TW202330913A - 突變的磺基轉移酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列。與野生型酶相比，突變的芳基磺基轉移酶可具有增強的將腺苷3',5'-二磷酸（adenosine 3',5'-bisphosphate，PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate，PAPS）的磺基轉移酶活性。
Description
本發明涉及具有增強特性的突變酶。本發明還涉及具有增強的硫酸化活性的突變的或非天然存在的芳基磺基轉移酶。本發明還涉及使用這些突變體硫酸化受質的方法。還提供了用於合成肝素化合物的方法和系統。
硫酸化是參與許多生物過程的綴合過程，所述生物過程包括蛋白質、肽或醣胺聚糖（GAG）的合成、解毒、激素調節、分子識別、細胞訊息傳遞或病毒進入細胞。
硫酸化反應需要作為催化劑的磺基轉移酶（SULT）和作為磺醯基（或磺基）供體的共受質。用於這些反應的通用供體是3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate，PAPS）。磺基轉移酶（SULTS）是將硫酸基團從PAPS通常轉移到目標受質的羥基上的酶家族。
由硫酸化過程產生的磺化醣胺聚糖（GAG）包括硫酸乙醯肝素（HS）和肝素。這些GAG是密切相關的高度硫酸化的多醣，其由與葡萄糖胺連接的葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的重複二糖單元組成，並參與許多重要的生物學和藥理學活性。
HS是細胞表面和胞外受質的組分，並參與廣泛的生理和病理生理功能，如凝血和病毒感染（Esko和Selleck (2002) Annu. Rev. Biochem. 71, 435-471；Liu和Thorp (2002) Med. Res. Rev. 22, 1-25）。它是一種包含含有N-和O-磺基二者的1→4連接的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸單元的高度帶電的多醣。
肝素是硫酸乙醯肝素的一種特殊形式，主要在肥大細胞顆粒的細胞內發現，並且是常用的抗凝藥物。市場上可以找到三種形式的肝素：未分級（UF）肝素（MW
平均約14000 Da）；低分子量肝素（MW
平均約6000 Da）；以及合成的ULMW肝素五糖（MW 1508.3 Da）。UF肝素由於其半衰期相對較短而用於手術和腎透析，而LMW肝素和ULMW肝素旨在用於預防高風險患者的靜脈血栓形成。
在體內，HS和肝素在內質網（ER）和高爾基體區室中生物合成。糖基轉移酶催化UDP活化的β-D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）殘基的交替添加以產生多醣鏈，隨後藉由
N-脫乙醯酶、C5-差向異構酶和磺基轉移酶對所述多醣鏈修飾。
N-脫乙醯酶/
N-磺基轉移酶（NDST）用
N-磺基替代
N-乙醯基，並且C5-差向異構酶和
O-磺基轉移酶（OST）一起作用以將GlcA轉化為α-L-艾杜糖醛酸（IdoA），然後轉化為IdoA2S（添加2-O-磺基）。D-葡萄糖胺殘基然後用6-
O-磺基轉移酶（6OST）修飾，然後用3-
O-磺基轉移酶（3OST）修飾。不同酶亞型的組織特異性表現微調HP和HS的合成以產生不同的結構，允許使功能適應局部細胞環境（Fu等人,
Adv Drug Deliv Rev. 2016;97:237-249）。
因為成功表現重組肝素生物合成酶，所以HS生物合成酶用於產生具有所需生物活性的大肝素和HS寡糖的應用現在是可能的（Fu等人,
Adv Drug Deliv Rev. 2016;97:237-249）。
在開發用於合成HS和肝素的生物過程中，OST在輔因子3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）的存在下作用於
N-磺基肝素原（Fu等人,
Adv Drug Deliv Rev. 2016;97:237-249）。3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）是一磷酸腺苷的衍生物，其在3′位被磷酸化並且具有附接至5′磷酸的硫酸基團。它是參與磺基轉移酶反應的最常見的輔酶。
涉及芳基磺基轉移酶-IV（AST-IV）的輔因子再循環系統可用於藉由以下方式將昂貴的輔因子3'-磷酸腺苷-5'-磷酸（adenosine 3',5'-bisphosphate，PAP）轉化為PAPS：將磺基從廉價的犧牲供體對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）轉移到PAP從而再生PAPS（Burkart等人,
J Org Chem. 2000;65(18):5565-5574；Xiong等人,
J Biotechnol. 2013;167(3):241-247）。這種系統已用於產生硫酸乙醯肝素（Chen等人,
J Biol Chem. 2005;280(52):42817-42825）和肝素（WO 2010/040973）。該反應還產生可以回收和化學磺化的對硝基苯酚（PNP）。這種輔因子再生系統節省成本，因為PAPS比pNPS昂貴近1000倍（Fu等人,
Adv Drug Deliv Rev. 2016;97:237-249）。
PAPS（一種通用硫酸鹽供體和所有磺基轉移酶的硫酸鹽來源）是一種非常昂貴且不穩定的分子，其一直是酶促硫酸化產物的大規模生產的障礙。
因此，需要優化PAP轉化或再循環為PAPS的產率。
已知在酶的胺基酸序列中引入突變會負面或正面地影響酶的催化活性。
Guo等人（
Chem Biol Interact. 1994;92(1-3):25-31）和Sheng等人（
Drug Metab Dispos. 2004;32(5):559-565）描述了突變的苯酚磺基轉移酶IV，其中突變誘導所述酶對於不同受質的相對特異性活性或立體特異性的改變。
Marshall等人（
J Biol Chem. 1997;272(14):9153-9160）和Lin等人（
Biochem Pharmacol. 2012;84(2):224-23）披露了具有各種氧化還原調節能力的大鼠苯酚磺基轉移酶（rSULT1A1）突變體。
Berger等人（
PLoS One. 2011;6(11):e26794）和Zhou等人（
3 Biotech. 2019;9(6):246）描述了具有增強的催化活性的人類芳基磺基轉移酶SULTA1突變體。
磺基轉移酶活性可以用本領域已知的各種測定來測量（Paul等人,
Anal Bioanal Chem. 2012;403(6):1491-1500）。
需要可用於將PAP轉化為PAPS的生物過程中的酶。
需要具有增強的將PAP轉化為PAPS的催化活性的酶。
需要具有增強的將PAP轉化為PAPS的催化活性的芳基磺基轉移酶，如大鼠芳基磺基轉移酶IV。
需要具有增強的熱穩定性的芳基磺基轉移酶，如大鼠芳基磺基轉移酶IV。
需要以較低成本及/或提高的產率硫酸化受質的方法。
需要以較低成本及/或提高的產率硫酸化N-硫酸化肝素原、硫酸乙醯肝素或硫酸肝素原的方法。
需要以較低成本及/或提高的產率生物合成肝素的方法。
需要用於生物合成肝素的方法，其可以使用再循環系統以將3'-磷酸腺苷-5'-磷酸（PAP）轉化為3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）。
本發明的目的是滿足這些需求的全部或部分。
根據本發明的目的之一，本發明涉及非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，條件是當所述芳基磺基轉移酶是大鼠芳基磺基轉移酶IV時，突變不是F138A及/或Y236A。
如說明本公開內容的
實例中所示，諸位發明人出人意料地獲得了一系列突變的芳基磺基轉移酶，其中一些胺基酸已被取代，具有增強的將3’,5’-腺苷-磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的催化活性。
本文公開的突變的芳基磺基轉移酶具有比野生型大鼠芳基磺基轉移酶的相應活性增強至少1.3倍至高達7倍的PAP
→PAPS轉化活性。
本文公開的突變的芳基磺基轉移酶可有利地用於硫酸化生物過程系統。
本文公開的突變的芳基磺基轉移酶可有利地用於硫酸化生物過程系統的再循環系統中，以增強PAP向PAPS的轉化活性，所述PAPS用作其他磺基轉移酶活性的輔酶輔因子。突變的芳基磺基轉移酶可有利地用於硫酸化生物過程系統中，以降低PAP積累對其他磺基轉移酶活性的抑制作用，同時還向系統持續提供主要硫供體分子PAPS。
本文公開的突變的芳基磺基轉移酶可有利地用於肝素合成生物過程系統中，以增強PAP向PAPS的轉化活性，所述PAPS用作涉及其他磺基轉移酶活性的再循環系統中的輔酶輔因子。換言之，本文公開的突變的芳基磺基轉移酶可有利地用於肝素合成生物過程系統中，以降低PAP積累對其他磺基轉移酶活性的抑制作用，同時還向系統持續提供主要硫供體分子PAPS。
本文有利地以低成本和高產率提供PAPS來源，以允許大規模合成硫酸化受質如硫酸乙醯肝素和肝素。
此外，本文提供了具有增強的將PAP轉化為PAPS的活性的突變的芳基磺基轉移酶，其可以容易地重組獲得。
本文公開的突變的非天然存在的芳基磺基轉移酶具有增強的熱及/或結構穩定性，從而導致更可持續及/或增強的催化活性。
本文有利地提供了以高產率和低成本獲得硫酸化受質如硫酸乙醯肝素和肝素的方法，從而允許有效的工業放大。
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
根據本發明的目的之一，本發明涉及非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，(ii) 與SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，和 (iii) 具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
根據本發明的目的之一，本發明涉及非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，(ii) 與SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，和 (iii) 具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在選自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195及/或263的至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或10個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在選自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195及/或263的不超過2個、或不超過3個、或不超過4個、或不超過5個、或不超過6個、或不超過7個、或不超過8個、或不超過9個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在胺基酸位置6、7、8、9和11處包含胺基酸取代。在這樣的實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自位置33、62、97、195及/或263的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在胺基酸位置33、62、97、195和263處包含胺基酸取代。在這樣的實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自位置6、7、8、9及/或11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195和263處，和視需要地在位置236處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、263和236處包含胺基酸取代。在這樣的實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在胺基酸位置195處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自位置17、20、138、236、239及/或244的至少1個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或6個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自位置17、20、138、236、239及/或244的不超過1個、或不超過2個、或不超過3個、或不超過4個、或不超過5個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含以下作為取代胺基酸：
-在位置6處的麩醯胺酸（Q）或天門冬醯胺酸（N），和在一些實施例中，在位置6處的取代胺基酸可以是麩醯胺酸（Q），
-在位置7處的天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E），並且在一些實施例中，在位置7處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D），
-在位置8處的丙胺酸（A）、甘胺酸（G）或擷胺酸（V），並且在一些實施例中，在位置8處的取代胺基酸可以是丙胺酸（A），
-在位置9處的甘胺酸（G）、丙胺酸（A）或擷胺酸（V），並且在一些實施例中，在位置9處的取代胺基酸可以是甘胺酸（G），
-在位置11處的白胺酸（L）、擷胺酸（V）或異白胺酸（I），並且在一些實施例中，在位置11處的取代胺基酸可以是白胺酸（L），
-在位置17處的苯丙胺酸（F）或酪胺酸（Y），
-在位置20處的異白胺酸（I）或白胺酸（L），
-在位置33處的精胺酸（R）、組胺酸（H）或離胺酸（K），並且在一些實施例中，在位置33處的取代胺基酸可以是精胺酸（R），
-在位置62處的天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E），並且在一些實施例中，在位置62處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D），
在位置97處的絲胺酸（S）或蘇胺酸（T），並且在一些實施例中，在位置97處的取代胺基酸可以是絲胺酸（S），
在位置138處的組胺酸（H）、離胺酸（K）或精胺酸（R），並且在一些實施例中，在位置138處的取代胺基酸可以是組胺酸（H），
-在位置195處的天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E），並且在一些實施例中，在位置195處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D），
-在位置236處的苯丙胺酸（F）或色胺酸（W），並且在一些實施例中，在位置236處的取代胺基酸可以是苯丙胺酸（F），
-在位置239處的天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E），並且在一些實施例中，在位置239處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D），
-在位置244處的天門冬醯胺酸（N）或麩醯胺酸（Q），及/或在一些實施例中，在位置244處的取代胺基酸可以是天門冬醯胺酸（N），
-在位置263處的組胺酸（H）、離胺酸（K）或精胺酸（R），並且在一些實施例中，在位置263處的取代胺基酸可以是組胺酸（H）。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含至少一個選自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17F、I17Y、F20L、F20I、W33R、K62D、A97S、F138H、N195D、Y236F、I239D、M244N、T263H及其組合的胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含胺基酸取代P6Q。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可包含選自W33R、K62D及其組合的胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D和T263H。在這樣的實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可包含至少一個選自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L及其組合的胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S和T263H。視需要地，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不包含取代N195D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可包含胺基酸取代Y236F。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以至少包含或可以僅包含胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、Y236F和T263H。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的胺基酸序列。非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的序列具有至少60%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的序列具有至少60%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其基本上類似於或大於具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.5倍、或至少1.8、或至少1.9、或至少2.0、或至少2.2、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.2、或至少3.5、或至少4.0、或至少4.5、或至少5.0、或至少5.5、或至少6.0、或至少6.5、或至少7.0倍。
根據本發明的目的之一，本發明涉及編碼本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的分離的核酸。
根據本發明的目的之一，本發明涉及包含本文公開的核酸的重組表現載體。
根據本發明的目的之一，本發明涉及包含本文公開的核酸或重組表現載體的體外或重組宿主細胞。
根據本發明的目的之一，本發明涉及用於硫酸化受質的套組，所述套組至少包含：
在第一容器中的一種本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶；和
在第二容器中的磺基供體。
在一些實施例中，在本文公開的套組中，磺基供體可以是芳基硫酸鹽化合物。
在一些實施例中，在本文公開的套組中，芳基硫酸鹽化合物是對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）。
在一些實施例中，本文公開的套組還可包含緩衝液。
在一些實施例中，在本文公開的套組中，緩衝液可以選自包含TRIS-緩衝液、磷酸鈉緩衝液和磷酸鉀緩衝液的群組。
根據本發明的目的之一，本發明涉及一種選擇非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的方法，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含至少一個胺基酸取代且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少基本上等於或大於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性，所述方法至少包括以下步驟：
a) 使包含至少一個胺基酸取代的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物與磺基供體在適於將磺基從磺基供體轉移至PAP的條件下接觸，以獲得PAPS，
b) 檢測PAPS的形成速率或量，
c) 將步驟b) 中獲得的PAPS的形成速率或量與參考速率或量進行比較，該參考速率或量進行比較係用SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV獲得的或用具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至-47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶所獲得，和
d) 選擇任何非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物候選物包含至少一個胺基酸取代且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少基本上等於或大於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
在一些實施例中，在本文公開的方法中，磺基供體可以是對硝基苯基硫酸鹽。
根據本發明的目的之一，本發明涉及一種非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含至少一個胺基酸取代且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，藉由本文公開的方法鑒定，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少基本上等於或大於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
根據本發明的目的之一，本發明涉及非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶用於硫酸化受質的用途，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，條件是當所述芳基磺基轉移酶是大鼠芳基磺基轉移酶IV時，突變不是F138A及/或Y236A。
在本文公開的用途中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
根據本發明的目的之一，本發明涉及非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶用於硫酸化受質的用途，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，(ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，和 (iii) 具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
替代性地，在本文公開的用途中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其基本上類似於或大於具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
根據本發明的目的之一，本發明涉及一種用於硫酸化受質的方法，其至少包括使所述待硫酸化的受質與以下物質在適於將磺基從磺基供體轉移到所述受質的條件下接觸的步驟：
a) 非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，條件是當所述芳基磺基轉移酶是大鼠芳基磺基轉移酶IV時，突變不是F138A及/或Y236A，和
b) 在適於將磺基從磺基供體轉移到所述受質的條件下的磺基供體。
根據本發明的目的之一，本發明涉及一種用於硫酸化受質的方法，其至少包括使所述待硫酸化的受質與以下物質在適於將磺基從磺基供體轉移到所述受質的條件下接觸的步驟：
a) 非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，(ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，和 (iii) 具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其為SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性的至少1.3倍，和
b) 在適於將磺基從磺基供體轉移到所述受質的條件下的磺基供體。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
替代性地，在本文公開的方法中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其基本上類似於或大於具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
根據本發明的目的之一，本發明涉及一種在適於將磺基從PAPS轉移到待硫酸化的受質並獲得硫酸化的受質和PAP的條件下用磺基轉移酶和PAPS硫酸化受質的方法，其至少包括藉由使如此獲得的PAP與以下物質：
(i) 非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (1) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (2) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，以及
(ii) 磺基供體
在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下接觸而將PAP轉化為PAPS的步驟。
在本文公開的用途或方法中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其為SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性的至少1.3倍。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
替代性地，在本文公開的用途或方法中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其基本上類似於或大於具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
在本文公開的方法中，可以將受質用一種或多種磺基轉移酶硫酸化以進行多次硫酸化。
在本文公開的方法中，可以相伴或依序進行多次硫酸化。
在本文公開的方法中，將PAP轉化為PAPS的步驟可以與硫酸化相伴進行或分開進行。
在本文公開的方法中，硫酸化步驟和將PAP轉化為PAPS的步驟可以在相同的反應混合物中相伴進行。
本文公開的方法還可以包括回收硫酸化受質的步驟。
在本文公開的用途或方法中，受質可選自包含以下的群組：腺苷3',5'-二磷酸（PAP）、多醣、乙醯肝素、硫酸肝素原、化學脫硫酸化的N-硫酸化（CDSNS）肝素、醣胺聚糖（GAG）、硫酸乙醯肝素或硫酸化肝素。
本文公開的用途或方法可用於將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）。
本文公開的用途或方法可用於製備肝素。
根據本發明的目的之一，本發明涉及一種用於將PAP再循環為PAPS的方法，其至少包括使所述PAP與以下物質在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下接觸的步驟：
a) 非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，以及
b) 在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下的磺基供體。
在本文公開的方法中，磺基供體可以是芳基硫酸鹽化合物。
芳基硫酸鹽化合物可以是對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）。
在本文公開的用途或方法中，可以將突變的非天然存在的芳基磺基轉移酶接枝到支持物上。
在本文公開的用途或方法中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的胺基酸序列。
在本文公開的用途或方法中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的序列具有至少60%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用下文所述的比色法測量。
替代性地，在本文公開的用途或方法中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的序列具有至少60%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
SEQ ID NO: 1表示大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 2表示來自智人的芳基磺基轉移酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 3表示來自原雞的芳基磺基轉移酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 4表示來自家牛的芳基磺基轉移酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 5表示包含突變I17F（Var01）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 6表示包含突變F20L（Var04）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 7表示包含突變F20I（Var03）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 8表示包含突變F138H（Var05）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 9表示包含突變Y236F（Var06）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 10表示包含突變M244N（Var07）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 11表示包含突變I17Y（Var02）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 12表示包含突變I239D（Var08）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 13表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（Var09）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 14表示包含突變P6Q（Var09-1）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 15表示包含突變P7D（Var09-2）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 16表示包含突變L8A（Var09-3）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 17表示包含突變V9G（Var09-4）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 18表示包含突變V11L（Var09-5）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 19表示包含突變W33R（Var09-6）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 20表示包含突變K62D（Var09-7）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 21表示包含突變A97S（Var09-8）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 22表示包含突變N195D（Var09-9）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 23表示包含突變T263H（Var09-10）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 24表示包含突變P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H（Var09沒有突變P6Q：「Var09-P6Q」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 25表示包含突變P6Q-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H（Var09沒有突變P7D：「Var09-P7D」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 26表示包含突變P6Q-P7D-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H（Var09沒有突變L8A：「Var09-L8A」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 27表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H（Var09沒有突變V9G：「Var09-V9G」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 28表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V9G-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H（Var09沒有突變V11L：「V11L」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 29表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-A97S-N195D-T263H（Var09沒有突變W33R：「Var09-W33R」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 30表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S-N195D-T263H（Var09沒有突變K62D：「Var09-K62D」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 31表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-N195D-T263H（Var09沒有突變A97S：「Var09-A97S」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 32表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-T263H（Var09沒有突變N195D：「Var09-N195D」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 33表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D（Var09沒有突變T263H：「Var09-T263H」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 34表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S-N195D（Var09沒有突變K62D和T263H：「Var09-K62D-T263H」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 35表示包含突變P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S（「Var09沒有突變K62D、N195D和T263H：Var09-K62D-N195D-T263H」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 36表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17F、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（Var09加突變I17F：「Var09+I17F」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 37表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17Y、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（Var09加突變I17Y：「Var09+I17Y」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 38表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、F20I、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（「Var09加突變F20I：Var09+F20I」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 39表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、F20L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（Var09加突變F20L：「Var09+F20L」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 40表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、F138H、N195D和T263H（Var09加突變F138H：「Var09+F138H」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 41表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、Y236F和T263H（Var09加突變Y236F「“Var09+Y236F」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 42表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、I239D和T263H（Var09加突變I239D：「Var09+I239D」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 43表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、M244N和T263H（「Var09加突變M244N：Var09+M244N」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 44表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L（「Var5A」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 45表示包含突變W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（「Var5B」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 46表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和W33R（「Var5A+W33R」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 47表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和K62D（「Var5A+K62D」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 48表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和A97S（「Var5A+A97S」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 49表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和N195D（「Var5A+N195D」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 50表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和T263H（「Var5A+T263H」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 51表示包含突變P6Q、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（「Var5B+P6Q」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 52表示包含突變P7D、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（「Var5B+P7D」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 53表示包含突變L8A、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（「Var5B+L8A」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 54表示包含突變V9G、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（「Var5B+V9G」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 55表示包含突變V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H（「Var5B+V11L」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 56表示包含突變P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、T263H和Y236F（Var09沒有N195D並加Y236F：「Var09-N195D+Y236F」）的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸序列。
定義
必須指出的是，除非上下文另外清楚地指出，否則如在本文以及在所附申請專利範圍中所用的，單數形式「
一個 / 一種（ a ）」、「
一個 / 一種（ an ）」以及「
所述（ the ）」包括複數指示物。除非內容另外清楚地指明，「
一個 / 一種（ a ）」和「
一個 / 一種（ an ）」意指「至少一個/至少一種」。
如本文所用的術語「
約」或「
大約」是指本技術領域的具有通常知識者容易知道的相應值的常用誤差範圍。本文對「約」某一值或參數的提及包括（並描述）針對所述值或參數本身的實施例。在一些實施例中，術語「約」是指給定值的± 10%。然而，只要所討論的值指代不可分割的對象，如分子或一旦細分就會失去其身份的其他對象，則「約」指代不可分割的對象的± 1。
在本文中，表述「
取代」和「
胺基酸取代」可互換使用，並且旨在表示一個胺基酸殘基被另一個取代。胺基酸取代可以是保守的或非保守的。「
保守胺基酸取代」是指一個胺基酸殘基被共用胺基酸側鏈的化學和物理特性（例如電荷、大小、疏水性/親水性）的另一個胺基酸殘基取代。被另一個替代的胺基酸稱為被取代的胺基酸。替代另一個的胺基酸稱為取代胺基酸。
在本文中，表述「
芳基磺基轉移酶」是指催化產物的硫酸鹽綴合的酶。例如，芳基磺基轉移酶可以在硫酸鹽供體（或磺基供體）如3'-磷酸腺苷醯硫酸或3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的存在下催化芳基部分如苯酚上的磺基轉移，以產生芳基硫酸鹽和硫酸鹽供體的代謝物，如腺苷3',5'-二磷酸或（PAP）。在合適的條件下，芳基磺基轉移酶也可以催化該反應的逆向，從而由PAP產生PAPS。
在本文中，表述「
芳基磺基轉移酶活性」旨在指芳基磺基轉移酶轉移PAP上的硫酸基團以產生PAPS的催化活性。磺基轉移酶活性可導致PAPS的產生，PAP的消失，反應中使用的磺基供體的消耗，或從磺基供體產生代謝物作為反應結果。
應理解的是，本文所述的本文的態樣和實施例包括「
具有」、「
包含」態樣和實施例，「
由 …… 組成」以及「
基本上由 …… 組成」。詞語「具有」和「包含」或諸如「具有」（「has」、「having」）、「包含」（「comprises」或「comprising」）等變體應理解為暗示包含一種或多種所述要素（如物質組合物或方法步驟），但不排除任何其他要素。術語「由……組成」暗示包含一種或多種所述要素，排除任何另外的要素。術語「基本上由……組成」暗示包含所述要素以及可能的一種或多種其他要素，其中所述一種或多種其他要素不會對本文的一種或多種基本特徵產生實質性影響。應理解，使用術語「包含」或等同術語的本文的不同實施例涵蓋了其中該術語被替換為「僅包含」、「由……組成」或「基本上由……組成」的實施例。
關於非天然存在的酶的表述「
增強的活性」旨在表示該酶具有與野生型酶相比增強的催化活性或熱穩定性或結構穩定性。
在本文中，關於化合物或實體（例如酶）的表述「
分離的」是指該化合物或實體處於與該化合物或實體可天然存在的環境不同的環境中。「分離的」意指包括如下樣品中的化合物或實體，所述樣品基本上富含該化合物或實體及/或所述樣品中該化合物或實體是部分或基本上純化的。在一些情況下，分離的化合物或實體（例如蛋白質，如突變的芳基磺基轉移酶；核酸；重組載體）是純化的，例如其純度為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或大於99%。
在本文中，如本文關於核酸、肽、多肽或蛋白質使用的表述「
非天然存在的」是指在自然界中未發現的任何核酸、肽、多肽或蛋白質。
在本文中，如本文關於肽、多肽或蛋白質使用的表述「
突變體」是指包含至少一個胺基酸突變的任何肽、多肽或蛋白質。「胺基酸突變」和「突變」可互換使用並且旨在指代與野生型或天然存在的對應物相比，胺基酸的取代、缺失或插入。特別地，突變肽、多肽或蛋白質可以包含至少一個胺基酸取代。
本文所用的「
重組蛋白質」旨在指代用重組DNA產生的蛋白質。「
重組 DNA」是指藉由從不同來源或相同來源的另一部分剪接DNA片段，然後引入受體（宿主）細胞中而形成的基因工程化DNA分子。例如，重組蛋白質可以藉由將相應的編碼核酸插入質體載體中並將載體遞送到適於表現蛋白質的宿主細胞中來產生。
在本文中，關於變化所使用的術語「
顯著」旨在意指觀察到的變化是明顯的及/或它具有統計學意義。
在本文中，與本文的特徵結合使用的術語「
基本上」旨在定義與該特徵相關的在很大程度上類似於該特徵但不完全類似於該特徵的一組實施例。與給定特徵相關的一組實施例與給定特徵之間的區別使得在該組實施例中，給定特徵的性質和功能沒有受到實質影響。
在本文中，用於相對於參考酶的催化活性限定給定酶的催化活性的表述「
基本上等於或大於」旨在定義 (i) 當用相同的方案和條件測量時，兩種酶的催化活性不顯著不同，或 (ii) 當用相同的方案和條件測量時，給定酶的催化活性顯著高於參考酶的催化活性。顯著高於參考催化活性的催化活性可以例如比參考催化所述活性高至少1.3倍，例如比參考催化所述活性高至少2、3或4倍。
本文所用的術語「
硫酸化」是指將磺酸鹽或磺醯基從一個分子轉移到另一個分子。
應理解的是，為了清晰起見，在單獨實施例的背景中描述的本發明的某些特徵也可以在單個實施例中組合提供。相反的，為了簡潔起見，在單個實施例的背景中描述的本發明的多種特徵也可以單獨提供或以任何合適的子組合來提供。
除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科技術語均具有與本發明所屬領域的普通具有通常知識者通常所理解的相同含義。但是與本文所述的類似或等同的任何方法和材料也可以用於實踐或測試本發明。將本文提及的所有出版物均藉由引用併入本文，以公開和描述與引用出版物相關的方法及/或材料。
列出了如下文所述的來源、成分和組分的清單，它們的組合和混合物也被考慮並且落在本文的範圍內。
應理解在本說明書通篇中給出的每一個最大數值限制包括每一個較低數值限制，如同此類較低數值限制被明確地書寫在本文中一樣。在本說明書通篇中給出的每一個最小數值限制將包括每一個較高數值限制，如同此類較高數值限制被明確地書寫在本文中一樣。在本說明書通篇中給出的每一個數值範圍將包括落在這種較寬的數值範圍內的每一個較窄數值範圍，如同此類較窄數值範圍都被明確地書寫在本文中一樣。
所有項目列表，例如成分列表，旨在並且應解釋為馬庫西群組。因此，所有列表都可以被閱讀和解釋為「選自項目的列表」的項目「及其組合和混合物」。
本文引用的可以是包括在本文中使用的各種成分的組分的商品名。本文的諸位發明人不意圖受到任何特定商品名下的材料的限制。與以商品名引用的材料等同的材料（例如，以不同名稱或參考編號從不同來源獲得的材料）可以在本文的描述中被取代和使用。
芳基磺基轉移酶突變體
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含如下胺基酸序列或由如下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO: 1（大鼠芳基磺基轉移酶IV或大鼠AST IV的序列）具有至少60%同一性並且在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，胺基酸位置是相對於SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV而言的。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以是包含本文公開的胺基酸取代及其組合的SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含除上文指出的突變以外的其他突變，條件是另外的突變不會負面影響本文公開的突變體的特性，特別是與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的硫酸化活性相比顯示的增強的硫酸化活性。
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高約至少1.3倍。
可以根據本領域中任何已知的方法檢測和測量芳基磺基轉移酶活性。在一些實施例中，與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用比色法測量。在一些實施例中，比色法允許根據以下方案反應測量藉由將磺醯基從對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）轉移到3’,5’-腺苷-磷酸（PAP）以產生3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）而釋放（或產生）的對硝基苯基（pNP）的量：PAP + pNPS
→PAPS + pNP
該方法可以包括以下步驟：
a) 使例如在細菌中表現或在表現所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的細菌的裂解物中提供或以純化形式提供的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶與足量的pNPS和PAP在合適的緩衝液中接觸，
b) 獲得代表在步驟a) 產生的pNP的測量值，
c) 使例如在細菌中表現或在表現所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的細菌的裂解物中提供或以純化形式提供的SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV與足量的pNPS和PAP在合適的緩衝液中接觸，
d) 獲得代表在步驟c) 產生的pNP的測量值，以及
e) 比較在步驟b) 和步驟d) 獲得的測量值。
適於表現突變型或野生型芳基磺基轉移酶（如SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV）的細菌可以是大腸桿菌BL21 DE3。無論以何種方式提供，適於反應的酶量可以為約30 ng/μL。
當使用30 ng/μL酶時，足夠量的pNPS和PAP可分別為約1 mM和約0.23 mM。
代表反應期間產生的pNP的測量值可以藉由測量404 nm處的光密度來獲得，例如根據製造商的建議使用來自Molecular Devices的SpectraMax® 190測量。獲得的測量值可以以任意吸光度單位表示。
用於反應的合適緩衝液可以是pH 7.0的磷酸鹽緩衝液，其包含10%的甘油。
合適的反應溫度可為約37ºC。
測量值的獲得可以在反應開始後10、30或90分鐘進行，例如在反應開始後10分鐘進行。
在一些實施例中，可以減去空白以標準化所獲得的測量值。空白可以是水或不含酶和受質的緩衝液。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的突變的芳基磺基轉移酶中的任一個的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 5的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 6的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 7的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 8的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 9的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 10的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 11的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 12的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 13的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 14的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 15的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 16的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 17的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 18的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 19的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 20的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 21的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 22的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 23的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 25的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 26的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 27的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 28的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 29的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 30的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 31的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 32的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 33的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 34的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 35的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 41的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 45的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 46的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 47的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 49的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 50的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 51的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 52的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 53的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 54的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 55的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 56的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含如下胺基酸序列或由如下胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO: 1（大鼠芳基磺基轉移酶IV或大鼠AST IV的序列）具有至少60%同一性並且在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，胺基酸位置是相對於SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV而言的，並具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍。至少約1.3倍的活性增加可以用文中所述的比色法測量。
在一些其他實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不包含除上文指出的位置以外的其他位置處的突變。
在說明書中，被取代的胺基酸的位置相對於胺基酸序列SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的胺基酸位置給出。
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶是分離的蛋白質。
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶是重組蛋白質。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少85%、90%、95%或99%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少90%、95%或99%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少90%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少95%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少99%同一性。
可以使用已知方法測量序列的同源性或同一性。例如，UWGCG套裝軟體提供了BESTFIT程式，其可用於計算同源性（例如以其默認設置使用）（Devereux等人 (1984)
Nucleic Acids Research12, 387-395）。PILEUP和BLAST演算法可用於計算同源性或排列序列（通常採用它們的默認設置），例如Altschul S. F. (1993)
J Mol Evol36:290-300；Altschul, S, F等人 (1990)
J Mol Biol215:403-10中所述。
用於進行BLAST分析的軟體是可藉由國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information）公開獲得的（www.ncbi.nlm.nih.gov/）。這種演算法涉及首先藉由鑒定查詢序列中長度W的短字來鑒定高評分序列對（HSP），所述短字在與資料庫序列中相同長度的字比對時，匹配或符合一定的正值閾值得分T。T稱為相鄰字得分閾值（Altschul等人，同上）。這些初始相鄰字命中用作開始搜索的種子，以發現含有該種子的HSP。沿每個序列在兩個方向上延長字命中，只要可以增加累積比對得分即可。在累積比對得分從其最大達成值下降數量X時；在累積得分由於一個或多個負評分殘基比對的積累而變為零或更低時；或在到達任一序列的末端時，停止每一方向上的字命中延伸。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLAST程式預設使用11的字長（W），BLOSUM62評分矩陣（參見Henikoff和Henikoff (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）比對（B）為50，期望值（E）為10，M=5，N=4，並比較兩條鏈。
BLAST演算法對兩個序列之間的相似性進行統計分析；參見例如，Karlin和Altschul (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 5873-5787。BLAST演算法提供的一個相似性量度是最小總和概率（P(N)），其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列與第二序列比較的最小和概率小於約1，較佳小於約0.1，更佳小於約0.01，以及最佳小於約0.001，則認為序列與另一序列相似。
儘管藉由參考胺基酸序列SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV中的胺基酸位置來定義突變，但也涵蓋與SEQ ID NO: 1共用至少60%，或至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%胺基酸同一性的芳基磺基轉移酶同源物的多肽鏈中的同源或相應位置處的等效取代。藉由參考胺基酸序列SEQ ID NO: 1確定等效位置。基於序列之間的同源性，藉由排列同源物和SEQ ID NO: 1的序列，可以容易地推斷出同源或相應位置。PILEUP和BLAST演算法可用於排列序列。
作為適用於本文的同源序列的實例，可列舉智人（SEQ ID NO: 2）、原雞（SEQ ID NO: 3）或家牛（SEQ ID NO: 4）的芳基磺基轉移酶的序列。
在一些實施例中，當非天然存在的芳基磺基轉移酶是大鼠芳基磺基轉移酶IV時，取代不是F138A及/或Y236A。例如，當非天然存在的芳基磺基轉移酶是大鼠芳基磺基轉移酶IV並且包含一個或兩個突變時，它們不是F138A及/或Y236A。
在一些實施例中，酶突變體不包含以下取代中的任一個：I239M、F138A、Y236A，胺基酸位置是相對於SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV而言的。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不是以下序列中的任一個：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263的任何胺基酸位置處或胺基酸位置的任何組合處包含胺基酸取代。它們可以包含僅1至最多16個取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，並且其活性與序列SEQ ID NO: 1的野生型芳基磺基轉移酶相比增強。增強的活性可以是增強的催化活性、或熱穩定性或結構穩定性。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，並且與序列SEQ ID NO: 1的野生型芳基磺基轉移酶相比具有增強的磺基轉移酶催化活性。
位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263及其組合中任一處的胺基酸取代可有利地影響突變體的磺基轉移酶催化活性。與序列SEQ ID NO: 1的野生型芳基磺基轉移酶相比，具有這樣的突變的突變體可以具有增強至少1.3倍的磺基轉移酶活性。
與序列SEQ ID NO: 1的野生型芳基磺基轉移酶相比，位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263及其組合中任一處的胺基酸取代可具有增強的熱及/或結構穩定性。在這些位置的任一處的胺基酸取代可以有利地影響突變體的熱穩定性。位置33、62、97、195、263及其組合中任一處（例如在所有位置）的胺基酸取代可具有增強的熱穩定性。突變體的熱穩定性可以比野生型芳基磺基轉移酶高至少約1ºC、約2ºC、約3ºC、約4ºC、約5ºC、約6ºC、約10ºC、約15ºC、約20ºC或更高，例如高約1ºC至30ºC、約2ºC至25ºC、約3ºC至20ºC、約4ºC至15ºC、約5ºC至10ºC或約6ºC。突變體的熱穩定性可以比野生型芳基磺基轉移酶高至少約1ºC至約6ºC，或約1ºC、2ºC、3ºC、4ºC、5ºC或約6ºC。如本文所用的，「
熱穩定性」是指當暴露於較高溫度時蛋白質的穩定性；熱穩定的突變蛋白與野生型蛋白相比在更高的溫度下保持其構形。
在其他實施例中，胺基酸取代可以在位置17、20、138、236、239、244及其組合中的任一處。取自該組取代位置中的單獨或組合的取代可有利地影響突變體的磺基轉移酶活性。與序列SEQ ID NO: 1的野生型芳基磺基轉移酶相比，具有這樣的突變的突變體可以具有增強至少1.3倍的磺基轉移酶活性。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在選自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195和263的位置處包含至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或10個胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在選自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195和263的位置處包含不超過2個、或不超過3個、或不超過4個、或不超過5個、或不超過6個、或不超過7個、或不超過8個、或不超過9個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在選自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195和263的位置處包含至少5個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以至少包含至少在位置6處的胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以至少包含在選自位置33、62、97、195和263的位置處的胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以至少包含在選自位置6、33、62、97、195和263的位置處的胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以至少在所有胺基酸位置6、7、8、9和11處包含胺基酸取代。在所有位置6、7、8、9和11處包含胺基酸取代的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還在選自位置33、62、97、195和263的至少一個或至少兩個胺基酸位置處包含胺基酸取代。在所有位置6、7、8、9和11處包含胺基酸取代的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還在選自位置33、62、195和263的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，並且在位置97處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11和33處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置62、97、195和263的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11和62處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置33、97、195和263的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11和97處包含胺基酸取代，並且在選自位置33、62、195和263的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11和195處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置33、62、97和263的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置33、62、97和195的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
至少在所有位置6、7、8、9和11處包含胺基酸取代的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自位置33、62、195和263的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
至少在所有胺基酸位置6、7、8、9和11處包含胺基酸取代的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自位置33、62和263的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9和11處包含胺基酸取代，並且在選自位置33和62的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9和11處包含胺基酸取代，在位置97處不包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶在位置97處不包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以至少在所有胺基酸位置33、62、97、195和263處包含胺基酸取代。在所有胺基酸位置33、62、97、195和263處包含胺基酸取代的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可在選自位置6、7、8、9和11的群組的胺基酸位置處包含至少一個胺基酸取代突變。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置33、62、97、195、263和6處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置7、8、9和11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置33、62、97、195、263和7處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置6、8、9和11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置33、62、97、195、263和8處包含胺基酸取代，並且視需要地至少在選自位置6、7、9和11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置33、62、97、195、263和9處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置6、7、8和11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置33、62、97、195、263和11處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置6、7、8和9的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、33、62、97、195和263處包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、33、62、97、195、263和236處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置7、8、9和11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、33、62、195、263和236處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置7、8、9和11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、33、62、195、263和236處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置7、8、9和11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，並且在位置97處不包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、33、62、97、263和236處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置7、8、9和11的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，並且在位置195處不包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97和263處包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195和263處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、8、9、11、33、62、97、195和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置7處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、9、11、33、62、97、195和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置8處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、11、33、62、97、195和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置9處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、9、33、62、97、195和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置11處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、62、97、195和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置33處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、97、195和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置62處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、195和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置97處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97和263處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置195處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97和195處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置263處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、97和195處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置62及/或263處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33和97處包含胺基酸取代，並且視需要地在位置62、195及/或263處不包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶在位置195處不包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶在位置97處不包含胺基酸取代。
在另外的實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自位置17、20、138、236、239和244的至少1個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個胺基酸位置處包含胺基酸取代。替代性地，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自位置17、20、138、236、239和244的不超過1個、或不超過2個、或不超過3個、或不超過4個、或不超過5個胺基酸位置處包含胺基酸取代。在另外的實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在選自位置17、20、138、236、239和244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，其獨立於（或沒有）在胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195和263處包含胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195和263處包含胺基酸取代，並且可能在選自位置17、20、138、236、239和244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以至少在位置6和236處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在胺基酸位置6和236處包含胺基酸取代，並且在位置97及/或195處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263和
17處包含胺基酸取代，並且至少在選自位置20、138、236、239和244的一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263和20處包含胺基酸取代，並且在選自位置17、138、236、239和244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263和138處包含胺基酸取代，並且在選自位置17、20、236、239和244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263和236處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置17、20、138、239和244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、263和236處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置17、20、138、239和244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、263和236處包含胺基酸取代，並且視需要地在選自位置17、20、138、239和244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，並且在位置195處不包含胺基酸取代。
天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、263和236處包含胺基酸取代，並且在位置195處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263和239處包含胺基酸取代，並且在選自位置17、20、138、236和244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少在所有胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263和244處包含胺基酸取代，並且至少在選自位置17、20、138、236和239的一個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
在一些實施例中，取代可以是保守的，即將一種胺基酸用具有類似化學結構、類似化學特性或類似側鏈體積的另一種胺基酸替代。引入的胺基酸可以具有與它們替代的胺基酸類似的極性、親水性或疏水性。保守胺基酸改變是本領域熟知的。保守胺基酸改變也可以藉由參考胺基酸序列保守性評分矩陣的點接受突變（PAM）或模組取代矩陣（BLOSUM）家族來確定。因此，保守胺基酸改變可以是等效組的成員，即在選擇用於比對參考多肽鏈和突變多肽鏈的評分矩陣的相似性表示中具有相互正得分的一組胺基酸。
例如，保守取代可以是一類胺基酸被同一類胺基酸取代：
表 1 ：胺基酸類別
| 類別 | 胺基酸 | 單字母代碼 |
| 脂肪族 | 甘胺酸、丙胺酸、擷胺酸、白胺酸、異白胺酸 | G、A、V、L、I |
| 含羥基或硫/硒 | 絲胺酸、半胱胺酸、硒半胱胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸 | S、C、U、T、M |
| 環狀 | 脯胺酸 | P |
| 芳香族 | 苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸 | F、Y、W |
| 鹼性 | 組胺酸、離胺酸、精胺酸 | H、K、R |
| 酸性及其醯胺 | 天門冬胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸 | D、E、N、Q |
替代性地，保守取代可以是一類胺基酸被另一類的但具有類似化學結構、類似化學特性及/或類似側鏈體積的胺基酸取代。
替代性地，在一些實施例中，取代突變可以是非保守突變，其將一類胺基酸用具有非類似化學結構、非類似化學性質及/或非類似側鏈體積的胺基酸替代。
例如，給出了可能的保守突變的表格：
表 2 ：保守胺基酸取代
| 胺基酸 （單字母代碼） | 保守取代 |
| A | G、S、T、V |
| C | S、T、M |
| D | S、K、Q、H、N、E |
| E | P、D、S、R、K、Q、H、N |
| F | M、V、I、L、W、Y |
| G | A、S、N |
| H | D、E、N、M、R、Q |
| I | M、V、Y、F、L |
| K | D、E、N、Q、R |
| L | M、V、I、Y、F |
| M | H、Q、Y、F、L、I、V |
| N | G、D、E、T、S、R、K、Q、H |
| P | E、A、T、G |
| Q | D、E、N、H、M、S、R、K |
| R | E、N、H、Q、K |
| S | G、D、E、N、Q、A、T |
| T | N、S、V、A |
| V | T、A、M、F、L、I |
| W | F、Y |
| Y | H、M、I、L、F、W |
在一些實施例中，本文公開的突變的芳基磺基轉移酶可包含保守和非保守取代。
位置6處的取代胺基酸可以是麩醯胺酸（Q）或天門冬醯胺酸（N）。在一些實施例中，位置6處的取代胺基酸可以是麩醯胺酸（Q）。
位置7處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E）。在一些實施例中，位置7處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D）。
位置8處的取代胺基酸可以是丙胺酸（A）、甘胺酸（G）或擷胺酸（V）。在一些實施例中，位置8處的取代胺基酸可以是丙胺酸（A）。
位置9處的取代胺基酸可以是甘胺酸（G）、丙胺酸（A）或擷胺酸（V）。在一些實施例中，位置9處的取代胺基酸可以是甘胺酸（G）。
位置11處的取代胺基酸可以是白胺酸（L）、擷胺酸（V）或異白胺酸（I）。在一些實施例中，位置11處的取代胺基酸可以是白胺酸（L）。
位置17處的取代胺基酸可以是苯丙胺酸（F）或酪胺酸（Y）。
位置20處的取代胺基酸可以是異白胺酸（I）或白胺酸（L）。
位置33處的取代胺基酸可以是精胺酸（R）、組胺酸（H）或離胺酸（K）。在一些實施例中，位置33處的取代胺基酸可以是精胺酸（R）。
位置62處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E）。在一些實施例中，位置62處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D）。
位置97處的取代胺基酸可以是絲胺酸（S）或蘇胺酸（T）。在一些實施例中，位置97處的取代胺基酸可以是絲胺酸（S）。
位置138處的取代胺基酸可以是組胺酸（H）、離胺酸（K）或精胺酸（R）。在一些實施例中，位置138處的取代胺基酸可以是組胺酸（H）。
位置195處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E）。在一些實施例中，位置195處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D）。
位置236處的取代胺基酸可以是苯丙胺酸（F）或色胺酸（W）。在一些實施例中，位置236處的取代胺基酸可以是苯丙胺酸（F）。
位置239處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E）。在一些實施例中，位置239處的取代胺基酸可以是天門冬胺酸（D）。
位置244處的取代胺基酸可以是天門冬醯胺酸（N）或麩醯胺酸（Q）。在一些實施例中，位置244處的取代胺基酸可以是天門冬醯胺酸（N）。
位置263處的取代胺基酸可以是組胺酸（H）、離胺酸（K）或精胺酸（R）。在一些實施例中，位置263處的取代胺基酸可以是組胺酸（H）。
在一些實施例中，胺基酸取代不是F138A及/或Y236A。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17F、I17Y、F20L、F20I、W33R、K62D、A97S、F138H、N195D、Y236F、I239D、M244N和T263H及其組合。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H及其組合。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含胺基酸取代P6Q。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L。包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可還包含選自W33R、K62D、A97S、N195D和T263H的至少一個或至少兩個胺基酸取代。包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可包含選自W33R、K62D、N195D和T263H的至少一個胺基酸取代，並且不包含胺基酸取代A97S。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和W33R，以及視需要地選自K62D、A97S、N195D和T263H的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和K62D，以及視需要地選自W33R、A97S、N195D和T263H的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和A97S，以及選自W33R、K62D、N195D和T263H的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和N195D，以及視需要地選自W33R、K62D、A97S和T263H的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L和T263H，以及視需要地選自W33R、K62D、A97S和N195D的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L，以及視需要地選自W33R、K62D、N195D和T263H的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L，可還包含選自W33R、K62D和T263H的至少一個胺基酸取代。
包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可包含選自W33R和K62D的至少一個胺基酸取代。
在一些實施例中，包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不包含胺基酸取代A97S。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D和T263H。包含所有胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D和T263H的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可包含選自P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和P6Q，以及視需要地選自P7D、L8A、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和P7D，以及視需要地選自P6Q、L8A、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和L8A，以及視需要地選自P6Q、P7D、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和V9G，以及視需要地選自P6Q、P7D、L8A和V11L的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和V11L，以及視需要地選自P6Q、P7D、L8A和V9G的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有位置W33R、K62D、A97S、N195D和T263H處包含胺基酸取代，以及視需要地選自P6Q及/或Y236F的胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有位置P6Q、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H處包含胺基酸取代，以及視需要地選自P7D、L8A、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有位置P6Q、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和Y236F處包含胺基酸取代，以及視需要地選自P7D、L8A、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有位置P6Q、W33R、K62D、N195D、T263H和Y236F處包含胺基酸取代，以及視需要地選自P7D、L8A、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不包含胺基酸取代A97S。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有位置P6Q、W33R、K62D、N195D、T263H和Y236F處包含胺基酸取代，以及視需要地選自P7D、L8A、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代，並且不包含胺基酸取代A97S。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不包含胺基酸取代N195D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在所有位置P6Q、W33R、K62D、T263H和Y236F處包含胺基酸取代，以及視需要地選自P7D、L8A、V9G和V11L的至少一個胺基酸取代，並且不包含胺基酸取代N195D。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含選自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H的胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，並且視需要地不包含胺基酸取代P7D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，並且視需要地不包含胺基酸取代L8A。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，並且視需要地不包含胺基酸取代V9G。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，並且視需要地不包含胺基酸取代V11L。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、K62D、A97S、N195D和T263H，並且視需要地不包含胺基酸取代W33R。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、A97S、N195D和T263H，並且視需要地不包含胺基酸取代K62D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、N195D和T263H，並且視需要地不包含胺基酸取代A97S。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S和T263H，並且視需要地不包含胺基酸取代N195D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S和N195D，並且視需要地不包含胺基酸取代T263H。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、A97S和N195D，並且視需要地不包含胺基酸取代K62D及/或T263H。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R和A97S，並且視需要地不包含胺基酸取代K62D、N195D及/或T263H。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不包含胺基酸取代N195D。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不包含胺基酸取代A97S。
在另外的實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可包含選自包含以下的群組的至少一個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個胺基酸取代：I17、F20、F138、Y236、I239、M244及其組合。替代性地，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶還可以在選自I17、F20、F138、Y236、239和IM244的不超過1個、或不超過2個、或不超過3個、或不超過4個、或不超過5個胺基酸位置處包含胺基酸取代。在另外的實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可在選自I17、F20、F138、Y236、239和IM244的至少一個胺基酸位置處包含胺基酸取代，其獨立於（或沒有）選自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H的胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S和T263H，並且可能包含選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：I17F、I17Y、F20L、F20I、F138H、Y236F、I239D、M244N及其組合。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含胺基酸取代P6Q和Y236F。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含胺基酸取代P6Q和Y236F，並且在位置97及/或195處不包含胺基酸取代。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含胺基酸取代P6Q和Y236F，並且不包含胺基酸取代A97S及/或N195D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及視需要地Y236F。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸P7D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代L8A。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代V9G。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代V11L。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、K62D、A97S、N195D和T263H，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代W33R。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、A97S、N195D和T263H，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代K62D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、N195D和T263H，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代A97S。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S和T263H，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代N195D。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S和N195D，以及視需要地Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代T263H。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、T263H和Y236F，並且視需要地不包含胺基酸取代N195D。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和I17F，以及選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：F20L、F20I、F138H、Y236F、I239D、M244N及其組合。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和I17Y，以及選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：F20L、F20I、F138H、Y236F、I239D、M244N及其組合。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和F20L，以及選自包含以下的組的至少一個胺基酸取代：I17F、I17Y、F138H、Y236F、I239D、M244N及其組合。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和F20I，以及選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：I17F、I17Y、F138H、Y236F、I239D、M244N及其組合。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和F138H，以及選自I17F、I17Y、F20I、F20L、Y236F、I239D、M244N及其組合的至少一個胺基酸取代。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和Y236F，以及視需要地包含選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、I239D、M244N及其組合。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、T263H和Y236F，以及視需要地包含選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、I239D、M244N及其組合，並且視需要地不包含胺基酸取代N195D。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、N195D、T263H和Y236F，以及視需要地包含選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、I239D、M244N及其組合，並且視需要地不包含胺基酸取代A97S。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、T263H和Y236F，並且不包含胺基酸取代N195D。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和I239D，以及選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、Y236F、M244N及其組合。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可至少包含所有胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H和M244N，以及選自包含以下的群組的至少一個胺基酸取代：I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、Y236F、I239D及其組合。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以是包含本文公開的胺基酸取代及其組合的SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV。
非天然存在的芳基磺基轉移酶可以包含或可以是如下表3中所列的胺基酸序列：
表 3 ：芳基磺基轉移酶突變體的序列
| 突變體（ Var ） | SEQ ID NO: | 序列 |
| Var01 I17F | 5 | MEFSRPPLVHVKGIPLFKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var04 F20L | 6 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYLAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var03 F20l | 7 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYIAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var05 F138H | 8 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNHYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var06 Y236F | 9 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNFTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Va07 M244N | 10 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEINDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var 02 I17Y | 11 | MEFSRPPLVHVKGIPLYKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var08 I239D | 12 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTDPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 P6Q P7D L8A V9G V11L W33R K62D A97S N195D T263H | 13 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-01 P6Q | 14 | MEFSRQPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-02 P7D | 15 | MEFSRPDLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-03 L8A | 16 | MEFSRPPAVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-04 V9G | 17 | MEFSRPPLGHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-05 V11L | 18 | MEFSRPPLVHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-06 W33R | 19 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-07 K62D | 20 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-08 A97S | 21 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-09 N195D | 22 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09-10 T263H | 23 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 -P6Q | 24 | MEFSRPDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 -P7D | 25 | MEFSRQPAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
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| Var09 -V9G | 27 | MEFSRQDAVHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 -V11L | 28 | MEFSRQDAGHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 -W33R | 29 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 -K62D | 30 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 -A97S | 31 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 -N195D | 32 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 -T263H | 33 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| VAR09 -K62D -T263H | 34 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| VAR09 -K62D -N195D -T263H | 35 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 +I17F | 36 | MEFSRQDAGHLKGIPLFKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 +I17Y | 37 | MEFSRQDAGHLKGIPLYKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 +F20I | 38 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYIAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 +F20L | 39 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYLAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 +F138H | 40 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNHYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 +Y236F | 41 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNFTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 +I239D | 42 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTDPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var09 +M244N | 43 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEINDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5A P6Q P7D L8A V9G V11L | 44 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5B W33R K62D A97S N195D T263H | 45 | MEFSRPPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5A +W33R | 46 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5A +K62D | 47 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5A +A97S | 48 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5A +N195D | 49 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNTFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5A +T263H | 50 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTAWPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGKLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPAPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5B +P6Q | 51 | MEFSRQPLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5B +P7D | 52 | MEFSRPDLVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5B +L8A | 53 | MEFSRPPAVHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5B +V9G | 54 | MEFSRPPLGHVKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| Var5B +V11L | 55 | MEFSRPPLVHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKEDPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNYTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
| 「Var09-N195D+Y236F」 P6Q P7D L8A V9G V11L W33R K62D A97S T263H Y236F | 56 | MEFSRQDAGHLKGIPLIKYFAETIGPLQNFTARPDDLLISTYPKSGTTWMSEILDMIYQGGDLEKCGRAPIYARVPFLEFKCPGVPSGLETLEETPSPRLLKTHLPLSLLPQSLLDQKVKVIYIARNAKDVVVSYYNFYNMAKLHPDPGTWDSFLENFMDGEVSYGSWYQHVKEWWELRHTHPVLYLFYEDIKENPKREIKKILEFLGRSLPEETVDSIVHHTSFKKMKENCMTNFTTIPTEIMDHNVSPFMRKGTTGDWKNHFTVAQNERFDAHYAKTMTDCDFKFRCEL |
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的胺基酸序列。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍、或至少約兩倍、或至少約三倍。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 13。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與序列SEQ ID NO: 13（Var09）具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍或至少約兩倍、或至少約三倍。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 32。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與序列SEQ ID NO: 32（「Var09-N195D」）具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍或至少約兩倍、或至少約三倍。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 41。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與序列SEQ ID NO: 41（「Var09+Y236F」）具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍或至少約兩倍、或至少約三倍。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 45。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與序列SEQ ID NO: 45（「Var05B」）具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍或至少約兩倍、或至少約三倍。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與序列SEQ ID NO: 45（Var05B）具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其基本上類似於SEQ ID NO: 45的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有胺基酸序列SEQ ID NO: 56。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有與序列SEQ ID NO: 56（「Var09-N195D+Y236F」）具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍或至少約兩倍、或至少約三倍。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶不是選自SEQ ID NO: 24、36至40、42至44和48的胺基酸序列。
可以將本文公開的突變藉由使用本領域已知的任何方法（如酶的定點誘變、PCR和基因改組方法）或藉由在定點誘變的循環中使用多種誘變寡核苷酸引入酶中。可以以定向或隨機方式引入突變。因此，誘變方法產生編碼一種或多種不同突變體的一種或多種多核苷酸。通常，產生可用於產生突變酶文庫的突變基因文庫。
重組表現
本文的芳基磺基轉移酶突變體可以藉由任何合適的方法產生，包括重組和非重組方法（例如化學合成）。
當使用重組技術產生非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶時，所述方法可涉及任何合適的構建體和任何合適的宿主細胞，其可以是原核或真核細胞，通常是細菌或酵母宿主細胞，更通常是細菌細胞。將遺傳物質引入宿主細胞中的方法包括例如轉化、電穿孔、綴合、磷酸鈣法等。可以選擇轉移方法以提供引入的非天然存在的編碼芳基磺基轉移酶的核酸的穩定表現。編碼突變的芳基磺基轉移酶的核酸可以作為可遺傳的附加型元件（例如質體）提供或可以在基因體上整合。
本文提供了包含編碼本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的核苷酸序列的核酸，包括分離的或重組的核酸。在一些實施例中，本文提供了編碼本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的核酸（或核苷酸序列）。在一些實施例中，核苷酸序列可操作地連接到轉錄控制元件，例如啟動子。啟動子在一些情況下是組成型的。啟動子在一些情況下是誘導型的。在一些情況下，啟動子適用於原核宿主細胞（例如，在其中有活性）。在一些情況下，啟動子適用於真核宿主細胞（例如，在其中有活性）。
在一些情況下，包含編碼非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的核苷酸序列的核酸可存在於表現載體中。在一些實施例中，本文提供了包含編碼本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的核酸的重組表現載體。本文提供了包含編碼本文的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的核苷酸序列的重組表現載體（例如，分離的重組表現載體）。
在一些實施例中，編碼突變的芳基磺基轉移酶的核苷酸序列可操作地連接到轉錄控制元件，例如啟動子。啟動子在一些情況下是組成型的。啟動子在一些情況下是誘導型的。在一些情況下，啟動子適用於原核宿主細胞（例如，在其中有活性）。在一些情況下，啟動子適用於真核宿主細胞（例如，在其中有活性）。
用於轉移編碼非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的核酸的合適載體在組成上可以不同。
整合載體可以是條件複製型或自殺質體、噬菌體等。構建體可以包括各種元件，所述各種元件包括例如啟動子、選擇性遺傳標記（例如，賦予抗生素（例如康黴素、紅黴素、氯黴素或僅大黴素(gentamycin)）抗性的基因）、複製起點（以促進宿主細胞例如細菌宿主細胞中的複製）等。載體的選擇將取決於各種因素，如需要在其中增殖的細胞類型和增殖目的。某些載體可用於擴增和製造大量所需的DNA序列。其他載體適用於在培養的細胞中表現。另其他載體適用於在整個動物的細胞中轉移和表現。適當載體的選擇完全在本領域的技術範圍內。許多此類載體是可商購的。
在一個實例中，載體是基於游離型質體的表現載體，其含有選擇性耐藥性標記和提供在不同宿主細胞（例如，在大腸桿菌和腦膜炎奈瑟氏菌二者中）中自主複製的元件。這種「穿梭載體」的一個實例是質體pFPIO（Pagotto等人 (2000) Gene 244: 13-19）。
構建體（重組載體）可以藉由例如將感興趣的多核苷酸插入構建體主鏈中（通常藉由DNA連接酶附接至載體中切割的限制性酶切位點）來製備。替代性地，可以藉由同源重組或位點特異性重組插入所需的核苷酸序列。通常，同源重組藉由將同源區在所需核苷酸序列側翼附接至載體上來完成，而位點特異性重組可以藉由使用促進位點特異性重組的序列（例如cre-lox、att位點等）來完成。可以藉由例如寡核苷酸的連接或藉由使用包含同源區和所需核苷酸序列的一部分的引子進行的聚合酶鏈式反應來添加含有此類序列的核酸。
載體可以提供用於在宿主細胞中的染色體外保持或可以提供用於整合到宿主細胞基因體中。載體在本領域具有通常知識者熟知的眾多出版物中得到充分描述，包括例如Short Protocols in Molecular Biology, (1999) F. Ausubel, 等人, 編, Wiley & Sons。載體可以提供用於編碼感興趣的蛋白質的核酸的表現，可以提供用於標的核酸的增殖，或二者。
可以使用的載體的例子包括但不限於源自重組噬菌體DNA、質體DNA或黏粒DNA的那些。例如，可以使用質體載體如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13 mp系列的載體。pET21也是一種可以使用的表現載體。噬菌體載體可以包括λgtl0、λgtl l、λgtl8-23、λZAP/R和EMBL系列的噬菌體載體。可以使用的另外的載體包括但不限於pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9(charomid 9)系列的載體。
對於感興趣的蛋白質的表現，可以使用表現匣。因此，本文提供了包含標的核酸的重組表現載體。表現載體提供轉錄和轉譯調節序列，並且可以提供用於誘導型或組成型表現，其中編碼區在轉錄起始區和轉錄和轉譯終止區的轉錄控制下可操作地連接。這些控制區對於衍生非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的芳基磺基轉移酶可以是天然的，或者可以衍生自外源來源。總體上，轉錄和轉譯調節序列可以包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、轉譯起始和終止序列以及增強子或啟動子序列。啟動子可以是組成型或誘導型的，並且可以是強組成型啟動子（例如，T7等）。
表現載體通常具有位於啟動子序列附近的便利的限制位點，以提供編碼感興趣的蛋白質的核酸序列的插入。可存在可在表現宿主中操作的選擇性標記以促進含有載體的細胞的選擇。此外，表現構建體可以包含額外的元件。例如，表現載體可以具有一個或兩個複製系統，從而使其能夠維持在生物體中，例如在哺乳動物或昆蟲細胞中進行表現，並在原核宿主中進行選殖和擴增。此外，表現構建體可以含有選擇性標記基因以允許選擇轉化的宿主細胞。選擇基因是本領域中熟知的，並且將隨著所用宿主細胞而變化。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的分離和純化可以根據本領域已知的方法完成。例如，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可藉由免疫親和純化從經基因修飾以表現非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的細胞裂解物中分離，或從合成的反應混合物中分離，所述免疫親和純化通常涉及使樣品與抗芳基磺基轉移酶抗體接觸，洗滌以除去非特異性結合的物質，以及洗脫特異性結合的芳基磺基轉移酶。分離的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可藉由透析和蛋白質純化方法中通常使用的其他方法進一步純化。在一個實例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可使用金屬螯合層析法分離。
許多合適的宿主細胞中的任一種可用於產生非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶。通常，本文所述的感興趣的蛋白質可根據常規技術在原核生物或真核生物例如細菌如大腸桿菌中表現。因此，本文還提供了體外宿主細胞，其包含編碼本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的核酸。用於產生（包括大規模產生）感興趣的蛋白質的宿主細胞可以選自多種可用宿主細胞中的任一種。
用於表現的宿主細胞的實例包括原核或真核單細胞生物體（如細菌（例如大腸桿菌菌株）、酵母（例如釀酒酵母、大腸桿菌屬等））的那些，並且可以包括最初衍生自高等生物體如昆蟲、脊椎動物（例如哺乳動物）的宿主細胞。合適的細菌包括但不限於BL21勝任大腸桿菌、BL21（DE3）勝任大腸桿菌、NEB Express勝任大腸桿菌、NEB Express Iq勝任大腸桿菌、T7 Express勝任大腸桿菌、T7 Express Iq勝任大腸桿菌、T7 Express lysY勝任大腸桿菌、T7 Express lysY/Iq勝任勝任大腸桿菌、T7 Express晶體勝任大腸桿菌、SHuffle Express勝任大腸桿菌、Shuffle T7 Express勝任大腸桿菌、SHuffle T7 Express lysY勝任大腸桿菌、Shuffle T7勝任大腸桿菌、NiCo21（DE3）勝任大腸桿菌、Lemo21（DE3）勝任大腸桿菌。合適的哺乳動物細胞株包括但不限於HeLa細胞（例如，美國典型培養物保藏中心（ATCC）編號CCL-2）、CHO細胞（例如，ATCC編號CRL9618、CCL61、CRL9096）、293細胞（例如，ATCC編號CRL-1573）、Vero細胞、NIH 3T3細胞（例如，ATCC編號CRL-1658）、Huh-7細胞、BHK細胞（例如，ATCC編號CCL10）、PC12細胞（ATCC編號CRL1721）、COS細胞、COS-7細胞（ATCC編號CRL1651）、RATI細胞、小鼠L細胞（ATCC編號CCLI.3）、人胚腎（HEK）細胞（ATCC編號CRL1573）、HLHepG2細胞等）。在一些情況下，特別令人感興趣的是細菌宿主細胞和酵母宿主細胞用於產生感興趣的蛋白質。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可以以基本上純的或基本上分離的形式製備。可以提供純化的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，使得多肽存在於基本上不含其他表現的多肽的組成物中，例如所述組成物的少於90%，通常少於60%，更通常少於50%由其他表現的多肽組成。
套組
在一些實施例中，本文涉及用於硫酸化受質的套組。
用於硫酸化受質的套組可以至少包含：
在第一容器中的一種本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶；和
在第二容器中的磺基供體。
本文公開的套組可用於硫酸化多醣。本文公開的套組可用於將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）。本文公開的套組可用於合成硫酸化受質。本文公開的套組可用於合成硫酸乙醯肝素。本文公開的套組可用於合成硫酸化肝素。
磺基供體可以是芳基硫酸鹽化合物。
芳基硫酸鹽化合物可以是pNPS。
套組還可包含用於硫酸化受質例如多醣的說明書。說明書可能涉及肝素的合成。
套組還可含有適於酶催化活性的緩衝液。可以將緩衝液與本文公開的芳基磺基轉移酶一起包裝，或者可以包裝在單獨的容器中。合適的緩衝液可以是例如TRIS-緩衝液、磷酸鈉緩衝液和磷酸鉀緩衝液。合適的pH值為約6.0至約7.5、以及約7.0。
在一些實施例中，套組可以包含至少一種另外的酶。另外的酶可以是糖基轉移酶、
N-脫乙醯酶/
N-磺基轉移酶、C5-差向異構酶或O-磺基轉移酶（OST），例如2-OST、3-OST、3-OST-1、3-OST-3、6-OST、6-OST-1、6-OST3。當套組含有兩種或更多種酶時，可以將每種酶包裝在單獨的容器中。
芳基磺基轉移酶突變體催化活性和篩選方法
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高約至少1.3倍。
可以根據本領域中任何已知的方法檢測和測量芳基磺基轉移酶活性。
在一些實施例中，與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加至少約1.3倍可以用比色法測量，所述比色法允許測量藉由根據以下方案反應將磺醯基從對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）轉移至3’,5’-腺苷-磷酸（PAP）以產生3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸（PAPS）而釋放（或產生）的對硝基苯基（pNP）的量：
PAP + pNPS
→PAPS + pNP
該方法可以包括以下步驟：
a) 使例如在細菌中表現或在表現所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的細菌的裂解物中提供或以純化形式提供的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶與足量的pNPS和PAP在合適的緩衝液中接觸，
b) 獲得代表在步驟a) 產生的pNP的測量值，
c) 使例如在細菌中表現或在表現所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的細菌的裂解物中提供或以純化形式提供的SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV與足量的pNPS和PAP在合適的緩衝液中接觸，
d) 獲得代表在步驟c) 產生的pNP的測量值，以及
e) 比較在步驟b) 和步驟d) 獲得的測量值。
適於表現突變型或野生型芳基磺基轉移酶（如SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV）的細菌可以是大腸桿菌BL21 DE3。無論以何種方式提供，適於反應的酶量可以為約30 ng/μL。
當使用30 ng/μL酶時，足夠量的pNPS和PAP可分別為約1 mM和約0.23 mM。
代表反應期間產生的pNP的測量值可以藉由測量404 nm處的光密度來獲得，例如根據製造商的建議使用來自Molecular Devices的SpectraMax® 190測量。獲得的測量值可以以任意吸光度單位表示。
用於反應的合適緩衝液可以是pH 7.0的磷酸鹽緩衝液，其包含10%的甘油。
合適的反應溫度可為約37ºC。
測量值的獲得可以在反應開始後10、30或90分鐘進行，例如在反應開始後10分鐘進行。
在一些實施例中，可以減去空白以標準化所獲得的測量值。空白可以是水或不含酶和受質的緩衝液。
替代性地，在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的突變的芳基磺基轉移酶中的至少一種的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的突變的芳基磺基轉移酶中的任一個的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 5的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 6的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 7的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 8的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 9的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 10的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 11的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 12的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 13的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 14的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 15的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 16的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 17的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 18的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 19的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 20的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 21的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 22的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 23的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 25的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 26的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 27的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 28的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 29的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 30的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 31的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 32的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 33的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 34的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 35的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 41的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 45的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 46的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 47的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 49的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 50的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 51的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 52的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 53的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 54的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 55的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
在一些實施例中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 56的突變的芳基磺基轉移酶的催化活性。
本文的芳基磺基轉移酶突變體相對於相應的野生型大鼠AST IV酶顯示增強的硫酸化活性。增強的硫酸化活性可以按採用一種或多種用於硫酸化的受質的情況下增加的催化效率或增加的產物形成速率來表徵。增加的偶聯效率或增加的產物形成速率可以或可以不在本文的芳基磺基轉移酶突變體使用的所有受質之間共用。在一些實施例中，與野生型大鼠AST IV酶相比，本文公開的突變的芳基磺基轉移酶的增強的催化活性是由PAP與磺基供體如pNPS產生PAPS的逆反應。
本文公開的芳基磺基轉移酶的酶活性可以使用適合於給出硫酸化速率、代謝物形成速率或受質消失速率的任何受質或條件在體外測量。例如，可以用比色法檢測和測量芳基磺基轉移酶活性。在這種方法中，可以使用比色酶受質或比色代謝物。可以檢測和測量比色受質的消失，及/或可以檢測和測量比色代謝物的出現。
可以測量轉化率。
用於硫酸化方法的受質可以是能夠被芳基磺基轉移酶硫酸化的任何有機化合物。任何有機化合物被芳基磺基轉移酶硫酸化的適合性可以藉由本文所述的方法常規確定。
受質可以是野生型芳基磺基轉移酶的天然受質或通常不是野生型酶的受質但能夠在突變酶中原樣使用的受質。芳基磺基轉移酶的天然受質的例子是3’,5’-腺苷-磷酸（PAP）或對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）。
為了檢測和測量3’,5’-腺苷-磷酸（PAP）轉化為3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸（PAPS）的芳基磺基轉移酶活性，可以將對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）用作磺基供體，根據以下方案將其轉化為比色代謝物對硝基苯基（pNP）：
PAP + pNPS
→PAPS + pNP
pNP的存在可以藉由在404 nm下測量的吸光度檢測來檢測和測量。
在這種方法中用於檢測和測量芳基磺基轉移酶活性的合適參數可以是在pH 7.0的磷酸鹽緩衝液中使用約30 ng/μL酶，1 mM pNPS，0.23 mM PAP；及10%甘油。可將反應混合物在約37ºC下培育10、30或90分鐘。藉由向酶和pNPS的混合物中添加PAP來引發反應。
在一些實施例中，可以根據以下反應，藉由測量所形成的代謝物pNP的量來檢測和測量芳基磺基轉移酶活性：PAP + pNPS
→PAPS + pNP。
在一些實施例中，將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性可以比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.5倍、或至少約1.8、或至少約1.9、或至少約2.0、或至少約2.2、或至少約2.5、或至少約3.0、或至少約3.2、或至少約3.5、或至少約4.0、或至少約4.5、或至少約5.0、或至少約5.5、或至少約6.0、或至少約6.5、或至少約7.0倍。與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加可以用本文所述的比色法測量。
將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性可以藉由檢測由磺基供體的轉化產生的代謝物（例如檢測由pNPS的轉化產生的pNP）來測量。在這種情況下，在反應PAP + pNPS
→PAPS + pNP中pNPS向pNP的提高的轉化率相當於PAP向PAPS的增強的轉化率。
如上所述，非天然存在的芳基磺基轉移酶可以經分離和純化而使用或在重組宿主細胞如重組大腸桿菌中使用。適於表現突變型或野生型芳基磺基轉移酶（如SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV）的細菌可以是大腸桿菌BL21 DE3。無論以何種方式提供，適於反應的酶量可以為約30 ng/μL。
當使用30 ng/μL酶時，足夠量的pNPS和PAP可分別為約1 mM和約0.23 mM。
為了發生催化酶反應，可將反應介質置於範圍為約20ºC至約40ºC、或約25ºC至約37ºC、或約30ºC至約35ºC的溫度下。例如，反應溫度可以為約37ºC。作為其他實例，反應溫度可為約40ºC。
可以在催化反應開始後的不同時間段例如0、10、30或90分鐘，讀取光密度（OD）或吸光度，以測量催化活性的速率。可以減去空白以標準化所獲得的測量值。空白可以是水或不含酶和受質的緩衝液。
可以將本文公開的突變藉由使用本領域已知的任何方法（如酶的定點誘變、PCR和基因改組方法）或藉由在定點誘變的循環中使用多種誘變寡核苷酸引入酶中。可以以定向或隨機方式引入突變。因此，誘變方法產生編碼一種或多種不同突變體的一種或多種多核苷酸。通常，產生可用於產生突變酶文庫的突變基因文庫，然後可根據下文公開的方法對其進行篩選。替代性地，可以使用本領域已知的任何基因合成方法獲得編碼本文公開的突變酶的核酸。
可以在從重組細胞中萃取和純化後或在用於產生它們的重組細胞內篩選芳基磺基轉移酶突變體。
篩選方法可以使用在作為磺基供體的對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）的存在下，將3’,5’-腺苷-磷酸（PAP）轉化為3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸（PAPS）。對硝基苯基（pNP）代謝物形成的測量可用於尋找增強的催化活性。
與野生型酶的催化活性相比至少1.3倍的增強的催化活性可用作參考閾值，以鑒定具有增強的目的催化活性的突變的芳基磺基轉移酶。
替代性地，對應於本文公開的任一種芳基磺基轉移酶（例如具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列）的催化活性可用作參考閾值，以鑒定具有增強的目的催化活性的突變的芳基磺基轉移酶。
在一些實施例中，一種篩選及/或選擇如下非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的方法可至少包括以下步驟，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含至少一個胺基酸取代突變且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少基本上等於或大於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性：
a) 使包含至少一個胺基酸取代突變的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物與磺基供體在適於將磺基從磺基供體轉移至PAP的條件下接觸，以獲得PAPS，
b) 檢測PAPS的形成速率或量，
c) 將步驟b) 中獲得的PAPS的形成速率或量與參考速率或量進行比較，該參考速率或量進行比較係用SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV獲得的或用具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶所獲得，和
d) 選擇任何非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物包含至少一個胺基酸取代突變且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少基本上等於或大於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
與SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的活性相比，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性增加可以用本文所述的比色法測量。
步驟b) 中PAPS形成的速率或量的檢測可以藉由測量代謝物PAPS的量直接進行，藉由測量待轉化的產物PAP的量間接進行。
替代性地，步驟b) 中PAPS形成的速率或量的檢測可藉由測量磺基供體（例如pNPS）的量或藉由測量磺基供體的代謝物（例如pNP）的量來進行。
在一個實施例中，本文公開的方法可以實施磺基供體，如對硝基苯基硫酸鹽。
在一個實施例中，本文公開的方法實施pNPS作為磺基供體，並且檢測PAPS形成的速率或量的步驟b) 藉由檢測由pNPS形成pNP的速率或量來間接進行。
在一些實施例中，本文還涉及一種非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含至少一個胺基酸取代突變且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，藉由本文公開的方法鑒定，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少等於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
用於硫酸化受質的用途和方法 硫酸化
在一些實施例中，本文涉及本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶用於硫酸化受質的用途。
在一些實施例中，本文涉及硫酸化受質的方法，其至少包括以下步驟：使待硫酸化的受質與a) 本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶和b) 磺基供體在適於將磺基從磺基供體轉移到所述受質的條件下接觸。
本文的用途或方法可用於將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）。
本文的用途或方法可以是合成肝素。
本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含在選自6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中胺基酸位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的；以及包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，條件是當所述芳基磺基轉移酶是大鼠芳基磺基轉移酶IV時，突變不是F138A及/或Y236A。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高約至少1.3倍。
非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中胺基酸位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的；以及包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，並且其中所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍。
替代性地，在一些實施例中，在本文公開的用途和方法中，本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶可具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其至少基本上類似於或大於SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的突變的芳基磺基轉移酶中的至少一種的催化活性。
本文公開的一種用於硫酸化受質的方法可至少包括使所述待硫酸化的受質與以下物質在適於將磺基從磺基供體轉移到所述受質的條件下接觸的步驟：
a) 本文公開的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，和
b) 在適於將磺基從磺基供體轉移到所述受質的條件下的磺基供體。
所述方法還可以包括收回硫酸化受質的步驟。
待硫酸化的受質可選自包含以下的群組：腺苷3',5'-二磷酸（PAP）、多醣、乙醯肝素、硫酸肝素原或硫酸化肝素。
本文涉及藉由用至少一種磺基轉移酶和PAPS硫酸化受質來獲得硫酸化受質的方法，所述方法包括藉由使PAP與非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶接觸來將所述PAP轉化為PAPS的至少一個步驟，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含 (1) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中胺基酸位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (2) 與SEQ ID NO: 1具有至少60%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
根據具體實施例，將PAP轉化為PAPS的步驟與硫酸化步驟同時進行。
根據另一個實施例，將PAP轉化為PAPS的步驟和硫酸化步驟是依序的。
本文涉及一種在適於將磺基從PAPS轉移到待硫酸化的受質並獲得硫酸化的受質和PAP的條件下用磺基轉移酶和PAPS硫酸化受質的方法，其至少包括藉由使如此獲得的PAP與以下物質：
(i) 非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (1) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的胺基酸位置處的至少一個胺基酸取代突變，其中胺基酸位置是相對於SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV而言的，和 (2) 與SEQ ID NO: 1具有至少60%胺基酸序列同一性的胺基酸序列，以及
(ii) 磺基供體
在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下接觸而將所述PAP轉化為PAPS的步驟。
本文涉及一種用於硫酸化受質的方法，其至少包括以下步驟：
a) 在適於將磺基從PAPS轉移至待硫酸化的受質並獲得硫酸化的受質和PAP的條件下，用磺基轉移酶和PAPS硫酸化受質，和
b) 藉由使步驟a) 中獲得的PAP與以下物質接觸而將所述PAP轉化為PAPS：
(i) 非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (1) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中胺基酸位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (2) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，以及
(ii) 磺基供體，
在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下。
所述方法還可以包括回收如此形成的硫酸化受質的步驟。
本文公開的方法可以用於將PAP再循環成PAPS，並且可以至少包括在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下，使所述PAP與以下物質接觸的步驟：
a) 非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，以及
b) 在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下的磺基供體。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少85%、90%、95%或99%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少90%、95%或99%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少90%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少95%同一性。
在一些實施例中，非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的序列在SEQ ID NO: 1的整個序列上可具有至少99%同一性。
本文公開的方法可以用於合成肝素。
當用於硫酸化受質的方法包括用本文公開的突變的芳基磺基轉移酶將PAP轉化為PAPS時，用於硫酸化受質的磺基轉移酶可以不同於突變的芳基磺基轉移酶。受質的硫酸化可以用O-磺基轉移酶（OST）（例如2-OST、3-OST、3-OST-1、3-OST-3、6-OST、6-OST-1、6-OST3）或N-磺基轉移酶（如NDST1、NDST2）進行。
受質的硫酸化步驟和將PAP轉化為PAPS的步驟可以在一鍋反應中依序或同時進行。
將PAP轉化為PAPS的步驟可包括提供包含PAP、本文公開的芳基磺基轉移酶和磺基供體的反應混合物。
在一些實施例中，本文公開的方法的受質的硫酸化步驟可包括多個子步驟a
1)、a
2)、a
3)……，在此期間受質可經歷連續的酶催化反應。這些反應可以是受質內不同位置的硫酸化，使用PAPS作為磺基供體藉由不同磺基轉移酶進行。不同的磺基轉移酶可以是例如不同的OST。其中發生硫酸化的每個子步驟a
1)、a
2)、a
3)……可以與將PAP轉化為PAPS的單個步驟或多個相關聯的子步驟b
1)、b
2)、b
3)……相關聯，在此期間由不同硫酸化步驟產生的PAP藉由本文所公開的突變的芳基磺基轉移酶轉化為PAPS。
在一些實施例中，受質的硫酸化步驟可包括多個同時或依序的子步驟a
1)、a
2)、a
3)……a
n)，並且其中至少兩個子步驟各自包括使用PAPS作為磺基供體由磺基轉移酶催化的硫酸化以獲得PAP和硫酸化受質。
在一些實施例中，將PAP轉化為PAPS的步驟可以包括單個步驟或多個同時或依序的子步驟b
1)、b
2)、b
3)……b
n)，並且其中將在每個子步驟a
1)、a
2)、a
3)中獲得的PAP轉化為PAP，在所述子步驟a
1)、a
2)、a
3)期間發生了使用PAPS由磺基轉移酶催化的硫酸化。
本文的一個態樣涉及可用於多醣受質的硫酸化的方法中的PAPS再生系統。在將PAP轉化為PAPS的步驟中可以使用PAPS再生系統。所述方法可以是這樣的類型，其中多醣受質的硫酸化由磺基轉移酶如一種或多種OST催化，其中將3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）轉化為腺苷3′,5′-二磷酸（PAP）。硫酸化過程可以與PAPS再生系統偶聯，允許從腺苷3′,5′-二磷酸酶促再生3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸。酶促再生系統使用本文公開的突變的非天然存在的芳基磺基轉移酶和作為受質的芳基硫酸鹽。
在本文公開的PAPS再生系統中，可以將突變的非天然存在的芳基磺基轉移酶接枝到支持物上。合適的支持物可以是珠、板、纖維素片。因此，反應器皿可以含有反應混合物，所述反應混合物包含待硫酸化的受質，不同於本文公開的突變的芳基磺基轉移酶的一種或多種磺基轉移酶，和作為磺基供體的PAPS，並將突變的芳基磺基轉移酶接枝到支持物上，從而允許將PAP連續轉化為PAPS。
本文公開的突變的芳基磺基轉移酶可以根據本領域任何已知的方法共價或非接枝到合適的支持物上。
將磺基轉移酶催化的硫酸化反應與本文公開的PAPS再生系統偶聯可提供直接由PAP產生用於反應中的PAPS的另一優點。即，可配製反應混合物以在向反應混合物中添加磺基轉移酶之前或同時將PAP與PAPS再生系統結合。然後突變的芳基磺基轉移酶可以從PAP產生PAPS以供磺基轉移酶使用，從而減輕了向反應混合物提供任何更昂貴和不穩定的PAPS的需要。
時間和溫度
可以使本文公開的突變的芳基磺基轉移酶與PAP和磺基供體接觸足夠長的時間段（例如約1分鐘至約90分鐘、約10分鐘至約30分鐘的時間段），以藉由本文公開的芳基磺基轉移酶利用磺基供體作為受質催化從PAP產生PAPS。
在一些實施例中，可以使本文公開的突變的芳基磺基轉移酶與PAP和磺基供體接觸一個時間段（如約2小時、或約3小時、或約6小時、或約12小時、或約24小時、或約48小時、或約72小時），所述時間段與在工業放大方法中藉由芳基磺基轉移酶從PAP產生PAPS相容。
反應溫度可以為約20ºC至約40ºC、或約25ºC至約37ºC、或約30ºC至約35ºC。例如，反應溫度可以為約37ºC。作為其他實例，反應溫度可以為約40ºC。
磺基供體
磺基供體可以是芳基硫酸鹽化合物。芳基硫酸鹽化合物可以是對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）。
受質
在用於硫酸化受質的方法中，其中本文公開的突變的芳基磺基轉移酶用於將PAP轉化為PAPS，待硫酸化的受質可以選自包含以下的群組：多醣、乙醯肝素、硫酸肝素原、化學脫硫酸化的N-硫酸化（CDSNS）肝素、醣胺聚糖（GAG）、硫酸乙醯肝素或硫酸化肝素。
多醣受質可以在反應混合物培育之前被部分硫酸化。在一些實施例中，硫酸化多醣是醣胺聚糖（GAG），如硫酸乙醯肝素（HS）。在一些實施例中，硫酸化多醣是HS，其為抗凝血活性HS、抗凝血酶結合HS、成纖維細胞生長因子（FGF）結合HS、單純皰疹病毒包膜醣蛋白D結合HS或具有這些特性的組合。
在一些實施例中，待硫酸化的受質可以進一步經歷至少一個額外的酶催化反應以硫酸化。這個或這些額外的反應可以在硫酸化之前或之後進行。
待硫酸化的受質可以是預先N,O-脫硫酸化的多醣受質和再N-硫酸化的多醣，如化學脫硫酸化的N-硫酸化（CDSNS）肝素。例如，多醣如CDSNS可以與特定OST在PAPS的存在下反應，以產生硫酸化多醣中間產物，所述硫酸化多醣中間產物然後可以隨後與不同OST在PAPS的存在下反應，以進一步在不同位置硫酸化多醣。使多醣受質與不同OST反應的該依序過程可以繼續，直到產生展現出所需生物活性的最終多醣。然後，由每個連續硫酸化步驟得到的PAP可以在單個步驟中或在連續步驟期間（例如在每個硫酸化步驟之後）轉化為PAPS。
本文公開的硫酸化方法允許藉由選擇適當的磺基轉移酶和藉由依序控制向反應系統中添加那些磺基轉移酶以促進多醣硫酸化的適當時機來產生大量硫酸化多醣，如具有不同生物活性的硫酸乙醯肝素分子。例如，可合成的具有特定生物活性的硫酸乙醯肝素包括抗凝血硫酸乙醯肝素、肝素、成纖維細胞生長因子-2結合活性、單純皰疹病毒醣蛋白D（gD）結合HS和成纖維細胞生長因子2（FGF2）受體結合HS。這些生物活性硫酸乙醯肝素分子中的每一種的合成僅需要兩個或三個酶促步驟。因此，本文公開的方法由於高產率PAPS再生系統而提供了用於大規模合成具有特定活性的寬範圍硫酸乙醯肝素的高效且有效方法。
在一些實施例中，硫酸化多醣受質可以是醣胺聚糖（GAG）。GAG是體內最豐富的雜多醣。這些分子是含有重複雙醣單元的長的無支鏈多醣。雙醣單元可以含有兩種修飾糖中的任一種：N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）或N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）和糖醛酸（如葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸）。GAG是高度帶負電荷的分子，具有賦予溶液高黏度的擴展構形。GAG的高黏度伴隨著低壓縮性，這使得這些分子對於關節中的潤滑流體是理想的。同時，它們的剛性為細胞提供結構完整性並在細胞之間提供通道，允許細胞遷移。具有生理意義的特定GAG是透明質酸、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙醯肝素（包括肝素）和硫酸角質素。因此，在一些實施例中，硫酸化多醣產物是HS。在一些實施例中，硫酸化多醣產物是抗凝血活性HS、抗凝血酶結合HS、FGF結合HS和HSV gD結合HS。
肝素合成
在一些實施例中，本文公開的標的提供了合成肝素化合物的方法。
肝素作為硫酸乙醯肝素被知曉，所述硫酸乙醯肝素為一種具有非常可變結構的高度酸性線性多醣，具有抗凝血活性。因此，本文公開的標的提供了一種合成以下的方法：肝素，低分子量肝素如重均分子量為4000至6000且由於其較少的副作用如出血而被越來越多地使用的低分子量肝素，或具有抗凝血活性的硫酸乙醯肝素；肝素，低分子量肝素，通常稱為肝素化合物或肝素的硫酸乙醯肝素和硫酸乙醯肝素前驅物。
用於合成肝素的方法可以包括藉由用至少一種磺基轉移酶和PAPS硫酸化肝素前驅物來獲得硫酸化肝素前驅物，所述方法包括藉由使PAP與非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶接觸來將所述PAP轉化為PAPS的至少一個步驟，所述非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含 (1) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (2) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列。
一種用於合成肝素的方法可以包括在適於將磺基從PAPS轉移到待硫酸化的肝素前驅物並獲得肝素前驅物和PAP的條件下，用磺基轉移酶和PAPS硫酸化肝素前驅物，藉由使如此獲得的PAP與以下物質接觸：
(i) 非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (1) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的群組的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中所述位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (2) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，以及
(ii) 磺基供體
在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下接觸將所述PAP轉化為PAPS。
肝素原可以用作用於本發明的肝素合成方法的多醣原料。肝素原是由雙醣的重複結構構成的多醣，所述雙醣由葡萄糖醛酸（GlcA）殘基和N-乙醯基-D-葡萄糖胺（GlcNAc）殘基構成[
→4)-β-D-GlcA-(1
→4)-α-D-GlcNAc-(1
→]。肝素原可以例如藉由利用具有產生肝素原能力的細菌的發酵方法來產生。
在一些實施例中，本文公開的用於合成肝素的方法可以使用肝素原作為肝素前驅物。肝素可以藉由將肝素原作為起始材料進行不同的步驟來產生，這些步驟包括N-脫乙醯化、N-硫酸化、C5-差向異構化、2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、3-O-硫酸化。肝素可以藉由使肝素原進行一個、幾個或所有這些步驟或這些步驟中的一些或所有這些步驟的組合來產生。用於產生肝素的方法可以進一步包括解聚步驟。肝素產生過程中步驟的實施順序不受特別限制，只要可以獲得具有所需特性的肝素即可。
在本文公開的用於合成肝素的方法中，這些步驟可以藉由化學或酶促方式進行，或者可以是化學方式和酶促方式進行的步驟之間的組合。酶促步驟可以是例如N-硫酸化、2-O-硫酸化酶促步驟、3-O-硫酸化酶促步驟、6-O-硫酸化酶促步驟、或一系列這些步驟或這些步驟的組合。這樣的酶促步驟可以藉由使用例如N-磺基轉移酶（如NDST1或NDST2）、O-磺基轉移酶（OST）（例如2-OST、3-OST、3-OST-1、3-OST-3、6-OST、6-OST-1、6-OST-3）來進行。根據本文公開的方法合成肝素的酶促步驟可以藉由多於一種磺基轉移酶或藉由一種或多種磺基轉移酶與另一種酶（例如2-OST和C5差向異構酶）之間的組合來進行。本文公開的方法包括使用一種磺基轉移酶和PAPS的至少一個步驟，包括藉由使PAP與根據本發明的非天然存在的芳基磺基轉移酶接觸而將所述PAP轉化為PAPS的至少一個步驟。
用於合成肝素的方法還可以包括額外的酶促催化反應。
一種用於合成肝素的方法可以包括：
-提供醣類受質；將所述醣類受質延長為所需或預定長度的醣類；進行差向異構化反應；以及用磺基轉移酶和PAPS（作為磺基供體）進行一個或多個硫酸化反應，由此合成肝素化合物，和
-藉由使步驟a) 中獲得的PAP與本文公開的突變的非天然存在的芳基磺基轉移酶和磺基供體在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下接觸，將所述PAP轉化為PAPS。
在一些實施例中，本文公開的標的提供了一種合成肝素化合物的方法，其至少包括以下步驟：
-提供雙醣受質；將所述雙醣受質延長為四醣；將所述四糖醣長為六糖或七糖，其中所述六糖或七糖包含N-磺基轉移酶受質殘基；將所述六糖或七糖上的N-磺基轉移酶受質殘基轉化為N-磺基葡萄糖胺（GlcNS）殘基；進行差向異構化反應；以及進行一種或多種硫酸化反應從而合成肝素化合物和PAP，所述硫酸化反應選自與至少3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸（PAPS）（作為磺基供體）接觸的N-硫酸化、2-O-硫酸化反應、6-O-硫酸化反應、3-O-硫酸化反應及其組合，以及
-藉由使步驟a) 中獲得的PAP與本文公開的突變的非天然存在的芳基磺基轉移酶和磺基供體在適於將磺基從磺基供體轉移到PAP以獲得PAPS的條件下接觸，將所述PAP轉化為PAPS。
將雙醣受質延長為四糖可以使用酶
N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶和肝素原合酶-2，以及受質葡萄糖醛酸（GlcUA）和N-三氟乙醯基葡萄糖胺（GlcNTFA）進行。
將四糖延長為七糖可以使用酶
N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶和肝素原合酶-2，以及受質葡萄糖醛酸（GlcUA）、N-三氟乙醯基葡萄糖胺（GlcNTFA）和
N-乙醯化葡萄糖胺（GlcNAc）進行。
可以使用糖基轉移酶將六糖延長為七糖。糖基轉移酶可以是
N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶。在另一態樣，N-磺基轉移酶受質殘基是N-三氟乙醯基葡萄糖胺（GlcNTFA）殘基。
可以使用N-磺基轉移酶（NST）、3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸（PAPS）、三乙胺、CH
3OH和H
2O將七糖上的一個或多個N-三氟乙醯基葡萄糖胺（GlcNTFA）殘基轉化為N-磺基葡萄糖胺（GlcNS）殘基。
差向異構化庚糖可以使用C5-差向異構酶（C5-epi）進行。
硫酸化七糖可以使用2-O-磺基轉移酶（2-OST）和3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸（PAPS）進行。
硫酸化七糖可以使用6-O-磺基轉移酶（6-OST）和3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸（PAPS）進行。
硫酸化七糖可以使用3-O-磺基轉移酶（3-OST）和3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸（PAPS）進行。
藉由以下非限制性實例進一步理解本發明。提供以下實例以詳細描述本發明的一些代表性的、目前較佳的方法和材料。提供這些實例是為了說明本發明的概念，並不旨在限制由所附申請專利範圍限定的本發明的範圍。
[ 實例 ] 實例 1 ：芳基磺基轉移酶突變體的製備
來自大鼠芳基磺基轉移酶IV（AST-IV-EC 2.8.2.9）的突變體藉由基因合成獲得，並使用來自公司CODEX DNA的自動化系統BioXp™ 3200根據製造商的建議選殖到pET-Duet載體中。
製備以下AST IV突變體：
單一突變體：
Var01 (I17F) - SEQ ID NO: 5，
Var04 (F20L) - SEQ ID NO: 6，
Var03 (F20I) - SEQ ID NO: 7，
Var05 (F138H) - SEQ ID NO: 8，
Var06 (Y236F) - SEQ ID NO: 9，
Var07 (M244N) - SEQ ID NO: 10，
Var02 (I17Y) - SEQ ID NO: 11，
Var08 (I239D) - SEQ ID NO: 12，
Var09-01 (P6Q) - SEQ ID NO: 14，
Var09-02 (P7D) - SEQ ID NO: 15，
Var09-03 (L8A) - SEQ ID NO: 16，
Var09-04 (V9G) - SEQ ID NO: 17，
Var09-05 (V11L) - SEQ ID NO: 18，
Var09-06 (W33R) - SEQ ID NO: 19，
Var09-07 (K62D) - SEQ ID NO: 20，
Var09-08 (A97S) - SEQ ID NO: 21，
Var09-09 (N195D) - SEQ ID NO: 22，和
Var09-10 (T263H) - SEQ ID NO: 23。
多重突變體：
包含10個組合突變的Var09：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:13。
包含9個組合突變的「Var09-P6Q」：P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
24。去除了突變P6Q。
包含9個組合突變的「Var09-P7D」：P6Q-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
24。去除了突變P7D
包含9個組合突變的「Var09-L8A」：P6Q-P7D-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
26。去除了突變L8A。
包含9個組合突變的「Var09-V9G」：P6Q-P7D-L8A-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
27。去除了突變V9G。
包含9個組合突變的「Var09-V11L」：P6Q-P7D-L8A-V9G-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
28。去除了突變V11L。
包含9個組合突變的「Var09-W33R」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
29。去除了突變W33R。
包含9個組合突變的「Var09-K62D」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
30。去除了突變K62D。
包含9個組合突變的「Var09-A97S」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-N195D-T263H - SEQ ID NO:
31。去除了突變A97S。
包含9個組合突變的「Var09-N195D」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-T263H - SEQ ID NO:
32。去除了突變N195D。
包含9個組合突變的「Var09-T263H」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D - SEQ ID NO:
33。去除了突變T263H。
包含8個組合突變的「Var09-K62D-T263H」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S-N195D - SEQ ID NO:
34。去除了突變K62D和T263H。
包含7個組合突變的「Var09-K62D-N195D-T263H」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S - SEQ ID NO:
35。去除了突變K62D、N195D和T263H。
包含11個組合突變的「Var09+I17F」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-I17F-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
36。
包含11個組合突變的「Var09+I17Y」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-I17Y-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
37。
包含11個組合突變的「Var09+F20I」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-F20I-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
38。
包含11個組合突變的「Var09+F20L」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-F20L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
39。
包含11個組合突變的「Var09+F138H」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-F138H-N195D-T263H - SEQ ID NO:
40。
包含11個組合突變的「Var09+Y236F」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-Y236F-N195D-T263H - SEQ ID NO:
41。
包含11個組合突變的「Var09+I239D」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-I239D-N195D-T263H - SEQ ID NO:
42。
包含11個組合突變的「Var09+M244N」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-M244N-T263H - SEQ ID NO:
43。
包含5個組合突變的Var5A：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L - SEQ ID NO
: 44。
包含5個組合突變的Var5B：W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
45。
包含6個組合突變的「Var5A+W33R」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R - SEQ ID NO:
46。
包含6個組合突變的「Var5A+K62D」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-K62D - SEQ ID NO:
47。
包含6個組合突變的「Var5A+A97S」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-A97S - SEQ ID NO:
48。
包含6個組合突變的「Var5A+N195D」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-N195D - SEQ ID NO:
49。
包含6個組合突變的「Var5A+T263H」：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-T263H - SEQ ID NO:
50。
包含6個組合突變的「Var5B+P6Q」：P6Q-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
51。
包含6個組合突變的「Var5B+P7D」：P7D-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
52。
包含6個組合突變的「Var5B+L8A」：L8A-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
53。
包含6個組合突變的「Var5B+V9G」：V9G-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
54。
包含6個組合突變的「Var5B+V11L」：V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H - SEQ ID NO:
55。
用獲得的編碼不同突變體和野生型AST IV（SEQ ID NO: 1）的質體轉化大腸桿菌BL21 DE3細胞。將2 μL選殖的質體（1/10稀釋）與40倍體積的BL21電勝任細胞混合，然後進行電穿孔。簡言之，將40 μl細胞與2 μl DNA混合，並轉移到電穿孔杯中。電穿孔裝置是根據製造商建議使用的BioRad的Gene pulser XCell電穿孔系統。
用950 μL SOC培養基（ThermoFisher Scientific）重懸浮轉化的細胞。將200 μL重懸浮液鋪板到適當的抗生素（氨苄青黴素100 mg/L LB板）瓊脂板上。
為了產生AST-IV的野生型酶和不同突變體，將轉化的大腸桿菌BL21 DE3細胞在TB培養基（Terrific Broth medium-ThermoFisher Scientific（0002123806）中在37ºC下生長，直到OD
600nm達到0.5，用Thermo Scientific的Genesys 10 Bio測量，然後藉由向生長培養基中添加1 mM ITPG並將細菌培養物在25ºC保持24小時來誘導突變體的產生。
然後收穫表現野生型酶和突變酶的細胞，用磷酸鹽緩衝液洗滌並在-80ºC冷凍直到分析酶活性。
實例 2 ：芳基磺基轉移酶突變體催化活性的分析 材料和方法
對於芳基磺基轉移酶活性的測試，已經開發了比色法以測量藉由根據以下方案反應將磺醯基從對硝基苯基硫酸鹽（pNPS）轉移到3’,5’-腺苷-磷酸（PAP）以產生3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）而釋放的對硝基苯基（pNP）的量：
PAP + pNPS
→PAPS + pNP
對於測試，將10 µL OD
600nm=100（對應於30 ng/μL酶）的如
實例 1中製備的表現一種突變體的大腸桿菌BL21 DE3細胞與以下物質（最終濃度）一起培育：
pNPS 1 mM；
PAP 0.23mM；
磷酸鹽緩衝液pH 7.0；和
甘油10%。
表現野生型AST IV（EC 2.8.2.9）的大腸桿菌BL21 DE3細胞用作對照。
將反應混合物在37ºC下進一步培育，並且根據製造商的建議使用來自Molecular Devices的SpectraMax® 190在404 nm下測量10、30或90分鐘的光密度（OD）。
對於每種酶製劑，沒有添加PAP的反應混合物樣品作為陰性對照。
突變體的酶活性以404 nm處的任意吸光度單位表示為pNP產量。減去空白以標準化結果。
結果
在第一系列實驗中，非突變（野生型）芳基磺基轉移酶IV（AST IV）和不同突變體Var01至Var09在10和30分鐘的酶活性。結果呈現於
圖 1A和
圖 1B中。
非突變的芳基磺基轉移酶IV（AST IV）和不同突變體Var09-01至Var09-10和Var09在90分鐘的酶活性呈現於
圖 2中。
如圖所示，與野生型AST IV酶相比，突變體具有比野生型酶活性增加至少約1.3倍的酶活性。
圖 1A示出，在反應開始後10分鐘，單一突變體Var01到Var08的酶活性是野生型酶活性的至少2倍。此外，與野生型酶的活性相比，突變體Var05的酶活性增加了4倍，而突變體Var01、Var02、Var06、Var07和Var08的酶活性增加了5倍。
與野生型酶相比，多重突變體Var09的酶活性增加了至少8倍。
這些結果表明，鑒定的突變體與野生型酶相比具有增加的催化效率。
圖 1A示出，在反應開始後30分鐘，單一突變體Var01至Var08的酶活性比野生型酶的活性增加約1.4至約1.9倍。多重突變體Var09的酶活性比野生型酶的活性增加至少約3倍。
這些結果表明，鑒定的突變體與野生型酶相比具有增加的催化速率。
圖 2示出，在反應開始後90分鐘，多重突變體Var09的酶活性比野生型酶的活性增加至少約7倍。單一突變體Var09-01至Var09-10的酶活性比野生型酶的所述活性高約1.3倍至約2.0-2.2倍。值得注意的是，與野生型相比，Var09-01和Var09-07的酶活性增加約1.4倍，並且與野生型酶的活性相比，Var09-02、Var09-03、Var09-04、Var09-06、Var09-08、Var09-09和Var09-10的酶活性增加約1.8至約2.2倍。
這些結果表明，與野生型酶相比，單獨或組合的Var09突變誘導催化速率增加。
在第二系列實驗中，用去除了Var09的一個、兩個或三個取代的不同構建體探索了Var09的組合突變的重要性。
在反應開始後10分鐘，如上詳述測量突變體的催化活性。結果呈現於
圖 3中。如
圖 3所示，除了Var09-P6Q（其中取代P6Q已被去除的突變體Var09）和Var09-N195D以外，所有突變體保持高於野生型酶但低於Var09的活性。不同的取代顯現都在一定程度上有助於Var09催化活性的增加。此外，它們顯現一起協作以增強催化活性。
取代P6Q的去除降低了含有Var09的其他取代的突變體的催化活性，低於野生型酶的活性（
圖 3）。單獨實施P6Q取代時（Var09-01；
圖 2）導致催化活性增加，但以適度的方式。因此，P6Q顯現與其他突變正協作並且可以比其他突變更能強烈地提高Var09 AST IV的催化活性。
取代N195D的去除增強了含有Var09的其他取代的突變體的催化活性，高於突變體Var09的活性（
圖 3）。單獨實施N195D取代時（Var09-09；
圖 2）導致與野生型酶相比催化活性的顯著增加。因此，當與Var09的其他取代組合時，N195D顯現與其他突變負協作，導致突變的AST IV的催化活性降低。
去除2（K62D&T263H）或3（K62D、N195D&T263H）的取代導致突變體與野生型AST IV酶相比具有增強的催化活性，但低於Var09。有趣的是，在已經剝奪K62D和T263H的突變體中去除N195D不會導致酶活性的顯著增加，這表明N195D與上述其他突變的負協作不適用於K62D和T263H組合。值得注意的是，當單獨實施時，與野生型酶相比，取代K62D、N195D和T263H中的每一個導致酶活性的顯著增加（參見
圖 2中的Var09-07、Var09-09和Var09-10）。
這些結果一起顯示Var09中的每個取代，雖然在單獨使用時能夠增加酶活性，但傾向於彼此協作以進一步增強酶活性。除了Var09和Var09-N195D，圖3的結果還顯示AST的幾種多重突變體表現出高於野生型酶活性的酶活性（Var09-L8A、Var09-A97S、Var09-K62D、Var09-K62D-T263H、Var09-W33R、Var09-V11L、Var09-V9G、Var09-K62D-N195D-T263H、Var09-T263H）。
在另一組實驗中，將單個取代Var01至Var08中的每一個與Var09組合，得到「Var09+I17F」、「Var09+I17Y」、「Var09+F20I」、「Var09+F20L」、「Var09+F138H」、「Var09+Y236F」、「Var09+I239D」和「Var09+M244N」。
酶催化活性的結果呈現於
圖 4中。在測試的突變體中，Var09的10個取代與Y236F的組合導致遠高於Var09酶的強烈活性增加，表明該位置的突變與其他突變正協作以增加酶活性。
關於酶的構形，位置6、7、8、9和11的突變隨機分佈於3-D構形，並且可以在蛋白質結構上產生小的重排以促進更好的活性，而位置33、62、97、195和263的突變則在3-D構形的表面，並且可以影響蛋白質的熱穩定性。因此，藉由構建以下兩個突變體探索了這2類突變關於它們對酶的影響的影響：包含表面突變（W33R、K62D、A97S、N195D和T263H）的Var5B和包含其他突變（P6Q、P7D、L8A、V9G和V11L）的Var5A。此後，使用每個新突變體構建一系列突變體，其中添加每個其他突變之一：一態樣是Var5A+W33R、Var5A+K62D、Var5A+A97S、Var5A+N195D和Var5A+T263H，以及Var5B+P6Q、Var5B+P7D、Var5B+L8A、Var5B+V9G和Var5B+V11L。如前所示測量這一組新的突變體的催化活性，並與野生型酶和Var09突變體進行比較。結果呈現於
圖 5中。
結果表明，表面突變的組合增加了催化活性，並且添加其他突變具有輕微的正效應或相當中性的效應。5A突變的組合具有輕微的負效應，其可藉由在位置33或62、195、263添加其他突變來拯救，其中突變K62d和W33R具有最強的正效應。
本文公開的芳基磺基轉移酶突變體與野生型酶相比具有增加的酶速率和酶效率。因此，此類突變體可用於將PAP轉化或再循環為PAPS。這些突變體可以有利地用於需要PAPS作為受質的酶促過程，例如硫酸化多醣（例如肝素）的酶促產生，以將PAP有效地轉化或再循環為PAPS並確保維持這種酶促過程的高速率和效率。
實例 3 ：芳基磺基轉移酶突變體熱穩定性的分析 材料和方法
為了測試芳基磺基轉移酶的熱穩定性，使用帶有CFX96光學反應模組的C1000接觸式熱循環儀Bio-Rad實施熱移位測定。使用來自BioRad的軟體CFX Maestro獲得每個變體的熔點，以用於分析計算d（螢光）/dT的結果。
對不同的芳基磺基轉移酶突變體和野生型酶施加15秒內從15ºC至100ºC的溫度梯度，每5秒增加+0.5ºC。
使用的反應混合物如下：
酶 20 µg
磷酸鈉緩衝液pH 7.0 50 mM
甘油 10%
Sypro Orange 1x
結果
在另一組實驗中，組成變體5B的簡單變體W33R、K62D、A97S、N195D和T263H的熔點已藉由熱移位測定測量以確定其各自的熱穩定性效應。結果呈現於下表4中。大多數變體顯示它們各自的熔點從1ºC到3ºC的低但顯著的增加。與野生型酶相比，變體Var5B顯示熔點增加6ºC，這明顯受益於這些突變對熱穩定性的各自正效應。
結果呈現於下表4中。
表 4 ：胺基酸取代對大鼠芳基磺基轉移酶熱穩定性的影響
| 變體 | 突變 | 熔解溫度 |
| AST-IV | 野生型 | 50 |
| Var5B | W33R-K62D-A97S-N195D-T263H | 56 |
| Var09-06 | W33R | 53 |
| Var09-07 | K62D | 53 |
| Var09-08 | A97S | 51 |
| Var09-09 | N195D | 52 |
| Var09-10 | T263H | 53 |
如表4所示，與野生型酶相比，單獨或組合的胺基酸取代將突變酶的熱穩定性從至少1ºC提高到6ºC。
熱穩定性更強的酶可以在更高的用於酶反應（例如用於將PAP轉化為PAPS）的培育溫度下使用，這可以加速反應速率。這可以有利地用於生物過程系統，例如用於硫酸肝素原的硫酸化，例如用於肝素產生，以提高將PAP再循環成PAPS的速率。這可以進一步提高反應產率並進一步降低生產成本。
實例 4 ：芳基磺基轉移酶突變體在偶聯反應中的活性 材料與方法
實施測試，以間接測量在用2O-磺基轉移酶和C5-差向異構酶對N-硫酸化肝素原（NS肝素原）的硫酸化偶聯反應中的芳基磺基轉移酶PAPS再循環活性。幾種芳基磺基轉移酶突變體首先被純化，然後加入到如下的反應介質中。
酶純化方法
AST-IV酶（野生型和突變體）、C5差向異構酶（D-葡萄糖醛酸基C5-差向異構酶；來自Danio rerio的EC:5.1.3.17，參考Yi Qin等人，J Biol Chem. 2015年2月20日;290(8):4620-4630. doi: 10.1074/jbc.M114.602201. Epub 2015年1月7日）和2-OST（硫酸乙醯肝素2-O-磺基轉移酶1；來自Cricetulus longicaudatus的EC:2.8.2.，參考M. Kobayashi等人 J Biol Chem. 1996年3月29日;271(13):7645-53. doi: 10.1074/jbc.271.13.7645）藉由基因合成得到，將它們選殖到pET-Duet載體中並在大腸桿菌BL21 DE3中產生，如實例1中詳述。
在Ni-NTA樹脂上純化酶。首先用50 mM磷酸鈉pH 7、20 mM咪唑平衡緩衝液平衡Ni-NTA。將來自細菌的酶裂解物施加到樹脂上並在4ºC下在旋轉輪上培育過夜。將Ni-NTA樹脂用50 mM磷酸鈉pH 7、20 mM咪唑洗滌緩衝液洗滌3次。添加50 mM磷酸鈉pH 7、250 mM咪唑洗脫緩衝液，在4ºC下在旋轉輪上持續2小時。將洗脫物用Amicon Ultra（截止值10 kDa）在50 mM磷酸鈉pH 7、10%甘油緩衝液中透析並儲存在-80ºC。
測試的芳基磺基轉移酶突變體是：「Var09」（SEQ ID NO: 13）、「Var09-N195D」（SEQ ID NO: 32）和「Var09+Y236F」（SEQ ID NO: 41）。
酶促反應
酶促反應介質的組成在下表5中給出：
表 5 ：酶促反應介質的組成
| MES-KOH緩衝液pH 7 | 50 mM |
| NaCl | 100 mM |
| CaCl2.2H2O | 1.32 mM |
| PNPS（4-硝基苯基硫酸鉀鹽） | 1-10 mM |
| 還原劑 | 1 mM |
| PAPS | 0.1-0.5 mM |
| NS肝素原 | 1.2 g/L |
| C5epimerase | 22 mU/mL |
| 2OSulfotransferase | 60 mU/mL |
| 大鼠AST IV野生型和突變體 | 根據實驗的量（0.1或0.03 g/L） |
首先添加所有原料並在添加酶之前溶解在介質中。然後將混合物在37ºC下在攪拌下培育24小時。藉由在95ºC下熱衝擊45分鐘來停止酶反應。然後，將樣品在4ºC下以9100 g離心10分鐘。回收上清液進行分析。
用於 LC-MS 分析的樣品製備
將40 μL酶反應產生的樣品（1 g/L）與20 μL檸檬酸（2 M）和10 μL NaNO2（1.05 M）混合，並在Thermomixer中在1000 rpm攪拌下在65ºC培育2小時。添加30 μL DNPH二硝基苯肼（51.5 mM）並在65ºC下在1000 rpm攪拌下在Thermomixer中培育2小時。離心樣品並將上清液轉移到HPLC小瓶中。
LC-MS 分析 表 6 ：超高效液相層析（ UPLC ）分析採用下列參數：
| 設備 | UPLC：Acquity Waters | |
| 設置 | ||
| 採集軟體 | Unifi | |
| 管柱 | SUMIPAX ODS Z-CLUE 250 x 2 mm 3 µm | |
| 流速 | 0.3 mL/min | |
| 執行時間 | 40 min | |
| 管柱溫度： | 50ºC | |
| 流動相： | A相：用HCOOH（5%）將50 mM HCOONH4調節至pH 4.24 B相：乙腈 | |
| 梯度 | ||
| 時間（min） | A相（%） | B相（%） |
| 0 | 90 | 10 |
| 13 | 80 | 20 |
| 27 | 20 | 80 |
| 27,1 | 90 | 10 |
| 40 | 90 | 10 |
| UV | 365 nm |
峰分離後，應用採用Waters的Xevo G2-XS QT的質譜（MS）進行峰鑒定。MS用於鑒定對應於每個峰的單醣。硫酸化速率計算為顯示2-O硫酸化的單糖與所分析的所有單糖的總和相比的百分比。
結果
在C5-差向異構酶和幾種AST-IV突變體[Var-09（SEQ ID NO: 13）、Var-09-N195D（SEQ ID NO: 32）和Var-09+Y236F（SEQ ID NO: 41）]的存在下測量2-O磺基轉移酶對N-硫酸化肝素原（NS肝素原）的活性。將獲得的硫酸化速率與野生型AST-IV進行比較。
在使用兩種不同AST-IV酶量（分別為0.1 g/L（
圖 7A）和0.03 g/L（
圖 7B））的兩個實驗中，當與野生型AST-IV相比時，在三種突變體Var-09、Var-09-N195D和Var-09+Y236F的存在下獲得的硫酸化速率明顯更高。
換言之，與AST-IV WT相比，三種突變體Var-09、Var-09-N195D和Var-09+Y236F允許增加2-O硫酸化水準，表明PAPS再循環活性的改善與其在生物過程系統中的有利用途相容，所述生物過程系統例如用於N-硫酸化肝素原或硫酸乙醯肝素的硫酸化，例如用於肝素生產，其中需要增強將PAP再循環為PAPS。
[ 參考文獻 ]Altschul SF. A protein alignment scoring system sensitive at all evolutionary distances.
J Mol Evol. 1993;36(3):290-300. doi:10.1007/BF00160485
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool.
J Mol Biol. 1990;215(3):403-410. doi:10.1016/S0022-2836(05)80360-2
Berger I, Guttman C, Amar D, Zarivach R, Aharoni A. The molecular basis for the broad substrate specificity of human sulfotransferase 1A1.
PLoS One. 2011;6(11):e26794. doi:10.1371/journal.pone.0026794
Burkart MD, Izumi M, Chapman E, Lin CH, Wong CH. Regeneration of PAPS for the enzymatic synthesis of sulfated oligosaccharides.
J Org Chem. 2000;65(18):5565-5574. doi:10.1021/jo000266o
Chen J, Avci FY, Muñoz EM, et al. Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate.
J Biol Chem. 2005;280(52):42817-42825. doi:10.1074/jbc.M504338200
Devereux J, Haeberli P, Smithies O. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX.
Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11;12(1 Pt 1):387-95. doi: 10.1093/nar/12.1part1.387. PMID: 6546423; PMCID: PMC321012
Esko JD, Selleck SB. Order out of chaos: assembly of ligand binding sites in heparan sulfate.
Annu Rev Biochem. 2002;71:435-471. doi:10.1146/annurev.biochem.71.110601.135458
Fu L, Suflita M, Linhardt RJ. Bioengineered heparins and heparan sulfates.
Adv Drug Deliv Rev. 2016;97:237-249. doi:10.1016/j.addr.2015.11.002
Guo WX, Yang YS, Chen X, McPhie P, Jakoby WB. Changes in substrate specificity of the recombinant form of phenol sulfotransferase IV (tyrosine-ester sulfotransferase).
Chem Biol Interact. 1994;92(1-3):25-31. doi:10.1016/0009-2797(94)90050-7
Henikoff S, Henikoff JG. Amino acid substitution matrices from protein blocks.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(22):10915-10919. doi:10.1073/pnas.89.22.10915
Karlin S, Altschul SF. Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90(12):5873-5877. doi:10.1073/pnas.90.12.5873
Lin CH, Lin ES, Su TM, Hung KS, Yang YS. A nano switch mechanism for the redox-responsive sulfotransferase.
Biochem Pharmacol. 2012;84(2):224-231. doi:10.1016/j.bcp.2012.04.003
Liu J, Thorp SC. Cell surface heparan sulfate and its roles in assisting viral infections.
Med Res Rev. 2002;22(1):1-25. doi:10.1002/med.1026
Marshall AD, Darbyshire JF, Hunter AP, McPhie P, Jakoby WB. Control of activity through oxidative modification at the conserved residue Cys66 of aryl sulfotransferase IV.
J Biol Chem. 1997;272(14):9153-9160. doi:10.1074/jbc.272.14.9153
Paul P, Suwan J, Liu J, Dordick JS, Linhardt RJ. Recent advances in sulfotransferase enzyme activity assays.
Anal Bioanal Chem. 2012;403(6):1491-1500. doi:10.1007/s00216-012-5944-4
Sheng JJ, Saxena A, Duffel MW. Influence of phenylalanines 77 and 138 on the stereospecificity of aryl sulfotransferase IV.
Drug Metab Dispos. 2004;32(5):559-565. doi:10.1124/dmd.32.5.559
WO 2010/040973 - Biosynthetic HeparinXiong J, Bhaskar U, Li G, et al. Immobilized enzymes to convert N-sulfo, N-acetyl heparosan to a critical intermediate in the production of bioengineered heparin.
J Biotechnol. 2013;167(3):241-247. doi:10.1016/j.jbiotec.2013.06.018
Zhou Z, Li Q, Xu R, Wang B, Du G, Kang Z. Secretory expression of the rat aryl sulfotransferases IV with improved catalytic efficiency by molecular engineering.
3 Biotech. 2019;9(6):246. doi:10.1007/s13205-019-1781-x
Yi Qin, Jiyuan Ke, Xin Gu, Jianping Fang, Wucheng Wang, Qifei Cong, Jie Li, Jinzhi Tan, Joseph S Brunzelle, Chenghai Zhang, Yi Jiang, Karsten Melcher, Jin-Ping Li, H Eric Xu, Kan Ding, Structural and functional study of D-glucuronyl C5-epimerase J Biol Chem. 2015 Feb 20;290(8):4620-4630. doi: 10.1074/jbc.M114.602201. Epub 2015 Jan 7.
M Kobayashi, H Habuchi, O Habuchi, M Saito, K Kimata Purification and characterization of heparan sulfate 2-sulfotransferase from cultured Chinese hamster ovary cells J Biol Chem. 1996 Mar 29;271(13):7645-53. doi: 10.1074/jbc.271.13.7645
無
圖 1：
圖 1A表示將PAP轉化為PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，藉由關於在pNP產生的在404 nm處的吸光度測量並且在反應開始10分鐘後用野生型（AST IV）和突變體Var01至Var09獲得。
圖 1B表示將PAP轉化為PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，藉由關於pNP產生的在404 nm處的吸光度測量並且在反應開始30分鐘後用野生型（AST IV）和突變體Var01至Var09獲得。
圖 2：表示將PAP轉化為PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，藉由關於pNP產生的在404 nm處的吸光度測量並且在反應開始90分鐘後用野生型（AST IV）和突變體Var09-1至Var09-10、和Var09獲得。
圖 3：表示將PAP轉化為PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，藉由關於pNP產生的在404 nm處的吸光度測量並且在反應開始10分鐘後用野生型（AST IV）和突變體Var09-P6Q、Var09-P7D、Var09-L8A、Var09-V9G、Var09-V11L、Var09-W33R、Var09-K62D、Var09-A97S、Var09-N195D、Var09-T263H、VAR09-K62D-T263H、VAR09-K62D-N195D-T263H和Var09獲得。
圖 4：表示將PAP轉化為PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，藉由關於pNP產生的在404 nm處的吸光度測量並且在反應開始10分鐘後用野生型（AST IV）和突變體Var09+I17F、Var09+I17Y、Var09+F20I、Var09+F20L、Var09+F138H、Var09+Y236F、Var09+I239D、Var09+M244N和Var09獲得。
圖 5：表示將PAP轉化為PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，藉由關於pNP產生的在404 nm處的吸光度測量並且在反應開始10分鐘後用野生型（AST IV）和突變體Var09、Var5A（P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L）、Var5B（W33R、K62D、A97S、N195D、T263H）、Var5A+W33R、Var5A+K62D、Var5A+A97S、Var5A+N195D、Var5A+T263H、Var5B+P6Q、Var5B+P7D、Var5B+L8A、Var5B+V9G和Var5B+V11L獲得。
圖 6：表示來自原雞（SEQ ID NO: 3）、褐家鼠（SEQ ID NO: 1）、智人（SEQ ID NO: 2）和家牛（SEQ ID NO: 4）的序列或芳基磺基轉移酶（AST）的比對。在來自大鼠的AST序列中，以粗體和底線表示可藉由胺基酸取代而突變的位置。
圖 7：表示在存在C5-差向異構酶和不同AST-IV WT和變體[「Var09」（SEQ ID NO: 13）、「Var09-N195D」（SEQ ID NO: 32）和「Var09+Y236F」（SEQ ID NO: 41）]的情況下，在使用兩種不同AST-IV酶量（分別為0.1 g/L（
圖 7A）和0.03 g/L（
圖 7B））的兩個實驗中對N-硫酸化肝素原（NS肝素原）的2-O硫酸化活性。
TW202330913A_111136676_SEQL.xml
無。
Claims (19)
- 一種非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中該位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，和 (ii) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，條件是當該芳基磺基轉移酶是大鼠芳基磺基轉移酶IV時，突變不是F138A及/或Y236A。
- 如請求項1所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其具有將腺苷3',5'-二磷酸（adenosine 3',5'-bisphosphate，PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate，PAPS）的磺基轉移酶活性，比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍。
- 一種非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含 (i) 在選自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263及其組合的至少一個胺基酸位置處的胺基酸取代，其中該位置是相對於大鼠芳基磺基轉移酶IV SEQ ID NO: 1的胺基酸序列而言的，(ii) 與SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的胺基酸序列，和 (iii) 具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍。
- 如請求項1至3中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其在選自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195及/或263的至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或10個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
- 如請求項1至4中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其在胺基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195和263處，和視需要地在位置236處包含胺基酸取代。
- 如請求項1至5中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其中取代胺基酸： -在位置6處是麩醯胺酸（Q）或天門冬醯胺酸（N）， -在位置7處是天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E）， -在位置8處是丙胺酸（A）、甘胺酸（G）或擷胺酸（V）， -在位置9處是甘胺酸（G）、丙胺酸（A）或擷胺酸（V）， -在位置11處是白胺酸（L）、擷胺酸（V）或異白胺酸（I）， -在位置17處是苯丙胺酸（F）或酪胺酸（Y）， -在位置20處是異白胺酸（I）或白胺酸（L）， -在位置33處是精胺酸（R）、組胺酸（H）或離胺酸（K）， -在位置62處是天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E）， -在位置97處是絲胺酸（S）或蘇胺酸（T）， -在位置138處是組胺酸（H）、離胺酸（K）或精胺酸（R）， -在位置195處是天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E）， -在位置236處是苯丙胺酸（F）或色胺酸（W）， -在位置239處是天門冬胺酸（D）或麩胺酸（E）， -在位置244處是天門冬醯胺酸（N）或麩醯胺酸（Q），及/或 -在位置263處是組胺酸（H）、離胺酸（K）或精胺酸（R）。
- 如請求項1至6中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含至少一個選自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17F、I17Y、F20L、F20I、W33R、K62D、A97S、F138H、N195D、Y236F、I239D、M244N、T263H及其組合的胺基酸取代。
- 如請求項1至7中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其至少包含胺基酸取代P6Q。
- 如請求項1至8中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含胺基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D和T263H。
- 如請求項1至9中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其至少包含胺基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H。
- 如請求項1至10中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含胺基酸取代Y236F。
- 如請求項1至11中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，該非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶具有選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的胺基酸序列或具有與選自SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47、和49至56的序列具有至少60%同一性的胺基酸序列和將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少約1.3倍。
- 如請求項1至12中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，該非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶具有將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.5倍、或至少1.8、或至少1.9、或至少2.0、或至少2.2、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.2、或至少3.5、或至少4.0、或至少4.5、或至少5.0、或至少5.5、或至少6.0、或至少6.5、或至少7.0倍。
- 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至13中任一項所述的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶。
- 一種重組表現載體，其包含如請求項14所述的核酸。
- 一種體外宿主細胞，其包含如請求項14所述的核酸或如請求項15所述的重組表現載體。
- 一種用於硫酸化受質的套組，該套組至少包含： a. 在第一容器中的如請求項1至13中任一項所述的一種非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶；以及 b. 在第二容器中的磺基供體。
- 一種選擇非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的方法，該非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶包含至少一個胺基酸取代且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少基本上等於或大於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性，該方法至少包括以下步驟： a. 使包含至少一個胺基酸取代的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物與磺基供體在適於將磺基從磺基供體轉移至PAP的條件下接觸，以獲得PAPS， b. 檢測PAPS的形成速率或量， c. 將步驟b) 中獲得的PAPS的形成速率或量與參考速率或量進行比較，該參考速率或量係用SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV獲得的或用具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶所獲得，和 d. 選擇任何非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物，該非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶候選物包含至少一個胺基酸取代且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少基本上等於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的所述活性。
- 一種非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶，其包含至少一個胺基酸取代且包含將腺苷3',5'-二磷酸（PAP）轉化為3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸（PAPS）的磺基轉移酶活性，其比SEQ ID NO: 1的大鼠芳基磺基轉移酶IV的所述活性高至少1.3倍或至少等於具有選自包含SEQ ID NO: 5至23、25至35、41、45至47和49至56的群組的胺基酸序列的非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶的活性，該非天然存在的突變的芳基磺基轉移酶係藉由如請求項18所述的方法所鑒定。
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