1.1 mL、1 mL、0.9 mL、0.8 mL、0.7 mL、0.6 mL、或0.5 mL之體積的情況下進行。

在一些實施例中，在較大規模的程序中，經採集樣本中至少40%，41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、或65%的淋巴球係初始細胞。

在一些實施例中，在較大規模的程序中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的經採集之淋巴球係經轉染淋巴球。在一些實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的經採集之淋巴球將轉殖基因整合至其等基因體中。

在細胞製備程序的任何一實施例中，經採集之細胞可經受細胞活化（如在轉染前未活化）、選擇、及/或擴增。在一些實施例中，擴增可進行1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10天。 組成物及治療

本揭露之細胞，例如同種異體細胞，可用於治療各種疾病及病況，特別是癌症。在一個實施例中，癌症可包含威爾姆斯瘤(Wilms' tumor)、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、神經內分泌腫瘤、神經膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、皮膚癌、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、肺癌、膽道癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、甲狀腺髓質癌、卵巢癌、神經膠質瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、及尿道膀胱癌(urinary bladder cancer)。

本文所述之另一實施例係一種治療有需要之對象之癌症的方法，其包含投予有效量，例如治療有效量之包含本揭露之經轉染細胞的組成物。本文亦提供包括本文所揭示之經轉染淋巴球及醫藥上可接受之賦形劑的組成物。

投予之量及頻率將藉由患者之病況及患者之疾病之類型及嚴重程度等因素來判定，但適當的劑量可藉由臨床試驗判定。在一些實施例中，癌症之特徵在於表現由CAR或TCR分子靶向之抗原，諸如CD19及/或CD20。

在其他實施例中，提供一種方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量的本文所涵蓋之經修飾之T細胞或包含其之組成物，單獨或與一或多種治療劑組合。在某些實施例中，本揭露之細胞用於治療有患癌風險之患者。因此，本揭露提供治療或預防癌症之方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量之本揭露之經修飾之T細胞。

所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，可能需要多次投予本揭露之組成物，以影響所欲療法。舉例而言，組成物可在1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年、2年、5年、10年、或更久內投予1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、或10次、或更多次。

在一個實施例中，向有需要之對象投予有效量之組成物以增加對象對癌症之細胞免疫反應。免疫反應可包括藉由能夠殺死感染細胞、調控T細胞、及輔助T細胞反應之細胞毒性T細胞介導之細胞免疫反應。主要由能夠活化B細胞從而導致抗體產生之輔助T細胞介導之體液免疫反應亦可被誘導。各種技術可用於分析由本揭露之組成物所誘導之免疫反應的類型，該等技術在所屬技術領域中熟知；例如， Current Protocols in Immunology，由下列者編輯：John E.Coligan, Ada M.Kruisbeek, David H.Margulies, Ethan M.Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y.

用於投予本文所述之細胞組成物之方法包括任何方法，其可有效導致再引入經離體基因修飾之免疫效應細胞，其在對象中直接表現TCR或CAR，或再引入免疫效應細胞之經基因修飾之先驅細胞，其在引入對象中時分化成表現TCR或CAR之成熟免疫效應細胞。一種方法包含將周邊血液T細胞用根據本揭露之核酸構築體離體轉染、及將經轉染之細胞返回對象中。

儘管前述揭露已藉由說明及實例之方式進行詳細說明以用於清晰理解目的，然而根據本揭露之教示對所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見可在不背離隨附申請專利範圍之精神或範圍內進行某些變化及修改。僅以說明性的方式而非限制性的方式提供以下實例。所屬技術領域中具有通常知識者將容易地識別許多非臨界參數，其可改變或修改以產生類似的結果。

本說明書中所提及之所有出版物、專利、及專利申請案係以引用方式併入本文中，有如特定及個別指示以引用方式併入各個別出版物、專利、及專利申請案。然而，在本文中引用參考文獻不應解讀為承認此類參考文獻對本揭露而言係先前技術。在以引用方式併入之參考文獻中所提供之任何定義及用語不同於本文中所提供之用語及論述之情況下，則以本文之用語及定義為準。本說明書中各處所引用之所有參考文獻之內容係以引用方式明示併入本文中。 實例 實例 1. 轉位子介導之雙順反子 CAR 轉染及整合

本實例測試轉位子系統，其將抗CD19及抗CD20雙順反子CAR構築體引入宿主細胞中。

雙順反子CAR（在此稱為KITE-001）係表現為單鏈前驅物，其（從N端至C端）包括：第一信號肽-抗CD19 scFv-CD28鉸鍊及跨膜域-CD28共刺激域-CD3ζ-T2A-第二信號肽-抗CD20 scFv-CD8鉸鍊及跨膜域-4-1BB共刺激域-CD3ζ。位於T2A的自裂解導致產生兩個分離的CAR分子。

KITE-001的編碼序列（介於抗CD19部分與抗CD20部分之間）在CD3ζ域共享同源性區。此種同源性被懷疑會導致重組及隱蔽性剪切(cryptic splicing)。因此，本文執行密碼子最佳化及序列搖擺，以降低核苷酸同源性至短於9個核苷酸。

在使用慢病毒載體的試驗性研究中，觀察到表現蛋白產物包括數種變體。具體而言，變體1 (V1)佔所有蛋白產物的約1.5%至2%，其僅包括抗CD19；變體14 (V14)，佔所有蛋白產物的約0.02至0.05%，其包括抗CD19單元中的框移突變，並因此無功能性；變體15 (V15)，佔所有蛋白產物的約0.02至0.05%，其包括抗CD20 scFv之重鏈中的框移突變，因此僅具有抗CD19活性；變體22 (V22)，佔所有蛋白產物的約0.02至0.05%，其在抗CD20 scFv與CD8鉸鏈之間具有缺失，並因此僅對CD19具有功能性。

本實例隨後採用具有對應轉位酶之轉位子系統，其經由電穿孔(EP)將KITE-001的編碼序列轉染至T細胞中。轉位子系統包括側接兩組重複序列（CAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTAAG, SEQ ID NO: 28，及YCCAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTMART, SEQ ID NO: 29）的編碼序列。實例轉位酶序列係MGKSKEISQDLRKRIVDLHKSGSSLGAISKRLAVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRVLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGHSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMDAVQYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQHDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPNYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY (SEQ ID NO: 30)。

接著，對經轉染細胞進行培養及擴增。不同於慢病毒系統，經轉染細胞中完全未偵測出V1及V15變體，且未發現其他變體超過0.02%發生率。相比之下，在基於轉位子的樣本中，偵測出V22變體的水準明顯較高（表1）。 表 1. 變體之百分比

變體	慢病毒	轉位子
未轉譯	0.13%	0.0048%
V1	0.40%	0%
V14	0.026%	0.015%
V15	0.048%	0%
V22	0.026%	0.15%

針對基於轉位子之整合的穩定性監測三週。如 表 2 及表 3所示，LVV產生之CAR及非病毒轉位之CAR皆顯示出CD19/CD20表現的體外穩定性。 表 2. 總 CAR 表現 (LVV)

製造天數	供體 1 NTD	供體 1 雙 CAR	供體 2 NTD	供體 2 雙 CAR
第 1 天
第 3 天	0.12	52.5	0.025	50.7
第 4 天	5	70	3.79	65.5
第 5 天
第 6 天
第 7 天
第 8 天	0.18	64.9	0.3	60.9
第 11 天	1.01	50.1	2.24	48.2
第 15 天	2.42	54.9	3.79	50.8
第 18 天	0.2	50.8	1.6	47.4
第 22 天	0.02	45	0.97	42.8

表 3. 總 CAR 表現（非病毒）

電穿孔後天數	供體 1 （無 EP ）	供體 1 雙 CAR	供體 2 （無 EP ）	供體 2 雙 CAR
第 1 天	0.29	0.77	0.94	0.58
第 3 天
第 4 天	3.55	32.4	2.89	27.6
第 5 天
第 6 天
第 7 天
第 8 天	0.33	32.4	0.41	32.5
第 11 天	0.41	26.5	1.05	20
第 15 天	1.1	34.1	3.64	21.4
第 18 天	0.2	37.5	1.3	22.1
第 22 天	0.2	34.3	0.4	20.6

實例 2. 單 CAR 轉染效率

接著，將轉位子系統的轉染效率與慢病毒載體的轉染效率進行比較，其中轉位子系統的T細胞來自四個不同的供體。就經轉染細胞佔總存活CD3+細胞之百分比（ 表 4）及整體T細胞存活率（ 表 5）方面而言，兩個系統皆取得了極佳的結果。因此，此結果表明，不同於基於病毒載體的系統，本文之轉位子系統無需T細胞活化即可實現高轉染效率。 表 4. 存活 CD3+ 細胞之 CAR+ 之百分比

轉位子	對照組（無 EP ）	實驗組 EP 規模	擴展組 EP 規模
第 1 天	0.81±0.32	36.20±19.95	47.66±11.35
第 4 天	0.2±0.099	58.55±14.56	73.90±9.48
第 7 天	0.16±0.095	38.26±3.87	54.95±13.28

慢病毒	NTD	LVV-TD
第 0 天	0±0	0±0
第 3 天	0.050±0.038	61.73±4.07
第 7 天	0.020±0.0052	77.83±2.99

表 5.T 細胞存活率

轉位子	對照組（無 EP ）	實驗組 EP 規模	擴展組 EP 規模
第 0 天	94.55±1.92	88.45±2.27	93.78±1.67
第 1 天	92.23±1.48	73.8±2.81	79.45±3.10
第 4 天	94.65±1.82	81.25±4.34	85.63±1.63
第 7 天	92.53±0.90	86.9±4.29	89.3±1.01

慢病毒	NTD	LVV-TD
第 0 天	85.25±2.49	84.00±3.39
第 1 天	62.13±10.89	65.5±12.03
第 3 天	82.38±2.63	81.00±4.06
第 4 天	86.00±6.04	86.25±3.34
第 5 天	87.25±3.70	91.5±1.66
第 6 天	92.00±5.062	92.75±1.09
第 7 天	92.25±3.11	92±2.24

實例 3. 轉位子介導之報導子基因或單 CAR 轉染及整合

本實例測試轉位子系統，其將GFP報導子基因、具有4-1BB共刺激區之抗CD19 CAR構築體、或具有CD28共刺激區之抗CD19 CAR構築體中之一者引入宿主細胞中。

如 表 6所示，經整合GFP報導子基因的表現維持了超過21天。作為比較，未經整合表現對照組（無電穿孔、微環、或僅有質體而不具有轉位酶）在7至10天內下降至低於1%。因此，此資料表明轉位酶介導之基因整合係穩定的。值得注意的是，當轉位子封閉於微環質體中進行遞送時，轉染效率在所有時間點上皆得到進一步改良。 表 6. 表現 GFP 之細胞佔總存活 CD3+T 細胞之百分比

EP 後	微環 3 µg+ 轉位酶	微環 6.5 µg+ 轉位酶	質體 6.5 µg+ 轉位酶	無 EP	微環對照組 6.5 µg	質體對照組 6.5 µg
第 1 天	31.3	37.6	23.5	0.056	21	14.9
第 4 天	62	75.6	38.8	0.54	57.8	6.82
第 6 天	60.3	74.5	43.5	0.053	26.1	0.68
第 8 天	58.2	65.1	45.6	0.011	0.74	0.088
第 11 天	53.5	61.9	40.4	0.0053	0.49	0.15
第 14 天	49.75	56.2	35.4		0.095	0.05
第 18 天	48.95	55	34.9		0.075	0.07
第 21 天	50.3	56.4	35.8		0.1	0.072

如 表 7所示，具有4-1BB共刺激區之經整合抗CD19 CAR構築體的表現維持了超過21天。作為比較，未經整合表現對照組（僅有質體而不具有轉位酶）在7至10天內下降至低於1%。因此，此資料表明針對此CAR構築體的轉位子介導之基因整合係穩定的。 表 7. 表現具有 4-1BB 共刺激之抗 CD19 CAR 的 CD3 T 細胞之百分比

EP 後	僅質體	具有 4-1BB 共刺激之經轉位抗 CD19 CAR
第 1 天	3.78	5.83
第 4 天	0.6	22.5
第 6 天	0.16	30.2
第 8 天
第 11 天	0.1	31.2
第 14 天	0.038	26.7
第 18 天	0.042	24.2
第 21 天	0.022	29.4

如 表 8所示，具有CD28共刺激區之經整合抗CD19 CAR構築體的表現維持了超過21天。作為比較，未經整合表現對照組（無電穿孔或僅有質體）在7至10天內下降至低於1%。因此，此資料表明針對此CAR構築體的轉位子介導之基因整合係穩定的。 表 8. 表現具有 CD28 共刺激之抗 CD19 CAR 的 CD3 T 細胞之百分比

EP 後	對照組（無 EP ）	僅質體	具有 CD28 共刺激之經轉位抗 CD19 CAR
第 1 天	0.00589	11.7	28.2
第 3 天
第 4 天	0	0.017	54.1
第 5 天
第 6 天
第 7 天
第 8 天	0.00309	0.03	21.8
第 11 天	0	0.028	14
第 15 天	0.36	0.56	10.2
第 18 天	0.2	0.4	10
第 22 天	0.2	0.11	12

實例 4. 轉位子介導之自體程序之開發

習知基於病毒載體之自體程序，自獲取細胞至植入需要7天甚至數週。本實例試圖開發可在一天內快速完成的自體程序。

經血球分離後，自經收集之周邊血液單核細胞(PBMC)富集T細胞，接著使用轉位子構築體使該等T細胞經受電穿孔（如實例1之測試）。於24小時後採集T細胞，或進一步進行活化及擴增。

評估該程序期間產生之影響。如 表 9所示， 表 9. 轉位子介導之自體程序之基本特徵

天數	CAR （佔總存活 CD3 T 細胞之 % ）	存活率 (%)	CD4/CD8 比率	CD45RA+CCR7+CD62L+ CD27+CD28+ （佔總存活 CD3 T 細胞之 % ）
0（EP前）	-	-	5.51	52.5
1（EP後）	19.4	62	5.74	59.3
4	20.3	57	11.92	34.6
8	30.5	80	1.40	27.2

該等程序使用Nalm6白血病小鼠模型進行測試（1天、3天、及7天，於不同的細胞計數下）。植入自體細胞後測量腫瘤負荷(tumor burden)，且結果呈現於 表 10。使用具有相同CAR序列之基於慢病毒載體之自體程序（7天）作為對照組。 表 10. 植入 T 細胞後之腫瘤負荷（以生物發光（光子 / 秒）測量）

植入後天數	媒劑	LVV CAR （ 7 天） 1E6 個細胞	經轉位 CAR （ 7 天） 1E6 個細胞	經轉位 CAR （ 1 天） 1E6 個細胞
5	4.6E+07	±4.1E-01	9.6E+07	±2.1E-01	5.4E+07	±4.0E-01	9.1E+07	±3.2E-01
8	7.5E+08	±3.3E-01	2.7E+08	±3.6E-01	7.5E+07	±3.6E-01	5.2E+08	±5.1E-01
13	1.4E+10	±1.3E-01	6.5E+05	±5.5E-02	9.3E+05	±4.7E-01	4.7E+06	±8.5E-01
16	3.2E+10	±1.4E-01	1.2E+06	±4.7E-02	6.3E+05	±7.5E-02	1.1E+06	±3.7E-02
20	4.2E+10	±3.2E-01	7.7E+05	±1.6E-01	7.0E+05	±1.0E-01	6.4E+05	±8.5E-02
22			6.7E+05	±1.8E-01	6.6E+05	±1.5E-01	5.8E+05	±9.3E-02
26			9.8E+05	±4.3E-01	1.0E+06	±6.7E-01	6.8E+05	±1.1E-01
29			1.1E+06	±6.0E-01	3.6E+06	±1.6E+00	5.6E+05	±7.7E-02
34			4.3E+06	±1.6E+00	3.6E+07	±1.9E+00	5.8E+05	±9.0E-02
37			1.9E+07	±1.8E+00	1.1E+08	±1.9E+00	6.1E+05	±4.6E-02
41			2.8E+07	±1.8E+00	2.1E+07	±1.9E+00	6.9E+05	±1.2E-01
44			1.6E+06	±7.6E-01	7.7E+05	±1.4E-01	7.4E+05	±4.4E-02
48			2.1E+06	±1.3E+00	8.2E+05	±1.4E-01	7.3E+05	±1.3E-01
54			7.3E+06	±1.8E+00	8.5E+05	±1.4E-01	7.3E+05	±9.1E-02
58			3.1E+07	±1.9E+00	8.1E+05	±2.3E-01	7.0E+05	±5.6E-02
62			3.8E+08	±2.0E+00	1.1E+06	±7.3E-01	7.0E+05	±7.7E-02
65			1.1E+09	±2.0E+00	2.0E+06	±1.2E+00	8.6E+05	±1.6E-01
68			2.3E+09	±2.0E+00	1.8E+06	±9.5E-01	9.2E+05	±1.4E-01
75			1.2E+07	±1.3E+00	4.6E+06	±1.6E+00	9.9E+05	±1.3E-01
82			3.4E+08	±1.4E+00	1.6E+07	±1.8E+00	8.4E+05	±1.3E-01
89			1.7E+08	±1.4E+00	1.2E+07	±1.8E+00	7.1E+05	±1.7E-01

植入後天數	經轉位 CAR （ 3 天） 1E6 個細胞	經轉位 CAR （ 1 天） 2E5 個細胞	經轉位 CAR （ 3 天） 2E5 個細胞	經轉位 CAR （ 7 天） 2E5 個細胞
5	6.1E+07	±2.6E-01	3.7E+07	±2.0E-01	4.5E+07	±3.6E-01	5.0E+07	±4.6E-01
8	9.0E+08	±2.6E-01	7.0E+08	±4.7E-01	6.6E+08	±4.9E-01	6.5E+08	±4.7E-01
13	1.7E+07	±5.3E-01	5.2E+09	±5.7E-01	5.8E+09	±3.5E-01	3.2E+09	±4.3E-01
16	7.5E+05	±3.6E-02	4.4E+08	±1.2E+00	7.4E+07	±9.3E-01	1.2E+08	±9.9E-01
20	7.9E+05	±5.9E-02	9.0E+05	±3.4E-02	6.7E+05	±1.2E-01	7.2E+05	±7.4E-02
22	4.9E+05	±6.9E-02	6.6E+05	±1.1E-01	6.1E+05	±9.4E-02	6.5E+05	±8.2E-02
26	6.7E+05	±1.5E-01	2.8E+06	±1.1E+00	6.4E+05	±1.4E-01	1.7E+06	±7.0E-01
29	6.5E+05	±8.7E-02	1.3E+06	±5.8E-01	7.1E+05	±1.9E-01	1.3E+06	±8.4E-01
34	6.3E+05	±7.7E-02	8.0E+05	±2.2E-01	5.8E+05	±1.7E-01	2.5E+06	±9.7E-01
37	5.7E+05	±9.0E-02	7.4E+05	±2.3E-01	5.6E+05	±8.9E-02	2.0E+07	±1.4E+00
41	6.7E+05	±2.0E-01	9.3E+05	±3.0E-01	7.3E+05	±1.8E-01	1.0E+07	±1.3E+00
44	9.9E+05	±7.2E-01	1.4E+06	±6.7E-01	6.2E+05	±1.2E-01	1.2E+08	±1.8E+00
48	8.0E+05	±2.7E-01	2.6E+06	±9.8E-01	7.4E+05	±5.7E-02	6.5E+08	±1.7E+00
54	2.8E+06	±1.5E+00	1.6E+07	±1.4E+00	6.9E+05	±1.3E-01	1.6E+10	±1.4E+00
58	1.2E+06	±1.2E+00	9.2E+07	±1.9E+00	5.6E+05	±1.0E-01	4.6E+09	±1.0E+00
62	1.1E+06	±9.0E-01	1.7E+09	±1.8E+00	6.6E+05	±6.6E-02	1.1E+10	±5.3E-01
65	1.0E+07	±1.8E+00	3.0E+09	±1.9E+00	7.2E+05	±1.6E-01	1.4E+10	±4.7E-01
68	4.3E+07	±1.9E+00	3.0E+09	±1.8E+00	7.2E+05	±5.9E-02	7.2E+09	±1.3E+00
75	8.3E+07	±1.9E+00	1.3E+08	±1.5E+00	9.3E+05	±9.8E-02	2.0E+10	±9.9E-01
82	2.2E+07	±1.6E+00	1.7E+08	±1.9E+00	8.2E+05	±1.2E-01
89	4.3E+07	±1.7E+00	3.0E+08	±1.9E+00	9.1E+05	±1.6E-01

基於慢病毒載體之7天程序（10 ⁶個細胞）導致腫瘤生長顯著降低。腫瘤負荷在第68天逐漸達到高峰（約2.3×10 ⁹個光子/秒），接著在第89天降低至約1.7×10 ⁸個光子/秒。

然而，在所有基於轉位子的程序中，僅低劑量之7天程序（2×10 ⁵個細胞）表現劣於高劑量之基於慢病毒載體之程序（10 ⁶個細胞）。具體而言，高劑量之1天程序（10 ⁶個細胞）及低劑量之3天程序（2×10 ⁵個細胞）在大約第20天（＜10 ⁶個光子/秒）實現腫瘤之消除，且腫瘤完全未復發。高劑量之3天及7天程序亦表現極佳，而低劑量之1天程序（2×10 ⁵個細胞）則與高劑量之基於慢病毒載體之程序相當。

因此，此等結果表明，新開發之基於轉位子之自體CAR-T的1天程序在相同劑量（10 ⁶個細胞）下所實現的結果遠遠優於基於慢病毒載體之7天程序。即使使用較慢病毒載體7天程序（10 ⁶個細胞）更低的劑量（2×10 ⁵個細胞），其等結果仍相當。可以設想，新開發、縮短的程序所致之此種優異結果可產生高品質的CAR-T細胞，其等具有更多有利於癌症治療的初始T細胞群體。 實例 5. 自體程序之進一步測試

本實例進一步測試使用其他CAR構築體之縮短的基於轉位子之自體程序。使用靶向CD19、但包括4-1BB共刺激域的構築體。同樣地，高劑量及低劑量的早期（第4天）採集大幅優於晚期（第14天）採集。

在各實驗中，皆使用固定量的質體DNA（基因貨物(gene cargo)，5 µg）及mRNA（編碼轉位酶，5 µg）。比較結果顯示於 表 11中。 表 11. 各構築體之轉染效率

電穿孔後天數 (EP)	無 EP	GFP	CD19 及 41BB	CD19 及 CD28	CD19/CD20 雙順反子
1	0.00541	17.9	6.77	6.52	0.067
4	0.016	33.7	57.8	45.7	11.6
6	0.00442	30.5	37.1	30.2	12.3
8	0.071	28	33.4	20.8	10.7

一般而言，質體DNA的電穿孔在最初的24小時內會導致30%至50%的細胞死亡。由新程序所產生的細胞存活率得到活化及擴增，並在每個階段評估其等存活率。 表 12顯示，8天後細胞存活率回復至80%至90%，與無電穿孔細胞組的存活率水準相同。 表 13顯示，在新製造程序後，存活細胞生長良好，擴增30至40倍。 表 12. 不同天數之 T 細胞存活率

電穿孔後天數 (EP)	無 EP	GFP	CD19 及 41BB	CD19 及 CD28	CD19/CD20 雙順反子
1	86	56	54	51	57
4	77	67	56	65	63
6	85	90	85	88	87
8	90	91	88	90	87

表 13. 不同天數之倍數擴增

電穿孔後天數 (EP)	無 EP	GFP	CD19 及 41BB	CD19 及 CD28	CD19/CD20 雙順反子
1	1	1	1	1	1
4	2.43	1.16	1.11	1.39	1.23
6	13.12	8.87	9.08	10.79	9.6
8	61.19	36.07	40.77	39.66	30.86

因此，此等資料表明，新的非病毒程序適用於各種類型的構築體。此外，在隨後的擴增中，細胞存活率可得到回復，表明經電穿孔之T細胞具有極佳的生長潛力。 實例 6. 新程序所產生細胞之評估

本實例評估從縮短的程序中所產生的CAR-T細胞，具體而言，係使用與T細胞之初始狀態有關的標記進行評估。

CAR T細胞係使用 實例 4中所描述之非病毒轉位子方法而製造，置於靜態袋(static bag)中。表型資料係指表現CD45RA、CCR7、CD62L、CD27、及CD28的T細胞佔總T細胞的百分比（ 表 14）。 表 14. 初始 T 細胞之百分比（ CD45RA ⁺CCR7 ⁺CD62L ⁺CD27 ⁺CD28 ⁺ ）

日期	起始材料	電穿孔後第 0 天	第 3 天	第 7 天
%	52.5	59.3	34.6	27.2

較早採集的細胞具有較多幼年(juvenile)群體，表明加速程序的益處。

本實例亦評估轉染前之T細胞狀態對轉染效率的影響。本實例研究四種類型的T細胞，包括CD45RA ⁺CCR7 ⁺、CD45RA ⁺CCR7 ^-、CD45RA ^-CCR7 ⁺、及CD45RA ^-CCR7 ^-。細胞解凍後經2小時回復，並接著使用DNA轉位子及mRNA轉位酶進行電穿孔/轉染。轉染後1天，細胞經活化並基於新程序進行擴增。經採集之細胞基於活化日標記為第0天、第3天、及第7天。如 表 15所示，初始T細胞較其他子集接收到更多的基因貨物。 表 15.T 細胞子集之轉染效率

下列之CAR %	1dpt（第0天）	4dpt（第3天）	8dpt（第7天）
CD45RA+CCR7+	34.3	21.3	23.7	44.9	48.7	68.3	23.5	24.9	29.7
CD45RA+CCR7-	6.64	2.33	5.1	38.5	35.3	66	23.4	23.1	28.7
CD45RA-CCR7+	8.74	5.92	11	35.3	42.5	67.5	17.5	20.7	27.8
CD45RA-CCR7-	3.88	3.4	4.95	29.3	29.1	59	18.2	18.3	19.4

實例 7. 載體拷貝數 (VCN) 測量

本實例開發一種方法，其用於測量整合至目標細胞基因體中之構築體的拷貝數。

引子組係設計為靶向構築體（例如CD19編碼序列）、質體主鏈區(Amp)、及宿主參考基因（例如CDKN2A）。未整合之游離DNA使用Dpn I消化。VCN實驗的進行係使用兩個分離的ddPCR反應：「CD19對比宿主參考基因」及「AMP對比宿主參考基因」。CD19 VCN = 2 * CD19/宿主拷貝數；Amp VCN = 2* Amp/宿主拷貝數（乘以每個參考之基因組的拷貝數（二倍體係2））。經整合之計算係VCN = CD19 VCN - AMP VCN。

藉由此種方法，使用上述方法產生之細胞中平均VCN即判定為約5.07（6.07總DNA減去1.0未消化的游離DNA）。 實例 8. 與 TcBuster 之比較

本實例針對實例1中所測試之轉位子系統（以及LVV）的性能與TcBuster（另一種非病毒、基於轉位子之遞送系統）進行比較。所有系統皆使用CD19單一CAR，其包括4-1BB作為共刺激域。經冷凍的經轉染細胞係經過夜解凍，以進行CAR+百分比測量及體外細胞毒性檢定。結果顯示於 表 16 及表 17中。 表 16. 經轉染 T 細胞之百分比

	僅轉位子	TcBuster	實例 1 之	經轉染 LVV
供體#1	0.055	27	18.2	53.7
供體#2	0.54	20	12.9	52.7
供體#3	0.034	30.2	15.6	57.8

表 17. 細胞毒性

	E:T	僅質體	TcBuster	實例 1 之	慢病毒
供體#1	1比1	-32.1	-23.6	-27.4	97.2	97.5	98.3	98.5	98.9	98.8	98.5	98.6	98.5
1比3	-41.5	-36.2	-33.6	71.7	76.3	64.6	72.3	75.4	74.6	77.5	76.3	75.1
1比10	-24.5	-24.6	-28.2	6.4	15.8	9.1	16	15.8	18.7	18.2	22.2	20.9
供體#2	1比1	-12.3	-15.5	-13.9	96.4	96.7	96.3	97.7	97.7	97.7	97.3	96.8	97.3
1比3	-27.2	-29.4	-11.7	69.9	67.1	69.1	73.6	75.6	73.8	69.4	66.3	67.4
1比10	-17.2	-14	-7	7.6	12.2	7.7	5.4	18.3	25	12.7	5.4	10.3
供體#3	1比1	-19.5	-19.5	-28.4	98.8	98.8	98.8	99.3	99	99.1	99.1	98.5	99
1比3	-33.6	-36.3	-25.8	87.8	87.3	86.7	93.6	91.7	92.2	74.2	74.5	69.7
1比10	-22.4	-25.4	-21.3	18.2	16.2	31.5	20.5	22.8	35.3	13.3	9.8	16.3

採用 實例 4 及實例 5中使用的Nalm6動物模型測試此等CAR細胞的腫瘤抑制效果。結果展示於 表 18中。 表 18. 腫瘤抑制效果

天數	G1.媒劑	G3.僅UT轉位子	G4.TcBuster	G5.實例1之	G6.慢病毒Td
0	1.2E+06	±9.6E+04	1.3E+06	±1.1E+05	1.2E+06	±1.3E+05	1.2E+06	±1.6E+05	1.1E+06	±2.2E+05
3	2.4E+06	±3.5E+05	2.8E+06	±3.7E+05	2.6E+06	±4.4E+05	2.8E+06	±3.3E+05	1.8E+06	±2.2E+05
5	9.5E+06	±2.0E+06	9.3E+06	±2.0E+06	1.0E+07	±1.5E+06	9.2E+06	±1.3E+06	8.1E+06	±8.7E+05
10	9.5E+08	±2.7E+08	7.1E+08	±7.8E+07	1.2E+06	±1.3E+05	2.2E+06	±5.3E+05	2.1E+06	±5.9E+05
13	1.6E+10	±3.8E+09	1.0E+10	±2.0E+09	1.6E+06	±1.4E+05	2.2E+06	±4.1E+05	2.3E+06	±3.5E+05
17					1.6E+06	±1.7E+05	3.6E+06	±1.4E+06	2.6E+06	±1.5E+06
20					1.9E+06	±4.2E+05	1.3E+07	±1.3E+07	1.2E+07	±1.7E+07
25					1.0E+07	±8.3E+06	5.2E+07	±4.8E+07	4.8E+08	±8.9E+08
27					3.0E+07	±2.8E+07	1.2E+08	±1.2E+08	1.4E+09	±2.6E+09
31					2.3E+08	±2.5E+08	5.9E+08	±6.0E+08	3.2E+09	±5.8E+09
34					1.1E+09	±1.3E+09	2.4E+09	±2.5E+09	6.1E+09	±9.6E+09
38					8.9E+09	±1.1E+10	9.1E+09	±9.0E+09	7.3E+09	±4.8E+09

因此，此等資料表明，由TcBuster、實例1之轉位子系統、或LVV系統所製造的CAR T細胞之體外細胞毒性及體內效果相當。 實例 9. 大規模製造程序

本實例基於 實例 4中之小規模試驗性研究，開發出大規模的製造程序。

在小規模程序中，在電穿孔中使用5×10 ⁶個細胞，體積係100 µL。在大規模程序中，使用50×10 ⁶至100×10 ⁶個細胞，體積係1 mL。在比較性研究中，從小規模及大規模程序中採集的細胞經受活化（使用抗CD3抗體），並進行至多7天的擴增。

就細胞數目的倍數變化而言，兩種程序之間無顯著差異(P = 08725)。然而，使用成對t測試(paired t test)，則顯示大規模程序的存活率顯著高於小規模程序(p = 0.0090)。

最後，亦相較於小規模程序的轉染效率，來評估大規模程序的轉染效率。使用成對t測試，大規模程序顯示出顯著高於小規模程序的轉染效率(p = 0.0115)。 實例 10. 大有效負載轉染：三順反子

本實例描述利用睡美人轉位子系統之三種不同的大有效負載質體的分離轉染，如圖1所描繪。三種不同的質體構築體（質體1、質體2、及質體3）經電穿孔至細胞中。

質體1至質體3各自分別編碼CAR、顯性負受體(dominant negative receptor, DNR)、及膜結合介白素受體(membrane bound interleukin receptor, mbIL)。質體1係三順反子構築體，其長度係7725 bp（包括4835 bp的插入物），以一個mRNA轉錄本及單一長多肽的形式表現，該單一長多肽在T2A及P2A位點進行轉譯後裂解，以提供CAR、DNR、及mbIL。質體2係三順反子構築體，其長度係8203 bp（包括5313 bp的插入物），以一個mRNA轉錄本及兩個分離的多肽的形式表現。第一多肽包括CAR及DNR，其在T2A位點進行轉譯後裂解。第二多肽係mbIL。質體3係三順反子構築體，其長度係8132 bp（包括5242 bp的插入物），以兩個mRNA轉錄本及兩個多肽的形式表現。第一多肽包括CAR及DNR，其在T2A位點進行轉譯後裂解。第二多肽係mbIL。 表 19. 轉染效率

	質體1	質體2	質體3
DPT\單一TD%	CAR	DNR	mbIL	CAR	DNR	mbIL	CAR	DNR	mbIL
D1	2.3	1.1	1.6	1.7	1.7	0.3	1.4	1.3	0.3
D4	23.3	15.9	17.3	30.2	26.8	4.6	14.5	13.1	4.3
D6	25.4	5.8	15.5	24.4	20.4	4.9	10.9	8.6	3.1
D8	15.2	4.8	9.1	16.5	12.1	3.3	8.4	5.6	1.5

實例 11. 大有效負載轉染：四順反子

本實例描述兩種不同的巨大有效負載質體的分離轉染，如圖2所描繪。兩種不同的質體構築體（質體4及質體5）係使用單一脈衝經電穿孔至細胞中。表20顯示在具有轉位酶的情況下，使用具有8kb插入物之質體4進行轉染後的CAR表現。表21顯示在不加入轉位酶的情況下，使用質體4進行轉染後的CAR表現。表22顯示在具有轉位酶的情況下，使用具有10kb插入物之質體5進行轉染後的CAR表現。表23顯示在不加入轉位酶的情況下，使用質體5進行轉染後的CAR表現。 表 20 ： 8 kb 插入物（質體 4 ）

質體 4_ 轉位酶
DPT/單一TD%	CAR1	CAR2	CAR3	CAR4	整體TG%
第1天	6.54	12.4	16.6	13.5	18.81
第4天	21.6	31.6	19.6	34.6	35.47
第6天	22.2	27.6	24.9	29.1	29.83
第8天	21.6	24.4	26.4	31.2	31.72

表 21 ：無轉位酶（質體 4 ）

質體 4_ 僅質體
DPT/單一TD%	CAR1	CAR2	CAR3	CAR4	整體TG%
第1天	5.18	9.93	13.1	11	14.28
第4天	1.14	1.19	0.76	2.79	3.49
第6天	0.92	0.71	0.52	2.02	2.92
第8天	0.49	0.89	0.41	1.61	2.46

表 22 ： 10 kb 插入物（質體 5 ）

質體 5_ 轉位酶
DPT/單一TD%	CAR1	CAR2	CAR3	CAR4	整體TG%
第1天	25.2	5.95	23.9	24.3	29.32
第4天	53.7	4.27	14.9	43.8	53.96
第8天	18	4.1	10	10.9	19.98

表 23 ：無轉位酶（質體 5 ）

質體 5_ 僅質體
DPT/單一TD%	CAR1	CAR2	CAR3	CAR4	整體TG%
第1天	23.6	5.7	21.9	23	24.64
第4天	9.86	1.82	0.49	4.86	5.45
第8天	0.96	1.18	2.83	0.64	1.99

圖3A至圖3C顯示四順反子質體4之四個CAR之各者在電穿孔後第8天的CAR表現係相對成比例的。圖4A至圖4C顯示四順反子質體5之四個CAR之各者在電穿孔後第8天的CAR表現亦係相對成比例的。 實例 12. 穩定性及再刺激

本實例描述使用質體4對細胞進行非病毒轉染後的CAR表現。在電穿孔後第11天，對經轉染之細胞使用抗CD3抗體進行再刺激。表24顯示未進行再刺激之CAR表現。表25顯示在第11天進行再刺激之CAR表現。資料顯示來自大有效負載構築體（質體4）之轉殖基因表現的穩定性。 表 24 ：未進行再刺激之 CAR 表現

質體 4_20ug DNA_DNA:mRNA=1:16 無再刺激
	CAR1	CAR2	CAR3	CAR4	整體 TD%	僅來自質體之整體TD%
第1天	6.54	12.4	16.6	13.5	18.81	14.28
第4天	21.6	31.6	19.6	34.6	35.47	3.49
第6天	22.2	27.6	24.9	29.1	29.83	2.92
第8天	21.6	24.4	26.4	31.2	31.72	2.46
第11天	23.1	24.5	29.5	38.9	39.9	3.06
第15天	16.8	21.4	18	35	35	1.66
第19天	9.34	13.7	11.5	25.1	17.03	2.12

表 25 ：第 11 天進行再刺激之 CAR 表現

質體 4_20ug DNA_DNA:mRNA=1:16 再刺激
	CAR1	CAR2	CAR3	CAR4	整體 TD%	僅來自質體之整體TD%
第1天	6.54	12.4	16.6	13.5	18.81	14.28
第4天	21.6	31.6	19.6	34.6	35.47	3.49
第6天	22.2	27.6	24.9	29.1	29.83	2.92
第8天	21.6	24.4	26.4	31.2	31.72	2.46
第11天	23.1	24.5	29.5	38.9	39.9	3.06
第12天	37	40.1	45	56.1	54.52	2.24
第15天	22.9	40.4	35.1	49.5	51.25	2.74
第19天	13.6	16.3	10.2	28	19.51	3.94

實例 13. 啟動子評估

本實例描述在轉位子編碼質體中對不同啟動子的評估。在不同啟動子的條件下設計相同所關注之基因卡匣，並在非病毒細胞培養程序中進行測試，以評估由不同啟動子所驅動的基因表現動力學。結果顯示，轉位子轉染系統適用於不同啟動子，得以提供來自具有不同啟動子之單CAR及雙CAR質體中的CAR表現。此外，不同啟動子提供不同水準的CAR表現，得以基於啟動子的選擇從而提供CAR表現水準的選擇。 表 26 ：用於啟動子評估之質體

	CAR	啟動子
質體6	單CAR	1
質體7	雙CAR	2
質體8	雙CAR	1
質體9	雙CAR	3
質體10	雙CAR	4

表 27 ：使用睡美人轉位子系統之 CAR 表現

質體 +SB （轉位子 + 轉位酶）
CAR 1%	6_SB	7_SB	8_SB	9_SB	10_SB	非 EP	無 DNA
第1天	27.4	3.13	9.68	2.12	2.09	0.04	0.08
第4天	33	7.23	28.9	16.6	7.27	0.08	0.13
第6天	17	6.25	12	13.6	9.81	0.3	0.42
CAR 2%		7_SB	8_SB	9_SB	10_SB	非 EP	無 DNA
第1天		0.94	12	3.33	3.45	0.46	0.14
第4天		4.9	28.6	14.2	4.92	0.22	0.26
第6天		4.84	11.5	12.8	8.25	1.1	0.39
整體 TD%		7_SB	8_SB	9_SB	10_SB	非 EP	無 DNA
第1天		3.47	12.68	3.97	3.85	0.73	0.31
第4天		7.73	31.55	17.19	7.54	0.30	0.35
第6天		6.16	12.21	13.74	9.68	1.13	0.56

表 28 ：無睡美人轉位酶之 CAR 表現

僅質體（僅轉位子）
CAR 1%	6_only	7_only	8_only	9_only	10_only	非 EP	無 DNA
第1天	19.9	2.24	12.4	1.88	1.6	0.04	0.08
第4天	2.91	0.49	3.61	3.62	0.55	0.08	0.13
第6天	0.34	0.35	0.37	0.38	0.24	0.3	0.42
CAR 2%		7_only	8_only	9_only	10_only	非 EP	無 DNA
第1天		0.62	15.1	3.1	2.44	0.46	0.14
第4天		0.16	0.86	1.85	0.12	0.22	0.26
第6天		0.13	0.25	0.26	0.14	1.1	0.39
整體 TD%		7_only	8_only	9_only	10_only	非 EP	無 DNA
第1天		2.55	15.64	3.62	3.02	0.73	0.31
第4天		0.63	3.78	3.83	0.63	0.30	0.35
第6天		0.27	0.41	0.44	0.25	1.13	0.56

實例 14. 轉殖基因表現奈米質體對比 pCDL 質體之測試

本實例描述對於不同主鏈大小的評估，針對使用pCDL質體上之抗CD19 CAR編碼轉位子藉由電穿孔轉染後，與使用奈米質體上之相同轉位子藉由電穿孔轉染後，比較兩者之抗CD19 CAR之基因的表現。表29的結果顯示，藉由使用奈米質體進行轉染，抗CD19 CAR的表現水準更高。轉位子DNA與轉位酶mRNA的比係1:4。 表 29 ：奈米質體對比 pCDL 質體之抗 CD19 CAR 表現

時間	pCDL質體 8ug	奈米質體 5.6 ug	奈米質體 8ug	非EP
第1天	11.8	12.8	22.5	0.43
第4天	53.9	68.9	77.9	2.07
第6天	39	53.3	65.2	1.55
第8天	30.8	44.9	52	0.81

*        *        *

雖然已描述數個實施例，但顯然本揭露及實例可提供利用本文所述之組成物及方法或由本文所述之組成物及方法涵蓋之其他實施例。因此，將理解的是，其範圍由可自本揭露及隨附申請專利範圍中理解的內容所界定，而非由以實例之方式表示之實施例所界定。

無

［圖1］係描繪三種不同質體構築體之示意圖：質體1（7725 bp，包括4835 bp的插入物），質體2（8203 bp，包括5313 bp的插入物），及質體3（8132 bp，包括5242 bp的插入物）。 ［圖2］係描繪兩種不同的大有效負載質體構築體之示意圖：質體4（10929 bp，包括8038 bp的插入物），及質體5（12754 bp，包括9863 bp的插入物）。 ［圖3A］至［圖3C］示出使用質體4進行電穿孔後第8天的CAR表現之圖。 ［圖4A］至［圖4C］示出使用質體5進行電穿孔後第8天的CAR表現之圖。

Claims (51)

1. 一種轉位子，其包含編碼多肽之轉殖基因，該多肽包含第一嵌合抗原受體(CAR)及第二CAR，其中該第一CAR及該第二CAR各自包含：單鏈片段(scFv)、跨膜域、及基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。
2. 如請求項1之轉位子，其中該轉位子係DNA轉位子，其選自由睡美人(Sleeping Beauty)轉位子、piggyBac轉位子、及Tc Buster轉位子所組成之群組，或係反轉錄轉位子。
3. 如請求項2之轉位子，其中該轉位子係睡美人轉位子或Tc Buster轉位子。
4. 如前述請求項中任一項之轉位子，其中該轉殖基因的長度至少係5000個核苷酸。
5. 如請求項4之轉位子，其中該轉殖基因的長度至少係6000個核苷酸。
6. 如前述請求項中任一項之轉位子，其中該轉殖基因中用於每個ITAM的編碼序列係經密碼子最佳化，使其與12個或更長之連續核苷酸中的其他者不具有序列同一性。
7. 如請求項6之轉位子，其中該轉殖基因中用於每個ITAM的編碼序列係經密碼子最佳化，使其與9個或更長之連續核苷酸中的其他者不具有序列同一性。
8. 如前述請求項中任一項之轉位子，其中該ITAM係衍生自蛋白質的細胞質信號傳導序列，該蛋白質係選自由TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d所組成之群組。
9. 如請求項8之轉位子，其中該ITAM係衍生自CD3ζ、CD3ε、或兩者。
10. 如前述請求項中任一項之轉位子，其中該第一CAR及該第二CAR各自進一步包含胞內共刺激域。
11. 如請求項10之轉位子，其中該胞內共刺激域係蛋白質的信號傳導區，該蛋白質係選自由以下所組成之群組：DAP-10、CD28、OX-40、4-1BB (CD137)、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡1 (PD-1)、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1、CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276 (B7-H3)、腫瘤壞死因子超家族成員14、TNFSF14、LIGHT)、NKG2C、Igα (CD79a)、Fcγ受體、MHC第一型分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、活化NK細胞受體、BTLA、鐸配體受體、CDS、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30，NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD (CD11d)、ITGAE (CD103)、ITGAL (CD11a)、ITGAM (CD11b)、ITGAX (CD11c)、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE (RANKL)、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244, 2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A, Lyl08)、SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG (Cbp)、CD19a、與CD83特異性結合之配體，及其等之組合。
12. 如請求項2之轉位子，其中該胞內共刺激域係DAP-10、4-1BB、或CD28的信號傳導區。
13. 一種細胞，其包含如請求項1至12中任一項之轉位子。
14. 如請求項13之細胞，其係T細胞、NK細胞、NKT細胞、單核細胞、巨噬細胞、或其前驅細胞。
15. 如請求項13或14之細胞，其進一步包含異源轉位酶。
16. 如請求項15之細胞，其中該異源轉位酶係選自由piggyBac ^®轉位酶、piggy-Bac ^®樣轉位酶、Super piggyBac ^®(SPB)轉位酶、piggyBac轉位酶、睡美人轉位酶、超活性睡美人(SB100X)轉位酶、Helitron轉位酶、Tol2轉位酶、TcBuster轉位酶、或超活性TcBuster轉位酶所組成之群組。
17. 如請求項16之細胞，其中該異源轉位酶係睡美人轉位酶SB100X或piggyBac轉位酶。
18. 一種製備經轉染淋巴球的方法，其包含： 自供體對象獲取包含T細胞的一樣本； 使用轉位子培養該樣本，以將該等T細胞進行轉染，從而產生經轉染T細胞；及 在採集該等T細胞之前，培養包含該等經轉染T細胞的該樣本少於96小時，以產生一經採集樣本， 其中該經採集樣本中至少40%的T細胞係初始(naïve) T細胞。
19. 如請求項18之方法，其中該經採集樣本中至少50%的T細胞係初始T細胞。
20. 如請求項18或19之方法，其中該等初始T細胞之特徵在於CD45RA ⁺及CCR7 ⁺。
21. 如請求項20之方法，其中該等初始T細胞進一步之特徵在於CD62L ⁺、CD27 ⁺、及CD28 ⁺。
22. 如請求項18至21中任一項之方法，其中該等T細胞在該轉染前未經活化。
23. 如請求項18至22中任一項之方法，其中該等T細胞包含CD4+ T細胞。
24. 如請求項18至23中任一項之方法，其中該轉位子係DNA轉位子，其選自由睡美人轉位子、piggyBac轉位子、及Tc Buster轉位子所組成之群組，或係反轉錄轉位子。
25. 如請求項24之方法，其中該轉位子係睡美人轉位子或Tc Buster轉位子。
26. 如請求項24或25之方法，其中該轉殖基因的長度至少係5000個核苷酸。
27. 如請求項26之方法，其中該轉殖基因的長度至少係6000個核苷酸。
28. 如請求項18至27中任一項之方法，其中該轉位子包含編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)的轉殖基因。
29. 一種製備表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)的淋巴球的方法，其包含： 獲取一生物樣本，其包含來自人類對象的淋巴球； 向該等淋巴球引入轉位酶及轉位子，該轉位子包含編碼包含該CAR或該TCR之多肽的轉殖基因；及 採集包含該轉位酶及該轉位子的淋巴球， 其中對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後之96小時內。
30. 如請求項29之方法，其中該轉位酶及該轉位子係經由電穿孔、核轉染、脂質轉染、超聲波、或磁轉染引入該等淋巴球。
31. 如請求項29之方法，其中該轉位酶及該轉位子係經由電穿孔引入該等淋巴球。
32. 如請求項29至31中任一項之方法，其中對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後之72小時內。
33. 如請求項29至31中任一項之方法，其中對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後之48小時內。
34. 如請求項29至31中任一項之方法，其中對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後之36小時內。
35. 如請求項29至31中任一項之方法，其中對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後之24小時內。
36. 如請求項29至35中任一項之方法，其進一步包含對經採集之該等淋巴球進行冷凍保存，或將經採集之該等淋巴球注射於患者，其中該冷凍保存或該注射發生於獲取該生物樣本後之48小時內。
37. 如請求項29至36中任一項之方法，其中該方法不包括淋巴球活化。
38. 如請求項29至37中任一項之方法，其中該方法不包括淋巴球選擇或淋巴球擴增。
39. 如請求項29至38中任一項之方法，其中該等淋巴球係NK細胞。
40. 如請求項29至38中任一項之方法，其中該等淋巴球係T細胞。
41. 如請求項40之方法，其中將該轉殖基因整合至基因體中之該等T細胞的至少40%在採集時係初始T細胞。
42. 如請求項41之方法，其中該等初始T細胞係CD45RA ⁺及CCR7 ⁺。
43. 如請求項29至35中任一項之方法，其中相較於其中對於淋巴球的該採集發生於獲取該生物樣本後168小時的一相當之程序，該等淋巴球在採集時包含更多初始T細胞。
44. 如請求項29至43中任一項之方法，其中該多肽進一步包含第二CAR，且該第一CAR及該第二CAR各自包含：單鏈片段(scFv)、跨膜域、及基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。
45. 如請求項29至44中任一項之方法，其中該轉位子係DNA轉位子，其選自由睡美人轉位子、piggyBac轉位子、及Tc Buster轉位子所組成之群組，或係反轉錄轉位子。
46. 如請求項45之方法，其中該轉位子係睡美人轉位子或Tc Buster轉位子。
47. 如請求項29至46中任一項之方法，其中該轉殖基因的長度至少係5000個核苷酸。
48. 如請求項18至47中任一項之方法，其中經受轉染的該樣本包含至少25×10 ⁶個細胞。
49. 如請求項48之方法，其中經受轉染之該樣本包含至少50×10 ⁶個細胞。
50. 如請求項48或49之方法，其中該轉染係於體積為0.1 mL至100 mL的溶液中進行。
51. 如請求項48至50中任一項之方法，其中該轉染導致該樣本中至少40%的T細胞或淋巴球經轉染。