TW202315612A - 以結合191p4d12蛋白之抗體藥物結合物(adc)治療非肌肉浸潤性膀胱癌(nmibc)之方法 - Google Patents

以結合191p4d12蛋白之抗體藥物結合物(adc)治療非肌肉浸潤性膀胱癌(nmibc)之方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供以結合191P4D12蛋白(連接素-4)之抗體藥物結合物(antibody drug conjugate；ADC)針對膀胱癌之膀胱內治療方法及治療非肌肉浸潤性膀胱癌之方法。

Description

以結合191P4D12蛋白之抗體藥物結合物(ADC)治療非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)之方法
本文提供以結合191P4D12蛋白(連接素-4)之抗體藥物結合物(ADC)治療非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)之方法。
膀胱癌係尿道上皮癌(UC)之最常見形式，且係美國(U.S.)第六大常見癌症，估計每年在全球造成近200,000名患者死亡，包括歐洲的65,000多人及美國的近18,000人(Bray 2018; Ferlay 2018; Siegel 2019)。據估計，2018年全球每年診斷出的膀胱癌新病例超過549,000例。2020年，美國估計有81,400例膀胱癌新病例；此估計在2021年增加至超過83,000例(American Cancer Society (ACS) 2021; National Cancer Institute (NCI) 2021)。膀胱癌發病率及死亡率隨著年齡而大幅度增加且隨著人群變得更加老年化時，將成為日益嚴重的問題。
約70%至80%之膀胱癌診斷呈現為非肌肉浸潤性疾病(Chang 2016; Woldu 2017; Kates 2020; Li 2020)。非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)表示一組異質性癌症，包括本質上呈乳突狀且侷限於黏膜(Ta)、高級別且扁平且侷限於上皮細胞(Tis或原位癌[CIS])、以及浸潤至黏膜下層或固有層(T1)中之彼等(Pasin 2008)。在NMIBC患者中，乳突狀疾病最為常見，影響約70%患者，而T1疾病及CIS分別影響約20%及10%患者(Kirkali 2005; Anastasiadis 2012)。
治療NMIBC之照護標準涉及經由膀胱腫瘤之經尿道切除術(TURBT)來手術切除膀胱腫瘤，接著膀胱內投與治療劑以獲得進一步抗腫瘤活性(Kawai 2013; Chang 2016; Woldu 2017; Jamil 2019; Kates 2020)。膀胱內卡介苗(BCG)被視為首選的治療劑，其觸發似乎與患有NMIBC之患者，及尤其具有高風險疾病之特徵的患者之抗腫瘤活性相關的局部免疫反應(Kassouf 2015; Chang 2016)。
BCG無反應性疾病指示NMIBC患者之一個子組，其未能對BCG之適當治療起反應且保持處於疾病復發及進展至UC之後續階段的高風險下。對於此等患者，用BCG額外治療並非一種選擇方案，且根治性膀胱切除術仍為最佳可用的選擇方案。膀胱內化學治療劑，諸如吉西他濱(gemcitabine)、絲裂黴素(mitomycin)及伐柔比星(valrubicin)已展現出一定功效；然而，當前的指南表明，除根治性膀胱切除術以外之治療對於BCG無反應性疾病之治療較差(Navai 2016; Taylor 2020) (EAU. Guidelines for Non-muscleinvasive Bladder Cancer. 2020. https://uroweb.org/guideline/non-muscle-invasive-bladdercancer/2021年2月16日擷取.)。儘管最近批准全身性帕博利珠單抗(pembrolizumab)用於治療患有BCG無反應性疾病與原位癌(CIS)之患者，但超過一半的經帕博利珠單抗治療之患者未實現對療法之完全反應；因此，在此患者群體中仍然需要安全且有效的膀胱內療法。
191P4D12 (其亦稱為連接素(Nectin)-4)為一種66 kDa的I型跨膜蛋白，屬於黏附分子之連接素家族。其由含有3個免疫球蛋白(Ig)樣亞域的胞外域(ECD)、跨膜螺旋及胞內區域構成(Takai等人, Annu Rev Cell Dev Biol (2008); 24: 309-42)。連接素被認為經由在黏著帶處之嗜同性及嗜異性反式相互作用介導Ca 2+非依賴性細胞-細胞黏附，在該等黏著帶處，連接素可募集鈣黏素且調節細胞骨架重排(Rikitake等人., Cell Mol Life Sci (2008); 65(2): 253-63.)。連接素-4與其他連接素家族成員之序列一致性較低且在ECD中在25%至30%之間的範圍內(Reymond等人., Biol Chem (2001); 276(46): 43205-15)。
已發現，連接素-4表現於多種癌症中，特定言之，尿道上皮癌、乳癌、肺癌、胰臟癌及卵巢癌。較高的表現量與疾病惡化及/或不良預後相關(Fabre-Lafay等人, BMC Cancer (2007); 7: 73)。
對於不適合或沒有資格進行根治性膀胱切除術之患有BCG無反應性NMIBC之患者或對於已做出不接受根治性膀胱切除術之知情決定的彼等患者，對安全且有效的膀胱內治療的需求仍未得到滿足。
本文提供經由膀胱內投與結合191P4D12之抗體藥物結合物(ADC)治療人類個體之膀胱癌的方法。
實施例1.一種治療人類個體之膀胱癌之方法，其包含向該個體膀胱內投與有效量之抗體藥物結合物(ADC)，其中該ADC包含結合191P4D12之與一或多個單甲基奧瑞他汀E (monomethyl auristatin E，MMAE)單元結合的抗體或其抗原結合片段。
實施例2.如實施例1之方法，其中該膀胱癌為非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)。
實施例3.如實施例2之方法，其中該NMIBC已經組織學確認且係原位癌(CIS)。
實施例4.如實施例3之方法，其中該個體患有乳突狀疾病。
實施例5.如實施例3之方法，其中該個體未患有乳突狀疾病。
實施例6.如實施例2至5中任一項之方法，其中該NMIBC已經組織學確認，且其中該主要組織學組成部分(＞50%)為尿道上皮(移行細胞)癌。
實施例7.如實施例1至6中任一項之方法，其中該個體患有高風險卡介苗(BCG)無反應性疾病。
實施例8.如實施例1至7中任一項之方法，其中該個體不符合或拒絕經歷根治性膀胱切除術。
實施例9.如實施例1至8中任一項之方法，其中該個體之所有可見乳突狀Ta/T1腫瘤在該治療之前60天內完全切除。
實施例10.如實施例9之方法，其中該個體具有殘留純CIS。
實施例11.如實施例9之方法，其中該個體不具有殘留純CIS。
實施例12.如實施例1至11中任一項之方法，其中該個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體能狀態評分為0。
實施例13.如實施例1至11中任一項之方法，其中該個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為1。
實施例14.如實施例1至11中任一項之方法，其中該個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為2。
實施例15.如實施例14之方法，其中該個體之腎小球濾過率(GFR)不低於50 mL/min且該個體不具有紐約心臟協會(New York Heart Association，NYHA) III級心臟衰竭。
實施例16.如實施例1至15中任一項之方法，其中該個體具有一或多種選自由以下組成之群的狀況： a.絕對嗜中性白血球計數(ANC) ≥1500/μL； b.血紅蛋白(Hgb) ≥10 g/dL； c.血小板計數≥100,000/μL； d.血清膽紅素≤1.5 ×正常上限(ULN)或≤3 x ULN，對於患有吉爾伯氏病(Gilbert's disease)之個體； e.經計算之肌酸酐清除率(CrCl) ≥30 mL/min (亦可使用GFR代替肌酸酐或CrCl)。應使用柯克勞夫-高爾特方法(Cockcroft-Gault method)或腎病飲食改進(MDRD)等式來計算CrCl。ECOG體能狀態為2之個體必須具有GFR ≥50 mL/min； f.丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及天冬胺酸胺基轉移酶(AST) ≤3 × ULN；或 g.除非個體正接受抗凝血劑療法，只要PT或aPTT在預期使用抗凝血劑之治療範圍內，否則國際標準化比值(INR)或凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血激酶時間(aPTT)或部分凝血激酶時間(PTT) ≤1.5 ULN。
實施例17.如實施例16之方法，其中該個體具有如實施例16之所有狀況(a)至(g)。
實施例18.如實施例1至17中任一項之方法，其中該個體之所估計的預期壽命超過2年。
實施例19.如實施例1至18中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區之該等CDR之該等胺基酸序列的互補決定區(CDR)；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區之該等CDR之該等胺基酸序列的CDR。
實施例20.如實施例1至19中任一項之方法， 其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之CDR-H2、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H3、包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L3，或 其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的CDR-L2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的CDR-L3。
實施例21.如實施例1至19中任一項之方法， 其中該抗體或其抗原結合片段包含：由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成的CDR-H1、由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成的CDR-H2、由SEQ ID NO: 11之胺基酸序列組成的CDR-H3；由SEQ ID NO: 12之胺基酸序列組成的CDR-L1、由SEQ ID NO: 13之胺基酸序列組成的CDR-L2及由SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的CDR-L3，或 其中該抗體或其抗原結合片段包含：由胺基酸序列SEQ ID NO: 16組成的CDR-H1、由胺基酸序列SEQ ID NO: 17組成的CDR-H2、由胺基酸序列SEQ ID NO: 18組成的CDR-H3；由胺基酸序列SEQ ID NO: 19組成的CDR-L1、由胺基酸序列SEQ ID NO: 20組成的CDR-L2，及由胺基酸序列SEQ ID NO: 21組成的CDR-L3。
實施例22.如實施例1至21中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
實施例23.如實施例1至22中任一項之方法，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO: 7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO: 8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內之胺基酸序列。
實施例24.如實施例1至23中任一項之方法，其中該抗原結合片段為Fab、F(ab')2、Fv或scFv。
實施例25.如實施例1至24中任一項之方法，其中該抗體為完全人類抗體。
實施例26.如實施例1至25中任一項之方法，其中該抗體為IgG1，且輕鏈為κ輕鏈。
實施例27.如實施例1至26中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係以重組方式產生。
實施例28.如實施例1至27中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段經由連接子與MMAE之各單元結合。
實施例29.如實施例28之方法，其中該連接子為酶可裂解連接子，且其中該連接子與該抗體或其抗原結合片段之硫原子形成鍵。
實施例30.如實施例28或29之方法，其中該連接子具有-Aa-Ww-Yy-之式；其中-A-為延伸子單元，a為0或1；-W-為胺基酸單元，w為在0至12範圍內之整數；及-Y-為間隔子單元，y為0、1或2。
實施例31.如實施例30之方法，其中該延伸子單元具有下式(1)之結構；該胺基酸單元為纈胺酸-瓜胺酸；且該間隔子單元為包含下式(2)之結構的PAB基團：
Figure 02_image003
式(1)
Figure 02_image005
式(2)。
實施例32.如實施例30或31之方法，其中該延伸子單元與該抗體或其抗原結合片段之硫原子形成鍵；且其中該間隔子單元經由胺基甲酸酯基與MMAE連接。
實施例33.如實施例1至32中任一項之方法，其中該ADC包含1至20個MMAE單元/抗體或其抗原結合片段。
實施例34.如實施例1至33中任一項之方法，其中該ADC包含1至10個MMAE單元/抗體或其抗原結合片段。
實施例35.如實施例1至34中任一項之方法，其中該ADC包含2至8個MMAE單元/抗體或其抗原結合片段。
實施例36.如實施例1至35中任一項之方法，其中該ADC包含3至5個MMAE單元/抗體或其抗原結合片段。
實施例37.如實施例1至36中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
Figure 02_image007
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段，且p為1至10。
實施例38.如實施例37之方法，其中p為2至8。
實施例39.如實施例37或38之方法，其中p為3至5。
實施例40.如實施例37至39中任一項之方法，其中p為3至4。
實施例41.如實施例37至40中任一項之方法，其中p為約4。
實施例42.如實施例37至40中任一項之方法，其中有效量之該等抗體藥物結合物的平均p值為約3.8。
實施例43.如實施例1至42中任一項之方法，其中該ADC係調配於包含L-組胺酸、聚山梨醇酯-20 (TWEEN-20)及脫水海藻糖之醫藥組合物中。
實施例44.如實施例1至43中任一項之方法，其中該ADC係調配於包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5.5% (w/v)二水合海藻糖及鹽酸鹽之醫藥組合物中，且其中該醫藥組合物之pH在25℃下為約6.0。
實施例45.如實施例1至43中任一項之方法，其中該ADC係調配於包含約9 mM組胺酸、約11 mM組胺酸鹽酸鹽單水合物、約0.02% (w/v) TWEEN-20及約5.5% (w/v)二水合海藻糖之醫藥組合物中，且其中該醫藥組合物之pH在25℃下為約6.0。
實施例46.如實施例1至45中任一項之方法，其中該ADC之該有效量係在約100 mg至約1000 mg之間、在約125 mg至約950 mg之間、在約125 mg至約900 mg之間、在約125 mg至約850 mg之間、在約125 mg至約800 mg之間或在約125 mg至約750 mg之間的劑量，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。
實施例47.如實施例1至46中任一項之方法，其中該ADC之該有效量係在約125 mg至約750 mg之間的劑量，其中滴注體積為約25 mL。
實施例48.如實施例1至47中任一項之方法，其中該ADC之該有效量為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
實施例49.如實施例1至47中任一項之方法，其中該ADC之該有效量為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
實施例50.如實施例1至47中任一項之方法，其中該ADC之該有效量為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
實施例51.如實施例1至47中任一項之方法，其中該ADC之該有效量為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
實施例52.如實施例1至51中任一項之方法，其中各膀胱內投與之最長停留時間為約90分鐘。
實施例53.如實施例1至51中任一項之方法，其中各膀胱內投與之最長停留時間為約120分鐘。
實施例54.如實施例1至51中任一項之方法，其中各膀胱內投與之該停留時間為約30、40、50、60、70、80、90或120分鐘。
實施例55.如實施例1至54中任一項之方法，其中該ADC係在兩個階段期間經膀胱內投與，其中該等兩個階段為誘導階段及維持階段。
實施例56.如實施例55之方法，其中該維持階段在該誘導階段之後的六至十週之間、六至九週之間或六至八週之間開始。
實施例57.如實施例55或56之方法，其中該ADC在誘導階段期間膀胱內投與一週一次持續六週。
實施例58.如實施例55至57中任一項之方法，其中該ADC在維持階段期間膀胱內投與一月一次持續九個月。
實施例59.如實施例1至58中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
Figure 02_image009
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約125 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
實施例60.如實施例1至58中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
Figure 02_image011
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約250 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
實施例61.如實施例1至58中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
Figure 02_image013
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約500 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
實施例62.如實施例1至58中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
Figure 02_image015
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約750 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
相關申請之交叉引用
本申請案主張2021年8月13日申請之美國申請案第63/233,048號、2021年9月9日申請之美國申請案第63/242,380號及2022年4月7日申請之美國申請案第63/328,441號之益處，該等申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。 對以電子方式提交之序列表之引用
本申請案含有已以XML檔案格式與本申請案一起提交之電腦可讀序列表，該文獻之全部內容以全文引用之方式併入本文中。本申請案中提交之序列表XML檔案名稱為「14369-281-228_SEQ_LISTING.xml」，創建於2022年8月2日且大小為34,743個位元組。
在進一步描述本發明之前，應瞭解，本發明不限於本文所闡述之特定實施例，且亦應瞭解，本文所用之術語係僅出於描述特定實施例之目的且不希望具有限制性。
需要在有效使用膀胱內治療中考慮多種因素，包括至少滴注體積、停留時間、劑量濃度、總劑量、滴注之pH、尿液之pH、在治療之前及期間減少尿液產生等，以便達成功效與安全性之間的適當平衡。本公開意外地確定，劑量濃度和總劑量為ADC，諸如本文所揭示之MMAE ADC，的有效及安全遞送的最重要因素。本發明使用此知識以告知利用ADC之膀胱內投與治療膀胱癌(例如，非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC))之各種方法的發展。 5.1 定義
本文所描述或提及之技術及程序包括熟習此項技術者大體上充分瞭解及/或通常使用習知方法而採用的技術及程序，諸如以下中所描述之廣泛利用的方法：Sambrook等人., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010); and Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010)。
除非本文中另外定義，否則本說明書中所使用之技術及科學術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下術語說明且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之亦然。在所闡述之術語之任何說明與以引用之方式併入本文中之任何文獻存在衝突之情況下，以下文闡述之術語說明為準。
術語「抗體」、「免疫球蛋白」或「Ig」在本文中可互換使用，且在最廣泛意義上使用且特定涵蓋例如單株抗體(包括促效劑、拮抗劑、中和抗體、全長或完整單株抗體)、具有多抗原決定基或單抗原決定基特異性之抗體組合物、多株或一價抗體、多價抗體、由至少兩種完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其呈現所需生物活性即可)、單鏈抗體及其片段，如下文所描述。抗體可為人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體及/或親和力成熟抗體，以及來自其他物種(例如小鼠及兔等)之抗體。術語「抗體」意欲包括免疫球蛋白類別之多肽內的B細胞之多肽產物，其能夠與特異性分子抗原結合且由兩對相同的多肽鏈構成，其中每一對具有一條重鏈(約50-70 kDa)及一條輕鏈(約25 kDa)，各鏈之各胺基端部分包括具有約100至約130個或更多個胺基酸之可變區，且各鏈之各羧基端部分包括恆定區。參見例如Antibody Engineering (Borrebaeck編, 第2版，1995)；及Kuby, Immunology (第3版，1997)。在特定實施例中，特定分子抗原可由本文提供之抗體(包括多肽或抗原決定基)結合。抗體亦包括(但不限於)合成抗體、以重組方式製造之抗體、駱駝化抗體、胞內抗體、抗個體基因型(抗Id)抗體，及以上任一種之功能片段(例如抗原結合片段)，該等功能片段係指抗體重鏈或輕鏈多肽的保留作為片段來源之抗體的一些或全部結合活性的部分。功能片段(例如抗原結合片段)之非限制性實例包括單鏈Fv (scFv) (例如包括單特異性、雙特異性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab) 2片段、F(ab') 2片段、二硫鍵連接的Fv (dsFv)、Fd片段、Fv片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體。特定言之，本文所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如含有結合於抗原之抗原結合位點的抗原結合域或分子(例如抗體之一或多個CDR)。此類抗體片段可見於例如Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989)；Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers編, 1995)；Huston等人, 1993, Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun及Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515；及Day, Advanced Immunochemistry (第2版1990)。本文所提供之抗體可屬於免疫球蛋白分子之任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)或任何子類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。抗體可為促效抗體或拮抗抗體。
術語「單株抗體」係指自基本上均質的抗體群獲得的抗體，亦即，構成該群體之個別抗體為相同的，除了可以少量存在的可能天然存在之突變外。單株抗體為高度特異性的，其針對單一抗原位點。與可包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。
「抗原」為抗體可以選擇性結合的結構。目標抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些實施例中，目標抗原係多肽。在某些實施例中，抗原與細胞相關，例如存在於細胞(例如癌細胞)上或中。
「完整」抗體為包含抗原結合位點以及CL及至少重鏈恆定區CH1、CH2及CH3之抗體。恆定區可包括人類恆定區或其胺基酸序列變異體。在某些實施例中，完整抗體具有一或多種效應功能。
術語「抗原結合片段」、「抗原結合域」、「抗原結合區」及類似術語係指抗體中包含與抗原相互作用之胺基酸殘基且賦予結合劑其針對抗原(例如CDR)之特異性及親和力的部分。如本文所用，「抗原結合片段」包括「抗體片段」，其包含完整抗體之一部分，諸如完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括(但不限於) Fab、Fab'、F(ab') 2及Fv片段；雙功能抗體及二-雙功能抗體(參見例如Holliger等人, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6444-48；Lu等人, 2005, J. Biol. Chem. 280:19665-72；Hudson等人, 2003, Nat. Med. 9:129-34；WO 93/11161；及美國專利第5,837,242號及第6,492,123號)；單鏈抗體分子(參見例如美國專利第4,946,778號；第5,260,203號；第5,482,858號；及第5,476,786號)；雙可變域抗體(參見例如美國專利第7,612,181號)；單可變域抗體(sdAb) (參見例如Woolven等人, 1999, Immunogenetics 50: 98-101；及Streltsov等人, 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「結合(binds/binding)」係指分子之間的相互相用，包括例如形成複合物。相互作用可為例如非共價相互作用，包括氫鍵、離子鍵、疏水相互作用及/或凡得瓦爾相互作用。複合物亦可包括藉由共價或非共價鍵、相互作用或力保持在一起的兩個或更多個分子之結合。抗體上之單一抗原結合位點與目標分子之單一抗原決定基(諸如抗體)之間的總非共價相互作用力為抗體或功能片段針對該抗原決定基之親和力。結合分子相對於單價抗原之解離速率(k off)對結合速率(k on)的比率(k off/k on)為解離常數K D，該解離常數與親和力逆相關。K D值愈低，則抗體親和力愈高。K D值因抗體與抗原之不同複合物而變且視k on與k off而定。本文所提供之抗體的解離常數K D可使用本文所提供之任何方法或熟習此項技術者熟知之任何其他方法測定。一個結合位點處之親和力並不始終反映抗體與抗原之間的相互相用的真實強度。當含有多個重複抗原決定子之複合抗原(諸如多價抗體)與含有多個結合位點之抗體接觸時，抗體與抗原在一個位點處之相互相用將增加第二個位點處的反應機率。多價抗體與抗原之間的此類多重相互作用之強度稱為親合力。
結合本文所描述之抗體或其抗原結合片段，諸如「結合(bind to)」、「特異性結合(that specifically bind to)」之術語及類似術語在本文中亦可互換使用，且係指具有特異性結合抗原(諸如多肽)之抗原結合域的結合分子。結合至或特異性結合至抗原之抗體或抗原結合片段可具有與相關抗原的交叉反應性。在某些實施例中，結合或特異性結合抗原之抗體或抗原結合片段不具有與其他抗原之交叉反應性。結合至或特異性結合至抗原的抗體或抗原結合片段可藉由例如免疫分析、Octet ®、Biacore ®或熟習此項技術者已知之其他技術來鑑別。在一些實施例中，在抗體或抗原結合片段以比與任何交叉反應性抗原更高之親和力結合抗原時，如使用實驗技術(諸如放射免疫分析(RIA)及酶聯免疫吸附分析(ELISA))所測定，該抗體或抗原結合片段結合或特異性結合抗原。通常，特異性或選擇性反應將為背景訊號或雜訊的至少兩倍且可超過背景的10倍。關於結合特異性之論述，參見例如Fundamental Immunology 332-36 (Paul編, 第2版, 1989)。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段與「非目標」蛋白質結合之程度小於約結合分子或抗原結合域與其特定目標抗原之結合之10%，例如如藉由螢光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting；FACS)分析或RIA所測定。諸如「特異性結合(specific binding)」、「與……特異性結合(specifically binds to)」或「對……具有特異性(is specific for)」之術語意謂可量測地不同於非特異性相互作用之結合。特異性結合可例如藉由測定分子之結合、與對照分子之結合對比來量測，對照分子通常為結構類似、不具有結合活性的分子。例如，特異性結合可以藉由與類似於目標之對照分子的競爭來確定，例如過量的未標記目標。在此情況下，若經標記之目標與探針之結合受到過量的未標記目標之競爭性抑制，則指示特異性結合。結合至抗原之抗體或抗原結合片段包括能夠以足夠親和力結合抗原的抗體或抗原結合片段，使得結合分子適用作例如靶向抗原之診斷劑。在某些實施例中，結合至抗原的抗體或抗原結合片段具有小於或等於1000 nM、800 nM、500 nM、250 nM、100 nM、50 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM或0.1 nM的解離常數(K D)。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段結合至抗原之抗原決定基，該抗原決定基在來自不同物種之抗原間(例如在人類與食蟹獼猴物種之間)為保守的。
「結合親和力」通常指分子(例如結合蛋白，諸如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如，抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。結合分子X針對其結合搭配物Y之親和力一般可由解離常數(K D)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之彼等方法)來量測親和力。低親和力抗體一般緩慢結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體一般較快結合抗原且傾向於較長時間保持結合狀態。此項技術中已知多種量測結合親和力的方法，其中之任一者可用於本發明之目的。特定說明性實施例包括以下。在一個實施例中，「K D」或「K D值」可藉由此項技術中已知的分析法量測，例如藉由結合分析法。K D可用RIA量測，例如使用所關注抗體之Fab型式及其抗原進行(Chen等人, 1999, J. Mol Biol 293:865-81)。K D或K D值亦可藉由使用生物層干涉術(biolayer interferometry；BLI)或表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)分析，藉由Octet®，使用例如Octet®QK384系統，或藉由Biacore®，使用例如Biacore®TM-2000或Biacore®TM-3000來量測。「結合速率(on-rate/rate of association/association rate)」或「kon」亦可用上文所描述之相同生物層干涉術(BLI)或表面電漿子共振(SPR)技術，使用例如Octet®QK384、Biacore®TM-2000或Biacore®TM-3000系統來測定。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含「嵌合」序列，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之抗體中之對應序列一致或與其同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類別之抗體以及此類抗體之片段中之對應序列一致或與其同源，只要其呈現所需生物活性即可(參見美國專利第4,816,567號；及Morrison等人, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55)。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含作為嵌合抗體之非人類(例如鼠類)抗體「人類化」形式的一部分，該等嵌合抗體包括人類免疫球蛋白(例如受者抗體)，其中原生CDR殘基經來自非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之包含所需特異性、親和力及能力之相應CDR (例如供者抗體)的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之一或多個FR區殘基由相應的非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在受體抗體或供者抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。人類化抗體重鏈或輕鏈可包含實質上所有至少一或多種可變區，其中所有或實質上所有CDR對應於非人類免疫球蛋白之CDR且所有或實質上所有FR係人類免疫球蛋白序列之FR。在某些實施例中，人類化抗體將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人, 1986, Nature 321:522-25；Riechmann等人, 1988, Nature 332:323-29；Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96；Carter等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89；美國專利第6,800,738號；第6,719,971號；第6,639,055號；第6,407,213號；及第6,054,297號。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含「完全人類抗體」或「人類抗體」之部分，其中該等術語在本文中可互換使用且係指包含人類可變區及例如人類恆定區之抗體。在特定實施例中，該等術語係指包含人類來源之可變區及恆定區之抗體。在某些實施例中，「完全人類」抗體亦可涵蓋結合多肽且由核酸序列編碼之抗體，該等核酸序列為人類生殖系免疫球蛋白核酸序列之天然存在之體細胞變體。術語「完全人類抗體」包括含對應於如由Kabat等人所描述之人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體(參見Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, 美國衛生與人群服務部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH公開案第91-3242號)。「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列及/或已使用任何製備人類抗體之技術製得之抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。人類抗體可以使用此項技術中已知的各種技術產生，包括噬菌體呈現文庫(Hoogenboom及Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381；Marks等人, 1991, J. Mol. Biol. 222:581)及酵母呈現文庫(Chao等人, 2006, Nature Protocols 1: 755-68)。亦可利用以下文獻中所描述的方法於製備人類單株抗體：Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985)；Boerner等人, 1991, J. Immunol. 147(1):86-95；以及van Dijk及van de Winkel, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74。人類抗體可藉由向已經修飾以回應於抗原刺激而產生此類抗體，但其內源性基因座已失能之轉殖基因動物(例如小鼠)投與抗原來製備(參見例如Jakobovits, 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66；Brüggemann及Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58；及美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，關於XENOMOUSE TM技術)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生的人類抗體，亦參見例如Li等人, 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-62。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含「重組型人類抗體」之一部分，其中該片語包括藉由重組工具製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組型表現載體表現之抗體；自重組型、組合型人類抗體文庫分離之抗體；自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因及/或轉殖染色體動物(例如小鼠或牛)分離之抗體(參見例如Taylor, L. D.等人(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)或藉由任何其他將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之方式製備、表現、產生或分離之抗體。此類重組人類抗體可具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區(參見Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開號91-3242)。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體可經受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之動物轉殖基因時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列雖然衍生自且關於人類生殖系VH及VL序列，但該等胺基酸序列為可不活體內天然存在於人類抗體生殖系抗體庫內之序列。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含「單株抗體」之一部分，其中如本文所用，該術語係指自基本上均質抗體之群體獲得之抗體，例如除可能少量存在的可天然存在之突變以外，構成該群體之個別抗體為一致的，且各單株抗體典型地將識別抗原上之單一抗原決定基。在特定實施例中，如本文所用，「單株抗體」為由單一融合瘤或其他細胞產生之抗體。術語「單株」不限於任何用於製備抗體之特定方法。舉例而言，適用於本揭示案單株抗體可藉由首次由Kohler等人, 1975, Nature 256:495所描述之融合瘤方法製備，或可在細菌或真核動物或植物細胞中使用重組DNA方法製備(參見例如美國專利第4,816,567號)。「單株抗體」亦可使用例如Clackson等人, 1991, Nature 352:624-28及Marks等人, 1991, J. Mol. Biol., 222:581-97中所描述之技術，自噬菌體抗體文庫中分離。用於製備純系細胞株及由其表現之單株抗體的其他方法為此項技術中熟知的。參見例如Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編, 第5版. 2002)。
典型的4鏈抗體單元為雜四聚醣蛋白，其由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈構成。在IgG之情況下，該4鏈單元一般係約150,000道爾頓。各L鏈藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈視H鏈同型而藉由一或多個二硫鍵彼此連接。各H鏈及L鏈亦具有有規律地隔開之鏈內二硫橋鍵。各H鏈在N端具有可變域(VH)，接著為各α及γ鏈之三個恆定域(CH)以及μ及ε同型之四個CH域。各L鏈在N端具有可變域(VL)，繼之為位於其另一端的恆定域(CL)。將VL與VH比對，且將CL與重鏈之第一恆定域(CH1)比對。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界面。VH與VL配對在一起而形成單一抗原結合位點。關於不同類別之抗體的結構及特徵，參見例如Basic and Clinical Immunology 71 (Stites等人編, 第8版1994)；及Immunobiology (Janeway等人編, 第5版2001)。
術語「Fab」或「Fab區」係指與抗原結合之抗體區域。習知IgG通常包含兩個Fab區，各駐存於Y形IgG結構之兩個臂中之一者上。各Fab區典型地由重鏈及輕鏈中之每一者之一個可變區及一個恆定區構成。更特定言之，Fab區中之重鏈可變區及恆定區為VH及CH1區，且Fab區中之輕鏈可變區及恆定區為VL及CL區。Fab區中之VH、CH1、VL及CL可以各種方式排列以根據本發明賦予抗原結合能力。舉例而言，VH及CH1區可位於一個多肽上，且VL及CL區可位於各別多肽上，類似於習知IgG之Fab區域。可替代地，VH、CH1、VL及CL區可全部在同一個多肽上且以如以下章節中更詳細描述之不同次序定向。
術語「可變區」、「可變域」、「V區」或「V域」係指抗體之輕鏈或重鏈之一部分，其通常位於輕鏈或重鏈之胺基端且在重鏈中長度為約120至130個胺基酸且在輕鏈中長度為約100至110個胺基酸，且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。重鏈之可變區可稱為「VH」。輕鏈之可變區可稱為「VL」。術語「可變」係指可變區之某些區段在抗體中之序列方面廣泛不同之事實。V區介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性不均勻分佈於可變區之110個胺基酸跨距內。實情為，V區由以下組成：約15-30個胺基酸之弱可變(例如相對恆定)延伸部分(稱為構架區(FR))，該等延伸部分被較短的可變性更大的(例如極端可變性)區域(稱為「高變區」，各自長度為約9-12個胺基酸)分隔。重鏈及輕鏈之可變區各自包含基本上採用β片組態之四個FR，該等FR由三個高變區連接，該等高變區形成連接β片結構之環且在一些情況下形成β片結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FR與來自其他鏈之高變區緊密結合在一起，促進形成抗體之抗原結合位點(參見例如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版, 1991))。恆定區不直接涉及抗體與抗原之結合，但呈現多種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。可變區在不同抗體之間的序列方面廣泛不同。在特定實施例中，可變區係人類可變區。
術語「根據Kabat的可變區殘基編號」或「如Kabat中的胺基酸位置編號」及其變化形式，係指Kabat等人(同上)用於編譯抗體重鏈可變區或輕鏈可變區的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或CDR之縮短或向其中之插入的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括位於殘基52之後的單一胺基酸插入(殘基52a，根據Kabat)及位於殘基82之後的三個插入殘基(例如殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。Kabat編號系統一般在提及可變域中之殘基(約輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時使用(例如Kabat等人, 見上文)。通常在提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時使用「EU或Kabat編號系統」或「EU索引」(例如，Kabat等人之同前文獻中所報導之EU索引)。「如Kabat中之EU指數」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。已藉由例如AbM、Chothia、Contact、IMGT及AHon描述其他編號系統。
當關於抗體使用時，術語「重鏈」係指約50-70 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括具有約120至130個或更多個胺基酸之可變區，且羧基端部分包括恆定區。基於重鏈恆定區之胺基酸序列，恆定區可為五種不同類型中之一種(例如同型)，稱為alpha (α)、delta (δ)、epsilon (ε)、gamma (γ)及mu (µ)。不同重鏈之大小不同：α、δ及γ含有約450個胺基酸，而µ及ε含有約550個胺基酸。當與輕鏈組合時，此等不同類型之重鏈產生五種熟知類別(例如同型)之抗體，分別為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，包括IgG之四個子類，即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
當參考抗體使用時，術語「輕鏈」係指約25 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約100至約110個或更多個胺基酸之可變區，且羧基端部分包括恆定區。輕鏈之約長度係211至217個胺基酸。基於恆定域之胺基酸序列，存在兩種不同類型，稱為kappa (κ)或lambda (λ)。
如本文所用，術語「高變區」、「HVR」、「互補決定區」及「CDR」可互換地使用。「CDR」係指免疫球蛋白(Ig或抗體)VH β-片狀構架之非構架區內的三個高變區(H1、H2或H3)之一，或抗體VL β-片狀構架之非構架區內的三個高變區(L1、L2或L3)之一。因此，CDR為構架區序列內穿插之可變區序列。
CDR區已為熟習此項技術者熟知且已藉由熟知編號系統定義。舉例而言，Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且最常用(參見例如Kabat等人, 見上文)。Chothia實際上係指結構環之位置(參見例如Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17)。在使用Kabat編號規約進行編號時，Chothia CDR-H1環之末端在H32與H34之間變化，此視環之長度而定(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B；若既不存在35A，亦不存在35B，則環末端位於32；若僅存在35A，則環末端位於33；若35A與35B均存在，則環末端位於34)。AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用(參見例如Antibody Engineering第2卷(Kontermann及Dübel編, 第2版, 2010))。「接觸」高變區係基於可利用的複雜晶體結構之分析。已開發及廣泛採用之另一通用編號系統為ImMunoGeneTics (IMGT) Information System ®(Lafranc等人, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77)。IMGT為專用於人類及其他脊椎動物之免疫球蛋白(IG)、T細胞受體(TR)及主要組織相容複合物(MHC)的整合式資訊系統。本文中，依據胺基酸序列及輕鏈或重鏈內的位置提及CDR。由於免疫球蛋白可變域之結構內之CDR的「位置」在物種之間為保守的且存在於稱為環的結構中，因此使用根據結構特徵來比對可變結構域序列的編號系統容易鑑別CDR及構架殘基。此資訊可用於將來自一個物種之免疫球蛋白之CDR殘基移植及置換至通常來自人類抗體之受體構架中。Honegger及Plückthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70已開發出另一種編號系統(AHon)。編號系統(包括例如Kabat編號及IMGT獨特編號系統)之間的對應關係已為熟習此項技術者熟知(參見例如Kabat，同上；Chothia及Lesk，同上；Martin，同上；Lefranc等人，同上)。來自此等高變區或CDR中之每一者之殘基標示於下表1中。 表1
Kabat AbM Chothia 接觸 IMGT
CDR-L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 L27--L38
CDR-L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 L56--L65
CDR-L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 L105-L117
CDR-H1 H31--H35B H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B H27--H38
(Kabat編號)
CDR-H1 H31--H35 H26--H35 H26--H32 H30--H35
(Chothia編號)
CDR-H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58 H56--H65
CDR-H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101 H105-H117
既定CDR之邊界可視用於鑑別之方案而變化。因此，除非另外規定，否則術語既定抗體之「CDR」及「互補決定區」或其區域，諸如可變區，以及抗體之個別CDR (例如CDR-H1、CDR-H2)或其區域應理解為涵蓋如由上文所描述之已知方案中之任一者所定義之互補決定區。在一些情況下，指定用於鑑別一或多個特定CDR之流程，諸如藉由Kabat、Chothia或接觸方法所定義之CDR。在其他情況下，明示CDR的特定胺基酸序列。
高變區可以包含如下「延伸的高變區」：VL中的24-36或24-34 (L1)、46-56或50-56 (L2)，及89-97或89-96 (L3)；以及VH中的26-35或26-35A (H1)、50-65或49-65 (H2)及93-102、94-102或95-102 (H3)。
術語「恆定區」或「恆定域」係指輕鏈及重鏈之羧基端部分，其不直接涉及抗體與抗原之結合，但展現多種效應功能，諸如與Fc受體之相互相用。該術語係指免疫球蛋白分子的一部分，該部分包含的胺基酸序列比免疫球蛋白之含有抗原結合位點的其他部分(可變區)更保守。恆定區可含有重鏈之CH1、CH2及CH3區以及輕鏈之CL區。
術語「構架」或「FR」係指側接CDR之彼等可變區殘基。FR殘基存在於例如嵌合、人類化、人類、結構域抗體、雙功能抗體、線形抗體及雙特異性抗體中。FR殘基係除高變區殘基或CDR殘基以外的可變域殘基。
在本文中，術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括例如原生序列Fc區、重組型Fc區及變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。可移除Fc區之C端離胺酸(殘基447，根據EU編號系統)，例如在抗體之製備或純化期間，或藉由以重組方式工程改造編碼抗體之重鏈的核酸。因此，完整抗體之組合物可包含所有K447殘基均被移除之抗體群、K447殘基未移除之抗體群，以及含有具有K447殘基之抗體與不具有該殘基之抗體之混合物的抗體群。「功能Fc片段」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；下調細胞表面受體(例如B細胞受體)等。此類效應功能通常需要Fc區與結合區或結合域(例如抗體可變區或域)組合，且可使用熟習此項技術者已知之各種分析法評估。「變體Fc區」包含與原生序列Fc區相差至少一個胺基酸修飾(例如取代、添加或缺失)的胺基酸序列。在某些實施例中，變異型Fc區相較於原生序列Fc區或相較於親本多肽之Fc區，在原生序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中具有至少一個胺基酸取代，例如約一個至約十個胺基酸取代，或約一個至約五個胺基酸取代。本文中之變異型Fc區將較佳與原生序列Fc區及/或親本多肽之Fc區具有至少約80%同源性，且更佳與其具有至少約90%同源性，例如與其具有至少約95%同源性。
如本文所使用，「抗原決定基」係此項技術中之術語且係指結合分子(例如抗體)所能特異性結合之抗原的局部區域。抗原決定基可為線性抗原決定基或構形、非線性或不連續之抗原決定基。舉例而言，在多肽抗原之情況下，抗原決定基可為多肽之連續胺基酸(「線形」抗原決定基)，或抗原決定基可包含來自多肽之兩個或更多個非連續區的胺基酸(「構形」、「非線形」或「不連續」抗原決定基)。熟習此項技術者應瞭解，一般而言，線形抗原決定基可或可不依賴於二級、三級或四級結構。舉例而言，在一些實施例中，結合分子結合至一組胺基酸，不論其是否摺疊成天然三維蛋白質結構。在其他實施例中，結合分子需要構成抗原決定基之胺基酸殘基展現特定構形(例如彎曲、扭轉、轉角或摺疊)以識別及結合抗原決定基。
術語「多肽」及「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可以包含經修飾之胺基酸，且其可以間雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋已經天然修飾或藉由干預(例如二硫鍵形成、醣基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操縱或修飾)修飾之胺基酸聚合物。該定義內亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括(但不限於)非天然胺基酸)以及此項技術中已知之其他修飾之多肽。應理解，由於本發明之多肽可基於抗體或免疫球蛋白超家族之其他成員，因此在某些實施例中，「多肽」可以單鏈或作為兩條或更多條結合的鏈存在。
如本文所使用，術語「醫藥學上可接受」意謂由聯邦或州政府之監管機構批准或列於美國藥典(United States Pharmacopeia)、歐洲藥典(European Pharmacopeia)或其他公認藥典中用於動物，且更特定言之，用於人類。
「賦形劑」意謂醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、溶劑或囊封材料。賦形劑包括例如囊封材料或添加劑，諸如吸收加速劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、包衣劑、著色劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、保濕劑、潤滑劑、香料、防腐劑、推進劑、釋放劑、滅菌劑、甜味劑、增溶劑、潤濕劑及其混合物。術語「賦形劑」亦可指稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(Freunds' adjuvant)(完全或不完全)或媒劑。
在一個實施例中，各組分在以下意義上為「醫藥學上可接受的」：與醫藥調配物之其他成分相容且適合用於與人類及動物之組織或器官接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應、免疫原性或其他問題或併發症，與合理益處/風險比相匹配。參見例如Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第6版; Rowe等人編；The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009；Handbook of Pharmaceutical Additives, 第3版; Ash及Ash編; Gower Publishing Company: 2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 第2版; Gibson編; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑在所使用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑為水性pH緩衝溶液。
縮寫「MMAE」係指單甲基奧瑞他汀E。
除非上下文另外指示，否則連字符(-)表示與連至側接分子之連接點。
術語「化學治療劑」係指有效抑制腫瘤生長之所有化合物。化學治療劑之非限制性實例包括：烷基化劑，例如氮芥、伸乙亞胺化合物及磺酸烷基酯；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如抗微管蛋白劑，諸如長春花生物鹼、奧瑞他汀(auristatin)及鬼臼毒素(podophyllotoxin)之衍生物；細胞毒性抗生素；損傷或干擾DNA表現或複製之化合物，例如DNA小溝結合劑；及生長因子受體拮抗劑。另外，化學治療劑包括細胞毒素劑(如本文所定義)、抗體、生物分子及小分子。
如本文所用，術語「保守取代」係指胺基酸取代已為熟習此項技術者所知且通常不會改變所得分子之生物活性。熟習此項技術者認識到，一般而言，在多肽之非必需區域中之單胺基酸取代實質上不改變生物活性(參見例如Watson等人, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., 第224頁(第4版1987))。此類例示性取代較佳根據表2及表3中所闡述之彼等取代進行。舉例而言，此類變化包括異白胺酸(I)、纈胺酸(V)及白胺酸(L)中之任一個取代此等疏水性胺基酸中之任何其他胺基酸；天冬胺酸(D)取代麩胺酸(E)且反之亦然；麩醯胺酸(Q)取代天冬醯胺(N)且反之亦然；及絲胺酸(S)取代蘇胺酸(T)且反之亦然。視特定胺基酸之環境及其在蛋白質三維結構中之作用而定，其他取代亦可視為保守的。舉例而言，甘胺酸(G)與丙胺酸(A)時常為可互換的，且丙胺酸(A)與纈胺酸(V)亦可為可互換的。相對呈疏水性之甲硫胺酸(M)常常可與白胺酸及異白胺酸互換，且有時可與纈胺酸互換。離胺酸(K)與精胺酸(R)在胺基酸殘基之顯著特徵為其電荷之位置中時常為可互換的且該兩個胺基酸殘基之pK差異不顯著。在特定環境中，仍有其他變化可視為「保守的」 (參見例如本文中之表3；「Biochemistry」第2版Lubert Stryer編(Stanford University)之第13-15頁；Henikoff等人, PNAS 1992第89卷10915-10919；Lei等人, J Biol Chem 1995年5月19日; 270(20):11882-11886)。其他取代亦可容許且可憑經驗或根據已知之保守取代確定。 表2.胺基酸縮寫
單字母 三字母 全名
        
F Phe 苯丙胺酸
L Leu 白胺酸
S Ser 絲胺酸
Y Tyr 酪胺酸
C Cys 半胱胺酸
W Trp 色胺酸
P Pro 脯胺酸
H His 組胺酸
Q Gln 穀胺醯胺
R Arg 精胺酸
I Ile 異白胺酸
M Met 甲硫胺酸
T Thr 蘇胺酸
N Asn 天冬醯胺
K Lys 離胺酸
V Val 纈胺酸
A Ala 丙胺酸
D Asp 天冬胺酸
E Glu 麩胺酸
G Gly 甘胺酸
表3.胺基酸取代或相似性矩陣 改編自GCG軟體9.0 BLOSUM62胺基酸取代矩陣(區塊取代矩陣)。值愈高，則在相關天然蛋白質中發現取代之可能性愈大。
Figure 02_image017
術語「同源性」或「同源」欲意謂兩個多核苷酸之間或兩個多肽之間的序列相似性。相似性可藉由對出於比較目的而比對之各序列中的位置進行比較來判定。若兩種多肽序列之給定位置不一致，則該位置之相似性或保守性可藉由評估該位置之胺基酸的相似性(例如根據表3)來確定。各序列之間之相似性程度隨該等序列共有之相配或同源位置的數量而變化。比對兩個序列以判定其百分比序列相似性可使用此項技術中已知之軟體程式進行，諸如Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)中描述之軟體程式。較佳地，使用預設參數進行比對，其實例闡述如下。此項技術中熟知之可使用的一種比對程式為設定成預設參數之BLAST。特定言之，程式為BLASTN及BLASTP，其使用以下預設參數：遺傳密碼=標準；過濾器=無；股=兩條；截止值=60；期望值=10；矩陣=BLOSUM62；描述=50個序列；分選方式=高分；資料庫=非冗餘，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS轉換+ Swissprotein + SPupdate + PIR。此等程式之詳情可見於國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)。
指定胺基酸序列或核酸序列之術語「同源物」意指「同源物」之相應序列與指定胺基酸序列或核酸序列具有實質上的一致性或同源性。
測定兩個序列(例如胺基酸序列或核酸序列)之間的百分比一致性可使用數學算法來實現。用於比較兩個序列之數學算法的較佳非限制性實例為Karlin及Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268之算法，如Karlin及Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877中所修改。將此類算法併入Altschul等人, 1990, J. Mol. Biol. 215:403之NBLAST及XBLAST程式中。可利用NBLAST核苷酸程式參數集(例如對於分數=100而言，字長=12)進行BLAST核苷酸檢索，以獲得與本文所描述之核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜尋可利用XBLAST程式參數集執行，例如對於分數50，字長=3，以獲得與本文所描述之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為得到間隙式比對以達成比較目的，可如Altschul等人., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402中所描述利用間隙式BLAST。替代地，PSI BLAST可用於進行迭代檢索，其偵測分子間之遠距離關係(同上)。當利用BLAST、間隙式BLAST及PSI Blast程式時，可使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數(參見例如，全球資訊網上之國家生物技術資訊中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用於序列比較之數學演算法的另一個非限制實例為Myers及Miller, 1988, CABIOS 4:11 17之演算法。此類演算法併入ALIGN程式(2.0版)中，該ALIGN程式為GCG序列比對套裝軟體之一部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4。
兩個序列之間的一致性百分比可在允許有空隙或不允許有空隙的情況下，使用與上文所描述類似的技術來確定。在計算一致性百分比時，通常僅對精確匹配進行計數。
術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞表現活性、細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素、化學治療劑，及毒素，諸如小分子毒素或源自細菌、真菌、植物或動物之酶活性毒素，包括其片段及/或變異體。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)奧瑞他汀(例如奧瑞他汀E、奧瑞他汀F、MMAE及MMAF)、金黴素(auromycins)、類美登素(maytansinoids)、蓖麻毒素(ricin)、蓖麻毒素A鏈、康普瑞汀(combrestatin)、倍癌黴素(duocarmycins)、海兔毒素(dolastatins)、阿黴素(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、紫杉醇(taxols)、順鉑(cisplatin)、cc1065、溴化乙錠(ethidium bromide)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、放線菌素(actinomycin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、綠膿桿菌外毒素(PE) A、PE40、相思子毒素(abrin)、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴黴素(alpha-sarcin)、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(retstrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、麻瘋樹逆境蛋白(curicin)、巴豆毒素(crotin)、卡奇黴素(calicheamicin)、肥皂草抑制劑，及糖皮質激素及其他化學治療劑，以及放射性同位素，諸如At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212或Bi 213、P 32及Lu放射性同位素，包括Lu 177。抗體亦可與能夠將前藥轉化成其活性形式的抗癌前藥活化酶結合。
如本文所使用，術語「有效量」或「治療有效量」係指足以引起所需結果的本文所提供之結合分子(例如抗體)或醫藥組合物的量。
術語「個體」與「患者」可互換使用。如本文所用，在某些實施例中，個體為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如乳牛、豬、馬、貓、犬、大鼠等)或靈長類動物(例如猴及人類)。在特定實施例中，個體為人類。在一個實施例中，個體為哺乳動物，例如診斷患有病狀或病症的人類。在另一實施例中，個體為處於發展病狀或病症之風險下的哺乳動物，例如人類。
「投與(administer/administration)」係指將存在於體外的物質注射或另外物理遞送至患者體內之操作，諸如藉由經黏膜、皮內、靜脈內、肌肉內遞送，及/或本文所描述或此項技術中已知之任何其他物理遞送方法。
如本文所用，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指由投與一或多種療法產生的疾病或病狀之進展、嚴重程度及/或持續時間的降低或改善。治療可如下確定：評估與潛在病症相關之一或多種症狀是否已減少、緩解及/或緩和，從而觀測到患者之改善，儘管患者可能仍罹患該潛在病症。術語「治療」包括管理與改善疾病。術語「管理(manage/managing/management)」係指個體得自療法之有利效果，其未必導致疾病治癒。
術語「預防(prevent/preventing/prevention)」係指降低疾病、病症、病況或相關症狀(例如癌症)發作(或復發)之可能性。
術語「癌症」或「癌細胞」在本文中用於表示發現贅瘤之組織或細胞，其具有將其與正常組織或組織細胞區分開的特徵。此類特徵包括(但不限於)：退行發育程度、形狀之不規則性、細胞輪廓不清晰、細胞核尺寸、細胞核或細胞質結構的變化、其他表型變化、指示癌性或癌前狀態之細胞蛋白質的存在、有絲分裂數目增加，及能夠轉移。關於「癌症」之詞包括癌瘤、肉瘤、腫瘤、上皮瘤、白血病、淋巴瘤、息肉及硬癌、轉形、贅瘤及其類似者。
如本文所用，「局部晚期」癌症係指已自其開始處擴散至附近組織或淋巴結的癌症。
如本文所用，「轉移」癌症係指已自其開始處擴散至身體之不同部分的癌症。
術語「膀胱內投與」係指經由尿道導管之插入將治療劑直接滴注至膀胱中。
術語「停留時間」係指治療物質將保留於所治療個體之某些部分或器官(例如，膀胱)中的時間長度。
術語「約」及「約」意謂在既定值或範圍的20%以內、15%以內、10%以內、9%以內、8%以內、7%以內、6%以內、5%以內、4%以內、3%以內、2%以內、1%以內或更小。
除非上下文另有明確規定，否則如本發明及申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數形式。
應理解，當本文中用術語「包含」描述實施例時，亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」描述之其他類似實施例。亦應理解，當在本文中用片語「基本上由……組成」描述實施例時，亦提供用術語「由……組成」描述之其他類似的實施例。
如在諸如「A及/或B」之片語中所使用的術語「及/或」在本文中意欲包括A及B；A或B；A (單獨)；及B (單獨)。同樣，如「A、B及/或C」之片語中所使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一個：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
術語「變體」係指與所描述類型或規範展現不同的分子，諸如在具體描述蛋白質(例如 圖 1A中所示之191P4D12蛋白)之對應位置中具有一或多個不同胺基酸殘基的蛋白質。類似物為變異蛋白之一個實例。剪接同功型及單一核苷酸多型性(single nucleotides polymorphism；SNP)為變體之其他實例。
本發明之「191P4D12蛋白」及/或「191P4D12相關蛋白質」包括本文中特別標識之彼等蛋白質(參見 圖 1A)，以及遵循本文中概述或此項技術中易於得到的方法，無需過度實驗即可分離/產生及表徵的對偶基因變體、保守取代變體、類似物及同源物。組合不同191P4D12蛋白或其片段之部分的融合蛋白、以及191P4D12蛋白與異源多肽之融合蛋白亦包括在內。此類191P4D12蛋白統稱為191P4D12相關蛋白質、本發明之蛋白質或191P4D12。術語「191P4D12相關蛋白質」係指4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或超過25個胺基酸；或至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、330、335、339或更多個胺基酸之多肽片段或191P4D12蛋白序列。術語「191P4D12」可與連接素-4互換使用。 5.2 治療所選擇之患者之 非肌肉浸潤性膀胱癌 (NMIBC) 的方法
本文提供經由膀胱內投與結合191P4D12之抗體藥物結合物(ADC)治療人類個體之膀胱癌的方法。
在一個態樣中，本文提供治療人類個體之膀胱癌的方法，其包含向該個體膀胱內投與有效量之抗體藥物結合物(ADC)，其中該ADC包含與一或多個單甲基奧瑞他汀E (MMAE)單元結合的結合至191P4D12之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，膀胱癌為非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)。在一些實施例中，NMIBC已經組織學確認。在一些實施例中，該NMIBC為原位癌(CIS)。在一些實施例中，該NMIBC已經組織學確認且係原位癌(CIS)。在某些實施例中，該個體患有乳突狀疾病。在一些實施例中，該個體未患有乳突狀疾病。在一些實施例中，該NMIBC已經組織學確認，且其中該主要組織學組成部分(＞50%)為尿道上皮(移行細胞)癌。
在一些實施例中，經本文所提供之方法處理之該人類個體患有高風險卡介苗(BCG)無反應性疾病。在某些實施例中，高風險BCG無反應性疾病經定義為單獨的持久性或復發性CIS或在足夠的BCG療法完成12個月內伴有復發性Ta/T1 (非浸潤性乳突狀疾病/腫瘤侵入上皮下結締組織)疾病。在某些實施例中，足夠BCG療法定義為初始誘導過程之6次中之5次劑量加維持療法之3次劑量中之至少2次。在某些實施例中，足夠BCG療法定義為初始誘導過程之6次中之5次劑量加第二誘導過程之6次劑量中之至少2次。
在一些實施例中，經本文所提供之方法治療的人類個體不適合接受根治性膀胱切除術。在一些實施例中，經本文所提供之方法治療的人類個體拒絕經歷根治性膀胱切除術。
在一些實施例中，該個體之所有可見乳突狀Ta/T1腫瘤在該治療之前60天內完全切除。在一些實施例中，該個體具有殘留純CIS。在一些實施例中，該個體不具有殘留純CIS。
在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體具有令人滿意之膀胱功能且保持本文所提供之ADC即使使用術前用藥亦滴注最少1小時之能力。在一些實施例中，人類個體為至少18歲。在一些實施例中，人類個體所估計的預期壽命超過2年。
在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為0。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為1。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為2。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為2且該個體之腎小球濾過率(GFR)不低於50 mL/min且該個體不具有紐約心臟協會(NYHA) III級心臟衰竭。
在本文所提供之方法的其他實施例中，包括前述段落中的方法，可使用本文所提供之方法的人類個體為符合多種其他條件的人類個體。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之絕對嗜中性白血球計數(ANC)狀況不低於1500/μL。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之血紅蛋白(Hgb)狀況不低於10 g/dL。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之血小板計數狀況不低於100,000/μL。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體具有不超過1.5 ×正常上限(ULN)或不超過3 x ULN之血清膽紅素的狀況，對於患有吉爾伯氏病之個體。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之經計算之肌酸酐清除率(CrCl)狀況不低於30 mL/min。在一些實施例中，使用柯克勞夫-高爾特方法或腎病飲食改進(MDRD)等式來計算CrCl。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之GFR狀況不低於30 mL/min。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之ECOG體能狀態為2且GFR不低於50 mL/min。在一些實施例中，經本文所提供之方法處理的該人類個體之丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及天冬胺酸胺基轉移酶(AST)狀況不超過3 × ULN。在一些實施例中，除非個體正接受抗凝血劑療法，只要PT或aPTT在預期使用抗凝血劑之治療範圍內，否則經本文所提供之方法處理的該人類個體之國際標準化比值(INR)或凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血激酶時間(aPTT)或部分凝血激酶時間(PTT)不超過1.5 ULN。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體具有超過此段落中所描述之病狀。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體具有此段落中所描述之所有病況。
在本文所提供之方法之其他實施例中，包括前述段落之方法，可使用本文所提供之方法之人類個體為不具有某些病況之人類個體。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體不具有肌肉-浸潤性尿道上皮癌(亦即，T2、T3或T4疾病)或轉移性疾病之當前或先前病史。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體不具有結節或轉移性疾病，如在用ADC治療之前3個月內進行之電腦斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)上所指出。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體不具有伴隨性上尿路尿道上皮癌，如在用ADC治療之前3個月內進行之腹部/骨盆對比CT或MRI尿路造影上所指出。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體在用ADC治療之前6個月內不具有前列腺尿道之先前或伴隨的尿道上皮癌。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體在投與ADC之前不具有腫瘤相關之腎盂積水。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體在用本文所提供之方法治療之第一劑量的4週內尚未接受非系統性抗癌療法(例如，化學療法、生物療法、免疫療法、靶向療法、內分泌療法、研究性藥劑)或在開始用本文所提供之方法治療之前6週內尚未接受用於治療NMIBC之任何膀胱內療法。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體已在開始用本文所提供之方法治療之前14天與60天之間緊接在TURBT程序之後接受單次滴注之細胞毒性劑(例如，絲裂黴素C、小紅莓及吉西他濱)。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體不具有繼發於與先前NMIBC療法相關之不良事件(AE)的持續症狀(2級及更高)。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體尚未接收到針對膀胱用於治療尿道上皮癌之先前放射。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體不具有活動性感染，其中個體在開始用ADC治療之前14天內已用全身性(例如，經口或靜脈內)抗生素治療。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體耐受膀胱內給藥或膀胱內手術操作。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體在用本文所提供之方法治療之前3年內不具有惡性病病史，或不具有來自先前診斷之惡性病的殘留疾病之任何證據。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療之人類個體具有可忽略的癌轉移或死亡風險(例如，5年總存活期[OS] ≥90%)，諸如子宮頸之經充分處理CIS、非黑色素瘤皮膚癌、乳房之乳腺管CIS或I期子宮癌。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體在用本文所提供之方法治療之前至少1年具有以明確意圖治療(以手術方式或以放射療法治療)的前列腺癌病史(T2N0M0或更低，格里森分數≤7)，其限制條件為該個體視為無前列腺癌，且滿足以下準則：(1)經歷根除性前列腺切除術之個體在投與ADC之前必須具有不可偵測之前列腺特異性抗原(PSA) ＞1年，及(2)已發生輻射之個體必須具有PSA倍增時間＞1年(基於至少3個確定之值＞1個月間隔)及不滿足生物化學復發之菲尼克斯準則的總PSA值(亦即，最低點以上＜2.0 ng/mL)。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體先前未暴露於連接素-4靶向療法或含有單甲基奧瑞他汀E (MMAE)之藥劑。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不患有自體免疫性或發炎性皮膚病症。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不患有牛皮癬或異位性皮膚炎。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不具有持續的2級或更高的感官或運動神經病變。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不具有陽性B型肝炎表面抗原及/或抗B型肝炎核心抗體。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體具有B型肝炎之陰性聚合酶連鎖反應(PCR)分析且具有適當抗病毒預防。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不具有活動性C型肝炎感染或已知人類免疫缺乏病毒(HIV)感染。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不具有活動性肺結核。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不具有不可控之糖尿病。在一些實施例中，不可控之糖尿病經定義為具有血紅蛋白A1c (HbA1c) ≥8%或HbA1c 7%至＜8%之個體，伴隨相關糖尿病症狀(多尿症或煩渴症)。在一些實施例中，在第一劑量之ADC之前6個月內，用本文所提供之方法治療的人類個體未患有腦血管事件(例如，中風或暫時性局部缺血發作)、不穩定絞痛症、心肌梗塞或與III-IV級NYHA一致之心臟症狀。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不具有針對恩諾單抗維多汀或針對恩諾單抗維多汀藥物調配物中所含之任何賦形劑(例如，組胺酸、二水合海藻糖及/或聚山梨醇酯20)的嚴重(≥ 3級)超敏反應。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體不具有活動性角膜炎或角膜潰瘍。在一些實施例中，用本文所提供之方法治療的人類個體具有淺表性點狀角膜炎。
在某些實施例中，本文所提供之方法用於治療具有表現191P4D12 RNA、表現191P4D12蛋白或表現191P4D12 RNA及191P4D12蛋白兩者之非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)的個體。
在一些實施例中，癌症中之191P4D12 RNA表現係藉由聚核苷酸雜交、定序(評估序列之相對豐度)及/或PCR (包括RT-PCR)來確定。在一些實施例中，癌症中之191P4D12蛋白表現係藉由IHC、螢光活化細胞分選(FACS)分析及/或西方墨點法確定。在一些實施例中，藉由超過一種方法來確定癌症中之191P4D12蛋白表現。在一些實施例中，藉由兩種IHC方法來確定癌症中之191P4D12蛋白表現。
在一些實施例中，非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)在組織學上、在細胞學上或在組織學上及細胞學上證實。
在另一態樣中，本文提供治療人類個體之NMIBC的方法，其包含向該個體投與有效量之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物包含與一或多個單甲基奧瑞他汀E (MMAE)單元結合的結合至191P4D12之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區之該等CDR之該等胺基酸序列的互補決定區(CDR)；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區之該等CDR之該等胺基酸序列的CDR；且其中該個體具有如章節6中所提供之適合之特徵中之任一者。
在另一態樣中，本文提供一種預防或治療人類個體之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物包含與一或多個單甲基奧瑞他汀E (MMAE)單元結合的結合至191P4D12之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區之該等CDR之該等胺基酸序列的互補決定區(CDR)；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區之該等CDR之該等胺基酸序列的CDR；且其中該癌症具有如章節6中所提供之適合之標記物及/或特徵中之任一者。
在另一態樣中，本文提供一種預防或治療人類個體之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物包含與一或多個單甲基奧瑞他汀E (MMAE)單元結合的結合至191P4D12之抗體或其抗原結合片段，且其中該個體具有如章節6中所提供之適合之特徵中之任一者。在另一態樣中，本文提供一種預防或治療人類個體之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物包含與一或多個單甲基奧瑞他汀E (MMAE)單元結合的結合至191P4D12之抗體或其抗原結合片段，且其中該癌症具有如章節6中所提供之適合之標記物及/或特徵中之任一者。
在本文所提供之所有方法且特定言之前述段落中所描述之彼等方法中：可使用之ADC描述於章節3、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6及6中，用於治療之患者的選擇描述於本文中且例示於此章節(章節5.2)及章節3及6中，投與該治療劑之給藥方案及醫藥組合物描述於以下章節5.4、5.6及6中，可用於鑑別治療劑、選擇患者、確定此等方法之結果及/或以任何方式充當此等方法之準則的生物標記物描述於本文中且例示於此章節及章節6中，生物標記物可如章節5.7中所描述或此項技術中已知來確定，本文所提供之方法的治療結果描述於此章節(章節5.2)及章節3及6中，本文所提供之方法的額外治療結果可改進本文所描述之生物標記物，例如此章節(章節5.2)及章節3及6中所描述及例示之彼等，及包括ADC之組合療法，且其他治療劑描述於此章節及章節5.5中。因此，熟習此項技術者應瞭解，本文所提供之方法包括如上文及下文所描述之患者、治療劑、給藥方案、生物標記物及治療結果的所有排列及組合。 5.3 用於該等方法之抗體藥物結合物
在本文所提供之方法(包括章節5.2中所提供之方法)的各種實施例中，該等方法中所用的ADC包含或為本文及/或美國專利第8,637,642號所描述之抗191P4D12 ADC，該專利以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本文向該等方法提供的抗191P4D12抗體藥物結合物包含如本文(包括章節3、5.3.1，及6)所提供之結合至191P4D12的抗體或其抗原結合片段與如本文(包括章節3及6，及本章節(章節5.3))所提供之細胞毒性劑之一或多個單元(藥物單元，或D)的結合物，其他內容揭示於章節5.3.2及5.3.4中。在某些實施例中，細胞毒性劑(藥物單元，或D)可直接或經由如本文(包括章節3及6，及本章節(章節5.3))所提供的連接單元(LU)共價連接，其他內容揭示於章節5.3.3中。
在一些實施例中，抗體藥物結合物化合物具有下式： L - (LU-D) p (I)或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物；其中： L為抗體單元，例如抗連接素-4抗體或其抗原結合片段，例如如章節3、5.3.1及6所提供，且 (LU-D)為連接子單元-藥物單元部分，其中： LU-為連接單元，例如章節3及6及本章節(章節5.3)中所提供，其他內容揭示於章節5.3.3中，且 D為具有針對目標細胞之細胞抑制或細胞毒性活性的藥物單元，例如章節3及6及本章節(章節5.3)中所提供，其他內容揭示於章節5.3.2及5.3.4中；且 p為整數1至20，其他實例提供於章節3及6及本章節(章節5.3)中。
在一些實施例中，p的範圍為1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。在一些實施例中，p在以下之範圍內：2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。在一些實施例中，p的範圍為3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5或3至4。在一些實施例中，p為約1。在一些實施例中，p為約2。在一些實施例中，p為約3。在一些實施例中，p為約4。在一些實施例中，p為約3.8。在一些實施例中，p為約5。在一些實施例中，p為約6。在一些實施例中，p為約7。在一些實施例中，p為約8。在一些實施例中，p為約9。在一些實施例中，p為約10。在一些實施例中，p為約11。在一些實施例中，p為約12。在一些實施例中，p為約13。在一些實施例中，p為約14。在一些實施例中，p為約15。在一些實施例中，p為約16。在一些實施例中，p為約17。在一些實施例中，p為約18。在一些實施例中，p為約19。在一些實施例中，p為約20。
在一些實施例中，抗體藥物結合物化合物具有下式： L - (A a-W w-Y y-D) p (II)或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物，其中： L為抗體單元，例如抗連接素-4抗體或其抗原結合片段，例如如章節3、5.3.1及6所提供；且 -A a-W w-Y y-為連接子單元(LU)，其中： -A-為延伸子單元， a為0或1， 各-W-獨立地為胺基酸單元， w為0至12範圍內之整數， -Y-為自我分解型間隔單元， y為0、1或2； 各如例如章節3及6及本章節(章節5.3)所提供，其他內容揭示於章節5.3.3中； D為具有針對目標細胞之細胞抑制或細胞毒性活性的藥物單元，例如章節3及6及本章節(章節5.3)中所提供，其他內容揭示於章節5.3.2及5.3.4中；且 p為整數1至20，其他實例提供於章節3及6及本章節(章節5.3)中。
在一些實施例中，a係0或1，w係0或1，且y係0、1或2。在一些實施例中，a為0或1，w為0或1，且y為0或1。在一些實施例中，p的範圍為1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。在一些實施例中，p在以下之範圍內：2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。在一些實施例中，p的範圍為3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5或3至4。在一些實施例中，p為約1。在一些實施例中，p為約2。在一些實施例中，p為約3。在一些實施例中，p為約4。在一些實施例中，p為約3.8。在一些實施例中，p為約5。在一些實施例中，p為約6。在一些實施例中，p為約7。在一些實施例中，p為約8。在一些實施例中，p為約9。在一些實施例中，p為約10。在一些實施例中，p為約11。在一些實施例中，p為約12。在一些實施例中，p為約13。在一些實施例中，p為約14。在一些實施例中，p為約15。在一些實施例中，p為約16。在一些實施例中，p為約17。在一些實施例中，p為約18。在一些實施例中，p為約19。在一些實施例中，p為約20。在一些實施例中，當w不為零時，y為1或2。在一些實施例中，當w為1至12時，y為1或2。在一些實施例中，w為2至12且y為1或2。在一些實施例中，a為1且w及y為0。
在本文所提供之方法(包括章節5.2中所提供之方法)之一些具體實施例中，作為本文向該等方法提供之任一種ADC之一部分的細胞毒性劑包含MMAE、由MMAE組成或為MMAE。
對於包含複數種抗體或其抗原結合片段之組合物而言，藥物負載由p (藥物分子之平均數目/抗體單元)表示。藥物負載可在1至20個藥物(D)/抗體之範圍內。製備結合反應物時之每個抗體的平均藥物數目可藉由諸如質譜法、ELISA分析及HPLC之習知方式來表徵。亦可就p而言來判定抗體藥物結合物之定量分佈。在一些情況下，均質抗體藥物結合物(其中p為具有其他藥物負載之抗體藥物結合物的特定值)的分離、純化及表徵可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方式來達成。在某些例示性實施例中，p為2至8。
用於本文所提供之方法之ADC的其他實施例已描述於美國專利第8,637,642號及國際申請案第PCT/US2019/056214號(公開案第WO2020/117373號)，該兩者以其全文引用之方式併入本文中。
在本文(包括章節3、5.3及6及此章節(章節5.2)中)所提供之方法之一些實施例中，ADC為恩諾單抗維多汀。在本文(包括章節3、5.3及6及此章節(章節5.2))所提供之方法的某些實施例中，ADC為恩諾單抗維多汀之生物類似物。 5.3.1 抗 191P4D12 抗體或抗原結合片段
在一個實施例中，結合連接素-4相關蛋白之抗體或其抗原結合片段為特異性結合包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之連接素-4蛋白的抗體或抗原結合片段(參見 圖 1A) 。編碼191P4D12蛋白之對應cDNA具有SEQ ID NO:1之序列(參見 圖 1A)。
特異性結合包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之連接素-4蛋白的抗體包括可結合其他連接素-4相關蛋白的抗體。舉例而言，結合包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之連接素-4蛋白的抗體可結合連接素-4相關蛋白，諸如連接素-4變體以及其同源物或類似物。
在一些實施例中，本文提供之抗連接素-4抗體為單株抗體。
在一些實施例中，抗體包含含SEQ ID NO:4之胺基酸序列(SEQ ID NO:3之cDNA序列)的重鏈及/或含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列(SEQ ID NO:5之cDNA序列)的輕鏈，如 圖 1B及 圖 1C中所示。
在一些實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區之CDR的胺基酸序列之互補決定區(CDR) (其為介於SEQ ID NO: 7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第136個胺基酸(絲胺酸)範圍內之胺基酸序列)，且該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區之CDR的胺基酸序列之CDR (其為介於SEQ ID NO: 8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第130個胺基酸(精胺酸)範圍內之胺基酸序列)。在某些實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含含SEQ ID NO:22 (其為SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第136個胺基酸(絲胺酸)範圍內的胺基酸序列)中所闡述之重鏈可變區序列中之對應CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3；及輕鏈可變區，其包含含SEQ ID NO:23 (其為SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第130個胺基酸(精胺酸)範圍內的胺基酸序列)中所闡述之輕鏈可變區序列之對應CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在一些實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：含有互補決定區(CDR)的重鏈可變區，該等互補決定區由SEQ ID NO: 22中所示之重鏈可變區CDR的胺基酸序列(其為SEQ ID NO: 7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第136個胺基酸(絲胺酸)範圍內的胺基酸序列)組成；及含有CDR的輕鏈可變區，該等CDR由SEQ ID NO: 23中所示之輕鏈可變區CDR的胺基酸序列(其為SEQ ID NO: 8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第130個胺基酸(精胺酸)範圍內的胺基酸序列)組成。在某些實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO:22 (其為SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第136個胺基酸(絲胺酸)範圍內的胺基酸序列)中所闡述之重鏈可變區序列中之對應CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之胺基酸序列組成的互補決定區1 (CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO:23 (其為SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第130個胺基酸(精胺酸)範圍內的胺基酸序列)中所闡述之輕鏈可變區序列之對應CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之胺基酸序列組成的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8如 圖 1D及 1E中所示且列於下：
Figure 02_image019
Figure 02_image021
可根據熟知編號系統來測定CDR序列。如上文所描述，CDR區已為熟習此項技術者熟知且已由熟知編號系統定義。舉例而言，Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且最常用(參見例如Kabat等人, 見上文)。Chothia實際上係指結構環之位置(參見例如Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17)。在使用Kabat編號規約進行編號時，Chothia CDR-H1環之末端在H32與H34之間變化，此視環之長度而定(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B；若既不存在35A，亦不存在35B，則環末端位於32；若僅存在35A，則環末端位於33；若35A與35B均存在，則環末端位於34)。AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用(參見例如Antibody Engineering第2卷(Kontermann及Dübel編, 第2版, 2010))。「接觸」高變區係基於可利用的複雜晶體結構之分析。已開發及廣泛採用之另一通用編號系統為ImMunoGeneTics (IMGT) Information System ®(Lafranc等人, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77)。IMGT為專用於人類及其他脊椎動物之免疫球蛋白(IG)、T細胞受體(TR)及主要組織相容複合物(MHC)的整合式資訊系統。本文中，依據胺基酸序列及輕鏈或重鏈內的位置提及CDR。由於免疫球蛋白可變域之結構內之CDR的「位置」在物種之間為保守的且存在於稱為環的結構中，因此使用根據結構特徵來比對可變結構域序列的編號系統容易鑑別CDR及構架殘基。此資訊可用於將來自一個物種之免疫球蛋白之CDR殘基移植及置換至通常來自人類抗體之受體構架中。Honegger及Plückthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70已開發出另一種編號系統(AHon)。編號系統(包括例如Kabat編號及IMGT獨特編號系統)之間的對應關係已為熟習此項技術者熟知(參見例如Kabat，同上；Chothia及Lesk，同上；Martin，同上；Lefranc等人，同上)。來自此等高變區或CDR中之每一者的殘基標示於上表1中。
在一些實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含含根據Kabat編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含含根據Kabat編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR。
在一些實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含含根據AbM編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含含根據AbM編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR。
在其他實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含含根據Chothia編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含含根據Chothia編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR。
在其他實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含含根據Contact編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含含根據Contact編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR。
在又其他實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含含根據IMGT編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含含根據IMGT編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列的CDR。
在一些實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含由根據Kabat編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列組成的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含由根據Kabat編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列組成的CDR。
在一些實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：含有CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)的重鏈可變區，該等CDR由根據AbM編號之SEQ ID NO: 22中所示之重鏈可變區CDR的胺基酸序列組成；以及含有CDR的輕鏈可變區，該等CDR由根據AbM編號之SEQ ID NO: 23中所示之輕鏈可變區CDR的胺基酸序列組成。
在其他實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含由根據Chothia編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列組成的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含由根據Chothia編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列組成的CDR。
在其他實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含由根據Contact編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列組成的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含由根據Contact編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列組成的CDR。
在又其他實施例中，抗連接素-4抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含由根據IMGT編號之SEQ ID NO:22中所闡述之重鏈可變區之CDR之胺基酸序列組成的CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)；及輕鏈可變區，其包含由根據IMGT編號之SEQ ID NO:23中所闡述之輕鏈可變區之CDR之胺基酸序列組成的CDR。
如上文所描述，根據不同編號系統之CDR序列可容易測定，例如使用線上工具，諸如根據抗原受體編號及受體分類(Antigen receptor Numbering And Receptor ClassificatIon；ANARCI)提供之線上工具。舉例而言，如藉由ANARCI所測定，根據Kabat編號之SEQ ID NO:22內之重鏈CDR序列及SEQ ID NO:23內之輕鏈CDR序列列於下表4中。 表4
   SEQ ID NO:22之VH SEQ ID NO:23之VL
CDR1 SYNMN (SEQ ID NO:9) RASQGISGWLA (SEQ ID NO:12)
CDR2 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:10) AASTLQS (SEQ ID NO:13)
CDR3 AYYYGMDV (SEQ ID NO:11) QQANSFPPT (SEQ ID NO:14)
作為另一實例，如根據ANARCI所測定，根據IMGT編號的SEQ ID NO: 22內之重鏈CDR序列及SEQ ID NO: 23內之輕鏈CDR序列列於下表5中。 表5
   SEQ ID NO:22之VH SEQ ID NO:23之VL
CDR1 GFTFSSYN (SEQ ID NO:16) QGISGW (SEQ ID NO:19)
CDR2 ISSSSSTI (SEQ ID NO:17) AAS (SEQ ID NO:20)
CDR3 ARAYYYGMDV (SEQ ID NO:18) QQANSFPPT (SEQ ID NO:21)
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列；CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列；及CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列；CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列；及CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：CDR-H1，其由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；CDR-H2，其由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；CDR-H3，其由SEQ ID NO: 11之胺基酸序列組成；CDR-L1，其由SEQ ID NO: 12之胺基酸序列組成；CDR-L2，其由SEQ ID NO: 13之胺基酸序列組成；及CDR-L3，其由SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：CDR-H1，其由SEQ ID NO: 16之胺基酸序列組成；CDR-H2，其由SEQ ID NO: 17之胺基酸序列組成；CDR-H3，其由SEQ ID NO: 18之胺基酸序列組成；CDR-L1，其由SEQ ID NO: 19之胺基酸序列組成；CDR-L2，其由SEQ ID NO: 20之胺基酸序列組成；及CDR-L3，其由SEQ ID NO: 21之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含由SEQ ID NO: 22之胺基酸序列組成的重鏈可變區及由SEQ ID NO: 23之胺基酸序列組成的輕鏈可變區。
在一些實施例中，該抗體包括含範圍自SEQ ID NO: 7之第20位胺基酸(麩胺酸)至第466位胺基酸(離胺酸)之胺基酸序列的重鏈及含範圍自SEQ ID NO: 8之第23位胺基酸(天冬胺酸)至第236位胺基酸(半胱胺酸)之胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施例中，該抗體包含：由SEQ ID NO: 7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO: 8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內之胺基酸序列組成的輕鏈。
在一些實施例中，涵蓋本文所描述之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要最佳化抗體之結合親和力及/或其他生物特徵，包括(但不限於)特異性、熱穩定性、表現量、效應功能、糖基化、減小之免疫原性，或溶解性。因此，除本文所描述之抗體之外，預期可以製備抗體變異體。舉例而言，抗體變體可藉由將適當核苷酸變化引入至編碼DNA中及/或藉由合成所需抗體或多肽來製備。熟習此項技術者瞭解，胺基酸變化可以改變抗體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置或改變膜錨定特徵。
在一些實施例中，本文所提供之抗體經化學修飾，例如藉由使任何類型的分子共價連接至抗體。抗體衍生物可包括如下經化學修飾之抗體：例如糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/封端基團之衍生化、蛋白質裂解、與細胞配位體或其他蛋白質之連接等。許多化學修飾中之任一者可藉由包括(但不限於)以下之已知技術來進行：特異性化學裂解、乙醯化、調配、衣黴素之代謝合成等。另外，該抗體可含有一或多種非典型胺基酸。
變異可為編碼單域抗體或多肽之一或多個密碼子的取代、缺失或插入，與原始抗體或多肽相比，其引起胺基酸序列變化。胺基酸取代可為一個胺基酸被包含類似結構及/或化學特徵之另一胺基酸置換的結果，諸如白胺酸被絲胺酸置換，例如保守胺基酸置換。熟習此項技術者已知的標準技術可用於將突變引入編碼本文中提供之分子的核苷酸序列中，包括例如引起胺基酸取代的定點突變誘發及PCR介導突變誘發。插入或缺失視情況可在約1至5個胺基酸範圍內。在某些實施例中，相對於初始分子，取代、缺失或插入包括少於25個胺基酸取代、少於20個胺基酸取代、少於15個胺基酸取代、少於10個胺基酸取代、少於5個胺基酸取代、少於4個胺基酸取代、少於3個胺基酸取代或少於2個胺基酸取代。在特定實施例中，取代為在一或多個所預測之非必需胺基酸殘基處產生的保守性胺基酸取代。允許發生的變異可如下測定：在序列中系統地產生胺基酸插入、缺失或取代且測試所得變異體是否具有親本抗體所展現的活性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合體，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。
本發明包括藉由保守胺基酸取代產生之抗體。在保守胺基酸取代中，胺基酸殘基經包含具有類似電荷之側鏈的胺基酸殘基置換。如上文所描述，包含具有類似電荷之側鏈的胺基酸殘基家族在此項技術中已定義。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。或者，突變可沿著編碼序列之全部或一部分隨機引入，諸如藉由飽和突變誘發，且可根據生物活性篩選所得突變體以鑑別保持活性的突變體。在突變誘發之後，可表現所編碼蛋白質，且可測定蛋白質之活性，可進行保守性(例如在具有類似特徵及/或側鏈之胺基酸群組內)取代，以便維持或不顯著地改變特徵。
胺基酸可根據其側鏈特徵之相似性分組(參見例如Lehninger, Biochemistry 73-75 (第2版, 1975))：(1)非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M)；(2)不帶電荷的極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q)；(3)酸性：Asp (D)、Glu (E)；及(4)鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His (H)。或者，天然存在的殘基可以基於共同的側鏈特徵來分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性、親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
舉例而言，不參與維持抗體適當構形的任何半胱胺酸殘基亦可用例如另一胺基酸(諸如丙胺酸或絲胺酸)取代，以改良分子的氧化穩定性及防止異常交聯。
可以使用此項技術中已知之方法產生變異，諸如寡核苷酸介導(定點)突變誘發、丙胺酸掃描及PCR誘變。可對所選殖的DNA進行定點突變誘發(參見例如Carter, 1986, Biochem J. 237:1-7；及Zoller等人, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-500)、卡匣突變誘發(參見例如Wells等人, 1985, Gene 34:315-23)或其他已知技術，以產生抗-抗MSLN抗體變體DNA。
本發明之範疇內包括抗體的共價修飾.共價修飾包括使抗體之目標胺基酸殘基與有機衍生劑反應，該有機衍生劑能夠與抗體之所選側鏈或N端或C端殘基反應。其他修飾包括麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別去醯胺化而形成相應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基、脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基甲基化(參見例如Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983))、N端胺之乙醯化，及任何C端羧基之醯胺化。
本發明範疇內所包括之抗體之其他類型的共價修飾包括改變抗體或多肽之原生糖基化模式(參見例如Beck等人, 2008, Curr. Pharm. Biotechnol. 9:482-501；及Walsh, 2010, Drug Discov. Today 15:773-80)，及以例如以下文獻中所闡述之方式使抗體與多種非蛋白性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)之一連接：美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號。
在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 7所示之重鏈具有一定同源性或一致性的重鏈及與如SEQ ID NO: 8所示之輕鏈具有一定同源性或一致性的輕鏈。具有同源性或一致性之重鏈/輕鏈的此類實施例進一步提供如下。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 7中所示之重鏈具有超過70%同源性或一致性的重鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 7中所示之重鏈具有超過75%同源性或一致性的重鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 7中所示之重鏈具有超過80%同源性或一致性的重鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 7中所示之重鏈具有超過85%同源性或一致性的重鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 7中所示之重鏈具有超過90%同源性或一致性的重鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 7中所示之重鏈具有超過95%同源性或一致性的重鏈。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 7中所示之重鏈具有所提供之任一種同源性或一致性的重鏈，其中CDR (CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)與如SEQ ID NO: 7所示之重鏈中的CDR一致。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 8中所示之輕鏈具有超過70%同源性或一致性的輕鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 8中所示之輕鏈具有超過75%同源性或一致性的輕鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 8中所示之輕鏈具有超過80%同源性或一致性的輕鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 8中所示之輕鏈具有超過85%同源性或一致性的輕鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 8中所示之輕鏈具有超過90%同源性或一致性的輕鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 8中所示之輕鏈具有超過95%同源性或一致性的輕鏈。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 8所示之輕鏈具有所提供之任一種同源性或一致性的輕鏈，其中CDR (CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)與如SEQ ID NO: 8所示之輕鏈中的CDR一致。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含如此段落中所提供之任何同源輕鏈與任何同源重鏈的任何組合或排列。
在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 22中所示之重鏈可變區具有一定同源性或一致性的重鏈可變區及與如SEQ ID NO: 23中所示之輕鏈可變區具有一定同源性或一致性的輕鏈可變區。具有同源性或一致性之重鏈可變區及輕鏈可變區的此類實施例進一步提供如下。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區具有超過70%同源性或一致性的重鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區具有超過75%同源性或一致性的重鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區具有超過80%同源性或一致性的重鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區具有超過85%同源性或一致性的重鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區具有超過90%同源性或一致性的重鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 22中所闡述之重鏈可變區具有超過95%同源性或一致性的重鏈可變區。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 22所示之重鏈可變區具有所提供之任一種同源性或一致性的重鏈可變區，其中CDR (CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)與如SEQ ID NO: 22所示之重鏈可變區中的CDR一致。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區具有超過70%同源性或一致性的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區具有超過75%同源性或一致性的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區具有超過80%同源性或一致性的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區具有超過85%同源性或一致性的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區具有超過90%同源性或一致性的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 23中所闡述之輕鏈可變區具有超過95%同源性或一致性的輕鏈可變區。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與如SEQ ID NO: 23所示之輕鏈可變區具有所提供之任一種同源性或一致性的輕鏈可變區，其中CDR (CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)與如SEQ ID NO: 23所示之輕鏈可變區中的CDR一致。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含如此段落中所提供之任何同源輕鏈可變區與任何同源重鏈可變區的任何組合或排列。
在一些實施例中，本文所提供之抗連接素-4抗體包含以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)之融合瘤所產生的稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗體的重鏈及輕鏈CDR區，或包含胺基酸序列與Ha22-2(2,4)6.1之重鏈及輕鏈CDR區之胺基酸序列同源的重鏈及輕鏈CDR區，且其中抗體保持以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗連接素-4抗體的所需功能特徵。
在一些實施例中，本文所提供之抗連接素-4抗體包含以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗體的重鏈及輕鏈CDR區(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，或由與Ha22-2(2,4)6.1之重鏈及輕鏈CDR區之胺基酸序列同源的胺基酸序列組成的重鏈及輕鏈CDR區，且其中抗體保持以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗連接素-4抗體的所需功能特徵。
在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段包含人類化重鏈可變區及人類化輕鏈可變區，其中： (a)重鏈可變區包含CDR (CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)，該等CDR包含以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體中所示的重鏈可變區CDR胺基酸序列； (b)輕鏈可變區包含CDR (CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，該等CDR包含以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體中所示的輕鏈可變區CDR胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段包含人類化重鏈可變區及人類化輕鏈可變區，其中： (a)重鏈可變區包含CDR (CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)，該等CDR由以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體中所示的重鏈可變區CDR胺基酸序列組成； (b)輕鏈可變區包含CDR (CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，該等CDR由以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體中所示的輕鏈可變區CDR胺基酸序列組成。
在一些實施例中，本文所提供之抗連接素-4抗體包含以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗體的重鏈及輕鏈可變區，或包含胺基酸序列與Ha22-2(2,4)6.1之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列同源的重鏈及輕鏈可變區，且其中該等抗體保持本文所提供之抗連接素-4抗體的所需功能特徵。在一些實施例中，本文所提供之抗連接素-4抗體包含以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗體的重鏈及輕鏈可變區，或由與Ha22-2(2,4)6.1之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列同源之胺基酸序列組成的重鏈及輕鏈可變區，且其中該等抗體保持本文所提供之抗連接素-4抗體的所需功能特徵。可選擇恆定區之任何子類作為本發明抗體之恆定區。在一個實施例中，可使用人類IgG1恆定區作為重鏈恆定區且使用人類Igκ恆定區作為輕鏈恆定區。
在一些實施例中，本文所提供之抗連接素-4抗體包含以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗體的重鏈及輕鏈，或包含胺基酸序列與Ha22-2(2,4)6.1之重鏈及輕鏈之胺基酸序列同源的重鏈及輕鏈，且其中該等抗體保持本文所提供之抗連接素-4抗體的所需功能特徵。在一些實施例中，本文所提供之抗連接素-4抗體包含以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗體的重鏈及輕鏈，或由與Ha22-2(2,4)6.1之重鏈及輕鏈胺基酸序列同源之胺基酸序列組成的重鏈及輕鏈，且其中該等抗體保持本文所提供之抗連接素-4抗體的所需功能特徵。
在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： (a)該重鏈可變區包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的重鏈可變區胺基酸序列至少80%同源或一致的胺基酸序列；且 (b)該輕鏈可變區包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈可變區胺基酸序列至少80%同源或一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的重鏈可變區胺基酸序列具有一定同源性或一致性的重鏈可變區，及與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈可變區胺基酸序列具有一定同源性或一致性的輕鏈可變區。具有同源性或一致性之重鏈可變區及輕鏈可變區的此類實施例進一步提供如下。在一些實施例中，重鏈可變區包含與藉由寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)寄存編號：PTA-11267下之融合瘤產生之抗體的重鏈可變區胺基酸序列至少85%同源或一致的胺基酸序列。在其他實施例中，重鏈可變區包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的重鏈可變區胺基酸序列至少90%同源或一致的胺基酸序列。在又其他實施例中，重鏈可變區包含與藉由寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)寄存編號：PTA-11267下之融合瘤產生之抗體的重鏈可變區胺基酸序列至少95%同源或一致的胺基酸序列。在其他實施例中，重鏈可變區可與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的重鏈可變區胺基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或一致。在一些實施例中，輕鏈可變區包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈可變區胺基酸序列至少85%同源或一致的胺基酸序列。在其他實施例中，輕鏈可變區包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈可變區胺基酸序列至少90%同源或一致的胺基酸序列。在又其他實施例中，輕鏈可變區包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈可變區胺基酸序列至少95%同源或一致的胺基酸序列。在其他實施例中，輕鏈可變區可與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈可變區胺基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或一致。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含如此段落中所提供之任何同源輕鏈可變區與任何同源重鏈可變區的任何組合或排列。
在其他實施例中，本文提供之抗體或其抗原結合片段包含重鏈及輕鏈，其中： (a)該重鏈包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的重鏈胺基酸序列至少80%同源或一致的胺基酸序列；且 (b)該輕鏈包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈胺基酸序列至少80%同源或一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的重鏈胺基酸序列具有一定同源性或一致性的重鏈，及與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈胺基酸序列具有一定同源性或一致性的輕鏈。具有同源性或一致性之重鏈及輕鏈的此類實施例進一步提供如下。在一些實施例中，重鏈包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的重鏈胺基酸序列至少85%同源或一致的胺基酸序列。在其他實施例中，重鏈包含與藉由寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)寄存編號：PTA-11267下之融合瘤產生之抗體的重鏈胺基酸序列至少90%同源或一致的胺基酸序列。在又其他實施例中，重鏈包含與藉由以美國典型培養物保藏中心(ATCC)寄存編號：PTA-11267保藏之融合瘤產生之抗體的重鏈胺基酸序列至少95%同源或一致的胺基酸序列。在其他實施例中，重鏈可與以登錄號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的重鏈胺基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或一致。在一些實施例中，輕鏈包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈胺基酸序列至少85%同源或一致的胺基酸序列。在其他實施例中，輕鏈包含與藉由寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)寄存編號：PTA-11267下之融合瘤產生之抗體的輕鏈胺基酸序列至少90%同源或一致的胺基酸序列。在又其他實施例中，輕鏈包含與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈胺基酸序列至少95%同源或一致的胺基酸序列。在其他實施例中，輕鏈可與以寄存編號：PTA-11267寄存於美國菌種保藏中心(ATCC)之融合瘤所產生之抗體的輕鏈胺基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或一致。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段包含如此段落中所提供之任何同源輕鏈與任何同源重鏈的任何組合或排列。
在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12中之特定抗原決定基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之VC1域。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之VC1域，但不結合至C1C2域。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第1個至第147個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至位於191P4D12之第1個至第147個胺基酸殘基中的抗原決定基。在一些實施例中，本文提供之抗體或其抗原結合片段與191P4D12之第1個至第10個胺基酸殘基結合。在一些實施例中，本文提供之抗體或其抗原結合片段與191P4D12之第11個至第20個胺基酸殘基結合。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第21個至第30個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第31個至第40個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第41個至第50個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第51個至第60個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第61個至第70個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第71個至第80個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第81個至第90個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第91個至第100個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第101個至第110個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第111個至第120個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第121個至第130個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第131個至第140個胺基酸殘基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12之第141個至第147個胺基酸殘基。本文提供之抗體或其抗原結合片段之某些實施例之結合抗原決定基已在WO 2012/047724中所測定及描述，該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12中之抗原決定基，該等抗原決定基為人體中所觀測之191P4D12變異體之間共同的抗原決定基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12中的抗原決定基，該等抗原決定基為人體中所觀測到之191P4D12多態性之間共同的抗原決定基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12中的抗原決定基，該等抗原決定基為人類癌症中所觀測到之191P4D12多態性之間共同的抗原決定基。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12中的抗原決定基，從而結合、內化、破壞或調節191P4Dl2或191P4D12變異體的生物功能。在一些實施例中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段結合至191P4D12中的抗原決定基，從而破壞191P4D12與配位體、受質及結合搭配物之間的相互作用。
本文所提供的工程化抗體包括VH及/或VL內之構架殘基已修飾(例如為了改良抗體之特徵)的彼等抗體。通常，進行此類構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基「回復突變(backmutate)」成相應生殖系序列。更特定而言，已經歷體細胞突變之抗體可含有與衍生抗體之生殖系序列不同的構架殘基。此類殘基可藉由比較抗體構架序列與獲得抗體之生殖系序列來鑑別。為了使構架區序列恢復其生殖系組態，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發或PCR介導之突變誘發而「回復突變」成生殖系序列(例如白胺酸「回復突變」成甲硫胺酸)。此類「回復突變」抗體亦意欲由本發明所涵蓋。
另一類型之構架修飾涉及使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，以藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第2003/0153043號中。
除在構架或CDR區內達成修飾之外或作為其替代方式，可對本發明之抗體進行工程改造以將修飾納入Fc區內，從而典型地改變抗體的一或多種功能特徵，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合，及/或抗原依賴性細胞的細胞毒性。另外，本文所提供之抗191P4D12抗體可經化學修飾(例如一或多個化學部分可連接至抗體)或經修飾以改變其糖基化，以再次改變抗體之一或多種功能特徵。此等實施例中之每一者進一步詳細描述於下文中。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中的半胱胺酸殘基之數目改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。改變CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目，以例如促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或降低抗191P4D12抗體之穩定性。
在另一個實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短抗191P4D12抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區以使得抗體對葡萄球菌蛋白A (SpA)的結合相對於原生Fc鉸鏈域SpA結合減弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，抗191P4D12抗體經修飾以延長其生物半衰期。可進行多種方法。舉例而言，可如Ward之美國專利第6,277,375號中所描述，引入突變。可替代地，為了增加生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有獲自IgG之Fc區之CH2域之兩個環的救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所描述。
在又其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，選自特定胺基酸殘基之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體針對效應配體之親和力改變但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於例如Winter等人之美國專利第5,624,821號與第5,648,260號中。
抗191P4D12抗體與191P4D12相關蛋白之反應性可藉由多種熟知方式(包括西方墨點法、免疫沈澱、ELISA及FACS分析)，適當時使用191P4D12相關蛋白、191P4D12表現細胞或其提取物來確立。191P4D12抗體或其片段可用可偵測標記物加以標記或與第二分子結合。適合的可偵測標記物包括(但不限於)放射性同位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合劑或酶。另外，使用此項技術中通常已知之方法來產生對兩種或更多種191P4D12抗原決定基具有特異性之雙特異性抗體。亦可藉由此項技術中已知之交聯技術(例如Wolff等人, Cancer Res. 53: 2560-2565)來產生均二聚抗體。
在又另一個特定實施例中，本文所提供之抗191P4D12抗體為包含稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗體之重鏈及輕鏈的抗體。Ha22-2(2,4)6.1之重鏈由SEQ ID NO: 7之第20個殘基E至第466個殘基K範圍內的胺基酸序列組成；且Ha22-2(2,4)6.1之輕鏈由SEQ ID NO: 8序列之第23個殘基D至第236個殘基C範圍內的胺基酸序列組成。
2010年8月18日，將產生稱為Ha22-2(2,4)6.1之抗體的融合瘤送達(經由Federal Express)美國菌種保藏中心(ATCC)(P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108)，且指定寄存編號PTA-11267。
抗連接素-4抗體之額外實施例已描述於以下中：美國專利案第8,637,642號及國際申請案第PCT/US2019/056214號(公開案第WO2020/117373號)，該兩者以其全文引用之方式併入本文中。 5.3.2 細胞毒性劑 ( 藥物單元 )
由於本文提供之方法中使用的ADC包含與細胞毒性劑結合的抗體或其抗原結合片段，因此本發明進一步提供細胞毒性劑之各種實施例作為該等方法中使用之ADC的一部分。在本文所提供之方法(包括章節5.2中所提供之方法)之各種實施例中，作為本文向該等方法提供之任一種ADC之一部分的細胞毒性劑包含微管蛋白破裂劑、由微管蛋白破裂劑組成或為微管蛋白破裂劑。在一個實施例中，細胞毒性劑為微管蛋白破裂劑。在一些實施例中，微管蛋白破裂劑選自由以下組成之群：海兔毒素(dolastatin)、奧瑞他汀(auristatin)、哈米特林(hemiasterlin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、類美登素(maytansinoid)、艾瑞布林(eribulin)、秋水仙鹼(colchicine)、普羅布林(plocabulin)、福莫普辛(phomopsin)、埃坡黴素(epothilone)、念珠藻素(cryptophycin)及紫杉烷(taxane)。在一個具體實施例中，微管蛋白破裂劑為奧瑞他汀。在另一具體實施例中，奧瑞他汀為單甲基奧瑞他汀E (MMAE)、單甲基奧瑞他汀F (MMAF)、AFP或奧瑞他汀T。在又另一具體實施例中，奧瑞他汀為單甲基奧瑞他汀E (MMAE)。
在本文所提供之方法(包括章節5.2中所提供之方法)的各種實施例中，作為本文向該等方法提供之任一種ADC之一部分的細胞毒性劑包含選自以下的任何藥劑、由選自以下的任何藥劑組成或為選自以下的任何藥劑：美國專利第8,637,642號及國際申請案第PCT/US2019/056214號(公開案第WO2020/117373號)中所描述的細胞毒性劑，該兩者以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，奧瑞他汀為MMAE (其中波浪線指示與抗體藥物結合物之連接子的共價連接)。
Figure 02_image023
在一些實施例中，包含MMAE及連接子組分(本文中進一步描述)的一個例示性實施例具有以下結構(其中L表示抗體(例如抗連接素-4抗體或其抗原結合片段)且p在1至12範圍內)：
Figure 02_image025
在前一段落所描述之式的一些實施例中，p的範圍為1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p的範圍為2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。在前述段落中所描述之式之一些實施例中，p在以下之範圍內：3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5或3至4。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約1。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約2。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約3。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約4。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約3.8。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約5。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約6。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約7。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約8。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約9。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約10。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約11。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約12。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約13。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約14。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約15。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約16。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約17。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約18。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約19。在前一段落所描述之式的一些實施例中，p為約20。
典型地，基於肽之藥物單元可藉由在兩個或更多個胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。此類肽鍵可例如根據肽化學領域中熟知的液相合成方法(參見E. Schröder及K. Lübke, 「The Peptides」, 第1卷, 第76-136頁, 1965, Academic Press)製備。奧瑞他汀/海兔毒素藥物單元可根據以下文獻之方法製備：US 5635483；US 5780588；Pettit等人(1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465；Pettit等人(1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G. R.等人, Synthesis, 1996, 719-725；Pettit等人(1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863；及Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784。
細胞毒性劑之額外實施例已描述於以下中：美國專利案第8,637,642號及國際申請案第PCT/US2019/056214號(公開案第WO2020/117373號)，該兩者以其全文引用之方式併入本文中。 5.3.3 連接子
典型地，抗體藥物結合物包含介於藥物單元(例如MMAE)與抗體單元(例如抗191P4D12抗體或其抗原結合片段)之間的連接單元。在一些實施例中，連接子在胞內條件下可裂解，使得連接子在胞內環境中裂解而自抗體釋放藥物單元。在又其他實施例中，連接子單元不可裂解且(例如)藉由抗體降解來釋放藥物。在一些實施例中，連接子為可藉由胞內環境(例如，溶酶體或核內體或胞膜窖內)中存在之裂解劑裂解的。連接子可為例如可由細胞內肽酶或蛋白酶(包括(但不限於)溶酶體或內體蛋白酶)裂解之肽基連接子。在一些實施例中，肽基連接子為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長。在其他實施例中，可裂解連接子為pH敏感的，亦即在某些pH值下對水解敏感。通常，pH敏感性連接子可在酸性條件下水解。例如，可使用在溶酶體中可水解之酸不穩定連接子(例如，腙、半卡巴腙、硫半卡巴肼、順式烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或類似者)。在又其他實施例中，連接子在還原條件下可裂解(例如二硫化物連接子)。各種二硫化物連接子係此項技術中已知的，包括例如可使用N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基硫基乙酸酯(SATA)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)及N-琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯(SMPT)、SPDB及SMPT形成之連接子。
「連接單元」(LU)為可用於將藥物單元與抗體單元連接以形成抗體藥物結合物之雙官能化合物。在一些實施例中，連接單元具有下式： -A a-W w-Y y- 其中：-A-為延伸單元， a為0或1， 各-W-獨立地為胺基酸單元， w為0至12範圍內之整數， -Y-為自我分解型間隔子單元，且 y係0、1或2。
在一些實施例中，a係0或1，w係0或1，且y係0、1或2。在一些實施例中，a為0或1，w為0或1，且y為0或1。在一些實施例中，當w為1至12時，y為1或2。在一些實施例中，w為2至12且y為1或2。在一些實施例中，a為1且w及y為0。連接子以及延伸子單元、胺基酸單元與間隔子單元中之每一者已描述於美國專利第8,637,642號及國際申請案第PCT/US2019/056214號(公開案第WO2020/117373號)中，該兩者以全文引用之方式併入本文中。
抗體-藥物結合物之實施例可包括：
Figure 02_image027
其中w及y各自為0、1或2；以及
Figure 02_image029
其中w及y各自為0，
Figure 02_image031
5.3.4 藥物負載
藥物負載由p表示且為分子中每個抗體之藥物單元平均數目。藥物負載可在每個抗體1至20個藥物單元(D)範圍內。本文所提供之ADC包括與多個(例如1至20個)藥物單元結合的抗體或抗原結合片段之集合。在由結合反應製備ADC時，平均藥物單元數目/抗體可藉由諸如質譜分析及ELISA分析之習知手段表徵。亦可根據p來確定ADC之定量分佈。在一些情況下，其中p為特定值的均質ADC自具有其他藥物負載之ADC之分離、純化及表徵可藉由諸如電泳之手段來達成。
在某些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載在1至20個之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至18之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至15之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至12之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至10之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至9之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至8之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至7之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至6之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至5之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至4之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在1至3之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在2至12之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在2至10之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在2至9之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在2至8之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在2至7之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在2至6之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在2至5之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在2至4之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在3至12之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在3至10之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在3至9之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在3至8之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在3至7之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在3至6之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在3至5之範圍內。在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在3至4之範圍內。
在某些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在以下之範圍內：1至約8；約2至約6；約3至約5；約3至約4；約3.1至約3.9；約3.2至約3.8；約3.2至約3.7；約3.2至約3.6；約3.3至約3.8；或約3.3至約3.7。
在某些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12或更多。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8或約3.9。
在一些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在以下之範圍內：2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14或2至13。在一些實施例中，本文提供之ADC之藥物負載在以下之範圍內：3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14或3至13。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約1。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約2。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約3。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約4。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約3.8。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約5。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約6。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約7。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約8。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約9。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約10。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約11。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約12。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約13。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約14。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約15。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約16。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約17。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約18。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約19。在一些實施例中，本文所提供之ADC的藥物負載為約20。
在某些實施例中，在結合反應期間，使少於理論最大值之藥物單元與抗體結合。抗體可含有例如與藥物-連接子中間物或連接子試劑不會反應的離胺酸殘基。一般而言，抗體不含有可與藥物單元連接之許多游離的反應性半胱胺酸硫醇基；實際上，抗體中之大部分半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋鍵形式存在。在某些實施例中，抗體可用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑在部分或完全還原條件下還原，產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中，抗體經歷變性條件，以顯出反應性親核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。在一些實施例中，連接單元或藥物單元經由抗體單元上之離胺酸殘基來結合。在一些實施例中，連接單元或藥物單元經由抗體單元上之半胱胺酸殘基來結合。
在一些實施例中，與連接單元或藥物單元連接之胺基酸存在於抗體或其抗原結合片段之重鏈中。在一些實施例中，與連接單元或藥物單元連接之胺基酸存在於抗體或其抗原結合片段之輕鏈中。在一些實施例中，與連接單元或藥物單元連接之胺基酸存在於抗體或其抗原結合片段之鉸鏈區中。在一些實施例中，與連接單元或藥物單元連接之胺基酸存在於抗體或其抗原結合片段之Fc區中。在其他實施例中，與連接子單元或藥物單元連接之胺基酸係在抗體或其抗原結合片段之恆定區(例如重鏈之CH1、CH2或CH3，或輕鏈之CH1)中。在又其他實施例中，與連接單元或藥物單元連接之胺基酸存在於抗體或其抗原結合片段之VH構架區中。在又其他實施例中，與連接單元或藥物單元連接之胺基酸存在於抗體或其抗原結合片段之VL構架區中。
ADC之負載(藥物/抗體比率)可以不同方式控制，例如：(i)限制藥物-連接子中間物或連接子試劑相對於抗體之莫耳濃度過量；(ii)限制結合反應時間或溫度；(iii)用於半胱胺酸硫醇修飾之部分或限制性還原條件；(iv)藉由重組技術對抗體之胺基酸序列進行工程改造，使得半胱胺酸殘基之數目及位置經修改以控制連接子-藥物連接之數目及/或位置(諸如本文及WO2006/034488 (以全文引用的方式併入本文中)所揭示而製備之thioMab或thioFab)。
應瞭解，若超過一個親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應，隨後與藥物單元試劑反應，則所得產物為ADC化合物的混合物，其中存在一或多個連接至抗體單元之藥物單元的分佈。混合物中每個抗體的藥物平均數目可藉由對抗體具有特異性且對藥物具有特異性之雙重ELISA抗體分析來計算。個別ADC分子可藉由質譜法在混合物中鑑別出來且藉由HPLC (例如疏水相互作用層析)來分離(參見例如Hamblett, K.J.等人「Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」, 摘要編號624, American Association for Cancer Research, 2004年年度會議, 2004年3月27-31日,  AACR會議論文, 第45卷, 2004年3月；Alley, S.C.等人「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」, 摘要編號627, 美國癌症研究學會(American Association for Cancer Research), 2004年年度會議, 2004年3月27-31日, AACR會議論文, 第45卷, 2004年3月)。在某些實施例中，具有單一負載值之均質ADC可藉由電泳或層析自結合混合物分離。
用於製備、篩選及表徵抗體藥物結合物方法係一般熟習此項技術者已知的，例如美國專利案第8,637,642號中所描述，該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，用於本文所提供之方法的抗體藥物結合物係AGS-22M6E，其係根據美國專利案第8,637,642號中所描述之方法製備且具有下式：
Figure 02_image033
其中L係Ha22-2(2,4)6.1，且p係1至20。
在一些實施例中，p範圍為1至20、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。在一些實施例中，p在以下之範圍內：2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。在其他實施例中，p為約1。在其他實施例中，p為約2。在其他實施例中，p為約3。在其他實施例中，p為約4。在其他實施例中，p為約5。在其他實施例中，p為約6。在其他實施例中，p為約7。在其他實施例中，p為約8。在其他實施例中，p為約9。在其他實施例中，p為約10。在一些實施例中，p為約3.1。在一些實施例中，p為約3.2。在一些實施例中，p為約3.3。在一些實施例中，p為約3.4。在一些實施例中，p為約3.5。在其他實施例中，p為約3.6。在一些實施例中，p為約3.7。在一些實施例中，p為約3.8。在一些實施例中，p為約3.9。在一些實施例中，p為約4.0。在一些實施例中，p為約4.1。在一些實施例中，p為約4.2。在一些實施例中，p為約4.3。在一些實施例中，p為約4.4。在一些實施例中，p為約4.5。在其他實施例中，p為約4.6。在一些實施例中，p為約4.7。在一些實施例中，p為約4.8。在一些實施例中，p為約4.9。在一些實施例中，p為約5.0。
在一些實施例中，本文所提供之方法中使用的ADC為恩諾單抗維多汀。恩諾單抗維多汀為一種ADC，其包含經由蛋白酶可裂解連接子與微管破壞劑(MMAE)結合的完全人類免疫球蛋白G1κ (IgG1 Κ)抗體(Challita-Eid PM等人, Cancer Res. 2016;76(10):3003-13)。恩諾單抗維多汀如下誘導抗腫瘤活性：結合至細胞表面上之191P4D12蛋白，引起ADC-191P4D12複合物內化，接著運輸至溶酶體隔室，在該隔室中經由蛋白水解裂解連接子而釋放MMAE。細胞內釋放MMAE隨後干擾微管蛋白聚合作用，導致G2/M期細胞週期停滯及細胞凋亡性細胞死亡(Francisco JA等人, Blood. 2003 Aug 15;102(4):1458-65)。
如上文及美國專利第8,637,642號中所描述，AGS-22M6E為來源於鼠類融合瘤細胞株之ADC。恩諾單抗維多汀為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株來源的AGS-22M6E ADC等效物且為用於人類療法之例示性產品。恩諾單抗維多汀具有與AGS-22M6E相同的胺基酸序列、連接子及細胞毒性藥物。恩諾單抗維多汀與AGS-22M6E之間的可比較性係經由深入分析及生物表徵研究，諸如與191P4D12之結合親和力、活體外細胞毒性及活體內抗腫瘤活性確定。
在一個實施例中，本文所提供之ADC為恩諾單抗維多汀，亦稱為EV、PADCEV、AGS-22M6E、AGS-22C3E及AGS-22CE。恩諾單抗維多汀包括抗191P4D12抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含含SEQ ID NO:7之胺基酸殘基20至胺基酸殘基466的重鏈及含SEQ ID NO:8之胺基酸殘基23至胺基酸殘基236的輕鏈。
恩諾單抗維多汀為針對連接素-4之抗體-藥物結合物(ADC)，其由經由蛋白酶可裂解之順丁烯二醯亞胺基己醯基纈胺酸-瓜胺酸(vc)連接子(SGD-1006)與小分子微管破裂劑單甲基奧瑞他汀E (MMAE)結合的完全人類抗連接素-4 IgG1κ單株抗體(AGS-22C3)構成。結合發生在包含抗體之鏈間二硫鍵的半胱胺酸殘基上，從而產生藥物:抗體比率為約3.8:1的產物。分子量為約152 kDa。
恩諾單抗維多汀具有以下結構式：
Figure 02_image035
約4個MMAE分子與每個抗體分子連接。藉由化學結合抗體及小分子組分，產生恩諾單抗維多汀。抗體由哺乳動物(中國倉鼠卵巢)細胞產生，且小分子組分藉由化學合成產生。
恩諾單抗維多汀注射劑係以無菌、不含防腐劑的白色至灰白色凍乾粉末形式提供於單次劑量小瓶中供靜脈內使用。供應呈20 mg/小瓶及30 mg/小瓶形式之恩諾單抗維多汀，且需要用USP注射用無菌水(分別2.3 mL及3.3 mL)復原，產生最終濃度為10 mg/mL的透明至略微乳白色、無色至略微黃色的溶液。復原之後，各小瓶允許抽取2 mL (20 mg)及3 mL (30 mg)。每一mL之復原溶液含有10 mg恩諾單抗維多汀、組胺酸(1.4 mg)、單水合組胺酸鹽酸鹽(2.31 mg)、聚山梨醇酯20 (0.2 mg)及二水合海藻糖(55 mg)，pH為6.0。 5.4 醫藥組合物
在本文所提供之方法的某些實施例中，該等方法中使用之ADC係以「醫藥組合物」形式提供。此類醫藥組合物包括本文所提供之抗體藥物結合物，及醫藥學上可接受或生理學上可接受之一或多種賦形劑。在某些實施例中，抗體藥物結合物與一或多種其他藥劑組合提供或分開提供。亦提供一種組合物，其包含一或多種此類其他藥劑及醫藥學上可接受或生理學上可接受之一或多種賦形劑。在特定實施例中，抗體藥物結合物及其他藥劑以治療上可接受的量存在。可根據本文提供之方法及用途來使用醫藥組合物。因此，舉例而言，可向個體離體或活體內投與醫藥組合物，以便實施本文提供之治療方法及用途。本文所提供之醫藥組合物可經調配以與預期方法或投與途徑相容；例示性投與途徑在本文中闡述。
在一些實施例中，提供調節癌症或腫瘤之抗體藥物結合物的醫藥組合物。
在本文所提供之方法的某些實施例中，包含ADC之醫藥組合物可進一步包含本文所揭示或熟習此項技術者已知之其他治療活性劑或化合物，該等其他治療活性劑或化合物可用於治療或預防如本文所闡述之各種疾病及病症(例如癌症)。如上文所描述，其他治療活性劑或化合物可存在於各別的醫藥組合物中。
醫藥組合物典型地包含治療有效量之本文所提供的至少一種抗體藥物結合物及醫藥學上可接受之一或多種調配劑。在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含本文所描述之一或多種其他藥劑。
在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之本文所提供的抗體藥物結合物。在某些實施例中，醫藥組合物包含醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中的抗體藥物結合物係選自上述章節5.3中所描述的抗體藥物結合物。
在某些實施例中，醫藥組合物包含濃度為0.1-100 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為1至20 mg/mL之抗體藥物結合物。在其他實施例中，醫藥組合物包含濃度為5至15 mg/mL之抗體藥物結合物。在其他實施例中，醫藥組合物包含濃度為8至12 mg/mL之抗體藥物結合物。在其他實施例中，醫藥組合物包含濃度為9至11 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約9.5 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約9.6 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約9.7 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約9.8 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約9.9 mg/mL之抗體藥物結合物。在又其他實施例中，醫藥組合物包含濃度為約10 mg/mL之抗體藥物結合物。在又其他實施例中，醫藥組合物包含濃度為約10.1 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約10.2 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約10.3 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約10.3 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約10.4 mg/mL之抗體藥物結合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為約10.5 mg/mL之抗體藥物結合物。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含
L-組胺酸、TWEEN-20及二水合海藻糖或蔗糖中的至少一者。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物進一步包含鹽酸(HCl)或丁二酸。
在一些實施例中，適用於本文所提供之醫藥組合物中的L-組胺酸濃度在5與50 mM之間的範圍內。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物中之L-組胺酸之濃度在10與40 mM之間的範圍內。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物中之L-組胺酸之濃度在15至35 mM的範圍之間。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中的L-組胺酸濃度在15與30 mM之間的範圍內。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物中之L-組胺酸之濃度在15至25 mM的範圍之間。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物中之L-組胺酸之濃度在15至35 mM的範圍之間。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物中之L-組胺酸之濃度為約16 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約17 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約18 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約19 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約20 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約21 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約22 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約23 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約24 mM。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物中L-組胺酸之濃度係約25 mM。
在一些實施例中，適用於本文提供之醫藥組合物中之TWEEN-20之濃度在0.001至0.1% (v/v)之範圍內。在另一個實施例中，TWEEN-20之濃度在0.0025至0.075% (v/v)之範圍內。在一個實施例中，TWEEN-20之濃度在0.005至0.05% (v/v)之範圍內。在另一個實施例中，TWEEN-20之濃度在0.0075至0.025% (v/v)之範圍內。在另一實施例中，TWEEN-20之濃度在0.0075至0.05% (v/v)之範圍內。在另一個實施例中，TWEEN-20之濃度在0.01至0.03% (v/v)之範圍內。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度係約0.01% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.015% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.016% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.017% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.018% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.019% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.02% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.021% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.022% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.023% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.024% (v/v)。在一個特定實施例中，TWEEN-20之濃度為約0.025% (v/v)。
在一個實施例中，適用於本文提供之醫藥組合物中之二水合海藻糖之濃度在1%至20% (w/v)的範圍之間。在另一個實施例中，二水合海藻糖之濃度在2%至15% (w/v)之範圍內。在一個實施例中，二水合海藻糖之濃度在3%至10% (w/v)之範圍內。在另一個實施例中，二水合海藻糖之濃度在4%至9% (w/v)之範圍內。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度在4%至8% (w/v)之範圍內。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度在4%至7% (w/v)之範圍內。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度在4%至6% (w/v)之範圍內。在另一個實施例中，二水合海藻糖之濃度在4.5%至6% (w/v)之範圍內。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約4.6% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約4.7% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約4.8% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約4.9% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.0% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.1% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.2% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.3% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.4% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.5% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.6% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.7% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.8% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約5.9% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約6.0% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約6.1% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約6.2% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約6.3% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約6.4% (w/v)。在另一實施例中，二水合海藻糖之濃度為約6.5% (w/v)。
在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為50至300 mM。在其他實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為75至250 mM。在一些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度係100至200 mM。在其他實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為130至150 mM。在一些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為135至150 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約135 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約136 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約137 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約138 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約139 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約140 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約141 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約142 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約143 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約144 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約145 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約146 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約150 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約151 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約151 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約152 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約153 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約154 mM。在某些實施例中，二水合海藻糖之莫耳濃度為約155 mM。
在一個實施例中，適用於本文所提供之醫藥組合物中的蔗糖濃度在1%與20% (w/v)之間的範圍內。在另一個實施例中，蔗糖之濃度在2%至15% (w/v)之範圍內。在一個實施例中，蔗糖之濃度在3%至10% (w/v)之範圍內。在另一個實施例中，蔗糖之濃度在4%及9% (w/v)之範圍內。在另一個實施例中，蔗糖之濃度在4%及8% (w/v)之範圍內。在另一個實施例中，蔗糖之濃度在4%及7% (w/v)之範圍內。在另一個實施例中，蔗糖之濃度在4%及6% (w/v)之範圍內。在另一個實施例中，蔗糖之濃度在4.5%及6% (w/v)之範圍內。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約4.6% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約4.7% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約4.8% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約4.9% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.0% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.1% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.2% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.3% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.4% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.5% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.6% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.7% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.8% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約5.9% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約6.0% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約6.1% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約6.2% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約6.3% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約6.4% (w/v)。在另一實施例中，蔗糖之濃度為約6.5% (w/v)。
在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為50至300 mM。在其他實施例中，蔗糖之莫耳濃度為75至250 mM。在一些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為100至200 mM。在其他實施例中，蔗糖之莫耳濃度為130至150 mM。在一些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為135至150 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約135 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約136 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約137 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約138 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約139 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約140 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約141 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約142 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約143 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約144 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約145 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約146 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約150 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約151 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約151 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約152 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約153 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約154 mM。在某些實施例中，蔗糖之莫耳濃度為約155 mM。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含HCl。在其他實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含丁二酸。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有在5.5至6.5之範圍內之pH。在其他實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有在5.7至6.3之範圍內之pH。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有約5.7之pH。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有約5.8之pH。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有約5.9之pH。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有約6.0之pH。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有約6.1之pH。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有約6.2之pH。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物具有約6.3之pH。
在一些實施例中，在室溫下獲取pH。在其他實施例中，pH係在15℃至27℃下獲得。在又其他實施例中，pH係在4℃下獲取。在又其他實施例中，pH係在25℃下獲得。
在一些實施例中，藉由HCl調節pH。在一些實施例中，醫藥組合物包含HCl，且醫藥組合物在室溫下具有在5.5至6.5之範圍內的pH值。在一些實施例中，醫藥組合物包含HCl，且醫藥組合物在室溫下具有5.7至6.3範圍內的pH。在一些更具體實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在室溫下醫藥組合物具有約5.7之pH。在一些更具體實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在室溫下醫藥組合物具有約5.8之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在室溫下醫藥組合物具有約5.9之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在室溫下醫藥組合物具有約6.0之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且醫藥組合物在室溫下具有約6.1之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且醫藥組合物在室溫下具有約6.2之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在室溫下醫藥組合物具有約6.3之pH。
在一些實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有5.5至6.5範圍內的pH。在一些實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有在5.7至6.3之範圍內之pH。在一些更特定的實施例中，醫藥組合物包含HCl，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有約5.7之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有約5.8之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有約5.9之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有約6.0之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有約6.1之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有約6.2之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含HCl，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有約6.3之pH。
在一些實施例中，藉由丁二酸調節pH。在一些實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且醫藥組合物在室溫下具有5.5至6.5範圍內之pH。在一些實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在室溫下醫藥組合物具有在5.7至6.3之範圍內之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在室溫下醫藥組合物具有約5.7之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在室溫下醫藥組合物具有約5.8之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在室溫下醫藥組合物具有約5.9之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在室溫下醫藥組合物具有約6.0之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在室溫下醫藥組合物具有約6.1之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在室溫下醫藥組合物具有約6.2之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在室溫下醫藥組合物具有約6.3之pH。
在一些實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有5.5至6.5範圍內之pH。在一些實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有在5.7至6.3之範圍內之pH。在一些更特定的實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有約5.7之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有約5.8之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有約5.9之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有約6.0之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有約6.1之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且在15℃至27℃下醫藥組合物具有約6.2之pH。在一些更特定實施例中，醫藥組合物包含丁二酸，且醫藥組合物在15℃至27℃下具有約6.3之pH。
在一些特定實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20及約5.5% (w/v)二水合海藻糖或約5% (w/v)蔗糖中之至少一者。在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物進一步包含HCl或丁二酸。在一些實施例中，pH值在室溫下係約6.0。在一些實施例中，在25℃下pH為約6.0。
在一些具體實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5.5% (w/v)二水合海藻糖及HCl。在一些實施例中，pH值在室溫下係約6.0。在一些實施例中，在25℃下pH為約6.0。
在一些具體實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5% (w/v)蔗糖及HCl。在一些實施例中，pH值在室溫下係約6.0。在一些實施例中，在25℃下pH為約6.0。
在其他具體實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5.5% (w/v)二水合海藻糖及丁二酸。在一些實施例中，pH值在室溫下係約6.0。在一些實施例中，在25℃下pH為約6.0。
在一些具體實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5% (w/v)蔗糖及丁二酸。在一些實施例中，pH值在室溫下係約6.0。在一些實施例中，在25℃下pH為約6.0。
在一個特定實施例中，本文所提供的包含 (a)抗體藥物結合物，其包含以下結構：
Figure 02_image037
其中L-表示抗體或其抗原結合片段(例如抗連接素-4抗體或其抗原結合片段)且p為1至10；且 (b)醫藥學上可接受之賦形劑，其包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5.5%(w/v)二水合海藻糖及HCl，其中抗體藥物結合物之濃度係約10 mg/mL，且其中pH值在25℃下係約6.0。
在另一特定實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含： (a)抗體藥物結合物，其包含以下結構：
Figure 02_image039
其中L-表示抗體或其抗原結合片段(例如抗連接素-4抗體或其抗原結合片段)且p為1至10；及 (b)醫藥學上可接受之賦形劑，其包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5.5% (w/v)二水合海藻糖及琥珀酸， 其中抗體藥物結合物之濃度為約10 mg/mL，且其中在25℃下pH為約6.0。
在又另一特定實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含： (a)抗體藥物結合物，其包含以下結構：
Figure 02_image041
其中L-表示抗體或其抗原結合片段(例如抗連接素-4抗體或其抗原結合片段)且p為1至10；及 (b)醫藥學上可接受之賦形劑，其包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5.0% (w/v)蔗糖及HCl， 其中抗體藥物結合物之濃度為約10 mg/mL，且其中在25℃下pH為約6.0。
儘管提供某些數字(及其數值範圍)，但應理解，在某些實施例中，亦涵蓋在該數字(或數值範圍)之例如2%、5%、10%、15%或20%以內的數值。
媒劑中之主溶劑在本質上可為水性或非水性的。另外，媒劑可含有用於調節或維持醫藥組合物之pH、容積滲透濃度、黏度、無菌或穩定性的醫藥學上可接受之其他賦形劑。在某些實施例中，醫藥學上可接受之媒劑為水性緩衝液。在其他實施例中，媒劑包含例如氯化鈉及/或檸檬酸鈉。
本文所提供之醫藥組合物可含有用於調節或維持如本文所描述之抗體藥物結合物及/或另一種藥劑之釋放速率的醫藥學上可接受之又其他調配劑。此類調配劑包括熟習製備持續釋放型調配物之技術者已知之彼等物質。關於醫藥學上及生理學上可接受之調配劑的其他參考文獻，參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版(1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042), 第1435-1712頁, The Merck Index, 第12版(1996, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ)；及Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.)。適合於投與之額外醫藥組合物為此項技術中已知的，且可應用於本文提供之方法及組合物中。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物呈液體形式。在其他實施例中，本文所提供之醫藥組合物被凍乾。
醫藥組合物經調配可與其預定的投藥途徑相容。因此，醫藥組合物包括適合於藉由包括以下之途徑投與之賦形劑：非經腸(例如皮下(s.c.)、靜脈內、肌肉內或腹膜內)、皮內、經口(例如攝取)、吸入、腔內、顱內及經皮(局部)。本文闡述其他例示性投與途徑。
醫藥組合物可呈無菌可注射水性或油性懸浮液形式。此懸浮液可使用本文所揭示或熟習此項技術者已知之適合分散劑或濕潤劑及懸浮劑調配。無菌可注射製劑亦可為存在於非經腸可接受之無毒稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如1,3-丁二醇中之溶液。可採用的可接受之稀釋劑、溶劑及分散介質包括水、林格氏溶液(Ringer's solution)、等張氯化鈉溶液、Cremophor EL™ (BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇)及其適合混合物。另外，無菌不揮發性油習用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和的不揮發性油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸可用於製備可注射劑。特定可注射調配物之延長吸收可藉由包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來達成。
在一個實施例中，本文所提供之醫藥組合物可藉由注射、輸注或植入、以非經腸方式投與，用於局部或全身投與。如本文所用，非經腸投藥包括靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、腦室內、尿道內、胸骨內、顱內、肌肉內、滑膜內及皮下投藥。
在一個實施例中，本文所提供之醫藥組合物可以調配成適於非經腸投與之任何劑型，包括溶液、懸浮液、乳液、微胞、脂質體、微球體、奈米系統，及適於在注射之前溶解於或懸浮於液體中的固體形式。此類劑型可根據熟習醫藥科學技術者已知之習知方法製備(參見例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 同上)。
在一個實施例中，意欲非經腸投與之醫藥組合物可包括一或多種醫藥學上可接受之載劑及賦形劑，包括(但不限於)水性媒劑、水混溶性媒劑、非水性媒劑、對抗微生物生長之抗微生物劑或防腐劑、穩定劑、溶解度增強劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑及分散劑、濕潤劑或乳化劑、錯合劑、鉗合劑或螯合劑、低溫保護劑、凍乾保護劑、增稠劑、pH調節劑及惰性氣體。
在一個實施例中，適合的水性媒劑包括(但不限於)水、鹽水、生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、氯化鈉注射液、林格氏注射液、等張右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸化林格氏注射液。非水性媒劑包括(但不限於)植物來源之不揮發油，蓖麻油、玉米油、棉籽油、橄欖油、花生油、薄荷油、紅花油、芝麻油、大豆油、氫化植物油、氫化大豆油，及椰子油之中鏈三酸甘油酯，及棕櫚籽油。水混溶性媒劑包括(但不限於)乙醇、1,3-丁二醇、液體聚乙二醇(例如聚乙二醇300及聚乙二醇400)、丙二醇、甘油、N-甲基-2-吡咯啶酮、N,N-二甲基乙醯胺及二甲亞碸。
在一個實施例中，適合的抗微生物劑或防腐劑包括(但不限於)苯酚、甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞(thimerosal)、苯紮氯銨(benzalkonium chloride)(例如苄索氯銨(benzethonium chloride))、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯，以及山梨酸。適合之等滲劑包括但不限於氯化鈉、甘油及右旋糖。合適之緩衝劑包括(但不限於)磷酸鹽及檸檬酸鹽。合適之抗氧化劑為如本文所描述之彼等抗氧化劑，包括亞硫酸氫鹽及偏亞硫酸氫鈉。合適之局部麻醉劑包括(但不限於)鹽酸普魯卡因(procaine hydrochloride)。合適之懸浮劑及分散劑為如本文所描述之彼等懸浮劑及分散劑，包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。適合的乳化劑包括本文中所描述之彼等物，包括聚氧化乙烯去水山梨醇單月桂酸酯、聚氧化乙烯去水山梨醇單油酸酯80及油酸三乙醇胺。合適之鉗合劑或螯合劑包括(但不限於) EDTA。合適之pH值調節劑包括(但不限於)氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸及乳酸。適合的錯合劑包括(但不限於)環糊精，包括α-環糊精、β-環糊精、羥丙基-β-環糊精、磺基丁醚-β-環糊精及磺基丁醚7-β-環糊精(CAPTISOL®, CyDex, Lenexa, KS)。
在一個實施例中，本文所提供之醫藥組合物可調配成以單次劑量或多次劑量投與。單次劑量調配物係封裝於安瓿、小瓶或注射器中。多次劑量非經腸調配物可含有抑制細菌或抑制真菌濃度之抗微生物劑。如此項技術中已知及實踐，所有非經腸調配物必須為無菌的。
在一個實施例中，醫藥組合物係以即用型無菌溶液形式提供。在另一個另一實施例中，醫藥組合物以待在使用之前用媒劑復水之無菌乾式可溶產品形式提供，包括凍乾粉末及皮下錠劑。在又一實施例中，醫藥組合物係以即用型無菌懸浮液形式提供。在又一實施例中，醫藥組合物係以待在使用之前用媒劑復水之無菌乾式不可溶產品形式提供。在再一實施例中，醫藥組合物係以即用型無菌乳液形式提供。
在一個實施例中，本文所提供之醫藥組合物可調配為速釋型或調節釋放劑型，包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、控制釋放、靶向釋放及程式化釋放形式。
適於藉由添加水來製備水性懸浮液之可分散散劑及粒劑提供與分散劑或濕潤劑、懸浮劑及一或多種防腐劑摻合之活性成分。適合的分散劑或潤濕劑及懸浮劑例示於本文中。
醫藥組合物亦可包括賦形劑以保護組合物免於快速降解或自身體排出，諸如控制釋放型調配物，包括植入物、脂質體、水凝膠、前藥及微囊封遞送系統。舉例而言，時間延遲材料，諸如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯，可單獨或與蠟組合使用。可注射醫藥組合物之延長吸收可藉由包括吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來達成。可藉由例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物之各種抗微生物及抗真菌劑來實現阻止微生物作用。
本文所提供之醫藥組合物可在-80℃、4℃、25℃或37℃下儲存。
可藉由冷凍乾燥本文所提供之液體醫藥組合物來製備凍乾組合物。在一個特定實施例中，本文所提供之醫藥組合物為凍乾醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥調配物為凍乾粉末，其可經復原以便作為溶液、乳液及其他混合物投與。其亦可復原且調配成固體或凝膠形式。
在一些實施例中，本文所提供之凍乾調配物的製備包括將經調配的本體溶液(bulk solution)分批凍乾、無菌過濾，裝填於小瓶中，將小瓶在冷凍乾燥室中冷凍，隨後凍乾、塞緊及蓋緊。
凍乾器可用於製備凍乾調配物。舉例而言，可採用VirTis Genesis型號EL試驗單元。該單元併有腔室，該腔室具有三個處理擱架(至約0.4平方公尺之總可用擱架面積)、外部冷凝器及機械真空泵系統。級聯的機械製冷允許擱板冷卻至-70℃或更低，且允許外部冷凝器冷卻至-90℃或更低。自動地將擱板溫度及箱壓力分別控制至+/- 0.5℃及+/- 2微米(毫托)。該單元配備有真空電容壓力計、Pirani真空計、壓力轉換器(量測範圍：0至1個大氣壓)及相對濕度感測器。
凍乾粉末可藉由將本文所提供的抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受的衍生物溶解於適合溶劑中來製備。在一些實施例中，凍乾粉末為無菌的。隨後無菌過濾溶液，繼而在熟習此項技術者已知之標準條件下凍乾，以提供所要調配物。在一個實施例中，將所得溶液分配至小瓶中凍乾。各小瓶含有單次劑量或多次劑量之抗體藥物結合物。凍乾粉末可在適當條件下儲存，諸如在約4℃至室溫下儲存。
用注射用水復原此凍乾粉末得到用於非經腸投藥之調配物。復原時，將凍乾粉末添加至無菌水或其他適合賦形劑中。此量可憑經驗確定且根據特定需要進行調整。
例示性復原程序說明如下：(1)將5 mL或3 mL注射器裝配一個18或20號針並用注射用水(WFI)級水填充該注射器；(2)使用注射器刻度量測適量之WFI，確保注射器不含氣泡；(3)將針插入穿過橡膠塞；(4)將注射器之全部內容物沿瓶壁向下分配至容器中，移出注射器及針且放入利器容器中；(4)持續渦旋小瓶以小心地溶解整個小瓶內容物直至完全復原為止(例如約20-40秒)，並使可導致起泡的對蛋白質溶液之過多攪動減到最少。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物係以無菌乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式、於氣密密封式容器中供應且可以用例如水或鹽水復原至適於投與個體的濃度。在某些實施例中，抗體藥物結合物係以乾燥無菌凍乾粉末形式以以下之單位劑量在氣密密封式容器中供應：至少0.1 mg、至少0.5 mg、至少1 mg、至少2 mg或至少3 mg，諸如至少5 mg、至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少30 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少60 mg、至少75 mg、至少80 mg、至少85 mg、至少90 mg、至少95 mg或至少100 mg。凍乾之抗體藥物結合物可在2與8℃之間儲存於其初始容器中，且抗體藥物結合物可在復原後12小時內，諸如6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在一替代實施例中，包含本文提供之抗體藥物結合物之醫藥組合物以液體形式在氣密密封式容器中供應，該容器指示抗體藥物結合物之數量及濃度。在某些實施例中，抗體藥物結合物之液體形式係以至少0.1 mg/ml、至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少5 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/ml、至少25 mg/ml、至少30 mg/ml、至少40 mg/ml、至少50 mg/ml、至少60 mg/ml、至少70 mg/ml、至少80 mg/ml、至少90 mg/ml或至少100 mg/ml、在氣密密封式容器中供應。
醫藥組合物的其他實施例已描述於美國專利第8,637,642號及國際申請案第PCT/US2019/056214號(公開案第WO2020/117373號)，該兩者以其全文引用之方式併入本文中。 5.5 組合治療方法
將本文所提供之醫藥組合物與化學療法或輻射或兩者組合使用來抑制腫瘤細胞生長的方法包含在開始化學療法或輻射療法以及其任何組合之前、期間或之後(亦即，在開始化學療法及/或輻射療法之前及期間、之前及之後、期間及之後，或之前、期間及之後)，投與本發明醫藥組合物。視治療方案及特定患者需要而定，以將提供最有效治療且最終延長患者生命之方式執行該方法。此類組合療法的其他實施例已描述於美國專利第8,637,642號及國際申請案第PCT/US2019/056214號(公開案第WO2020/117373號)，該兩者以其全文引用之方式併入本文中。 5.6  ADC 用於該等方法的劑量
在一些實施例中，預防劑或治療劑(例如本文所提供之抗體藥物結合物)或本文所提供之醫藥組合物之有效預防及/或治療癌症的量可藉由標準臨床技術確定。在一些實施例中，有效劑量可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推得到。應瞭解，調配物的精確使用劑量亦視投藥途徑及個體之癌症嚴重程度而定，且應根據從醫者之判斷及各患者的情形決定。
在一些實施例中，方法中的ADC (其各種劑量描述於本章節(章節5.6))為恩諾單抗維多汀(EV)。
在一些實施例中，向患者投與以本文所提供之醫藥組合物形式調配的抗體藥物結合物之劑量的投與途徑為鼻內、肌肉內、靜脈內、血管內或其組合，但本文所描述之其他途徑亦為可接受的。各劑量可或可不藉由相同投與途徑投與。在一些實施例中，調配成本文所提供之醫藥組合物的抗體藥物結合物可在一或多種其他治療劑之其他劑量的同時或之後，經由多種投藥途徑投與。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在血管內投與。
對於包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物而言，有效量之ADC為約10 mg至約1000 mg之間的劑量，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約950 mg之間的劑量，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約900 mg之間的劑量，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約850 mg之間的劑量，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約800 mg之間的劑量，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約750 mg之間的劑量，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約750 mg之間的劑量，其中滴注體積為約25 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約10 mg至約1000 mg之間的劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約50 mg至約1000 mg之間的劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg至約900 mg之間的劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約900 mg之間的劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約850 mg之間的劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約800 mg之間的劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg至約750 mg之間的劑量。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量。
在一些實施例中，滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。在一些實施例中，滴注體積在約10 mL至約50 mL之間。在一些實施例中，滴注體積在約15 mL至約30 mL之間。在一些實施例中，滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，滴注體積為約55 mL。在一些實施例中，滴注體積為約60 mL。在一些實施例中，滴注體積為約65 mL。在一些實施例中，滴注體積為約70 mL。在一些實施例中，滴注體積為約75 mL。在一些實施例中，滴注體積為約80 mL。在一些實施例中，滴注體積為約85 mL。在一些實施例中，滴注體積為約90 mL。在一些實施例中，滴注體積為約95 mL。在一些實施例中，滴注體積為約100 mL。
在一些實施例中，滴注體積為10 mL。在一些實施例中，滴注體積為15 mL。在一些實施例中，滴注體積為20 mL。在一些實施例中，滴注體積為25 mL。在一些實施例中，滴注體積為30 mL。在一些實施例中，滴注體積為35 mL。在一些實施例中，滴注體積為40 mL。在一些實施例中，滴注體積為45 mL。在一些實施例中，滴注體積為50 mL。在一些實施例中，滴注體積為55 mL。在一些實施例中，滴注體積為60 mL。在一些實施例中，滴注體積為65 mL。在一些實施例中，滴注體積為70 mL。在一些實施例中，滴注體積為75 mL。在一些實施例中，滴注體積為80 mL。在一些實施例中，滴注體積為85 mL。在一些實施例中，滴注體積為90 mL。在一些實施例中，滴注體積為95 mL。在一些實施例中，滴注體積為100 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約10 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為10 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約15 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為15 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約20 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為20 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為25 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約30 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為30 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約35 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為35 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約40 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為40 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約45 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為45 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為約100 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約150 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約200 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約300 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約350 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約400 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約450 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約550 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約600 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約650 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約700 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約800 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約850 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為約900 mg之劑量，其中滴注體積為約50 mL。
在一些實施例中，有效量之ADC為100 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為125 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為150 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為200 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為250 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為300 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為350 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為400 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為450 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為500 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為550 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為600 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為650 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為700 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為750 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為800 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為850 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。在一些實施例中，有效量之ADC為900 mg之劑量，其中滴注體積為50 mL。
在一些實施例中，各膀胱內投與之最長停留時間為約120分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之最長停留時間為約90分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之最長停留時間為該個體之耐受停留時間。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間在約30分鐘至約120分鐘之間。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間在約30分鐘至約90分鐘之間。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約30分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約40分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約50分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約60分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約70分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約80分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約90分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約100分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約110分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為約120分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為30分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為40分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為50分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為60分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為70分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為80分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為90分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為100分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為110分鐘。在一些實施例中，各膀胱內投與之停留時間為120分鐘。
在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在誘導階段期間膀胱內投與。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在維持階段期間膀胱內投與。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在兩個階段期間膀胱內投與，其中該兩個階段為誘導階段及維持階段。在一些實施例中，維持階段在誘導階段之後開始。在一些實施例中，該維持階段在該誘導階段之後的六至十週之間、六至九週之間或六至八週之間開始。在一些實施例中，維持階段在誘導階段之後十週開始。在一些實施例中，維持階段在誘導階段之後九週開始。在一些實施例中，維持階段在誘導階段之後八週開始。在一些實施例中，維持階段在誘導階段之後七週開始。在一些實施例中，維持階段在誘導階段之後六週開始。
在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物投與約1至約25次，其中該等劑量可視需要投與，例如每週一次、兩週一次、每月一次、兩月一次、三月一次等，如醫師所決定。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物每週一次投與。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物兩週一次投與。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物每月一次投與。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物兩月一次投與。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物三月一次投與。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物投與25次、24次、23次、22次、21次、20次、19次、18次、17次、16次、15次、14次、13次、12次、11次、10次、9次、8次、7次、6次、5次、4次、3次、2次或1次以治療NMIBC，其中該劑量在約10 mg至約1000 mg之間，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。
在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在誘導階段期間膀胱內投與一週一次持續四週。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在誘導階段期間膀胱內投與一週一次持續五週。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在誘導階段期間膀胱內投與一週一次持續六週。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在誘導階段期間膀胱內投與一週一次持續七週。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在誘導階段期間膀胱內投與一週一次持續八週。
在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在維持階段期間膀胱內投與一月一次持續六個月。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在維持階段期間膀胱內投與一月一次持續七個月。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在維持階段期間膀胱內投與一月一次持續八個月。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在維持階段期間膀胱內投與一月一次持續九個月。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在維持階段期間膀胱內投與一月一次持續十個月。在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在維持階段期間膀胱內投與一月一次持續11個月。
在一些實施例中，包含本文所提供之抗體藥物結合物的醫藥組合物在誘導階段期間一週一次持續六週，且在維持階段期間一月一次投與持續九個月膀胱內投與，其中該維持階段在該誘導階段之後的六至十週之間、六至九週之間或六至八週之間開始。
在本文所提供之方法的一些更特定實施例中，ADC具有以下結構：
Figure 02_image043
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約125 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
在本文所提供之方法的一些更特定實施例中，ADC具有以下結構：
Figure 02_image045
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約250 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
在本文所提供之方法的一些更特定實施例中，ADC具有以下結構：
Figure 02_image047
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約500 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
在本文所提供之方法的一些更特定實施例中，ADC具有以下結構：
Figure 02_image049
其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約750 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。 5.7 生物標記物測定方法
本發明提供，本文所提供之任一種標記之表現可藉由本領域中已知之各種方法測定。在一些實施例中，標記物的表現可根據自標記基因轉錄之mRNA的量或相對量測定。在一個實施例中，標記基因之表現可根據由標記基因編碼之蛋白質產物的量或相對量測定。在另一實施例中，標記基因之表現可根據由標記基因編碼之蛋白質產物所誘導的生物學或化學反應水準來測定。另外，在某些實施例中，標記基因之表現可根據與標記基因之表現相關之一或多種基因的表現來測定。
如上文所描述，標記基因之基因轉錄本(例如mRNA)的水準或量可用作標記基因之表現量的指示。此項技術中已知多種不同的PCR或qPCR方案，包括本文中例示的彼等方案。在一些實施例中，多種PCR或qPCR方法應用於或經調適而用於測定各種標記基因的mRNA含量。定量PCR (qPCR)(亦稱為即時PCR)應用於且經調適而用於一些實施例中，原因在於其不僅提供定量的量測結果，而且減少時間及污染。如本文所用，「定量PCR」(或「qPCR」)係指如正發生之PCR擴增進度之直接監測，而無需對反應產物重複取樣。在定量PCR中，反應產物在其產生時可以經由傳訊機制(例如螢光)加以監測且在訊號上升而高於背景水準、但在反應達到平穩階段之前加以追蹤。為達成可偵測或「臨限」螢光水準所需的循環數目在PCR過程開始時直接隨著可擴增的目標濃度而變化，從而允許量測訊號強度，以便即時量測樣品中之目標核酸含量。當應用qPCR測定mRNA表現量時，mRNA逆轉錄為DNA之額外步驟係在qPCR分析之前執行。PCR方法之實例可見於文獻中(Wong等人, BioTechniques 39:75-85 (2005)；D'haene等人, Methods 50:262-270 (2010))，該文獻以全文引用的方式併入本文中。PCR分析之實例亦可見於美國專利第6,927,024號中，其以全文引用的方式併入本文中。RT-PCR方法之實例可見於美國專利第7,122,799號中，其以全文引用的方式併入本文中。螢光原位PCR方法描述於美國專利第7,186,507號中，其以全文引用的方式併入本文中。
在一個特定實施例中，可如下進行qPCR以測定或量測標記基因之mRNA水準。簡言之，測定標記基因及一或多種管家基因之複製qPCR反應的平均Ct (循環臨限)值(或在本文中可互換地稱為Cq (定量循環))。標記基因之平均Ct值接著可以利用以下例示公式以管家基因之Ct值標準化：標記基因ΔCt = (標記基因之平均Ct - 管家基因A之平均Ct)。接著可以利用相對標記基因-ΔCt測定標記基因mRNA的相對水準，例如使用mRNA表現公式=  2 -∆Ct。關於Ct及Cq值之概述，參見MIQE指南(Bustin等人, The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, Clinical Chemistry 55:4 (2009))。
為了定量樣本中之標記基因的RNA轉錄本作為標記基因之表現的指示，亦可使用此項技術中已知之其他常用方法，包括北方墨點法及原位雜交法(Parker及Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999))；RNA酶保護分析(Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992))；微陣列法(Hoheisel等人, Nature Reviews Genetics 7:200-210 (2006)；Jaluria等人, Microbial Cell Factories 6:4 (2007))；及聚合酶鏈反應(PCR) (Weis等人, Trends in Genetics 8:263-264 (1992))。RNA原位雜交(ISH)為一種分子生物學技術，其廣泛用於量測及定位細胞(諸如循環腫瘤細胞(CTC))或組織切片內的特定RNA序列，例如信使RNA (mRNA)、非編碼長RNA (lncRNA)，及微RNA (miRNA)，同時保持細胞及組織環境。ISH為一種雜交類型，其使用直接或間接標記之互補DNA或RNA股(諸如探針)結合及定位樣品(特定而言，組織或細胞(原位)的一部分或切片)中的特定核酸，諸如DNA或RNA。探針類型可為雙股DNA (dsDNA)、單股DNA (ssDNA)、單股互補RNA (sscRNA)、信使RNA (mRNA)、微RNA (miRNA)、核糖體RNA、粒線體RNA及/或合成寡核苷酸。術語「螢光原位雜交」或「FISH」係指使用螢光標記的ISH類型。術語「顯色原位雜交」或「CISH」係指使用顯色標記的ISH類型。ISH、FISH及CISH方法已為熟習此項技術者所熟知(參見例如Clinics in Laboratory Medicine 10(1):215-236 (1990)；In situ hybridization. A practical approach, Wilkinson編, IRL Press, Oxford (1992)；Schwarzacher及Heslop-Harrison, Practical in situ hybridization, BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford (2000))。RNA ISH因此對細胞及組織內的基因表現提供空間-時間可視化以及定量。其在研究及診斷方面具有廣泛應用(Hu等人, Biomark. Res. 2(1):1-13, doi：10.1186/2050-7771-2-3 (2014)；Ratan等人, Cureus 9(6):e1325. doi：10.7759/cureus.1325 (2017)；Weier等人, Expert Rev. Mol. Diagn. 2(2):109-119 (2002))。螢光RNA ISH分別使用螢光染料及螢光顯微鏡進行RNA標記及偵測。螢光RNA ISH可提供四種至五種目標序列的多工處理。
替代地，樣本中之標記基因的RNA轉錄本作為標記基因表現的指示，可藉由定序技術測定。用於基於定序之基因表現分析的代表性方法包括基因表現系列分析(SAGE)及藉由大規模並行標誌定序(MPSS)進行之基因表現分析。
在一些實施例中，標記基因之表現可根據標記基因之RNA轉錄本(包括例如mRNA)在總轉錄RNA池中之相對豐度來測定。標記基因之RNA轉錄本的此類相對豐度可藉由稱為RNA-seq的次世代定序測定。在RNA-seq程序的一個實例中，將來自不同來源(血液、組織、細胞)的RNA純化，視情況增濃(例如利用寡核苷酸(dT)引子)，轉化為cDNA且片段化。利用隨機片段化cDNA文庫產生數百萬或甚至數十億個短序列讀段。參見Zhao等人, BMC genomics 16: 97 (2015)；Zhao等人, Scientific Reports 8: 4781 (2018)；Shanrong Zhao等人, RNA, 在2020年4月13日提前公開, doi：10.1261/rna.074922.120，其均以全文引用的方式併入本文中。標記基因之各mRNA轉錄本的表現量係根據標準化後定位之片段總數目測定，該總數目與其豐度水準成正比。幾種標準化方案已知且用於促進使用RNA轉錄本豐度作為用於測定基因表現的參數，包括每百萬每千鹼基的讀段數(RPKM)、每百萬每千鹼基的片段數(FPKM)及/或每百萬每千鹼基的轉錄本數(TPM)。簡言之，RPKM可計算如下：對樣本中之總讀段進行計數且將該數目除以1,000,000 (其為「每百萬」比例因子)；將讀段計數除以「每百萬」比例因子，其針對定序深度進行標準化，得到每百萬讀段數(RPM)；及將RPM值除以基因長度(以千鹼基為單位)，得到RPKM。除用片段置換讀段之外，FPKM與RPKM密切相關。根據單端RNA-seq產生RPKM，其中每個讀段對應於定序的單個片段。根據成對端RNA-seq產生FPKM，其中兩個讀段可對應於單個片段，或若一對中的一個讀段未定位，則一個讀段可對應於單個片段。TPM非常類似於RPKM及FPKM且如下計算：將讀段計數除以各基因之長度(千鹼基)，得到每千鹼基之讀段數(RPK)；對樣品的所有RPK值計數且將此數除以1,000,000，得到「每百萬」比例因子；將RPK值除以「每百萬」比例因子，得到TPM。參見Zhao等人, BMC genomics 16: 97 (2015)；Zhao等人, Scientific Reports 8: 4781 (2018)；Shanrong Zhao等人, RNA, 在2020年4月13日提前公開, doi：10.1261/rna.074922.120，其均以全文引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，標記基因的表現係藉由RNA-seq (例如TPM、RPKM及/或FPKM)測定。在一些實施例中，標記基因的表現係藉由TPM測定。在一些實施例中，標記基因的表現係藉由RPKM測定。在一些實施例中，標記基因的表現係藉由FPKM測定。
如早先所描述，可測定來自個體之樣本中之標記基因的表現。在一些實施例中，樣品為血液樣品、血清樣品、血漿樣品、體液(例如組織液，包括癌症組織液)，或組織(例如癌症組織或癌症周圍的組織)。在一些實施例中，該樣品為組織樣品。在一些實施例中，組織樣品為自哺乳動物(特定言之，人類)分離或提取之組織部分。在一些實施例中，組織樣品為自哺乳動物(特定言之，人類)分離或提取之細胞群。在一些實施例中，組織樣品為獲自活組織檢查之樣品。在某些實施例中，組織樣品可以獲自個體(包括人類個體)之多種器官。在一些實施例中，樣品獲自患有癌症之個體的器官。在一些實施例中，樣品獲自患有癌症之個體的患癌器官。在其他實施例中，樣品，例如參考樣品獲自患者或第二人類個體之正常器官。
在本文所提供之方法的某些實施例中，組織包括來自膀胱、輸尿管、乳房、肺、大腸、直腸、卵巢、輸卵管、食道、子宮頸、子宮內膜、皮膚、喉、骨髓、唾液腺、腎臟、前列腺、腦、脊髓、胎盤、腎上腺、胰臟、副甲狀腺、腦垂體、睪丸、甲狀腺、脾、扁桃體、胸腺、心臟、胃、小腸、肝臟、骨骼肌、周邊神經、間皮或眼的組織。
在本文所提供之方法的其他實施例中，不同標記基因的表現可藉由此項技術中已知的多種免疫分析加以偵測，包括免疫組織化學(IHC)分析、免疫墨點法分析、FACS分析及ELISA。
在多種IHC分析中，各種標記基因之表現可藉由針對由標記基因編碼之蛋白質產物的抗體偵測。組織切片之IHC染色已表明為評估或偵測樣品中蛋白質之存在的可靠方法。IHC技術利用抗體探測及可視化原位細胞抗原，通常藉由顯色或螢光方法來探測及可視化。初級抗體或抗血清，諸如特異性地靶向由標記基因編碼之蛋白質產物的多株抗血清及單株抗體，可在IHC分析中用於偵測標記基因的表現。在一些實施例中，使組織樣品與針對特定目標的初級抗體接觸足以使抗體-目標結合發生的時間。如早先更詳細地論述，該等抗體可藉由用例如放射性標記、螢光標記、半抗原標記(諸如生物素)或酶(諸如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)直接標記抗體本身來偵測。或者，未標記之初級抗體與對該初級抗體具有特異性的經標記之二級抗體(包含抗血清、多株抗血清或單株抗體)結合使用。IHC方案及套組在此項技術中已熟知且可商購。用於載片製備及IHC處理之自動化系統係可商購的。Leica BOND自動染色儀及Leica Bond Refine偵測系統為此類自動化系統之實例。
在一些實施例中，使用未標記之初級抗體，聯合間接分析中之經標記之二級抗體來執行IHC分析。間接分析係使用兩種抗體偵測組織樣品中由標記基因編碼的蛋白質產物。首先，將未結合的初級抗體施加至組織(第一層)，與組織樣品中的目標抗原反應。接著，施加經酶標記之二級抗體，其特異性識別初級抗體之抗體同型(第二層)。二級抗體與初級抗體反應，隨後施加受質-色素原。第二層抗體可以用酶(過氧化酶)標記，該過氧化酶與色素原3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)反應，在反應位點產生棕色沈澱物。此方法由於潛在的訊號經由訊號放大系統放大而靈敏且通用。
在某些實施例中，為了增加偵測靈敏性，可以使用訊號放大系統。如本文所用，「訊號放大系統」意謂試劑與方法之系統，其可以用於增強來自偵測所結合之初級或二級抗體的訊號。訊號放大系統增強目標蛋白偵測靈敏性、增強所偵測訊號，且減少偵測極限之下邊界。存在若干類型的訊號放大系統，包括酶標記系統及宏觀標記系統。此等系統/方法互不排斥且可以組合使用以得到相加效應。
宏觀標記系統(Macrolabels/macrolabeling)為連接至或併入共同支架中的標記集合，其數目為數十(例如，藻膽蛋白)至數百萬(例如螢光微球體)。支架可以與目標特異性親和試劑(諸如抗體)偶聯，且併入的標記在結合後藉此一起與目標關聯。宏觀標記中的標記可為本文所描述之任一種標記，諸如螢光團、半抗原、酶及/或放射性同位素。在訊號放大系統之一個實施例中，使用經標記之鏈聚合物所結合的二級抗體。聚合物技術係利用可與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50個或更多個二級抗體分子連接之經HRP酶標記的惰性「棘」聚葡萄糖分子，從而使系統甚至更靈敏。
基於酶標記系統之訊號放大系統係利用酶(諸如辣根過氧化酶(HRP)或鹼性磷酸酶)之催化活性來原位產生目標蛋白或核酸序列之高密度標記。在一個實施例中，可以使用酪醯胺增強HRP訊號。在此系統中，HRP以酶方式使經標記之酪醯胺衍生物轉化成反應性高、壽命短的酪醯胺基團。經標記之活性酪醯胺基團接著與HRP抗體-目標相互作用位點附近的殘基(主要為蛋白質酪胺酸殘基之苯酚部分)共價偶聯，引起該位點處之標記數目擴增且與擴散相關的訊號局域化損失最小。因此，訊號可以擴增1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、75或100倍。如熟習此項技術者所知，酪醯胺上之標記可為本文所描述之任何標記，包括螢光團、酶、半抗原、放射性同位素及/或發光器。亦可利用基於酶之其他反應產生訊號放大。舉例而言，經酶標記之螢光(ELF)訊號放大可利用於鹼性磷酸酶，其中鹼性磷酸酶以酶方式使弱藍色螢光受質(ELF 97磷酸酯)裂解且將其轉化成亮黃色-綠色螢光沈澱物，該沈澱物展現異常大的斯托克位移(Stokes shift)及優良的光穩定性。基於酪醯胺之訊號放大系統與ELF訊號放大可購自例如ThermoFisher Scientific (Waltham, MA USA 02451)。
因此，在本文所提供之方法的一些實施例中，經由使用訊號放大系統的IHC偵測標記基因之表現量。在一些實施例中，接著對試樣進行對比染色，以鑑別細胞及次細胞元件。
在一些實施例中，由標記基因編碼之蛋白質產物的表現量亦可經由針對標記基因所編碼之蛋白質產物的抗體、使用免疫墨點分析加以偵測。在免疫墨點分析之一些實施例中，通常(但不一定)藉由電泳分離出蛋白質且轉印至膜(通常為硝化纖維素或PVDF膜)上。類似於IHC分析，初級抗體或抗血清，諸如特異性地靶向由標記基因編碼之蛋白質產物的多株抗血清及單株抗體，可用於偵測標記基因的表現。在一些實施例中，使膜與針對特定目標之初級抗體接觸足以發生抗體-抗原結合的時間且所結合的抗體可以藉由用例如放射性標記、螢光標記、半抗原標記(諸如生物素)或酶(諸如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)直接標記初級抗體本身來偵測。在其他實施例中，在如上文所描述之間接分析中，結合對初級抗體具有特異性之經標記之二級抗體來使用未標記之初級抗體。如本文所描述，二級抗體可以用例如酶或其他可偵測標記(諸如螢光標記、發光標記、比色標記，或放射性同位素)標記。免疫墨點方案及套組在此項技術中已熟知且可商購。用於免疫墨點法的自動化系統，例如用於西方墨點法的iBind Western系統(ThermoFisher, Waltham, MA USA 02451)可市購。免疫墨點法包括但不限於西方墨點法、細胞內西方墨點法及點漬墨法。點漬墨法為一種簡化程序，其中蛋白質樣品並非藉由電泳分離，而是直接點樣至膜上。細胞內西方墨點法包括將細胞接種於微量滴定盤中、固定/滲透細胞，及隨後用初級經標記之初級抗體或未標記之初級抗體偵測，隨後用經標記之二級抗體偵測，如本文所描述。
在其他實施例中，由標記基因編碼之蛋白質產物的表現量亦可使用本文在流式細胞術分析(包括螢光活化細胞分選(FACS)分析)中所描述之抗體偵測。類似於IHC或免疫墨點分析，可以在FACS分析中使用初級抗體或抗血清(諸如特異性靶向由標記基因編碼之蛋白質產物的多株抗血清及單株抗體)偵測蛋白質表現。在一些實施例中，細胞用針對特定目標蛋白的初級抗體染色足以發生抗體-抗原結合的時間且所結合的抗體可以藉由初級抗體上的直接標記(例如螢光標記或半抗原標記，諸如初級抗體上的生物素)來偵測。在其他實施例中，在如上文所描述的間接分析中，未標記之初級抗體聯合對初級抗體具有特異性之經螢光標記之二級抗體來使用。FACS提供一種基於各種細胞之特定光散射及螢光特徵來分選或分析經螢光標記之生物細胞之混合物的方法(一次一種細胞)。因此，流式細胞儀偵測且報導經螢光染料標記之抗體的強度，其指示目標蛋白之表現量。因此，由標記基因編碼之蛋白質產物的表現量可使用針對此類蛋白質產物之抗體偵測。亦可藉由對所滲透細胞染色來觀察非螢光細胞質蛋白質。用於執行FACS染色及分析之方法已為熟習此項技術者熟知且描述於Teresa S. Hawley及Robert G. Hawley in Flow Cytometry Protocols, Humana Press, 2011 (ISBN 1617379506, 9781617379505)中。
在其他實施例中，由標記基因編碼之蛋白質產物的表現量亦可使用免疫分析法偵測，諸如酶免疫分析(EIA)或ELISA。EIA與ELISA分析在此項技術中已知，例如，用於分析多種組織及樣品，包括血液、血漿、血清或骨髓。有多種ELISA分析形式可供利用，參見例如美國專利第4,016,043號、第4,424,279號及第4,018,653號，該等專利以全文引用的方式併入本文中。此等分析包括非競爭型單點及兩點或「夾心」分析，以及傳統競爭性結合分析。此等分析亦包括經標記之抗體對目標蛋白的直接結合。夾心分析為常用的分析形式。存在夾心分析技術之多種變化形式。舉例而言，在典型正向分析中，將未經標記之抗體固定於固體基質上，且使待測試之樣品與經結合分子接觸。在培育適合時間段，即足以允許形成抗體-抗原錯合物之時間段之後，隨後添加用能夠產生可偵測訊號之報導體分子標記的對抗原具有特異性之第二抗體且培育，給予足夠的時間以形成抗體-抗原-經標記抗體之另一錯合物。洗掉任何未反應之物質，且藉由觀察由報導體分子產生之訊號來確定抗原之存在。結果可藉由簡單地觀測可見訊號來定性，或可藉由與含有已知量之目標蛋白的對照樣品比較來定量。
在EIA或ELISA分析之一些實施例中，使酶與第二抗體結合。在其他實施例中，可以在ELISA分析形式中使用經螢光標記之二級抗體來代替經酶標記之二級抗體產生可偵測訊號。當在特定波長之光照射下活化時，螢光染料標記之抗體吸附光能，誘導分子之可激發性狀態，隨後發射可用光學顯微鏡目測偵測之特徵性顏色的光。如同EIA及ELISA，允許經螢光標記之抗體結合第一抗體-目標蛋白複合物。在洗掉未結合之試劑之後，接著使殘留三元複合物暴露於適當波長之光，觀測到的螢光指示存在所關注之目標蛋白。免疫螢光與EIA技術在此項技術中均沿用已久且揭示於本文中。
對於本文所描述之免疫分析而言，可以使用多種酶或非酶標記中之任一者，只要可以分別偵測到酶活性或非酶標記即可。酶藉此產生可偵測訊號，該訊號可以用於偵測目標蛋白。特別適用的可偵測訊號為顯色或螢光訊號。因此，用作標記的特別適用酶包括可利用顯色或螢光受質的酶。此類顯色或螢光受質可以藉由酶反應轉化為容易偵測的顯色或螢光產物，該產物可以容易利用顯微法或光譜法偵測及/或定量。此類酶已為熟習此項技術者熟知，包括(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶及其類似物(參見Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996))。利用熟知顯色或螢光受質的其他酶包括各種肽酶，其中顯色或螢光肽受質可以用於偵測蛋白分解裂解反應。顯色及螢光受質在細菌診斷中的用途亦熟知，包括(但不限於)使用α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、6-磷酸化-β-D-半乳糖苷6-磷酸化半乳糖水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、澱粉酶、神經胺糖酸苷酶、酯酶、脂肪酶及其類似物(Manafi等人, Microbiol. Rev. 55:335-348 (1991))，且顯色或螢光受質已知的此類酶可容易調適以用於本發明方法中。
產生可偵測訊號的各種顯色或螢光受質已為熟習此項技術者熟知且可商購。可用於產生可偵測訊號的例示性受質包括(但不限於)辣根過氧化酶用的3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、氯萘酚(Chloronaphthol)(4-CN)(4-氯-1-萘酚)、2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)，及3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)；鹼性磷酸酶用的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸酯(BCIP)、硝基藍四唑鎓(NBT)、快速紅(快速紅TR/AS-MX)，及對硝基苯基磷酸酯(PNPP)；β-半乳糖用的1-甲基-3-吲哚基-β-D-哌喃半乳糖苷及2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-哌喃半乳糖苷；α-葡糖苷酶用的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-哌喃葡萄糖苷；及其類似物。例示性螢光受質包括但不限於鹼性磷酸酶用的4-(三氟甲基)傘形酮基磷酸酯；磷酸酶用的4-甲基傘形酮基磷酸酯雙(2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基傘形酮基磷酸酯雙(環己基銨)及4-甲基傘形酮基磷酸酯；辣根過氧化酶用的QuantaBlu TM及QuantaRed TM；β-半乳糖苷酶用的4-甲基傘形酮基β-D-哌喃半乳糖苷、螢光素二(β-D-哌喃半乳糖苷)及萘并螢光素二-(β-D-哌喃半乳糖苷)；β-葡糖苷酶用的3-乙醯基傘形酮基β-D-哌喃葡萄糖苷及4-甲基傘形酮基-β-D-哌喃葡萄糖苷；及α-半乳糖苷酶用的4-甲基傘形酮基-α-D-哌喃半乳糖苷。用於產生可偵測訊號的例示性酶及受質亦描述於例如US公開案2012/0100540中。各種可偵測酶受質(包括顯色或螢光受質)已熟知且可市購(Pierce, Rockford IL; Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX; Invitrogen, Carlsbad CA; 42 Life Science; Biocare)。一般而言，將受質轉化成產物，形成沈澱物，其沈積於目標核酸位點處。其他例示性受質包括(但不限於) HRP-綠(42 Life Science)、Betazoid DAB、Cardassian DAB、Romulin AEC、Bajoran紫、Vina綠、Deep Space Black™、Warp Red™、Biocare的Vulcan速紅及Ferangi藍(Concord CA；biocare.net/products/detection/chromogens)。
在免疫分析之一些實施例中，可偵測標記可與可具有的初級抗體或偵測未標記之初級抗體的二級抗體直接偶聯。熟習此項技術者已熟知例示性可偵測標記，包括但不限於顯色或螢光標記(參見Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996))。適用作標記的例示性螢光團包括(但不限於)若丹明(rhodamine)衍生物，例如四甲基若丹明、若丹明B、若丹明6G、磺醯若丹明B、德克薩斯紅(Texas Red)(磺醯若丹明101)、若丹明110及其衍生物，諸如四甲基若丹明-5-(或6)、麗絲胺若丹明B (lissamine rhodamine B)及其類似物；7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)；螢光素及其衍生物；萘，諸如丹醯基(5-二甲胺基萘-1-磺醯基)；香豆素衍生物，諸如7-胺基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、7-二乙基胺基-3-[(4'-(碘乙醯基)胺基)苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)、Alexa fluor染料(Molecular Probes)，及其類似物；4,4-二氟-4-硼雜-3a,4a-二氮雜-s-二環戊二烯并苯(BODIPY TM)及其衍生物(Molecular Probes; Eugene Oreg.)；芘及磺化芘，諸如Cascade Blue TM及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸，及其類似物；吡啶基噁唑衍生物及達珀西(dapoxyl)衍生物(Molecular Probes)；螢光黃(3,6-二磺酸酯-4-胺基-萘二甲醯亞胺)及其衍生物；CyDye TM螢光染料(Amersham/GE Healthcare Life Sciences；Piscataway NJ)，及其類似物。例示性發色團包括(但不限於)酚酞、孔雀綠(malachite green)、硝基芳族烴(諸如硝基苯基)、重氮染料、達波希(dabsyl)(4-二甲胺基偶氮苯-4'-磺醯基)，及其類似物。
可以利用熟習此項技術者熟知的方法(諸如顯微法或光譜法)使與所結合之初級或二級抗體結合的顯色或螢光可偵測訊號可視化。
此章節(章節5.7)中所提供的方法可結合此項技術中已知的各種癌症模型使用。在一個實施例中，使用小鼠異種移植癌症模型。簡言之，T-24及UM-UC-3細胞購自ATCC且使用推薦的培養基條件培養。使用pRCDCMEP-CMV-hNectin-4 EF1-Puro構築體，藉由用含有人類連接素-4的慢病毒轉導親代細胞來產生T-24 hNectin-4 (人類連接素-4)及UM-UC-3連接素-4細胞，且使用嘌呤黴素加以選擇。將T-24連接素-4 (純系1A9)細胞植入裸小鼠且經由套針繼代，允許達到約200 mm 3腫瘤體積，且隨後用腹膜內(IP)單次劑量的恩諾單抗維多汀(3mg/kg)或非結合ADC (3 mg/kg)處理，每個處理組7隻動物。使用此模型的追蹤ICD研究涉及處理後的第5天收集腫瘤用於藉由RNA-seq、流式、免疫組織化學(IHC)及Luminex進行下游分析。將腫瘤於福馬林中固定且製備成FFPE組織塊。切割4 μm塊且使用F4/80、CD11c執行免疫組織化學。免疫組織化學染色的載片切片用Leica AT2數位完整載片掃描儀掃描，且藉由使用針對連接素4、CD11c及F4/80染色定製的演算法、用Visiopharm軟體分析影像。基於染色強度及背景染色，使算法最佳化。計算連接素4的陽性染色百分比，且計算F480及CD11c的每mm 2陽性細胞數。
將腫瘤切片溶解於細胞溶解緩衝液2 (R&D Systems®，目錄號895347)。使用MILLIPLEX MAP小鼠細胞介素/趨化介素磁珠集合(Millipore)量測腫瘤樣品中的細胞介素及趨化介素且在LUMINEX MAGPIX系統上讀取。
在RNA-seq分析中，使用TRIZOL Plus RNA純化套組(Life Technologies)，根據製造商方案自急驟冷凍的腫瘤中分離出RNA，從而產生高品質RNA (平均RNA完整數＞ 8)。RNA選擇方法係使用Poly(A)選擇及Illumina的mRNA文庫Prep套組且在單指數Hi-Seq 2×150 bp (Illumina)上讀取。使序列讀段相對於人類及小鼠總轉錄本定位且測定每百萬總讀段數。
使用肯定語言描述多個實施例來大體提供揭示內容。本發明亦特別包括其中特定標的物被完全或部分排除的實施例，諸如物質或材料、方法步驟及條件、方案、程序、分析法或分析。因此，儘管本文中未依本發明不包括的內容來大體表述本發明，但本文揭示了未明確包括於本發明中的態樣。
本文中描述本發明之特定實施例，包括本發明人已知之實施本發明的最佳方式。在閱讀前述描述後，所揭示實施例之變體可對於在此項技術中工作之個體變得顯而易見，且吾人預期，彼等熟習此項技術者可按需要採用此類變體。因此，希望本發明可以除本文具體描述之外的方式實施，且本發明包括隨附申請專利範圍中所描述之標的物的所有變型及等效物，如適用的法律所允許。此外，除非本文另外指出或另外明顯與上下文矛盾，否則本發明涵蓋上述要素呈其所有可能變化形式的任何組合。
本說明書所列舉之所有公開案、專利申請案、寄存編號及其他參考文獻均以全文引用之方式併入本文中，如同各個別公開案或專利申請案具體地且個別地指示以引用之方式併入一般。
已描述本發明之許多實施例。然而，應瞭解可進行各種修改而不背離本發明之精神及範疇。 6. 實例 6.1 實例 1 - 動物模型中膀胱內投與恩諾單抗維多汀之功效及安全性研究6.1.1連接素-4 +膀胱正位異種移植小鼠模型中之功效研究
此研究旨在量測在連接素-4 +膀胱正位異種移植小鼠模型中膀胱內投與恩諾單抗維多汀(EV)之功效。特定言之，且不受任何特定作用機制限制，經由膀胱內投與局部投與EV可使得EV能夠直接暴露於NMIBC細胞，其中全身暴露量減少且安全概況與EV之全身投與相比改善。
表6展示小鼠及大鼠中臨床前實驗之劑量選擇。利用人類尿道上皮膀胱癌細胞株UM-UC-3在SCID小鼠中研發小鼠原位模型，該細胞株經工程化以表現人類連接素-4及螢光素酶(亦即，UM-UC-3-hNectin4+-Luc+)。在大鼠中進行安全性評估，因為EV以與大鼠及人類連接素-4異種同源物相當的親和力結合。 表 6. 劑量選擇
   總劑量 (mg) 劑量濃度 (mg/mL) 劑量含量 a (mg/kg) 劑量 / 膀胱表面積 b (mg/cm 2)
小鼠 0.75 15 30 0.5
大鼠 2 6 12 20 5 15 30 50 10 30 60 100 0.4 1.2 2.5 4.1
人類 ( 批准之總 IV 劑量 ) 125       0.4
a假定78 kg患者(群體藥物動力學EV模型群體之平均體重)，200 g大鼠，25 g小鼠。 b膀胱表面積由膀胱體積衍生，其中V=(4/3)πr 3且SA=4πr 2(Andersson KE,等人. Physiol Rev. 2004;84:935-986)。注意：由於有限全身行暴露及局部投與劑量途徑，體表面積之劑量縮放不適當；實際上，總劑量已針對膀胱組織表面積標準化，以確保相關臨床前劑量(U.S. Food and Drug Administration. Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers 2005. www.fda.gov/media/ 72309/download. Accessed March 1, 2022)。
連接素-4在所有膀胱癌階段中經高度表現，包括非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)及肌肉浸潤性膀胱癌(MIBC) (資料未展示)。為了在模擬膀胱內給藥之條件下活體外評估EV之細胞毒性活性，將過度表現膀胱癌細胞之連接素-4 (UM-UC-3-hNectin-4 +)暴露於EV、未結合的抗連接素-4抗體、未結合的MMAE或對照ADC ( 圖 2)。IV給藥藉由暴露細胞持續96小時來建模。膀胱內給藥藉由2及24小時之暴露來建模，接著洗去測試物品。使用細胞TiterGlo® (Promega公司，Madison，WI，USA)來量測細胞死亡。對於未結合的MMAE，使暴露自96降低至2小時使效能(EC 90)降低44倍，但對於EV (2倍)幾乎不變。對照ADC及未結合的抗連接素-4未引起足夠的活性以確定EC 90(資料未展示)。因此，EV使用模擬膀胱內給藥之條件活體外維持細胞毒性活性( 圖 2)。
為了構築連接素-4 +膀胱原位異種移植小鼠模型，經螢光素酶轉導之UM-UC-3-hNectin4+-Luc+膀胱癌細胞經由導管經尿道滴注至SCID-米色小鼠中( 圖 3A)。總共18隻小鼠用於此研究中：3隻小鼠未處理( 圖 3B，最左側圖名為「未處理」)；5隻小鼠每週一次處理持續兩週，且2小時膀胱內投與無菌水( 圖 3B，左起第二個圖名為「媒劑(SWFI) 2小時膀胱內」)；5隻小鼠每週一次處理持續兩週，且2小時膀胱內投與0.75 mg EV (以15 mg/mL之0.05 mL EV (注意：小鼠中劑量濃度為15 mg/ml對應於小鼠中劑量/膀胱表面積為0.5 mg/cm 2) ( 圖 3B，左起第三個圖名為「EV 2小時膀胱內」)；5隻小鼠每週一次處理持續兩週，且靜脈內投與0.75 mg EV (以3 mg/mL之0.25 mL EV) ( 圖 3B，最右側圖名為「EV IV劑量」)。使小鼠成像以量測EV之功效。另外，在EV投與之後24小時自經處理小鼠中之各者收集血液用於藥物動力學分析。本文涉及之方法為熟習此項技術者熟知。
如 圖 3B中之生物發光成像結果所示，未經處理小鼠及經2小時膀胱內投與無菌水處理之小鼠中的膀胱腫瘤長大( 圖 3B，最左側圖名為「未處理」且左起第二個圖名為「媒劑(SWFI) 2小時膀胱內」)。相比之下，膀胱腫瘤實質上在經2小時膀胱內投與EV處理之小鼠以及經靜脈內投與EV處理之小鼠中消退( 圖 3B，左起第三個圖名為「EV 2小時膀胱內」且最右側圖名為「EV IV劑量」)。 圖 3C中所示之抗連接素-4免疫組織化學結果亦指示經2小時膀胱內投與EV處理之小鼠中膀胱腫瘤消退。 圖 3C中之右側五個圖中之膀胱組織分別來自 圖 3B中之經膀胱內劑量之EV處理的五個小鼠。另外，對 圖 3B中之生物發光成像結果定量及概述於 圖 3D及表7中。在經2小時停留時間膀胱內投與EV處理之小鼠中，腫瘤生長抑制(TGI)在第17天為97.1% (如藉由分析與對照相比總通量單元(光子/秒)所量測) ( 圖 3B，左起第三個圖名為「EV 2小時膀胱內」 圖 3D及表7)。 表 7. NMIBC 原位模型中 EV 之 腫瘤生長抑制
處理 組 劑量含量 途徑 % TGI
未處理 1 N/A N/A 0.0
媒劑 2 N/A 膀胱內 57.4
AGS-22C3E 3 15 mg/mL 膀胱內 97.1
AGS-22C3E 4 3 mg/kg IV 99.9
在研究結束時(開始後16天)，與未處理對照組相比，根據平均腫瘤生物發光訊號計算腫瘤生長抑制。15 mg/mL之膀胱內劑量為750 μg總劑量且表示0.5 mg/cm 2膀胱表面積之劑量。靜脈內遞送之EV的總劑量低約10倍，75 μg/25公克小鼠。
另外，進行免疫組織化學(IHC)染色以評估連接素-4及MMAE在膀胱腫瘤組織中之定位( 圖 3E)。特定言之，在第一EV劑量之後六(6)小時，收集腫瘤且針對連接素-4及抗MMAE染色，如 圖 3E中所繪示。IHC分析顯示在膀胱腫瘤組織中存在連接素-4以及藥物共定位，如藉由生物素結合之抗MMAE初級抗體偵測。
以上結果證實本文所用之連接素-4 +膀胱原位異種移植小鼠模型中腫瘤(NMIBC)移植及膀胱內EV活性。 6.1.2史泊格多利大鼠中之安全性研究
此研究旨在表徵在不同濃度及達至復原EV之最大可行濃度的投與體積下，在單一膀胱內劑量之恩諾單抗維多汀(EV)後，史泊格多利大鼠中對局部組織、血漿暴露及組織藥物含量之影響。
根據表8中顯示之研究設計，以15、30或50 mg/mL向雌性史泊格多利大鼠膀胱內投與0.1、0.2或0.4 mL的單次劑量之EV持續兩小時。 表8.研究設計
組 處理 ( 單次劑量 ) 劑量濃度 (mg/mL) 劑量體積 (mL) 總劑量 (mg) 大鼠編號 (F) 安樂死時間點 ( 給藥後小時數 )
24 hr 168 hr
1 對照 0 0.4 0 3 3 24 hrs (n=3/組)；168 hrs (n=3/組)
2 調配物緩衝液 0 0.4 0 3 3
3 恩諾單抗維多汀 15 0.1 1.5 3 3
4 恩諾單抗維多汀 15 0.2 3 4 3
5 恩諾單抗維多汀 15 0.4 6 3 3
6 恩諾單抗維多汀 30 0.1 3 3 3
7 恩諾單抗維多汀 30 0.2 6 3 3
8 恩諾單抗維多汀 30 0.4 12 3 3
9 恩諾單抗維多汀 50 0.12 6 3 3
10 恩諾單抗維多汀 50 0.24 12 3 3
11 恩諾單抗維多汀 50 0.4 20 3 3
為了測定局部組織(腎臟、膀胱、輸尿管及尿道)中ADC及MMAE之濃度，在EV投與之後24小時自各大鼠收集此等組織用於生物分析及抗MMAE免疫組織化學(IHC)分析。為了測定ADC及MMAE之血清濃度，在不同時間點(EV投與之後1小時、6小時、24小時、72小時以及168小時)自各大鼠收集300 µL血液用於生物分析。本文涉及之方法為熟習此項技術者熟知。
如 圖 4A 及圖 4B中之生物分析結果及表9中之抗MMAE IHC結果所示 ，較高劑量濃度及總劑量，超過較大滴注體積引起膀胱組織中之MMAE含量升高。特定而言， 圖 4A展示在15-50 mg/mL及2小時停留時間下以0.3-4.1 mg/cm 2之劑量向雌性大鼠投與的單次膀胱內劑量之EV，表示以質量計至多100 mg/kg之劑量。將24小時總MMAE之膀胱含量標準化至膀胱組織重量。在膀胱組織中偵測MMAE至多7天，其中峰值濃度在給藥24小時內。另外，MMAE通常在血清中偵測到最少ADC的情況下不可偵測(＜1 ng/mL)。當濃度保持恆定且停留時間在30至120分鐘間變化時，總MMAE含量無有意義的差異(資料未示出)。因此，遞送較高總劑量及濃度之EV將比改變滴注體積或停留時間更能增強活性且增加組織藥物含量。以上結果指示，向雌性史泊格多利大鼠以15、30或50 mg/mL之膀胱內劑量為0.1、0.2或0.4 mL之恩諾單抗維多汀具有良好耐受性。因此，EV之膀胱內投與提供EV之有效局部投與，其中在史泊格多利大鼠中全身暴露有限。 表9.局部組織中之抗MMAE IHC
處理： 水 媒劑 恩諾單抗維多汀
總劑量 (mg) ： 0 0 1.5 3 6 3 6 12 6 12 20
濃度 (mg/ml) ： 0 0 15 15 15 30 30 30 50 50 50
體積 (ml) ： 0.4 0.4 0.1 0.2 0.4 0.1 0.2 0.4 0.12 0.24 0.4
動物編號： 151 152 153 251 252 253 351 352 353 452 453 457 551 552 553 651 652 653 751 752 753 851 852 853 951 952 953 ### ### ### ### ### ###
IHC 評分- 移行細胞染色
URINARY BLADDER - - - - - - 2 - - 1 - - 1 3 2 - 2 - 1 - 4 4 4 4 2 2 - 4 3 4 4 4 3
KIDNEY - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 - - - - -
URETER - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - 4 - 4 4 4 3 2 1 - 3 3 4 3 4 -
URETHRA - - - - - - 1 1 - - - 1 1 1 1 - - - 2 - 4 4 3 3 2 3 - 3 4 4 3 4 1
IHC評分： - = ＜1%移行細胞染色陽性 1 = 1-25%陽性 2 = 26-50%陽性 3 = 50-75%陽性 4 = ＞75%陽性
為了評估毒性之潛能且表徵膀胱內EV之藥物動力學，向雌性大鼠投與六(6)次每週一次膀胱內劑量之EV或對照物。如表10中所示，先前鑑別之目標組織，包括皮膚及骨髓中不存在微觀發現。對應於EV之無作用含量之劑量等效於經批准人類IV劑量之＞20倍。 表 10：劑量毒性研究
每週膀胱內劑量含量 臨床症狀、臨床病理學、器官重量、死亡率、宏觀發現 鏡檢發現 結論
0.1 mg/cm 2(3 mg/kg) 無EV相關發現 無EV相關發現 --
0.4 mg/cm 2(10 mg/kg) 無EV相關發現 無EV相關發現 未觀測到作用含量 (NOEL)
1.2 mg/cm 2(30 mg/kg) 無EV相關發現 腎臟及膀胱之移行上皮細胞中的最小/輕微有絲分裂/凋亡圖 未觀測到之不良作用含量 (NOAEL)
在EV之第一劑量之後使用經驗證之基於ELISA之分析(平均值±SEM)測定膀胱內投與之EV的血清濃度( 圖 5)。平均EV C max為≤750 ng/mL (亦即，比臨床上核准劑量之IV C max低＞35倍)且藉由經驗證之質譜分析未偵測到血清MMAE。時間濃度曲線下血清面積之估算限於僅最高EV劑量(30 mg/kg)，僅可在滴注後至多24小時偵測到。未結合的MMAE之血清濃度低於定量下限(＜10 pg/mL)。因此，EV之膀胱內投與限制全身暴露，具有較低及短暫全身吸收。
因此，表9及 圖 5展示EV之膀胱內投與具有良好耐受性，且無可偵測之局部或全身性毒性，且具有較低及短暫全身性吸收。不受任何特定作用機制限制，此等資料亦表明膀胱內EV之較低全身性吸收可降低用全身性投與EV所觀測到之最常見不良事件的發生率。 6.1.3史泊格多利大鼠之停留時間長度的效應
此研究旨在測定史泊格多利大鼠中膀胱組織在膀胱內投與恩諾單抗維多汀(EV)持續不同長度之停留時間之後的MMAE含量。
具體言之，24隻雌性史泊格多利大鼠隨機分成4組(每組6隻大鼠)。以30 mg/mL向各大鼠膀胱內投與單次劑量之0.4 mL EV持續30、60、90或120分鐘。在EV投與之後24小時自各大鼠收集膀胱組織以用於生物分析以確定膀胱組織中MMAE之濃度。本文涉及之方法為熟習此項技術者熟知。
如 圖6中所繪示，在30分鐘至120分鐘範圍內之不同停留時間長度下，在膀胱內投與EV之大鼠中膀胱組織MMAE含量無實質性差異。在包括可潛在地抑制ADC進入目標細胞之黏液層的因子及控制與傳統小分子相比更大程度之擴散的存在下，此類活體內結果為稍微出人意料的。不受理論束縛，似乎相對短的停留時間可足以使膀胱組織MMAE在大鼠中達到飽和。 6.2 假設實例 2 - 經設計以評估在患有 非肌肉浸潤性膀胱癌 (NMIBC) 之成人中膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性、耐受性、 PK 及抗腫瘤活性的 1 期、 開放標記、多中心、劑量遞增及劑量擴增研究 .6.2.1臨床研究中使用的藥物
恩諾單抗維多汀為與微管破裂劑單甲基奧瑞他汀E (MMAE)共價連接的靶向連接素-4之單株抗體(AGS-22C3)。恩諾單抗維多汀具有三種功能亞單元： ● 完全人類IgG1Κ抗體(AGS-22C3)； ● 微管破裂劑MMAE； ● 使MMAE與AGS-22C3共價連接的蛋白酶可裂解順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸(vc)連接子。
恩諾單抗維多汀結合連接素-4之V域(Challita-Eid等人, Cancer Res (2016); 76(10): 3003-13)。在推測的作用機制中，藥物結合細胞表面上的連接素-4蛋白且內化，從而引起vc連接子發生蛋白分解裂解及MMAE的細胞內釋放。游離的MMAE隨後破壞微管蛋白聚合且導致有絲分裂阻滯。 6.2.2研究概述 6.2.2.1方案名稱：
用於治療患有非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)之患者之膀胱內恩諾單抗維多汀的研究 6.2.2.2研究目標
主要 ● 評估膀胱內恩諾單抗維多汀在患有NMIBC之個體中的安全性及耐受性 ● 鑑別患有NMIBC之個體中膀胱內恩諾單抗維多汀之最大耐受劑量(MTD)或建議劑量
次要 ● 評估膀胱內恩諾單抗維多汀之藥物動力學(PK) ● 評估膀胱內恩諾單抗維多汀之免疫原性 ● 評估膀胱內恩諾單抗維多汀之抗腫瘤活性，如藉由完全反應(CR)速率所量測 ● 評估CR之持續時間 ● 評估膀胱切除術之速率 ● 評估無惡化存活期(PFS) ● 評估不使用膀胱切除術之存活(CFS)
探測性 ● 評估關於反應、毒性、藥力學、藥物動力學/藥力學(PK/PD)關係或對恩諾單抗維多汀之抗性的生物標記物 ● 評估個體報導之經歷及個體報導之治療耐受性 6.2.2.3研究群體
納入準則 1.個體必須患有組織學上確認之具有原位癌(CIS)之非肌肉浸潤性尿道上皮(移行細胞)癌(患有或不患有乳突狀疾病)。組織學確認應在研究治療之第一劑量之前60天內發生。 2.主要組織學組成部分(＞50%)必須為尿道上皮(移行細胞)癌。不包括純變體組織學。 3.個體必須具有高風險卡介苗(BCG)無反應性疾病，其經定義為： ● 在完成足夠BCG療法之12個月內，單獨持續性或復發性CIS或伴有復發性Ta/T1 (非侵入性乳突狀疾病/腫瘤侵入上皮下結締組織)疾病。 足夠BCG療法經定義為以下中之一者： ● 初始誘導過程之6次中之5次劑量+維持療法之3次劑量中之至少2次 ● 初始誘導過程之6次中之5次劑量+第二誘導過程之6次劑量中之至少2次 注意：歸因於全世界BCG不足而不能完成適當過程或接受降低劑量之BCG療法的個體符合在與醫療監測者協商之後入選的條件。 4.在調查員之觀點中，個體必須不符合或拒絕根治性膀胱切除術。 5.所有可見乳突狀Ta/T1腫瘤必須在入選之前60天內完全切除。允許殘留純CIS。 ● 注意到具有T1腫瘤之所有個體在開始研究治療之前應經歷額外re-TURBT (膀胱腫瘤之經尿道切除)。重新分期TURBT必須顯示非受傷側(無腫瘤)固有肌層 6.個體必須具有令人滿意的膀胱功能且保持研究藥物滴注最少1小時之能力，甚至使用術前用藥。 7.年齡為18歲或更大。 8.美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)機能狀態評分為0、1或2 (若適用，則使用卡諾夫斯基量表對機能狀態進行轉換)。 ECOG體能狀態為2之個體必須另外符合以下標準： ● 腎小球濾過率(GFR) ≥50 mL/min ● 可能不會具有紐約心臟協會(NYHA) III級心臟衰竭 9.以下基線實驗室資料： ● 絕對嗜中性白血球計數(ANC) ≥1500/μL； ● 血紅蛋白(Hgb) ≥10 g/dL ● 血小板計數≥100,000/μL ● 血清膽紅素≤1.5 ×正常上限(ULN)或≤3 x ULN，對於患有吉爾伯氏病之個體 ● 經計算之肌酸酐清除率(CrCl) ≥30 mL/min (亦可使用GFR代替肌酸酐或CrCl)。應使用柯克勞夫-高爾特方法或腎病飲食改進(MDRD)等式來計算CrCl。ECOG體能狀態為2之個體必須具有GFR ≥50 mL/min。 ● 丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及天冬胺酸胺基轉移酶(AST) ≤3 × ULN ● 除非個體正接受抗凝血劑療法，只要PT或aPTT在預期使用抗凝血劑之治療範圍內，否則國際標準化比值(INR)或凝血酶原時間(PT)；活化部分凝血激酶時間(aPTT)或部分凝血激酶時間(PTT) ≤1.5 ULN。 10.所估計的預期壽命＞2歲。 11.具有生育潛力之女性個體係已經歷初潮且未進行手術絕育(例如，子宮切除術、雙側輸卵管切除術、雙側卵巢切除術)或尚未完成停經之任何出生為女性的人。閉經在臨床上定義為45歲以上的人在不存在其他生物學、生理或藥理學病因之情況下閉經12個月。具有生育潛力之女性個體必須符合以下條件： ● 同意在研究期間及投與最後一劑研究藥物之後的至少6個月內不嘗試懷孕。 ● 在第1天之前3天內必須具有陰性血清或尿妊娠試驗(最小敏感性25 mIU/mL或β人類絨毛膜激性腺素[β-hCG]之等效單元)結果。具有假陽性結果且陰性妊娠狀態記錄驗證的女性個體有資格入選。 ● 若異性戀活躍，則必須始終使用高效的生育控制方法，其中在篩選開始、整個研究時段且在最後一次劑量之研究藥物之後至少6個月失敗率低於1%。 ● 女性個體必須同意在篩選開始及整個研究時段且在最後一次劑量之研究藥物之後至少6個月哺乳或供給卵。 12.可生育兒童之男性個體係具有睪丸且尚未進行手術絕育(例如，輸精管結紮，接著進行臨床測試證明該程序有效)之任何出生為男性的人。可生育兒童之男性個體必須符合以下條件： ● 在篩選時開始及整個研究階段，以及最後一次劑量之研究藥物之後至少6個月，不得捐獻精子。男性個體告知來自研究治療之生殖功能及生育力的陰性風險。治療之前，應建議男性個體尋求關於生育力保存及精子低溫保存之資訊。 ● 必須始終使用高效的生育控制方法，其中在篩選開始及整個研究時段繼續且在最後一次劑量之研究藥物之後至少6個月失敗率低於1%。 ● 具有懷孕或哺乳配偶之男性個體必須始終使用2個避孕選項中之一者，以防止在懷孕期間或時間配偶在整個研究期間及最後一次劑量之研究藥物之後持續至少6個月再次暴露於精液。 13.個體必須提供書面知情同意書。
排除準則 1.目前罹患肌肉-浸潤性尿道上皮癌(亦即，T2、T3或T4疾病)或轉移性疾病或先前有病史。 2.在研究治療開始之前3個月內，經執行電腦斷層攝影法(computed tomography；CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging；MRI)所註記之結節或轉移性疾病。 3.在研究治療開始前3個月內，經執行CT或MRI尿路造影以及腹部/骨盆對比顯示所註記的伴隨上尿路尿道上皮癌。 4.在研究治療開始前6個月內，由研究者評估已知先前罹患前列腺尿道之尿道上皮癌或伴隨尿道上皮癌之個體。 5.在篩選時患有腫瘤相關腎盂積水之個體(若由研究者確認，則允許患有歸因於除腫瘤以外之病因之腎盂積水的個體)。 6.在第一劑量之研究治療之4週內或在開始研究治療之前6週內用於治療NMIBC之任何膀胱內療法，個體已接受任何其他全身性抗癌療法(例如化學療法、生物療法、免疫療法、靶向療法、內分泌療法、研究性藥劑)，除了以下之外： ● 細胞毒性劑(例如，絲裂黴素C、小紅莓及吉西他濱)在TURBT程序後立即以單次滴注形式投與時，其在研究治療開始之前的14天與60天之間是允許的 7.個體具有繼發於與NMIBC之先前療法相關之不良事件(AE)的持續症狀(2級及更高)。 8.個體先前已經歷針對尿道上皮癌之任何放療。 9.在開始研究治療之前14天內需要全身性(例如，經口或靜脈內)抗生素之活動性感染。接受預防性抗生素(例如，用於預防泌尿道感染[UTI]或慢性阻塞性肺病)之個體為符合條件的。 10.無法耐受膀胱內給藥或膀胱內手術操作之個體。 11.在研究藥物之第一劑量之前的3年內有另一種惡性疾病的病史，或先前診斷之惡性疾病之殘留疾病的任何證據。例外情況為具有可忽略的癌轉移或死亡風險(例如，5年總存活率[OS] ≥90%)之惡性腫瘤，諸如經充分治療之子宮頸CIS、非黑色素瘤皮膚癌、乳腺管CIS或I期子宮癌。 ● 在進入研究前至少1年以明確意圖(以手術方式或用放射療法)治療之前列腺癌(T2N0M0或更低，其中格里森分數≤7)的病史為可接受的，其限制條件為個體視為無前列腺癌，且滿足以下準則： (i)經歷根除性前列腺切除術之個體必須具有不可偵測之前列腺特異性抗原(PSA)持續＞1年及篩選。 (ii)已接收輻射之個體必須具有＞1年之PSA倍增時間(基於至少3個確定之值＞1個月間隔)及不滿足生物化學復發之菲尼克斯準則的總PSA值(亦即，最低點以上＜2.0 ng/mL)。 12.先前暴露於連接素-4靶向療法或含有單甲基奧瑞他汀E (MMAE)之藥劑。 13.患有自體免疫性或發炎性皮膚病症，諸如牛皮癬或異位性皮膚炎之個體，其患有需要任何治療之活動性疾病。 14.具有持續的2級或更高的感官或運動神經病變之個體。 15. B型肝炎表面抗原及/或抗肝炎B核心抗體呈陽性的個體。使用陰性聚合酶連鎖反應(PCR)分析，經過適當抗病毒防治的個體係允許的。 16.活動性C型肝炎感染或已知的人類免疫缺乏病毒(HIV)感染。若已針對C型肝炎感染接受治療的個體已記錄有≥12週的持久病毒反應，則其為允許的。除非由局部健康授權機構授權，否則不需要HIV測試。 17.已知活動性肺結核。 18.患有不可控糖尿病之個體。不可控的糖尿病定義為血紅素A1c (HbA1c) ≥8%或HbA1c 7%至＜8%及否則無法解釋的相關糖尿病症狀(多尿症或煩渴症)。 19.在其第一劑量之恩諾單抗維多汀之前6個月內腦血管事件(例如，中風或暫時性局部缺血發作)、不穩定絞痛症、心肌梗塞或與III-IV級NYHA一致之心臟症狀的記錄病史。 20.自知情同意時直至投與最後一劑研究藥物之後至少6個月，哺乳、懷孕或規劃懷孕之個體。 21.已知對恩諾單抗維多汀或對恩諾單抗維多汀藥物調配物中所含的任何賦形劑(包括組胺酸、二水合海藻糖，及聚山梨醇酯20)重度(≥3級)超敏反應。 22.出現活動性角膜炎或角膜潰瘍的個體。出現淺表性點狀角膜炎的個體若在研究者看來，其病症得到充分治療，則係允許的。 23.在研究者看來，會減弱個體接受或耐受計劃治療及追蹤之能力的其他嚴重潛在醫學病狀。 6.2.2.4計劃之個體之數目
約58名個體入選此研究。此包括在劑量遞增中評估的至多約18名個體及在劑量擴增中評估的約40名個體(各自至多2個具有約20名個體的群組)。 6.2.2.5研究設計
此為經設計以評估在患有NMIBC之成人中膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性、耐受性、PK及抗腫瘤活性的1期、開放標記、多中心、劑量遞增及劑量擴增研究。
研究在2個部分中進行：
劑量遞增：治療約18名個體以評估膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性、耐受性及全身性暴露以鑑別MTD及/或建議劑量。
劑量擴增：以MTD或建議劑量處理約40名個體(至多2名各自為約20名個體之群組)以進一步表徵膀胱內恩諾單抗維多汀的安全性、PK及抗腫瘤活性。
劑量遞增及劑量擴增使患有具有CIS之BCG無反應性NMIBC (患有或不患有乳突狀疾病)的成年個體入選。所有個體在研究下經由膀胱內投與接受恩諾單抗維多汀(研究用藥劑)。對研究之治療在誘導及維持階段期間進行，且個體在完成維持階段之後進入追蹤期。
在誘導階段期間，個體一週一次(q1wk)接受恩諾單抗維多汀之膀胱內滴注持續6週。在誘導階段完成之後六至8週，個體接受其第一研究中反應評估，其後其進入維持階段。在維持階段期間，個體每月一次接受恩諾單抗維多汀，總共9次劑量。
在完成維持階段之後，個體進入研究之後續階段。經由標準照護膀胱鏡檢(亦即，膀胱鏡檢±活組織檢查)及細胞學之腫瘤反應評估在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行，且其後每6個月持續在入選之後5年進行，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法之起始或死亡，以先發生者為準。在因疾病持續、復發、進展或後續抗癌療法之起始所致的研究治療停止之後，個體進入存活追蹤，其中每6個月(±2週)收集存活及後續抗癌療法資料，直至入選後最長5年，失去追蹤、撤回同意書、死亡或由試驗委託者研究終止(以先發生者為準)。
經由膀胱鏡檢及尿液細胞學之反應評估必須在下一次投與研究藥物之前14天內完成。具有異常膀胱鏡檢、陽性或異常尿液細胞學之個體應根據研究者之臨床判斷進行額外評估(例如成像、活組織檢查、在麻醉下檢查)。
在第12個月評估時需要進行膀胱定位活組織檢查以進行研究。在不存在可見腫瘤之情況下，活體組織切片應自膀胱之所有象限獲得(需要最少4個活體組織切片)。在所有其他問診時不需要活體組織切片，但當臨床上指示考慮功效時將考慮活體組織切片。
在任何研究中評估(包括第一研究中3個月評估)時發現患有具有或不具有CIS或階段進展之高級別T1疾病的個體中斷研究治療。第一研究中3個月評估時患有持久性CIS或復發性高級別Ta疾病之個體可在重新同意繼續研究治療之後繼續療法且在6個月時再次評估。開始於6個月評估，患有持久性或復發性高風險NMIBC或疾病進展之任何個體中斷研究治療。更低級別腫瘤之出現、存在或持久性不視為復發。僅患有低級別腫瘤之個體應在切除及組織學確認之後繼續治療。
由於除疾病持續、復發或進展以外之原因而中斷研究治療之個體保持於研究之後續階段。 劑量遞增
當前在美國核准之以1.25 mg/kg之劑量(至多最大劑量之125 mg)全身性恩諾單抗維多汀，以用於治療先前已接受PD-1或PD-L1抑制劑及含鉑化學療法的患有局部晚期或轉移性尿道上皮癌之患者。已良好確立全身性恩諾單抗維多汀之安全概況且其亦在多次臨床試驗中以此劑量含量進行評估。鑒於此確定之全身性劑量及其安全概況，此研究以125 mg膀胱內投與開始評估恩諾單抗維多汀。
該研究之劑量遞增部分評估在4個計劃劑量含量(125、250、500及750 mg)下遞增濃度之恩諾單抗維多汀，及25 mL滴注體積且最長停留時間為90分鐘(或個體耐受之停留時間；實際停留時間將基於適當電子案例報告形式記錄)。使至多約18名個體入選以評估安全性、耐受性、全身性生物可用性，及鑑別膀胱內恩諾單抗維多汀之MTD及/或建議劑量。
使用經修改之毒性機率間隔(mTPI)方法進行劑量遞增。入選按逐個群組進行的。
以上表中所顯示之計劃劑量，在誘導階段期間q1wk持續6週及在維持階段期間一月一次持續9個劑量膀胱內投與恩諾單抗維多汀。試驗委託者及/或安全性監測委員會(SMC)亦可推薦更低及/或中等劑量含量之調查。若未實現MTD，則可研究高於750 mg之劑量含量。 劑量限制性毒性
在研究之劑量遞增部分期間評估劑量限制性毒性(DLT)。DLT評估期間為自誘導開始至所有6個誘導劑量之完成加上1週之時間。若個體經歷DLT或已接受最少5個誘導劑量之恩諾單抗維多汀，則其將視為DLT-可評估(DE)個體。
若研究者評估與用膀胱內恩諾單抗維多汀治療相關，則DLT經定義為以下中之任一者。定級將根據NCI CTCAE，5.0版本： ● 出現3級或更高級治療引發之泌尿道AE，諸如血尿、排尿困難、尿瀦留、尿頻/尿緊或膀胱痙攣 ● 3級或更高級腹股溝或會陰區域的局部皮膚或黏膜反應 ● 根據研究者評估，引起與研究藥物相關的血淤阻礙之血尿 ● 3級或更高級血液毒性(若其比基線增加≥2個等級)，包括： o嗜中性白血球減少性發熱 - 3級發熱性嗜中性白血球減少症經定義為ANC ＜1000/mm 3，其中單次溫度為＞38.3℃ (101°F)或持續溫度≥38℃ (100.4°F)持續超過1小時 - 4級發熱性嗜中性白血球減少症經定義為ANC ＜1000/mm 3，其中單次溫度為＞38.3℃ (101°F)或持續溫度≥38℃ (100.4°F)持續超過1小時，其危及生命結果且指示緊急干預 o 4級嗜中性白細胞減少症或血小板減少症持續＞7天 o 3級血小板減少症伴有出血 ● 除非藉由潛在醫學病況、間發疾病或惡性病解釋，否則任何其他3級或更高級非血液AE。 ● 持續＞14天之未解決的治療相關之2級AE ● 不明顯歸因於潛在疾病或外來原因之任何死亡。 ● Hy定律之病例
以下非血液學毒性不視為DLT： ● 3級噁心/嘔吐或腹瀉＜ 72小時，使用充足抗嘔劑及其他支持性護理 ● 3級疲乏＜1週 ● 持續＜72小時，臨床上不複雜，且自發解決或對習知醫療干預起反應的≥3級電解質或其他非血液學實驗室異常 ● 不與胰臟炎之症狀或臨床表現相關的≥ 3級澱粉酵素或脂肪酶 劑量擴增
為了進一步表徵膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性、耐受性、PK及抗腫瘤活性，約40名額外個體入選至多2個劑量擴增群組(每個群組約20名個體)。若在研究之劑量遞增部分中鑑別MTD，則在劑量擴增中評估對應劑量含量。若未達到MTD，或若保證進一步評估不同劑量含量，則與SMC一起協商之主持者亦可評估劑量擴增中超過1個劑量含量。此等劑量擴增群組之開始係由主持者基於在劑量遞增期間展現之累積安全性及活性與SMC協商來確定。 安全性監測委員會
由現場調查員及試驗委託者代表組成之SMC (包括研究醫學監測、藥物安全代表、臨床科學家及生物製劑醫師)將監測個體安全性且在劑量遞增及劑量擴增過程中進行給藥建議。SMC可建議以給定劑量進一步評估安全性(亦即，以給定劑量招募額外個體)或調查低於計劃劑量含量或接近計劃劑量含量的劑量含量。SMC亦審查累積安全資料，以鑑別可歸因於DLT窗之外的累積暴露而出現的安全問題。SMC亦可審查抗腫瘤活動資料以確定益處風險概況是否支持繼續研究或停止研究劑量或群組之調查。SMC提供建議且藉由試驗委託者作出最終決策。更多細節記錄在SMC章程中。 6.2.2.6研究產品、劑量及投與模式
恩諾單抗維多汀在誘導階段期間膀胱內投與q1wk持續6週及在維持階段期間一月一次持續9個劑量。 6.2.2.7治療持續時間
在誘導階段期間，個體q1wk接受恩諾單抗維多汀之膀胱內滴注持續6週。在誘導階段完成之後六至8週，個體接受其第一研究中反應評估，其後其進入維持階段。在維持階段期間，個體每月一次接受恩諾單抗維多汀，總共9次劑量。 6.2.2.8112B反應/功效評估
研究中之腫瘤反應評估在篩選時經由標準照護膀胱鏡檢(亦即，膀胱鏡檢±活組織檢查)及細胞學進行，接著在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行評估，且其後每6個月進行評估持續入選之後5年。
經由膀胱鏡檢及尿液細胞學之反應評估必須在下一次投與研究藥物之前14天內完成。具有異常膀胱鏡檢、陽性或異常尿液細胞學之個體應根據研究者之臨床判斷進行額外評估(例如成像、活組織檢查、在麻醉下檢查)。
當對個體進行研究時，每年進行一次上尿路成像，如臨床指示。
在第12個月評估時需要進行膀胱定位活組織檢查以進行研究。在不存在可見腫瘤之情況下，活體組織切片應自膀胱之所有象限獲得(需要最少4個活體組織切片)。在所有其他問診時不需要活體組織切片，但當臨床上指示考慮功效時考慮活體組織切片。
當個體具有所有以下發現時，該等發現均視為具有CR： 1.膀胱鏡檢：膀胱之正常外觀。在膀胱鏡檢上出現異常之情況下，活體組織切片應為陰性或展現出低級Ta、具有低惡性潛能之任何級別乳突狀尿道上皮贅瘤或任何級別乳突狀瘤。若進行隨機膀胱活組織檢查，則此等活體組織切片應為陰性或顯示為低級別疾病。 2.尿液細胞學：陰性。 a.不確定之尿液細胞學應根據方案評估 b.陽性尿液細胞學應藉由膀胱鏡檢±活組織檢查及成像在臨床上進一步評估 3.成像(若執行)：正常或若發現異常，則發現應支援膀胱中之CR。
由於研究治療之膀胱內投與，若個體患有惡性尿液細胞學之陰性膀胱鏡檢，若癌症發現於上尿路或前列腺尿道中且隨機膀胱活組織檢查為陰性，則將其視為具有CR。
持續性疾病定義為存在有或無乳突狀疾病之CIS疾病(高級別Ta/T1)。
復發定義為開始療法之後的高級別疾病(高級別Ta、T1或CIS)之再現。復發必須藉由活體組織切片證實。
進展經定義為發展出以下中之任一者：T1疾病(固有層浸入)、≥T2疾病(肌肉-浸潤性)、淋巴結(N1+)、遠端癌轉移(M1)或級別自低至高增加。
較低級別疾病之持久性、出現或存在不視為復發。患有復發性低級乳突狀疾病之個體可經歷切除且繼續進行研究。 6.2.2.9藥物動力學及免疫原性評估
在方案定義之時間點收集用於PK及抗治療性抗體(ATA)分析之血液樣品及用於PK分析之尿液樣品。所估計之恩諾單抗維多汀之劑量相關血液PK參數可包括(但不限於)濃度-時間曲線下面積(AUC)、最大濃度(Cmax)、達至最大濃度之時間(Tmax)、表觀終末半衰期(t1/2)及谷值濃度(Ctrough)。視需要評估額外分析物。 6.2.2.10 藥力學及生物標記物評估 腫瘤組織中之生物標誌物
若可獲得，則所有個體需要在入選12個月內收集之存檔腫瘤組織(應使用最近可獲得的組織)。若僅可提供新鮮切割之載片，則最少需要10至15個切片(若小於10個，則聯繫試驗委託者)。在第12個月評估時需要活組織檢查且應如臨床上指示在所有其他評估時進行活組織檢查。來自在治療時收集之活體組織切片的組織用於生物標記評估。
為理解治療之前腫瘤之生物學特徵與個體結果之間的關係，檢驗來自TURBT之組織(腫瘤活體組織切片)。針對腫瘤中之特定藥力學、預測性及預後生物標記物評估活體組織切片。若組織可獲自入選後收集之標準照護活體組織切片，則亦檢驗其進一步鑑別反應之生物標記物及作用機制及對治療之抗性。
腫瘤組織中之生物標記物評估可包括(但不限於)：藉由免疫組織化學及次世代定序對連接素-4及PD-L1表現進行集中評估、腫瘤亞型分析、腫瘤微環境分析及對體細胞突變或通常在癌症中變化之基因或RNA的變化進行分析。 血液及 / 或尿液中之生物標誌物
恩諾單抗維多汀對腫瘤細胞的主要作用可使得局部的腫瘤相關及周邊免疫細胞的活化狀態發生變化。血液及尿液樣品中之生物標記物評估可包括(但不限於)循環/游離腫瘤DNA、可溶性連接素-4酶聯結免疫吸附分析(ELISA)評估、泌尿生物標記物之免疫分析及免疫功能之標記，包括免疫細胞亞群及細胞介素之豐度。 6.2.2.11 安全性評估
安全性評估包括：包括嚴重不良事件(SAE)之AE的監測及記錄、伴隨藥物治療之記錄及方案指定之體檢結果及實驗室測試之量測。 6.2.2.12 其 他評估
經由電話訪問持續45至60分鐘定性評估個體視角，涵蓋關於治療之經驗及耐受性的主題。關於在此等訪問期間所探索之主題及問題的額外細節描述於個體訪問指南文件中。在以下時間點在劑量遞增及劑量擴增期間進行訪問：在誘導階段結束時，在維持階段期間5次劑量之完成時及在維持階段結束時。 6.2.2.13統計方法
MTD之劑量遞增及鑑別係使用mTPI方法進行。在劑量遞增結束時，呈現DLT之機率的基於模型的評估以及95%可信度間隔。DE分析組包括所有經處理之個體的劑量遞增，其經歷DLT或接受至少5個誘導劑量之恩諾單抗維多汀。DE分析組為用於測定MTD的主要群體。
安全性及抗腫瘤活性終點係使用基於所有經處理個體分析組之描述性統計資料，包括經任何量之研究藥物治療之所有個體來概述。在研究上任何時間之CR速率、在3、6、12、18及24個月之CR速率及膀胱切除術之速率連同精確95%之2邊信賴區間(CI)一起彙總。CR之持續時間、PFS及不使用膀胱切除術存活期使用卡本-麥爾方法估算。
未對擴增群組計劃正式的假設檢驗。假定所觀測到之CR比率在30%至50%範圍內，則95%及80%精確CI(其中每群組20名個體)概述於下表11中。 表11
CR比率 95%精確CI (n=20) 80%精確CI (n=20)
30% (12%，54%) (17%，47%)
40% (19%，64%) (25%，57%)
50% (27%，73%) (34%，66%)
CI=信賴區間；CR=完全反應 6.2.3目標
此研究評估膀胱內恩諾單抗維多汀在患有NMIBC之個體中的安全性、耐受性、PK及抗腫瘤活性。研究之特定目標及對應終點概述於下表12中。 表12
主要目標 相應主要終點
評估膀胱內恩諾單抗維多汀在患有NMIBC之個體中的安全性及耐受性 鑑別患有NMIBC之個體中膀胱內恩諾單抗維多汀之MTD或建議劑量 AE的類型、發生率、嚴重度、嚴重性及相關性 實驗室異常之類型、發生率及嚴重度 劑量含量之DLT發生率及累積安全性
次要目標 相應次要指標
評估膀胱內恩諾單抗維多汀之PK 評估膀胱內恩諾單抗維多汀之免疫原性 評估如藉由CR速率所量測之膀胱內恩諾單抗維多汀之抗腫瘤活性 評估CR之持續時間 評估膀胱切除術之速率 評估無進展存活期 評估不使用膀胱切除術之存活 所選PK參數之評估，包括AUC、Cmax、Tmax、t1/2、Ctrough  ATA之發生率 在研究任何時間之CR比率及3、6、12、18及24個月之CR比率  CR之持續時間 膀胱切除術之速率 無進展存活期 不使用膀胱切除術之存活
探究性目標 相應探索性指標
評估針對反應之生物標記物、毒性、藥力學、PK/PD關係或對恩諾單抗維多汀之抗性 評估個體報導之經歷及個體報導之治療耐受性 藥力學量測及PK、反應、毒性及抗性評估之相關分析 評估連接素-4及PD-L1表現量腫瘤細胞作為臨床活性之探索性預測性生物標記物 恩諾單抗維多汀介導之藥力學作用的生物標記物包括(但不限於)無細胞腫瘤DNA、可溶性連接素-4、細胞激素之含量 個體經歷，如藉由個體訪問所評估
AE=不良事件；ATA=抗治療性抗體；AUC=濃度-時間曲線下面積；Cmax=最大濃度；CR=完全反應；Ctrough=谷值濃度；DLT= 劑量限制性毒性；MTD=最大耐受劑量；NMIBC=非肌肉浸潤性膀胱癌；PD-L1=計劃性死亡-配體1；PK=藥物動力學；PK/PD=藥物動力學/藥力學；Tmax=最大濃度出現的時間；t1/2=半衰期 6.2.4研究計劃 6.2.4.1 研究設計之概述
此為經設計以評估在患有NMIBC之成人中膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性、耐受性、PK及抗腫瘤活性的1期、開放標記、多中心、劑量遞增及劑量擴增研究。
研究在2個部分中進行： ● 劑量遞增：治療約18名個體以評估膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性、耐受性及全身性暴露以鑑別最大耐受劑量(MTD)及/或建議劑量。 ● 劑量擴增：以MTD或建議劑量處理約40名個體(至多2名各自為約20名個體之群組)以進一步表徵膀胱內恩諾單抗維多汀的安全性、PK及抗腫瘤活性。
劑量遞增及劑量擴增使患有具有CIS之BCG無反應性NMIBC (患有或不患有乳突狀疾病)的成年個體入選。所有個體在研究下經由膀胱內投與接受恩諾單抗維多汀(研究用藥劑)。對研究之治療在誘導及維持階段期間進行，且個體在完成維持階段之後進入追蹤期。
在誘導階段期間，個體一週一次(q1wk)接受恩諾單抗維多汀之膀胱內滴注持續6週。在誘導階段完成之後六至8週，個體接受其第一研究中反應評估，其後其進入維持階段。在維持階段期間，個體每月一次接受恩諾單抗維多汀，總共9次劑量。
在完成維持階段之後，個體進入研究之後續階段。經由標準照護膀胱鏡檢(亦即，膀胱鏡檢±活組織檢查)及細胞學之腫瘤反應評估在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行，且其後每6個月持續在入選之後5年進行，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法之起始或死亡，以先發生者為準。在因疾病持久性、復發、進展或後續抗癌療法之起始所致的研究治療停止之後，個體進入存活追蹤，其中每6個月(±2週)收集存活及後續抗癌療法資料，直至入選後最長5年，失去追蹤、撤回同意書、死亡或由試驗委託者研究終止(以先發生者為準)。
經由膀胱鏡檢及尿液細胞學之反應評估必須在下一次投與研究藥物之前14天內完成。具有異常膀胱鏡檢、陽性或異常尿液細胞學之個體應根據研究者之臨床判斷進行額外評估(例如成像、活組織檢查、在麻醉下檢查)。
在第12個月評估時需要進行膀胱定位活組織檢查以進行研究。在不存在可見腫瘤之情況下，活體組織切片應自膀胱之所有象限獲得(需要最少活體組織切片)。在所有其他問診時不需要活體組織切片，但當臨床上指示考慮功效時考慮活體組織切片。
在任何研究中評估(包括第一研究中3個月評估)時發現患有具有或不具有CIS或階段進展之高級別T1疾病的個體中斷研究治療。第一研究中3個月評估時患有持久性CIS或復發性高級別Ta疾病之個體可在重新同意繼續研究治療之後繼續療法且在6個月時再次評估。開始於6個月評估，患有持久性或復發性高風險NMIBC或疾病進展之任何個體中斷研究治療。更低級別腫瘤之出現、存在或持久性不視為復發。僅患有低級別腫瘤之個體應在切除及組織學確認之後繼續治療。
由於除疾病持續、復發或進展以外之原因而中斷研究治療之個體保持於研究之後續階段。 圖 7呈現總體研究設計。
由現場調查員及試驗委託者代表組成之安全性監測委員會(SMC)(包括研究醫學監測、藥物安全代表、臨床科學家及生物製劑醫師)監測個體安全性且在劑量遞增及劑量擴增過程中進行給藥建議。SMC可建議以給定劑量進一步評估安全性(亦即，以給定劑量招募額外個體)或調查低於計劃劑量含量或接近計劃劑量含量的劑量含量。SMC亦審查累積安全資料，以鑑別可歸因於劑量限制性毒性(DLT)窗之外的累積暴露而出現的安全問題。SMC亦可審查抗腫瘤活動資料以確定益處風險概況是否支持繼續研究或停止研究劑量或群組之調查。SMC提供建議且將藉由試驗委託者作出最終決策。更多細節記錄在SMC章程中。 (i)劑量遞增群組
約18名個體入選劑量遞增。
劑量遞增使用經修改之毒性機率區間(mTPI)方法(Ji 2010)進行，以評估安全性及耐受性且鑑別膀胱內恩諾單抗維多汀之MTD及/或建議劑量。安全性、PK、藥力學、生物標記分析及初步抗腫瘤活性用於確定建議劑量及時程。
mTPI方法使用貝氏模型來計算3次間隔之後驗機率，其反映各劑量含量對目標DLT速率之毒性速率之間的相對距離。針對25%之目標DLT率確定給藥決策規則，其中5%裕度。3次間隔為(0%，20%)、(20%，30%)及(30%，100%)及相應給藥決策規則為 1.若當前劑量DLT率可能＜20%，則遞增， 2.若當前劑量DLT率可能在20%與30%之間，則維持， 3.若當前劑量DLT率可能＞30%，則遞減。
劑量探索決策展示於表13中。「E」表示遞增劑量，「S」表示維持相同劑量且「D」表示遞減劑量。決策「DU」意謂當前劑量因為高毒性而為不可接受的。若DLT比率高於25%之後驗機率超過95%，則將劑量定義為具有不可接受的毒性。 表13. mTPI設計之劑量發現試算表
DLT數目 在當前劑量下DLT可評價個體之數目
   2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0 E E E E E E E E E E E E E E
1 S S S S E E E E E E E E E E
2 DU D D S S S S S S S S S E E
3    DU DU DU D S S S S S S S S S
4       DU DU DU DU DU D S S S S S S
5          DU DU DU DU DU DU D S S S S
6             DU DU DU DU DU DU DU DU D S
7                DU DU DU DU DU DU DU DU DU
8                   DU DU DU DU DU DU DU DU
9                      DU DU DU DU DU DU DU
10                         DU DU DU DU DU DU
11                            DU DU DU DU DU
12                               DU DU DU DU
13                                  DU DU DU
14                                     DU DU
15                                        DU
D=遞減至下一個較低劑量；DLT=劑量限制性毒性；DU=當前劑量具有不可接受之毒性；E=遞增至下一個較高劑量；mTPI=經修改之毒性機率區間；S=維持在當前劑量。
入選按逐個群組進行的。關於劑量遞增及後續群組大小(最少2名個體)之決策由試驗委託者在完成各群組之後與SMC一起查詢。在使下一群組之患者入選之前，必須在DLT期之完整持續時間內觀測當前群組中之個體。作為注意事項，對於研究中之最初2名個體，在各個體在下一個體可給藥之前接受其第一劑量之研究藥物之後存在72小時觀測期。在高於劑量含量1之劑量下，在第一個體在以彼劑量含量給藥後續個體之前接受其第一劑量之膀胱內恩諾單抗維多汀之後需要72小時觀測期。替換視為對DLT不可評估之個體。在停止劑量遞增之前，在所估計MTD下觀測到最少6個DLT-可評估(DE)個體。基於所有評估劑量中所有個體之資料評估MTD。若未達到MTD，則使用安全性、PK、藥力學及生物標記資料以及初步抗腫瘤活性來確定建議劑量。
藉由試驗委託者在與SMC協商之任何時間執行降級至較低或中等劑量含量。
該研究之劑量遞增部分評估在4個計劃劑量含量(125、250、500及750 mg；參見表3)下遞增濃度之恩諾單抗維多汀，及25 mL滴注體積且最長停留時間為90分鐘(或個體耐受之停留時間；實際停留時間基於適當電子案例報告形式[eCRF]記錄)。在研究之劑量遞增部分中招募至多約18名個體。以表14中所顯示之計劃劑量，在誘導階段期間q1wk持續6週及在維持階段期間一月一次持續9個劑量膀胱內投與恩諾單抗維多汀。試驗委託者及/或SMC亦可推薦較低劑量及/或中間劑量含量之調查。若未達到MTD，則探索高於750 mg之劑量含量。 表 14. 劑量遞增方案
   劑量含量 a 劑量(mg)
   1 125
   2 250
   3 500
   4 750
q1wk=一週一次；SMC=安全監測委員會；給藥頻率：誘導q1wk持續6週；維持：一月一次持續9次劑量；25 mL之滴注體積。 a  SMC可基於新出現的臨床資料推薦對較低或中等劑量含量之調查。 (ii)劑量擴增群組
為了進一步表徵膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性、耐受性、PK及抗腫瘤活性，約40名額外個體入選至多2個劑量擴增群組(每個群組約20名個體)。若在研究之劑量遞增部分中鑑別MTD，則在劑量擴增中評估對應劑量含量。若未達到MTD，或若保證進一步評估不同劑量含量，則與SMC一起協商之主持者亦可評估劑量擴增中超過1個劑量含量。此等劑量擴增群組之開始係由試驗委託者基於在劑量遞增期間展現之累積安全性及活性與SMC協商來確定。 (iii)治療持續時間
在誘導階段期間，個體q1wk接受恩諾單抗維多汀之膀胱內滴注持續6週。在誘導階段完成之後六至8週，個體接受其第一研究中反應評估，其後其進入維持階段。在維持階段期間，個體每月一次接受恩諾單抗維多汀，總共9次劑量。 (iv)劑量限制性毒性
在研究之劑量遞增部分期間評估DLT。DLT評估期間為自誘導開始至所有6個誘導劑量之完成加上1週之時間。若個體經歷DLT或已接受最少5個誘導劑量之恩諾單抗維多汀，則其將視為DE個體。
若研究者評估與用膀胱內恩諾單抗維多汀治療相關，則DLT經定義為以下中之任一者。定級係根據國家癌症研究所不良事件常見術語標準(NCI CTCAE) 5.0版本： ●出現3級或更高級治療引發之泌尿道AE，諸如血尿、排尿困難、尿瀦留、尿頻/尿緊或膀胱痙攣 ● 3級或更高級腹股溝或會陰區域的局部皮膚或黏膜反應 ●根據研究者評估，引起與研究藥物相關的血淤阻礙之血尿 ●  3級或更高級血液毒性(若其比基線增加≥2個等級)，包括： ○ 嗜中性白血球減少性發熱 ● - 3級發熱性嗜中性白血球減少症經定義為絕對嗜中性白血球計數(ANC) ● ＜1000/mm 3，其中單次溫度為＞38.3℃ (101°F)或持續溫度≥38℃ (100.4°F)持續超過1小時 ● - 4級發熱性嗜中性白血球減少症經定義為ANC ＜1000/mm 3，其中單次溫度為＞38.3℃ (101°F)或持續溫度≥38℃ (100.4°F)持續超過1小時，其危及生命結果且指示緊急干預 ○  4級嗜中性白細胞減少症或血小板減少症持續＞7天 ○  3級血小板減少症伴有出血 ● 除非藉由潛在醫學病況、間發疾病或惡性病解釋，否則任何其他3級或更高級非血液AE。 ● 持續＞14天之未解決的治療相關之2級AE ● 不明顯歸因於潛在疾病或外來原因之任何死亡。 ● Hy定律之病例
以下非血液學毒性不視為DLT： ● 3級噁心/嘔吐或腹瀉＜ 72小時，使用充足抗嘔劑及其他支持性護理 ● 3級疲乏＜1週 ● 持續＜72小時，臨床上不複雜，且自發解決或對習知醫療干預起反應的≥3級電解質或其他非血液學實驗室異常 ● 不與胰臟炎之症狀或臨床表現相關的≥ 3級澱粉酵素或脂肪酶 (v)停止準則 (a)群組層面下之入選暫停
若試驗委託者認為死亡與恩諾單抗維多汀相關，則以彼劑量及所有較高劑量暫停入選，直至： 1.案例由研究者、試驗委託者及SMC審查，且 2.試驗委託者通知安全性評估之結果的適用法規當局及用於在受影響群組中重新開始入選的調整，且在當地法規需要時已接受批准以恢復。 (b)全部研究之入選停止
若認為總益處風險平衡為負，則試驗委託者中斷整個研究中之入選。
在整個研究中由試驗委託者及SMC連續監測安全性，若毒性之發生率及/或嚴重程度引起對研究群體不可接受之風險益處評估，則考慮停止入選。試驗委託者同意SMC以考慮是否允許已接受治療之個體繼續、考慮對方案之修改以繼續入選或終止研究。
若由於安全問題停止入選，則可僅在適當修正及通知授權機構之後重新開始入選，在當地法規需要時批准恢復。 (vi)研究終點
在招募最後一名個體之後約5年或當無個體留在追蹤時(以先發生者為準)停止研究。另外，試驗委託者可在任何時間終止研究。 (vii)安全性監測委員會
SMC監測恩諾單抗維多汀在整個劑量遞增及劑量擴增中之安全性。SMC由現場調查員及試驗委託者代表(包括研究醫學監測、藥物安全代表、臨床科學家及生物製劑醫師)構成。委員會經由包括關於劑量遞增決策及治療引發(TE)毒性之資料之審閱的常規及/或特用會議監測此研究中參與者之安全性。在最低限度下，在群組中之所有個體已完成DLT評估期之後，在研究之遞增部分期間舉行SMC會議。SMC審查來自入選之個體之臨床資料用於安全性評估及DLT確定。SMC給出劑量含量及群組大小決策以及mTPI規則圖。根據mTPI模型，多個群組以劑量含量入選。SMC在整個劑量擴增中亦近似每季度地滿足以用於累積個體資料審查。
除DLT及劑量遞增建議之確定以外，SMC可在研究期間作出以下建議中之一或多者，如可適用： ● 對給定劑量下安全性之進一步評估 ● 評估研究藥物投與之替代方法(例如，增加投與持續時間或在投與之前需要預藥物治療) ● 評估劑量遞增期間之較低或中等劑量含量 ● 基於遞增期間之劑量含量之活性及耐受性在擴增群組中待評估之劑量之建議 ● 基於安全性及活動資料針對膀胱內恩諾單抗維多汀之單藥劑劑量及時程的建議 ● 若未達到MTD，則評估劑量遞增期間的較高劑量含量
更多細節記錄在SMC章程中。 6.2.4.2研究設計之論述及基本原理
此首次用於人體(FIH)研究為1期、劑量遞增及劑量擴增研究以評估在誘導階段期間q1wk投與之膀胱內恩諾單抗維多汀持續6週之安全性及耐受性及在維持階段期間持續總共9次劑量，且估計MTD及/或確定患有NMIBC之個體中之建議劑量及時程。膀胱內恩諾單抗維多汀之初始臨床進展涉及其在BCG無反應的且不具有適當標準治療選項之個體中之評估(例如，對於不符合或拒絕經歷根治性膀胱切除術)且為治療醫師觀點中恩諾單抗維多汀膀胱內投與之候選物。
劑量遞增用於估算MTD及/或確定膀胱內恩諾單抗維多汀之建議劑量。一旦完成劑量遞增且證實藥物之初始安全性，則約20名個體之至多2個擴增群組各自入選，以進一步評估膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性及抗腫瘤活性。擴增群組允許收集關於膀胱內恩諾單抗維多汀之安全性、耐受性、PK及抗腫瘤活性的額外資訊。此資訊將提供膀胱內恩諾單抗維多汀之進一步發展的基礎。 (i)在劑量遞增期間使用mTPI之基本原理
選擇mTPI劑量遞增方法用於此研究，因為其具有優於用於劑量發現之傳統「3+3」方法的潛在優勢。此等優點包括能夠靶向任何預先指定DLT率，治療MTD以上之較少個體，由此改進安全性，且允許靈活的群組大小(Ji 2010)。mTPI方法亦使用來自所有劑量含量下治療之個體的資訊來評估MTD，以改進評估準確性。 (ii)將個體分配至治療組之方法
在劑量遞增期間，個體分配至劑量含量係藉由如表13中所說明之mTPI決策規則確定，且在由試驗委託者批准個體入選之後進行。
在劑量擴增期間，將個體入選於至多2名各自具有約20名個體的群組中。若在研究之劑量遞增部分中鑑別MTD，則在劑量擴增中評估對應劑量含量。若未達到MTD，或若保證進一步評估不同劑量含量，則與SMC一起協商之主持者亦可評估劑量擴增中超過1個劑量含量。此等劑量擴增群組之開始將由試驗委託者基於在劑量遞增期間展現之累積安全性及活性與SMC協商來確定。
醫療監測者評估在整個試驗中恩諾單抗維多汀膀胱內投與之安全性，且出於安全原因，可超過個體之模型分配至特定劑量含量。 (iii)劑量選擇之基本原理
針對在新佐劑/佐劑、局部晚期或轉移性環境中先前已接受PD-1或PD-L1抑制劑及含鉑化學療法之患有局部晚期或轉移性UC之患者的治療當前在美國核准以1.25 mg/kg之劑量(至多125 mg最大劑量)全身性恩諾單抗維多汀且亦在臨床試驗中在此劑量下進行評估。在此劑量含量下之恩諾單抗維多汀的安全概況已在全身性實體腫瘤試驗中充分建立，且具體言之在膀胱癌中(EV-101、EV-201、EV-301；參見調查員手冊瞭解更多詳情)。鑒於耐受性、低全身性吸收及125 mg全身性恩諾單抗維多汀之已知安全概況的臨床前證據，此研究將以125 mg之膀胱內投與開始評估恩諾單抗維多汀。 (iv)盲性及非盲性
此為開放標記研究。 6.2.5研究群體
個體必須滿足適合此研究的所有招募準則。研究者不可放棄合格性準則且在優良臨床試驗規範稽查及/或健康管理機構檢查的情況下對合格性準則進行評審。 6.2.5.1納入及排除標準
參見章節6.2.2。 6.2.5.2生育潛能
具有生育潛力之個體係已經歷初潮且未進行手術絕育(例如，子宮切除術、雙側輸卵管切除術、雙側卵巢切除術)或尚未完成停經之任何出生為女性的人。閉經在臨床上定義為45歲以上的人在不存在其他生物學、生理或藥理學病因之情況下閉經12個月。
可生育兒童之個體係具有睪丸且尚未進行手術絕育(例如，輸精管結紮，接著進行臨床測試證明該程序有效)之任何出生為男性的人。 6.2.5.3 自研究治療或評估移除個體
若個體自研究治療或自研究退出，則必須通知研究之試驗委託者。個體之退出原因必須記錄在個體醫療記錄及案例報告形式(CRF)中。 (i)研究治療中止
個體之研究治療出於以下原因中之任一者而中止： ● 根據方案完成治療 ● 持續性、復發性或進行性疾病 ○ 在任何研究中評估(包括第一研究中3個月評估)時發現患有具有或不具有CIS或階段進展之高級別T1疾病的個體中斷研究治療 ○ 第一研究中3個月評估時患有持久性CIS或復發性高級別Ta疾病之個體可在其重新同意繼續研究治療之後繼續療法且在6個月時再次評估。 ○ 開始於6個月評估，患有持久性或復發性高風險NMIBC或疾病進展之任何個體中斷研究治療。 ● 更低級別腫瘤之出現、存在或持久性將不視為復發。僅患有低級別腫瘤之個體應在切除及組織學確認之後繼續治療。 ● 不良事件(AE) ● 懷孕 ● 研究者判斷 ● 個體決策，非AE ● 由試驗委託者終止研究 ● 其他非AE
除非個體撤銷同意書，否則中斷研究治療之個體將繼續進行後續研究。 (ii)與肝臟安全相關之治療中斷建議
在沒有解釋增強型肝功能測試(諸如病毒性肝炎、先前存在的肝病或急性肝病，或暴露於與肝臟損傷相關的其他藥劑)的情況下，中斷個體的研究治療。研究者可判定，繼續研究治療不符合該個體之最佳利益。若出現以下情況，則應考慮中斷治療： ● ALT或AST ＞8 × ULN ● ALT或AST＞5 × ULN，超過2週 ● ALT或AST ＞3 × ULN及總膽紅素＞2 × ULN或INR ＞1.5 (若INR測試適用/評估) ● ALT或AST＞3×ULN，出現暗示肝臟損傷(例如右上腹疼痛或觸痛)及/或嗜酸性球增多症(＞5%)的症狀
此等治療中斷建議係基於FDA行業指南(藥物誘發性肝臟損傷：市售前的臨床評價(Drug-Induced Liver Injury: Premarketing Clinical Evaluation)，2009年7月)。該等建議為對研究者的基本指導，其基於藥物開發中積累的臨床經驗，而非特指恩諾單抗維多汀的臨床經驗。 (iii)個體退出研究
任何個體出於以下原因中之任一者而中止研究： ● 根據方案完成研究 ● 個體撤回同意書 ● 由試驗委託者終止研究 ● 失去追蹤 ● 死亡 ● 其他 6.2.6處理 6.2.6.1所投與之療法
所有個體在此方案中在研究下經由膀胱內投與接受恩諾單抗維多汀(研究用藥劑)。 6.2.6.2研究產品
描述恩諾單抗維多汀之製備、投與及儲存的詳細資訊位於藥理學說明中。 (i)說明書
藉由使含有MMAE與連接子亞單元的化學中間物與抗體之半胱胺酸殘基結合來產生恩諾單抗維多汀。所得ADC含有平均3.8個藥物分子/抗體。恩諾單抗維多汀藥品為無菌、無防腐劑的白色至灰白色凍乾粉末，其復原後膀胱內投與。恩諾單抗維多汀於30 mg單次劑量小瓶中供應。 (ii)劑量及投與
恩諾單抗維多汀在誘導階段期間膀胱內投與q1wk持續6週及在維持階段期間一月一次持續9個劑量。
該研究之劑量遞增部分評估在4個計劃劑量含量(125、250、500及750 mg)下遞增濃度之恩諾單抗維多汀，及25 mL滴注體積且最長停留時間為90分鐘(或個體耐受之停留時間；實際停留時間將基於適當eCRF記錄)。 (iii)劑量修改
毒性劑量延遲或劑量修改應由研究人員根據每個個體與醫學監測員協商後進行。在研究之劑量遞增部分期間，若個體在DLT評估時段期間經歷符合DLT準則之任何毒性，則中斷研究治療之個體，除非充分管理毒性，否則研究者認為繼續研究治療之恢復為適當的，且存在醫學監測者之批准。考慮所觀測AE之類型及嚴重程度，以告知決策。
在劑量延遲之情況下，個體應根據標準照護及事件時程每3個月繼續進行反應評估。 (a)誘導階段
在誘導階段期間，允許具有醫學監測批准之劑量延遲高達14天。在誘導階段期間，研究者可由於未消退毒性而僅跳過1次安排之誘導治療。需要超過1次預定誘導治療待跳過之個體中斷研究治療。
除非充分管理毒性，否則在誘導階段期間經歷符合DLT準則之AE的個體不應接受用膀胱內恩諾單抗維多汀進行之進一步治療，研究者認為膀胱內恩諾單抗維多汀之恢復為適當的，且醫學監測者批准恢復。考慮所觀測AE之類型及嚴重程度，以告知決策。
在與醫學監測者一起討論之後，個體可以相同劑量含量或降低之劑量含量恢復治療。若個體在AE (其稱為DLT及相同AE復發)之後繼續治療，則治療必須永久地中斷。經歷符合永久中斷膀胱內恩諾單抗維多汀之標準的AE之個體可能不會恢復研究治療，包括以較低或修改之劑量。
對於相同3級AE之第二次出現，膀胱內恩諾單抗維多汀應永久地中斷。
在任何其他治療無關AE之情況下接觸醫療監測者，則需要給藥延遲≥14天。 (b)維持階段
在維持階段期間，需要給藥延遲的具有未消退治療相關2級或更高級AE的個體可保持定期維持劑量，直至AE返回至1級或基線嚴重程度。任何未消退AE的治療延遲＞28天可經醫學監測者論述，以確定個體是否存在持續的臨床益處來繼續試驗。維持劑量應延遲而非跳過。不准許因未消退治療相關毒性所致之延遲2次連續維持劑量，且必須永久地中斷治療。
在與醫學監測者一起討論之後，個體可以相同劑量含量或降低之劑量含量恢復治療。若個體在AE (其稱為DLT及相同AE復發)之後繼續治療，則治療必須永久地中斷。經歷符合永久中斷膀胱內恩諾單抗維多汀之標準的AE之個體可能不會恢復研究治療，包括以較低或修改之劑量。
對於相同3級AE之第二次出現，膀胱內恩諾單抗維多汀將永久地中斷。 (c)用於治療相關毒性之劑量修改
針對恩諾單抗維多汀相關之血液及非血液毒性的劑量修改建議分別呈現於表15及表16中。 表15.針對恩諾單抗維多汀相關血液毒性的建議劑量修改
1 級 2 級 3 級 4 級
在相同劑量含量下繼續。 在相同劑量含量下繼續。    對於2級血小板減少症而言，停止給藥直至毒性≤1級或已回至基線，接著以相同劑量恢復治療。 中斷治療。 中斷治療。
表 16.針對恩諾單抗維多汀相關非血液毒性的建議劑量修改
毒性 1 級 2 級 3 級 4 級
與偶發局部尿液或藥物暴露無關之皮疹 可在相同劑量含量下繼續。 對於2級皮疹而言，考慮停止恩諾單抗維多汀，直至毒性≤1級或已回至基線，接著以相同劑量含量恢復治療。 中斷治療。 中斷治療。
眼事件 對於1級眼部事件，眼部症狀及/或視覺變化(若鑑定)應由合格的驗光師或眼科醫師評估。 中斷治療。 中斷治療。 中斷治療。
神經病 可在相同劑量含量下繼續。 中斷治療。 中斷治療。 中斷治療。
高糖血症 可在相同劑量含量下繼續。 對於3級高血糖症或血糖＞250 mg/dL，停止恩諾單抗維多汀治療。一旦高血糖症/血糖≤250 mg/dL且個體在臨床及代謝上穩定，則恢復治療。 對於視為與研究治療相關之＞500 mg/dL之4級高血糖症或血糖，其退出恩諾單抗維多汀治療且經歷高血糖症之完全評估以確定潛在診斷。高血糖症/升高之血糖改進至≤250 mg/dL後，給藥可以在與醫學監測者協商之後重新開始密切監測。
在整個研究治療期間，與臨床後遺症無關且在發生的72小時內經由增補/適當管控而經校正的3/4級電解質不平衡/實驗室異常(除高血糖症之外)不需要中斷治療(例如4級低鈉血症)。 (iv)儲存及操縱
應將冷藏設定在2℃至8℃下以用於儲存小瓶及含有恩諾單抗維多汀之溶液。受控位置必須僅對於藥劑師、研究者或粗略指定人員可接近。研究藥物必須在投與之前復原。
尚未評估光照對研究藥物之影響；因此，建議將恩諾單抗維多汀凍乾粉末、復原藥品及/或給藥溶液小瓶避光，直至使用時間。
不震盪研究藥物之復原小瓶。
任何部分使用之小瓶或製備之給藥溶液應根據機構藥物處置程序由位點破壞。未使用小瓶應由地點破壞或在由試驗委託者授權之後返回至試驗委託者。 6.2.6.3需要術前用藥及術後用藥
不存在用於膀胱內恩諾單抗維多汀之所需術前用藥及術後用藥。
在外部生殖器周圍滴注之前使用局部皮膚障壁軟膏視為防止皮膚接觸或刺激。
應指示個體，尤其女性在滴注當天各排尿後洗滌生殖器，且視需要使用障壁軟膏。 6.2.6.4伴隨療法
研究者認為個體福利需要之所有治療由研究者根據社區醫療照護標準酌情投與，除了鑑別為禁止之彼等藥物以外。
所有伴隨藥物治療及投與之血液產品係自第1天(給藥前)至安全報告時段記錄。應記錄自知情同意書籤署時針對研究方案相關之AE所給與的任何伴隨藥物。 (i)必需的伴隨療法
不存在必需的伴隨療法。 (ii)允許的伴隨療法
伴隨慢性普賴松(或等效物)以≤20 mg/天劑量使用。治療在研究期間產生之急性病狀(如醫學上所指示)的持續時間有限時，允許提高普賴松(或等效物)的劑量。允許使用鎮吐藥。
對於正接受伴隨恩諾單抗維多汀服用的強細胞色素P450 (CYP) 3A4抑制劑或P-醣蛋白(P-gp)抑制劑的個體，應密切監測其不良反應。
允許用疫苗進行常規預防；建議所用疫苗不含活微生物。
在基線時B型肝炎表面抗原及/或抗肝炎B核心抗體呈陽性且PCR分析呈陰性的個體應根據當地或機構指南接受適當的抗病毒防治或常規的監督監測。
允許預防性抗生素如臨床上指示使泌尿道感染之風險降至最低。若個體具有症狀性UTI，則其用抗生素之完整療程治療且將停止研究藥物直至消退。
對於具有頻率、緊急或失禁之症狀的個體，開具抗膽鹼激導性劑處方。
研究者認為個體福利需要之所有治療由研究者根據社區醫療照護標準酌情投與。 (iii)禁止的伴隨療法
利尿劑不應在給藥日之前的夜晚或在研究藥物投與之前的給藥日服用。
在可行的範圍內，應在滴注膀胱內恩諾單抗維多汀之前4至6小時避免流體消耗。
個體在研究期間可不接受其他研究性藥物、放射線療法、膀胱內或全身性抗腫瘤療法。 6.2.6.5 治療引發不良事件之管理(i)高血糖症之管理
研究者應監測血糖含量，且若觀測到高血糖症之任何症狀，則最好執行其他評估，包括針對感染的充分評價。另外，若使用類固醇治療任何其他病狀，則需要對血糖含量進行額外的監測。若觀測到血糖含量升高，則個體應根據當地照護標準進行治療且考慮轉診至內分泌科。
個體，尤其是有糖尿病或高血糖症病史或正在發生的糖尿病或高血糖症的患者，若其葡萄糖含量變得難以控制或若其經歷了暗示高血糖症的症狀，諸如尿頻、口渴加劇、視力模糊、疲勞及頭痛，則最好立即告知其醫師。
在基線時HbA1c升高(≥6.5%)之加入研究的個體應在誘導階段期間轉診至進行葡萄糖管控的適當提供者。應在各給藥之前檢查血糖且劑量應保留血糖＞250 mg/dL。一旦個體之血糖已改善至≤250 mg/dL且個體在臨床及代謝上穩定，則給藥可繼續。允許胰島素之使用作為護理標準之一部分。認為與恩諾單抗維多汀相關之血糖＞500 mg/dL需要藥物中斷且完全評估高血糖症，以確定潛在診斷。高血糖症/升高之血糖改進至≤250 mg/dL後，給藥可在與醫學監測者協商之後重新開始密切監測。若個體經歷新發作型糖尿病，則用代謝組、尿酮、HbA1c、C-肽評估個體以評估先前檢查點抑制劑療法中之新發作型1型糖尿病。 (ii)使用恩諾單抗維多汀管理皮疹
恩諾單抗維多汀為連接素-4引導之抗體藥物結合物。連接素-4為高度表現於尿道上皮癌中之細胞黏附分子。低至中等含量之連接素-4亦表現於正常組織上，包括皮膚角質細胞、汗腺及毛囊；因此，皮膚反應為預期事件。因此，皮膚反應為在與恩諾單抗維多汀之所有臨床研究中所關注的不良事件。
來自2019年12月18日之上市後安全性資料的累積審查(美國，恩諾單抗維多汀之批准日期)至2020年10月22日鑑別出接受IV恩諾單抗維多汀之15名患者中之嚴重皮膚不良反應的報導，其中一些具有致命結果。此等反應主要在第一治療週期期間發生。報導於此等案例中之AE包括史蒂芬斯-強森症候群(SJS) (5個案例)、水皰(3個案例)、大皰性皮炎(3個案例)、對稱藥物相關彌漫性及播散性紅斑(SDRIFE；2個案例)及剝脫性皮炎、剝脫性皮疹、表皮壞死、口咽起泡、口腔炎及中毒性表皮壞死溶解(TEN)中之各者的1個案例。
在尿道上皮癌之全身性恩諾單抗維多汀單一療法研究中，重度皮膚不良反應之嚴重不良事件(SAE)報導於749名個體中之11名(1.5%)中且包括大皰性皮炎(0.4%)、藥疹(0.4%)、水皰(0.1%)、結膜炎(0.1%)、SJS (0.1%)、口腔炎(0.1%)及毒性皮疹(0.1%)。
若個體具有皮膚反應、口腔黏膜及眼部異常(包括，黏膜炎或結膜炎)之病徵及症狀，則應建議該等個體立即接觸研究者。第一週期及整個治療中開始，密切監測個體之皮膚反應。對於輕度至中度皮膚反應，考慮適當治療，諸如臨床上指示之局部皮質類固醇及抗組織胺。對於惡化2級皮疹或皮膚反應，考慮停止恩諾單抗維多汀。對於3級或4級皮疹或皮膚反應或疑似或確診為SJS或TEN，永久地中斷恩諾單抗維多汀且考慮轉診接受專科照護。 (a)局部皮膚照護
在進行中的臨床試驗或臨床前研究中尚未評價出在暴露時經由皮膚或黏膜表面發生之恩諾單抗維多汀的安全性。應小心以避免在滴注或滴注後尿液期間意外暴露於任何皮膚、眼睛或黏膜表面。
由於在滴注、停留時間或排尿期間存在無意的皮膚暴露，所以治療研究者應在各滴注之前針對任何皮膚刺激或分解檢查局部生殖器及會陰區域。對於最小皮膚刺激或分解，應施用局部障壁軟膏或敷料以防止皮膚在此等時間期間暴露。對於在滴注之前注意到之顯著皮膚變化或分解，除醫療監測中心之外，應考慮必要的防護措施及/或劑量保持。當可實行時或若個體報導任何意外暴露或與皮膚刺激相關之症狀，則生殖器及會陰區域或其他受影響皮膚區域之目視檢查應在排尿後進行。
個體應在排尿之後洗手。若個體發生任何意外暴露，則受影響皮膚區域應立即用肥皂及水洗滌。在第二天，應觀測到受影響區域之任何發紅、瘙癢、腫脹或其他症狀之發展。必須即刻向治療研究者報導任何症狀以便適當照護及追蹤。 (iii)過敏性/超敏反應
過敏性/超敏反應係由暴露於過敏原之有害局部或一般反應(NCI CTCAE版本5.0)表徵。過敏性/超敏反應可顯現為包括瘙癢、各種類型之皮疹、風疹、噁心、嘔吐、背痛或腹痛之病徵或症狀的組合。
允許的量測包括劑量修改(表16)及伴隨藥物治療。 (iv)過度劑量之管理
在過度劑量＞10%之恩諾單抗維多汀之情況下，一旦發現過度劑量，該網站應立即通知贊助商。應密切監測患者之不良反應。應投與每個機構標準之支持性護理。 6.2.6.6 治療依從性
研究藥物的投與將由研究現場的人員執行且記錄於源文件及CRF中。 6.2.7研究活動 6.2.7.1 事件計劃表
自第1天(給藥前)至安全性報告期記錄AE及伴隨藥物治療。應自知情同意時記錄任何研究相關AE以及針對治療AE所給出之任何伴隨藥品。
臨床實驗室評估(血清化學組，全血細胞計數[CBC]，具有差異性[若臨床上指示手動差異性]及尿樣分析[反射性顯微鏡檢查異常結果])、身體檢查、重量及ECOG體能狀態在投與研究藥物之前3天內在誘導階段之第1週第1天執行。必須在給藥之前審查所有相關臨床實驗室評估之結果。事件計劃表提供於表17中。 表17.事件計劃表
   治療訪問 篩選/基線 入選 誘導階段 A(第1個月至第3個月) 維持階段 B(第4個月至第12個月) EOT 追蹤 D 存活追蹤
D -28 至1 D -7 至1 在第1次劑量之7D內 第1週 第2週至第6週 第9週 第12-14週 B至第52週 (每月9次劑量) 在最後一次給藥之30至37D內 C    每6個月 Y
第1天 第2天 E 第4天 E 第1天 第2天 E 第4天 E 第1天 第1天 第15天 F(電話呼叫)         
問診時間窗                   ±1d       ±3d ±3d ±3d    ±1 wk ±2週
篩選/基線評估 知情同意書 X    在治療之前對試驗委託者之合格性確認                      XCC            
納入/排除，醫療史 X    X                                 
妊娠測試(血清或尿液；有可能生育之個體)    X XG       XG       XG XG    X XH   
安全性評估 身體檢查    X XI XJ    X XJ       X    X X   
高度 K    X                                    
重量    X XI       X          X            
有差異的CBC L    X XI       X          X    X      
血清化學組 L,AA    X XI,M       XM          X    X      
HbA1c    X                                    
葡萄糖    X XZ       XZ          XZ    X      
血清學(B型及C型肝炎)    X                                    
PT/PTT/INR    X XN       XN          XN            
用反射性顯微鏡分析進行分析    X XI       X          X    X X   
生命體徵    X XO       XO          XO    X      
ECOG體能狀態    X XI                   X    X      
ECG X                                       
成像 XP                                     XN   
完全眼睛檢查 XBB                                  XBB      
個體訪問 Q                      XQ          XQ         
伴隨藥物治療 與研究程序相關 R 自第1天給藥前至研究藥物之安全性報告期收集   
不良事件收集   
處理 研究藥物投與          X       X          XS            
 PK/免疫原性/生物標記物 開始收集(存檔的)腫瘤樣本 XT       關於樣品收集細節參見 表 18PK、ATA及生物標記物收集(血液)及 表 19PK及生物標記物收集(尿液)表   
血液/尿液/組織樣品收集 X         
反應評估 膀胱鏡檢 W, DD X                            XU, V       X   
細胞學 W X                            XU       X   
活組織檢查 W XN                            XX       XN   
疾病狀態、存活狀態、第一次後續療法之收集                                     X    XY
AE=不良事件；ALT=丙胺酸胺基轉移酶；AST=天冬胺酸胺基轉移酶；ATA=抗治療性抗體；CBC=全血細胞計數；CIS=原位癌；CT=電腦斷層掃描；D/d=天；ECOG=美國東岸癌症臨床研究合作組織；ECG=心電圖；EOT=治療結束；HbA1c=血紅蛋白A1c；MRI=磁共振成像；PK=藥物動力學；PT/PTT/INR=凝血酶原時間/部分凝血激酶時間/國際標準化比值；q1wk=每週一次；TURBT=膀胱腫瘤之經尿道切除；Wk=週 A程序將在誘導階段期間在各週之第1天及第2天q1wk進行。 B在其第一研究中反應評估(其將在誘導階段完成後6至8週進行)之後，個體將進入維持階段。程序將在維持階段期間每月在第1天及第15天進行。 C  EOT評估應在非方案抗癌治療開始之前獲得。若在最後一次研究治療劑之後的30天之前完成EOT評價，則在個體的最後一次研究治療劑之後的第30至37天執行電話篩檢，以確保AE概況尚未發生變化。 D由於除疾病持久性、復發或進展以外之原因而中斷研究治療之個體及完成維持階段之個體將進入研究之追蹤階段。追蹤將在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行，且其後每6個月進行，持續5年，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法開始或死亡，以先發生者為準。 E在誘導階段期間第2天訪問在診所中或經由遠程醫療/電話呼叫訪問進行。第4天訪視僅在第1週、第2週及第6週進行有可能在第2天及第4天收集PK樣品，藉由外部家庭健康機構供應商經由家庭訪問採集。 F第15天訪視在前3個維持劑量期間被要求且將經由遠程醫療/電話呼叫進行以評估AE及伴隨藥物治療。 G若在第1天之前7天內進行，則不需要。在誘導期間第1週、第3週、第6週及第9週之研究第1天及在維持階段期間各月之研究第1天需要妊娠測試。 H在最後所接受之恩諾單抗維多汀劑量之後每月收集6個月。 I若在第1天之前3天內進行，則不需要。 J若在現場進行訪問，則進行。 K利用在先前12個月內獲得之高度量測結果。 L若臨床上指示，則在研究期間之任何點時進行。 M僅在誘導階段期間在第1週、第3週及第6週需要血清化學組。 N若臨床上指示。 O將收集生命徵象且將在給藥前及在第一排尿之後2小時記錄AE。 P除非醫學上禁忌，否則需要使用IV造影劑對胸部之診斷品質CT。若個體不能耐受IV造影劑，則非造影胸部CT為可接受的。對於上尿路、腹部及骨盆之成像，CT或MRI尿路造影(除非醫學上禁忌)為可接受的。若在開始研究治療之前3個月內進行，則使用具有類似儀器治療之先前成像。 Q將在以下時間點(+7-天窗口)在劑量遞增及劑量擴增期間進行訪問：在誘導階段結束時，在維持階段期間5次劑量之完成時及在維持階段結束時。在誘導階段之第6週之前中斷的個體將在其最終訪問時經歷退出訪問。 R自知情同意書之時間。 S在維持階段期間，恩諾單抗維多汀將一月一次以膀胱內投與持續總共9次劑量。 T若可獲得，則需要自入選12個月內收集之最新TURBT收集的所存檔腫瘤樣本或組織。應使用最近可獲得的組織。若僅可提供新鮮切割之載片，則最少需要10至15個切片(若小於10個，則聯繫試驗委託者)。 U經由膀胱鏡檢及尿液細胞學之反應評估必須在下一次投與研究藥物之前14天內完成。具有異常膀胱鏡檢、陽性或異常尿液細胞學之個體應根據研究者之臨床判斷進行額外評估(例如成像、活組織檢查、在麻醉下檢查)。 V個體在進入維持階段之前必須經歷膀胱鏡檢。 W所有可見乳突狀Ta/T1腫瘤必須在入選之前60天內完全切除。允許殘留純CIS。具有T1疾病之個體應在開始研究之前經歷重複TURBT。重新分期TURBT必須顯示非受傷側固有肌層。經由標準照護膀胱鏡檢(亦即，膀胱鏡檢±活組織檢查)及細胞學之腫瘤反應評估將在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行，且其後每6個月持續在入選之後5年進行，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法之起始或死亡，以先發生者為準。對於所有個體而言，應基於腫瘤評估期間之發現(諸如異常血管檢查、陽性尿液細胞學)將額外評估(諸如成像、活組織檢查)視為臨床上指示的，且具有2或更多個具有可疑或不確定發現之順序尿液細胞學樣本。 X在第12個月評估時需要進行膀胱定位活組織檢查以進行研究。在不存在可見腫瘤之情況下，活體組織切片應自膀胱之所有象限獲得(需要最少4個活體組織切片)。在所有其他問診時不需要活體組織切片，但當臨床上指示考慮功效時將考慮活體組織切片。 Y在由於後續抗癌療法之疾病持久性、復發、進展或起始而停止研究治療之後，個體將進入存活追蹤。每6個月(±2週)將收集存活率及隨後抗癌療法資料，直至失去追蹤、撤回同意書、死亡或由試驗委託者研究終止(以先發生者為準)，持續在入選之後持續最多5年。 Z在給藥之前，藉由抽血或手指針刺，驗證血糖＜250 mg/dL。 AA血清化學組包括以下測試：白蛋白、鹼性磷酸酶、ALT、AST、碳酸氫鹽、血尿素氮、鈣、肌酸酐、氯離子、乳酸脫氫酶、磷、鉀、鈉、總膽紅素、澱粉酶、脂肪酶、尿酸及尿酸。 BB由合格的驗光師或眼科醫師進行之完整眼睛檢查，包括(但不限於)視力、裂隙燈、壓力測定檢查及擴張眼底檢查。後續眼睛檢查打算如臨床上指示進行。EOT狹縫燈檢查為在研究期間經歷角膜AE的個體所需，且必須自最後一次給藥至少4週進行。 CC僅第4個月。第一研究中3個月評估時患有持久性CIS或復發性高級別Ta疾病之個體可在重新同意繼續研究治療之後繼續療法且在6個月時再次評估。 DD所有已知疾病部位必須在篩選時記錄且在各後續腫瘤評估時重新評估。 表 18. PK 、 ATA 及 生物標記物收集 ( 血液 )
研究期 研究日 時間 窗口 相對時間 PK (血液) ATA 血清連接素-4 PBMC 免疫表型 血漿1細胞介素 血漿2 cfDNA 腫瘤樣本 A
篩選 -28至1 N/A N/A N/A                XB XC
第1週、第2週及第6週誘導 第1天 劑量前 24 hr 滴注之開始 X X X X X X   
排尿後 +15 min 停留時間之結束 X                  
2 hr ±15 min X                  
第2天 D 24 hr ±4 hr 停留時間之結束 X                  
第4天 D 72 hr ±4 hr X                  
第3週、第4週及第5週誘導 第1天 劑量前 24 hr 滴注之開始 X X          X   
排尿後 +15 min 停留時間之結束 X                  
2 hr ±15 min X                  
維持(第4個月至第12個月) 第1天 劑量前 24 hr 滴注之開始 X X          X XE
排尿後 +15 min 停留時間之結束 X                  
2 hr ±15 min X                  
EOT X X          X XA
追蹤 F                X XA
ATA=抗治療性抗體；cfDNA=循環的游離DNA；EOT=治療結束；N/A=不適用；PBMC=外周血單核球；PK=藥物動力學；TURBT=膀胱腫瘤之經尿道切除 A若在研究期間獲得腫瘤樣品作為標準照護之一部分，則應向試驗委託者提交彼樣品之一部分以用於生物標記物測試(若可用)。來自在治療時收集之活體組織切片的組織用於生物標記評估。 B若TURBT在篩選窗內進行，則篩選時用於生物標記物評估之收集應在TURBT之前或在TURBT時收集。 C若可獲得，則需要自入選12個月內收集之最新TURBT收集的所存檔腫瘤樣本或組織。應使用最近可獲得的組織。若僅可提供新鮮切割之載片，則最少需要10至15個切片(若小於10個，則聯繫試驗委託者)。 D有可能在第2天及第4天收集PK樣品，藉由外部家庭健康機構供應商經由家庭訪問採集。 E在第12個月評估時需要進行膀胱定位活組織檢查以進行研究。在不存在可見腫瘤之情況下，活體組織切片應自膀胱之所有象限獲得(需要最少4個活體組織切片)。在所有其他問診時不需要活體組織切片，但當臨床上指示考慮功效時將考慮活體組織切片。 F追蹤將在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行，且其後每6個月進行，持續5年，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法開始或死亡，以先發生者為準。 表 19. PK 及生物標記物收集 ( 尿液 )
研究期 研究日 時間 窗口 相對時間 PK (尿液) 尿液cfDNA 尿液連接素-4細胞介素
篩選 -28至1 N/A N/A N/A    XA XA
第1週、第2週及第6週誘導 第1天 劑量前 24 hr 滴注之開始 X X X
排尿 B 無 B 停留時間之結束 C X      
2 hr ±15 min D X      
第2天 E 24 hr ±4 hr 停留時間之結束 X      
第4天 E 72 hr ±4 hr X      
誘導第3週、第4週及第5週；及維持階段第4個月至第12個月 第1天 劑量前 24 hr 滴注之開始 X X X
排尿 B 無 B 停留時間之結束 C X      
2 hr ±15 min D X      
EOT X X X
追蹤 F    X X
cfDNA=循環的游離DNA；EOT=治療結束；N/A=不適用；PK=藥物動力學；TURBT=膀胱腫瘤之經尿道切除 A若TURBT在篩選窗內進行，則篩選時用於生物標記物評估之收集應在TURBT之前或在TURBT時收集。 B應收集緊接在停留時間完成之後的排尿。尿液收集將為研究藥物之最長90分鐘停留時間(或個體之耐受停留時間結束)之後的排尿。 C在滴注研究藥物之後，個體將保持研究藥物持續最長90分鐘停留時間，或直至個體之耐受停留時間結束。 D在完成最長90分鐘停留時間排尿(或個體之耐受停留時間排尿結束)後進行第二次尿液收集。 E 有可能在第2天及第4天收集PK樣品，藉由外部家庭健康機構供應商經由家庭訪問採集。 F追蹤將在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行，且其後每6個月進行，持續5年，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法開始或死亡，以先發生者為準。 6.2.7.2 篩選訪問 ( 第 ~28 天至第 1 天 )●知情同意書 ●根據納入/排除準則之研究合格性 ●醫療史 ●心電圖(ECG) ●成像(若在開始研究治療之前3個月內進行，則使用具有類似儀器治療之先前成像)： ○除非醫學上禁忌，否則需要使用IV造影劑對胸部之診斷品質CT。若個體不能耐受IV造影劑，則非造影胸部CT為可接受的。 ○對於上尿路、腹部及骨盆之成像，CT或MRI尿路造影(除非醫學上禁忌)為可接受的。 ●完全眼睛檢查 ●起始收集所存檔腫瘤活體組織切片樣本，以便在入選時提交 ●膀胱鏡檢及細胞學(所有已知疾病部位必須在篩選時記錄且在各後續腫瘤評估時重新評估。具有T1疾病之個體應在開始研究之前經歷重複TURBT。重新分期TURBT必須顯示非受傷側固有肌層。) ●活組織檢查(若臨床上指示) ●用於生物標記評估之血液及尿液樣品收集(若可能且若適用，則在TURBT之前或TURBT之時收集) 6.2.7.3 基線訪問 ( 第 ~7 天至第 1 天 )●身體檢查 ●高度及重量(使用前12個月內獲得之高度的量測結果) ●生命體徵 ● ECOG體能狀態 ● 針對以下之血液及尿液樣品收集： ○有差異的CBC ○血清化學組(包括葡萄糖) ○HbA1c ○血清學(B型及C型肝炎) ○凝血酶原時間/部分凝血激酶時間/國際標準化比值(PT/PTT/INR) ○尿樣分析(針對異常結果，利用反射顯微術) ○針對具有生育力之個體的血清或尿液β-hCG妊娠測試 6.2.7.4 誘導階段 ( 第 1 個月至第 3 個月 )(i)第1週至第6週之第1天(僅在第1週之後±1天) ●在恩諾單抗維多汀膀胱內投與之前： ○根據納入/排除準則確認個體合格性；記錄病史(僅第1週) ○身體檢查；論述新的或進行中的症狀* ○重量* ○  ECOG體能狀態(僅第1週)* ○生命體徵 ○收集AE及伴隨藥物治療(若適用) ○針對以下之血液及/或尿液樣品收集： ○血清化學組(僅第1、3及6週)* ○在給藥之前，藉由抽血或手指針刺，應驗證葡萄糖＜250 mg/dL。 ○有差異的CBC* ○ PT/PTT/INR (若臨床上指示) ○ PK/抗治療性抗體(ATA)評估 ○生物標記物評估 ○血清或尿液β-hCG妊娠測試(第1週、第3週及第6週) (僅具有生育力之個體) (若在給藥之前7天內收集則不需要) ○尿樣分析(針對異常結果，利用反射顯微術)* ●必須審查來自臨床實驗室評估之結果且必須在研究藥物投與之前(僅第1週)確認合格性 ●恩諾單抗維多汀膀胱內投與(待q1wk投與持續6週) ●在完成恩諾單抗維多汀膀胱內投與之後： ○生命跡象(待在第一排尿之後2小時[±15分鐘]收集) ○在第一排尿後2小時之觀測結果 ○收集AE及伴隨藥物治療(若適用) ○用於PK評估之血液及尿液樣品 *僅在第1週之第1天，指定評估在給藥之前3天內收集。 (ii)第1週至第6週之第2天
在誘導階段期間第2天訪問在診所中或經由遠程醫療/電話呼叫訪問進行。對於未進行臨床中訪問之個體，經由家庭健康提供者收集血液及尿液樣品。 ●身體檢查(若在現場進行訪問，將進行) ●個體訪問(+7天窗口；僅第6週；在誘導階段之第6週之前中斷的個體將在其最終訪問時經歷退出訪問) ●收集AE及伴隨藥物治療(若適用) ●用於PK評估之血液及尿液樣品(±4小時；僅第1週、第2週及第6週) (iii)第1週至第6週之第4天
對於未進行臨床中訪問之個體，經由家庭健康提供者收集血液及尿液樣品。 ●收集AE及伴隨藥物治療(若適用) ●用於PK評估之血液及尿液樣品(±4小時；僅第1週、第2週及第6週) (iv)第9週之第1天(±3天)
血清或尿液β-hCG妊娠測試(僅具有生育力之個體) 6.2.7.5 維持階段( 第 4 個月至第 12 個月) (i)第1天(±3天) ●在恩諾單抗維多汀膀胱內投與之前： ○知情同意書(僅第4個月；第一研究中3個月評估時患有持久性CIS或復發性高級別Ta疾病之個體可在重新同意繼續研究治療之後繼續療法且在6個月時再次評估)。 ○身體檢查；論述新的或進行中的症狀 ○重量 ○ ECOG體能狀態 ○生命體徵 ○收集AE及伴隨藥物治療(若適用) 針對以下之血液及/或尿液樣品收集： ○血清化學組 ○在給藥之前，藉由抽血或手指針刺，應驗證葡萄糖＜250 mg/dL。 ○有差異的CBC ○ PT/PTT/INR (若臨床上指示) ○ PK/ATA評估 ○生物標記物評估 ○血清或尿液β-hCG妊娠測試(僅具有生育力之個體) (若在給藥之前7天內收集則不需要) ○尿樣分析(針對異常結果，利用反射顯微術) ○膀胱鏡檢及細胞學(個體必須在進入維持階段之前及在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行膀胱鏡檢檢查；必須在投與研究藥物之前14天內完成) ○膀胱映射活組織檢查(在第12個月評估時需要。在不存在可見光腫瘤之情況下，活體組織切片應自膀胱之所有象限獲得[所需最少4個活體組織切片]。在所有其他訪問時不需要活體組織切片，但當臨床上指示考慮功效時將考慮活體組織切片) ●恩諾單抗維多汀膀胱內投與(待每月投與持續總計9個劑量) ●在完成恩諾單抗維多汀膀胱內投與之後： ○生命跡象(待在第一排尿之後2小時[±15分鐘]收集) ○在第一排尿後2小時之觀測結果 ○收集AE及伴隨藥物治療(若適用) ○用於PK評估之血液及尿液樣品 (ii)第15天(±3天)
第15天訪視在前3個維持劑量期間被要求且將經由遠程醫療/電話呼叫進行以評估AE及伴隨藥物治療。 ●個體訪問(待在完成維持階段期間5個劑量時及在維持階段結束[+7天窗口]時進行) 6.2.7.6反應評估
研究中之腫瘤反應評估在篩選時經由標準照護膀胱鏡檢(亦即，膀胱鏡檢±活組織檢查)及細胞學進行，接著在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行評估，且其後每6個月進行評估持續入選之後5年。
經由膀胱鏡檢及尿液細胞學之反應評估必須在下一次投與研究藥物之前14天內完成。具有異常膀胱鏡檢、陽性或異常尿液細胞學之個體應根據研究者之臨床判斷進行額外評估(例如成像、活組織檢查、在麻醉下檢查)。
在第12個月評估時需要進行膀胱定位活組織檢查以進行研究。在不存在可見腫瘤之情況下，活體組織切片應自膀胱之所有象限獲得(需要最少4個活體組織切片)。在所有其他問診時不需要活體組織切片，但當臨床上指示考慮功效時考慮活體組織切片。 6.2.7.7治療訪問結束(在最後一個劑量之研究藥物之後30至37天)
除非歸因於AE而延遲，否則治療結束(EOT)訪問應在最後一次劑量之研究藥物之後30至37天進行。注意：對於在第3個月膀胱鏡檢之後中斷治療之個體，至EOT訪問之時間長於37天；然而，EOT評估必須在開始新的抗癌治療之前進行。若在最後研究治療之後30天之前完成EOT評估，則在最後處理之後30至37天使個體接觸以評估AE。 ●身體檢查 ●生命體徵 ● ECOG體能狀態 ●若適用，則進行完整眼部檢查(EOT狹縫燈檢查為在研究期間經歷角膜AE的個體所需，且必須自最後一次給藥至少4週進行) ●收集AE及伴隨藥物治療(若適用) ●針對以下之血液及/或尿液樣品收集： ○血清化學組(包括葡萄糖) ○有差異的CBC ○ PK/ATA評估 ○生物標記物評估 ○血清或尿液β-hCG妊娠測試(僅具有生育力之個體) ○尿樣分析(針對異常結果，利用反射顯微術) ●疾病狀態、存活狀態、第一次後續療法之集合(若適用) 6.2.7.8 追蹤 (±1 週 )
由於除疾病持久性、復發或進展以外之原因而中斷研究治療之個體及完成維持階段之個體進入研究之追蹤階段。在追蹤期中，經由標準照護膀胱鏡檢(亦即，膀胱鏡檢±活組織檢查)之腫瘤反應及細胞學在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月，且其後每6個月在入選之後5年，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法之起始或死亡出現，以先發生者為準。
在入選之後前2年，自第一誘導劑量每3個月，且在入選之後5年，在其後每6個月進行以下評估，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法之起始或死亡，以先發生者為準： ● 身體檢查 ● 血清或尿液β-hCG妊娠測試(僅具有生育力之個體)(在最後一次接受之恩諾單抗維多汀劑量之後每月收集持續6個月) ● 尿樣分析(針對異常結果，利用反射顯微術) ● 成像(若臨床上指示) ● 用於生物標記物評估之血液及尿液樣品 ● 膀胱鏡檢及細胞學 ● 活組織檢查(若臨床上指示) ● 若嚴重且認為與研究治療相關，則收集AE 6.2.7.9 存活追蹤 (±2 週 )
在由於後續抗癌療法之疾病持久性、復發、進展或起始而停止研究治療之後，個體進入存活追蹤。每6個月(±2週)收集疾病狀態、存活率及後續抗癌療法資料，直至失去追蹤、撤回同意書、死亡或由試驗委託者研究終止(以先發生者為準)，持續在入選之後最多5年。 6.2.7.10 研究結束 / 追蹤結束
個體之日期符合研究中斷之準則且將記錄研究中斷之原因。 6.2.8研究評估 6.2.8.1 篩選 / 基線評估
僅符合合格性準則之個體入選此研究中。
個體病史包括對重要的既往病史、當前狀況、先前惡性腫瘤的任何治療及對先前治療之反應以及任何伴隨藥物治療的全面回顧。
身體檢查應包括評估以下身體部分/系統：腹部、肢體、頭部、心臟、肺、頸部及神經。亦量測重量及身高；利用先前12個月內獲得之身高量測值。
在篩選時進行完全眼睛檢查。
血液及尿液測試包括有差異的CBC、血清化學組、HbA1c、葡萄糖、血清學(B型及C型肝炎)、PT/PTT/INR及尿樣分析(針對異常結果，利用反射顯微術)。對具有生育力之個體進行血清或尿妊娠試驗。
收集血液及尿液樣品用於生物標記物評估。若可獲得，則需要自入選12個月內收集之最新TURBT收集的所存檔腫瘤樣本或組織。關於其他細節參見表18及表19。
在篩選所有個體時進行ECG。
在研究治療開始之前3個月內需要使用CT或MRI泌尿系放射攝影術進行的胸部CT及上尿路、腹部及骨盆成像。對於胸部CT，使用造影劑之成像為較佳的。若個體不能耐受IV造影劑，則非造影CT為可接受的。對於上尿路、腹部及骨盆之成像，CT或MRI尿路造影(除非醫學上禁忌)為可接受的。 6.2.8.2 反應 / 抗腫瘤活性 評估
研究中之腫瘤反應評估在篩選時經由標準照護膀胱鏡檢(亦即，膀胱鏡檢±活組織檢查)及細胞學進行，接著在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行評估，且其後每6個月進行評估持續入選之後5年。
經由膀胱鏡檢及尿液細胞學之反應評估必須在下一次投與研究藥物之前14天內完成。具有異常膀胱鏡檢、陽性或異常尿液細胞學之個體應根據研究者之臨床判斷進行額外評估(例如成像、活組織檢查、在麻醉下檢查)。
當對個體進行研究時，每年進行一次上尿路成像，如臨床指示。
白光膀胱鏡檢、窄頻帶成像膀胱鏡檢或螢光(藍光)可用於研究評估。儘可能地，在開始研究治療之後，在整個研究中，相同膀胱鏡檢方法應用於各個體之疾病監督且在研究CRF中捕捉。
在第12個月評估時需要進行膀胱定位活組織檢查以進行研究。在不存在可見腫瘤之情況下，活體組織切片應自膀胱之所有象限獲得(需要最少4個活體組織切片)。在所有其他問診時不需要活體組織切片，但當臨床上指示考慮功效時考慮活體組織切片。
當個體具有所有以下發現時，該等發現均視為具有CR： 1.膀胱鏡檢：膀胱之正常外觀。在膀胱鏡檢上出現異常之情況下，活體組織切片應為陰性或展現出低級Ta、具有低惡性潛能之任何級別乳突狀尿道上皮贅瘤或任何級別乳突狀瘤。若進行隨機膀胱活組織檢查，則此等活體組織切片應為陰性或顯示為低級別疾病。 2.尿液細胞學：陰性。 a.應評估不確定之尿液細胞學 b.陽性尿液細胞學應藉由膀胱鏡檢±活組織檢查及成像在臨床上進一步評估 3.成像(若執行)：正常或若發現異常，則發現應支援膀胱中之CR。
由於研究治療之膀胱內投與，若個體患有惡性尿液細胞學之陰性膀胱鏡檢，若癌症發現於上尿路或前列腺尿道中且隨機膀胱活組織檢查為陰性，則將其視為具有CR。 (i)尿液細胞學之解釋 ●若個體在進行研究時具有陽性尿液細胞學，則如臨床上所指示，研究者必須進行進一步評估，其中使用膀胱鏡檢及/或上尿路成像。 ●陽性尿液細胞學不可單獨用作疾病進展之指標，且必須進行支持性臨床研究。 ●若尿液細胞學結果為不令人滿意、非典型細胞、可疑或不確定的，隨後重複細胞學必須在接下來21天內進行。樣品之間的時間應至少＞24小時。 ●若2次連續重複尿液細胞學結果為可疑的或不確定的，則此等結果需要藉由膀胱鏡檢及/或上尿路成像進行進一步臨床評估，如藉由治療研究者所確定。 ●若個體患有可疑或不確定尿液細胞學且活體組織切片為陰性，則結果解釋為陰性。 ●若2次連續結果不令人滿意或非典型，則總體結果將視為陰性。
持續性疾病定義為存在有或無乳突狀疾病之CIS疾病(高級別Ta/T1)。
復發定義為開始療法之後的高級別疾病(高級別Ta、T1或CIS)之再現。復發必須藉由活體組織切片證實。
進展經定義為發展出以下中之任一者：T1疾病(固有層浸入)、≥T2疾病(肌肉-浸潤性)、淋巴結(N1+)、遠端癌轉移(M1)或級別自低至高增加。
較低級別疾病之持久性、出現或存在不視為復發。患有復發性低級乳突狀疾病之個體可經歷切除且繼續進行研究。
個體的臨床資料必須可用於CRF源驗證。 6.2.8.3 藥物動力學及免疫原性評估
將根據表18及表19中提供之樣品收集時程，在整個研究期間收集用於PK及ATA的血液及尿液樣品。將使用經驗證之分析確定恩諾單抗維多汀、ac-MMAE、總抗體(TAb)及未結合的MMAE濃度。若需要進一步表徵，則分析可包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)以及其他分析。存檔PK樣品用於其他恩諾單抗維多汀相關物種之可能的分析。電化學發光分析用於確定在血清中針對恩諾單抗維多汀之ATA的含量。欲估計之恩諾單抗維多汀之劑量相關血液PK參數可包括(但不限於)濃度-時間曲線下面積(AUC)、最大濃度(Cmax)、達至最大濃度之時間(Tmax)、表觀終末半衰期(t1/2)及谷值濃度(Ctrough)。
視需要評估額外分析物。 6.2.8.4藥力學及生物標記物評估
在尿液、末梢血液及腫瘤組織中進行生物標記物評估，如此章節及事件計劃表中所概述。對於個體選擇，不使用生物標記物評估。在用恩諾單抗維多汀治療之前及期間監測與反應、抗性或安全性觀測結果相關之探索性、預測性及預後生物標記物。
恩諾單抗維多汀對腫瘤細胞的主要作用可使得局部的腫瘤相關及周邊免疫細胞的活化狀態發生變化。血液及尿液樣品中之生物標記物評估可包括(但不限於)循環/游離腫瘤DNA、可溶性連接素-4之ELISA評估、泌尿生物標記物之免疫分析及免疫功能之標記物，包括免疫細胞亞群及細胞介素之豐度。
若可獲得，則所有個體需要在入選12個月內收集之存檔腫瘤組織(應使用最近可獲得的組織)。若僅可提供新鮮切割之載片，則最少需要10至15個切片(若小於10個，則聯繫試驗委託者)。在第12個月評估時需要活組織檢查且應如臨床上指示在所有其他評估時進行活組織檢查。若在研究期間獲得腫瘤樣品作為標準照護之一部分，則應向試驗委託者提交彼樣品之一部分以用於生物標記物測試。
活體組織切片應藉由經適當訓練之臨床現場人員收集。建議在可行時，病理學家在活組織檢查期間在場以確保活組織檢查位置有足夠的腫瘤含量，且確認活體組織切片獲取及處理技術為最佳的(Ferry-Galow 2018)。
為理解治療之前腫瘤之生物學特徵與個體結果之間的關係，檢驗來自TURBT之組織(腫瘤活體組織切片)。針對腫瘤中之特定藥力學、預測性及預後生物標記物評估活體組織切片。若組織可獲自入選後收集之標準照護活組織檢查，則亦可對其進行檢驗以進一步鑑別反應之生物標記物及作用機制及對治療之抗性。
腫瘤組織中之生物標記物評估可包括(但不限於)：藉由免疫組織化學及次世代定序對連接素-4及PD-L1表現進行集中評估、腫瘤亞型分析、腫瘤微環境分析及對體細胞突變或通常在癌症中變化之基因或RNA的變化進行分析。 6.2.8.5 生物樣本庫
僅在美國，對於另外提供同意書的個體而言，去標識化、未使用的剩餘血液及/或組織由研究試驗委託者保留且用於將來的研究，包括(但不限於)評價目標以獲得新穎治療劑、ADC敏感性及抗性機制的生物學，及ADC的生物標記物標識。捐贈給將來研究用的血液及組織樣品保留長達25年的時段。若未提供額外同意書，則在已完成研究之後破壞任何剩餘生物樣品且已滿足所有可適用之調節義務。 6.2.8.6 個體訪問
經由電話訪問持續45至60分鐘定性評估個體視角，涵蓋關於治療之經驗及耐受性的主題。關於在此等訪問期間所探索之主題及問題的額外細節描述於個體訪問指南中。在以下時間點在劑量遞增及劑量擴增期間進行訪問：在誘導階段結束時，在維持階段期間5次劑量之完成時及在維持階段結束時。 6.2.8.7 安全性評估
此研究過程中的安全評估由以下組成：AE (包括SAE)的監督及記錄、伴隨藥物的記錄，及方案指定之身體檢查結論的量測及實驗室測試。 (i)不良事件 (a)定義 不良事件
根據國際協調委員會(ICH) E2A指南速報之定義及標準，以及21 CFR 312.32，IND安全性報導，AE為投與藥品之個體或臨床研究個體中之任何不良醫療事件，且其未必與此治療有因果關係。
當確定是否記錄測試結果、醫學病況或關於不良事件CRF之其他事件時，應考慮以下資訊： ●自知情同意書籤署時直至研究第1天的前一天，應僅記錄與研究方案相關的AE。方案相關的AE定義為作為方案授權之程序的結果發生的不良醫學事件。 ●應記錄在研究第1天存在或進行中的給藥前，NC I CTCAE等級增加之所有醫學病況。 ●應記錄在研究第1天存在或進行中的給藥前，嚴重程度惡化，頻率增加、變得與研究藥物相關或以任何其他方式惡化，但不滿足NCI CTCAE級別增加之臨限值的醫學病況。 ●應記錄自研究第1天(給藥期間及給藥後)至安全性報告期結束之所有AE (無論與研究藥物之關係如何)。與任何程序(例如，活組織檢查)相關而發生的併發症應記錄為AE，無論該程序是否經方案授權。 ●一般而言，異常實驗值不應記錄為AE，除非其與臨床徵象或症狀有關，需要干預，導致SAE，或導致研究終止或研究治療劑中斷/中止。當記錄由實驗室異常引起之AE時，應記錄所產生的醫學病況而非異常本身(例如，記錄「貧血」，而非「低血紅素」)。 嚴重不良事件
若AE滿足以下準則中之一者，則將其歸類為SAE： 致命的：導致死亡之AE 危及生命的：AE將個體置於直接的死亡風險中。此分類不適用於假設若更嚴重則會引起死亡之AE。 住院：AE導致住院或延長現有住院患者的住院。 根據此準則，在研究中簽署知情同意書或常規體檢之前計劃的為了選擇性醫學或手術程序或治療的住院不為SAE。入住姑息治療單位或臨終關懷照護機構不視為住院。因潛在癌症或研究目標疾病之預定療法而住院或長期住院不必被視為SAE。 失能/無力：導致個體執行正常生命功能之能力出現持久性或顯著失能或實質性中斷的AE。 先天性異常或生育缺陷： 懷孕之前或懷孕期間暴露於分子或研究治療方案之個體之孩子或胎兒的不良結果。 醫學上顯著：AE不滿足上述準則中之任一者，但可能危及個體且可能需要醫療或手術干預來預防上文所列之結果中之一者，或涉及疑似經由傳染原藥品傳播。潛在DILI亦被視為醫療顯著事件。 不良事件嚴重度
應使用NCI CTCAE，5.0版本對AE嚴重程度分級。此等準則提供於研究手冊中。
獨立地評估AE嚴重度及嚴重性。『嚴重度』表徵AE之強度。『嚴重性』為法規定義且充當試驗委託者界定法規報告義務的指導(參見上述SAE定義)。 不良事件與研究治療之關係
各AE與恩諾單抗維多汀的關係應由研究者利用以下準則評價： 相關：有證據表明藥物與AE之間存在因果關係，諸如： 單次出現不常見且已知與藥物暴露強烈相關之事件(例如，血管性水腫、肝損傷、史蒂芬斯-強森症候群(Stevens-Johnson Syndrome)) 通常不與藥物暴露相關，但在暴露於藥物之群體中並不常見之事件的一或多次出現(例如，肌腱斷裂) 無關：AE的另一原因似乎更合理(例如，歸因於潛在疾病或在研究群體中普遍發生)，或對AE發生及研究治療之投與無法確定時間順序，或因果關係被視為生物學上不可行的 (b)促使報告及記錄不良事件的程序
適當時，研究者及研究人員藉由將所有AE及SAE記錄於CRF及/或SAE表格上來報導所有AE及SAE，不論其是否在個體問卷調查期間促成、在體檢、實驗室試驗期間發現及/或藉由其他方式發現。 促使報告不良事件
每次研究問診時應使用開放式或非導引式問卷調查方法來促使報告AE。 記錄不良事件
以下資訊應記錄在不良事件CRF上： ●包括發生及消退日期在內的說明 ●其是否符合SAE準則 ●嚴重度 ●與研究治療劑的關係或其他因果關係 ●結果 針對病徵或症狀的診斷
一般而言，較佳對個別症狀的清單使用統一診斷。若徵象及/或症狀的各分量為醫學上確認的診斷分量(如標準醫學教科書所證明)，則應僅將症狀分類納入診斷。若徵象或症狀的任何方面不符合經典的診斷模式，則個別症狀作為各別AE報導。 記錄嚴重不良事件
對於SAE而言，將事件記錄於CRF與SAE表格上。當記錄SAE時，應考慮以下內容： ●死亡為事件的結果。導致死亡的事件應記錄且報告於SAE表格與CRF。 ●對於住院、手術或診斷程序而言，引起手術或診斷程序的病痛應記錄為SAE，而非程序自身。程序應作為回應於病痛而採取的一部分行動記於敍述內容中。 潛在惡性病之進展
由於潛在惡性病之進展以功效變化形式評估，因此其不應報導為AE或SAE。術語「疾病進展」、「疾病之進展」或「惡性病之進展」及其他類似術語不應用於描述AE或SAE。然而，若臨床症狀由於潛在惡性病之進展而無法僅確定或不適應研究中之疾病的預期進展模式，則進展之臨床症狀報導為AE或SAE。此外，發生潛在惡性病之進展的併發症應報導為AE或SAE。 懷孕 藥物安全通知
對於自研究藥物首次給與時直至研究藥物最後一次給與之後的6個月發生的所有妊娠，包括能夠生育兒童之研究個體伴侶發生的任何妊娠，均完成妊娠報告表格。若估算的懷孕日期在個體首次給與研究藥物之後，則僅報告個體伴侶發生的妊娠。在意識到妊娠的48小時內向贊助商的藥物安全部門發送電子郵件或傳真。監測所有妊娠的完整持續時間；應報告所有圍產期及新生兒結果。嬰兒應隨訪最少8週。 CRF 上資料之收集
在最後一次劑量之研究藥物之30天內出現的所有妊娠(如上文所描述)亦記錄在不良事件CRF上。
不論意外、治療或自發引起的流產應作為SAE報告。如藉由以上「嚴重」準則所定義，先天性異常或生育缺陷應報導為SAE。 角膜不良事件
角膜潰爛或角膜炎AE≥2級應在其相應NCI CTCAE類別內分級。1級角膜潰爛或角膜炎AE應根據「眼病-其他，詳細說明(Eye disorders - Other, specify)」準則分級。其他角膜AE應記錄且根據「眼病-其他，詳細說明」準則分級。 糖尿病及高血糖症
糖尿病之定級應基於葡萄糖不耐之NCI CTCAE v5.0事件術語。高血糖症之定級應基於高血糖症之NCI CTCAE v5.0事件術語。 潛在藥物誘發之肝臟損傷
Hy之定律用於評估嚴重程度及研究藥物可引起嚴重肝毒性之發生率增加的可能性。
臨床試驗中不存在肝毒性為正在研究之臨床配置中之潛在的藥物誘導之肝損傷(DILI)提供有限預測值。然而，在臨床試驗中之發現1 Hy之定律案例為不吉利的；發現2案例高度預測嚴重DILI之可能性。 定義
簡言之，潛在的Hy之定律案例包括以下3種組分： 1.胺基轉移酶(ALT及/或AST)升高＞3 x ULN，及 2.總膽紅素＞2 x ULN，不具有膽汁淤積之初始發現(亦即，升高之血清鹼性磷酸酶)， 及 3.不存在由胺基轉移酶升高及高膽紅素血症之其他立即顯而易見的可能原因，包括(但不限於)病毒性肝炎、預先存在之慢性或急性肝病，或已知可為肝毒性之其他藥物的投與。 報導要求
任何潛在Hy之定律案例應作為SAE處置且即時地報導給試驗委託者。
報告應包括所有可用資訊，且應啟動閉合追蹤，直至問題之完全解決且完成獲得補充資料之所有嘗試。 表明潛在 DILI 之 異常實驗室結果的追蹤
一般而言，血清ALT或AST增加至＞3 x ULN應在血清ALT、AST、鹼性磷酸酶及總膽紅素之48至72小時內緊隨重複測試，以確認異常且確定其是否惡化。
應開始適當醫療評估以研究潛在混淆因素及肝毒性之替代原因。在此研究期間，考慮退出研究藥物。 (c)不良事件及嚴重不良事件報導期
所有AE及SAE的安全報告期為研究第1天(給藥前)直至研究治療劑最後一次給與之後的30天。然而，自知情同意書籤署時記錄與研究方案相關的所有AE。安全報告期之後發生且在研究者看來被認為與研究治療劑相關的所有SAE亦應報告給試驗委託者。
追蹤SAE直至顯著變化恢復至基線，事件穩定化(恢復/消退)或研究者不再認為臨床上顯著，或個體死亡或撤回同意書。整個安全報告期期間追蹤所有不嚴重的AE。追蹤所關注之某些非嚴重AE，直至消退、恢復至基線或研究停止。 (d)嚴重不良事件需要立即報告
在SAE觀測或學習的24小時內，研究者應將事件報告給試驗委託者，不論事件與研究治療劑療法的關係。
對於初始SAE報告而言，應將可獲得的個案詳情記錄於SAE表格上。最少應包括以下內容： ●個體數目 ●事件發生日期 ●事件描述 ●研究治療(若已知) ●研究者因果關係評估
完成的SAE表格在24小時內發送電子郵件或傳真至試驗委託者的藥物安全事件(參見SAE報導表格上指定之電子郵件或傳真數字)。
一旦相關追蹤資訊變得可用，將相關隨訪資訊提交至試驗委託者。 (e)向管理機構報導之試驗委託者安全性
研究者需要將所有SAE報告給試驗委託者。根據當地法規或調節性報導要求，試驗委託者視需要向管理機構報導所有SAE，包括疑似出人意料的嚴重不良反應(SUSAR)。 (f)特別受關注之不良事件
追蹤特別受關注的某些不嚴重不良事件(AESI) (包括收集相關的伴隨藥物)，直至消退、恢復至基線、個體退出、研究停止或事件就其被充分表徵而言變成長期的。
出於此目的，與恩諾單抗維多汀相關的AEO包括(但不限於)以下清單中之彼等事件： ●皮膚反應 ●周邊神經病變 ●角膜事件 ●高糖血症
AESI應即時由電子資料捕捉(EDC)報告。若事件符合嚴重準則，則應在24小時內將其報告為嚴重事件。 (ii)生命體徵
生命體徵量測包括心率、收縮血壓及舒張血壓及溫度。記錄生命徵象值，且與臨床上顯著異常的生命徵象相關的任何診斷作為AE或預先存在之病狀記錄。 (iii)臨床實驗室測試
取樣用於當地實驗室。當地實驗室測試包括用於評估安全性及制定臨床決策之機構標準測試。以下實驗室評估由當地實驗室進行，以評估在研究時程期間排定時間點(參見事件計劃表)之安全性： ●血清化學組包括以下測試：白蛋白、鹼性磷酸酶、ALT、AST、碳酸氫鹽、血尿素氮、鈣、肌酸酐、氯離子、乳酸脫氫酶(LDH)、磷、鉀、鈉、總膽紅素、澱粉酶、脂肪酶、葡萄糖及尿酸。 ● HbA1c ●葡萄糖(在給藥之前，藉由抽血或手指針刺，應驗證＜250 mg/dL)。 ●有差異的CBC包括以下測試：分五種部分差異的白血細胞計數(嗜中性球、淋巴球、單核球、嗜伊紅血球及嗜鹼性球)、血小板計數、Hgb及血容比。 ●經計算之CrCl (GFR亦可用於代替肌酸酐或CrCl)。應使用柯克勞夫-高爾特方法或MDRD等式計算CrCl。
在研究時程期間排定時間點(參見事件計劃表)，以下實驗室評估由當地實驗室進行： ●血清學(B型及C型肝炎) ● PT/PTT/INR ●尿樣分析 ○標準尿樣分析(若異常，則利用反射顯微術) ○針對具有生育力之個體的血清或尿液β-hCG妊娠測試 (iv)身體檢查
身體檢查應包括評估以下身體部分/系統：腹部、肢體、頭部、心臟、肺、頸部及神經。亦量測重量及高度。利用在先前12個月內獲得之高度量測結果。
在各膀胱內恩諾單抗維多汀滴注之前，建議由個體解決之問題可包括任何新的或正在進行的症狀，諸如腹痛(尤其在下腹、側腹或尿道中)、發熱、發冷、提示堵塞之症狀、皮疹及檢查任何出血跡象(最小或肉眼血尿、結塊)。若總體臨床評估暗示AE，則應保持進一步治療，直至症狀根據治療研究者之判斷消退。 (v) ECOG體能狀態
在方案指定的時間點評價ECOG體能狀態。 (vi)心電圖
所有個體在篩選時重複三次接受12導聯ECG。若臨床上指示，則應執行額外的ECG。個體以仰臥姿勢維持至少5分鐘之後，執行ECG。若可能，則應在獲得生物標記物樣品之前進行ECG。
不需要各ECG之間的等待時段。將追蹤之電子或紙張複本提交至贊助商指定人員，以進行可能的中央評估。 (vii)妊娠測試
對於具有生育力之個體，敏感性為至少25 mIU/mL之血清或尿液β-hCG妊娠測試在誘導期間在第1週、第3週、第6週及第9週之研究第1天、在維持階段期間各月之研究第1天、在EOT訪問時進行，且在最後接受之給藥恩諾單抗維多汀之後每月持續6個月。在個體可接受研究藥物之前，需要陰性妊娠結果。亦可根據機構審查委員會/獨立倫理委員會(IRB/IEC)所要求或若當地法規需要，重複妊娠測試。 (viii)成像
個體在篩選時進行上尿路、腹部及骨盆之CT或MRI泌尿及胸部之成像。若個體不能耐受IV造影劑，則非造影CT為可接受的。對於上尿路、腹部及骨盆之成像，CT或MRI尿路造影(除非醫學上禁忌)為可接受的。若在開始研究治療之前3個月內進行，則使用具有類似儀器治療之先前成像。 (ix)全面眼部檢查
進行由合格的驗光師或眼科醫師進行之完整眼睛檢查的個體，包括(但不限於)視力、裂隙燈、壓力測定檢查及擴張眼底檢查。後續眼睛檢查如臨床上指示進行。EOT狹縫燈檢查為在研究期間經歷角膜AE的個體所需，且必須自最後一次給藥至少4週進行。 6.2.8.8 治療後評估(i)追蹤評估
由於除疾病持久性、復發或進展以外之原因而中斷研究治療之個體及完成維持階段之個體進入研究之追蹤階段。如事件計劃表中所指示進行身體檢查、尿樣分析及妊娠測試。若臨床上指示，則執行成像。在追蹤期間，經由標準照護膀胱鏡檢(亦即，膀胱鏡檢±活組織檢查)及細胞學之腫瘤反應評估將在入選之後前2年自第一誘導劑量每3個月進行，且其後每6個月持續在入選之後5年進行，直至疾病復發、進展、後續抗癌療法之起始或死亡，以先發生者為準。 (ii)存活追蹤評估
在由於後續抗癌療法之疾病持久性、復發、進展或起始而停止研究治療之後，個體進入存活追蹤。每6個月(±2週)收集存活率及隨後抗癌療法資料，直至失去追蹤、撤回同意書、死亡或由試驗委託者研究終止(以先發生者為準)，持續在入選之後持續最多5年。 6.2.8.9 量測的適當性
此試驗中使用的安全措施視為評價研究藥物之潛在不良作用的標準程序。
反應藉由膀胱鏡檢±活組織檢查及細胞學(其標準用於評估NMIBC中之反應)評估。此方案中之評估間隔視為適合於疾病管理。
通常針對生物製劑，共同評估免疫原性；因此，將執行標準測試以偵測針對恩諾單抗維多汀之特異性抗體的可能存在。藥物動力學評估亦常見於臨床研究中以有助於表徵劑量-暴露-反應關係。 6.2.9資料分析方法 6.2.9.1樣品尺寸之確定
約58名個體入選此研究。此包括在劑量遞增中評估之約18名個體及在至多2個擴增群組中評估之約40名個體(各群組中之約20名個體)。
完成劑量遞增所需之個體的準確數目為未知的，因為視評估達到MTD之劑量含量的數目及在各劑量含量下治療之個體的數目而定。
未對擴增群組計劃正式的假設檢驗。假定所觀測到之CR比率在30%至50%範圍內，則95%及80%精確CI (其中每群組20名個體)概述於上文表11中。 6.2.9.2研究終點定義
研究終點呈現於6.1.3目標中。終點定義呈現於此章節中。 (i) 完全反應率
CR速率定義為達成CR之個體的比例。
當個體具有所有以下發現時，個體將視為具有CR： 1.膀胱鏡檢：膀胱之正常外觀。在膀胱鏡檢上出現異常之情況下，活體組織切片為陰性或展現出低級Ta、具有低惡性潛能之任何級別乳突狀尿道上皮贅瘤或任何級別乳突狀瘤。若進行隨機膀胱活組織檢查，則此等活體組織切片應為陰性或顯示為低級別疾病。 2.尿液細胞學：陰性。 a.應評估不確定之尿液細胞學 b.陽性尿液細胞學應藉由膀胱鏡檢±活組織檢查及成像在臨床上進一步評估 3.成像(若執行)：正常或若發現異常，則發現應支援膀胱中之CR。
由於研究治療之膀胱內投與，若個體患有惡性尿液細胞學之陰性膀胱鏡檢，若癌症發現於上尿路或前列腺尿道中且隨機膀胱活組織檢查為陰性，則將其視為具有CR。
不具有基線後反應評估之個體視為未實現CR。 (ii)完全反應持續時間
CR之持續時間定義為自第一記錄之CR至歸因於任何原因之復發、進展或死亡(以先發生者為準)之第一跡象的時間。
達成CR、存活且無疾病復發及在分析時之進展的個體將在最後疾病評估時進行檢查。詳細檢查規則提供於統計分析計劃(SAP)中。 (iii)膀胱切除術之速率
膀胱切除術之速率經定義為隨後經歷膀胱切除術之個體的比例。 (iv)無進展存活期
無進展存活期(PFS)定義為自研究治療開始至進展之第一跡象或由任何原因所致之死亡(以先發生者為準)的時間。在最後疾病評估時檢查在分析時存活且無進展之個體。詳細檢查規則提供於SAP中。 (v)不使用膀胱切除術之存活
不使用膀胱切除術之存活(CFS)經定義為自研究治療開始至膀胱切除術或由任何原因所致之死亡(以先發生者為準)的時間。在最後已知存活日時檢查在分析時存活且未進行膀胱切除術之個體。詳細檢查規則提供於SAP中。 6.2.9.3統計及分析計劃
高位準統計及分析計劃在下文中概述。更詳細且全面的計劃將提供於SAP中。 (i)一般考慮因素
此為具有後續擴增群組之1期劑量遞增研究。所有分析均為描述性的。
描述性統計(平均值、中值、標準差、最小值、最大值)用於描述連續變數。頻率及百分比用以描述類別變數。 (a)隨機化及盲法
此為開放標記劑量遞增及擴增研究。不利用隨機化，且盲法不適用。 (b)共變數之調整
並未規劃共變數之調整。 (c)退出及遺漏資料之處理
除非另外規定，否則估算遺漏資料。出於計算事件持續時間及TE狀態之目的，估算缺失的AE開始及停止日期。關於遺漏資料處置之細節提供於SAP中。 (d) 多中心研究
在此研究中存在多個中心；然而，預期任何中心均將累積足夠個體以保證按中心分析。 (e)多重比較及多重性
在此階段1研究中不計劃多個比較且不需要α調節。 (f)資料變換及推導
除非在分析計劃中另外指定，否則基於2個日期(例如開始日期及結束日期)之時間變數計算為(結束日期-開始日期1)(以天為單位)。
除非在分析計劃中另外規定，否則所有統計分析中使用之基線值係在第一劑量之研究藥物之前的最新非遺漏量測。 (g)分析組 所有經處理個體分析組
所有經處理個體(ATS)分析組包括接收任何量之恩諾單抗維多汀的所有個體。ATS分析組用於分析安全性及功效終點。 DLT- 可評估的分析組
DE分析組包括所有經處理之個體的劑量遞增，其經歷DLT或接受至少5個誘導劑量之恩諾單抗維多汀。DE分析組為用於測定MTD。 (h)小組檢查
作為探索性分析，對所選終點進行子組分析。子組可包括(但不限於)以下： ●先前療法 ●疾病亞型 ●連接素-4表現量 (i)分析時序
此研究之最終分析在所有個體已完成其治療及追蹤期之後或在由試驗委託者研究終止之後進行。 (ii)個體處置
將藉由安置對研究個體進行列表且將概述各分析組中個體之數目。出於中斷或退出之原因，概述中斷研究治療之個體及自研究退出之個體。 (iii)個體特徵
概述人口統計資料及其他基線特徵。詳情將提供於SAP中。 (iv)治療依從性
在研究性位點中膀胱內投與研究藥物。未計劃治療順應性之概述。 (v)功效分析
使用ATS分析組進行所有功效分析。
在研究任何時間之CR比率及3、6、12、18及24個月之CR比率連同精確95% CI一起彙總。
使用卡本-麥爾方法估計CR之持續時間。分析中僅包括達成CR之個體。
使用卡本-麥爾方法估計PFS及CFS。適當時將呈現卡本-麥爾曲線。詳細方法提供於SAP中。
連同精確95% CI，概述膀胱切除術之速率。 (vi)藥物動力學及免疫原性分析
在各PK取樣時間點，以描述性統計方式概括血液及尿液中之恩諾單抗維多汀濃度。待計算之劑量相關PK參數可包括(但不限於) AUC、Cmax、Tmax、t1/2及Ctrough，且藉由非室分析估計且藉由描述性統計資料概述。視需要評估額外分析物。研究PK及藥力學終點、安全性或功效之間的關係。
ATA之發病率係根據描述性統計資料來彙總。 (vii)生物標記物分析
研究生物標記物參數(例如，基線值、相對於基線之絕對及相對變化)與抗腫瘤活性、安全性及PK參數之關係。概述經確定所關注之關係及相關資料。細節分別在SAP或生物標記物分析計劃中描述。 (viii)患者報導結果分析
經由個體訪問收集患者報導結果。對由此等訪問產生之轉錄物的分析描述於獨立文獻中。 (ix)安全性分析
使用ATS分析組進行所有安全性分析。 (a)暴露程度
概述治療持續時間、劑量數目、總劑量及劑量強度。概述劑量修改，包括劑量延遲、跳躍及減少。細節提供於SAP中。 (b)不良事件
AE之概述提供所有治療引發不良事件(TEAE)、治療相關TEAE、3級或更高級TEAE、治療相關3級或更高級TEAE、TE SAE、治療相關TE SAE、導致死亡之TEAE、導致死亡之治療相關TEAE、導致治療中斷之TEAE及導致治療中斷之治療相關TEAE之發生率的列表。若在第一劑量研究治療之後及在最後劑量之後30天或之前新出現或惡化，則將AE定義為治療引發。
TEAE係藉由用於法規活動之醫學詞典(MedDRA)較佳術語、嚴重性及與研究藥物之關係概述。在1名個體中多次出現具有相同較佳術語之相同AE的情況下，對AE計數為發生一次。導致劑量修飾或治療中斷之TEAE以相同方式彙總。
列出所有TEAE、3級或更高級TEAE及導致治療中斷之TEAE。 (c)劑量限制性毒性
針對DE分析組概述經歷DLT之個體的數目及百分比。針對各劑量含量，呈現DLT之機率的基於模型之估計值以及95%可靠區間。 (d)死亡及嚴重不良事件
SAE以與TEAE相同之方式列出及彙總。列出具有致命結果之事件。 (e)臨床實驗室結果
實驗室值(例如，化學、血液學及尿分析)藉由訪問概述。將自基線變化至最大基線後NCI CTCAE級製成表。
根據NCI CTCAE列舉實驗室值且當值處於正常參考範圍外部時加以標記。 (f)其他安全分析 生命體徵
列出生命體徵量測結果(收縮性及舒張性血壓、心跳速率及溫度)。 ECOG 體能狀態
將基線變化至最佳及最差基線後評分製成表。 ECG
列出ECG狀態(正常、臨床上顯著或臨床上不顯著之異常)。 (x)中期分析
未計劃正式推理分析。在研究之劑量遞增部分期間，在各群組之後由主持者及SMC評估資料以確定DLT且告知劑量遞增決定。SMC在進行中的基礎上監測安全性及DLT試驗。
用於SMC決策之方法及SMC之作用及責任詳述於單獨文件中。
來自研究之中期資料以科學會議呈現，諸如美國臨床腫瘤學協會之年度會議。 6.2.10術語之縮寫及定義清單 ADC抗體-藥物結合物 AE不良事件 AESI特別受關注之不良事件 ALT丙胺酸胺基轉移酶 ANC絕對嗜中性白血球計數 aPTT活化部分凝血激酶時間 AST天冬胺酸胺基轉移酶 ATA抗治療性抗體 ATS所有經處理個體 AUA美國泌尿協會 AUC濃度-時間曲線下面積 β-hCG β人類絨毛膜激性腺素 BCG卡介苗 BICR盲態獨立中心評估 Cmax最大濃度 CrCl肌酸酐清除率 Ctrough谷值濃度 CBC全血細胞計數 CFS不使用膀胱切除術 CI信賴區間 CIS原位癌 CR完全反應 CRF案例報告形式 CT電腦斷層掃描 CYP細胞色素P450 DE DLT-可評估 DILI藥物誘導之肝損傷 DLT劑量限制性毒性 DOR反應持續時間 DU當前劑量具有不可接受之毒性 EAU歐洲血清學協會 ECD胞外域 ECG心電圖 ECOG美國東岸癌症臨床研究合作組織 eCRF電子案例報告形式 ELISA酶聯免疫吸附分析 EOT治療結束 FIH首次用於人體 GFR腎小球濾過率 HbA1c血紅蛋白A1c Hgb血紅素 HIV已知的人類免疫缺乏病毒 HR風險比 ICH國際協調委員會 IEC獨立倫理委員會 Ig免疫球蛋白 IND研究中新藥 IRB機構審查委員會 IRR輸注相關之反應 IV靜脈內 LDH乳酸脫氫酶 mAB單株抗體 MDRD腎病飲食改進 MedDRA法規活動之醫學詞典 MMAE單甲基阿瑞他汀E MRHD最大建議人類劑量 MRI磁共振成像 MTD最大耐受劑量 mTPI經修改之毒性機率區間 NCI CTCAE國家癌症研究所不良事件常見術語準則(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events) NMIBC非肌肉浸潤性膀胱癌 NOAEL未觀測到之不良作用含量 NYHA紐約心臟協會 ORR客觀反應率(Objective response rate) OS總存活期 PACS圖像存檔及通信系統 PCR聚合酶連鎖反應 PD-1計劃性細胞死亡蛋白1 PD-L1計劃性死亡配位體1 PFS無進展存活期 P-gp  P-醣蛋白 PK藥物動力學 PK/PD藥物動力學/藥效性s PN周邊神經病變 PSA前列腺特異性抗原 PT/PTT/INR凝血酶原時間/部分凝血激酶時間/國際標準化比值 q1wk一週一次 SAE嚴重不良事件 SAP統計分析計劃 SJS史蒂芬斯-強森症候群 SMC安全性監測委員會 SUSAR疑似未預期嚴重不良反應 t1/2半衰期 TAb總抗體 TE治療引發 TEAE治療引發之不良事件 TEN中毒性表皮壞死溶解 Tmax達到最大濃度之時間 TURBT膀胱腫瘤之經尿道切除 UC尿道上皮癌 ULN正常值上限 US美國 UTI泌尿道感染
圖 1A 至圖 1E描繪連接素-4蛋白的核苷酸及胺基酸序列( 圖 1A)、Ha22-2(2.4)6.1之重鏈( 圖 1B)及輕鏈( 圖 1C)的核苷酸及胺基酸序列，以及Ha22-2(2.4)6.1之重鏈( 圖 1D)及輕鏈( 圖 1E)的胺基酸序列。
圖 2描繪使用模擬膀胱內給藥之條件，恩弗妥單抗維汀(EV)活體外在過度表現連接素-4之膀胱癌細胞(亦即，UM-UC-3-hNectin-4 +)的細胞毒性活性。
圖 3A 至圖3 E描繪在連接素-4 +膀胱正位異種移植小鼠模型中膀胱內投與恩弗妥單抗維汀(EV)之功效。 圖 3A描繪用UM-UC-3-hNectin4 +-Luc +細胞化學磨損之後原位植入SCID小鼠之產生，以及用於向小鼠膀胱內投與EV，接著對膀胱組織進行組織學分析之給藥時程。 圖 3B描繪確認腫瘤移植及EV活性之生物發光成像結果。SWFI，注射用無菌水。 圖 3C描繪證實EV活性之抗連接素-4免疫組織化學結果。 圖 3C中之右側五個圖中之膀胱組織分別來自 圖 3B中之經膀胱內劑量之EV處理的五個小鼠。 圖 3D描繪 圖 3B中之生物發光成像結果的定量分析。 圖 3E描繪連接素-4及MMAE在膀胱腫瘤組織中之免疫組織化學(IHC)染色，展現出連接素-4及MMAE之共定位。
圖 4A 至圖 4B描繪在以不同濃度及投與體積經單次膀胱內劑量之EV處理的史泊格多利大鼠之膀胱組織中的游離MMAE。
圖 5描繪膀胱內EV全身暴露。
圖 6描繪在經單次膀胱內劑量之EV處理不同停留時間長度的史泊格多利大鼠之膀胱組織中的游離MMAE。
圖 7描繪章節6.1中所描述之臨床試驗的方案，其為1期、開放標記、多中心、劑量遞增及劑量擴增研究，其經設計以評估膀胱內恩諾單抗維多汀(enfortumab vedotin)在患有NMIBC之成人中之安全性、耐受性、PK及抗腫瘤活性。(BCG= 卡介苗；CIS= 原位癌；EV= 恩諾單抗維多汀；mTPI=經修飾之毒性機率區間；q3= 每3；q6= 每6；TURBT= 膀胱腫瘤之經尿道切除術；wkly= 每週。預期在給定劑量下之安全性或低於或接近計劃劑量含量的劑量含量的研究。)
TW202315612A_111130416_SEQL.xml
Figure 111130416-A0101-11-0002-1

Claims (62)

  1. 一種治療人類個體中膀胱癌之方法，該方法包含向該個體膀胱內投與有效量之抗體藥物結合物(antibody drug conjugate；ADC)，其中該ADC包含結合191P4D12之抗體或其抗原結合片段，該191P4D12係與單甲基奧瑞他汀E (monomethyl auristatin E，MMAE)之一或多個單元結合。
  2. 如請求項1之方法，其中該膀胱癌為非肌肉浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer；NMIBC)。
  3. 如請求項‎2之方法，其中該NMIBC已經組織學確認且係原位癌(carcinoma in situ；CIS)。
  4. 如請求項‎3之方法，其中該個體患有乳突狀疾病。
  5. 如請求項‎3之方法，其中該個體未患有乳突狀疾病。
  6. 如請求項2至5中任一項之方法，其中該NMIBC已經組織學確認，且其中主要組織學組成部分(＞50%)為尿道上皮(移行細胞)癌。
  7. 如請求項‎1至‎6中任一項之方法，其中該個體患有高風險卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin；BCG)無反應性疾病。
  8. 如請求項‎1至‎7中任一項之方法，其中該個體不適合或拒絕接受根治性膀胱切除術。
  9. 如請求項‎1至‎8中任一項之方法，其中該個體所有可見乳突狀Ta/T1腫瘤在該治療之前60天內已完全切除。
  10. 如請求項‎9之方法，其中該個體具有殘留純CIS。
  11. 如請求項‎9之方法，其中該個體不具有殘留純CIS。
  12. 如請求項‎1至‎11中任一項之方法，其中該個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體能狀態評分為0。
  13. 如請求項‎1至‎11中任一項之方法，其中該個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為1。
  14. 如請求項‎1至‎11中任一項之方法，其中該個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為2。
  15. 如請求項‎14之方法，其中該個體之腎小球濾過率(glomerular filtration rate；GFR)不低於50 mL/min，且該個體未罹患有紐約心臟協會(New York Heart Association，NYHA) III級心臟衰竭。
  16. 如請求項‎1至‎15中任一項之方法，其中該個體具有一或多種選自由以下組成之群的狀況： a.絕對嗜中性白血球計數(Absolute neutrophil count；ANC) ≥1500/μL； b.血紅蛋白(Hgb) ≥10 g/dL； c.血小板計數≥100,000/μL； d.血清膽紅素≤1.5 ×正常上限(upper limit of normal；ULN)或對於患有吉爾伯氏病(Gilbert's disease)之個體≤3 x ULN； e.經計算之肌酸酐清除率(creatinine clearance；CrCl) ≥30 mL/min (亦可使用GFR代替肌酸酐或CrCl)，應使用柯克勞夫-高爾特方法(Cockcroft-Gault method)或腎病飲食改進(Modification of Diet in Renal Disease；MDRD)等式來計算CrCl，ECOG體能狀態為2之個體必須具有GFR ≥50 mL/min； f.丙胺酸胺基轉移酶(alanine aminotransferase；ALT)及天冬胺酸胺基轉移酶(aspartate aminotransferase；AST) ≤3 × ULN；或 g.除非個體正接受抗凝血劑療法，只要PT或aPTT在預期使用抗凝血劑之治療範圍內，否則國際標準化比值(international normalized ratio；INR)或凝血酶原時間(prothrombin time；PT)、活化部分凝血激酶時間(activated partial thromboplastin time；aPTT)或部分凝血激酶時間(partial thromboplastin time；PTT) ≤1.5 ULN。
  17. 如請求項‎16之方法，其中該個體具有如請求項16之 (a)至(g) 所有狀況。
  18. 如請求項‎1至‎17中任一項之方法，其中該個體之經估計預期壽命超過2年。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含含有互補決定區(complementarity determining region；CDR)之重鏈可變區，該CDR包含SEQ ID NO: 22中所闡述之CDR胺基酸序列 ，該輕鏈可變區包含含有CDR之輕鏈可變區，該CDR包含SEQ ID NO: 23中所闡述之CDR胺基酸序列。
  20. 如請求項‎1至‎19中任一項之方法， 其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之CDR-H2、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H3、包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L3，或 其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的CDR-H3；包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的CDR-L2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的CDR-L3。
  21. 如請求項‎1至‎19中任一項之方法， 其中該抗體或其抗原結合片段包含：由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成的CDR-H1、由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成的CDR-H2、由SEQ ID NO: 11之胺基酸序列組成的CDR-H3；由SEQ ID NO: 12之胺基酸序列組成的CDR-L1、由SEQ ID NO: 13之胺基酸序列組成的CDR-L2及由SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的CDR-L3，或 其中該抗體或其抗原結合片段包含：由胺基酸序列SEQ ID NO: 16組成的CDR-H1、由胺基酸序列SEQ ID NO: 17組成的CDR-H2、由胺基酸序列SEQ ID NO: 18組成的CDR-H3；由胺基酸序列SEQ ID NO: 19組成的CDR-L1、由胺基酸序列SEQ ID NO: 20組成的CDR-L2，及由胺基酸序列SEQ ID NO: 21組成的CDR-L3。
  22. 如請求項‎1至‎21中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
  23. 如請求項‎1至‎22中任一項之方法，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO: 7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO: 8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內之胺基酸序列。
  24. 如請求項‎1至‎23中任一項之方法，其中該抗原結合片段為Fab、F(ab')2、Fv或scFv。
  25. 如請求項‎1至‎24中任一項之方法，其中該抗體為完全人類抗體。
  26. 如請求項‎1至‎25中任一項之方法，其中該抗體為IgG1，且輕鏈為κ輕鏈。
  27. 如請求項‎1至‎26中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係以重組方式產生。
  28. 如請求項‎1至‎27中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段經由連接子與MMAE之各單元結合。
  29. 如請求項28之方法，其中該連接子為酶可裂解連接子，且其中該連接子與該抗體或其抗原結合片段之硫原子形成鍵。
  30. 如請求項‎28或‎29之方法，其中該連接子具有-Aa-Ww-Yy-之式；其中-A-為延伸子單元，a為0或1；-W-為胺基酸單元，w為在0至12範圍內之整數；及-Y-為間隔子單元，y為0、1或2。
  31. 如請求項‎30之方法，其中該延伸子單元具有下式(1)之結構；該胺基酸單元為纈胺酸-瓜胺酸；且該間隔子單元為包含下式(2)之結構的PAB基團：
    Figure 03_image051
    式(1)
    Figure 03_image053
    式(2)。
  32. 如請求項‎30或‎31之方法，其中該延伸子單元與該抗體或其抗原結合片段之硫原子形成鍵；且其中該間隔子單元經由胺基甲酸酯基與MMAE連接。
  33. 如請求項‎1至‎32中任一項之方法，其中該ADC包含1至20個MMAE單元/抗體或其抗原結合片段。
  34. 如請求項‎1至‎33中任一項之方法，其中該ADC包含1至10個MMAE單元/抗體或其抗原結合片段。
  35. 如請求項‎1至‎34中任一項之方法，其中該ADC包含2至8個MMAE單元/抗體或其抗原結合片段。
  36. 如請求項‎1至‎35中任一項之方法，其中該ADC包含3至5個MMAE單元/抗體或其抗原結合片段。
  37. 如請求項‎1至‎36中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
    Figure 03_image001
    其中L-表示該抗體或其抗原結合片段，且p為1至10。
  38. 如請求項‎37之方法，其中p為2至8。
  39. 如請求項‎37或‎38之方法，其中p為3至5。
  40. 如請求項‎37至‎39中任一項之方法，其中p為3至4。
  41. 如請求項‎37至‎40中任一項之方法，其中p為約4。
  42. 如請求項‎37至‎40中任一項之方法，其中該有效量之該等抗體藥物結合物的平均p值為約3.8。
  43. 如請求項‎1至‎42中任一項之方法，其中該ADC係調配於包含L-組胺酸、聚山梨醇酯-20 (TWEEN-20)及脫水海藻糖之醫藥組合物中。
  44. 如請求項‎1至‎43中任一項之方法，其中該ADC係調配於包含約20 mM L-組胺酸、約0.02% (w/v) TWEEN-20、約5.5% (w/v)二水合海藻糖及鹽酸鹽之醫藥組合物中，且其中該醫藥組合物之pH在25℃下為約6.0。
  45. 如請求項‎1至‎43中任一項之方法，其中該ADC係調配於包含約9 mM組胺酸、約11 mM組胺酸鹽酸鹽單水合物、約0.02% (w/v) TWEEN-20及約5.5% (w/v)二水合海藻糖之醫藥組合物中，且其中該醫藥組合物之pH在25℃下為約6.0。
  46. 如請求項‎1至‎45中任一項之方法，其中該ADC之該有效量係在約100 mg至約1000 mg之間、在約125 mg至約950 mg之間、在約125 mg至約900 mg之間、在約125 mg至約850 mg之間、在約125 mg至約800 mg之間或在約125 mg至約750 mg之間的劑量，其中滴注體積在約10 mL至約100 mL之間。
  47. 如請求項‎1至‎46中任一項之方法，其中該ADC之該有效量係在約125 mg至約750 mg之間的劑量，其中滴注體積為約25 mL。
  48. 如請求項‎1至‎47中任一項之方法，其中該ADC之該有效量為約125 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
  49. 如請求項‎1至‎47中任一項之方法，其中該ADC之該有效量為約250 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
  50. 如請求項‎1至‎47中任一項之方法，其中該ADC之該有效量為約500 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
  51. 如請求項‎1至‎47中任一項之方法，其中該ADC之該有效量為約750 mg之劑量，其中滴注體積為約25 mL。
  52. 如請求項‎1至‎51中任一項之方法，其中各膀胱內投與之最長停留時間為約90分鐘。
  53. 如請求項1至51中任一項之方法，其中各膀胱內投與之最長停留時間為約120分鐘。
  54. 如請求項1至51中任一項之方法，其中各膀胱內投與之停留時間為約30、40、50、60、70、80、90或120分鐘。
  55. 如請求項‎1至54中任一項之方法，其中該ADC係在兩個階段期間經膀胱內投與，其中該等兩個階段為誘導階段及維持階段。
  56. 如請求項55之方法，其中該維持階段在該誘導階段之後的六至十週之間、六至九週之間或六至八週之間開始。
  57. 如請求項55或56之方法，其中該ADC在該誘導階段期間膀胱內投與一週一次持續六週。
  58. 如請求項55至57中任一項之方法，其中該ADC在該維持階段期間膀胱內投與一月一次持續九個月。
  59. 如請求項‎1至58中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
    Figure 03_image056
    其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約125 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
  60. 如請求項‎1至58中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
    Figure 03_image058
    其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約250 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
  61. 如請求項‎1至58中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
    Figure 03_image060
    其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約500 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
  62. 如請求項‎1至58中任一項之方法，其中該ADC具有以下結構：
    Figure 03_image062
    其中L-表示該抗體或其抗原結合片段且p為約3至約4，該抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7之第20個胺基酸(麩胺酸)至第466個胺基酸(離胺酸)範圍內的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:8之第23個胺基酸(天冬胺酸)至第236個胺基酸(半胱胺酸)範圍內的胺基酸序列，其中該ADC係以約750 mg之劑量膀胱內投與，其中滴注體積為約25 mL且最長停留時間為90分鐘，其中該劑量係在該誘導階段期間一週一次持續六週及在該維持階段期間一月一次持續九個月膀胱內投與，且其中該維持階段在該誘導階段之後六至十週之間開始。
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