TW202345859A - 用於治療ｂ型肝炎病毒感染的方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種組合物用於製備治療B型肝炎病毒(HBV)感染，特別是慢性HBV感染，所引起的相關疾病之症狀的藥物之用途，其中該組合物包括一CRM1抑制劑，且該CRM1抑制劑具有抑制HBV核心顆粒的核輸出路徑的功能。

Description

用於治療B型肝炎病毒感染的方法

本發明係關於一種使用CRM1抑制劑來治療B型肝炎病毒感染的方法，特別是該CRM1抑制劑能夠抑制HBV核心顆粒的核輸出路徑。

根據世界衛生組織(WHO)於2019年的估算，全球有超過3億個慢性B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)帶原者。儘管B型肝炎病毒(HBV)的高效疫苗已經問世四十多年，但針對HBV有療效性的治療處理仍然是一項未得到滿足的醫療需求。目前的臨床治療依賴口服用的核苷酸類似物，例如泰諾福韋(tenofovir)或恩替卡維爾(entecavir)。雖然這些藥物可以抑制病毒生長，但它們不能從肝臟中完全根除病毒。慢性B肝患者需要終生服用核苷酸類似物進行治療。長期治療總是會誘發抗藥性變異株的出現。

CRM1(染色體區域穩定蛋白1(chromosome region maintenance 1)，外輸蛋白1(exportin 1)，Xpo1)是將蛋白質貨物輸出到細胞核外的主要受體。SINE化合物(核輸出的選擇性抑制劑)是最有名的CRM1抑制劑，其已經通過癌症治療測試。此外，SINE化合物，例如菲地尼索(Verdinexor，KPT-335)，已作為流感病毒和呼吸道融合細胞病毒 (respiratory syncytial virus，RSV)的抗病毒劑進行了測試。另一種化合物艾塔尼西(Eltanexor，KPT-8602)可以透過增加第I型干擾素的表現來抑制人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)。KPT-8602還減少了卡波氏肉瘤相關疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)的溶裂複製(lytic replication)。

本發明係關於一種用於治療B型肝炎病毒(HBV)感染所引起的相關疾病之症狀的組合物，其中該組合物包含一治療有效量的CRM1抑制劑。

本文所用的術語「一」或「一個」用於描述本發明的元件和成分。該術語僅用於方便和提供本發明的基本概念。再者，描述應被理解為包含一個或至少一個，並且除非上下文另有明確指示，否則單數術語包括複數且複數術語包括單數。當在申請專利範圍中與單詞「包含」結合使用時，術語「一」或「一個」可以表示一個或多個。

本文所用的術語「或」可以表示「及/或」。

本發明提供一種用於治療一個體中B型肝炎病毒(HBV)感染所引起的相關疾病之症狀的方法，其包含向患有HBV感染的該個體施予一包含一治療有效量的CRM1抑制劑的組合物。

本發明也提供一種組合物用於製備治療B型肝炎病毒(HBV)感染所引起的相關疾病之症狀的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效量的CRM1抑制劑。

如本文所用，術語「B型肝炎病毒」或「HBV」是指任何血 清型或基因型的任何B型肝炎病毒。在一些具體實施例中，該HBV是基因型A-J中的任何一種。

在另一具體實施例中，該HBV感染之相關疾病包含慢性肝病或病症、肝臟發炎、肝纖維化病況、增殖性肝細胞病症、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、D型肝炎病毒合併感染、急性HBV感染、慢性B型肝炎或慢性HBV感染。因此，該CRM1抑制劑能夠治療由HBV感染引起的疾病。

如本文所用，術語「治療」是指預防性或醫療性治療，其中該個體是要預防、逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或停止與HBV感染相關的病況之進展或嚴重性。

在一具體實施例中，該個體為動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類。在另一具體實施例中，該個體是一患有慢性HBV感染的個體。

在一些方面，CRM1(染色體區域穩定蛋白1)，也稱為外輸蛋白1(XPO1)，是含有具聚集的疏水性殘基之核輸出信號(nuclear export signals，NES)的核蛋白之主要輸出受體。如本文所用，術語「CRM1抑制劑」是指一種化合物，其抑制CRM1 mRNA的製造、產生、合成、加工或修飾，促進降解或隔離CRM1 mRNA，抑制CRM1 mRNA轉譯成蛋白質，或是抑制CRM1蛋白的半衰期(壽命(longevity)、周轉(turnover))或生物活性。該CRM1抑制劑的非限制性實施例包括來普黴素A(Leptomycin A)、來普黴素B、來普黴素類似物、干擾CRM1表現的RNA或其mRNA、瑞佳酮(ratjadone)、戊曲酯(valtrate)、乙醯氧基佳咪酚乙酸酯(acetoxychavicol acetate)、口服CRM1抑製劑(CBS9106)、核輸出的選擇 性抑制劑(SINE)、抑制CRM1的天然化合物，或天然產物(如薑黃素)。

在一些具體實施例中，該SINE化合物是阻斷CRM1與貨物結合的藥物。因此，該SINE化合物可以抑制CRM1依賴性HBV病毒體(virion)分泌。在一些方面，該SINE化合物包含KPT-330、KPT-8602、KPT-185、KPT-276或KPT-335。

在另一具體實施例中，該CRM1抑制劑包含一干擾RNA分子、KPT-330、KPT-8602、KPT-185、KPT-276、KPT-335或其衍生物。在一些方面，該干擾RNA分子具有干擾CRM1 mRNA表現或其穩定性的功能。在一具體實施例中，該干擾RNA分子包含短髮夾RNA(short hairpin，shRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、反義RNA(antisense RNA)、寡核苷酸或微小RNA(microRNA，miRNA)。

在本發明中，肝細胞中CRM1介導的路徑促進了含有HBV pgRNA衣殼(capsids)的核輸出。因此，該CRM1抑制劑可以抑製包殼HBV pgRNA(encapsidated HBV pgRNA)和含有HBV pgRNA的衣殼的核輸出。再者，該CRM1抑制劑能夠抑制HBV病毒體的分泌。在一具體實施例中，該CRM1抑制劑透過抑制HBV核心顆粒的核輸出路徑來治療HBV感染。在一較佳具體實施例中，該CRM1抑制劑透過抑制含有成熟鬆弛環狀(RC)DNA基因組的HBV衣殼之核輸出來治療HBV感染。

在本發明中，該CRM1抑制劑可以與其他抗HBV藥物組合使用來治療HBV感染。在另一具體實施例中，該組合物進一步包含抗HBV藥物。此外，該抗HBV藥物的活性成分與該CRM1抑制劑的活性成分不同。在另一具體實施例中，該抗HBV藥物包含HBV聚合酶抑制劑、HBV免疫 調節劑、細胞激素或干擾素。在一些具體實施例中，其他抗HBV藥物包含拉米夫定(lamivudine)、替比夫定(telbivudine)、泰諾福韋(tenofovir)、恩替卡維爾(entecavir)、阿德福韋雙匹酯(adefovir dipivoxil)、阿法菲酮(alfaferone)、阿洛非隆(alloferon)、西莫介白素(celmoleukin)、克來夫定(clevudine)、恩曲他賓(emtricitabine)、抗濾兒(famciclovir)、寶甘靈(Hepatect)CP、干擾素-1a、干擾素-1b、干擾素-2a、干擾素-2b、介白素-2、米沃替酯(mivotilate)、硝唑尼特(nitazoxanide)、聚乙二醇化干擾素(peginterferon)α-2a、利巴韋林(ribavirin)、羅飛龍(Roferon)-A、西佐喃(sizofiran)、安普利近(Ampligen)、福斯非茲(phosphazid)、海普薩烏(Heplisav)、左旋四咪唑(levamisole)或丙帕鍺(propagermanium)。

在一些具體實施例中，該抗HBV藥物的形式包含聚乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素、免疫調節劑、治療性疫苗、HBV蛋白特異性單株抗體、核苷酸類似物、反義分子、siRNA、進入抑制劑、衣殼抑制劑、HBsAg抑制劑、HBx抑制劑、PDL1抑制劑、其他檢查點抑制劑、FXR致效藥劑(agonists)、細胞凋亡誘導劑、基因編輯分子。在一較佳具體實施例中，該抗HBV藥物的核苷酸類似物包含拉米夫定(Epivir)、阿德福韋雙匹酯、恩替卡維爾、替比夫定、泰諾福韋、克拉夫定(Cledvudine)，或它們的前藥，或它們的衍生物。

在一些方面，該CRM1抑制劑與其他抗HBV藥物可以形成一用於治療B型肝炎病毒感染的藥物組合。該CRM1抑制劑和該抗HBV藥物作為獨立的實體(例如，醫藥組合物、醫藥製劑)可以同時、平行或依次給藥，並且沒有特定的時間限制，其中該組合物的活性成分施予於該 個體來達到治療有效量。因此，本發明的藥物組合中的活性成分可以單獨施予，也可以部分或全部施予。本發明的藥物組合中的活性成分可以基本上在不同的時間施予，或者基本上同時施予其部分或全部。

在本發明中，該CRM1抑制劑是有利與醫藥上可接受的載體一起配製在一醫藥組合物中。

如本文所用，術語「醫藥上的」或「醫藥上可接受的」是指當適當地給予哺乳動物，特別是人類，不產生不利、過敏或其他不良反應的分子實體和組合物。醫藥上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑是指任何類型的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或製劑助劑。

可用於本發明組合物的醫藥上可接受的載體和賦形劑包括但不限於，離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物遞送系統(self-emulsifying drug delivery systems，SEDDS)(如d-a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、醫藥劑型中使用的介面活性劑(如Tweens或其他類似的聚合物遞送基質)、血清蛋白(如人類血清白蛋白)，緩衝物質(如磷酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀，飽和油脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(如魚精蛋白硫酸鹽)、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯氫吡咯酮、纖維素類物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

如本領域技術人員所理解的，該醫藥組合物被適當地配製以與預期的施予途徑相容。合適的施予途徑的實施例包括外用途徑、口服途徑、鼻內途徑、眼內途徑、腸胃外途徑，並且包括肌肉內、皮下、靜脈內、 腹膜內或局部注射。可以使用口服途徑，前提是該組合物是適合口服給藥的形式，即能夠保護活性成分免受胃和腸道內酵素的影響。較佳地，用於根據本發明的用途的CRM1抑制劑透過外用途徑、口服途徑、鼻內途徑、眼內途徑、腸胃外途徑來施予，或透過肌肉內、皮下、靜脈內、腹膜內或局部注射。

較佳地，該醫藥組合物包含載體，其是用於醫藥上可注射的製劑。它們可以特別是無菌的、等滲透的鹽類溶液(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)、或乾燥的(特別是凍乾)、組合物，其透過適當地添加無菌水或生理食鹽水，可形成注射用溶質。

本文所用的術語「治療有效量」是指能夠預防、減少、停止或逆轉個體於特定條件下出現的症狀，或是部分、完全緩解個體於開始接受治療時在特定條件下已經存在的症狀之治療劑量。

用於施予的劑量可以依各種參數的函數進行調整，特別是作為所用的給藥模式、相關病理學或選擇治療所需持續時間的函數。例如，以低於實現所需治療效果所需的程度作為化合物劑量的開始，並逐漸增加劑量直至實現所需效果，此作法完全在本領域的技術範圍內。然而，產品的每日劑量可能會在每位成人每天0.01至1,000mg的廣範圍內進行變化。較佳地，該組合物包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，用於針對待治療的個體的劑量進行症狀調整。藥劑通常包含約0.01mg至約500mg的活性成分，較佳為0.01mg至約100mg的活性成分。藥物的有效量通常以每天約0.01mg/ 公斤體重至100mg/公斤體重的劑量程度來提供，特別是每天約0.1mg/公斤體重至50mg/公斤體重。

在一具體實施例中，該CRM1抑制劑的治療有效量範圍為0.01mg/kg至100mg/kg。在一較佳具體實施例中，該CRM1抑制劑的治療有效量範圍為0.1mg/kg至50mg/kg。在一更佳具體實施例中，該CRM1抑制劑的治療有效量範圍為0.2mg/kg至25mg/kg。

在一具體實施例中，該治療有效量是以每天單次劑量施予。在一較佳具體實施例中，該治療有效量是以每天兩次或更多次劑量施予。

本發明的組合物可以按照例行時間表施予。如本文所用，例行時間表指的是預定的指定時間區段。例行時間表可以包含相同或不同長度的時間區段，只要時間表是預先確定的即可。例如，例行時間表可涉及一天、每天、每兩天、每三天、每四天、每五天、每六天、每週、每月或任何設定的天數或週數之內施予一劑。或者，預定的例行時間表可涉及在第一周每天一次施予，隨後幾個月每天施予等。在其他具體實施例中，本發明提供的藥物可以口服，並且其時間取決於或不取決於食物攝取。是以，例如，可以每天早上及/或每天晚上服用藥物，而且不管個體何時進食或將進食。在一具體實施例中，該組合物每週施予一次。在一較佳具體實施例中，該組合物的持續施予大約或超過3-12個月的時間。在另一具體實施例中，該組合物的施予至少3個月。在一較佳具體實施例中，該組合物的施予至少6個月。在一更佳具體實施例中，該組合物的施予至少12個月。

本發明進一步提供一種在體外細胞中抑制HBV核心顆粒的核輸出路徑的方法，其包含施予一包含CRM1抑制劑的組合物至HBV感染 或轉染的細胞中。

本發明也提供一種組合物用於製備在體外細胞抑制HBV核心顆粒的核輸出路徑之藥物的用途，其中該組合物包含一治療有效量的CRM1抑制劑。

在一具體實施例中，用於處理細胞的該CRM1抑制劑的濃度範圍為0.1至10μM。在一較佳具體實施例中，用於處理細胞的該CRM1抑制劑的濃度範圍為0.3至5μM。在一更佳具體實施例中，用於處理細胞的該CRM1抑制劑的濃度範圍為0.5至3μM。

因此，本發明證明該CRM1抑制劑阻斷含有HBV RNA的衣殼的核輸出或HBV病毒體分泌。因此，對於已確診為慢性HBV感染的個體而言，需要使用CRM1抑制劑進行長期治療，而非是短期治療，以防止肝臟再生中未感染的新生肝細胞再次感染。總之，CRM1抑制劑是治療HBV感染的潛在候選藥物。

圖1A和1B顯示CRM1機器促進包殼病毒RNA(encapsidated viral RNA)的核輸出。圖1A顯示NES^CRM1突變僅減少在細胞質中的衣殼相關病毒RNA(capsid-associated viral RNAs)，但在細胞核則沒有減少。將WT-HBV和NES^CRM1 I+II突變體(mtNES^CRM1-I+II)轉染到HuH-7細胞中。針對轉染細胞溶解後所分離的細胞核和細胞質的成分，使用5種不同的檢測方法分析包殼病毒RNA、總病毒RNA(包殼+非包殼)、核糖體RNA、衣殼顆粒和α-微管蛋白(α-tubulin)。上圖：比較細胞核和細胞質成分之間的包殼病毒RNA。透過Bio-Rad蛋白質檢測法測量每個組分 中的總蛋白質濃度。每條泳道的衣殼顆粒都是來自相同量(1.4mg)總蛋白的PEG沉澱物。萃取出包殼病毒RNA，並透過使用HBV核心(HBV core，HBc)探針的北方墨點法進行分析。中圖：使用HBs探針透過北方墨點法比較WT和NES突變體之間來自細胞核和細胞質區室(compartment)的總量RNA。在每條泳道上加載等量(20μg)的總RNA樣本。包含核糖體RNA(rRNA)在內作為加載控制組。*rRNA的核前體(nuclear precursor)。下圖：透過使用抗核心抗體的天然瓊脂糖凝膠來測量衣殼顆粒。微管蛋白：細胞質標記物。在瓊脂糖凝膠或SDS-PAGE的每個泳道上加載等量的總蛋白。圖1B顯示HBV聚合酶對於細胞質和細胞核中的pgRNA包殼至關重要。本發明比較了WT HBV和突變體NES^CRM1-I和NES^CRM1-II(有或沒有功能性聚合酶(△Pol))之間的細胞核和細胞質中的包殼病毒RNA和總病毒RNA的程度。與圖1A中類似的實驗設計用於評估聚合酶(Pol)在細胞核中pgRNA包殼化的作用。透過與WT聚合酶共同轉染來挽救pgRNA包殼化的缺乏。藉由密度測定法(densitometry)和Image J軟體量化條帶強度，並且比率是以WT樣本的細胞質信號進行標準化。對於衣殼相關的RNA，整條泳道的信號都被用來量化。對於總細胞內病毒RNA，僅量化3.5kb pgRNA來進行比較。包括28S和18S rRNA都用於定量。WT：野生型。Cy：細胞質。Nu：細胞核。

圖2A至2F顯示早期病毒與CRM1抑制劑共同處理，可強烈抑制HBV感染系統中的pgRNA包殼和DNA合成。圖2A顯示執行免疫螢光顯微鏡測定(IFA)以分析HBc的亞細胞定位。無藥物的模擬處理表現出細胞質為主的HBc分佈模式(C(細胞質)>N(細胞核))。當HBV感 染在感染前3小時用病毒進入抑制劑(myr-preS1胜肽)處理時，並未檢測到HBc信號。然而，當病毒與化合物KPT-330或KPT-335共同處理時，HBc在9dpi時被強烈鎖定在細胞核中約150倍。這兩種藥物都是CRM1抑制劑。綠色：HBc。紅色：NTCP。藍色：DAPI。圖2B顯示將圖2A中IFA測定的定量結果總結於條狀圖中。***p<0.001。圖2C顯示使用HBV感染系統進行藥物處理的時程動力學實驗的概要。簡而言之，HepG2-NTCP-AS細胞的感染培養物在0、3和5dpi連續用KPT-335(0.5-1μM)處理，直到細胞收集。收集培養液以用於HBsAg和HBeAg的ELISA。收集細胞用於透過南方墨點法(SB)和北方墨點法(NB)進行進一步分析。圖2D顯示，透過ELISA，只有更早的共同處理可以抑制培養液中的HBsAg和HBeAg。圖2E和2F顯示在透過南方墨點法和北方墨點法分析的感染測定中，SINE化合物強烈抑制HBV DNA合成和細胞質中衣殼所包殼的pgRNA。透過SINE化合物(1μM)的處理可適度降低總細胞質病毒RNA的程度。鬆弛環狀(RC)DNA條帶強度的比較如圖1A-1B圖示中所述，並在此用無藥物處理控制組進行標準化。SS：單鏈RNA(single-strand RNA)。

圖3A至3C總結了HBc的核輸出信號以及pgRNA包殼發生地點在細胞質或細胞核中的模型。圖3A顯示HBc衣殼用於通過核孔進行核輸出的CRM1和Nup358。在cryoEM 3D重建密度圖中的藍色代表HBc衣殼顆粒的棘突(spike)。HBc蛋白包含兩個不同的核輸出域，各自由CRM1和NXF1所分別主導。NES^CRM1基序(motif)位於HBc 52-95的棘突尖端附近。NES^NXF1基序位於靠近HBc 147-183 C-末端的富含精胺酸的RNA結合域中。包殼pgRNA(10-20%)可以經由CRM1主導的機器輸出。相反地， 非包殼pgRNA(80%)可以透過NXF1所主導的機器輸出。HBc衣殼會先與CRM1結合後才能通過核孔複合體進行核輸出。Nup358：一種參與核輸出的核孔蛋白(nucleoporin)。圖3B顯示一個舊的法則認為病毒RNA包殼的動作起始細胞質中。而本發明則在此提出這種細胞質中的包殼事件只能在HBV生命週期的後期才會發生。圖3C顯示另一種新模型，其提出病毒包殼RNA的動作也可以起始於細胞核中，當病毒剛進入寄主細胞後不久的較早的時間點。在細胞核中組裝出來的這種未成熟衣殼會被迅速輸出到細胞質中，以利於進行後續的基因組成熟。在細胞質中，成熟的衣殼含有鬆弛環狀(RC)DNA，可以再循環回到細胞核中。如此透過重複地來回穿梭於細胞核與細胞質之間，核衣殼(nucleocapsids)可以擴增共價閉合的環狀cccDNA的數目(cccDNA pool)。這種於細胞核中啟動pgRNA包殼的新模型，可發生於HBV生命週期之早期，當pgRNA濃度尚處於較低時。其與在HBV生命週期後期，所可能發生的在細胞質中啟動pgRNA包殼的舊模型，並不相互排斥。Θ：CRM1抑制劑。Pol：聚合酶。

圖4顯示透過siRNA處理來降低CRM1可以顯著增加細胞核中HBc蛋白量。該降低效果顯示在左圖中。將野生型HBV基因組和siRNA共同轉染到HuH-7細胞中。IFA測定的定量結果繪製在右圖中。CRM1和NXF1特異性siRNA的聯合處理導致細胞核HBc的進一步累積。p值：**<0.01；***<0.001。TAP/NXF1基因(ON-TARGETplus SMARTpool)的siRNAs購自Dharmacon(美國)。對CRM1/XPO1基因具有特異性的siRNAs HSS111415、HSS111416、HSS111417購自Invitrogen公司(美國)。SiNonTarget在siRNA降低實驗中作為陰性控制組。

圖5顯示B型肝炎病毒在肝細胞培養物中總共分泌六種不同的病毒和亞病毒顆粒。所分泌的HBV病毒體、裸衣殼(naked capsids)和HBsAg顆粒以卡通圖顯示。左圖：含基因組的病毒體和無基因組的空病毒體，其都含有表面抗原和核心蛋白；中圖：含基因組和無基因組的裸衣殼，其不含表面抗原；右圖：HBV表面抗原顆，其不含核心蛋白。只有含有基因組的病毒體才具有傳染性。

圖6A和6B以卡通圖示呈現細胞外和細胞內HBV病毒和亞病毒顆粒的分析方法。圖6A顯示，在天然瓊脂糖凝膠電泳之前，培養液中的細胞外HBV顆粒會先透過蔗糖緩衝墊子(sucrose cushion)以超高速離心進行沉澱。透過南方墨點法和西方墨點法分析將病毒和亞病毒顆粒進行分離和表徵。抗HBc和抗HBs抗體連續用於同一張的西方墨點法過濾膜。南方墨點法則在單獨的瓊脂糖凝膠中進行，其可以區別含有基因組(G⁺)和不含基因組(G^-)的病毒和亞病毒顆粒。圖6B顯示透過PEG沉澱和核酸萃取將細胞內核心顆粒所包殼的病毒RNA和DNA純化出來。然後，透過北方墨點法和南方墨點法分析RNA/DNA信號。3.5kb pgRNA：全長3.5kb前基因組RNA。RT RNA：反轉錄進行中的RNA。

圖7A至7C顯示CRM1抑制劑阻斷HBV病毒體的分泌，但不阻斷裸衣殼。圖7A顯示WT-HBV病毒體和HBsAg顆粒的分泌被劑量反應曲線中0.1μM的SINE化合物強烈抑制。當SINE化合物濃度增加時，病毒體分泌明顯降低，而裸衣殼的分泌則對藥物處理的敏感度要低得多。同樣地，南方墨點法分析顯示與含有基因組的裸衣殼相比，含有基因組的病毒體的分泌則對SINE化合物更加敏感。圖7B顯示作為圖7A中細胞外 分泌概況的控制組，本發明透過SINE化合物處理於相同的劑量反應實驗中檢查細胞內WT-HBV衣殼蛋白、衣殼所包殼之病毒RNA和DNA。圖7C顯示對於具有複製缺陷的HBc NES突變體L65A/V89A，SINE化合物處理也能抑制無基因組空病毒體的分泌。該突變體也不分泌裸衣殼。V/NC：病毒體/裸衣殼。

圖8顯示在用CRM1抑制劑處理後透過阿爾瑪藍(alamarBlue)和CCK-8分析方法來監測細胞增殖。SINE化合物低於0.25μM時未檢測到任何顯著的抗增殖作用。

圖9顯示CRM1直接參與HBV病毒體分泌。在HuH-7細胞的HBV瞬時轉染系統中，慢病毒(Lentivirus)shCRM1 #1和#2顯著降低了CRM1的表現，並同時降低了HBV病毒體的分泌。條狀圖(右圖)是基於使用密度測定法(densitometry)和Image J的病毒體和裸衣殼(左圖)的信號強度。平均值是從至少三個獨立實驗所計算而得。shScramble：非特定控制組。垂直虛線表示來自同一凝膠的數據拼接。shScramble實驗中分泌的病毒體(實心條)和裸衣殼(空心條)的HBc蛋白信號在此處顯示為100%參考控制組。用於降低CRM1的慢病毒shRNA(ShCRM1：TRCN0000152787、TRCN0000150975、TRCN0000338401和TRC1.Scramble)是購自台灣中央研究院的RNAiCore。

圖10A和10B顯示兩種不同的HBV病毒體分泌模型。圖10A顯示當前所知的病毒體分泌模型，乃假設細胞質中之衣殼，可以獨立於細胞核的方式直接出芽(budding)進入ER/Golgi。圖10B顯示在本發明的新模型中，CRM1主導的HBc衣殼核輸出是緊接著微管所主導的轉運， 從位於核孔處的MTOC(微管組織中心(microtubule organization center))到核周邊的ER/Golgi，接著進行套膜(envelopment)和病毒體排出。包含有基因組和無基因組的衣殼都可以進行核質穿梭。Nu：細胞核。Cy：細胞質。ER：內質網。Golgi：高基氏體。

圖11顯示0.1μM的KPT-8602阻斷了HBV病毒體分泌。將HBV複製子質體轉染到HuH-7人類肝癌細胞株中。SINE化合物KPT-8602在轉染後0小時添加到轉染的培養物中(即共同處理)。轉染後第5天(120小時)收集細胞外培養液。病毒體分泌的測定如圖6A所述。裸衣殼的分泌對KPT-8602處理的敏感度比病毒體低100倍(10μM/0.1μM)。

圖12顯示KPT-8602，比起KPT-335，在0.1、0.25、0.5和1μM的濃度範圍內，更能有效抑制HBV病毒體分泌。與病毒體相比，裸衣殼的分泌對KPT-335或KPT-8602的敏感度要低得多。

本發明實施例可以有不同的實施內容，並不侷限於下文所列舉的實施例。以下實施例僅代表本發明的各個方面和特色。

第1部分：

本發明教示一種使用CRM1抑制劑阻斷HBV包殼化的前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)從細胞核向細胞質運輸的有效方法。此處的藥物標靶是HBV生命週期中的早期事件。

本發明鑑定了聚集在HBc蛋白顆粒(衣殼)的棘突尖端的CRM1特異性核輸出信號(CRM1-specific nuclear export signals，NES^CRM1)。NES^CRM1的突變會將HBc衣殼鎖定在細胞核中。

由於NES^CRM1突變體將HBc衣殼阻滯在細胞核中，本發明探詢這些衣殼是否含有任何HBV特異性RNA或DNA。在圖1A的上圖中，WT在細胞質中含有比在細胞核中更強的衣殼所包殼之HBV RNA信號(泳道1>>泳道3)。然而，在NES突變體中觀察到和WT相反的情況(泳道2<泳道4)。此結果表明(1)NES突變體的細胞核pgRNA信號不是來自細胞質pgRNA組分的污染；以及(2)它可能起源於被阻滯在細胞核中的包殼pgRNA。以另一種方向分析圖1A中的數據，上圖，比較泳道1與泳道2(5倍差異)以及泳道3與泳道4(1.3倍差異)中的衣殼所包殼之HBV RNA。同樣地，WT和NES突變體之間的細胞質中包殼pgRNA程度的巨大差異，其與它們在細胞核中的微小差異並無法對比。圖1A中的這些結果在圖1B的上圖中則忠實地重現。總之，HBV衣殼顆粒的棘突尖端上的NES^CRM1是含有HBV-RNA的衣殼之核輸出所需要的。

圖1A-1B中基因突變分析的結果也得到CRM1藥物處理實驗結果的支持(圖2A-2F)。KPT-330和KPT-335是已知的CRM1抑制劑。在HBV體外感染系統中，當在感染HBV之前或之後不久將KPT-330或KPT-335添加到細胞培養物中，透過免疫螢光顯微鏡，HBc被強烈鎖定在細胞核中(圖2A)。相對於無藥物處理的控制組，KPT-330和KPT-335可使細胞核內HBc蛋白量增加約150倍(圖2B)。HBsAg和HBeAg是HBV血清標誌物。在動力學實驗中，當透過ELISA測量培養液中的HBsAg和HBeAg時，如果是在3或5dpi才添加藥物，對HBV沒有明顯影響。然而，當藥物和病毒同時添加(共同處理)時，透過ELISA觀察到HBsAg和HBeAg的表現完全被抑制(圖2C和2D)。再者，如果與濃度為0.5-1μM的KPT-335 共同處理，則可強烈抑制HBV RNA包殼、DNA合成和HBc衣殼的形成(圖2E和2F)。

如圖3A的卡通圖所示，CRM1機器可以識別棘突尖端(藍色)處的NES^CRM1基序，從而促進HBc衣殼顆粒通過核孔的核輸出。圖1A-1B和2A-2F中的結果讓本發明提出了一種新的HBV生命週期模型(圖3B)。在這個新模型中，pgRNA包殼可能是發生在細胞核中的早期事件，並且從頭組裝之含有RNA的衣殼需要透過CRM1輸出到細胞質以進行反轉錄和DNA合成。相反的，在舊模型中(圖3C)，pgRNA包殼主要是發生在細胞質中。果真如此，CRM1抑制劑(KPT-335)理論上應該要對HBV生命週期沒有影響才對。因為KPT-335如果添加時間點是3或5dpi時，對HBV沒有影響，這表明pgRNA包殼的細胞質啟動，只能發生在HBV生命週期後期(3或5dpi)。

除了SINE化合物，例如KPT-335，CRM1也可以被siRNA處理所抑制。在圖4中，當CRM1或NXF1被各自的siRNA單獨抑制時，觀察到細胞核HBc增加了近20倍。組合siRNA處理對細胞核HBc產生了累加效應(增加約50倍)(圖4)。該siRNA實驗證實，CRM1特異性siRNA可以降低CRM1蛋白表現，從而導致細胞核中HBc蛋白的累積增加。在過去兩年(2021年至今)中，SARS-CoV-2 RNA疫苗已透過使用脂質包裹的奈米顆粒成功遞送。可想而知，CRM1特異性干擾RNA(siRNA、shRNA)也可以用類似的方式進行遞送來治療B型肝炎患者。

第二部分

本發明教示一種使用CRM1抑制劑阻斷HBV病毒體分泌 (排出、釋放)的有效方法。此處的藥物標靶是HBV生命週期中的一個非常晚期的事件。

本發明將提出另一個新發現，即CRM1抑制劑不僅可以抑制B型肝炎病毒之含有RNA衣殼的核輸出，還可以阻斷病毒體釋放。HBV在肝細胞培養物中總共分泌六種不同的病毒和亞病毒顆粒(圖5)。唯一的具感染力的顆粒是含有基因組的病毒體，其含有套膜蛋白(橙色)、衣殼(藍色)和包殼化的鬆弛環狀DNA基因組(黑色)。在圖6A和6B中，卡通圖說明了細胞外和細胞內HBV病毒和亞病毒顆粒的分析方法。在圖7A中，令人驚訝的是SINE化合物(KPT-335)在0.5μM時可以幾乎完全阻斷病毒顆粒的分泌。在此濃度下，則對衣殼蛋白和衣殼所包殼的RNA(RNA包殼化)沒有顯著影響(圖7B)。同樣地，同時添加病毒和KPT的共同處理，則對抗病毒體分泌最有效。在感染後1天添加藥物，則不能有效阻斷病毒體分泌(圖7C)。使用兩種不同的方法，阿爾瑪藍和CCK-8測定，評估KPT-335的潛在細胞毒性(圖8)。SINE化合物在0.25μM以下，則未檢測到對HuH-7細胞有任何顯著的抗增殖作用。

除了SINE化合物，另一種降低CRM1活性的方法是使用CRM1特異性干擾RNA，例如siRNA或shRNA。如圖9所示，CRM1特異性shRNA，shCRM1#1和shCRM1 #2，顯著減少了細胞內CRM1蛋白的量和分泌到細胞外的病毒體。正如前面圖4中所討論的，莫德納(Moderna)或BNT-Pfizer疫苗公司已使用脂質包封的奈米顆粒來成功證明了SARS-CoV-2 RNA疫苗的遞送。可想而知，CRM1特異性干擾RNA(siRNA、shRNA)也可以以類似的方式遞送來治療B型肝炎患者(圖4和9)。

在本發明的舊概念中(圖10A)，含有鬆弛環狀(RC)DNA的成熟基因組之HBV衣殼，可以透過從細胞質直接出芽進入內質網/高基氏體而分泌到細胞外區室。然而，圖5、6A-6B、7A-7C和8-9中的結果導致了一種新的HBV病毒體分泌的模型，即“細胞核繞道(en route)模型”(圖10B)。在該模型中，細胞質中HBV成熟衣殼的龐大二十面體顆粒(T=3或4)無法直接出芽進入內質網/高基氏體來進行套膜和排出。相反地，成熟的衣殼需要先進入細胞核，然後才能到達核周邊的內質網/高基氏體來分泌病毒體。因此，CRM1所主導的核輸出是HBV病毒體分泌的關鍵步驟。

第三部分

本發明呈現第二代SINE化合物KPT-8602(Eltanexor)之改良療效的新數據。在第一部分和第二部分的基礎上，本發明找到了一種治療B型肝炎患者的”一石二鳥”治療方法。

最近，第二代SINE化合物KPT-8602(Eltanexor)已經上市。KPT-8602在結構上與KPT-335(Verdinexor)相關，正在進行臨床試驗測試(例如，ClinicalTrials.gov標別號：NCT02649790)。使用以HBV複製子質體轉染的HuH-7肝癌細胞株，本發明發現了早期與0.1μM的KPT-8602共同處理，可以幾乎完全阻斷HBV病毒體分泌(圖11)。KPT-8602和KPT-335之間的並列比較表明KPT-8602比KPT-335更有效且細胞毒性更低(圖12)。

總結

在感染(圖2C-2F)和轉染系統(圖7C和11)中，較早與SINE化合物共同處理是成功抑制HBV基因表現、RNA包殼、DNA合成和病毒顆粒分泌的關鍵。當在感染或轉染後的較晚時間點(1、3或5dpi)才 將藥物添加到HBV細胞培養物中時，則觀察到對SINE化合物的抗藥性，進而導致沒有顯著的抗病毒作用。因此，對於慢性B型肝炎患者，其肝臟中的肝細胞絕大多數已經被HBV感染，用SINE化合物進行“短期”治療可能沒有任何清除病毒的功效。相對地，在“長期”治療中，未感染HBV的早期新生肝細胞亞群，會從再生肝臟的代謝更新中產生。因此，SINE化合物可以將長期治療方案中早期共同處理的易感窗口(susceptibility window)作為標靶。

本領域的技術人員將前述概述視為對用於傳送託管申請資訊的方法的描述。熟練的技術人員將認識到這些只是說明性的並且許多等效物都是可能的。

Claims (10)

1. 一種組合物用於製備治療B型肝炎病毒(HBV)感染所引起的相關疾病之症狀的藥物之用途，其中該組合物包含一治療有效量的CRM1抑制劑。
2. 如請求項1所述的用途，其中該HBV感染之相關疾病包含慢性肝病或病症、肝臟發炎、肝纖維化病況、增殖性肝細胞病症、肝細胞癌、D型肝炎病毒合併感染、急性HBV感染、慢性B型肝炎或慢性HBV感染。
3. 如請求項1所述的用途，其中該CRM1抑制劑包含一干擾RNA分子、KPT-330、KPT-8602、KPT-185、KPT-276、KPT-335或其衍生物。
4. 如請求項1所述的用途，其中該干擾RNA分子包含shRNA、siRNA、反義RNA、寡核苷酸或miRNA。
5. 如請求項1所述的用途，其中該CRM1抑制劑透過抑制HBV核心顆粒的核輸出路徑來治療HBV感染。
6. 如請求項1所述的用途，其中該組合物進一步包含抗HBV藥物。
7. 如請求項6所述的用途，其中該抗HBV藥物包含HBV聚合酶抑制劑、HBV免疫調節劑、細胞激素或干擾素。
8. 如請求項1所述的用途，其中該CRM1抑制劑的治療有效量範圍為0.01mg/kg至100mg/kg。
9. 如請求項1所述的用途，其中該組合物為每週施予。
10. 如請求項1所述的用途，其中該組合物的施予至少3個月。

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