TW202330044A - 免疫原組合物及其方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於用於製備、製造及治療使用核糖核酸免疫原組合物及/或疫苗之組合物及方法，該等核糖核酸免疫原組合物及/或疫苗包含較佳編碼一或多種流感抗原，諸如血球凝集素抗原之聚核苷酸分子，其中該組合物經冷凍或凍乾。

Description

免疫原組合物及其方法

本發明係關於用於製備、製造及治療使用核糖核酸免疫原組合物及/或疫苗之組合物及方法，該等核糖核酸免疫原組合物及/或疫苗包含編碼抗原，諸如血球凝集素抗原之聚核苷酸分子，其中該等組合物為液體，較佳經冷凍或凍乾。

基於RNA之疫苗顯示出應對現有及新發感染性疾病之巨大前景。然而，疫苗RNA分子可能易於被普遍存在的核糖核酸酶裂解。另外，單獨RNA在注射後不容易跨越細胞膜進入目標細胞。RNA遞送調配物(諸如脂質奈米粒子(LNP))已用於幫助穩定化及保護RNA分子免受核糖核酸酶降解，且增強RNA有效負載之有效細胞吸收及細胞內遞送。然而，維持LNP調配物中之RNA的長期穩定性需要在低於零溫度下儲存，其可能潛在地對LNP之膠體穩定性及在冷凍/解凍之後RNA暴露程度造成不利後果。

因此，仍需要有效且熱穩定的RNA組合物。為滿足此等需求及其他需求，本文揭示可凍乾及熱穩定的組合物及其方法，以有效遞送基於mRNA及複製RNA之疫苗，較佳藉由肌肉內注射遞送。

抗流感疫苗亦需要有效且熱穩定的RNA組合物。流感病毒為正黏液病毒科之成員，且基於其核蛋白(NP)與基質(M)蛋白質之間的抗原差異而分為三種類型(A、B及C)。A型流感病毒之基因體包括八種具有線性、負極性、單股RNA之分子(七種針對C型流感病毒)，該等RNA編碼若干多肽，包括：形成核衣殼之RNA導向RNA聚合酶蛋白質(PB2、PB1及PA)及核蛋白(NP)；基質蛋白質(M1、M2，其亦為包埋於病毒膜中之表面暴露蛋白質)；兩個自脂蛋白包膜突出的表面糖蛋白：血球凝集素(HA)及神經胺糖酸苷酶(NA)；及非結構蛋白(NS1及NS2)。血球凝集素為A型及B型流感病毒之主要包膜糖蛋白，且C型流感病毒之血球凝集素-酯酶(HE)為與HA同源之蛋白質。

使用傳統疫苗治療及預防流感及其他感染之一個挑戰為疫苗廣度有限，僅提供針對緊密相關之亞型的保護。此外，完成現行標準流感病毒疫苗生產過程所需之時長抑制了在大流行性情形下適應性疫苗之快速開發及生產。需要改良之抗流感免疫原組合物。

在一個態樣中，本發明係關於一種免疫原組合物，諸如液體、冷凍或凍乾免疫原組合物，包含(a)第一脂質奈米粒子；(b)第二脂質奈米粒子；及(c)低溫保護劑；其中該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質；其中該第一脂質奈米粒子囊封具有編碼至少一種抗原，較佳流感抗原之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸；且該第二脂質奈米粒子不囊封核酸，使得第一脂質奈米粒子在不修飾其組合物之情況下之有效濃度增加。第一脂質奈米粒子之有效濃度隨其微環境附近之水分子可用率而變化。不希望受理論所束縛，在一些態樣中，用額外調配物緩衝溶液稀釋調配物引起第一脂質奈米粒子之有效濃度降低，引起膠體不穩定性及RNA暴露量增加(亦即，囊封%降低)；在一些態樣中，添加第二脂質奈米粒子使得能夠增加第一脂質奈米粒子之有效濃度，從而防止如上文所述的對第一脂質奈米粒子之不利影響。

在一個態樣中，本發明係關於一種免疫原組合物，諸如液體、冷凍或凍乾免疫原組合物，其包含(a)第一脂質奈米粒子；及有效量之低溫保護劑；其中第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質；其中第一脂質奈米粒子囊封具有編碼至少一種相關多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其中該至少一種相關多肽包含抗原，較佳其中該抗原為流感抗原；其中該低溫保護劑包含醣；且其中低溫保護劑之有效量為至少約2% w/v至30% w/v之組合物，例如至少、至多、其中任何兩者之間或恰好2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30% w/v之組合物。在一些態樣中，組合物進一步包含第二脂質奈米粒子，其中第二脂質奈米粒子不囊封RNA聚核苷酸。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，與不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，包括第二脂質奈米粒子進一步增強組合物之穩定性。

在一些態樣中，第一脂質奈米粒子與第二脂質奈米粒子之總比率在1:1至1:4999範圍內。在一些態樣中，第一脂質奈米粒子與第二脂質奈米粒子之總比率在1:1至1:4999，包括1:4至1:4999範圍內。參見例如表3。

比率定義為與第一脂質奈米粒子相關之總脂質組分的質量分率(基於每單位體積RNA有效負載之等效質量報導)與第二脂質奈米粒子中之總脂質的質量分率之比，該等第二脂質奈米粒子為增加第一脂質奈米粒子之有效濃度以保持膠體穩定性(粒度及尺寸分佈)及囊封%所需。

在一些態樣中，調配物中至少60%之RNA完全囊封於第一脂質奈米粒子中或與第一脂質奈米粒子締合。在一些態樣中，組合物中總RNA之至少80%囊封於第一脂質奈米粒子內或與第一脂質奈米粒子締合。在一些態樣中，調配物中0%之RNA囊封於第二奈米粒子中。

在一些態樣中，第二脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質。在一些態樣中，第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質與第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質相同。在一些態樣中，第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質中之一或多者不同於第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質。在一些態樣中，第二脂質奈米粒子為脂質體。在一些態樣中，脂質體包含i)中性脂質及/或磷脂；ii)類固醇；及iii)聚合物結合脂質。在一些態樣中，脂質體進一步包含陽離子脂質。

在一些態樣中，脂質奈米粒子包含40與50莫耳%之間的陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含41至49莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含41至48莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含42至48莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含43至48莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含44至48莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含45至48莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含46至48莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含47至48莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含47.2至47.8莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含約47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0莫耳%陽離子脂質。在其他態樣中，脂質奈米粒子包含0至10莫耳%陽離子脂質。在某些特定態樣中，脂質奈米粒子包含至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10莫耳%陽離子脂質。

在一些態樣中，磷脂及/或中性脂質以5至15莫耳%範圍內之濃度存在。在一些態樣中，磷脂及/或中性脂質以7至13莫耳%範圍內之濃度存在。在一些態樣中，磷脂及/或中性脂質以9至11莫耳%範圍內之濃度存在。在一些態樣中，磷脂及/或中性脂質以約9.5、10或10.5莫耳%之濃度存在。在其他態樣中，磷脂及/或中性脂質以40至60莫耳%範圍內之濃度存在。在某些態樣中，磷脂及/或中性脂質以40至60莫耳%之濃度存在。在某些特定態樣中，磷脂及/或中性脂質以約48、49或50莫耳%之濃度存在。在一些態樣中，陽離子脂質與磷脂及/或中性脂質之莫耳比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0或約4.7:1.0至4.8:1.0範圍內。

在一些態樣中，類固醇以32至40莫耳%範圍內之濃度存在。在一些態樣中，類固醇以39至49莫耳%範圍內之濃度存在。在一些態樣中，類固醇以約40、41、42、43、44、45或46莫耳%之濃度存在。在某些態樣中，類固醇以40至60莫耳%之濃度存在。在某些特定態樣中，類固醇以約48、49或50莫耳%之濃度存在。在一些態樣中，陽離子脂質與類固醇之莫耳比在1.0:0.9至1.0:1.2範圍內。在一些態樣中，總陽離子脂質與類固醇之莫耳比在1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。

在一些態樣中，脂質奈米粒子包含i)具有大於6.0之有效pKa之陽離子脂質；ii) 5至15莫耳%中性脂質；iii) 1至15莫耳%陰離子脂質；iv) 30至45莫耳%類固醇；v)聚合物結合脂質；及vi)治療劑或其醫藥學上可接受之鹽或前藥，其囊封於脂質奈米粒子內或與該脂質奈米粒子締合，其中莫耳%係基於脂質奈米粒子中存在之脂質的總莫耳數測定。在一些態樣中，陽離子脂質具有大於6.25之有效pKa。在一些態樣中，脂質奈米粒子包含40至55莫耳%陽離子脂質。在一些態樣中，脂質奈米粒子包含：i) 45至55莫耳%陽離子脂質；ii) 5至10莫耳%中性脂質；iii) 1至5莫耳%陰離子脂質；及iv) 32至40莫耳%類固醇。

在一些態樣中，組合物包含ALC-0315 (4-羥丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)。在一些態樣中，組合物包含ALC-0159 (2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙醯胺)。在一些態樣中，組合物包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。在一些態樣中，組合物包含膽固醇。在一些態樣中，組合物包含0.9-1.85 mg/mL ALC-0315；0.11-0.24 mg/mL ALC-0159；0.18-0.41 mg/mL DSPC；及0.36-0.78 mg/mL膽固醇。

在一些態樣中，脂質奈米粒子尺寸為至少40 nm。在一些態樣中，脂質奈米粒子尺寸為至多180 nm。在一些態樣中，第二脂質奈米粒子之尺寸比第一脂質奈米粒子小50%。在一些態樣中，第二脂質奈米粒子之尺寸比第一脂質奈米粒子大50%。在一些態樣中，組合物已凍融至少2次。在一些態樣中，組合物已凍融至少5次。在一些態樣中，第一脂質及第二奈米粒子的混合物在凍融循環及/或冷凍乾燥之後之尺寸較佳在20至180 nm範圍內，更佳在30至150 nm範圍內，且最佳在40至120 nm範圍內。

在一些態樣中，低溫保護劑為醣。在一些態樣中，低溫保護劑為雙醣。在一些態樣中，低溫保護劑為蔗糖。在一些態樣中，低溫保護劑包含蔗糖，且組合物包含至少約2% w/v至30% w/v蔗糖，例如至少、至多、其中任何兩者之間或恰好2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30% w/v蔗糖。在一些態樣中，低溫保護劑包含蔗糖，且組合物包含至少約10% w/v至25% w/v蔗糖。在一些態樣中，低溫保護劑包含蔗糖，且組合物包含至少約10.3% w/v至20.5% w/v蔗糖。在一些態樣中，在冷凍及/或冷凍乾燥之前組合物中低溫保護劑之濃度為10至600 mg/mL。

在一些態樣中，冷凍組合物。在一些態樣中，將組合物凍乾。在一些態樣中，組合物藉由噴霧冷凍乾燥來凍乾。在一些態樣中，將組合物凍乾及復原。在一些態樣中，組合物為液體。在一些態樣中，組合物具有小於總組合物之約10%的含水量。在一些態樣中，組合物具有在總組合物之約0.1%與5%之間的含水量。

在一些態樣中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之緩衝液。在一些態樣中，組合物包含Tris。在一些態樣中，組合物包含蔗糖。在一些態樣中，組合物不進一步包含氯化鈉。在一些態樣中，組合物包含10 mM Tris。在一些態樣中，組合物包含300 mM蔗糖。在一些態樣中，組合物具有pH 7.4。在一些態樣中，組合物具有小於或等於12.5 EU/mL之細菌內毒素。

在一些態樣中，組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後穩定至少約兩週。在一些態樣中，組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後穩定至少1個月。在一些態樣中，組合物經組態以在約2℃至30℃之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後穩定至少約兩週。在一些態樣中，組合物經組態以在約2℃至30℃之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後穩定至少約四週。在一些態樣中，組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後穩定約2週至約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或2年。在一些態樣中，組合物經組態以在於約25℃下作為液體儲存之後穩定至少1週，較佳至少2週，更佳至少3週，最佳至少4週。在一些態樣中，組合物經組態以在約40℃下作為液體儲存之後穩定至少1天，較佳至少2天，更佳至少3天，最佳至少4天。

在一些態樣中，組合物已凍融至少2次。在一些態樣中，組合物已凍融至少3次。在一些態樣中，組合物已凍融至少4次。在一些態樣中，組合物已凍融至少5次。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物在冷凍之後及/或在冷凍乾燥之後復原時的穩定性大於包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物在凍融至少一次之後的穩定性大於包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物在凍融至少兩次之後的穩定性大於包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物在凍融至少三次之後的穩定性大於包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物在凍融至少四次之後的穩定性大於包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物在凍融至少五次之後的穩定性大於包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物。

在一些態樣中，RNA之濃度在約10 pg/ml至約10 mg/ml範圍內，較佳在約0.1 μg/mL至0.5 mg/mL範圍內。

在一些態樣中，核酸為RNA且組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後至少約兩週時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。在一些態樣中，組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後至少1個月時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。在一些態樣中，組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後約2週至約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或2年時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。在一些態樣中，組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後約兩週時具有至少80%之完整RNA。

在一些態樣中，當在相同條件下量測時，與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，RNA具有至少約50%或更大，較佳至少約60%或更大，更佳至少約70%或更大，最佳至少約80%或更大之RNA完整性。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，RNA具有大至少約50%，較佳大至少約60%，更佳大至少約70%，最佳大至少約80%之RNA完整性。在一些態樣中，相同條件為在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或凍乾組合物儲存之後。

在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比包含小於約20%之游離RNA，較佳小於約15%以下之游離RNA，更佳小於約10%之游離RNA%。

在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比包含大於60%以上之經囊封RNA，較佳大於70%以上之經囊封RNA，更佳大於80%以上之經囊封RNA且最佳大於90%以上之經囊封RNA。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比包含大於60%之經囊封RNA，較佳大於70%之經囊封RNA，更佳大於80%之經囊封RNA，且最佳大於90%之經囊封RNA。

在一些態樣中，當在相同條件下量測時，與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，RNA之完整性降低小於約30%，較佳小於約20%，更佳小於約10%。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，游離RNA之量增加不超過10%，較佳不超過5%。

在一些態樣中，當在相同條件下量測時，與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，囊封RNA之脂質載劑之Z平均尺寸增加不超過20%，較佳不超過10%。在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物之濁度與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比增加不超過20%，較佳不超過10%。

在一些態樣中，當在相同條件下量測時，與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，pH及/或重量莫耳滲透濃度增加或降低不超過20%，較佳不超過10%。

在一些態樣中，當在相同條件下量測時，組合物之效能與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比降低小於約30%，較佳小於約20%，更佳小於約10%。

在一些態樣中，RNA已藉由至少一個純化步驟純化，且其中第一脂質奈米粒子已藉由至少一個純化步驟，較佳藉由至少一個切向流過濾(TFF)步驟及/或至少一個澄清步驟及/或至少一個過濾步驟純化。在一些態樣中，RNA為純化RNA，較佳RP-HPLC純化RNA及/或切向流過濾(TFF)純化RNA。

在一些態樣中，組合物包含有效量之RNA以在細胞中產生相關多肽。在一些態樣中，RNA包含開放閱讀框架，且開放閱讀框架經密碼子最佳化。在一些態樣中，RNA包含編碼至少一種流感病毒抗原性多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架。

在一些態樣中，抗原為流感血球凝集素1 (HA1)、血球凝集素2 (HA2)、HA1或HA2之免疫原片段或前述中之任何兩者或更多者的組合。在一些態樣中，RNA編碼至少兩種抗原性多肽或其免疫原片段，其中第一抗原為HA1、HA2或HA1與HA2之組合，且其中第二抗原為神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)。在一些態樣中，RNA編碼至少兩種抗原性多肽或其免疫原片段，其中第一抗原為HA1、HA2或HA1與HA2之組合，且其中第二抗原為神經胺糖酸苷酶(NA)。

在一些態樣中，抗原為來自以下的多肽或其免疫原片段：沙狀病毒；星狀病毒；崩芽病毒；杯狀病毒；冠狀病毒；絲狀病毒；黃病毒；嗜肝DNA病毒；肝炎病毒；正黏液病毒；副黏液病毒；小RNA病毒；里奧病毒(reovirus)；反轉錄病毒；棒狀病毒；披衣病毒；或前述中之任何兩者或更多者之組合。

在一些態樣中，抗原為來自以下的多肽或其免疫原片段：鮑氏不動桿菌( Acinetobacter baumannii)、邊蟲屬( Anaplasma genus)、嗜吞噬細胞無形體( Anaplasma phagocytophilum)、巴西鉤蟲( Ancylostoma braziliense)、十二指腸鉤蟲( Ancylostoma duodenale)、溶血隱秘桿菌( Arcanobacterium haemolyticum)、蛔蟲( Ascaris lumbricoides)、麴菌屬( Aspergillus genus)、星狀病毒科( Astroviridae)、巴貝蟲屬( Babesia genus)、炭疽芽孢桿菌( Bacillus anthracis)、蠟樣芽胞桿菌( Bacillus cereus)、韓瑟勒巴通氏菌( Bartonella henselae)、BK病毒、人芽囊原蟲( Blastocystis hominis)、皮炎芽生菌( Blastomyces dermatitidis)、百日咳博德特氏菌( Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋體( Borrelia burgdorferi)、疏螺旋體屬( Borrelia genus)、疏螺旋體屬( Borrelia spp)、布魯桿菌屬( Brucella genus)、馬來絲蟲( Brugia malayi)、布尼亞病毒科( Bunyaviridae family)、洋蔥伯克氏菌( Burkholderia cepacia)及其他伯克氏菌種、鼻疽伯克氏菌( Burkholderia mallei)、類鼻疽伯克氏菌( Burkholderia pseudomallei)、杯狀病毒科( Caliciviridae family)、彎曲桿菌屬( Campylobacter genus)、白色念珠菌( Candida albicans)、念珠菌屬( Candida spp)、沙眼披衣菌( Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原體( Chlamydophila pneumoniae)、鸚鵡披衣菌( Chlamydophila psittaci)、CJD朊病毒、華支睾吸蟲( Clonorchis sinensis)、肉毒桿菌( Clostridium botulinum)、艱難梭菌( Clostridium difficile)、產氣莢膜梭菌( Clostridium perfringens)、產氣莢膜梭菌、梭菌屬( Clostridium spp)、破傷風梭菌( Clostridium tetani)、球孢子菌屬( Coccidioides spp)、冠狀病毒( coronaviruses)、白喉棒狀桿菌( Corynebacterium diphtheriae)、貝氏考克斯菌( Coxiella burnetii)、克里米亞-岡果出血熱病毒( Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、新型隱球菌( Cryptococcus neoformans)、隱孢子蟲屬( Cryptosporidium genus)、巨細胞病毒(CMV)、登革病毒( Dengue viruses) (DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4)、脆雙核阿米巴( Dientamoeba fragilis)、伊波拉病毒( Ebolavirus，EBOV)、胞蟲屬( Echinococcus genus)、查菲艾利希體( Ehrlichia chaffeensis)、尤溫艾利希體( Ehrlichia ewingii)、艾利希體屬( Ehrlichia genus)、溶組織內阿米巴( Entamoeba histolytica)、腸球菌屬( Enterococcus genus)、腸病毒屬( Enterovirus genus)、腸病毒( Enteroviruses)、主要科沙奇A病毒( Coxsackie A virus)及腸病毒71 (EV71)、表皮癬菌屬( Epidermophyton spp)、埃-巴二氏病毒( Epstein-Barr Virus，EBV)、大腸桿菌01 57:H7、01 1 1及O104:H4、肝片吸蟲( Fasciola hepatica)及巨大肝蛭( Fasciola gigantica)、FFI朊病毒、絲蟲總科超家族( Filarioidea superfamily)、黃病毒( Flaviviruses)、土拉文氏桿菌( Francisella tularensis)、梭桿菌屬( Fusobacterium genus)、白地絲黴菌( Geotrichum candidum)、腸鞭毛蟲( Giardia intestinalis)、頷口蟲屬( Gnathostoma spp)、GSS朊病毒、瓜納瑞托病毒( Guanarito virus)、杜克雷嗜血桿菌( Haemophilus ducreyi)、流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)、幽門螺旋桿菌( Helicobacter pylori)、亨尼帕病毒( Henipavirus/Hendra virus Nipah virus)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、單純疱疹病毒1及2 (HSV-1及HSV-2)、莢膜組織胞漿菌( Histoplasma capsulatum)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、威尼克外瓶黴( Hortaea werneckii)、人類博卡病毒( Human bocavirus，HBoV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)及人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類間質肺炎病毒(hMPV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、人類副流行性感冒病毒(HPIV)、日本腦炎病毒、JC病毒、胡寧病毒( Junin virus)、金氏金氏菌( Kingella kingae)、肉芽腫克雷伯氏菌( Klebsiella granulomatis)、庫魯病朊病毒( Kuru prion)、賴薩病毒( Lassa virus)、嗜肺性退伍軍人桿菌( Legionella pneumophila)、利什曼原蟲屬( Leishmania genus)、鉤端螺旋體屬( Leptospira genus)、產單核細胞李斯特氏菌( Listeria monocytogenes)、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒( Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)、馬丘波病毒( Machupo virus)、馬拉色菌屬( Malassezia spp)、馬堡病毒( Marburg virus)、麻疹病毒、橫川後殖吸蟲( Metagonimus yokagawai)、微孢子蟲門( Microsporidia phylum)、傳染性軟疣病毒( Molluscum contagiosum virus，MCV)、腮腺炎病毒、麻風分支桿菌( Mycobacterium leprae)及彌漫型痲瘋分枝桿菌( Mycobacterium lepromatosis)、結核分支桿菌( Mycobacterium tuberculosis)、潰瘍分枝桿菌( Mycobacterium ulcerans)、肺炎黴漿菌( Mycoplasma pneumoniae)、變形纖毛蟲( Naegleria fowled)、美洲鉤蟲( Necator americanus)、淋病奈瑟氏菌( Neisseria gonorrhoeae)、奈瑟氏腦膜炎菌( Neisseria meningitidis)、星形土壤絲菌( Nocardia asteroides)、諾卡菌屬( Nocardia spp)、人蟠尾絲蟲( Onchocerca volvulus)、恙蟲病東方體( Orientia tsutsugamushi)、正黏液病毒科家族(流感)、巴西副球孢子菌( Paracoccidioides brasiliensis)、並殖吸蟲屬( Paragonimus spp)、衛氏並殖吸蟲( Paragonimus westermani)、細小病毒( Parvovirus) B1 9、巴氏桿菌屬( Pasteurella genus)、瘧原蟲屬( Plasmodium genus)、傑氏肺囊蟲( Pneumocystis jirovecii)、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、鼻病毒( Rhinovirus)、鼻病毒( rhinoviruses)、痘立克次體( Rickettsia akari)、立克次體屬( Rickettsia genus)、普氏立克次體( Rickettsia prowazekii)、落磯山熱立克次體( Rickettsia rickettsii)、傷寒立克次體( Rickettsia typhi)、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒( Rift Valley fever virus)、輪狀病毒( Rotavirus)、風疹病毒、薩比亞病毒( Sabia virus)、沙門氏菌屬( Salmonella genus)、疥蟎( Sarcoptes scabiei)、SARS冠狀病毒、住血吸蟲屬( Schistosoma genus)、志賀氏桿菌屬( Shigella genus)、辛諾柏病毒( Sin Nombre virus)、漢坦病毒( Hantavirus)、申克孢子絲菌( Sporothrix schenckii)、葡萄球菌屬( Staphylococcus genus)、葡萄球菌屬( Staphylococcus genus)、無乳鏈球菌( Streptococcus agalactiae)、肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumoniae)、化膿性鏈球菌( Streptococcus pyogenes)、腸類圓線蟲( Strongyloides stercoralis)、條蟲屬( Taenia genus)、有鉤條蟲( Taenia solium)、蜱傳腦炎病毒( Tick-borne encephalitis virus，TBEV)、犬蛔蟲( Toxocara canis)或貓蛔蟲( Toxocara cati)、弓蟲( Toxoplasma gondii)、梅毒螺旋體( Treponema pallidum)、旋毛蟲( Trichinella spiralis)、陰道毛滴蟲( Trichomonas vaginalis)、發癬菌屬( Trichophyton spp)、毛首鞭形線蟲( Trichuris trichiura)、布氏錐蟲( Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲( Trypanosoma cruzi)、解脲支原體( Ureaplasma urealyticum)、水痘帶狀皰狀病毒( Varicella zoster virus，VZV)、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、大天花( Variola major)或小天花( Variola minor)、vCJD朊病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒( Venezuelan equine encephalitis virus)、霍亂弧菌( Vibrio cholerae)、西尼羅河病毒( West Nile virus)、西部馬腦炎病毒( Western equine encephalitis virus)、潘氏絲狀蟲( Wuchereria bancrofti)、黃熱病病毒( Yellow fever virus)、小腸結腸炎耶爾森氏菌( Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶爾森菌( Yersinia pestis)、假結核耶爾森菌( Yersinia pseudotuberculosis)或前述任何兩者或更多者之組合。

在一些態樣中，該組合物包含a)至少一種具有編碼流感血球凝集素1 (HA1)或其免疫原片段之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其；b)至少一種具有編碼血球凝集素2 (HA2)或其免疫原片段之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸；c)至少一種具有編碼至少一種抗原性多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其中抗原為神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)或其免疫原片段；及d)至少一種具有編碼至少一種抗原性多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其中抗原為神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)或其免疫原片段。

在一些態樣中，組合物進一步包含陽離子脂質。在一些態樣中，組合物包含a)涵蓋至少一種具有編碼流感血球凝集素1 (HA1)或其免疫原片段之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸的脂質奈米粒子；b)涵蓋至少一種具有編碼血球凝集素2 (HA2)或其免疫原片段之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸的脂質奈米粒子；c)涵蓋至少一種具有編碼至少一種抗原性多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸的脂質奈米粒子，其中抗原為神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)或其免疫原片段；及d)涵蓋至少一種具有編碼至少一種抗原性多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸的脂質奈米粒子，其中抗原為神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)或其免疫原片段。

在一些態樣中，RNA進一步包含經修飾之核苷酸。在一些態樣中，RNA包含經修飾之核苷酸，該核苷酸包含N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸酯(m1ΨTP)。在一些態樣中，RNA包含編碼抗原之可轉譯區且包含經修飾之核苷，該核苷包含1-甲基-假尿苷。

在一些態樣中，RNA進一步包含5'帽類似物。在一些態樣中，RNA進一步包含5'帽類似物，且5'帽類似物包含m ₂ ^7,3' ^-OGppp(m ₁2' ^-O)ApG。在一些態樣中，RNA聚核苷酸包含5'帽、5' UTR、3' UTR、組蛋白莖環及poly-A尾。在一些態樣中，5' UTR包含序列AATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC (5' UTR1)。在一些態樣中，5' UTR包含序列：AGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC (5' UTR1)。在一些態樣中，3' UTR包含序列CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCCUGGAGCUAGC (3' UTR2)。

在一些態樣中，3' UTR包含序列CΨCGAGCΨGGΨACΨGCAΨGCACGCAAΨGCΨAGCΨGCCCCΨΨΨCCCGΨCCΨGGGΨACCCCGAGΨCΨCCCCCGACCΨCGGGΨCCCAGGΨAΨGCΨCCCACCΨCCACCΨGCCCCACΨCACCACCΨCΨGCΨAGΨΨCCAGACACCΨCCCAAGCACGCAGCAAΨGCAGCΨCAAAACGCΨΨAGCCΨAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGΨGAΨΨAACCΨΨΨAGCAAΨAAACGAAAGΨΨΨAACΨAAGCΨAΨACΨAACCCCAGGGΨΨGGΨCAAΨΨΨCGΨGCCAGCCACACCCΨGGAGCΨAGC (3' ΨTR2)。

在一些態樣中，本文亦揭示一種在細胞中產生相關多肽之方法，該方法包含投與本文所述之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比產生增加量的該多肽。

在一些態樣中，本文亦揭示一種在細胞中產生相關多肽之方法，其包含投與如技術方案91至151中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含該第一脂質奈米粒子而不包含有效量之低溫保護劑之組合物相比產生增加量的該多肽。

在該等方法之一些態樣中，向哺乳動物投與組合物。在該方法之一些態樣中，向人類投與組合物。在該方法之一些態樣中，向處於感染流感之風險下的哺乳動物投與組合物。

在一些態樣中，本文亦揭示一種增加包含第一脂質奈米粒子及第二脂質奈米粒子之組合物之穩定性的方法，該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇、iv)聚合物結合脂質及v)囊封於第一脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，該第二脂質奈米粒子不具有囊封於第二脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，且該方法包含純化該組合物以在冷凍及/或冷凍乾燥之前自該組合物移除複數種第二脂質奈米粒子之第一部分，其中該複數種第二脂質奈米粒子之第二部分保留在該組合物中。

在一些態樣中，本文亦揭示一種增加包含第一脂質奈米粒子之組合物之穩定性的方法，該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇、iv)聚合物結合脂質及v)囊封於第一脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，該方法包含使該組合物與第二脂質奈米粒子接觸，其中該第二脂質奈米粒子不囊封核糖核酸(RNA)聚核苷酸。

在一些態樣中，本文亦揭示一種增加包含第一脂質奈米粒子之組合物之穩定性的方法，該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇、iv)聚合物結合脂質及v)囊封於第一脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，該方法包含使該組合物與有效量之低溫保護劑接觸，其中該低溫保護劑包含醣，且其中該有效量之低溫保護劑為至少約2% w/v至30% w/v之組合物。在該方法之一些態樣中，組合物進一步包含第二脂質奈米粒子，且其中第二脂質奈米粒子不囊封RNA聚核苷酸。

在該等方法之一些態樣中，第二脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質。在該等方法之一些態樣中，第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質與第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質相同。在該等方法之一些態樣中，第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質中之一或多者不同於第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質。在該等方法之一些態樣中，第二脂質奈米粒子包含脂質體。在該方法之一些態樣中，脂質體包含i)磷脂及/或中性脂質；ii)類固醇及/或iii)聚合物結合脂質。在該方法之一些態樣中，脂質體進一步包含陽離子脂質。

在該等方法之一些態樣中，低溫保護劑包含雙醣。在該等方法之一些態樣中，低溫保護劑包含蔗糖。在該等方法之一些態樣中，低溫保護劑之有效量為至少約2% w/v至30% w/v蔗糖，例如至少、至多、其中任何兩者之間或恰好2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30% w/v之組合物。在該等方法之一些態樣中，低溫保護劑之有效量為至少約15% w/v至25% w/v之組合物。在該等方法之一些態樣中，低溫保護劑之有效量為至少約10% w/v至25% w/v之組合物。在該等方法之一些態樣中，低溫保護劑之有效量為至少約10.3% w/v至20.5% w/v之組合物。在該等方法之一些態樣中，在冷凍及/或冷凍乾燥之前組合物中低溫保護劑之濃度為5至600 mg/mL。

在該等方法之一些態樣中，穩定性增加包含冷凍時及/或在冷凍乾燥時組合物之儲存穩定性。在該等方法之一些態樣中，穩定性增加包含在冷凍之後解凍時及/或在冷凍乾燥之後復原時組合物之穩定性。在該等方法之一些態樣中，穩定性增加包含當組合物已凍融至少1次時組合物之穩定性。在該等方法之一些態樣中，穩定性增加包含當組合物已凍融至少2次時組合物之穩定性。在該等方法之一些態樣中，穩定性增加包含當組合物已凍融至少3次時組合物之穩定性。在該等方法之一些態樣中，穩定性增加包含當組合物已凍融至少4次時組合物之穩定性。在該等方法之一些態樣中，穩定性增加包含當組合物已凍融至少5次時組合物之穩定性。

在該等方法之一些態樣中，使組合物與第二脂質奈米粒子接觸形成本文揭示之免疫原組合物。在該等方法之一些態樣中，在冷凍乾燥及/或冷凍乾燥之前純化組合物以自組合物移除複數種第二脂質奈米粒子之第一部分，形成本文所揭示之免疫原組合物。在該等方法之一些態樣中，使組合物與有效量之低溫保護劑接觸形成本文所揭示之免疫原組合物。

本發明之其他目的、特徵及優點將根據以下圖式、實施方式及實例而變得顯而易見。然而，應理解，該等圖式、實施方式及實例儘管指示本發明之特定態樣，但僅以說明之方式給出且不意欲為限制性的。本文中所描述之態樣應理解為適用於本發明之其他態樣的本發明之態樣。關於本發明之一個態樣論述之任何態樣適用於本發明之其他態樣，且反之亦然。另外，經考慮，根據此實施方式在本發明之精神及範疇內之變化及改良將變得對於熟習此項技術者顯而易見。在其他態樣中，來自特定態樣之特徵可與來自其他態樣之特徵組合及/或關於本發明之任何方法或組合物實施，且反之亦然。舉例而言，來自一個態樣之特徵可與來自任何其他態樣之特徵組合。在其他態樣中，可將其他特徵添加至本文中所描述之特定態樣。此外，本發明之組合物及系統可用於實現本發明之方法。

發明人出人意料地構想之組合物及其方法係關於在低溫保護劑，較佳碳水化合物低溫保護劑存在下，及/或進一步在不含核酸，例如不囊封RNA及不與RNA締合之脂質奈米粒子(在本文中亦稱為「空白」LNP)或脂質體或較高濃度低溫保護劑的存在下的囊封RNA或與RNA相關之冷凍或凍乾脂質奈米粒子，產生包含囊封RNA或與RNA締合之LNP的組合物，該組合物之特徵尤其在於，當在相同條件下評定時，與在不存在空白LNP或脂質體或較高濃度低溫保護劑的情況下包含囊封RNA或與RNA締合之脂質奈米粒子的組合物相比，在完成各別冷凍或凍乾過程後，RNA完整性經改良，且其特徵進一步在於，諸如就長期儲存及/或在非冷卻條件下之儲存而言，儲存穩定性增加。換言之，在一些態樣中，組合物包括囊封RNA或與RNA締合之第一脂質奈米粒子、不含核酸之第二脂質奈米粒子及低溫保護劑的混合物，在冷凍或凍乾過程之後產生特徵改良之經囊封RNA，較佳用作醫藥組合物，諸如免疫原組合物或疫苗。在一些態樣中，組合物包括囊封RNA或與RNA締合之第一脂質奈米粒子與濃度增加之低溫保護劑的混合物，在冷凍或凍乾過程之後產生特徵改良之經囊封RNA，較佳用作醫藥組合物，諸如免疫原組合物或疫苗。在一些態樣中，組合物包括囊封RNA或與RNA締合之第一脂質奈米粒子與不含核酸之第二脂質奈米粒子之混合物，在冷凍或凍乾過程之後產生特徵改良之經囊封RNA，較佳用作醫藥組合物，諸如免疫原組合物或疫苗。在一些態樣中，組合物包括囊封RNA或與RNA締合之第一脂質奈米粒子及脂質體之混合物，在冷凍或凍乾過程之後產生特徵改良之經囊封RNA，較佳用作醫藥組合物，諸如免疫原組合物或疫苗。在一些態樣中，組合物包括囊封RNA或與RNA締合之第一脂質奈米粒子、脂質體及濃度增加之低溫保護劑的混合物，在冷凍或凍乾過程之後產生特徵改良之經囊封RNA，較佳用作醫藥組合物，諸如免疫原組合物或疫苗。

有利地，本文所述之組合物及其方法適用於工業規模。本文所描述之方法可用於以可複製及有成本效益的方式產生例如具有上述特性之包含LNP之冷凍或凍乾組合物，該LNP囊封RNA或與RNA締合。包含囊封RNA或與RNA締合之LNP的組合物可宜於，例如作為無需冷鏈之疫苗，儲存、運輸及應用，而組合物中RNA之完整性及生物活性出乎意料地保持較高。

冷凍組合物係指已進行冷凍處理之組合物，使得組合物之溫度例如至少低於0℃且大於約-80℃，至少低於0℃且大於約-90℃，或至少低於0℃且大於約-40℃，或小於約-30℃之溫度，例如約-40℃至約-30℃，或約-40℃至約-15℃，或約-40℃至約-20℃，由此形成冷凍組合物。凍乾或冷凍乾燥係在醫藥行業中廣泛用於保存生物及醫藥材料之方法。在凍乾中，材料中所存在之水在冷凍步驟期間轉化為冰，且隨後藉由在初次乾燥步驟期間在低壓條件下直接昇華自材料移除。然而，在冷凍期間，並非所有水均轉化為冰。一部分水截留於含有例如調配物組分及/或活性成分之固體之基質中。可在二次乾燥步驟期間將基質內之過量結合水減少至所需殘餘水分水平。所有凍乾步驟，冷凍、初次乾燥及二次乾燥決定最終產物特性。

本發明之態樣提供RNA (例如mRNA)疫苗，其包括編碼流感病毒抗原之聚核苷酸。如本文所提供之流感病毒RNA疫苗可用於誘導平衡的免疫反應，包含細胞及體液免疫，而無許多與DNA疫苗接種相關之風險。

在一些態樣中，病毒係A型流感或B型流感或其組合之病毒株。

在一些態樣中，抗原性多肽編碼血球凝集素蛋白質或其免疫原片段。在一些態樣中，血球凝集素蛋白質為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18或其免疫原片段。在一些態樣中，血球凝集素蛋白質不包含頭域。在一些態樣中，血球凝集素蛋白質包含頭域之一部分。在一些態樣中，血球凝集素蛋白質不包含細胞質域。在一些態樣中，血球凝集素蛋白質包含細胞質域之一部分。在一些態樣中，截斷之血球凝集素蛋白質包含跨膜域之一部分。

一些態樣提供流感疫苗，其包含調配於陽離子脂質奈米粒子內的一或多種具有編碼血球凝集素蛋白質之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些態樣中，血球凝集素蛋白質係選自H1、H7及H10。在一些態樣中，RNA聚核苷酸進一步編碼神經胺糖酸苷酶蛋白。在一些態樣中，血球凝集素蛋白質來源於A型流感病毒或B型流感病毒之病毒株或其組合。在一些態樣中，流感病毒係選自H1N1、H3N2、H7N9及H10N8。

一些態樣提供預防或治療流感病毒感染之方法，其包含向個體投與本文所述之免疫原組合物及/或疫苗中之任一者。在一些態樣中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應。在一些態樣中，抗原特異性免疫反應包含B細胞反應。在一些態樣中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應及B細胞反應。在一些態樣中，產生抗原特異性免疫反應之方法涉及單次投與免疫原組合物及/或疫苗。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗藉由皮內、肌肉內注射、皮下注射、鼻內接種或經口投與來向個體投與。

在一些態樣中，RNA (例如mRNA)聚核苷酸或其部分可編碼作為抗原的流感病毒株之一或多種多肽或其片段。

I.   定義之實例  在整個本申請案中，術語「約」根據其在細胞及分子生物學領域中之普通及一般含義用以指示數值包括用於測定值的量測或定量方法之誤差之固有變化或標凖偏差。舉例而言，在一些態樣中，術語「約」可涵蓋在量測值或定量值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小值內的一系列值。

當與術語「包含」結合使用時，詞語「一(a/an)」之使用可意謂「一個(種)」，但其亦與「一或多個(種)」、「至少一個(種)」及「一個(種)或多於一個(種)」之含義相符。

片語「及/或」意謂「及」或「或」。為了說明，A、B及/或C包括：單獨的A、單獨的B、單獨的C、A與B之組合、A與C之組合、B與C之組合或A、B及C的組合。換言之，「及/或」作為包含性的「或」。

片語「基本上全部」定義為「至少95%」；若群組之基本上全部成員具有某一特性，則該群組之至少95%成員具有該特性。在一些情況下，基本上所有意謂等於具有該特性之群組之成員的95%、96%、97%、98%、99%或100%中之任一者、至少為其中之任一者或介於其中任何兩者之間。

組合物及方法在使用時可「包含本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟」、「基本上由本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟組成」或「由本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟組成」。在整個本說明書中，除非上下文另外要求，否則詞語「包含(comprising)」(及包含之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及具有之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」)為包括性或開放性的，且應理解為暗示包括所陳述步驟或要素或者步驟或要素之群組，但不排除包括任何其他步驟或要素或者步驟或要素之群組。經考慮，本文在術語「包含」之上下文中描述的態樣亦可在術語「由...組成」或「基本上由...組成」的上下文中實施。「基本上由」所揭示之成分或步驟中之任一者「組成」的組合物及方法將申請專利範圍之範疇限制於不實質影響所主張發明之基本及新穎特徵的指定材料或步驟。詞語「由…組成(consisting of)」(及由…組成之任何形式，諸如「由…組成(consist of)」及「由…組成(consists of)」)意謂包括且限於接在片語「由…組成」後面的任何內容。因此，片語「由……組成」指示所列要素為所需或必選的，且不可存在其他要素。

在整個本說明書中對「一個態樣」、「一態樣」、「一特定態樣」、「一相關態樣」、「某一態樣」、「一額外態樣」或「另一態樣」或其組合之提及意謂結合該態樣描述之特定特徵、結構或特性包括在本發明之至少一個態樣中。因此，前述片語在整個本說明書中各處之出現未必皆指代同一態樣。此外，特定特徵、結構或特性可在一或多個態樣中以任何合適方式組合。

術語「抑制」或「減少」或「降低」或此等術語之任何變化形式包括實現所需結果之任何可量測降低或完全抑制。術語「促進」或「增加」或此等術語之任何變化形式包括實現所需蛋白質或分子之結果或產量的任何可量測增加。

如本文所用，術語「參考」、「標準」或「對照」描述相對於其進行比較的值。舉例而言，將藥劑、個體、群體、樣品或相關值與參考、標準或對照藥劑、個體、群體、樣品或相關值進行比較。參考物、標準物或對照物可實質上同時進行測試及/或測定及/或與藥劑、個體、群體、樣品或相關值之相關測試或測定一起，及/或可在與評定下之藥劑、個體、群體、樣品或相關值相當之條件或情況下測定或表徵。

如本文所用，術語「RNA」意謂包括核糖核苷酸殘基(諸如含有核苷酸鹼基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)及/或尿嘧啶(U))之核酸分子。舉例而言，RNA可含有所有或大部分核糖核苷酸殘基。如本文所用，術語「核糖核苷酸」意謂在β-D-呋喃核糖基之2'位置處具有羥基的核苷酸。在一個態樣中，RNA可為與編碼肽或蛋白質之RNA轉錄物相關的信使RNA (mRNA)。如熟習此項技術者已知，mRNA一般含有5'非轉譯區(5'-UTR)、多肽編碼區及3'非轉譯區(3'-UTR)。不受任何限制，RNA可涵蓋雙股RNA、反義RNA、單股RNA、分離RNA、合成RNA、以重組方式產生之RNA及經修飾之RNA (modRNA)。

如本文中所涵蓋，不受任何限制，RNA可用作治療及/或預防哺乳動物(包括人類)之多種病況的治療模式。本文所描述之方法包含向哺乳動物(諸如人類)投與本文所描述之RNA。舉例而言，在一個態樣中，RNA之此類使用方法包括抗原編碼RNA疫苗以誘導穩定中和抗體及伴隨/相伴的T細胞反應，從而以較佳最小疫苗劑量實現保護性免疫接種。所投與RNA較佳為活體外轉錄RNA。

舉例而言，此類RNA可用於編碼至少一種意欲在該哺乳動物中產生免疫反應之抗原。抗原可為來自癌症、病原體、突變蛋白、錯誤摺疊蛋白、朊病毒之肽或蛋白質。病原性抗原可為衍生自與感染性疾病相關之病原體的肽或蛋白質抗原，該等抗原較佳選自衍生自以下之抗原：病原體鮑氏不動桿菌、邊蟲屬、嗜吞噬細胞無形體、巴西鉤蟲、十二指腸鉤蟲、溶血隱秘桿菌、蛔蟲、麴菌屬、星狀病毒科、巴貝蟲屬、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、韓瑟勒巴通氏菌、BK病毒、人芽囊原蟲、皮炎芽生菌、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋體、疏螺旋體屬、疏螺旋體屬、布魯桿菌屬、馬來絲蟲、布尼亞病毒科、洋蔥伯克氏菌及其他伯克氏菌種、鼻疽伯克氏菌、類鼻疽伯克氏菌、杯狀病毒科、彎曲桿菌屬、白色念珠菌、念珠菌屬、沙眼披衣菌、肺炎嗜衣原體、鸚鵡披衣菌、CJD朊病毒、華支睾吸蟲、肉毒桿菌、艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、產氣莢膜梭菌、梭菌屬、破傷風梭菌、球孢子菌屬、冠狀病毒、白喉棒狀桿菌、貝氏考克斯菌、克里米亞-岡果出血熱病毒、新型隱球菌、隱孢子蟲屬、巨細胞病毒(CMV)、登革病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4)、脆雙核阿米巴、伊波拉病毒(EBOV)、胞蟲屬、查菲艾利希體、尤溫艾利希體、艾利希體屬、溶組織內阿米巴、腸球菌屬、腸病毒屬、腸病毒、主要科沙奇A病毒及腸病毒71 (EV71)、表皮癬菌屬、埃-巴二氏病毒(EBV)、大腸桿菌01 57:H7、01 1 1及O104:H4、肝片吸蟲及巨大肝蛭、FFI朊病毒、絲蟲總科超家族、黃病毒、土拉文氏桿菌、梭桿菌屬、白地絲黴菌、腸鞭毛蟲、頷口蟲屬、GSS朊病毒、瓜納瑞托病毒、杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、幽門螺旋桿菌、亨尼帕病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、單純疱疹病毒1及2 (HSV-1及HSV-2)、莢膜組織胞漿菌、人類免疫缺乏病毒(HIV)、威尼克外瓶黴、人類博卡病毒(HBoV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)及人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類間質肺炎病毒(hMPV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、人類副流行性感冒病毒(HPIV)、日本腦炎病毒、JC病毒、胡甯病毒、金氏金氏菌、肉芽腫克雷伯氏菌、庫魯病朊病毒、賴薩病毒、嗜肺性退伍軍人桿菌、利什曼原蟲屬、鉤端螺旋體屬、產單核細胞李斯特氏菌、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、馬丘波病毒、馬拉色菌屬、馬堡病毒、麻疹病毒、橫川後殖吸蟲、微孢子蟲門、傳染性軟疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻風分支桿菌及彌漫型痲瘋分枝桿菌、結核分支桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎黴漿菌、變形纖毛蟲、美洲鉤蟲、淋病奈瑟氏菌、奈瑟氏腦膜炎菌、星形土壤絲菌、諾卡菌屬、人蟠尾絲蟲、恙蟲病東方體、正黏液病毒科家族(流感)、巴西副球孢子菌、並殖吸蟲屬、衛氏並殖吸蟲、細小病毒B1 9、巴氏桿菌屬、瘧原蟲屬、傑氏肺囊蟲、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、鼻病毒、鼻病毒、痘立克次體、立克次體屬、普氏立克次體、落磯山熱立克次體、傷寒立克次體、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒、輪狀病毒、風疹病毒、薩比亞病毒、沙門氏菌屬、疥蟎、SARS冠狀病毒、住血吸蟲屬、志賀氏桿菌屬、辛諾柏病毒、漢坦病毒、申克孢子絲菌、葡萄球菌屬、葡萄球菌屬、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、腸類圓線蟲、條蟲屬、有鉤條蟲、蜱傳腦炎病毒(TBEV)、犬蛔蟲或貓蛔蟲、弓蟲、梅毒螺旋體、旋毛蟲、陰道毛滴蟲、發癬菌屬、毛首鞭形線蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、解脲支原體、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、大天花或小天花、vCJD朊病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、霍亂弧菌、西尼羅河病毒、西部馬腦炎病毒、潘氏絲狀蟲、黃熱病病毒、小腸結腸炎耶爾森氏菌、鼠疫耶爾森菌及假結核耶爾森菌。

可用此類RNA治療劑治療之病況及/或疾病包括但不限於癌症、過度產生蛋白質、產生突變蛋白、蛋白質錯誤摺疊及/或由病原體(諸如病毒感染)引起及/或影響之病況及/或疾病。本發明RNA治療劑可用於治療的癌症之代表性但非限制性清單包括但不限於淋巴瘤；B細胞淋巴瘤；T細胞淋巴瘤；蕈樣黴菌病；霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)；骨髓白血病；膀胱癌；腦癌；神經系統癌；頭頸癌；頭頸部鱗狀細胞癌；腎癌；肺癌，諸如小細胞肺癌及非小細胞肺癌；神經母細胞瘤/神經膠母細胞瘤；卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；皮膚癌；肝癌；黑色素瘤；口腔、咽喉、喉頭及肺鱗狀細胞癌；子宮內膜癌；宮頸癌；子宮頸癌；乳癌；上皮癌；腎癌；泌尿生殖道癌；肺癌；食道癌；頭頸癌；大腸癌；造血癌；睪丸癌；大腸直腸癌；前列腺癌及胰臟癌。本發明RNA治療劑可用於治療的病毒之代表性但非限制性清單包括但不限於沙狀病毒(諸如賴薩病毒或淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV))；星狀病毒；崩芽病毒(諸如漢坦病毒)；杯狀病毒；冠狀病毒(諸如嚴重急性呼吸道症候群病毒(SARS)-例如SARS-CoV-1)或中東呼吸症候群(MERS)病毒)；絲狀病毒(諸如伊波拉病毒或馬堡病毒)；黃病毒(諸如黃熱病病毒、西尼羅河病毒或C型肝炎病毒(HCV))；嗜肝DNA病毒；肝炎病毒；正黏液病毒(諸如A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒)；副黏液病毒(諸如紅疹病毒或腮腺炎病毒)；小RNA病毒(諸如脊髓灰白質炎病毒、A型肝炎病毒或鼻病毒)；里奧病毒(諸如輪狀病毒)；反轉錄病毒(諸如人類免疫缺乏病毒(HIV)或人類嗜T淋巴球病毒(HTLV))；棒狀病毒(諸如狂犬病病毒(Rabies virus/Rabies lyssavirus))；披衣病毒(諸如辛得比斯病毒(Sindbis virus，SINV)、東部馬腦炎病毒(EEEV)、西部馬腦炎病毒(WEEV)或風疹病毒)。

「經分離RNA」定義為一種RNA分子，其可為重組的或已自總基因體核酸分離。

「經修飾RNA」或「modRNA」係指與天然存在之RNA相比具有一或多個核苷酸之至少一個添加、缺失、取代及/或改變的RNA分子，例如mRNA分子。此類改變可指將非核苷酸材料添加至內部RNA核苷酸，或添加至RNA之5'及/或3'端。在一個態樣中，此類modRNA含有至少一個經修飾之核苷酸，諸如對核苷酸之鹼基之改變。舉例而言，經修飾之核苷酸可置換一或多個尿苷及/或胞苷核苷酸。舉例而言，此等置換可針對RNA序列中之尿苷及/或胞苷的每個實例進行，或可僅針對所選擇尿苷及/或胞苷核苷酸進行。RNA中標準核苷酸之此類改變可包括非標準核苷酸，諸如化學合成之核苷酸或去氧核苷酸。舉例而言，RNA序列中至少一個尿苷核苷酸可經1-甲基假尿苷置換。其他此類經改變之核苷酸為熟習此項技術者已知的。此類經改變之RNA被視為天然存在之RNA之類似物。在一些態樣中，RNA藉由使用DNA模板進行活體外轉錄而產生，其中DNA係指含有去氧核糖核苷酸之核酸。在一些態樣中，RNA可為複製子RNA (複製子)，尤其自複製RNA或自擴增RNA (saRNA)。

如本文所用，術語「DNA」意謂包括去氧核糖核苷酸殘基(諸如含有核苷酸鹼基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)及/或胸腺嘧啶(T))的核酸分子。舉例而言，DNA可含有所有或大部分去氧核糖核苷酸殘基。如本文所用，術語「去氧核糖核苷酸」意謂在β-D-呋喃核糖基之2'位置處缺乏羥基的核苷酸。不受任何限制，DNA可涵蓋雙股DNA、反義DNA、單股DNA、分離DNA、合成DNA、以重組方式產生之DNA及經修飾之DNA。

如本文所用，「蛋白質」、「多肽」或「肽」係指包含至少兩個胺基酸殘基之分子。如本文所用，術語「野生型」係指在生物體中天然存在之分子之內源性版本。在一些態樣中，採用蛋白質或多肽之野生型型式，然而在本發明之許多態樣中，採用經修飾之蛋白質或多肽以產生免疫反應。上文所描述之術語可互換使用。「經修飾之蛋白質」或「經修飾之多肽」或「變異體」係指其化學結構，尤其其胺基酸序列相對於野生型蛋白質或多肽改變之蛋白質或多肽。在一些態樣中，經修飾之蛋白質/變異蛋白或多肽具有至少一種經修飾之活性或功能(認識到蛋白質或多肽可具有多種活性或功能)。經特別考慮，經修飾之蛋白質/變異蛋白或多肽可相對於一種活性或功能改變，但在其他方面中保留野生型活性或功能，諸如免疫原性。當在本文中特定提及蛋白質時，其一般指天然(野生型)或重組(經修飾)蛋白質。蛋白質可自天然的生物體直接分離，藉由重組DNA/外源性表現方法產生或藉由固相肽合成(SPPS)或其他活體外方法產生。在特定態樣中，存在經分離之核酸區段及重組載體，其併有編碼多肽(例如抗原或其片段)之核酸序列。術語「重組」可與多肽或特異性多肽之名稱結合使用，且此一般係指由已經活體外操作或為此類分子之複製產物之核酸分子產生的多肽。

II.  mRNA分子  本發明大體上係關於mRNA免疫原組合物及/或疫苗。先前技術中可獲得許多mRNA疫苗平台。活體外轉錄(IVT) mRNA之基本結構大體上極類似於「成熟」真核mRNA，且係由以下組成：(i)編碼蛋白質之開放閱讀框架(ORF)，其側接(ii) 5'及3'非轉譯區(UTR)，及在末端處(iii) 7-甲基鳥苷5'帽結構及(iv) 3' poly(A)尾。mRNA分子可包括一個(單順反子)、兩個(雙順反子)或更多個(多順反子)開放閱讀框架(ORF)，其可為可轉譯成相關多肽或蛋白質之密碼子序列。mRNA分子可編碼一種相關多肽或更多種，諸如抗原或多於一種抗原，例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種多肽。替代地或另外，一個mRNA分子亦可編碼多於一種相關多肽，諸如抗原，例如編碼不同或相同抗原的雙順反子或三順反子mRNA分子。非編碼結構特徵在mRNA之藥理學方面起重要作用且可經個別最佳化以調節mRNA穩定性、轉譯效率及免疫原性。

藉由併入經修飾之核苷，可產生免疫刺激活性降低的稱為「經核苷修飾之mRNA」或「modRNA」之mRNA轉錄物，且因此可獲得改良之安全概況。另外，經修飾之核苷允許設計出具有在很大程度上增強之穩定性及轉譯能力的mRNA免疫原組合物及/或疫苗，因為該等核苷可避免藉由IFN型誘導且經程式化以降解及抑制侵入之mRNA的直接抗病毒路徑。舉例而言，IVT mRNA中用假尿苷置換尿苷降低2'-5'-寡腺苷酸合成酶之活性，該合成酶藉由核糖核酸酶L調控mRNA裂解。此外，量測蛋白激酶R (一種與mRNA轉譯過程之抑制相關的酶)之較低活性。

除併入經修飾之核苷酸以外，亦證實其他方法增加mRNA之轉譯能力及穩定性。一個實例為「序列工程改造之mRNA」之發展。此處，可藉由mRNA之ORF及UTR中之序列最佳化，例如藉由富集GC含量或藉由選擇天然長期存活之mRNA分子之UTR來在很大程度上增加mRNA表現。另一方法為「自擴增mRNA」構築體之設計。此等構築體主要衍生自α病毒，且含有經相關抗原置換之ORF以及編碼病毒複製酶之額外ORF。後者驅動mRNA之細胞內擴增，且因此可顯著增加抗原表現能力。此外，已在mRNA之末端結構處實施若干修飾。抗反向帽(anti-reverse cap，ARCA)修飾可確保在5'端處之正確帽取向，其產生可有效結合核糖體之mRNA之幾乎完全部分。其他帽修飾，諸如硫代磷酸酯帽類似物，可進一步改良針對真核轉譯起始因子4E之親和力，且增加針對RNA脫帽複合物之抗性。

相反地，藉由修飾其結構，可進一步改良mRNA觸發先天性免疫反應之效能，但損害轉譯能力。藉由用硫代磷酸酯主鏈使mRNA穩定或藉由用陽離子蛋白魚精蛋白使其沈澱，可減弱抗原表現，但可獲得更強的免疫刺激能力。

在一個態樣中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含編碼作為抗原之流感病毒株之一或多種多肽或其片段的mRNA分子。在一些態樣中，mRNA分子包含經核苷修飾之mRNA。在一些態樣中，mRNA分子不包含經核苷修飾之mRNA，例如不併有經修飾之核苷之自擴增RNA。在一些態樣中，mRNA分子為自擴增RNA分子。

適用於本發明之mRNA通常包括編碼相關多肽之鍵聯核苷之第一區(例如編碼區)、位於第一區之5'端的第一側接區(例如5'-UTR)、位於第一區之3'端的第二側接區(例如3'-UTR)、至少一個5'-帽區及3'-穩定區。在一些態樣中，本發明之mRNA進一步包括poly-A區或Kozak序列(例如在5'-UTR中)。在一些情況下，本發明之mRNA可含有一或多個能夠自該聚核苷酸切除之內含子核苷酸序列。在一些態樣中，本發明之mRNA可包括5'帽結構、鏈終止核苷酸、莖環、poly A序列及/或聚腺苷酸化信號。核酸之任一區域可包括一或多種替代性組分(例如替代性核苷)。舉例而言，3'-穩定區可含有替代性核苷，諸如L-核苷、反向胸苷或2'-O-甲基核苷；及/或編碼區、5'-UTR、3'-UTR或帽區可包括替代性核苷，諸如5-取代之尿苷(例如5-甲氧基尿苷)、1-取代之假尿苷(例如1-甲基假尿苷)及/或5-取代之胞苷(例如5-甲基-胞苷)。

在一些態樣中，mRNA分子包括等於約20至約100,000個核苷酸中之任一者、至少為其中之任一者、至多為其中之任一者或介於其中任何兩者之間(例如等於30至50、30至100、30至250、30至500、30至1,000、30至1,500、30至3,000、30至5,000、30至7,000、30至10,000、30至25,000、30至50,000、30至70,000、100至250、100至500、100至1,000、100至1,500、100至3,000、100至5,000、100至7,000、100至10,000、100至25,000、100至50,000、100至70,000、100至100,000、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至3,000、500至5,000、500至7,000、500至10,000、500至25,000、500至50,000、500至70,000、500至100,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至3,000、1,000至5,000、1,000至7,000、1,000至10,000、1,000至25,000、1,000至50,000、1,000至70,000、1,000至100,000、1,500至3,000、1,500至5,000、1,500至7,000、1,500至10,000、1,500至25,000、1,500至50,000、1,500至70,000、1,500至100,000、2,000至3,000、2,000至5,000、2,000至7,000、2,000至10,000、2,000至25,000、2,000至50,000、2,000至70,000及2,000至100,000個中之任一者、至少為其中之任一者、至多為其中之任一者或介於其中任何兩者之間)。在一些態樣中，mRNA分子包括至少100個核苷酸。舉例而言，在一些態樣中，mRNA之長度在100與15,000個核苷酸之間；在7,000與16,000個核苷酸之間；在8,000與15,000個核苷酸之間；在9,000與12,500個核苷酸之間；在11,000與15,000個核苷酸之間；在13,000與16,000個核苷酸之間；在7,000與25,000個核苷酸之間。在一些態樣中，mRNA長度為至少、至多、其中任何兩者之間或恰好30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000、51000、52000、53000、54000、55000、56000、57000、58000、59000、60000、61000、62000、63000、64000、65000、66000、67000、68000、69000、70000、71000、72000、73000、74000、75000、76000、77000、78000、79000、80000、81000、82000、83000、84000、85000、86000、87000、88000、89000、90000、91000、92000、93000、94000、95000、96000、97000、98000、99000或100000個核苷酸。在一些態樣中，可排除清單中核苷酸尺寸範圍中之一或多者。

在一些態樣中，LNP包括一或多個RNA，且可選擇一或多個RNA、脂質及其量以提供特定N:P比。組合物之N:P比係指一或多種脂質中之氮原子與RNA中之磷酸酯基之數目的莫耳比。一般而言，較低的N:P比為較佳的。可選擇一或多個RNA、脂質及其量以提供約2:1至約30:1之N:P比，諸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1。在某些態樣中，N:P比可為約2:1至約8:1。在其他態樣中，N:P比為約5:1至約8:1。舉例而言，N:P比可為約5.0:1、約5.5:1、約5.67:1、約6.0:1、約6.5:1或約7.0:1。舉例而言，N:P比可為約5.67:1。

本發明之mRNA可包括一或多種天然存在之組分，包括典型核苷酸A (腺苷)、G (鳥苷)、C (胞嘧啶)、U (尿苷)或T (胸苷)中之任一者。在一個態樣中，包含(a) 5'-UTR、(b)開放閱讀框架(ORF)、(c) 3'-UTR、(d)聚腺苷酸poly A尾及(a、b、c或d)之任何組合的所有或實質上所有核苷酸包含天然存在之典型核苷酸A (腺苷)、G (鳥苷)、C (胞嘧啶)、U (尿苷)或T (胸苷)。

在一些態樣中，RNA分子為類似物且可包括修飾，尤其增加核酸酶抗性、改良結合親和力及/或改良結合特異性之修飾。舉例而言，當核苷或核苷酸之糖部分由碳環部分置換時，其不再為糖。此外，當進行其他取代，諸如糖間磷酸二酯鍵之取代時，所得材料不再為真實物種。所有此類化合物被視為類似物。在整個本說明書中，提及核酸物種之糖部分應理解為指真糖或佔據野生型核酸之糖結構的物種。此外，提及糖間鍵應視為包括用於以野生型核酸之方式接合糖或糖類似物部分的部分。

經修飾之寡核苷酸及寡核苷酸類似物可展現相對於其天然存在之對應物增加的化學及/或酶穩定性。細胞外及細胞內核酸酶一般不識別且因此不結合至經主鏈修飾之化合物。當以質子化酸形式存在時，帶負電主鏈之缺乏可促進細胞滲透。

在一些情況下，經修飾之核苷間鍵意欲用四個原子鍵聯基團置換天然存在之磷酸二酯-5'-亞甲基鍵，以賦予所得化合物核酸酶耐受性及增強的細胞吸收。

本發明之mRNA可包括一或多種如本文所述之替代性組分，其賦予有用特性，包括增加之穩定性及/或缺乏實質性誘導引入聚核苷酸之細胞的先天性免疫反應。舉例而言，相對於不含有或不引入替代性組分之對應未改變之mRNA或mRNA或modRNA，mRNA或modRNA可在引入各別mRNA或modRNA的細胞中展現降低之降解。此等替代物種可增加蛋白質生產效率、聚核苷酸之細胞內保持力及/或接觸細胞之存活率，以及具有降低之免疫原性。在一些情況下，核酸實質上不誘導引入聚核苷酸(例如mRNA)之細胞的先天性免疫反應。經誘導之先天性免疫反應之特徵可包括1)增加促炎性細胞介素之表現，2)活化細胞內PRR(RIG-I、MDA5等)，及/或3)終止或減少蛋白質轉譯。

本發明之mRNA可包括一或多個經修飾(例如，經改變或替代之)核鹼基、核苷、核苷酸或其組合。適用於LNP中之mRNA可包括任何有用的修飾或改變，諸如對核鹼基、糖或核苷間鍵(例如，對連接磷酸酯/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈)的修飾或改變。在某些態樣中，改變(例如一或多種改變)存在於核鹼基、糖及核苷間鍵中之各者中。本發明之改變可為核糖核酸(RNA)之改變，例如呋喃核糖基環之2'-OH取代為2'-H、蘇糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或其雜交體。本文中描述額外改變。

本發明之mRNA可或可不沿分子之整個長度均勻地改變。舉例而言，一或多種類型或所有類型之核苷酸(例如嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中之任何一或多者或全部)可或可不在mRNA中或其給定預定序列區中均勻地改變。在一些情況下，mRNA中(或其給定序列區中)之所有核苷酸X經改變，其中X可為核苷酸A、G、U、C中之任一者，或組合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中之任一者。

不同糖改變及/或核苷間鍵(例如主鏈結構)可存在於聚核苷酸中之各種位置。一般熟習此項技術者應瞭解，核苷酸類似物或其他改變可位於聚核苷酸之任何位置，使得聚核苷酸之功能不實質上降低。改變亦可為5'-末端或3'-末端改變。在一些態樣中，聚核苷酸包括在3'-端處之改變。聚核苷酸可含有約1%至約100%替代性核苷酸(相對於總核苷酸含量抑或相對於一或多種類型之核苷酸，亦即A、G、U或C中之任一或多者)或任何中間百分比(例如1%至20%、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%及95%至100%) (例如至少、至多、其中任何兩者之間或恰好0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%替代性核苷酸)。應理解，任何剩餘百分比由典型核苷酸(例如A、G、U或C)之存在補足。

聚核苷酸可含有最小為零且最大100%替代性核苷酸，或任何中間百分比，諸如至少5%替代性核苷酸、至少10%替代性核苷酸、至少25%替代性核苷酸、至少50%替代性核苷酸、至少80%替代性核苷酸或至少90%替代性核苷酸。舉例而言，聚核苷酸可含有替代性嘧啶，諸如替代性尿嘧啶或胞嘧啶。在一些態樣中，聚核苷酸中至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少80%、至少90%或100% (例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)尿嘧啶經替代性尿嘧啶(例如5-取代之尿嘧啶)置換。替代性尿嘧啶可經具有單一獨特結構之化合物置換或可經具有不同結構(例如2、3、4種或更多種獨特結構)之複數種化合物置換。在一些情況下，聚核苷酸中至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少80%、至少90%或100% (例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之胞嘧啶經替代性胞嘧啶(例如5-取代之胞嘧啶)置換。替代性胞嘧啶可經具有單一獨特結構之化合物置換或可經具有不同結構(例如2、3、4種或更多種獨特結構)之複數種化合物置換。

在一些態樣中，mRNA包含一或多個替代性核苷或核苷酸。替代性核苷及核苷酸可包括替代性核鹼基。核酸之核鹼基為有機鹼基，諸如嘌呤或嘧啶或其衍生物。核鹼基可為典型鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)。此等核鹼基可經改變或完全置換以提供具有增強之特性，例如增加之穩定性，諸如對核酸酶之抗性的聚核苷酸分子。非典型或經修飾鹼基可包括例如一或多個取代或修飾，包括但不限於烷基、芳基、鹵基、側氧基、羥基、烷氧基及/或硫基取代；一或多個稠環或開環；氧化；及/或還原。

在一些態樣中，核鹼基為替代性尿嘧啶。具有替代性尿嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿嘧啶、6-氮雜-尿嘧啶、2-硫基-5-氮雜-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶(s2U)、4-硫基-尿嘧啶(s4U)、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基-尿嘧啶(ho5U)、5-胺基烯丙基-尿嘧啶、5-鹵基-尿嘧啶(例如5-碘-尿嘧啶或5-溴-尿嘧啶)、3-甲基-尿嘧啶(m U)、5-甲氧基-尿嘧啶(mo5U)、尿嘧啶5-氧基乙酸(cmo5U)、尿嘧啶5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿嘧啶(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羥基甲基-尿嘧啶(chm5U)、5-羧基羥基甲基-尿嘧啶甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫基-尿嘧啶(mcm5s2U)、5-胺基甲基-2-硫基-尿嘧啶(nmVu)、5-甲基胺基甲基-尿嘧啶(mnm5U)、5-甲基胺基甲基-2-硫基-尿嘧啶(mnmVu)、5-甲基胺基甲基-2-硒基-尿嘧啶(mnm5se2U)、5-胺甲醯基甲基-尿嘧啶(ncm5U)、5-羧基甲基胺基甲基-尿嘧啶(cmnm5U)、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫基-尿嘧啶(cmnmVu)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿嘧啶、5-牛磺酸甲基-尿嘧啶(xm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿嘧啶(xm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫基-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m5U，亦即具有核鹼基去氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(mV)、5-甲基-2-硫基-尿嘧啶(m5s2U)、l-甲基-4-硫基-假尿苷(m xj/)、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m \|/)、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿嘧啶(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿嘧啶、5-甲基-二氫尿嘧啶(m5D)、2-硫基-二氫尿嘧啶、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫基-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、Nl-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿嘧啶(acp U)、l-甲基-3-(3-胺基-3-羧基丙基)假尿苷(acp ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿嘧啶(inm5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫基-尿嘧啶(inm5s2U)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2-硫基-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mem Um)、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基胺基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m Um)及5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫基-尿嘧啶、去氧胸苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)-尿嘧啶、5-(胺甲醯基羥基甲基)-尿嘧啶、5-胺甲醯基甲基-2-硫基-尿嘧啶、5-羧基甲基-2-硫基-尿嘧啶、5-氰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫基-尿嘧啶及5-[3-(l-E-丙烯基胺基)]尿嘧啶。

在一些態樣中，核鹼基為替代性胞嘧啶。具有替代性胞嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括5-氮雜-胞嘧啶、6-氮雜-胞嘧啶、假異胞苷、3-甲基-胞嘧啶(m3C)、N4-乙醯基-胞嘧啶(ac4C)、5-甲醯基-胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-鹵基-胞嘧啶(例如5-碘-胞嘧啶)、5-羥基甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-假異胞苷、吡咯并胞嘧啶、吡咯并假異胞苷、2-硫基-胞嘧啶(s2C)、2-硫基-5-甲基-胞嘧啶、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基1-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基1-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、賴胞苷(lysidine) (k2C)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙醯基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲醯基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫基-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-(3-疊氮基丙基)-胞嘧啶及5-(2-疊氮基乙基)-胞嘧啶。

在一些態樣中，核鹼基為替代性腺嘌呤。具有替代性腺嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括2-胺基-嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基-6-鹵基-嘌呤(例如2-胺基-6-氯-嘌呤)、6-鹵基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-胺基-6-甲基-嘌呤、8-疊氮基-腺嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基-嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基1-腺嘌呤(ml A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)、2-甲基硫基-N6-甲基-腺嘌呤(ms2m6A)、N6-異戊烯基-腺嘌呤(i6A)、2-甲基硫基-N6-異戊烯基-腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(順-羥基異戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲基硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-甘胺醯基胺甲醯基(glycinylcarbamoyl)-腺嘌呤(g6A)、N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(t6A)、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲基硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羥基去纈胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲基硫基-N6-羥基去纈胺醯基胺甲醯基-腺嘌呤(ms2hn6A)、N6-乙醯基-腺嘌呤(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(mlAm)、2-胺基-N6-甲基-嘌呤、1-硫基-腺嘌呤、8-疊氮基-腺嘌呤、N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲醯基-腺嘌呤及N6-羥基甲基-腺嘌呤。

在一些態樣中，核鹼基為替代性鳥嘌呤。具有替代性鳥嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(mil)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、4-去甲基-懷俄苷(imG-14)、異懷俄苷(imG2)、懷俄丁苷(yW)、過氧基懷俄丁苷(o2yW)、羥基懷俄丁苷(OHyW)、欠修飾之羥基懷俄丁苷(OHyW*)、7-去氮-鳥嘌呤、Q核苷(Q)、環氧Q核苷(oQ)、半乳糖基-Q核苷(galQ)、甘露糖基-Q核苷(manQ)、7-氰基-7-去氮-鳥嘌呤(preQO)、7-胺基甲基-7-去氮-鳥嘌呤(preQl)、古嘌苷(G+)、7-去氮-8-氮雜-鳥嘌呤、6-硫基-鳥嘌呤、6-硫基-7-去氮-鳥嘌呤、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥嘌呤、7-甲基-鳥嘌呤(m7G)、6-硫基-7-甲基-鳥嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鳥嘌呤、1-甲基-鳥嘌呤(mlG)、N2-甲基-鳥嘌呤(m2G)、N2,N2-二甲基-鳥嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基-鳥嘌呤(m2,7G)、N2、N2,7-二甲基-鳥嘌呤(m2,2,7G)、8-側氧基-鳥嘌呤、7-甲基-8-側氧基-鳥嘌呤、1-甲基-6-硫基-鳥嘌呤、N2-甲基-6-硫基-鳥嘌呤、N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥嘌呤、N2-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2,2Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(mlGm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(mllm)、1-硫基-鳥嘌呤及O-6-甲基-鳥嘌呤。

核苷酸之替代性核鹼基可獨立地為嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶類似物。舉例而言，核鹼基可為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶或次黃嘌呤之替代物。在另一態樣中，核鹼基亦可包括例如鹼基之天然存在的衍生物及合成的衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基(例如，8-溴基)、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代的腺嘌呤及鳥嘌呤、5鹵基，尤其5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、脫氮鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、3-脫氮鳥嘌呤、脫氮腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、3-脫氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5三𠯤酮、9-脫氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡𠯤、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡𠯤-2-酮、1,2,4-三𠯤、嗒𠯤；或1,3,5三𠯤。當使用簡寫A、G、C、T或U描繪核苷酸時，各字母係指代表性鹼基及/或其衍生物，例如A包括腺嘌呤或腺嘌呤類似物，例如7-去氮腺嘌呤)。

5'非轉譯區(UTR)位於蛋白質編碼序列之5'端的DNA調控區，該蛋白編碼序列經轉錄成mRNA但不轉譯成蛋白質。5' UTR可含有各種可在轉譯起始控制方面起一定作用的調控元件，例如5'帽結構、莖環結構及內部核糖體進入位點(IRES)。位於蛋白質編碼序列下游之3' UTR可涉及調控過程，包括轉錄物裂解、穩定性及聚腺苷酸化、轉譯及mRNA定位。在一些態樣中，UTR來源於在mRNA表現所靶向之特定組織(例如淋巴組織)中天然豐富的mRNA。在一些態樣中，UTR增加蛋白質合成。不受機制或理論束縛，UTR可藉由增加mRNA在轉譯聚核糖體中之保持時間(信息穩定性)及/或核糖體基於信息起始轉譯之速率(信息轉譯效率)來增加蛋白質合成。相應地，UTR序列可以組織特異性方式延長蛋白質合成。在一些態樣中，5' UTR及3' UTR序列以計算方式衍生。在一些態樣中，5' UTR及3' UTR來源於組織中天然豐富的mRNA。組織可為例如肝臟、幹細胞或淋巴組織。淋巴組織可包括例如淋巴細胞(例如B淋巴細胞、輔助T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調控性T淋巴細胞或自然殺手細胞)、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、嗜中性白血球、嗜伊紅血球及網狀紅血球中之任一者。

mRNA可包括5'-帽結構。聚核苷酸之5'-帽結構涉及核輸出及增加聚核苷酸穩定性且結合mRNA帽結合蛋白(CBP)，該蛋白經由CBP與poly-A結合蛋白締合形成成熟環狀mRNA物種而負責聚核苷酸在細胞中的穩定性及轉譯能力。在mRNA剪接期間，帽進一步有助於移除5'-近端內含子。內源性聚核苷酸分子可為5'-末端加帽的，在聚核苷酸之末端鳥苷帽殘基與5'端轉錄之有義核苷酸之間產生5'-ppp-5'-三磷酸酯鍵。此5'-鳥苷酸帽可接著經甲基化以產生N7-甲基-鳥苷酸殘基。聚核苷酸之5'-端之末端及/或前末端轉錄的核苷酸之核糖亦可視情況經2'-O-甲基化。經由水解及裂解鳥苷酸帽結構進行之5'-脫帽可靶向聚核苷酸分子，諸如mRNA分子，以進行降解。對聚核苷酸之改變可產生不可水解的帽結構，從而防止脫帽且因此增加聚核苷酸半衰期。因為帽結構水解需要裂解5'-ppp-5'磷酸二酯鍵，所以可在加帽反應期間使用替代性核苷酸。舉例而言，可根據製造商說明書使用來自New England Biolabs (Ipswich, MA)之牛痘加帽酶以及a-硫基-鳥苷核苷酸，以在5'-ppp-5'帽中產生硫代磷酸酯鍵。

可使用額外替代性鳥苷核苷酸，諸如a-甲基-膦酸酯及硒基-磷酸酯核苷酸。額外改變包括但不限於5'-末端之核糖之2'-O-甲基化及/或糖之2'-羥基上的聚核苷酸(如上文所提及)的5'前末端核苷酸。多個不同的5'-帽結構可用於產生mRNA分子之5'-帽。

在本文中亦稱為合成帽類似物、化學帽、化學帽類似物或結構性或功能性帽類似物之帽類似物在其化學結構方面不同於天然(亦即，內源性、野生型或生理性) 5'-帽，同時保留帽功能。帽類似物可為化學(亦即，非酶促)合成或酶促合成的且/鍵聯至聚核苷酸。舉例而言，抗反向帽類似物(Anti-Reverse Cap Analog；ARCA)帽含有兩個由5'-5'-三磷酸酯基鍵聯之鳥苷，其中一個鳥苷含有N7-甲基以及3'-O-甲基(亦即，N7，'-O-二甲基-鳥苷-5'-三磷酸-5'-鳥苷、m ⁷G-3'mppp-G，其可等效地命名為3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一不變的鳥苷之3'-O原子鍵聯至加帽聚核苷酸(例如，mRNA)之5'-末端核苷酸。N7-及3'-O-甲基化鳥苷提供加帽聚核苷酸(例如，mRNA)之末端部分。另一例示性帽為mCAP，其類似於ARCA但在鳥苷上具有2'-O-甲基(亦即，N7,2'-O-二甲基-鳥苷-5'-三磷酸-5'-鳥苷、m7Gm-ppp-G)。

帽可為二核苷酸帽類似物。作為非限制性實例，二核苷酸帽類似物可在不同磷酸位置處經諸如美國專利第8,519,110號中所描述之二核苷酸帽類似物的硼烷磷酸酯基或磷酸硒酸酯基(phophoroselenoate group)修飾，其帽結構以引用的方式併入本文中。替代地，帽類似物可為此項技術中已知及/或本文中所描述之經N7-(4-氯苯氧基乙基)取代之二核苷酸帽類似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽類似物之非限制性實例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5 )ppp(5')G及N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5 )ppp(5')G帽類似物(參見例如，Kore等人Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21 :4570-4574中所描述之各種帽類似物及合成帽類似物的方法；其帽結構以引用之方式併入本文中)。在其他情況下，適用於本發明之聚核苷酸的帽類似物為4-氯/溴苯氧基乙基類似物。雖然帽類似物允許聚核苷酸在活體外轉錄反應中同時加帽，但至多20%之轉錄物保持未加帽。此點以及帽類似物與由內源性細胞轉錄機構產生之聚核苷酸的內源性5'-帽結構之結構差異可導致轉譯能力降低及細胞穩定性降低。

替代性聚核苷酸亦可使用酶在轉錄後加帽，以便產生更可靠的5'-帽結構。如本文所用，片語「更真實」係指在結構上或功能上密切反映或模擬內源性或野生型特徵的特徵。亦即，與先前技術之合成特徵或類似物相比，「更可靠的」特徵更佳地表示內源性、野生型、天然或生理學細胞功能及/或結構，或其在一或多個方面優於對應內源性、野生型、天然或生理學特徵。與此項技術中已知的合成的5'-帽結構(或與野生型、天然或生理學5'-帽結構)相比，適用於本發明之聚核苷酸中的更可靠的5'-帽結構之非限制性實例為尤其具有增強的帽結合蛋白結合、增加的半衰期、降低的對5'-核酸內切酶之易感性及/或減少的5'-脫帽之彼等結構。舉例而言，重組牛痘病毒加帽酶及重組2'-O-甲基轉移酶可在聚核苷酸之5'-末端核苷酸與鳥苷帽核苷酸之間產生典型的5'-5'-三磷酸酯鍵，其中帽鳥苷含有N7-甲基化且聚核苷酸之5'-末端核苷酸含有2'-O-甲基。此類結構被稱為帽1結構。與例如此項技術中已知的其他5'帽類似物結構相比，此帽產生更高的轉譯能力、細胞穩定性及降低的細胞促炎性細胞介素之活化。其他例示性帽結構包括7mG(5')ppp(5')N,pN2p (帽0)、7mG(5')ppp(5')NlmpNp (帽1)、7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (帽2)及m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up (帽4)。因為替代性聚核苷酸可在轉錄後加帽，且因為此過程更高效，所以幾乎100%之mRNA可經加帽。此與帽類似物在活體外轉錄反應過程中連接至聚核苷酸時的約80%形成對比。

5'端帽可包括內源性帽或帽類似物。5'端帽可包括鳥苷類似物。有用的鳥苷類似物包括肌苷、N1-甲基-鳥苷、2'-氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-氧代鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷及2-疊氮基-鳥苷。在一些情況下，聚核苷酸含有經修飾之5'-帽。5'-帽上之修飾可增加聚核苷酸之穩定性，增加聚核苷酸之半衰期，且可增加聚核苷酸轉譯效率。經修飾之5'-帽可包括但不限於以下修飾中之一或多者：加帽鳥苷三磷酸酯(GTP)之2'-位置及/或3'-位置處的修飾、糖環氧(產生碳環)經亞甲基部分(CH2)置換、帽結構之三磷酸酯橋部分處的修飾，或核鹼基(G)部分處的修飾。

5'-UTR可提供為mRNA之側接區。5'-UTR可與見於聚核苷酸中之編碼區同源或異源。多個5'-UTR可包括於側接區中且可為相同或不同序列。側接區之任何部分(包括無一者)可經密碼子最佳化且任何部分可在密碼子最佳化之前及/或之後獨立地含有一或多個不同結構或化學改變。為改變mRNA之一或多個特性，可工程改造與mRNA之編碼區異源的5'-UTR。接著可將mRNA投與細胞、組織或生物體，且可量測諸如蛋白質含量、定位及/或半衰期之結果以評估異源5'-UTR可對mRNA具有之有益作用。可利用5'-UTR之變異體，其中一或多個核苷酸被添加或移除至末端，包括A、T、C或G。5'-UTR亦可以密碼子最佳化或以本文所述的任何方式改變。

在一些態樣中，加帽區可包括單一帽或形成帽之一系列核苷酸。在此態樣中，加帽區之長度可等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個核苷酸中之任一者、至少任一者、至多任一者或任何兩者之間或至少2或10個或更少核苷酸。在一些態樣中，不存在帽。在一些態樣中，第一及第二操作區之長度可等於3至40，例如5-30、10-20、15、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個核苷酸中之任一者、至少任一者、至多任一者或任何兩者之間或至少4或30個或更少核苷酸，且可包含除開始及/或終止密碼子之外的一或多個信號及/或限制序列。

mRNA可包括莖環，諸如(但不限於)組蛋白莖環。莖環可為長度為約25或約26個核苷酸之核苷酸序列。組蛋白莖環可位於相對於編碼區之3' (例如在編碼區之3'-末端)。作為非限制性實例，莖環可位於本文所述之聚核苷酸之3'-端。在一些情況下，mRNA包括超過一個莖環(例如兩個莖環)。莖環可位於聚核苷酸之第二末端區中。作為非限制性實例，莖環可位於第二末端區中之非轉譯區(例如，3'-UTR)內。

在一些情況下，包括組蛋白莖環之mRNA可藉由添加3'-穩定區(例如包括至少一個鏈終止核苷之3'-穩定區)來穩定。不希望受理論束縛，添加至少一個鏈終止核苷可減緩聚核苷酸之降解且因此可增加聚核苷酸之半衰期。在其他情況下，包括組蛋白莖環之mRNA可藉由改變可阻止及/或抑制添加oligio(U)之聚核苷酸之3'-區來穩定。在其他情況下，包括組蛋白莖環之mRNA可藉由添加在3'-去氧核苷、2',3'-二去氧核苷3'-O-甲基核苷、3'-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷及此項技術中已知及/或本文所述之其他替代性核苷中終止的寡核苷酸來穩定。

在一些情況下，本發明之mRNA可包括組蛋白莖環、poly-A區及/或5'-帽結構。組蛋白莖環可在poly-A區之前及/或之後。包括組蛋白莖環及poly-A區序列之聚核苷酸可包括本文所述之鏈終止核苷。在其他情況下，本發明之聚核苷酸可包括組蛋白莖環及5'-帽結構。5'-帽結構可包括但不限於本文所述及/或此項技術中已知的彼等結構。在一些情況下，保守莖環區可包括本文中所描述之miR序列。作為非限制性實例，莖環區可包括本文中所描述之miR序列的種子序列。在另一非限制性實例中，莖環區可包括miR-122種子序列。mRNA可包括至少一種組蛋白莖環及poly-A區或聚腺苷酸化信號。在某些情況下，編碼組蛋白莖環及poly-A區或聚腺苷酸化信號之聚核苷酸可編碼病原體抗原或其片段。在其他情況下，編碼組蛋白莖環及poly-A區或聚腺苷酸化信號之聚核苷酸可編碼治療蛋白。在一些情況下，編碼組蛋白莖環及poly-A區或聚腺苷酸化信號之聚核苷酸可編碼腫瘤抗原或其片段。在其他情況下，編碼組蛋白莖環及poly-A區或聚腺苷酸化信號之聚核苷酸可編碼過敏抗原或自體免疫性自身抗原。

mRNA可包括poly-A序列及/或聚腺苷酸化信號。poly-A序列可完全或大部分由腺嘌呤核苷酸或其類似物或衍生物構成。poly-A序列可為鄰近於核酸之3'非轉譯區定位之尾。在RNA處理期間，將長鏈腺苷核苷酸(poly-A區)正常添加至信使RNA (mRNA)分子以增加分子之穩定性。緊接著在轉錄之後，轉錄物之3'-端裂解以釋放3'-羥基。接著，poly-A聚合酶將腺苷核苷酸鏈添加至RNA。稱為聚腺苷酸化之過程添加長度在100與250個殘基之間的poly-A區。獨特的poly-A區長度可提供本發明之替代性聚核苷酸之某些優勢。

一般而言，本發明之poly-A區之長度為至少30個核苷酸長。在另一態樣中，poly-A區為至少35個核苷酸長。在另一態樣中，長度為至少40個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少45個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少55個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少60個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少70個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少80個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少90個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少100個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少120個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少140個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少160個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少180個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少200個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少250個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少300個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少350個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少400個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少450個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少500個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少600個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少700個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少800個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少900個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1000個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1100個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1200個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1300個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1400個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1500個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1600個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1700個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1800個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少1900個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少2000個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少2500個核苷酸。在另一態樣中，長度為至少3000個核苷酸。

在一些情況下，在本文所述之替代性聚核苷酸分子上的poly-A區之長度可為80個核苷酸、120個核苷酸、160個核苷酸。在其他情況下，在本文所述之替代聚核苷酸分子上的poly-A區之長度可為20、40、80、100、120、140或160個核苷酸。

在一些態樣中，本發明之poly-A區之長度為至少、至多、其中任何兩者之間或恰好30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2810、2820、2830、2840、2850、2860、2870、2880、2890、2900、2910、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990或3000個核苷酸。

在一些情況下，poly-A區係相對於整個替代性聚核苷酸之長度設計。此設計可基於替代性聚核苷酸之編碼區的長度、替代性聚核苷酸(諸如mRNA)之特定特徵或區的長度，或基於由替代性聚核苷酸表現之最終產物的長度。當相對於替代性聚核苷酸(例如，除包括poly-A區之mRNA部分以外)之任何特徵時，poly-A區之長度比其他特徵大10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。poly-A區亦可設計成其所屬之替代性聚核苷酸的一部分。在此情形下，poly-A區可為構築體之總長度或構築體之總長度減去poly-A區之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%或更大。

在某些情況下，經工程改造之結合位點及/或mRNA與poly-A結合蛋白之結合可用於增強表現。經工程改造之結合位點可為感測器序列，其可作為mRNA局部微環境之配位體的結合位點操作。作為非限制性實例，mRNA可包括至少一個經工程改造之結合位點以改變poly-A結合蛋白(PABP)及其類似物之結合親和力。併入至少一個經工程改造之結合位點可增加PABP及其類似物之結合親和力。

另外，多個不同mRNA可使用替代性核苷酸，在poly-A區之3'-末端經由3'-端與poly-A結合蛋白(PABP)連接在一起。轉染實驗可在相關細胞株中進行且蛋白質產生可在轉染後12小時、24小時、48小時、72小時及第7天藉由ELISA分析。作為一個非限制性實例，轉染實驗可用於評估由於添加至少一個經工程改造之結合位點而對PABP或其類似物結合親和力之影響。在某些情況下，poly-A區可用於調節轉譯起始。雖然不希望受理論束縛，但poly-A區募集PABP，其又可與轉譯起始複合物相互作用且因此對於蛋白質合成而言可為必需的。在一些情況下，poly-A區亦可用於本發明中以保護免受3'-5'-核酸外切酶消化。

在一些情況下，mRNA可包括poly-A-G四重體。G-四重體為四個鳥苷核苷酸之環狀氫鍵結陣列，其可由DNA及RNA兩者中富含G之序列形成。在此態樣中，在poly-A區末端併入G-四重體。可在各種時間點處分析所得mRNA之穩定性、蛋白質產生及包括半衰期之其他參數。已發現，poly-A-G四重體使得蛋白質產生等效於單獨使用120個核苷酸之poly-A區所見之蛋白質產生之至少75%。

在一些情況下，mRNA可包括poly-A區且可藉由添加3'-穩定區來穩定。具有poly-A區之mRNA可進一步包括5'-帽結構。在其他情況下，mRNA可包括poly-A-G四重峰。具有poly-A-G四重峰之mRNA可進一步包括5'-帽結構。在一些情況下，可用於使mRNA穩定的3'-穩定區包括poly-A區或poly-A-G四重體。在其他情況下，可用於本發明之3'-穩定區包括鏈終止核苷，諸如3'-去氧腺苷(蛹蟲草菌素)、3'-去氧尿苷、3'-去氧胞嘧啶、3'-去氧鳥苷、3'-去氧胸腺嘧啶；2',3'-二去氧核苷，諸如2',3'-二去氧腺苷、2',3'-二去氧尿苷、2',3'-二去氧胞嘧啶、2',3'-二去氧鳥苷、2',3'-二去氧胸腺嘧啶；2'-去氧核苷或O-甲基核苷。在其他情況下，包括poly-A區或poly-A-G四重體之mRNA可藉由改變可阻止及/或抑制添加oligo(U)之聚核苷酸之3'-區來穩定。在其他情況下，包括poly-A區或poly-A-G四重體之mRNA可藉由添加在3'-去氧核苷、2',3'-二去氧核苷3'-O-甲基核苷、3'-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷及此項技術中已知及/或本文所述之其他替代性核苷中終止的寡核苷酸來穩定。

對本文所描述之mRNA分子之修飾可使用可以手動操縱的固體支撐物，或與DNA或RNA合成器結合，使用熟習DNA或RNA合成器技術者通常已知之方法來實現。一般而言，程序涉及使將在所選序列中彼此鄰接之兩個核苷之糖部分官能化。在5'至3'有義上，諸如結構H之「上游」合成組元在其末端3'位點處經修飾，而諸如結構H1之「下游」合成組元在其末端5'位點處經修飾。

藉由肼、羥基胺及其他連接基團連接之寡核苷可藉由5'-羥基處之二甲氧基三苯甲基保護且經活化以用於在3'-羥基處與氰基乙基二異丙基-亞磷酸酯部分偶合。此等化合物可藉由標準、固相、自動化DNA或RNA合成技術插入至任何所需序列中。最常用製程中之一者為胺基亞磷酸酯技術。含有均勻主鏈鍵之寡核苷酸可藉由使用CPG-固體支撐物及標準核酸合成機器，諸如Applied Biosystems Inc. 380B及394及Milligen/Biosearch 7500及8800s來合成。初始核苷酸(3'-端處之編號1)連接至固體支撐物，諸如受控微孔玻璃。在序列特定次序中，藉由手動操縱或藉由自動化合成器系統連接各新的核苷酸。

可在乙酸中用例如丙酮及氰基硼氫化鈉使游離胺基烷基化。烷基化步驟可用於在大分子上引入其他有用的功能分子。此類有用的功能分子包括但不限於報導分子、RNA裂解基團、用於改良寡核苷酸之藥物動力學特性之基團及用於改良寡核苷酸之藥效學特性之基團。此類分子可經由連接至主鏈鍵中之氮原子而連接至大分子或與大分子結合。替代地，此類分子可連接至自一或多個核苷酸之糖部分之羥基延伸的側基。此類其他有用的官能基之實例係由WO1993007883提供，其以引用之方式併入本文中，且提供於其他上述專利申請案中。

固體支撐物可包括此項技術中已知之用於聚核苷酸合成之任何彼等固體支撐物，包括受控微孔玻璃(CPG)、乙二醯基受控微孔玻璃、TENTAGEL®支撐物-胺基聚乙二醇衍生支撐物或Poros-聚苯乙烯/二乙烯苯之共聚物。核苷酸及寡核苷酸之連接及裂解可經由標準程序實現。如本文所用，術語固體支撐物進一步包括任何用於使生長寡核苷結合至固定相之連接子(例如長鏈烷基胺及丁二醯基殘基)，諸如CPG。在一些態樣中，寡核苷酸可進一步定義為具有一或多個鎖定核苷酸、乙烯橋連核苷酸、肽核酸或5'(E)-乙烯基-膦酸酯(VP)修飾。在一些態樣中，寡核苷酸具有一或多個硫代磷酸化DNA或RNA鹼基。

本文所述之mRNA分子可使用各種方法分析及表徵。可在加帽之前或之後進行分析。替代地，可在基於poly-A捕捉之親和純化之前或之後進行分析。在另一態樣中，可在額外純化步驟，例如陰離子交換層析及其類似步驟之前或之後進行分析。舉例而言，可使用基於生物分析器晶片之電泳系統測定mRNA品質。在其他態樣中，使用分析型逆相HPLC分析mRNA純度。加帽效率可使用例如總核酸酶消化，隨後二核苷酸帽物種相對於未加帽GTP物種之MS/MS定量來分析。活體外功效可藉由例如將mRNA分子轉染至人類細胞株中來分析。可使用諸如ELISA或流式細胞量測術之方法定量相關多肽之蛋白質表現。免疫原性可藉由例如將mRNA分子轉染至指示先天性免疫刺激之細胞株(例如PBMC)中來分析。可使用例如，諸如ELISA之方法來分析細胞介素誘導，從而定量細胞介素，例如干擾素-α。

在一些態樣中，RNA分子為saRNA。「saRNA」、「自擴增RNA」及「複製子」係指能夠自我複製之RNA。自擴增RNA分子可藉由使用衍生自一或多種病毒(例如α病毒)之複製元件及用編碼相關多肽之核苷酸序列取代結構性病毒多肽而產生。自擴增RNA分子通常為可在遞送至細胞之後直接轉譯的正股分子，且此轉譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，其隨後自所遞送RNA產生反義及正義轉錄物。所遞送之RNA使得產生多個子RNA。此等子RNA以及共線次基因體轉錄物可自身經轉譯以提供經編碼之相關基因(例如病毒抗原)之原位表現，或可經轉錄以提供與經轉譯以提供相關蛋白質，例如抗原之原位表現的所遞送RNA同義的其他轉錄物。此系列轉錄之總體結果為所引入saRNA之數目擴增，且因此經編碼之相關基因(例如病毒抗原)可變成細胞之主要多肽產物。

在一些態樣中，自擴增RNA包括至少一或多個選自以下中之任一者的基因：病毒複製酶、病毒蛋白酶、病毒解螺旋酶及其他非結構性病毒蛋白質。在一些態樣中，自擴增RNA亦可包括5'端及3'端牽引複製序列，及視情況存在之編碼所需胺基酸序列(例如相關抗原)之異源序列。引導異源序列之表現的次基因體啟動子可包括在自擴增RNA中。視情況，異源序列(例如，相關抗原)可框內融合至自擴增RNA中之其他編碼區及/或可處於內部核糖體進入位點(IRES)之控制下。

在一些態樣中，自擴增RNA分子未囊封於病毒樣粒子中。本文所述之自擴增RNA分子可經設計以使得自擴增RNA分子無法誘導傳染性病毒粒子之產生。此可例如藉由省略一或多種編碼在自擴增RNA中產生病毒粒子所需之結構蛋白的病毒基因來實現。舉例而言，當自擴增RNA分子係基於α病毒，諸如辛畢斯病毒(Sinbis virus，SIN)、勝利基森林病毒(Semliki forest virus)及委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)時，可省略編碼病毒結構蛋白，諸如衣殼及/或包膜糖蛋白之一或多個基因。

在一些態樣中，本文所描述之自擴增RNA分子編碼：(i)可由自擴增RNA分子轉錄RNA之RNA依賴性RNA聚合酶；及(ii)相關多肽，例如病毒抗原。在一些態樣中，聚合酶可為α病毒複製酶，例如包括α病毒蛋白質nsP1、nsP2、nsP3、nsP4中之任一者及其任何組合。在一些態樣中，本文所描述之自擴增RNA分子可包括一或多種經修飾之核苷酸(例如假尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷)。在一些態樣中，自擴增RNA分子不包括經修飾之核苷酸(例如假尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷)。

saRNA構築體可編碼至少一種非結構蛋白(NSP)，該非結構蛋白安置於編碼至少一種相關肽或多肽之序列的5'或3'。在一些態樣中，編碼至少一種NSP之序列安置於編碼相關肽或多肽之序列的5'。因此，編碼至少一種NSP之序列可安置於RNA構築體之5'端處。在一些態樣中，由RNA構築體編碼之至少一種非結構蛋白可為RNA聚合酶nsP4。在一些態樣中，saRNA構築體編碼nsP1、nsP2、nsP3及nsP4。如此項技術中已知，nsP1為病毒加帽酶及複製複合物(RC)之膜錨。nsP2為RNA解螺旋酶及負責ns聚合蛋白質處理之蛋白酶。nsP3與若干宿主蛋白質相互作用且可調節蛋白多ADP核糖基化及單ADP核糖基化。nsP4為核心病毒RNA依賴性RNA聚合酶。在一些態樣中，聚合酶可為α病毒複製酶，例如包含α病毒蛋白質nsP1、nsP2、nsP3及nsP4中之一或多者。

儘管除非結構複製酶多肽以外，天然α病毒基因體編碼結構病毒粒子蛋白，但在一些態樣中，自擴增RNA分子不編碼α病毒結構蛋白。在一些態樣中，自擴增RNA可引起在細胞中產生自身的基因體RNA複本，但不產生包括病毒粒子之RNA。不受理論或機制束縛，不能產生此等病毒粒子意謂與野生型α病毒不同，自擴增RNA分子無法維持自身呈感染形式。使野生型病毒延續所需之α病毒結構蛋白可不存在於本發明之自擴增RNA中，且其位置可由編碼相關免疫原之基因獲得，使得次基因體轉錄物編碼免疫原而非結構性α病毒之病毒粒子蛋白。

在一些態樣中，自擴增RNA分子可具有兩個開放閱讀框架。第一(5')開放閱讀框架可編碼複製酶；第二(3')開放閱讀框架可編碼包含相關抗原之多肽。在一些態樣中，RNA可具有額外(例如下游)開放閱讀框架，例如以編碼其他抗原或編碼輔助多肽。

在一些態樣中，saRNA分子進一步包括：(1) α病毒5'複製識別序列；及(2) α病毒3'複製識別序列。在一些態樣中，自擴增RNA分子之5'序列經選擇以確保與所編碼之複製酶相容。

視情況，本文所述之自擴增RNA分子亦可經設計以誘導產生減毒或有毒的感染性病毒粒子，或產生能夠進行單輪後續感染的病毒粒子。

在一些態樣中，saRNA分子係基於α病毒。α病毒包括披膜病毒科之一組遺傳、結構及血清學相關之節肢動物媒介病毒。α病毒屬內之例示性病毒及病毒亞型包括辛得比斯病毒、勝利基森林病毒、羅斯河病毒(Ross River virus)及委內瑞拉馬腦炎病毒。因此，本文所述之自擴增RNA可併入RNA複製酶，該RNA複製酶來源於以下中之任一者：勝利基森林病毒(SFV)、辛得比斯病毒(SIN)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)、羅斯河病毒(RRV)或屬於α病毒家族之其他病毒。在一些態樣中，本文所述之自擴增RNA可併入來源於突變型或野生型病毒序列之序列，例如已在saRNA中使用VEEV之減毒TC83突變體。

基於α病毒之saRNA為可在遞送至細胞之後轉譯之(+)-多股saRNA，其引起複製酶(或複製酶-轉錄酶)之轉譯。複製酶轉譯為自裂解以提供複製複合物之聚合蛋白質，該複製複合物產生(+)-股遞送RNA之基因體(-)-股複本。此等(-)-股轉錄物本身可轉錄，得到(+)-股親本RNA之其他複本且亦得到編碼所需基因產物之次基因體轉錄物。次基因體轉錄物之轉譯由此引起受感染細胞原位表現所需基因產物。適合的α病毒saRNA可使用來自辛得比斯病毒、勝利基森林病毒、東部馬腦炎病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒或其突變變異體之複製酶。

在一些態樣中，自擴增RNA分子源自或基於除α病毒以外的病毒，諸如陽性多股RNA病毒，且尤其小RNA病毒、黃病毒、風疹病毒屬、瘟病毒、C型肝炎病毒、杯狀病毒或冠狀病毒。適合的野生型α病毒序列為熟知的且可獲自序列保藏處，諸如American Type Culture Collection, Rockville, Md。適合的α病毒的代表性實例包括奧拉病毒(Aura) (ATCC VR-368)、貝巴魯病毒(Bebaru virus) (ATCC VR-600、ATCC VR-1240)、卡巴斯歐病毒(Cabassou) (ATCC VR-922)、屈公病毒(Chikungunya virus) (ATCC VR-64、ATCC VR-1241)、東部馬腦炎病毒(ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡病毒(Fort Morgan) (ATCC VR-924)、蓋塔病毒(Getah virus) (ATCC VR-369、ATCC VR-1243)、克孜拉加奇病毒(Kyzylagach) (ATCC VR-927)、馬亞羅(Mayaro) (ATCC VR-66)、馬亞羅病毒(Mayaro virus) (ATCC VR-1277)、米德爾堡病毒(Middleburg) (ATCC VR-370)、穆坎布病毒(Mucambo virus) (ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、恩杜姆病毒(Ndumu) (ATCC VR-371)、皮春納病毒(Pixuna virus) (ATCC VR-372、ATCC VR-1245)、羅斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、勝利基森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛得比斯病毒(ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、圖那特病毒(Tonate) (ATCC VR-925)、特里尼蒂病毒(Triniti) (ATCC VR-469)、烏納病毒(Una) (ATCC VR-374)、委內瑞拉馬腦炎(ATCC VR-69、ATCC VR-923、ATCC VR-1250 ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西部馬腦炎(ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、ATCC VR-1252)、沃達羅河病毒(Whataroa) (ATCC VR-926)及Y-62-33 (ATCC VR-375)。在一些態樣中，可排除清單中α病毒中之一或多者。

在一些態樣中，本文所述之自擴增RNA分子大於其他類型之RNA (例如mRNA)。通常，本文所述之自擴增RNA分子包括至少約4 kb。舉例而言，自擴增RNA可等於3 kb、4 kb、5 kb、6 kb、7 kb、8 kb、9 kb、10 kb、11 kb、12 kb、13 kb、14 kb、15 kb、16 kb中之任一者、至少任一者、至多任一者或任何兩者之間。在一些情況下，自擴增RNA可包括至少約5 kb、至少約6 kb、至少約7 kb、至少約8 kb、至少約9 kb、至少約10 kb、至少約11 kb、至少約12 kb或超過12 kb。在某些實例中，自擴增RNA為約4 kb至約12 kb、約5 kb至約12 kb、約6 kb至約12 kb、約7 kb至約12 kb、約8 kb至約12 kb、約9 kb至約12 kb、約10 kb至約12 kb、約11 kb至約12 kb、約5 kb至約11 kb、約5 kb至約10 kb、約5 kb至約9 kb、約5 kb至約8 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約6 kb、約6 kb至約12 kb、約6 kb至約11 kb、約6 kb至約10 kb、約6 kb至約9 kb、約6 kb至約8 kb、約6 kb至約7 kb、約7 kb至約11 kb、約7 kb至約10 kb、約7 kb至約9 kb、約7 kb至約8 kb、約8 kb至約11 kb、約8 kb至約10 kb、約8 kb至約9 kb、約9 kb至約11 kb、約9 kb至約10 kb或約10 kb至約11 kb。

在一些態樣中，自擴增RNA分子可編碼單一多肽抗原，或視情況編碼兩個或更多個多肽抗原，該等多肽抗原以序列中之各者在以胺基酸序列形式表現時保持其特性的方式連接在一起(例如，串聯連接)。由自擴增RNA產生之多肽接著可以融合多肽之形式產生，或以使得產生不同多肽或肽序列之方式經工程改造。

在一些態樣中，本文所述之自擴增RNA可編碼包括一系列抗原決定基之一或多種多肽抗原。在一些態樣中，本文所述之自擴增RNA可編碼能夠引發輔助T細胞反應或細胞毒性T細胞反應或兩者之抗原決定基。

III. 脂質及脂質奈米粒子  在一態樣中，本文中所揭示之組合物包含脂質。舉例而言，組合物可包括脂質及mRNA (例如modRNA)，且脂質及mRNA (例如modRNA)可共同形成奈米粒子，由此產生包含脂質之含mRNA奈米粒子。脂質可以脂質奈米粒子(LNP)形式囊封mRNA或與mRNA締合以幫助RNA/脂質奈米粒子穩定、細胞進入及細胞內釋放。

在一些情況下，LNP包含微胞、固體脂質奈米粒子、奈米乳液、脂質體等或其組合。

LNP之脂質組分可包括例如陽離子脂質、磷脂(諸如不飽和脂質，例如DOPE或DSPC)、聚合物-脂質結合物(例如聚乙二醇化脂質)、結構性脂質、可電離脂質、中性脂質或其任何組合。脂質組分之元素可以特定分率提供。本發明之方法的適合陽離子脂質、磷脂、聚合物-脂質結合物、結構性脂質、可電離脂質及中性脂質進一步揭示於本文中。

在一些態樣中，LNP之脂質組分包括陽離子脂質、磷脂、聚合物-脂質結合物、結構性脂質、可電離脂質及/或中性脂質中之任何一或多者。在某些態樣中，脂質奈米粒子之脂質組分包括約0莫耳%至約60莫耳%陽離子脂質(例如至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳%陽離子脂質)；約0莫耳%至約60莫耳%磷脂(例如至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳%磷脂)；約0莫耳%至約60莫耳%結構性脂質(例如至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60莫耳%結構性脂質)；約0莫耳%至約60莫耳%聚合物-脂質結合物(例如至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳%聚合物-脂質結合物)；約0莫耳%至約60莫耳%可電離脂質(例如至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳%可電離脂質)；及/或約0莫耳%至約60莫耳%中性脂質(例如至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳%中性脂質)。LNP可具有前述脂質組分之任何量，其限制條件為總莫耳%不超過100%。如本文所用，「莫耳%」係指相對於LNP中所有脂質組分之總莫耳(亦即，陽離子脂質、中性脂質、類固醇及聚合物結合脂質之總莫耳)的組分之莫耳百分比。

在一些態樣中，脂質奈米粒子之脂質組分包括約35莫耳%至約55莫耳%陽離子脂質化合物、約5莫耳%至約25莫耳%磷脂、約30莫耳%至約50莫耳%結構性脂質及約0莫耳%至約10莫耳%聚合物-脂質結合物。在一特定態樣中，脂質組分包括約50莫耳%該陽離子脂質、約10莫耳%磷脂、約40莫耳%結構性脂質及約1.5莫耳%聚合物-脂質結合物。在另一特定態樣中，脂質組分包括約40莫耳%該陽離子脂質、約20莫耳%磷脂、約40莫耳%結構性脂質及約1.5莫耳%聚合物-脂質結合物。在一特定態樣中，脂質奈米粒子之脂質組分包括莫耳比為約47.5:10:40.7:1.8之陽離子脂質、磷脂、結構性脂質及聚合物-脂質結合物。

在一些態樣中，脂質奈米粒子之脂質組分包括約0莫耳%至約10莫耳%陽離子脂質化合物、約40莫耳%至約60莫耳%磷脂及約40莫耳%至約60莫耳%結構性脂質。在一特定態樣中，脂質組分包括約2莫耳%該陽離子脂質、約49莫耳%磷脂及約49莫耳%結構性脂質。在一特定態樣中，脂質奈米粒子之脂質組分包括莫耳比為約1.8:49.1:49.1之陽離子脂質、磷脂及結構性脂質。

在一些態樣中，磷脂可為DOPE或DSPC。在其他態樣中，聚合物-脂質結合物可為PEG-DMG及/或結構性脂質可為膽固醇。在其他態樣中，聚合物-脂質結合物可為PEG-2000 DMG及/或結構性脂質可為膽固醇。

在一些態樣中，脂質奈米粒子包括： i)在40與50莫耳%之間的陽離子脂質； ii)磷脂及/或中性脂質； iii)結構性脂質； iv)聚合物結合脂質；及 v)囊封於脂質奈米粒子內或與脂質奈米粒子締合之治療劑(亦即RNA)。

在一些態樣中，脂質奈米粒子包括： i) 0與10莫耳%之間的陽離子脂質； ii)磷脂及/或中性脂質；及 iii)類固醇。

在一些態樣中，脂質奈米粒子包含41至50莫耳%、42至50莫耳%、43至50莫耳%、44至50莫耳%、45至50莫耳%、46至50莫耳%或47至50莫耳%陽離子脂質。在某一特定態樣中，脂質奈米粒子包含至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好41.0、41.1、41.2、41.3、41.4、41.5、41.6、41.7、41.8、41.9、42.0、42.1、42.2、42.3、42.4、42.5、42.6、42.7、42.8、42.9、43.0、43.1、43.2、43.3、43.4、43.5、43.6、43.7、43.8、43.9、44.0、44.1、44.2、44.3、44.4、44.5、44.6、44.7、44.8、44.9、45.0、45.1、45.2、45.3、45.4、45.5、45.6、45.7、45.8、45.9、46.0、46.1、46.2、46.3、46.4、46.5、46.6、46.7、46.8、46.9、47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、48.0、48.1、48.2、48.3、48.4、48.5、48.6、48.7、48.8、48.9、49.0、49.1、49.2、49.3、49.4、49.5、49.6、49.7、49.8、49.9或50莫耳%陽離子脂質。

在其他態樣中，脂質奈米粒子包含0至10莫耳%陽離子脂質。在某些特定態樣中，脂質奈米粒子包含至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10莫耳%陽離子脂質。

在一些態樣中，磷脂及/或中性脂質以5至15莫耳%、7至13莫耳%或9至11莫耳%範圍內之濃度存在。在某些態樣中，磷脂及/或中性脂質以至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9或15莫耳%範圍內之濃度存在。在某些特定態樣中，磷脂及/或中性脂質以約9.5、10或10.5莫耳%之濃度存在。

在其他態樣中，磷脂及/或中性脂質以40至60莫耳%範圍內之濃度存在。在某些態樣中，磷脂及/或中性脂質以至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳%之濃度存在。在某些特定態樣中，磷脂及/或中性脂質以約48、49或50莫耳%之濃度存在。

在一些態樣中，陽離子脂質與磷脂及/或中性脂質之莫耳比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0或約4.7:1.0至4.8:1.0範圍內。在其他態樣中，磷脂及/或中性脂質與陽離子脂質之莫耳比為1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8或1:4.9。

在一些態樣中，結構性脂質為類固醇。在一些態樣中，類固醇係膽固醇。在一些態樣中，結構性脂質以39至49莫耳%、40至46莫耳%、40至44莫耳%、40至42莫耳%、42至44莫耳%或44至46莫耳%範圍內之濃度存在。在某些特定態樣中，結構性脂質以至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好39、39.1、39.2、39.3、39.4、39.5、39.6、39.7、39.8、39.9、40、40.1、40.2、40.3、40.4、40.5、40.6、40.7、40.8、40.9、41、41.1、41.2、41.3、41.4、41.5、41.6、41.7、41.8、41.9、42、42.1、42.2、42.3、42.4、42.5、42.6、42.7、42.8、42.9、43、43.1、43.2、43.3、43.4、43.5、43.6、43.7、43.8、43.9、44、44.1、44.2、44.3、44.4、44.5、44.6、44.7、44.8、44.9、45、45.1、45.2、45.3、45.4、45.5、45.6、45.7、45.8、45.9、46、46.1、46.2、46.3、46.4、46.5、46.6、46.7、46.8、46.9、47、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、48、48.1、48.2、48.3、48.4、48.5、48.6、48.7、48.8、48.9或49莫耳%之濃度存在。在某些特定態樣中，結構性脂質以40、41、42、43、44、45或46莫耳%之濃度存在。

在其他態樣中，結構性脂質以40至60莫耳%範圍內之濃度存在。在某些態樣中，結構性脂質以至少約、至多約、其中任何兩者之間或恰好40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳%之濃度存在。在某些特定態樣中，結構性脂質以約48、49或50莫耳%之濃度存在。

在某些態樣中，陽離子脂質與結構性脂質之莫耳比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內，例如1:0.9、1:1, 1:1.1或1:1.2。

在較佳態樣中，陽離子脂質為具有以下結構(IE)之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽或立體異構物，其中： G ¹及G ²各自獨立地為未經取代之伸烷基； G ³為未經取代之C1-C12伸烷基； R ¹及R ²各自獨立地為C6-C24烷基； R ³為OR ⁵、CN、-C(═O)OR ⁴、-OC(═O)R ⁴或NR ⁵C(═O)R ⁴； R ⁴為C1-C12烷基；及 R ⁵為H或C1-C6烷基。

在一些態樣中，化合物包括以下結構： ， 其中R ⁶在各次出現時為H；n為介於2至12範圍內之整數；且y及z各自獨立地為介於6至9範圍內之整數。在一些態樣中，n為3、4、5或6。在一些態樣中，y及z各自為6。在一些態樣中，y及z各自為9。在一些態樣中，R ¹及R ²各自獨立地具有以下結構，其中：R ^7a及R ^7b在各次出現時獨立地為H或C1-C12烷基；且a為2至12之整數，其中R ^7a、R ^7b及a各自經選擇使得R ¹及R ²各自獨立地包含6至20個碳原子。在一些態樣中，a為8至12之整數。在一些態樣中，R ^7a在至少一次出現時為H。在一些態樣中，R ^7a在各次出現時為H。在一些態樣中，R ^7b在至少一次出現時為C1-C8烷基。在一些態樣中，C1-C8烷基係甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基或正辛基。在一些態樣中，R ³為OH。在一些態樣中，R ³為CN。在一些態樣中，R ³為-C(═O)OR4、-OC(═O)R ⁴或NHC(═O)R ⁴。在一些態樣中，R ⁴為甲基或乙基。在一些態樣中，化合物具有以下結構： 。

額外例示性可電離脂質包括： ，其為此項技術中已知的。

脂質奈米粒子組合物之脂質組分可包括一或多種包含聚合物，諸如聚乙二醇的分子，例如PEG或經PEG改質之脂質。該等物種可替代地稱為聚乙二醇化脂質。PEG脂質為經聚乙二醇改質之脂質。PEG脂質可選自包括以下之非限制性群：經PEG改質之磷脂醯乙醇胺、經PEG改質之磷脂酸、經PEG改質之神經醯胺、經PEG改質之二烷基胺、經PEG改質之二醯基甘油、經PEG改質之二烷基甘油及其混合物。在一些態樣中，PEG脂質可為PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂質。如本文所用，術語「PEG脂質」係指經聚乙二醇(PEG)改質之脂質。PEG脂質之非限制性實例包括經PEG改質之磷脂醯乙醇胺及磷脂酸、PEG-神經醯胺結合物(例如PEG-CerCl4或PEG-CerC20)、經PEG改質之二烷基胺及經PEG改質之1,2-二醯基氧基丙-3-胺。此類脂質亦稱為聚乙二醇化脂質。在一些態樣中，PEG脂質可為PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂質。在一些態樣中，經PEG改質之脂質為PEG DMG之改質形式。

在一些態樣中，經PEG改質之脂質為具有式(IV)之PEG脂質： 。其中R ⁸及R ⁹各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中該烷基鏈視情況間雜有一或多個酯鍵；且w具有範圍為30至60之平均值。

在一些態樣中，聚合物結合脂質為包含式(IV)之聚㗁唑啉(POZ)脂質： 。POZ為此項技術中已知且描述於2020年6月29日申請之WO/2020/264505、PCT/US2020/040140中。

在一些態樣中，聚乙二醇化脂質具有以下結構(II)： 或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體或立體異構體，其中：R ¹⁰及R ¹¹各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中該烷基鏈視情況間雜有一或多個酯鍵；且 z具有範圍為30至60之平均值；其限制條件為當 z為42時，R ¹⁰及R ¹¹不都為正十八烷基。在聚乙二醇化脂質之一些態樣中，R ¹⁰及R ¹¹各自獨立地為含有12至16個碳原子之直鏈飽和烷基鏈。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質 z為約45。

在一些態樣中，聚乙二醇化脂質具有以下結構中之一者： ， 其中n具有範圍為40至50之平均值。在一較佳態樣中，組合物包含上文所描述之ALC-315陽離子脂質及具有以下結構中之一者的聚乙二醇化脂質： 。

在上文所描述之聚乙二醇化脂質之一些態樣中，R ¹⁰及R ¹¹各自獨立地為含有12個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在上文所描述之聚乙二醇化脂質之一些態樣中，R ¹⁰及R ¹¹各自獨立地為含有14個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在上文所描述之聚乙二醇化脂質之一些態樣中，R ¹⁰及R ¹¹各自獨立地為含有16個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。其他例示性脂質及其相關調配物揭示於例如2017年2月14日申請之美國專利第9,737,619號、2016年10月28日申請之美國專利第10,166,298號及2017年10月26日申請之國際專利申請案第PCT/US2017/058619號中，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些態樣中，可電離脂質為式(IL-l)化合物： ， 或其N-氧化物，或其鹽或異構體，其中： R ⁱ係選自由以下組成之群：C _5-30烷基、C _5-20烯基、-R*YR''、-YR''及-R''M'R'；R ²及R ³獨立地選自由以下組成之群：H、C _1-14烷基、C _2-14烯基、-R*YR''、-YR''及-R*OR''，或R ²及R ³與其所附接之原子一起形成雜環或碳環；R ⁴係選自由以下組成之群：氫、C _3-6碳環、-(CH ₂)nQ、-(CH ₂)nCHQR、-CHQR、-CQ(R) ₂及未經取代之C _1-6烷基，其中Q係選自碳環、雜環、-OR、-O(CH ₂)nN(R) ₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX ₃、-CX ₂H、-CXH ₂、-CN、-N(R) ₂、-C(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) ₂R、-N(R)C(O)N(R) ₂、-N(R)C(S)N(R) ₂、-N(R)Re、N(R)S(O) ₂R ₈、-O(CH ₂)nOR、-N(R)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(R)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-OC(O)N(R) ₂J -N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) ₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) ₂、-N(OR)C(S)N(R) ₂、-N(OR)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(OR)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-C(=NR ₉)N(R) ₂、-C(=NR ₉)R、-C(O)N(R)OR及-C(R)N(R) ₂C(O)OR，且各n獨立地選自1、2、3、4及5；各R ⁵獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；各R ^e獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；M及M'獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M''-C(O)O-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O) ₂-、-S-S-、芳基及雜芳基，其中M''為鍵、C _1-13烷基或C _2-13烯基；R ⁷係選自由以下組成之群：C _1-3烷基、C _2-3烯基及H；R ^e係選自由以下組成之群：C _3-6碳環及雜環；R ⁹係選自由以下組成之群：H、CN、NO ₂、C _1-6烷基、-OR、-S(O) ₂R、-S(O) ₂N(R) ₂、C _2-6烯基、C _3-6碳環及雜環；各R獨立地選自由以下組成之群：C _1-3烷基、C _2-3烯基及H；各R'獨立地選自由以下組成之群：C _1-15烷基、C _2-15烯基、-R*YR''、-YR''及H；各R''獨立地選自由以下組成之群：C _3-15烷基及C _3-15烯基；各R*獨立地選自由以下組成之群：C _1-12烷基及C _2-12烯基；各Y獨立地為C _3-6碳環；各X獨立地選自由以下組成之群：F、Cl、Br及I；且m係選自5、6、7、8、9、10、11、12及13；且其中當R ⁴為-(CH ₂)nQ、-(CH ₂)nCHQR、-CHQR或-CQ(R) ₂時，則(i)當n為1、2、3、4或5時，Q不為-N(R) ₂，或(ii)當n為1或2時，Q不為5、6或7員雜環烷基。

在較佳態樣中，組合物進一步包括核酸。在較佳態樣中，核酸包含信使RNA。在一些態樣中，組合物進一步包括一或多種選自中性脂質及類固醇之賦形劑。在一些態樣中，組合物包含一或多種選自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE及SM之中性脂質。較佳地，在一些態樣中，中性脂質為DSPC。較佳地，在一些態樣中，類固醇為膽固醇。

LNP可包括一或多種本文所述之組分。在一些態樣中，本發明之LNP調配物包括至少一種脂質奈米粒子組分。脂質奈米粒子可包括脂質組分及一或多種額外組分，諸如治療劑及/或預防劑，諸如核酸。LNP可經設計用於一或多種特定應用或目標。可基於特定應用或目標及/或基於一或多種元素之功效、毒性、費用、易用性、可用性或其他特徵來選擇LNP之元素。類似地，可根據例如元素之特定組合之功效及毒性來為特定應用或目標選擇LNP之特定調配物。LNP調配物之功效及耐受性可能受調配物之穩定性影響。

脂質奈米粒子可經設計用於一或多種特定應用或目標。舉例而言，LNP可經設計以將治療劑及/或預防劑，諸如RNA遞送至哺乳動物體中之特定細胞、組織、器官或系統或其群組。可改變脂質奈米粒子之生理化學特性以便增加對特定身體目標之選擇性。舉例而言，可基於不同器官之開窗尺寸調整粒度。亦可基於一或多種所需遞送目標選擇包括於LNP中之治療劑及/或預防劑。舉例而言，可針對特定適應症、病況、疾病或病症及/或遞送至特定細胞、組織、器官或系統或其群組(例如，局部或特定遞送)來選擇治療劑及/或預防劑。在某些態樣中，LNP可包括編碼相關多肽的mRNA，該mRNA能夠在細胞內轉譯以產生相關多肽。此類組合物可經設計以特異性遞送至特定器官。在一些態樣中，組合物可經設計以特異性遞送至哺乳動物肝臟。在一些態樣中，組合物可經設計以特異性遞送至淋巴結。在一些態樣中，組合物可經設計以特異性遞送至哺乳動物脾臟。

在一些態樣中，聚合物可包括於LNP中及/或用於囊封或部分囊封LNP。聚合物可為可生物降解的及/或生物相容的。聚合物可選自但不限於多元胺、聚醚、聚醯胺、聚酯、聚胺基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚醯亞胺、聚碸、聚胺甲酸酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙亞胺、聚異氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈及聚芳酯。例如，聚合物可包括聚(己內酯) (PCL)；乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)；聚(乳酸) (PLA)；聚(L-乳酸) (PLLA)；聚(乙醇酸) (PGA)；聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)；聚(L-乳酸-共-乙醇酸) (PLLGA)；聚(D,L-丙交酯) (PDLA)；聚(L-丙交酯) (PLLA)；聚(D,L-丙交酯-共-己內酯)；聚(D,L-丙交酯-共-己內酯-共-乙交酯)；聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)；聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯),氰基丙烯酸聚烷酯；聚胺甲酸酯；聚-L-離胺酸(PLL)；甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)；聚乙二醇；聚-L-麩胺酸；聚(羥基酸)；聚酸酐；聚原酸酯；聚(酯醯胺)；聚醯胺；聚(酯醚)；聚碳酸酯；聚伸烷，諸如聚乙烯及聚丙烯；聚伸烷二醇，諸如聚(乙二醇) (PEG)；聚環氧烷(PEO)；對苯二甲酸聚伸烷酯，諸如聚(對苯二甲酸乙二酯)；聚乙烯醇(PVA)；聚乙烯醚；聚乙烯酯，諸如聚(乙酸乙烯酯)；聚鹵乙烯，諸如聚(氯乙烯) (PVC)；聚乙烯吡咯啶酮(PVP)；聚矽氧烷；聚苯乙烯；聚胺甲酸酯；衍生纖維素，諸如烷基纖維素；羥烷基纖維素；纖維素醚；纖維素酯；硝基纖維素；羥基丙基纖維素；羧基甲基纖維素；丙烯酸之聚合物；諸如聚((甲基)丙烯酸甲酯) (PMMA)；聚((甲基)丙烯酸乙酯)；聚((甲基)丙烯酸丁酯)；聚((甲基)丙烯酸異丁酯)；聚((甲基)丙烯酸己酯)；聚((甲基)丙烯酸異癸酯)；聚((甲基)丙烯酸月桂酯)；聚((甲基)丙烯酸苯酯)；聚(丙烯酸甲酯)；聚(丙烯酸異丙酯)；聚(丙烯酸異丁酯)；聚(丙烯酸十八烷酯)及其共聚物及混合物；聚二氧環己酮及其共聚物；聚羥基烷酸酯；聚反丁烯二酸伸丙酯；聚甲醛；泊洛沙姆(poloxamer)；泊洛沙胺(poloxamine)；聚(鄰)酯；聚(丁酸)；聚(戊酸)；聚(丙交酯-共-己內酯)；碳酸三亞甲酯；聚(N-丙烯醯嗎啉) (PAcM)；聚(2-甲基-2-㗁唑啉) (PMOX)；聚(2-乙基-2-㗁唑啉) (PEOZ)及聚丙三醇。

在一些態樣中，表面改變劑可包括於LNP中及/或用於囊封或部分囊封LNP。表面改變劑可包括但不限於陰離子蛋白質(例如牛血清白蛋白)、界面活性劑(例如陽離子界面活性劑，諸如二甲基二(十八基)-溴化銨)、糖或糖衍生物(例如環糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇及泊洛沙姆)、黏液溶解劑(例如乙醯半胱胺酸、艾蒿、鳳梨酵素、番木瓜糖、大青(clerodendrum)、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司鈉(mesna)、胺溴素(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奧醇(domiodol)、來托司坦(letosteine)、司替羅寧(stepronin)、硫普羅寧(tiopronin)、膠溶素、胸腺素β4、鏈道酶α、奈替克新(neltenexine)及厄多司坦(erdosteine))及DNA酶(例如rhDNA酶)。表面改變劑可安置於奈米粒子內及/或LNP之表面上(例如藉由塗佈、吸附、共價鍵或其他方法)。

LNP亦可包含一或多種官能化脂質。舉例而言，脂質可用炔基官能化，炔基當在適當反應條件下暴露於疊氮化物時可經歷環加成反應。尤其，脂質雙層可以此方式經適用於促進膜滲透、細胞識別或成像之一或多個基團官能化。LNP之表面亦可與一或多種有用的抗體結合。適用於目標細胞遞送、成像及膜滲透之官能基及結合物在此項技術中已熟知。

除了此等組分之外，脂質奈米粒子可包括適用於醫藥組合物之任何物質。舉例而言，脂質奈米粒子可包括一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或附屬成分，諸如(但不限於)一或多種溶劑、分散介質、稀釋劑、分散助劑、懸浮助劑、表面活性劑、緩衝劑、防腐劑及其他物種。

表面活性劑及/或乳化劑可包括但不限於自然乳化劑(例如阿拉伯膠、褐藻酸、海藻酸鈉、膽固醇及卵磷脂)、去水山梨醇脂肪酸酯(例如去水山梨醇單月桂酸聚氧伸乙酯[TWEEN®20]、聚氧伸乙基脫水山梨糖醇[TWEEN® 60]、去水山梨醇單油酸聚氧伸乙酯[TWEEN®80]、去水山梨醇單軟脂酸酯[SPAN®40]、去水山梨醇單硬脂酸酯[SPAN®60]、去水山梨醇三硬脂酸酯[SPAN®65]、單油酸甘油酯、去水山梨醇單油酸酯[SPAN®80])、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯單硬脂酸酯[MYRJ® 45]、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯及SOLUTOL®)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如CREMOPHOR®)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚[BRIJ® 30])、聚(乙烯基-吡咯啶酮)、二乙二醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸鈉、油酸鉀、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸鈉、PLURONIC®F 68、POLOXAMER® 188、溴化十六烷基三甲基銨、氯化十六烷基吡啶、氯化苯甲烴銨、多庫酯鈉及/或其組合。

防腐劑之實例可包括但不限於抗氧化劑、螯合劑、自由基清除劑、抗微生物防腐劑、抗真菌劑防腐劑、醇防腐劑、酸性防腐劑及/或其他防腐劑。抗氧化劑的實例包括但不限於α生育酚、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚、丁基化羥基甲苯、單硫代甘油、偏亞硫酸氫鉀、丙酸、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉及/或亞硫酸鈉。螯合劑的實例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、單水合檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸、反丁烯二酸、蘋果酸、磷酸、乙二胺四乙酸鈉、酒石酸及/或乙二胺四乙酸三鈉。抗微生物防腐劑的實例包括但不限於苯紮氯銨、苄索氯銨、苯甲醇、溴硝丙二醇、西曲溴銨、氯化鯨蠟基吡錠、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪唑啶基脲、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇及/或硫柳汞。抗真菌防腐劑的實例包括但不限於對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉及/或山梨酸。醇防腐劑的實例包括但不限於乙醇、聚乙二醇、苄醇、苯酚、酚化合物、雙酚、氯丁醇、羥基苯甲酸酯及/或苯乙醇。酸性防腐劑的實例包括但不限於維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素、檸檬酸、乙酸、去氫抗壞血酸、抗壞血酸、山梨酸及/或植酸。其他防腐劑包括但不限於生育酚、生育酚乙酸酯、去鐵胺甲磺酸酯、西曲溴銨、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸鈉(SLS)、月桂基醚硫酸鈉(SLES)、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、偏亞硫酸氫鉀、GLYDANT PLUS®、PHENONIP®、對羥基苯甲酸甲酯、GERMALL® 115、GERMABEN®II、NEOLONE™、KATHON™及/或EUXYL®。例示性自由基清除劑包括丁基化羥基甲苯(BHT或丁基羥基甲苯)或去鐵胺。在一些較佳態樣中，組合物不包括防腐劑。

緩衝劑之實例包括但不限於檸檬酸鹽緩衝溶液、乙酸鹽緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、氯化銨、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡糖酸鈣、d-葡萄糖酸、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、乳糖酸鈣、丙酸、乙醯丙酸鈣、戊酸、磷酸氫鈣、磷酸、磷酸鈣、磷酸氫氧化鈣、乙酸鉀、氯化鉀、葡糖酸鉀、鉀混合物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀混合物、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉混合物、緩血酸胺、胺基磺酸鹽緩衝液(例如HEPES)、氫氧化鎂、氫氧化鋁、褐藻酸、無熱原水、等張生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇及/或其組合。在一些態樣中，組合物中緩衝劑之濃度為約10 mM。舉例而言，緩衝液濃度可等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mM或20 mM，或可來源於其中之任何範圍或值。在特定態樣中，緩衝液濃度為10 mM。緩衝液可呈中性pH，pH 6.5至8.5，pH 7.0至pH 8.0，或pH 7.2至pH 7.6。舉例而言，緩衝液可為pH 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，或可來源於其中之任何範圍或值。在特定態樣中，緩衝液呈pH 7.4。

在一些態樣中，包括LNP之調配物可進一步包括鹽，諸如氯鹽。在一些態樣中，包括LNP之調配物可進一步包括糖，諸如雙醣。在一些態樣中，調配物進一步包括糖但不包括鹽，諸如氯鹽。在一些態樣中，LNP可進一步包括一或多種小疏水性分子，諸如維生素(例如維生素A或維生素E)或固醇。碳水化合物可包括單糖(例如葡萄糖)及多醣(例如肝醣及其衍生物及類似物)。

LNP之特徵可視其組分而定。舉例而言，包括膽固醇作為結構性脂質之LNP的特徵可不同於包括不同結構性脂質之LNP。如本文所用，術語「結構性脂質」係指固醇以及含有固醇部分之脂質。如本文所定義，「固醇」為由類固醇組成之類固醇子組。在一些態樣中，結構性脂質為類固醇。在一些態樣中，結構性脂質為膽固醇。在一些態樣中，結構性脂質為膽固醇類似物。在一些態樣中，結構性脂質為α-生育酚。

在一些態樣中，LNP之特徵可視其組分之絕對或相對量而定。舉例而言，包括較高莫耳分率之磷脂的LNP可具有與包括較低莫耳分率之磷脂的LNP不同的特徵。特徵亦可視脂質奈米粒子之製備方法及條件而變化。一般而言，磷脂包含磷脂部分及一或多種脂肪酸部分。

磷脂部分可選自例如由以下組成之非限制性群：磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、2-溶血磷脂醯膽鹼及神經鞘磷脂。脂肪酸部分可選自例如由以下組成之非限制性群：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二烷酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸。特定磷脂可促進與膜之融合。在一些態樣中，陽離子磷脂可與膜(例如，細胞膜或細胞內膜)中之一或多種帶負電磷脂相互作用。磷脂與膜之融合可允許含脂質組合物(例如LNP)之一或多種成分(例如治療劑)穿過該膜，允許例如將該一或多個成分遞送至目標組織。亦考慮非天然磷脂物種，包括天然物種，天然物種具有包括分支、氧化、環化及炔烴之修飾及取代。在一些態樣中，磷脂可經一或多種炔烴(例如一或多個雙鍵經參鍵置換之烯基)官能化或與之交聯。在適當反應條件下，炔基可在暴露於疊氮化物時經歷銅催化之環加成。此類反應可適用於使奈米粒子組合物之脂質雙層官能化以促進膜滲透或細胞識別，或適用於將奈米粒子組合物結合至適用組分，諸如靶向或成像部分(例如染料)。磷脂包括但不限於甘油磷脂，諸如磷脂醯膽鹼、磷脂醯基-乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油及磷脂酸。磷脂亦包括磷神經脂質，諸如神經鞘磷脂。在一些態樣中，適用於或潛在地適用於本發明之磷脂為DSPC之類似物或變異體。

包含兩親媒性聚合物及脂質奈米粒子之調配物可全部或部分調配成醫藥組合物。醫藥組合物可包括一或多種兩親媒性聚合物及一或多種脂質奈米粒子。舉例而言，醫藥組合物可包括一或多種兩親媒性聚合物及一或多種脂質奈米粒子，包括一或多種不同治療劑及/或預防劑。醫藥組合物可進一步包括一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或附屬成分，諸如本文所述之彼等。醫藥組合物及藥劑之調配及製造的一般指南可例如在Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006中獲得。習知賦形劑及附屬成分可用於任何醫藥組合物中，除非任何習知賦形劑或附屬成分可能與LNP之一或多種組分或本發明調配物中之一或多種兩親媒性聚合物不相容。賦形劑或附屬成分若與組分或兩親媒性聚合物之組合可產生任何不合需要的生物效應或其他有害效應，則其可能與其LNP或調配物之兩親媒性聚合物之組分不相容。

在一些態樣中，組合物可包含醫藥學上可接受之載劑及/或媒劑。在一些態樣中，組合物可進一步包括無熱原質水；等張生理鹽水或緩衝(水性)溶液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽等緩衝溶液。在一些態樣中，組合物可包括含有鈉鹽之水及/或緩衝劑，諸如至少50 mM鈉鹽、鈣鹽，在一些態樣中至少0.01 mM鈣鹽及視情況選用之鉀鹽，在一些態樣中至少3 mM鉀鹽。在一些態樣中，鈉鹽、鈣鹽及視情況鉀鹽可以其鹵化物(例如氯化物、碘化物或溴化物)形式，以其氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫酸鹽等形式存在。鈉鹽之實施例包括例如NaCl、NaI、NaBr、Na ₂CO ₃、NaHCO ₃、Na ₂SO ₄，鉀鹽之實施例包括例如KCl、KI、KBr、K ₂CO ₃、KHCO ₃、K ₂SO ₄，且鈣鹽之實施例包括例如CaCl ₂、CaI ₂、CaBr ₂、CaCO ₃、CaSO ₄、Ca(OH) ₂。在一些態樣中，前述陽離子之有機陰離子可包含於緩衝劑中。在一些態樣中，組合物可包括選自氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl ₂)及氯化鉀(KCl)之鹽，其中除了氯離子以外可存在其他陰離子。CaCl ₂亦可由另一鹽(如KCl)替換。在一些態樣中，注射緩衝液參照特定參考介質可為高張、等張或低張的，亦即緩衝液參照特定參考介質可具有更高、相同或更低的鹽含量，其中可使用前面提及之使由滲透或其他濃度作用所致之細胞損害降至最低的鹽的該等濃度。組合物中鹽之濃度可為約70 mM至約140 mM。舉例而言，鹽濃度可等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、120 mM、130 mM、140 mM、150 mM、160 mM、170 mM、180 mM、190 mM或200 mM，或可來源於其中之任何範圍或值。鹽可呈中性pH，pH 6.5至8.5，pH 7.0至pH 8.0，或pH 7.2至pH 7.6。舉例而言，該鹽之pH可等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，或可來源於其中之任何範圍或值。

在一些態樣中，一或多種賦形劑或附屬成分可佔包括LNP之醫藥組合物之總質量或體積的大於50%。舉例而言，一或多種賦形劑或附屬成分可構成醫藥慣例之50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些態樣中，醫藥學上可接受之賦形劑為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純。賦形劑之實例(指代組合物中不為活性成分之成分)包括但不限於載劑、黏合劑、稀釋劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、緩衝劑、調味劑、崩解劑、包衣、塑化劑、壓縮劑、濕式造粒劑或著色劑。用於本文所揭示之組合物中的防腐劑包括但不限於苯紮氯銨、氯丁醇、對羥基苯甲酸酯及硫柳汞。如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如水、醇/水溶液、生理鹽水溶液、非經腸媒劑，諸如氯化鈉、林格氏右旋糖等)、非水性溶劑(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯)、分散介質、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、流體及營養補充劑，諸如如一般熟習此項技術者將已知之材料及其組合。稀釋劑或者稀釋或稀化劑包括但不限於乙醇、甘油、水、糖(諸如乳糖、蔗糖、甘露糖醇及山梨糖醇)及來源於小麥、玉米水稻及馬鈴薯之澱粉；及纖維素，諸如微晶纖維素。組合物中稀釋劑之量按總組合物之重量計可介於約10%至約90%、約25%至約75%、約30%至約60%、或約12%至約60%之間。

在一些態樣中，賦形劑經批准用於人類及獸醫用途。在一些態樣中，賦形劑經美國食品藥物管理局批准。在一些態樣中，賦形劑為醫藥級。在一些態樣中，賦形劑滿足美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國藥典及/或國際藥典之標準。根據本發明之醫藥組合物中之一或多種兩親媒性聚合物、一或多種脂質奈米粒子、一或多種醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分的相對量將取決於所治療個體之特性、身材及/或條件而變化，且進一步取決於投與組合物之途徑。藉助於實例，醫藥組合物可包含0.1%與100% (wt/wt)之間的一或多種脂質奈米粒子。作為另一實例，醫藥組合物可包含0.1%與15% (重量/體積)之間的一或多種兩親媒性聚合物(例如，0.5%、1%、2.5%、5%、10%或12.5% w/v)。

根據熟知參數調節醫藥組合物中各種組分之pH值及精確濃度。此類培養基及試劑用於醫藥學活性物質之用途在此項技術中熟知。除非任何習知介質或試劑與活性成分不相容，否則涵蓋其在免疫原性及治療組合物中之用途。

在某些態樣中，本發明脂質奈米粒子及/或醫藥組合物經冷藏或冷凍儲存及/或運輸(例如儲存於10℃或更低之溫度下，諸如約4℃之溫度、約-150℃與約10℃之間(例如約10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)之溫度下或約-80℃與約-20℃之間(例如約-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)之溫度下。舉例而言，包含一或多種兩親媒性聚合物及一或多種脂質奈米粒子之醫藥組合物為在例如約-20℃、至-30℃、至-40℃、至-50℃、至-60℃、至-70℃、至-80℃或至-90℃下冷藏儲存及/或運輸之溶液或固體(例如經由凍乾)。

在某些態樣中，本發明亦關於增加脂質奈米粒子之穩定性的方法，其藉由添加有效量的兩親媒性聚合物，及藉由在10℃或更低的溫度，諸如約4℃之溫度、約-150℃與約10℃之間(例如約10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)之溫度或約-80℃與約-20℃之間(例如約-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)之溫度下儲存脂質奈米粒子及/或其藥物組合物來實現。

本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之化學特性可藉由多種方法表徵。舉例而言，顯微法(例如穿透電子顯微法或掃描電子顯微法)可用於檢查LNP之形態及尺寸分佈。動態光散射或電位滴定法(例如，電位滴定)可用於量測ζ電位。動態光散射亦可用於測定粒度。諸如Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK)之儀器亦可用於量測LNP之多重特徵，諸如粒度、多分散性指數及ζ電位。

LNP之平均尺寸可在10 nm與100 nm之間，例如藉由動態光散射(DLS)量測。舉例而言，平均尺寸可為約40 nm至約150 nm，諸如約40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。在一些態樣中，LNP之平均尺寸可為約50 nm至約100 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約60 nm、約60 nm至約100 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約70 nm、約70 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、約80 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm或約90 nm至約100 nm。在某些態樣中，LNP之平均尺寸可為約70 nm至約100 nm。在一特定態樣中，平均尺寸可為約80 nm。在其他態樣中，平均尺寸可為約100 nm。

LNP可為相對均質的。多分散性指數可用於指示LNP之均質性，例如脂質奈米粒子之粒度分佈。小(例如小於0.3)多分散性指數一般指示窄粒度分佈。LNP之多分散性指數可為約0至約0.25，諸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25之多分散性指數。在一些態樣中，LNP之多分散性指數可為約0.10至約0.20。

LNP之ζ電位可用於指示組合物之動電位。舉例而言，ζ電位可描述LNP之表面電荷。具有相對較低電荷(正或負)之脂質奈米粒子通常為合乎需要的，此係帶更高電荷之物質可能不合需要地與細胞、組織及體內之其他元素相互作用。在一些態樣中，LNP之ζ電位可為約-10 mV至約+20 mV、約-10 mV至約+15 mV、約-10 mV至約+10 mV、約-10 mV至約+5 mV、約-10 mV至約0 mV、約-10 mV至約-5 mV、約-5 mV至約+20 mV、約-5 mV至約+15 mV、約-5 mV至約+10 mV、約-5 mV至約+5 mV、約-5 mV至約0 mV、約0 mV至約+20 mV、約0 mV至約+15 mV、約0 mV至約+10 mV、約0 mV至約+5 mV、約+5 mV至約+20 mV、約+5 mV至約+15 mV或約+5 mV至約+10 mV。

治療劑及/或預防劑之囊封效率描述相對於所提供之初始量，在製備之後經囊封或以其他方式與LNP締合的治療劑及/或預防劑之量。囊封效率宜較高(例如接近100%)。囊封效率可例如藉由比較在用一或多種有機溶劑或清潔劑使脂質奈米粒子破裂之前及之後，含有脂質奈米粒子之溶液中治療劑及/或預防劑的量來量測。螢光可用於量測溶液中之游離治療劑及/或預防劑(例如，RNA)之量。對於本文所描述之脂質奈米粒子，治療劑及/或預防劑之囊封效率可為至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些態樣中，囊封效率可為至少80%。在某些態樣中，囊封效率可為至少90%。在一些態樣中，在空白LNP (例如包含本文中列出的脂質但不囊封任何核酸的脂質奈米粒子)存在下產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之LNP囊封效率，與在較少濃度的空白LNP存在下或在空白LNP不存在下由相當的方法產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之LNP囊封效率相比，為約50%或更高、約55%或更高、約60%或更高、約65%或更高、約70%或更高、約75%或更高、約80%或更高、約8%或更高、約90%或更高、約91%或更高、約92%或更高、約93%或更高、約94%或更高、約95%或更高、約96%或更高、約97%或更高、約98%或更高或約99%或更高。

在一些態樣中，電泳(例如毛細電泳)或層析(例如逆相液相層析)可用於檢查mRNA完整性。

在一些態樣中，在空白LNP (例如包含本文中列出的脂質但不囊封任何核酸的脂質奈米粒子)存在下產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之LNP完整性，與在較少濃度的空白LNP存在下或在空白LNP不存在下由相當的方法產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之LNP完整性相比，為約20%或更高、約25%或更高、約30%或更高、約35%或更高、約40%或更高、約45%或更高、約50%或更高、約55%或更高、約60%或更高、約65%或更高、約70%或更高、約75%或更高、約80%或更高、約85%或更高、約90%或更高、約95%或更高、約96%或更高、約97%或更高、約98%或更高或約99%或更高。

在一些態樣中，在空白LNP (例如包含本文中列出的脂質但不囊封任何核酸的脂質奈米粒子)存在下產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之LNP完整性比在較少濃度的空白LNP存在下或在空白LNP不存在下由相當的方法產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之LNP完整性高約5%或更高、約10%或更多、約15%或更多、約20%或更多、約30%或更多、約40%或更多、約50%或更多、約60%或更多、約70%或更多、約80%或更多、約90%或更多、約1倍或更多倍、約2倍或更多倍、約3倍或更多倍、約4倍或更多倍、約5倍或更多倍、約10倍或更多倍、約20倍或更多倍、約30倍或更多倍、約40倍或更多倍、約50倍或更多倍、約100倍或更多倍、約200倍或更多倍、約300倍或更多倍、約400倍或更多倍、約500倍或更多倍、約1000倍或更多倍、約2000倍或更多倍、約3000倍或更多倍、約4000倍或更多倍、約5000倍或更多倍或約10000倍或更多倍。

在一些態樣中，在空白LNP (例如包含本文中列出的脂質但不囊封任何核酸的脂質奈米粒子)存在下產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之Txo%，與在較少濃度的空白LNP存在下或在空白LNP不存在下由相當的方法產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之Txo%相比，為約12個月或更長、約15個月或更長、約18個月或更長、約21個月或更長、約24個月或更長、約27個月或更長、約30個月或更長、約33個月或更長、約36個月或更長、約48個月或更長、約60個月或更長、約72個月或更長、約84個月或更長、約96個月或更長、約108個月或更長、約120個月或更長。在一些態樣中，在空白LNP (例如包含本文中列出的脂質但不囊封任何核酸的脂質奈米粒子)存在下產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之Txo%比在較少濃度的空白LNP存在下或在空白LNP不存在下由相當的方法產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之Txo%長約5%或更高、約10%或更多、約15%或更多、約20%或更多、約30%或更多、約40%或更多、約50%或更多、約60%或更多、約70%或更多、約80%或更多、約90%或更多、約1倍或更多、約2倍或更多倍、約3倍或更多倍、約4倍或更多倍、約5倍或更多倍。

在一些態樣中，在空白LNP (例如包含本文中列出的脂質但不囊封任何核酸的脂質奈米粒子)存在下產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之T1/2，與在較少濃度的空白LNP存在下或在空白LNP不存在下由相當的方法產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之T1/2相比，為約12個月或更長、約15個月或更長、約18個月或更長、約21個月或更長、約24個月或更長、約27個月或更長、約30個月或更長、約33個月或更長、約36個月或更長、約48個月或更長、約60個月或更長、約72個月或更長、約84個月或更長、約96個月或更長、約108個月或更長、約120個月或更長。

在一些態樣中，在空白LNP (例如包含本文中列出的脂質但不囊封任何核酸的脂質奈米粒子)存在下產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之T1/2比在較少濃度的空白LNP存在下或在空白LNP不存在下由相當的方法產生的本發明之LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之T1/2長約5%或更高、約10%或更多、約15%或更多、約20%或更多、約30%或更多、約40%或更多、約50%或更多、約60%或更多、約70%或更多、約80%或更多、約90%或更多、約1 fold或更多、約2倍或更多倍、約3倍或更多倍、約4倍或更多倍、約5倍或更多倍。

如本文所用，「Tx」係指LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之核酸完整性(例如mRNA完整性)降至用於製備LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之核酸(例如mRNA)的初始完整性之約X所持續的時間量。例如，「T80」係指LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之核酸完整性(例如mRNA完整性)降至用於製備LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之核酸(例如mRNA)的初始完整性之約80%所持續的時間量。再例如，「T1/2」係指LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之核酸完整性(例如mRNA完整性)降至用於製備LNP、LNP懸浮液、凍乾LNP組合物或LNP調配物之核酸(例如mRNA)的初始完整性之約1/2所持續的時間量。

LNP中之治療劑及/或預防劑的量可視脂質奈米粒子之尺寸、組合物、所需目標及/或應用，或其他特性以及治療劑及/或預防劑之特性而定。舉例而言，適用於LNP之RNA的量可視RNA之尺寸、序列及其他特徵而定。LNP中治療劑及/或預防劑(亦即醫藥物質)及其他元素(例如脂質)之相對量亦可變化。在一些態樣中，脂質組分與LNP中之治療劑及/或預防劑之wt/wt比可為約5:1至約60:1，諸如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40: 1、45:1、50:1及60:1。舉例而言，脂質組分與治療劑及/或預防劑之wt/wt比可為約10:1至約40:1。在某些態樣中，wt/wt比為約20:1。LNP中治療劑及/或預防劑之量可例如使用吸收光譜(例如紫外輻射可見光譜)量測。

在一些態樣中，LNP中mRNA與脂質比(亦即N:P，其中N表示陽離子脂質之莫耳數，且P表示作為核酸主鏈之一部分存在的磷酸酯莫耳數)在2:1至30:1，例如3:1至22:1範圍內。在其他態樣中，N:P在6:1至20:1或2:1至12:1範圍內。例示性N:P範圍包括約3:1。約6:1、約12:1及約22:1。

IV. RNA轉錄及囊封  在一些態樣中，本文所揭示之RNA藉由活體外轉錄產生。「活體外轉錄」或「IVT」係指在活體外非細胞系統中進行轉錄，產生用於各種應用中之合成RNA產物，包括例如產生蛋白質或多肽的過程。此類合成RNA產物可活體外轉譯或直接引入細胞中，該等產物可在細胞中轉譯。此類合成RNA產物包括例如(但不限於) mRNA、saRNA、反義RNA分子、shRNA分子、長鏈非編碼RNA分子、核糖核酸酶、適體、引導RNA (例如用於CRISPR)、核糖體RNA、小核RNA、小核仁RNA及其類似者。IVT反應通常利用如本文所描述及/或利用之DNA模板(例如，線性DNA模板)、核糖核苷酸(例如，未經修飾之核糖核苷酸三磷酸或經修飾之核糖核苷酸三磷酸)及適當RNA聚合酶。

在一些態樣中，IVT之起始材料可包括線性化DNA模板、核苷酸、核糖核酸酶抑制劑、焦磷酸酶及/或T7 RNA聚合酶。在一些態樣中，IVT過程在生物反應器中進行。生物反應器可包含混合器。在一些態樣中，可在整個IVT過程中將核苷酸添加至生物反應器中。

在一些態樣中，在生物反應器中，在IVT過程後，向包含RNA之IVT混合物中添加一或多種IVT後試劑。例示性IVT後試劑可包括經組態以消化線性化DNA模板之DNAse I以及經組態以消化DNAse I及T7 RNA聚合酶之蛋白酶K。在一些態樣中，在IVT之後，將IVT後試劑與生物反應器中之混合物一起培育。在一些態樣中，生物反應器可含有以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間之IVT混合物：60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490及500或更多公升。IVT混合物可具有以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的RNA濃度：3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90及100 mg/mL或更高的RNA。

在一些態樣中，IVT混合物可包括殘餘亞精胺、殘餘DNA、殘餘蛋白質、肽、HEPES、EDTA、硫酸銨、陽離子(例如Mg ²⁺、Na ⁺、Ca ²⁺)、RNA片段、殘餘核苷酸、游離磷酸根或其任何組合。

在一些態樣中，IVT混合物之至少一部分經過濾。IVT混合物可經由超濾及/或透濾來過濾，從而自IVT混合物移除至少一些雜質及/或改變緩衝溶液獲得至少一部分IVT混合物以產生濃縮RNA溶液作為保留物。

在一些態樣中，「超濾」及「透濾」均係指膜過濾製程。超濾通常使用孔徑為以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的膜：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09及0.1 µm。在一些態樣中，超濾膜通常藉由截留分子量(MWCO)而非孔徑來進行分類。例如，MWCO可為以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：30 kDa、40 kDa、50 kDa、60 kDa、70 kDa、80 kDa、90 kDa、100 kDa、110 kDa、120 kDa、130 kDa、140 kDa、150 kDa、160 kDa、170 kDa、180 kDa、190 kDa、200 kDa、210 kDa、220 kDa、230 kDa、240 kDa、250 kDa、260 kDa、270 kDa、280 kDa、290 kDa、300 kDa、310 kDa、320 kDa、330 kDa、340 kDa、350 kDa、360 kDa、370 kDa、380 kDa、390 kDa、400 kDa、500 kDa、600 kDa、700 kDa、800 kDa、900 kDa、1000 kDa、2000 kDa、3000 kDa、4000 kDa、5000 kDa、6000 kDa、7000 kDa、8000 kDa、9000 kDa及10000 kDa。熟習此項技術者應理解，視應用而定，過濾膜可具有不同的適合材料，包括例如聚合物、纖維素、陶瓷等。在一些態樣中，膜過濾可更合乎大體積純化製程需要。

在一些態樣中，用於純化RNA的IVT混合物之超濾及透濾可包括：(1)直流過濾(DFF)，亦稱為「死端」過濾，其應用垂直於膜表面之進料流且試圖使100%的流體通過膜；及/或(2)切向流過濾(TFF)，亦稱為掃流過濾，其中進料流平行於膜表面遞送，其中一個部分通過膜(滲透物)，而剩餘物(保留物)保留及/或再循環回至進料槽。

在一些態樣中，IVT混合物之過濾係經由TFF進行，該TFF包含超濾步驟、第一透濾步驟及第二透濾步驟。在一些態樣中，第一透濾步驟在硫酸銨存在下進行。第一透濾步驟可經組態以自IVT混合物移除大部分雜質。在一些態樣中，第二透濾步驟在不存在硫酸銨之情況下進行。第二透濾步驟可經組態以將RNA轉移至DS緩衝液調配物中。

可選擇具有適當MWCO之過濾膜用於TFF製程中之超濾。TFF膜之MWCO決定哪些溶質可通過膜進入濾液中及哪些溶質保留在保留物中。TFF膜之MWCO可經選擇，使得實質上所有相關溶質(例如，所需合成RNA物質)保留在保留物中，而非所需組分(例如，過量的核糖核苷酸、小核酸片段(諸如經消化或水解之DNA模板)、肽片段(諸如經消化之蛋白質)及/或其他雜質)遞送至濾液中。在一些態樣中，包含所需合成RNA物質之保留物可再循環至進料儲槽中以在額外循環中再過濾。在一些態樣中，TFF膜可具有等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的MWCO：至少30 kDa、至少40 kDa、至少50 kDa、至少60 kDa、至少70 kDa、至少80 kDa、至少90 kDa或更大。在一些態樣中，TFF膜可具有等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的MWCO：至少100 kDa、至少150 kDa、至少200 kDa、至少250 kDa、至少300 kDa、至少350 kDa、至少400 kDa或更大。在一些態樣中，TFF膜之MWCO可為約250-350 kDa。在一些態樣中，TFF膜(例如基於纖維素之膜)之MWCO可為約30-300 kDa；在一些態樣中，可為約50-300 kDa、約100-300 kDa、或約200-300 kDa。

透濾可不連續地或者連續地進行。舉例而言，在連續透濾中，透濾溶液可以與產生濾液相同的速率添加至樣品進料儲槽中。以此方式，樣品儲槽中之體積保持恆定，但移除可經由膜自由滲透之小分子(例如鹽、溶劑等)。使用溶劑移除作為實例，各額外透濾體積(DV)進一步降低溶劑濃度。在不連續透濾中，溶液首先經稀釋且接著濃縮回至起始體積。隨後重複此製程直至達到儲槽中剩餘之小分子(例如，鹽、溶劑等)之所需濃度。各額外透濾體積(DV)進一步降低小分子(例如溶劑)濃度。連續透濾通常需要用於待過濾分子之給定降低的最小體積。另一方面，不連續透濾允許保留物狀態(諸如pH、鹽含量及其類似者)之快速變化。在一些態樣中，第一透濾步驟以等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的透濾體積進行：至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10個或更大。在一些態樣中，第二透濾步驟以等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的透濾體積進行：至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20個或更大。在一些態樣中，第一透濾步驟以5個透濾體積進行，且第二透濾步驟以10個透濾體積進行。

在一些態樣中，對於超濾及/或透濾，IVT混合物以等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的速率過濾：每小時至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、至少300、至少310、至少320、至少330、至少340、至少350、至少360、至少370、至少380、至少390、至少400、至少410、至少420、至少430、至少440、至少450、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000 L/m ²的過濾面積或更大。濃縮RNA溶液可包含以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的單股RNA：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4及2.5 mg/mL。

在一些態樣中，亦可減少經由過濾獲得RNA產物溶液的濃縮RNA溶液之生物負荷。可使用一或多個過濾器進行過濾以用於減少生物負荷。一或多個過濾器可包括孔徑為0.2 µm、0.45 µm、0.65 µm、0.8 µm或任何其他經組態以移除生物負荷之孔徑的過濾器。

作為一個實例，減少生物負荷可包括對含有獲自超濾及/或透濾之保留物的保留物貯槽進行排液以獲得保留物。減少生物負荷可包括使用洗滌緩衝溶液來沖洗用於超濾及/或透濾之過濾系統，以獲得包含過濾系統中剩餘之殘餘RNA的洗滌池溶液。可過濾保留物以獲得經過濾之保留物。可使用第一0.2 µm過濾器過濾洗滌池溶液以獲得經過濾之洗滌池溶液。可使用第一0.2 µm過濾器或另一0.2 µm過濾器來過濾保留物。

可合併經過濾之洗滌彙集溶液及經過濾之保留物以形成經合併之彙集溶液。可使用第二0.2 µm過濾器來過濾合併彙集溶液以獲得經過濾之合併彙集溶液，該經過濾之合併彙集溶液使用第三0.2 µm過濾器進一步過濾以產生RNA產物溶液。

RNA產物溶液中之RNA可經囊封，且RNA溶液可進一步包含至少一種囊封劑。在一個態樣中，囊封劑包含脂質、脂質奈米粒子(LNP)、脂質複合物、聚合物粒子、聚合複合物及整體型遞送系統以及其組合。在一個態樣中，囊封劑為脂質，且產生脂質奈米粒子(LNP)囊封之RNA。在一些態樣中，LNP可經設計以保護RNA (例如saRNA、mRNA)免受細胞外核糖核酸酶破壞，及/或可經工程改造以用於將RNA全身遞送至目標細胞。在一些態樣中，當將RNA靜脈內投與至有需要之個體時，此類LNP可尤其適用於遞送RNA (例如saRNA、mRNA)。在一些態樣中，當RNA肌肉內投與至有需要之個體時，此類LNP可尤其適用於遞送RNA (例如saRNA、mRNA)。

在一些態樣中，所提供之RNA (例如saRNA、mRNA)可用LNP調配。在各種態樣中，此類LNP之平均尺寸(例如平均直徑)可等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約50 nm至約130 nm、約50 nm至約110 nm、約50 nm至約100 nm、約50至約90 nm或約60 nm至約80 nm或約60 nm至約70 nm。在一些態樣中，根據本發明可能適用之LNP的平均尺寸(例如平均直徑)可等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：約50 nm至約100 nm。在一些態樣中，LNP之平均尺寸(例如平均直徑)可小於80 nm、小於75 nm、小於70 nm、小於65 nm、小於60 nm、小於55 nm、小於50 nm或小於45 nm。在一些態樣中，根據本發明可能適用之LNP的平均尺寸(例如平均直徑)可等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：約45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。

在某些態樣中，核酸(例如RNA)當存在於所提供之LNP中時，在水溶液中對核酸酶降解具有抗性。在一些態樣中，LNP為靶向肝臟之脂質奈米粒子。在一些態樣中，LNP為包含一或多種陽離子脂質(例如本文所述者)的陽離子脂質奈米粒子。在一些態樣中，陽離子LNP可包含至少一種陽離子脂質、至少一種聚合物結合脂質及至少一種輔助脂質(例如至少一種中性脂質)。

在一些態樣中，藉由將由本文所述之RNA溶液(例如RNA產物溶液)及本文所述之脂質製劑(包含例如至少一種陽離子脂質及視情況選用之一或多種其他脂質組分於有機溶劑中)在引起脂質組分之溶解度突然改變的條件下快速混合，驅使脂質以LNP形式自組裝，來產生經LNP囊封之RNA。在一些態樣中，適合的緩衝劑包含tris、組胺酸、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽或丁二酸鹽。在製備液態的經LNP囊封之RNA調配物期間的pH值與囊封劑(例如陽離子脂質)之pKa有關。酸化緩衝液之pH可比囊封劑(例如陽離子脂質)之pKa小至少一半pH標度，且最終緩衝液之pH可比囊封劑(例如陽離子脂質)之pKa大至少一半pH標度。在一些態樣中，選擇陽離子脂質之特性以使得粒子之初始形成係藉由與核酸(例如RNA)之帶相反電荷之主鏈締合而發生。以此方式，粒子圍繞核酸而形成，例如在一些態樣中，該等粒子產生的囊封效率可比其在不存在核酸與脂質組分中之至少一者之間的相互作用的情況下產生的囊封效率高得多。在一些態樣中，在製備經LNP囊封之RNA期間的pH與在製備經LNP囊封之RNA後的經LNP囊封之RNA的pH不同。

在一個態樣中，RNA溶液中之RNA之濃度＜ 1 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少約0.05 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少約0.5 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少約1 mg/mL。在另一態樣中，RNA濃度為約0.05 mg/mL至約0.5 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少10 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少50 mg/mL。在一些態樣中，RNA之濃度等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：約0.05 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL或更高。

在另一態樣中，RNA溶液及脂質製劑混合物進一步包含穩定劑。在一些態樣中，穩定劑包含蔗糖、甘露糖、山梨糖醇、棉子糖、海藻糖、甘露糖醇、肌醇、氯化鈉、精胺酸、乳糖、羥乙基澱粉、聚葡萄糖、聚乙烯吡咯啶酮、甘胺酸或其組合。在一特定態樣中，穩定劑為蔗糖。在一特定態樣中，穩定劑為海藻糖。在一特定態樣中，穩定劑為蔗糖及海藻糖之組合。在一些態樣中，穩定劑濃度包括但不限於約10 mg/mL至約400 mg/mL、約100 mg/mL至約200 mg/mL或約103 mg/mL至約200 mg/mL之濃度。在一些態樣中，穩定劑之濃度等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：10 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL、103 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL或更高。在一些態樣中，組合物中之穩定劑之濃度為約1%至約30% w/v。舉例而言，穩定劑之濃度可等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30% w/v，或可來源於其中之任何範圍或值。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)之濃度為10.3%。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)之濃度為15.4%。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)之濃度為20.5%。

在另一態樣中，穩定劑之質量的量與RNA之質量的量呈特定比率。在一個態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過5000。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過2000。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過1000。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過500。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過100。在另一態樣中，穩定劑與醫藥物質之質量的量之比率不超過50。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過10。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過1。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過0.5。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量之比率不超過0.1。在另一態樣中，穩定劑及RNA包含約200-2000:1之質量比的穩定劑及RNA。在另一態樣中，RNA為saRNA且穩定劑為蔗糖。

在一些態樣中，RNA溶液及脂質製劑混合物進一步包含鹽。在一個態樣中，鹽為鈉鹽。在一特定態樣中，鹽為NaCl。在一些態樣中，RNA溶液及脂質製劑混合物進一步包含界面活性劑、防腐劑、任何其他賦形劑或其組合。如本文所使用，「任何其他賦形劑」包括但不限於抗氧化劑、麩胱甘肽、EDTA、甲硫胺酸、甲磺酸去鐵胺(desferal)、抗氧化劑、金屬清除劑或游離基清除劑。在一個態樣中，界面活性劑、防腐劑、賦形劑或其組合係選自注射用無菌水(sWFI)、注射用抑菌水(BWFI)、生理鹽水、右旋糖溶液、聚山梨醇酯、泊洛沙姆、Triton、二價陽離子、林格氏乳酸鹽、胺基酸、糖、多元醇、聚合物或環糊精。

在一些態樣中，RNA溶液及/或脂質製劑混合物進一步包含至少一種游離胺基酸。在某些情況下，將至少一種游離胺基酸內部裝載於經LNP囊封之RNA中。舉例而言，在一些情況下，至少一種游離胺基酸可溶於水且與本文所描述之RNA溶液(例如RNA產物溶液)組合。在一些情況下，至少一種游離胺基酸可溶於乙醇中且與本文所描述之脂質製劑(包含例如至少一種陽離子脂質及視情況選用之一或多種其他脂質組分於有機溶劑中)組合。在一些情況下，至少一種游離胺基酸可溶於水及/或乙醇中且與本文所述之RNA溶液(例如RNA產物溶液)及本文所述之脂質製劑(包含例如至少一種陽離子脂質及視情況選用之一或多種其他脂質組分於有機溶劑中)組合。以此方式，至少一種游離胺基酸包含於經LNP囊封之RNA中。

替代地或另外，除在內部用至少一種游離胺基酸裝載經LNP囊封之RNA以外，預形成之經LNP囊封之RNA可在外部負載有至少一種游離胺基酸。舉例而言，在一些情況下，根據本文所描述之方法生產之經LNP囊封之RNA與至少一種游離胺基酸組合。

在一些態樣中，RNA溶液及脂質製劑混合物中包括緩衝劑、穩定劑、鹽、界面活性劑、防腐劑及賦形劑中之各者。在其他態樣中，緩衝劑、穩定劑、鹽、界面活性劑、防腐劑及賦形劑中之任何一或多者可自RNA溶液及脂質製備混合物排除。

V.  RNA免疫原組合物及/或疫苗  視感染之流行率或未滿足之醫療需求的程度或水平而定，RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗可用於各種環境中。RNA免疫原組合物及/或疫苗可用於治療及/或預防具有各種基因型、病毒株及分離株之流感病毒。RNA免疫原組合物及/或疫苗通常具有優異的特性，因為其與市售抗病毒治療性治療相比產生高得多的抗體效價且產生反應更早。雖然不希望受理論束縛，但咸信RNA免疫原組合物及/或疫苗作為mRNA聚核苷酸經較好地設計以在轉譯後產生適當蛋白質構形作為RNA免疫原組合物及/或疫苗共同選擇天然細胞機構。不同於離體製造且可觸發非所需細胞反應的傳統疫苗，RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗係以更天然的方式呈現給細胞系統。

可存在個人處於感染超過一種流感病毒株之風險下的情形。RNA (例如mRNA)免疫原組合物，諸如治療性疫苗由於多種因素而尤其適合於組合疫苗接種方法，該等因素包括但不限於製造速度、快速調整疫苗適應察覺到的地理位置威脅的能力及其類似因素。此外，因為免疫原組合物及/或疫苗利用人體產生抗原性蛋白，所以免疫原組合物及/或疫苗能夠在人類個體中產生較大、較複雜的抗原性蛋白，從而允許適當摺疊、表面表現、抗原呈現等。為避免超過一種流感病毒株，可投與的組合疫苗包括編碼第一流感病毒或生物體之至少一種抗原性多肽蛋白質(或其抗原部分)的RNA (例如mRNA)且進一步包括編碼第二流感病毒或生物體之至少一種抗原性多肽蛋白質(或其抗原部分)的RNA。RNA (例如mRNA)可共調配於例如單一脂質奈米粒子(LNP)中或可調配於單獨LNP中以用於共投與。

本發明之一些態樣提供病毒疫苗(或組合物或免疫原組合物)，其包括至少一種具有編碼至少一種病毒抗原性多肽或其免疫原片段(例如能夠誘導針對該病毒之免疫反應的免疫原片段)的開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。可提供具有編碼至少一種病毒抗原性多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸的病毒之代表性但非限制性清單包括但不限於沙狀病毒(諸如賴薩病毒或淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV))；星狀病毒；崩芽病毒(諸如漢坦病毒)；杯狀病毒；冠狀病毒(諸如嚴重急性呼吸道症候群病毒(SARS)-例如SARS-CoV-1或中間呼吸道症候群(MERS)病毒)；絲狀病毒(諸如伊波拉病毒或馬堡病毒)；黃病毒(諸如黃熱病病毒、西尼羅河病毒或C型肝炎病毒(HCV))；嗜肝DNA病毒；肝炎病毒；正黏液病毒(諸如A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒)；副黏病毒(諸如紅疹病毒或腮腺炎病毒)；小RNA病毒(諸如脊髓灰白質炎病毒、A型肝炎病毒或鼻病毒)；里奧病毒(諸如輪狀病毒)；反轉錄病毒(諸如人類免疫缺乏病毒(HIV)或人類嗜T淋巴球病毒(HTLV))；棒狀病毒(諸如狂犬病病毒(Rabies virus/Rabies lyssavirus))；披衣病毒(諸如辛得比斯病毒(SINV)、東部馬腦炎病毒(EEEV)、西部馬腦炎病毒(WEEV)或風疹病毒)。

疫苗可包括具有編碼至少一種來源於例如以下之抗原性多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸：鮑氏不動桿菌、邊蟲屬、嗜吞噬細胞無形體、巴西鉤蟲、十二指腸鉤蟲、溶血隱秘桿菌、蛔蟲、麴菌屬、星狀病毒科、巴貝蟲屬、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、韓瑟勒巴通氏菌、BK病毒、人芽囊原蟲、皮炎芽生菌、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋體、疏螺旋體屬、疏螺旋體屬、布魯桿菌屬、馬來絲蟲、布尼亞病毒科、洋蔥伯克氏菌及其他伯克氏菌種、鼻疽伯克氏菌、類鼻疽伯克氏菌、杯狀病毒科、彎曲桿菌屬、白色念珠菌、念珠菌屬、沙眼披衣菌、肺炎嗜衣原體、鸚鵡披衣菌、CJD朊病毒、華支睾吸蟲、肉毒桿菌、艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、產氣莢膜梭菌、梭菌屬、破傷風梭菌、球孢子菌屬、冠狀病毒、白喉棒狀桿菌、貝氏考克斯菌、克里米亞-岡果出血熱病毒、新型隱球菌、隱孢子蟲屬、巨細胞病毒(CMV)、登革病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4)、脆雙核阿米巴、伊波拉病毒(EBOV)、胞蟲屬、查菲艾利希體、尤溫艾利希體、艾利希體屬、溶組織內阿米巴、腸球菌屬、腸病毒屬、腸病毒、主要科沙奇A病毒及腸病毒71 (EV71)、表皮癬菌屬、埃-巴二氏病毒(EBV)、大腸桿菌01 57:H7、01 1 1及O104:H4、肝片吸蟲及巨大肝蛭、FFI朊病毒、絲蟲總科超家族、黃病毒、土拉文氏桿菌、梭桿菌屬、白地絲黴菌、腸鞭毛蟲、頷口蟲屬、GSS朊病毒、瓜納瑞托病毒、杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、幽門螺旋桿菌、亨尼帕病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、單純疱疹病毒1及2 (HSV-1及HSV-2)、莢膜組織胞漿菌、人類免疫缺乏病毒(HIV)、威尼克外瓶黴、人類博卡病毒(HBoV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)及人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類間質肺炎病毒(hMPV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、人類副流行性感冒病毒(HPIV)、日本腦炎病毒、JC病毒、胡甯病毒、金氏金氏菌、肉芽腫克雷伯氏菌、庫魯病朊病毒、賴薩病毒、嗜肺性退伍軍人桿菌、利什曼原蟲屬、鉤端螺旋體屬、產單核細胞李斯特氏菌、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、馬丘波病毒、馬拉色菌屬、馬堡病毒、麻疹病毒、橫川後殖吸蟲、微孢子蟲門、傳染性軟疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻風分支桿菌及彌漫型痲瘋分枝桿菌、結核分支桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎黴漿菌、變形纖毛蟲、美洲鉤蟲、淋病奈瑟氏菌、奈瑟氏腦膜炎菌、星形土壤絲菌、諾卡菌屬、人蟠尾絲蟲、恙蟲病東方體、正黏液病毒科家族(流感)、巴西副球孢子菌、並殖吸蟲屬、衛氏並殖吸蟲、細小病毒B1 9、巴氏桿菌屬、瘧原蟲屬、傑氏肺囊蟲、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、鼻病毒、鼻病毒、痘立克次體、立克次體屬、普氏立克次體、落磯山熱立克次體、傷寒立克次體、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒、輪狀病毒、風疹病毒、薩比亞病毒、沙門氏菌屬、疥蟎、SARS冠狀病毒、住血吸蟲屬、志賀氏桿菌屬、辛諾柏病毒、漢坦病毒、申克孢子絲菌、葡萄球菌屬、葡萄球菌屬、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、腸類圓線蟲、條蟲屬、有鉤條蟲、蜱傳腦炎病毒(TBEV)、犬蛔蟲或貓蛔蟲、弓蟲、梅毒螺旋體、旋毛蟲、陰道毛滴蟲、發癬菌屬、毛首鞭形線蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、解脲支原體、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、大天花或小天花、vCJD朊病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、霍亂弧菌、西尼羅河病毒、西部馬腦炎病毒、潘氏絲狀蟲、黃熱病病毒、小腸結腸炎耶爾森氏菌、鼠疫耶爾森菌及假結核耶爾森菌。

本發明之一些態樣提供流感病毒(流感病毒)疫苗(或組合物或免疫原組合物)，其包括至少一種具有編碼至少一種流感抗原性多肽或其免疫原片段(例如能夠誘導針對流感之免疫反應的免疫原片段)之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。

在一些態樣中，至少一種抗原性多肽為HA之經界定之抗原子域中之一者，稱為HA1、HA2或HA1及HA2之組合，及至少一種選自神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)之抗原性多肽。

在一些態樣中，至少一種抗原性多肽為包含來自HA1及/或HA2之抗原性序列的HA或其衍生物，及至少一種選自NA、NP、M1、M2、NS1及NS2之抗原性多肽。

在一些態樣中，至少一種抗原性多肽為包含來自HA1及/或HA2之抗原性序列的HA或其衍生物，及至少兩種選自NA、NP、M1、M2、NS1及NS2之抗原性多肽。

在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼流感病毒蛋白質或其免疫原片段之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。

在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼多種流感病毒蛋白質或其免疫原片段之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼HA蛋白質或其免疫原片段(例如至少一個HA1、HA2或兩者之組合)之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。

在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如至少一個HA1、HA2或兩者之組合，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18中之任一者或其中之任何或全部的組合)之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸，及至少一種具有編碼選自以下之蛋白質的開放閱讀框架的其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸：獲自流感病毒之NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白及NS2蛋白。

在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18中之任一者或其中之任何或全部的組合中的至少一者)之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸，及至少兩種具有編碼兩個選自以下之兩種蛋白質的開放閱讀框架的其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸：獲自流感病毒之NP蛋白質、NA蛋白質、M1蛋白質、M2蛋白質、NS1蛋白質及NS2蛋白質。

在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18中之任一者或其中之任何或全部的組合中的至少一者)之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸，及至少三種具有編碼三個選自以下之三種蛋白質的開放閱讀框架的其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸：獲自流感病毒之NP蛋白質、NA蛋白質、M蛋白質、M2蛋白質、NS1蛋白質及NS2蛋白質。

在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18中之任一者或其中之任何或全部的組合中的至少一者)之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸，及至少四種具有編碼四個選自以下之四種蛋白質的開放閱讀框架的其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸：獲自流感病毒之NP蛋白質、NA蛋白質、M1蛋白質、M2蛋白質、NS1蛋白質及NS2蛋白質。

在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18中之任一者或其中之任何或全部的組合中的至少一者)之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸，及至少五種具有編碼五個選自以下之五種蛋白質的開放閱讀框架的其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸：獲自流感病毒之NP蛋白質、NA蛋白質、M1蛋白質、M2蛋白質、NS1蛋白質及NS2蛋白質。

在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少一種具有編碼以下之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸：HA蛋白或其免疫原片段(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18中之任一者或其中之任何或全部的組合中的至少一者)、NP蛋白或其免疫原片段、NA蛋白或其免疫原片段、M1蛋白或其免疫原片段、M2蛋白或其免疫原片段、NS1蛋白或其免疫原片段及獲自流感病毒之NS2蛋白或其免疫原片段。

本發明之一些態樣提供以下新穎流感病毒多肽序列：H1HA10-Foldon_ΔNgly1；H1HA10TM-PR8 (H1 A/Puerto Rico/8/34 HA)；H1HA10-PR8-DS (H1 A/Puerto Rico/8/34 HA；pH1HA10-Cal04-DS (H1 A/California/04/2009 HA)；來自California 04之流行性H1HA10；pH1HA10-鐵蛋白；HA10；來自California 04之流行性H1HA10；來自California 04病毒株之流行性H1HA10/無摺疊子且具有用於三聚的K68C/R76C突變；來自A/Puerto Rico/8/34病毒株之H1HA10，無摺疊子且具有用於三聚之Y94D/N95L突變；來自A/Puerto Rico/8/34病毒株之H1HA10，無摺疊子且具有用於三聚之K68C/R76C突變；H1N1 A/Viet Nam/850/2009；H3N2 A/Wisconsin/67/2005；H7N9 (A/Anhui/1/2013)；H9N2 A/Hong Kong/1073/99；H10N8 A/JX346/2013。

本發明之一些態樣提供流感病毒(流感)免疫原組合物及/或疫苗，其包括至少一種具有編碼至少一種流感抗原性多肽之開放閱讀框架或上文所描述之新穎流感病毒多肽序列之免疫原片段(例如能夠誘導針對流感之免疫反應的免疫原片段)的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，流感疫苗包含至少一種具有編碼至少一種流感抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸，該流感抗原性多肽包含與上文所描述之新穎流感病毒序列之胺基酸序列至少75% (例如，75%與100%之間的任何數值(包括端點)，例如70%、80%、85%、90%、95%、99%及100%)一致的經修飾序列。經修飾序列可與上文所述之新穎流感病毒序列之胺基酸序列至少75% (例如，75%與100%之間的任何數值(包括端點)，例如70%、80%、85%、90%、95%、99%及100%)一致。本發明之一些態樣提供經分離之核酸，其包含編碼上文所描述之新穎流感病毒多肽序列之序列；包含核酸之表現載體；及包含核酸之宿主細胞。本發明亦提供產生上文所描述之新穎流感病毒序列中之任一者之多肽的方法。方法可包括在培養基中在允許上文所描述之新穎流感病毒序列之核酸表現的條件下培養宿主細胞，及自所培養細胞或細胞培養基純化新穎流感病毒多肽。本發明亦提供針對新穎流感病毒序列之抗體分子，包括全長抗體及抗體衍生物。

在一些態樣中，RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗之開放閱讀框架經密碼子最佳化。在一些態樣中，RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗進一步包含佐劑。在一些態樣中，至少一個RNA聚核苷酸編碼至少一種附接至細胞受體之流感抗原性多肽。在一些態樣中，至少一個RNA聚核苷酸編碼引起病毒與細胞膜融合之至少一種流感抗原性多肽。在一些態樣中，至少一個RNA聚核苷酸編碼至少一種引起病毒與所感染細胞之結合的流感抗原性多肽。本發明之一些態樣提供一種免疫原組合物及/或疫苗，其包括至少一種具有編碼至少一種流感抗原性多肽之開放閱讀框架、至少一個5'端帽及至少一個化學修飾的調配於脂質奈米粒子內之核糖核酸(RNA) (例如mRNA)聚核苷酸。

在一些態樣中，5'端帽為7mG(5')ppp(5')NlmpNp。在一些態樣中，至少一個化學修飾係選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿苷。在一些態樣中，化學修飾位於尿嘧啶之5-位置中。在一些態樣中，化學修飾為N1-甲基假尿苷。在一些態樣中，化學修飾為N1-乙基假尿苷。

在一些態樣中，脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子脂質。在一些態樣中，陽離子脂質為可電離陽離子脂質且非陽離子脂質為中性脂質，且固醇為膽固醇。在一些態樣中，陽離子脂質係選自由以下組成之群：2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基) 9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)。

本發明之一些態樣提供一種免疫原組合物及/或疫苗，其包括至少一種具有編碼至少一種抗原，諸如流感抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其中開放閱讀框架中之尿嘧啶的至少80% (例如85%、90%、95%、98%、99%)具有化學修飾，視情況其中免疫原組合物及/或疫苗調配於脂質奈米粒子(例如包含陽離子脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子脂質的脂質奈米粒子)中。在一些態樣中，開放閱讀框架中100%尿嘧啶具有化學修飾。在一些態樣中，化學修飾位於尿嘧啶之5-位置中。在一些態樣中，化學修飾為N1-甲基假尿苷。在一些態樣中，開放閱讀框架中100%尿嘧啶具有尿嘧啶之5-位置中之N1-甲基假尿苷。

在一些態樣中，RNA (例如mRNA)聚核苷酸之開放閱讀框架編碼至少一種抗原，諸如流感抗原性多肽。在一些態樣中，開放閱讀框架編碼至少兩種、至少五種或至少十種抗原性多肽。在一些態樣中，開放閱讀框架編碼至少100種抗原性多肽。在一些態樣中，開放閱讀框架編碼1至100種抗原性多肽。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少兩種各自具有編碼至少一種流感抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少五種或至少十種各自具有編碼至少一種抗原性多肽或其免疫原片段的開放閱讀框架的RNA(例如mRNA)聚核苷酸。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含至少100種各自具有編碼至少一種抗原性多肽的開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗包含2-100種各自具有編碼至少一種抗原性多肽的開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。

本文亦提供前述段落中任一項之在奈米粒子(例如脂質奈米粒子)中調配的流感RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗。在一些態樣中，奈米粒子具有50-200 nm之平均直徑。在一些態樣中，奈米粒子為脂質奈米粒子。在一些態樣中，脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子脂質。在一些態樣中，脂質奈米粒子包含約20-60%陽離子脂質、0.5-15%經PEG改質之脂質、25-55%固醇及25%非陽離子脂質的莫耳比。在一些態樣中，陽離子脂質為可電離陽離子脂質且非陽離子脂質為中性脂質，且固醇為膽固醇。在一些態樣中，奈米粒子之多分散性值小於0.4 (例如小於0.3、0.2或0.1)。在一些態樣中，奈米粒子在中性pH值下具有淨中性電荷。

本發明之一些態樣提供誘導個體之抗原特異性免疫反應之方法，其包含以可有效產生抗原特異性免疫反應之量向該個體投與如本文所提供之RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗中之任一者。在一些態樣中，RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗為流感免疫原組合物及/或疫苗。在一些態樣中，RNA (例如mRNA)疫苗為包含流感疫苗(廣譜流感疫苗)之組合的組合疫苗。在一些態樣中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應或B細胞反應。在一些態樣中，產生抗原特異性免疫反應之方法包含向個體投與單次劑量(無加強劑量)本發明之流感RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗。在一些態樣中，方法進一步包含向個體投與第二(加強)劑量之流感RNA (例如mRNA)疫苗。可投與額外劑量之流感RNA (例如mRNA)免疫原組合物及/或疫苗。

在一些態樣中，在免疫原組合物及/或疫苗之第一劑量或第二(加強)劑量之後，個體展現至少80% (例如至少85%、至少90%或至少95%)之血清轉化率。血清轉化為特異性抗體在該期間產生且在血液中變得可偵測的時間段。在出現血清轉化之後，可在抗體之血液測試中偵測到病毒。在感染或免疫期間，抗原進入血液，且免疫系統作為反應開始產生抗體。在血清轉化之前，抗原本身可為或可不為可偵測的，但抗體視為不存在。在血清轉化期間，存在抗體，但其尚不可被偵測到。在血清轉化之後的任何時間，可在血液中偵測到抗體，指示先前或當前感染。

投與本文所述之免疫原組合物，諸如疫苗，諸如流感RNA (例如mRNA)疫苗可經由用於提供類似效用之藥劑的任一公認投與模式進行。免疫原組合物可調配成固體、半固體、液體或氣體形式之製劑，諸如錠劑、膠囊、散劑、顆粒、軟膏、溶液、懸浮液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體及氣溶膠。投與此類免疫原組合物之典型途徑包括但不限於經口、局部、經皮、吸入、非經腸、舌下、經頰、經直腸、經陰道及鼻內。如本文所用，術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、皮內、胸骨內注射或輸注技術。本文所述之免疫原組合物經調配以允許在向患者投與組合物後其中所含之活性成分為生物可用的。將向個體或患者投與之免疫原組合物採取一或多個劑量單位形式，其中例如錠劑可為單一劑量單位，且具有呈氣溶膠形式之化合物之容器可容納複數個劑量單位。待投與之免疫原組合物將在任何情況下含有治療有效量之本發明範疇內的化合物或其醫藥學上可接受之鹽，用於根據本文所述之教示治療或預防相關疾病或病況。

在本發明之範疇內的免疫原組合物可呈固體或液體形式。在一個態樣中，載劑為微粒，使得免疫原組合物例如呈錠劑或散劑形式。載劑可為液體，其中免疫原組合物為例如口服糖漿、可注射液體或適用於例如吸入劑投與之氣溶膠。當意欲經口投與時，免疫原組合物較佳呈固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液及凝膠形式包括在本文視為固體或液體之形式內。作為用於經口投與之固體組合物，免疫原組合物可調配成散劑、顆粒、壓縮錠劑、丸劑、膠囊、口嚼錠、粉片或其類似形式。該固體組合物典型地含有一或多種惰性稀釋劑或可食載劑。另外，可存在或不包括以下中之一或多者：黏合劑，諸如羧基甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉、乳糖或糊精；崩解劑，諸如褐藻酸、褐藻酸鈉、澱粉羥基乙酸鈉、玉米澱粉及其類似物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotex；助流劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或柑橘調味劑；及著色劑。當免疫原組合物呈膠囊，例如明膠膠囊形式時，除以上類型之材料以外，其可含有液體載劑，諸如聚乙二醇或油。免疫原組合物可呈液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。舉兩個例子，液體可用於經口投與或用於藉由注射遞送。當意欲經口投與時，較佳組合物除本發明化合物之外亦含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑及香味增強劑中之一或多者。在意欲藉由注射投與之免疫原組合物中，可包括或不包括界面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑及等張劑中之一或多者。

液體免疫原組合物，無論其為溶液、懸浮液或其他類似形式，均可包括或不包括以下佐劑中之一或多者：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液(較佳生理鹽水)、林格氏溶液、等張氯化鈉、不揮發性油(諸如可充當溶劑或懸浮介質之合成單酸甘油酯或二酸甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝液，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖；充當低溫保護劑之試劑，諸如蔗糖或海藻糖。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水係較佳佐劑。可注射醫藥組合物較佳地為無菌的。意欲非經腸或經口投與之液體免疫原組合物應含有一定量之化合物，使得將獲得適合劑量。

免疫原組合物可藉由醫藥技術中熟知之方法製備。舉例而言，意欲藉由注射投與之醫藥組合物可藉由將mRNA與無菌蒸餾水或其他載劑組合以便形成溶液來製備。可添加界面活性劑以促進形成均質溶液或懸浮液。界面活性劑為與同本文中之教示一致的化合物非共價相互作用以便促進該化合物溶解或均勻懸浮於水性遞送系統中的化合物。

在一些態樣中，免疫原組合物，諸如流感RNA (例如mRNA)疫苗係藉由皮內注射、肌肉內注射或藉由鼻內投與向個體投與。在一些態樣中，免疫原組合物，諸如流感RNA (例如mRNA)疫苗藉由肌肉內注射投與個體。

本發明之一些態樣提供誘導個體之抗原特異性免疫反應之方法，其包括以有效量向個體投與免疫原組合物，諸如流感RNA (例如mRNA)疫苗，以在個體中產生抗原特異性免疫反應。在一些態樣中，可藉由在向個體投與本發明之免疫原組合物及/或疫苗中之任一者之後分析抗體效價(抗體與流感抗原性多肽結合之效價)來測定個體中之抗原特異性免疫反應。在一些態樣中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價的對數增加至少1。在一些態樣中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價的對數增加1-3。在一些態樣中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價增加至少2倍。在一些態樣中，相對於對照，個體中所產生之抗抗原性多肽抗體效價增加至少5倍。在一些態樣中，相對於對照，個體中所產生之抗抗原性多肽抗體效價增加至少10倍。在一些態樣中，相對於對照，個體中所產生之抗抗原性多肽抗體效價增加2-10倍。在一些態樣中，對照為在尚未投與本發明之免疫原組合物，諸如本發明之RNA (例如mRNA)疫苗之個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價。在一些態樣中，對照為在已投與減毒活流感或不活化流感之個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價，或其中對照物為在已投與重組型或純化型流感蛋白疫苗之個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價。在一些態樣中，對照為產生於已投與流感病毒樣粒子(VLP)疫苗之個體中的抗抗原性多肽抗體效價。

以有效量(有效誘導免疫反應之量)向個體投與本發明之免疫原組合物，諸如RNA(例如mRNA)疫苗。在一些態樣中，有效量為等效於標準照護免疫原組合物(諸如重組型流感蛋白疫苗)之標準照護劑量減少至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍的劑量。其中在該個體中產生的該抗抗原性多肽抗體效價等效於投與該標準照護療法免疫原組合物(諸如重組型流感蛋白疫苗、純化型流感蛋白疫苗、減毒活流感疫苗、不活化流感疫苗或流感VLP疫苗)的標準照護劑量的對照個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價。在一些態樣中，有效量為等效於在標準照護劑量之標準照護免疫原組合物，諸如重組型流感病毒蛋白疫苗中減少2-1000倍的劑量，其中在個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價等於在投與標準照護劑量之標準照護療法免疫原組合物(諸如重組型流感蛋白疫苗、純化流感蛋白疫苗、減毒活流感疫苗、不活化流感疫苗或流感VLP疫苗)的對照個體中產生的抗抗原性多肽抗體效價。在一些態樣中，對照為產生於已投與包含流感之結構蛋白的病毒樣粒子(VLP)疫苗的個體中的抗抗原性多肽抗體效價。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗係以有效量調配以在個體中產生抗原特異性免疫反應。在一些態樣中，該有效量為25 μg至1000 μg或50 μg至1000 μg之總劑量。在一些態樣中，有效量為100 μg總劑量。在一些態樣中，該有效量為向個體投與25 μg之劑量總共兩次。在一些態樣中，該有效量為向該個體投與之100 μg劑量總共兩次。在一些態樣中，該有效量為向個體投與400 μg之劑量總共兩次。在一些態樣中，該有效量為向該個體投與之500 μg劑量總共兩次。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物及/或疫苗之功效(或有效性)大於60%。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗含有編碼至少一種流感抗原性多肽之RNA (例如mRNA)。

免疫原組合物功效可使用標準分析評定。舉例而言，免疫原組合物功效可藉由雙盲、隨機、臨床試驗量測。免疫原組合物功效可表示為未經疫苗接種(ARU)與投與本發明之免疫原組合物而經疫苗接種(ARV)的研究小組之間的疾病攻擊率(AR)之成比例減小，且可由使用下式之疫苗接種組中疾病之相對風險(RR)計算：功效=(ARU-ARV)/ARU×100；及功效=(1-RR)×100。同樣地，免疫原組合物有效性可使用標準分析評定。免疫原組合物有效性為對免疫原組合物(其可能已證實具有高功效)如何減少群體之疾病的評定。此量測可評定在自然野外條件下而非在受控臨床試驗中免疫原組合物投與計劃，而不僅免疫原組合物本身之益處及不良影響之淨平衡。免疫原組合物有效性與免疫原組合物功效(效能)成比例，但亦受以下影響：群體中之目標基團免疫之程度，以及影響住院治療、能走動問診或成本之『真實世界』結果的其他非免疫原組合物相關因素。舉例而言，可使用回溯性病例控制分析，其中比較一組感染病例及適當對照當中的免疫原組合物投與速率。儘管投與免疫原組合物，但免疫原組合物有效性可表示為率差，其中針對產生感染，使用幾率比(OR)：有效性= (1-OR)×100。在一些態樣中，本文揭示之免疫原組合物之功效(或有效性)為至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%。

在一些態樣中，免疫原組合物使個體針對產生抗原之生物體、病毒或細胞(諸如流感)免疫至多2年。在一些態樣中，免疫原組合物使個體免疫超過2年、超過3年、超過4年或5至10年。在一些態樣中，個體為約5歲或更小。舉例而言，個體年齡可在約1歲與約5歲之間(例如約1、2、3、5或5歲)，或年齡在約6個月與約1歲之間(例如約6、7、8、9、10、11或12個月)。在一些態樣中，個體係約12個月或更小(例如12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2個月或1個月)。在一些態樣中，個體係約6個月或更小。在一些態樣中，個體為足月出生(例如約37-42週)。在一些態樣中，個體早產，例如在妊娠約36週或更早(例如約36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25週)。舉例而言，個體可能在妊娠約32週或更早出生。在一些態樣中，個體在妊娠約32週與約36週之間早產。在此類個體中，免疫原組合物可稍投與生命，例如在約6個月至約5歲或更大時投與。在一些態樣中，個體為年齡在約20歲與約50歲(例如約20、25、30、35、40、45或50歲)之間的年輕成人。在一些態樣中，個體為約60歲、約70歲或更大(例如約60、65、70、75、80、85或90歲)老年個體。

在一些態樣中，疫苗使個體對流感免疫至多2年。在一些態樣中，疫苗使個體對流感免疫超過2年、超過3年、超過4年或5至10年。在一些態樣中，個體為約5歲或更小。舉例而言，個體年齡可在約1歲與約5歲之間(例如約1、2、3、5或5歲)，或年齡在約6個月與約1歲之間(例如約6、7、8、9、10、11或12個月)。在一些態樣中，個體係約12個月或更小(例如12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2個月或1個月)。在一些態樣中，個體係約6個月或更小。在一些態樣中，個體為足月出生(例如約37-42週)。在一些態樣中，個體早產，例如在妊娠約36週或更早(例如約36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25週)。舉例而言，個體可能在妊娠約32週或更早出生。在一些態樣中，個體在妊娠約32週與約36週之間早產。在此類個體中，RNA (例如mRNA)疫苗可稍後投與生命，例如在約6個月至約5歲或更大時投與。在一些態樣中，個體為年齡在約20歲與約50歲(例如約20、25、30、35、40、45或50歲)之間的年輕成人。在一些態樣中，個體為約60歲、約70歲或更大(例如約60、65、70、75、80、85或90歲)老年個體。

在一些態樣中，個體已暴露於流感(例如沙眼衣原體)；個體感染流感(例如沙眼衣原體)；或個體處於感染流感(例如沙眼衣原體)之風險下。在一些態樣中，個體免疫功能不全(具有受損免疫系統，例如具有免疫病症或自體免疫病症)。

在一些態樣中，本發明之免疫原組合物之RNA分子編碼病毒多肽或其片段，包括其天然存在或經工程改造之變異體，以預防人類中之病毒。在一些態樣中，病毒多肽不包含冠狀病毒多肽。在一些態樣中，病毒多肽不包含嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒多肽。在一些態樣中，病毒多肽不包含SARS-CoV-2多肽。

因此，在一些態樣中，本發明之免疫原組合物之RNA分子不編碼冠狀病毒多肽或其片段，包括其天然存在或經工程改造之變異體。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物之RNA分子不編碼SARS病毒多肽或其片段，包括其天然存在或經工程改造之變異體。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物之RNA分子不編碼SARS-CoV-2病毒多肽或其片段，包括其天然存在或經工程改造之變異體。

在其他態樣中，本發明之免疫原組合物的RNA分子不用於預防人類冠狀病毒。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物之RNA分子不用於預防人類中之SARS病毒。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物之RNA分子不用於預防人類之SARS-CoV-2。

在一些態樣中，本發明之免疫原組合物，諸如RNA (例如mRNA)疫苗包含編碼病毒多肽或其片段之RNA，包括其天然存在或經工程改造之變異體，以預防人類之病毒。在一些態樣中，病毒多肽不包含冠狀病毒多肽。在一些態樣中，病毒多肽不包含嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒多肽。在一些態樣中，病毒多肽不包含SARS-CoV-2多肽。

因此，在一些態樣中，本發明之免疫原組合物，諸如RNA (例如mRNA)疫苗不包含編碼冠狀病毒多肽或其片段之RNA，包括其天然存在或經工程改造之變異體。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物不包含編碼嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒多肽或其片段之RNA，包括其天然存在或經工程改造之變異體。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物不包含編碼SARS-CoV-2病毒多肽或其片段之RNA，包括其天然存在或經工程改造之變異體。

在其他態樣中，本發明之免疫原組合物不用於預防人類之冠狀病毒。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物不用於預防人類之SARS病毒。在一些態樣中，本發明之免疫原組合物不用於預防人類之SARS-CoV-2。

在一些態樣中，本文所述之核酸免疫原組合物及/或疫苗經化學修飾。在其他態樣中，核酸免疫原組合物疫苗未經修飾。其他態樣提供組合物及向個體投與免疫原組合物的方法，其包含向個體投與核酸疫苗，該核酸疫苗包含一或多種具有編碼第一病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件，且其中佐劑不與疫苗共調配或共投與。

在其他態樣中，本發明為一種免疫原組合物或疫苗接種個體的方法，其包含向個體投與免疫原組合物及/或疫苗，該免疫原組合物及/或疫苗包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中向個體投與介於10 μg/kg與400 μg/kg之間的劑量的核酸免疫原組合物及/或疫苗。在一些態樣中，RNA聚核苷酸之劑量為每劑量1-5 μg、5-10 μg、10-15 μg、15-20 μg、10-25 μg、20-25 μg、20-50 μg、30-50 μg、40-50 μg、40-60 μg、60-80 μg、60-100 μg、50-100 μg、80-120 μg、40-120 μg、40-150 μg、50-150 μg、50-200 μg、80-200 μg、100-200 μg、120-250 μg、150-250 μg、180-280 μg、200-300 μg、50-300 μg、80-300 μg、100-300 μg、40-300 μg、50-350 μg、100-350 μg、200-350 μg、300-350 μg、320-400 μg、40-380 μg、40-100 μg、100-400 μg、200-400 μg或300-400 μg。在一些態樣中，藉由皮內或肌肉內注射向個體投與核酸免疫原組合物及/或疫苗。在一些態樣中，在第零天向個體投與核酸免疫原組合物及/或疫苗。在一些態樣中，在二十一天向個體投與第二劑量之核酸免疫原組合物及/或疫苗。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中包括劑量為25微克的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中包括劑量為100微克的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中包括劑量為50微克的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中包括劑量為75微克的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中包括劑量為150微克的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中包括劑量為400微克的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中包括劑量為200微克的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，RNA聚核苷酸在局部淋巴結中之累積量比在遠端淋巴結中高100倍。在其他態樣中，核酸免疫原組合物及/或疫苗經化學修飾，且在其他態樣中，核酸免疫原組合物及/或疫苗未經化學修飾。

本發明之態樣提供一種核酸免疫原組合物及/或疫苗，其包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，其中疫苗中不包括佐劑。在一些態樣中，穩定元件為組蛋白莖環。在一些態樣中，穩定元件為GC含量相對於野生型序列增加之核酸序列。

本發明之態樣提供核酸免疫原組合物及/或疫苗，其包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投與之調配物形式存在，對於可接受之人類個體百分比而言，其賦予第一抗原優於血清保護準則的抗體效價。在一些態樣中，藉由本發明之mRNA免疫原組合物及/或疫苗產生的抗體效價為中和抗體效價。在一些態樣中，中和抗體效價大於蛋白質疫苗。在其他態樣中，藉由本發明之mRNA免疫原組合物及/或疫苗產生的中和抗體效價大於佐劑蛋白質疫苗。在其他態樣中，藉由本發明之mRNA免疫原組合物及/或疫苗產生的中和抗體效價為1,000-10,000、1,200-10,000、1,400-10,000、1,500-10,000、1,000-5,000、1,000-4,000、1,800-10,000、2000-10,000、2,000-5,000、2,000-3,000、2,000-4,000、3,000-5,000、3,000-4,000或2,000-2,500。中和效價通常表示為實現溶菌斑數目減少50%所需的最高血清稀釋度。

亦提供核酸免疫原組合物及/或疫苗，其包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投與的調配物形式存在，進而引起的較高抗體效價比由具有穩定元件或用佐劑調配且編碼第一抗原性多肽的mRNA免疫原組合物及/或疫苗所引起的抗體效價持續長。在一些態樣中，RNA聚核苷酸經調配以在單次投與一週內產生中和抗體。在一些態樣中，佐劑係選自陽離子肽及免疫刺激性核酸。在一些態樣中，陽離子肽為魚精蛋白。

態樣提供核酸免疫原組合物及/或疫苗，其包含一或多種具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含經修飾之核苷酸的RNA聚核苷酸，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投與的調配物形式存在，使得宿主中的抗原表現量顯著超過由具有穩定元件或用佐劑調配且編碼第一抗原性多肽的mRNA免疫原組合物及/或疫苗產生的抗原表現量。

其他態樣提供核酸免疫原組合物及/或疫苗，其包含一或多種具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含經修飾之核苷酸的RNA聚核苷酸、該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該免疫原組合物及/或疫苗的RNA聚核苷酸比未經修飾之mRNA免疫原組合物及/或疫苗產生等效抗體效價所需的RNA聚核苷酸少至少10倍。在一些態樣中，RNA聚核苷酸以25-100微克之劑量存在。

本發明之態樣亦提供一種使用免疫原組合物及/或疫苗之單位，其包含10 μg與400 μg之間的一或多種具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含經修飾之核苷酸的RNA聚核苷酸，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，該免疫原組合物及/或疫苗經調配以遞送至人類個體。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗進一步包含陽離子脂質奈米粒子。

本發明之態樣提供在一名個體或一群個體中創建、維持或恢復對抗原，諸如病毒株抗原之抗原記憶的方法，其包含向該個體或群體投與增強抗原記憶之核酸免疫原組合物及/或疫苗，該核酸免疫原組合物及/或疫苗包含(a)至少一個RNA聚核苷酸，該聚核苷酸包含至少一個化學修飾或視情況不含經修飾之核苷酸及兩個或更多個經密碼子最佳化之開放閱讀框架，該等開放閱讀框架編碼一組參考抗原性多肽，及(b)視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些態樣中，免疫原組合物及/或疫苗係經由選自由肌肉內投與、皮內投與及皮下投與組成之群的途徑投與個體。在一些態樣中，投與步驟包含使個體之肌肉組織與適合於注射組合物之裝置接觸。在一些態樣中，投與步驟包含與電穿孔組合用適合於注射組合物之裝置接觸個體之肌肉組織。

本發明之態樣提供向個體投與免疫原組合物及/或疫苗(例如對個體進行疫苗接種)的方法，其包含向個體投與例如單次劑量在25 μg/kg與400 μg/kg之間的核酸免疫原組合物及/或疫苗，該核酸免疫原組合物及/或疫苗包含可有效投與個體或對個體進行疫苗接種的量的一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。

其他態樣提供核酸免疫原組合物及/或疫苗，其包含一或多種具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾之RNA聚核苷酸，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該免疫原組合物及/或疫苗的RNA聚核苷酸比未經修飾之mRNA免疫原組合物及/或疫苗產生等效抗體效價所需的RNA聚核苷酸少至少10倍。在一些態樣中，RNA聚核苷酸以25-100微克之劑量存在。

其他態樣提供核酸免疫原組合物及/或疫苗，其包含LNP調配之RNA聚核苷酸，該RNA聚核苷酸具有開放閱讀框架、不含核苷酸修飾(未經修飾)，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該免疫原組合物及/或疫苗的RNA聚核苷酸比不調配於LNP中之未經修飾之mRNA免疫原組合物及/或疫苗產生等效效價所需的RNA聚核苷酸少至少10倍。在一些態樣中，RNA聚核苷酸以25-100微克之劑量存在。

呈現於實例中之資料表明顯著增強之品質及屬性，其可使用本發明之調配物產生免疫反應。根據本發明，經化學修飾及未經修飾之RNA免疫原組合物及/或疫苗均適用。

在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療年齡為60歲或更大的老年個體的方法，其包含向個體投與核酸免疫原組合物及/或疫苗，該核酸免疫原組合物及/或疫苗包含可有效對個體進行疫苗接種的量的一或多種具有編碼病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療年齡為17歲或更小的幼齡個體的方法，其包含向個體投與核酸免疫原組合物及/或疫苗，該核酸免疫原組合物及/或疫苗包含可有效對個體進行疫苗接種的量的一或多種具有編碼病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療成年個體的方法，其包含向個體投與核酸免疫原組合物及/或疫苗，該核酸免疫原組合物及/或疫苗包含可有效投與個體或對個體進行疫苗接種的量的一或多種具有編碼病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。

在一些態樣中，本發明係關於一種向個體投與(例如疫苗接種)組合免疫原組合物及/或疫苗的方法，該組合免疫原組合物及/或疫苗包括至少兩個編碼抗原之核酸序列，其中疫苗之劑量為組合治療劑量，其中各編碼抗原之個別核酸之劑量為子治療劑量。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中，組合劑量為25微克RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中，組合劑量為100微克RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中，組合劑量為50微克RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中，組合劑量為75微克RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中，組合劑量為150微克RNA聚核苷酸。在一些態樣中，在投與給個體之核酸免疫原組合物及/或疫苗中，組合劑量為400微克RNA聚核苷酸。在一些態樣中，包含一個經脂質奈米粒子囊封之編碼HA之mRNA分子的免疫原組合物為單價的且具有選自以下中之任一者的劑量：1 µg mRNA、2 µg RNA、5 µg RNA及20 µg RNA。

在一些態樣中，免疫原組合物包含經第一脂質奈米粒子囊封之編碼HA之mRNA分子、經第二脂質奈米粒子囊封之編碼HA之mRNA分子、經第三脂質奈米粒子囊封之編碼NA之mRNA分子及經第四脂質奈米粒子囊封之編碼NA之mRNA分子，其中總劑量為至多20 µg RNA。

在較佳態樣中，本發明之免疫原組合物及/或疫苗(例如經LNP囊封之mRNA疫苗)在經疫苗接種之個體之血液或血清中產生預防及/或治療有效含量、濃度及/或效價之抗原特異性抗體。如本文所定義，術語抗體效價係指在s個體，例如人類個體中產生之抗原特異性抗體的量。在例示性態樣中，抗體效價表現為仍產生陽性結果之最大稀釋度(在連續稀釋中)之倒數。在例示性態樣中，藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定或量測抗體效價。在例示性態樣中，藉由中和分析，例如藉由微中和分析測定或量測抗體效價。在某些態樣中，抗體效價量測表示為比率，諸如1:40、1:100等。

在本發明之例示性態樣中，有效免疫原組合物及/或疫苗產生大於1:40、大於1:100、大於1:400、大於1:1000、大於1:2000、大於1:3000、大於1:4000、大於1:500、大於1:6000、大於1:7500、大於1:10000之抗體效價。在例示性態樣中，在疫苗接種之後10天、疫苗接種之後20天、疫苗接種之後30天、疫苗接種之後40天或疫苗接種之後50天或更多天產生或達到抗體效價。在例示性態樣中，在向個體投與單次劑量之免疫原組合物及/或疫苗之後產生或達到效價。在其他態樣中，在多次劑量後，例如在第一次及第二次劑量(例如加打劑量)後產生或達到效價。在本發明之例示性態樣中，抗原特異性抗體以μg/ml為單位量測或以IU/L (國際單位/公升)或mIU/ml (毫國際單位/毫升)為單位量測。在本發明之例示性態樣中，有效免疫原組合物及/或疫苗產生＞0.5 μg/ml、＞0.1 μg/ml、＞0.2 μg/ml、＞0.35 μg/ml、＞0.5 μg/ml、＞1 μg/ml、＞2 μg/ml、＞5 μg/ml或＞10 μg/ml。在本發明之例示性態樣中，有效免疫原組合物及/或疫苗產生＞10 mIU/ml、＞20 mIU/ml、＞50 mIU/ml、＞100 mIU/ml、＞200 mIU/ml、＞500 mIU/ml或＞1000 mIU/ml。在例示性態樣中，在疫苗接種之後10天、疫苗接種之後20天、疫苗接種之後30天、疫苗接種之後40天或疫苗接種之後50天或更多天產生或達到抗體含量或濃度。在例示性態樣中，在向個體投與單次劑量免疫原組合物及/或疫苗之後產生或達到含量或濃度。在其他態樣中，在多次劑量之後，例如在第一次及第二次劑量(例如加打劑量)之後產生或達到含量或濃度。在例示性態樣中，藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定或量測抗體含量或濃度。在例示性態樣中，藉由中和分析，例如藉由微量中和分析測定或量測抗體含量或濃度。

VI. 冷凍或凍乾  可藉由以下進行凍乾：在第一步驟中冷凍樣品且隨後經由昇華在一或多個步驟中乾燥樣品，視情況藉由降低周圍壓力及/或藉由加熱樣品使得溶劑自固相直接昇華為氣相。在一些態樣中，凍乾方法包括提供一種組合物，其包含囊封RNA或與RNA締合的脂質奈米粒子及至少一種低溫保護劑及空白LNP。在一些態樣中，該方法進一步包括在冷凍乾燥器中冷凍乾燥組合物，冷凍乾燥器係指使脂質或半液體調配物凍乾之儀器。此類儀器在此項技術中可獲得。

如本文所用，術語「低溫保護劑」通常指部分或全部置換分子周圍之水合球且因此防止催化及/或水解過程之賦形劑。在一些態樣中，低溫保護劑為空白LNP或脂質體，其中LNP或脂質體不囊封RNA。在一些態樣中，低溫保護劑為雙醣(例如蔗糖)。在較佳態樣中，步驟a)中提供之組合物包含i)囊封RNA或與RNA締合之脂質奈米粒子；ii)至少一種低溫保護劑，其中低溫保護劑為碳水化合物；及iii)不具有囊封於其中或與其締合之RNA的脂質奈米粒子或脂質體。在另一較佳態樣中，提供於步驟a)中之組合物包含i)囊封RNA或與RNA締合之脂質奈米粒子；及ii)有效量之至少一種低溫保護劑，其中低溫保護劑為雙醣，且其中低溫保護劑之有效量為至少約2% w/v至30% w/v (例如至少、至多、其中任何兩者之間或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30% w/v/)之組合物。

例示性碳水化合物可包含(但不限於)適用於製備醫藥組合物之任何碳水化合物，較佳(但不限於)單醣，諸如葡萄糖、果糖、半乳糖、山梨糖、甘露糖(較佳意謂未結合或不結合的甘露糖，例如甘露糖不共價鍵結至至少一個RNA，或換言之，甘露糖不結合，較佳就至少一個RNA而言)等及其混合物；雙醣，諸如乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等及其混合物；多醣，諸如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、聚葡萄糖、糊精、纖維素、澱粉等及其混合物；及醛醣醇，諸如甘油、甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇、哌喃糖基山梨糖醇、肌醇等及其混合物。較佳包含於組合物中之糖之實例包括乳糖、甘露糖、甘露糖醇、蔗糖或海藻糖。較佳地，糖為蔗糖。在一些態樣中，糖具有較高排水活性及較高玻璃轉移溫度。在一些態樣中，糖較佳為親水性但無吸濕性的。在一些態樣中，糖具有較低結晶趨勢。在一些態樣中，低溫保護劑係選自甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖、甘露糖及海藻糖中之任一者。在一些態樣中，其他組分可用作低溫保護劑。尤其醇(諸如PEG、甘露糖醇、山梨糖醇)、環糊精、DMSO、胺基酸及蛋白質(諸如脯胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、精胺酸、絲胺酸及白蛋白)及明膠可用作低溫保護劑。另外，如下文所定義之金屬離子、界面活性劑及鹽可用作低溫保護劑。此外，聚合物可用作低溫保護劑，尤其聚乙烯吡咯啶酮。

在一些態樣中，該組合物中之RNA與該組合物中之低溫保護劑，較佳碳水化合物，更佳糖，甚至更佳蔗糖之重量比較佳在約1:2000至約1:10，更佳約1:1000至約1:100範圍內。最佳地，組合物中之至少一種RNA與低溫保護劑，較佳碳水化合物，更佳糖，甚至更佳蔗糖在該液體中之重量比在約1:250至約1:10範圍內，且更佳在約1:100至約1:10範圍內，且最佳在約1:100至約1:50範圍內。在一些態樣中，低溫保護劑包含該組合物之1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30% w/v或更大，或可來源於其中之任何範圍或值。

在一些態樣中，組合物可進一步包括以下中之任一者：低溫保護劑、凍乾保護劑、增積劑、防腐劑、抗氧化劑、金屬螯合劑、抗微生物劑、著色劑、載劑、填充劑、成膜劑、再分散劑及崩解劑。此外，在一些態樣中，組合物可進一步包括以下賦形劑中之任一者，諸如消泡劑、界面活性劑、增黏劑、力控制劑或其類似物。

在一些態樣中，包含至少一種RNA及至少一種凍乾保護劑之組合物藉由玻璃轉移溫度(Tg)表徵，其在一些態樣中等於或高於60℃，在一些態樣中等於或高於70℃，且在一些態樣中等於或高於80℃。在一些態樣中，組合物之玻璃轉移溫度在50℃至200℃範圍內，在一些態樣中在60℃至120℃範圍內，且在一些態樣中在70℃至100℃範圍內。且在一些態樣中約78℃至約88℃。在較佳態樣中，組合物藉由殘餘水分含量表徵，其在一些態樣中在約0.1% (w/w)至約10% (w/w)範圍內，在一些態樣中在約1% (w/w)至約8% (w/w)範圍內，且在一些態樣中在約2% (w/w)至約5% (w/w)範圍內，且在一些態樣中在約3% (w/w)至約4% (w/w/w)範圍內，例如3% (w/w)±2% (w/w)或3% (w/w)±1% (w/w)。在一些態樣中，組合物之殘餘含水量等於或小於10% (w/w)，在一些態樣中等於或小於7% (w/w)，在一些態樣中等於或小於5% (w/w)，且在一些態樣中等於或小於4% (w/w)。如本文所用，術語「殘餘水分含量」(或「殘餘水分」)係指存在於組合物中之溶劑總量。組合物中殘餘溶劑之該總量可使用此項技術中已知之任何適合方法測定。舉例而言，用於測定殘餘水分含量之方法可包括卡爾-費歇爾滴定技術(Karl-Fischer-titrimetric technique)或熱解重量分析(TGA)方法。在一些態樣中，包含於組合物中之殘餘溶劑為水或基本上為水溶液，且殘餘水分含量係藉由卡爾-費歇爾滴定技術測定。

該組合物較佳適用作穩定儲存形式的囊封RNA之脂質奈米粒子。RNA之儲存穩定性可經由在給定儲存時段之後測定相對(結構)完整性及生物活性，例如經由時程活體外表現研究來測定。相對完整性可測定為相對於RNA之總量(亦即全長RNA及降解RNA片段(其在凝膠電泳中可呈現為塗片)的全長RNA(亦即非降解RNA)之百分比，較佳在扣除LOD (3×背景雜訊)之後，例如藉由使用來自BioRad之QuantityOne軟體進行。在一些態樣中，該組合物與在不存在空白LNP的情況下包含囊封RNA或與RNA締合之LNP的對應組合物相比允許在-80℃至60℃之溫度下於WFI或其他可注射溶液中儲存較長時間。在一些態樣中，組合物可儲存在室溫下。在一些態樣中，組合物儲存有或無屏蔽氣體。在一些態樣中，封裝及密封組合物之單次劑量。或者，多次劑量可封裝在一個封裝單元中。

包括囊封RNA之脂質奈米粒子的組合物可儲存至少約2小時至2年。在一些態樣中，RNA或經囊封RNA在等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的時長內儲存：至少約2小時、4小時至8週、6小時至七週、12小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、21週、22週、23週、24週、1年、2年，或可來源於其中之任何範圍或值。包括囊封RNA之脂質奈米粒子的組合物可在約室溫至約-90℃之溫度下儲存。舉例而言，RNA或經囊封RNA可在低於室溫、處於或低於4℃、處於或低於0℃、處於或低於-20℃、處於或低於-60℃、處於或低於-70℃、處於或低於-80℃、或處於或低於-90℃之溫度下儲存。在一些態樣中，包括囊封RNA之脂質奈米粒子的組合物在等於以下中之任一者、至少以下中之任一者、至多以下中之任一者或介於以下中任何兩者之間的溫度下儲存：約20℃、15℃、10℃、5℃、0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃或-90℃，或可來源於其中之任何範圍或值。

在一些態樣中，在於室溫下儲存較佳至少一週，更佳至少一個月，甚至更佳至少6個月，且最佳至少一年之後，組合物中至少一種RNA之相對完整性為至少70%、更佳至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些態樣中，在室溫下儲存之後組合物的至少一種RNA之生物活性為凍乾之前的RNA之生物活性的至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。生物活性可藉由分別分析由復原的囊封RNA或與RNA締合之LNP表現之蛋白質的量及由凍乾前囊封RNA或與RNA締合之LNP表現之蛋白質的量測定，例如在轉染至哺乳動物細胞株中或個體中之後進行。或者，生物活性可藉由量測個體中之(適應性或先天性)免疫反應之誘導來測定。

在一些態樣中，囊封RNA之LNP係藉由以下凍乾：a)提供具有囊封RNA之LNP及至少一種低溫保護劑的組合物；b)將組合物裝載至冷凍乾燥器之冷凍乾燥腔室中；c)將組合物冷卻至冷凍溫度；d)在冷凍溫度下冷凍該組合物以獲得冷凍組合物；e)將冷凍乾燥腔室中之壓力降低至低於大氣壓之壓力；f)乾燥步驟d)中獲得之冷凍組合物以便獲得包含囊封RNA之LNP及至少一種低溫保護劑之凍乾組合物；g)使冷凍乾燥腔室中之壓力平衡至大氣壓且自冷凍乾燥腔室移除包含囊封RNA之LNP及至少一種低溫保護劑之凍乾組合物。在一些態樣中，乾燥步驟f)在低於約200 mbar之壓力下進行。在一些態樣中，冷凍乾燥腔室中之壓力在3至200 mbar之間。在一些態樣中，冷凍乾燥腔室中之壓力在30至200 mbar之間。在一些態樣中，冷凍乾燥腔室中之壓力在3至100 mbar之間。在一些態樣中，冷凍乾燥腔室中之壓力在45至150 mbar之間。

實例  包括以下實例以說明本發明之態樣。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術表示由發明人發現在本發明之實踐中運作良好之技術，且因此可視為構成其實踐之較佳模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不偏離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定態樣作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。

實例1：流感modRNA 除非另外規定，否則實例係基於流感modRNA。特定的構築體(Washington modRNA)為免疫原組合物中之唯一活性成分。在pH 7.0下將藥物物質調配於10 mM HEPES緩衝液、0.1 mM EDTA中且儲存在-20±5℃下。

除編碼抗原之密碼子最佳化序列以外，RNA含有經最佳化以用於介導高RNA穩定性及轉譯效率之共同結構元件(5'-帽、5'UTR、3'-UTR、poly(A)-尾；參見下表及序列)。此外，內在的信號肽(sec)為開放閱讀框架之一部分且經轉譯為N端肽。RNA不含有任何尿苷；在RNA合成中使用經修飾之N1-甲基假尿苷代替尿苷。

特定構築體各自包含以下表1中所示之元件： 表 1 構築體元件

元件	描述	位置
5'-帽	經修飾之5'-帽1結構(m 7G +m3'-5'-ppp-5'-Am)	1-2
5'-UTR	來源於人類α-血球蛋白RNA具有最佳化Kozak序列之5'-非轉譯區	3-54
3'-UTR	3'非轉譯區包含兩個來源於胺基末端分裂增強因子(AES) mRNA及粒線體編碼之12S核糖體RNA之序列元件以賦予RNA穩定性及較高總蛋白質表現。
poly(A)	110個核苷酸的poly(A)-尾由以下組成：一段30個腺苷殘基，接著為10個核苷酸的連接子序列及其他70個腺苷殘基。

元件之序列 ： 帽及5' -UTR ： GA GAAΨAAAC ΨAGΨAΨΨCΨΨ CΨGGΨCCCCA CAGACΨCAGA GAGAACCCGC CACC (SEQ ID NO:1)，其中加粗及帶下劃線的文字對應於帽，且未經修改的文字對應於5'-UTR。 Poly(A) 尾：AAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCAΨAΨ GACΨAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA (SEQ ID NO:3)

如本文中所使用，Ψ表示1-甲基-3'-假尿苷基。

用於產生含有帽1結構之RNA的5'-帽類似物(m ₂ ^7,3' ^-OMeGppp(m ₁2' ^-O)ApG)展示如下

以上結構對應於Trilink的CleanCap AG (3'OMe) - m27,3'-OGppp(m12'-O)ApG。此分子與天然RNA帽結構一致，因為其以在N7處甲基化之鳥苷開始，且藉由5'至5'三磷酸鍵連接至所轉錄RNA之第一經編碼核苷酸(在此情況下為腺苷)。此鳥苷亦在核糖之3'羥基處甲基化以緩解帽分子之可能反向併入。最後，腺苷上核糖之2'羥基經甲基化，賦予帽1結構，相比之下，將此保持為2'羥基將賦予此帽0結構。帽1結構相比於具有帽0結構的RNA應在真核生物中提供更優異的轉錄。

流感modRNA疫苗候選物可編碼衍生自A/Wisconsin/588/2019 (H1N1)、A/Cambodia/e0826360/2020 (H3N2)、B/Washington/02/2019 (B/維多利亞世系(Victoria lineage))及B/Phuket/3073/2013 (B/山形世系(Yamagata lineage))之HA蛋白，其為用於北半球2021-2022季節基於細胞培養物之流感疫苗的推薦疫苗株。序列中之poly(A)-尾中存在之A核苷酸的數目較佳反映其在用BspQ1 (或其同型異質鑑識酶)線性化之後在最終RNA中將如何：30A-連接子-70A。在具有帽1結構之經轉錄RNA中，mRNA序列中之前兩個核苷酸(AG)實際上由CLEANCAP試劑提供且第一腺苷上之核糖之2'羥基經甲基化。

在活體外轉錄期間，藉由使用各別帽類似物將帽1結構(亦即含有RNA鏈之5'端之倒數第二核苷上的2'-O-甲基)併入至藥物物質中。對於具有經修飾之尿苷核苷酸的RNA，帽1結構優於其他帽結構，因為帽1不被諸如IFIT1之細胞因子識別且因此，與真核轉譯起始因子4E競爭不會抑制帽1依賴型轉譯。在IFIT1表現之情形下，具有帽1結構之mRNA提供較高蛋白質表現量。

在一些較佳實施例中，流感疫苗藥物物質為單股、5'-加帽mRNA，該mRNA經轉譯成對應於來自流感病毒株A/Wisconsin/588/2019 H1N1、A/Cambodia/e0826360/2020、B/Washington/02/2019或B/Phuket/3073/2013之血球凝集素(HA)蛋白質的各別蛋白質(經編碼抗原)。編碼抗原之RNA之通用結構藉由用作活體外RNA轉錄之模板之DNA的各別核苷酸序列來確定。除編碼抗原之密碼子最佳化序列以外，RNA含有經最佳化以用於介導高RNA穩定性及轉譯效率之共同結構元件(5'-帽、5'UTR、3'-UTR、poly(A)-尾；參見下文)。RNA不含有任何尿苷；在RNA合成中使用經修飾之N1-甲基假尿苷代替尿苷。

製造過程包含經由活體外轉錄(IVT)步驟，接著DNA酶I及蛋白酶K消化步驟進行RNA合成、藉由超濾/透濾(UFDF)純化、最終過濾、分配至適當容器中及儲存在-20℃下。在四個modRNA的生產中，使用IVT、消化及純化處理步驟之平台方法。以37.6 L之IVT起始體積規模製備mRNA臨床批次。所有材料藉由單個2階段UFDF純化以產生mRNA藥物物質。

流感modRNA免疫原組合物由一或多種編碼來源於季節性人類流感病毒株之全長HA糖蛋白的經核苷修飾之mRNA構成。modRNA用2種功能性脂質及2種結構性脂質調配，該等脂質保護modRNA免於降解且使得modRNA在IM注射之後能夠轉染至宿主細胞中。流感HA為A型及B型流感病毒粒子之表面上最豐富的包膜糖蛋白。

LNP調配物含有2種功能性脂質(ALC-0315及ALC-0159)及2種結構性脂質(DSPC (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼)及膽固醇)。4種脂質之物理化學特性及結構展示於下表中。

根據美國專利9737619 (PCT公開案第WO2015/199952號)及美國專利10166298 (WO 2017/075531)及WO2020/146805中所述之通用程序製備及測試脂質奈米粒子。簡言之，陽離子脂質、DSPC、膽固醇及PEG-脂質以約47.5:10:40.7:1.8之莫耳比溶解於乙醇中。脂質奈米粒子(LNP)以大致10:1至30:1之較佳總脂質與mRNA重量比製備。將mRNA稀釋於緩衝液中。使用注射泵混合乙醇脂質溶液與mRNA水溶液。隨後移除乙醇且用不同的緩衝液(例如Tris)藉由透析置換外部緩衝液。最後，過濾脂質奈米粒子。 表 2   LNP 調配物中之脂質

脂質(CAS 編號)	分子量[Da]	分子式	物理狀態及儲存條件	化學名稱 ( 同義詞 ) 及結構
ALC-0315 (不適用)	766	C 48H 95NO 5	液體(油) -20℃	(4-羥丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2 -己基癸酸酯)
ALC-0159 (1849616-42-7)	~2400-2600	C 30H 60NO(C 2H 4O) nOCH 3n=45-50	固體 -20℃	2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺
DSPC (816-94-4)	790	C 44H 88NO 8P	固體 -20℃	1,2-二硬脂醯基- sn-甘油-3-磷酸膽鹼
膽固醇 (57-88-5)	387	C 27H 46O	固體 -20℃
CAS=化學文摘社(Chemical Abstracts Service)；DSPC=1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼。

實例2：經受凍融或冷凍乾燥之組合物  例示性調配物含有一種混合物，其具有(a)包括脂質奈米粒子的mRNA藥品(DP)，該等脂質奈米粒子含有流感modRNA (亦即，包含5'端帽、5' UTR、3'UTR及3'聚腺苷酸化尾的編碼流感抗原之RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸包含至少一個經修飾之核苷，諸如N1-甲基假尿苷，且較佳其中開放閱讀框架中100%尿嘧啶為N1-甲基假尿苷)，該流感modRNA編碼Washington 2019血球凝集素(mRNA LNP)，及(b)分散於蔗糖及Tris溶液(pH 7.4)中的不包括核酸的脂質奈米粒子(空白LNP)。如本文中之實例中所用，術語「空白LNP」係指包含表2中所列脂質的脂質奈米粒子，其中脂質奈米粒子不囊封任何核酸。

以下例示性實例說明在不存在及存在脂質空白奈米粒子的情況下，如下表5中所示，使用表3中所示含有10.3% w/v相對於含有20.5% w/v蔗糖的流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)進行多次凍融循環實驗(-80℃↔ +20℃)或進行冷凍乾燥實驗的研究。

在進行及不進行黏接之情況下，在高於最大冷凍濃縮溶液之玻璃轉移溫度(Tg')且低於冰熔化溫度之溫度下進行冷凍乾燥。 表 3 使用流感 modRNA 的用於凍融或冷凍乾燥的調配物

調配物編號	mRNA ，mg/mL	Tris ，mM	蔗糖% ，w/v	包括空白LNP	等效於0.1 或0.5 mg/mL mRNA DP 的目標脂質	空白 LNP:mRNA LNP
1	0.5	10	10.3	否	NA	NA
2	0.1	10	10.3	否	NA	NA
3	0.01	10	10.3	否	NA	NA
4	0.001	10	10.3	否	NA	NA
5	0.1	10	10.3	是	0.5	1:5
6	0.01	10	10.3	是	0.5	1:50
7	0.001	10	10.3	是	0.5	1:500
8	0.01	10	10.3	是	0.1	1:10
9	0.001	10	10.3	是	0.1	1:100
10	0.5	10	20.5	否	NA	NA
11	0.1	10	20.5	否	NA	NA
12	0.01	10	20.5	否	NA	NA
13	0.001	10	20.5	否	NA	NA
14	0.01	10	20.5	是	0.1	1:10
15	0.001	10	20.5	是	0.1	1:100

實例3：例示性凍乾循環 凍乾LNP之例示性方法為此項技術中已知的。舉例而言，本文所描述之包含脂質奈米粒子之組合物可經凍乾，其中75 μl等分試樣可分配至無菌2R玻璃瓶(1型)中。用冷凍乾燥橡膠塞部分塞住小瓶。將小瓶裝載至冷凍乾燥器中且在以下條件下乾燥。較佳在受控冷凍(進行或不進行黏接)及受控乾燥條件下使凍乾循環最佳化。例示性凍乾步驟描述於下表4中。 表 4 例示性凍乾步驟

步驟	描述	溫度 ( 擱板 )	皮冉尼 壓力 ( Pressure Pirani )	持續時間 (hh:mm)
1	裝載	＜ -70℃	大氣壓	00:00
4	抽空	＜-50℃ (用液氮冷卻擱板)	63 µbar	約00:20
5	初次乾燥	＜-50℃→40℃加熱，僅藉由最終溫度控制	63 µbar	18:30
9	二次乾燥	40℃擱板使得產物大致20℃	45 µbar	06:00
10	氮氣回填	40℃	n.a.	-
11	小瓶封閉	40℃	n.a.	-
12	充氣	40℃	大氣壓	-

可藉由在塞子及小瓶之頸部上方壓接鋁帽而密封小瓶。隨後，將樣品儲存在5℃、25℃/60%相對濕度(R.H.)或40℃/75% R.H.下，且在5、8、13、24及40週(各3個樣品)之後分析相對完整性。包含於凍乾組合物中之mRNA的相對完整性係經由瓊脂糖凝膠電泳測定。特定言之，相對完整性係藉由分別量測在瓊脂糖凝膠之泳道中(亦即在給定樣品中)對應於全長mRNA及所有其他信號之信號強度以及計算該泳道中相關全長mRNA與所有其他信號之信號強度之比率來測定。

實例4：凍融循環對含有流感MODRNA之脂質奈米粒子的影響  將空白LNP (由根據表2之脂質構成)添加至包含囊封流感modRNA之LNP (0.5、0.1、0.01及0.001 mg/mL，華盛頓病毒株(Washington strain)，該等囊封流感modRNA之LNP包含根據表2之脂質)的組合物中，使得所得調配物之脂質含量等效於0.5及0.1 mg/mL mRNA藥品的脂質含量。製備單獨的一批空白LNP (由根據表2之脂質構成)且與一批含有mRNA之LNP及調配緩衝液混合以在最終調配物中實現目標脂質及mRNA濃度。在-80℃與室溫之間進行5次凍融(FT)循環(2.25 mL填充物)。

如圖1-圖12中所示，在不含有空白LNP之分散液中觀測到，包括空白LNP減緩了凍融後尺寸及PDI之增加及囊封%之降低。空白LNP之作用在更稀的組合物中顯而易見。 表 5 凍融前調配物屬性

調配物編號	mRNA ， mg/mL	Tris ， mM	蔗糖 % ， w/v	包括空白 LNP		等效於 0.1 或 0.5 mg/mL mRNA DP 的目標脂質	Z- 平均值， nm	PDI	囊封 %	濃度， mg/mL
1	0.5	10	10.3	否		NA	53	0.19	96	0.505
2	0.1	10	10.3	否		NA	51	0.10	94	0.101
3	0.01	10	10.3	否		NA	52	0.14	93	0.010
4	0.001	10	10.3	否		NA	66	0.28	87	0.001
5	0.1	10	10.3	是		0.5	45	0.12	97	0.101
6	0.01	10	10.3	是		0.5	49	0.23	97	0.010
7	0.001	10	10.3	是		0.5	48	0.23	97	0.001
8	0.01	10	10.3	是		0.1	53	0.19	96	0.011
9	0.001	10	10.3	是		0.1	51	0.10	96	0.001
空白	0	10	10.3	是		0.5	55	0.12	NA	NA
空白	0	10	10.3	是		0.1	57	0.14	NA	NA
10	0.5	10	20.5	否		NA	42	0.72	96	0.494
11	0.1	10	20.5	否		NA	56	0.24	100	0.101
12	0.01	10	20.5	否		NA	59	0.26	92	0.011
13	0.001	10	20.5	否		NA	52	0.31	89	0.001
14	0.01	10	20.5	是		0.1	54	0.31	95	0.010
15	0.001	10	20.5	是		0.1	54	0.34	94	0.001

包括空白LNP會減緩凍融尺寸之增加，尤其在較低mRNA劑量組合物(0.01及0.001 mg/mL)下。

下表6中展示對在存在(圖7-圖9)及不存在(圖1-圖3)空白LNP的情況下獲得的含有10.3% w/v蔗糖之流感mRNA調配物的尺寸(Z平均值，nm) (圖1、圖7)、PDI (圖2、圖8)及囊封效率(囊封%) (圖3、圖9)的值進行直接並列比較。 表 6 在存在及不存在空白 LNP 之情況下 10.3% w/v 蔗糖流感 mRNA 調配物屬性之概述

		Z- 平均值，nm	PDI	囊封%
mRNA ，mg/mL	蔗糖% ，w/v	- 空白LNP	+ 空白LNP	- 空白LNP	+ 空白LNP	- 空白LNP	+ 空白LNP
0.5	10.3	53-65	NA	0.11-0.19	NA	96-97	NA
0.1	51-71	45-59	0.10-0.21	0.10-0.12	94-97	97-98
0.01	52-91	49-57 52-64*	0.14-0.37	0.23-0.11 0.17-0.25	90-95	97-98 96-97
0.001	66-206	48-60 55-64	0.28-0.45	0.17-0.23 0.16-0.30	50-87	96-97 84-96

*加粗值對應於等效於0.1 mg/mL mRNA藥品之較低目標脂質濃度

類似地，如圖10-圖12中所示，在逐漸增加的凍融循環期間，尤其在包含0.01及0.001 mg/ml mRNA的更稀的調配物的情況下觀測到，在含有20.5% w/v蔗糖的流感mRNA調配物中包括某一濃度之空白LNP以使總脂質濃度提高至等效於含有0.1 mg/mL mRNA藥品而無空白LNP之調配物(調配物14-15)的總脂質濃度減緩了尺寸(圖10)、PDI (圖11)及囊封效率(圖12)之增加。

下表7中展示對在存在(圖10-圖12)及不存在(圖4-圖6)空白LNP的情況下獲得的含有20.5% w/v蔗糖之流感mRNA調配物的尺寸(Z-平均值，nm) (圖4、圖10)、PDI (圖5、圖11)及囊封效率(囊封%) (圖6、圖12)的值進行直接並排比較。 表 7 在存在及不存在空白 LNP 之情況下 20.5% w/v 蔗糖流感 mRNA 調配物屬性之概述

		Z- 平均值 ，nm	PDI	囊封%
mRNA ，mg/mL	蔗糖% ，w/v	- 空白LNP	+ 空白LNP	- 空白LNP	+ 空白LNP	- 空白LNP	+ 空白LNP
0.5	20.5	42-87	NA	0.13-0.16- 0.72	NA	96-97	NA
0.1	56-85	NA	0.22-0.24	NA	97-100	NA
0.01	58-62	53-57	0.15-0.26	0.18-0.31	90-94	95-97
0.001	52-90	54-57	0.31-0.42	0.19-0.34	60-89	94-95

僅包括20.5%蔗糖(調配物10-13，-空白LNP) (圖4-圖6)相比於使用10.3% w/v蔗糖(調配物1-4，-空白LNP) (圖1-圖3)在五次凍融循環過程中對流感mRNA調配物的化學及物理特徵的保存不提供任何額外優勢。另外，將空白LNP包括於流感mRNA調配物中更有效地防止尺寸及PDI之增加及囊封%之降低。

實例5：冷凍乾燥對含有流感MODRNA之脂質奈米粒子的影響  將空白LNP (由根據表2之脂質構成)添加至包含囊封流感modRNA之LNP(0.5、0.1、0.01及0.001 mg/mL，Washington病毒株，該等囊封流感modRNA之LNP包含根據表2之脂質)的組合物中，使得所得調配物之脂質含量等效於0.5及0.1 mg/mL mRNA藥品的脂質含量。製備單獨的一批空白LNP (由根據表2之脂質構成)且與一批含有mRNA之LNP及調配緩衝液混合以在最終調配物中實現目標脂質及mRNA濃度。

在進行及不進行黏接之情況下進行冷凍乾燥(0.3 mL填充物)，且針對在生理鹽水相對於注射用無菌水(sWFI)中復原之餅量測調配物屬性。

如圖16-圖27中所示，在不含有空白LNP之分散液中觀測到，在生理鹽水(S)或無菌水(W)中復原的含黏接(A)及未黏接(NA)之mRNA的冷凍乾燥LNP樣品中包括空白LNP減緩了復原後尺寸及PDI之增加及囊封%之降低。空白LNP之影響在更稀的組合物(0.01及0.001 mg/mL)中顯而易見。

下表8中展示對在存在(圖22-圖24)及不存在(圖16-圖18)空白LNP的情況下獲得的含有10.3% w/v蔗糖之流感mRNA調配物的尺寸(Z-平均值，nm) (圖16、圖22)、PDI (圖17、圖23)及囊封效率(囊封%) (圖18、圖24)的值進行直接並列比較。 表 8 在冷凍乾燥後 在存在及不存在空白 LNP 之情況下 10.3% w/v 蔗糖流感 mRNA 調配物屬性之概述

		Z- 平均值，nm	PDI	囊封%
mRNA ，mg/mL	蔗糖% ，w/v	- 空白LNP	+ 空白LNP	- 空白LNP	+ 空白LNP	- 空白LNP	+ 空白LNP
0.5	10.3	75-85	NA	0.13-0.15	NA	88-92	NA
0.1	74-77	68-72	0.13-0.16	0.16-0.20	84-89	89-92
0.01	79-91	61-68 65-70*	0.21-0.31	0.18-0.23 0.20-0.23*	78-82	90-93 82-90*
0.001	111-176	64-69 67-70*	0.37-0.48	0.21-0.27 0.21-0.28*	60-67	84-90 79-88*

*加粗值對應於等效於0.1 mg/mL mRNA藥品之較低目標脂質濃度

類似地，如圖25-圖27中所示，在復原後，尤其在包含0.01及0.001 mg/ml mRNA的更稀的調配物的情況下觀測到，在含有20.5% w/v蔗糖的流感mRNA調配物中包括某一濃度之空白LNP以使總脂質濃度提高至等效於含有0.1 mg/mL mRNA藥品而無空白LNP之調配物(調配物14-15)的總脂質濃度減緩了尺寸(圖25)、PDI (圖26)及囊封效率(圖27)之增加。下表9中展示對在存在(圖25-圖27)及不存在(圖19-圖21)空白LNP的情況下獲得的含有20.5% w/v蔗糖之流感mRNA調配物的尺寸(Z-平均值，nm) (圖19、圖25)、PDI (圖20、圖26)及囊封效率(囊封%) (圖21、圖27)的值進行直接並列比較。 表 9 在冷凍乾燥後 在存在及不存在空白 LNP 之情況下 20.5% w/v 蔗糖流感 mRNA 調配物屬性之概述

		Z- 平均值，nm	PDI	囊封%
mRNA ， mg/mL	蔗糖% ，w/v	- 空白LNP	+ 空白LNP	- 空白LNP	蔗糖% ，w/v	- 空白LNP	+ 空白LNP
0.5	20.5	75-85	NA	0.13-0.15	NA	88-92	NA
0.1	64-69	NA	0.14-0.17	NA	82-87	NA
0.01	72-85	59-62	0.25-0.33	0.20-0.22	72-75	83-88
0.001	84-120	61-63	0.41-0.52	0.25-0.27	39-52	81-86

僅包括20.5%蔗糖(調配物10-13，-空白LNP) (圖19-圖21)相比於使用10.3% w/v蔗糖(調配物1-4，-空白LNP) (圖16-圖18)在復原後對流感mRNA調配物的化學及物理特徵的保存不提供任何額外優勢。另外，將空白LNP包括於流感mRNA調配物中更有效地防止尺寸及PDI之增加及囊封%之降低。

實例6：具有空白LNP之saRNA LNP調配物  稀釋囊封自擴增RNA之LNP (根據表2製備該等LNP)以評定在凍融條件之前及之後對粒度及多分散性指數(PDI)之影響。觀測到隨著在稀釋後LNP濃度降低，更大比例之PEG可逐漸解離，引起在凍融後更大的粒度及PDI變化。參見表8、表9及表10。 表 8

濃度(mg/ml)	T=0 ( 液體 ) 尺寸/PDI	1X F/T -80 ℃ 尺寸/PDI	3X F/T -80 ℃ 尺寸/PDI
0.06	63.4 / 0.15	64.9 / 0.16	69.1 / 0.19
0.03	64.0 / 0.16	65.8 / 0.16	71.4 / 0.21
0.01	62.9 / 0.14	66.1 / 0.19	77.5 / 0.26
0.005	62.3 / 0.17	67.3 / 0.23	83.3 / 0.34
0.001	61.5 / 0.22	68.7 / 0.31	95.2 / 0.64

為了解決冷凍/解凍後之尺寸及PDI變化，用不囊封RNA的「空白」或「空」LNP (根據表2製備)稀釋囊封saRNA之LNP，以獲得低於10 µg/ml之saRNA濃度。PS80、1% PEG或20%蔗糖作為賦形劑可在最低濃度下防止在凍融(F/T)後的粒度及PDI變化。 表 9

	0.05% PS80	粒度	PDI
液體	3x F/T	液體	3x F/T
0.03	82.56	85.89	0.091	0.068
0.01	82.83	86.17	0.096	0.088
0.001	82.68	72.88	0.2	0.255
0.1% PEG 400	粒度	PDI
液體	3x F/T	液體	3x F/T
0.03	82.61	86.34	0.071	0.118
0.01	82.07	89.78	0.06	0.149
0.001	82.43	100.3	0.145	0.237
1% PEG 400	粒度	PDI
液體	3x F/T	液體	3x F/T
0.03	88.75	89.38	0.098	0.088
0.01	90.59	93.97	0.077	0.129
0.001	87.76	94.31	0.135	0.165
20%蔗糖 20S	粒度	PDI
液體	3x F/T	液體	3x F/T
0.03	70.99	73.82	0.08	0.071
0.01	71.56	73.5	0.092	0.086
0.001	69.33	69.23	0.184	0.192

表 10

	10%蔗糖 用空LNP稀釋	粒度	PDI
液體	3x F/T	液體	3x F/T
0.03	82.69	88.43	0.094	0.115
0.01	68.79	75.71	0.101	0.141
0.001	58.42	65.2	0.065	0.089
20%蔗糖 用空LNP稀釋	粒度	PDI
液體	3x F/T	液體	3x F/T
0.03	83.84	88.32	0.07	0.089
0.01	51.53	58.25	0.079	0.133
0.001	55.45	58.33	0.112	0.12
調配物1:對照 1.8%ALC-0159 不包括空LNP	粒度	PDI
液體	3x F/T	液體	3x F/T
0.03	82.69	88.43	0.094	0.115
0.01	82.72	90.69	0.085	0.123
0.001	81.82	94.88	0.117	0.229

使用空LNP稀釋至低於10ug/mL，減少凍融後之變化。使用空LNP較佳稀釋RNA且不稀釋調配物中組分之其餘部分。

實例7：VSVG saRNA LNP凍乾  將60 µg/ml的VSV-g saRNA LNP於10 mM Tris及10%蔗糖中之調配物凍乾。在此可行性評定中，以0.5 mL填充2 mL小瓶且用0.475 ml之水復原。本文所用之VSVG saRNA不包含除5'帽以外的經修飾之核苷。

凍乾的含VSVG saRNA LNP DP之Tris/蔗糖似乎在5℃下穩定8個月。參見圖13A-圖13E。

實例8：流感saRNA LNP凍乾  將以下含10 µg/ml的流感HA saRNA LNP之基質凍乾。本文中所使用之HA saRNA分子不包含除5'帽以外的經修飾之核苷。在此可行性評定中，以0.35 mL填充2 mL小瓶且用0.33 ml之生理鹽水復原。 表 11

調配物	LNP基質	濃度(ug/ml)	凍乾前尺寸/PDI	凍乾後水復原尺寸/PDI	凍乾後生理鹽水復原尺寸/PDI
A2	10mM Tris於10%蔗糖中	10	68.1 / 0.22	80.2 / 0.23	84.7 / 0.26
B2	10mM Tris於20%蔗糖中	10	63.0 / 0.21	69.8 / 0.21	72.9 / 0.25

凍乾基質產生精緻餅，且在水復原的情況下復原後尺寸及PDI為有利的。參見圖15A-圖15E。

在VSVG及HA saRNA調配物中，評定IVE上之凍乾後表現%。已在VSVG及HA saRNA調配物中觀測到IVE上之凍乾後表現%增加。

實例9：使用各種膠體穩定劑穩定低mRNA濃度調配物  測試空白LNP或脂質體對低mRNA濃度調配物之穩定的影響。

將空白LNP (由ALC-0159、DSPC、膽固醇及包含MC3或A9之陽離子脂質構成；參見下表14)添加至組合物中，該組合物包含囊封流感modRNA之LNP (0.3、0.1、0.01及0.001 mg/mL，華盛頓病毒株，該等囊封流感modRNA之LNP包含ALC-0159、DSPC、膽固醇及含MC3或A9之陽離子脂質)，使得所得調配物之脂質含量等效於0.5、0.3及0.1 mg/mL mRNA藥品之脂質含量。製備單獨的一批空白LNP (由ALC-0159、DSPC、膽固醇及包含MC3或A9之陽離子脂質構成)且將其與一批含有mRNA之LNP及調配緩衝液混合以在最終調配物中實現目標脂質及mRNA濃度。 表 14- 空白 LNP 之陽離子脂質

脂質 (CAS 編號 )	分子量 [Da]	分子式	物理狀態及儲存條件	化學名稱及結構
DLin-MC3-DMA (MC3) (1224606-06-7)	642.1	C 43H 79NO 2	液體 -20℃	4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯
A9 (2036272-50-9)	905.5	C 57H 112N 2O 5	液體 -20℃	1,19-雙(2-丁基辛基)10-[[3-(二甲胺基)丙基](1-側氧基壬基)胺基]十九烷二酸酯

將脂質體(由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成)添加至包含囊封流感modRNA之LNP (0.1、0.01及0.001 mg/mL，華盛頓病毒株，該囊封流感modRNA之LNP包含ALC-0159、DSPC、膽固醇及包含MC3或ALC-0315之陽離子脂質)的組合物中，使得所得調配物之脂質含量等效於0.5 mL及0.1 mg/mL mRNA藥品之脂質含量。製備單獨的一批脂質體(由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成)且與一批含有mRNA之LNP及調配緩衝液混合以在最終調配物中實現目標脂質及mRNA濃度。

在-70℃與25℃之間進行5次凍融(FT)循環(0.3 mL填充物)。如圖34-圖37中所示，在不含有空白LNP之分散液中觀測到，對於包含ALC-0159、DSPC、膽固醇及含MC3或A9之陽離子脂質的囊封流感modRNA之LNP，包括空白LNP (由ALC-0159、DSPC、膽固醇及包含MC3或A9之陽離子脂質構成)在凍融後減緩了尺寸及PDI之增加及囊封%之降低。如圖38-圖41中所示，對於包含ALC-0159、DSPC、膽固醇及含MC3或ALC-0315之陽離子脂質的囊封流感modRNA之LNP，包括脂質體在凍融期間亦減緩了尺寸/PDI之增加及囊封%之降低。

除凍融外，在進行及不進行黏接的情況下進行冷凍乾燥(0.3 mL填充物)，且針對在生理鹽水相對於注射用無菌水中復原之餅量測產物屬性。如圖42-圖45中所示，與不含有空白LNP之分散液相比，對於包含ALC-0159、DSPC、膽固醇及含MC3或A9之陽離子脂質的囊封流感modRNA之LNP，包括空白LNP (由ALC-0159、DSPC、膽固醇及包含MC3或A9之陽離子脂質構成)在冷凍乾燥後的復原期間減緩了尺寸及PDI之增加及囊封%之降低。如圖46-圖49中所示，對於包含ALC-0159、DSPC、膽固醇及含MC3或ALC-0315之陽離子脂質的囊封流感modRNA之LNP，包括脂質體在冷凍乾燥後的復原期間亦減緩了尺寸/PDI之增加及囊封%之降低。

所測試之所有空白LNP的結果一致，該等空白LNP具有包含選自例如MC3及A9之脂質中之任一者的陽離子脂質。在具有含有mRNA之LNP及脂質體之共調配物的情況下，在冷凍乾燥後觀測到尺寸/PDI之減小，類似於空白LNP之觀測結果。脂質體防止含有mRNA之LNP的囊封%之降低，但程度上比空白LNP低。

實例10：使用空白LNP穩定低mRNA濃度調配物及/或增加蔗糖濃度  測試空白LNP及/或較高蔗糖濃度對低mRNA濃度調配物之穩定的影響。

將空白LNP (由根據表2之脂質構成)添加至包含囊封流感modRNA之LNP(0.01及0.005 mg/mL，華盛頓病毒株，該等囊封流感modRNA之LNP包含根據表2之脂質)的組合物中，使得所得調配物之脂質含量等效於0.1及0.2 mg/mL mRNA藥品的脂質含量。製備單獨的一批空白LNP (由根據表2之脂質構成)且與一批含有mRNA之LNP及調配緩衝液混合以在最終調配物中實現目標脂質及mRNA濃度。所測試之含有modRNA之調配物概述於表15中。

將濃度為10.3%、15.4%或20.5% w/v之蔗糖添加至包含囊封流感modRNA之LNP (0.01及0.005 mg/mL，華盛頓病毒株，該等囊封流感modRNA之LNP包含根據表2之脂質)的組合物中。

在-70℃與25℃之間進行4次凍融(FT)循環(2.25 mL填充物)。

如圖28-圖33中所示，在不含有空白LNP之分散液中觀測到，包括空白LNP或20.5%蔗糖在凍融後減緩了尺寸及PDI之增加及囊封%之降低。 表 15

調配物編號	LNP-modRNA 描述	調配物描述	調配緩衝液
1	4x FT 後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
2	4x FT 後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 其中目標脂質等效於 0.2 mg/mL mRNA，2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
3	4x FT 後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中其中目標脂質等效於0.1 mg/mL DP，2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
4	4x FT 後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-15.4% w/v蔗糖中	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris / 15.4% w/v 蔗糖中 2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 15.4% w/v蔗糖
5	4x FT 後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-20.5% w/v蔗糖中	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris / 20.5% w/v 蔗糖中 2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 20.5% w/v蔗糖
6	4x FT 後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
7	4x FT 後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 其中目標脂質等效於0.2 mg/mL DP，2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
8	4x FT 後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 其中目標脂質等效於0.1 mg/mL DP，2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
9	4x FT 後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-15.4% w/v蔗糖中	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris / 15.4% w/v 蔗糖中 2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 15.4% w/v蔗糖
10	4x FT 後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-20.5% w/v蔗糖中	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris / 20.5% w/v 蔗糖中 2.25 mL填充體積，-80℃冷凍儲存	10 mM Tris / 20.5% w/v蔗糖
11	空白 LNP ( 冷凍 )目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	空白LNP (對照樣品) 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
12	空白 LNP ( 冷凍 )目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	空白LNP (對照樣品) 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
13	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-蔗糖中， ( 未冷凍 )	0.01 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中，3.5 mL填充體積， 2-8 ℃ 儲存	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
14	0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-蔗糖中， ( 未冷凍 )	0.005 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中，3.5 mL填充體積， 2-8 ℃ 儲存	10 mM Tris / 10.3% w/v蔗糖
15	0.1 mg/mL流感modRNA於Tris-蔗糖中 ( 冷凍對照 )	0.1 mg/mL mRNA於Tris / 10%蔗糖中，0.075mL填充體積 -80℃冷凍對照	10 mM Tris / 10%蔗糖

更詳細而言，第1-10組之藥品(DP)冷凍供應且在劑量製備時已完成4×解凍循環。第1-5組對應於含有0.01 mg/mL流感modRNA之DP調配物。第6-10組對應於含有0.005 mg/mL流感modRNA之DP調配物。第11-12組(空白LNP於Tris-10.3% w/v蔗糖中)冷凍供應且在劑量製備時完成1次。制定第11-12組(空白LNP)之稀釋計劃以靶向與第7組及第8組(含有0.005 mg/mL mRNA且靶向脂質等效於0.2或0.1 mg/mL含有mRNA之DP)所提供相同的量之脂質。第13-14組以液體形式供應且保持在2-8℃。第15組用作冷凍研究對照。將先前冷凍之原始小瓶解凍，等分至單次使用試管中，且再冷凍。

進行HAI及中和分析作為讀數結果。所有中和樣品均熱滅活且在-80℃下冷凍/儲存。

實例11：研究測試在高蔗糖濃度下之共調配之流感modRNA及空白LNP相對於流感modRNA LNP (初打及加打)  此小鼠研究將提供活體內資料以使得能夠圍繞空白脂質奈米粒子(LNP)相對於高蔗糖濃度之使用而得出調配物研發策略。研究之目的包括：(1)研究與僅mRNA LNP相比時，共調配之(mRNA及空白LNP)對含有低濃度流感modRNA(華盛頓病毒株)之Tris-10.3% w/v蔗糖調配物的免疫原性之影響；(2)研究空白LNP在不存在mRNA之情況下對免疫原性之影響；(3)研究高蔗糖濃度(15.4% w/v相對於20.5% w/v)對含有低濃度流感modRNA之Tris-蔗糖調配物之免疫原性的影響；(4)比較含有mRNA LNP (在Tris-10.3% w/v蔗糖中)之冷凍與未冷凍藥品在完成4次凍融循環後對免疫原性的影響。小鼠將免疫接種不同的含有modRNA之調配物，其概述於表12中，表13中提供測試品及稀釋劑的其他細節。在初打後21天及加打後14天(在第28天進行)收集之血清將藉由血清學測試(HAI，1天中和，第21天、第42天)評估。可藉由使用每組10只小鼠確定各組之間的統計差異。小鼠中開始有Balb/c雌性小鼠在研究開始第11-13週衰老。表12-15分別指相同15種調配物及生理鹽水對照。 表 12

小組編號	小鼠	RNA DP描述 †	劑量(µg)	劑量體積/途徑	疫苗接種 (日)	出血 (日)
1	10	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
2	10	DP4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.2 mg/mL	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
3	10	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
4	10	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-15.4% w/v蔗糖中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
5	10	蔗糖4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-20.5% w/v中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
6	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
7	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
8	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
9	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-15.4% w/v蔗糖中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
10	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-20.5% w/v蔗糖中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
11	10	空白LNP於Tris-10.3% w/v蔗糖(冷凍)中 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	-	50 µl / IM	0，28	21，42
12	10	空白LNP於Tris-10.3% w/v蔗糖(冷凍)中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	-	50 µl / IM	0，28	21，42
13	10	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖(液體)中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
14	10	0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖(液體)中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
15	10	1x FT，0.1 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中	0.2	50 µl / IM	0，28	21，42
16	5	生理鹽水	-	50 µl / IM	0，28	21，42

^†第1-10組冷凍供應且在劑量製備時將完成4×F/T。 第11-12組(空白LNP於Tris-10.3 w/v蔗糖中)冷凍供應且在劑量製備時將完成1×F/T。 第13-14組以液體形式供應且將保持在2-8℃。 第15組將充當研究橋接對照，且冷凍供應 表 13測試品及稀釋劑

項目編號	測試品/稀釋劑	DP描述 †	調配基質及資訊	小瓶數目/儲存 (包括應急小瓶)
1	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即不包括空白LNP)	0.01 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
2	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris- 10.3% w/v蔗糖中	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 其中目標脂質等效於0.2 mg/mL DP， 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即包括空白LNP)	0.01 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
3	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris- 10.3% w/v蔗糖中	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 其中目標脂質等效於0.1 mg/mL DP， 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即包括空白LNP)	0.01 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
4	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris- 15.4% w/v蔗糖中	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris/中間物蔗糖中 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即不包括空白LNP)	0.01 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/15.4% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
5	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris- 20.5% w/v蔗糖中	4X FT後，0.01 mg/mL mRNA於Tris/High蔗糖中 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即不包括空白LNP)	0.01 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/20.5% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
6	0.005 mg/mL流感modRNA於Tris- 10.3% w/v蔗糖中	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即不包括空白LNP)	0.005 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
7	0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 其中目標脂質等效於0.2 mg/mL DP， 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即包括空白LNP)	0.005 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
8	0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中 其中目標脂質等效於0.1 mg/mL DP， 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即包括空白LNP)	0.005 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
9	0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-15.4% w/v蔗糖中	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris/ Intermediate蔗糖中 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即不包括空白LNP)	0.005 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/15.4% w/v蔗糖中，pH 7.4	4個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及2個應急)
10	0.005mg/mL流感modRNA於Tris-20.5% w/v蔗糖中	4X FT後，0.005 mg/mL mRNA於Tris/ High蔗糖中 2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積(亦即不包括空白LNP)	0.005 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/20.5% w/v蔗糖中，pH 7.4	6個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及4個應急)
11	空白LNP 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	具有等效於0.2 mg/mL DP之脂質且無mRNA的LNP於Tris/蔗糖中，2.25 mL填充體積， -80℃冷凍儲存	LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
12	空白LNP 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	具有等效於0.1 mg/mL DP之脂質且無mRNA的LNP於Tris/蔗糖中，2.25 mL填充體積， -80℃冷凍體積	LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	5個小瓶/-80℃ (1個初打、1個加打及3個應急)
13	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖(液體)中	0.01 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中， 3.5 mL填充體積， 2-8℃儲存(亦即不包括空白LNP)	0.01 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	3個小瓶/2-8℃ (1個初打、1個加打及1個應急)
14	0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖(液體)中	0.005 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中， 3.5 mL填充體積， 2-8℃儲存(亦即不包括空白LNP)	0.005 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中，pH 7.4	3個小瓶/2-8℃ (1個初打、1個加打及1個應急)
15	0.1 mg/mL流感modRNA於Tris- 10.3% w/v蔗糖中	0.1 mg/mL mRNA於Tris/蔗糖中， -80℃冷凍對照，先前經1次解凍及再冷凍之等分試樣 0.075 mL填充體積 -80℃儲存(亦即不包括空白LNP)	0.1 mg/mL modRNA LNP於10 mM Tris/10.3% w/v蔗糖中， pH 7.4	2個等分試樣/-80℃ (1次初打/1次加打)
16	生理鹽水	生理鹽水	0.9 % NaCl於水中	3個等分試樣，RT

^†第1-10組冷凍供應且在劑量製備時將完成4×F/T。 第11-12組(空白LNP於Tris-10.3 w/v蔗糖中)冷凍供應且在劑量製備時將完成1×F/T。 第13-14組以液體形式供應且將保持在2-8℃。 第15組將充當研究橋接對照，且冷凍供應 表 14表12及表13中所述之測試品之分析測試結果.

	小組編號	DP 描述	所量測濃度， mg/mL	藉由 FA 之 mRNA 完整性， % / LMS ， %	囊封， %	藉由 DLS 之 尺寸， nm / PDI	藉由 IVE 之 陽性細胞 % (160 ng)	內毒素 ， EU/mL†
在空白 LNP 或高蔗糖濃度存在或不存在下含有 0.01 mg/mL 流感 modRNA 之藥品	1	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 (亦即不包括空白LNP)	0.0116	83 / NMT 3	90	79 / 0.22	81	NMT 0.1
2	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中，目標脂質等效於0.2 mg/mL DP (亦即包括空白LNP)	0.0123	80 / NMT 3	98	64 / 0.16	71	0.61
3	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP (亦即包括空白LNP)	0.0118	75 / NMT 3	98	68 / 0.19	81	0.12
4	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-15.4% w/v蔗糖中	0.0120	83 / NMT 3	94	70 / 0.15	81	NMT 1.00
5	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-20.5% w/v蔗糖中 (亦即不包括空白LNP)	0.0118	83 / NMT 3	95	61 / 0.13	83	NMT 1.00
在空白 LNP 或高蔗糖濃度存在或不存在下含有 0.005 mg/mL 流感 modRNA 之藥品	6	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 (亦即不包括空白LNP)	0.0058	83 / NMT 3	83	92 / 0.32	90	NMT 1.00
7	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中，目標脂質等效於0.2 mg/mL DP (亦即包括空白LNP)	0.0061	81 / 4	98	63 / 0.16	41	0.34
8	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中，目標脂質等效於0.1 mg/mL DP (亦即包括空白LNP)	0.0059	82 / NMT 3	98	65 / 0.16	72	0.54
9	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-15.4% w/v蔗糖中 (亦即不包括空白LNP)	0.0056	82 / NMT 3	91	73 / 0.20	90	NMT 1.00
10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-20.5% w/v蔗糖中 (亦即不包括空白LNP)	0.0050	81 / NMT 3	91	65 / 0.19	90	NMT 1.00
	小組編號	DP 描述	所量測濃度， mg/mL	藉由 FA 之 mRNA 完整性， % / LMS ， %	囊封， %	藉由 DLS 之 尺寸， nm / PDI	藉由 IVE 之 陽性細胞 % (160 ng)	內毒素 ， EU/mL†
空白 LNP 對照樣品	11	空白LNP於Tris-10.3% w/v蔗糖中， 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	NA	NA	NA	56 / 0.10	5	0.83
12	空白LNP於Tris-10.3% w/v蔗糖中， 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	NA	NA	NA	57 / 0.10	6	0.31
液體藥品	13	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中， ( 液體 )(亦即不包括空白LNP)	0.013	86 / NMT 3	98	61 / 0.08	83	NMT 0.1
14	0.005 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中， ( 液體 )(亦即不包括空白LNP)	0.006	87 / NMT 3	97	63 / 0.09	95	NMT 1.00
研究橋接對照	15	0.1 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中， 冷凍對照	0.109	94	94	70 / 0.16	94 (125 ng) 91 (63 ng)	0.88

結果：對於modRNA+空白LNP之2種，給藥後2週觀測到中和效價(幾何平均效價，GMT)的較大提昇(參見例如第2組、第3組、第7組及第8組)；未冷凍材料(第13組及第14組)引發抗體效價比4×F/T材料低5(0.005 mg)至20(0.01 mg)倍。 表 15

小組編號	小鼠	RNA DP描述 †	GMT	IVE
1	10	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於 Tris-10.3% w/v蔗糖中	4726	81
2	10	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於 Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	29824	71
3	10	0.01 mg/mL流感modRNA於Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	22881	81
4	10	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於 Tris-15.4% w/v蔗糖中	9397	81
5	10	4x FT後，0.01 mg/mL流感modRNA於 Tris-20.5% w/v蔗糖中	3464	83
6	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於 Tris-10.3% w/v蔗糖中	1637	90
7	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於 Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	10886	41
8	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於 Tris-10.3% w/v蔗糖中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	25297	72
9	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於 Tris-15.4% w/v蔗糖中	2776	90
10	10	4x FT後，0.005 mg/mL流感modRNA於 Tris-20.5% w/v蔗糖中	1881	90
11	10	空白LNP於Tris-10.3% w/v蔗糖(冷凍)中 目標脂質等效於0.2 mg/mL DP	41	5
12	10	空白LNP於Tris-10.3% w/v蔗糖(冷凍)中 目標脂質等效於0.1 mg/mL DP	44	6
13	10	0.01 mg/mL流感modRNA於 Tris-10.3% w/v蔗糖(液體)(未冷凍)中	237	83
14	10	0.005 mg/mL流感modRNA於 Tris-10.3% w/v蔗糖(液體)(未冷凍)	306	95
15	10	1x FT，0.1 mg/mL流感modRNA於 Tris-10.3% w/v蔗糖中	373072	n/a
16	5	生理鹽水	40	n/a

* * *

本文所揭示及主張之所有方法可在不依據本發明進行不當實驗之情況下進行及執行。雖然本發明之組合物及方法已根據較佳態樣加以描述，但熟習此項技術者將顯而易見的係，變化形式可適用於本文所描述之方法以及方法之步驟或方法之步驟順序，而不脫離本發明之概念、精神及範疇。更確切而言，顯而易知化學上及生理學上均相關之某些藥劑可取代本文所描述之藥劑，同時實現相同或類似結果。本領域中熟習此項技術者顯而易知的所有此類類似取代及修改視為在由隨附申請專利範圍所界定的本揭示案之精神、範疇及概念內。

在以下編號實施例中進一步描述本發明之實施例： 1.     一種免疫原組合物，其包含(a)第一脂質奈米粒子；(b)第二脂質奈米粒子；及(c)低溫保護劑；其中該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質；其中該第一脂質奈米粒子囊封具有編碼至少一種相關多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其中該至少一種相關多肽包含抗原，較佳其中該抗原為流感抗原；且其中該第二脂質奈米粒子不囊封核酸。 2.     如實施例1之組合物，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 3.     如實施例1或2之組合物，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 4.     如實施例1至3中任一項之組合物，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 5.     如實施例1至4中任一項之免疫原組合物，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 6.     如實施例1之組合物，其中該第一脂質奈米粒子與該第二脂質奈米粒子之總比率在1:1至1:4999範圍內。 7.     如實施例1至6中任一項之組合物，其中該組合物中至少60%之該RNA完全囊封於該第一脂質奈米粒子中或與該第一脂質奈米粒子締合。 8.     如實施例1至7中任一項之組合物，其中該第二脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質；ii)中性脂質及/或磷脂；iii)類固醇；及iv)聚合物結合脂質。 9.     如實施例8之組合物，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 10.   如實施例8或9之組合物，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 11.    如實施例8至10中任一項之組合物，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 12.   如實施例8至11中任一項之組合物，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 13.   如實施例8至12中任一項之組合物，其中該第二脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質與該第一脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質相同。 14.   如實施例8至12中任一項之組合物，其中第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質中之一或多者不同於第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質。 15.   如實施例1至7中任一項之組合物，其中該第二脂質奈米粒子為脂質體。 16.   如實施例15之組合物，其中該脂質體包含i)磷脂及/或中性脂質；ii)類固醇；及iii)聚合物結合脂質。 17.   如實施例15或16之組合物，其中該脂質體進一步包含陽離子脂質。 18.   如實施例17之組合物，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 19.   如實施例16至18中任一項之組合物，其中中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 20.   如實施例16至19中任一項之組合物，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 21.   如實施例16至20中任一項之組合物，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 22.   如實施例1至21中任一項之組合物，其中組合物為液體。 23.   如實施例1至22中任一項之組合物，其中該組合物經冷凍。 24.   如實施例1至23中任一項之組合物，其中低溫保護劑包含雙醣。 25.   如實施例1至24中任一項之組合物，其中低溫保護劑包含蔗糖。 26.   如實施例1至25中任一項之組合物，其中低溫保護劑包含蔗糖，且其中組合物包含至少約2% w/v至30% w/v蔗糖。 27.   如實施例1至26中任一項之組合物，其中低溫保護劑包含蔗糖，且其中組合物包含至少約10% w/v至25% w/v蔗糖。 28.   如實施例1至27中任一項之組合物，其中低溫保護劑包含蔗糖，且其中組合物包含至少約10.3% w/v至20.5% w/v蔗糖。 29.   如實施例1至28中任一項之組合物，其中在冷凍之前組合物中低溫保護劑之濃度為5至600 mg/mL。 30.   如實施例1至29中任一項之組合物，其中第一及第二脂質奈米粒子包含相對於第一及第二脂質奈米粒子中之所有脂質組分之總莫耳數的40與50莫耳%之間的陽離子脂質。 31.   如實施例1至30中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之緩衝液。 32.   如實施例1至31中任一項之組合物，其中第二脂質奈米粒子之尺寸比第一脂質奈米粒子小50%。 33.   如實施例1至31中任一項之組合物，其中第二脂質奈米粒子之尺寸比第一脂質奈米粒子大50%。 34.   如實施例1至33中任一項之組合物，其中第一脂質奈米粒子及該第二脂質奈米粒子之混合物在凍融循環之後之平均直徑尺寸較佳在20至180 nm範圍內，更佳在30至150 nm範圍內，且最佳在40至120 nm範圍內。 35.   如實施例1至34中任一項之組合物，其中組合物之含水量小於總組合物之約10%。 36.   如實施例1至35中任一項之組合物，其中組合物之含水量在總組合物之約0.1%與10%之間。 37.   如實施例1至36中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定至少約兩週。 38.   如實施例1至37中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定至少1個月。 39.   如實施例1至38中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定至少約兩週。 40.   如實施例1至39中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定至少約四週。 41.   如實施例1至40中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定約2週至約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或2年。 42.   如實施例1至41中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後至少約兩週時具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。 43.   如實施例1至42中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後至少1個月時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。 44.   如實施例1至43中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後約2週至約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或2年時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。 45.   如實施例1至44中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存約兩週之後具有至少80%之完整RNA。 46.   如實施例1至45中任一項之組合物，其中該RNA之濃度在約10 pg/ml至約10 mg/ml範圍內，較佳在約0.1 μg/mL至0.5 mg/mL範圍內。 47.   如實施例1至46中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，RNA之RNA完整性為至少約50%或更高，較佳至少約60%或更高，更佳至少約70%或更高，最佳至少約80%或更高。 48.   如實施例1至47中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，RNA之RNA完整性比包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物高至少約50%，較佳高至少約60%，更佳高至少約70%，最佳高至少約80%。 49.   如實施例1至48中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比包含大於60%以上之經囊封RNA，較佳大於70%以上之經囊封RNA，更佳大於80%以上之經囊封RNA且最佳大於90%以上之經囊封RNA。 50.   如實施例1至49中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比包含大於60%之經囊封RNA，較佳大於70%之經囊封RNA，更佳大於80%之經囊封RNA，且最佳大於90%之經囊封RNA。 51.   如實施例1至50中任一項之組合物，其中RNA已藉由至少一個純化步驟純化，且其中第一脂質奈米粒子已藉由至少一個純化步驟，較佳藉由至少一個切向流過濾(TFF)步驟及/或至少一個澄清步驟及/或至少一個過濾步驟純化。 52.   如實施例1至51中任一項之組合物，其中RNA為純化RNA，較佳RP-HPLC純化RNA及/或切向流過濾(TFF)純化RNA。 53.   如實施例1至52中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，組合物之效能與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比降低小於約30%，較佳小於約20%，更佳小於約10%。 54.   如實施例1至53中任一項之組合物，其中該組合物包含有效量之RNA以在細胞中產生相關多肽。 55.   如實施例1至54中任一項之組合物，其中該RNA進一步包含經修飾之核苷酸。 56.   如實施例1至55中任一項之組合物，其中RNA包含經修飾之核苷酸，該核苷酸包含N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸酯(m1ΨTP)。 57.   如實施例1至56中任一項之組合物，其中該RNA包含編碼該抗原之可轉譯區且包含經修飾之核苷，該核苷包含1-甲基-假尿苷。 58.   如實施例1至57中任一項之組合物，其中RNA包含編碼至少一種流感病毒抗原性多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架。 59.   如實施例1至58中任一項之組合物，其中RNA進一步包含5'帽類似物。 60.   如實施例1至59中任一項之組合物，其中該RNA進一步包含5'帽類似物且其中該5'帽類似物包含m ₂ ^7,3' ^-OMeGppp(m ₁2' ^-O)ApG。 61.   如實施例1至60中任一項之組合物，其中該抗原為流感血球凝集素1 (HA1)、血球凝集素2 (HA2)、HA1或HA2之免疫原片段或前述中之任何兩者或多於兩者之組合。 62.   如實施例1至61中任一項之組合物，其中RNA編碼至少兩種抗原性多肽或其免疫原片段，其中第一抗原為HA1、HA2或HA1與HA2之組合，且其中第二抗原選自由以下組成之群：神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)。 63.   如實施例1至62中任一項之組合物，其中該RNA編碼至少兩種抗原性多肽或其免疫原片段，其中第一抗原為HA1、HA2或HA1與HA2之組合，且其中第二抗原為神經胺糖酸苷酶(NA)。 64.   如實施例1至60中任一項之組合物，其中抗原為來自以下的多肽或其免疫原片段：沙狀病毒；星狀病毒；崩芽病毒；杯狀病毒；冠狀病毒；絲狀病毒；黃病毒；嗜肝DNA病毒；肝炎病毒；正黏液病毒；副黏液病毒；小RNA病毒；里奧病毒(reovirus)；反轉錄病毒；棒狀病毒；披衣病毒；或前述中之任何兩者或更多者之組合。 65.   如實施例1至60中任一項之組合物，其中該抗原為來自以下之多肽或其免疫原片段：鮑氏不動桿菌、邊蟲屬、嗜吞噬細胞無形體、巴西鉤蟲、十二指腸鉤蟲、溶血隱秘桿菌、蛔蟲、麴菌屬、星狀病毒科、巴貝蟲屬、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、韓瑟勒巴通氏菌、BK病毒、人芽囊原蟲、皮炎芽生菌、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋體、疏螺旋體屬、疏螺旋體屬、布魯桿菌屬、馬來絲蟲、布尼亞病毒科、洋蔥伯克氏菌及其他伯克氏菌種、鼻疽伯克氏菌、類鼻疽伯克氏菌、杯狀病毒科、彎曲桿菌屬、白色念珠菌、念珠菌屬、沙眼披衣菌、肺炎嗜衣原體、鸚鵡披衣菌、CJD朊病毒、華支睾吸蟲、肉毒桿菌、艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、產氣莢膜梭菌、梭菌屬、破傷風梭菌、球孢子菌屬、冠狀病毒、白喉棒狀桿菌、貝氏考克斯菌、克里米亞-岡果出血熱病毒、新型隱球菌、隱孢子蟲屬、巨細胞病毒(CMV)、登革病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4)、脆雙核阿米巴、伊波拉病毒(EBOV)、胞蟲屬、查菲艾利希體、尤溫艾利希體、艾利希體屬、溶組織內阿米巴、腸球菌屬、腸病毒屬、腸病毒、主要科沙奇A病毒及腸病毒71 (EV71)、表皮癬菌屬、埃-巴二氏病毒(EBV)、大腸桿菌01 57:H7、01 1 1及O104:H4、肝片吸蟲及巨大肝蛭、FFI朊病毒、絲蟲總科超家族、黃病毒、土拉文氏桿菌、梭桿菌屬、白地絲黴菌、腸鞭毛蟲、頷口蟲屬、GSS朊病毒、瓜納瑞托病毒、杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、幽門螺旋桿菌、亨尼帕病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、單純疱疹病毒1及2 (HSV-1及HSV-2)、莢膜組織胞漿菌、人類免疫缺乏病毒(HIV)、威尼克外瓶黴、人類博卡病毒(HBoV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)及人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類間質肺炎病毒(hMPV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、人類副流行性感冒病毒(HPIV)、日本腦炎病毒、JC病毒、胡甯病毒、金氏金氏菌、肉芽腫克雷伯氏菌、庫魯病朊病毒、賴薩病毒、嗜肺性退伍軍人桿菌、利什曼原蟲屬、鉤端螺旋體屬、產單核細胞李斯特氏菌、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、馬丘波病毒、馬拉色菌屬、馬堡病毒、麻疹病毒、橫川後殖吸蟲、微孢子蟲門、傳染性軟疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻風分支桿菌及彌漫型痲瘋分枝桿菌、結核分支桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎黴漿菌、變形纖毛蟲、美洲鉤蟲、淋病奈瑟氏菌、奈瑟氏腦膜炎菌、星形土壤絲菌、諾卡菌屬、人蟠尾絲蟲、恙蟲病東方體、正黏液病毒科家族(流感)、巴西副球孢子菌、並殖吸蟲屬、衛氏並殖吸蟲、細小病毒B1 9、巴氏桿菌屬、瘧原蟲屬、傑氏肺囊蟲、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、鼻病毒、鼻病毒、痘立克次體、立克次體屬、普氏立克次體、落磯山熱立克次體、傷寒立克次體、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒、輪狀病毒、風疹病毒、薩比亞病毒、沙門氏菌屬、疥蟎、SARS冠狀病毒、住血吸蟲屬、志賀氏桿菌屬、辛諾柏病毒、漢坦病毒、申克孢子絲菌、葡萄球菌屬、葡萄球菌屬、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、腸類圓線蟲、條蟲屬、有鉤條蟲、蜱傳腦炎病毒(TBEV)、犬蛔蟲或貓蛔蟲、弓蟲、梅毒螺旋體、旋毛蟲、陰道毛滴蟲、發癬菌屬、毛首鞭形線蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、解脲支原體、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、大天花或小天花、vCJD朊病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、霍亂弧菌、西尼羅河病毒、西部馬腦炎病毒、潘氏絲狀蟲、黃熱病病毒、小腸結腸炎耶爾森氏菌、鼠疫耶爾森菌、假結核耶爾森菌或前述任何兩者或更多者之組合。 66.   如實施例1至65中任一項之組合物，其中開放閱讀框架經密碼子最佳化。 67.   如實施例1至66中任一項之組合物，其中該組合物包含ALC-0315 (4-羥丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)。 68.   如實施例1至67中任一項之組合物，其中組合物包含ALC-0159 (2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙醯胺)。 69.   如實施例1至68中任一項之組合物，其中該組合物包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。 70.   如實施例1至69中任一項之組合物，其中該組合物包含膽固醇。 71.   如實施例1至70中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少2次。 72.   如實施例1至71中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少3次。 73.   如實施例1至72中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少4次。 74.   如實施例1至73中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少5次。 75.   一種在細胞中產生相關多肽之方法，其包含投與如實施例1至74中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比產生增加之量的該多肽。 76.   如實施例75之方法，其中該組合物係向哺乳動物投與。 77.   如實施例75至76中任一項之方法，其中該組合物係向人類投與。 78.   如實施例75至77中任一項之方法，其中該組合物係向處於感染流感之風險下的哺乳動物投與。 79.   一種增加包含第一脂質奈米粒子之組合物之穩定性的方法，該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇、iv)聚合物結合脂質及v)囊封於第一脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，該方法包含使該組合物與第二脂質奈米粒子接觸，其中該第二脂質奈米粒子不囊封核糖核酸(RNA)聚核苷酸。 80.   如實施例79之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 81.   如實施例79或80之方法，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 82.   如實施例79至81中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 83.   如實施例79至82中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 84.   如實施例79至83中任一項之方法，其中該第二脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質。 85.   如實施例84之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 86.   如實施例84或85之方法，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 87.   如實施例84至86中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 88.   如實施例84至87中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 89.   如實施例84至88中任一項之方法，其中該第二脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質與該第一脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質相同。 90.   如實施例84至88中任一項之方法，其中第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質中之一或多者不同於第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質。 91.   如實施例79之方法，其中該第二脂質奈米粒子包含脂質體。 92.   如實施例91之方法，其中該脂質體包含i)磷脂及/或中性脂質；ii)類固醇及/或iii)聚合物結合脂質。 93.   如實施例92之方法，其中該脂質體進一步包含陽離子脂質。 94.   如實施例93之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 95.   如實施例92至94中任一項之方法，其中中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 96.   如實施例92至95中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 97.   如實施例92至96中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 98.   如實施例79至97中任一項之方法，其中穩定性增加包含該組合物在冷凍時之儲存穩定性。 99.   如實施例79至98中任一項之方法，其中穩定性增加包含該組合物在冷凍之後解凍時的穩定性。 100.  如實施例79至99中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少2次時組合物之穩定性。 101.  如實施例79至100中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少3次時組合物之穩定性。 102.  如實施例79至101中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少4次時組合物之穩定性。 103.  如實施例79至102中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少5次時組合物之穩定性。 104.  如實施例79至103中任一項之方法，其中使該組合物與第二脂質奈米粒子接觸形成如實施例1至74中任一項之免疫原組合物。 105.  一種增加包含第一脂質奈米粒子及第二脂質奈米粒子之組合物之穩定性的方法，該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇、iv)聚合物結合脂質及v)囊封於該第一脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，該第二脂質奈米粒子不具有囊封於該第二脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，且該方法包含純化該組合物以在冷凍之前自該組合物移除複數種該第二脂質奈米粒子之第一部分，其中該複數種該第二脂質奈米粒子之第二部分保留在該組合物中。 106.  如實施例105之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 107.  如實施例105或106之方法，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 108.  如實施例105至107中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 109.  如實施例105至108中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 110.  如實施例105至109中任一項之方法，其中該第二脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質。 111.  如實施例110之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 112.  如實施例110或111之方法，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 113.  如實施例110至112中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 114.  如實施例110至113中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 115.  如實施例110至114中任一項之方法，其中該第二脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質與該第一脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質相同。 116.  如實施例110至114中任一項之方法，其中第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質中之一或多者不同於第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質。 117.  如實施例105之方法，其中該第二脂質奈米粒子包含脂質體。 118.  如實施例117之方法，其中該脂質體包含i)磷脂及/或中性脂質；ii)類固醇及/或iii)聚合物結合脂質。 119.  如實施例118之方法，其中該脂質體進一步包含陽離子脂質。 120.  如實施例119之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 121.  如實施例118至120中任一項之方法，其中中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 122.  如實施例118至121中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 123.  如實施例118至122中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 124.  如實施例105至123中任一項之方法，其中穩定性增加包含該組合物在冷凍時之儲存穩定性。 125.  如實施例105至124中任一項之方法，其中穩定性增加包含該組合物在冷凍之後解凍時的穩定性。 126.  如實施例105至125中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少2次時組合物之穩定性。 127.  如實施例105至126中之任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少3次時組合物之穩定性。 128.  如實施例105至127中之任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少4次時組合物之穩定性。 129.  如實施例105至128中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少5次時組合物之穩定性。 130.  如實施例105至129中任一項之方法，其中純化該組合物以在冷凍之前自組合物移除複數種該第二脂質奈米粒子之第一部分，形成如實施例1至74中任一項之免疫原組合物。 131.  一種免疫原組合物，其包含(a)第一脂質奈米粒子；及有效量之低溫保護劑；其中第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質；其中該第一脂質奈米粒子囊封具有編碼至少一種相關多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其中該至少一種相關多肽包含抗原，較佳其中該抗原為流感抗原；其中該低溫保護劑包含醣；且其中低溫保護劑之有效量為至少約2% w/v至30% w/v之組合物。 132.  如實施例131之組合物，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 133.  如實施例131或132之組合物，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 134.  如實施例131至133中任一項之組合物，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 135.  如實施例131至134中任一項之組合物，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 136.  如實施例131至135中任一項之組合物，其中低溫保護劑包含雙醣。 137.  如實施例131至136中任一項之組合物，其中低溫保護劑包含蔗糖。 138.  如實施例131至137中任一項之組合物，其中該組合物包含至少約10% w/v至25% w/v之低溫保護劑。 139.  如實施例131至138中任一項之組合物，其中組合物包含至少約10.3% w/v至20.5% w/v之低溫保護劑。 140.  如實施例131至139中任一項之組合物，其中在冷凍之前組合物中低溫保護劑之濃度為5至600 mg/mL。 141.  如實施例131至140中任一項之組合物，其進一步包含第二脂質奈米粒子，其中該第二脂質奈米粒子不囊封RNA聚核苷酸。 142.  如實施例141之組合物，其中該第二脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質。 143.  如實施例142之組合物，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 144.  如實施例142或143之組合物，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 145.  如實施例142至144中任一項之組合物，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 146.  如實施例142至145中任一項之組合物，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 147.  如實施例142至146中任一項之組合物，其中該第二脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質與該第一脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質相同。 148.  如實施例142至146中任一項之組合物，其中第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質中之一或多者不同於第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質。 149.  如實施例141之組合物，其中該第二脂質奈米粒子為脂質體。 150.  如實施例149之組合物，其中該脂質體包含i)磷脂及/或中性脂質；ii)類固醇；及iii)聚合物結合脂質。 151.  如實施例150之組合物，其中該脂質體進一步包含陽離子脂質。 152.  如實施例151之組合物，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 153.  如實施例150或152中任一項之組合物，其中中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 154.  如實施例150至153中任一項之組合物，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 155.  如實施例150至154中任一項之組合物，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 156.  如實施例141至155中任一項之組合物，其中該第一脂質奈米粒子與該第二脂質奈米粒子之總比率在1:1至1:4999範圍內。 157.  如實施例141至156中任一項之組合物，其中該組合物中至少60%之該RNA完全囊封於該第一脂質奈米粒子中或與該第一脂質奈米粒子締合。 158.  如實施例141至157中任一項之組合物，其中第一及第二脂質奈米粒子包含相對於第一及第二脂質奈米粒子中之所有脂質組分之總莫耳數的40與50莫耳%之間的陽離子脂質。 159.  如實施例141至158中任一項之組合物，其中第二脂質奈米粒子之尺寸比第一脂質奈米粒子小50%。 160.  如實施例141至158中任一項之組合物，其中第二脂質奈米粒子之尺寸比第一脂質奈米粒子大50%。 161.  如實施例141至160中任一項之組合物，其中第一脂質奈米粒子及該第二脂質奈米粒子之混合物在凍融循環之後之平均直徑尺寸較佳在20至180 nm範圍內，更佳在30至150 nm範圍內，且最佳在40至120 nm範圍內。 162.  如實施例141至161中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，與不包含第二脂質奈米粒子之組合物相比，包括第二脂質奈米粒子進一步增加組合物之穩定性。 163.  如實施例131至162中任一項之組合物，其中該組合物為液體。 164.  如實施例131至163中任一項之組合物，其中該組合物在小於或等於冷藏儲存之溫度下經冷凍或呈凍乾組合物形式。 165.  如實施例131至164、235或254中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之緩衝液。 166.  如實施例131至165中任一項之組合物，其中組合物之含水量小於總組合物之約10%。 167.  如實施例131至166中任一項之組合物，其中組合物之含水量在總組合物之約0.1%與10%之間。 168.  如實施例131至167中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定至少約兩週。 169.  如實施例131至168中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定至少1個月。 170.  如實施例131至169中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定至少約兩週。 171.  如實施例131至170中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定至少約四週。 172.  如實施例131至171中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後穩定約2週至約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或2年。 173.  如實施例131至172中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後至少約兩週時具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。 174.  如實施例131至173中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後至少1個月時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整經囊封RNA。 175.  如實施例131至174中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存之後約2週至約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或2年時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。 176.  如實施例131至175中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為冷凍液體組合物或作為凍乾組合物儲存約兩週之後具有至少80%之完整RNA。 177.  如實施例131至176中任一項之組合物，其中該RNA之濃度在約10 pg/ml至約10 mg/ml範圍內，較佳在約0.1 μg/mL至0.5 mg/mL範圍內。 178.  如實施例131至177中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，與包含該第一脂質奈米粒子而不包含有效量之低溫保護劑之組合物相比，RNA之RNA完整性為至少約50%或更高，較佳至少約60%或更高，更佳至少約70%或更高，最佳至少約80%或更高。 179.  如實施例131至178中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，RNA之RNA完整性比包含第一脂質奈米粒子而不包含有效量之低溫保護劑的組合物高至少約50%，較佳高至少約60%，更佳高至少約70%，最佳高至少約80%。 180.  如實施例131至179中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含有效量之低溫保護劑之組合物相比包含大於60%以上之經囊封RNA，較佳大於70%以上之經囊封RNA，更佳大於80%以上之經囊封RNA且最佳大於90%以上之經囊封RNA。 181.  如實施例131至180中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含有效量之低溫保護劑之組合物相比包含大於60%之經囊封RNA，較佳大於70%之經囊封RNA，更佳大於80%之經囊封RNA，且最佳大於90%之經囊封RNA。 182.  如實施例131至181中任一項之組合物，其中RNA已藉由至少一個純化步驟純化，且其中第一脂質奈米粒子已藉由至少一個純化步驟，較佳藉由至少一個切向流過濾(TFF)步驟及/或至少一個澄清步驟及/或至少一個過濾步驟純化。 183.  如實施例131至182中任一項之組合物，其中RNA為純化RNA，較佳RP-HPLC純化RNA及/或切向流過濾(TFF)純化RNA。 184.  如實施例131至183中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，組合物之效能與包含第一脂質奈米粒子而不包含有效量之低溫保護劑的組合物相比降低小於約30%，較佳小於約20%，更佳小於約10%。 185.  如實施例131至184中任一項之組合物，其中該組合物包含有效量之RNA以在細胞中產生相關多肽。 186.  如實施例131至185中任一項之組合物，其中該RNA進一步包含經修飾之核苷酸。 187.  如實施例131至186中任一項之組合物，其中RNA包含經修飾之核苷酸，該核苷酸包含N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸酯(m1ΨTP)。 188.  如實施例131至187中任一項之組合物，其中該RNA包含編碼該抗原之可轉譯區且包含經修飾之核苷，該核苷包含1-甲基-假尿苷。 189.  如實施例131至188中任一項之組合物，其中RNA包含編碼至少一種流感病毒抗原性多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架。 190.  如實施例131至189中任一項之組合物，其中RNA進一步包含5'帽類似物。 191.  如實施例131至190中任一項之組合物，其中該RNA進一步包含5'帽類似物且其中該5'帽類似物包含m ₂ ^7,3' ^-OMeGppp(m ₁2' ^-O)ApG。 192.  如實施例131至191中任一項之組合物，其中該抗原為流感血球凝集素1 (HA1)、血球凝集素2 (HA2)、HA1或HA2之免疫原片段或前述中之任何兩者或多於兩者之組合。 193.  如實施例131至192中任一項之組合物，其中RNA編碼至少兩種抗原性多肽或其免疫原片段，其中第一抗原為HA1、HA2或HA1與HA2之組合，且其中第二抗原選自由以下組成之群：神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)。 194.  如實施例131至193中任一項之組合物，其中該RNA編碼至少兩種抗原性多肽或其免疫原片段，其中第一抗原為HA1、HA2或HA1與HA2之組合，且其中第二抗原為神經胺糖酸苷酶(NA)。 195.  如實施例131至191中任一項之組合物，其中抗原為來自以下的多肽或其免疫原片段：沙狀病毒；星狀病毒；崩芽病毒；杯狀病毒；冠狀病毒；絲狀病毒；黃病毒；嗜肝DNA病毒；肝炎病毒；正黏液病毒；副黏液病毒；小RNA病毒；里奧病毒(reovirus)；反轉錄病毒；棒狀病毒；披衣病毒；或前述中之任何兩者或更多者之組合。 196.  如實施例131至191中任一項之組合物，其中該抗原為來自以下之多肽或其免疫原片段：鮑氏不動桿菌、邊蟲屬、嗜吞噬細胞無形體、巴西鉤蟲、十二指腸鉤蟲、溶血隱秘桿菌、蛔蟲、麴菌屬、星狀病毒科、巴貝蟲屬、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、韓瑟勒巴通氏菌、BK病毒、人芽囊原蟲、皮炎芽生菌、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋體、疏螺旋體屬、疏螺旋體屬、布魯桿菌屬、馬來絲蟲、布尼亞病毒科、洋蔥伯克氏菌及其他伯克氏菌種、鼻疽伯克氏菌、類鼻疽伯克氏菌、杯狀病毒科、彎曲桿菌屬、白色念珠菌、念珠菌屬、沙眼披衣菌、肺炎嗜衣原體、鸚鵡披衣菌、CJD朊病毒、華支睾吸蟲、肉毒桿菌、艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、產氣莢膜梭菌、梭菌屬、破傷風梭菌、球孢子菌屬、冠狀病毒、白喉棒狀桿菌、貝氏考克斯菌、克里米亞-岡果出血熱病毒、新型隱球菌、隱孢子蟲屬、巨細胞病毒(CMV)、登革病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4)、脆雙核阿米巴、伊波拉病毒(EBOV)、胞蟲屬、查菲艾利希體、尤溫艾利希體、艾利希體屬、溶組織內阿米巴、腸球菌屬、腸病毒屬、腸病毒、主要科沙奇A病毒及腸病毒71 (EV71)、表皮癬菌屬、埃-巴二氏病毒(EBV)、大腸桿菌01 57:H7、01 1 1及O104:H4、肝片吸蟲及巨大肝蛭、FFI朊病毒、絲蟲總科超家族、黃病毒、土拉文氏桿菌、梭桿菌屬、白地絲黴菌、腸鞭毛蟲、頷口蟲屬、GSS朊病毒、瓜納瑞托病毒、杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、幽門螺旋桿菌、亨尼帕病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、單純疱疹病毒1及2 (HSV-1及HSV-2)、莢膜組織胞漿菌、人類免疫缺乏病毒(HIV)、威尼克外瓶黴、人類博卡病毒(HBoV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)及人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類間質肺炎病毒(hMPV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、人類副流行性感冒病毒(HPIV)、日本腦炎病毒、JC病毒、胡甯病毒、金氏金氏菌、肉芽腫克雷伯氏菌、庫魯病朊病毒、賴薩病毒、嗜肺性退伍軍人桿菌、利什曼原蟲屬、鉤端螺旋體屬、產單核細胞李斯特氏菌、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、馬丘波病毒、馬拉色菌屬、馬堡病毒、麻疹病毒、橫川後殖吸蟲、微孢子蟲門、傳染性軟疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻風分支桿菌及彌漫型痲瘋分枝桿菌、結核分支桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎黴漿菌、變形纖毛蟲、美洲鉤蟲、淋病奈瑟氏菌、奈瑟氏腦膜炎菌、星形土壤絲菌、諾卡菌屬、人蟠尾絲蟲、恙蟲病東方體、正黏液病毒科家族(流感)、巴西副球孢子菌、並殖吸蟲屬、衛氏並殖吸蟲、細小病毒B1 9、巴氏桿菌屬、瘧原蟲屬、傑氏肺囊蟲、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、鼻病毒、鼻病毒、痘立克次體、立克次體屬、普氏立克次體、落磯山熱立克次體、傷寒立克次體、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒、輪狀病毒、風疹病毒、薩比亞病毒、沙門氏菌屬、疥蟎、SARS冠狀病毒、住血吸蟲屬、志賀氏桿菌屬、辛諾柏病毒、漢坦病毒、申克孢子絲菌、葡萄球菌屬、葡萄球菌屬、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、腸類圓線蟲、條蟲屬、有鉤條蟲、蜱傳腦炎病毒(TBEV)、犬蛔蟲或貓蛔蟲、弓蟲、梅毒螺旋體、旋毛蟲、陰道毛滴蟲、發癬菌屬、毛首鞭形線蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、解脲支原體、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、水痘帶狀皰狀病毒(VZV)、大天花或小天花、vCJD朊病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、霍亂弧菌、西尼羅河病毒、西部馬腦炎病毒、潘氏絲狀蟲、黃熱病病毒、小腸結腸炎耶爾森氏菌、鼠疫耶爾森菌、假結核耶爾森菌或前述任何兩者或更多者之組合。 197.  如實施例131至194中任一項之組合物，其中開放閱讀框架經密碼子最佳化。 198.  如實施例131至197中任一項之組合物，其中該組合物包含ALC-0315 (4-羥丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)。 199.  如實施例131至198中任一項之組合物，其中組合物包含ALC-0159 (2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙醯胺)。 200.  如實施例131至199中任一項之組合物，其中該組合物包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。 201.  如實施例131至200中任一項之組合物，其中該組合物包含膽固醇。 202.  如實施例131至201中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少2次。 203.  如實施例131至202中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少3次。 204.  如實施例131至203中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少4次。 205.  如實施例131至204中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少5次。 206.  一種在細胞中產生相關多肽之方法，其包含投與如實施例131至205中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含第一脂質奈米粒子而不包含有效量之低溫保護劑之組合物相比產生增加量之多肽。 207.  根據實施例206之方法，其中該組合物係向哺乳動物投與。 208.  如實施例206至207中任一項之方法，其中該組合物係向人類投與。 209.  如實施例206至208中任一項之方法，其中該組合物係向處於感染流感之風險下的哺乳動物投與。 210.  一種增加包含第一脂質奈米粒子之組合物之穩定性的方法，該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇、iv)聚合物結合脂質及v)囊封於第一脂質奈米粒子中之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，該方法包含使該組合物與有效量之低溫保護劑接觸，其中該低溫保護劑包含醣，且其中該有效量之低溫保護劑為該組合物之至少約2% w/v至30% w/v。 211.  如實施例210之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 212.  如實施例210或211之方法，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 213.  如實施例210至212中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 214.  如實施例210至213中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 215.  如實施例210至214中任一項之方法，其中低溫保護劑包含雙醣。 216.  如實施例210至215中任一項之方法，其中低溫保護劑包含蔗糖。 217.  如實施例210至216中任一項之方法，其中該低溫保護劑之有效量為該組合物之至少約10% w/v至25%。 218.  如實施例210至217中任一項之方法，其中該低溫保護劑之有效量為該組合物之至少約10.3% w/v至20.5%。 219.  如實施例210至218中任一項之方法，其中在冷凍之前組合物中低溫保護劑之濃度為5至600 mg/mL。 220.  如實施例210至219中任一項之方法，其中該組合物進一步包含第二脂質奈米粒子，且其中該第二脂質奈米粒子不囊封RNA聚核苷酸。 221.  如實施例220之方法，其中該第二脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質。 222.  如實施例221之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 223.  如實施例221或222之方法，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 224.  如實施例221至223中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 225.  如實施例221至224中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 226.  如實施例221至225中任一項之方法，其中該第二脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質與該第一脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質相同。 227.  如實施例221至225中任一項之方法，其中第二脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質中之一或多者不同於第一脂質奈米粒子之i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及/或iv)聚合物結合脂質。 228.  如實施例220之方法，其中該第二脂質奈米粒子包含脂質體。 229.  如實施例228之方法，其中該脂質體包含i)磷脂及/或中性脂質；ii)類固醇及/或iii)聚合物結合脂質。 230.  如實施例229之方法，其中該脂質體進一步包含陽離子脂質。 231.  如實施例230之方法，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。 232.  如實施例229至223中任一項之方法，其中中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。 233.  如實施例229至232中任一項之方法，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。 234.  如實施例229至233中任一項之方法，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。 235.  如實施例210至234中任一項之方法，其中穩定性提高包含該組合物在冷凍時之儲存穩定性。 236.  如實施例210至235中任一項之方法，其中穩定性增加包含該組合物在冷凍之後解凍時的穩定性。 237.  如實施例210至236中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少2次時組合物之穩定性。 238.  如實施例210至237中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少3次時組合物之穩定性。 239.  如實施例210至238中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少4次時組合物之穩定性。 240.  如實施例210至239中任一項之方法，其中穩定性增加包含當組合物已凍融至少5次時組合物之穩定性。 241.  如實施例210至240中任一項之方法，其中使組合物與有效量的低溫保護劑接觸形成如實施例131至實施例205中任一項之免疫原組合物。 242.  如實施例1至22中任一項之組合物，其中該組合物經凍乾。 243.  如實施例1至22中任一項之組合物，其中該組合物經凍乾及復原。 244.  如實施例1至36中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為凍乾組合物儲存之後穩定至少約兩週。 245.  如實施例1至37中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在作為冷凍液體組合物儲存之後穩定至少1個月。 246.  如實施例1至38中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在作為冷凍液體組合物儲存之後穩定至少約兩週。 247.  如實施例1至39中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為凍乾組合物儲存之後穩定至少約四週。 248.  如實施例1至40中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為凍乾組合物儲存之後穩定約2週至約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或2年。 249.  如實施例1至41中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為凍乾組合物儲存之後至少約兩週時具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。 250.  如實施例1至42中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為凍乾組合物儲存之後至少1個月時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。 251.  如實施例1至43中任一項之組合物，其中該組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為凍乾組合物儲存之後約2週至約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年或2年時具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之完整RNA。 252.  如實施例1至44中任一項之組合物，其中組合物經組態以在小於或等於冷藏儲存之溫度下作為凍乾組合物儲存約兩週之後具有至少80%之完整RNA。 253.  如實施例131至162中任一項之組合物，其中該組合物經凍乾。 254.  如實施例131至163中任一項之組合物，其中該組合物經凍乾及復原。

以下圖式形成本說明書之一部分且包括以進一步展現本發明之某些態樣。參考此等圖式中之一或多者，結合本文中呈現之特定態樣之詳細描述，可更好地理解本發明。 圖1繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有10.3% w/v蔗糖(F1-F4)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖2繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有10.3% w/v蔗糖(F1-F4)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖3繪示在不存在空白脂質奈米粒子之情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有10.3% w/v蔗糖(F1-F4)之流感mRNA LNP調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖4繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有20.5% w/v蔗糖(F10-F13)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖5繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有20.5% w/v蔗糖(F10-F13)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之LNP PDI的影響。 圖6繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT，2FT，3FT，4FT，5FT)對含有20.5% w/v蔗糖(F10-F13)之流感mRNA LNP調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖7繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有10.3% w/v蔗糖(F5-F9)之流感mRNA調配物(0.001至0.1 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖8繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有10.3% w/v蔗糖(F5-F9)之流感mRNA調配物(0.001至0.1 mg/mL mRNA)之LNP PDI的影響。 圖9繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有10.3% w/v蔗糖(F5-F9)之流感mRNA LNP調配物(0.001至0.1 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖10繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有20.5% w/v蔗糖(F14-F15)之流感mRNA調配物(0.001至0.01 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖11繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT、5FT)對含有20.5% w/v蔗糖(F14-F15)之流感mRNA調配物(0.001至0.01 mg/mL mRNA)之LNP PDI的影響。 圖12繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT，2FT，3FT，4FT，5FT)對含有20.5% w/v蔗糖(F14-F15)之流感mRNA LNP調配物(0.001至0.01 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖13A-圖13E繪示VSVg saRNA Lyo藥品穩定性資料：(A)片段分析儀資料，隨時間(月)藉由FA之完整性%；(B)隨時間(月)之表現%；(C)隨時間(月)以囊封%表示之囊封效率(EE)；(D)隨時間(月)之尺寸；及(E)隨時間(月)之多分散性指數(PDI)。 圖14繪示在第二脂質奈米粒子，亦即空白LNP存在下增加囊封RNA之第一脂質奈米粒子之有效濃度以保持第一脂質奈米粒子之膠體穩定性及囊封百分比的態樣。 圖15A-圖15E繪示HA saRNA LNP凍乾之結果。將含10ug/ml之HA saRNA LNP的各別基質凍乾。以0.35 mL填充2 mL小瓶且用0.33 mL水及生理鹽水復原。基質「10T10S」係指10 mM Tris於10%蔗糖中。基質「10T20S」係指10 mM Tris於20%蔗糖中。凍乾材料及凍乾前材料均具有額外凍融。圖15(A)隨時間(月)以囊封%表示之囊封效率(EE)；(B)預凍乾及凍乾後資料之圖例；(C)片段分析儀資料；隨時間(月)藉由FA之完整性%；(D)隨時間(月)之尺寸；及(E)隨時間(月)之多分散性指數(PDI)。 圖16繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有10.3% w/v蔗糖(F1-F4)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖17繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有10.3% w/v蔗糖(F1-F4)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖18繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有10.3% w/v蔗糖(F1-F4)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖19繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有20.5% w/v蔗糖(F10-F13)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖20繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有20.5% w/v蔗糖(F10-F13)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖21繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有20.5% w/v蔗糖(F10-F13)之流感mRNA調配物(0.001至0.5 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖22繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有10.3% w/v蔗糖(F5-F9)之流感mRNA調配物(0.001至0.1 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖23繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有10.3% w/v蔗糖(F5-F9)之流感mRNA調配物(0.001至0.1 mg/mL mRNA)之LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖24繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有10.3% w/v蔗糖(F5-F9)之流感mRNA調配物(0.001至0.1 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖25繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有20.5% w/v蔗糖(F14-F15)之流感mRNA調配物(0.001至0.01 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖26繪示在存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有20.5% w/v蔗糖(F14-F15)之流感mRNA調配物(0.001至0.01 mg/mL mRNA)之LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖27繪示在不存在空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對含有20.5% w/v蔗糖(F14-F15)之流感mRNA調配物(0.001至0.01 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖28繪示在存在空白脂質奈米粒子或增加之蔗糖濃度(15.4%或20.5% w/v)的情況下至多四次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT)對流感mRNA LNP調配物(0.01 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖29繪示在存在空白脂質奈米粒子或增加之蔗糖濃度(15.4%或20.5% w/v)的情況下至多四次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT)對流感mRNA LNP調配物(0.005 mg/mL mRNA)之LNP粒度(Z平均值)的影響。 圖30繪示在存在空白脂質奈米粒子或增加之蔗糖濃度(15.4%或20.5% w/v)的情況下至多四次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT)對流感mRNA LNP調配物(0.01 mg/mL mRNA)之LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖31繪示在存在空白脂質奈米粒子或增加之蔗糖濃度(15.4%或20.5% w/v)的情況下至多四次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT)對流感mRNA LNP調配物(0.005 mg/mL mRNA)之LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖32繪示在存在空白脂質奈米粒子或增加之蔗糖濃度(15.4%或20.5% w/v)的情況下至多四次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT)對流感mRNA LNP調配物(0.01 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖33繪示在存在空白脂質奈米粒子或增加之蔗糖濃度(15.4%或20.5% w/v)的情況下至多四次凍融循環(1FT、2FT、3FT、4FT)對流感mRNA LNP調配物(0.005 mg/mL mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖34繪示在存在由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3構成之空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、3FT、5FT)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3囊封之mRNA)之LNP粒度及LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖35繪示在存在由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3構成之空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、3FT、5FT)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3囊封之mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖36繪示在存在由ALC-0159、DSPC、膽固醇及A9構成之空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、3FT、5FT)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及A9囊封之mRNA)之LNP粒度及LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖37繪示在存在由ALC-0159、DSPC、膽固醇及A9構成之空白脂質奈米粒子的情況下至多五次凍融循環(1FT、3FT、5FT)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及A9囊封之mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖38繪示在存在由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成之脂質體的情況下至多五次凍融循環(1FT、3FT、5FT)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及ALC-0315囊封之mRNA)之LNP粒度及LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖39繪示在存在由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成之脂質體的情況下至多五次凍融循環(1FT、3FT、5FT)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及ALC-0315囊封之mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖40繪示在存在由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成之脂質體的情況下至多五次凍融循環(1FT、3FT、5FT)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3囊封之mRNA)之LNP粒度及LNP多分散性指數(PDI)的影響。 圖41繪示在存在由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成之脂質體的情況下至多五次凍融循環(1FT、3FT、5FT)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3囊封之mRNA)之mRNA囊封效率(囊封%)的影響。 圖42A-圖42B繪示在存在由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3構成之空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3囊封之mRNA)之LNP粒度(圖42A)及LNP多分散性指數(PDI) (圖42B)的影響。 圖43繪示在存在由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3構成之空白脂質空白奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3囊封之mRNA)之囊封效率(囊封%)的影響。 圖44A-圖44B繪示在存在由ALC-0159、DSPC、膽固醇及A9構成之空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及A9囊封之mRNA)之LNP粒度(圖44A)及LNP多分散性指數(PDI) (圖44B)的影響。 圖45繪示在存在由ALC-0159、DSPC、膽固醇及A9構成之空白脂質奈米粒子的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及A9囊封之mRNA)之囊封效率(囊封%)的影響。 圖46A-圖46B繪示在存在由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成之脂質體的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及ALC-0315囊封之mRNA)之LNP粒度(圖46A)及LNP多分散性指數(PDI) (圖46B)的影響。 圖47繪示在存在由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成之脂質體的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及ALC-0315囊封之mRNA)之囊封效率(囊封%)的影響。 圖48A-圖48B繪示在存在由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成之脂質體的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3囊封之mRNA)之LNP粒度(圖48A)及LNP多分散性指數(PDI) (圖48B)的影響。 圖49繪示在存在由ALC-0159、DSPC及膽固醇構成之脂質體的情況下凍乾(在冷凍期間進行及不進行黏接)及復原(在水或生理鹽水中)對流感mRNA LNP調配物(3、0.1、0.01及0.001 mg/mL由ALC-0159、DSPC、膽固醇及MC3囊封之mRNA)之囊封效率(囊封%)的影響。

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Claims (23)

1. 一種組合物，其包含(a)第一脂質奈米粒子；(b)第二脂質奈米粒子；及(c)低溫保護劑；其中該第一脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質；其中該第一脂質奈米粒子囊封具有編碼至少一種相關多肽之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其中該至少一種相關多肽包含抗原；且其中該第二脂質奈米粒子不囊封核酸。
2. 如請求項1之組合物，其中該陽離子脂質包含ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、A9、C12-200、L5或其衍生物及/或組合。
3. 如請求項1或2之組合物，其中該中性脂質及/或磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM或其衍生物及/或組合。
4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該類固醇包含膽固醇、α-生育酚或其衍生物及/或組合。
5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該聚合物結合脂質包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE或其衍生物及/或組合。
6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該第二脂質奈米粒子包含i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質。
7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該第二脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質與該第一脂質奈米粒子之該i)陽離子脂質、ii)中性脂質及/或磷脂、iii)類固醇及iv)聚合物結合脂質相同。
8. 如請求項1至7中任一項之組合物，其中該低溫保護劑包含蔗糖，且其中該組合物包含至少約2% w/v至30% w/v蔗糖。
9. 如請求項1至8中任一項之組合物，其中該組合物為液體。
10. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中該組合物經冷凍。
11. 如請求項1至10中任一項之組合物，其中該組合物經凍乾。
12. 如請求項1至11中任一項之組合物，其中該組合物經凍乾及復原。
13. 如請求項1至12中任一項之組合物，其中該RNA包含編碼該抗原之可轉譯區且包含經修飾之核苷，該核苷包含1-甲基-假尿苷。
14. 如請求項1至13中任一項之組合物，其中該RNA為包含編碼該抗原之可轉譯區的自擴增RNA。
15. 如請求項1至14中任一項之組合物，其中該RNA包含編碼至少一種流感病毒抗原性多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架。
16. 如請求項1至15中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含該第一脂質奈米粒子而不包含該第二脂質奈米粒子之組合物相比包含超過70%以上的經囊封RNA。
17. 如請求項1至16中任一項之組合物，其中該第二脂質奈米粒子不囊封RNA聚核苷酸。
18. 如請求項1至17中任一項之組合物，其中該組合物已凍融至少2次。
19. 如請求項1至18中任一項之組合物，其中該組合物為免疫原性的。
20. 如請求項1至19中任一項之組合物，其中在相同條件下量測時，該第一脂質奈米粒子在存在該第二脂質奈米粒子的情況下之直徑尺寸小於脂質奈米粒子在不存在該第二脂質奈米粒子的情況下之直徑尺寸。
21. 如請求項1至20中任一項之組合物，其中該第一脂質奈米粒子在存在該第二脂質奈米粒子的情況下之多分散性指數小於脂質奈米粒子在不存在該第二脂質奈米粒子的情況下之多分散性指數。
22. 一種在細胞中產生相關多肽之方法，其包含投與如請求項1至21中任一項之組合物，其中當在相同條件下量測時，該組合物與包含該第一脂質奈米粒子而不包含該第二脂質奈米粒子之組合物相比產生增加量的該多肽。
23. 如請求項22之方法，其中該組合物係向哺乳動物投與。