TW202346577A

TW202346577A - 用於製備用於細胞療法之經工程改造之淋巴球的組成物及方法

Info

Publication number: TW202346577A
Application number: TW112119651A
Authority: TW
Inventors: 瓦利德哈索; 齊蔡; 譚阮亞波; 蔡新全; 卡爾門沃倫; 美樂蒂葛瑞勾軒
Original assignee: 美商凱特製藥公司
Priority date: 2022-05-27
Filing date: 2023-05-26
Publication date: 2023-12-01
Also published as: US20230392119A1; WO2023230276A1

Abstract

本文提供用於製造經工程改造之淋巴球之組成物及方法。亦提供製備的經工程改造之淋巴球，其具有增加的幼年/初始淋巴球比例以增加治療功效。與習知技術相比，各種實施例中之方法更快速，且產生具有提高的存活率、轉導成功率、及體內抗腫瘤功效之淋巴球。

Description

用於製備用於細胞療法之經工程改造之淋巴球的組成物及方法

本揭露係關於細胞療法之領域，且更具體而言，係關於用於製造經工程改造之淋巴球的組成物及方法。

免疫細胞可經修飾以靶向且殺死患者體內之癌細胞。為了增加免疫細胞靶向及殺滅特定癌細胞之能力，已開發出方法來工程改造免疫細胞以表現將免疫細胞對準特定目標癌細胞之構築體。包括能夠與特定腫瘤抗原交互作用之結合域的嵌合抗原受體(CAR)及經工程改造T細胞受體(TCR)讓免疫細胞能夠靶向及殺滅表現該特定腫瘤抗原之癌細胞。

重大挑戰係來自高度複雜的自體細胞工程改造及產生過程，其通常需要至少一週的時間，且甚至可能長達數週。在該過程期間，從患者身上收集的淋巴球必須運到加工中心，同時產生出的細胞必須經冷凍保存，接著運回予患者以進行植入。此種高度複雜的過程必然導致高成本，且在臨床應用上有所限制。

另外，冗長過程可導致降低的細胞存活率及增加的淋巴球成熟，兩者皆不利於體內功效。因此，開發不僅持續時間更短，且亦產生具有改進的治療功效之免疫細胞的過程的需求尚未得到滿足。

如所提供，當前自體CAR細胞製造過程一般耗時約7天且可能更長。本揭露描述可在6天或甚至4天內（或在富集步驟之後5天或甚至3天內）完成之改進過程。在各種實例中，5天過程（亦即，在富集之後5天）包括轉導準備及實施步驟，其中將更多數目的淋巴球與固定至塗覆於封閉系統之內表面之重組纖連蛋白的載體接觸。此類改進的轉導程序允許大大縮短轉導後細胞擴增步驟。

然而，完全不需要轉導後擴增之另一改進的過程可在起始富集步驟之後僅3天內完成。出人意料地發現，3天及5天過程均產生具有較高幼年細胞百分比之經轉導淋巴球。至少部分由於增加的幼年細胞群體，與習知7天過程相比，此等細胞產物展現出大幅提高的體內抗腫瘤功效。

因此，根據本揭露之一個實施例，提供用於製備經轉導淋巴球之方法，其包含將自供體對象獲得的包含淋巴球之樣本與多核苷酸載體一起培養，以轉導淋巴球來產生經轉導之淋巴球；及培養包含經轉導之淋巴球之樣本少於72小時，之後收集該等淋巴球以產生收集的樣本。

在一些實施例中，將經轉導之淋巴球培養少於48小時，之後收集。在一些實施例中，將經轉導之淋巴球培養少於36小時，之後收集。

在一些實施例中，培養係在封閉系統中進行。在一些實施例中，封閉系統之內表面積為至少1500 cm ²。在一些實施例中，封閉系統具有塗覆有重組人類纖連蛋白之內表面，其中該塗覆係以包含約1至10 µg/ml之重組人類纖連蛋白之溶液進行。在一些實施例中，內表面進一步與包含多核苷酸載體之第二溶液接觸，其中該第二溶液之體積為約200 mL。在一些實施例中，該塗覆進一步包含第二溶液之引流。在一些實施例中，封閉系統中之樣本包含至少1.5 × 10 ⁸個淋巴球。在一些實施例中，樣本包含至少4 × 10 ⁸個淋巴球。

在一些實施例中，淋巴球係周邊血液單核細胞(PBMC)或T細胞。在一些實施例中，收集的樣本包含CD3+細胞。在一些實施例中，收集的樣本包含CD4+及CD8+ T細胞。在一些實施例中，至少20%之收集的CD4+ T細胞係初始T細胞，且不大於12%之收集的CD4+ T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，至少25%之收集的CD4+ T細胞係初始T細胞，且不大於9%之收集的CD4+ T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，至少80%之收集的CD4+ T細胞係CCR7+細胞。在一些實施例中，至多20%之收集的CD4+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。

在一些實施例中，至少10%之收集的CD8+ T細胞係初始T細胞，且不大於30%之收集的CD8+ T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，至少20%之收集的CD8+ T細胞係初始T細胞，且不大於20%之收集的CD8+ T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，初始T細胞表徵為CCR7+及CD45RA+。在一些實施例中，效應記憶T細胞表徵為CCR7-、CD45RO+、及CD95+。在一些實施例中，至少60%之收集的CD8+ T細胞係CCR7+細胞。在一些實施例中，至多40%之收集的CD8+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。

在一些實施例中，該方法進一步包含自供體對象取得淋巴球。在一些實施例中，該方法進一步包含富集淋巴球。在一些實施例中，該方法進一步包含使樣本與淋巴球刺激劑接觸以活化淋巴球。

在一些實施例中，活化該樣本係在將該樣本與多核苷酸載體一起培養之前。在一些實施例中，樣本包含至少1 × 10 ⁹個淋巴球。在一些實施例中，活化該樣本係在將該樣本與多核苷酸載體一起培養之後。在一些實施例中，淋巴球刺激劑包含抗CD3抗體及/或抗CD28抗體。

在一些實施例中，該方法進一步包含在收集之後，向對象投予收集的淋巴球或冷凍收集的淋巴球。在一些實施例中，該對象與供體對象相同。在一些實施例中，向對象投予每公斤對象總計10,000至3,000,000個收集的淋巴球。在一些實施例中，向對象投予每公斤對象總計20,000至400,000個收集的淋巴球。在一些實施例中，至少15%之收集的淋巴球係用載體轉導。

在一些實施例中，多核苷酸載體係病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係反轉錄病毒載體或慢病毒載體。在一些實施例中，載體編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，CAR包含胞內共刺激域。在一些實施例中，胞內共刺激域係選自由下列所組成之群組的蛋白質的信號傳導區：DAP-10、CD28、OX-40、4-1BB (CD137)、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1 (PD-1)、可誘導T細胞共刺激分子(ICOS)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1，CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276 (B7-H3)、腫瘤壞死因子超家族成員14 (TNFSF14，LIGHT)、NKG2C、Igα (CD79a)、Fcγ受體、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、CDS、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD (CD11d)、ITGAE (CD103)、ITGAL (CD11a)、ITGAM (CD11b)、ITGAX (CD11c)、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE (RANKL)、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG (Cbp)、CD19a、與CD83特異性結合之配體、及其組合。在一些實施例中，胞內共刺激域係CD28之信號傳導區。

在一些實施例中，CAR或TCR識別腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原係CD19。在一些實施例中，包含CAR之淋巴球係西卡思羅(axicabtagene ciloleucel)或布萊奧妥(brexucabtagene autoleucel)。在一些實施例中，腫瘤抗原係CD19及/或CD20。在一些實施例中，腫瘤抗原係CLL-1。

在一些實施例中，CAR或TCR識別抗原，該抗原包含2B4 (CD244)、4-1BB、5T4、A33抗原、腺癌抗原、腎上腺素受體β3 (ADRB3)、A激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)、α胎兒蛋白(AFP)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、雄性激素受體、B7H3 (CD276)、β2整合素、BAFF、B淋巴瘤細胞、B細胞成熟抗原(BCMA)、bcr-abl（由斷點簇集區(BCR)及Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1 (Abl)所組成之致癌基因融合蛋白）、BhCG、骨髓基質細胞抗原2 (BST2)、CCCTC結合因子（鋅指蛋白質）樣（BORIS或印記位點調節物兄弟）、BST2、C242抗原、9-0-乙醯基-CA19-9標記、CA-125、CAEX、鈣網蛋白、碳酸酐酶9 (CAIX)、C-MET、CCR4、CCR5、CCR8、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD7、CD10、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23（IgE受體）、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30 (TNFRSF8)、CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD51、CD52、CD56、CD63、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD96、CD97、CD100、CD123、CD125、CD133、CD137、CD138、CD150、CD152 (CTLA-4)、CD160、CD171、CD179a、CD200、CD221、CD229、CD244、CD272 (BTLA)、CD274 (PDL-1、B7H1)、CD279 (PD-1)、CD352、CD358、CD300分子樣家族成員f (CD300LF)、癌胚抗原(CEA)、密連蛋白6 (CLDN6)、C型凝集素樣分子-1（CLL-1或CLECL1）、C型凝集素域家族12成員A (CLEC12A)、巨細胞病毒(CMV)感染之細胞抗原、CNT0888、CRTAM (CD355)、CS-1（亦稱為CD2子集1、CRACC、CD319、及19A24）、CTLA-4、週期蛋白B l、染色體X開讀框61 (CXORF61)、細胞色素P450 1B 1 (CYP1B1)、DNAM-1 (CD226)、橋粒芯蛋白4、DR3、DR5、E-鈣黏素新表位、上皮生長因子受體(EGFR)、EGF1R、上皮生長因子受體變體III (EGFRvIII)、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)、突變型延伸因子2 (ELF2M)、內皮唾液酸蛋白、上皮細胞黏附分子(EPCAM)、A型蝶素受體2 (EphA2)、蝶素B2、受體酪胺酸蛋白質激酶erb-B2,3,4 (erb-B2,3,4)、ERBB、ERBB2 (Her2/neu)、ERG（跨膜絲胺酸蛋白酶2 (TMPRSS2) ETS融合基因）、ETA、位於染色體12p上之ETS易位變體基因6 (ETV6-AML)、IgA受體之Fc片段（FCAR或CD89）、纖維母細胞活化蛋白α (FAP)、FBP、Fc受體樣5 (FCRL5)、胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)、纖連蛋白外域B、Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)、葉酸結合蛋白(FBP)、葉酸受體1、葉酸受體α、葉酸受體β、Fos相關抗原1、岩藻醣基、岩藻醣基GM1；GM2、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)、GITR (TNFRSF 18)、GM1、神經節苷脂GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、GP 100、globoH糖神經醯胺(GloboH)之六醣部分、醣蛋白75、磷脂肌醇聚醣-3 (GPC3)、醣蛋白100 (gplOO)、GPNMB、G蛋白偶聯受體20 (GPR20)、G蛋白偶聯受體C型家族5成員D (protein-coupled receptor class C group 5, member D, GRC5D)、A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)、人類上皮生長因子受體2 (HER-2)、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMWMAA)、人類乳突狀瘤病毒E6 (HPV E6)、人類乳突狀瘤病毒E7 (HPV E7)、突變之熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)、人類分散因子受體激酶、人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)、HVEM、ICOS、胰島素樣生長因子受體1（IGF-1受體）、IGF-I、IgGl、免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)、IL-6、介白素11受體α (IL-11Ra)、IL-13、介白素-13受體次單元α-2（IL-13Ra2或CD213A2）、胰島素樣生長因子I受體(IGF1-R)、整合素α5β1、整合素ανβ3、腸羧基酯酶、κ-輕鏈、KCS1、激酶插入域受體(KDR)、KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、KIR-L、KG2D配體、KIT (CD117)、KLRGI、LAGE-la、LAG3、淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)、白血球免疫球蛋白樣受體子家族A成員2 (LILRA2)、豆莢蛋白(legumain)、白血球相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)、路易士(Y)抗原、LeY、LG、LI細胞黏附分子(LI-CAM)、LIGHT、LMP2、淋巴球抗原6複合物、LTBR、基因座(locus) K 9 (LY6K)、Ly-6、淋巴球抗原75 (LY75)、黑色素瘤癌睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2 (MAD-CT-1)、MAGE、黑色素瘤相關抗原1 (MAGE-A1)、T細胞辨識之MAGE-A3黑色素瘤抗原1（MelanA或MARTI）、MelanA/MARTl、間皮素、MAGE A3、黑色素瘤凋亡抑制劑ML-IAP)、黑色素瘤特異性硫化軟骨蛋白多醣(MCSCP)、MORAb-009、MS4A1、黏蛋白1 (MUCl)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC16、黏蛋白CanAg、II型密拉氏管抑制物質(MIS)受體、v-myc禽骨髓瘤細胞病毒致癌基因神經母細胞瘤衍生性同源物(MYCN)、N-羥乙醯神經胺酸、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶V (Na17)、神經細胞黏附分子(NCAM)、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E配體、NKR-P IA、NPC-1C、NTB-A、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、NY-ESO-1、致癌胎兒抗原(h5T4)、嗅覺受體51E2 (OR51E2)、OX40、漿細胞抗原、poly SA、前頂體素結合蛋白sp32 (OY-TES l)、p53、p53突變體、泛連接蛋白3 (PANX3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)、成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)、前列腺癌腫瘤抗原1（PCTA-1或半乳糖凝集素8）、PD-1H、血小板衍生生長因子受體α (PDGFR-α)、PDGFR-β、PDL192、PEN-5、磷脂絲胺酸、胎盤特異性蛋白1 (PLAC1)、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌細胞、前列腺蛋白(prostein)、蛋白酶絲胺酸21（睪素或PRSS21）、蛋白酶3 (PR1)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、蛋白酶體（前體、巨蛋白因子）次單元β型、晚期糖化終產物受體(RAGE-1)、RANKL、Ras突變體、Ras同源物家族成員C (RhoC)、RON、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、腎遍在蛋白1 (renal ubiquitous 1, RU1)、腎遍在蛋白2 (RU2)、肉瘤易位斷點、由T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)、SAS、SDC1、SLAMF7、唾液酸基路易士黏附分子(sLe)、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、音蝟因子(SHH)、精子蛋白17 (SPA17)、階段特異性胚胎抗原4 (SSEA-4)、STEAP、sTn抗原、滑膜肉瘤X斷點2 (SSX2)、存活素、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、TCR5y、TCRa、TCRB、TCRγ交替讀框蛋白(TARP)、端粒酶、TIGIT TNF-α前驅物、腫瘤內皮標記1 (TEM1/CD248)、腫瘤內皮標記7相關蛋白(TEM7R)、肌腱蛋白C、TGF-β2、TGF-β、轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)、促血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)、TIM1、TIM2、TIM3、Tn Ag、TRAIL-R1、TRAIL-R2、酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)、促甲狀腺激素受體(TSHR)、腫瘤抗原CTAA16.88、酪胺酸酶、ROR1、TAG- 72、尿溶蛋白2 (UPK2)、VEGF-A、VEGFR-1、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、及波形蛋白、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)蛋白(WT1)、或X抗原家族成員1A (XAGE1)、或其組合。

在一個實施例中，亦提供由供體對象之血液樣本製備之細胞群體，其包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞，其中：至少20%之收集的CD4+ T細胞係初始T細胞，且不大於12%之收集的CD4+ T細胞係效應記憶T細胞；至少10%之收集的CD8+ T細胞係初始T細胞，且不大於30%之收集的CD8+ T細胞係效應記憶T細胞；至少50%之收集的細胞係CD3+ T細胞；及至少25%之所有T細胞均經編碼CAR或TCR之多核苷酸載體轉導。

在一個實施例中，亦提供由供體對象之血液樣本製備之細胞群體，其包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞，其中：至少80%之CD4+ T細胞係CCR7+細胞；至少60%之CD8+ T細胞係CCR7+細胞；至多20%之CD4+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合；且至多40%之CD8+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合，其經編碼CAR或TCR之多核苷酸載體轉導。

在一些實施例中，至少25%之收集的CD4+ T細胞係初始T細胞，且不大於9%之收集的CD4+ T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，至少20%之收集的CD8+ T細胞係初始T細胞，且不大於20%之收集的CD8+ T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，初始T細胞表徵為CCR7+及CD45RA+。在一些實施例中，效應記憶T細胞表徵為CCR7-、CD45RO+、及CD95+。在一些實施例中，至少65%之收集的細胞係CD3+ T細胞。在一些實施例中，至少15%之所有T細胞均經多核苷酸載體轉導。

在一些實施例中，至少80%之收集的CD4+ T細胞係CCR7+細胞。在一些實施例中，至多20%之收集的CD4+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。在一些實施例中，至少60%之收集的CD8+ T細胞係CCR7+細胞。在一些實施例中，至多40%之收集的CD8+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。

在一些實施例中，多核苷酸載體係病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係反轉錄病毒載體或慢病毒載體。在一些實施例中，CAR包含胞內共刺激域。在一些實施例中，胞內共刺激域係CD28之信號傳導區。在一些實施例中，CAR識別腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原係CD19。在一些實施例中，包含CAR之細胞群體係西卡思羅(axicabtagene ciloleucel)或布萊奧妥(brexucabtagene autoleucel)。

亦提供醫藥組成物，其包含如本文所述之細胞群體。

又另一實施例提供用於向對象投予T細胞之方法，其包含向對象注射藉由本揭露之方法製備的收集的樣本，或醫藥組成物。在一些實施例中，對象患有癌症。在一些實施例中，癌症係B細胞惡性疾病。在一些實施例中，癌症係非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、彌漫型大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴球淋巴瘤(SLL/CLL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、結外（MALT淋巴瘤）、結型（單核細胞樣B細胞淋巴瘤）、脾彌漫型大細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病/淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、急性骨髓性白血病、或多發性骨髓瘤。

相關申請案之交互參照

本申請案主張於2022年5月27日提出申請之美國臨時專利申請案第63/346,709號、於2023年2月17日提出申請之美國臨時專利申請案第63/485,623號、及於2023年3月14日提出申請之美國臨時專利申請案第63/490,162號之優先權權益，其等全文特此以引用方式併入本文中。定義

為了能更輕易理解本揭露，以下先定義某些用語。下列用語及其他用語之額外定義係在本說明書中各處闡述。

除非有具體陳述或自上下文中明顯可知，如本文中所使用，用語「或(or)」係理解為涵括性的且同時涵蓋「或(or)」與「及(and)」。

在本文中，將使用用語「及/或(and/or)」之處認為是具體揭露兩個指定特徵或組分之各者（包含或不包含另一者）。因此，如用於諸如「A及/或B」之詞組中的用語「及/或」在本文中係意欲包括A及B；A或B；A（單獨）；及B（單獨）。同樣地，如用於諸如「A、B、及/或C (A, B, and/or C)」之詞組中的用語「及/或(and/or)」係意欲涵蓋下列態樣之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A（單獨）；B（單獨）；及C（單獨）。

除非特定陳述或從上下文顯而易見，否則用語「約(about)」係指藉由所屬技術領域中具有通常知識者所判定之特定值或組成之可接受誤差範圍內之一值或組成，其將部分取決於該值或組成如何測量或判定，即，測量系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含(comprising essentially of)」可意指根據所屬技術領域中之實踐之一或多個標準差內。「約」或「基本上包含」可意指至多10%之範圍（即±10%）。因此，「約」可理解為在10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、或0.001%內大於或小於所述值。例如，約5 mg可包括在4.5 mg與5.5 mg之間的任何量。此外，特別是關於生物系統或程序，用語可意指至多一個數量級或至多5倍之值。除非另外說明，否則在本揭露中提供特定值或組成時，應假設「約」或「基本上包含」之意義係在該特定值或組成之可接受誤差範圍內。

「投予(Administering)」係指使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何各種方法及遞送系統將藥劑實體引入至對象，諸如本文所揭示之經修飾之T細胞。用於本文所揭示之配方的例示性投予途徑包括靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、脊椎、或其他腸胃外投予途徑，例如藉由注射或輸注。片語「腸胃外投予(parenteral administration)」意指除腸內及局部(topical)投予以外的投予模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴內(intralymphatic)、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊椎內、硬膜外、及胸骨內注射及輸注、以及體內電穿孔。在一些實施例中，配方經由非腸胃外途徑投予，例如經口。其他非腸胃外途徑包括局部、上皮或黏膜投予途徑，例如，鼻內、陰道內、直腸、舌下、或局部。亦可執行投予，例如一次、多次、及/或經過一或多個延伸週期。

用語「同種異體(allogeneic)」係指衍生自一個個體之任何材料，其接著引入相同物種之另一個體，例如同種異體T細胞移植。

用語「抗體(antibody)」(Ab)包括但不限於特異性結合至抗原之醣蛋白免疫球蛋白。一般而言，且抗體可包含至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈，其等藉由二硫鍵或其抗原結合分子互相連接。各H鏈包含重鏈可變區（在本文中縮寫為VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定域，CH1、CH2、及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（在本文中縮寫為VL）及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域，CL。VH及VL區可進一步細分成高度變異區，稱為互補決定區(CDR)，其中散布稱為架構區(FR)之更具保守性的區。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，以下列順序從胺基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合域。Ab之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統之第一組分(C1q)。一般而言，人類抗體係大約150 kD之四聚體藥劑，由兩個同一之重(H)鏈多肽（各自約50 kD）及兩個同一之輕(L)鏈多肽（各自約25 kD）組成，其等彼此締合成一般稱為「Y形狀」結構。重鏈及輕鏈藉由單一二硫鍵彼此相連或連接；其他兩個二硫鍵將重鏈鉸鏈區彼此連接，使得二聚體彼此連接並形成四聚體。天然產生之抗體亦經醣化，例如在CH2域上。

「抗原結合分子(antigen binding molecule)」、「抗原結合部分(antigen binding portion)」、「抗原結合片段(antigen binding fragment)」、或「抗體片段(antibody fragment)」係指包含衍生分子之抗體之抗原結合部分（例如CDR）之任何分子。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括但不限於形成自抗原結合分子之Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體、及多特異性抗體。肽體(peptibody)（亦即，包含肽結合域之Fc融合分子）係合適抗原結合分子之另一實例。在一些實施例中，抗原結合分子結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中，抗原結合分子結合至涉及過度增生性疾病之細胞上的抗原或結合至病毒或細菌抗原。在某些實施例中，抗原結合分子係嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。

用語「可變區(variable region)」或「可變域(variable domain)」可互換使用。可變區一般係指抗體之一部分，通常係輕鏈或重鏈之一部分，一般係成熟重鏈中胺基端的約110至120個胺基及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其在抗體之間的序列差異很大，且係用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列之變異性集中在稱為互補決定區(CDR)之區中，而可變域中更高度保守的區稱為架構區(FR)。不希望受任何特定機制或理論束縛，咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之交互作用及特異性。在某些實施例中，可變區係人類可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及人類架構區(FR)。在特定實施例中，可變區係靈長類（例如非人類靈長類）可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及靈長類（例如非人類靈長類）架構區(FR)。

用語「VL」及「VL域(VL domain)」可互換使用以指抗體或其抗原結合分子之輕鏈可變區。

用語「VH」及「VH域(VH domain)」可互換使用以指抗體或其抗原結合分子之重鏈可變區。

CDR之一些定義係通常使用：Kabat編號、Chothia編號、AbM編號、或contact編號。AbM定義係Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體所使用之兩者之間之妥協。Contact定義係基於可用複雜晶體結構之分析。

用語「自體(autologous)」係指任何衍生自相同個體之材料，該材料之後會再重新引入至該個體。例如，本文所述之經工程改造之自體細胞療法(eACT™)方法涉及自患者收集淋巴球，接著將其工程改造以表現例如CAR構築體，接著投予回同一位患者。

「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」或「CAR」係指經工程改造以包含結合模體之分子及活化免疫細胞（例如T細胞，諸如初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞、或其組合）在抗原結合時之手段。CAR亦稱為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。在一些實施例中，CAR包含結合模體、胞外域、跨膜域、一或多個共刺激域、及胞內信號傳導域。已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體之T細胞可稱為CAR T細胞。「胞外域(extracellular domain)」（或「ECD」）係指多肽之部分，其當多肽存在於細胞膜中時，應理解為位於細胞膜外之胞外空間中。

「T細胞受體」或「TCR」係指存在於T細胞表面上之抗原識別分子。在正常T細胞發展期間，四個TCR基因α、β、γ、及δ之各者可重新排列導致高度不同之TCR蛋白質。

用語「異源(heterologous)」意指來自非天然存在之序列的任何來源。例如，作為共刺激蛋白質之一部分包括的異源序列係非天然存在之胺基酸，亦即與野生型人類共刺激蛋白質不一致。例如，異源核苷酸序列係指野生型人類共刺激蛋白質編碼序列以外的核苷酸序列。

用語「同一性(identity)」係指聚合分子之間的整體相關性，例如在核酸分子之間（例如DNA分子及/或RNA分子）及/或多肽分子之間。與兩個所提供之多肽序列之間的同一性百分比計算的方法係已知的。例如可藉由比對二個序列以用於最佳比較目的來執行兩個核酸或多肽序列之同一性百分比之計算（例如可在第一及第二序列中之一或兩者中引入間隙以用於最佳比對，且可出於比較目的忽略非同一性序列）。接著比較對應位置處之核苷酸或胺基酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之對應位置同一之殘基（例如核苷酸或胺基酸）佔據時，則分子在彼位置處係同一的。兩個序列之間的同一性百分比係序列共有的相同位置數目之函數，其可選地考慮間隙數目及各間隙之長度，可能需要引入間隙以達到兩個序列之最佳比對。可使用數學演算法（諸如BLAST（基本局部比對搜尋工具））實現序列之比較或比對及兩個序列之間的同一性百分比之判定。在一些實施例中，若其序列係至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），則聚合分子視為彼此「同源」。

免疫療法之免疫細胞可來自所屬技術領域中已知之任何來源。例如，免疫細胞可體外分化自造血幹細胞群體，或免疫細胞可獲自對象。免疫細胞可得自例如周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積水、脾臟組織、及腫瘤。此外，免疫細胞可衍生自所屬技術領域中可用之一或多種免疫細胞系。免疫細胞亦可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何數量之技術，諸如FICOLL™分離、OPTIPREP™分離、及/或血球分離來自對象收集之血液之單位獲取。免疫細胞療法單離免疫細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號中，其全文以引用方式併入本文中。

「患者(patient)」包括任何罹患癌症（例如，淋巴瘤或白血病）之人類。用語「對象(subject)」及「患者」在本文中可互換使用。

用語「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」係指分子或組成物當向接受者投予時，對其接受者無害，或對其接受者的益處超過任何有害效應。關於用於調配如本文所揭示之組成物的載劑、稀釋劑、或賦形劑，醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑必須與組成物之其他成分相容且對其接受者無害，或對接受者的益處必須超過任何有害效應。用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」意指醫藥上可接受之材料、組成物、或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、或溶劑包封材料，其涉及將藥劑自身體之一個部分攜帶或運輸至另一部分（例如自一個器官至另一個）。在醫藥組成物中存在之各載體在與配方之其他成分相容之情況下必須係「可接受(acceptable)」，且對患者無害，或必須對接受者的益處超過任何有害效應。可用作醫藥上可接受之載劑之材料的一些實例包含：糖，諸如乳糖、葡萄糖、及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油、及黃豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇、及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；洋菜；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無致熱原的水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酐；及醫藥配方中採用的其他非毒性相容物質。

用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指其中活性劑與一或多種醫藥上可接受之載劑調配在一起之組成物。在一些實施例中，活性劑以適於治療方案中投予之單位劑量存在，該治療方案展示當向相關對象或群體投予時達成預定治療效果之統計顯著機率。在一些實施例中，醫藥組成物可經調配以固體或液體形式投予，包含但不限於適用於以下形式：口服投予，例如灌劑（水性或非水性溶液或懸浮液）、錠劑，例如用於經頰、舌下、及全身性吸收者、丸劑、散劑、顆粒劑、施用於舌頭之糊劑；腸胃外投予，例如藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射作為例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放配方；局部施用，例如作為乳膏、軟膏或控制釋放貼片、或施用至皮膚、肺或口腔之噴霧；陰道內或直腸內，例如作為栓劑、乳膏或泡沫；舌下；眼；經皮膚；或經鼻、肺及其他黏膜表面。

用語「降低(reducing)」及「減少(decreasing)」在本文中可互換使用，並且指示任何小於原始者之改變。「降低」及「減少」係相對用語，需要測量前後之間的比較。「降低」及「減少」包括完全耗盡。

用語「參考(reference)」描述與其進行比較之標準或控制。舉例而言，在一些實施例中，將所關注之藥劑、動物、個體、群體、樣本、序列、或值與作為藥劑、動物、個體、群體、樣本、序列、或值之參考或對照相比較。在一些實施例中，將所關注之測試、測量或判定與參考或對照實質上同時測試、測量及/或判定。在一些實施例中，參考或對照係歷史參考或對照，該歷史參考或對照可選地實施在有形介質中。通常，參考或對照係在與評估對象相當的條件或情況下判定或表徵的。當存在足夠的相似性以證明對所選擇之參考或對照的依賴及/或比較是合理的。

治療劑（例如經工程改造之CAR T細胞）之「治療有效量(therapeutically effective amount)」、「有效劑量(effective dose)」、「有效量(effective amount)」、或「治療有效劑量(therapeutically effective dosage)」係任何量，當單獨或與另一治療劑組合使用時，保護對象免受疾病之發作或促進疾病回歸，表現為疾病症狀之嚴重程度降低、疾病無症狀期之頻率及持續時間增加，或預防由於疾病折磨造成的損害或殘疾。促進疾病回歸之治療劑之能力可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類對象中、在預測人類功效的動物模型系統中、或藉由在體外檢定中檢定藥劑之活性。

用語「轉導(transduction)」及「經轉導(transduced)」係指經由病毒載體將外來核酸引入細胞中之過程（參見Jones et al.,「Genetics: principles and analysis,」Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998))。在一些實施例中，載體係反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾司坦-巴爾(Epstein Barr)病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體、或其任何組合。

對象之「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指向對象進行之任何類型之干預或過程，或向對象投予活性劑，目的係反轉、緩解、改善、抑制、減緩或預防症狀、併發症或病況之發作、進展、發展、嚴重程度或再發、或與疾病相關聯之生物化學指示。在一個實施例中，「治療(treatment)」或「治療(treating)」」包括部分緩解。在另一實施例中，「治療」包括完全緩解。在一些實施例中，治療可係未展現出相關疾病、病症及/或病況之徵象之對象，及/或僅展現出疾病、病症及/或病況之早期徵象之對象。在一些實施例中，此類治療可係展現出相關疾病、病症及/或病況之一或多種建立徵象之對象。在一些實施例中，治療可係已診斷患有相關疾病、病症及/或病況之對象。在一些實施例中，治療可係已知具有一或多個敏感性因子之對象，該一或多個敏感性因子與相關疾病、病症及/或病況之發展風險增加的統計學上相關。

用語「載體(vector)」係指經修飾以包含或合併所提供核酸序列之接受者核酸分子。一種類型之載體係「質體(plasmid)」，其係指額外DNA可連接之環狀雙股DNA分子。另一種類型之載體係病毒載體，其中額外DNA區段可連接至病毒基因體中。某些載體能夠在其等被引入的宿主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起源之細菌載體及游離基因(episomal)哺乳動物載體）。其他載體（例如非游離基因哺乳動物載體）在引入宿主細胞中後可整合至宿主細胞之基因體中，且藉此與宿主基因體一起複製。此外，某些載體包含直接表現可操作性地連接至其之插入基因之序列。此類載體在本文中可稱為「表現載體(expression vector)」。標準技術可用於載體之工程改造，例如，見於Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其以引用方式併入本文中。

用語「7天過程(7-day process)」係指在多個起始富集及/或活化步驟後耗時約7天之CAR細胞製造過程。7天過程係自（多個）起始富集及/或活化步驟至收集步驟之至少8天時間長度，且當包括多個富集及/或活化步驟，總計在8至11天之間。在一些實施例中，在轉導之前不存在起始活化步驟或無活化。

用語「5天過程(5-day process)」係指在多個起始富集及/或活化步驟後耗時約5天之CAR細胞製造過程。5天過程係自（多個）起始富集及/或活化步驟至收集步驟之6天時間長度，且當包括多個富集及/或活化步驟，總計在6至9天之間。在一些實施例中，在轉導之前不存在起始活化步驟或無活化。

用語「3天過程(3-day process)」係指自多個起始富集及/或活化步驟耗時約3天之CAR細胞製造過程。3天過程係自多個起始富集及/或活化步驟至收集步驟之約4天時間長度。3天過程不包括包含在轉導步驟之後及在收集步驟之前一或多天的細胞擴增步驟。在一些實施例中，在轉導之前不存在起始活化步驟或無活化。

在一些實施例中，本文所述之3天過程係自多個起始富集及/或活化步驟至收集步驟之約5天時間長度。在一些實施例中，3天過程係自（多個）起始富集及/或活化步驟至收集步驟之約3至4天時間長度或約72至96小時時間長度（例如，約72小時、74小時、76小時、78小時、80小時、82小時、84小時、86小時、88小時、90小時、92小時、94小時、96小時時間長度）。在一些實施例中，3天過程係自（多個）起始富集及/或活化步驟至收集步驟之約4至5天時間長度或約96至約120小時時間長度（例如，約96小時、98小時、100小時、102小時、104小時、106小時、108小時、110小時、112小時、114小時、116小時、118小時、120小時時間長度）。在一些實施例中，3天過程係自（多個）起始富集及/或活化步驟至收集步驟少於5天或120小時時間長度。經工程改造之淋巴球之製備

習知自體CAR細胞製造過程耗時約7天且可能更長。至少因為起始材料（亦即，自供體對象收集之血球分離術所獲得之淋巴球）之有限供應、相對低效率轉導、及需要擴增經轉導之細胞，咸信該冗長過程係必要的。CAR細胞製造過程之非限制性實例描述於WO 2015120096及WO 2016191755中，其中之各者全文併入本文中。

然而，如隨附實例中所示，此類冗長過程對患者而言不需要亦無益。如表 7中所示，例如，在擴增過程期間各洗滌步驟相當大地減少經轉導細胞之存活率。此外，數天擴增過程在增加經轉導細胞之總數的同時亦減少更多幼年者（例如，初始T細胞、幹記憶T細胞、及中央記憶T細胞）之百分比且增加更成熟者（例如，效應記憶T細胞）之百分比（表 2 及表 6）。然而，顯示更多的幼年淋巴球比更多的成熟者更有效（表 5 、表 10 及表 11）。

本揭露描述可在5天或甚至3天內（在富集步驟之後）完成之改進過程。在各種實例中，5天過程包括轉導準備及實施步驟，其中將更多數目的淋巴球與固定至塗覆於封閉系統之內表面之重組纖連蛋白的載體接觸。此類改進的轉導程序允許大大縮短轉導後細胞擴增步驟。如表 2中所示，自該5天過程製備之經轉導細胞偏向於更多的幼年細胞。體內抗腫瘤功效結果示於（表 5）中。

然而，完全不需要轉導後擴增之另一改進的過程可在富集步驟之後僅3天內完成。令人驚訝的是，與5天製過程相比，此3天過程產生具有更大百分比之幼年細胞之細胞群體且減少了更成熟、分化及活化的細胞之百分比（將表 6與表 2進行比較）。因此，不僅來自3天過程之細胞產物展現出最佳的體內抗腫瘤功效，甚至可使用更低的劑量來達成此大大提高的功效（表 10 至表 11）。

在又另一令人驚訝的發現中，雖然更快速的淋巴球製備過程提高了所有測試的CAR類型之功效，但其對具有CD28共刺激域之CAR分子尤其有益（與具有4-1BB共刺激域之CAR分子相比）（表 13）。

因此，根據本揭露之一個實施例，提供用於製備經轉導（或以同樣方式轉染）淋巴球之方法。在一些實施例中，方法涉及將淋巴球樣本與多核苷酸載體一起培養，以轉導淋巴球來產生經轉導之淋巴球，及培養含有經轉導之淋巴球之樣本，之後收集該等淋巴球以產生收集的樣本。

在一些實施例中，與耗時約4天之習知過程相比，培養步驟時間縮短。在一些實施例中，在96小時內，或在72小時、60小時、50小時、48小時、42小時、36小時、30小時、29小時、28小時、27小時、26小時、25小時、24小時、23小時、22小時、21小時、20小時、19小時、18小時、17小時、16小時、15小時、14小時、13小時、12小時、11小時、10小時、9小時、8小時、7小時、6小時、5小時、或4小時內完成培養步驟。

在一些實施例中，培養步驟之時間係自轉導步驟（例如，自具有固定的載體之系統移除細胞）至收集細胞以儲存、運輸、或臨床使用來計數。

經轉導淋巴球之培養可在所屬技術領域中已知之培養基及條件中進行。在一些實施例中，經轉導淋巴球之培養可在一定溫度下及/或在CO ₂存在下進行。在某些實施例中，該溫度可係約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、或約39℃。在某些實施例中，該溫度可係約34℃至39℃。在某些實施例中，預定溫度可係約35℃至37℃。在某些實施例中，較佳預定溫度可係約36℃至38℃。在某些實施例中，預定溫度可係約36℃至37℃或更佳約37℃。

在一些實施例中，經轉導淋巴球之培養可在預定水準之CO ₂下進行 _。在某些實施例中，預定水準之CO ₂可係1.0至10% CO ₂。在某些實施例中，預定水準之CO ₂可係約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6.0%、約7.0%、約8.0%、約9.0%、或約10.0% CO ₂。在某些實施例中，預定水準之CO ₂可係約4.5至5.5% CO ₂。在某些實施例中，預定水準之CO ₂可係約5% CO ₂。在某些實施例中，預定水準之CO ₂可係約3.5%、約4.0%、約4.5%、約5.0%、約5.5%、或約6.5% CO ₂。在一些實施例中，擴增經轉導之T細胞群體之步驟可在預定溫度下及/或在預定水準之CO ₂存在下以任何組合進行。例如，在一個實施例中，擴增經轉導之T細胞群體之步驟可包含約36℃至38℃之預定溫度及在約4.5%至5.5% CO ₂之預定水準之CO ₂存在下。

任何合適的培養介質T細胞生長培養基可用於培養於懸浮液中之細胞。例如，T細胞生長培養基可包括但不限於無菌低葡萄糖溶液，該溶液包括合適量之緩衝劑、丙酮酸鎂、丙酮酸鈣、丙酮酸鈉、及碳酸氫鈉。在一個實施例中，培養基係OpTmizer™ (Life Technologies)，但所屬技術領域中具有通常知識者將理解如何產生類似培養基。在一個實施例中，培養基係EX-VIVO™無血清培養基(Lonza Bioscience)。

培養（及/或轉導）步驟可在但不限於封閉系統中進行。在某些實施例中，封閉系統係使用任何合適的細胞培養袋（例如Mitenyi Biotec MACS® GMP細胞分化袋、Origen Biomedical PermaLife™細胞培養袋）之封閉袋培養系統。在一些實施例中，封閉系統之內表面積為至少500 cm ²。在一些實施例中，封閉系統之內表面積為至少1000 cm ²、1200 cm ²、1400 cm ²、1500 cm ²、1600 cm ²、1800 cm ²、2000 cm ²、2200 cm ²、2500 cm ²、或3000 cm ²。在一些實施例中，封閉系統之內表面積不大於1500 cm ²、1600 cm ²、1800 cm ²、2000 cm ²、2200 cm ²、2500 cm ²、或3000 cm ²。

在一些實施例中，用於封閉系統中之細胞培養袋係用重組人類纖連蛋白塗覆。重組人類纖連蛋白片段可包括三個功能域：中央細胞結合域、肝素結合域II、及CS1-序列。重組人類纖連蛋白或其片段可用於藉由協助靶細胞或載體之共定位來增加免疫細胞之病毒轉導的基因效率。在某些實施例中，重組人類纖連蛋白片段係RetroNectin® (Takara Bio, Japan)。在某些實施例中，細胞培養袋可用濃度為約0.1至60 µg/mL，較佳0.5至40 µg/mL之重組人類纖連蛋白片段塗覆。在某些實施例中，細胞培養袋可用濃度為約0.5至20 µg/mL、20至40 µg/mL、或40至60 µg/mL之重組人類纖連蛋白片段塗覆。在某些實施例中，細胞培養袋可用約0.5 µg/mL、1 µg/mL、約2 µg/mL、約3 µg/mL、約4 µg/mL、約5 µg/mL、約6 µg/mL、約7 µg/mL、約8 µg/mL、約9 µg/mL、約10 µg/mL、約11 µg/mL、約12 µg/mL、約13 µg/mL、約14 µg/mL、約15 µg/mL、約16 µg/mL、約17 µg/mL、約18 µg/mL、約19 µg/mL、或約20 µg/mL之重組人類纖連蛋白片段塗覆。在某些實施例中，細胞培養袋可用約2至5 µg/mL、約2至10 µg/mL、約2至20 µg/mL、約2至25 µg/mL、約2至30 µg/mL、約2至35 µg/mL、約2至40 µg/mL、約2至50 µg/mL、或約2至60 µg/mL之重組人類纖連蛋白片段塗覆。在某些實施例中，細胞培養袋可用至少約2 µg/mL、至少約5 µg/mL、至少約10 µg/mL、至少約15 µg/mL、至少約20 µg/mL、至少約25 µg/mL、至少約30 µg/mL、至少約40 µg/mL、至少約50 µg/mL、或至少約60 µg/mL之重組人類纖連蛋白片段塗覆。在某些實施例中，細胞培養袋可用至少約10 µg/mL之重組人類纖連蛋白片段塗覆。在某些實施例中，細胞培養袋可不用重組人類纖連蛋白片段塗覆。

在一些實施例中，將轉導增強劑引入封閉系統中。此類轉導增強劑之非限制性實例包括Vectofusin™轉導混合物。

在某些實施例中，用於封閉袋培養系統中之細胞培養袋可用人類白蛋白血清(HSA)阻斷。在一替代實施例中，細胞培養袋未用HSA阻斷。

一旦封閉系統用重組纖連蛋白塗覆，將包括載體之溶液添加至封閉系統中，使得載體可藉由重組纖連蛋白固定於封閉系統之內表面上。一旦添加細胞，此類固定即可提高轉導效率。

在一些實施例中，載體可係病毒載體，諸如慢病毒載體以及反轉錄病毒載體。數種重組病毒已被用作病毒載體以將基因材料遞送至細胞。可根據轉導步驟使用之病毒載體可係任何親嗜性(ecotropic)或雙嗜性病毒載體，包括但不限於重組反轉錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體、及重組腺相關病毒(AAV)載體。在一個實施例中，病毒載體係MSGV1γ反轉錄病毒載體。在一些實施例中，載體係非病毒載體。

在一些實施例中，使用含有載體之至少100 mL總體積之溶液。在一些實施例中，使用含有載體之至少110 mL、120 mL、130 mL、140 mL、150 mL、160 mL、170 mL、180 mL、190 mL、200 mL、210 mL、220 mL、230 mL、240 mL、250 mL、260 mL、270 mL、280 mL、290 mL、300 mL、350 mL、或400 mL總體積之溶液。在一些實施例中，使用含有載體之不大於150 mL、160 mL、170 mL、180 mL、190 mL、200 mL、210 mL、220 mL、230 mL、240 mL、250 mL、260 mL、270 mL、280 mL、290 mL、300 mL、350 mL、400 mL、或500 mL總體積之溶液。

在一些實施例中，載體溶液包括每毫升1×10 ³至1×10 ¹²個轉導單位(TU/ml)之病毒載體。

一旦封閉系統用重組纖連蛋白塗覆且固定載體，則可移除載體溶液。在一些實施例中，封閉系統不包括重組纖連蛋白。在一些實施例中，移除載體溶液係藉由重力或注射器引流進行，其有助於將固定載體保留在內表面上，同時移除雜質。淋巴球轉導可在具有固定載體之經塗覆的封閉系統中進行。在一些實施例中，用含有淋巴球之樣本進行轉導。在一些實施例中，樣本包括至少2.5 × 10 ⁷個淋巴球（例如，T細胞）。在一些實施例中，樣本包括至少3 × 10 ⁷、4 × 10 ⁷、5 × 10 ⁷、6 × 10 ⁷、7 × 10 ⁷、8 × 10 ⁷、9 × 10 ⁷、1 × 10 ⁸、1.2 × 10 ⁸、1.5 × 10 ⁸、1.8 × 10 ⁸、2 × 10 ⁸、2.2 × 10 ⁸、2.5 × 10 ⁸、2.6 × 10 ⁸、2.7 × 10 ⁸、2.8 × 10 ⁸、2.9 × 10 ⁸、3 × 10 ⁸、3.1 × 10 ⁸、3.2 × 10 ⁸、3.3 × 10 ⁸、3.4 × 10 ⁸、3.5 × 10 ⁸、3.6 × 10 ⁸、3.7 × 10 ⁸、3.8 × 10 ⁸、3.9 × 10 ⁸、4 × 10 ⁸、4.1 × 10 ⁸、4.2 × 10 ⁸、4.3 × 10 ⁸、4.4 × 10 ⁸、4.5 × 10 ⁸、4.6 × 10 ⁸、4.7 × 10 ⁸、4.8 × 10 ⁸、4.9 × 10 ⁸、5 × 10 ⁸、5.1 × 10 ⁸、5.2 × 10 ⁸、5.3 × 10 ⁸、5.4 × 10 ⁸、5.5 × 10 ⁸、5.6 × 10 ⁸、5.7 × 10 ⁸、5.8 × 10 ⁸、5.9 × 10 ⁸、6 × 10 ⁸、6.1 × 10 ⁸、6.2 × 10 ⁸、6.3 × 10 ⁸、6.4 × 10 ⁸、6.5 × 10 ⁸、6.6 × 10 ⁸、6.7 × 10 ⁸、6.8 × 10 ⁸、6.9 × 10 ⁸、7 × 10 ⁸、7.5 × 10 ⁸、8 × 10 ⁸、9 × 10 ⁸、或10 × 10 ⁸個淋巴球（例如，T細胞）。在一些實施例中，樣本包括不大於3 × 10 ⁸、3.1 × 10 ⁸、3.2 × 10 ⁸、3.3 × 10 ⁸、3.4 × 10 ⁸、3.5 × 10 ⁸、3.6 × 10 ⁸、3.7 × 10 ⁸、3.8 × 10 ⁸、3.9 × 10 ⁸、4 × 10 ⁸、4.1 × 10 ⁸、4.2 × 10 ⁸、4.3 × 10 ⁸、4.4 × 10 ⁸、4.5 × 10 ⁸、4.6 × 10 ⁸、4.7 × 10 ⁸、4.8 × 10 ⁸、4.9 × 10 ⁸、5 × 10 ⁸、5.1 × 10 ⁸、5.2 × 10 ⁸、5.3 × 10 ⁸、5.4 × 10 ⁸、5.5 × 10 ⁸、5.6 × 10 ⁸、5.7 × 10 ⁸、5.8 × 10 ⁸、5.9 × 10 ⁸、6 × 10 ⁸、6.1 × 10 ⁸、6.2 × 10 ⁸、6.3 × 10 ⁸、6.4 × 10 ⁸、6.5 × 10 ⁸、6.6 × 10 ⁸、6.7 × 10 ⁸、6.8 × 10 ⁸、6.9 × 10 ⁸、7 × 10 ⁸、7.5 × 10 ⁸、8 × 10 ⁸、9 × 10 ⁸、或10 × 10 ⁸個淋巴球（例如，T細胞）。

在一些實施例中，淋巴球轉導係在不含固定劑（例如，重組纖連蛋白）之封閉系統中進行。

用於本發明揭示之方法中之淋巴球通常係自供體對象獲得，該供體對象可係藉由本文所述之方法所產生之細胞群體治療的癌症患者，或可係捐獻淋巴球樣本之個體，該淋巴球樣本在藉由本文所述之方法產生之細胞群體產生後，將用於治療不同的個體或癌症患者（亦即，同種異體供體）。淋巴球可藉由所屬技術領域中使用之任何合適方法自供體對象獲得。例如，淋巴球可藉由任何合適的體外方法、靜脈穿刺或其他血液收集方法獲得，藉由該血液收集方法獲得血液及/或淋巴球之樣本。在一個實施例中，淋巴球係藉由血球分離術獲得。

可選地，在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在轉導之前富集自供體對象獲得之淋巴球群體的步驟。富集淋巴球可藉由任何合適的分離方法，包括但不限於使用分離培養基（例如，Ficoll-Paque™、RosetteSep™ HLA總淋巴球富集混合液、淋巴球分離培養基(LSA)（MP Biomedical目錄號0850494X）、基於非離子型碘克沙醇之培養基，諸如OptiPrep™、或其類似者）、藉由過濾或淘析之細胞大小、形狀或密度分離、免疫磁性分離（例如，磁活化細胞分選系統，MACS）、螢光分離（例如，螢光活化細胞分選系統，FACS）、或基於珠粒之管柱分離來完成。

可選地，在一些實施例中，經由使用選擇試劑通過CD4 ⁺/CD8 ⁺細胞之正向富集自樣本移除循環淋巴瘤細胞。在一些此類實施例中，在與選擇試劑一起培養之後，將經培養之細胞，包括其中結合有選擇試劑之細胞，轉移至用於基於免疫親和力之細胞分離系統中。在一些實施例中，用於基於免疫親和力之分離系統係或含有磁性分離柱。

在一些此類實施例中，單離方法包括基於一或多種特定分子（諸如表面標記，例如表面蛋白、胞內標記、或核酸）在細胞中之表現或存在來分離不同的細胞類型。在一些實施例中，可使用任何已知的基於此類標記之分離方法。在一些實施例中，分離係基於親和力或免疫親和力之分離。例如，在一些實施例中，單離包括基於細胞之表現、或一或多種標記（一般係細胞表面標記）之表現水準將細胞及細胞群分離，例如藉由與特異性結合至此類標記之抗體或結合夥伴培養，接著通常進行洗滌步驟及將已結合抗體或結合夥伴之細胞與未與抗體或結合夥伴結合之細胞分離。此類分離步驟可基於正向選擇，其中保留已結合試劑之細胞以供進一步使用；及/或負向選擇，其中保留未與抗體或結合夥伴結合之細胞。此類分離步驟可基於正向選擇，其中保留已結合試劑之細胞以供進一步使用；及/或負向選擇，其中保留未與抗體或結合夥伴結合之細胞。在一些實例中，保留兩個部分以供進一步使用。

在一些此類實施例中，在沒有特異性識別異質群中之細胞類型的抗體可用之情況下，負向選擇可係特別有用的，使得最好基於由除所欲群以外之細胞表現的標記進行分離。

分離不需要產生100%富集或移除表現特定標記之特定細胞群體或細胞。舉例而言，對於特定類型之細胞（諸如表現標記之彼等細胞）的正向選擇或富集係指增加此類細胞之數目或百分比，但不需要導致完全不存在不表現標記之細胞。同樣地，特定類型之細胞（諸如表現標記之彼等細胞）的負向選擇、移除或耗乏係指減少此類細胞之數目或百分比，但不需要導致完全移除所有此類細胞。

在一些實例中，進行多輪分離步驟，其中來自一個步驟之正向或負向選擇之部分經受另一分離步驟，諸如後續正向選擇或負向選擇。在一些實例中，單一分離步驟可諸如藉由將細胞與複數個抗體或結合夥伴（各自特異性針對靶向負向選擇之標記）一起培養來同時耗乏表現多個標記之細胞。同樣地，多種細胞類型可藉由將細胞與在各種細胞類型上表現之複數個抗體或結合夥伴一起培養來同時正向選擇。

舉例而言，在一些實施例中，藉由正向選擇或負向選擇技術單離T細胞之特定亞群，諸如陽性或表現一或多個表面標記，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及/或CD45RO+T細胞之細胞。舉例而言，CD3+、CD28+T細胞可使用抗CD3/抗CD28接合磁珠（例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）來正向選擇。在一些實施例中，針對具有初始表型之T細胞(CD45RA+ CCR7+)富集細胞群。

在一些實施例中，單離係藉由正選擇富集特定細胞群體，或藉由負向選擇耗乏特定細胞群體來進行。在一些實施例中，正向選擇或負向選擇係藉由將細胞與特異性結合至分別在正向選擇細胞或負向選擇細胞上表現或以相對更高水準（標記高）表現（標記+）之一或多個表面標記的一或多種抗體或其他結合劑一起培養來達成。

在特定實施例中，對生物樣本，例如PBMC或其他白血球樣本進行CD4+ T細胞選擇，其中保留負向選擇及正向選擇部分兩者。在某些實施例中，CD8+ T細胞係選自負向選擇部分。在一些實施例中，對生物樣本進行CD8+ T細胞選擇，其中保留負向選擇及正向選擇部分兩者。在某些實施例中，CD4+ T細胞係選自負向選擇部分。

在一些實施例中，藉由在非T細胞，諸如諸如B細胞、單核球、或其他白血球，諸如CD14上表現之標記的負向選擇自PBMC樣本分離T細胞。在一些實施例中，CD4+或CD8+選擇步驟用於分離CD4+輔助及CD8+細胞毒性T細胞。此類CD4+及CD8+群可藉由正向選擇或負向選擇進一步分類為用於在一或多個初始、記憶、及/或效應T細胞亞群上表現或表現至相對較高程度之標記的亞群。

在一個實例中，為了藉由負向選擇來富集CD4+細胞，單株抗體混合物一般包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、及CD8之抗體。在一些實施例中，抗體或結合夥伴結合至固體支撐物或基質，諸如磁珠或順磁珠，以允許分離用於正向選擇及/或負向選擇之細胞。例如，在一些實施例中，使用免疫磁性（或親和力磁性）分離技術將細胞及細胞群分離或單離。在一些實施例中，將待分離之細胞之樣本或組成物與小型、可磁化、或磁性反應材料，諸如磁性反應粒子或微粒子，諸如順磁珠（例如，諸如Dynabeads™或MACS珠粒）一起培養。磁性反應材料，例如粒子通常直接或間接附接至結合夥伴，例如抗體，該結合夥伴特異性結合至分子，例如，存在於細胞、多個細胞、或細胞群體上之表面標記，例如意欲分離，例如意欲進行負向選擇或正向選擇。

在一些實施例中，磁性粒子或珠粒包含結合至特定結合部件，諸如抗體或其他結合夥伴之磁性反應材料。在磁性分離方法中使用了許多眾所周知的磁性反應材料。培養通常係在其中抗體或結合夥伴，或分子（諸如二級抗體或其他試劑）之條件下進行，該等分子特異性結合至與磁性粒子或珠粒附接之此類抗體或結合夥伴，特異性結合至細胞表面分子（若存在於樣本內的細胞上）。在一些實施例中，將樣本置於磁場中，且具有與其附接的磁性反應或可磁化粒子之彼等細胞將吸引至磁體且與未經標記之細胞分離。對於正向選擇，保留吸引至磁體之細胞；對於負向選擇，保留未吸引之細胞（未經標記之細胞）。在一些實施例中，正向選擇及負向選擇之組合係在相同選擇步驟期間執行，其中保留正向選擇及負向選擇部分且進一步處理或經受進一步分離步驟。在一些實施例中，磁性反應粒子被初級抗體或其他結合夥伴、二級抗體、凝集素、酶、或鏈親和素塗覆。在某些實施例中，磁性粒子經由特異性針對一或多個標記之初級抗體的塗覆來附接至細胞。在某些實施例中，添加細胞而非用初級抗體或結合夥伴標記之珠粒，且接著添加經細胞類型特異性二級抗體或其他結合夥伴（例如鏈親和素）塗覆之磁性粒子。在某些實施例中，將經鏈親和素塗覆之磁性粒子與生物素化初級或二級抗體結合使用。在一些實施例中，使磁性反應粒子附接至隨後培養(incubated)、培養(cultured)、及/或工程改造之細胞；在一些實施例中，使該等粒子附接至用於向患者投予之細胞。在一些實施例中，可磁化或磁性反應粒子自細胞移除。用於自細胞移除磁化顆粒之方法為已知的且包括例如使用競爭非標記抗體及接合至可裂解連接子之可磁化粒子或抗體。在一些實施例中，可磁化粒子係可生物降解的。

在一些實施例中，基於親和力選擇係經由磁性活化細胞分選(MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)。磁性活化細胞分選(MACS)系統能夠具有附接至其之磁化粒子之細胞的高純度選擇。在某些實施例中，MACS以其中在施用外部磁場之後依序洗提非靶標及靶標物種之模式操作。亦即，附接至磁化粒子之細胞在不附接物種經洗提時保持原位。接著，在完成此第一洗提步驟之後，以某種方式釋放在磁場中捕獲且被阻止洗提之物種，使得該等物種可被洗提且回收。在某些實施例中，非靶細胞係經標記且自非均質細胞群體耗乏。

在一些實施例中，使用進行方法之單離、細胞製備、分離、處理、培養(incubation)、培養(culture)、及/或調配步驟中之一或多者之系統、裝置、或設備來進行分離或單離。在一些實施例中，系統用於在封閉或無菌環境中進行此等步驟中之每一者，例如以最大限度地減少誤差、用戶處理、及/或污染。在一個實例中，系統係如國際專利申請公開案第W02009/072003號或第US 20110003380 Al號中所描述之系統，該等國際專利申請公開案各自以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，系統或設備以整合或自含式系統及/或以自動化或可程式化方式進行例如單離、處理、工程改造、及調配步驟中之一或多者。在一些實施例中，系統或設備包括與該系統或設備通訊之電腦及/或電腦程式，該電腦及/或電腦程式允許使用者程式化、控制、評定處理、單離、工程改造及調配步驟之結果、及/或調整處理、單離、工程改造及調配步驟之各種實施例。在一些實施例中，使用CliniMACS系統(Miltenyi Biotec)進行分離及/或其他步驟，例如用於在封閉及無菌系統中以臨床規模水準自動分離細胞。組分可包括整合微電腦、磁性分離單元、蠕動泵及各種夾緊閥。在一些實施例中，整合電腦控制儀器之組件，且將系統引導在標準化序列中執行重複程序。在一些實施例中，磁性分離單元包括可移動永久磁鐵及用於選擇管柱之固持器。該蠕動泵控制整個管道組中之流動速率且與該等夾緊閥一起，確保緩衝液受控流動通過系統及細胞之持續懸浮液。

在一些實施例中，CliniMACS系統使用在無菌、非致熱溶液中供應之抗體-偶聯可磁化粒子。在一些實施例中，在具有磁性粒子之細胞標記之後，將細胞洗滌以移除過量粒子。接著將細胞製備袋連接至管道組，繼而連接至含有緩衝液之袋子及細胞收集袋。管道組由預組裝無菌管道，包括前置管柱及分離管柱組成，且僅用於單次使用。在分離程式起始後，系統自動將細胞樣本施加至分離管柱上。將經標記之細胞保留在管柱內，而未經標記之細胞藉由一系列洗滌步驟移除。在一些實施例中，用於與本文所述之方法使用之細胞群體未經標記且未保留在管柱中。在一些實施例中，用於與本文所述之方法使用之細胞群體經標記且保留在管柱中。在一些實施例中，用於與本文所述之方法使用之細胞群體在移除磁場後自管柱洗提，且在細胞收集袋內收集。

在某些實施例中，使用CliniMACS Prodisy系統(Miltenyi Biotec)進行分離及/或其他步驟。在一些實施例中，CliniMACS Prodigy系統配備有細胞處理單元，其允許藉由離心對細胞進行自動化洗滌及分離(fractionation)。CliniMACS Prodisy系統亦可包括機載攝影機及影像識別軟體，其藉由辨別源細胞產品之肉眼可見層來判定最佳細胞分離終點。例如，周邊血液自動分離成紅血球、白血球細胞、及血漿層。CliniMACS Prodisy系統亦可包括整合細胞培養室，其實現細胞培養方案，諸如細胞分化及擴增、抗原裝載、及長期細胞培養。輸入埠可允許無菌移除以及補充培養基，且可使用整合顯微鏡監測細胞。

在一些實施例中，本文所述之細胞群體經由流式細胞術收集且富集（或耗乏），其中針對多種細胞表面標記染色之細胞在流體流中攜帶。在一些實施例中，本文所述之細胞群體經由製備型規模(FACS)-分選收集且富集（或耗乏）。在某些實施例中，本文所述之細胞群體藉由使用微電機系統(MEMS)晶片與基於FACS之偵測系統之組合來收集且富集（或耗乏）（參見例如WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573；及Godin et al. (2008) J Biophoton. l(5):355-376）。在兩種情況下，細胞可用多種標記來標記，允許以高純度單離良好界定之T細胞子集。

在一些實施例中，抗體或結合夥伴經一或多個可偵測標記來標記，以促進正向選擇及/或負向選擇之分離。舉例而言，分離可基於與螢光標記之抗體之結合。在一些實例中，基於針對一或多種細胞表面標記具有特異性之抗體或其他結合夥伴之結合的細胞分離在流體流中進行，諸如藉由螢光活化細胞分選(FACS)，包括製備型規模(FACS)及/或微電機系統(MEMS)晶片，例如與流式細胞術偵測系統組合。此類方法允許同時基於多種標記進行正向選擇及負向選擇。

在一些實施例中，至少0.5 × 10 ⁹個淋巴球係自供體取得，且可選地富集及/或經受刺激。在一些實施例中，至少0.6 × 10 ⁹、0.7 × 10 ⁹、0.8 × 10 ⁹、0.9 × 10 ⁹、1 × 10 ⁹、1.1 × 10 ⁹、1.2 × 10 ⁹、1.3 × 10 ⁹、1.4 × 10 ⁹、1.5 × 10 ⁹、1.6 × 10 ⁹、1.7 × 10 ⁹、1.8 × 10 ⁹、1.9 × 10 ⁹、2 × 10 ⁹、2.5 × 10 ⁹、或3 × 10 ⁹個淋巴球係自供體取得，且可選地富集及/或經受刺激。在一些實施例中，不大於1 × 10 ⁹、1.1 × 10 ⁹、1.2 × 10 ⁹、1.3 × 10 ⁹、1.4 × 10 ⁹、1.5 × 10 ⁹、1.6 × 10 ⁹、1.7 × 10 ⁹、1.8 × 10 ⁹、1.9 × 10 ⁹、2 × 10 ⁹、2.5 × 10 ⁹、或3 × 10 ⁹個淋巴球係自供體取得，且可選地富集及/或經受刺激。

亦可選地，本文所述之方法進一步包括用一或多種淋巴球刺激劑刺激淋巴球之步驟。在一些實施例中，刺激係在轉導步驟之前進行。在一些實施例中，刺激係在轉導步驟之後進行。刺激步驟在本文中亦稱為活化步驟。

一或多種合適淋巴球刺激劑之任何組合可用於刺激（活化）淋巴球。非限制性實例包括抗體或其功能片段，其靶向T細胞刺激或共刺激分子（例如，抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD28抗體、或其功能片段）、T細胞細胞介素（例如，任何單離、野生型或重組細胞介素，諸如：介白素1(IL-1)、介白素2(IL-2)、介白素4(IL-4)、介白素5(IL-5)、介白素7(IL-7)、介白素15(IL-15)、腫瘤壞死因子α (TNFα)），或任何其他合適的有絲分裂原（例如十四烷醯佛波醋酸酯(tetradecanoyl phorbol acetate, TPA)、植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)、刀豆球蛋白A(concanavalin A, conA)、脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)、美洲商陸有絲分裂原(pokeweed mitogen, PWM)）或T細胞刺激或共刺激分子之天然配體。在一些實施例中，刺激劑係抗CD3抗體及/或抗CD28抗體。

在一些實施例中，淋巴球刺激劑可係基於珠粒之活化劑，諸如T細胞TransAct™ (Miltenyi Biotec)、Dynabeads® (Thermo Fisher Scientific)、或Cloudz™ T細胞活化套組(R&D Systems)。

在一些實施例中，如本文所述之刺激淋巴球之步驟可能需要在預定溫度下用一或多種刺激劑刺激淋巴球預定時間量，及/或在預定水準之CO ₂存在下刺激。在某些實施例中，用於刺激之預定溫度可係約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、或約39℃。在某些實施例中，用於刺激之預定溫度可係約34℃至39℃。在某些實施例中，刺激淋巴球之步驟包含用一或多種刺激劑刺激淋巴球預定時間。在某些實施例中，用於刺激之預定時間可係約24小時至72小時。在某些實施例中，用於刺激之預定時間可係約24小時至36小時。在某些實施例中，刺激淋巴球之步驟可包含在預定水準之CO ₂存在下用一或多種刺激劑刺激淋巴球。在某些實施例中，用於刺激之預定水準之CO ₂可係約1.0至10% CO ₂。在某些實施例中，用於刺激之預定水準之CO ₂可係約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6.0%、約7.0%、約8.0%、約9.0%、或約10.0% CO ₂。

在一些實施例中，可根據刺激淋巴球群體之步驟使用抗CD3抗體（或其功能片段）、抗CD28抗體（或其功能片段）、或抗CD3及抗CD28抗體之組合。可使用任何可溶性或經固定之抗CD3及/或抗CD28抗體或其功能片段（例如殖株OKT3（抗CD3）、殖株145-2C11（抗CD3）、殖株UCHT1（抗CD3）、殖株L293（抗CD28）、殖株15E8（抗CD28））。在一些態樣中，抗體可商購自所屬技術領域中已知的供應商，包括但不限於Miltenyi Biotec、BD Biosciences（例如MACS GMP CD3純1 mg/mL，件號170-076-116）、及eBioscience, Inc。此外，所屬技術領域中具有通常知識者將理解如何藉由標準方法產生抗CD3及/或抗CD28抗體。本文所述之方法中所使用之任何抗體應在良好作業規範(GMP)下產生，以符合生物產品之相關機構指南。

在某些實施例中，T細胞刺激劑可包括濃度為約20 ng/mL至100 ng/mL的抗CD3或抗CD28抗體。在某些實施例中，抗CD3或抗CD28抗體之濃度可係約20 ng/mL、約30 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、或約100 ng/mL。

在一些實施例中，本揭露之3天過程可包含下列步驟：血球分離術材料收集、第0天進行之第一洗滌步驟、第0天進行之第二洗滌步驟、第0天進行之富集步驟、第0天進行之第三洗滌步驟、第0天直至第1天進行之活化步驟、第1天直至第4天進行之病毒轉導步驟、及第3天直至第4天（收集日）進行之第四洗滌及濃縮步驟。血球分離術材料可係新鮮血球分離術材料、冷凍保存之血球分離術材料、或冷凍保存之T細胞。

在一些實施例中，3天過程可包含第0天、第1天、或第2天之活化步驟。在一些實施例中，3天過程可包含第1天、第2天、或第3天之病毒載體轉導步驟。

在一些實施例中，3天過程可選地包含一、二、三、四、五、六、七、八、或更多個洗滌步驟。各洗滌步驟可包含相同洗滌程序或不同洗滌程序。在一些實施例中，一或多個洗滌步驟可在富集步驟之前發生。在一些實施例中，第一洗滌可在富集步驟之後發生。在一些實施例中，第一洗滌可在富集步驟之後及活化步驟之前發生。在一些實施例中，第一洗滌可在富集及活化步驟兩者之後發生。在一些實施例中，洗滌步驟可在收集當天進行。製備經工程改造之淋巴球

如隨附實驗實例中所示，製備的淋巴球包括較高比率的幼年細胞（例如初始T細胞）。因此，本揭露之一個實施例提供藉由本方法製備之淋巴球群體，其包括CD4+及CD8+ T細胞。

在一些實施例中，至少20%之CD4+ T細胞係初始T細胞。在一些實施例中，至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、或60%之CD4+ T細胞係初始T細胞。

在一些實施例中，不大於25%之CD4+ T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，不大於20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、或5%之CD4+ T細胞係效應記憶T細胞。

在一些實施例中，不大於44%之CD4+ T細胞係中央記憶T細胞。在一些實施例中，不大於43%、42%、41%、或40%之CD4+ T細胞係中央記憶T細胞。

在一些實施例中，不大於1.5%之CD4+ T細胞係效應T細胞。在一些實施例中，不大於1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、或0.5%之CD4+ T細胞係效應T細胞。

在一些實施例中，至少80%之收集的CD4+ T細胞係CCR7+細胞。在一些實施例中，至多20%之收集的CD4+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。

在一些實施例中，至少5%之CD8+ T細胞係初始T細胞。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、或35%之CD8+ T細胞係初始T細胞。

在一些實施例中，不大於30%之CD8+ T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，不大於28%、27%、25%、22%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、或10%之CD8+ T細胞係效應記憶T細胞。

在一些實施例中，不大於60%之CD8+ T細胞係中央記憶T細胞。在一些實施例中，不大於58%、56%、55%、54%、52%、或50%之CD8+ T細胞係中央記憶T細胞。

在一些實施例中，至少60%之收集的CD8+ T細胞係CCR7+細胞。在一些實施例中，至多40%之收集的CD8+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。

各類型之T細胞均可用如所屬技術領域中熟知的細胞表面標記表徵。例如，初始T細胞可表徵為CCR7+、CD45RO-、及CD95-。初始T細胞之額外標記包括CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD127+、CD132+、CD25-、CD44-、及HLA-DR-。

記憶T幹細胞(Tscm)之表面標記包括但不限於CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+（L-選擇素）、CD27+、CD28+、IL-7Ra+、CD95+、IL-2RP+、CXCR3+、及LFA-。

效應記憶T細胞(Tem)之表面標記包括但不限於CCR7-、CD45RO+、及CD95+。效應記憶T細胞之額外標記係IL-2Rβ+。對於中央記憶T細胞(Tcm)，合適的標記包括CD45RO+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7+、及CD62L+。對於效應T細胞(Teff)，合適的標記包括但不限於CD45RA+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7-、及CD62L-。

如全文中所提及之用語「幼年細胞(juvenile cell)」包括初始T細胞、幹記憶T細胞(Tscm)、及中央記憶T細胞(Tcm)中之一或多者。此等細胞之特徵部分在於表現CCR7+。

收集的淋巴球較佳地包括具有良好比例的CD3+ T細胞。在一些實施例中，至少25%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%之收集的淋巴球係CD3+ T細胞。

收集的淋巴球較佳地包括已轉導的良好比例。在一些實施例中，至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14% 15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、42%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、或50%之收集的淋巴球經載體轉導。在一些實施例中，各經轉導淋巴球包括整合至宿主基因體之載體（或包括編碼序列）之至少一個複本。在一些實施例中，各經轉導淋巴球包括整合至宿主基因體之至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10個複本。

在一些實施例中，載體包括編碼多肽之轉殖基因。多肽（不限於）可係CAR或TCR。在一些實施例中，CAR或TCR包括抗原結合分子。在一些實施例中，抗原結合分子具有針對抗原部分之結合特異性。在一些實施例中，抗原部分係腫瘤抗原（例如，由癌細胞產生之蛋白質或其他分子）。

在一些實施例中，載體包括多於一種轉殖基因，其編碼包括對不同抗原部分具有特異性之抗原結合分子的多於一種CAR或TCR分子。在一些實施例中，載體包括多於一種轉殖基因，其編碼包括對兩種不同的腫瘤抗原具有特異性之抗原結合分子的多於一種CAR或TCR分子。

在一些態樣中，抗原部分係與癌症或癌細胞相關之抗原。此類抗原可包括但不限於707-AP（707丙胺酸脯胺酸）、AFP（α (a)–胎兒蛋白）、ART-4（由T4細胞識別之腺癌抗原）、BAGE（B抗原；b-鏈蛋白/m、b-鏈蛋白/突變）、BCMA（B細胞成熟抗原）、Bcr-abl（斷點簇集區-Abelson）、CAIX（碳酸酐酶IX）、CD19（分化簇19）、CD20（分化簇20）、CD22（分化簇22）、CD30（分化簇30）、CD33（分化簇33）、CD44v7/8（分化簇44、外顯子7/8）、CAMEL（黑色素瘤上之CTL識別抗原）、CAP-1（癌胚抗原肽-1）、CASP-8（凋亡蛋白酶-8）、CDC27m（突變的細胞分裂週期27）、CDK4/m（突變的週期蛋白依賴性激酶4）、CEA（癌胚抗原）、CT（癌症/睾丸（抗原））、Cyp-B（親環蛋白B）、DAM（分化抗原黑色素瘤）、EGFR（上皮生長因子受體）、EGFRvIII（上皮生長因子受體，變體III）、EGP-2（上皮醣蛋白2）、EGP-40（上皮醣蛋白40）、Erbb2、3、4（紅血球白血病病毒致癌基因同源物-2、-3、4）、ELF2M（突變的延長因子2）、ETV6-AML1（Ets變體基因6/急性骨髓性白血病1基因ETS）、FBP（葉酸結合蛋白）、fAchR（胎兒乙醯膽鹼受體）、G250（醣蛋白250）、GAGE（G抗原）、GD2（雙唾液酸神經節苷脂2）、GD3（雙唾液酸神經節苷脂3）、GnT-V（N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V）、Gp100（醣蛋白100kD）、HAGE（螺旋酶抗原）、HER-2/neu（人類表皮因子-2/神經性；亦稱為EGFR2）、HLA-A（人類白血球抗原-A）、HPV（人類乳突狀瘤病毒）、HSP70-2M（突變的熱休克蛋白70-2）、HST-2（人類戒環腫瘤-2）、hTERT或hTRT（人類端粒酶反轉錄酶）、iCE（腸羧酸酯酶）、IL-13R-a2（介白素-13受體亞單位α-2）、KIAA0205、KDR（激酶插入域受體）、κ-輕鏈、LAGE（L抗原）、LDLR/FUT（低密度脂受體/GDP-L-岩藻醣：b-D-半乳糖苷酶2-a-L岩藻醣轉移酶）、LeY（Lewis-Y抗體）、L1CAM（L1細胞黏附分子）、MAGE（黑色素瘤抗原）、MAGE-A1（黑色素瘤相關抗原1）、間皮素、鼠類CMV感染細胞、MART-1/Melan-A（由T細胞識別之黑色素瘤抗原-1/黑色素瘤抗原A）、MC1R（黑皮質素1受體）、肌凝蛋白/m（突變的肌凝蛋白）、MUC1（黏蛋白1）、MUM-1、-2、-3（黑色素瘤擴散突變1、2、3）、NA88-A（患者的NA cDNA殖株M88）、NKG2D（自然殺手組2成員D）配體、NY-BR-1（紐約乳腺分化抗原1）、NY-ESO-1（紐約食管鱗狀細胞癌-1）、致癌胎兒抗原(h5T4)、P15（蛋白15）、p190次要bcr-abl（190KD bcr-abl蛋白）、Pml/RARa（前骨髓細胞白血病/網膜酸受體a）、PRAME（黑色素瘤優先表現抗原）、PSA（前列腺特異性抗原）、PSCA（前列腺幹細胞抗原）、PSMA（前列腺特異性膜抗原）、RAGE（腎抗原）、RU1或RU2（腎擴散1或2）、SAGE（肉瘤抗原）、SART-1或SART-3（鱗狀抗原排斥腫瘤1或3）、SSX1、-2、-3、4（滑膜肉瘤X1、-2、-3、-4）、TAA（腫瘤相關抗原）、TAG-72（腫瘤相關醣蛋白72）、TEL/AML1（易位Ets家族白血病/急性骨髓性白血病1）、TPI/m（磷酸丙糖異構酶突變）、TRP-1（酪胺酸酶相關蛋白1或gp75）、TRP-2（酪胺酸酶相關蛋白2）、TRP-2/INT2（TRP-2/內含子2）、VEGF-R2（血管內皮生長因子受體2）、或WT1（Wilms氏腫瘤基因）、或其組合。

腫瘤抗原之額外實例包括2B4 (CD244)、4-1BB、5T4、A33抗原、腺癌抗原、腎上腺素受體β3 (ADRB3)、A激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)、α胎兒蛋白(AFP)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、雄性激素受體、B7H3 (CD276)、β2整合素、BAFF、B淋巴瘤細胞、B細胞成熟抗原(BCMA)、bcr-abl（由斷點簇集區(BCR)及Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1 (Abl)所組成之致癌基因融合蛋白）、BhCG、骨髓基質細胞抗原2 (BST2)、CCCTC結合因子（鋅指蛋白質）樣（BORIS或印記位點調節物兄弟）、BST2、C242抗原、9-0-乙醯基-CA19-9標記、CA-125、CAEX、鈣網蛋白、碳酸酐酶9 (CAIX)、C-MET、CCR4、CCR5、CCR8、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD7、CD10、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23（IgE受體）、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30 (TNFRSF8)、CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD51、CD52、CD56、CD63、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD96、CD97、CD100、CD123、CD125、CD133、CD137、CD138、CD150、CD152 (CTLA-4)、CD160、CD171、CD179a、CD200、CD221、CD229、CD244、CD272 (BTLA)、CD274 (PDL-1、B7H1)、CD279 (PD-1)、CD352、CD358、CD300分子樣家族成員f (CD300LF)、癌胚抗原(CEA)、密連蛋白6 (CLDN6)、C型凝集素樣分子-1（CLL-1或CLECL1）、C型凝集素域家族12成員A (CLEC12A)、巨細胞病毒(CMV)感染之細胞抗原、CNT0888、CRTAM (CD355)、CS-1（亦稱為CD2子集1、CRACC、CD319、及19A24）、CTLA-4、週期蛋白B l、染色體X開讀框61 (CXORF61)、細胞色素P450 1B 1 (CYP1B1)、DNAM-1 (CD226)、橋粒芯蛋白4、DR3、DR5、E-鈣黏素新表位、上皮生長因子受體(EGFR)、EGF1R、上皮生長因子受體變體III (EGFRvIII)、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)、突變型延伸因子2 (ELF2M)、內皮唾液酸蛋白、上皮細胞黏附分子(EPCAM)、A型蝶素受體2 (EphA2)、蝶素B2、受體酪胺酸蛋白質激酶erb-B2,3,4 (erb-B2,3,4)、ERBB、ERBB2 (Her2/neu)、ERG（跨膜絲胺酸蛋白酶2 (TMPRSS2) ETS融合基因）、ETA、位於染色體12p上之ETS易位變體基因6 (ETV6-AML)、IgA受體之Fc片段（FCAR或CD89）、纖維母細胞活化蛋白α (FAP)、FBP、Fc受體樣5 (FCRL5)、胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)、纖連蛋白外域B、Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)、葉酸結合蛋白(FBP)、葉酸受體1、葉酸受體α、葉酸受體β、Fos相關抗原1、岩藻醣基、岩藻醣基GM1；GM2、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)、GITR (TNFRSF 18)、GM1、神經節苷脂GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、GP 100、globoH糖神經醯胺(GloboH)之六醣部分、醣蛋白75、磷脂肌醇聚醣-3 (GPC3)、醣蛋白100 (gplOO)、GPNMB、G蛋白偶聯受體20 (GPR20)、G蛋白偶聯受體C型家族5成員D (protein-coupled receptor class C group 5, member D, GRC5D)、A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)、人類上皮生長因子受體2 (HER-2)、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMWMAA)、人類乳突狀瘤病毒E6 (HPV E6)、人類乳突狀瘤病毒E7 (HPV E7)、突變之熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)、人類分散因子受體激酶(、人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)、HVEM、ICOS、胰島素樣生長因子受體1（IGF-1受體）、IGF-I、IgGl、免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)、IL-6、介白素11受體α (IL-11Ra)、IL-13、介白素-13受體次單元α-2（IL-13Ra2或CD213A2）、胰島素樣生長因子I受體(IGF1-R)、整合素α5β1、整合素ανβ3、腸羧基酯酶、κ-輕鏈、KCS1、激酶插入域受體(KDR)、KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、KIR-L、KG2D配體、KIT (CD117)、KLRGI、LAGE-la、LAG3、淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)、白血球免疫球蛋白樣受體子家族A成員2 (LILRA2)、豆莢蛋白(legumain)、白血球相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)、路易士(Y)抗原、LeY、LG、LI細胞黏附分子(LI-CAM)、LIGHT、LMP2、淋巴球抗原6複合物、LTBR、基因座(locus) K 9 (LY6K)、Ly-6、淋巴球抗原75 (LY75)、黑色素瘤癌睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2 (MAD-CT-1)、MAGE、黑色素瘤相關抗原1 (MAGE-A1)、T細胞辨識之MAGE-A3黑色素瘤抗原1（MelanA或MARTI）、MelanA/MARTl、間皮素、MAGE A3、黑色素瘤凋亡抑制劑ML-IAP)、黑色素瘤特異性硫化軟骨蛋白多醣(MCSCP)、MORAb-009、MS4A1、黏蛋白1 (MUCl)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC16、黏蛋白CanAg、II型密拉氏管抑制物質(MIS)受體、v-myc禽骨髓瘤細胞病毒致癌基因神經母細胞瘤衍生性同源物(MYCN)、N-羥乙醯神經胺酸、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶V (Na17)、神經細胞黏附分子(NCAM)、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E配體、NKR-P IA、NPC-1C、NTB-A、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、NY-ESO-1、致癌胎兒抗原(h5T4)、嗅覺受體51E2 (OR51E2)、OX40、漿細胞抗原、poly SA、前頂體素結合蛋白sp32 (OY-TES l)、p53、p53突變體、泛連接蛋白3 (PANX3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)、成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)、前列腺癌腫瘤抗原1（PCTA-1或半乳糖凝集素8）、PD-1H、血小板衍生生長因子受體α (PDGFR-α)、PDGFR-β、PDL192、PEN-5、磷脂絲胺酸、胎盤特異性蛋白1 (PLAC1)、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌細胞、前列腺蛋白(prostein)、蛋白酶絲胺酸21（睪素或PRSS21）、蛋白酶3 (PR1)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、蛋白酶體（前體、巨蛋白因子）次單元β型、晚期糖化終產物受體(RAGE-1)、RANKL、Ras突變體、Ras同源物家族成員C (RhoC)、RON、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、腎遍在蛋白1 (renal ubiquitous 1, RU1)、腎遍在蛋白2 (RU2)、肉瘤易位斷點、由T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)、SAS、SDC1、SLAMF7、唾液酸基路易士黏附分子(sLe)、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、音蝟因子(SHH)、精子蛋白17 (SPA17)、階段特異性胚胎抗原4 (SSEA-4)、STEAP、sTn抗原、滑膜肉瘤X斷點2 (SSX2)、存活素、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、TCR5y、TCRa、TCRB、TCRγ交替讀框蛋白(TARP)、端粒酶、TIGIT TNF-α前驅物、腫瘤內皮標記1 (TEM1/CD248)、腫瘤內皮標記7相關蛋白(TEM7R)、肌腱蛋白C、TGF-β2、TGF-β、轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)、促血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)、TIM1、TIM2、TIM3、Tn Ag、TRAIL-R1、TRAIL-R2、酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)、促甲狀腺激素受體(TSHR)、腫瘤抗原CTAA16.88、酪胺酸酶、ROR1、TAG- 72、尿溶蛋白2 (UPK2)、VEGF-A、VEGFR-1、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、及波形蛋白、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)蛋白(WT1)、或X抗原家族成員1A (XAGE1)。

在其他實施例中，抗原部分與病毒感染之細胞（亦即，病毒抗原部分）相關。此類抗原部分可包括但不限於艾司坦-巴爾病毒(EBV)抗原（例如，EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3、LMP-1、LMP-2）、A型肝炎病毒抗原（例如，VP1、VP2、VP3）、B型肝炎病毒抗原（例如，HBsAg、HBcAg、HBeAg）、C型肝炎病毒抗原（例如，包膜醣蛋白E1及E2）、單純疱疹病毒1型、2型或8型（HSV1、HSV2、或HSV8）病毒抗原（例如，醣蛋白gB、gC、gC、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、UL20、UL32、US43、UL45、UL49A）、巨細胞病毒(CMV)病毒抗原（例如，醣蛋白gB、gC、gC、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、或其他包膜蛋白）、人類免疫缺陷病毒(HIV)病毒抗原（醣蛋白gp120、gp41、或p24）、流感病毒抗原（例如，血球凝集素(HA)或神經胺酸脢(NA)）、麻疹或流行性腮腺炎病毒抗原、人類乳突狀瘤病毒(HPV)病毒抗原(例如L1, L2)、副流感病毒病毒抗原、德國麻疹病毒病毒抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)病毒抗原、或水痘帶狀疱疹病毒病毒抗原。在此類實施例中，細胞表面受體可係識別靶標病毒感染細胞上任何前述病毒抗原之任何TCR或任何CAR。

在其他實施例中，抗原部分與具有免疫或炎性功能障礙之細胞相關。此類抗原部分可包括但不限於髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、髓磷脂蛋白脂質蛋白(PLP)、髓磷脂寡樹突細胞醣蛋白(MOG)、癌胚抗原(CEA)、前胰島素、麩醯胺去羧酶(GAD65, GAD67)、熱休克蛋白(HSP)、或涉及或與致病性自體免疫過程相關的任何其他組織特異性抗原。

在一些實施例中，TCR對癌細胞上之抗原部分具有特異性。TCR之非限制性實例包括抗707-AP TCR、抗AFP TCR、抗ART-4 TCR、抗BAGE TCR、抗Bcr-abl TCR、抗CAMEL TCR、抗CAP-1 TCR、抗CASP-8 TCR、抗CDC27 m TCR、抗CDK4/m TCR、抗CEA TCR、抗CT TCR、抗Cyp-B TCR、抗DAM TCR、抗TCR、抗EGFRvIII TCR、抗ELF2M TCR、抗ETV6-AML1 TCR、抗G250 TCR, GAGE TCR、抗GnT-V TCR、抗Gp100 TCR、抗HAGE TCR、抗HER-2/neu TCR、抗HLA-A TCR、抗HPV TCR、抗HSP70-2M TCR、抗HST-2 TCR、抗hTERT TCR或抗hTRT TCR、抗iCE TCR、抗KIAA0205、抗LAGE（L抗原）、抗LDLR/FUT TCR、抗MAGE TCR、抗MART-1/Melan-A TCR、抗MC1R TCR、抗肌凝蛋白/m TCR、抗MUC1 TCR、抗MUM-1、-2、-3 TCR、抗NA88-A TCR、抗NY-ESO-1 TCR、抗P15 TCR、抗p190次要bcr-abl TCR、抗Pml/RARa TCR、抗PRAME TCR、抗PSA TCR、抗PSMA TCR、抗RAGE TCR、抗RU1 TCR或抗RU2 TCR、抗SAGE TCR、抗SART-1 TCR或抗SART-3 TCR、抗SSX1、-2、-3、4 TCR、抗TEL/AML1 TCR、抗TPI/m TCR、抗TRP-1 TCR、抗TRP-2 TCR、抗TRP-2/INT2 TCR、或抗WT1 TCR。

本揭露的CAR除了抗原結合分子外，亦可包括鉸鏈、跨膜域，及/或胞內域。在一些實施例中，胞內域可包括共刺激域及活化域。

鉸鏈可係定位於結合模體與跨膜域之間的抗原結合系統之胞外域。鉸鏈亦可稱為胞外域或「間隔子」。鉸鏈可有助於受體表現、活性、及/或穩定性。鉸鏈亦可提供接近目標抗原之靈活性。在一些實施例中，鉸鏈域係定位於結合模體與跨膜域之間。

在一些實施例中，鉸鏈係、來自、或衍生自（例如包含所有或片段的）免疫球蛋白樣鉸鏈域。在一些實施例中，鉸鏈域來自免疫球蛋白或衍生自免疫球蛋白。在一些實施例中，鉸鏈域係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、或IgM、或其片段之鉸鏈。

在一些實施例中，鉸鏈係、來自、或衍生自（例如包含所有或片段的）CD2、CD3 δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A（B細胞抗原受體複合物相關α鏈）、CD79B（B細胞抗原受體複合物相關β鏈）、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、或鐸配體受體、或其片段或組合。

在一些實施例中，鉸鏈係、來自、或衍生自（例如包含所有或片段的）CD8α之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鍊係、來自、或衍生自CD28之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈係、來自、或衍生自CD8α之鉸鏈的片段或CD28之鉸鏈的片段，其中該片段不是整個鉸鏈。在一些實施例中，CD8α鉸鏈之片段或CD28鉸鏈之片段包含排除CD8α鉸鏈或CD28鉸鏈之N端、或C端、或兩者之至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或至少20個胺基酸的胺基酸序列。

「跨膜域(transmembrane domain)」係指當在細胞表面或細胞膜存在於分子中時，具有存在於膜中之屬性的域（例如跨越一部分或所有細胞膜）。不需要跨膜域中之每一胺基酸存在於膜中。舉例而言，在一些實施例中，跨膜域特徵在於蛋白質之指定段或部分實質上位於膜中。可使用多種演算法分析胺基酸或核酸序列以預測蛋白質子細胞定位（例如跨膜定位）。程式psort (PSORT.org)及Prosite (prosite.expasy.org)係此類程式之例示性。

跨膜域可衍生自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白，諸如T細胞受體之α、β、或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD3 δ、CD3γ、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD8α、CD8β、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、TNFSFR25、CD154、4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD276 (B7-H3)、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96 (Tactile)、CD5、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83結合之配體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1；CD1-1a/CD18)、MHC第1型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6 (NTB-A; Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。

胞內域（或細胞質域）包含一或多個信號傳導域，其在目標抗原與結合模體結合後造成且/或介導胞內信號，該胞內信號例如活化一或多種免疫細胞效應功能（例如天然免疫細胞效應功能）。在一些實施例中，胞內域之信號傳導域介導免疫細胞之正常效應功能中之至少一者活化。T細胞之效應功能例如可係細胞溶解活性或輔助活性，其包含細胞介素之分泌。在一些實施例中，胞內域之信號傳導域介導T細胞活化、增生、存活、及/或其他T細胞功能。胞內域可包含為活化域的信號傳導域。胞內域可包含為共刺激信號傳導域的信號傳導域。

胞內信號傳導域在抗原與免疫細胞結合時可轉導信號係眾所周知。例如，已知T細胞受體(TCR)之細胞質序列在TCR結合至抗原之後起始信號轉導（參見例如Brownlie et al., Nature Rev. Immunol. 13:257-269 (2013)）。

在某些實施例中，合適的信號傳導域包括但不限於4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD5、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83結合之配體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、Ly108)、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1; CD1-1a/CD18)、MHC第1型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6 (NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。

CAR亦可包括共刺激信號傳導域，例如以增加信號傳導效力。參見美國專利第7,741,465、及6,319,494號，以及Krause et al. and Finney et al. (supra), Song et al., Blood 119:696-706 (2012)；Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011), and Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)。透過單獨TCR產生的信號可能不足以完全活化T細胞，且二級或共刺激信號可增加活化。因此，在一些實施例中，信號傳導域進一步包含活化一或多種免疫細胞效應功能（例如本文所述之天然免疫細胞效應功能）的一或多個額外信號傳導域（例如共刺激信號傳導域）。在一些實施例中，可使用此類共刺激信號傳導域之一部分，只要該部分轉導效應功能信號即可。在一些實施例中，本文所述之細胞質域包含T細胞輔助受體（或其片段）之一或多個細胞質序列。此類T細胞共受體之非限制性實例包含CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1)、MYD88、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及與CD83結合之配體。例示性共刺激蛋白質具有天然存在於T細胞上之共刺激蛋白質之胺基酸序列，其共刺激蛋白質之完整天然胺基酸序列係描述於NCBI參考序列：NP 0.1中。在某些情況下，CAR包括4-1BB共刺激域。在某些情況下，CAR包括CD28共刺激域。在某些情況下，CAR包括DAP-10共刺激域。

在一些實施例中，共刺激信號傳導域係CD28之信號傳導域。如實驗實例中所示，具有CD28共刺激信號傳導域之CAR分子可特別受益於新開發之更快速的製造方法。在一些實施例中，CAR由包埋於病毒載體中之核酸分子編碼。在一些實施例中，CAR由包埋於慢病毒載體中之核酸分子編碼。

在一些實施例中，CAR進一步包括ITAM。含有特別用於本揭露之初級細胞質信號傳導序列之ITAM的實例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3 δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d者。在一些實施例中，ITAM包括CD3ζ。

在一些實施例中，CAR分子可係任何抗CD19 CAR分子。在一個態樣中，抗CD19 CAR包括如WO2015120096或WO2016191755中所述之胞外scFv域、CD28分子之胞內及/或跨膜部分、CD28分子之可選胞外部分、及胞內CD3ζ域，該等文獻之各者全文併入本文中。

在某些實施例中，抗CD19 CAR亦可包括額外域，諸如CD8胞外及/或跨膜區、胞外免疫球蛋白Fc域（例如lgG1、lgG2、lgG3、lgG4）、或一或多個額外信號傳導域，諸如41 BB、OX40、CD2 CD16、CD27、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、IL-2受體、Fcγ受體、或具有基於免疫受體酪胺酸之活化模體之任何其他共刺激域。

在某些實施例中，細胞表面受體係抗CD19 CAR，諸如FMC63-28Z CAR或FMC63-CD828BBZ CAR，如Kochenderfer et al., J Immunother. 2009年9月；32(7): 689-702，「Construction and Preclinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor,」中所闡述的，出於提供構築用於產生表現FMC63-28Z CAR或FMC63-CD828BBZ CAR之T細胞之載體的方法的目的，該文獻之主題特此以引用之方式併入。

在一些實施例中，包括CAR分子之T細胞係Yescarta®（阿基侖賽(axicabtagene ciloleucel)）。在一些實施例中，包括CAR分子之T細胞係Tecartus®（布萊奧妥）。

在一些實施例中，經工程改造之淋巴球包含雙靶向抗原結合系統。雙靶向抗原結合系統可包含雙特異性CAR或TCR，及/或雙順反子CAR或TCR。雙特異性及雙順反子CAR可包含兩個結合模體（分別在單個CAR分子中或兩個CAR分子中）。在一些實施例中，本揭露之載體編碼雙順反子及/或雙特異性CAR（例如，結合CD20及CD19之雙順反子及/或雙特異性CAR）。

在一些實施例中，提供包括由本文所述之方法產生之經工程改造之淋巴球群體的醫藥組成物。在某些實施例中，醫藥組成物亦可包括醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑可係醫藥上可接受之材料、組成物、或媒劑，該媒劑參與將感興趣之細胞自身體之一個組織、器官、或部分攜帶或運輸至身體之另一組織、器官、或部分。舉例而言，載劑可為液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑、或囊封物材料、或其一些組合。載劑之各組分必須係「醫藥上可接受的」，其必須與配方之其他成分相容。亦必須適用於與其可能遇到之身體之任何組織、器官或部分接觸，意謂其不得具有毒性、刺激、過敏反應、免疫原性、或超出其治療益處之任何其他併發症之風險。治療及用途，及可選的儲存

藉由本文所揭示之本方法或淋巴球群製備之淋巴球可用於治療各種疾病及病況。

在一些實施例中，若未立即使用淋巴球，則可將其冷凍保存，使得其可在稍後日期使用。此類方法可包括將經工程改造之淋巴球群體用稀釋溶液洗滌及濃縮之步驟。在一些態樣中，稀釋溶液係生理食鹽水、0.9%食鹽水、PlasmaLyte A (Pl)、5%右旋糖/0.45% NaCl食鹽水溶液(D5)、人類血清白蛋白(HSA)、或其組合。在一些態樣中，可將HSA添加至經洗滌及濃縮之細胞，以提高解凍之後的細胞存活率及細胞恢復率。在另一態樣中，洗滌溶液係生理食鹽水，且經洗滌及濃縮之細胞補充有HSA (5%)。方法亦可包括產生冷凍保存混合物之步驟，其中冷凍保存混合物包括於稀釋溶液中之經稀釋細胞群體及合適的冷凍保存溶液。在一些態樣中，冷凍保存溶液可係任何合適的冷凍保存溶液，包括但不限於CryoStor10 (BioLife Solution)，其以1:1或2:1之比與經工程改造之淋巴球的稀釋溶液混合。

在某些實施例中，可添加HSA以提供於冷凍保存混合物中之約1.0%至10% HSA之最終濃度。在某些實施例中，可添加HSA以提供於冷凍保存混合物中之約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6.0%、約7.0%、約8.0%、約9.0%、或約10.0% HSA之最終濃度。在某些實施例中，可添加HSA以提供於冷凍保存混合物中之約1%至3% HSA、約1%至4% HSA、約1%至5% HSA、約1%至7% HSA、約2%至4% HSA、約2%至5% HSA、約2%至6% HSA、或約2%至7% HSA之最終濃度。在某些實施例中，可添加HSA以提供於冷凍保存混合物中之約2.5% HSA之最終濃度。舉例而言，在某些實施例中，經工程改造之T細胞群體之冷凍保存可包含將細胞用0.9%生理食鹽水洗滌、以5%之最終濃度將HSA添加至經洗滌之細胞、及將細胞用CryoStor™ CS10以1:1稀釋（在最終冷凍保存混合物中之最終濃度為2.5% HSA）。在一些實施例中，方法亦包括將冷凍保存混合物冷凍之步驟。在一個態樣中，冷凍保存混合物係以在約1e6至約1.5e7個細胞/mL之間的冷凍保存混合物之細胞濃度，使用定義的冷凍循環在控速冷凍器中冷凍。方法亦可包括將冷凍保存混合物儲存在氣相液態氮中之步驟。

亦提供方法及用途，用於治療患有疾病或病理學病況之對象之疾病或病理學病況。在一些實施例中，方法涉及向對象投予治療有效量或治療有效劑量之經工程改造之淋巴球。可用由本文所述之方法產生之經工程改造之T細胞治療的病原性病況包括但不限於癌症、病毒感染、急性或慢性發炎、自體免疫疾病、或任何其他免疫異常。

如本文中所提及，「癌症(cancer)」可係與表面抗原或癌症標記相關之任何癌症，包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、腺樣囊狀癌、腎上腺皮質癌、AIDS相關癌症、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、非常型類畸胎/橫紋肌瘤、中樞神經系統、B細胞白血病、淋巴瘤或其他B細胞惡性腫瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤及惡性纖維組織細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、腦瘤、乳癌、枝氣管腫瘤、Burkitt氏淋巴瘤、類癌瘤、中樞神經系統癌、子宮頸癌、脊索瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性病症、大腸癌、大腸直腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、胚胎細胞瘤、中樞神經系統、子宮內膜癌、室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、食管癌、敏感性神經胚細胞瘤、Ewing氏肉瘤家族腫瘤顱外生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、惡性骨纖維性組織細胞瘤及骨肉瘤、膽囊癌、胃(gastric/stomach)癌、胃腸道類癌瘤、胃腸道間質瘤(GIST)、軟組織肉瘤、殖細胞腫瘤、妊娠期滋養性腫瘤、神經膠質瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟病、肝細胞（肝）癌、組織球增多症、何杰金氏淋巴瘤、下嚥癌、球內黑色素瘤、胰島細胞腫瘤（內分泌胰腺）、Kaposi氏肉瘤、腎癌、蘭格罕細胞組織球增多症、喉頭癌、白血病、唇癌及口腔癌、肝癌(原發性)、小葉原位癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳癌、惡性骨纖維組織細胞瘤及與骨肉瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel氏細胞癌、間皮瘤、轉移性鱗狀頸癌伴涉及NUT基因之隱發性原發性中線道癌、口癌、多發性內分泌腫瘤症候群、多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤、蕈狀肉芽腫、骨髓化生不良症候群、骨髓化生不良/骨髓增生性腫瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、多發性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔癌及副鼻竇癌、鼻咽癌、經母細胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、口腔癌(oral cancer)、口腔癌(oral cavity cancer)、口咽癌、骨肉瘤及惡性骨纖維組織細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀瘤病、副神經節瘤、副鼻竇癌及鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、中等分化之松果體實質瘤、松果體母細胞瘤及小腦幕上原始神經外胚層腫瘤、腦下垂體瘤、漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤、胸膜肺胚細胞瘤、妊娠癌及乳癌、原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞（腎）癌、腎盂及輸尿管、移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、Sézary氏症候群、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、鱗狀頸癌、胃(stomach/gastric)癌、小腦幕上原始神經外胚層腫瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤及胸腺癌、甲狀腺癌、腎盂及輸尿管之移行細胞癌、滋養層腫瘤、輸尿管及腎盂癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、陰門癌、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)、Wilms氏瘤。

在一些態樣中，癌症係B細胞惡性疾病。B細胞惡性疾病之實例包括但不限於非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、彌漫型大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴球淋巴瘤(SLL/CLL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、結外（MALT淋巴瘤）、結型（單核細胞樣B細胞淋巴瘤）、脾彌漫型大細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病/淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、及淋巴母細胞性淋巴瘤。如本文中所提及，「病毒感染(viral infection)」可係由任何病毒引起之感染，其導致宿主中疾病或病理學病況。可用本文所述之方法產生之經工程改造之T細胞治療的病毒感染之實例包括但不限於由艾司坦-巴爾病毒(EBV)引起之病毒感染；由A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、或C型肝炎病毒引起之病毒感染；由1型單純疱疹病毒、2型單純疱疹病毒、或8型單純疱疹病毒引起之病毒感染；由巨細胞病毒(CMV)引起之病毒感染；由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起之病毒感染；由流感病毒引起之病毒感染；由麻疹或流行性腮腺炎病毒引起之病毒感染；由人類乳突狀瘤病毒(HPV)引起之病毒感染；由副流感病毒引起之病毒感染；由德國麻疹病毒引起之病毒感染；由呼吸道合胞病毒(RSV)引起之病毒感染；或由水痘帶狀疱疹病毒引起之病毒感染。在一些態樣中，病毒感染可導致或引起患有病毒感染之對象的癌症發展（例如，HPV感染可引起若干種癌症或與若干種癌症之發展相關，包括子宮頸癌、陰門癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、口咽癌，且HIV可導致Kaposi氏肉瘤發展）。可用本文所述之方法產生之經工程改造之T細胞治療的慢性發炎疾病、自體免疫疾病、或任何其他免疫異常之實例包括但不限於多發性硬化症、狼瘡、及乾癬。

可用本文所述之方法產生之經工程改造之T細胞治療的慢性發炎疾病、自體免疫疾病、或任何其他免疫異常之額外實例包括類風濕性關節炎、過敏、氣喘、Crohn氏病、IBD、IBS、纖維肌痛(fibromyalga)、肥胖細胞增多症、及乳糜瀉。

如本文所用，關於病況或疾病之用語「治療(treat/treating/treatment)」可指預防病況或疾病、減緩病況或疾病之發作或發展速度、降低形成病況或疾病之風險、預防或延遲與該病況或疾病相關之症狀的發展、減少或終止與該病況或疾病相關之症狀、使該病況或疾病完全或部分消退、或其一些組合。

「治療有效量(therapeutically effective amount)」或「治療有效劑量(therapeutically effective dose)」係在對象中產生所需治療效果，諸如藉由殺死靶細胞來預防或治療目標病況或緩解與病況相關之症狀的經工程改造之淋巴球的量。在給定對象之治療功效方面最有效之結果將視多種因素而變化，包括但不限於經工程改造之淋巴球之特性（包括壽命、活性、藥物動力學、藥效動力學、及生物可利用性）、對象之生理學條件（包括年齡、性別、疾病類型及階段、一般身體狀況、對給定劑量之反應、及藥物類型）、使用的任何組成物中任一或多種醫藥上可接受之載劑之性質、及投予途徑。經工程改造之淋巴球之治療有效劑量亦取決於由淋巴球表現之細胞表面受體（例如在細胞上表現之細胞表面受體的親和力及密度）、靶細胞之類型、所治療之疾病或病理學病況之性質、或兩者之組合。

如實例中所示，與習知技術相比，藉由本方法製備之經工程改造之淋巴球已大幅增加體內功效且因此需要更低劑量。

因此，在一些態樣中，經工程改造之淋巴球之治療有效劑量係每公斤需要治療之對象體重少於約2百萬個經工程改造之淋巴球（細胞數/kg）。因此，在一些態樣中，經工程改造之淋巴球之治療有效劑量係約10,000至約2,500,000個經工程改造之淋巴球/kg。在某些實施例中，經工程改造之淋巴球之治療有效劑量係約10,000至約1,500,000個經工程改造之淋巴球/kg。在某些實施例中，治療有效劑量係約20,000至約1,200,000個經工程改造之淋巴球/kg。在某些實施例中，治療有效劑量係約20,000至約1,000,000個經工程改造之淋巴球/kg。在某些實施例中，治療有效劑量係約20,000至約500,000個經工程改造之淋巴球/kg。在某些實施例中，治療有效劑量係約20,000至約400,000個經工程改造之淋巴球/kg。在某些實施例中，治療有效劑量係約40,000至約400,000個經工程改造之淋巴球/kg。在某些實施例中，治療有效劑量係約50,000至約200,000個經工程改造之淋巴球/kg。在某些實施例中，治療有效劑量係約50,000至約100,000個經工程改造之淋巴球/kg。

在一些態樣中，經工程改造之淋巴球之治療有效劑量係每公斤需要治療之對象體重約1,600,000至約2,500,000個經工程改造之淋巴球（細胞數/kg）。在一些實施例中，經工程改造之淋巴球之治療有效劑量係每公斤需要治療之對象體重約2,000,000至約2,400,000個經工程改造之淋巴球（細胞數/kg）。

在一些實施例中，所投予之T細胞係Yescarta®（阿基侖賽）。在一些實施例中，所投予之T細胞係Tecartus®（布萊奧妥）。

以下實例旨在說明本發明之各種實施例。因此，所論述之具體實施例並不解釋為限制本發明之範圍。舉例而言，儘管以下實例係關於經抗CD19嵌合抗原受體(CAR)轉導之T細胞，所屬技術領域中具有通常知識者將理解，本文所述之方法可適用於經任何CAR轉導之T細胞。所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見，可在不脫離本發明之範圍之情況下進行各種等效、改變、及修改，且應理解此等等效實施例包括於本文中。此外，本揭露中所引用之所有參考文獻特此均以全文引用之方式併入，如同在本文中完整闡述一樣。實例 1：七天淋巴球製造過程

此實例描述製備用多核苷酸載體（即編碼治療蛋白之病毒載體）轉導之淋巴球的過程。所製備之淋巴球可適用於治療各種疾病，諸如癌症，尤其當治療蛋白係嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)時，其經設計以靶向癌細胞。

如通篇所用，用語「7天過程(7-day process)」及「7天淋巴球製造過程(7-day lymphocyte manufacturing process)」可互換使用，且係指在起始富集及活化步驟後耗時約7天之CAR細胞製造過程。7天過程係自起始富集及活化步驟至收集步驟之至少8天時間長度，且可在包括富集及活化步驟之總計8至11天之間。

血球分離術收集。使用標準血球分離術設備，諸如Cobe® Spectra、Spectra Optia®、Fenwal™ Amicus®、或等效設備來收集白血球（白血球分離術）。白血球分離術過程通常自患者產生大約200 mL至400 mL血球分離術產物。血球分離術產物可在現場進行製造過程，或可選地在1℃至10℃下運送至設施以在不同位置進行製造過程。其他過程步驟可在ISO 7細胞培養過程套件（或類似清潔室類型環境）中進行。

體積減少。在適當之情況下，使用細胞處理儀器，諸如Sepax® 2實驗室儀器(Biosafe SA; Houston, TX)或等效儀器進行體積減少步驟，且使用標準無菌管套組進行。鑒於細胞數目及來自各對象之傳入源材料之體積（大約200 mL至400 mL）之變異性，設計體積減少步驟以將細胞體積標準化為大約120 mL。在血球分離術體積小於120 mL之情況下，不需要進行體積減少步驟，且對細胞直接進行淋巴球富集步驟。設計體積減少步驟以標準化自各對象所接收之細胞體積、保留單核細胞、達成一致細胞產率及高細胞存活率，且維持封閉系統以最小化污染風險。

淋巴球富集。在體積減少步驟之後，使用由儀器製造商(NeatCell Program)開發且推薦之分離方案並使用標準無菌管套件，在細胞處理儀器（諸如Sepax® 2或等效儀器）上對細胞進行基於Ficoll之分離。淋巴球富集步驟減少產物相關雜質（諸如RBC及顆粒球）、富集及濃縮單核細胞、洗滌及減少過程相關殘餘物（諸如Ficoll）、且調配生長培養基中之細胞以製備細胞活化，以及達成一致細胞產率及高細胞存活率。封閉系統最小化環境污染。

該過程可在環境溫度下在ISO 7區域中進行，且所有連接可使用無菌管道銲接機進行，或在ISO 5層流櫃中進行。

淋巴球活化。淋巴球活化步驟可用來自淋巴球富集之新鮮處理細胞或先前冷凍保存之細胞進行。在使用冷凍保存之細胞之情況下，在使用之前使用開發方案解凍細胞。

淋巴球活化步驟選擇性地活化淋巴球以變得接受反轉錄病毒載體轉導、減少所有其他細胞類型之活細胞群體、達成一致的細胞產率及高淋巴球存活率、且維持封閉系統以最小化污染風險。淋巴球活化可用淋巴球刺激劑（諸如抗CD3抗體及IL-2）達成。

洗滌 1。在淋巴球活化步驟之後，使用細胞處理設備（諸如Sepax® 2或等效設備），使用製造商開發之方案在標準無菌套組中之新鮮培養基洗滌細胞。細胞可選地濃縮至大約100 mL之最終體積，以用於反轉錄病毒載體轉導。洗滌1步驟減少過程相關殘餘物，諸如抗CD3抗體、廢生長培養基、及細胞碎片；達成一致的細胞產率及高T細胞細胞存活率、維持封閉系統以最小化污染風險；及在適合於起始轉導之小體積中濃縮且遞送足夠數目之活T細胞。

轉導。將來自新鮮細胞生長培養基之洗滌1步驟之經活化細胞轉移至細胞培養袋（Origen Biomedicine PL240或相當），該細胞培養袋先前已藉由首先將袋子用重組纖連蛋白或其片段，諸如RetroNectin® (Takara Bio, Japan)塗覆，且隨後在引入經活化細胞之前根據規定的程序與反轉錄病毒載體一起培養來製備。RetroNectin®塗覆(10 µg/mL)係在2℃至8℃之溫度下進行20±4小時，用稀釋緩衝液洗滌，且隨後在37±1℃及5 ± 0.5% CO ₂下與解凍的反轉錄病毒載體一起培養大約180至210分鐘。將細胞添加至袋子之後，在37±1℃及5 ± 0.5% CO ₂下轉導20 ± 4小時。反轉錄病毒轉導步驟在受控條件下在反轉錄病毒載體存在下培養經活化之T細胞以便允許有效轉導，達成一致的細胞產率及高細胞存活率，且維持封閉系統以便使最小化污染風險。

洗滌 2。在反轉錄病毒轉導步驟之後，使用藉由製造商開發之方案，使用諸如Sepax® 2或等效設備之細胞處理設備在標準無菌套組中用新鮮生長培養基洗滌細胞，且將細胞濃縮至大約100 mL之最終體積，為擴增步驟做準備。設計洗滌2步驟以降低過程相關殘餘物，諸如反轉錄病毒載體粒子、載體生產過程殘餘物、廢生長培養基、及細胞碎片，達成一致的細胞產率及高細胞存活率；維持封閉系統以最小化污染風險；及用在適合於起始擴增步驟之指定體積中含有目標細胞數之新鮮培養基更換廢生長培養基。

淋巴球擴增。將來自洗滌2步驟之細胞無菌地轉移至培養袋（Origen Biomedicine PL325或等效物）且用新鮮細胞生長培養基稀釋且在37 ± 1℃及5 ± 0.5% CO ₂下培養大約72小時。在第5天開始每日測量細胞密度。由於T細胞之倍增時間可在對象之間略微變化，在總細胞數不足以遞送CAR陽性T細胞/kg對象體重之目標劑量之情況下，則可能需要超過72小時之額外生長時間（亦即，3-6天）。設計淋巴球擴增步驟以在受控條件下培養細胞，以便產生足夠數目之經轉導之細胞以用於遞送有效劑量、維持封閉系統以最小化污染風險、且達成一致的細胞產率及高細胞存活率。一種此類有效劑量或目標劑量包括2 × 10 ⁶個FMC63-28Z CAR陽性或FMC63-CD828BBZ CAR陽性T細胞/kg對象體重(±20%)，該等細胞分別經由MSGV-FMC63-28Z反轉錄病毒載體或MSGV-FMC63-CD828BBZ反轉錄病毒載體進行轉導來產生，其兩者均詳細描述於Kochenderfer et al., J Immunother. 2009年9月；32(7): 689–702。

洗滌 3及濃縮。在淋巴球擴增步驟之後，使用藉由製造商開發之方案，使用諸如Sepax® 2或等效儀器之細胞處理儀器在標準無菌套組中0.9%食鹽水洗滌細胞，且將細胞濃縮至大約35 mL之最終體積，為調配及冷凍保存做準備。設計洗滌3步驟以降低過程相關殘餘物，諸如反轉錄病毒生產過程殘餘物、廢生長培養基、及細胞碎片；達成一致的細胞產率及高細胞存活率；及維持封閉系統以最小化污染風險。

一旦細胞已濃縮且洗滌至0.9%食鹽水，則可調配適當的細胞劑量以用於製備最終冷凍保存之產物。

本文所述之實施例提供在7天內有效生產經工程改造之淋巴球療法。實例 2：五天淋巴球製造過程

此實例基於如實例1中所述之7天過程開發了一種更快速的過程。

如通篇所用，用語「5天過程(5-day process)」及「5天淋巴球製造過程(5-day lymphocyte manufacturing process)」可互換使用，且係指在起始富集及活化步驟後耗時約5天之CAR細胞製造過程。5天過程係自起始富集及活化步驟至收集步驟之6天時間長度，且可在包括富集及活化步驟之總計6至9天之間。

在7天過程期間，在第0天富集且活化淋巴球；轉導袋在第1天用重組纖連蛋白塗覆；在第2天進行病毒轉導；洗滌經轉導之淋巴球且接著在第3天及第4天擴增；在第5天及第6天用每天更換之培養基僅需擴增；且在第7天收集最終細胞產物。在自血球分離術取得之約1.2×10 ⁹個淋巴球中，將約2.4×10 ⁸個淋巴球與病毒載體一起培養以用於轉導。

在新開發之5天過程中，在第0天並未對過程作出改變。然而，在第1天及第2天，使用較大袋子。代替Origen Biomedical PL240袋用於轉導，使用Origen Biomedical PL325袋，或更佳地使用PL750袋。更大的袋子允許更大體積之載體（200 mL代替100 mL）及更多的淋巴球（3.2×10 ⁸與6×10 ⁸之間，代替2.4×10 ⁸）以用於轉導步驟。

有趣的是，增加的轉導體積以及更多載體及起始淋巴球並未導致轉導效率（54%至35.15%）或細胞存活率（92%至92.4%）降低（參見表 1）。因此，在7天過程中需要4天之細胞擴增步驟減少至2天，使得能夠在第5天收集最終細胞產物。表1. 5天過程與7天過程之評估

屬性	7 天平均值	5 天平均值
存活率(%)	92	92.4
VCN（複本數/細胞）	0.4	1.21
CD3+ (%)	91	95.83
轉導率(%)	54	35.15
IFN-γ (pg/mL)	5942	2565

然而，轉導率之適度降低與臨床功效或患者安全性不相關。同樣重要地，發現來自5天過程之細胞產物包括CD4+及CD8+ T細胞群體中增加百分比之幼年細胞（表 2），咸信與提高的治療功效相關。應注意，此等變化係在7天過程收集之供體運行的歷史範圍內。應注意，在下表2中，7天過程運行之歷史平均值反映於標記為「歷史平均值(Historical average)」之列中，且來自當前研究中進行之5天及7天運行之資料分別描繪於標記為「5天(5-day)」及「7天(7-day)」之列中。表 2.歷史範圍內偏向於幼年細胞之 5天

細胞類型之 %	歷史平均值	5 天	7 天
CD4+CM	54.2	50.28	45.5
CD4+初始	18.2	40.65	24.6
CD4+Teff/TEMRA	1.33	0.525	1.65
CD4+EM	26.3	8.55	28.3
CD8+CM	63.4	79.8	59.4
CD8+初始	2.04	3.93	1.6
CD8+Teff/TEMRA	0.50	0.4	0.33
CD8+EM	34.0	15.85	38.7

CM：中央記憶T細胞；Teff：T效應細胞；EM：效應記憶T細胞。

因此，此實例表明縮短的5天過程符合對轉導效率、功效及安全性的規格要求。同時，5天產物在歷史範圍內展現出更多的幼年表型。

在100 µL溶液中iv植入5×10 ⁵個Nalm6細胞（人類急性淋巴母細胞白血病(ALL)細胞系）的小鼠模型中測試了來自5天過程之細胞產物的體內功效。在第6天以5×10 ⁶個細胞、1×10 ⁶個細胞、或0.2×10 ⁶個細胞/kg體重之劑量注射所用之CAR以靶向CD19（表 3）。表 3.實驗組

組	N	初代細胞	CAR+ 劑量 /kg
1	5	媒劑	N/A
2	5	NTD D5	5×10 ⁶
3	5	CD19 CAR D5	5×10 ⁶
4	5	CD19 CAR D5	1×10 ⁶
5	5	CD19 CAR D5	0.2×10 ⁶
6	5	CD19 CAR D5	1×10 ⁶D7 CAR匹配
7	5	NTD D7	5×10 ⁶
8	5	CD19 CAR D7	5×10 ⁶
9	5	CD19 CAR D7	1×10 ⁶
10	5	CD19 CAR D7	0.2×10 ⁶

與增加之腫瘤負荷相關之體重變化（表 4）表明所有此等治療對動物均係安全的。表 4.腫瘤植入後天數之體重變化

天數	G1	G2	G3	G4	G5	G6	G7	G8	G9	G10
5	0.3	-0.68	0.98	0.28	0.08	-1	-1.36	0.8	-2.14	0.28
8	3.98	3.26	5.68	4.5	2.46	4.28	2.68	4.14	2.38	4.22
13	5.22	2.3	6.22	4.74	3.96	2.1	1.98	4.74	1.38	3.22
16	6.58	4.62	9.44	8.08	5.74	5.68	5.5	7.28	3.24	6.84
20	3.28	0	7.08	5.8	5	3.76	1.96	3.62	2.28	5.68
23	-0.38	-6.58	10.3	7.82	8.66	7.2	-7	7.7	6.04	9
26	-5.9	-12.4	11.1	8.54	9.46	9.06	-15.8	9.1	7.22	11.48
29		-21.4	10.2	9.02	9.6	8.88		8.08	5.44	8.66
33			11.6	9.36	9.22	11.06		9.18	7.56	9.78
40			8.76	13.28	12.74	14.1		13.38	10.78	12.62
43			5.28	14.12	13.52	14.34		13.16	12.1	8.1
47			8.43	12.94	13.18	13.36		11.38	11.78	1.4
50			3.58	12.2	11.22	14.96		10.32	12.42	13.95
54			1.53	7.5	9.05	12.26		8.675	8.48	13.85
57			-0.17	8.6	8.475	13.58		9.275	6.68	15.7
61			-2	11.18	4.325	14.36		10.65	13.53	17.3

腫瘤抑制結果展示於表 5（以光子數/s測量）中。表 5.腫瘤植入後天數的腫瘤質量

天數	G1	G2	G3	G4	G5	G6	G7	G8	G9	G10
5	3.7e06	6.1e06	5.1e06	5.3e06	2.8e06	2.0e06	7.5e06	7.0e06	6.7e06	4.7e06
8	6.1e07	1.3e08	1.5e06	1.8e07	3.2e07	1.7e07	9.8e07	1.3e06	1.5e07	6.4e07
13	7.7e09	9.5e09	8.1e05	7.2e05	6.9e06	7.5e05	7.0e09	6.7e05	8.1e05	1.5e08
16	1.3e10	1.6e10	7.1e05	7.1e05	7.3e05	8.0e05	1.8e10	7.6e05	8.9e05	2.7e07
20	2.2e10	3.2e10	6.3e05	6.5e05	7.5e05	7.2e05	3.0e10	6.9e05	8.2e05	1.1e06
23	5.1e10	6.4e10	7.7e05	7.6e05	8.7e05	8.0e05	3.8e10	7.7e05	1.6e06	2.0e06
26	4.2e10	1.1e11	7.9e05	7.9e05	1.4e06	9.9e05	1.4e11	7.6e05	4.3e06	8.7e06
29		1.9e11	6.3e05	6.2e05	1.6e06	1.0e06		7.4e05	3.3e06	8.6e06
33			6.3e05	7.1e05	9.2e06	3.3e06		1.4e06	2.9e07	2.8e08
35			7.1e05	9.2e05	1.3e07	1.4e07		6.3e06	1.2e08	8.2e08
40			7.2e05	2.6e06	2.0e08	6.0e07		3.0e07	1.1e09	7.2e09
43			7.6e05	6.0e06	1.2e09	4.4e07		1.8e08	3.4e09	1.0e10
47			9.1e05	1.1e07	2.5e09	2.8e08		5.2e06	1.6e09	6.2e09
50			8.1e05	8.6e06	7.1e09	1.4e09		2.1e06	8.0e09	3.2e09
54			9.4e05	2.6e06	1.3e10	4.6e09		1.4e06	9.9e09	4.4e09
57			9.0e05	1.9e06	8.4e09	7.1e09		1.2e06	9.0e09	4.9e09
61			9.3e05	1.5e06	5.3e09	1.5e09		9.7e05	2.7e09	9.3e09

當以5×10 ⁶個細胞/kg給藥時，來自5天過程之細胞產物展示完全腫瘤生長抑制。在所有劑量下，來自5天過程之細胞產物優於7天過程之細胞產物。即使當CAR+細胞之百分比匹配（亦即，來自5天過程之CAR-T細胞更少）時，來自5天過程之細胞亦比7天過程之細胞更有效。實例 3：三天淋巴球製造過程

此實例基於如實例1中所述之7天過程及如實例2中所述之5天過程進一步開發了一種更快速的過程。

如通篇所用，用語「3天過程(3-day process)」及「3天淋巴球製造過程(3-day lymphocyte manufacturing process)」可互換使用，且係指自起始富集及活化步驟耗時約3天之CAR細胞製造過程。3天過程係自起始富集及活化步驟至收集步驟之約4天時間長度。3天過程不包括包含在轉導步驟之後及在收集步驟之前一或多天的細胞擴增步驟。

在此新過程中，第0至1天程序類似於5天過程，包括在第2天進行後續轉導之較大袋子之纖連蛋白塗覆（例如，Origen Biomedical PL325或較佳地PL750）然而，在第2天，在轉導步驟中僅使用約4.8×10 ⁸（代替6×10 ⁸）個淋巴球，具有相同量之病毒載體(200 mL)。另一個重要的區別是，與5天及7天過程不同，沒有進行T細胞擴增的特定步驟。替代地，在第3天收集經轉導之淋巴球，允許整個過程在自起始富集及活化步驟之3天內完成。

鑒於在此新開發之3天過程中缺乏特定T細胞擴增步驟，收集的細胞產物包括略小百分比之T細胞(CD3+)。然而，重要的是，3天產物包括更高百分比之幼年（初始）T細胞（表 6）。應注意，在下表6中，7天過程運行之歷史平均值反映於標記為「歷史平均值(Historical average)」之列中，且來自當前研究中進行之3天及7天運行之資料分別描繪於標記為「3天(3-day)」及「7天(7-day)」之列中。表 6.細胞產物之表型

	歷史平均值	3 天	7 天
CD4+CM	54.2	39.65	44.55
CD4+初始	18.2	55.75	26.75
CD4+Teff/TEMRA	1.33	0.25	1.65
CD4+EM	26.3	4.35	27
CD8+CM	63.4	46.95	63.05
CD8+初始	2.04	37.35	2.6
CD8+Teff/TEMRA	0.50	5.9	0.5
CD8+EM	34.0	9.85	33.85

CM：中央記憶T細胞；Teff：T效應細胞；EM：效應記憶T細胞。

即使未對來自相同供體之淋巴球進行測試，表 2與表 6之間的比較表明，3天過程之初始T細胞百分比亦顯著高於5天過程。在CD4+ T細胞內，3天過程產生約55.75%之初始T細胞，而5天過程產生約40.65%；在CD8+ T細胞內，3天過程產生約37.35%之初始T細胞，而5天過程產生約3.93%；

在其他用語中，3天過程產生之CD4+初始T細胞百分比與自5天過程觀測到之此類細胞的百分比相比增加了大約1.4倍，且產生的CD8+初始T細胞百分比與5天過程觀測到之此類細胞的百分比相比增加了大約9.5倍。同樣，3天過程產生之CD4+初始T細胞百分比與自7天過程觀測到之此類細胞的歷史平均值相比增加了大約3.0倍，且產生的CD8+初始T細胞百分比與7天過程觀測到之此類細胞的歷史平均值相比增加了大約18.0倍。

反之，在CD4+ T細胞內，3天過程僅產生約4.35%之效應記憶T細胞，而5天過程產生約8.55%；在CD8+ T細胞內，3天過程僅產生約9.85%之效應記憶T細胞，而5天過程產生約15.85%；

在其他用語中，3天過程產生之CD4+效應記憶T細胞百分比與自5天過程觀測到之此類細胞的百分比相比減少了大約2.0倍，且產生的CD8+效應記憶T細胞百分比與5天過程觀測到之此類細胞的百分比相比減少了大約1.6倍。同樣，3天過程產生之CD4+效應記憶T細胞百分比與自7天過程觀測到之此類細胞的歷史平均值相比減少了大約6.0倍，且產生的CD8+效應記憶T細胞百分比與7天過程觀測到之此類細胞的歷史平均值相比減少了大約3.5倍。

此外，如可自表6所理解的，來自3天過程之最終收集的群體中CD4+ CCR7+細胞（亦即CM及初始細胞）之百分比係收集的CD4+ T細胞群體的至少95%。換言之，來自3天過程之最終收集的群體中Teff/TEMRA及EM CD4+細胞之最大百分比係約5%。因此，收集的群體中CD4+ CCR7+細胞之數量係Teff/TEMRA及EM CD4+細胞的至少19倍。相比之下，來自7天過程之最終收集的群體中CD4+ CCR7+細胞（亦即CM及初始細胞）之百分比係收集的CD4+ T細胞群體的約71%。換言之，來自7天過程之最終收集的群體中Teff/TEMRA及EM CD4+細胞之最大百分比係約29%。因此，3天過程產生了CD4+ T細胞群體，其中CD4+ CCR7+細胞之百分比比7天過程增加了約1.3倍，而其中Teff/TEMRA及EM CD4+細胞之百分比減少了約5倍。

亦如表6中所示，來自3天過程之最終收集的群體中CD8+ CCR7+細胞（亦即CM及初始細胞）之百分比係收集的CD8+ T細胞群體的至少84%。換言之，來自3天過程之最終收集的群體中Teff/TEMRA及EM CD4+細胞之最大百分比係約16%。因此，收集的群體中CD8+ CCR7+細胞之數量係Teff/TEMRA及EM CD4+細胞的至少約5倍。相比之下，來自7天過程之最終收集的群體中CD8+ CCR7+細胞（亦即CM及初始細胞）之百分比係收集的CD8+ T細胞群體的約66%。換言之，來自7天過程之最終收集的群體中Teff/TEMRA及EM CD8+細胞之最大百分比係約34%。因此，3天過程產生了CD8+ T細胞群體，其中CD8+ CCR7+細胞之百分比比7天過程增加了約1.3倍，而其中Teff/TEMRA及EM CD8+細胞之百分比減少了約2倍。

細胞存活率測量表明，在整個3天過程中，細胞存活率保持較高(＞90%)，而第2天之洗滌步驟導致細胞存活率下降最多。相比之下，5天及7天過程包括額外洗滌步驟，其中各步驟均導致細胞存活率進一步下降（表 7）。表 7.過程期間之細胞存活率變化

天數 / 存活率 %	3Day	7Day (Ctrl)
D0 Aph	99.3	99.3
D0-整潔之後	99.1	99.1
D0-接種之後	99.2	99
D2-洗滌之後	92.9	92.2
D2-接種之後	91	92.7
D3-洗滌之前	92.6	94.4
D3-洗滌之後	81.5	89.2
D3-接種之後		87.6
D5		97.6
D6		97.8
D7-洗滌之前		97.1
D7-洗滌之後		92.6

實例 4：藉由三天過程製備之細胞之體內功效

該實例使用與實例 2中所述之相同的動物模型及程序比較了藉由如實例3中所述之3天過程製備之細胞與7天過程製備之細胞的體內功效。

實驗組展示於表 8中，且體重變化展示於表 9中。表 8.實驗組

組	N	初代細胞	CAR+ 劑量 /kg
1	5	媒劑	媒劑
2	5	NTD D3	3×10 ⁶
3	5	NTD D3	0.5×10 ⁶
4	5	NTD D7	3×10 ⁶
5	5	NTD D7	0.5×10 ⁶
6	5	CD19 CAR D3	3×10 ⁶
7	5	CD19 CAR D3	1×10 ⁶
8	5	CD19 CAR D3	0.5×10 ⁶
9	5	CD19 CAR D7	3×10 ⁶
10	5	CD19 CAR D7	1×10 ⁶
11	5	CD19 CAR D7	0.5×10 ⁶

表 9.腫瘤植入後天數之體重變化

天數	G1	G2	G3	G4	G5	G6	G7	G8	G9	G10	G11
5	0.3	0.64	1.54	0.48	-0.6	-0.1	0.02	-0.16	0.76	0.46	0.3
8	6.46	5.78	10.98	9.62	7.72	7.06	5.74	4.8	7.84	8.2	5.6
12	11.58	11.62	13.62	13.42	11.54	11.76	10.08	8.32	13.88	10.82	9.24
15	13.26	12.78	14.88	15.1	13.52	12.42	11.94	11.38	14.6	13.18	10.84
20	-4.78	-4.52	-1.43	-0.54	-9.95	7.42	13.18	10.7	14.34	10.6	13.1
23						3.48	12.52	10.26	12.8	10.2	12.38
26						3.5	13.94		13.4	11.62	11.18
34						-8.13	12.24	7.56	10.5	6.36	-8.95
40						-10.63	7.16	10.3	11.7	-1.2
47							1.72	15.98	5.28
61								7.7	10.68
68							19.25	10.07	11.1

腫瘤抑制結果展示於表 10（以光子數/s量測）中。表 10.腫瘤植入後天數的腫瘤質量

天數	G1	G2	G3	G4	G5	G6	G7	G8	G9	G10	G11
5	2.5e06	2.0e06	2.5e06	1.8e06	2.0e06	1.5e06	2.8e06	1.8e06	1.4e06	1.8e06	1.4e06
8	2.3e07	2.2e07	2.3e07	9.5e06	1.7e07	4.4e06	1.4e07	1.4e07	7.5e05	2.0e06	3.9e06
12	4.8e08	3.0e08	4.4e08	4.1e08	6.7e08	6.9e05	1.7e06	3.2e06	6.8e05	8.0e05	2.7e06
15	4.1e09	3.6e09	4.1e09	1.7e09	6.6e09	7.2e05	6.8e05	1.1e06	8.2e05	1.3e06	8.8e06
20	1.6e10	1.7e10	2.7e10	1.3e10	1.7e10	7.4e05	6.8e05	7.7e05	8.0e05	8.8e06	8.2e07
23				3.1e10	3.1e10	7.7e05	6.2e05	7.2e05	6.7e05	3.1e07	1.7e08
26						9.8e05	6.6e05	6.8e05	2.3e06	4.2e08	2.4e09
30						1.0e06	7.5e05	8.5e05	1.1e08	3.9e09	1.4e10
34						7.2e05	6.3e05	6.2e05	8.5e08	7.2e09	2.3e10
37						7.8e05	7.8e05	7.9e05	1.9e09	1.4e10	2.3e10
40						8.9e05	9.4e05	9.4e05	4.2e09
47							6.3e05	8.7e05	1.1e10
61							8.6e05	1.0e06	6.8e09
68							6.7e05	8.6e05	5.2e09

在所有三個劑量（0.5×、1×、及3×10 ⁶個細胞/kg）下，來自3天過程之細胞產物能夠完全抑制在觀測期中之腫瘤生長，而不具有標記差異。相比之下，來自7天過程之細胞僅能夠抑制腫瘤生長至15天（0.5及1×10 ⁶個細胞/kg）及23天（3×10 ⁶個細胞/kg）。

因此，此實例表明，相較於7天過程，3天過程能夠製備具有大幅改善之抗腫瘤功效之細胞產物。此外，鑒於大幅改善之功效，需要更低劑量，以達成更完全的抗腫瘤反應。

在進一步實驗中，將來自3天過程之甚至更低劑量之細胞（0.2×10 ⁶個細胞/kg；三種不同供體）與來自7天過程之高劑量細胞（1×10 ⁶個細胞/kg）進行了比較。結果（表 11）表明，即使在5倍差異下，3天過程之結果遠高至7天之結果。表 11.腫瘤植入後天數的腫瘤質量

天數	媒劑	1× 10 ⁶ 之 7 天	0.2× 10 ⁶ 之 3 天	0.2× 10 ⁶ 之 3 天	0.2× 10 ⁶ 之 3 天
6	5.63e07	7.7e07	9.2e07	1.0e08	5.1e07
12	1.45e10	3.7e07	6.5e09	1.5e10	1.3e10
15	3.09e10	2.5e06	7.6e08	1.9e09	8.2e09
19	7.61e10	1.2e06	1.3e06	1.6e06	1.4e06
22	1.02e11	1.2e06	1.2e06	1.4e06	1.5e06
26		2.6e06	1.2e06	1.3e06	1.5e06
29		4.9e06	1.0e06	1.4e06	1.4e06
33		6.0e06	1.1e06	1.3e06	1.5e06
36		9.9e06	1.0e06	1.3e06	1.3e06
40		4.1e07	9.2e05	9.2e05	1.3e06
43		1.9e08	1.3e06	1.4e06	1.8e06
47		1.8e09	1.0e06	1.2e06	2.3e06
54		3.5e10	9.5e05	1.2e06	3.6e06
61		7.4e10	9.4e05	1.6e06	1.4e07
68		4.4e09	1.1e06	1.4e06	3.2e07
75		1.1e10	1.1e06	1.2e06	6.3e07
82		2.6e10	1.1e06	1.0e06	2.1e08
89		9.7e09	1.0e06	1.0e06	6.3e09

實例 5：早期收集對 CAR之影響

此實例發現，與4-1BB共刺激域相比，當CAR構築體包括CD28共刺激域時，簡化（較早收集）過程之改良效能更明顯。

兩種類型之CAR包括CD19結合抗原結合片段，而CAR#1包括CD28共刺激域，且CAR#2包括4-1BB共刺激域，兩者均由慢病毒載體遞送。在第4天、第7天及第14天收集細胞，且用於體內動物研究之劑量包括0.2×10 ⁶個細胞/kg及1×10 ⁶個細胞/kg（表 12）。結果展示於表 13中。表 12.實驗組

組	N	初代細胞	CAR+ 劑量 /kg
G1	5	媒劑	媒劑
G2	5	NTD_D14 1e6	1×10 ⁶
G3	5	CD19-CD28_D4	0.2×10 ⁶
G4	5	CD19-CD28_D7	1×10 ⁶
G5	5	CD19-CD28_D7	0.2×10 ⁶
G7	5	CD19-CD28_D14	0.2×10 ⁶
G8	5	CD19-41BB_D4	0.2×10 ⁶
G9	5	CD19-41BB_D7	1×10 ⁶
G10	5	CD19-41BB_D7	0.2×10 ⁶
G12	5	CD19-41BB_D14	0.2×10 ⁶

表 13.腫瘤植入後天數的腫瘤質量

天數	G1	G2	G3	G4	G5	G7	G8	G9	G10	G12
5	3.1e06	2.5e06	1.3e06	1.2e06	1.7e06	3.4e06	2.3e06	8.3e05	1.1e06	1.1e06
8	3.5e07	2.6e07	6.0e06	1.0e06	7.0e06	2.4e07	2.5e07	1.3e06	3.9e06	3.6e06
11	7.8e08	5.2e08	2.1e07	7.4e05	1.1e07	7.8e07	1.5e08	7.5e05	9.1e06	3.8e06
14	5.7e09	6.1e09	1.5e06	1.2e06	5.8e06	5.7e07	4.6e07	8.7e05	7.3e06	3.6e06
18			7.9e05	1.0e06	2.0e06	4.0e07	3.3e06	9.7e05	1.8e07	1.9e07
21			8.0e05	1.8e06	6.1e06	4.3e07	1.1e06	1.3e06	2.0e07	1.1e08
25			9.9e05	7.7e06	7.9e07	2.0e08	1.4e06	1.7e06	5.7e07	5.3e08
28			1.2e06	4.7e07	6.4e08	1.6e09	3.6e06	6.1e06	4.7e08	3.1e09
32			9.5e05	3.2e08	5.7e09		1.8e07	4.6e07	5.5e09
35			1.2e06	2.5e09	9.3e09		7.9e07	3.7e08	1.6e10
39			3.3e06				1.2e09	1.1e09
42			1.3e07				8.4e08	9.5e08
46			9.9e07				9.8e06	3.3e08
49			5.3e08				2.9e07	6.6e08
53			2.9e08				3.9e08	1.1e09
56			1.1e07				2.7e09
60			8.2e06				1.0e10
62			1.3e07
67			1.5e07
70			7.1e06
74			2.3e06
77			2.6e06
81			2.8e06
84			1.7e07
88			8.4e07

如所示表 13中所示，在晚期收集（第7天或第14天）的情況下，兩個構築體之間的效能差異有限。然而，受益於兩個構築體之早期收集，CAR#1 (G3)展現比CAR#2 (G8)顯著更高的體內功效。

另外，靶向CD19且包括CD28共刺激域之CAR係用Nalm6白血病小鼠模型體內測試。結果表明，早期採集（第4天）較一般採集（第7天）導致更佳的體內抗腫瘤功效，而後者又較晚期採集（第14天）更有效。事實上，第4天採集之低劑量（2×10 ⁵個細胞）T細胞較第7天採集的高劑量（10 ⁶個細胞）T細胞效果高5倍。實例 6藉由三天過程製備之細胞之體內功效

此實例補充了實例4，且提供了比較藉由實例3中所述之3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞與藉由7天過程製備之細胞的體內功效的額外資料。

自健康人類供體製造藉由3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞及藉由7天過程製備之抗CD19 CAR T細胞及其各自的非轉導(NTD)第3天及NTD第7天細胞。將NALM6-Luc細胞（5 × 10 ⁵個細胞）經由側尾靜脈IV植入8週齡雌性NSG小鼠（5隻小鼠/組）。在腫瘤植入之後第6天，小鼠接受單劑量群組之對照（第3天之NTD或第7天之NTD）或多劑量群組之抗CD19 CAR T細胞產物。測試了總計5個劑量群組（1 × 10 ⁶、5 × 10 ⁵、3 × 10 ⁵、2 × 10 ⁵、及1 × 10 ⁵個CAR ⁺T細胞）之源自3天過程之細胞，且測試了4個劑量群組（1 × 10 ⁷、5 × 10 ⁶、3 × 10 ⁶、及1 × 10 ⁶個CAR ⁺T細胞）之源自7天過程之細胞。藉由判定抗CD19 CAR T細胞產物對腫瘤負荷及動物存活之效應，評定抗腫瘤活性。

藉由評定如自第5天（CAR T細胞治療之前1天）至第22天（CAR T細胞治療之後16天，以及所有組均完好之最後時間點）之生物發光成像(BLI)測量之腫瘤負荷變化來評估抗腫瘤活性。在用源自7天過程之抗CD19 CAR T細胞治療之小鼠之所有4個劑量群組及源自3天過程之抗CD19 CAR T細胞之所有5個劑量群組中觀測到腫瘤生長之抑制（表14、表15及表16）。對於源自3天過程之抗CD19 CAR T細胞，與未治療組相比，用1 × 10 ⁶、5 × 10 ⁵、3 × 10 ⁵、2 × 10 ⁵、及1 × 10 ⁵個CAR ⁺T細胞治療之動物之腫瘤生長抑制分別係128.1%、126.7%、117.7%、113.4%、及65.7%。對於源自7天過程之抗CD19 CAR T細胞，所測試之劑量群組之腫瘤生長抑制在109.0%至115.1%範圍內（表16）。在第22天時，所有組及所有CAR ⁺T細胞劑量下測試之腫瘤負荷均有所消退，除了藉由3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞之1 × 10 ⁵個CAR ⁺T細胞劑量群組，其中延遲了腫瘤控制，在第26天發生。當與未接受治療或接受NTD對照（Tukey事後檢定，p ＜ 0.05視為顯著的）之小鼠相比，藉由3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞及7天過程製備之抗CD19 CAR T細胞之各劑量在第22天之抗腫瘤功效均達到統計顯著性。表 14.表 15及表 16中所呈現之結果的實驗組

組	N	初代細胞	CAR+ 劑量 /kg
G1	5	未治療	N/A
G2	5	NTD_D3	1×10 ⁶
G3	5	NTD_D7	1×10 ⁷
G4	5	CD19-CD28_D3	1×10 ⁵
G5	5	CD19-CD28_D3	2×10 ⁵
G6	5	CD19-CD28_D3	3×10 ⁵
G7	5	CD19-CD28_D3	5×10 ⁵
G8	5	CD19-CD28_D3	1×10 ⁶
G9	5	CD19-CD28_D7	1×10 ⁶
G10	5	CD19-CD28_D7	3×10 ⁶
G11	5	CD19-CD28_D7	5×10 ⁶
G12	5	CD19-CD28_D7	1×10 ⁷

表 15.腫瘤植入後天數的腫瘤質量（表示為每個時間點每組觀察到之平均值；單位 =光子數 /s）

天數

G1

G2

G3

G4

G5

G6

G7

G8

G9

G10

G11

G12

5

2.10E+06

4.76E+06

3.22E+06

2.24E+06

2.23E+06

3.52E+06

7.51E+06

8.42E+06

2.28E+06

6.95E+06

2.70E+06

2.64E+06

8

5.87E+06

3.64E+07

2.32E+07

8.95E+06

9.52E+06

8.38E+06

6.03E+07

1.07E+08

1.21E+07

5.68E+06

9.15E+05

6.19E+05

13

4.04E+09

8.69E+09

2.10E+09

1.81E+08

1.18E+07

2.03E+06

1.66E+06

7.77E+05

1.17E+06

6.17E+05

7.19E+05

7.00E+05

16

9.43E+09

1.49E+10

1.11E+10

3.06E+07

6.67E+05

6.06E+05

6.58E+05

7.01E+05

6.93E+05

1.30E+06

6.26E+05

6.70E+05

19

1.38E+10

2.64E+10

1.70E+10

3.83E+07

6.12E+05

5.69E+05

5.07E+05

5.24E+05

6.79E+05

3.11E+06

5.96E+05

5.50E+05

22

3.12E+10

4.96E+10

2.53E+10

5.80E+07

5.70E+05

5.11E+05

5.44E+05

5.70E+05

9.69E+05

5.05E+06

6.55E+05

6.06E+05

26

8.22E+10

9.81E+10

6.19E+05

6.32E+05

5.64E+05

5.70E+05

5.47E+05

6.81E+06

4.54E+06

7.32E+05

6.30E+05

29

4.73E+05

5.06E+05

4.54E+05

4.80E+05

5.37E+05

1.23E+07

1.16E+07

1.21E+06

5.85E+05

33

4.98E+05

5.31E+05

6.04E+05

5.91E+05

1.29E+06

3.04E+08

3.37E+07

3.75E+06

6.65E+05

36

4.66E+05

5.25E+05

5.86E+05

5.67E+05

4.18E+06

1.55E+09

1.21E+08

1.87E+07

5.60E+05

40

6.06E+05

6.52E+05

8.47E+05

7.41E+05

1.47E+07

5.75E+09

3.11E+08

6.73E+07

6.92E+05

43

5.70E+05

5.79E+05

7.31E+05

6.16E+05

2.19E+07

8.45E+09

1.10E+09

2.48E+08

6.90E+05

47

4.77E+05

4.16E+05

6.66E+05

6.63E+05

1.33E+07

5.27E+09

3.59E+09

6.25E+08

7.02E+05

50

5.28E+05

4.58E+05

6.94E+05

7.34E+05

1.78E+07

7.42E+09

9.60E+09

3.55E+09

8.75E+05

54

6.66E+05

6.25E+05

8.24E+05

8.70E+05

3.39E+07

1.48E+10

7.90E+09

2.83E+09

3.07E+06

57

5.72E+05

4.19E+05

6.15E+05

6.68E+05

3.79E+07

1.66E+10

8.29E+09

5.05E+09

1.17E+07

61

5.54E+05

6.59E+05

6.42E+05

6.41E+05

6.26E+05

7.12E+09

4.72E+09

8.92E+08

5.74E+07

64

6.08E+05

5.06E+05

6.29E+05

5.88E+05

5.39E+05

8.40E+09

6.19E+09

1.26E+09

1.22E+08

表 16.腫瘤負荷之對數轉換分析

	G1	G2	G3	G8	G7	G6	G5	G4	G12	G11	G10	G9
第 5 天	6.31	6.58	6.49	6.92	6.85	6.45	6.32	6.33	6.41	6.42	6.83	6.34
第 22 天	10.48	10.69	10.38	5.75	5.73	5.71	5.75	7.76	5.78	5.81	6.25	5.97
變化，第 5 天至第 22 天	4.17	4.11	3.89	-1.17	-1.11	-0.74	-0.56	1.43	-0.63	-0.61	-0.58	-0.38
ΔT/ΔC (%)	100.0	98.4	93.3	-28.1	-26.7	-17.7	-13.4	34.3	-15.1	-14.6	-13.9	-9.0
腫瘤生長抑制，第 22 天（ % ）	0.0	1.6	6.7	128.1	126.7	117.7	113.4	65.7	115.1	114.6	113.9	109.0

在表16中，腫瘤負荷（藉由BLI量測）進行了log ₁₀標準化，各群組在研究之第5天及第20天之均值示於表中。計算第5天至第20天腫瘤BLI之變化，且相對於未治療組之腫瘤負荷之百分比變化計算為ΔT/ΔC。腫瘤生長抑制定義為(1-[ΔT/ΔC] × 100)且表示相對於對照（亦即，未接受治療之小鼠）之治療小組中之百分比腫瘤體積變化。0%之腫瘤生長抑制(TGI)指示組之平均腫瘤生長與未治療組中觀測到之平均腫瘤生長相當，而100% TGI指示在第5天至第20天之間未觀測到腫瘤生長。TGI ＞ 100%指示平均腫瘤負荷自第5天至第20天消退，而TGI ＜ 0指示腫瘤負荷量增加大於在未治療組(G1)中所見之增加。

與接受NTD或未治療之對照小鼠相比，用藉由3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞或藉由7天過程製備之抗CD19 CAR T細胞治療小鼠可延長存活期。基於由腫瘤負荷＜ 5 × 10 ⁸個光子/秒生物發光定義之存活設定點，NTD對照及未接受治療之小鼠在第8天退出研究。相比之下，用藉由3天過程細胞製備之抗CD19 CAR T細胞治療之組之存活率顯著提高，其中來自所有劑量群組之小鼠在第64天之研究終點達成100%存活率。與用藉由3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞治療之群組相比，用藉由7天過程製備之抗CD19 CAR T細胞治療之小鼠之存活率較低，範圍在1 × 10 ⁷個CAR ⁺T細胞劑量群組之80%存活率至5 × 10 ⁶個CAR ⁺T細胞劑量群組之20%存活率，以及3 × 10 ⁶及1 × 10 ⁶個CAR ⁺T細胞劑量群組之0%存活率。

相對於接受藉由7天過程製備之抗CD19 CAR T細胞之小鼠，接受所有劑量之藉由3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞之小鼠在3 × 10 ⁶及1 × 10 ⁶個CAR ⁺T細胞劑量下達成統計顯著性，但在藉由7天過程製備之抗CD19 CAR T細胞之1 × 10 ⁷個CAR ⁺T細胞劑量下並不具有統計學差異。藉由3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞之所有劑量產生完全抗腫瘤反應，且在研究結束（第64天）時產生100%存活率，而藉由7天過程製備之抗CD19 CAR T細胞最高劑量（1 × 10 ⁷個CAR ⁺T細胞）導致80%之研究結束存活率。

最後，在未治療組中隨時間增加之腫瘤負荷在第26天導致平均體重減輕＞18%及/或不良臨床徵象，之後自研究移除所有動物。接受NTD T細胞之動物在第29天時由於不受控腫瘤負荷而表現出類似的體重減輕模式。相比之下，1 × 10 ⁶至1 × 10 ⁵個細胞之所有劑量的藉由3天過程製備之抗CD19 CAR T細胞均係良好耐受的，其中動物在研究期間保持一致的體重。對於用藉由7天過程製備之抗CD19 CAR T細胞治療之組，在所有劑量（1 × 10 ⁷、5 × 10 ⁶、3 × 10 ⁶、及1 × 10 ⁶個CAR ⁺T細胞）下測試所有小鼠，在研究期間保持一致的體重。實例 7藉由三天過程製備之細胞之表徵

此實例描述了與第6天收集的抗CD19/CD20 CAR T細胞相比，第3天收集的抗CD19/CD20 CAR T細胞之功能及表型表徵。

簡言之，使用編碼雙重靶向抗CD19 CAR及抗CD20 CAR之慢病毒載體活化及轉導來自健康人類供體之正向選擇之CD4 ⁺及CD8 ⁺T細胞。隨後在第3天收集經轉導之細胞。類似地，另一組抗CD19/CD20 CAR T細胞產物係由來自同一供體之T細胞製造，但在第6天收集（在實例7及實例8中稱為「第6天之抗CD19/CD20 CAR」）。隨後，兩種CAR T細胞產物均功能性地表徵，且與其等各別NTD對照T細胞進行比較（第3天之NTD及第6天之NTD），該等對照T細胞係由同一供體材料平行地製造。

第3天收集之抗CD19/CD20 CAR T細胞係藉由以下自血球分離術材料收集開始之3天過程產生。起始血球分離術材料可選地係新鮮或冷凍保存之血球分離術或冷凍保存之T細胞。在第0天進行洗滌1、洗滌2、T細胞富集及洗滌3步驟。在第0天直至第1天進行T細胞活化。在第1天直至第4天進行慢病毒轉導。在第3天直至第4天進行收集洗滌及濃縮。

第6天收集之抗CD19/CD20 CAR T細胞係藉由以下自血球分離術材料收集開始之過程產生。在第0天進行洗滌1、洗滌2、T細胞富集及洗滌3步驟。在第0天直至第2天進行T細胞活化。在第2天直至第5天進行慢病毒轉導。在第4天直至第5天進行洗滌4。在第4天直至第15天進行T細胞擴增。在第6天直至第15天進行收集洗滌及濃縮。

本實例中所述之研究之實驗組示於表 17中。表 17.實驗組

組	初代細胞
1	NTD D3
2	抗CD19/CD20 CAR D3
3	NTD D6
4	抗CD19/CD20 CAR D6

評定由3天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞及第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物之CAR細胞表面擴增以建立CAR轉導效率。抗CD19 CAR及抗CD20 CAR兩者之細胞表面表現係使用螢光標記之抗特應型抗體，藉由流式細胞術偵測。抗CD19 CAR之個別表現對於3天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞係68%，且對於第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物係35%，且在相同樣本中抗CD20 CAR之表現分別係65%及37%。如藉由總抗CD19及抗CD20 CAR表現之總和（亦即，抗CD19 CAR抗體 ⁺細胞之百分比加抗CD29 CAR抗體 ⁺細胞之百分比）測量的轉導效率對於3天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞係72%且對於第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物係40%。

在與螢光標記之抗體一起培養之後，藉由流式細胞術進行CAR T細胞產物之表型表徵，以評定CD4 ⁺及CD8 ⁺細胞之存在，以及分化程度較低的T細胞亞群之相對組成。可使用CD45RA及CCR7標記來界定各種T細胞群體，包括初始及幹記憶T細胞(CD45RA ⁺CCR7 ⁺)，亦稱為幼年T細胞。3天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞展示出比第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物略微較高的CD4/CD8比率（表 18）。表 18.CD4/CD8比率（ CD3之%）

	CD4	CD8
G1	55.8	41.4
G2	53.8	42.1
G3	51.9	47.1
G4	49.2	48.6

與第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物相比，3天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞之CD4 ⁺及CD8 ⁺群體均展示出提高的幼年細胞頻率（表 19及表 20）。表 19.CD45RA ⁺CCR7 ⁺ （ CD4之 %）

G1	G2	G3	G4
67.3	71.7	31.3	22.8

表 20.CD45RA ⁺CCR7 ⁺ （ CD8之 %）

G1	G2	G3	G4
82.6	83.4	52.1	42.6

在與抗原陽性及抗原陰性目標細胞之共培養檢定中評定CAR T細胞產物之功能。NTD T細胞產物作為對照包括在實驗中以評定同種異體反應性之水平。細胞毒性係在T細胞產物與表現螢光素酶之目標細胞開始共培養後1天及4天測量。與僅接種目標細胞之孔相比，添加螢光素後測試孔中發出的螢光素酶信號減少，從而測量細胞毒性。此等檢定中所使用之多個E:T比在1:1至1:243範圍內。使用表現各種水平之CD19及CD20抗原之四種主要細胞系：Raji，表現高水平之CD19及CD20抗原之B細胞淋巴瘤細胞系；Nalm6，表現高水平之CD19但低水平之CD20之B細胞白血病細胞系；ST486，表現低水平之CD19但高水平之CD20之B細胞淋巴瘤細胞系；及K-562，不表現CD19或CD20抗原之慢性骨髓性白血病細胞系。另外，對照組由Raji CD19敲除(KO)細胞及Raji CD20KO細胞組成。Raji細胞系經工程改造以表現抗原：Raji CD19KO細胞僅表現CD20而非CD19，Raji CD20KO僅表現CD19而非CD20。藉由分解(TIDE)分析追蹤插入或缺失(indel)在DNA水準上確認抗原KO，且藉由流式細胞術在細胞表面蛋白水準上確認抗原KO。

在共培養之第4天，3天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞及第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物對抗原陽性目標細胞展示出相當的劑量依賴性特異性細胞毒性，與兩種或任一種抗原之表現無關（表 21A 至 21F）。藉由NTD D3對照T細胞在最高E:T比下對ST486細胞（低CD19/高CD20表現）之細胞毒性，觀測到由對目標細胞之同種異體反應性介導之抗原非依賴性細胞毒性的基礎水平。（表 21A）。3天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞及來源於健康供體之抗CD19/CD20 CAR D6 T細胞產物兩者在所測試的各種目標細胞系中均具有相當的細胞毒性活性，且缺乏抗原陰性K-562細胞之殺傷活性（表 21F）。表 21A. ST488細胞 (CD19+CD20+)（細胞毒性 %）

ET_ 比率	G2	G4	G1	G3
0.0041	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.012	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.037	34.93	31.91	22.59	30.28	27.98	21.04	0	0	0	0	0	0
0.11	87.23	84.35	83.47	73.04	64.55	64.67	0	0	0	0	0	0
0.33	99.11	98.74	98.51	95.66	96.45	98.11	8.16	7.59	0.28	0	0	0
1	99.79	99.65	99.65	99.73	99.76	99.69	61.53	54.83	55.11	0	0	0

表 21B. Nalm6細胞 (CD19+CD20+)（細胞毒性 %）

ET_ 比率	G2	G4	G1	G3
0.0041	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.012	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.037	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.11	60.09	62.71	66.74	26.08	31.46	29.1	0	0	0	0	0	0
0.33	99.01	98.95	98.45	91.1	91.74	92.73	0	0	0	0	0	0
1	99.94	99.92	99.95	99.8	99.64	99.78	0	0	0	0	0	0

表 21C. Raji細胞 (CD19+CD20+)（細胞毒性 %）

ET_ 比率	G2	G4	G1	G3
0.0041	0.67	1.85	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.012	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.037	0	0	0	0	0	3.12	0	0	0	0	0	0
0.11	6.2	7.04	2.67	6.29	5.23	3.01	0	0	0	0	0	0
0.33	23.82	23.4	21.59	22.3	23.09	22.26	0	0	0	0	0	0
1	55.98	54.26	53.38	53.83	53.61	53.91	8.96	4.07	2.58	8.63	6.24	3.13

表 21D. Raji CD19KO細胞 (CD19-CD20+)（細胞毒性 %）

ET_ 比率	G2	G4	G1	G3
0.0041	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.012	1.97	0.02	5.07	0	0	3.64	0	0	0	0	0	0
0.037	4.02	12.24	3.54	3.4	11.08	4.41	0	0	0	0	0	0
0.11	7.88	11.55	10.77	9.01	11.11	17.12	0	0	0	0	0	0
0.33	27.08	34.69	27.04	21.47	31.31	33.68	0	0	0	0	0	0
1	51.83	52.51	49.39	45.94	52.37	49.69	0.3	12.75	5.14	0	1.79	0

表 21E. Raji CD20KO細胞 (CD19+CD20-)（細胞毒性 %）

ET_ 比率	G2	G4	G1	G3
0.0041	2.13	5.08	6.03	10.71	7.73	6.1	0	0	0	0	1.58	0
0.012	17.55	16.79	16.18	24.96	19.97	18.29	8.54	5.02	14.91	7.75	7.88	5.99
0.037	31.28	29.9	29.89	28.39	28.21	27.88	11.98	11.38	9.98	14.52	12.93	8.95
0.11	30.11	20.83	32.51	29.55	29.13	30.22	1.54	0	0.5	7.33	2.56	6.88
0.33	24.09	24.84	24.58	37.77	34.9	37.91	0	0	4.72	1.67	0	1.78
1	51.67	47.7	48.05	47.12	48.77	45.02	8.09	11.02	11.07	3.49	8.43	7.68

表 21F. K-562細胞 (CD19-CD20-)（細胞毒性 %）

ET_ 比率	G2	G4	G1	G3
0.0041	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.012	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.037	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.11	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0.33	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
1	0	0	3.37	0	0	1.59	0	0	0	0	0	0

在以1:1之E:T比將T細胞產物與Nalm6、ST486、Raji、Raji CD19KO、Raji CD20KO、及K-562目標細胞共培養過夜後，藉由測量培養上清液中之細胞介素水平來進一步評估具體活性。對IFN-γ、IL-2、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)促炎細胞介素之產生進行定量。

三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞及第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物表明，與抗原陽性目標細胞Nalm6、ST486、Raji、Raji CD19KO、及Raji CD20KO共培養產生了強大的抗原依賴性IFN-γ、IL-2、及TNF-α促炎細胞介素（表 22A 至表 22C）。在測試的各種目標細胞系中，三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞及第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物均展示出相當的IL-2及TNF-α細胞介素水平。當將T細胞產物與表現單一抗原（Raji CD19KO或Raji CD20KO）之目標細胞共培養時，細胞介素之產生證實了各個別CAR之功能，儘管其水平低於與表現兩種抗原之Raji親本細胞共培養所誘導之水平。相比之下，在不存在目標細胞（亦即，單獨的T細胞）之情況下未偵測到細胞介素產生，且與如所示之抗原陰性K-562 (CD19 ^–CD20 ^–)細胞共培養之CAR T細胞未產生細胞介素（表 22A 至表 22C）。表 22A. IFNγ分泌 (pg/mL)

	G1	G2
Raji	631.842023	673.719917	693.715378	88686.8936	88390.2695	95705.4359
Raji CD19KO	492.120724	546.261438	615.66846	56910.7259	61177.0689	64253.8024
Raji CD20KO	513.960957	762.309569	463.0381	80535.1897	85534.1247	73591.69
Nalm6	556.3588	634.7961	846.9493	73772.59	71733.16	83234.62
ST486	859.1064	739.7526	610.4024	102770.7	74682.97	84363.41
K-562	504.6792	427.0096	494.3015	5068.977	5101.474	4395.067
單獨的 T 細胞	493.22016	439.41505	560.89536	3804.1729	2774.8777	3279.106
	G3	G4
Raji	64.633201	85.182547	62.767611	72703.3938	62697.5733	73943.3727
Raji CD19KO	50.653482	32.994943	46.00049	45363.4252	43389.0288	45471.0076
Raji CD20KO	59.970116	40.422233	58.25347	52114.3441	54101.4732	56705.47
Nalm6	24.02465	32.34113	21.25442	69690.74	74599.62	72071.31
ST486	54.5489			81068.87	59904.5	66741.56
K-562	112.971583	14.7083822	10.3012139
單獨的 T 細胞	15.963588	20.0692	16.993131	61.042722	59.292719	65.083158

表 22B. IL-2分泌 (pg/mL)

	G1	G2
Raji		1.2715598	1.9489383	4272.88282	5156.01144	4736.15664
Raji CD19KO	5.6393266	0.9313962	1.9489383	907.473679	944.985293	1060.583
Raji CD20KO	0.2456634	4.3021465	2.121362	4067.82741	3431.4832	3784.99
Nalm6				3087.476	3506.963	3593.429
ST486		0.02115656	10.4754167	4327.265	3690.72	3809.59
K-562	0	0	0	6.46259237	5.92807962	8.63028699
單獨的 T 細胞	1.5061941	2.0514315	1.6878284	7.6561311	4.574488	4.848683
	G3	G4
Raji	4.9712569	13.273517	3.2961473	3020.23907	3257.4112	3424.93298
Raji CD19KO	5.6393266		2.2865335	936.790753	927.019416	1056.80524
Raji CD20KO			5.047304	1720.39506	1631.67487	1711.666
Nalm6	4.722206			1930.181	2080.665	2074.802
ST486				2868.025	2615.041	2629.092
K-562	0	0.40768438	0.06331794	1.39388945	1.59690516	3.24797964
單獨的 T 細胞	0.7510095	2.2637136	1.5969961	3.3267079	3.2659041	3.9959589

表 22C. TNFα分泌 (pg/mL)

	G1	G2
Raji	23.813341	19.161838	20.192636	754.338361	891.841792	751.149696
Raji CD19KO	15.057532	13.018343	16.336655	357.632019	344.056688	461.368626
Raji CD20KO	22.518038	8.7215178	6.306	929.466749	898.546424	844.7008
Nalm6				821.6964	773.5773	844.172
ST486	1.608184	19.8814103	21.0210015	878.2847	793.4574	897.9296
K-562	1.47838933	0.47430105	0	6.70118515	5.88777721	6.81731438
單獨的 T 細胞	1.8959588	1.6426018	2.7219428	12.654293	10.497499	14.290262
	G3	G4
Raji	5.9760712	8.7215178	4.9869821	598.931052	475.071069	689.204856
Raji CD19KO	3.7596826	12.256219	10.484037	279.821783	271.683547	347.448925
Raji CD20KO	8.4706165	3.2721687	1.08748	524.274078	594.040007	527.0265
Nalm6				587.2551	614.7329	578.2727
ST486		7.07694449	12.7634852	672.34	647.3185	609.3595
K-562	0.17620014	0	0	1.27235707	1.15449786	0.71149013
單獨的 T 細胞	1.168786	1.1321249	2.9004278	1.3150979	1.8598301	2.9717291

為了評定CAR T細胞產物在與目標抗原接合時之抗原特異性增殖，在開始共培養後4天後收集已與Raji、Nalm6、Raji CD19KO、Raji CD20KO、及K-562目標細胞共培養之T細胞產物，離心成顆粒，且製備用於流式細胞術評估。使用以螢光染料預先標記之T細胞以藉由分析細胞分裂時之染料稀釋來追蹤多代細胞。使用來自共培養物之1:1 E:T比且將在不存在目標細胞（單獨的T細胞）之情況下培養的T細胞產物作為對照。使用與抗原陰性K-562 (CD19 ⁻CD20 ⁻)細胞共培養之T細胞以評定抗原非依賴性增殖之特異性及水平，而單獨的T細胞用於評定在不存在刺激之情況下的基礎增殖水平。在收集後，將細胞用針對CD3、CD4、CD8、CD19 CAR、CD20 CAR、CD25、及存活率染料之螢光標記之抗體染色。

三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞及第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物在與Nalm6、Raji、Raji CD19KO、及Raji CD20KO目標細胞（但不與抗原陰性K-562細胞）共培養中展現出相當的增殖，表明T細胞產物中之抗CD19 CAR及抗CD20 CAR均具有功能性。當與不同的目標細胞系共培養時，NTD T細胞對照展示出各種水平之非特異性基礎增殖，但總體而言，第3天之NTD細胞表現出比第6天之NTD細胞更多的基礎增殖。實例 8藉由三天過程製備之細胞之體內功效

在人類B-ALL之瀰漫性異種移植小鼠模型中進行了體內研究，該模型由靜脈注射表現高水平之CD19及CD20之Nalm6-luc細胞的高度免疫缺陷的非肥胖性糖尿病(NOD)、重度合併性免疫缺失(scid) IL-2受體γ鏈缺失(NSG)小鼠組成。評定CAR T細胞產物之抗腫瘤功效，該等細胞產物由來源於1個健康供體之T細胞產生，並且先前藉由實例7中所述之體外研究表徵。

將Nalm6luc細胞(5.0 × 10 ⁵)係經由側尾靜脈靜脈內植入7週齡雌性NSG小鼠（5隻小鼠/組）。在腫瘤植入後第6天，小鼠接受對照（媒劑[磷酸鹽緩衝鹽水]或第3天NTD細胞）或抗CD19/CD20 CAR T細胞，如下：在3個劑量水平（2.0 × 10 ⁵、4.0 × 10 ⁴、及8.0 × 10 ³CAR ⁺T細胞）中之1個下藉由三天過程產生的抗CD19/CD20 CAR T細胞；在1個劑量水準（2.0 × 10 ⁵CAR ⁺T細胞）下產生之第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞。所有動物均以100 µL之固定體積單次IV投予適用的治療來給藥，且來自媒劑組之小鼠接受100 µL PBS之IV注射。表 23展示了表 24 至表 26中所呈現之結果的實驗組。表 23.表 24至表 26中所呈現之結果的實驗組

組	N	初代細胞	CAR+ 劑量 /kg
G1	5	媒劑	N/A
G2	5	NTD_D3	5.0 × 10 ⁵（T細胞）
G3	5	抗CD19/CD20 CAR_D3	2.0 × 10 ⁵
G4	5	抗CD19/CD20 CAR_D3	4.0 × 10 ⁴
G5	5	抗CD19/CD20 CAR_D3	8.0 × 10 ³
G6	5	抗CD19/CD20 CAR_D6	2.0 × 10 ⁵

藉由評定自第5天（CAR T細胞輸注之前1天）至第22天（亦即，CAR T細胞輸注之後16天，以及所有組均完好之最後時間點）之腫瘤負荷（藉由生物發光及log ₁₀標準化測量）變化來評估抗腫瘤活性。當與接受媒劑(PBS)或第3天NTD T細胞之小鼠相比時，用三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞治療導致腫瘤負荷顯著降低（表 24）。表 24.T細胞產物對攜帶 Nalm6-luc之 NSG小鼠之腫瘤負荷的抗腫瘤活性（光子數 /s）

天數	G1
5	1.27E+07	6.11E+06	6.06E+06	4.56E+06	4.53E+06
8	1.28E+08	5.72E+07	6.38E+07	4.31E+07	6.22E+07
12	5.42E+09	4.00E+09	2.38E+09	2.60E+09	2.13E+09
15	1.39E+10	8.68E+09	9.48E+09	9.49E+09	9.04E+09
19	2.23E+10	2.80E+10	8.25E+08	2.86E+10	2.57E+10
22	4.47E+10	4.17E+10	4.59E+10	3.55E+10	3.92E+10
天數	G2
5	1.23E+07	6.14E+06	5.75E+06	4.71E+06	4.50E+06
8	1.30E+08	5.09E+06	5.66E+07	5.70E+07	4.59E+07
12	6.18E+09	3.42E+09	3.20E+09	2.99E+09	2.62E+09
15	1.56E+10	1.35E+10	1.57E+10	1.60E+10	1.08E+10
19	3.26E+10	2.86E+10	3.02E+10	3.48E+10	3.27E+10
22	4.75E+10	4.82E+10	5.80E+10	6.61E+10	4.67E+10
天數	G3
5	8.26E+06	6.56E+06	5.62E+06	4.84E+06	4.09E+06
8	9.42E+07	7.78E+07	7.66E+07	8.78E+07	6.56E+07
12	1.18E+08	1.97E+08	1.52E+08	1.50E+08	2.18E+08
15	4.28E+06	4.36E+06	1.10E+07	5.90E+06	1.67E+07
19	7.96E+05	9.64E+05	9.66E+05	7.64E+05	9.74E+05
22	6.41E+05	6.28E+05	7.37E+05	6.58E+05	7.24E+05
26	6.10E+05	7.45E+05	7.47E+05	6.72E+05	7.17E+05
29	6.42E+05	7.91E+05	1.19E+06	8.19E+05	8.23E+05
33	6.40E+05	7.79E+05	1.24E+06	9.26E+05	9.22E+05
36	6.50E+05	8.02E+05	1.43E+06	9.25E+05	8.02E+05
40	6.77E+05	7.81E+05	1.72E+06	8.67E+05	9.19E+05
44	8.32E+05	8.66E+05	3.04E+06	9.40E+05	1.09E+06
48	7.81E+05	8.16E+05	2.33E+06	7.85E+05	9.18E+05
51	8.04E+05	1.27E+06	6.47E+07	3.49E+06	9.71E+05
55	1.72E+06	4.65E+06	4.89E+08	1.60E+07	1.90E+06
58	1.20E+06	3.62E+06	3.83E+08	6.81E+06	1.13E+06
61	1.60E+07	1.31E+08	8.78E+09	2.15E+08	1.48E+07
65	3.97E+07	4.56E+08	1.20E+10	3.29E+08	2.92E+07
天數	G4
5	8.14E+06	6.59E+06	5.60E+06	5.08E+06	3.67E+06
8	4.50E+06	6.44E+07	8.50E+07	5.81E+07	4.03E+06
12	2.33E+09	2.40E+09	1.86E+09	1.59E+09	1.18E+09
15	3.07E+09	7.27E+09	3.02E+09	2.10E+09	1.48E+09
19	1.02E+06	1.14E+06	8.76E+05	1.07E+06	8.67E+05
22	8.96E+05	9.88E+05	1.02E+06	8.63E+05	6.80E+05
26	6.46E+05	9.76E+05	7.79E+05	6.63E+05	7.98E+05
29	6.71E+05	5.74E+05	6.93E+05	6.35E+05	6.12E+05
33	8.45E+05	1.01E+06	8.17E+05	9.12E+05	8.15E+05
36	8.75E+05	7.00E+05	1.01E+06	8.68E+05	9.22E+05
40	7.64E+05	1.35E+06	1.02E+06	8.80E+05	9.03E+05
44	9.17E+05	1.30E+06	1.07E+06	1.04E+06	9.77E+05
48	8.42E+05	3.24E+06	1.12E+06	1.88E+06	9.78E+05
51	9.25E+05	9.93E+05	1.14E+06	3.96E+06	1.26E+06
55	8.83E+05	5.95E+06	1.17E+06	6.44E+05	7.58E+05
58	1.05E+06	3.07E+06	1.38E+06	1.38E+06	7.95E+05
61	2.14E+06	1.14E+08	5.43E+06	4.49E+06	1.38E+06
65	1.19E+07	1.05E+09	2.37E+07	1.94E+07	2.26E+06
天數	G5
5	7.75E+06	6.60E+06	5.54E+06	5.14E+06	3.44E+06
8	3.90E+06	7.80E+07	7.16E+07	5.36E+07	2.84E+06
12	4.03E+09	3.73E+09	2.73E+09	2.22E+09	4.23E+09
15	1.41E+10	9.71E+09	1.04E+10	7.87E+09	1.30E+10
19	2.18E+10	1.99E+10	2.18E+10	1.64E+10	2.03E+10
22	2.51E+10	2.78E+10	3.45E+10	1.24E+10	1.84E+10
26	2.21E+10	4.28E+10	4.11E+10	2.01E+10	1.27E+10
29	3.01E+10	4.71E+10	8.67E+10	2.14E+10	9.90E+09
33					2.64E+10
天數	G6
5	1.03E+07	6.46E+06	5.66E+06	4.81E+06	4.33E+06
8	8.05E+07	4.06E+07	3.95E+07	2.32E+07	1.42E+07
12	3.73E+07	1.94E+06	2.90E+06	3.68E+06	1.52E+06
15	3.21E+06	7.48E+05	7.54E+05	8.15E+05	8.42E+05
19	1.44E+06	1.21E+06	1.45E+06	1.28E+06	1.20E+06
22	2.74E+06	1.40E+06	2.96E+06	2.14E+06	1.31E+06
26	8.18E+06	3.32E+06	1.49E+07	8.39E+06	4.55E+06
29	5.40E+07	2.11E+07	1.39E+08	6.41E+07	3.06E+07
33	1.38E+09	4.60E+08	4.35E+09	1.95E+09	1.32E+09
36	1.07E+10	4.52E+09	1.39E+10	8.28E+09	6.10E+09
40	2.92E+10	1.55E+10	2.61E+10	2.13E+10	1.81E+10
44	2.60E+10	3.51E+10	4.68E+10	4.37E+10	5.06E+10

在三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞之2.0 × 10 ⁵(124.3%)及4.0 × 10 ⁴(121.1%) CAR ⁺T細胞劑量群組中觀測到腫瘤生長之抑制及消退；且在8.0 × 10 ³CAR ⁺T細胞之最低劑量下，小鼠顯示輕微的腫瘤生長抑制(5.5%)。與媒劑組相比時，接受2.0 × 10 ⁵CAR ⁺T細胞劑量之第6天之抗CD19/CD20 CAR之小鼠中之腫瘤生長得到控制，其中腫瘤生長抑制係112.5%（表 24 ，表 25）。表 25.腫瘤負荷之對數轉換分析

	G1	G2	G3	G4	G5	G6
第5天	6.80	6.79	6.76	6.75	6.74	6.78
第22天	10.62	10.72	5.83	5.94	10.35	6.30
變化，第5天至第22天	3.82	3.93	−0.93	-0.80	3.61	-0.48
ΔT/ΔC	100.0%	102.9%	−24.3%	−21.1%	94.5%	−12.5%
腫瘤生長抑制，第22天	0.0%	−2.9%	124.3%	121.1%	5.5%	112.5%

腫瘤負荷（藉由BLI量測）進行了log ₁₀標準化，各群組在研究之第5天及第22天之均值示於表 25中。計算第5天至第22天腫瘤BLI之變化，且相對於媒劑組之腫瘤負荷之百分比變化計算為ΔT/ΔC。腫瘤生長抑制定義為(1-[ΔT/ΔC] × 100)且表示相對於對照（亦即，接受媒劑之小鼠[PBS]）之研究小組中之百分比腫瘤體積變化。0%之TGI指示組之平均腫瘤生長與接受媒劑之小鼠中所觀測到之平均腫瘤生長相當，而100% TGI指示在第5天至第22天之間未觀測到腫瘤生長。TGI ＞ 100%指示平均腫瘤負荷自第5天至第22天消退，而TGI ＜ 0指示腫瘤負荷增加大於在接受媒劑之小鼠中所見之增加。

如藉由腫瘤負荷分析所判定，在第22天，用三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞治療之小鼠在所有測試劑量（2.0 × 10 ⁵、4.0 × 10 ⁴、及8.0 × 10 ³CAR ⁺T細胞）下及用第6天之抗CD19/CD20 CAR治療之小鼠在2.0 × 10 ⁵CAR ⁺T細胞下的抗腫瘤功效達成統計顯著性（表 26）。表 26.腫瘤負荷之統計分析，第 22天

治療組	G1	G2	G3	G4	G5	G6
G1		ns	********	********	**	********
G2	ns		********	********	*******	********
G3	********	********		ns	********	********
G4	********	********	ns		********	*******
G5	**	*******	********	********		********
G6	********	********	********	*******	********

在表 26中，使用Tukey後檢定之方差分析，評定第22天Log ₁₀標準化腫瘤BLI數據在所有組中之統計顯著性。比較之間的顯著性，如下所示：ns，P ＞ 0.05；**，P ＜ 0.01；***，P ＜ 0.001；****，P ＜ 0.0001。

與接受媒劑或NTD對照之小鼠相比，用三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞及第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物治療小鼠導致整體存活率(OS)增加。基於由腫瘤負荷＜ 1 × 10 ¹⁰個光子/秒生物發光定義之存活設定點，接受媒劑或NTD對照之所有小鼠分別在第15天或第12天退出研究。在研究終點，用三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞以2.0 × 10 ⁵及4.0 × 10 ⁴CAR ⁺T細胞之最高劑量治療的組分別實現80%及100%存活率。與來自對照組（媒劑及第3天NTD）小鼠相似，用三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞之最低劑量（8.0 × 10 ³CAR ⁺T細胞）治療的小鼠達成12天的中值存活期。在相同劑量之2.0 × 10 ⁵CAR ⁺T細胞下，與用三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞治療之小鼠（未實現中值存活點）相比，接受第6天之抗CD19/CD20 CAR T細胞產物之小鼠具有縮短的中值存活期（36天）。

總之，在Nalm6-luc人類B-ALL異種移植NSG小鼠模型中，用三天過程產生之抗CD19/CD20 CAR T細胞治療顯著延遲了腫瘤生長且增加了存活率。實例 9：使用 3天過程製造之細胞的額外表型表徵

此實例補充了實例3，且提供了與使用3天過程製造之收集的細胞之表型特徵相關之額外資料。

表27及表28展示了使用3天過程製備之細胞的最終產物資料。細胞來源於健康供體材料（新鮮血球分離術或冷凍PBMC；N1-N9）及來源於患者材料（冷凍PBMC；P1-P4）。與Teff/TEMRA及效應記憶(EM)細胞群體相比，最終產物運行展現更高的中央記憶(CM)及幼年細胞之頻率，其指示更多的幼年產物（表27及表28）。表27

	CD3+ T細胞(%)	CD4+ T細胞(%)
	CD4	CD8	CM	幼年	Teff/TEMRA	EM
N1	46.7	49.2	37	56.3	0.29	6.39
N2	49.7	46.8	27.3	63.8	0.89	8.02
N3	32.4	54.1	37.9	53.5	0.6	8.0
N4	66	30.1	44.8	42.9	0.5	11.8
N5	55.7	41.4	52.9	46	0	1
N6	65.1	31.1	37.2	52.8	2.2	7.9
N7	72.9	23.6	56.8	27.2	0.2	15.9
N8	36.3	59.8	58.8	23.8	0.6	16.8
N9	53.5	42.8	24.7	66.3	2.2	6.8
P1	81.6	15.1	58.4	27.3	3.4	10.9
P2	70.8	27.2	53.3	34.3	0.6	11.8
P3	39.5	42.2	84.7	6.2	0.6	8.5
P4	71.2	25.6	84.3	4.1	0.3	11.3

表28

	CD8+ T細胞(%)
	CM	幼年	Teff/TEMRA	EM
N1	67.9	25.6	0.36	6.16
N2	62.2	27.3	2.62	7.9
N3	65.1	19.7	0.7	14.5
N4	54.6	33.1	0.7	11.5
N5	62.5	31.8	3.5	2.3
N6	70.5	9.3	4.4	15.8
N7	62.1	19.1	0.7	18.2
N8	81.5	10.6	0.3	7.6
N9	63.0	28.3	0.7	7.9
P1	71.2	3.2	0.8	24.8
P2	45.4	12.9	0.5	41.2
P3	93.3	0.4	0.3	6.0
P4	65.7	3.6	11.6	19.0

在表27及表28中，縮寫如下：CM，中央記憶；EM，效應記憶；HD，健康供體；TEMRA，終末分化效應記憶T細胞。CD45RA及CCR7用以界定T細胞表型亞群，其包括幼年T細胞（初始，CD45RA+CCR7+）、CM (CD45RA-CCR7+)、EM (CD45RA-CCR7-)、及Teff/TEMRA (CD45RA+CCR7-)

如表27中所示，最終收集的產物中CD4+ CCR7+細胞（亦即CM及幼年細胞）之百分比係收集的CD4+ T細胞群體的至少80%。換言之，最終收集的群體中Teff/TEMRA及EM CD4+細胞之最大百分比係約20%。因此，收集的群體中CD4+ CCR7+細胞之數量係Teff/TEMRA及EM CD4+細胞的至少4倍。

如表28中所示，最終收集的產物中CD8+ CCR7+細胞（亦即CM及幼年細胞）之百分比係收集的CD8+ T細胞群體的至少約60%。換言之，最終收集的群體中Teff/TEMRA及EM CD8+細胞之最大百分比係約40%。因此，收集的群體中CD8+ CCR7+細胞之數量係Teff/TEMRA及EM CD8+細胞的至少1.5倍。實例 10：藉由三天過程製備之細胞之表徵

此實例描述了與第8天收集的抗CLL-1 CAR T細胞相比，第3天收集的抗CLL-1 CAR T細胞之功能及表型表徵。此實例中所述之抗CLL-1 CAR T細胞係藉由如實例7中所述之類似方法產生。

簡言之，選自健康人類供體之T細胞在第0天活化且使用編碼抗CLL-1 CAR之慢病毒載體在第1天轉導。隨後在第3天收集經轉導之細胞。另一組抗CLL-1 CAR T細胞係由來自同一供體之T細胞製造，但在第8天收集。隨後，兩種CAR T細胞產物均功能性地表徵，且與其等各別NTD對照T細胞進行比較（第3天之NTD及第8天之NTD）。

本實例中所述之研究之實驗組示於表 29中。表 29.實驗組

組	初代細胞
1	第3天之抗CLL-1 CAR
2	第3天之NTD
3	第8天之抗CLL-1 CAR
4	第8天之NTD

評定第3天及第8天收集之抗CLL-1 CAR T細胞之CAR細胞表面表現以建立CAR轉導效率。CAR表現在第3天及第8天收集之彼等CAR表現相當。第3天收集之抗CLL-1 CAR T細胞之抗CLL-1 CAR表現係60.4%，且第8天收集之抗CLL-1 CAR T細胞之表現係78.9%。

藉由流式細胞術進行CAR T細胞產物之表型表徵。第3天收集之抗CLL-1 CAR T細胞展示出幼年T細胞特徵增加，第3天收集時CD45RA ⁺CCR7 ⁺細胞係83.7%，而在第8天收集時CD45RA ⁺CCR7 ⁺係23%。

與在第8天收集之抗CLL-1 CAR T細胞相比，第3天收集之抗CLL-1 CAR T細胞顯示出增加的CD4+細胞，如表 30中所示。表30：CD4+及CD8+之百分比

	CD4+	CD8+
G1	85.7	12.1
G2	87.6	10.8
G3	39	59.6
G4	34.5	64.4

在與抗原陽性目標細胞之共培養檢定中評定CAR T細胞產物之功能。NTD T細胞產物作為對照包括在實驗中。細胞毒性係在T細胞產物開始共培養後1天及4天測量。使用1:1至1:3之E:T比。使用MV4-11（CLL-1中等表現）及Kasumi-1（CLL-1極低表現）細胞系。

與第8天收集之抗CLL-1 CAR T細胞相比，第3天收集之抗CLL-1 CAR T細胞展示出對Kasumi-1細胞之增加的體外細胞毒性（表 30A 至表 30B）。第3天及第8天收集之抗CLL-1 CAR T細胞展示出對MV4-11細胞之相當的體外細胞毒性（表 30C 至表 30D）。表 30A. Kasumi-1 24 hr細胞毒性（細胞毒性 %； n=3）

ET_ 比率	G1	G3	G2	G4
	均值	SD	均值	SD	均值	SD	均值	SD
1:3	31.39755	7.237829	5.72886	0.190338	10.74357	10.65613	-1.74482	1.001606
1:1	31.1249	8.885557	1.456459	2.737722	19.24212	14.33823	-14.8815	2.310444

表 30B. Kasumi-1 96 hr細胞毒性（細胞毒性 %； n=3）

ET_ 比率	G1	G3	G2	G4
	均值	SD	均值	SD	均值	SD	均值	SD
1:3	52.72296	5.543031	61.92385	2.352123	16.17232	3.449642	7.881773	1.533963
1:1	71.15299	3.609597			51.42474	4.706712	45.29149	1.63592

表 30C. MV4-11 24 hr細胞毒性（細胞毒性 %； n=3）

ET_ 比率	G1	G3	G2	G4
	均值	SD	均值	SD	均值	SD	均值	SD
1:3	50.36574	13.43492	28.20413	0.961508	0.635403	5.109987	-10.2269	1.117845
1:1	62.16195	4.45965	54.16878	0.382472	18.13723	12.05343	-14.0123	1.843203

表 30D. MV4-11 96 hr細胞毒性（細胞毒性 %； n=3）

ET_ 比率	G1	G3	G2	G4
	均值	SD	均值	SD	均值	SD	均值	SD
1:3	91.10783	3.76045			19.22778	1.837575	10.31388	1.704941
1:1	89.19031	3.246625	99.74822	0.031169	16.87958	0.044702	13.43041	2.969454

實例 11：藉由 3天過程製備之細胞之進一步表徵

在此實例中，報導了使用類似於上述實例3中所述之3天過程所產生之細胞的表型特徵。在此實例中，使用慢病毒載體以遞送CAR。

首先，如表31中所示，與自7天過程收集之細胞相比，自3天過程產生之收集的細胞具有更大的CD4/CD8比。表31揭示了來自每個鑑別組4個個別樣本之值。表31.與自7天過程收集之細胞相比，自3天過程產生之細胞具有更大的CD4/CD8比。（NTD=未轉導之對照）

組	樣本	CD4/CD8比率
3天 NTD對照 (n=4)	1	20.50438596
2	8.466019417
3	4.174863388
4	6.453125
7天 NTD對照 (n=4)	1	3.143459916
2	1.809798271
3	1.063965885
4	2.210702341
3天細胞 (n=4)	1	12.86956522
2	7.016949153
3	4.2
4	6.373015873
7天細胞 (n=4)	1	2.590405904
2	2.105769231
3	1.023255814
4	2.022151899

其次，如表32中所示，與自7天過程收集之細胞相比，自3天過程產生之收集的細胞具有更大的CD45RA+CCR7+細胞及CD45RA-CCR7-細胞之百分比。表32揭示了來自每個鑑別組4個個別樣本之值。（NTD=未轉導之對照）表 32. CD45RA+CCR7+細胞及 CD45RA-CCR7-細胞在來自 3天過程的收集的細胞中更豐富

		活CD3 T細胞之平均%
組	樣本	CD45RA+CCR7+細胞	CD45RA-CCR7-細胞
3天 NTD對照 (n=4)	1	61.9	33.8
2	47.1	47.3
3	69	2.45
4	32.9	26.7
7天 NTD對照 (n=4)	1	36.5	21.4
2	30.8	25.6
3	17.8	0.19
4	5.49	10.2
3天細胞 (n=4)	1	58	34.3
2	33.4	55.8
3	70	3.15
4	28.9	28
7天細胞 (n=4)	1	26.9	24.8
2	20	33.2
3	16	0.12
4	3.31	8.81

其次，如表33中所示，與自7天過程收集之細胞相比，自3天過程產生之收集的細胞具有更大的Tscm細胞(CD27+CD28+CD45RA+CCR7+)之百分比。表33揭示了來自每個鑑別組4個個別樣本之值。表 33.與自 7天過程收集之細胞相比，來自 3天過程之細胞具有更大的 Tscm細胞百分比

組	樣本	活 CD3 T細胞之平均 %(CD27+CD28+CD45RA+CCR7+CD62L+)
3天陰性對照 (n=4)	1	54.7
2	41
3	49.1
4	26.2
7天陰性對照 (n=4)	1	25.9
2	26.5
3	9.93
4	2.94
3天細胞 (n=4)	1	27.5
2	17.6
3	26.7
4	11.9
7天細胞 (n=4)	1	3.98
2	6.79
3	3.94
4	0.77

最後，如表34中所示，與自7天過程收集之細胞相比，自3天過程產生之收集的細胞具有更低的終末分化T細胞(CD45RA+CCR7-CD27-CD28-)之百分比。表34揭示了來自每個鑑別組4個個別樣本之值。表 34.與自 7天過程收集之細胞相比，來自 3天過程之細胞具有更低的終末分化 T細胞百分比。

組	樣本	活 CD3 T細胞之平均 %(CD45RA+CCR7-CD27-CD28-CD62L-)
3天陰性對照 (n=4)	1	0.068
2	0.17
3	0.5
4	0.32
7天陰性對照 (n=4)	1	0.41
2	0.33
3	3.13
4	0.28
3天細胞 (n=4)	1	0.28
2	0.49
3	1.19
4	0.58
7天細胞 (n=4)	1	0.73
2	0.29
3	4.08
4	0.32

比較了在第1天或第2天藉由具有慢病毒轉導步驟之過程產生的抗CD19/CD20 CAR T細胞之表型及功能特徵。在兩種過程中，在第0天發生T細胞選擇及活化。藉由偵測抗CD19 CAR抗體來測量CAR表現。表 35展示了轉導的T細胞在第1天及第2天在第3天至第8天收集之細胞中的CAR表現。表 35：具有 CAR+表現之 CD3 T細胞之百分比

	第1天之轉導	第2天之轉導
在第3天收集	57.7	48.6
在第4天收集	63.2	48.3
在第6天收集	80.3	53.1
在第8天收集	77.3	45.2

在第1天及第2天測量經轉導之抗CD19/CD20 CAR T細胞之CD27+CD28+CD45RA+CCR7+CD62L+的T細胞亞群。表 36展示了藉由各方法產生之幼年CAR+ T細胞的百分比。表 36： CAR+細胞中 CD27+CD28+CD45RA+CCR7+CD62L+之百分比

	第1天之轉導	第2天之轉導
在第0天收集	52.5	52.5
在第3天收集	46.9	43.6
在第4天收集	24.9	23.8
在第6天收集	14.4	22.5
在第8天收集	15.6	23.8

表36中之第0天樣本係總T細胞。

在第1天(T-D1)或第2天(T-D2)轉導之抗CD19/CD20 CAR T細胞中比較細胞毒性之功能檢定。表 37展示了在第3、4、6、及8天（分別H-D3、H-D4、H-D6、及H-D8）收集時三種目標細胞系（Nalm 6 WT、Raji WT、及Nalm 6 CD19 KO）中具有1:3之E:T的24小時細胞毒性檢定之結果。表 37： 24小時細胞毒性檢定（殺傷之 %）， E:T = 1:3

	Nalm6 WT	Raji WT	Nalm6 CD19 KO
	T-D1	T-D2	T-D1	T-D2	T-D1	T-D2
H-D3	72.9	70.0	41.6	41.2	12.6	6.9
H-D4	65.9	60.9	36.3	29.2	2.9	-3.5
H-D6	75.7	72.0	48.4	49.6	-9.0	-11.0
H-D8	87.3	77.5	61.3	48.4	1.6	-7.7

***

雖然已描述數個實施例，但顯然本揭露及實例可提供利用本文所述之組成物及方法或由本文所述之組成物及方法涵蓋之其他實施例。因此，將理解的是，其範圍由可自本揭露及隨附申請專利範圍中理解的內容所界定，而非由以實例之方式表示之實施例所界定。

無

Claims

一種製備經轉導淋巴球的方法，其包含：將自供體對象獲得的包含淋巴球之樣本與多核苷酸載體一起培養，以轉導該等淋巴球來產生經轉導之淋巴球；及培養包含該等經轉導之淋巴球之樣本少於72小時，之後收集該等淋巴球以產生收集的樣本。
如請求項1之方法，其中將該等經轉導之淋巴球培養少於48小時，之後收集。
如請求項1之方法，其中將該等經轉導之淋巴球培養少於36小時，之後收集。
如前述請求項中任一項之方法，其中該培養係在封閉系統中進行。
如請求項4之方法，其中該封閉系統之內表面積為至少1500 cm ²。
如請求項4或5之方法，其中該封閉系統具有塗覆有重組人類纖連蛋白之內表面，其中該塗覆係以包含約1至10 µg/ml之該重組人類纖連蛋白之溶液進行。
如請求項6之方法，其中該內表面進一步與包含該多核苷酸載體之第二溶液接觸，其中該第二溶液之體積為約200 mL。
如請求項7之方法，其中該塗覆進一步包含該第二溶液之引流。
如請求項4至8中任一項之方法，其中該封閉系統中之該樣本包含至少1.5 × 10 ⁸個淋巴球。
如請求項8之方法，其中該樣本包含至少4 × 10 ⁸個淋巴球。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該等淋巴球係周邊血液單核細胞(PBMC)或T細胞。
如前述請求項中任一項之方法，其中該收集的樣本包含CD3+細胞。
如請求項12之方法，其中該收集的樣本包含CD4+及CD8+ T細胞。
如請求項13之方法，其中至少20%之該等CD4+ T細胞係初始T細胞，且不大於12%之該等CD4+ T細胞係效應記憶T細胞。
如請求項14之方法，其中至少25%之該等CD4+ T細胞係初始T細胞，且不大於9%之該等CD4+ T細胞係效應記憶T細胞。
如請求項13至15中任一項之方法，其中至少10%之該等CD8+ T細胞係初始T細胞，且不大於30%之該等CD8+ T細胞係效應記憶T細胞。
如請求項16之方法，其中至少20%之該等CD8+ T細胞係初始T細胞，且不大於20%之該等CD8+ T細胞係效應記憶T細胞。
如請求項13至17中任一項之方法，其中該等初始T細胞表徵為CCR7+及CD45RA+。
如請求項13至18中任一項之方法，其中該等效應記憶T細胞表徵為CCR7-、CD45RO+、及CD95+。
如請求項13之方法，其中至少80%之該等CD4+ T細胞係CCR7+細胞。
如請求項13之方法，其中至少60%之該等CD8+ T細胞係CCR7+細胞。
如請求項13之方法，其中至多20%之該等CD4+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。
如請求項13之方法，其中至多40%之該等CD8+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。
如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含自該供體對象取得該等淋巴球或富集該等淋巴球。
如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含使該樣本與淋巴球刺激劑接觸以活化該等淋巴球。
如請求項25之方法，其中活化該樣本係在將該樣本與該多核苷酸載體一起培養之前。
如請求項26之方法，其中該樣本包含至少1 × 10 ⁹個淋巴球。
如請求項25之方法，其中活化該樣本係在將該樣本與該多核苷酸載體一起培養之後。
如請求項25至28中任一項之方法，其中該淋巴球刺激劑包含抗CD3抗體及/或抗CD28抗體。
如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含在收集之後，向對象投予該等收集的淋巴球或冷凍該等收集的淋巴球。
如請求項30之方法，其中該對象與該供體對象相同。
如請求項30或31之方法，其中向該對象投予每公斤該對象總計10,000至1,000,000個收集的淋巴球。 [請求項32] 如請求項28之方法，其中向該對象投予每公斤該對象總計20,000至400,000個收集的淋巴球。
如請求項28或29之方法，其中至少15%之該等收集的淋巴球係用該載體轉導。
如前述請求項中任一項之方法，其中該多核苷酸載體係病毒載體。
如請求項31之方法，其中該病毒載體係反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
如前述請求項中任一項之方法，其中該載體編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
如請求項33之方法，其中該CAR包含胞內共刺激域。
如請求項34之方法，其中該胞內共刺激域係選自由下列所組成之群組的蛋白質的信號傳導區：DAP-10、CD28、OX-40、4-1BB (CD137)、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1 (PD-1)、可誘導T細胞共刺激分子(ICOS)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1，CD11a/CD18)、CD3γ、CD3 δ、CD3ε、CD247、CD276 (B7-H3)、腫瘤壞死因子超家族成員14 (TNFSF14，LIGHT)、NKG2C、Igα (CD79a)、Fcγ受體、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、CDS、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD (CD11d)、ITGAE (CD103)、ITGAL (CD11a)、ITGAM (CD11b)、ITGAX (CD11c)、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE (RANKL)、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG (Cbp)、CD19a、與CD83特異性結合之配體、及其組合。
如請求項38之方法，其中該胞內共刺激域係CD28之信號傳導區。
如請求項36至38中任一項之方法，其中該CAR識別腫瘤抗原。
如請求項40之方法，其中該腫瘤抗原係CD19、CD20、及/或CLL-1。
如請求項39之方法，其中包含該CAR之該淋巴球係西卡思羅(axicabtagene ciloleucel)或布萊奧妥(brexucabtagene autoleucel)。
一種由供體對象之血液樣本製備之細胞群體，其包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞，其中：至少20%之CD4+ T細胞係初始T細胞，且不大於12%之CD4+ T細胞係效應記憶T細胞；至少10%之CD8+ T細胞係初始T細胞，且不大於30%之CD8+ T細胞係效應記憶T細胞；至少50%之該等細胞係CD3+ T細胞；及至少25%之所有T細胞均經編碼CAR或TCR之多核苷酸載體轉導。
如請求項43之群體，其中至少25%之該等CD4+ T細胞係初始T細胞，且不大於9%之該等CD4+ T細胞係效應記憶T細胞。
如請求項43或44之群體，其中至少20%之該等CD8+ T細胞係初始T細胞，且不大於20%之該等CD8+ T細胞係效應記憶T細胞。
如請求項43至45中任一項之群體，其中該等初始T細胞表徵為CCR7+及CD45RA+。
如請求項43至46中任一項之群體，其中該等效應記憶T細胞表徵為CCR7-、CD45RO+、及CD95+。
如請求項43至47中任一項之群體，其中至少65%之該等細胞係CD3+ T細胞。
如請求項43至48中任一項之群體，其中至少15%之所有T細胞經該多核苷酸載體轉導。
如請求項43至48中任一項之群體，其中該多核苷酸載體係病毒載體。
如請求項48之群體，其中該病毒載體係反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
如請求項43至51中任一項之群體，其中該CAR包含胞內共刺激域。
如請求項52之群體，其中該胞內共刺激域係CD28之信號傳導區。
如請求項43至53中任一項之群體，其中該CAR識別腫瘤抗原。
如請求項54之群體，其中該腫瘤抗原係CD19或CD20。
如請求項53之群體，其中包含該CAR之該細胞群體係西卡思羅(axicabtagene ciloleucel)或布萊奧妥(brexucabtagene autoleucel)。
一種由供體對象之血液樣本製備之細胞群體，其包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞，其中：至少80%之CD4+ T細胞係CCR7+細胞；至少60%之CD8+ T細胞係CCR7+細胞；至多20%之CD4+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合；及至多40%之該等CD8+ T細胞係效應記憶T細胞及效應T細胞之組合。
一種醫藥組成物，其包含如請求項43至57中任一項之細胞群體。
一種用於向對象投予T細胞之方法，其包含向該對象注射藉由如請求項1至42中任一項之方法製備的收集的樣本，或如請求項58之醫藥組成物。
如請求項59之方法，其中該對象患有癌症。
如請求項59之方法，其中該癌症係B細胞惡性疾病。
如請求項60之方法，其中該癌症係非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、彌漫型大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴球淋巴瘤(SLL/CLL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、結外（MALT淋巴瘤）、結型（單核細胞樣B細胞淋巴瘤）、脾彌漫型大細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病/淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、急性骨髓性白血病、或多發性骨髓瘤。