TW202321683A - 使用繞射晶片之血液樣本檢測方法、裝置及系統 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種使用繞射晶片之血液樣本檢測方法、裝置及系統，其包含：使一血液樣本通過一繞射晶片；沖洗該繞射晶片；發射一雷射光源通過該繞射晶片，其中該雷射光源之波長範圍為400 nm至700 nm，通過該繞射晶片之雷射功率密度範圍為2 mW/cm 2至2000 mW/cm 2；以及在該雷射光源之相對面接收一雷射繞射訊號，藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的數量。本發明之方法、裝置及系統可在不需對細胞或細菌染色或染螢光的狀況下檢測細胞或病菌數目及狀態。

Description

使用繞射晶片之血液樣本檢測方法、裝置及系統
本發明關於一種使用繞射晶片之血液樣本檢測方法、裝置及系統，特別是關於一種使用雷射繞射技術之繞射晶片的血液樣本檢測方法、裝置及系統。
隨著生物晶片技術的發展，許多過去在實驗室中進行的檢測，現在已能於小小的晶片中完成，具有體積輕巧、成本低廉、減少試劑及樣本耗費的優點。生物晶片可以應用在細胞檢測，利用抗體標記來辨認細胞，但仍須經過螢光染色的步驟，再經螢光顯微鏡確認被染色細胞之數量及狀態，由於血液中白血球常常被誤染，加上螢光強度不同容易造成計數誤判，因此需要用不同染劑以及人工方式來排除偽陽性，檢測一個樣品常常需要耗費4小時以上，這樣的檢測速度並無法滿足大量病人的需求。因此，亟需一種能快速準確檢測細胞或細菌數量之生物檢測方法及系統。
本發明提供一種使用繞射晶片之血液樣本檢測方法，包含：使一血液樣本通過一繞射晶片；沖洗該繞射晶片；發射一雷射光源通過該繞射晶片，其中該雷射光源之波長範圍為400 nm至700 nm，通過該繞射晶片之雷射功率密度範圍為2 mW/cm 2至2000 mW/cm 2；以及在該雷射光源之相對面接收一雷射繞射訊號，藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的細胞數量，整個過程無須染色與人力計數。
本發明提供一種使用繞射晶片之血液樣本檢測系統，包含：一樣本注入組件，使一血液樣本通過一繞射晶片；一沖洗組件，用以沖洗該繞射晶片；一雷射發射器，設置於一固定組件上方，用以發射一雷射光源通過該繞射晶片，其中該雷射光源之波長範圍為400 nm至700 nm，通過該繞射晶片之雷射功率密度範圍為2 mW/cm 2至2000 mW/cm 2；一雷射接收器，設置於該固定組件下方並位於該雷射發射器之相對面，用以接收一雷射繞射訊號；一處理器，接收該雷射繞射訊號並藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的數量；以及一承載組件，設置於該固定組件且於該雷射發射器及該雷射接收器之間，用以置放該繞射晶片。
於某些具體實施例中進一步包含：乾燥組件用以乾燥該繞射晶片。
於某些具體實施例中，該樣本注入組件以流速範圍1 ml/hr至12 ml/hr，更佳1 ml/hr至3 ml/hr注入該血液樣本，且該血液樣本以流速範圍1 ml/hr至12 ml/hr，更佳1 ml/hr至3 ml/hr通過該繞射晶片。
於某些具體實施例中，該繞射晶片包含：一上蓋層，包含：一輸入口，供該血液樣本注入該繞射晶片；以及一輸出口，將該血液樣本導出該繞射晶片；一晶片層具有一繞射區域，該繞射區域包含複數個凸起部，並接枝與該受測標的有特異性結合之抗體；以及一黏著層，黏接該上蓋層及該晶片層，具有厚度200 µm至500 µm，該黏著層具有一中空區塊供該血液樣本通過該繞射晶片，該中空區塊包含：一注入流道，與該輸入口相連以將該血液樣本導入該繞射區域；一擴散區域，銜接該注入流道且該繞射區域中垂線與該擴散區域中垂線重疊；以及一輸出流道，銜接該擴散區域且與該輸出口相連且使該血液樣本流出該繞射區域。
於某些具體實施例中，該雷射繞射訊號之衰減量與該受測標的數量呈正比。
本發明提供一種使用繞射晶片之血液樣本檢測裝置，包含：一樣本注入組件，包含：一樣本槽、一推進幫浦、一注入通道及一注入接頭，該推進幫浦控制該樣本槽中之一血液樣本流經該注入通道，且該注入接頭設置在該注入通道之末端並連接一繞射晶片之一輸入口；一沖洗組件，包含：一沖洗液槽、一推進幫浦及一沖洗通道，其中該推進幫浦將該沖洗液槽之一沖洗液注入該沖洗通道，且該沖洗通道與該注入通道相通；一雷射發射器，設置於一固定組件上方，用以發射一雷射光源通過該繞射晶片，其中該雷射光源之波長範圍為400 nm至700 nm，通過該繞射晶片之雷射功率密度範圍為2 mW/cm 2至2000 mW/cm 2；一雷射接收器，設置於該固定組件並位於該雷射發射器之相對面，用以接收一雷射繞射訊號；一處理器，接收該雷射繞射訊號並藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的數量；以及 一承載組件，設置於該固定組件且於該雷射發射器及該雷射接收單元之間，用以置放該繞射晶片。
於某些具體實施例中，使用繞射晶片之血液樣本檢測裝置進一步包含一集液組件，該集液組件包含一收集槽、一導出通道及一導出接頭，其中該導出通道之兩端與該收集槽及該導出接頭相通，且該導出接頭係用以與該繞射晶片之一輸出口相接。
於某些具體實施例中，使用繞射晶片之血液樣本檢測裝置進一步包含一乾燥組件，用以乾燥該繞射晶片。
本發明所提供之使用繞射晶片之血液樣本檢測方法可以在未對血液樣本染螢光的狀況下檢測血液樣本中受測標的數量，例如細胞數量或是病原菌數量。利用雷射繞射技術，藉由本發明之血液樣本檢測裝置及系統的設計，可以用於各式細胞，特別是循環腫瘤細胞及鼠疫桿菌等受測標的。
應當理解的是，前面的一般描述與下面的詳細描述都是示例性及說明性的，並非用以限制本發明所請之申請專利範圍。本發明的一個或多個實施例的某些細節闡述於以下說明中。從以下代表性實施例之非窮舉的列表中，亦從所附的申請專利範圍中，本發明的其它特徵或優點將是顯而易見的。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。
如本文所用，冠詞「一」、「一個」以及「任何」是指一個或多於一個(即至少一個)的物品的文法物品。例如，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。
本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於文中所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
如本文所用，用語「免染色」係指能省略生物檢測中常見的染螢光標記步驟，例如但不限於蘇木素-伊紅染色（H-E Stain）等染色標記或Cy3、Cy5等螢光標記步驟。
如本文所用，用語「明膠」係指源自膠原蛋白的高分子量多肽， 過程涉及天然膠原蛋白大分子的結構破壞，為具生物相容性的材料。A 型明膠是由酸預處理的豬皮製成，B 型明膠是由鹼預處理的牛骨製成。
如本文所用，用語「硫醇自組裝單分子層」係指硫醇或二硫化物衍生物可通過自組裝自發地在金表面形成緊密堆積的單分子層。金的反應性較鈍，氧化程度較小，有利於硫醇化合物吸附，雖然金表面有高的自由能會使空氣中的碳氫物質附著，但硫醇官能基與金之間以更強烈的共價鍵鍵結，因此對成膜不造成影響。
如本文所用，用語「矽烷基自組裝單分子層」係指3-氨基丙基三乙氧基矽烷((3-aminopropyl)triethoxysilane,  APTES)進行脫醇反應， -Si-O-C 2H 5水解成-Si-OH，接著和矽晶片上的氫氧基進行吸附，形成共價鍵，並與其它吸附於表面之 APTES 分子產生聚合，進一步自組裝自發地形成之單分子層。
如圖1A所示，如本文所用，用語「柱/間距比」係指柱寬與間距寬的比例。本發明實施例之繞射結構區域包含複數個凸起部。在繞射結構中的複數個凸起部為柱狀凸起部20時，兩個柱狀凸起部20底部之間的距離即是「間距寬」B，柱狀凸起部20底部之寬度為「柱寬」A。
如圖1B所示，如本文所用，用語「線/間距比」係指線寬與間距寬的比例。本發明實施例之繞射結構區域包含複數個凸起部。在繞射結構中的複數個凸起部為線狀凸起部21時，兩條線狀凸起部21底部之間的距離即是「間距寬」D，線狀凸起部21底部之寬度為「線寬」C。
有關於本發明其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。
如圖2所示，本發明實施例提供一種繞射晶片檢測方法，包含：使一血液樣本通過一繞射晶片(步驟S10)；沖洗該繞射晶片(步驟S20)；發射一雷射光源通過該繞射晶片，其中該雷射光源之波長範圍為400 nm至700 nm，通過該繞射晶片之雷射功率密度範圍為2 mW/cm 2至2000 mW/cm 2(步驟S30)；以及在該雷射光源之相對面接收一雷射繞射訊號，藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的數量(步驟S40)。
本發明實施例之繞射晶片檢測系統可以實施本發明實施例之繞射晶片檢測方法。本發明實施例之繞射晶片檢測系統10包含一繞射晶片檢測裝置以及與其搭配使用之繞射晶片。如圖3A所示，本發明實施例之繞射晶片檢測裝置包含：一樣本注入組件11、一沖洗組件12、一雷射發射器15、一雷射接收器17、一承載組件16、一處理器18及一固定組件19。除此之外，本發明實施例之繞射晶片檢測裝置還可以進一步包含一乾燥組件13以及一集液組件14。如圖3B所示，本發明實施例之繞射晶片檢測系統包含：一樣本注入組件11、一沖洗組件12、一雷射發射器15、一雷射接收器17、一承載組件16、一處理器18、一固定組件19、一乾燥組件13、一集液組件14以及可互相搭配使用之一繞射晶片10。
請同時參考圖4，樣本注入組件11係用以使一血液樣本通過一繞射晶片10(步驟S10)，樣本注入組件11包含但不限於手動注射組件或具有注射幫浦之電動注射組件，例如包含一樣本槽111、一推進幫浦112、一注入通道113及一注入接頭114，樣本槽111及注入接頭114分別位於注入通道113之起始端及末端，血液樣本可置於樣本槽111中，並以推進幫浦112、蠕動泵或真空泵控制血液樣本注入的速度及體積，使血液樣本通過注入通道113並經由注入接頭114注入繞射晶片10。
繞射晶片10僅需少量的血液樣本即可進行檢測，因此樣本注入組件11約注入1ml至3ml之血液樣本即可進行檢測，包含但不限於約1ml、約1.5ml、約2ml、約2.5ml、約3ml。血液樣本的注入速度與受測標的之捕獲率有關。樣本注入組件11可以流速範圍1 ml/hr至12 ml/hr注入血液樣本，例如約1 ml/hr、約3 ml/hr、約5 ml/hr、約7 ml/hr、約9 ml/hr或約11 ml/hr。於某些具體實施例中，可以在流速範圍約1ml/hr至約3ml/hr中任何一個速率，例如約1 ml/hr、約2 ml/hr或約3 ml/hr，但不限於整數之速率，例如約1.33 ml/hr。在受測標的為鼠疫桿菌的具體實施例中，速率較佳為3ml/hr。在受測標的為循環腫瘤細胞的具體實施例中，速率較佳為1~2ml/hr，循環腫瘤細胞的抓取率達到70%。
沖洗組件12係用以沖洗該繞射晶片10(步驟S20)，其亦可以為手動注射組件或電動注射組件。沖洗組件12包含一沖洗液槽121、一推進幫浦122、一沖洗通道123及一轉接構件124，其中推進幫浦122、蠕動泵或真空泵將沖洗液槽121之一沖洗液注入沖洗通道123，且沖洗通道123與注入通道113相通，更佳可以利用轉接構件124將沖洗通道123導入注入通道113，例如一三通接頭或三向閥，三通接頭之兩個接頭間形成注入通道113之一段，且一個接頭與沖洗通道123連接。當血液樣本中的受測標的被捕獲後，需要使用磷酸鹽緩衝生理鹽水（Phosphate buffered saline, PBS）進行沖洗，以免繞射晶片10上的其他物質影響到檢測結果，沖洗的速度較佳為10 ml/min，沖洗體積較佳為10 ml。此外，更佳是將轉接構件124設置在注入通道113、樣本槽111與沖洗通道123間，以在檢測不同血液樣本時，可以對所有通道進行沖洗，避免不同樣本間之汙染。
在沖洗後，需要晾乾繞射晶片10以獲得較精確的檢測結果，因此本發明實施例之血液樣本檢測裝置及系統可進一步包含乾燥組件13以提高檢測速度，乾燥組件13可以為吹氣裝置或風扇裝置，用以烘乾或吹乾該繞射晶片10(步驟S25)。集液組件14包含但不限於可分離之收集槽141、導出通道142及導出接頭143，導出通道142之兩端與收集槽141及導出接頭143相通，其中收集槽141可以為真空槽，集液組件14可用以收集通過繞射晶片10後之血液樣本及沖洗組件12注入的磷酸鹽緩衝生理鹽水。
雷射發射器15，設置於一固定組件19上方之第一位置固定件191，用以發射一雷射光源通過該繞射晶片10(步驟S30)。雷射發射器15包含但不限於雷射光源之波長範圍為約400nm至約700 nm之雷射器，通過該繞射晶片10之雷射功率密度範圍為約2 mW/cm 2至約2000 mW/cm 2。雷射器15可以依照不同的情況調整適當的能量。於某些具體實施例中，雷射器的波長為約425 nm、約450 nm、約475 nm、約500 nm、約525 nm、約550 nm、約575 nm、約600 nm、約625 nm、約650 nm、約675 nm或約700nm。在某些特定具體實施例中，雷射光源為波長523 nm之綠光。通過繞射晶片10之雷射功率密度包括但不限於約5  mW/cm 2、約15 mW/cm 2、約25 mW/cm 2、約35 mW/cm 2、約45 mW/cm 2、約55 mW/cm 2、約65 mW/cm 2、約75 mW/cm 2、約85 mW/cm 2、約95 mW/cm 2、約105 mW/cm 2、約205 mW/cm 2、約305 mW/cm 2、約405 mW/cm 2、約505 mW/cm 2、約805 mW/cm 2、約1105 mW/cm 2、約1405 mW/cm 2或約1705 mW/cm 2，其中可以在雷射發射器15添加濾光片調整適當的雷射能量。
雷射接收器17，設置於該固定組件19之一第三位置固定件並位於該雷射發射器15之相對面，使雷射接收器17與雷射發射器15之中心位於同一軸線上，用以直接接收自該雷射發射器15射出並通過該繞射晶片10後經衰減之一雷射繞射訊號(步驟S40)。雷射接收器17包含但不限於陣列光束雷射分析儀或CCD (Charge-coupled Device)雷射相機，其與雷射接收器17之距離為約5cm至約30cm，包含但不限於約5cm、約10cm、約15cm、約20cm、約25cm或約30cm。陣列光束雷射分析儀以間接量測法對半導體雷射發散角測量，可精確得到光斑強度的空間分佈，還可繪出長軸和短軸分佈曲線，計算出雷射的遠場發散角。
固定組件19包含一第一位置固定件191、一第二位置固定件(圖未示)、一第三位置固定件(圖未示)，其中第一位置固定件191、第二位置固定件與第三位置固定件係由上而下依序設置。承載組件16包含但不限於一載台，載台係設置於該固定組件19之第二位置固定件且位於該雷射發射器15及該雷射接收器17之間，用以置放該繞射晶片10，以使來自雷射發射器15的雷射光通過繞射晶片10並由雷射接收器17偵測到。第一位置固定件191與第二位置固定件的距離約3 cm至約10 cm，第二位置固定件與第三位置固定件的距離約3 cm至約10 cm。除此之外，承載組件16還可以進一步包含一輸送件及一夾持件，輸送件與載台相連並將繞射晶片10自繞射晶片檢測裝置之一晶片入口輸送到載台上，夾持件在載台上方用以固定繞射晶片10。
處理器18，例如微處理器、電腦設備、平板裝置，用以接收該雷射繞射訊號並藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的數量(步驟S40)。繞射晶片10上的繞射區域會產生繞射光柵，因受測標的在繞射晶片10被捕獲後會改變其表面特性，受測標的的數量越多，被吸收的雷射能量越多，因此雷射繞射訊號產生衰減。將尚未通過血液樣本時所接收到的雷射能量做為基準值，便可知道通過血液樣本後雷射能量衰減之衰減量，將受測標的數量與相對應的雷射衰減量畫成趨勢線後，使趨勢線的雷射繞射訊號之衰減量與該受測標的數量呈正比，就可以利用測到的雷射衰減量推估出受測標的的數量，可用作細胞生長監控或癌症陰陽性的判定。雷射能量損失=(雷射通過繞射晶片測得的能量-雷射通過已抓取標的之繞射晶片測得的能量)/雷射通過繞射晶片測得的能量。上述公式之能量一詞，包含使用雷射功率密度、雷射能量密度或者是雷射接受器所量測的數值代表能量。
此外，在一個商用的繞射晶片檢測系統實施例中，可以進一步利用處理器18將樣本注入組件11、沖洗組件12、乾燥組件13、集液組件14或雷射發射器15做自動化的流程設計，並可設計將上述單元安裝於一殼體中，以實現自動化的檢測。在使用者介面上可以分別設定檢測流程、樣本注入組件11或沖洗組件12之流速或流量或時間、乾燥組件13之乾燥時間、集液組件14之自動排出時機或提醒時機、雷射發射器15之能量。
如圖5A至5D所示，繞射晶片10之長為約3 cm至約15 cm，例如約3 cm、約5 cm、約7 cm、約9 cm、約11 cm、約13 cm或約15 cm，寬為約1 cm至5 cm，例如約1 cm、約3 cm或約5 cm。繞射晶片10包含：一上蓋層101、一晶片層103及一黏著層102。上蓋層101包含：一輸入口1011及一輸出口1012，輸入口1011及輸出口1012自上蓋層101頂部貫穿至上蓋層101底部。黏著層102具有中空區塊，中空區塊包含：注入流道1021、擴散區域1023及輸出流道1022。
血液樣本自輸入口1011注入該繞射晶片10，其中輸入口1011可與樣本注入組件11之注入接頭114相接，例 如使用螺紋結構、套接結構或卡設結構將導管端或連通道端與輸入口1011做結合，輸入口1011底端口徑E為約0.08 cm至約0.4 cm。輸出口1012則將該血液樣本或沖洗溶液導出該繞射晶片10，並與集液組件14之導出接頭143相接。上蓋層101材質包含但不限於壓克力(poly (methyl methacrylate), PMMA)，輸入口1011及輸出口1012之間的區域越薄越好，以減少雷射通過時造成的衰減。
晶片層103之厚度範圍為約300 µm至約500 µm，例如約300 µm、350 µm、400 µm、450 µm及500 µm，且具有一繞射區域1031，該繞射區域1031包含複數個凸起部，凸起部可以為柱狀或線狀，以形成繞射結構，其中柱/間距比或線/間距比可以為約1:1至約1:1.5，柱寬及線寬可以為約500 nm、約1 µm。晶片層103材料可使用聚二甲基矽氧烷(PDMS)、PMMA或聚對苯二甲酸乙二酯(PET)，上面藉由微影製程轉印出繞射之柱狀或線狀之凸起部結構。繞射區域1031進一步包含自組裝單分子層、蛋白G及抗體。此外，在自組裝單分子層與蛋白G間還可以進一步包含一釋放層，或在接枝與該受測標的有特異性結合之抗體後進一步包含一抗沾黏層。
自組裝單分子層包含但不限於硫醇自組裝單分子層、矽烷基自組裝單分子層，形成在繞射結構上層。自組裝分子層上可利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺(EDC/NHS)反應接合蛋白G，蛋白G是從G型鏈球菌分離而得到的細胞壁蛋白，可做為與抗體相接之橋樑。選用特定抗體可以與受測標的產生特異性結合，藉此補獲受測標的，例如上皮細胞黏附分子抗體(Anti-EpCAM)可以與循環腫瘤細胞產生特異性結合，因此可以在蛋白G上接枝Anti-EpCAM來檢測循環腫瘤細胞。另外，在經過抗體表面改質後，還可以進一步於上方形成抗沾黏層，例如使用牛血清白蛋白(BovinS Serum Albumin, BSA)清洗表面以達到抗非特異性蛋白質沾黏效果。
傳統經螢光染色的受測標的在檢測完後並無法繼續用於其他研究或檢測，然而本發明實施例之繞射晶片10除了可以使用在快篩用途，檢測後受測標的可繼續培養在繞射晶片10上，並可以將捕獲的受測標的進行釋放供後續研究或其他檢測，例如醫師觀看細胞或細菌形態以作為用藥及治療的依據，提供更廣泛的用途。實現方法也很簡單，僅需要在自組裝單分子層與蛋白G間進一步包含一釋放層，釋放層材料包含但不限於明膠或海藻酸，明膠或海藻酸可藉由EDC/NHS反應利用共價鍵的結合形成在自組裝單分子層上，蛋白G再以EDC/NHS反應接合於釋放層上。因此使用海藻酸裂解酶即可將釋放層的鍵結打破，取出受測標的。
黏著層102係用以黏接該上蓋層101及該晶片層103，可以使用具有厚度約200 µm至約500 µm之雙面膠帶，在雙面膠帶上切割出中空區塊可為血液樣本設定一個流通的路徑範圍。黏著層102的中空區塊包含：注入流道1021、擴散區域1023及輸出流道1022。注入流道1021與該輸入口1011相連且注入流道1021之寬度範圍F在約0.04 cm至約0.2 cm，長度範圍H約在0.32 cm至約1.6 cm，擴散區域1023將該血液樣本導入該繞射區域1031，並藉由六角形設計之兩個邊，邊長範圍J約在0.12 cm至約0.6 cm，導角範圍(L/M)在91度至150度，將血液樣本完全引導流經四方形之繞射區域1031，邊長範圍K約在0.2 cm至約1.0 cm，並藉由六角形設計之另外兩個邊將流經繞射區域1031之血液樣本收納回輸出流道1022，中空區塊之輸入及輸出部分係採對稱設計。輸出流道1022與該輸出口1012相連且使該血液樣本流出該繞射區域1031。這樣的設計可以達到全程封閉，避免血液樣本外流，同時繞射晶片10為可拋棄式，價格便宜且可大量製造。
實施例一 子宮內膜癌評估
繞射晶片係以柱/間距比為1:1.5 (柱的底部直徑為500nm)之繞射圖案轉印之PDMS基材，鍍金後，浸泡入配置之 30mM 硫醇基乙酸 (Thioglycolic acid， TA)水溶液 (40μL+20mL H 2O)一小時以於PDMS基材上形成硫醇自組裝單分子層，再用去離子水潤洗 3 遍並放在氮氣環境下乾燥成為PDMS-TA。取3 mg A型明膠 (Sigma-Aldrich, 美國)、35 μL EDC (Alfa Aesar, 美國)及25 mg NHS (Acros Organics，比利時)加入1mL去離子水溶液中，在37 oC環境下與PDMS-TA反應一小時，以去離子水潤洗 3 遍即將明膠接枝完成，成為PDMS-TA-Gel。
接著，取75 µL EDC及50 mg NHS及100 µg蛋白G (Bio vision，美國)加入 1 mL且pH=7.2~7.4的PBS溶液中，在37 oC環境下與PDMS-TA-Gel反應一小時，以PBS潤洗 3 遍，再加入0.02 µg/ml之Anti-EpCAM反應一小時即可將抗體成功修飾在繞射晶片上，以PBS潤洗3遍移除多餘的Anti-EpCAM。接著，浸泡於牛血清蛋白(Sigma-Aldrich, 美國)溶液中反應30分鐘，以PBS潤洗 3 遍，可形成抗非特異性蛋白質之抗沾黏層。最後，以厚度約200 µm之雙面膠黏上中心區域(不含輸出口及輸入口)厚度約0.1 cm之壓克力板上蓋，形成長約3.5公分，寬約1.5公分之繞射晶片，輸入口及輸出口口徑E範圍約0.2 cm，晶片層之厚度約400 µm，繞射區域長約為0.5 cm，寬約為0.5 cm。雙面膠之中空區塊內，其H範圍約0.8 cm，F範圍約0.1 cm，K範圍約0.5 cm，J範圍約0.3 cm，L及M範圍約135度。
如圖6所示，放入不同數量的癌細胞通過繞射晶片，並偵測其相對應之雷射能量損失(%)，將上述結果畫成趨勢線，雷射能量損失與捕獲細胞之方程式為y=0.0098x+0.0111，其中y為雷射能量損失(%)，x為捕獲細胞數，線性相關係數R 2=0.99，顯示有較高線性關係。接著，本實驗取12位臨床子宮內膜癌病患的新鮮血液，有的患者有包含手術前及手術後3個月的採樣，將血液樣品各取3mL以針筒裝載，注射幫浦(CHEMXY Fusion 100)以流速3 ml/hr將血液樣本通過繞射晶片，使用波長532nm、功率密度50 mW/cm 2的雷射，雷射發射器與載台的距離約10 cm，載台與雷射接收器的距離約10 cm，當雷射垂直穿過繞射晶片上的微結構時會產生雷射繞射現象，在雷射發射器對面使用陣列雷射光束分析儀BeamMic (宏惠光電，台灣)量測雷射繞射能量損失(初始測得的能量約為75Mcnt)，並以雷射能量損失推算捕獲之循環腫瘤細胞顆數。11位受測樣本中，10位檢測都有捕獲到循環腫瘤細胞，顆數在1~7顆間。然而，傳統之腫瘤指數CA125檢測僅3位測到高於35unit/ml之參考值。顯見，本發明實施例一之檢測方法、裝置及系統比起腫瘤指數CA125檢測方法具有較高的檢測準確率，相較於傳統螢光偵測法又可以不經過螢光標記程序，實現快篩及估測細胞數量的需求。
實施例二，鼠疫桿菌的抓取與釋放
繞射晶片係以線/間距比為1:1.5 (線的底部寬度為500nm)之圖案化矽晶片模具奈米壓印於PET薄膜，以氧電漿機功率100W進行表面電漿活化5分鐘，浸泡入配置之0.05%(v/v)APTES水溶液 (10 µL+20mL H 2O)十分鐘以於PET基材上形成矽烷基自組裝單分子層，再用大量純水清洗並放在氮氣環境下乾燥。配置0.5mg/ml海藻酸 (Acros Organics，比利時)溶液，在取35 μg EDC及25 µg NHS加入200 µL海藻酸水溶液中，在37 oC環境下與PET基材反應30分鐘，以PBS洗 3 遍。
接著，取35 μL EDC及25 mg NHS及60 µg蛋白G加入 1000 mL且pH=7.2~7.4的PBS溶液中，在37 oC環境下與基材反應一小時，以PBS潤洗 3 遍，再加入0.02 µg/ml之鼠疫桿菌抗體 (Anti-Yp F1MoAB)反應一小時即可將抗體成功修飾在繞射晶片上，以PBS潤洗3遍移除多餘的Anti-Yp F1MoAB。接著，浸泡於牛血清蛋白溶液(5%溶於PBS中)反應一小時，以PBS潤洗 3 遍，可形成抗非特異性蛋白質之抗沾黏層。最後，以雙面膠(PMMA)黏上壓克力板上蓋，形成繞射晶片，其他晶片的尺寸參數及裝置設置請參考實施例一。
如圖7所示，本實驗使用不同濃度10 2~10 6CFU/ml之鼠疫桿菌溶液，將鼠疫桿菌溶液各取1mL以針筒裝載，注射幫浦(CHEMXY Fusion 100)以流速1 ml/hr將血液樣本通過繞射晶片，接著使用PBS沖洗並以氮氣吹乾，使用波長532 nm、功率密度50 mW/cm 2的雷射，當雷射垂直穿過繞射晶片上的微結構時會產生雷射繞射現象，在雷射發射器對面使用陣列雷射光束分析儀BeamMic (宏惠光電，台灣)量測雷射能量損失，並以雷射能量損失推算檢量線。同時，使用螢光顯微鏡確認結果，測得之雷射能量損失與捕獲細菌之方程式為y=0.0406x+0.002，其中y為雷射能量損失(%)，x為log(CFU/ml)，線性相關係數R 2=0.9899，顯示有較高線性關係。同時，在PET基材經海藻酸裂解酶反應後，使海藻酸高分子隨著細菌一起脫離完成釋放的效果，脫離後的細菌活性不受影響，可以進行後續其他研究及檢測。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
10:繞射晶片 101:上蓋層 1011:輸入口 1012:輸出口 102:黏著層 1021:注入流道 1022:輸出流道 1023:擴散區域 103:晶片層 1031:繞射區域 11:樣本注入組件 111:樣本槽 112:推進幫浦 113:注入通道 114:注入接頭 12:沖洗組件 121:沖洗液槽 122:推進幫浦 123:沖洗通道 124:轉接構件 13:乾燥組件 14:集液組件 141:收集槽 142:導出通道 143:導出接頭 15:雷射發射器 16:承載組件 17:雷射接收器 18:處理器 19:固定組件 191:第一位置固定件 20:柱狀凸起部 21:線狀凸起部 A:柱寬 B:間距寬 C:線寬 D:間距寬
圖1A為本發明實施例之柱狀繞射結構立體圖。圖1B為本發明實施例之線狀繞射結構立體圖。
圖2為本發明實施例之血液樣本檢測方法流程圖。
圖3A為本發明實施例之血液樣本檢測裝置方塊圖。圖3B為本發明實施例之血液樣本檢測系統方塊圖。
圖4為本發明實施例之繞射晶片檢測系統示意圖，其包含本發明實施例之繞射晶片檢測裝置及與其搭配使用之繞射晶片。
圖5A、5B、5C及5D分別為本發明實施例之繞射晶片之分解圖、結合圖、剖面圖及上視圖。
圖6為實施例一之腫瘤循環細胞數量與雷射能量損失之線性關係與癌症受試者之量測結果分布圖。
圖7為實施例二之鼠疫桿菌濃度與雷射能量損失之關係圖。
11:樣本注入組件
12:沖洗組件
15:雷射發射器
16:承載組件
17:雷射接收器
18:處理器
19:固定組件

Claims (13)

  1. 一種使用繞射晶片之血液樣本檢測方法，包含： 使一血液樣本通過一繞射晶片； 沖洗該繞射晶片； 發射一雷射光源通過該繞射晶片，其中該雷射光源之波長範圍為400 nm至700 nm，通過該繞射晶片之能量範圍為2 mW/cm 2至2000 mW/cm 2；以及 在該雷射光源之相對面接收一雷射繞射訊號，藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的數量。
  2. 如請求項1所述之血液樣本檢測方法進一步包含：乾燥該繞射晶片。
  3. 如請求項1所述之血液樣本檢測方法，其中該血液樣本以流速範圍1 ml/hr至12 ml/hr通過該繞射晶片。
  4. 如請求項1所述之血液樣本檢測方法，其中該繞射晶片包含： 一上蓋層，包含： 一輸入口，供該血液樣本注入該繞射晶片；以及 一輸出口，將該血液樣本導出該繞射晶片； 一晶片層具有一繞射區域，該繞射區域包含複數個凸起部，並接枝與該受測標的有特異性結合之抗體；以及 一黏著層，黏接該上蓋層及該晶片層，具有厚度200 µm至500 µm，該黏著層具有一中空區塊供該血液樣本通過該繞射晶片，該中空區塊包含： 一注入流道，與該輸入口相連以將該血液樣本導入該繞射區域； 一擴散區域，銜接該注入流道且該繞射區域中垂線與該擴散區域中垂線重疊；以及 一輸出流道，銜接該擴散區域且與該輸出口相連以使該血液樣本流出該繞射區域。
  5. 如請求項1所述之血液樣本檢測方法，其中該雷射繞射訊號之衰減量與該受測標的數量呈正比。
  6. 一種使用繞射晶片之血液樣本檢測系統，包含： 一樣本注入組件，使一血液樣本通過一繞射晶片； 一沖洗組件，用以沖洗該繞射晶片； 一雷射發射器，設置於一固定組件上方，用以發射一雷射光源通過該繞射晶片，其中該雷射光源之波長範圍為400 nm至700 nm，通過該繞射晶片之雷射功率密度範圍為2 mW/cm 2至2000 mW/cm 2； 一雷射接收器，設置於該固定組件下方並位於該雷射發射器之相對面，用以接收一雷射繞射訊號； 一處理器，接收該雷射繞射訊號並藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的數量；以及 一承載組件，設置於該固定組件且於該雷射發射器及該雷射接收單元之間，用以置放該繞射晶片。
  7. 如請求項6所述之血液樣本檢測系統，其進一步包含一乾燥組件，用以乾燥該繞射晶片。
  8. 如請求項6所述之血液樣本檢測系統，其中該樣本注入組件以流速範圍1 ml/hr至12 ml/hr注入該血液樣本。
  9. 如請求項6所述之血液樣本檢測系統，其中該繞射晶片包含： 一上蓋層，包含： 一輸入口，供該血液樣本注入該繞射晶片；以及 一輸出口，將該血液樣本導出該繞射晶片； 一晶片層，厚度範圍為0.1 cm至0.5 cm且具有一繞射區域，該繞射區域包含複數個凸起部，並接枝與該受測標的有特異性結合之抗體；以及 一黏著層，黏接該上蓋層及該晶片層，具有厚度200 µm至500 µm，該黏著層具有一中空區塊供該血液樣本通過該繞射晶片，該中空區塊包含： 一注入流道，與該輸入口相連以將該血液樣本導入該繞射區域； 一擴散區域，銜接該注入流道且該繞射區域中垂線與該擴散區域中垂線重疊；以及 一輸出流道，銜接該擴散區域且與該輸出口相連且使該血液樣本流出該繞射區域。
  10. 如請求項6所述之血液樣本檢測系統，其中該雷射繞射訊號之衰減量與該受測標的數量呈正比。
  11. 一種使用繞射晶片之血液樣本檢測裝置，包含： 一樣本注入組件，包含：一樣本槽、一推進幫浦、一注入通道及一注入接頭，該推進幫浦控制該樣本槽中之一血液樣本流經該注入通道，且該注入接頭設置在該注入通道之末端並連接一繞射晶片之一輸入口； 一沖洗組件，包含：一沖洗液槽、一推進幫浦及一沖洗通道，其中該推進幫浦將該沖洗液槽之一沖洗液注入該沖洗通道，且該沖洗通道與該注入通道相通； 一雷射發射器，設置於一固定組件上方，用以發射一雷射光源通過該繞射晶片，其中該雷射光源之波長範圍為400 nm至700 nm，通過該繞射晶片之雷射功率密度範圍為2mW/cm 2至2000 mW/cm 2； 一雷射接收器，設置於該固定組件並位於該雷射發射器之相對面，用以接收一雷射繞射訊號； 一處理器，接收該雷射繞射訊號並藉由該雷射繞射訊號之衰減量計算一受測標的數量；以及 一承載組件，設置於該固定組件且於該雷射發射器及該雷射接收單元之間，用以置放該繞射晶片。
  12. 如請求項11所述之血液樣本檢測裝置，其進一步包含一集液組件，該集液組件包含一收集槽、一導出通道及一導出接頭，其中該導出通道之兩端與該收集槽及該導出接頭相通，且該導出接頭係用以與該繞射晶片之一輸出口相接。
  13. 如請求項12所述之血液樣本檢測裝置，其進一步包含一乾燥組件，用以乾燥該繞射晶片。
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