TW202328437A - 用於基於細胞的免疫療法的系統和方法 - Google Patents

Abstract

本公開描述了用於免疫療法的系統和方法。與對照細胞（例如，非工程化免疫細胞）相比，免疫細胞可被工程化以表現出增加的半衰期。與對照細胞相比，免疫細胞可被工程化以表現出增強的增殖。免疫細胞可被工程化以有效地且特異性地靶向對照細胞在其他情況下不足以或不能靶向的患病細胞（例如，癌細胞）。本文公開的工程化免疫細胞可以離體、體外以及在一些情況下體內工程化。離體或體外製備的工程化免疫細胞可施用於需要其的物件以治療疾病（例如，骨髓瘤或實體瘤）。工程化免疫細胞可以是物件自體的。備選地，工程化免疫細胞對於物件可以是同種異體的。

Description

用於基於細胞的免疫療法的系統和方法

癌症（例如，瘤、腫瘤）是世界範圍內死亡的主要原因，每年約1千萬人死於癌症。癌症不斷給個人、家庭、社區和國家帶來越來越多的健康、經濟和情感負擔。增加對癌症生物學（例如，特別是癌症免疫生物學）和基因工程的理解促進了過繼性細胞療法（例如，細胞免疫療法）的開發，目標是治療或控制許多不同的癌症。

本公開提供了用於治療癌症的方法和系統。本公開的一些方面提供了工程化免疫細胞（例如，工程化自然殺傷（NK）細胞）及其用於治療癌症（例如，血液惡性腫瘤或實體瘤）的方法。

在一個方面，本公開提供了一種工程化NK細胞，其被構建成分泌異源銜接子至細胞外環境中，其中異源銜接子包括（i）用於偶聯至工程化NK細胞的偶聯結構域和（ii）表現出與靶細胞的抗原特異性結合的抗原結合結構域，其中在異源銜接子由工程化NK細胞分泌至細胞外環境時，（a）異源銜接子的偶聯結構域偶聯至工程化NK細胞，並且（b）異源銜接子的抗原結合結構域結合至靶細胞的抗原，使得工程化NK細胞特異性地靶向靶細胞，並且其中與不含異源銜接子的對照NK細胞相比，工程化NK細胞表現出針對靶細胞的增強的細胞毒性。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，與對照NK細胞相比，工程化NK細胞表現出針對靶細胞的細胞毒性的至少約0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍的增加。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子是抗體或其修飾物。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子是大小為至多約80千道爾頓（kDa），至多約60 kDa或更小的工程化抗體。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子缺少選自C _L、C _H1、C _H1和C _L的一個或多個成員。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子是scFv-Fc。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，偶聯結構域包括IgG、IgE、IgA、IgM、其修飾物或其組合。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，偶聯結構域偶聯至工程化NK細胞的表面受體的細胞外部分。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，表面受體包括Fc受體的至少一部分。在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，Fc受體包括FcγRI（或CD64）、FcγRII（或CD32）、FcγRIII（或CD16）、FcϵRI、FcαRI（或CD89）、FcμR、Fcα/μR（或CD351）、其修飾物或其組合。在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，Fc受體包括融合多肽，融合多肽包括CD16的至少一部分和CD64的至少一部分。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，表面受體是異源受體。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，工程化NK細胞足以殺傷靶細胞。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，工程化NK細胞被構建成基本上組成性地分泌異源銜接子。

在另一方面，本公開提供了一種工程化NK細胞，其包括：異源受體；以及異源銜接子，異源銜接子包括（i）用於偶聯至異源受體的偶聯結構域和（ii）表現出與靶細胞的抗原特異性結合的抗原結合結構域，其中在工程化NK細胞表達異源受體和異源銜接子時，（a）異源銜接子的偶聯結構域偶聯至異源受體，並且（b）異源銜接子的抗原結合結構域結合至靶細胞的抗原，使得工程化NK細胞特異性地靶向靶細胞。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，與缺少異源受體和/或異源銜接子的對照NK細胞相比，工程化NK細胞表現出針對靶細胞的細胞毒性的至少約0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍的增加。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子與異源受體的偶聯形成與工程化NK細胞的細胞外表面相鄰的複合物，該複合物能夠靶向抗原。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，偶聯結構域偶聯至異源受體的細胞外結構域。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子是抗體或其修飾物。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子是大小為至多約80千道爾頓（kDa），至多約60 kDa或更小的工程化抗體。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子缺少選自C _L、C _H1、C _H1和C _L的一個或多個成員。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源銜接子是scFv-Fc。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，偶聯結構域包括IgG、IgE、IgA、IgM、其修飾物或其組合。

在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，異源受體包括Fc受體的至少一部分。在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，Fc受體包括FcγRI（或CD64）、FcγRII（或CD32）、FcγRIII（或CD16）、FcϵRI、FcαRI（或CD89）、FcμR、Fcα/μR（或CD351），其修飾物或其組合。在本文公開的任一種工程化NK細胞的一些實施方案中，Fc受體包括融合多肽，融合多肽包括CD16的至少一部分和CD64的至少一部分。

在另一方面，本公開提供了一種工程化免疫細胞，其包括：異源受體；以及異源銜接子，其包括（i）用於偶聯至異源受體的細胞外結構域的偶聯結構域和（ii）表現出與靶細胞的抗原特異性結合的抗原結合結構域，其中在工程化免疫細胞表達異源受體和分泌異源銜接子時，（a）異源銜接子的偶聯結構域偶聯至異源受體的細胞外結構域，並且（b）異源銜接子的抗原結合結構域結合至靶細胞的抗原，使得工程化免疫細胞特異性地靶向靶細胞。

在一些實施方案中，工程化免疫細胞是NK細胞。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，與缺少異源受體和/或異源銜接子的對照免疫細胞相比，工程化免疫細胞表現出針對靶細胞的細胞毒性的至少約0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍的增加。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，異源銜接子是抗體或其修飾物。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，異源銜接子是大小為至多約80千道爾頓（kDa），至多約60 kDa或更小的工程化抗體。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，異源銜接子缺少選自C _L、C _H1、C _H1和C _L的一個或多個成員。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，異源銜接子是scFv-Fc。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，偶聯結構域包括IgG、IgE、IgA、IgM、其修飾物或其組合。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，異源受體包括Fc受體的至少一部分。在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，Fc受體包括FcγRI（或CD64）、FcγRII（或CD32）、FcγRIII（或CD16）、FcϵRI、FcαRI（或CD89）、FcμR、Fcα/μR（或CD351）、其修飾物或其組合。在本文公開的任一種工程化免疫細胞的一些實施方案中，Fc受體包括融合蛋白，融合蛋白包括CD16的至少一部分和CD64的至少一部分。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，偶聯結構域包括（1）用於偶聯至第一表面受體或異源受體的第一偶聯結構域和（2）用於偶聯至第二表面受體或異源受體的第二偶聯結構域，其中第一表面受體或異源受體不同於第二表面受體或異源受體。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，（1）第一表面受體或異源受體存在於第一免疫細胞上，並且（2）第二表面受體或異源受體存在於第二免疫細胞上，其中第一免疫細胞和第二免疫細胞是不同的。在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，第一免疫細胞是NK細胞，並且第二免疫細胞是T細胞。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，抗原結合部分側接第一偶聯結構域和第二偶聯結構域。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，（a）異源銜接子與NK細胞的異源受體的偶聯和（b）異源銜接子與抗原的結合是必需的，但各自不足以使工程化NK細胞殺傷靶細胞。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞還包括編碼異源銜接子和/或異源受體的異源多核苷酸序列。在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，異源多核苷酸序列是基因組整合的。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，與對照NK細胞相比，工程化免疫細胞或工程化NK細胞表現出編碼抗原的內源性基因的表達和/或活性水準降低。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，與對照NK細胞相比，工程化免疫細胞或工程化NK細胞表現出編碼CD38的內源性基因的表達和/或活性水準降低。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞還包括嵌合多肽受體，嵌合多肽受體包括能夠結合抗原和/或不同的抗原的抗原結合部分。在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，不同的抗原在靶細胞上。在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，不同的抗原在不同的靶細胞上。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞還包括異源細胞因數和/或其異源細胞因數受體，用於與不含異源細胞因數和/或異源細胞因數受體的細胞相比增強細胞因數信號轉導。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞表現出免疫檢查點抑制劑的表達和/或活性降低，免疫檢查點抑制劑選自：PD1、CTLA-4、TIM-3、KIR2D、CD94、NKG2A、NKG2D、TIGIT、CD96、LAG3、TIGIT、TGF β受體和2B4。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞表現出免疫低下調節劑的表達和/或活性降低，免疫低下調節劑選自B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB、ULBP1、HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞還包括能夠實現工程化NK細胞死亡的安全開關。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，在體外、離體或體內確定針對靶細胞的增強的細胞毒性。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，與對照免疫細胞或對照NK細胞的細胞毒性水準相比，針對靶細胞的增強的細胞毒性通過靶細胞群體的大小減少至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%來確定。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，與對照免疫細胞或對照NK細胞相比，針對靶細胞的增強的細胞毒性通過腫瘤大小的減小來確定。在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，與對照免疫細胞或對照NK細胞相比，腫瘤大小減小至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，與對照免疫細胞或對照NK細胞相比，工程化免疫細胞或工程化NK細胞在宿主細胞中誘導的免疫應答降低。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞用於治療有需要的物件。在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞對於物件是同種異體的。在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞是物件自體的。

在本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種的一些實施方案中，工程化免疫細胞或工程化NK細胞來源於分離的幹細胞或誘導的幹細胞。

在另一方面，本公開提供了一種組合物，其包括本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種。

在本文公開的任一種組合物的一些實施方案中，組合物還包括單獨的治療劑。在本文公開的任一種組合物的一些實施方案中，單獨的治療劑是化療劑。

在另一方面，本公開提供了一種方法，其包括（a）從物件獲得細胞；以及（b）從細胞產生本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種。

在另一方面，本公開提供了一種殺傷靶細胞的方法，該方法包括：使靶細胞與本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK細胞中的任一種接觸，其中接觸足以誘導靶細胞的殺傷。

在另一方面，本公開提供了一種治療有需要的物件的方法，該方法包括向物件施用本文公開的工程化免疫細胞或工程化NK中的任一種。在一些實施方案中，該方法還包括施用單獨的治療劑。在一些實施方案中，單獨的治療劑是化療劑。

在本文公開的任一種組合物的一些實施方案中，與對照細胞相比，工程化NK細胞表現出針對靶細胞的增強的細胞毒性。在本文公開的任一種組合物的一些實施方案中，與對照細胞相比，工程化NK細胞在宿主細胞中誘導的免疫應答降低。

在本文公開的任一種組合物的一些實施方案中，宿主細胞是免疫細胞。

從以下詳細描述中，本公開的其他方面和優點對於本領域技術人員將變得顯而易見，其中僅示出和描述了本公開的說明性實施方案。如將認識到的，本公開能夠具有其他和不同的實施方案，並且其若干細節能夠在各個明顯的方面進行修改，所有這些都不脫離本公開。因此，附圖和說明書本質上應被認為是說明性的而非限制性的。 [援引併入]

在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用併入本文，其程度如同每個單獨的出版物、專利或專利申請被具體地且單獨地指出通過引用併入。就通過引用併入的出版物和專利或專利申請與本說明書中包括的公開內容相矛盾而言，本說明書旨在取代和/或優先於任何這樣的矛盾材料。

[交叉引用]

本申請要求於2021年11月24日提交的國際申請第PCT/CN2021/132858號和於2022年10月25日提交的國際申請第PCT/CN2022/127383號的權益，所述申請通過引用整體併入文本。

雖然本文已經示出和描述了本發明的各種實施方案，但是對於本領域技術人員顯而易見的是，這些實施方案僅作為示例提供。在不脫離本發明的情況下，本領域技術人員可以想到許多變化、改變和替換。應當理解，可以採用本文所述的本發明實施方案的各種替代方案。

如在說明書和權利要求書中使用的，單數形式“一個（a）”、“一種（an）”和“所述”包括複數引用，除非上下文另外清楚地指明。例如，術語“嵌合跨膜受體”包括多種嵌合跨膜受體。

術語“約”或“大約”通常是指在本領域普通技術人員確定的特定值的可接受誤差範圍內，其將部分取決於如何測量或確定該值，即測量系統的限制。例如，根據本領域的實踐，“約”可意指在1個或多於1個標準差內。備選地，“約”可意指給定值的至多20%、至多10%、至多5%或至多1%的範圍。備選地，特別是對於生物系統或方法，該術語可以指數值的數量級內，優選5倍內，更優選2倍內。在本申請和權利要求書中描述特定值的情況下，除非另有說明，否則應假定術語“約”意指在特定值的可接受誤差範圍內。

備選（例如，“或”）的使用應理解為意指備選方案中的任一個，兩者或其任何組合。術語“和/或”應理解為意指備選方案中的一個或兩個。

術語“細胞”通常是指生物細胞。細胞可以是活生物體的基本結構，功能和/或生物單元。細胞可來源於具有一個或多個細胞的任何生物體。一些非限制性實例包括：原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古菌細胞、單細胞真核生物體的細胞、原生動物細胞、來自植物的細胞（例如來自植物作物、水果、蔬菜、穀物、大豆、玉米、玉蜀黍、小麥、種子、番茄、水稻、木薯、甘蔗、南瓜、乾草、馬鈴薯、棉花、大麻、煙草、開花植物、針葉樹、裸子植物、蕨類植物、石鬆類植物、金魚藻、苔類植物、蘚類植物的細胞）、藻類細胞（例如布朗葡萄藻、萊茵衣藻、擬微球藻、蛋白核小球藻、展枝馬尾藻圓幹變種（Sargassum patens C. Agardh）等）、海藻（例如，海帶）、真菌細胞（例如酵母細胞、來自蘑菇的細胞）、動物細胞、來自無脊椎動物（例如果蠅、刺胞動物、棘皮動物、線蟲等）的細胞、來自脊椎動物（例如魚、兩棲動物、爬行動物、鳥、哺乳動物）的細胞、來自哺乳動物（例如，豬、牛、山羊、綿羊、齧齒動物、大鼠、小鼠、非人靈長類動物、人等）的細胞等。有時細胞不是來源於天然生物體（例如，細胞可以是合成製備的，有時稱為人工細胞）。

本文可互換使用的術語“重程式設計”、“去分化”、“增加細胞能力”或“增加發育能力”通常是指增加細胞效力或使細胞去分化至較低分化狀態的方法。例如，與處於非重程式設計狀態的相同細胞相比，具有增加的細胞效力的細胞具有更多的發育可塑性（即，可以分化成更多的細胞類型）。換句話說，重新程式設計的細胞是與處於非重新程式設計狀態的相同細胞相比處於較低分化狀態的細胞。

術語“分化”通常是指非特化（“未定向”）或較少特化的細胞獲得特化細胞例如免疫細胞的特徵的過程。分化的或分化誘導的細胞是在細胞譜系中具有更特化（“定向”）位置的細胞。術語“定向”通常是指在分化途徑中已經進行到這樣的點的細胞，在該點上，在正常情況下，它將繼續分化為特定的細胞類型或細胞類型的亞群，並且在正常情況下不能分化為不同的細胞類型或回復為較少分化的細胞類型。

術語“多能”通常是指細胞形成身體的所有譜系或體組織（即胚胎本身）的能力。例如，胚胎幹細胞是一類多能幹細胞，其能夠從三個胚層、外胚層、中胚層和內胚層中的每一個形成細胞。多能可以是從不能產生完整生物體的不完全或部分多能細胞（例如，上胚層幹細胞）到能夠產生完整生物體的更原始，更多能細胞（例如，胚胎幹細胞）的發育潛能的連續體。

術語“誘導的多能幹細胞”（iPSC）通常是指來源於分化細胞（例如，分化的成體、新生兒或胎兒細胞）的幹細胞，分化細胞已被誘導或改變（即，重程式設計）成能夠分化成所有三種胚層或真皮層的組織的細胞：中胚層、內胚層和外胚層。所產生的iPSC不指在自然界中發現的細胞。在一些情況下，iPSC可被工程化以直接分化成定向細胞（例如，自然殺傷（NK）細胞）。在一些情況下，iPSC可被工程化以首先分化成組織特異性幹細胞（例如，造血幹細胞（HSC）），其可被進一步誘導分化成定向細胞（例如，NK細胞）。

術語“胚胎幹細胞”（ESC）通常是指胚胎胚泡的內細胞團的天然存在的多能幹細胞。胚胎幹細胞是多能的，並且在發育過程中產生三種初級胚層的所有衍生物：外胚層、內胚層和中胚層。在一些情況下，ESC可被工程化以直接分化成定向細胞（例如NK細胞）。在一些情況下，ESC可被工程化以首先分化成組織特異性幹細胞（例如，HSC），其可被進一步誘導分化成定向細胞（例如，NK細胞）。

術語“分離的幹細胞”通常是指本文公開的從多細胞生物體分離的任何類型的幹細胞（例如，ESC、HSC、間充質幹細胞（MSC）等）。例如，HSC可以從哺乳動物體內分離，如人體。在另一個實例中，胚胎幹細胞可以從胚胎中分離。

術語“分離的”通常指已經從其原始環境中分離的細胞或細胞群。例如，分離細胞的新環境基本上不含存在“未分離”參考細胞的環境中發現的至少一種組分。分離的細胞可以是從在其天然環境中發現的一些或所有組分中除去的細胞，例如從組織或活組織檢查樣本中分離的細胞。該術語還包括當在非天然存在的環境中發現細胞時從至少一種，一些或所有組分中除去的細胞，例如分離形式的細胞培養物或細胞懸浮液。因此，分離的細胞與至少一種組分（包括其他物質、細胞或細胞群）部分或完全分離，如其在自然界中發現或當其在非天然存在的環境中生長，儲存或保存時。

本文可互換使用的術語“造血幹細胞和祖細胞”、“造血幹細胞”、“造血祖細胞”或“造血前體細胞”通常是指定向於造血譜系但能夠進一步造血分化（例如，成NK細胞）的細胞，並且包括多能造血幹細胞（成血細胞）、骨髓祖細胞、巨核細胞祖細胞、紅細胞祖細胞和淋巴祖細胞。造血幹細胞和祖細胞（HSC）是產生所有血細胞類型的多能幹細胞，包括骨髓（單核細胞和巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞、巨核細胞/血小板、樹突細胞）和淋巴譜系（T細胞、B細胞、NK細胞）。在一些情況下，HSC可以是能夠產生成熟骨髓和淋巴樣細胞類型（包括T細胞、NK細胞和B細胞）的CD34＋造血細胞。

術語“免疫細胞”通常是指分化的造血細胞。免疫細胞的非限制性實例可包括NK細胞、T細胞、單核細胞、先天淋巴細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等。

術語“NK細胞”或“自然殺傷細胞”通常是指由CD56或CD16的表達和T細胞受體（CD3）的缺少所定義的外周血淋巴細胞亞群。在一些情況下，表型為CD3-和CD56＋的NK細胞表達NKG2C和CD57中的至少一種（例如，相同或不同程度的NKG2C、CD57或兩者）和任選地表達CD16，但缺少以下中的一種或多種的表達：PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些情況下，分離的CD56＋NK細胞亞群可表現出CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配體、NKp30、NKp40、NKp46、活化和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-1的表達。

如本文所用的術語“核苷酸”通常是指堿基-糖-磷酸組合。核苷酸可包括合成核苷酸。核苷酸可以包括合成的核苷酸類似物。核苷酸可以是核酸序列（例如，去氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA））的單體單元。術語核苷酸可包括核糖核苷三磷酸、腺苷三磷酸（ATP）、尿苷三磷酸（UTP）、胞嘧啶三磷酸（CTP）、鳥苷三磷酸（GTP）和去氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此類衍生物可包括例如[αS]dATP、7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP，以及賦予含有它們的核酸分子核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所用的術語核苷酸可以指雙去氧核苷三磷酸（ddNTPs）及其衍生物。雙去氧核苷三磷酸的說明性實例可包括但不限於ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未標記的或通過公知技術可檢測地標記的。標記也可以用量子點進行。可檢測標記可包括例如放射性同位素、螢光標記、化學發光標記、生物發光標記和酶標記。核苷酸的螢光標記可以包括但不限於螢光素、5-羧基螢光素（FAM）、2'7'-二甲氧基-4'5-二氯-6-羧基螢光素（JOE）、羅丹明、6-羧基羅丹明（R6G）、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基羅丹明（TAMRA）、6-羧基-X-羅丹明（ROX）、4-（4'二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸（DABCYL）、級聯藍（Cascade Blue）、俄勒岡綠、德州紅、花青和5-（2'-氨乙基）氨基萘-1-磺酸（EDANS）。螢光標記的核苷酸的具體實例可以包括購自加州福斯特市Perkin Elmer的 [R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G] dCTP、[TAMRA] dCTP、[JOE] ddATP、[R6G] ddATP、[FAM] ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP。購自伊利諾州阿靈頓高地Amersham的FluoroLink去氧核苷酸、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLink Cy3-dUTP和FluoroLink Cy5-dUTP；購自印第安那州印弟安納波里斯Boehringer Mannheim的螢光素-15-dATP、螢光素-12-dUTP、四甲基-羅丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、螢光素-12-ddUTP、螢光素-12-UTP以及螢光素-15-2'-dATP；以及購自俄勒岡州尤金Molecular Probes的染色體標記的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、級聯藍（Cascade Blue）-7-UTP、級聯藍（Cascade Blue）-7-dUTP、螢光素-12-UTP、螢光素-12-dUTP、俄勒岡綠488-5-dUTP、羅丹明綠-5-UTP、羅丹明綠-5-dUTP、四甲基羅丹明-6-UTP、四甲基羅丹明-6-dUTP、德州紅-5-UTP、德州紅-5-dUTP和德州紅-12-dUTP。核苷酸也可以通過化學修飾來標記或做標記。化學修飾的單核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化dNTP的一些非限制性實例可包括生物素-dATP（例如，bio-N6-ddATP、生物素-14-dATP）、生物素-dCTP（例如，生物素-11-dCTP、生物素-14-dCTP）和生物素-dUTP（例如，生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP）。

本文中可互換使用的術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”或“核酸”通常是指任何長度的核苷酸的聚合形式，去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物，呈單鏈、雙鏈或多鏈形式。多核苷酸對於細胞可以是外源性的或內源性的。多核苷酸可以存在於游離環境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三維結構，並且可以執行任何已知或未知的功能。多核苷酸可包括一種或多種類似物（例如，改變的主鏈、糖或核堿基）。如果存在，可以在聚合物組裝之前或之後對核苷酸結構進行修飾。類似物的一些非限制性實例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、非天然核酸、嗎啉代、鎖核酸、乙二醇核酸、蘇糖核酸、雙去氧核苷酸、蟲草素、7-脫氮-GTP、螢光團（例如，與糖連接的羅丹明或螢光素）、含硫醇的核苷酸、生物素連接的核苷酸、螢光堿基類似物、CpG島、甲基-7-鳥苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氫尿苷、辮苷和懷俄苷。多核苷酸的非限制性實例包括基因或基因片段的編碼或非編碼區、由鍵分析定義的基因座、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉移RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）、短干擾RNA（siRNA）、短髮夾RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體（vector）、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、包括游離DNA（cfDNA）和游離RNA（cfRNA）的游離多核苷酸、核酸探針和引物。核苷酸序列可被非核苷酸組分中斷。

術語“基因”通常是指參與編碼RNA轉錄物的核酸（例如DNA如基因組DNA和cDNA）及其相應的核苷酸序列。如本文所用的關於基因組DNA的術語包括插入非編碼區以及調節區，並且可包括5'和3'端。在一些用途中，該術語涵蓋轉錄序列，包括5'和3'非翻譯區（5'-UTR和3'-UTR），外顯子和內含子。在一些基因中，轉錄區將含有編碼多肽的“開放閱讀框”。在該術語的一些用途中，“基因”僅包括編碼多肽所必需的編碼序列（例如，“開放閱讀框”或“編碼區”）。在一些情況下，基因不編碼多肽，例如核糖體RNA基因（rRNA）和轉移RNA（tRNA）基因。在一些情況下，術語“基因”不僅包括轉錄序列，而且還包括非轉錄區，包括上游和下游調節區，增強子和啟動子。基因可以指“內源性基因”或生物體基因組中天然位置的天然基因。基因可以指“外源性基因”或非天然基因。非天然基因可以指通常不在宿主生物中發現但通過基因轉移導入宿主生物的基因。非天然基因還可以指在生物體基因組中不在其天然位置的基因。非天然基因還可以指包括突變，插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列（例如，非天然序列）。

術語“表達”通常是指多核苷酸從DNA範本轉錄（例如，轉錄成mRNA或其他RNA轉錄物）的一個或多個過程和/或轉錄的mRNA隨後翻譯成肽，多肽或蛋白的過程。轉錄物和編碼的多肽可統稱為“基因產物”。如果多核苷酸來源於基因組DNA，則表達可包括在真核細胞中剪接mRNA。關於表達，“上調”通常是指相對於其在野生型狀態中的表達水準，多核苷酸（例如，RNA如mRNA）和/或多肽序列的表達水準增加，而“下調”通常是指相對於其在野生型狀態中的表達，多核苷酸（例如，RNA如mRNA）和/或多肽序列的表達水準降低。轉染基因的表達可以在細胞中暫態或穩定地發生。在“暫態表達”期間，轉染的基因在細胞分裂期間不轉移到子細胞。由於其表達限於轉染的細胞，基因的表達隨時間而喪失。相反，當基因與賦予轉染細胞選擇優勢的另一基因共轉染時，可發生轉染基因的穩定表達。這種選擇優勢可以是對呈現給細胞的某種毒素的抗性。

本文可互換使用的術語“肽”、“多肽”或“蛋白”通常是指通過肽鍵連接的至少兩個氨基酸殘基的聚合物。該術語不表示特定長度的聚合物，也不旨在暗示或區分肽是使用重組技術、化學或酶促合成產生的，還是天然存在的。該術語適用于天然存在的氨基酸聚合物以及包括至少一個修飾的氨基酸的氨基酸聚合物。在一些情況下，聚合物可被非氨基酸中斷。該術語包括任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白，以及具有或不具有二級和/或三級結構（例如，結構域）的蛋白。該術語還包括已被修飾的氨基酸聚合物，例如通過二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化、氧化和任何其他操作如與標記組分偶聯。如本文所用的術語“氨基酸”通常指天然和非天然氨基酸，包括但不限於修飾的氨基酸和氨基酸類似物。修飾的氨基酸可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，它們已經被化學修飾以包括氨基酸上非天然存在的基團或化學部分。氨基酸類似物可以指氨基酸衍生物。術語“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸。

如本文所用關於多肽的術語“衍生物”、“變體”或“片段”通常是指與野生型多肽相關的多肽，例如通過氨基酸序列、結構（例如，二級和/或三級）、活性（例如，酶活性）和/或功能。與野生型多肽相比，多肽的衍生物、變體和片段可包括一個或多個氨基酸變化（例如，突變、插入和缺失）、截短、修飾或其組合。

如本文所用的關於多肽分子（例如，蛋白）的術語“工程化”、“嵌合”或“重組”通常是指具有異源氨基酸序列或改變的氨基酸序列的多肽分子，這是由於將基因工程技術應用於編碼多肽分子的核酸以及表達多肽分子的細胞或生物體。如本文所用的關於多核苷酸分子（例如，DNA或RNA分子）的術語“工程化”或“重組”通常是指由於應用基因工程技術而具有異源核酸序列或改變的核酸序列的多核苷酸分子。基因工程技術包括但不限於PCR和DNA克隆技術；轉染、轉化和其他基因轉移技術；同源重組；定點誘變；和基因融合。在一些情況下，工程化的或重組的多核苷酸（例如，基因組DNA序列）可以通過基因編輯部分來修飾或改變。

術語“基因編輯部分”通常是指可以編輯核酸序列的部分，無論是對於包括該核酸序列的細胞是外源性的還是內源性的。在一些實施方案中，基因編輯部分通過編輯核酸序列來調節基因的表達。在一些情況下，基因編輯部分可以通過編輯基因組DNA序列來調節基因的表達。在一些情況下，基因編輯部分可通過編輯mRNA範本來調節基因的表達。在一些情況下，編輯核酸序列可以改變基因表達的基礎範本。

備選地或另外，基因編輯部分能夠通過特異性結合可操作地偶聯到基因（或基因內的靶序列）的靶序列，並調節從DNA如染色體DNA或cDNA產生mRNA，從而調節基因的表達或活性。在一些情況下，基因編輯部分可募集或包括至少一種結合特定DNA序列的轉錄因數，從而控制遺傳信息從DNA轉錄到mRNA的速率。基因編輯部分本身可結合DNA並通過物理阻礙調節轉錄，例如防止蛋白如RNA聚合酶和其他相關蛋白在DNA範本上組裝。基因編輯部分可以在翻譯水準上調節基因的表達，例如，通過調節從mRNA範本產生蛋白。在一些情況下，基因編輯部分可通過影響mRNA轉錄物的穩定性來調節基因表達。

術語“抗體”通常指具有免疫球蛋白樣功能的蛋白結合分子。術語抗體包括抗體（例如，單克隆和多克隆抗體）及其衍生物、變體和片段。抗體包括但不限於不同類別（即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE）和亞類（例如，IgG1、IgG2等）的免疫球蛋白（Ig），包括通過二硫化物連接的至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈的免疫球蛋白等。每條H鏈可包括重鏈可變區（VH）和重鏈恒定區。每個L鏈可包括輕鏈可變區（VL）和輕鏈恒定區。VH和VL區的特徵還在於具有互補決定區（CDR），其散佈有稱為骨架區（FR）的更保守區。每個VH和VL可以含有三個CDR和四個FR，並且V和H鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。其衍生物、變體或片段可以指保留相應抗體的結合特異性（例如，完全和/或部分）的功能性衍生物或片段。抗原結合片段包括Fab、Fab'、F（ab'）2，可變片段（Fv）、單鏈可變片段（scFv）、微型抗體、雙抗體和單結構域抗體（“sdAb”或“納米抗體”或“camelids”）。術語抗體包括已經優化、工程化或化學偶聯的抗體和抗體的抗原結合片段。已經優化的抗體的實例包括親和力成熟的抗體。已經工程化的抗體的實例包括Fc優化的抗體（例如，在片段可結晶區中優化的抗體）和多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）。抗體的非限制性實例可包括但不限於單特異性或單價抗體（例如，CH-Fc/VL-Fc、Fc/Fab-Fc、HC-FC/LC-Fc等），具有scFv和/或scFab附屬物的IgG樣形式（例如scFv-Fc、scFv-Fc/scFv-Fc、Fab-Fc、Fab-Fc/Fab-Fc、Fab-Fc/scFab-Fc、Fv-/Fv-CrossMab IgG、Fab-CrossMab IgG等）和具有正確LC締合的IgG形式（例如，IgG、CrossMab IgG、普通LC-IgG、Ortho-Fab IgG、四合一Cross-Mab IgG等）。

術語“嵌合多肽受體”通常是指包括一個或多個抗原結合部分的非天然多肽受體，每個抗原結合部分能夠結合特定抗原。嵌合多肽受體可以是單特異性的（即，能夠結合一種類型的特異性抗原）。備選地，嵌合多肽受體可以是多特異性的（即，能夠結合兩種或多種不同類型的特異性抗原）。嵌合多肽受體可以是單價的（即，包括單個抗原結合部分）。備選地，嵌合多肽受體可以是多價的（即，包括多個抗原結合部分）。在一些情況下，嵌合多肽受體可包括T細胞受體（TCR）融合蛋白（TFP）或嵌合抗原受體（CAR）。

術語“抗原結合結構域”通常指表現出優先結合特異性靶抗原的構建體。抗原結合結構域可以是多肽構建體，例如抗體、其修飾物、其片段或其組合。抗原結合結構域可以是本文公開的任何抗體或其功能變體。抗原結合結構域的非限制性實例可包括鼠抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝Ig、僅鯊魚重鏈抗體（VNAR）、Ig NAR、嵌合抗體、重組抗體或其抗體片段。抗體片段的非限制性實例包括Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、單鏈抗原結合片段（scFv）、（scFv）2、二硫化物穩定的Fv（dsFv）、微型抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、單結構域抗原結合片段（sdAb、納米抗體）、重組僅重鏈抗體（VHH）和保持整個抗體的結合特異性的其他抗體片段。

術語“安全開關”通常是指設計用於防止細胞治療的潛在毒性或其他副作用的工程化多肽構建體。當在細胞中表達時，安全開關可誘導宿主細胞死亡，從而使宿主中（例如，物件體內）的細胞活性失活。因此，安全開關可以是自殺部分。在一些情況下，可以對細胞進行程式設計以在其生命週期的某些階段表達自殺部分（例如，時間程式設計）。在一些情況下，自殺部分在細胞中的表達可以是條件性的或誘導型的。在一些實例中，自殺部分的條件性調節（例如，表達）可包括通過小分子介導的翻譯後活化和組織特異性和/或時序轉錄調節的控制。因此，安全開關可以是可誘導的自殺部分。安全開關可以介導細胞凋亡的誘導、蛋白合成的抑制、DNA複製、生長停滯、轉錄和轉錄後遺傳調節、和/或抗體介導的耗竭。在一些情況下，安全開關可被外源性分子（例如，藥物或前藥）啟動，當被啟動時，其觸發細胞（例如，如本文公開的工程化NK細胞）的凋亡和/或細胞死亡。

術語“免疫低下調節劑”通常是指細胞中的多肽構建體，其中細胞中免疫低下調節劑的增強的表達（例如，通過敲入異源基因）或降低的表達（例如，通過敲除或敲弱內源性基因）可幫助細胞在施用於宿主身體後減少或避免來自宿主身體的免疫應答（例如，免疫攻擊，如適應性免疫排斥）。在一些情況下，可以修飾細胞（例如，如本文公開的工程化NK細胞）以表現出增強的表達或降低的低免疫調節劑的表達，使得細胞可以在第二次或進一步將細胞輸注到宿主（即，接受者）中時逃避宿主免疫攻擊。因此，與沒有增強表達或降低表達免疫力低下調節劑的對照細胞相比，細胞（i）將不會被宿主免疫系統排斥和/或（ii）將以較慢的速率被宿主免疫系統排斥。表現出低免疫調節劑的增強表達或降低表達的細胞可稱為表現出“低免疫”或“免疫優先”。

術語“免疫檢查點抑制劑”通常是指存在於免疫細胞（例如，T細胞、骨髓細胞、NK細胞、B細胞等）的細胞表面上的一組分子，其可以通過下調或抑制免疫細胞針對靶細胞（如癌細胞）的免疫應答（即，抗癌或抗腫瘤免疫應答）來調節細胞的免疫應答。靶細胞可以表達存在於免疫細胞表面上的免疫檢查點抑制劑的受體或配體，以與免疫檢查點抑制劑接合並且下調或抑制免疫細胞針對靶細胞的免疫應答。因此，在一些情況下，下調或抑制免疫檢查點抑制劑在免疫細胞中的表達可以增強或延長免疫細胞針對靶細胞的免疫應答。

術語“免疫應答”通常是指宿主免疫系統對物件（例如，外來物件）的T細胞介導的和/或B細胞介導的免疫應答。免疫應答的實例包括T細胞應答，例如細胞因數產生和細胞毒性。在一些情況下，免疫應答可通過T細胞活化間接實現，例如抗體產生（體液應答）和細胞因數應答細胞如巨噬細胞的活化。

術語“增強的表達”、“增加的表達”或“上調的表達”通常是指目的部分（例如，多核苷酸或多肽）在宿主菌株（例如，宿主細胞）中產生至高於目的部分的正常表達水準的水準。表達的正常水準可以基本上為零（或空）或高於零。目的部分可以包括宿主菌株的內源性基因或多肽構建體。目的部分可包括導入宿主菌株或導入宿主菌株的異源基因或多肽構建體。例如，可以將編碼目的多肽的異源基因敲入（KI）到宿主菌株的基因組中，以增強目的多肽在宿主菌株中的表達。

術語“增強的活性”、“增加的活性”或“上調的活性”通常是指在宿主菌株（例如，宿主細胞）中被修飾至高於目的部分的活性的正常水準的水準的目的部分（例如，多核苷酸或多肽）的活性。活性的正常水準可以基本上為零（或空）或高於零。目的部分可以包括宿主菌株的多肽構建體。目的部分可包括導入宿主菌株或導入宿主菌株的異源多肽構建體。例如，可以將編碼目的多肽的異源基因敲入（KI）到宿主菌株的基因組中，以增強目的多肽在宿主菌株中的活性。

術語“降低的表達”、“減少的表達”或“下調的表達”通常是指目的部分（例如多核苷酸或多肽）的產生水準低於宿主菌株（例如，宿主細胞）中目的部分的正常表達水準。表達的正常水準高於零。目的部分可以包括宿主菌株的內源性基因或多肽構建體。在一些情況下，目的部分可以在宿主菌株中敲除或敲弱。在一些實例中，目的部分的降低的表達可以包括在宿主菌株中完全抑制這種表達。

術語“降低的活性”、“減少的活性”或“下調的活性”通常是指在宿主菌株（例如，宿主細胞）中被修飾至低於目的部分的正常活性水準的水準的目的部分（例如，多核苷酸或多肽）的活性。活性的正常水準高於零。目的部分可以包括宿主菌株的內源性基因或多肽構建體。在一些情況下，目的部分可以在宿主菌株中敲除或敲弱。在一些實例中，目的部分的活性降低可包括完全抑制宿主菌株中的此類活性。

本文可互換使用的術語“物件”、“個體”或“患者”通常是指脊椎動物，優選哺乳動物，例如人。哺乳動物包括但不限於鼠、猿、人、農場動物、運動動物和寵物。也包括在體內或體外培養獲得的生物實體的組織、細胞及其後代。

術語“治療（treatment）”或“治療（treating）”通常是指用於獲得有益的或期望的結果的方法，包括但不限於治療益處和/或預防益處。例如，治療可包括施用本文公開的系統或細胞群體。治療益處是指治療中一種或多種疾病、病症或症狀的任何治療相關的改善或效果。對於預防益處，可以將組合物施用給處於發展特定疾病、病症或症狀的風險中的物件，或施用給報告疾病的一種或多種生理症狀的物件，即使疾病、病症或症狀可能顯現。

術語“有效量”或“治療有效量”通常是指組合物的量，例如包括免疫細胞如淋巴細胞（例如，T淋巴細胞和/或NK細胞）的組合物，其包括本公開的系統，量足以在向有需要的物件施用時產生期望的活性。在本公開的上下文中，術語“治療有效的”通常是指足以延遲通過本公開的方法治療的病症的表現、阻止其進展、緩解或減輕其至少一種症狀的組合物的量。

A. 概述

T細胞是適應性免疫系統的一部分，並且可以通過識別外源細胞表面上的免疫蛋白（即抗原）來引發以識別特定威脅。相反，NK細胞是先天免疫應答的一部分，並且可以應答被認為是“非自身”的廣泛對象。通常，與T細胞不同，NK細胞可以攻擊它們的靶細胞而不致敏（即，抗原特異性引發）以消除外來物質。

來源於物件的未修飾的NK細胞（例如，來源於物件的HSC）可以離體培養和擴增，然後作為攻擊其靶細胞（例如，癌細胞）的治療施用於物件。然而，基於NK細胞的療法可能由於NK細胞在離體或體內的半衰期短和/或增殖差而受到限制。此外，未修飾的NK細胞在靶向更難治療的癌症如骨髓瘤或實體瘤中可能是無效的。此外，基於血液來源的幹細胞（例如，HSC）的NK細胞的離體生產可以產生有限供應的NK細胞用於有效的過繼免疫療法。

因此，仍然存在對免疫細胞（例如，NK細胞、T細胞等）的顯著未滿足的需求，免疫細胞源自工程化以表現出例如增強的增殖，半衰期和針對靶細胞的細胞毒性活性。

B. 工程化免疫細胞

本公開描述了用於免疫療法的系統和方法。與對照細胞（例如，非工程化免疫細胞）相比，免疫細胞可被工程化以表現出增加的半衰期。與對照細胞相比，免疫細胞可被工程化以表現出增強的增殖。免疫細胞可被工程化以有效地且特異性地靶向對照細胞在其他情況下不足以或不能靶向的患病細胞（例如，癌細胞）。本文公開的工程化免疫細胞可以離體、體外以及在一些情況下體內工程化。離體或體外製備的工程化免疫細胞可施用於需要其的物件以治療疾病（例如，骨髓瘤或實體瘤）。工程化免疫細胞可以是物件自體的。備選地，工程化免疫細胞對於物件可以是同種異體的。

在一些情況下，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以源自分離的幹細胞（例如，分離的ESC）。在一些情況下，本文公開的工程化免疫細胞可以源自誘導的幹細胞（例如，iPSC）。

在一些情況下，本文公開的幹細胞（例如，分離的幹細胞、誘導的幹細胞）可以是自體細胞或源自自體細胞。自體細胞可以從患有病症或懷疑患有病症的對象獲得。備選地，可以在發現物件患有該病症之前從物件獲得自體細胞。在一些情況下，自體細胞可以是同種異體細胞，例如具有降低的免疫原性和降低的量或不需要免疫抑制藥物的通用幹細胞。自體細胞可以從健康供體獲得。

在一些情況下，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以是自體細胞。工程化免疫細胞可獲自患有病症或懷疑患有病症的對象。備選地，工程化免疫細胞可在發現物件患有病症之前從物件獲得。在一些情況下，工程化免疫細胞可以是同種異體細胞，例如用於具有降低的免疫原性和降低的量或不需要免疫抑制藥物的通用同種異體免疫療法。工程化免疫細胞可以從健康供體獲得。

在一些方面，與對照細胞（例如，非工程化的T細胞）相比，T細胞可被工程化以表現出增加的半衰期。與對照細胞相比，T細胞可被工程化以表現出增強的增殖。T細胞可被工程化以有效地且特異性地靶向對照細胞在其他情況下不足以或不能靶向的患病細胞（例如，癌細胞）。本文公開的工程化T細胞可以離體、體外以及在一些情況下體內工程化。離體或體外製備的工程化T細胞可以施用於有需要的物件以治療疾病（例如，骨髓瘤或實體瘤）。工程化T細胞可以是物件自體的。備選地，工程化T細胞對於物件可以是同種異體的。

在一些方面，NK細胞可被工程化以表現出與對照細胞（例如，非工程化NK細胞）相比增加的半衰期。與對照細胞相比，NK細胞可被工程化以表現出增強的增殖。NK細胞可被工程化以有效地且特異性地靶向對照細胞在其他情況下不足以或不能靶向的患病細胞（例如，癌細胞）。本文公開的工程化NK細胞可以離體、體外以及在一些情況下體內工程化。離體或體外製備的工程化NK細胞可以施用於需要其的物件以治療疾病（例如，骨髓瘤或實體瘤）。工程化NK細胞可以是物件自體的。備選地，工程化NK細胞對於物件可以是同種異體的。

在一個方面，本公開提供了包括異源銜接子的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）。異源銜接子可包括（i）（i）用於偶聯至工程化免疫細胞（例如偶聯至工程化免疫細胞的表面，諸如工程化免疫細胞表面上的受體蛋白的細胞外部分）的偶聯結構域和（ii）表現出與靶細胞的抗原特異性結合的抗原結合結構域。在一些情況下，工程化免疫細胞可分泌異源銜接子，使得異源銜接子可經由偶聯結構域偶聯至工程化免疫細胞。偶聯結構域和工程化免疫細胞之間的偶聯可以是非共價的（例如，通過氫鍵）。在一些情況下，異源銜接子可以與細胞內的受體蛋白偶聯，並且包括異源銜接子和受體蛋白的所得複合物（例如，非共價複合物）可以移動至工程化免疫細胞的膜，使得偶聯至受體蛋白的異源銜接子鄰近工程化免疫細胞的表面呈遞。因此，工程化免疫細胞可以通過異源銜接子的作用靶向（或結合）靶細胞，以表現出對靶細胞的增強的細胞毒性或殺傷靶細胞。本文提供的偶聯可包括兩個部分之間（例如，偶聯結構域和工程化免疫細胞或另一工程化免疫細胞的受體蛋白的細胞外部分之間）的非共價結合。

在一些實施方案中，異源銜接子是如本文所公開的抗體，其片段或其修飾。異源銜接子的偶聯結構域可以包括免疫球蛋白的至少一部分，例如IgG、IgE、IgA、IgM，其修飾物或其組合。例如，異源銜接子可以來源於IgG抗體，但不是全長IgG抗體。備選地，異源銜接子可以是全長IgG抗體。

在一些實施方案中，異源銜接子可以是或可以是以下各項的工程化變體：（i）人源化抗體（例如，通過將相關的互補性決定區（CDR）片段插入人抗體支架中，例如，用於CD20靶向的來源於奧比妥珠單抗（obinutuzumab）、維妥組單抗（veltuzumab）、奧瑞組單抗（ocrelizumab）等的CDR片段），（ii）完全人抗體（例如，用於CD20靶向的奧法木單抗（ofatumumab）、mAb 1.5.3等），和/或（iii）嵌合抗體（例如，通過將非人可變區剪接至人恒定區，例如，用於CD20靶向的利妥昔單抗）。

在一些實施方案中，偶聯結構域可包括長度為至少或至多約2個氨基酸殘基、至少或至多約5個氨基酸殘基、至少或至多約10個氨基酸殘基、至少或至多約15個氨基酸殘基、至少或至多約20個氨基酸殘基、至少或至多約25個氨基酸殘基、至少或至多約30個氨基酸殘基、至少或至多約35個氨基酸殘基、至少或至多約40個氨基酸殘基、至少或至多約45個氨基酸殘基、至少或至多約50個氨基酸殘基、至少或至多約60個氨基酸殘基、至少或至多約70個氨基酸殘基、至少或至多約80個氨基酸殘基、至少或至多約80個氨基酸殘基、至少或至多約90個氨基酸殘基、至少或至多約100個氨基酸殘基、至少或至多約110個氨基酸殘基、至少或至多約120個氨基酸殘基、至少或至多約130個氨基酸殘基、至少或至多約140個氨基酸殘基、至少或至多約150個氨基酸殘基、至少或至多約200個氨基酸殘基、至少或至多約250個氨基酸殘基、至少或至多約300個氨基酸殘基、至少或至多約400個氨基酸殘基、至少或至多約500個氨基酸殘基、至少或至多約600個氨基酸殘基、至少或至多約700個氨基酸殘基、至少或至多約800個氨基酸殘基、至少或至多約900個氨基酸殘基、或至少或至多約100個氨基酸殘基的多肽序列。

在一些實施方案中，異源銜接子可以是多肽，並且多肽可以具有至少或至多約5千道爾頓（kDa），至少或至多約10 kDa，至少或至多約15 kDa，至少或至多約20 kDa，至少或至多約30 kDa，至少或至多約40 kDa，至少或至多約50 kDa，至少或至多約60 kDa，至少或至多約70 kDa，至少或至多約80 kDa，至少或至多約90 kDa，至少或至多約100 kDa，至少或至多約110 kDa，至少或至多約120 kDa，至少或至多約130 kDa，至少或至多約140 kDa，至少或至多約150 kDa，至少或至多約160 kDa，至少或至多約170 kDa，至少或至多約180 kDa，至少或至多約190 kDa，至少或至多約200 kDa的大小。例如，異源銜接子可以是多肽，並且多肽可以具有至多約60 kDa的大小（例如，scFv-Fc）。

在一些情況下，異源銜接子可包括（i）可變重鏈（例如，VH、VHH等）和任選地可變輕鏈（例如，VL），其偶聯至（例如，直接或間接融合至）（ii）抗體的可結晶片段（Fc）的片段而非整體。在一些情況下，異源銜接子可以是比抗體小的抗體的衍生物，例如缺少選自C _L、C _H1、C _H1、C _L、C _H2和C _H3的一個或多個成員。例如，異源銜接子可以是比抗體小的抗體的衍生物，例如，缺少以下的一個或多個成員（例如，一個成員，兩個成員，三個成員或所有四個成員）：C _L、C _H1、C _H1和C _L。異源銜接子可至少缺少C _L。異源銜接子可至少缺少C _H1。異源銜接子可至少缺少C _H1。異源銜接子可至少缺少C _L。異源銜接子的大小可以比抗體（例如天然存在的抗體，如IgG）的大小小至少或至多約1%、至少或至多約2%、至少或至多約5%、至少或至多約10%、至少或至多約15%、至少或至多約20%、至少或至多約25%、至少或至多約30%、至少或至多約35%、至少或至多約40%、至少或至多約45%、至少或至多約50%、至少或至多約55%、至少或至多約60%、至少或至多約65%、或至少或至多約70%。

在一些實施方案中，受體蛋白可以是異源受體，使得異源銜接子和異源受體可以形成與本文公開的工程化免疫細胞的細胞外表面相鄰的複合物（例如，非共價複合物）。異源受體可包括Fc受體的至少一部分。Fc受體的非限制性實例可包括FcγRI（或CD64）、FcγRII（或CD32）、FcγRIII（或CD16）、FcϵRI、FcαRI（或CD89）、FcμR、Fcα/μR（或CD351），其修飾物或其組合。異源受體可包括FcγRI（或CD64）的至少一部分。異源受體可包括FcγRII（或CD32）的至少一部分。異源受體可包括FcγRIII（或CD16）的至少一部分。異源受體可以包括FcϵRI的至少一部分。異源受體可以包括FcαRI（或CD89）的至少一部分。異源受體可以包括FcμR的至少一部分。異源受體可包括Fcα/μR（或CD351）的至少一部分。

在一些實施方案中，（A）異源銜接子與工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的受體蛋白的偶聯和（B）異源銜接子與靶細胞的抗原的結合是必需的，但各自不足以使工程化免疫細胞殺傷靶細胞。在一些實施方案中，（A）異源銜接子與工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的異源受體的偶聯和（B）異源銜接子與靶細胞的抗原的結合是必需的，但各自不足以使工程化免疫細胞殺傷靶細胞。

在一些實施方案中，包括異源銜接子和異源受體的複合物的形成可以不需要和不需要抗生物素蛋白-生物素結合。在一些實施方案中，包括異源銜接子和異源受體的複合物的形成可利用抗生物素蛋白-生物素結合或其功能變體。

在一些實施方案中，本文公開的異源受體（或表面受體）可包括CD16、CD64，其修飾物或其組合。在一些情況下，異源受體可以是如本文所公開的用於增強CD16信號轉導的任何異源CD16變體。在一些實施方案中，異源受體可以是嵌合蛋白（例如，如本文公開的CD16-CD64融合蛋白、CD16-CD64-IL15RF融合蛋白等）。

在一些實施方案中，異源受體可包括至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%的如本文所公開的Fc受體。異源受體可包括至多約100%、至多約99%、95%、至多約90%、至多約85%、至多約80%、至多約75%、至多約70%、至多約60%、至多約50%、至多約40%、至多約30%、至多約25%、至多約20%、至多約15%、至多約10%或更少的如本文所公開的Fc受體。

在一些實施方案中，受體蛋白可以是內源性受體（例如，內源性表面受體）。例如，內源性受體可以是如本文所公開的內源性表達（例如，從工程化免疫細胞的內源性基因表達）的Fc受體。

在一些實施方案中，（a）異源銜接子的偶聯結構域可以偶聯至工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞），並且（b）異源銜接子的抗原結合結構域可以結合至靶細胞的抗原，使得工程化免疫細胞可以特異性地靶向靶細胞，例如以殺傷靶細胞。與不含異源銜接子的對照免疫細胞相比，異源銜接子可將工程化免疫細胞對靶細胞的靶特異性（例如，靶細胞特異性）提高至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約120%、至少約150%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%或更多。與對照免疫細胞相比，增強的靶特異性可以是至多約100%、至多約99%、95%、至多約90%、至多約85%、至多約80%、至多約75%、至多約70%、至多約60%、至多約50%、至多約40%、至多約30%、至多約25%、至多約20%、至多約15%、至多約10%、至多約5%、至多約2%、至多約1%、或更少。與對照免疫細胞相比，增強的靶特異性可以是至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或更多。與對照免疫細胞相比，增強的靶特異性可以是至多約500倍、至多約200倍、至多約100倍、至多約50倍、至多約40倍、至多約30倍、至多約25倍、至多約20倍、至多約15倍、至多約10倍、至多約9倍、至多約8倍、至多約7倍、至多約6倍、至多約5倍、至多約4倍、至多約3倍、至多約2倍、至多約1倍、至多約0.5倍、至多約0.2倍、至多約0.1倍或更少。

在一些實施方案中，異源銜接子可以將本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）和/或其他免疫細胞（例如宿主的其他NK細胞）募集至靶細胞，例如以誘導工程化免疫細胞和/或其他免疫細胞殺傷靶細胞。否則在沒有異源銜接子的情況下，工程化免疫細胞和/或其他免疫細胞將對靶細胞顯示很少或沒有靶特異性。

在一些實施方案中，異源銜接子可以是抗體或其修飾物，使得異源銜接子可以促進針對靶細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。具有產生和/或分泌異源銜接子的能力，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可足以誘導殺傷靶細胞（或靶細胞群體，如腫瘤）。例如，包括並能夠分泌異源銜接子的工程化NK細胞可以在基本上不含（例如，完全不含）異源銜接子的相應重組變體（例如，重組抗體，如重組單克隆抗體）的環境（例如，體外或體內環境）中誘導殺傷靶細胞群體（例如，癌症或腫瘤細胞群體），異源銜接子的相應重組變體不由工程化NK細胞分泌。因此，在另一個實例中，為了治療患有或懷疑患有癌症或腫瘤的物件，施用如本文所公開的工程化免疫細胞群體可足以基本上治療癌症或腫瘤，而不需要另外施用（例如，同時或依次）包括異源銜接子的相應重組變體（例如，重組抗體）的非細胞組合物。

包括並能夠分泌如本文所公開的異源銜接子的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以在非細胞組合物中減少量的重組抗體的情況下誘導對靶細胞群體（例如，癌症/腫瘤細胞）的殺傷。與不含任何能夠分泌異源銜接子的工程化免疫細胞的對照療法相比，包括並能夠分泌異源銜接子的工程化免疫細胞能夠將非細胞組合物中的重組抗體的量減少至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%。例如，使用分泌本文公開的異源銜接子的工程化免疫細胞的療法（例如，癌症療法）可能不需要與包括重組抗體的非細胞組合物的協同治療，例如用於治療癌症。

不希望受理論束縛，與直接施用抗體相比，通過施用分泌此類抗體（或變體）的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）向有需要的物件施用抗體或其變體可減少產生治療效果（例如癌症療法）所需的此類抗體的量。

不希望受理論束縛，（A）如本文所公開的包括異源銜接子（例如，抗體或其修飾物）和任選地異源受體的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的總量（例如，數目），其足以在物件中產生治療效果（例如，足以殺傷物件中的癌症或腫瘤細胞群體），可以小於（B）異源銜接子（例如，重組抗體）的相應重組變體的總量（例如，數目），其足以在對照物件中產生至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或更高的相當的治療效果。不希望受理論束縛，（A）如本文所公開的，足以在物件中產生治療效果的包括異源銜接子（例如，抗體或其修飾物）和任選地異源受體的工程化免疫細胞的總量（例如，數目）可以比（B）足以在對照物件中產生相當的治療效果的異源銜接子的相應重組變體的總量（例如，數目）小至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或更多。

不希望受理論束縛，（A）如本文所公開的足以在物件中產生治療效果（例如，足以殺傷物件中的癌症或腫瘤細胞群體）的工程化免疫細胞群體（例如，工程化NK細胞群體）分泌的異源銜接子（例如，抗體或其修飾物）的總量（例如，數目）可以比（B）足以在對照物件中產生相當的治療效果的異源銜接子的相應重組變體（例如，重組抗體）的總量（例如，數目）小至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或更多。不希望受理論束縛，（A）如本文所公開的工程化免疫細胞群體分泌的足以在物件中產生治療效果的異源銜接子的總量（例如，數目）可以比（B）足以在對照物件中產生相當的治療效果的異源銜接子的相應重組變體的總量（例如，數目）小至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或更多。

不希望受理論束縛，在施用於物件後，（A）如本文所公開的能夠分泌異源銜接子（例如，抗體或其修飾物）的工程化免疫細胞的半衰期可比（B）異源銜接子的相應重組變體（例如，重組抗體）的半衰期（例如，用於直接施用於物件）長至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約120%、至少約150%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%或更多。不希望受理論束縛，在施用于物件時，（A）分泌如本文所公開的異源銜接子的工程化免疫細胞的半衰期可比（B）異源銜接子的相應重組變體的半衰期長至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或更多。

不希望受理論束縛，在施用于物件時，分泌如本文所公開的異源銜接子的工程化免疫細胞的半衰期可為至少約1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、16小時、20小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更多。

不希望受理論束縛，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括如本文所公開的異源受體和異源銜接子（例如，異源抗體），並且異源受體和異源銜接子可被設計成使得（A）異源受體和異源銜接子之間的結合親和力可比（B）物件（例如人物件）的內源性免疫細胞（例如，內源性NK細胞）的Fc受體和異源銜接子的相應重組變體（例如，重組抗體）之間的結合親和力大至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約120%、至少約150%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%或更多。不希望受理論束縛，（A）異源受體和異源銜接子之間的結合親和力可以比（B）物件的內源性免疫細胞（例如，內源性NK細胞）的Fc受體和異源銜接子的相應重組變體之間的結合親和力大至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或更多。

不希望受理論束縛，施用工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）以實現如本文所公開的異源銜接子（例如，異源抗體）的體內和原位分泌可減少（或消除）單克隆抗體施用療法的一種或多種副作用，例如非特異性靶向、器官特異性不良事件（例如，心臟毒性）、發熱、寒戰、頭痛、噁心、嘔吐、腹瀉、皮疹等。

在一些實施方案中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以組成型表達異源銜接子（和/或異源受體），以組成型分泌異源銜接子（和/或異源受體）。例如，在工程化免疫細胞中，編碼異源銜接子（和/或異源受體）的基因可以可操作地偶聯至組成型啟動子（例如，用於哺乳動物系統的SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK和CAGG）。

在一些實施方案中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以有條件地表達異源銜接子（和/或異源受體），以有條件地分泌異源銜接子（和/或異源受體）。在一些情況下，編碼異源銜接子（和/或異源受體）的基因可以可操作地偶聯至對工程化免疫細胞的細胞狀態（或類型）特異性的啟動子。例如，這種基因可以可操作地與免疫細胞啟動子偶聯。免疫細胞啟動子的非限制性實例可包括CD8細胞特異性啟動子、CD4細胞特異性啟動子、嗜中性粒細胞特異性啟動子和NK特異性啟動子。例如，NK特異性啟動子可以是調節NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80等中的至少一種的表達的啟動子。在一些情況下，編碼異源銜接子（和/或異源受體）的基因可以可操作地偶聯至異源啟動子，其中異源啟動子在外部刺激（例如，光、磁場、細胞外配體等）下是可啟動的。例如，異源啟動子可以與細胞的嵌合抗原受體（CAR）信號轉導可操作地偶聯，使得活化的CAR在結合靶抗原時活化啟動子，從而活化異源銜接子（和/或異源受體）的表達。在另一個實例中，異源啟動子可以是小分子應答啟動子，如四環素應答啟動子（TRE）。

在一些實施方案中，編碼本文公開的異源銜接子的基因可被基因組整合到工程化免疫細胞中。在一些實施方案中，編碼本文公開的異源銜接子的基因可以不是基因組整合的。例如，這種基因可以在工程化免疫細胞內的異源質粒中。

在一些實施方案中，編碼本文公開的異源受體的基因可被基因組整合到工程化免疫細胞中。在一些實施方案中，編碼本文公開的異源受體的基因可以不是基因組整合的。例如，這種基因可以在工程化免疫細胞內的異源質粒中。

在一些實施方案中，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括編碼異源銜接子的第一多核苷酸序列和編碼異源受體的第二多核苷酸序列。在一些情況下，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列可以是相同核酸分子的一部分（例如，相同表達盒的一部分）。在這種情況下，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列可以在相同啟動子的控制下。備選地，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列可以在不同啟動子的控制下。在一些情況下，多核苷酸序列和第二多核苷酸序列可以各自在不同的核酸分子中（例如，在不同的表達盒中）。

在一些實施方案中，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以包括單一工程化免疫細胞，其包括異源銜接子和異源受體兩者。

在一些實施方案中，本文公開的工程化免疫細胞可包括第一工程化免疫細胞（例如，第一工程化NK細胞）和第二工程化免疫細胞（例如，第二工程化NK細胞）。第一工程化免疫細胞可被構建成表達和分泌本文公開的異源性，但可以不被構建成表達異源受體。第二工程化免疫細胞可被構建成表達異源受體，但可不被構建成表達異源銜接子。因此，第一工程化免疫細胞和第二工程化免疫細胞可能是必需的，但可能各自不足以在物件中產生治療效果（例如，在物件中治療癌症或腫瘤）。

在一些實施方案中，本文公開的異源銜接子可包括至少或至多1個、至少或至多2個、至少或至多3個、至少或至多4個、或至少或至多5個不同的偶聯結構域。異源銜接子可包括多個不同的偶聯結構域，並且多個不同的偶聯結構域可偶聯至相同的細胞（例如，如本文所公開的相同的工程化免疫細胞）或可偶聯至不同的細胞。例如，第一偶聯結構域與本文公開的工程化NK細胞偶聯，第二偶聯結構域與不同的免疫細胞（例如，T細胞）偶聯。在這種情況下，第一偶聯結構域可以側接第二偶聯結構域和抗原結合部分。備選地，抗原結合部分可以側接第一偶聯結構域和第二偶聯結構域。

在一些實施方案中，本文公開的異源銜接子可包括至少或至多1個、、至少或至多2個、至少或至多3個、至少或至多4個、至少或至多5個不同的抗原結合部分。異源銜接子可包括多種不同的抗原結合部分，用於靶向多種不同的抗原。多種不同的抗原可以呈遞在相同的靶細胞（例如，相同的癌細胞）或不同的靶細胞（例如，癌性靶細胞和非癌性免疫細胞）上。

在一些實施方案中，與對照免疫細胞相比，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可表現出降低的抗原內源性變體的表達和/或活性水準。與對照免疫細胞相比，工程化免疫細胞可表現出編碼抗原的內源性基因的降低的表達和/或活性水準。

在一些實施方案中，如本文所公開的，異源受體（或表面受體）可包括CD16或其修飾的至少一部分，以識別並結合至異源銜接子（例如，分泌型異源銜接子）的偶聯結構域。在（A）異源銜接子與異源受體偶聯和（B）異源銜接子與靶細胞的靶抗原結合後，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的CD16信號轉導可被增強以加強工程化免疫細胞的一種或多種活性（例如生存力、增殖、存活、針對靶細胞如癌細胞的細胞毒性等）。備選地或另外，可以設計基於CD16的異源受體，使其組成型活化以組成型誘導增強的CD信號轉導和工程化免疫細胞的一種或多種下游活性。在這種情況下，異源銜接子和基於CD16的異源受體之間的偶聯可用作錨，以允許工程化免疫細胞更有效、更快和/或更長地識別、靶向和結合靶細胞。

本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的增強的CD16信號轉導（例如，CD16的組成型活化信號轉導）可以通過在物件細胞中具有不可切割的CD16變體來實現。CD16（例如，CD16a）是免疫細胞（例如，NK細胞）表達的跨膜蛋白，其結合附著於靶細胞的單體IgG以啟動免疫細胞並促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。在非工程化免疫細胞中，CD16和單體IgG之間的結合可以在跨膜結構域附近的切割位元點誘導CD16蛋白的切割，從而在免疫細胞活化時調節CD16的細胞表面密度。因此，工程化免疫細胞的內源性CD16可被修飾以增強其信號轉導。備選地，可將CD16的增強信號轉導變體人工引入工程化免疫細胞。

在一些情況下，編碼CD16的工程化免疫細胞的內源性基因可在其細胞外結構域（例如，F176V）中經由如本文所公開的基因編輯部分的作用進行基因修飾，使得與天然CD16相比，經修飾的CD16展現與其靶標（例如，單體IgG）較高的結合親和力。在一些情況下，可以將編碼這種修飾的CD16的異源基因導入細胞。

在一些情況下，編碼CD16的工程化免疫細胞的內源性基因可以通過本文所公開的基因編輯部分的作用進行基因修飾，使得修飾的CD16是不可切割的並且可以誘導增強的CD16信號轉導。在一些實例中，可以修飾或消除CD16的近膜區（位置189-212）中的切割位點（例如，位置195-198）（例如，作為不可切割CD16變體的CD16 S197P變體）。在一些情況下，可以將編碼這種修飾的CD16的異源基因導入細胞。

在一些情況下，編碼異源CD16變體的異源基因引入細胞（即，hnCD16），異源CD16變體（i）對其靶標（例如，單體IgG）表現出較高的結合親和力並且（ii）是不可切割的。在一些實例中，異源CD16變體可以是修飾的CD16，其包括例如本文公開的F176V和S197P。在一些實例中，異源CD變體可以是融合受體蛋白，其包括（i）具有失活切割位點的CD16的至少一部分和（ii）不同細胞表面蛋白的細胞外結構域，例如糖蛋白（例如，CD64），其與未修飾的CD16相比表現出增強的與靶標（例如，單體IgG）的結合。

本文公開的異源基因可以通過本文公開的基因編輯部分的作用整合到工程化細胞（例如，工程化NK細胞）的基因組中。備選地，異源基因可以不整合到工程化細胞的基因組中，也不需要整合到工程化細胞的基因組中。

本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的增強的CD16信號轉導可通過多種方法確定，包括但不限於（i）通過蛋白印跡的下游信號轉導蛋白（例如，SHP-1）的磷酸化或（ii）通過蛋白印跡或PCR技術的下游基因（例如，CD25、IFN-γ、TNF等）的表達。

在一些情況下，本公開的工程化免疫細胞（例如，包括hnCD16的工程化NK細胞）的CD16信號轉導可以比對照細胞的CD16信號轉導大至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約4倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些情況下，本公開的工程化免疫細胞（例如，包括hnCD16的工程化NK細胞）的增強的CD16信號轉導的特徵可在於與對照細胞相比，下游信號轉導蛋白的磷酸化增加至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些情況下，本公開的工程化免疫細胞（例如，包括hnCD16的工程化NK細胞）的增強的CD16信號轉導的特徵可在於與對照細胞相比，下游基因的表達增加至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些情況下，本公開的工程化免疫細胞（例如，包括hnCD16的工程化NK細胞）的CD16信號轉導可以比對照細胞的CD16信號轉導延長（例如，活化的CD16信號轉導的持續時間更長）至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些實施方案中，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）還可以包括或表現出以下的一個或多個成員：（i）嵌合多肽受體（例如，嵌合抗原受體（CAR）、工程化T細胞受體（TCR）等），其包括能夠結合抗原的抗原結合部分；和/或（ii）與對照NK細胞相比內源性CD38的表達和/或活性水準降低；和/或（iii）降低的免疫檢查點抑制劑（例如，PD1、CTLA-4、TIM-3、KIR2D、CD94、NKG2A、TIGIT、CD96、LAG3、TIGIT、TGF β受體、2B4等）的表達和/或活性水準；和/或（iv）降低的免疫低下調節劑（例如，B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB、ULBP1、HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55、CD59等）的表達和/或活性水準；和/或（v）能夠實現工程化NK細胞死亡的安全開關（例如，在刺激後，如暴露於活化部分，如光或抗體）；和/或（vi）異源細胞因數（例如，白介素（IL））和/或其異源受體，用於與對照NK細胞相比增強的細胞因數信號轉導。在一些實施方案中，工程化免疫細胞可包括選自本文公開的（i）、（ii）、（iii）、（iv）、（v）和（vi）（“（i）-（vi）”）的一個或多個成員、兩個或更多個成員、三個或更多個成員、四個或更多個成員或所有成員。

在一些實施方案中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以包括/表現出嵌合多肽受體（例如，CAR、工程化TCR等），其包括能夠結合抗原（例如，靶細胞的抗原）的抗原結合部分。在一些情況下，本文公開的（A）嵌合多肽受體的抗原結合部分的靶抗原和（B）異源銜接子的抗原結合部分的靶抗原可以是相同的。在一些情況下，（A）嵌合多肽受體的抗原結合部分的靶抗原和（B）本文公開的異源銜接子的抗原結合部分的靶抗原可以不同。在這種情況下，不同的靶抗原可以是相同的靶細胞，或不同的靶細胞類型（例如，免疫細胞和癌細胞，兩種不同的癌細胞類型等）。

在一些實施方案中，本文公開的嵌合多肽受體的抗原結合部分和/或異源銜接子的抗原結合部分的抗原可以是BCMA、CD7、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CD123、κ（Kappa）、Lewis Y、ROR1、NY-ESO-1、NY-ESO-2、MART-1和/或gp10。

在一些實施方案中，與對照NK細胞相比，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括（或表現出）異源細胞因數（例如，IL）和/或其異源受體以增強工程化免疫細胞中細胞因數的信號轉導。

本文公開的異源細胞因數（例如，異源IL）和/或其異源受體可以是與工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）相同的物種。例如，異源細胞因數（和/或其異源受體）和工程化免疫細胞都可以是人源的。備選地，異源細胞因數（和/或其異源受體）可以是與工程化免疫細胞不同的物種。

本文公開的異源細胞因數（例如，異源IL）和/或其異源受體可通過將編碼異源細胞因數和/或其異源受體的異源多核苷酸與工程化免疫細胞接觸而引入工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）。異源多核苷酸可以整合到工程化免疫細胞的染色體（例如，核染色體）中。備選地，異源多核苷酸可以不整合到和不需要整合到工程化免疫細胞的染色體中。在一個實例中，可以將編碼異源細胞因數的mRNA引入（或插入）工程化免疫細胞。

在一些情況下，本文公開的細胞因數可以是IL。本文公開的IL可包括至少1、2、3、4、5或更多種不同類型的IL。本文公開的IL可包括至多5、4、3或2種不同類型的IL。備選地，IL可以是單一類型的IL。IL的非限制性實例可包括但不限於IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36。在一些實例中，IL可以包括選自IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21及其功能修飾的一個或多個成員。例如，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以包括本文公開的任一種IL的異源變體的至少一部分，例如人IL-15（或其編碼基因）。在另一個實例中，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以包括本文公開的任一種IL的受體的異源變體的至少一部分，例如人IL-15受體（IL-15R）（或其編碼基因）。

本文公開的異源細胞因數（例如，異源IL）可以是分泌細胞因數。備選地，異源細胞因數可以不是也不必由工程化免疫細胞分泌。在這種情況下，例如，異源細胞因數可以結合到工程化免疫細胞的細胞表面。

在一些情況下，本文公開的異源細胞因數（例如，異源IL）可以是分泌細胞因數。編碼異源細胞因數的表達盒可被引入工程化免疫細胞。表達盒可以進一步編碼另外的異源多肽，例如異源受體。在表達盒內，編碼異源細胞因數的第一多核苷酸序列和編碼另外的異源多肽（例如，異源受體）的第二多核苷酸序列可以通過編碼切割接頭的多核苷酸接頭彼此偶聯。在一些實例中，異源受體可以是異源細胞因數的相應受體（例如，異源IL-15的異源IL-15α或IL-15β）。備選地，表達盒可以不編碼和不需要編碼除異源細胞因數之外的任何其他異源多肽。

本文公開的可切割接頭可包括自切割肽，例如自切割2A肽。自切割肽可在核糖核酸病毒科病毒家族的成員中發現，包括口蹄疫病毒，例如口蹄疫病毒（FMDV）、馬鼻炎A病毒（ERAV）、Thosea asigna病毒（TaV）和豬捷申病毒-1（porcine tescho virus-1，PTV-1），和心病毒，例如泰勒病毒（Theilovirus）（例如，泰勒鼠腦脊髓炎）和腦心肌炎病毒。自切割2A肽的非限制性實例可包括“F2A”、“E2A”、“P2A”、“T2A”及其功能變體。

在一些情況下，如本文所公開的異源細胞因數（例如，異源IL）可以結合至工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的細胞表面。在一些實例中，工程化免疫細胞可被基因修飾，使得編碼異源細胞因數的異源多核苷酸序列與編碼工程化免疫細胞的內源性跨膜蛋白的基因偶聯。在一個實例中，內源性跨膜蛋白可以是異源細胞因數（例如異源IL-15的異源IL-15α或IL-15β）的相應受體。在一些實例中，可將編碼異源融合多肽的表達盒引入工程化免疫細胞，異源融合多肽包括（i）偶聯至（ii）異源受體的異源細胞因數。這裡，異源細胞因數可以不是也不需要可從異源受體切割。異源受體的非限制性實例可以包括異源細胞因數的相應受體（例如，異源IL-15的異源IL-15α或IL-15β），或不同的受體如共同的γ鏈（γC）受體或其修飾。

本文公開的表達盒可以通過本文公開的基因編輯部分的作用整合到工程化細胞（例如，工程化NK細胞）的基因組中。備選地，表達盒可以不整合到工程化細胞的基因組中，也不需要整合到工程化細胞的基因組中。

本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出涉及本文公開的異源細胞因數（例如，異源IL，如異源IL-15）和/或異源受體（例如，異源IL受體，如異源IL-15R）的內源性信號通路的增強的信號轉導。本文公開的內源性信號通路的增強的信號轉導可通過多種方法確定，包括但不限於，（i）下游信號轉導蛋白的磷酸化（例如，對於IL-15/IL-15R為JAK3、STAT3、STAT5等）或（ii）下游基因的表達（例如，對於IL-15/IL-15R為Mcl1、Cdk4/6、Mki67、Tnf、Gzmb、Gzmc、Ifng等），經由蛋白印跡或聚合酶鏈反應（PCR）技術。

在一些情況下，在本公開的工程化免疫細胞中由異源細胞因數和/或異源受體誘導（例如，由異源細胞因數和/或異源受體如本文公開的IL-15/IL-15R誘導）的內源性信號通路的增強的信號轉導的特徵可在於與對照細胞相比，下游信號轉導蛋白的磷酸化增加至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些情況下，在本公開的工程化免疫細胞中由異源細胞因數和/或異源受體誘導（例如，由異源細胞因數和/或異源受體如本文公開的IL-15/IL-15R誘導）的內源性信號通路的增強的信號轉導的特徵可在於與對照細胞相比下游基因的表達增加至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括降低的內源性細胞因數信號轉導（例如內源性IL信號轉導，諸如內源性IL-17信號轉導）活性。工程化免疫細胞可來源於分離的幹細胞（例如，分離的ESC）。備選地，工程化免疫細胞可來源於誘導的幹細胞（例如iPSC）。

在一些情況下，工程化NK細胞可用內源性細胞因數信號轉導的抑制劑（例如，小分子抑制劑）處理。在一些情況下，工程化NK細胞可包括內源性IL（例如，內源IL-17）或其內源性受體的降低的表達（例如，經由插入缺失（indel）或轉基因突變，經由暫態或永久抑制等）。在一些情況下，工程化NK細胞可包括降低的內源性IL-17表達。在一些情況下，工程化NK細胞可包括降低的內源性IL-17R表達。在一些情況下，工程化NK細胞可包括降低的內源性IL-17和內源性IL-17R的表達。

在一些情況下，本文公開的內源性細胞因數可以是內源性IL。本文公開的內源性IL可包括至少1、2、3、4、5或更多種不同類型的內源性IL。本文公開的內源性IL可包括至多5、4、3或2種不同類型的內源性IL。備選地，內源性IL可以是單一類型的內源性IL。內源性IL的非限制性實例可包括但不限於IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36。在一些實例中，內源性IL可以是IL-17。內源性Il-17的非限制性實例可包括IL-17A、IL-17F及其天然突變。例如，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可表現出降低的IL-17A或IL-17F表達或活性。

在一些情況下，編碼如本文所公開的內源性細胞因數（例如，內源性IL，諸如IL-17）的內源性基因可經由如本文所公開的基因編輯部分的作用來修飾。

內源性受體可以是本文公開的任何細胞因數的相應受體（例如，本文公開的任何IL的相應受體）。在一些情況下，內源性受體可為IL的相應受體（例如，IL-7信號轉導的IL-17R）。IL-17R的非限制性實例可包括IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE及其變體。在一個實例中，內源性IL-17R包括IL-17RA。

在一些情況下，如本文所公開的內源性細胞因數（例如，內源性IL，諸如IL-17）或其內源性受體的降低的表達或活性可通過多種方法來確定，包括但不限於（i）下游信號轉導蛋白（例如，IL-17的PI3K、Act1、MAP3K、MEK1/2、MKK3/6、MKK4/7、MKK3/6、ERK、p38、JNK等）的磷酸化或（ii）下游基因經由蛋白印跡或PCT技術的表達。在一些實例中，IL細胞因數例如IL-17的下游基因可包括趨化因數（例如CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL20等）、細胞因數（例如IL-6、TNFa、G-CSF、GM-CSF等）、急性期應答分子（例如SAA、CRP、脂質運載蛋白2/24p3等）和/或酶（例如，金屬蛋白酶，例如，MMP1、MMP3、MMP9、MMP13）。

在一些情況下，如本文所公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中內源性細胞因數（例如，內源性IL，諸如IL-17）或其內源性受體的表達或活性降低的特徵可在於與對照細胞相比，內源性細胞因數的下游信號轉導蛋白的磷酸化減少至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些情況下，如本文所公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中內源性細胞因數（例如，內源性IL，諸如IL-17）或其內源性受體的表達或活性降低的特徵可在於與對照細胞相比，內源性細胞因數的下游基因的表達減少至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些情況下，如本文所公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）與不顯示如本文所公開的內源性細胞因數信號轉導（例如，內源性IL信號轉導，諸如內源性IL-17信號轉導）活性降低的對照細胞相比，可顯示針對定向免疫細胞（例如，NK細胞標誌物）的特異性細胞標記的增強的表達譜。例如，定向NK細胞的特異性細胞標誌物的非限制性實例可包括CD57或殺傷免疫球蛋白樣受體（KIR）。KIR可以包括KIR2D和/或KIR3D。KIR2D可以包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4和/或KIR2DS5。KIR3D可以包括KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3和/或KIR3DS1。

本文公開的定向免疫細胞的特異性細胞標誌物（例如，NK細胞的CD57或KIR）的增強的表達譜可以通過多種方法確定，包括但不限於蛋白印跡或PCR技術。

在一些情況下，本公開的工程化免疫細胞中的定向免疫細胞（例如，CD57或KIR或NK細胞）的特異性細胞標誌物的表達可以比對照細胞的特異性細胞標誌物的表達多至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約4倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些實施方案中，與至少缺少異源銜接子和/或異源受體的對照細胞相比，如本文所公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）在腫瘤細胞存在下可表現出增強的存活。在一些情況下，工程化免疫細胞在腫瘤細胞存在下可以比對照細胞存活時間長至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些實施方案中，如在此公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出一種或多種免疫檢查點抑制劑（例如，PD1、CTLA-4、TIM-3、KIR2D、CD94、NKG2A、TIGIT、CD96、LAG3、TIGIT、TGF β受體、2B4等）的降低的表達或活性。一種或多種免疫檢查點抑制劑可以是工程化免疫細胞內源性的。在一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性PD1的降低的表達和/或活性。在另一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性CTLA-4的降低的表達和/或活性。在另一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性TIM-3的降低的表達和/或活性。在另一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性KIR2D的降低的表達和/或活性。在另一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性CD94的降低的表達和/或活性。在另一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性NKG2A的降低的表達和/或活性。在另一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性TIGIT的降低的表達和/或活性。在另一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性TGF β受體的降低的表達和/或活性。在另一個實例中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出內源性2B4的降低的表達和/或活性。

在一些情況下，免疫檢查點抑制劑（例如，CD94、CD96、TGF β受體等）在本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的降低的表達或活性可以比對照細胞對其的表達低至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約4倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在一些實施方案中，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以表現出本文公開的一種或多種免疫低下調節劑（例如，一種或多種內源性免疫調節劑多肽）的降低的表達或活性。一種或多種免疫低下調節劑可選自B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB、ULBP1、HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59。

通過蛋白印跡或PCT技術所確定，如本文所公開，在一些情況下，本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的免疫低下調節劑（例如，內源性免疫低下調節劑）的表達或活性可以比對照細胞中的表達或活性低至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約4倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，與對照細胞相比，工程化免疫細胞可表現出內源性CD38的表達或活性降低。這種工程化免疫細胞可用於治療患有或懷疑患有白細胞癌如多發性骨髓瘤（MM）的對象。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，工程化免疫細胞的內源性CD38的表達或活性可以不被修飾和不需要被修飾。這種工程化免疫細胞可用於治療患有或懷疑患有不是多發性骨髓瘤的疾病（例如，癌症、腫瘤）的對象。

在一些實施方案中，工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括嵌合多肽受體（或至少一種嵌合多肽受體），嵌合多肽受體包括能夠結合如本公開中所提供的抗原的抗原結合部分。在一些實例中，工程化免疫細胞可包括多種不同的嵌合多肽受體以特異性結合多種不同的抗原。在一些實例中，工程化免疫細胞可包括至少一種嵌合多肽受體，其包括多個抗原結合部分以特異性結合多個不同抗原。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，工程化免疫細胞可以包括能夠實現工程化免疫細胞死亡的安全開關。工程化免疫細胞可以包括通過如本文所公開的基因編輯部分的作用編碼安全開關（例如，整合到免疫細胞的基因組中）的基因。在一些情況下，可在不良事件的情況下或當不再需要適應性免疫療法時將前藥引入工程化免疫細胞（例如，向包括工程化免疫細胞的物件施用），並且前藥可被安全開關分子活化以殺傷物件的免疫細胞。在一些情況下，安全開關可包括選自以下的一個或多個成員：半胱天冬酶（caspase）（例如，半胱天冬酶3、7或9）、胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、經修飾的EGFR、B細胞CD20和其功能性變異體。在一些情況下，安全開關可經由活化劑（例如小分子或蛋白，諸如抗體）活化以用於物件工程化免疫細胞死亡（或耗竭）的翻譯後、時序和/或位點特異性調節。安全開關及其啟動物的非限制性實例可以包括半胱天冬酶9（或半胱天冬酶3或7）和AP1903；胸苷激酶（TK）和更昔洛韋（GCV）；以及胞嘧啶脫氨酶（CD）和5-氟胞嘧啶（5-FC）。備選地或另外，當對象細胞暴露于抗體時，含有由抗體（例如，抗EGFR Ab，諸如西妥昔單抗）識別的表位的經修飾的表皮生長因數受體（EGFR）可用於耗竭工程化免疫細胞。在一些情況下，如本文所公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括選自以下的安全開關蛋白：半胱天冬酶9（半胱天冬酶3或7）、胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、經修飾的EGFR和B細胞CD20.3。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，與對照細胞相比，工程化免疫細胞可表現出針對靶細胞的增強的細胞毒性。在一些情況下，如本文所公開的工程化免疫細胞可展現針對靶細胞或靶細胞群體的細胞毒性（例如，體外、離體或體內），該細胞毒性比對照細胞大至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍，如通過例如跟蹤靶細胞群體數目的變化所確定。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，與對照細胞相比，工程化免疫細胞可以誘導來自分離的免疫細胞（例如，體外分離的T細胞和/或B細胞，或在向宿主施用工程化免疫細胞後的宿主免疫細胞）的免疫應答降低。在一些情況下，與當暴露于對照細胞時來自分離的免疫細胞的免疫應答相比，如本文公開的工程化免疫細胞可以將來自分離的免疫細胞的免疫應答減少至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍，如通過例如測量（i）在暴露於分離的免疫細胞時工程化免疫細胞的初始群體的數目的變化或（ii）在暴露於工程化免疫細胞的初始群體時分離的免疫細胞的細胞因數釋放的變化所確定。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，與對照細胞相比，工程化免疫細胞在暴露於單獨的免疫細胞（例如，體外單獨的T細胞和/或B細胞，或在向宿主施用工程化免疫細胞後的宿主免疫細胞）時可表現出增加的半衰期。在一些情況下，在暴露於單獨的免疫細胞（例如，體外或體內）後，工程化免疫細胞的半衰期可以比對照細胞的半衰期大至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍，如通過隨時間監測工程化免疫細胞的數目（例如，經由FACS）所確定。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，與對照細胞相比，工程化免疫細胞可以實現物件身體組織的增強的功能或病理狀況。在一些情況下，與對照細胞或載體（即，無細胞）相比，用工程化免疫細胞治療可使物件的身體組織的功能或病理狀況增強至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，與對照細胞相比，工程化免疫細胞可實現物件身體組織的功能或病理狀況的延遲退化。在一些情況下，與對照細胞或載體（即，無細胞）相比，用工程化免疫細胞治療可使物件的身體組織的功能或病理狀況的退化延遲至少或至多約0.1倍、至少或至多約0.2倍、至少或至多約0.3倍、至少或至多約0.4倍、至少或至多約0.5倍、至少或至多約0.6倍、至少或至多約0.7倍、至少或至多約0.8倍、至少或至多約0.9倍、至少或至多約1倍、至少或至多約2倍、至少或至多約3倍、至少或至多約4倍、至少或至多約5倍、至少或至多約6倍、至少或至多約7倍、至少或至多約8倍、至少或至多約9倍、至少或至多約10倍、至少或至多約20倍、至少或至多約30倍、至少或至多約40倍、至少或至多約50倍、至少或至多約60倍、至少或至多約70倍、至少或至多約80倍、至少或至多約90倍、至少或至多約100倍、至少或至多約500倍、至少或至多約1,000倍、至少或至多約5,000倍、或至少或至多約10,000倍。

在本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種的一些實施方案中，身體組織可包括選自以下的一個或多個成員：血液、血漿、血清、尿液、外淋巴液、糞便、唾液、精液、羊水、腦脊液、膽汁、汗液、淚液、痰液、滑液、嘔吐物、骨、心臟、胸腺、動脈、血管、肺、肌肉、胃、腸、肝、胰腺、脾、腎、膽囊、甲狀腺、腎上腺、乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、皮膚、脂肪、眼、腦、感染組織、患病組織、惡性組織、鈣化組織和健康組織。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，工程化免疫細胞可誘導針對靶細胞的免疫應答。目標可以是例如患病細胞、癌細胞、腫瘤細胞等。

在一些實施方案中，如本文所公開的靶基因（例如，內源性基因、異源基因）的調節可以通過如本文所公開的基因編輯部分來調節。調節可以是增強（或啟動）或降低（或抑制）靶基因的表達水準和/或活性水準。調節可以包括通過基因編輯部分（例如，具有指導核酸分子如指導RNA分子的CRISPR-Cas系統）的作用切割靶基因的至少一部分，以編輯靶基因的至少該部分。備選地，調節可以不需要通過基因編輯部分的作用切割靶基因的任何部分。相反，基因編輯部分（例如，dCas-啟動劑或dCas-抑制劑融合蛋白，連同指導核酸分子）可以與靶基因形成複合物，以（A）啟動靶基因的表達或（B）阻礙或抑制靶基因的表達。

C. 工程化免疫細胞的其他方面

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，異源基因可以可操作地偶聯（例如用於敲入）組成型、誘導型、時序特異型、組織特異性和/或細胞類型特異性啟動子。目的啟動子的非限制性實例可以包括CMV、EF1a、PGK、CAG和UBC。插入位元點的非限制性實例可包括AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原、HTRP、H11、B2M、GAPDH、TCR、RUNX1、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR a或TCR b恒定區、NKG2A、NKG2D、CD38、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，可以表現出一種或多種以下用於增強工程化免疫細胞在腫瘤微環境中的功能的內源性基因（即腫瘤微環境基因或“TME”）的降低的表達或活性。在一些情況下，具有降低的TME表達或活性可以增強工程化免疫細胞針對靶細胞的免疫活性。在一些情況下，TME基因可以是免疫檢查點抑制劑。TME的非限制性實例可以包括：NKG2A、NKG2D、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、KIR2D、CD94、CD96、TGF β受體、2B4和SHIP2。

在本文公開的任一種工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的一些實施方案中，可以表現出一種或多種異源基因（例如敲入），用於例如增強的功能：CD137、CD80、CD86、DAP10（例如，具有或不具有點突變）。

在本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種的一些實施方案中，對於例如免疫低下，可表現出一種或多種以下內源性基因的降低的表達或活性：B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB和NKG2DL（例如，ULBP1）。

在本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種的一些實施方案中，可以展示一個或多個異源基因（例如敲入）用於例如免疫低下：HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59。

在本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種的一些實施方案中，可表現出一種或多種異源基因（例如敲入）：CD3、CD4、CD80、41BBL和CD131。

D. 嵌合抗原受體

本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以包括如本文公開的嵌合多肽受體（例如，至少1、2、3、4、5或更多種不同類型的嵌合多肽受體）。工程化免疫細胞可被工程化以暫態或永久地表達嵌合多肽受體。在一些情況下，重組嵌合多肽受體可經由例如脂質體遞送至工程化免疫細胞，並通過膜融合摻入工程化免疫細胞。在一些情況下，可將編碼嵌合多肽受體的異源多核苷酸構建體（例如DNA或RNA）遞送至工程化免疫細胞。編碼異源多核苷酸構建體的異源多核苷酸構建體（即基因）可以整合到工程化免疫細胞的染色體中（即染色體基因），或者備選地可以不整合到或不需要整合到本文公開的工程化免疫細胞的染色體中。

嵌合多肽受體可以包括T細胞受體融合蛋白（TFP）。術語“T細胞受體融合蛋白”或“TFP”通常是指重組多肽構建體，其包括（i）一個或多個抗原結合部分（例如，單特異性或多特異性），（ii）TCR細胞外結構域的至少一部分，（iii）TCR跨膜結構域的至少一部分，和（iv）TCR胞內結構域的至少一部分。

在一些情況下，本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）的內源性T細胞受體（TCR）可被滅活。在一些實例中，工程化免疫細胞的內源性TCR的功能可被抑制劑抑制。在一些實例中，編碼內源性TCR亞基的基因可被失活（例如，通過本文公開的基因編輯部分的作用進行編輯），從而使內源性TCR失活。編碼內源性TCR亞基的基因可以是以下一種或多種：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。

嵌合多肽受體可以包括嵌合抗原受體（CAR）。術語“嵌合抗原受體”或“CAR”通常是指重組多肽構建體，其至少包括細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞質信號轉導結構域（在本文中也稱為“細胞內或內在信號轉導結構域”），其包括源自刺激分子的功能性信號轉導結構域。在一些情況下，刺激分子可以是與T細胞受體複合物相關的ζ鏈。在一些情況下，細胞內信號轉導結構域還包括來源於至少一種共刺激分子的一個或多個功能性信號轉導結構域。在一些情況下，共刺激分子可包括4-1BB（即CD137）、CD27和/或CD28。在一個方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基末端（N端）包括任選的前導序列。在一個方面，CAR還在細胞外抗原識別結構域的N端包括前導序列，其中前導序列任選地在CAR的細胞加工和定位至細胞膜期間從抗原識別結構域（例如scFv）切割。

CAR可以是第一代、第二代、第三代或第四代CAR系統，其功能變體或其任何組合。第一代CAR（例如，CD19R或CD19CAR）包括對特定抗原具有特異性的抗原結合結構域（例如，抗體或其抗原結合片段、諸如scFv、Fab片段，VHH結構域，或僅重鏈抗體的VH結構域），來源於適應性免疫受體的跨膜結構域（例如，來自CD28受體的跨膜結構域），和來源於適應性免疫受體的信號轉導結構域（例如，一個或多個（例如，3個）來源於CD3ζ受體或FcεRIγ的胞內區的ITAM結構域。）。第二代CAR通過向CAR的細胞內信號轉導結構域部分添加共刺激結構域（例如，來源於與T細胞受體如CD28、CD137/4-1BB和CD134/OX40一起作用的共刺激受體）來修飾第一代CAR，這消除了與第一代CAR一起施用輔因數（例如，IL-2）的需要。第三代CAR向CAR的細胞內信號轉導結構域部分添加多個共刺激結構域（例如，CD3ζ-CD28-OX40或CD3ζ-CD28-41BB）。第四代CAR通過將活化細胞因數（例如IL-12、IL-23或IL-27）添加到CAR的細胞內信號轉導部分（例如在一個或多個共刺激結構域和CD3ζ ITAM結構域之間）或在CAR誘導的啟動子（例如NFAT/IL-2最小啟動子）的控制下修飾第二代或第三代CAR。在一些情況下，CAR可以是不同于本文公開的第一代，第二代，第三代或第四代CAR系統的新一代CAR系統。

本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的CAR的鉸鏈結構域（例如，細胞外抗原結合結構域和跨膜結構域之間的接頭）可以包括CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T細胞受體多肽的天然或修飾的跨膜區的全長或至少一部分。

本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的CAR的跨膜結構域可以包括CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T細胞受體多肽的天然或修飾的跨膜區的全長或至少一部分。

本文公開的CAR的鉸鏈結構域和跨膜結構域（例如，對於工程化免疫細胞，如工程化NK細胞）可以來源於相同的蛋白（例如，CD8）。備選地，本文公開的CAR的鉸鏈結構域和跨膜結構域可以來源於不同的蛋白。

CAR的信號轉導結構域可以包括至少或至多約1個信號轉導結構域、至少或至多約2個信號轉導結構域、至少或至多約3個信號轉導結構域、至少或至多約4個信號轉導結構域、至少或至多約5個信號轉導結構域、至少或至多約6個信號轉導結構域、至少或至多約7個信號轉導結構域、至少或至多約8個信號轉導結構域。至少或多達約9個信號轉導結構域、或至少或多達約10個信號轉導結構域。

本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的CAR的信號轉導結構域（例如細胞內信號轉導結構域的信號轉導肽）可以包括CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137（41BB）、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或其任何組合的多肽的全長或至少一部分。

備選地或除了（即共刺激結構域）之外，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的信號轉導結構域CAR可以包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或其任何組合的多肽的全長或至少一部分。

在一些情況下，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）包括嵌合多肽受體（例如CAR），其至少包括CD8跨膜結構域和以下的一種或多種：（i）2B4信號轉導結構域和（ii）DAP10信號轉導結構域。在一些情況下，本文公開的工程化細胞（例如，工程化NK細胞）包括嵌合多肽受體（例如TFP或CAR），嵌合多肽受體包括至少（i）CD8跨膜結構域，（ii）2B4信號轉導結構域和（iii）DAP10信號轉導結構域。2B4信號轉導結構域可以側接CD8跨膜結構域和DAP10信號轉導結構域。備選地，DAP10信號轉導結構域可以側接CD8跨膜結構域和2B4信號轉導結構域。在一些情況下，本文公開的嵌合多肽受體還可以包括來源於CD3ζ的另外的信號轉導結構域。

本文公開的嵌合多肽受體（例如，TFP或CAR）的抗原結合部分的抗原（即，靶抗原）可以是細胞表面標誌物、分泌性標誌物或細胞內標誌物。

本文公開的嵌合多肽受體（例如，TFP或CAR）的抗原結合部分的抗原（即，靶抗原）的非限制性實例可以包括ADGRE2、碳酸酐酶IX（CA1X）、CCRI、CCR4、癌胚抗原（CEA）、CD3ζ、CD5、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD133、CD138、CD269（BCMA）、CD S、CLEC12A、巨細胞病毒（CMV）感染的細胞的抗原（例如，細胞表面抗原）、上皮糖蛋白2（EGP 2）、上皮糖蛋白40（EGP-40）、上皮細胞黏附分子（EpCAM）、EGFRvIII、受體酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合蛋白（FBP）、胎兒乙醯膽鹼受體（AChR）、葉酸受體-a、神經節苷脂G2（GD2）、神經節苷脂G3（GD3）、gp100、人表皮生長因數受體2（HER-2）、人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）、ICAM-1、整合素B7、白介素-13受體亞基α2（IL-13Rα2）、κ-輕鏈、激酶插入結構域受體（KDR）、κ、Lewis A（CA19.9）、Lewis Y（LeY）、L1細胞黏附分子（L1-CAM）、LILRB2、MART-1、黑色素瘤抗原家族A1（MAGE-A1）、MICA/B、黏蛋白1（Muc-1）、黏蛋白16（Muc-16）、間皮素（MSLN）、NKCSI、NKG2D配體、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、NY-ESO-2、癌胚抗原（h5T4）、PRAIVIE、前列腺幹細胞抗原（PSCA）、PRAME前列腺特異性膜抗原（PSMA）、ROR1、腫瘤相關糖蛋白72（TAG-72）、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管內皮生長因數R2（VEGF-R2）、Wilms腫瘤蛋白（WT-1）和各種病原體抗原（例如源自能夠引起疾病的病毒、細菌、真菌、寄生蟲和原生動物的病原體抗原）。在一些實例中，病原體抗原來源於HIV、HBV、EBV、HPV、拉沙病毒（Lasse Virus）、流感病毒或冠狀病毒。

本文公開的嵌合多肽受體的抗原結合部分的抗原的另外的實例可以包括1-40-β-澱粉樣蛋白、4-1BB、5AC、5T4、活化素受體樣激酶1、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、甲胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、炭疽毒素、AOC3（VAP-1）、B7-H3、炭疽芽孢桿菌炭疽、BAFF、β-澱粉樣蛋白、B-淋巴瘤細胞、C242抗原、C5、CA-125、狗IL31（Canis lupus familiaris IL31）、碳酸酐酶9（CA-IX）、心臟肌球蛋白、CCL11（嗜酸細胞活化趨化因數-1）、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147（基礎免疫球蛋白）、CD15、CD152、CD154（CD40L）、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD25（IL-2受體α鏈）、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3 ε、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配體、CD41、CD44 v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA相關抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艱難梭菌、凝集因數A、CSF1R、CSF2、CTLA-4、C-X-C趨化因數受體4型、巨細胞病毒、巨細胞病毒糖蛋白B、達比加群酯、DLL4、DPP4、DR5、大腸桿菌志賀毒素1型、大腸桿菌志賀毒素2型、EGFL7、EGFR、內毒素、EpCAM、上皮唾蛋白（episialin）、ERBB3、大腸桿菌、呼吸道合胞病毒的F蛋白、FAP、纖維蛋白II β鏈、纖連蛋白額外結構域-B、葉酸水解酶、葉酸受體1、葉酸受體α、捲曲受體（Frizzled receptor）、神經節苷脂GD2、GD2、GD3神經節苷脂、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GMCSF受體α-鏈、GPNMB、生長分化因數8、GUCY2C、血凝素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、組蛋白複合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、人散射因數受體激酶、人TNF、人β-澱粉樣蛋白、ICAM-1（CD54）、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc區、IGF-1受體、IGF-1、IGHE、IL17A、IL17F、IL20、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-23、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受體、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、甲型流感病毒血凝素、胰島素樣生長因數I受體、整合素α4β7、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整合素αIIbβ3、整合素αvβ3、干擾素α/β受體、干擾素γ誘導蛋白、ITGA2、ITGB2（CD18）、KIR2D、Lewis-Y抗原、LFA-1（CD11a）、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-選擇素（CD62L）、LTA、MCP-1、間皮素、MIF、MS4A1、MSLN、MUC1、黏蛋白CanAg、髓鞘相關糖蛋白、肌肉生長抑制素、NCA-90（粒細胞抗原）、神經凋亡調節蛋白酶1、NGF、N-羥乙醯神經氨酸、NOGO-A、Notch受體、NRP1、穴兔、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸鹽-鈉協同轉運蛋白、磷脂醯絲氨酸、血小板源性生長因數受體β、前列腺癌細胞、銅綠假單胞菌、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、恒河猴因數、RON、RTN4、硬骨素、SDC1、選擇素P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸、金黃色葡萄球菌、STEAP1、TAG-72、T細胞受體、TEM1、腱生蛋白C、TFPI、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、MUC1的腫瘤特異性糖基化、腫瘤相關鈣信號轉導蛋白基因2、TWEAK受體、TYRP1（糖蛋白75）、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白和VWF。

本文公開的嵌合多肽受體的抗原結合部分的抗原的其他實例可包括707-AP、生物素化分子、a-輔肌動蛋白-4、abl-bcr alb-b3（b2a2）、abl-bcr alb-b4（b3a2）、脂肪分化相關蛋白、AFP、AIM-2、膜聯蛋白II、ART-4、BAGE、b-連環蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190（e1a2）、bcr-abl p210（b2a2）、bcr-abl p210（b3a2）、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8（Caspase-8）、CD171、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2（FGF6）、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-細胞黏附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、蘋果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、間皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白（Myosin）、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原（h5T4）、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、生存素、生存素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-葉酸受體和κ-輕鏈。

本文公開的嵌合多肽受體的抗原結合部分的抗原的其他實例可包括抗體、其片段或其變體。此類抗體可以是天然抗體（例如，由物件的免疫細胞如B細胞天然分泌），合成抗體或修飾的抗體。在一些情況下，如本文所公開的嵌合多肽受體的抗原結合部分的抗原可包括選自包括以下的抗體的Fc結構域：20-(74)-(74)（米拉組單抗（milatuzumab）；維妥組單抗（veltuzumab））、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)（米拉組單抗；維妥組單抗）、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏單抗、阿昔單抗（abciximab）、阿比妥珠單抗（abituzumab）、林妥珠單抗（zlintuzumab）、阿克托舒單抗（actoxumab）、阿達木單抗（adalimumab）、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿德木單抗（adecatumumab）、阿杜那單抗（aducanumab）、阿非莫單抗（afelimomab）、AFM13、阿托珠單抗（afutuzumab）、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、培戈-阿拉賽珠單抗（alacizumab pegol）、ALD518、阿侖單抗（alemtuzumab）、阿莫羅布單抗（alirocumab）、噴替酸阿妥莫單抗（altumomab pentetate）、阿麥妥單抗（amatuximab）、AMG 228、AMG 820、馬安那莫單抗（anatumomab mafenatox）、雷星-阿奈妥單抗（anetumab ravtansine）、阿尼魯單抗（anifrolumab）、安蘆組單抗（anrukinzumab）、APN301、APN311、阿泊珠單抗（apolizumab）、APX003/SIM-BD0801（sevacizumab）、APX005M、阿西莫單抗（arcitumomab）、ARX788、阿伐蘇單抗（ascrinvacumab）、阿塞珠單抗（aselizumab）、ASG-15ME、阿替利珠單抗（atezolizumab）、阿替奴單抗（atinumab）、ATL101、他利珠單抗（atlizumab）（也稱為托西珠單抗（tocilizumab））、阿托木單抗（atorolimumab）、阿維單抗（Avelumab）、B-701、巴匹珠單抗（bapineuzumab）、巴厘昔單抗（basiliximab）、巴維妥昔單抗（bavituximab）、BAY1129980、BAY1187982、貝妥莫單抗（bectumomab）、貝戈洛單抗（begelomab）、貝利尤單抗（belimumab）、貝那珠單抗（benralizumab）、柏替木單抗（bertilimumab）、貝索單抗（besilesomab）、Betalutin（177Lu-tetraxetan-tetulomab）、貝伐單抗（bevacizumab）、BEVZ92（貝伐單抗生物仿製藥（bevacizumab biosimilar））、貝洛托舒單抗（bezlotoxumab）、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西單抗（biciromab）、比瑪盧單抗（bimagrumab）、比美吉珠單抗（bimekizumab）、bivatuzumab mertansine、BIW-8962、博納吐單抗（blinatumomab）、布索組單抗（blosozumab）、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、伯考賽珠單抗（bococizumab）、維布妥昔單抗（brentuximab vedotin）、BrevaRex、布裡亞明單抗（briakinumab）、溴達拉單抗（brodalumab）、溴化丙單抗（brolucizumab）、支舒巴單抗（brontictuzumab）、C2-2b-2b、康納單抗（canakinumab）、莫坎妥珠單抗（cantuzumab mertansine）、雷坎妥珠單抗（cantuzumab ravtansine）、卡拉西單抗（caplacizumab）、卡羅單抗噴地肽（capromab pendetide）、卡蘆單抗（carlumab）、卡妥索單抗（catumaxomab）、CBR96-多柔比星免疫偶聯物、CBT124（貝伐單抗（bevacizumab））、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠單抗（cedelizumab）、培塞利珠單抗（certolizumab pegol）、西妥昔單抗（cetuximab）、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、泊西他組單抗（citatuzumab bogatox）、西妥木單抗（cixutumumab）、克拉紮珠單抗（clazakizumab）、克立昔單抗（clenoliximab）、泰坦-克利妥珠單抗（clivatuzumab tetraxetan）、CM-24、考曲妥單抗（codrituzumab）、雷星-考妥昔單抗（coltuximab ravtansine）、可那木單抗（conatumumab）、康賽珠單抗（concizumab）、（Cotara（碘 I-131美妥昔單抗（iodine I-131 derlotuximab biotin））、cR6261、克瑞組單抗（crenezumab）、（DA-3111（曲妥單抗生物仿製藥）、達西組單抗（dacetuzumab）、達利珠單抗（daclizumab）、達羅托組單抗（dalotuzumab）、培戈-達匹利珠單抗（dapirolizumab pegol）、達雷木單抗（daratumumab）、Daratumumab Enhanze（達雷妥尤單抗（daratumumab））、Darleukin、德屈庫單抗（dectrekumab）、登賽珠單抗（demcizumab）、瑪汀-地甯妥珠單抗（denintuzumab mafodotin）、地諾單抗（denosumab）、迪妥昔珠單抗（Depatuxizumab）、瑪汀-迪妥昔珠單抗（Depatuxizumab mafodotin）、美妥昔單抗（derlotuximab biotin）、地莫單抗（detumomab）、DI-B4、地努妥昔單抗（dinutuximab）、地利伏單抗（diridavumab）、DKN-01、DMOT4039A、阿托度單抗（dorlimomab aritox）、曲齊妥單抗（drozitumab）、DS-1123、DS-8895、度利戈妥單抗（duligotumab）、（dupilumab）、度伐魯單抗（durvalumab）、杜斯吉妥單抗（dusigitumab）、依美昔單抗（ecromeximab）、艾庫組單抗（eculizumab）、埃巴單抗（edobacomab）、依決洛單抗（edrecolomab）、依法珠單抗（efalizumab）、依芬古單抗（efungumab）、埃迪魯單抗（eldelumab）、依更妥單抗（elgemtumab）、埃羅妥珠單抗（elotuzumab）、艾西莫單抗（elsilimomab）、依米妥珠單抗（emactuzumab）、依瑪妥珠單抗（emibetuzumab）、依那妥組單抗（enavatuzumab）、維汀-恩弗妥單抗（enfortumab vedotin）、培戈賴莫單抗（enlimomab pegol）、依諾妥珠單抗（enoblituzumab）、依諾凱組單抗（enokizumab）、依諾蘇單抗（enoticumab）、恩妥昔單抗（ensituximab）、西依匹莫單抗（epitumomab cituxetan）、依帕珠單抗（epratuzumab）、厄利珠單抗（erlizumab）、厄妥索單抗（ertumaxomab）、艾達組單抗（etaracizumab）、etrolizumab、依維蘇單抗（evinacumab）、依洛尤單抗（evolocumab）、艾韋單抗（exbivirumab）、fanolesomab、法拉莫單抗（faralimomab）、法妥組單抗（farletuzumab）、法司努單抗（fasinumab）、FBTA05、泛維珠單抗（felvizumab）、非紮奴單抗（fezakinumab）、FF-21101、FGFR2抗體藥物偶聯物、Fibromun、非拉妥組單抗（ficlatuzumab）、芬妥木單抗（figitumumab）、非利伏單抗（firivumab）、法蘭妥單抗（flanvotumab）、夫來庫單抗（fletikumab）、芳妥珠單抗（fontolizumab）、福雷蘆單抗（foralumab）、福拉韋單抗（foravirumab）、FPA144、非蘇木單抗（fresolimumab）、FS102、福拉奴單抗（fulranumab）、伏妥昔單抗（futuximab）、加利昔單抗（galiximab）、加尼妥單抗（ganitumab）、gantenerumab、加維莫單抗（gavilimomab）、吉妥珠單抗奧加米星（gemtuzumab ozogamicin）、Gerilimzumab、吉伏組單抗（gevokizumab）、吉妥昔單抗（girentuximab）、維汀-格侖妥木單抗（glembatumumab vedotin）、GNR-006、GNR-011、戈利木單抗（golimumab）、gomiliximab、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞庫單抗（guselkumab）、Hu14.18K322A MAb、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴珠單抗（ibalizumab）、替伊莫單抗（ibritumomab tiuxetan）、艾蘆庫單抗（icrucumab）、艾達賽珠單抗（idarucizumab）、IGN002、IGN523、伊戈伏單抗（igovomab）、IMAB362、IMAB362（claudiximab）、伊瑪魯單抗（imalumab）、IMC-CS4、IMC-D11、英西單抗（imciromab）、伊馬曲單抗（imgatuzumab）、IMGN529、IMMU-102（釔Y-90替坦司依帕珠單抗（yttrium Y-90 epratuzumab tetraxetan））、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗劑抗體、INCAGN1876、inclacumab、INCSHR1210、雷英妥昔單抗（indatuximab ravtansine）、維汀-英度妥單抗（indusatumab vedotin）、英夫利昔單抗（infliximab）、伊諾莫單抗（inolimomab）、奧英妥珠單抗（inotuzumab ozogamicin）、英妥木單抗（intetumumab）、Ipafricept、IPH4102、伊匹單抗（ipilimumab）、伊妥木單抗（iratumumab）、isatuximab、艾司妥單抗（Istiratumab）、伊利組單抗（itolizumab）、ixekizumab、JNJ-56022473、JNJ-61610588、凱利昔單抗（keliximab）、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉貝珠單抗（Labetuzumab）、戈維替康-拉貝妥珠單抗（Labetuzumab Govitecan）、LAG525、蘭洛利珠單抗（lambrolizumab）、蘭帕利珠單抗（lampalizumab）、L-DOS47、來瑞組單抗（lebrikizumab）、來馬索單抗（lemalesomab）、侖茲魯單抗（lenzilumab）、樂德木單抗（lerdelimumab）、Leukotuximab、來沙木單抗（lexatumumab）、利韋單抗（libivirumab）、維汀-利法妥珠單抗（lifastuzumab vedotin）、利戈組單抗（ligelizumab）、lilotomab satetraxetan、林妥珠單抗（lintuzumab）、利瑞魯單抗（lirilumab）、LKZ145、洛迪賽珠單抗（lodelcizumab）、洛吉維單抗（lokivetmab）、莫星-洛沃妥珠單抗（lorvotuzumab mertansine）、盧卡木單抗（lucatumumab）、培戈-魯利珠單抗（lulizumab pegol）、魯昔單抗（lumiliximab）、魯妥珠單抗（lumretuzumab）、LY3164530、馬帕木單抗（mapatumumab）、馬吉妥昔單抗（margetuximab）、馬司莫單抗（maslimomab）、馬妥珠單抗（matuzumab）、瑪弗利木單抗（mavrilimumab）、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551（inebilizumab）、MEDI-565、MEDI6469、美泊利單抗（mepolizumab）、美替木單抗（metelimumab）、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉組單抗（milatuzumab）、米拉組單抗-SN-38、明瑞莫單抗（minretumomab）、索星-米妥昔單抗（mirvetuximab soravtansine）、米妥莫單抗（mitumomab）、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫格利珠單抗（mogamulizumab）、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫羅木單抗（morolimumab）、莫維組單抗（motavizumab）、moxetumomab pasudotox、莫羅莫那-CD3（muromonab-CD3）、他那可單抗（nacolomab tafenatox）、那美蘆單抗（namilumab）、埃托-那普妥莫單抗（naptumomab estafenatox）、那呐妥單抗（narnatumab）、那他珠單抗（natalizumab）、奈巴庫單抗（nebacumab）、耐昔妥珠單抗（necitumumab）、奈莫利珠單抗（nemolizumab）、奈瑞莫單抗（nerelimomab）、奈伐蘇單抗（nesvacumab）、尼妥珠單抗（nimotuzumab）、納武單抗（nivolumab）、諾非妥莫單抗（nofetumomab merpentan）、NOV-10、奧托薩昔單抗（obiltoxaximab）、奧濱尤妥珠單抗（obinutuzumab）、奧卡妥珠單抗（ocaratuzumab）、奧瑞組單抗（ocrelizumab）、奧度莫單抗（odulimomab）、奧法木單抗（ofatumumab）、奧拉單抗（olaratumab）、奧洛珠單抗（olokizumab）、奧馬珠單抗（omalizumab）、OMP-131R10、OMP-305B83、奧那妥組單抗（onartuzumab）、昂妥昔珠單抗（ontuxizumab）、奧匹努單抗（opicinumab）、莫妥組單抗（oportuzumab monatox）、奧戈伏單抗（oregovomab）、奧替蘇單抗（orticumab）、奧昔組單抗（otelixizumab）、奧樂妥珠單抗（otlertuzumab）、OX002/MEN1309、奧塞蘆單抗（oxelumab）、奧紮奈珠單抗（ozanezumab）、奧利組單抗（ozoralizumab）、帕昔單抗（pagibaximab）、帕利珠單抗（palivizumab）、帕尼單抗（panitumumab）、pankomab、PankoMab-GEX、帕巴庫單抗（panobacumab）、帕薩妥珠單抗（parsatuzumab）、帕考珠單抗（pascolizumab）、帕妥昔珠單抗（pasotuxizumab）、帕替組單抗（pateclizumab）、帕曲妥單抗（patritumab）、PAT-SC1、PAT-SM6、帕博利珠單抗（pembrolizumab）、佩圖莫單抗（pemtumomab）、培拉凱珠單抗（perakizumab）、帕妥珠單抗（pertuzumab）、培克珠單抗（pexelizumab）、PF-05082566 烏托魯單抗（utomilumab）、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹地利珠單抗（pidilizumab）、維汀-匹那妥珠單抗（pinatuzumab vedotin）、平妥莫單抗（pintumomab）、普拉魯單抗（placulumab）、泊洛妥珠單抗（polatuzumab vedotin）、泊奈組單抗（ponezumab）、普立昔單抗（priliximab）、瑞托薩昔單抗（pritoxaximab）、普林木單抗（pritumumab）、PRO 140、Proxinium、PSMA ADC、奎利珠單抗（quilizumab）、雷妥莫單抗（racotumomab）、雷曲妥單抗（radretumab）、雷韋單抗（rafivirumab）、雷泮賽珠單抗（ralpancizumab）、雷莫蘆單抗（ramucirumab）、雷尼珠單抗（ranibizumab）、雷昔庫單抗（raxibacumab）、瑞法奈珠單抗（refanezumab）、瑞加韋單抗（regavirumab）、REGN1400、REGN2810/SAR439684、瑞利珠單抗（reslizumab）、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥木單抗（rilotumumab）、利努蘇單抗（rinucumab）、利妥昔單抗（rituximab）、RM-1929、RO7009789、羅妥木單抗（robatumumab）、羅來度單抗（roledumab）、羅莫單抗（romosozumab）、隆利組單抗（rontalizumab）、羅維珠單抗（rovelizumab）、盧利珠單抗（ruplizumab）、戈沙妥珠單抗（sacituzumab govitecan）、沙馬組單抗（samalizumab）、SAR408701、SAR566658、sarilumab、SAT 012、沙妥莫單抗噴地肽（satumomab pendetide）、SCT200、SCT400、SEA-CD40、蘇金單抗（secukinumab）、瑟瑞妥單抗（seribantumab）、瑟托薩昔單抗（setoxaximab）、司韋單抗（sevirumab）、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西羅珠單抗（sibrotuzumab）、西法木單抗（sifalimumab）、司妥昔單抗（siltuximab）、辛妥珠單抗（simtuzumab）、西利珠單抗（siplizumab）、西魯庫單抗（sirukumab）、維汀-索非妥珠單抗（sofituzumab vedotin）、solanezumab、索利托單抗（solitomab）、（sonepcizumab）、松妥組單抗（sontuzumab）、司他蘆單抗（stamulumab）、硫索單抗（sulesomab）、舒維組單抗（suvizumab）、SYD985、SYM004（（伏妥昔單抗（futuximab）和紮妥昔單抗（modotuximab））、Sym015、TAB08、他貝蘆單抗（tabalumab）、替組單抗（tacatuzumab tetraxetan）、他度組單抗（tadocizumab）、他利珠單抗（talizumab）、tanezumab、Tanibirumab、帕他莫單抗（taplitumomab paptox）、他瑞妥單抗（tarextumab）、TB-403、替非組單抗（tefibazumab）、Teleukin、阿替莫單抗（telimomab aritox）、替妥莫單抗（tenatumomab）、替奈昔單抗（teneliximab）、teplizumab、替妥木單抗（teprotumumab）、特度魯單抗（tesidolumab）、tetulomab、TG-1303、TGN1412、釷-227-依帕珠單抗偶聯物、ticilimumab、替加組單抗（tigatuzumab）、替拉珠單抗（tildrakizumab）、Tisotumab vedotin、TNX-650、托珠單抗（tocilizumab）、toralizumab、托薩托舒單抗（tosatoxumab）、托西莫單抗（tositumomab）、托維妥單抗（tovetumab）、曲羅蘆單抗（tralokinumab）、曲妥單抗（trastuzumab）、恩美曲妥單抗（trastuzumab emtansine）、TRBS07、TRC105、曲利組單抗（tregalizumab）、曲美木單抗（tremelimumab）、曲戈盧單抗（trevogrumab）、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、西莫白介素單抗（tucotuzumab celmoleukin）、妥韋單抗（tuvirumab）、U3-1565、U3-1784、烏利妥昔單抗（ublituximab）、烏洛魯單抗（ulocuplumab）、烏瑞蘆單抗（urelumab）、烏珠單抗（urtoxazumab）、烏司奴單抗（ustekinumab）、他立林-伐達妥昔單抗（Vadastuximab Talirine）、維汀-萬多妥珠單抗（vandortuzumab vedotin）、萬替妥單抗（vantictumab）、伐努賽珠單抗（vanucizumab）、伐利昔單抗（vapaliximab）、伐立魯單抗（varlilumab）、伐利組單抗（vatelizumab）、VB6-845、維得利珠單抗（vedolizumab）、維妥組單抗（veltuzumab）、維帕莫單抗（vepalimomab）、維森庫單抗（vesencumab）、維西珠單抗（visilizumab）、伏洛昔單抗（volociximab）、瑪汀-沃瑟妥珠單抗（vorsetuzumab mafodotin）、伏妥莫單抗（votumumab）、YYB-101、紮蘆木單抗（zalutumumab）、紮木單抗（zanolimumab）、紮妥昔單抗（zatuximab）、ziralimumab和阿佐莫單抗（zolimomab aritox）。

在一些實施方案中，異源銜接子可表現出與CD20的特異性結合。異源銜接子可包括輕鏈或其衍生物，例如全長輕鏈、輕鏈的片段、輕鏈的CDR或其修飾。異源銜接子可包括重鏈或其衍生物，例如全長輕鏈、輕鏈片段、輕鏈CDR或其修飾。

在一些情況下，異源銜接子的輕鏈可包括與SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.9的多肽序列至少或至多約50%、至少或至多約55%、至少或至多約60%、至少或至多約62%、至少或至多約64%、至少或至多約65%、至少或至多約66%、至少或至多約68%、至少或至多約70%、至少或至多約72%、至少或至多約74%、至少或至多約75%、至少或至多約76%、至少或至多約78%、至少或至多約80%、至少或至多約82%、至少或至多約84%、至少或至多約85%、至少或至多約86%、至少或至多約88%、至少或至多約90%、至少或至多約91%、至少或至多約92%、至少或至多約93%、至少或至多約94%、至少或至多約95%、至少或至多約96%、至少或至多約97%、至少或至多約98%、至少或至多約99%、或100%相同的氨基酸序列。

在一些情況下，異源銜接子的重鏈可包括與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10的多肽序列至少或至多約50%、至少或至多約55%、至少或至多約60%、至少或至多約62%、至少或至多約64%、至少或至多約65%、至少或至多約66%、至少或至多約68%、至少或至多約70%、至少或至多約72%、至少或至多約74%、至少或至多約75%、至少或至多約76%、至少或至多約78%、至少或至多約80%、至少或至多約82%、至少或至多約84%、至少或至多約85%、至少或至多約86%、至少或至多約88%、至少或至多約90%、至少或至多約91%、至少或至多約92%、至少或至多約93%、至少或至多約94%、至少或至多約95%、至少或至多約96%、至少或至多約97%、至少或至多約98%、至少或至多約99%、或100%相同的氨基酸序列。

在一些情況下，如本文所公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括嵌合多肽受體（例如，TFP或CAR），嵌合多肽受體包括抗原結合結構域，並且抗原結合結構域能夠特異性地且優先地結合包括一個或多個成員的抗原，所述成員選自BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、κ、Lewis Y、NKG2D配體、ROR1、NY-ESO-1、NY-ESO-2、MART-1和gp100。NKG2D配體的非限制性實例包括選自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6的一個或多個成員。

在一些情況下，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以包括嵌合多肽受體（例如，TFP或CAR），其包括能夠特異性結合靶細胞抗原的抗原結合結構域，並且工程化免疫細胞可以表現出編碼嵌合多肽受體的相同抗原的內源性基因的降低的表達或活性。因此，工程化免疫細胞群可避免彼此靶向和殺傷，例如，在施用於有需要的物件時。

在一些情況下，如本文所公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括嵌合多肽受體（例如，TFP或CAR），其包括抗原結合結構域，並且抗原結合結構域能夠特異性地且優先地結合CD38。在一些情況下，可以修飾工程化免疫細胞的編碼CD38的內源性基因以實現內源CD38的降低的表達或活性。在一些情況下，包括針對CD38的嵌合多肽受體的物件工程化免疫細胞能夠靶向並影響漿細胞的死亡（或降解）。

在一些情況下，如本文所公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可包括嵌合多肽受體（例如，TFP或CAR），其包括抗原結合結構域，並且抗原結合結構域能夠特異性地且優先地結合CD38。在一些實例中，工程化免疫細胞是源自分離的ESC或誘導的幹細胞（例如，iPSC）的工程化NK細胞。在一些情況下，可以修飾工程化免疫細胞的編碼CD38的內源性基因以實現內源CD38的降低的表達或活性。

E. 幹細胞

本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種可以源自分離的幹細胞（例如，ESC）或誘導的幹細胞（iPSC）。分離的幹細胞或誘導的幹細胞可被修飾（例如，基因修飾）以產生工程化免疫細胞。

在一些情況下，幹細胞（例如，ESC或iPSC）的多能性可以部分地通過評估細胞的多能特徵來確定。多能特徵可以包括，但不限於：（i）多能幹細胞形態學；（ii）無限自我更新的潛能；（iii）多能幹細胞標誌物的表達，標誌物包括但不限於SSEA1（僅小鼠）、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；（iv）對所有三種體細胞譜系（外胚層、中胚層和內胚層）的分化能力；（v）由三種體細胞譜系組成的畸胎瘤形成；和（vi）形成由來自三種體細胞譜系的細胞組成的胚狀體。

在一些情況下，幹細胞（例如，ESC或iPSC）可經基因修飾以產生（例如，誘導分化成）CD34＋造血幹細胞。在誘導造血幹細胞分化之前，之後或過程中，可以基因修飾幹細胞以表達本文公開的任何一種異源多肽（例如，細胞因數、受體等）。在誘導造血幹細胞分化之前，之後或期間，可基因修飾幹細胞以降低如本文所公開的任何一種內源性基因或多肽（例如，細胞因數、受體等）的表達或活性。在一些情況下，此類經基因修飾的CD34＋造血幹細胞是本公開的工程化免疫細胞中的任一種或為其來源。

在一些實例中，如本文所公開的幹細胞可在具有ROCKi（Y-27632）（例如，以約10微摩爾（μM））、SCF（例如，以約40納克/毫升（ng/mL）培養基）、VEGF（例如，以約20 ng/mL培養基）和BMP-4（例如，以約20 ng/mL培養基）的APEL培養基中培養以分化成CD34＋造血幹細胞。

在一些情況下，可以誘導CD34＋造血幹細胞（例如，用本公開的工程化免疫細胞中的任一種的一個或多個特徵基因修飾的）分化成定向免疫細胞，如T細胞或NK細胞。因此，在一些情況下，誘導的分化過程產生本公開的工程化NK細胞中的任一種。

在一些實例中，將經基因修飾的CD34＋造血幹細胞在IL-3（例如，約5 ng/mL）、IL-7（例如，約20 ng/mL）、IL-15（例如，約10 ng/mL）、SCF（例如，約20 ng/mL）和Flt3L（例如，約10 ng/mL）存在下培養以分化成CD45＋NK細胞。

在一些情況下，CD45＋NK細胞可以在培養物中擴增，例如在包括IL-2、mbIL-21 aAPC的培養基中，使用透氣快速擴增（Gas Permeable Rapid Expansion，G-Rex）平臺。

在一些情況下，如本文公開的來源於iPSC的NK細胞可以與一種或多種包括Il-2、IL-15或IL-21的異源細胞因數一起培養。在一些情況下，如本文公開的來源於iPSC的NK細胞可以與一種或多種選自Il-2、IL-15和IL-21的異源細胞因數一起培養（例如，用於細胞擴增）。在一些情況下，如本文所公開的來源於iPSC的NK細胞可以與兩種或更多種選自Il-2、IL-15和IL-21（例如，IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、或IL-15和IL-21）的異源細胞因數同時或以任何順序依次培養。在一些情況下，如本文所公開的來源於iPSC的NK細胞可與Il-2、IL-15和IL-21全部同時或以任何順序依次培養。

F. 基因編輯或遺傳物質遞送

本文公開的基因編輯部分可包括CRISPR相關多肽（Cas）、鋅指核酸酶（ZFN）、鋅指相關基因調節多肽、轉錄啟動物樣效應物核酸酶（TALEN）、轉錄啟動物樣效應物相關基因調節多肽、大範圍核酸酶、天然主轉錄因數、表觀基因修飾酶、重組酶、翻轉酶、轉座酶、RNA結合蛋白（RBP）、Argonaute蛋白、其任何衍生物，其任何變體或其任何片段。在一些實施方案中，致動器部分包括Cas蛋白，並且系統還包括與Cas蛋白複合的嚮導RNA（gRNA）。在一些實施方案中，致動器部分包括與gRNA複合的RBP，gRNA能夠與Cas蛋白形成複合物。在一些實施方案中，gRNA包括與靶多核苷酸表現出至少80%序列同一性的靶區段。在一些實施方案中，Cas蛋白基本上缺少DNA切割活性。

在一些情況下，合適的基因編輯部分包括CRISPR相關（Cas）蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相關（Cas）多肽、II型CRISPR相關（Cas）多肽、III型CRISPR相關（Cas）多肽、IV型CRISPR相關（Cas）多肽、V型CRISPR相關（Cas）多肽和VI型CRISPR相關（Cas）多肽；鋅指核酸酶（ZFN）；轉錄啟動物樣效應物核酸酶（TALEN）；大範圍核酸酶；RNA結合蛋白（RBP）；CRISPR相關RNA結合蛋白；重組酶；翻轉酶；轉座酶；Argonaute（Ago）蛋白（例如原核Argonaute（pAgo）、古菌Argonaute（aAgo）和真核Argonaute（eAgo））；其任何衍生物，其任何變體；及其任何片段。

Cas蛋白的非限制性實例包括c2c1、C2c2、c2c3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e（CasD）、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9（Csn1或Csx12）、Cas10、Cas10d、Cas1O、Cas1Od、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1（CasA）、Cse2（CasB）、Cse3（CasE）、Cse4（CasC）、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx1O、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966、及其同源物或修改版本。

在一些情況下，如本文所公開的基因編輯部分可以與另外的功能性部分融合（例如，以形成融合部分），並且另外的功能性部分的功能的非限制性實例可以包括甲基轉移酶活性、脫甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脫嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚體形成活性、整合酶活性、轉座酶活性、重組酶活性、聚合酶活性、連接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性、乙醯基轉移酶活性、脫乙醯酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素連接酶活性、脫泛素化活性、腺苷酸化活性、脫戊烯化活性、SUMO化修飾（SUMOylating）活性、去SUMO化修飾（deSUMOylating）活性、核糖基化活性、脫核糖基化活性、豆蔻醯化活性、重構活性、蛋白酶活性、氧化還原酶活性、轉移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、異構酶活性、合酶活性、合成酶活性和脫豆蔻醯化活性。例如，融合蛋白可以是Cas蛋白和效應物或阻遏物功能部分的融合體。

備選地或另外，可以實現異源遺傳物質的基因編輯（例如，敲入）或遞送可以使用其他基於病毒和非病毒的基因轉移方法將核酸引入宿主細胞（例如，如本文所公開的幹細胞，造血幹細胞等）中。此類方法可用於將編碼本公開的多肽分子的核酸施用于培養物中（或宿主生物體中）的細胞。病毒載體遞送系統可包括DNA和RNA病毒，其在遞送至細胞後可具有游離型或整合的基因組。非病毒載體遞送系統可包括DNA質粒、RNA（例如，本文的載體的轉錄物）、裸核酸和與遞送載體如脂質體複合的核酸。

基於RNA或DNA病毒的系統可用于靶向特定細胞並將病毒有效載荷轉移至細胞核。病毒載體可用於體外處理細胞，並且修飾的細胞可任選地施用（離體）。備選地，病毒載體可直接（體內）施用於物件。基於病毒的系統可包括用於基因轉移的逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒和單純皰疹病毒載體。用逆轉錄病毒、慢病毒和腺相關病毒基因轉移方法可發生在宿主基因組中的整合，這可導致插入的轉基因的長期表達。

核酸的非病毒遞送方法可包括脂質轉染、核轉染、顯微注射、基因槍法、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質：核酸偶聯物、裸DNA、人工病毒體和試劑增強的DNA攝取。可以使用適於多核苷酸的有效受體識別脂質轉染的陽離子和中性脂質。

備選地或另外，反義寡核苷酸可用於抑制或沉默靶基因表達。反義寡核苷酸的非限制性實例可包括短髮夾RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA）。

G. 協同治療

本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以與協同治療劑組合以治療有需要的物件。在一些情況下，可在施用於物件協同治療劑之前，同時或之後施用於物件工程化免疫細胞。

在一個方面，本公開提供了組合物，其包括（a）本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種和（b）協同治療劑（即單獨的治療劑）（例如，抗體，諸如抗CD20抗體或抗PD1抗體）。在一些情況下，工程化免疫細胞可包括以下的一種或多種：（i）本文公開的異源細胞因數（例如，異源IL，如IL-15），（ii）本文公開的用於增強CD16信號轉導的CD16變體，和（iii）本文公開的包括能夠結合抗原的抗原結合部分的嵌合多肽受體。在一些實例中，協同治療劑包括抗CD20抗體。

在一些情況下，工程化免疫細胞可包括本文公開的異源細胞因數（例如，IL-15）和以下中的一種或兩種：（ii）用於增強CD16信號轉導的CD16變體和（iii）包括抗原結合部分的嵌合多肽受體。

在一些情況下，工程化免疫細胞可以包括用於增強的CD16信號轉導的CD16變體和以下之一或二者：（i）異源細胞因數（例如IL-15）和（iii）包括抗原結合部分的嵌合多肽受體。

在一些情況下，工程化免疫細胞可包括嵌合多肽受體，嵌合多肽受體包括抗原結合部分和以下之一或兩者：（i）異源細胞因數（例如IL-15）和（ii）用於增強CD16信號轉導的CD16變體。

協同治療劑的非限制性實例可包括細胞毒性劑、化學治療劑、生長抑制劑、放射療法中使用的藥劑、抗血管生成劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑和治療癌症的其他藥劑，例如抗CD20抗體、抗PD1抗體（例如帕博利珠單抗）、血小板源性生長因數抑制劑（例如GLEEVEC™（甲磺酸伊馬替尼））、COX-2抑制劑（例如塞來昔布）、干擾素、細胞因數，結合以下靶標中的一種或多種的拮抗劑（例如中和抗體）：PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA受體、TRAIL/Apo2，其他生物活性和有機化學藥劑等。

術語“細胞毒性劑”通常是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。細胞毒性劑的非限制性實例可包括放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素）、化學治療劑、例如甲氨蝶呤、阿黴素、長春花生物鹼（長春新堿、長春堿、依託泊苷）、多柔比星、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、柔紅黴素或其他嵌入劑、酶及其片段如溶核酶、抗生素和毒素如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素。

化療劑的非限制性實例可包括烷化劑，諸如噻替派和CYTOXAN®環磷醯胺；烷基磺酸鹽，例如白消安、英丙舒凡和呱泊舒凡；氮丙啶類，如苯紮多巴、卡波醌、美妥替呱（meturedopa）和烏瑞替派（uredopa）；乙烯亞胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙烯磷醯胺、乙撐硫代磷醯胺（triethiylenethiophosphoramide）和三羥甲蜜胺（trimethylolomelamine）；乙酸衍生物（尤其是布拉他辛（bullatacin）和布拉他辛酮（bullatacinone））；δ-9-四氫大麻酚（屈大麻酚，MARINOL®）；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙堿；樺木酸；喜樹堿（包括合成類似物拓撲替康（HYCAMTIN®）、CPT-11（伊立替康、CAMPTOSAR®）、乙醯基喜樹堿、莨菪亭和9-氨基喜樹堿）；苔蘚抑素（bryostatin）；凱利他汀（callystatin）；CC-1065（包括其阿多來新（adozelesin）、卡折來新（carzelesin）和比折來新（bizelesin）合成類似物）；足葉草毒素（podophyllotoxin）；足葉草酸（podophyllinic acid）；替尼泊苷（teniposide）；念珠藻素（cryptophycin）（具體是念珠藻素1和念珠藻素8）；朵拉司他汀（dolastatin）；倍癌黴素（duocarmycin）（包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1）；軟珊瑚醇（eleutherobin）；潘卡他汀（pancratistatin）；匍枝珊瑚醇（sarcodictyin）；海綿抑制素（spongistatin）；氮芥類如苯丁酸氮芥，萘氮芥（chlomaphazine），氯磷醯胺（cholophosphamide）、雌氮芥（estramustine）、異環磷醯胺（ifosfamide）、二氯甲基二乙胺（mechlorethamine）、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖（melphalan）、新恩比興（novembichin）、苯芥膽甾醇（phenesterine）、潑尼莫司汀（prednimustine）、氯乙環磷醯胺（trofosfamide）、尿嘧啶氮芥（uracil mustard）；亞硝基脲，諸如卡莫司汀（carmustine）、吡葡亞硝脲（chlorozotocin）、福莫司汀（fotemustine）、洛莫司汀（lomustine）、尼莫司汀（nimustine）和雷莫司汀（ranimnustine）；抗生素，例如烯二炔抗生素；達內黴素（dynemicin），包括達內黴素A；埃斯培拉黴素（esperamicin）；以及新制癌菌素（neocarzinostatin）發色團和相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素（aclacinomysin）、放線菌素（actinomycin）、安麯黴素（authramycin）、重氮絲氨酸（azaserine）、博萊黴素（bleomycin）、放線菌素C（cactinomycin）、卡拉比星（carabicin）、洋紅黴素（carminomycin）、嗜癌菌素（carzinophilin）、色黴素（chromomycinis）、更生黴素（dactinomycin）、道諾黴素（daunorubicin）、地托比星（detorubicin）、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN®阿黴素（包括嗎啉代-阿黴素、氰基嗎啉代-阿黴素、2-吡咯啉基-阿黴素和去氧阿黴素）、表柔比星（epirubicin）、依索比星（esorubicin）、伊達比星（idarubicin）、麻西羅黴素（marcellomycin）、絲裂黴素（mitomycin）（諸如絲裂黴素C）、黴酚酸（mycophenolic acid）、諾加黴素（nogalamycin）、橄欖黴素（olivomycin）、培洛黴素（peplomycin）、泊非黴素（porfiromycin）、嘌呤黴素（puromycin）、三鐵阿黴素（quelamycin）、羅多比星（rodorubicin）、鏈黑菌素（streptonigrin）、鏈脲黴素（streptozocin）、殺結核菌素（tubercidin）、烏苯美司（ubenimex）、淨司他汀（zinostatin）、佐柔比星（zorubicin）；抗代謝物，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶（5-FU）；葉酸類似物，諸如二甲葉酸（denopterin）、甲氨蝶呤、蝶羅呤（pteropterin）、三甲曲沙（trimetrexate）；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱（fludarabine）、6-巰嘌呤（6-mercaptopurine）、硫咪嘌呤（thiamiprine）、硫鳥嘌呤（thioguanine）；嘧啶類似物，諸如環胞苷（ancitabine）、阿紮胞苷（azacitidine）、6-氮尿苷（6-azauridine）、卡莫氟（carmofur）、阿糖胞苷（cytarabine）、二去氧尿苷（dideoxyuridine）、去氧氟尿苷（doxifluridine）、依諾他濱（enocitabine）、氟尿苷（floxuridine）；雄激素（androgen），諸如二甲睾酮（calusterone）、屈他雄酮丙酸鹽（dromostanolone propionate）、環硫雄醇（epitiostanol）、美雄烷（mepitiostane）、睾內酯（testolactone）；抗腎上腺劑，諸如氨魯米特（aminoglutethimide）、米托坦（mitotane）、曲洛司坦（trilostane）；葉酸（folicacid）補充劑，諸如弗羅林酸（frolinic acid）；乙醯葡醛酯（aceglatone）；醛磷醯胺糖苷（aldophosphamide glycoside）；氨基乙醯丙酸（aminolevulinic acid）；恩尿嘧啶（eniluracil）；安吖啶（amsacrine）；倍曲布西（bestrabucil）；比生群（bisantrene）；依達曲沙（edatraxate）；地佛法明（defofamine）；地美可辛（demecolcine）；地吖醌（diaziquone）；依洛尼塞（elfornithine）；依利醋銨（elliptinium acetate）；埃博黴素（epothilone）；依託格魯（etoglucid）；硝酸鎵（gallium nitrate）；羥基脲（hydroxyurea）；香菇多糖（lentinan）；lonidainine；美登素類化合物，諸如美登素（maytansine）和安絲菌素（ansamitocin）；米托胍腙（mitoguazone）；米托蒽醌（mitoxantrone）；莫匹丹莫（mopidanmol）；二胺硝吖啶（nitraerine）；噴司他汀（pentostatin）；苯來美特（phenamet）；吡柔比星（pirarubicin）；洛索蒽醌（losoxantrone）；2-乙基醯肼；甲基苄肼（procarbazine）；PSK®多糖複合物（JHS Natural Products，Eugene，Oreg.）；雷佐生（razoxane）；根黴素（rhizoxin）；西索菲蘭（sizofiran）；螺旋鍺（spirogermanium）；細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid）；三亞胺醌（triaziquone）；2,2’,2’’-三氯三乙胺；單端孢黴烯（trichothecene）（尤其T-2毒素、維拉庫林A（verracurin A）、杆孢菌素A（roridin A）和蛇形菌素（anguidine））；烏拉坦（urethan）；長春地辛（vindesine，ELDISINE®，FILDESIN®） 達卡巴嗪（dacarbazine）；甘露醇氮芥（mannomustine）；二溴甘露醇（mitobronitol）；二溴衛矛醇（mitolactol）；呱泊溴烷（pipobroman）；格塞圖辛（gacytosine）；阿拉伯糖苷（arabinoside）（“Ara-C”）；噻替派（thiotepa）；紫杉烷（taxoid），例如紫杉烷（taxane），包括TAXOL®紫杉醇（paclitaxel）（Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.）、ABRAXANE™無聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor-free）的白蛋白工程化的紫杉醇納米顆粒製劑（American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Ill）和TAXOTERE®多西他賽（docetaxel）（Rhône-Poulenc Rorer，Antony，France）；苯丁酸氮芥；吉西他濱（gemcitabine，GEMZAR®） 6-硫代鳥嘌呤（6-thioguanine）；巰嘌呤（mercaptopurine）；甲氨蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑（cisplatin）和卡鉑（carboplain）；長春花堿（vinblastine，VELBAN®） ；鉑；依託泊苷（VP-16）；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新堿（vincristine，ONCOVIN®） 奧沙利鉑（oxaliplatin）；亞葉酸（leucovovin）；長春瑞濱（vinorelbine，NAVELBINE®） 諾消靈（novantrone）；依達曲沙（edatrexate）；道諾黴素；氨基蝶呤（aminopterin）；伊班膦酸鹽（ibandronate）；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸（DMFO）；類視黃醇（retinoid），諸如視黃酸（retinoic acid）；卡培他濱（capecitabine，XELODA®）；任何上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述各物中兩種或更多種的組合，諸如CHOP，即環磷醯胺、阿黴素、長春新堿和潑尼松龍（prednisolone）的組合療法的縮寫，以及FOLFOX，即用奧沙利鉑（ELOXATIN™）與5-FU和亞葉酸組合進行的治療方案的縮寫。其他化療劑包括用作抗體藥物偶聯物的細胞毒性劑，例如美登素類化合物（例如DM1）和澳瑞他汀（auristatin）MMAE和MMAF。

“化療劑”的實例還可以包括用來調節、減少、阻斷或抑制可促進癌生長的激素作用並且常常為系統性或全身治療形式的“抗激素劑”或“內分泌治療劑”。它們本身可以是激素。實例包括抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑（SERM），包括例如它莫西芬（包括NOLVADEX®它莫西芬）、EVISTA®雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奧那司酮和FARESTON®托瑞米芬；抗孕酮；雌激素受體下調劑（ERD）；用來抑制或停止卵巢的藥劑，例如，促黃體激素釋放激素（leutinizing hormone-releasing hormone）（LHRH）激動劑諸如LUPRON®和ELIGARD）醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林（tripterelin）；其他抗雄激素諸如氟他胺、尼魯米特和比卡魯胺；和抑制調節腎上腺中雌激素產生的酶芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如4(5)-咪唑、氨魯米特、MEGASE®醋酸甲地孕酮、AROMASIN®依西美坦、福美司坦（formestanie）、法倔唑、RIVISOR®伏氯唑、FEMARA®來曲唑和ARIMIDEX®阿那曲唑。此外，化療劑的此類定義包括二膦酸鹽，諸如氯膦酸鹽（例如BONEFOS®或OSTAC®）、DIDROCAL®依替膦酸鹽、NE-58095、ZOMETA®唑來膦酸/唑來膦酸鹽、FOSAMAX®阿侖膦酸鹽、AREDIA®帕米膦酸鹽、SKELID®替魯膦酸鹽或ACTONEL®利塞膦酸鹽；以及曲沙他濱（1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常細胞增殖的信號通路方面的基因表達的那些反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因數受體（EGFR）；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗和VAXID®疫苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；二甲苯磺酸拉帕替尼（ErbB-2和EGFR雙酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016）；以及任何上述化療劑的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。

化療劑的實例還可以包括抗體，例如阿侖單抗（Campath）、貝伐單抗（AVASTIN®，Genentech）；西妥昔單抗（ERBITUX®，Imclone）；帕尼單抗（VECTIBIX®，Amgen）、利妥昔單抗（RITUXAN®，Genentech/Biogen Idec）、帕妥珠單抗（OMNITARG®，2C4，Genentech）、曲妥單抗（HERCEPTIN®，Genentech）、托西莫單抗（Bexxar，Corixia）和抗體藥物偶聯物、吉妥單抗奧佐米星（MYLOTARG®，Wyeth）。作為與本發明化合物組合的試劑的具有治療潛力的其他人源化單克隆抗體包括：阿泊珠單抗（apolizumab）、阿塞珠單抗（aselizumab）、他利珠單抗（atlizumab）、巴匹組單抗（bapineuzumab）、bivatuzumab mertansine、莫坎妥珠單抗（cantuzumab mertansine）、西利珠單抗（cedelizumab）、賽妥珠單抗（certolizumab pegol）、cidfusituzumab、cidtuzumab、達克珠單抗（daclizumab）、依庫珠單抗（eculizumab）、依法珠單抗（efalizumab）、依帕珠單抗（epratuzumab）、厄利珠單抗（erlizumab）、泛維珠單抗（feMzumab）、芳妥珠單抗（fontolizumab）、奧吉妥珠單抗（gemtuzumab ozogamicin）、奧英妥珠單抗（inotuzumab ozogamicin）、ipilimumab、拉貝珠單抗（labetuzumab）、林妥珠單抗（lintuzumab）、馬妥珠單抗（matuzumab）、美泊珠單抗（mepolizumab）、莫維珠單抗（motavizumab）、motovizumab、那他珠單抗（natalizumab）、尼妥珠單抗（nimotuzumab）、nolovizumab、numavizumab、ocrelizumab、奧馬珠單抗（omalizumab）、帕利珠單抗（palivizumab）、帕考珠單抗（pascolizumab）、pecfusituzumab、pectuzumab、培克珠單抗（pexelizumab）、ralivizumab、雷珠單抗（ranibizumab）、瑞利珠單抗（reslivizumab）、瑞利珠單抗（reslizumab）、resyvizumab、羅維珠單抗（rovelizumab）、盧利珠單抗（ruplizumab）、西羅珠單抗（sibrotuzumab）、西利珠單抗（siplizumab）、索土珠單抗（sontuzumab）、他珠單抗（tacatuzumab tetraxetan）、tadocizumab、他利珠單抗（talizumab）、特非珠單抗（tefibazumab）、托珠單抗（tocilizumab）、托利珠單抗（toralizumab）、西莫白介素（tucotuzumab celmoleukin）、tucusituzumab、umavizumab、烏珠單抗（urtoxazumab）、ustekinumab、維西珠單抗（visilizumab）以及抗白介素-12（ABT-874/J695，Wyeth Research和Abbott Laboratories），其為經基因修飾以識別白介素-12 p40蛋白的重組專有人類序列，全長IgG1λ抗體。

化療劑的實例還可以包括“酪氨酸激酶抑制劑”，諸如EGFR靶向劑（例如，小分子、抗體等）；購自Takeda的小分子HER2酪氨酸激酶抑制劑如TAK165；CP-724,714，一種ErbB2受體酪氨酸激酶的口服選擇性抑制劑（Pfizer和OSI）；雙重HER抑制劑，例如EKB-569（購自Wyeth），其優先結合EGFR但抑制HER2和EGFR過表達細胞兩者；拉帕替尼（GSK572016；購自Glaxo-SmithKline），一種口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制劑；PKI-166（購自Novartis）；泛HER抑制劑，例如卡奈替尼（CI-1033；Pharmacia）；Raf-1抑制劑，例如購自ISIS Pharmaceuticals的抑制Raf-1信號轉導的反義試劑ISIS-5132；非HER靶向TK抑制劑，例如甲磺酸伊馬替尼（GLEEVEC®，購自Glaxo SmithKline）；多靶點的酪氨酸激酶抑制劑，例如舒尼替尼（SUTENT®，購自Pfizer）；VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑，例如瓦他拉尼（PTK787/ZK222584，購自Novartis/Schering AG）；MAPK細胞外調節激酶I抑制劑CI-1040（購自Pharmacia）；喹唑啉類，例如PD 153035,4-（3-氯苯胺基）喹唑啉；吡啶並嘧啶類；嘧啶並嘧啶類；吡咯並嘧啶類，例如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑並嘧啶、4-（苯基氨基）-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶；薑黃素（二阿魏醯甲烷、4,5-雙（4-氟苯胺基）鄰苯二甲醯亞胺）；含有硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制劑；PD-0183805（Warner-Lamber）；反義分子（例如，與編碼HER的核酸結合的那些）；喹喔啉（美國專利第5,804,396號）；酪氨酸磷酸化抑制劑（美國專利第5,804,396號）；ZD6474（Astra Zeneca）；PTK-787（Novartis/Schering AG）；泛HER抑制劑如CI-1033（Pfizer）；Affinitac（ISIS 3521；Isis/Lilly）；甲磺酸伊馬替尼（GLEEVEC®）；PKI 166（Novartis）；GW2016（Glaxo SmithKline）；CI-1033（Pfizer）；EKB-569（Wyeth）；司馬沙尼（Pfizer）；ZD6474（AstraZeneca）；PTK-787（Novartis/Schering AG）；INC-1C11（Imclone）；和雷帕黴素（西羅莫司，RAPAMUNE®）。

化療劑的實例還可以包括地塞米松、干擾素、秋水仙堿、氯苯氨啶、環孢素、兩性黴素、甲硝唑、阿侖單抗、阿利維A酸、別嘌呤醇、氨磷汀、三氧化二砷、天冬醯胺酶、BCG活苗、bevacuzimab、貝沙羅汀、克拉屈濱、氯法拉濱、達依泊汀α、地尼白介素、右雷佐生、阿法依泊汀、elotinib、非格司亭、醋酸組氨瑞林、替伊莫單抗、干擾素α-2a、干擾素α-2b、來那度胺、左旋咪唑、美司鈉、甲氧沙林、諾龍、奈拉濱、諾非單抗、奧普瑞白介素、帕利夫明、氨羥二磷酸二鈉、培加酶、培門冬酶、乙二醇化非格司亭、培美曲塞二鈉、普卡黴素、卟吩姆鈉、奎納克林、拉布立酶、沙格司亭、替莫唑胺、VM-26、6-TG、托瑞米芬、維甲酸、ATRA、戊柔比星、唑來膦酸鹽和唑來膦酸、及其藥學上可接受的鹽。

化療劑的實例還可以包括氫化可的松、醋酸氫化可的松、醋酸可的松、替考索爾21-新戊酸酯（tixocortol pivalate）、曲安奈德、曲安奈德醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、醋酸氟輕鬆、醋酸氟輕鬆、倍他米松、倍他米松磷酸鈉、地塞米松、地塞米松磷酸鈉、氟可龍、氫化可的松-17-丁酸酯、氫化可的松-17-戊酸酯、阿洛米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松二丙酸酯、潑尼卡酯、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他索-17-丙酸酯、氟可龍己酸酯、氟可龍新戊酸酯和醋酸氟潑尼酯：免疫選擇性抗炎肽（ImSAID）如苯丙氨酸-穀氨醯胺-甘氨酸（FEG）及其D-異構體形式（feG）（IMULAN BioTherapeutics，LLC）；抗風濕藥，例如硫唑嘌呤、環孢素（環孢素A）、D-青黴胺、金鹽、羥氯喹、來氟米特米諾環素、柳氮磺吡啶、腫瘤壞死因數α（TNFα）阻斷劑、例如依那西普（ENBREL®）、英夫利昔單抗（REMICADE®）、阿達木單抗（HUMIRA®）、賽妥珠單抗（CIMZIA®）、戈利木單抗（SIMPONI®）、白介素1（IL-1）阻斷劑，例如阿那白滯素（KINERET®）、T-細胞共刺激阻斷劑，例如阿巴西普（ORENCIA®）、白介素6（IL-6）阻斷劑，例如托珠單抗（ACTEMERA®）；白介素13（IL-13）阻斷劑，例如來瑞組單抗（lebrikizumab）；干擾素α（IFN）阻斷劑，例如隆利組單抗（rontalizumab）；β7整合素阻斷劑，例如rhuMAb β7；IgE通路阻斷劑，例如抗M1蛋白；分泌的同源三聚體LTa3和膜結合的異源三聚體LTa/β2阻斷劑，例如抗淋巴毒素α（LTa）；其他研究藥物、如硫鉑、PS-341、苯丁酸酯、ET-18-OCH3或法尼基轉移酶抑制劑（L-739749、L-744832）；多酚如槲皮素、白藜蘆醇、白皮杉醇、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、茶黃素、黃烷醇、原花青素、樺木酸及其衍生物；自噬抑制劑，例如氯喹；δ-9-四氫大麻酚（屈大麻酚，MARINOL®）；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙堿；樺木酸；乙醯基喜樹堿、東莨菪堿和9-氨基喜樹堿）；足葉草毒素；替加氟（UFTORAL®）；貝沙羅汀（TARGRETIN®）；雙膦酸鹽，例如氯膦酸鹽（例如，BONEFOS®或OSTAC®）、依替膦酸鹽（DIDROCAL®）、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽（ZOMETA®）、阿侖膦酸鹽（FOSAMAX®）、帕米膦酸鹽（AREDIA®）、替魯膦酸鹽（SKELID®）或利塞膦酸鹽（ACTONEL®）；以及表皮生長因數受體（EGF-R）；疫苗例如THERATOPE®疫苗；呱立福辛、COX-2抑制劑（如塞來昔布或依託考昔）、蛋白體抑制劑（如PS341）；CCI-779；tipifamib（R11577）；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制劑如奧利默森鈉（GENASENSE®）；匹杉瓊；法尼基轉移酶抑制劑如洛那法尼（SCH 6636，SARASAR™）；以及任何上述藥物的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述藥物中兩種或更多種的組合。

術語“生長抑制劑”通常是指在體外或體內抑制細胞（例如，其生長依賴於PD-L1表達的細胞）的生長和/或增殖的化合物或組合物。生長抑制劑可以是顯著降低S期細胞百分比的物質。生長抑制劑的非限制性實例包括阻斷細胞週期進展（在S期以外的位置）的藥物，例如誘導G1期停滯和M期停滯的藥物。經典的M期阻斷劑包括長春藥類（長春新堿和長春堿）、紫杉烷和拓撲異構酶II抑制劑，例如蒽環類抗生素多柔比星（（8S-順式）-10-[（3-氨基-2,3,6-三去氧-α-L-來蘇-己吡喃糖基）氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-8-（羥基乙醯基）-1-甲氧基-5,12-萘並萘二酮）、表柔比星、柔紅黴素、依託泊苷和博萊黴素。抑制G1的那些藥劑也溢出到S期抑制中，例如DNA烷化劑如它莫西芬、潑尼松、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。紫杉烷類（紫杉醇和多西他賽）是抗癌藥物，兩者都來源於紫杉樹。得自歐洲紫杉的多西他賽（TAXOTERE®，Rhone-Poulenc Rorer）是紫杉醇（TAXOL®，Bristol-Myers Squibb）的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進微管從微管蛋白二聚體組裝並通過防止解聚來穩定微管，這導致細胞中有絲分裂的抑制。

H. 生產和使用方法

在一些實施方案中，本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可以從分離的幹細胞（例如，分離的ESC、iPSC等）產生。如本文所公開的異源銜接子，異源受體（用於與異源銜接子形成複合物）和/或（i）、（ii）、（iii）、（iv）、（v）和（vi）的一個或多個成員（“（i）-（vi）”）可以在（並且包括）（a）分離的幹細胞和（b）其分化的免疫細胞狀態（例如，終末分化的免疫細胞狀態，如終末分化的NK細胞狀態）之間的任何階段（或細胞狀態）引入。

在一些情況下，工程化NK細胞可以來源於iPSC，並且可以將異源銜接子，異源受體和/或（i）-（vi）的一個或多個成員引入處於（A）iPSC狀態，（B）造血幹細胞狀態和/或（C）NK細胞狀態的細胞。異源銜接子，異源受體和/或（i）-（vi）的一個或多個成員可在（A）、（B）和（C）之一期間引入細胞一次。備選地，異源銜接子、異源受體和/或（i）-（vi）的一個或多個成員可在（A）、（B）和（C）中的兩個或全部期間多次引入細胞。

本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可用於（例如施用）治療有需要的物件。物件可患有或可被懷疑患有病症，諸如疾病（例如，癌症、腫瘤、組織變性、纖維化等）。細胞（例如，幹細胞或定向成體細胞）可以從物件獲得，並且這樣的細胞可以離體培養並基因修飾以產生本文公開的任何物件工程化免疫細胞（例如，任何工程化NK細胞）。隨後，工程化免疫細胞可施用於物件用於適應性免疫療法。

物件可以用本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）群體治療（例如施用）至少或至多約1劑、至少或至多約2劑、至少或至多約3劑、至少或至多約4劑、至少或至多約5劑、至少或至多約6劑、至少或至多約7劑、至少或至多約8劑、至少或至多約9劑、或至少或至多約10劑。

在一個方面，本公開提供了一種方法，其包括（a）從物件獲得細胞；以及（b）從細胞產生本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種。在一些情況下，從物件獲得的細胞是ESC。在一些情況下，將從物件獲得的細胞（例如，成纖維細胞，諸如成人皮膚成纖維細胞）修飾並轉化為iPSC。

在一個方面，本公開提供了一種方法，其包括向有需要的物件施用包括本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種的NK細胞群體。在一些情況下，方法還可以包括施用於物件協同治療劑（例如，化學治療劑、抗CD20抗體等）。

在一個方面，本公開提供了一種方法，其包括向有需要的物件施用本文公開的組合物中的任一種。在一些情況下，組合物可包括（i）本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種和（ii）協同治療劑（例如化療劑、抗CD20抗體等）。

本文公開的任何一種方法可用於治療物件的靶細胞、靶組織、目標病症或目標疾病。

目標疾病可以是病毒、細菌和/或寄生蟲感染；炎性和/或自身免疫疾病；或瘤，例如癌症和/或腫瘤。

靶細胞可以是患病細胞。患病細胞可具有改變的代謝，基因表達和/或形態學特徵。患病細胞可以是癌細胞、糖尿病細胞和凋亡細胞。患病細胞可以是來自患病物件的細胞。示例性疾病可包括血液病症、癌症、代謝病症、眼部病症、器官病症、肌肉骨骼病症、心臟疾病等。

可以使用本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種殺傷多種靶細胞。靶細胞可包括多種細胞類型。靶細胞可以是體外的。靶細胞可以在體內。靶細胞可以是離體的。靶細胞可以是分離的細胞。靶細胞可以是生物體內的細胞。靶細胞可以是生物體。靶細胞可以是細胞培養物中的細胞。靶細胞可以是細胞集合之一。靶細胞可以是哺乳動物細胞或來源於哺乳動物細胞。靶細胞可以是齧齒動物細胞或來源於齧齒動物細胞。靶細胞可以是人細胞或來源於人細胞。靶細胞可以是原核細胞或來源於原核細胞。靶細胞可以是細菌細胞或可以來源於細菌細胞。靶細胞可以是古菌細胞或來源於古菌細胞。靶細胞可以是真核細胞或來源於真核細胞。靶細胞可以是多能幹細胞。靶細胞可以是植物細胞或來源於植物細胞。靶細胞可以是動物細胞或來源於動物細胞。靶細胞可以是無脊椎動物細胞或來源於無脊椎動物細胞。靶細胞可以是脊椎動物細胞或來源於脊椎動物細胞。靶細胞可以是微生物細胞或來源於微生物細胞。靶細胞可以是真菌細胞或來源於真菌細胞。靶細胞可以來自特定的器官或組織。

靶細胞可以是幹細胞或祖細胞。靶細胞可包括幹細胞（例如，成體幹細胞、胚胎幹細胞、誘導的多能幹（iPS）細胞）和祖細胞（例如，心臟祖細胞、神經祖細胞等）。靶細胞可包括哺乳動物幹細胞和祖細胞，包括齧齒動物幹細胞，齧齒動物祖細胞，人幹細胞，人祖細胞等。克隆細胞可包括細胞的後代。靶細胞可包括靶核酸。靶細胞可以在活的生物體中。靶細胞可以是基因修飾的細胞。靶細胞可以是宿主細胞。

靶細胞可以是全能幹細胞，然而，在本公開的一些實施方案中，可以使用術語“細胞”，但可以不是指全能幹細胞。靶細胞可以是植物細胞，但在本公開的一些實施方案中，可以使用術語“細胞”，但可以不是指植物細胞。靶細胞可以是多能細胞。例如，靶細胞可以是多能造血細胞，其能分化成造血細胞譜系中的其他細胞，但不能分化成任何其他非造血細胞。靶細胞可以發育成整個生物體。靶細胞可以或不可以發育成整個生物體。靶細胞可以是整個生物體。

靶細胞可以是原代細胞。例如，原代細胞培養物可以傳代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多次。細胞可以是單細胞生物。細胞可以在培養物中生長。

靶細胞可以是患病細胞。患病細胞可具有改變的代謝，基因表達和/或形態學特徵。患病細胞可以是癌細胞、糖尿病細胞和凋亡細胞。患病細胞可以是來自患病物件的細胞。示例性疾病可包括血液病症、癌症、代謝病症、眼部病症、器官病症、肌肉骨骼病症、心臟疾病等。

如果靶細胞是原代細胞，它們可以通過任何方法從個體收穫。例如，可以通過單采血液成分術、白細胞單采血液成分術、密度梯度分離等收穫白細胞。可以通過活組織檢查收穫來自組織如皮膚、肌肉、骨髓、脾、肝、胰腺、肺、腸、胃等的細胞。合適的溶液可用於分散或懸浮收穫的細胞。這種溶液通常可以是平衡鹽溶液（例如，生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）、Hank平衡鹽溶液等），方便地補充有胎牛血清或其他天然存在的因數，連同低濃度的可接受緩衝液。緩衝液可包括HEPES、磷酸鹽緩衝液、乳酸鹽緩衝液等。細胞可立即使用，或它們可儲存（例如通過冷凍）。冷凍細胞可被解凍並且能夠被再利用。細胞可在DMSO、血清、培養基緩衝液（例如10% DMSO、50%血清、40%緩衝培養基）和/或用於在冷凍溫度下保存細胞的一些其他此類常用溶液中冷凍。

可以是靶細胞的細胞的非限制性實例包括但不限於淋巴樣細胞，例如B細胞、T細胞（細胞毒性T細胞、自然殺傷T細胞、調節性T細胞、T輔助細胞）、自然殺傷細胞、細胞因數誘導的殺傷（CIK）細胞（參見例如US20080241194）；髓樣細胞、例如粒細胞（嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞/超節段中性粒細胞）、單核細胞/巨噬細胞、紅細胞（網織紅細胞）、肥大細胞、血小板/巨核細胞、樹突細胞；來自內分泌系統的細胞、包括甲狀腺（甲狀腺上皮細胞、濾泡旁細胞）、甲狀旁腺（甲狀旁腺主細胞、嗜酸性細胞）、腎上腺（嗜鉻細胞）、松果體（松果體細胞）細胞；神經系統的細胞、包括神經膠質細胞（星形膠質細胞、小神經膠質細胞）、大細胞神經分泌細胞、星形細胞、伯特歇爾細胞（Boettcher cell）和垂體細胞（促性腺激素細胞、促腎上腺皮質激素細胞、促甲狀腺激素細胞、促生長激素細胞細胞、催乳激素細胞）；呼吸系統細胞、包括肺細胞（I型肺細胞、II型肺細胞）、克拉拉細胞、杯狀細胞、噬塵細胞；循環系統的細胞、包括心肌細胞、紅細胞；消化系統細胞、包括胃（胃主細胞、壁細胞）、杯狀細胞、潘氏細胞、G細胞、D細胞、ECL細胞、I細胞、K細胞、S細胞；腸內分泌細胞、包括腸嗜鉻細胞、APUD細胞、肝臟（肝細胞、枯氏細胞）、軟骨/骨/肌肉；骨細胞、包括成骨細胞、骨細胞、破骨細胞、牙齒（成牙骨質細胞、成釉細胞）；軟骨細胞、包括成軟骨細胞、軟骨細胞；皮膚細胞、包括毛細胞、角質形成細胞、黑素細胞（痣細胞）；肌肉細胞、包括肌細胞；泌尿系統細胞，包括足狀突細胞、球旁細胞、球內系膜細胞/球外系膜細胞、腎近端小管刷狀緣細胞、緻密斑細胞；生殖系統細胞，包括精子細胞、足細胞、萊氏細胞、卵細胞；以及其他細胞，包括脂肪細胞、成纖維細胞、肌腱細胞、表皮角質形成細胞（分化表皮細胞）、表皮基底細胞（幹細胞）、指甲和趾甲角質形成細胞、甲床基底細胞（幹細胞）、髓毛幹細胞、皮質毛幹細胞、角質層毛幹細胞、角質層毛根鞘細胞、赫胥黎氏層毛根鞘細胞、亨利層毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛基質細胞（幹細胞）、濕分層屏障上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、遠端尿道和陰道的分層鱗狀上皮表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、遠端尿道和陰道上皮的基底細胞（幹細胞）、泌尿上皮細胞（膀胱和尿管內襯）、外分泌分泌上皮細胞、唾液腺黏液細胞（富含多糖的分泌）、唾液腺漿液細胞（富含糖蛋白酶的分泌）、舌頭中的馮·艾伯納氏腺細胞（洗味蕾）、乳腺細胞（乳汁分泌）、淚腺細胞（淚液分泌）、耳中的耵聹腺細胞（蠟質分泌）、汗腺暗細胞（糖蛋白分泌）、外分泌汗腺透明細胞（小分子分泌）。頂泌汗腺細胞（有氣味分泌、性激素敏感）、眼瞼中的莫氏腺細胞（特化汗腺）、皮脂腺細胞（富脂質皮脂分泌）、鼻中的鮑曼氏腺細胞（洗嗅上皮）、十二指腸中的布倫納氏腺細胞（酶和鹼性黏液）、精囊細胞（分泌精液組分、包括用於游動精子的果糖）、前列腺腺細胞（分泌精液組分）、尿道球腺細胞（黏液分泌）、前庭大腺細胞（陰道潤滑劑分泌）、利特雷氏腺細胞（黏液分泌）、子宮內膜細胞（碳水化合物分泌）、分離的呼吸道和消化道杯狀細胞（黏液分泌）、胃內層黏液細胞（黏液分泌）、胃腺酶原細胞（胃蛋白酶原分泌）、胃腺胃泌酸細胞（鹽酸分泌）、胰腺腺泡細胞（碳酸氫鹽和消化酶分泌）、小腸潘氏細胞（溶菌酶分泌）、肺II型肺細胞（表面活性物質分泌）、肺克拉拉細胞、激素分泌細胞、垂體前葉細胞、促生長激素細胞、催乳激素細胞、促甲狀腺激素細胞、促性腺激素細胞、促腎上腺皮質激素細胞、中間垂體細胞、大細胞神經分泌細胞、腸和呼吸道細胞、甲狀腺細胞、甲狀腺上皮細胞、濾泡旁細胞、甲狀旁腺細胞、甲狀旁腺主細胞、嗜酸性細胞、腎上腺細胞、嗜鉻細胞、睾丸間質細胞、卵泡內膜細胞、破裂卵泡的黃體細胞、顆粒層黃體素細胞、膜黃體細胞、球旁細胞（腎素分泌）、腎緻密斑細胞、代謝和儲存細胞、屏障功能細胞（肺、腸、外分泌腺和泌尿生殖道）、腎、I型肺細胞（肺內空氣間隙內襯）、胰腺導管細胞（泡心細胞）、（汗腺、唾液腺、乳腺等的）未分化導管細胞、（精囊、前列腺等的）導管細胞、封閉內腔上皮細胞、具有推進功能的纖毛細胞、細胞外基質分泌細胞、收縮細胞；骨骼肌細胞、幹細胞、心肌細胞、血液和免疫系統細胞、紅細胞（紅細胞）、巨核細胞（血小板前體）、單核細胞、結締組織巨噬細胞（各種類型）、表皮朗格漢斯細胞、破骨細胞（在骨中）、樹突細胞（在淋巴組織中）、小神經膠質細胞（在中樞神經系統中）、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、肥大細胞、輔助T細胞、抑制性T細胞、細胞毒性T細胞、自然殺傷T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、網織紅細胞、血液和免疫系統的幹細胞和定向祖細胞（各種類型）、多能幹細胞、全能幹細胞、誘導的多能幹細胞、成體幹細胞、感覺轉導細胞、自主神經元細胞、感覺器官和外周神經元支援細胞、中樞神經系統神經元和神經膠質細胞、晶狀體細胞、色素細胞、黑素細胞、視網膜色素上皮細胞、生殖細胞、卵原細胞/卵母細胞、精母細胞、精母細胞、精原細胞（精母細胞的幹細胞）、精子、護士細胞、卵巢卵泡細胞、足細胞（睾丸中）、胸腺上皮細胞、間質細胞和間質腎細胞。

特別令人感興趣的是癌細胞。在一些實施方案中，靶細胞是癌細胞。癌細胞的非限制性實例包括癌症的細胞，該癌症包括棘皮瘤、腺泡細胞癌、聽神經瘤、肢端黑色素瘤、色素性汗腺頂端汗腺瘤、急性嗜酸細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性巨核細胞白血病、急性單核細胞白血病、成熟急性髓細胞白血病、急性髓系樹突狀細胞白血病、急性髓性白血病、急性早幼粒細胞白血病、造釉細胞瘤、腺癌、腺樣囊性癌、腺瘤、腺瘤樣牙源性腫瘤、腎上腺皮質癌、成人T細胞白血病、侵襲性NK細胞白血病、AIDS相關癌症、AIDS相關淋巴瘤、肺泡軟組織肉瘤、成釉細胞纖維瘤、肛門癌、間變性大細胞淋巴瘤、甲狀腺未分化癌、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、闌尾癌、星形細胞瘤、非典型畸胎瘤性橫紋肌樣瘤、基底細胞癌、基底樣癌、B細胞白血病、B細胞淋巴瘤、Bellini導管癌、膽道癌、膀胱癌、母細胞瘤、骨癌、骨腫瘤、腦幹性膠質瘤、腦腫瘤、乳腺癌、布倫內羅氏瘤、支氣管腫瘤、細支氣管肺泡癌、棕色腫瘤、伯基特淋巴瘤、未知原發癌、癌類腫瘤、癌、原位癌、陰莖癌、未知原發癌、癌肉瘤、Castleman病、中樞神經系統胚胎腫瘤、小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤、子宮頸癌、膽管癌、軟骨瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、絨毛膜癌、脈絡叢乳頭狀瘤、慢性淋巴細胞白血病、慢性單核細胞白血病、慢性粒細胞白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性中性粒細胞白血病、透明細胞瘤、結腸癌、結直腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、德戈斯病、皮膚纖維肉瘤、皮樣囊腫、增生性小圓細胞瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、胚胎發育不良性神經上皮腫瘤、胚胎癌、內胚竇瘤、子宮內膜癌、子宮內膜子宮癌、子宮內膜樣腫瘤、腸病相關T細胞淋巴瘤、室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、上皮樣肉瘤、紅白血病、食管癌、雌激素母細胞瘤、尤文氏腫瘤家族、尤文氏家族肉瘤、尤文氏肉瘤、顱外生殖細胞腫瘤、外源性胚芽細胞腫瘤、肝外膽管癌、乳房外Paget病、輸卵管癌、畸胎瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、濾泡性淋巴瘤、濾泡性甲狀腺癌、膽囊癌、膽囊癌、神經膠質瘤、神經節細胞瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃腸道癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸道間質瘤、胃腸道間質瘤、生殖細胞腫瘤、生殖細胞瘤、妊娠絨毛膜癌、妊娠滋養細胞腫瘤、骨巨細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、膠質瘤、腦膠質瘤病、球狀瘤、胰高血糖素瘤、促性腺細胞瘤、顆粒細胞瘤、毛細胞白血病、毛細胞白血病、頭頸癌、頭頸癌、心臟癌、血管母細胞瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、血液系統惡性腫瘤、肝細胞癌、肝脾T細胞淋巴瘤、遺傳性乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下嚥癌、下丘腦神經膠質瘤、炎症性乳腺癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞癌、胰島細胞瘤、青少年髓單核細胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、Klatskin腫瘤、Krukenberg腫瘤、喉癌、喉癌、惡性黑色素瘤、白血病、白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黃體瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴樣白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、惡性纖維組織細胞瘤、惡性纖維組織細胞瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、惡性膠質瘤、惡性間皮瘤、惡性外周神經鞘瘤、惡性橫紋肌樣瘤、惡性氚核腫瘤、MALT淋巴瘤、地幔細胞淋巴瘤、肥大細胞白血病、縱隔生殖細胞瘤、縱隔腫瘤、甲狀腺髓樣癌、成神經管細胞瘤、成神經管細胞瘤、髓母細胞瘤、黑色素瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、Merkel細胞癌、間皮瘤、間皮瘤、轉移性鱗狀細胞癌隱匿性原發性、轉移性尿路上皮癌、混合性繆勒腫瘤、單核細胞白血病、口腔癌、黏液瘤、多發性內分泌腫瘤綜合症、多發性骨髓瘤、多發性骨髓瘤、蕈樣真菌病、骨髓增生異常疾病、骨髓增生異常綜合症、骨髓性白血病、骨髓性肉瘤、骨髓增生性疾病、黏液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、鼻咽癌、腫瘤、神經瘤、成神經細胞瘤、成神經細胞瘤、神經纖維瘤、神經瘤、結節性黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌、眼腫瘤、寡星狀膠質瘤、少突膠質細胞瘤、嗜酸細胞瘤、視神經鞘膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢低惡性潛能腫瘤、乳腺Paget病、胰腺瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、乳頭狀瘤病、副神經節瘤、副鼻竇癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、血管周圍上皮樣細胞瘤、咽癌、嗜鉻細胞瘤、中間分化的松果體實質腫瘤、松果體細胞瘤、垂體腺瘤、垂體腺瘤、垂體瘤、漿細胞腫瘤、胸膜肺母細胞瘤、多胚胎瘤、前體T淋巴母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、原發性肝細胞癌、原發性肝癌、原發性腹膜癌、原始神經外胚層腫瘤、前列腺癌症、腹膜假性黏液瘤、直腸癌、腎細胞癌、15號染色體上涉及NUT基因的呼吸道癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、裡氏轉化、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神經鞘瘤病、皮脂腺癌、繼發性腫瘤、精原細胞瘤、漿液性腫瘤、Sertoli-Leydig細胞瘤、性索間質瘤、Sezary綜合症、印戒細胞癌、皮膚癌、小藍圓細胞瘤、小細胞癌、小細胞肺癌、小細胞淋巴瘤、小腸癌、軟組織肉瘤、體抑素瘤、煙塵疣、脊柱腫瘤、脊柱腫瘤、脾邊緣區淋巴瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、淺表性擴散黑素瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、表面上皮-間質瘤、滑膜肉瘤、T細胞急性淋巴細胞白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤、T細胞幼淋巴細胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、腫瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管移行細胞癌、移行細胞癌、臍尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系腫瘤、子宮肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、陰道癌、Verner Morrison綜合症、疣狀癌、視覺通路膠質瘤、外陰癌、華氏巨球蛋白血症、Warthin腫瘤、威爾姆斯氏腫瘤及其組合。在一些實施方案中，靶向癌細胞代表癌細胞群體內的亞群，例如癌症幹細胞。在一些實施方案中，癌症是造血譜系的癌症，例如淋巴瘤。抗原可以是腫瘤相關抗原。

在一些情況下，本文公開的靶細胞（例如，B細胞）與自身免疫性疾病相關或被懷疑與自身免疫性疾病相關。用本公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種治療的物件可具有或可懷疑具有自身免疫性疾病。

自身免疫性疾病的非限制性實例可以包括急性播散性腦脊髓炎（ADEM）、急性壞死性出血性白質腦炎、阿狄森氏病（Addison's disease）、無丙種球蛋白血症、過敏性哮喘、過敏性鼻炎、斑禿、澱粉樣變性、強直性脊柱炎、抗體介導的移植排斥、抗GBM/抗TBM腎炎、抗磷脂綜合症（APS）、自身免疫性血管性水腫、自身免疫性再生障礙性貧血、自身免疫性自主神經異常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性內耳病（AIED）、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性視網膜病變、自身免疫性血小板減少性紫癜（ATP）、自身免疫性甲狀腺病、自身免疫性蕁麻疹、軸突和神經元神經病、巴羅病（Balo disease）、白塞氏病（Behcet's disease）、大皰性類天皰瘡、心肌病、Castleman病、乳糜瀉、查加斯病（Chagas disease）、慢性疲勞綜合症、慢性炎性脫髓鞘性多發性神經病（CIDP）、慢性復發性多灶性骨髓炎（CRMO）、丘格-斯特勞斯綜合症（Churg-Strauss syndrome）、瘢痕性類天皰瘡/良性黏膜類天皰瘡、克羅恩氏病（Crohn's disease）、柯剛氏綜合症（Cogans syndrome）、冷凝集素病、先天性心臟傳導阻滯、柯薩奇病毒性心肌炎（coxsackie myocarditis）、CREST疾病、原發性混合性冷球蛋白血症、脫髓鞘性神經病、皰疹樣皮炎、皮肌炎、德維克氏病（Devic's disease）（視神經脊髓炎）、盤狀狼瘡、德雷斯勒氏綜合症（Dressler's syndrome）、子宮內膜異位、嗜酸細胞性筋膜炎、結節性紅斑、實驗性變應性腦脊髓炎、伊文思綜合症（Evans syndrome）、纖維肌痛、纖維化肺泡炎、巨細胞動脈炎（顳動脈炎）、腎小球性腎炎、古德帕斯徹氏綜合症（goodpasture's syndrome）、肉芽腫性多血管炎（GPA）、格雷夫斯病（Graves'disease）、格林-巴厘綜合症（Guillain-Barre syndrome）、橋本氏腦炎（Hashimoto's encephalitis）、橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis）、溶血性貧血、亨-舍二氏紫癜（Henoch-Schonlein purpura）、妊娠皰疹、低丙種球蛋白血症、高丙種球蛋白血症、特發性血小板減少性紫癜（ITP）、IgA腎病、IgG4相關硬化性疾病、免疫調控性脂蛋白、包涵體肌炎、炎症性腸病、胰島素依賴型糖尿病（1型）、間質性膀胱炎、幼年型關節炎、幼年型糖尿病、川崎綜合症（Kawasaki syndrome）、蘭伯特-伊頓綜合症（Lambert-Eaton syndrome）、白細胞破碎性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔蘚、木樣結膜炎、線狀IgA疾病（LAD）、狼瘡（SLE）、萊姆病（lyme disease）、美尼爾氏病（Meniere's disease）、顯微鏡下多血管炎、混合性結締組織病（MCTD）、意義未明的單克隆丙種球蛋白病（MGUS）、莫倫氏潰瘍（Mooren's ulcer）、穆-哈二氏病（Mucha-Habermann disease）、多發性硬化、重症肌無力、肌炎、嗜眠發作、視神經脊髓炎（德維克氏病）、嗜中性白血球減少症、眼部瘢痕性類天庖瘡、視神經炎、復發性風濕病、PANDAS（與鏈球菌相關的小兒自身免疫性神經精神障礙）、副腫瘤性小腦變性、陣發性睡眠性血紅蛋白尿症（PNH）、帕-羅二氏綜合症（Parry Romberg syndrome）、帕森-特納綜合症（Parsonnage-Turner syndrome）、睫狀體扁平部炎（周邊葡萄膜炎）、天皰瘡、周圍神經病、靜脈周圍腦脊髓炎、惡性貧血、POEMS綜合症、結節性多動脈炎、I型、II型和III型自身免疫性多腺體綜合症、風濕性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞後綜合症、心包切開術後綜合症、孕酮性皮炎、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、牛皮癬、牛皮癬關節炎、特發性肺纖維化、壞疽性膿皮病、純紅細胞再生障礙、雷諾現象（Raynauds phenomenon）、反射交感性營養不良、萊特爾氏綜合症（Reiter's syndrome）、復發性多軟骨炎、不寧腿綜合症、腹膜後纖維化、風濕熱、類風濕性關節炎、肉狀瘤病、施密特綜合症（Schmidt syndrome）、鞏膜炎、硬皮病、斯耶葛籣氏綜合症（Sjogren's syndrome）、精子和睾丸自身免疫、僵人綜合症、亞急性細菌性心內膜炎（SBE）、蘇薩克氏綜合症（Susac's syndrome）、交感性眼炎、高安氏動脈炎（Takayasu's arteritis）、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、血小板減少性紫癜（TTP）、托洛薩-亨特綜合症（Tolosa-Hunt syndrome）、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結腸炎、未分化結締組織病（UCTD）、葡萄膜炎、血管炎、水皰性皮膚病、白癜風、華氏巨球蛋白血症（WM）和韋格納氏肉芽腫病（現稱為肉芽腫性多血管炎（GPA））。

在一些情況下，自身免疫性疾病包括選自以下的一個或多個成員：類風濕性關節炎、1型糖尿病、系統性紅斑狼瘡（狼瘡或SLE）、重症肌無力、多發性硬化、硬皮病、阿狄森氏病、大皰性類天皰瘡、尋常天皰瘡、格林-巴厘綜合症、斯耶葛籣氏綜合症、皮肌炎、血栓性血小板減少性紫癜、高丙種球蛋白血症、意義未明的單克隆丙種球蛋白病（MGUS）、華氏巨球蛋白血症（WM）、性炎性脫髓鞘性多發性神經根神經病（CIDP）、橋本腦病（HE）、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、韋格納氏肉芽腫病和抗體介導的移植排斥（例如，用於組織移植如腎移植）。在實例中，自身免疫性疾病可以是1型糖尿病、狼瘡或類風濕性關節炎。

在一些情況下，目標疾病是急性髓性白血病（AML）。例如，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種包括以下中的一種或多種：（i）嵌合多肽受體，其包括能夠結合本文公開的抗原（例如，CD33）的抗原結合結構域，（ii）本文公開的異源細胞因數（例如，IL-15），和（iii）本文公開的用於增強CD16信號轉導的CD16變體，施用於需要其的物件以治療AML。

在一些情況下，目標疾病是非何傑金氏淋巴瘤（NHL）。

在一些情況下，目標疾病是慢性淋巴細胞白血病（CLL）。

在一些情況下，目標疾病是B細胞白血病（BCL）。例如，本文公開的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）中的任一種包括以下中的一種或多種：（i）如本文所公開的包括能夠結合CD19的抗原結合結構域的嵌合多肽受體，（ii）如本文所公開的異源細胞因數（例如IL-15），和（iii）如本文所公開的用於增強CD16信號轉導的CD16變體，可以施用於需要其的物件以治療BCL。

在一些情況下，目標疾病是非小細胞肺癌（NSCLC）。

在一些情況下，靶細胞形成腫瘤（即實體瘤）。用本文的方法治療的腫瘤可以導致穩定的腫瘤生長（例如，一種或多種腫瘤大小增加不超過1%、5%、10%、15%或20%和/或不轉移）。在一些情況下，腫瘤穩定至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週或更多週。在一些情況下，腫瘤穩定至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月。在一些情況下，腫瘤穩定至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在一些情況下，腫瘤的大小或腫瘤細胞的數目減少至少約5%、10%、15%、20%、25、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。在一些情況下，腫瘤被完全消除、或降低到低於檢測水準。在一些情況下，物件在治療後至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週或更多週保持無腫瘤（例如緩解期）。在一些情況下，物件在治療後至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月保持無腫瘤。在一些情況下，物件在治療後至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年保持無腫瘤。 [實施例]

實施例 1 ：用於分泌異源銜接子的工程化免疫細胞

圖1A示意性說明了本文公開的工程化免疫細胞用於靶向靶細胞以殺傷靶細胞的用途。工程化免疫細胞可分泌110包括（i）偶聯結構域和（ii）抗原結合部分的異源銜接子。異源銜接子可以是抗體（例如，單克隆抗體）。當（A）異源銜接子的偶聯結構域與表面受體偶聯120和（B）異源銜接子的抗原結合部分與靶細胞的抗原結合130時，工程化免疫細胞可特異性結合靶細胞（或可向靶細胞募集），例如誘導殺傷靶細胞。

圖2示意性說明了圖1所述特徵的示例性使用。參考圖2，工程化免疫細胞是來源於幹細胞（例如，iPSC）的工程化NK細胞。工程化NK細胞的表面受體是異源受體，如hnCD16。異源銜接子是抗CD20-IgG1（或抗CD20 scFv-Fc）。工程化NK細胞可分泌210異源銜接子，其包括（i）偶聯結構域（例如，IgG1）和（ii）抗原結合部分（例如，抗CD20抗體或scFv）。在（A）異源銜接子的偶聯結構域與表面受體的偶聯220和（B）異源銜接子的抗原結合部分與靶細胞的抗原（例如CD20）的結合230後，工程化NK細胞可特異性結合靶細胞（或可向靶細胞募集），例如以誘導殺傷靶細胞（例如，腫瘤細胞）。

參考圖2，利用分離的幹細胞，例如iPSC，可以獲得均一工程化NK細胞的大量生產。靶向顯示在惡性和/或正常癌細胞（例如，B淋巴細胞）表面上的CD20抗原的全長抗CD20-IgG1抗體的連續分泌可介導工程化NK細胞針對此類癌細胞的ADCC作用。表面受體可以是異源hnCD16受體。異源hnCD17受體可以是高親和力158V，不可切割的CD16 Fc受體，其被工程化以通過防止CD16下調和增強CD16與異源銜接子（例如，抗CD20抗體）的結合來增強ADCC。

圖3示意性說明了用於表達本文公開的異源銜接子（例如，分泌性異源銜接子）的示例性基因構建體（例如，表達盒）300。例如，由基因構建體300編碼的異源銜接子可以是抗CD20抗體，如圖2所示。參考圖3，基因構建體300可以包括信號肽（SP）。例如，信號肽可具有以下氨基酸序列（SEQ ID NO. 1）:

MAWSPLFLTLITHCAGSWA

基因構建體300可包括抗原結合部分，抗原結合部分包括由自身可切割肽序列（例如T2A）分開的輕鏈（例如利妥昔單抗輕鏈）和重鏈（例如利妥昔單抗重鏈）。基因構建體300可包括下列氨基酸序列（SEQ ID NO.2），其被稱為“利妥昔單抗重鏈”結構域並編碼利妥昔單抗的VH、C _H1、鉸鏈、C _H2和C _H3：

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

基因構建體300可包括以下氨基酸序列（SEQ ID NO.3），其被稱為“利妥昔單抗輕鏈”結構域並編碼利妥昔單抗的VH和C _L：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

自身可切割的肽序列（例如，T2A）可以包括以下氨基酸序列（SEQ ID NO.4）:

GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP

基因構建體300可包括具有以下氨基酸序列（SEQ ID NO.5）的Fc受體（例如，hnCD16）：

MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK

基因構建體300可包括不同變異的IgG信號肽（例如，IFN-γ信號肽、GM-CSF信號肽、IgK VIII信號肽），例如具有一個或多個以下氨基酸序列：  IFN-γ信號肽（SEQ ID NO.6）：  MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYC  GM-CSF信號肽（SEQ ID NO.7）：  MWLQSLLLLGTVACSIS  IgK VIII 信號肽（SEQ ID NO.8）：

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC

圖15示意性說明了用於表達本文公開的異源銜接子（例如，分泌性異源銜接子）的示例性scFv-Fc構建體（例如，表達盒）400。例如，由基因構建體400編碼的異源銜接子可以是抗CD20抗體，如圖2所示。參考圖15，scFv-Fc構建體400可以包括信號肽（SP）。例如，信號肽可包括以下氨基酸序列（SEQ ID NO.1）：

MAWSPLFLTLITHCAGSWA

基因構建體400可包括Fc受體（例如，hnCD16），包括輕鏈（例如，利妥昔單抗輕鏈）和重鏈（例如，利妥昔單抗重鏈）的抗原結合部分，輕鏈和重鏈由scFv肽接頭（例如，(G4S)3接頭）分開，隨後是鉸鏈結構域和Fc融合蛋白。  具有以下氨基酸序列（SEQ ID NO.5）的Fc受體（例如，hnCD16）：

MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK

利妥昔單抗輕鏈可變區可包括以下氨基酸序列（SEQ ID NO.9）：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK

利妥昔單抗重鏈可變區可包括以下氨基酸序列（SEQ ID NO.10）：

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA

scFv肽接頭（例如，(G4S)3接頭）包括以下氨基酸序列（SEQ ID NO.11）：

GGGGSGGGGSGGGGS

鉸鏈結構域可包括以下氨基酸序列（SEQ ID No.12）：  EPKSCDKTHTCP  Fc融合蛋白可包括以下氨基酸序列（SEQ ID No.13）：

PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

實施例 2 ：工程化免疫細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ ADCC ）

如本文所公開的，能夠分泌異源銜接子的工程化免疫細胞（例如，工程化NK細胞）可用於誘導通過ADCC殺傷靶細胞。例如，如圖1和圖2中所述，可以工程化各種細胞（例如，iPSC、來源於iPSC的免疫細胞，如來源於iPSC的NK細胞等）以表達和分泌異源銜接子（例如，抗CD20-IgG1抗體），並測試例如異源銜接子的分泌，異源銜接子的結合特異性和ADCC。

a. 包括編碼異源銜接子的基因構建體的慢病毒顆粒的產生

編碼抗原結合部分（例如，抗CD20 scFv）的DNA序列可針對哺乳動物表達進行密碼子優化，用5’ NdeI和3’ ClaI限制性位點合成，並在人Fc IgG1或穩定的IgG4慢病毒載體中代替占位元體（例如，ZsGreen）進行克隆。對於陰性對照，抗原結合部分（例如，抗CD20 scFv）可以用IgG1-Fc慢病毒載體中針對不同靶抗原的非靶向部分或不同抗原結合部分替換。

慢病毒可以通過使用聚乙烯亞胺（PEI）將5種質粒暫態轉染到293T細胞中來產生。在293T細胞產生病毒後，可收集病毒上清液並使用Lenti-X Concentrator根據製造商的說明書進行濃縮，並在-80℃下冷凍保存。

b. 細胞的慢病毒轉導

iPSC或來源於iPSC的免疫細胞（例如，來源於iPSC的NK細胞）可以用慢病毒以20 μg/mL和10 μg/mL二乙基氨基乙基的感染複數轉導。當確定要轉導的iPSC或衍生物的能力是可變的時，加入到實驗中的細胞數可以通過轉導%校正以避免這種偏差。

c. 異源銜接子的分泌和異源銜接子的結合特異性

可以維持經Lenti轉導的iPSC或來源於iPSC的免疫細胞（例如，1×10 ⁶個此類工程化細胞）（例如，持續兩天）。然後，可除去至少一部分培養基（例如，100微升）以給予總IgG或異源銜接子（例如，包括抗CD20 IgG）。分泌到轉導細胞培養基中的IgG的總水準可以使用人IgG ELISA定量裝置檢測。轉導的細胞分泌的異源銜接子（例如，包括抗CD20 IgG）可被純化（例如，用蛋白A瓊脂糖珠）和生物素化。這些抗體可以與重組抗原蛋白（例如，CD20人Fc蛋白）一起孵育，重組抗原蛋白可以預固定（例如，在室溫下在板上2小時）。生物素化抗體可通過與鏈黴親和素-HRP孵育（例如，1 h）來檢測，並用染色試劑盒顯影。可根據染色試劑盒（例如，在λ=450 nm）讀取吸光度。

d. 通過異源銜接子的 ADCC

可以將表達抗原（例如，CD20）的靶細胞鋪板並培養。在轉導iPSC或來源於iPSC的免疫細胞（例如，來源於iPSC的NK細胞）以表達如本文所公開的異源銜接子後（例如，病毒轉導後4天），可以以各種效應細胞：靶細胞（E:T）比例（例如，25:1、50:1、100:1等）將工程化細胞添加至靶細胞中並孵育（例如，過夜）。可以除去工程化細胞，並且可以通過MTT測定法測定靶細胞的生存力。對於ADCC測定，可將靶細胞與包括經調節（例如，調節至0.5 μg/mL的相應抗體或異源銜接子）的工程化細胞的上清液的溶液（例如，50 μL）一起孵育（例如，37℃下1 h）。細胞可以各種NK細胞：靶細胞（E:T）比例（例如，12.5:1、25:1、50:1等）孵育（例如，4 h，37℃）。乳酸脫氫酶（LDH）可以通過CytoTox 96®非放射性細胞毒性測定法在上清液中測定。

實施例 3 ：哺乳動物細胞分泌的異源銜接子（例如，分泌的異源抗體）的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ ADCC ）

可以工程化一個或多個細胞（例如，相同類型或不同類型的多個細胞）以共同地（i）分泌如本文公開的異源銜接子和（ii）能夠偶聯至異源銜接子的偶聯結構域的表面受體（例如，異源受體，如嵌合抗原受體或工程化T細胞受體或NK細胞受體）。分泌異源銜接子後，表達表面受體的一種或多種細胞中的至少一種細胞可通過包括分泌的異源銜接子和表面受體的複合物的作用結合靶細胞。在一些情況下，第一細胞可被工程化以分泌異源銜接子（例如，並且不表達表面受體），並且第二細胞可被工程化以表達表面受體（例如，並且不表達和/或分泌異源銜接子）。在一些實例中，可將第一細胞和第二細胞兩者施用於有需要的物件，例如以治療癌症。在一些情況下，單個細胞（例如，T細胞、NK細胞等）可被工程化以表達/分泌異源銜接子並表達表面受體。在一些實例中，此類單細胞在此類工程改造後可施用於有需要的物件，例如以治療癌症。

a. 哺乳動物細胞分泌異源銜接子

異源銜接子可以是抗體或其修飾物，如抗CD20抗體。

用（i）不編碼抗CD20 Ab的陰性對照載體（例如，GGV8-hnCD16或“hnCD16”），或（ii）編碼抗CD20 Ab的載體（例如，GGV8-hnCD16-抗CD20或“hnCD16-抗CD20”）轉染（例如，暫態轉染）293FT人胚腎細胞，隨後收集培養基（例如，在轉染後2天）。為了檢測293FT細胞分泌的抗CD20 Ab，然後將各上清液與表達CD20的Raji細胞孵育（例如，在4℃孵育1小時），隨後與FITC偶聯的山羊抗-人IgG H&L抗體孵育（例如，30分鐘）。對照上清液包括來自未轉染的對照293FT細胞的上清液（“Ctrl”），包括市售抗CD20抗體（“利妥昔單抗（300 nM）”）的溶液，和包括第二、非CD20靶向抗體（“第二AB”）的溶液。因此，在該測定中，檢測的Raji細胞的數目與293FT細胞分泌的抗CD20 Ab的量相關。

如圖4所示，在暫態轉染的293FT細胞的上清液中檢測到分泌的抗CD20抗體，如通過使用Raji細胞的FACS結合測定所測量的。

b. 由哺乳動物細胞分泌的異源銜接子介導的 ADCC

收集轉染的293FT細胞的上清液並與（i）效應細胞，如臍帶血NK細胞（CBNK）和（ii）靶細胞，如Raji細胞或Daudi細胞以各種E/T比例（例如，2:1或1:2）孵育（例如，6小時）。隨後稀釋上清液（例如，3倍或15倍）。市售的抗CD23抗體（例如，5微克/毫升的利妥昔單抗）用作陽性對照，而IgG1同種型用作陰性對照。

如圖5A所示，CD16-抗CD20上清液以各種E/T比例介導CBNK對Raji細胞和Daudi細胞的劑量依賴性ADCC功能。

收集轉染的293FT細胞的上清液，並與（i）效應細胞，如擴增的NK細胞（eNK）和（ii）靶細胞，如Raji細胞以1:1的E/T比孵育。如圖5B所示，用抗CD20 scFv-Fc上清液，eNK細胞介導的抗Raji細胞的ADCC功能，如通過檢測細胞毒性的發光測定法所測量的。

c. 工程化 NK92 細胞分泌異源銜接子

將不同形式（例如scFv-Fc和全長形式）的抗CD20抗體與hnCD16引入NK92細胞（例如通過轉染）。收集並濃縮來自轉染的NK92細胞的培養基（例如，通過截斷值為50千道爾頓的Ultra-4離心過濾單元）。然後將濃縮的上清液與表達CD20的Raji細胞孵育（例如，在4℃孵育1小時），隨後與FITC偶聯的山羊抗-人IgG Fc抗體孵育（例如，30分鐘）。

如圖13所示，在NK92細胞的上清液中檢測到抗CD20抗體的scFv-Fv形式，而不是抗CD20抗體的全長形式，如通過使用Raji細胞的FACS結合測定所測量的。此外，如圖14所示，scFv-Fc形式的抗CD20 mRNA水準比全長形式高3.5倍，這可能導致更多的抗體分泌。

d. 誘導的多能幹細胞克隆分泌異源銜接子

用編碼抗CD20 Ab（例如，GGV8-hnCD16-抗CD20或“hnCD16-抗CD20”）的載體轉染（例如，經由Piggybac轉座子系統）iPSC（例如，表達CAR19的wt ANB iPSC克隆或OI42 ANB iPSC克隆），並且收集一些轉染的iPSC（例如，轉染的ANB iPSC克隆）並且用PE偶聯的抗CD16抗體染色。如圖6所示，轉染的iPSC表現出異源CD16的表達，表明轉染的iPSC也表達和分泌異源抗CD20抗體。

單獨地，收集轉染的iPSC的培養基（例如，不更換培養基2天），並濃縮（例如，通過截斷值為50千道爾頓的Ultra-4離心過濾單元）。然後將濃縮的上清液與表達CD20的Raji細胞孵育（例如，在4℃孵育1小時），隨後與FITC偶聯的山羊抗-人IgG Fc抗體孵育（例如，30分鐘）。如圖7所示，在轉染的iPSC的上清液中檢測到分泌的抗CD20抗體，如通過使用Raji細胞的FACS結合測定所測量的。

e. 由 iPSC 分泌的異源銜接子介導的 ADCC

上述轉染的iPSC細胞可分化成NK細胞，從而產生工程化NK細胞，其各自能夠（i）表達抗CD20抗體和（ii）hnCD16。這種工程化NK細胞可用作效應細胞，並與靶細胞例如Raji細胞或Daudi細胞以各種E/T比例（例如，2:1或1:2）孵育（例如，6小時）。市售的抗CD23抗體（例如，每毫升5微克的利妥昔單抗）可用作陽性對照，而IgG1同種型可用作陰性對照。與缺少分泌性抗CD20抗體的NK細胞相比，工程化NK細胞可以表現出對靶細胞的增強的靶向和殺傷。

實施例 4 ：工程化細胞分泌的異源銜接子的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ ADCC ）

本文公開的工程化免疫細胞可以來源於幹細胞，例如iPSC。因此，可以在進行免疫細胞分化之前，測試經工程化以分泌異源銜接子的此類幹細胞的（i）產生和分泌異源銜接子的能力和/或（ii）此類分泌的異源銜接子實現ADCC的能力。

a. 誘導的多能幹細胞衍生的胚狀體（ iPSC- 衍生的 EB ）分泌異源銜接子

用編碼抗CD20 Ab的載體（例如，GGV8-hnCD16-抗CD20或“hnCD16-抗CD20”，其中GGV8是hnCD16-抗CD20克隆到其中的克隆載體）轉染iPSC。將表達低或高表達的異源CD16變體（例如hnCD16）的轉染的iPSC分化成胚狀體（EB）。收集來自來源於iPSC的EB的培養基並濃縮（例如，通過具有50千道爾頓截止值的Ultra-4離心過濾單元）。然後將濃縮的上清液與表達CD20的Raji細胞孵育（例如，在4℃孵育1小時），隨後與FITC偶聯的山羊抗-人IgG Fc抗體孵育（例如，30分鐘）。

如圖8所示，在分化自iPCS的EB上清液中檢測到分泌的抗CD20抗體，其具有異源CD16變體的高（H）和低（L）表達，如通過使用Raji細胞的FACS結合測定所測量。

b. 由來源於 iPSC 的 EB 分泌的異源銜接子介導的 ADCC

收集轉染的來源於iPSC的EB的上清液，並與（i）效應細胞，如外周血NK細胞（PBNK）和（ii）靶細胞，如Raji-GFP細胞孵育。與PBNK組合的市售抗CD20抗體（例如，5微克/毫升的利妥昔單抗（RTX））用作陽性對照，而Raji細胞和PBNK細胞單獨用作陰性對照。

如圖9所示，含有來自hnCD16-抗CD20 EB的上清液的PBNK在24小時內對Raji-GFP細胞進行ADCC，計算綠色螢光面積作為腫瘤大小的量度。分泌的抗CD20異源銜接子誘導針對表達CD20的靶細胞的細胞毒性的能力與對照抗CD20抗體（例如針對CD20的重組單克隆抗體）相當。在不存在PBNK細胞的情況下，分泌的抗CD20異源銜接子和對照抗CD20抗體都對靶細胞不產生顯著的細胞毒性，證明上述細胞毒性是由於與PBNK細胞組合的ADCC。

c. 由來源於 iPSC 的 NK 細胞分泌異源銜接子

從表達hnCD16-aCD20 IgG1的iPSC分化的EB進一步分化為NK細胞（iNK細胞）。如圖10所示，將表達高水準和低水準的異源CD16變體（例如，hnCD16）的iPSC分化成iNK細胞，例如，至少95%的iNK細胞是CD56＋細胞。CD56＋細胞與野生型（WT）（例如，不表達hnCD16-aCD20 IgG1的來源於iPSC的NK細胞）中的NKG2A表達也沒有差異，即使CD16表達保留在iNK中。

在2個分化階段（第12天（D12）和第24天（D24）的iNK）收集iNK細胞的上清液，並濃縮（例如，通過截斷值為50千道爾頓的Ultra-4離心過濾單元）。如圖11所示，在iNK D12和D24的上清液中檢測到分泌的抗CD20抗體，如通過使用Raji細胞的FACS結合測定所測量的。

不希望受理論束縛，由工程化NK細胞（例如，iNK細胞）分泌的異源銜接子（例如抗CD20抗體）的量可以足以實現針對靶細胞（例如，表達CD20的癌細胞）的ADCC。

d. 由擴增的來源於 iPSC 的 NK 細胞分泌的異源銜接子介導的 ADCC

用K562-41BBL-mlL21 aAPC擴增分泌抗體（例如，抗CD20抗體）的iNK細胞，然後與Raji或K562細胞孵育（例如，5小時）以測試針對這些靶細胞的細胞毒性。如圖12所示，從具有高或低異源CD16變體（例如，hnCD16）的iPSC分化的兩種擴增的NK（eNK）細胞都顯示出比WT（例如，不表達hnCD16-aCD20 IgG1的來源於iPSC的NK細胞）更高的細胞毒性。與不表達抗CD20抗體的對照NK細胞相比，分泌抗CD20抗體的iNK細胞對表達CD20的Raji細胞表現出約10%至約30%（例如，對於CD16-αCD20高約20%，對於CD16-αCD20低約15%）的更高的細胞毒性，表明由本文公開的工程化免疫細胞介導的ADCC。相反，分泌抗CD20抗體的iNK細胞和不表達抗CD20抗體的對照NK細胞對不表達CD20的K562細胞表現出相當的細胞毒性，進一步證明iNK細胞分泌的抗CD20抗體促進ADCC的能力。

應當理解，可以單獨地，共同地或彼此組合地理解本發明的不同方面。本文描述的本發明的各個方面可以應用于本文公開的任何特定應用。包括本公開的工程化免疫細胞的物質組合物可用于包括本文公開的使用和生產方法的方法部分，或反之亦然。

雖然本文已經示出和描述了本發明的優選實施方案，但是對於本領域技術人員顯而易見的是，這些實施方案僅作為實例提供。本發明不受說明書中提供的具體實施例的限制。雖然已經參考前述說明書描述了本發明，但是本文中的實施方案的描述和說明並不意味著以限制意義來解釋。在不脫離本發明的情況下，本領域技術人員將想到許多變化、改變和替換。此外，應當理解，本發明的所有方面不限於本文所述的具體描述、配置或相對比例，其取決於各種條件和變數。應當理解，在實施本發明時可以採用本文所述的本發明實施方案的各種替代方案。因此，預期本發明還應涵蓋任何此類替代、修改、變化或等同物。以下權利要求旨在限定本發明的範圍，並且由此涵蓋這些權利要求範圍內的方法和結構及其等同項。

110:工程化免疫細胞分泌異源銜接子 120:異源銜接子的偶聯結構域與表面受體偶聯 130:異源銜接子的抗原結合部分與靶細胞的抗原結合 210:工程化NK細胞分泌異源銜接子 220:異源銜接子的偶聯結構域與表面受體偶聯 230:異源銜接子的抗原結合部分與靶細胞的抗原結合 300:異源銜接子的示例性基因構建體 400:異源銜接子的示例性scFv-Fc構建體

本發明的新穎特徵在所附權利要求中具體闡述。通過參考以下對其中利用了本發明的原理的說明性實施方案進行闡述的詳細描述和附圖（也稱為“圖（Figure）”和“圖（FIG.）”），將獲得對本發明的特徵和優點的更好理解，在附圖中：

圖 1示意性說明了用於抗體依賴性細胞毒性的工程化免疫細胞的實例。

圖 2示意性說明了用於抗體依賴性細胞毒性的工程化NK細胞的實例。

圖 3說明了編碼用於促進抗體依賴性細胞毒性的異源銜接子（例如，全長）的核酸載體。

圖 4顯示了哺乳動物細胞分泌異源銜接子。

圖 5A顯示了臍帶血NK細胞針對靶細胞的異源銜接子介導的ADCC功能。

圖 5B顯示了NK細胞和包括哺乳動物細胞分泌的抗體的培養基的組合對靶細胞的細胞毒性。

圖 6顯示了誘導的多能幹細胞分泌異源銜接子。

圖 7顯示了由誘導的多能幹細胞分泌的異源銜接子與靶細胞的結合。

圖 8顯示了由誘導的多能幹細胞衍生的胚狀體分泌的異源銜接子與靶細胞的結合。

圖 9顯示了誘導的多能幹細胞衍生的胚狀體對靶細胞的異源銜接子介導的ADCC功能。

圖 10顯示了誘導的多能幹細胞成功分化為NK細胞。

圖 11顯示了工程化NK細胞分泌的異源銜接子與靶細胞的結合。

圖 12顯示了工程化NK細胞針對靶細胞的異源銜接子介導的ADCC功能。

圖 13顯示了NK-92細胞分泌的異源銜接子與靶細胞的結合。

圖 14顯示了NK-92細胞分泌的異源銜接子的mRNA水準。

圖 15說明了編碼用於促進抗體依賴性細胞毒性的scFv-Fc異源銜接子的核酸載體。圖公開了SEQ ID NO: 11。

TW202328437A_111144872_SEQL.xml

110:工程化免疫細胞分泌異源銜接子

120:異源銜接子的偶聯結構域與表面受體偶聯

130:異源銜接子的抗原結合部分與靶細胞的抗原結合

Claims (70)

1. 一種工程化NK細胞，其被構建成分泌異源銜接子至細胞外環境中，其中所述異源銜接子包括（i）用於偶聯至所述工程化NK細胞的偶聯結構域和（ii）表現出與靶細胞的抗原特異性結合的抗原結合結構域， 其中，在所述異源銜接子由所述工程化NK細胞分泌至所述細胞外環境時，（a）所述異源銜接子的所述偶聯結構域偶聯至所述工程化NK細胞，並且（b）所述異源銜接子的所述抗原結合結構域結合至所述靶細胞的所述抗原，使得所述工程化NK細胞特異性地靶向所述靶細胞，並且 其中與不含所述異源銜接子的對照NK細胞相比，所述工程化NK細胞表現出針對所述靶細胞的增強的細胞毒性。
2. 如請求項1之工程化NK細胞，其中與所述對照NK細胞相比，所述工程化NK細胞表現出針對靶細胞的細胞毒性的至少約0.2倍、至少約0.3倍、至少約0.5倍、至少約1倍或更多倍的增加。
3. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子是抗體或其修飾物。
4. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子是大小為至多約80千道爾頓（kDa）、至多約60 kDa或更小的工程化抗體。
5. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子缺少選自C _L、C _H1、C _H1和C _L的一個或多個成員。
6. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子是scFv-Fc。
7. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述偶聯結構域包括IgG、IgE、IgA、IgM、其修飾物或其組合。
8. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述偶聯結構域偶聯至所述工程化NK細胞的表面受體的細胞外部分。
9. 如請求項8之工程化NK細胞，其中所述表面受體包括Fc受體的至少一部分。
10. 如請求項9之工程化NK細胞，其中所述Fc受體包括FcγRI（或CD64）、FcγRII（或CD32）、FcγRIII（或CD16）、FcϵRI、FcαRI（或CD89）、FcμR、Fcα/μR（或CD351）、其修飾物或其組合。
11. 如請求項9之工程化NK細胞，其中所述Fc受體包括融合多肽，所述融合多肽包括CD16的至少一部分和CD64的至少一部分。
12. 如請求項8之工程化NK細胞，其中所述表面受體是異源受體。
13. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述工程化NK細胞足以殺傷所述靶細胞。
14. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述工程化NK細胞被構建成基本上組成性地分泌所述異源銜接子。
15. 一種工程化NK細胞，其包括： 異源受體；以及 異源銜接子，其包括（i）用於偶聯至所述異源受體的偶聯結構域和（ii）表現出與靶細胞的抗原特異性結合的抗原結合結構域， 其中在所述工程化NK細胞表達所述異源受體和所述異源銜接子時，（a）所述異源銜接子的所述偶聯結構域偶聯至所述異源受體，並且（b）所述異源銜接子的所述抗原結合結構域結合至所述靶細胞的所述抗原，使得所述工程化NK細胞特異性地靶向所述靶細胞。
16. 如請求項14之工程化NK細胞，其中與缺少所述異源受體和/或所述異源銜接子的對照NK細胞相比，所述工程化NK細胞表現出針對靶細胞的細胞毒性的至少約00.2倍、至少約0.3倍、至少約0.5倍、至少約1倍或更多倍的增加。
17. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子與所述異源受體的偶聯形成與所述工程化NK細胞的細胞外表面相鄰的複合物，所述複合物能夠靶向所述抗原。
18. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述偶聯結構域偶聯至所述異源受體的細胞外結構域。
19. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子是抗體或其修飾物。
20. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子是大小為至多約80千道爾頓（kDa）、至多約60 kDa或更小的工程化抗體。
21. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子缺少選自C _L、C _H1、C _H1和C _L的一個或多個成員。
22. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子是scFv-Fc。
23. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述偶聯結構域包括IgG、IgE、IgA、IgM、其修飾物或其組合。
24. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源受體包括Fc受體的至少一部分。
25. 如請求項24之工程化NK細胞，其中所述Fc受體包括FcγRI（或CD64）、FcγRII（或CD32）、FcγRIII（或CD16）、FcϵRI、FcαRI（或CD89）、FcμR、Fcα/μR（或CD351）、其修飾物或其組合。
26. 如請求項24之工程化NK細胞，其中所述Fc受體包括融合多肽，所述融合多肽包括CD16的至少一部分和CD64的至少一部分。
27. 一種工程化免疫細胞，其包括： 異源受體；以及 異源銜接子，其包括（i）用於偶聯至所述異源受體的細胞外結構域的偶聯結構域和（ii）表現出與靶細胞的抗原特異性結合的抗原結合結構域， 其中在所述工程化免疫細胞表達所述異源受體和分泌所述異源銜接子時，（a）所述異源銜接子的所述偶聯結構域偶聯至所述異源受體的所述細胞外結構域，並且（b）所述異源銜接子的所述抗原結合結構域結合至所述靶細胞的所述抗原，使得所述工程化免疫細胞特異性地靶向所述靶細胞。
28. 如請求項27之工程化免疫細胞，其中所述工程化免疫細胞是NK細胞。
29. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞，其中與缺少所述異源受體和/或所述異源銜接子的對照免疫細胞相比，所述工程化免疫細胞表現出針對靶細胞的細胞毒性的至少約0.2倍、至少約0.3倍、至少約0.5倍、至少約1倍或更多倍的增加。
30. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞，其中所述異源銜接子是抗體或其修飾物。
31. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子是大小為至多約80千道爾頓（kDa）、至多約60 kDa或更小的工程化抗體。
32. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞，其中所述異源銜接子缺少選自C _L、C _H1、C _H1和C _L的一個或多個成員。
33. 如前述請求項中任一項之工程化NK細胞，其中所述異源銜接子是scFv-Fc。
34. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞，其中所述偶聯結構域包括IgG、IgE、IgA、IgM、其修飾物或其組合。
35. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞，其中所述異源受體包括Fc受體的至少一部分。
36. 如請求項35之工程化免疫細胞，其中所述Fc受體包括FcγRI（或CD64）、FcγRII（或CD32）、FcγRIII（或CD16）、FcϵRI、FcαRI（或CD89）、FcμR、Fcα/μR（或CD351）、其修飾物或其組合。
37. 如請求項35之工程化免疫細胞，其中所述Fc受體包括融合蛋白，所述融合蛋白包括CD16的至少一部分和CD64的至少一部分。
38. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述偶聯結構域包括（1）用於偶聯至第一表面受體或異源受體的第一偶聯結構域和（2）用於偶聯至第二表面受體或異源受體的第二偶聯結構域，其中所述第一表面受體或異源受體不同於所述第二表面受體或異源受體。
39. 如請求項38之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中（1）所述第一表面受體或異源受體存在於第一免疫細胞上，並且（2）所述第二表面受體或異源受體存在於第二免疫細胞上，其中所述第一免疫細胞和所述第二免疫細胞是不同的。
40. 如請求項39之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述第一免疫細胞是NK細胞，並且所述第二免疫細胞是T細胞。
41. 如請求項38之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述抗原結合部分側接所述第一偶聯結構域和所述第二偶聯結構域。
42. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中（a）所述異源銜接子與所述NK細胞的所述異源受體的偶聯和（b）所述異源銜接子與所述抗原的結合是必需的，但各自不足以使所述工程化NK細胞殺傷所述靶細胞。
43. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其還包括編碼所述異源銜接子和/或所述異源受體的異源多核苷酸序列。
44. 如請求項43之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述異源多核苷酸序列是基因組整合的。
45. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中與所述對照NK細胞相比，所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞表現出編碼所述抗原的內源性基因的表達和/或活性水準降低。
46. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中與所述對照NK細胞相比，所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞表現出編碼CD38的內源性基因的表達和/或活性水準降低。
47. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞還包括嵌合多肽受體，所述嵌合多肽受體包括能夠結合所述抗原和/或不同的抗原的抗原結合部分。
48. 如請求項47之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述不同的抗原在所述靶細胞上。
49. 如請求項47之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述不同的抗原在不同的靶細胞上。
50. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞還包括異源細胞因數和/或其異源細胞因數受體，用於與不含所述異源細胞因數和/或所述異源細胞因數受體的細胞相比增強細胞因數信號轉導。
51. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞表現出免疫檢查點抑制劑的表達和/或活性降低，所述免疫檢查點抑制劑選自PD1、CTLA-4、TIM-3、KIR2D、CD94、NKG2A、NKG2D、TIGIT、CD96、LAG3、TIGIT、TGF β受體和2B4。
52. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞表現出免疫低下調節劑的表達和/或活性降低，所述免疫低下調節劑選自B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB、ULBP1、HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59。
53. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞還包括能夠實現所述工程化NK細胞死亡的安全開關。
54. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中在體外、離體或體內確定針對所述靶細胞的增強的細胞毒性。
55. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中與所述對照免疫細胞或所述對照NK細胞的細胞毒性水準相比，針對所述靶細胞的增強的細胞毒性通過靶細胞群體的大小減少至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%來確定。
56. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中與所述對照免疫細胞或所述對照NK細胞相比，針對所述靶細胞的增強的細胞毒性通過腫瘤大小的減小來確定。
57. 如請求項56之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中與所述對照免疫細胞或所述對照NK細胞相比，所述腫瘤大小減小至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%。
58. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中與所述對照免疫細胞或所述對照NK細胞相比，所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞在宿主細胞中誘導的免疫應答降低。
59. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞用於治療有需要的物件。
60. 如請求項59之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞對於所述物件是同種異體的。
61. 如請求項59之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞是所述物件自體的。
62. 如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞，其中所述工程化免疫細胞或所述工程化NK細胞來源於分離的幹細胞或誘導的幹細胞。
63. 一種組合物，其包括如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞。
64. 如請求項63之組合物，其還包括單獨的治療劑。
65. 如請求項64之組合物，其中所述單獨的治療劑是化療劑。
66. 一種方法，其包括： 從對象獲得細胞；以及 從所述細胞產生如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞。
67. 一種殺傷靶細胞的方法，所述方法包括： 使所述靶細胞與如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞接觸，其中所述接觸足以誘導所述靶細胞的殺傷。
68. 一種治療有需要的物件的方法，所述方法包括向所述物件施用如前述請求項中任一項之工程化免疫細胞或工程化NK細胞。
69. 如請求項68之方法，其還包括施用單獨的治療劑。
70. 如請求項69之方法，其中所述單獨的治療劑是化療劑。