TW202346356A - 抗cd3抗體、其製備方法及應用 - Google Patents
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Abstract
本發明公開了一種抗CD3抗體、其製備方法及應用。所述抗CD3抗體包括輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述輕鏈可變區包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包括HCDR1、HCDR2和HCDR3。所述抗CD3抗體具有較高的與人CD3結合的活性，可直接激活CD3下游的信號通路，活化T細胞，且對猴PBMC有結合活性，具有和猴CD3交叉反應性；本發明的抗CD3抗體可作為CD3-TAA（腫瘤相關抗原）類型雙抗的CD3端抗體的一個選擇。
Description
本發明涉及抗體領域，具體涉及一種抗CD3抗體、其製備方法及應用。
本申請要求申請日為2022/3/23的中國專利申請2022102940270的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
CD3有四個亞基CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ，分別組成ε γ、ε δ和ζ ζ三種二聚體，與TCR-αβ形成TCR-CD3複合物，胞內端有ITAM區域（免疫受體酪胺酸激活基序），表達在T細胞上，抗原-MHC複合物結合TCR後，可通過CD3介導的信號傳導活化T細胞，殺傷腫瘤細胞或感染外來物質的細胞。
CD3抗體識別所有T細胞，它和70%-80%的人外周血淋巴細胞和65%-85%的胸腺細胞發生反應。CD3抗體激活後的T細胞定向至腫瘤細胞周圍，兩種細胞接觸進而形成突觸，觸發T細胞受體（TCR）信號通路的激活，顆粒酶表達、釋放進而引起腫瘤細胞膜穿孔，導致後者的溶胞和凋亡。TCR信號通路的激活同時引起一系列細胞因數的表達與釋放，例如IL-2的釋放回饋刺激T細胞的增殖，放大免疫殺傷效應。臨床前研究資料證明，在靶細胞存在下，雙特異性抗體分子可有效激活T細胞，並刺激其增殖，同時引起靶細胞的死亡。
Jurkat細胞是人白血病T淋巴細胞，表達CD3/TCR複合物，由其發展而成的過表達報告基因元件的工程細胞株可通過檢測報告基因下游luciferase酶信號的激活程度來確認Jurkat細胞可否被CD3抗體激活。
現有技術中缺乏能與猴CD3交叉反應的抗CD3抗體，僅能結合人CD3的抗體的研發便利性較低；同時缺乏結合活性和活化PBMC活性多樣的抗CD3抗體，不利於抗CD3雙抗的進一步研發。現有技術中，大多數抗體雖然和人CD3結合，但和靈長類動物猴CD3不結合，無法使用靈長類動物來評估抗體藥的安全性。
針對現有技術中缺乏能與猴CD3交叉反應的抗CD3抗體，且現有抗CD3抗體結合活性和活化PBMC活性多樣性低的缺陷，本發明提供了一種抗CD3抗體、其製備方法、含其的藥物組合物、含其的檢測試劑、含其的套裝藥盒及其應用。本發明所述抗CD3抗體具有較高的與人CD3結合的活性，可直接激活CD3下游的信號通路，活化T細胞，且對猴PBMC有結合活性，具有和猴CD3交叉反應性；本發明的抗CD3抗體可作為CD3-TAA（腫瘤相關抗原）類型雙抗的CD3端抗體的一個選擇。
為解決上述技術問題，本發明提供了一種抗CD3抗體，所述抗CD3抗體包括輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述輕鏈可變區包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 1、4或5所示的胺基酸序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列，所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列。CDR序列見下表1：
表1 CDR序列資訊
| LCDR1 | SEQ ID NO: | LCDR2 | SEQ ID NO: | LCDR3 | SEQ ID NO: |
| KSSQSLFNSRTRKNYLA | 1 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| KSSQSLFQSRTRKNYLA | 4 | ||||
| KSSQSLFSSRTRKNYLA | 5 | ||||
| HCDR1 | SEQ ID NO: | HCDR2 | SEQ ID NO: | HCDR3 | SEQ ID NO: |
| GYTFTDY | 6 | YPGEDT | 7 | NNNYYFDY | 8 |
在本發明一較佳實施方案中，所述VL包含如SEQ ID NO: 10-15任一所示的胺基酸序列。
在本發明一較佳實施方案中，所述VH包含如SEQ ID NO: 17-19任一所示的胺基酸序列。
在本發明一具體實施方案中，所述VL包含如SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 17所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列。
在本申請中，上述所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的（本發明的請求項中也是按照Chothia定義規則所示出的序列）。但是，本發明所屬領域中具通常知識者公知，在本領域中可以通過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則（參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州（1991））和基於結構環區域位置的Chothia定義規則（參見JMol Biol 273:927-48,1997）。
較佳地，所述的抗CD3抗體滿足以下二項中至少一項：
（1）所述抗CD3抗體為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)
2或Fv，所述Fv優選為scFv；
（2）所述抗CD3抗體為由第（1）項中所述抗CD3抗體制得的單株抗體或多克隆抗體。
在本發明一較佳實施方案中，所述的抗CD3抗體為全長抗體，所述全長抗體包括輕鏈和重鏈；所述輕鏈包括輕鏈恆定區（CL），所述抗體輕鏈恆定區優選為人源抗體輕鏈恆定區或鼠源抗體輕鏈恆定區，所述人源抗體輕鏈恆定區更優選為κ亞型的輕鏈恆定區；所述重鏈包括重鏈恆定區（CH），所述抗體重鏈恆定區優選為人源或鼠源抗體重鏈恆定區，更優選為hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4亞型的重鏈恆定區，進一步優選為hIgG1亞型的重鏈恆定區。
在本發明一更佳實施方案中，所述人源抗體輕鏈恆定區包括如SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列，且所述人源抗體重鏈恆定區包括如SEQ ID NO: 21所示的胺基酸序列。
在本發明一較佳實施方案中，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 23-28所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 30-32任一所示的胺基酸序列。
更佳地，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 23所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 30所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 27所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 27所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 31所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 26所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 26所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 31所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 24所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 25所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 28所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 31所示的胺基酸序列。
在本發明的抗體或其抗原結合片段包含與所述抗體或其抗原結合片段具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。這種同源性可由本領域已知的方法進行序列比較和/或比對來確定。例如，序列比對演算法BLAST或手動比對可以測定序列同一性或同源性。
本發明某一方面還提供了一種分離的核酸，其編碼如本發明所述的抗CD3抗體。
本發明某一方面還提供了一種重組表達載體，其包含如本發明所述的分離的核酸。較佳地，所述重組表達載體包含真核細胞表達載體和/或原核細胞表達載體。更佳地，所述真核細胞表達載體為pcDNA3.4。
本發明某一方面還提供了一種轉化體，其包含如本發明所述的重組表達載體。較佳地，所述轉化體的宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞優選為
E. coli細胞，所述真核細胞優選為Expi293F細胞或CHO細胞。
本發明某一方面還提供了一種如本發明所述的抗CD3抗體的製備方法，其包括以下步驟：培養如本發明所述的轉化體，從培養物中獲得所述抗CD3抗體。
本發明某一方面還提供了一種藥物組合物，其包含如本發明所述的抗CD3抗體，以及藥學上可接受的載體和/或藥學上可接受的佐劑。
本發明某一方面還提供了一種檢測試劑，其包含如本發明所述的抗CD3抗體。較佳地，所述檢測試劑為液體劑型、氣體劑型、固體劑型和半固體劑型。更佳地，所述檢測試劑還包括二抗、CD3或其衍生物，所述二抗例如抗人IgG的抗體偶聯山葵過氧化氫酶和抗人IgG的抗體偶聯生物素蛋白。
本發明某一方面還提供了一種套裝藥盒，其包含藥盒A，所述藥盒A含有如本發明所述的抗CD3抗體、如本發明所述的藥物組合物和如本發明所述的檢測試劑中的一種或多種。
較佳地，所述套裝藥盒還包括藥盒B，所述藥盒B含有其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組合物，和/或由激素製劑、靶向小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的激活劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
本發明某一方面還提供了如本發明所述的抗CD3抗體、如本發明所述的藥物組合物、如本發明所述的檢測試劑和/或如本發明所述的套裝藥盒在製備診斷、預防和/或治療CD3相關疾病的藥物中的應用。較佳地，所述CD3相關疾病為CD3相關腫瘤。
本發明某一方面還提供了一種檢測樣品中CD3的方法，其包括使用如本發明所述的抗CD3抗體或如本發明所述的檢測試劑與所述樣品接觸的步驟。較佳地，所述方法為非診斷和/或治療目的。所述樣品例如血液樣本（例如全血樣本和血清樣本）、包含CD3的試劑、含CD3的抗體藥物偶聯物或含CD3的嵌合抗原受體細胞。
本發明還提供了一種抗體組合，其中包括如本發明所述的抗CD3抗體。
本發明的抗體可利用該領域廣為周知的技術製備，例如雜交瘤方法、重組DNA技術、噬菌體展示技術、合成技術或該等技術的組合、或該領域己知的其它技術。
術語
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域中具通常知識者通常所理解的相同的含義。
本發明中，術語「一種」和「所述」通常包括多個指示物。
本文所述的「抗體分子」或「抗體」是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結合抗原的抗原結合位點的分子。因此，術語「抗體」不僅涵蓋完整抗體分子，還包括所述抗體的片段以及所述抗體和抗體片段的變體（包括衍生物）。在本文中所述術語“抗體分子”例如包括但非限於單鏈Fv（scFv），Fab片段，Fab’片段，F(ab’)
2，二硫鍵連接的Fv（sdFv），Fv，及完整抗體或全長抗體。術語「單鏈Fv」或「scFv」是指一種多肽，其包含與抗體VH結構域連接的抗體的VL結構域。免疫特異性結合CD3的抗體可以與其它抗原發生交叉反應。優選地，免疫特異性結合CD3的抗體與其它抗原不發生交叉反應。免疫特異性結合CD3的抗體可以例如通過免疫測定或其它本領域技術人員已知的方法鑒別。「完整抗體」或「全長抗體」指包含兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）的蛋白，所述重鏈和輕鏈通過二硫鍵相互連接，所述蛋白包含：（1）就重鏈而言，包含重鏈可變區（本文縮寫為「VH」）和含有三個結構域CH1、CH2、CH3的重鏈恆定區；和（2）就輕鏈而言，包含輕鏈可變區（本文縮寫為「VL」）和含有一個結構域CL的輕鏈恆定區。VH和VL可進一步再分為高變區，稱為互補決定區（CDR），CDR散佈在被稱為框架區（FR）的更加保守的區域中。每個VH和VL均由三個CDR和四個FR組成，它們從胺基端向羧基端以如下順序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4。VH和VL含有可與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因數的結合，該宿主組織或因數包括免疫系統的各種細胞（例如效應細胞）和經典補體系統的成分。本發明的抗體包括但非限於單特異性、多特異性、人或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)片段、抗獨特型（抗-Id）抗體（包括例如本發明抗體的抗-Id抗體）和上述任何抗體的表位結合片段。本發明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白的任何類型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY），類別（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亞類。本發明的抗體可為一種單株抗體或者多克隆抗體，所述的單株抗體優選鼠抗人單株抗體。
本發明中，術語「抗CD3抗體」表示所述抗體可與CD3特異性結合。「特異性結合」通常是指可測量且可再現的相互作用。例如抗原和抗體之間的結合，抗體通過其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。例如，特異性結合靶物（其可以是表位）的抗體是以比其結合其它靶物更高的親和力、親合力、更容易和/或以更長的持續時間結合此靶物的抗體。當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言更容易通過其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為「特異性結合」該抗原。
本發明中，術語「CD3」為CD3蛋白。所述CD3蛋白有四個亞基：CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ，分別組成ε γ、ε δ和ζ ζ三種二聚體，與TCR-αβ形成TCR-CD3複合物，胞內端有ITAM區域（免疫受體酪胺酸激活基序），表達在T細胞上，抗原-MHC複合物結合TCR後，可通過CD3介導的信號傳導活化T細胞，殺傷腫瘤細胞或感染外來物質的細胞。
本發明中，術語「可變區」（也稱「可變結構域」）通常是指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。重鏈和輕鏈可變區可以分別稱為「VH」和「VL」。這些結構域通常是抗體中最可變的部分並且含有抗原結合位元點。然而，可變性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中，它集中在VH和VL中的三個區段，所述三個區段被稱為高變區（HVR）或被稱為互補決定區（CDR），分別為LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。可變結構域中更高度保守的部分被稱為框架區（FR）。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區：HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，大部分採用β-折疊構型，通過三個CDR結構環區連接。每條鏈中的CDR通過FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。
在本領域中，可以通過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則、基於結構環區域位置的Chothia定義規則和基於IMGT本體論（IMGT-ONTOLOGY）的概念。本發明中，抗CD3抗體的VL和VH的胺基酸序列按Chothia編碼規則進行編碼，所述抗CD3抗體的LCDR1-3和HCDR1-3按Chothia定義。
本發明中，術語「單株抗體」通常是指從一群基本上同質的抗體中獲得的抗體，即集群中的抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。
在本發明中，術語「全人源抗體」或「人抗體」通常是指抗體所有部分（包括抗體的可變區和恆定區）均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體部分對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術、核糖體展示技術等。
本發明中，術語「分離的」通常是指大體上不含其天然存在的環境中通常伴隨或與之相互作用的組分（例如病毒、核酸或蛋白質）。本發明中，術語「分離的核酸分子」通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
如本領域已知，在本發明中可交換使用的「多核苷酸」或「核酸」是指任何長度的核苷酸鏈，並且包括DNA和RNA。核苷酸可以是去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或它們的類似物、或者能夠通過DNA或RNA聚合酶摻入鏈的任何底物。
本發明中，術語「表達載體」通常是指能夠轉運與它連接的另一個核酸分子，並在合適的宿主中自我複製的核酸分子。表達載體包括任何遺傳元件，例如質體、轉座子、人工染色體和病毒等，其在與適當的控制元件組合時能夠進行自我複製並且將基因序列轉移到宿主或宿主之間。所述表達載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。所述表達載體還包括具有多種上述功能的載體。所述表達載體還可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，通過培養包含所述表達載體的宿主細胞，所述表達載體可以產生期望的表達產物。表達載體的實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質體、黏粒或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑相關的DNA或RNA表達載體、包囊化於脂質體中的DNA或RNA表達載體以及某些真核細胞，例如生產細胞。
在本發明中術語「宿主細胞」可包括已經引入外源性核酸的細胞，包括這些細胞的子代。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化的細胞」，其包括原代轉化細胞以及由此來源的子代，而不考慮傳代次數。子代在核酸含量上與親代細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本發明包括與在初始轉化的細胞中篩選或選擇的細胞具有相同功能或生物學活性的突變子代。
在本發明中「K
D」、「K
D 」或「KD」可互換使用，本發明中使用的「KD」是解離速率常數（kdis，也稱為「解離率（off-rate）（koff）」或「kd」）與結合速率常數（kon，也稱為「結合率（kon）」或「ka」）的比值。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知的，包括但不限於生物膜干涉技術（BLI）、放射免疫法（RIA）、平衡透析法、表面等離子共振（SPR）、螢光共振能量遷移（FRET）、免疫共沉澱（Co-IP）以及蛋白質晶片技術。如果在不同的條件（例如鹽濃度、pH下測量），則所測得的某種特定蛋白-蛋白相互作用的親和力可不同。
本發明所述的「藥學上可接受的佐劑」包括但不限於表面活性劑、溶液穩定劑、等滲調節劑或緩衝液中的一種或其組合。其中，表面活性劑包括但不限於非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐溫20或吐溫80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸鈉（SDS）；月桂硫酸鈉；十四烷基或十八烷基肌胺酸等，其加入量應使結合人Ang2的抗體或其抗原結合片段的顆粒化趨勢最小。溶液穩定劑包括但不限於糖類，例如還原性糖或非還原性糖；胺基酸類，例如麩胺酸鈉或組胺酸；醇類，例如三元醇、丙二醇或聚乙二醇；溶液穩定劑的加入量應使最後形成的製劑在本發明所屬領域中具通常知識者認為達到穩定的時間內保持穩定的狀態。等滲調節劑包括但不限於氯化鈉、甘露醇或其組合。緩衝液包括但不限於Tris、組胺酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液或其組合。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明提供的抗CD3抗體除與人CD3的結合活性高外，均表現與猴PBMC的結合活性，具有猴CD3交叉反應性，為評估抗研究體的安全性研究帶來便利，便於後續開發；且所述抗CD3抗體表現出多樣性的結合和活化PBMC的活性，為後續雙抗的開發和研究提供便利。
下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實施例1雜交瘤技術篩選抗CD3抗體
用CD3抗原（包括蛋白和過表達CD3抗原的細胞株）分別免疫Balb/c、SD小鼠（購自北京維通利華）3-4次，3-5×10
6細胞或25-50 μg蛋白/只。依照常規方法進行PEG融合或者電融合後，將融合後的細胞加入96孔細胞培養板內，置CO
2培養箱內培養9-10天。用流式檢測96孔細胞培養板中的雜交瘤上清對Jurkat細胞的結合活性。陽性的雜交瘤上清對應的細胞克隆轉至24孔細胞培養板繼續培養2-4天后，24孔細胞培養板中的雜交瘤上清用於確認與Jurkat細胞的結合活性。從24孔細胞培養板中挑取陽性細胞進行亞克隆及亞克隆篩選，直至得到穩定的可分泌結合Jurkat細胞的雜交瘤單株抗體細胞株若干。並採用常規無血清培養基進行50毫升小規模生產，常規protein A柱純化得到純化單株抗體做後續鑒定。
實施例2 雜交瘤抗體測序和嵌合抗體表達
培養雜交瘤單克隆細胞株，離心收集5×10
6個雜交瘤細胞，常規Trizol法（Thermofisher，15596026）提取總RNA，逆轉錄反應後得到的cDNA通過末端轉移酶進行加G反應，後用VH、VK引子和polyC引子擴增含可變區序列的DNA，做TA克隆，測序後得鼠源雜交瘤克隆10E1C11的可變區序列如下表2：
表2 鼠源雜交瘤克隆10E1C11抗體的輕重鏈可變區序列
單株抗體輕重鏈蛋白質序列分別進行密碼子優化，基因合成密碼子優化後DNA片段，克隆合成後基因片段到表達載體pcDNA3.4 (Life Technologies)。表達質體擴增和質體抽提後雙質體共轉Expi293F (ThermoFisher Scientific，A14527)或CHO-K1細胞（ECACC catalogue no. 85051005），根據供應商Expi293F或CHO-K1表達系統方法進行抗體瞬轉表達，上清離心後經protein A柱按常規方法純化。
| 雜交瘤克隆 | SEQ ID NO: | 可變區序列 |
| 10E1C11 VH | 17 | QVQLQQSGLELVKPGAAVKMSCTASGYTFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGEDTSKYNEKFKAKTSLTADKSSSTAYMLLNSLTSEDSAIYFCVRNNNYYFDYWGQGTTLTVSS |
| 10E1C11 VL | 10 | DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQAEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKLESK |
實施例3 雜交瘤抗CD3抗體流式結合Jurkat細胞和猴PBMC細胞
用FACS鑒定鼠抗人CD3單株抗體10E1C11結合Jurkat細胞和猴PBMC細胞的活性。將Jurkat細胞（ATCC，TIB-152）在T175細胞培養瓶中培養至密度為1E6/mL，取出所需數量的細胞，300×g離心5分鐘，棄上清，用FACS緩衝液（含有2% FBS的PBS）（FBS: ThermoFisher Scientific, 10099-141C; PBS: ThermoFisher Scientific, 10010023）洗滌1次，然後將細胞用FACS緩衝液重懸至每毫升2×10
6個細胞，室溫孵育15分鐘後將細胞懸液按50 μL/孔加入到U型96孔板（Corning，3798）中。用FACS緩衝液將單株抗體按梯度稀釋，將抗體稀釋液加入上述96孔板中，50 μL/孔，4℃孵育1小時。離心棄上清，用FACS緩衝液洗滌細胞1次，每孔加入100 μL螢光（Alexa 488）標記的二抗（Thermo Fisher，A-11029），4℃孵育1小時。用FACS緩衝液洗滌細胞1次，每孔加入100 μL固定液[4%（v/v）多聚甲醛]重懸細胞，10分鐘後用FACS緩衝液洗滌細胞2次。用30 μL/孔FACS緩衝液重懸細胞後用流式細胞儀intellycite plus（Sartorius）檢測和分析結果。猴PBMC（澳賽爾斯，CAT#:NHP-PB001F）取凍存細胞復蘇後按流式結合方法操作。小鼠同型對照抗體（購自Thermofisher，貨號02-6502）。SP34陽性對照參考WO2015181098A1製備。
鼠單株抗體10E1C11與Jurkat細胞的結合曲線如圖1所示，鼠單株抗體10E1C11與猴PBMC的結合曲線如圖2所示，顯示鼠單株抗體10E1C11與猴CD3和人CD3均可結合細胞。
實施例4 鼠源抗CD3抗體親和力測定
（1）採用Octet RED96e（Fortébio）測定鼠源抗CD3抗體與人CD3E & CD3G，Fc（KACTUS，貨號：CD3-HM257）的親和力，抗原及抗體均用1×PBST（1×PBS：生工，B548117-0500；0.02%吐溫20：sigma-aldrich，P1379）稀釋，抗原使用濃度為50 nM，抗體使用濃度為33.3 nM。
（2）樣品上機檢測（Octet Data Acquisition 11.1.0.11）：首先，將樣品加入96孔板（Greiner bio-one，655209），體系為200 µL/well。然後設置軟體參數，板溫設定為30℃，收集標準動力學信號的頻率為5.0 HZ。接著，用1×PBST預濕AMQ感測器（Fortébio，貨號：18-5022）10分鐘，然後上機檢測。每個迴圈包含以下步驟：
1）10 mM pH1.7的甘胺酸溶液再生；
2）浸入緩衝液60s；
3）抗體固化在感測器上，時間為35s；
6）感測器浸入緩衝液180s；
7）抗原與抗體結合，時間180s；
8）抗原抗體的解離，時間10分鐘；
9）感測器再生。
（3）資料分析
採用Fortebio的Data Analysis 12.0軟體，對抗原-抗體以1:1的結合方式，測定結合速率（Ka）和解離速率（Kd），以此計算抗體的平衡解離常數（KD），結果如下表3：
表3 鼠源抗CD3抗體與人CD3E & CD3G的親和力
| 抗原 | 抗體 | 回應值 | KD (M) | ka (1/Ms) | kdis (1/s) |
| 人CD3E & CD3G | 10E1C11 | 0.2787 | 1.03E-09 | 3.70E+05 | 3.80E-04 |
| SP34 | 0.1368 | 2.24E-09 | 5.76E+05 | 1.29E-03 |
實施例5 雜交瘤抗CD3抗體激活Jurkat NFAT-Luc細胞中luciferase報告基因
Jurkat NFAT-Luc細胞（Invivogen, jktl-nfat）是含有NFAT元件控制其下游luciferase基因表達的報告基因系統的Jurkat細胞，被確認luciferase基因表達可被CD3抗體激活。
抗CD3抗體包板，抗體包板濃度20 μg/mL起始，2倍梯度稀釋，稀釋11個點，4℃包板過夜；第二天，收集Jurkat NFAT-Luc細胞，密度調整至1×10
6細胞/mL（細胞沉澱用1640（ThermoFisher Scientific, A10491）+2%FBS重懸），吸棄anti-CD3抗體，板用PBS洗2遍後每孔加入100 μL Jurkat NFAT-Luc細胞（1×10
5細胞/孔），37℃、5% CO
2培養6小時後，每孔吸出20 μL到白色的96孔板（Corning，3917）中，然後加入50µL Coelenterazine-utilizing luciferase detection medium（Invivogen，貨號：rep-qlc1）來檢測樣品中螢光素酶的活性。H2M2690N為陽性對照（參考US9657102B2製備）。
結果如圖3所示，從圖中可以看出，與對照抗體H2M2690N 和 SP34相比，抗體10E1C11可激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因。
實施例6 雜交瘤抗CD3抗體激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2
抗CD3抗體包板，抗體包板濃度10 μg/mL起始，5倍梯度稀釋，稀釋5個點，4℃包板過夜；第二天，首先收集新鮮CD4
+T細胞（ALLCELLS, PB009-2-C），密度調整至2×10
6細胞/mL（細胞沉澱用1640+2% FBS重懸），然後用細胞懸液配製抗CD28抗體（BD，貨號：555725）濃度為4 μg/mL，接著吸棄抗CD3抗體，板用PBS洗2遍後每孔加入50 μL新鮮CD4
+T細胞（1×10
5細胞/孔）和50 μL抗CD28抗體（終濃度2 μg/mL），37℃、5% CO
2培養3 d，最後離心取細胞上清稀釋3倍，嚴格按照IL-2 ELISA kit（Abclonal，貨號：RK04123）檢測IL-2的含量。資料用GraphPad Prism8.0軟體進行處理。從圖中結果可以看出，抗體均有活性。小鼠同型對照抗體購自百英（貨號B115101）。
雜交瘤抗CD3抗體激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2的結果如圖4所示，表明雜交瘤抗CD3抗體可激活CD4
+T細胞釋放IL-2。
實施例7 抗CD3嵌合抗體流式結合Jurkat細胞
將雜交瘤抗CD3抗體10E1C11的重鏈可變區序列與人IgG1 LALA D265S（SEQ ID NO: 21）融合，輕鏈可變區與人Kappa鏈恆定區（SEQ ID NO: 20）融合（人恆定區序列見表6），構建得到CD3嵌合抗體CAb10E1。
用FACS鑒定抗CD3嵌合抗體CAb10E1結合Jurkat細胞的活性。將Jurkat細胞在T175細胞培養瓶中培養至密度為10
6個/mL，取出所需數量的細胞，300×g離心5分鐘，棄上清，用FACS緩衝液（含有2% FBS的PBS）洗滌1次，然後將細胞用FACS緩衝液重懸至每毫升2×10
6個細胞，室溫孵育15分鐘後將細胞懸液按50 μL/孔加入到U型96孔板（Corning，3798）中。用FACS緩衝液將單株抗體按梯度稀釋，將抗體稀釋液加入上述96孔板中，50 μL/孔，4℃孵育1小時。離心棄上清，用FACS緩衝液洗滌細胞1次，每孔加入100 μL螢光（Alexa 488）標記的二抗（Thermo Fisher，A-11029），4℃孵育1小時。用FACS緩衝液洗滌細胞1次，每孔加入100 μL固定液[4%（v/v）多聚甲醛]重懸細胞，10分鐘後用FACS緩衝液洗滌細胞2次。用30 μL/孔FACS緩衝液重懸細胞後用流式細胞儀intellycite plus（Sartorius）檢測和分析結果。小鼠同型對照抗體（購自Thermofisher，貨號02-6502）；人源同型對照抗體（購自Solarbio，貨號SP001）。
抗CD3嵌合抗體CAb10E1流式結合Jurkat細胞的實驗結果如圖5所示，表明嵌合抗體CAb10E1保留有母本雜交瘤抗體的與Jurkat細胞結合的活性。
實施例8 抗CD3嵌合抗體激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因
用Jurkat NFAT-Luc細胞的報告基因激活實驗檢測抗CD3嵌合抗體的激活活性。將抗體稀釋五個濃度，5倍梯度稀釋，100 μL/孔，加入96孔板（Corning，3599）中，4℃包板過夜。收集Jurkat NFAT-Luc細胞，用RPMI 1640（Thermo Fisher，A1049101）+2%FBS培養基重懸細胞，密度調整至1E6/mL；吸棄96孔板中的人源化CD3抗體，用PBS洗2遍後每孔加入100 μL細胞（1E5細胞/孔）。將96孔板放入培養箱中，6小時後，每孔吸出20 μL細胞到白色的96孔酶標板（Corning，3917）中，然後每孔加入50µL檢測液QUANTI-Luc（INVIVOGEN，rep-qlc2），用多功能酶標儀檢測樣品中螢光素酶的活性。小鼠同型對照抗體（購自Thermofisher，貨號02-6502）；人源同型對照抗體（購自Solarbio，貨號SP001）。
抗CD3嵌合抗體激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因的實驗結果如圖6所示，表明嵌合抗體CAb10E1保留有母本雜交瘤抗體的激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因。
實施例9 抗CD3嵌合抗體激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2
採用同實施例6中相同的實驗方法，測定抗CD3嵌合抗體激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2的功能。小鼠同型對照抗體（購自百英，貨號B115101）。
結果如圖7所示，表明嵌合抗體CAb10E1可激活CD4
+T細胞釋放IL2。
實施例10 抗CD3抗體的人源化和表達
1. 通過序列比對，挑選同源性最高的人抗體胚系基因（Human Antibody Germline Gene，資料來源：IMGT）作為人源化設計框架（Greg Winter, 1986; Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H. et al. 1988）。輕鏈以IGKV4-1*01或IGKV3-20，IGKJ4*01為框架，重鏈以IGHV1-3*01，IGHJ4*01為框架。對抗體輕重鏈可變區進行Chothia編號（Chothia & Lesk, 1987），定義抗體CDR區：LCDR1（L24-L34）、LCDR2（L50-L56）、LCDR3（L89-L97）、HCDR1（H26-H32）、HCDR2（H52-H56）和HCDR3（H95-H97），由此定義的CDR如表4所示：
表4 Chothia編號的鼠源抗體10E1C11的CDR序列
根據序列比對和可變區結構資訊對抗體輕重鏈可變區的胺基酸進行人源化設計；
| LCDR1 | SEQ ID NO: | LCDR2 | SEQ ID NO: | LCDR3 | SEQ ID NO: |
| KSSQSLFNSRTRKNYLA | 1 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| HCDR1 | SEQ ID NO: | HCDR2 | SEQ ID NO: | HCDR3 | SEQ ID NO: |
| GYTFTDY | 6 | YPGEDT | 7 | NNNYYFDY | 8 |
2. 設計表達載體，基因合成，哺乳細胞表達純化重組抗體，比較人源化抗體和嵌合抗體活性，理化性質的差異，進行1-2輪人源化優化；
3. 人胚系抗體基因胺基酸序列資訊：
➢IGKV4-1*01：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP （SEQ ID NO: 33）
➢IGKV3-20：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP （SEQ ID NO: 22）
➢IGHV1-3*01：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR （SEQ ID NO: 29）
➢IGKJ4*01：
LTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 9）
➢IGHJ4*01：
YFDYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 16）
以下輕鏈可變區的優化設計是以人抗體胚系基因序列IGKV4- 1*01、IGKV3-20或IGKJ4*01為框架，002hzVK0（10E1C11 VK）為嵌合抗體的輕鏈可變區序列進行CDR移植和回復突變的人源化序列：
➢002hzVK0
輕鏈可變區序列（SEQ ID NO: 10）：
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQAEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKLESK
➢002hzVK1b
輕鏈可變區序列（SEQ ID NO: 11）：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIK
優化突變位點：S5T, S9D, A15L, K18R, V19A, M21I, S22N, S43P, T63S, N77S, V78L, V83L, L103V, S105I。
➢002hzVK2b
輕鏈可變區序列（SEQ ID NO: 12）：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFQSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIK
優化突變位點：S5T, S9D, A15L, K18R, V19A, M21I, S22N, N30aQ, S43P, T63S, N77S, V78L, V83L, L103V, S105I。
➢002hzVK8
輕鏈可變區序列（SEQ ID NO: 13）:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLFQSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIK
優化突變位點：D1E, M4L, S5T, S9G, S10T, A12S, V13L, A15P, K18R, V19A, M21L, N30aQ, S43A, K45R, V58I, T63S, N77R, V78L, Q79E, A80P, L83F, L103V, S105I。
➢002hzVK9
輕鏈可變區序列（SEQ ID NO: 14）：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLFSSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIK
優化突變位點：D1E, M4L, S5T, S9G, S10T, A12S, V13L, A15P, K18R, V19A, M21L, N30aS, S43A, K45R, V58I, T63S, N77R, V78L, Q79E, A80P, L83F, L103V, S105I。
➢002hzVK9b
輕鏈可變區序列（SEQ ID NO: 15）：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLFSSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIK
優化突變位點：D1E, M4L, S5T, S9G, S10T, A12S, V13L, A15P, K18R, V19A, M21L, N30aS, S43A, K45R, V58I, T63S, N77R, V78L, Q79E, A80P, F83L, L103V, S105I。
以下重鏈可變區的優化設計是以人抗體胚系基因序列IGHV1-3*01和IGHJ4*01為框架， 002hzVH0（10E1C11 VH）為嵌合抗體的重鏈可變區序列進行CDR移植和回復突變的人源化序列。
➢002hzVH0
重鏈可變區序列（SEQ ID NO: 17）：
QVQLQQSGLELVKPGAAVKMSCTASGYTFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGEDTSKYNEKFKAKTSLTADKSSSTAYMLLNSLTSEDSAIYFCVRNNNYYFDYWGQGTTLTVSS
➢002hzVH2
重鏈可變區序列（SEQ ID NO: 18）：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSS
優化突變位點：Q5V, L9A, L11V, V12K, A17S, M20V, T23K, A33Y, M34I, K38R, R40A, G44R, I48M, T57S, N60S, E61Q, K64Q, A65G, K66R, T67V, S68T, L69I, A71R, K73T, S75A, L81E, N82aS, T83R, S87T, I89V, F91Y, A93V, T108L, L109V。
➢002hzVH3
重鏈可變區序列（SEQ ID NO: 19）：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSS
優化突變位點：Q5V, L9A, L11V, V12K, A17S, M20V, T23K, A33Y, M34I, K38R, R40A, G44R, I48M, T57S, N60S, E61Q, K64Q, A65G, K66R, T67V, S68T, L69I, R71A, T73K, S75A, L81E, N82aS, T83R, S87T, I89V, F91Y, A93V, T108L, L109V。
上述所有輕重鏈可變區的CDR如下表5所示：
表5 各抗體CDR序列及編號
| LCDR1 | SEQ ID NO: | LCDR2 | SEQ ID NO: | LCDR3 | SEQ ID NO: | |
| 10E1C11-VL | KSSQSLFNSRTRKNYLA | 1 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| 002hzVK0 (10E1C11 VK) | KSSQSLFNSRTRKNYLA | 1 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| 002hzVK1b | KSSQSLFNSRTRKNYLA | 1 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| 002hzVK2b | KSSQSLFQSRTRKNYLA | 4 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| 002hzVK8 | KSSQSLFQSRTRKNYLA | 4 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| 002hzVK9 | KSSQSLFSSRTRKNYLA | 5 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| 002hzVK9b | KSSQSLFSSRTRKNYLA | 5 | GASTRES | 2 | KQSFILRT | 3 |
| HCDR1 | SEQ ID NO: | HCDR2 | SEQ ID NO: | HCDR3 | SEQ ID NO: | |
| 10E1C11-VH | GYTFTDY | 6 | YPGEDT | 7 | NNNYYFDY | 8 |
| 002hzVH0（10E1C11 VH） | GYTFTDY | 6 | YPGEDT | 7 | NNNYYFDY | 8 |
| 002hzVH2 | GYTFTDY | 6 | YPGEDT | 7 | NNNYYFDY | 8 |
| 002hzVH3 | GYTFTDY | 6 | YPGEDT | 7 | NNNYYFDY | 8 |
4. 人源化抗體的重鏈輕鏈組合與抗體表達
將上述人源化的輕鏈可變區序列與人Kappa鏈恆定區（SEQ ID NO: 20）組合成人源化抗體輕鏈，將上述人源化的重鏈可變區序列與人IgG1 LALA D265S（SEQ ID NO: 21）組合成人源化抗體重鏈。恆定區序列如表6所示。
表6 人輕鏈和重鏈恆定區
| 恆定區 | SEQ ID NO: | 序列 |
| 人輕鏈恆定區CL | 20 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 人重鏈恆定區CH | 21 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
002hzVH2重鏈可變區和002hzVK8輕鏈可變區分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體002hz28；002hzVH2重鏈可變區和輕鏈可變區002hzVK9分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體002hz29；002hzVH2重鏈可變區和002hzVK9b輕鏈可變區分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體002hz29b；002hzVH3重鏈可變區和002hzVK1b輕鏈可變區分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體002hz31b。
002hzVH3重鏈可變區和002hzVK2b輕鏈可變區分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體002hz32b。
002hzVH3重鏈可變區和002hzVK8輕鏈可變區分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體002hz38；002hzVH3重鏈可變區和002hzVK9輕鏈可變區分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體002hz39。
上述鼠源抗體、嵌合抗體和人源化抗體的輕重鏈全長列序列資訊如下表7所示：
表7 抗體輕重鏈
| SEQ ID NO: | 序列 | |
| CAb10E1-LC | 23 | DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQAEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKLESKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| CAb10E1-HC | 30 | QVQLQQSGLELVKPGAAVKMSCTASGYTFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGEDTSKYNEKFKAKTSLTADKSSSTAYMLLNSLTSEDSAIYFCVRNNNYYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 002hz39-LC | 27 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLFSSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 002hz39-HC | 32 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 002hz29-LC | 27 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLFSSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 002hz29-HC | 31 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 002hz38-LC | 26 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLFQSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 002hz38-HC | 32 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 002hz28-LC | 26 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLFQSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 002hz28-HC | 31 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 002hz31b-LC | 24 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 002hz31b-HC | 32 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 002hz32b-LC | 25 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFQSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 002hz32b-HC | 32 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 002hz29b-LC | 28 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLFSSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCKQSFILRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 002hz29b-HC | 31 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGEDTSKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRNNNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
優化設計序列後，全長重組單株抗體輕重鏈蛋白質序列分別進行密碼子優化，基因合成密碼子優化後DNA片段，克隆合成後基因片段到表達載體pcDNA3.4（Life Technologies）。表達質體擴增和質體抽提（Qiagen, EndoFree® Plasmid Maxi Kit, Cat. No. 12362）後雙質體共轉Expi293F（ThermoFisher Scientific，A14527）或CHO-K1細胞（ECACC catalogue no. 85051005），根據供應商Expi293F或CHO-K1表達系統方法進行抗體瞬轉表達，大致過程如下：
(一) 細胞復蘇：使用125 mL一次性無菌搖瓶，將凍存的CHO細胞37℃水浴解凍，細胞稀釋至0.3×10
6個/mL，體積30 mL。125 rpm(19mm軌道)，8% CO
2，37℃培養至4-6×10
6個/mL左右。
(二) 傳代：細胞長至4-6×10
6個/mL左右，傳代密度為0.2-0.3×10
6個/mL，培養3天。
(三) 瞬轉轉染：細胞傳至3代以上，轉染前一天密度4-6×10
6個/mL左右，稀釋細胞至密度3-4×10
6個/mL，過夜培養，第二天7-10×10
6，稀釋至6×10
6，以瞬轉體積100 mL（500 mL搖瓶）為例：溶液1：用培養液（4 mL）稀釋100 μg質體，混勻；溶液2：用培養液（3.68 mL）稀釋320 μL轉染試劑，混勻；將溶液2加入溶液1中，總體積是8 mL，輕柔混勻後室溫孵育1-5分鐘，不超過5分鐘，將混合轉染液逐滴加入細胞液中，邊搖邊加。
(四) 蛋白表達（最大滴度）：18-22個小時加輔料Feed-16 mL，增強劑Enhancer-0.6mL，32℃培養。第五天加輔料Feed-16 mL，123rpm，5% CO
2，32℃培養，待第12-14天離心收集上清。
(五) 抗體純化：Protein A親和層析柱純化：1）平衡層析柱：1×PBS，流速1 mL/min，20mL；2）上樣：流速1mL/min；3） 洗雜：1×PBS，流速1 mL/min，20 mL；4）洗脫：檸檬酸緩衝液（PH3.4），1 mL/min，分管收集，每管約500 μL。共收集10管，使用NanoDrop儀器讀取280 nm吸光度值；5）透析：將高濃度蛋白吸至透析袋放1×PBS的燒杯中透析。6）收集抗體備用。
抗體表達結果如表8所示，表明利用上述方法能表達出抗CD3抗體。
表8 表達量資料
| 抗體名稱 | 表達量（mg/L） |
| 002hz39 | 48.4 |
| 002hz29 | 19.7 |
| 002hz38 | 21.0 |
| 002hz28 | 19.0 |
| 002hz31b | 70.3 |
| 002hz29b | 65.3 |
| 002hz32b | 42.0 |
實施例11 人源化抗CD3抗體的親和力測定
測定人源化抗CD3抗體與人CD3E & CD3G，Fc的親和力，使用CH1感測器（Fortébio，貨號：18-5127），其餘實驗方法及步驟同實施例4，兩次實驗結果如表9和表10。其中OKT3為陽性對照（購自invitrogen，貨號為16-0037-85）。SP34陽性對照（參考WO2015181098A1製備）。SP34.1與SP34的可變區相同，恆定區為人IgG1 L234A、L235A和D265S；OKT3.1與OKT3的可變區相同，恆定區為人IgG1 L234A、L235A和D265S。
表9 人源化抗CD3抗體與人CD3E & CD3G的親和力
表10 人源化抗CD3抗體與人CD3E & CD3G的親和力
由表9和表10可知，人源化CD3抗體與嵌合抗體CAb10E1相比，其與人CD3E & CD3G，Fc的親和力差異不明顯，所以均進一步進行體外功能實驗評估。
| 抗原 | 抗體 | 回應值 | KD (M) | ka (1/Ms) | kdis (1/s) |
| Human CD3E & CD3G, Fc | 002hz31b | 0.2947 | 1.57E-09 | 2.13E+05 | 3.35E-04 |
| 002hz32b | 0.1121 | 2.23E-09 | 2.20E+05 | 4.91E-04 | |
| 002hz28 | 0.1282 | 1.87E-09 | 3.03E+05 | 5.68E-04 | |
| 002hz38 | 0.0883 | 1.72E-09 | 3.01E+05 | 5.16E-04 | |
| 002hz29b | 0.2625 | 2.33E-09 | 2.30E+05 | 5.36E-04 | |
| CAb10E1 | 0.2552 | 1.13E-09 | 2.69E+05 | 3.04E-04 | |
| SP34.1 | 0.1246 | 3.38E-09 | 4.08E+05 | 1.38E-03 | |
| OKT3.1 | 0.0189 | 不結合 |
| 抗原 | 抗體 | 回應值 | KD (M) | ka (1/Ms) | kdis (1/s) |
| Human CD3E & CD3G, Fc | 002hz29 | 0.3015 | 5.57E-09 | 2.35E+05 | 1.31E-03 |
| 002hz39 | 0.3473 | 6.15E-09 | 2.15E+05 | 1.32E-03 | |
| CAb10E1 | 0.331 | 2.90E-09 | 2.62E+05 | 7.61E-04 |
實施例12 人源化抗CD3抗體的流式結合Jurkat細胞和猴PBMC細胞
用FACS鑒定人源化抗CD3抗體結合Jurkat細胞的活性。將Jurkat細胞在T175細胞培養瓶中培養至密度為1×10
6個/mL，取出所需數量的細胞，300×g離心5分鐘，棄上清，用FACS緩衝液（含有2% FBS的PBS）洗滌1次，然後將細胞用FACS緩衝液重懸至每毫升2×10
6個細胞，室溫孵育15分鐘後將細胞懸液按50 μL/孔加入到U型96孔板（Corning，3798）中。用FACS緩衝液將人源化抗體按梯度稀釋，將抗體稀釋液加入上述96孔板中，50 μL/孔，4℃孵育1小時。離心棄上清，用FACS緩衝液洗滌細胞1次，每孔加入100 μL螢光（Alexa 488）標記的二抗（Thermo Fisher，A-11013），4℃孵育1小時。用FACS緩衝液洗滌細胞1次，每孔加入100 μL固定液[4%（v/v）多聚甲醛]重懸細胞，10分鐘後用FACS緩衝液洗滌細胞2次。用30 μL/孔FACS緩衝液重懸細胞後用流式細胞儀intellycite plus（Sartorius）檢測和分析結果。人源同型對照抗體（購自Solarbio，貨號SP001）。取凍存猴PBMC，復蘇後按相同方法做流式結合。
人源化抗體與Jurkat細胞的結合曲線如圖8A至8B所示，人源化抗體與猴PBMC細胞的結合曲線如圖9A至9B所示，表明人源化後的抗體002hz39、002hz29、002hz38、002hz28、002hz31b、002hz32b和002hz29b可與Jurkat細胞和猴PBMC的結合。
實施例13 人源化抗體激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因
用Jurkat NFAT-Luc細胞的報告基因激活實驗檢測人源化CD3抗體的激活活性。將抗體稀釋五個濃度，5倍梯度稀釋，100 μL/孔，加入96孔板（Corning，3599）中，4℃包板過夜。收集Jurkat NFAT-Luc細胞，用RPMI 1640（Thermo Fisher，A1049101）+2%FBS培養基重懸細胞，密度調整至1E6/mL；吸棄96孔板中的人源化CD3抗體，用PBS洗2遍後每孔加入100 μL細胞（1E5細胞/孔）。將96孔板放入培養箱中，6小時後，每孔吸出20 μL細胞到白色的96孔酶標板（Corning，3917）中，然後每孔加入50 µL檢測液QUANTI-Luc（INVIVOGEN，rep-qlc2），用多功能酶標儀檢測樣品中螢光素酶的活性。小鼠同型對照抗體（購自Thermofisher，貨號02-6502），人源同型對照抗體（購自Solarbi，貨號SP001）。
實驗結果如圖10A至圖10B所示，人源化後的抗體具有激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因的活性。
實施例14 人源化抗CD3抗體激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2
抗CD3抗體包板，抗體包板濃度10 μg/mL起始，5倍梯度稀釋，稀釋5個點，4℃包板過夜；第二天，首先收集新鮮CD4
+T細胞，密度調整至2×10
6細胞/mL（細胞沉澱用1640+2 %FBS重懸），然後用細胞懸液配製抗CD28抗體（BD，貨號：555725）濃度為4 μg/mL，接著吸棄抗CD3抗體，板用PBS洗2遍後每孔加入50 μL新鮮CD4
+T細胞（1×10
5細胞/孔）和50 μL抗CD28抗體（終濃度2 μg/mL），37℃、5% CO
2培養3d，最後離心取細胞上清稀釋3倍，嚴格按照IL-2 ELISA kit（Abclonal，貨號：RK04123）檢測IL-2的含量。其中OKT3為陽性對照（購自invitrogen，貨號為16-0037- 85）。SP34陽性對照（參考WO2015181098A1製備）。SP34.1與SP34的可變區相同，恆定區為人IgG1 L234A、L235A和D265S；OKT3.1與OKT3的可變區相同，恆定區為人IgG1 L234A、L235A和D265S。
實驗結果如圖11A至圖11B所示，表明抗體均可激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2。
無
圖1為鼠單株抗體與Jurkat細胞的結合曲線。
圖2為鼠單株抗體與猴PBMC的結合曲線。
圖3為雜交瘤抗CD3抗體激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因的結果。
圖4為雜交瘤抗CD3抗體活化T細胞，激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2曲線。
圖5為抗CD3嵌合抗體與Jurkat細胞的結合曲線。
圖6為抗CD3嵌合抗體激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因的結果。
圖7為抗CD3嵌合抗體活化T細胞，激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2曲線。
圖8A和8B為人源化抗體與Jurkat細胞的結合曲線。
圖9A和9B為人源化抗體與猴PBMC的結合曲線。
圖10A和10B為人源化抗體激活Jurkat NFAT-Luc細胞中Luciferase報告基因的結果。
圖11A和11B為人源化抗體活化T細胞，激活新鮮CD4
+T細胞釋放IL-2曲線。
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Claims (14)
- 一種抗CD3抗體，所述抗CD3抗體包括輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述輕鏈可變區包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 1、4或5所示的胺基酸序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列，所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的抗CD3抗體，其中，所述VL包含如SEQ ID NO: 10-15任一所示的胺基酸序列；和/或，所述VH包含如SEQ ID NO: 17-19任一所示的胺基酸序列； 較佳地，所述VL包含如SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 17所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；或，所述VL包含如SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列，且所述VH包含如SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列。
- 如請求項1或2所述的抗CD3抗體，其中，所述的抗CD3抗體滿足以下二項中至少一項： （1）所述抗CD3抗體為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’) 2或Fv，所述Fv優選為scFv； （2）所述抗CD3抗體為由第（1）項中所述抗CD3抗體制得的單株抗體或多克隆抗體。
- 如請求項1-3任一項所述的抗CD3抗體，其中，所述的抗CD3抗體為全長抗體，所述全長抗體包括輕鏈和重鏈；所述輕鏈包括輕鏈恆定區（CL），所述輕鏈恆定區優選為人源抗體輕鏈恆定區或鼠源抗體輕鏈恆定區，所述人源抗體輕鏈恆定區更優選為κ亞型的輕鏈恆定區；所述重鏈包括重鏈恆定區（CH），所述重鏈恆定區優選為人源或鼠源抗體重鏈恆定區，更優選為hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4亞型的重鏈恆定區，進一步優選為hIgG1亞型的重鏈恆定區； 較佳地，所述人源抗體輕鏈恆定區包括如SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列，且所述人源抗體重鏈恆定區包括如SEQ ID NO: 21所示的胺基酸序列。
- 如請求項1-4任一項所述的抗CD3抗體，其中，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 23-28任一所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 30-32任一所示的胺基酸序列； 較佳地，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 23所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 30所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 27所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 27所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 31所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 26所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 26所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 31所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 24所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 25所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列；或，所述輕鏈包括如SEQ ID NO: 28所示的胺基酸序列，且所述重鏈包括如SEQ ID NO: 31所示的胺基酸序列。
- 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-5任一項所述的抗CD3抗體。
- 一種重組表達載體，其包含如請求項6所述的分離的核酸； 較佳地，所述重組表達載體包含真核細胞表達載體和/或原核細胞表達載體； 更佳地，所述真核細胞表達載體為pcDNA3.4。
- 一種轉化體，其包含如請求項7所述的重組表達載體； 較佳地，所述轉化體的宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞優選為 E. coli細胞，所述真核細胞優選為Expi293F細胞或CHO細胞。
- 一種如請求項1-5任一項所述的抗CD3抗體的製備方法，其包括以下步驟：培養如請求項8所述的轉化體，從培養物中獲得所述抗CD3抗體。
- 一種藥物組合物，其包含如請求項1-5任一項所述的抗CD3抗體，以及藥學上可接受的載體和/或藥學上可接受的佐劑。
- 一種檢測試劑，其包含如請求項1-5任一項所述的抗CD3抗體； 較佳地，所述檢測試劑為液體劑型、氣體劑型、固體劑型和半固體劑型； 更佳地，所述檢測試劑還包括二抗、CD3或其衍生物，所述二抗例如抗人IgG的抗體偶聯山葵過氧化氫酶和抗人IgG的抗體偶聯生物素蛋白。
- 一種套裝藥盒，其包含藥盒A，所述藥盒A含有如請求項1-5任一項所述的抗CD3抗體、如請求項10所述的藥物組合物和如請求項11所述的檢測試劑中的一種或多種； 較佳地，所述套裝藥盒還包括藥盒B，所述藥盒B含有其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組合物，和/或由激素製劑、靶向小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因數、共刺激分子的激活劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
- 如請求項1-5任一項所述的抗CD3抗體、如請求項10所述的藥物組合物、如請求項11所述的檢測試劑和/或如請求項12所述的套裝藥盒在製備診斷、預防和/或治療CD3相關疾病的藥物中的應用； 較佳地，所述CD3相關疾病為CD3相關腫瘤。
- 一種檢測樣品中CD3的方法，其包括使用如請求項1-5任一項所述的抗CD3抗體或如請求項11所述的檢測試劑與所述樣品接觸的步驟； 較佳地，所述方法為非診斷和/或治療目的；所述樣品例如血液樣本、包含CD3的試劑、含CD3的抗體藥物偶聯物或含CD3的嵌合抗原受體細胞。
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