TW202311528A - 大規模腺相關病毒產生系統 - Google Patents

Abstract

本發明提供用於產生且表徵腺相關病毒粒子及桿狀病毒粒子之方法。

Description

大規模腺相關病毒產生系統

本發明係關於用於產生腺相關病毒（adeno associated virus, AAV）粒子之方法及製程。

本發明係有關改進腺相關病毒（AAV）產生之方法。AAV為無套膜病毒，其單股DNA基因體在末端處具有含至少一個反向末端重複序列（inverted termincal repeat, ITR）。舉例而言，該AAV2血清型可具有約4.7千鹼基（kb）之單股DNA基因體，在末端處具有兩個145個核苷酸長的反向末端重複序列（ITR）。病毒不編碼聚合酶，且因此依賴於細胞聚合酶進行基因體複製。ITR側接兩種病毒基因——rep（複製）及cap（衣殼），分別編碼非結構蛋白及結構蛋白。經由使用兩種啟動子及替代性剪接，Rep基因編碼四種調控蛋白質，該等蛋白質稱為Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。此等蛋白質參與AAV基因體複製及封裝。Cap基因經由替代性剪接及轉譯起始產生三種衣殼蛋白質VP1（病毒粒子蛋白質1）、VP2及VP3。AAV2之VP1、VP2及VP3的分子量分別為87、72及62 kDa。此等衣殼蛋白質組裝成具有60個次單元之近似球形的蛋白質殼。

AAV不能獨立地複製且需要經輔助病毒，通常為腺病毒或疱疹病毒共感染。當AAV單獨感染人類細胞時，其基因表現程式為自動抑制的且發生細胞之潛伏感染。然而，當潛伏感染之細胞經諸如腺病毒或單純疱疹病毒之輔助病毒共感染時，AAV基因表現得以活化，使得原病毒DNA自宿主細胞染色體切除，接著複製且封裝病毒基因體。

含有AAV基因及治療性基因之桿狀病毒已用於感染Sf9細胞以產生含有治療性基因之AAV衣殼。舉例而言，含有AAV Rep/Cap基因或治療性基因之桿狀病毒用於共感染Sf9細胞。藉由此方法，桿狀病毒發揮雙重作用，從而充當AAV產生所需之「輔助」病毒以及AAV及治療性基因物質之運載體（vehicle）。

桿狀病毒AAV產生方法有多種優點。首先，Sf9細胞可以較高密度作為自由浮動的懸浮液培養於具有高達2000公升（L）體積之較大生物反應器中，從而能夠實現與經由黏附細胞培養物所實現的相比更高效的AAV產生。另外，Sf9細胞可在無血清條件下生長，其藉由消除潛在免疫原性或毒性動物衍生之蛋白質的存在來改進生物安全。此外，桿狀病毒無法在人類細胞中複製。

然而，AAV衣殼之桿狀病毒/Sf9產生亦存在顯著限制。舉例而言，桿狀病毒基因體可能因多次繼代而變得不穩定。若rep基因損失，則rAAV之產生將停止。Pijlman（Pijlman, Gorben P.,等人 「 Autographa californica baculoviruses with large genomic deletions are rapidly generated in infected insect cells」 Virology 283.1 (2001): 132-138）揭示尤其在兩次繼代內桿狀病毒基因體中之缺失。Airenne（Airenne, Kari J.,等人 「 Improved generation of recombinant baculovirus genomes in Escherichia coli」 Nucleic acids research 31.17 (2003): e101-e101）揭示選擇具有重組穿梭載體之大腸桿菌群落的致死性選擇策略。Scholz及Suppmann（Scholz, Judith及Sabine Suppmann. 「 A new single-step protocol for rapid baculovirus-driven protein production in insect cells」 BMC biotechnology 17.1 (2017): 83）揭示在懸浮液中之穿梭載體轉染及分離P0桿狀病毒來減少重組蛋白質之產生時間，但未揭示分離P0 BV以解決基因體不穩定性或用於AAV產生。Negrete（Negrete, Alejandro,等人 「 Economized large ‐ scale production of high yield of rAAV for gene therapy applications exploiting baculovirus expression system」 The Journal of Gene Medicine: A cross‐disciplinary journal for research on the science of gene transfer and its clinical applications 9.11 (2007): 938-948)揭示在0.03之MOI下用桿狀病毒感染Sf細胞以產生AAV。Mena（Mena, Jimmy A.,等人 「 Improving adeno ‐ associated vector yield in high density insect cell cultures」 The Journal of Gene Medicine: A cross‐disciplinary journal for research on the science of gene transfer and its clinical applications 12.2 (2010): 157-167）亦揭示在0.3之MOI下用桿狀病毒感染Sf細胞以產生AAV。對於AAV產生， Negrete及 Mena均未表明使用低於0.3 BV MOI。

本發明解決與使用經桿狀病毒感染之Sf9細胞產生rAAV相關之問題且實現用於產生rAAV之改進的方法。本發明人已研發出用於產生重組桿狀病毒（recombinant baculovirus, rBV）及重組腺相關病毒（rAAV）之不同方法。此等方法解決諸如基因體不穩定性之問題且亦引起改進rAAV之產生，以及產生具有改進之特性的rAAV（例如，更高感染性、降低之衣殼化核酸雜質等）。

揭示產生rAAV之實施例。

在各種實施例中，產生rAAV之方法包含用至少一種rBV感染細胞之步驟。至少一種rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。該方法進一步包含培養經感染細胞以產生rAAV之步驟。在此方法中，至少一種rBV係自至少一種包含經該等核苷酸序列中之至少一者轉染的細胞之細胞培養物分離。

在各種實施例中，產生rAAV之方法包含用至少一種rBV感染細胞之步驟。至少一種rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。該方法進一步包含培養經感染細胞以產生rAAV之步驟。在此方法中，在該感染步驟之前至少一種rBV係自至少一種包含具有桿狀病毒基因體之至少一部分的細胞之細胞培養物分離。細胞亦經至少一種核苷酸序列轉染，該至少一種核苷酸序列與桿狀病毒基因體之至少一部分組合以形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體。

在各種實施例中，產生rAAV之方法包含以下步驟：用第零代（P0）rBV感染至少一個細胞且培養經感染之至少一個細胞以產生rAAV。P0 rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。

在各種實施例中，產生rAAV之方法包含以低於0.01之感染倍率（multiplicity of infection, MOI）用rBV感染細胞之步驟。rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。該方法亦包含培養經感染細胞以產生rAAV之步驟。

在各種實施例中，揭示使用至少一種rBV產生大規模基於rBV之rAAV的方法。該方法包含以下步驟：產生含有具有AAV Rep基因、AAV Cap基因及rAAV載體基因體之穿梭載體的重組大腸桿菌（E. coli）庫；冷凍保存該大腸桿菌庫；解凍該大腸桿菌庫；使穿梭載體與經解凍大腸桿菌庫分離；用來自該經解凍大腸桿菌庫之穿梭載體轉染昆蟲細胞；分離rBV與經轉染昆蟲細胞；及用經分離rBV在生物反應器中感染其他昆蟲細胞且培養該感染昆蟲細胞以產生rAAV。

亦揭示與基於rBV產生rAAV相關之其他實施例。

在各種實施例中，揭示一種用於增加rAAV產生且減少在該所產生之rAAV內經衣殼化之核酸雜質的方法。該方法包含用具有用於rAAV載體基因體之核苷酸序列的rBV及一個或多個具有編碼Rep及Cap蛋白質之核苷酸序列的第二rBV感染不同細胞培養物之步驟。以第一rBV MOI:一個或多個第二rBV MOI之不同比率用該第一rBV及該一個或多個第二rBV感染各細胞培養物。該方法亦包含以下步驟：自該等不同細胞培養物中分離rAAV，確定自該等不同細胞培養物中分離之rAAV的效價，確定自該等不同細胞培養物中分離之rAAV內之衣殼化核酸雜質的濃度；及根據兩種確定步驟鑑別該第一rBV MOI:該一個或多個第二rBV MOI之一種或多種比率。

在各種實施例中，一種用於量測rBV效價之方法包含用rBV感染指示細胞之步驟。指示細胞具有可操作地連接至早期或中間桿狀病毒啟動子序列之報導核苷酸序列。在其他實施例中，該報導核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒衍生之強化子序列。該方法亦包含量測報導核苷酸序列之表現且自報導核苷酸序列之表現確定rBV效價的步驟。

在各種實施例中，用於量測rBV效價之細胞包含可操作地連接至早期或中間桿狀病毒啟動子序列之報導核苷酸序列。該報導核苷酸序列及該早期或中間桿狀病毒啟動子序列穩定地維持於該細胞內。在不同實施例中，其中該報導核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒衍生之強化子序列，且該桿狀病毒衍生之強化子序列係穩定地維持於細胞內。

在各種實施例中，揭示一種用於產生用於量測rBV效價之指示細胞的方法。該方法包括將包含可操作地連接至早期或中間桿狀病毒啟動子之報導核苷酸序列之載體轉染至細胞中之步驟。在其他實施例中，該報導核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒衍生之強化子序列。

同時在此提交作為正文檔案之名為「6439-0113PWO1.xml」（ST.26 標準）的序列表。

視需要，本文中揭示本發明之詳細實施例；然而，應理解，所揭示之實施例僅為示例性的且可以各種及替代形式體現。

除實例外，或除非明確指示，否則本說明書中指示材料之量或反應及/或使用之條件的所有數量皆應理解為由字「約」修飾。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。在一個實例中，術語「約」理解為在此項技術中正常公差之範圍內，例如在平均值之2個標凖偏差內。在不同實例中，「約」係指±0.0001%、±0.0005%、±0.001%、±0.005%、±0.01%、±0.05%、±0.1%、±0.5%、±1%、±5%或±10%之變化性。在其他實例中，「約」可理解為在±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%或±2%內。

字首語或其他縮寫之第一定義適用於同一縮寫在本文中之所有後續使用，並且在細節上作必要修改後適用於最初定義之縮寫之正常語法變體；且除非明確地相反陳述，否則屬性之量測藉由與先前或稍後針對相同屬性所參考相同的技術確定。

除非另外指示，否則本文中所用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。

亦應瞭解，本發明不限於下述特定實施例及方法，因為特定組分及/或條件當然可變化。此外，本文所用之術語僅用於描述特定實施例之目的且並不意欲以任何方式限制本發明。

亦必須注意到，除非上下文另外清晰地指示，否則如在本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一（a、an）」及「該」包含複數個指示物。舉例而言，以單數形式提及組分意欲包含複數個組分。

術語「或」及「及」可互換地使用且可理解為意謂「及/或」。

術語「包含」與「包括」、「具有」、「含有」或「其特徵在於」同義。此等術語為包括性的及開放式的，並且不排除其他未列出之要素或方法步驟。

片語「由……組成」不包括申請專利範圍中未指定的任何要素、步驟或成分。當此片語出現在一個請求項主體之子句中而非緊接在前言之後時，其僅限制該子句中所闡述之要素；該請求項總體上不排除其他要素。

片語「基本上由……組成」將技術方案之範疇限於指定材料或步驟及實質上不影響所主張主題之基本及新穎特徵的彼等材料或步驟。

術語「包含」、「由……組成」及「基本上由……組成」可替代性地使用。當使用此等三個術語中之一者時，本發明揭示及主張之標的物可包括使用其他兩個術語中之任一者。

貫穿本申請案，在參考公開案之情況下，此等公開案之揭示內容在此以引用之方式全部併入本申請案中，以更充分地描述本發明係關於的目前先進技術。

術語「異源」係指作為非天然AAV或細胞或天然AAV或細胞，但不位於其天然位置或位於病毒基因體或宿主細胞基因體內之位置的聚核苷酸序列。

「編碼（encodes）」、「經編碼（encoded）」及「編碼（encoding）」係指聚核苷酸（諸如基因、cDNA或mRNA）中核苷酸之特定序列的固有性質，以充當用於在生物過程中合成其他聚合物及大分子之模板。因此，若由該基因產生之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中的編碼股與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股均可稱為編碼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。

術語「表現控制元件」係指能夠調節與其可操作地連接之核苷酸序列之表現的聚核苷酸中之核酸序列。「以操作方式連接」係指一個部分活性（例如，調節轉錄之能力）在另一部分上產生作用（例如，序列之轉錄）之兩個部分之間的功能關係。當元件控制或調節核苷酸序列之轉錄或轉譯時，表現控制元件可操作地連接至核苷酸序列。表現控制元件之實例包括啟動子序列（例如，誘導性或組成型）、增強子、轉錄終止子、起始密碼子（例如，ATG）、內含子之剪接訊號、終止密碼子、內部核糖體入口位點、同源區元件（例如，來自加洲苜蓿夜蛾多衣殼核多角體病毒（ Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus， AcMNPV）之同源區2）、AAV調節元件（例如，Rep結合元件）等。

術語「啟動子」或「啟動子聚核苷酸」應理解為意謂能夠結合/募集核糖核酸聚合酶且在啟動子下游或在3'方向上之序列之初始化轉錄調節序列/元件或控制序列/元件。啟動子可為例如組成性活性（始終開啟）或誘導型的，其中啟動子在外部刺激存在下為活性或無活性的。啟動子能夠以高濃度表現蛋白質。舉例而言，啟動子之轉錄物含量比編碼調節蛋白之操縱子的天然啟動子之轉錄物含量高約或至少高約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、12.5倍、13倍、13.5倍、14倍、14.5倍、15倍、15.5倍、16倍、16.5倍、17倍、17.5倍、18倍、18.5倍、19倍、19.5倍、20倍、50倍、100倍、250倍、500倍、1000倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍、4000倍、4500倍、5000倍、5500倍、6000倍、6500倍、7000倍、7500倍、8000倍、8500倍、9000倍、9500倍或10000倍。在不同實例中，組成型啟動子聚核苷酸之轉錄物含量在上文所列之任何兩個含量之間的範圍內。亦可將啟動子安置於其他表現控制元件中以控制轉錄物表現。舉例而言，具有啟動子、同源區元件及/或AAV調節元件之表現卡匣可穩定地併入昆蟲細胞之基因體中，使得昆蟲細胞之桿狀病毒感染誘導表現卡匣之轉錄物表現（參見US2012/0100606） 。

腺相關病毒

治療上有效之rAAV粒子包括US 9,504,762、WO 2019/222136、US 2019/0376081及WO 2021/097157中所揭示之rAAV粒子，其揭示內容以引用的方式併入本文中。

「AAV」為腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒為具有由衣殼衣殼化之基因體的單股DNA細小病毒。當前存在十三種已表徵之AAV血清型。AAV之總體資訊及評述可見於例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, 第1卷, 第169-228頁；及Berns, 1990, Virology, 第1743-1764頁, Raven Press, (New York)。然而，完全預期此等相同原理將適用於其他AAV血清型，因為熟知各種血清型在結構上及功能上相當緊密相關，甚至在基因層面上亦如此。（參見例如Blacklowe, 1988, 《小病毒及人類疾病（Parvoviruses and Human Disease）》之第165-174頁, J. R. Pattison編；及Rose, 《綜合病毒學（Comprehensive Virology）》 3:1-61 (1974)）。舉例而言，所有AAV血清型明顯展現由同源rep基因介導之極類似複製特性；並且所有皆帶有三種相關衣殼蛋白質。相關性程度藉由以下進一步表明：沿基因體長度在血清型之間展現廣泛交叉雜交之異雙螺旋分析；及對應於反向末端重複序列（ITR）之末端處之類似自黏合區段的存在。類似感染性模式亦表明各血清型中之複製功能受到類似調節控制。

如本文所用，「AAV病毒粒子」係指由至少一種AAV衣殼蛋白及衣殼化AAV基因體構成之感染性病毒粒子。「重組AAV」或「rAAV」、「rAAV病毒粒子」或「rAAV病毒粒子」係指由至少一個如本文所描述之衣殼或cap蛋白質及衣殼化rAAV載體基因體構成之病毒粒子。因此，rAAV粒子之產生包括rAAV載體基因體之產生。不同實施例之rAAV病毒粒子包括US 9,504,762、WO 2019/222136、US 2019/0376081及WO 2021/097157中所揭示之AAV粒子及rAAV粒子，其揭示內容以引用的方式併入本文中。

「衣殼」係指封裝rAAV載體基因體之結構。衣殼包括VP1蛋白或VP3蛋白，但更通常，VP1、VP2及VP3蛋白全部三種，如天然AAV中所發現。衣殼蛋白質之序列確定rAAV病毒粒子之血清型。rAAV病毒粒子包括由多個包括以下之AAV血清型衍生的彼等：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、Bba21、Bba26、Bba27、Bba29、Bba30、Bba31、Bba32、Bba33、Bba34、Bba35、Bba36、Bba37、Bba38、Bba41、Bba42、Bba43、Bba44、Bce14、Bce15、Bce16、Bce17、Bce18、Bce20、Bce35、Bce36、Bce39、Bce40、Bce41、Bce42、Bce43、Bce44、Bce45、Bce46、Bey20、Bey22、Bey23、Bma42、Bma43、Bpo1、Bpo2、Bpo3、Bpo4、Bpo6、Bpo8、Bpo13、Bpo18、Bpo20、Bpo23、Bpo24、Bpo27、Bpo28、Bpo29、Bpo33、Bpo35、Bpo36、Bpo37、Brh26、Brh27、Brh28、Brh29、Brh30、Brh31、Brh32、Brh33、Bfm17、Bfm18、Bfm20、Bfm21、Bfm24、Bfm25、Bfm27、Bfm32、Bfm33、Bfm34、Bfm35、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43、AAVanc80L65或其任何變異體（針對非天然混合式血清型之其揭示內容參見例如，美國專利第8,318,480號）。例示性衣殼亦提供於國際申請公開案第WO 2018/022608號及第WO 2019/222136號中，該等申請公開案全文併入本文中。衣殼蛋白質亦可為天然VP1、VP2及VP3之變異體，包括突變、嵌合或改組蛋白。衣殼蛋白質可為rh.10或AAV多種進化枝內之其他亞型的衣殼蛋白；多種進化枝及亞型揭示於例如美國專利第7,906,111號中。在各個實施例中，AAV病毒粒子之衣殼具有胺基酸序列與來自AAV-1（Genbank寄存編號AAD27757.1）、AAV-2（NCBI參考序列號YP_680426.1）、AAV-3（NCBI參考序列號NP_043941.1）、AAV-3B（Genbank寄存編號AAB95452.1）、AAV-4（NCBI參考序列號NP_044927.1）、AAV-5（NCBI參考序列號YP_068409.1）、AAV-6（Genbank寄存編號AAB95450.1）、AAV-7（NCBI參考序列號YP_077178.1）、AAV-8（NCBI參考序列號YP_077179.1）、AAV-9（Genbank寄存編號AAS99264.1）、AAV-10（Genbank寄存編號AAT46337.1）、AAV-11（Genbank寄存編號AAT46339.1）、AAV-12（Genbank寄存編號ABI16639.1）、AAV-13（Genbank寄存編號ABZ10812.1）之胺基酸序列之一部分或WO 2018/022608及WO 2019/222136中揭示之任何胺基酸序列至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VP1、VP2或VP3蛋白。不同血清型之AAV蛋白質的構築及用途論述於Chao等人, Mol. Ther. 2:619-623, 2000; Davidson等人, PNAS 97:3428-3432, 2000; Xiao等人, J. Virol. 72:2224-2232, 1998; Halbert等人, J. Virol. 74:1524-1532, 2000; Halbert等人, J. Virol. 75:6615-6624, 2001；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001中。

如本文所用，「AAV載體基因體」、「載體基因體」或「rAAV載體基因體」係指單股核酸。rAAV病毒粒子具有在衣殼內衣殼化之rAAV載體基因體。rAAV載體基因體具有AAV 5'反向末端重複（ITR）序列及AAV 3' ITR側接蛋白編碼序列（較佳為功能性編碼治療性蛋白質之序列；例如FVIII、FIX及PAH），該序列可操作地連接至與AAV病毒基因體異源之轉錄調控元件，亦即一個或多個啟動子及/或增強子及視情況，聚腺苷酸化序列及/或一個或多個插入於調節元件中或在調節元件與蛋白編碼序列之間或在蛋白編碼序列之外顯子之間的內含子。rAAV載體基因體係指rAAV病毒顆粒中存在之核酸，且可為本文所揭示之核酸序列的有義股或反義股。此類單股核酸之尺寸以鹼基提供。如本文所用之術語「反向末端重複序列」及「ITR」係指順式充當病毒DNA複製起點及病毒基因體之封裝訊號的在rAAV基因體之5'及3'端處發現之技術公認的區域。AAV ITR連同Rep蛋白質一起提供自插入兩個側接ITR之間的核苷酸序列自宿主細胞基因體之有效切除及救援以及核苷酸序列整合至宿主細胞基因體中。某些AAV-相關之ITR的序列藉由Yan等人, J. Virol. 79（1）:364-379 （2005）揭示。ITR亦存在於「flip」或「flop」組態，其中在AA'反向重複序列（其形成髮夾之臂）之間的序列存在於反向補體中（Wilmott, Patrick,等人 Human gene therapy methods30.6 (2019): 206-213）。不同血清型之AAV載體基因體的構築及用途論述於Chao等人, Mol. Ther. 2:619-623, 2000; Davidson等人, PNAS 97:3428-3432, 2000; Xiao等人, J. Virol. 72:2224-2232, 1998; Halbert等人, J. Virol. 74:1524-1532, 2000; Halbert等人, J. Virol. 75:6615-6624, 2001；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001中。由於廣泛的構築體可利用性及廣泛表徵，以下揭示之例示性AAV載體基因體來源於血清型2。

治療上有效之rAAV粒子或治療性rAAV能夠感染細胞，使得經感染細胞表現（例如，藉由轉錄及/或藉由轉譯）相關元件（例如核苷酸序列、蛋白質等）。在此程度上，治療上有效之rAAV粒子可包括含有具有不同特性之衣殼或載體基因體（vgs）之AAV粒子。例如，治療上有效之AAV粒子可含有具有不同轉譯後修飾之衣殼。在其他實例中，治療有效之AAV粒子可含有具有不同尺寸/長度、正或負股序列、不同翻轉/觸發ITR組態翻轉/觸發、觸發/翻轉、翻轉/翻轉、觸發/觸發等）、不同數目ITR（1、2、3等）或截短的vg。舉例而言，在經AAV感染細胞中發生重疊截短加上及減去基因體之黏接/互補，使得產生編碼較大蛋白質之「完整」核酸，由此重建構功能性全長基因。治療上有效之AAV粒子亦稱為「重」或「完全」衣殼。

作為一實例，「治療性rAAV」係指包含編碼治療性蛋白質之異源聚核苷酸的rAAV病毒粒子、rAAV病毒粒子、rAAV載體粒子或rAAV，可用於在活體內替代或補充蛋白質。「治療性蛋白質」為一種具有替代或補償對應內源性蛋白質之活性損失或降低之生物活性的多肽。舉例而言，功能性苯丙胺酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）為苯酮尿症（phenylketonuria, PKU）之治療性蛋白質。因此，舉例而言，重組型AAV PAH病毒可用於治療罹患PKU之個體的藥劑。藥劑可藉由靜脈內（intravenous, IV）投與來投與且藥劑之投與引起PAH蛋白質在個體中表現，足以改變個體中之神經傳遞素代謝物或神經傳遞素含量。視情況，藥劑亦可包含用於預防及/或治療與投與編碼PAH之rAAV相關之任何肝毒性的防治性及/或治療性皮質類固醇。包含預防性或治療性皮質類固醇治療劑之藥物可包含每天至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多的皮質類固醇。包含防治性或治療性皮質類固醇之藥劑可經至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或更久之連續時段投與。PKU療法可視情況亦包括酪胺酸補充劑。

併入至AAV衣殼中之轉殖基因不受限制且可為所關注之治療劑之任何異源基因。轉殖基因為核酸序列，其與側接轉殖基因之AAV ITR序列異源，該核酸序列編碼所關注之多肽、蛋白質或其他產物。核酸編碼序列與調節組分以允許轉殖基因在宿主細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式可操作地連接。

轉殖基因序列之組成將視將置放之所得病毒的用途而定。舉例而言，一種類型之轉殖基因序列包括報導序列，其在表現時產生可偵測訊號。這類報導序列包括（但不限於）編碼以下之DNA序列：b-內醯胺酶、b-半乳糖苷酶（LacZ）、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白（GFP）、氯黴素乙醯轉移酶（CAT）、螢光素酶、膜結合蛋白（包括例如CD2、CD4、CD8、流感血球凝集素蛋白及所屬領域中熟知之其他存在或可藉由習知方法產生針對其之高親和力抗體的蛋白質）及融合蛋白，包含與尤其來自血球凝集素或Myc之抗原標籤域適當融合的膜結合蛋白。

此等編碼序列在與驅動其表現之調節元件相關時，提供可藉由習知方法偵測之訊號，習知方法包含酶性、放射照相、比色、螢光或其他光譜分析、螢光活化細胞分選分析及免疫分析，包含酶聯免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、放射免疫分析（radioimmunoassay, RIA）及免疫組織化學。舉例而言，在標記序列為LacZ基因之情況下，藉由針對β-半乳糖苷酶活性之分析來偵測由編碼訊號之rAAV感染之細胞的存在。在轉殖基因係綠色螢光蛋白或螢光素酶之情況下，編碼訊號之rAAV可藉由量測螢光或發光之儀器偵測。

然而，轉殖基因通常為編碼可用於生物學及醫學中之產物，諸如蛋白質、肽、RNA、酶、顯性負性突變體或催化性RNA的非標記序列。所期望的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖體RNA、催化性RNA、siRNA、小髮夾（small hairpin）RNA、反式剪接RNA及反義RNA。適用之RNA序列之一個實例為抑制或消除靶向核酸序列在經處理個體中之表現的序列。通常，適合之目標序列包括致癌性目標及病毒性疾病。對於此類目標之實例，參見下文在與免疫原相關之部分中鑑定的致癌性目標及病毒。

轉殖基因可用於校正或改善基因缺陷，基因缺陷可包括正常基因之表現量低於正常表現量的缺陷或功能基因產物未表現的缺陷。較佳類型之轉殖基因序列編碼在經感染細胞中表現之治療性蛋白質或多肽。載體基因體可進一步包括多個轉殖基因，例如以校正或改善由多次單元蛋白質引起之基因缺陷。在某些情況下，可使用不同的轉殖基因編碼蛋白質之各次單元，或編碼不同的肽或蛋白質。當編碼蛋白質次單元之DNA的大小很大時，例如對於免疫球蛋白、血小板衍生生長因子或肌肉萎縮蛋白，這是所期望的。為了使細胞產生多次單元蛋白質，用含有不同次單元中之每一者的重組病毒感染細胞。替代地，可由相同的轉殖基因編碼蛋白質之不同次單元。在此情況下，單個轉殖基因包括編碼次單元中之每一者的DNA，各次單元之DNA由內部核糖核酸酶進入位點（internal ribozyme entry site, IRES）隔開。當編碼該等次單元中之每一者的DNA的大小很小時，例如，編碼次單元之DNA及IRES的總的大小小於五千鹼基，這是所期望的。作為IRES之替代方案，編碼序列可由編碼2A肽之序列隔開，該肽在轉譯後事件中自切割。參見例如Donnelly等人, J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (January 1997); Furler等人, Gene Ther., 8(1 1):864-873 (June 2001); Klump等人, Gene Ther., 8(lO):8 11-817 (May 2001)。此2A肽顯著地小於IRES，這使其非常適合在空間為限制因素時使用。更常見的是，當轉殖基因很大，由多個次單元組成，或兩個轉殖基因共同遞送時，攜帶所期望的轉殖基因或次單元之rAAV共同投與以允許其在活體內多連體化（concatamerize），形成單個載體基因體。在此類實施例中，第一AAV可攜帶表現單個轉殖基因之表現卡匣且第二AAV可攜帶表現不同轉殖基因以在宿主細胞中共表現之表現卡匣。然而，所選擇之轉殖基因可編碼任何生物活性產物或其他產物，例如研究所需的產物。

適合之轉殖基因可藉由熟習此項技術者容易地選擇。轉殖基因之選擇不被認為是對本發明之限制。轉殖基因可為異源蛋白質，且此異源蛋白質可為治療性蛋白質。例示性治療性蛋白質包括但不限於血液因子，諸如β-血球蛋白、血紅素、組織纖維蛋白溶酶原活化因子及凝血因子；集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF）；介白素，諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等；生長因子，諸如角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor, KGF）、幹細胞因子（stem cell factor, SCF）、纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF，諸如鹼性FGF及酸性FGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor, IGF）、骨形態生成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）、表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、生長分化因子-9（growth differentiation factor-9, GDF-9）、肝癌衍生生長因子（hepatoma derived growth factor, HDGF）、肌肉抑制素（myostatin, GDF-8）、神經生長因子（nerve growth factor, NGF）、神經營養素、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）、血小板生成素（thrombopoietin, TPO）、轉化生長因子α（transforming growth factor-a, TGF-a）、轉化生長因子β（transforming growth factor-b, TGF-b）及類似者；可溶性受體，諸如可溶性TNF-a受體、可溶性VEGF受體、可溶性介白素受體（例如，可溶性IL-l受體及可溶性II型IL-l受體）、可溶性g/d T細胞受體、可溶性受體之配體結合片段及其類似物；酶類，諸如a-葡糖苷酶、伊米苷酶、b-葡糖腦苷脂酶及阿糖腦苷酶；酶活化劑，諸如組織纖維蛋白溶酶原活化因子；趨化細胞素，諸如1P-10、藉由干擾素-γ誘導之單核球激素（Mig）、Groα/IL-8、RANTES、MIP-la、MIP-1b、MCP-1、PF-4及其類似物；血管生成劑，諸如血管內皮生長因子（VEGF，例如，VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2）、神經膠質瘤衍生生長因子、血管生成素、血管生成素-2；及類似者；抗血管生成劑，諸如可溶性VEGF受體；蛋白質疫苗；神經活性肽，諸如神經生長因子（NGF）、緩激肽、膽囊收縮素、胃泌素、腸泌素、催產素、促性腺激素釋放激素、β-內啡肽、腦啡肽、P物質、生長抑素、催乳素、甘丙胺素、生長激素釋放激素、鈴蟾素、強啡肽、華法林、神經調壓素、腸動素、促甲狀腺素、神經肽Y、促黃體生成激素、降鈣素、胰島素、升糖素、血管加壓素、血管緊張素II、促甲狀腺素釋放激素、血管活性腸肽、睡眠肽及類似者；溶栓劑；心房利尿鈉肽；鬆弛素；膠質原纖維酸性蛋白；激濾泡素（follicle stimulating hormone, FSH）；人類α-1抗胰蛋白酶；白血病抑制因子（leukemia inhibitory fctor, LIF）；組織因子，促黃體生成激素；巨噬細胞活化因子；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）；嗜中性白血球趨化因子（neutrophil chemotactic factor, NCF）；金屬蛋白酶之組織抑制劑；血管活性腸肽；血管生成素；促血管素；纖維蛋白；水蛭素；IF-l受體拮抗劑；及類似者。感興趣的蛋白質之一些其他非限制性實例包含睫狀神經滋養因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）；大腦衍生神經滋養因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）；神經滋養素3及4/5（NT-3及4/5）；神經膠細胞衍生神經滋養因子（glial cell derived neurotrophic factor, GDNF）；芳族胺基酸去羧酶（aromatic amino acid decarboxylase, AADC）；血友病相關的凝血蛋白，諸如因子VIII、因子IX、因子X；肌肉萎縮蛋白、迷你肌肉萎縮蛋白或微小肌肉萎縮蛋白；溶酶體酸性脂肪酶；苯丙胺酸羥化酶（PAH）；肝糖貯積病相關酶，諸如葡萄糖-6-磷酸酶、酸性麥芽糖酶、糖原去分支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶（例如，PHKA2）、葡萄糖運輸蛋白（例如，GFUT2）、醛縮酶A、b-烯醇酶及糖原合成酶；溶酶體酶（例如，β-N-乙醯基己糖胺酶A）；及其任何變體。AAV載體基因體亦包括習知控制元件或序列，其以允許其在經載體轉染或經病毒感染之細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與轉殖基因可操作地連接。如本文所使用，「可操作地連接」之序列包括與所關注基因相鄰之表現控制序列及以反式起作用或在一定距離起作用以控制所關注基因之表現控制序列兩者。適合之基因包括以下中所論述之彼等基因：Anguela等人「 Entering the Modern Era of Gene Therapy」 ,Annual Rev. of Med. Vol. 70, 第272-288頁(2019)及Dunbar等人, 「 Gene comes of age」, Science, Vol. 359, Issue 6372, eaan4672 (2018)。

表現控制序列可連接至轉殖基因。表現控制序列之實例可包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工訊號，諸如剪接及聚腺苷酸化（polyA）訊號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯效率之序列（亦即，克紮克共有序列（Kozak consensus sequence））；增強蛋白質穩定性之序列；及增強經編碼產物之分泌的序列。所屬領域中已知且可採用大量表現控制序列，包括原生、組成性、誘導性及/或組織特異性之啟動子。組成性啟動子之實例包括但不限於反轉錄病毒勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus；RSV）LTR啟動子（視情況具有RSV強化子）、細胞巨大病毒（cytomegalovirus, CMV）啟動子（視情況具有CMV強化子）（參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530（1985））、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、b-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶（phosphoglycerol kinase, PGK）啟動子及EF1啟動子。誘導性啟動子允許基因表現之調節且可藉由以下調節：外源提供之化合物；環境因素，諸如溫度；或特定生理狀態（例如急性期，細胞之特定分化狀態）之存在，或僅存在於複製細胞中。誘導型啟動子及誘導型系統可自許多商業來源獲得，包括（但不限於）Invitrogen、Clontech及Ariad。已描述許多其他系統且其可由熟習此項技術者容易地選擇。藉由外源提供之化合物調控之誘導性啟動子的實例包括鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白（metallothionine, MT）啟動子、地塞米松（dexamethasone，Dex）誘導性小鼠乳腺腫瘤病毒（mouse mammary tumor virus, MMTV）啟動子、T7聚合酶啟動子系統[WO 98/10088]；蛻皮激素昆蟲啟動子[No等人, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 93:3346-3351（1996）]、四環素可抑制型系統[Gossen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551（1992）]、四環素誘導性系統[Gossen等人, Science, 268:1766-1769（1995）, 亦參見Harvey等人, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518（1998）]、RU486誘導性系統[Wang等人, Nat. Biotech., 15:239-243（1997）及Wang等人, Gene Ther., 4:432-441（1997）]及雷帕黴素（rapamycin）誘導性系統[Magari等人, J. Clin. Invest.,100:2865-2872（1997）]。可適用於此背景下之其他類型的誘導性啟動子為藉由特定生理狀態（例如溫度、急性期、細胞之特定分化狀態或僅在複製細胞中）調節之彼等啟動子。

視情況，可使用轉殖基因之天然啟動子。當需要轉殖基因之表現應模擬原生表現時，原生啟動子可為較佳的。當轉殖基因之表現必須在時間上或發育上，或以組織特異性方式，或回應於特定轉錄刺激調節時，可使用天然啟動子。在另一實施例中，其他天然表現控制元件，諸如強化子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列，亦可用於模擬天然表現。

轉殖基因亦可包括可操作地連接於組織特異性啟動子之基因。例如，若骨骼肌中之表現為所期望的，則應使用在肌肉中有活性的啟動子。此等啟動子包括來自編碼骨骼β-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌縮蛋白、肌肉肌酸激酶之基因的啟動子，以及活性高於天然存在之啟動子的合成肌肉啟動子（參見Li等人, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)）。針對以下之組織特異性之啟動子的實例為吾人所知：肝臟（白蛋白，Miyatake等人, J. Virol.,71:5124-32 (1997)；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig等人, Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；α-胎蛋白（AFP)，Arbuthnot等人, Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)）；骨骼骨鈣化素（Stein等人, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨骼唾液蛋白（Chen等人, J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）；淋巴細胞（CD2，Hansal等人, J. Immunol., 161:1063-8 (1998)；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體鏈)；神經元，諸如神經元特異性烯醇酶（neuron-specific enolase, NSE)啟動子（Andersen等人, Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、神經絲輕鏈基因（Piccioli等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）及神經元特異性vgf基因（Piccioli等人, Neuron, 15:373-84 (1995)）以及其他。

重組AAV可用於在活體外，例如在細胞培養物中產生所關注之蛋白質。例如，可在用於產生所關注之蛋白質之方法中使用AAV，其中該方法包括提供重組AAV，該重組AAV包含編碼異源蛋白質之核苷酸序列；及在細胞培養物中使重組AAV與細胞接觸，其中重組AAV在細胞中表現所關注之蛋白。編碼所關注蛋白質之核苷酸序列的大小可變化。舉例而言，核苷酸序列可為至少約0.1千鹼基（kb）、至少約0.2 kb、至少約0.3 kb、至少約0.4 kb、至少約0.5 kb、至少約0.6 kb、至少約0.7 kb、至少約0.8 kb、至少約0.9 kb、至少約1 kb、至少約1.1 kb、至少約1.2 kb、至少約1.3 kb、至少約1.4 kb、至少約1.5 kb、至少約1.6 kb、至少約1.7 kb、至少約1.8 kb、至少約2.0 kb、至少約2.2 kb、至少約2.4 kb、至少約2.6 kb、至少約2.8 kb、至少約3.0 kb、至少約3.2 kb、至少約3.4 kb、至少約3.5 kb長、至少約4.0 kb長、至少約5.0 kb長、至少約6.0 kb長、至少約7.0 kb長、至少約8.0 kb長、至少約9.0 kb長或至少約10.0 kb長。在一些實施例中，核苷酸長度為至少約1.4 kb。

重組AAV亦可用於在活體內，例如在諸如哺乳動物之動物中產生所關注之蛋白質。一些實施例提供一種用於在活體內產生所關注之蛋白質的方法，其中該方法包括：提供重組AAV，該重組AAV包含編碼所關注之蛋白質之核苷酸序列；及向個體投與重組AAV，其中重組AAV在個體中表現所關注之蛋白質。在一些實施例中，個體可為非人類哺乳動物，例如猴、狗、貓、小鼠或牛。編碼所關注蛋白質之核苷酸序列的大小可變化。舉例而言，核苷酸序列可為至少約0.1 kb、至少約0.2 kb、至少約0.3 kb、至少約0.4 kb、至少約0.5 kb、至少約0.6 kb、至少約0.7 kb、至少約0.8 kb、至少約0.9 kb、至少約1 kb、至少約1.1 kb、至少約1.2 kb、至少約1.3 kb、至少約1.4 kb、至少約1.5 kb、至少約1.6 kb、至少約1.7 kb、至少約1.8 kb、至少約2.0 kb、至少約2.2 kb、至少約2.4 kb、至少約2.6 kb、至少約2.8 kb、至少約3.0 kb、至少約3.2 kb、至少約3.4 kb、至少約3.5 kb長、至少約4.0 kb長、至少約5.0 kb長、至少約6.0 kb長、至少約7.0 kb長、至少約8.0 kb長、至少約9.0 kb長或至少約10.0 kb長。在一些實施例中，核苷酸長度為至少約1.4 kb。

尤其關注重組AAV表現一種或多種治療性蛋白質以治療多種疾病或病症之用途。疾病之非限制性實例包含癌症，諸如癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤；及自體免疫疾病，諸如多發性硬化症。癌瘤的非限制性實例包括食道癌；肝細胞癌；基底細胞癌；鱗狀細胞癌（各種組織）；膀胱癌，包括移行細胞癌；支氣管源性癌；結腸癌；結腸直腸癌；胃癌；肺癌，包括小細胞肺癌及非小細胞肺癌；腎上腺皮質癌；甲狀腺癌；胰臟癌；乳癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌；汗腺癌；皮脂腺癌；乳頭狀癌；乳頭狀腺癌；囊腺癌；髓樣癌；腎細胞癌；導管原位癌或膽管癌；絨毛膜癌；精原細胞瘤；胚胎癌；威爾姆氏腫瘤（Wilm's tumor）；宮頸癌；子宮癌；睾丸癌；成骨細胞癌；上皮癌；及鼻咽癌。肉瘤之非限制性實例包含纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏肉瘤（Ewing's sarcoma）、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤及其他軟組織肉瘤。實體瘤的非限制性實例包括神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡突神經膠質瘤、血管瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。白血病之非限制性實例包含慢性骨髓增生性症候群；急性骨髓性白血病；慢性淋巴球性白血病，包含B細胞CLL、T細胞CLL、前淋巴球性白血病及毛細胞白血病；及急性淋巴母細胞性白血病。淋巴瘤之實例包含但不限於B細胞淋巴瘤，諸如伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma）；霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma）；及類似淋巴瘤。

可使用本文中所揭示之rAAV及方法治療之疾病的其他非限制性實例包括遺傳病症，包括鐮狀細胞貧血、囊腫性纖維化、溶酶體酸性脂肪酶（lysosomal acid lipase, LAL）缺乏症1、泰-薩克斯病（Tay-Sachs disease）、苯丙酮尿症、黏多醣貯積症、肝糖貯積症（glycogen storage disease, GSD，例如GSD類型I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII及XIV）、半乳糖血症、肌肉萎縮症（例如，杜興氏肌肉萎縮症（Duchenne muscular dystrophy））及血友病，諸如A型血友病（經典血友病）及B型血友病（克里斯多氏症（Christmas Disease））、威爾森氏病（Wilson's disease）、法布瑞氏症（Fabry Disease）、高雪氏症（Gaucher Disease）、遺傳性血管性水腫（hereditary angioedema, HAE）及α1抗胰蛋白酶缺乏症。另外，本文所揭示之rAAV及方法可用於治療其他病症，其可藉由轉殖基因在肝臟中之局部表現或藉由自肝臟或肝細胞之分泌性蛋白質之表現來治療。

在個體（例如，個體之血清）中表現之異源蛋白質之量可變化。例如，在一些實施例中，蛋白質在個體血清中之表現量可為至少約9毫克（mg）/mL、至少約10 mg/mL、至少約11 mg/mL、至少約12 mg/mL、至少約13 mg/mL、至少約14 mg/mL、至少約15 mg/mL、至少約16 mg/mL、至少約17 mg/mL、至少約18 mg/mL、至少約19 mg/mL、至少約20 mg/mL、至少約21 mg/mL、至少約22 mg/mL、至少約23 mg/mL、至少約24 mg/mL、至少約25 mg/mL、至少約26 mg/mL、至少約27 mg/mL、至少約28 mg/mL、至少約29 mg/mL、至少約30 mg/mL、至少約31 mg/mL、至少約32 mg/mL、至少約33 mg/mL、至少約34 mg/mL、至少約35 mg/mL、至少約36 mg/mL、至少約37 mg/mL、至少約38 mg/mL、至少約39 mg/mL、至少約40 mg/mL、至少約41 mg/mL、至少約42 mg/mL、至少約43 mg/mL、至少約44 mg/mL、至少約45 mg/mL、至少約46 mg/mL、至少約47 mg/mL、至少約48 mg/mL、至少約49 mg/mL或至少約50 mg/mL。所關注之蛋白質在個體血清中之表現量可為約9 pg/mL、約10 pg/mL、約50 pg/mL、約100 pg/mL、約200 pg/mL、約300 pg/mL、約400 pg/mL、約500 pg/mL、約600 pg/mL、約700 pg/mL、約800 pg/mL、約900 pg/mL、約1000 pg/mL、約1500 pg/mL、約2000 pg/mL、約2500 pg/mL或此等值中之任兩者之間的範圍。熟練技術人員將理解，治療功效所需之所關注之蛋白質的表現量可視非限制性因素而變化，諸如特定的所關注之蛋白質及接受治療之個體，且蛋白質之有效量可容易由熟練技術人員使用所屬領域中已知之習知方法確定而無需過多的實驗。

產生腺 相關病毒之方法

本揭示案提供用於在諸如昆蟲細胞之細胞中產生rAAV病毒粒子之材料及方法。

產生AAV病毒粒子之方法描述於例如以下中：美國專利第US6204059號、第US5756283號、第US6258595號、第US6261551號、第US6270996號、第US6281010號、第US6365394號、第US6475769號、第US6482634號、第US6485966號、第US6943019號、第US6953690號、第US7022519號、第US7238526號、第US7291498號及第US7491508號、第US5064764號、第US6194191號、第US6566118號、第US8137948號；或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號、第WO2015191508號、第WO2019217513號、第WO2018022608號、第WO2019222136號、第WO2020232044號、第WO2019222132號；Methods In Molecular Biology, Richard編, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人, J. Vir.63:3822-8 (1989)；Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人, J. Vir. 66:6922-30 (1992)；Kimbauer等人, Vir., 219:37-44 (1996)；Zhao等人, Vir.272:382-93 (2000)；該等文獻中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中。

細胞，諸如昆蟲細胞、酵母細胞及哺乳動物細胞（例如，人類細胞或非人類哺乳動物細胞）能夠產生rAAV。舉例而言，當所提供之AAV輔助功能、AAV非輔助功能及細胞用以產生AAV載體基因體之核苷酸序列時，細胞能夠產生rAAV。在各種實施例中，AAV輔助功能、AAV非輔助功能及細胞用以產生rAAV之核苷酸序列係由載體提供，該載體例如經由轉染使用轉染試劑，經由用其他重組病毒轉導/感染，藉由將核苷酸序列併入至細胞基因體中或藉由其他方法遞送至細胞。

應理解術語「載體」係指當與適當控制元件相關聯時能夠複製且可在細胞之間輸送基因序列的任何基因元件，諸如質體、噬菌體、轉座子、黏質體、桿狀病毒質體、微型質體（例如，缺乏細菌元件之質體）、狗骨頭DNA（Doggybone DNA）（例如，最小的閉合線性構築體）、染色體、病毒、病毒體（例如，桿狀病毒）等。如本文所用之「昆蟲細胞相容載體」或「載體」係指能夠有效轉型或轉染昆蟲或昆蟲細胞的核酸分子。例示性生物載體包括質體、線性核酸分子及重組病毒。可使用任何載體，只要其為昆蟲細胞相容的。載體可整合至昆蟲細胞基因體中，但載體無需永久存在於昆蟲細胞中，並且亦包括短暫游離型載體。載體可藉由任何已知方法引入，例如藉由化學處理細胞、電穿孔或感染。桿狀病毒載體及其使用方法描述於上文所引用之關於昆蟲細胞之分子工程化的參考文獻中。

細胞自其中產生rAAV載體基因體之載體可含有啟動子及在啟動子下游之限制位點，以允許編碼一種或多種所關注之蛋白質之聚核苷酸的插入，其中該啟動子及該限制位點位於5' AAV ITR下游及3' AAV ITR上游。載體亦可含有轉錄後調節元件，該轉錄後調節元件在限制位點之下游及3' AAV ITR之上游。病毒構築體可進一步包含插入在限制位點且與啟動子可操作地連接之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含所關注之蛋白質之編碼區。

術語「AAV輔助（AAV helper）」係指AAV衍生之編碼序列，其可經表現以提供AAV基因產物，該等AAV基因產物又在反式起作用以進行富有成效之AAV複製。因此，AAV輔助功能包括主要AAV開放閱讀框架（open reading frame, ORF）rep及cap兩者。rep表現產物已證明具有許多功能，尤其包含：DNA複製之AAV起點的識別、結合及作缺口（nicking）；DNA解旋酶活性；及AAV（或其他異源）啟動子之轉錄調節。衣殼（cap）表現產物提供必需的封裝功能。AAV輔助功能用於補充AAV載體基因體中缺失的反式AAV功能。

在各個實施例中，提供AAV輔助功能之載體包括編碼衣殼蛋白質或Rep蛋白質之核苷酸序列。來自任何AAV血清型（包括（但不限於）AAV1（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_002077.1）、AAV2（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_001401.2）、AAV3（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_001729.1）、AAV3B（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AF028705.1）、AAV4（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_001829.1）、AAV5（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_006152.1）、AAV6（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AF028704.1）、AAV7（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_006260.1）、AAV8（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號NC_006261.1）、AAV9（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AX753250.1）、AAV10（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AY631965.1）、AAV11（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號AY631966.1）、AAV12（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號DQ813647.1）、AAV13（NCBI參考序列號/Genbank寄存編號EU285562.1）、Bba21、Bba26、Bba27、Bba29、Bba30、Bba31、Bba32、Bba33、Bba34、Bba35、Bba36、Bba37、Bba38、Bba41、Bba42、Bba43、Bba44、Bce14、Bce15、Bce16、Bce17、Bce18、Bce20、Bce35、Bce36、Bce39、Bce40、Bce41、Bce42、Bce43、Bce44、Bce45、Bce46、Bey20、Bey22、Bey23、Bma42、Bma43、Bpo1、Bpo2、Bpo3、Bpo4、Bpo6、Bpo8、Bpo13、Bpo18、Bpo20、Bpo23、Bpo24、Bpo27、Bpo28、Bpo29、Bpo33、Bpo35、Bpo36、Bpo37、Brh26、Brh27、Brh28、Brh29、Brh30、Brh31、Brh32、Brh33、Bfm17、Bfm18、Bfm20、Bfm21、Bfm24、Bfm25、Bfm27、Bfm32、Bfm33、Bfm34、Bfm35、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43、AAVanc80L65或其任何變異體）之cap基因及/或rep基因可在本文中用於產生AAV。例示性衣殼亦提供於國際申請公開案第WO 2018/022608號及第WO 2019/222136號中，該等申請公開案全文併入本文中。以上提供之各NCBI參考序列號或Genbank寄存編號亦以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，AAV cap基因編碼來自血清型1、血清型2、血清型3、血清型3B、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其變異體之衣殼。

為了產生，具有AAV輔助功能之細胞產生足以形成衣殼之重組衣殼蛋白。此至少包括VP1蛋白及VP3蛋白，但更通常，VP1、VP2及VP3蛋白全部三種，如天然AAV中所發現。衣殼蛋白質之序列確定由宿主細胞產生之AAV病毒粒子之血清型。可用於本發明中之衣殼包括來源於多種AAV血清型之衣殼，包括1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或混合血清型（關於非天然混合血清型之揭示內容，參見例如美國專利第8318480號）。衣殼蛋白質亦可為天然VP1、VP2及VP3之變異體，包括突變、嵌合或改組蛋白。衣殼蛋白質可為rh.10或AAV多種進化枝內之其他亞型的衣殼蛋白；多種進化枝及亞型揭示於例如美國專利第7,906,111號中。由於廣泛的構築體可利用性及廣泛表徵，以下揭示之例示性AAV載體來源於血清型2。不同血清型之AAV載體及AAV蛋白質的構築及用途論述於Chao等人, Mol. Ther. 2:619-623, 2000; Davidson等人, PNAS 97:3428-3432, 2000; Xiao等人, J. Virol. 72:2224-2232, 1998; Halbert等人, J. Virol. 74:1524-1532, 2000; Halbert等人, J. Virol. 75:6615-6624, 2001；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, 2001中。

在各個實施例中，編碼VP蛋白質之核苷酸序列可操作地連接於適合之表現控制序列。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒啟動子，諸如Polh啟動子、∆IE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。

在不同實例中，39K啟動子包括與SEQ ID NO: 1具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99+%或100%一致性之核苷酸序列。

TTCGGACTGCTTGACTCGCAGCGAAATACAAGCGCTGTTCAGGGAAGCCATCAACACGCTCAAGCACACGATGAACACAGAAAACGTCTGCGCGCACATGTTGGACATCGTGTCGTTTGAGCGTATAAAAGAATATATAAGAGCTAATTTAGGCCATTTCACAGTAATCACCGACAAATGTTCGAAGCGTAAGGTGTGTCTTCATCACAAACGAATTGCCAGGTTGTTGGGCATTAAAAAAATATATCATCAAGAATACAAACGGGTTGTTTCAAAGGTTTACAAGAAGCAAAC

在不同實例中，p6.9啟動子包括與SEQ ID NO: 2具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99+%或100%一致性之核苷酸序列。

AAATTCCGTTTTGCGACGATGCAGAGTTTTTGAACAGGCTGCTCAAACACATAGATCCGTACCCGCTCAGTCGGATGTATTACAATGCAGCCAATACCATGTTTTACACGACTATGGAAAACTATGCCGTGTCCAATTGCAAGTTCAACATTGAGGATTACAATAACATATTTAAGGTGATGGAAAATATTAGGAAACACAGCAACAAAAATTCAAACGACCAAGACGAGTTAAACATATATTTGGGAGTTCAGTCGTCGAATGCAAAGCGTAAAAAATATTAATAAGGTAAAAATTACAGCTACATAAATTACACAATTTAAAC

在不同實例中，Polh啟動子包括與SEQ ID NO: 3具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99+%或100%一致性之核苷酸序列。

ATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCG

為了產生，具有AAV輔助功能之細胞產生Rep蛋白質以促進rAAV產生。已發現，當在細胞中表現至少一種大Rep蛋白質（Rep78或Rep68）及至少一種小Rep蛋白質（Rep52及Rep40）時可產生感染性粒子。在一特定實施例中，表現Rep 78、Rep68、Rep52及Rep 40全部四種。或者，表現Rep78及Rep52、Rep78及Rep40、Rep 68及Rep52、或Rep68及Rep40。以下實例展示Rep78/Rep52組合之使用。Rep蛋白質可來源於AAV-2或其他血清型。在各個實施例中，編碼Rep蛋白質之核苷酸序列可操作地連接於合適表現控制序列。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒啟動子，諸如聚角體蛋白（Polh）啟動子、∆IE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。

具有AAV輔助功能之細胞亦可產生組裝活化蛋白（assembly-activating protein, AAP），該等蛋白質幫助組裝衣殼。在各個實施例中，編碼AAP之核苷酸序列可操作地連接至適合之表現控制序列。舉例而言，核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒啟動子，諸如聚角體蛋白（Polh）啟動子、∆IE1啟動子、p5啟動子、p10啟動子、p40啟動子、金屬硫蛋白啟動子、39K啟動子、p6.9啟動子及orf46啟動子。

術語「非AAV輔助功能」係指AAV複製所依賴之非AAV衍生之病毒及/或細胞功能。因此，術語包括在AAV複製中所需要之蛋白質及RNA，包括彼等涉及AAV基因轉錄之活化、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、Cap表現產物之合成及AAV衣殼組裝的部分。基於病毒之輔助功能可衍生自已知輔助病毒（諸如腺病毒、疱疹病毒（除1型單純疱疹病毒以外）及痘瘡病毒）中之任一者。

術語「非AAV輔助功能載體」通常係指包括提供附加功能之核苷酸序列的核酸分子。附加功能載體可經轉染至合適宿主細胞中，其中該載體隨後能夠支持AAV病毒粒子在宿主細胞中產生。該術語中明確排除感染性病毒粒子，因為其存在於自然界中，諸如腺病毒、疱疹病毒或痘瘡病毒粒子。因此，附加功能載體可呈質體、噬菌體、轉座子或黏質體之形式。詳言之，已證實附加輔助功能不需要腺病毒基因之完整互補序列。舉例而言，不能夠進行DNA複製及後期基因合成之腺病毒突變體已經展示為容許AAV複製。Ito等人, (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi等人, (1971) Virology 45:317。類似地，E2B及E3區域內之突變體已顯示支持AAV複製，此表明E2B及E3區域可能不參與提供附加功能。Carter等人, (1983) Virology 126:505。然而，在E1區域中為缺陷性的或具有缺失之E4區域之腺病毒無法支持AAV複製。因此，AAV複製可能直接或間接需要E1A及E4區。Laughlin等人, (1982). J. Virol. 41:868; Janik等人, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter等人, (1983) Virology 126:505。其他表徵之Ad突變體包括：E1B (Laughlin等人(1982), 見上文; Janik等人 (1981), 見上文; Ostrove等人, (1980) Virology 104:502); E2A (Handa等人, (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss等人, (1976) J. Virol. 17:140; Myers等人, (1980) J. Virol. 35:665; Jay等人, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers等人, (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen 編, 1990)）; E3 (Carter等人 (1983), 見上文）；及E4 (Carter等人 (1983), 見上文; Carter (1995)）。雖然對由具有E1B編碼區中之突變的腺病毒提供之附加功能的研究已產生衝突結果，但Samulski等人,（1988） J. Virol. 62: 206-210最近報導，AAV病毒粒子產生需要E1B55k，而E1B19k則不需要。另外，國際公開案WO 97/17458及Matshushita等人,（1998） Gene Therapy 5:938-945描述編碼各種Ad基因之附加功能載體。尤其較佳之附加功能質體包含腺病毒VA RNA編碼區、腺病毒E4 ORF6編碼區、腺病毒E2A 72 kD編碼區、腺病毒E1A編碼區及缺乏完整E1B55k編碼區之腺病毒E1B區。此類載體描述於國際公開案第WO 01/83797號中。

使用昆蟲細胞表現異源蛋白質為有據可查的，因為其作為將核酸，如載體，例如昆蟲-細胞相容載體引入至此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法。（參見例如METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Richard編, Humana Press, N J (1995)；O'Reilly等人, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人, J. Vir.(1989)第63卷, 第3822-3828頁；Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1991)第88卷, 第4646-4650頁；Ruffing等人, J. Vir. (1992)第66卷, 第6922-6930頁；Kirnbauer等人, Vir.(1996)第219卷, 第37-44頁；Zhao等人, Vir. (2000)第272卷, 第382-393頁；及美國專利第6,204,059號）。可使用之昆蟲細胞株的實例可來源於草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda），如Sf9、Sf21、SF900+；果蠅細胞株；蚊子細胞株，例如白蚊伊蚊（ Aedes albopictus）源性細胞株；家蠶細胞株，例如家蠶（ Bombyxmori）細胞株；粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni）細胞株，如High Five細胞；或鱗翅目昆蟲細胞株，如黑巫婆飛蛾（ Ascalapha odorata）細胞株。例示性昆蟲細胞為來自易受桿狀病毒感染之昆蟲物種的細胞，包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。

在各種實施例中，提供具有用於rAAV產生之載體的昆蟲細胞。具有用於rAAV產生之核苷酸序列的重組桿狀病毒（rBV）可用於將此等核苷酸序列遞送至用於rAAV產生之昆蟲細胞中。諸如rBV之桿狀病毒為節肢動物之包膜DNA病毒，其兩個成員為用於在細胞培養物中產生重組蛋白質的熟知表現載體。桿狀病毒具有環狀雙鏈基因體（80-200 kbp），其可經工程化以允許將大基因體內含物遞送至特定細胞。用作載體之病毒通常為加洲苜蓿夜蛾多衣殼核多角體病毒（AcMNPV）或家蠶核多角體病毒（Bm-NPV）（Katou, Yasuhiro等人, Virology404.2 (2010): 204-214.）。桿狀病毒通常用於感染昆蟲細胞以表現重組蛋白。特定言之，昆蟲中之異源性基因的表現可如例如以下中所描述實現：美國專利第4,745,051號；Friesen, P. D.及L. K. Miller., Current topics in microbiology and immunology131 (1986): 31-49; EP 127839; EP 155476; Vlak, Just M.,等人, Journal of General Virology69.4 (1988): 765-776; Miller, Lois K., Annual Reviews in Microbiology42.1 (1988): 177-199; Carbonell, Luis F.,等人, Gene73.2 (1988): 409-418; Maeda, Susumu,等人, Nature315.6020 (1985): 592-594; Lebacq-Verheyden, ANNE-MARIE,等人, Molecular and cellular biology8.8 (1988): 3129-3135; Smith, Gale E.,等人, Proceedings of the National Academy of Sciences82.24 (1985): 8404-8408; Miyajima, Atsushi,等人, Gene58.2-3 (1987): 273-281；及Martin, Brian M.,等人, DNA7.2 (1988): 99-106。可用於產生蛋白質之大量桿狀病毒病毒株及變異體以及相應容許昆蟲宿主細胞描述於以下中：Luckow, Verne A.及Max D. Summers., Bio/technology6.1 (1988): 47-55; Miller等人 (1986) Genetic Engineering, Principles and Methods, 第8卷（J. Setlow及A. Hollaender編), Plenum Press, N.Y., 第277-298頁, 1986); Maeda, Susumu,等人, Nature315.6020 (1985): 592-594；及McKenna, Kevin A., Huazhu Hong及Robert R. Granados., Journal of Invertebrate Pathology71.1 (1998): 82-90。

供體載體及穿梭載體或轉移載體及線性化桿狀病毒DNA用於產生重組桿狀病毒（rBV）。桿狀病毒質體在諸如大腸桿菌之細菌中繁殖，呈大型質體。當經轉染至昆蟲細胞中時，桿狀病毒質體產生桿狀病毒。傳統的桿狀病毒產生，例如如同Invitrogen之Bac-to-Bac系統中之一者藉由在大腸桿菌中之位點特異性換位產生重組桿狀病毒。隨後分離高分子量穿梭載體DNA，且轉染至Sf9或Sf21細胞中，重組桿狀病毒自其中分離且擴增。

昆蟲細胞可分別用具有rAAV載體基因體之核苷酸序列或具有提供AAV輔助功能以產生rBV之核苷酸序列的穿梭載體轉染。此等不同rBV隨後用於共感染初始昆蟲細胞以產生rAAV。

目前用於昆蟲細胞中之AAV產生的方案存在之顯著問題為桿狀病毒之不穩定性。此不穩定性引起缺陷性干擾粒子（Defective Interfering Particle, DIP）之產生。部分地引起不穩定性，因為桿狀病毒基因體複製固有地不穩定，引起較大缺失，包括所關注之基因，且引起較低rAAV生產率。解決此問題之常見緩解策略涉及以極低感染倍率（MOI）進行繼代及rBV感染。（MOI係指感染各細胞之病毒粒子的平均數量，亦即在感染期間每個細胞添加之病毒的數量。）第二策略為選殖rBV以選擇穩定性。其他策略涉及修飾桿狀病毒主鏈以嘗試藉由例如接近關鍵基因之重新定位選擇標記物及/或移動/缺失重複hr區域來最佳化穩定性。

如上所指出，用於解決桿狀病毒不穩定性之一種策略涉及使用較低MOI。儘管使用較低MOI略微改進小規模桿狀病毒不穩定性，但改進不足以用於商業生產。

舉例而言，發現桿狀病毒（baculovirus, BV）基因體不穩定且在多次繼代之後在 rep及 cap基因或治療性基因中出現缺失。此等缺失降低rAAV生產率。為解決缺失及降低生產率，研發出不同製程。第一製程為儲存具有穿梭載體之穩定的大腸桿菌純系且在純系中繁殖穿梭載體。第二製程為在懸浮液中進行Sf細胞轉染以產生BV且分離第0代（P0）BV用於rAAV產生。第三製程為用P0 BV以超低感染倍率（MOI）（例如，低於0.01）感染Sf細胞以產生rAAV。

在各種實施例中，產生rAAV之方法包含用至少一個重組桿狀病毒（rBV）感染細胞之步驟。至少一種rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。該方法進一步包含培養經感染細胞以產生rAAV之步驟。在此方法中，至少一種rBV係自至少一種包含經該等核苷酸序列中之至少一者轉染的細胞之細胞培養物分離。舉例而言，核苷酸序列中之至少一者在穿梭載體中。

在各種實施例中，rAAV係使用任何昆蟲細胞類型產生，該任何昆蟲細胞類型允許產生AAV或生物產物及其可維持於培養物中且其對桿狀病毒感染敏感，包括（但不限於）High Five、Sf9、Sf-RVN、Se30l、SeIZD2l09、SeUCRl、Sf900+、Sf2l、BTI-TN-5B1-4、MG-l、Tn368、HzAml、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。

在各種實施例中，產生rAAV之方法包含用至少一個重組桿狀病毒（rBV）感染細胞之步驟。至少一種rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。該方法進一步包含培養經感染細胞以產生rAAV之步驟。在此方法中，在該感染步驟之前至少一種rBV係自至少一種包含具有桿狀病毒基因體之至少一部分的細胞之細胞培養物分離。細胞亦經至少一種核苷酸序列轉染，該至少一種核苷酸序列與桿狀病毒基因體之至少一部分組合以形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體。舉例而言，線性化桿狀病毒基因體可與核苷酸分子重組，使得產生含有核苷酸分子之桿狀病毒基因體，使得具有新形成之桿狀病毒基因體的細胞能夠產生rBV。

在各種實施例中，產生rAAV之方法包含以下步驟：用第零代（P0）rBV感染細胞且培養經感染細胞以產生rAAV。P0 rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。在其他實施例中，用於感染細胞以產生rAAV之rBV在繼代下低於1。

在各種實施例中，揭示使用至少一種rBV產生大規模基於rBV之rAAV的方法。該方法包含以下步驟：產生含有具有AAV Rep基因、AAV Cap基因及rAAV載體基因體之穿梭載體的重組大腸桿菌庫；冷凍保存該大腸桿菌庫；解凍該大腸桿菌庫；使穿梭載體與經解凍大腸桿菌庫分離；用來自該經解凍大腸桿菌庫之穿梭載體轉染昆蟲細胞；分離rBV與經轉染昆蟲細胞；及用經分離rBV在生物反應器中感染其他昆蟲細胞且培養該感染昆蟲細胞以產生rAAV。

如關於rBV之術語「繼代」為藉由在培養物中感染諸如Sf9細胞之初始昆蟲細胞以產生更多rBV來繁殖rBV濃度之過程。與術語「繼代」相關之數目係指如下連續次數：自先前繼代之穿梭載體或rBV已用於產生更多rBV。舉例而言，轉染穿梭載體至培養物中之至少一部分初始Sf9細胞且培養此等細胞將產生經分離之第0代或P0 rBV。當P0 rBV用於感染培養物中之至少一部分未處理Sf9細胞時，此等細胞將產生P1 rBV。

在各種實施例中，由各種實施例之方法產生的至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、至少+99%或100%之P0 rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。

在各種實施例中，由各種實施例之方法產生的20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之P0 rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。在其他實施例中，藉由具有產生rAAV之核苷酸序列的各種實施例之方法產生的P0 rBV之百分比在上文提供之任何兩個百分比之間的範圍內。

在各種實施例中，大腸桿菌庫或純系經繁殖至預定細胞密度以萃取預定濃度之穿梭載體，以轉染呈至少5毫升（mL）、至少10 mL、至少50 mL、至少100 mL、至少500 mL、至少1公升（L）、至少10 L、至少50 L、至少100L、至少250 L、至少500 L、至少1000 L、至少1500 L、至少2000 L或至少2500 L之培養物體積的細胞。

在各種實施例中，可在轉染之後約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約72小時、約96小時、約120小時、約144小時、約168小時、約192小時、約216小時、約240小時或任何此兩個時間點之間的時間培養轉染之後的細胞。

在各種實施例中，產生rAAV之方法包含以低於0.01之感染倍率（MOI）用rBV感染細胞之步驟。rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列。該方法亦包含培養經感染細胞以產生rAAV之步驟。用於產生各種實施例之rAAV的核苷酸序列包括提供rAAV載體基因體及編碼Rep及衣殼蛋白質之核苷酸序列。

在各種實施例中，揭示使用至少一種rBV產生大規模基於rBV之rAAV的方法。該方法包含以下步驟：使用含有編碼Rep蛋白質之AAV rep基因、編碼Cap蛋白質之AAV cap基因及提供rAAV載體基因體之核苷酸序列的穿梭載體以一定體積在懸浮液中分開轉染昆蟲細胞；轉染昆蟲細胞及分離rBV；用rBV在生物反應器中感染其他昆蟲細胞；且培養經感染昆蟲細胞以產生rAAV。各種實施例之體積為例如至少0.0001毫升（mL）、至少0.0005 mL、至少0.001 mL、至少0.005 mL、至少0.01 mL、至少0.05 mL、至少0.1 mL、至少0.5 mL、至少1 mL、至少5 mL、至少10 mL、至少20 mL、至少30 mL、至少40 mL、至少50 mL、至少60 mL、至少70 mL、至少80 mL、至少90 mL、至少100 mL、至少200 mL、至少300 mL、至少400 mL或至少500 mL。

術語「感染倍率」及「MOI為在感染期間每個細胞添加之病毒粒子之總數目的比率。舉例而言，若將1 x 10 ⁶rBV粒子添加至含有1 x 10 ⁶個細胞之培養物中，則該MOI為1。

在各種實施例中，MOI低於0.01、0.0099、0.0098、0.0097、0.0096、0.0095、0.0094、0.0093、0.0092、0.0091、0.009、0.0089、0.0088、0.0087、0.0086、0.0085、0.0084、0.0083、0.0082、0.0081、0.008、0.0079、0.0078、0.0077、0.0076、0.0075、0.0074、0.0073、0.0072、0.0071、0.007、0.0069、0.0068、0.0067、0.0066、0.0065、0.0064、0.0063、0.0062、0.0061、0.006、0.0059、0.0058、0.0057、0.0056、0.0055、0.0054、0.0053、0.0052、0.0051、0.005、0.0049、0.0048、0.0047、0.0046、0.0045、0.0044、0.0043、0.0042、0.0041、0.004、0.0039、0.0038、0.0037、0.0036、0.0035、0.0034、0.0033、0.0032、0.0031、0.003、0.0029、0.0028、0.0027、0.0026、0.0025、0.0024、0.0023、0.0022、0.0021、0.002、0.0019、0.0018、0.0017、0.0016、0.0015、0.0014、0.0013、0.0012、0.0011、0.001、0.00099、0.00098、0.00097、0.00096、0.00095、0.00094、0.00093、0.00092、0.00091、0.0009、0.00089、0.00088、0.00087、0.00086、0.00085、0.00084、0.00083、0.00082、0.00081、0.0008、0.00079、0.00078、0.00077、0.00076、0.00075、0.00074、0.00073、0.00072、0.00071、0.0007、0.00069、0.00068、0.00067、0.00066、0.00065、0.00064、0.00063、0.00062、0.00061、0.0006、0.00059、0.00058、0.00057、0.00056、0.00055、0.00054、0.00053、0.00052、0.00051、0.0005、0.00049、0.00048、0.00047、0.00046、0.00045、0.00044、0.00043、0.00042、0.00041、0.0004、0.00039、0.00038、0.00037、0.00036、0.00035、0.00034、0.00033、0.00032、0.00031、0.0003、0.00029、0.00028、0.00027、0.00026、0.00025、0.00024、0.00023、0.00022、0.00021、0.0002、0.00019、0.00018、0.00017、0.00016、0.00015、0.00014、0.00013、0.00012、0.00011、0.0001、0.000099、0.000098、0.000097、0.000096、0.000095、0.000094、0.000093、0.000092、0.000091、0.00009、0.000089、0.000088、0.000087、0.000086、0.000085、0.000084、0.000083、0.000082、0.000081、0.00008、0.000079、0.000078、0.000077、0.000076、0.000075、0.000074、0.000073、0.000072、0.000071、0.00007、0.000069、0.000068、0.000067、0.000066、0.000065、0.000064、0.000063、0.000062、0.000061、0.00006、0.000059、0.000058、0.000057、0.000056、0.000055、0.000054、0.000053、0.000052、0.000051、0.00005、0.000049、0.000048、0.000047、0.000046、0.000045、0.000044、0.000043、0.000042、0.000041、0.00004、0.000039、0.000038、0.000037、0.000036、0.000035、0.000034、0.000033、0.000032、0.000031、0.00003、0.000029、0.000028、0.000027、0.000026、0.000025、0.000024、0.000023、0.000022、0.000021、0.00002、0.000019、0.000018、0.000017、0.000016、0.000015、0.000014、0.000013、0.000012、0.000011、0.00001、0.0000099、0.0000098、0.0000097、0.0000096、0.0000095、0.0000094、0.0000093、0.0000092、0.0000091、0.000009、0.0000089、0.0000088、0.0000087、0.0000086、0.0000085、0.0000084、0.0000083、0.0000082、0.0000081、0.000008、0.0000079、0.0000078、0.0000077、0.0000076、0.0000075、0.0000074、0.0000073、0.0000072、0.0000071、0.000007、0.0000069、0.0000068、0.0000067、0.0000066、0.0000065、0.0000064、0.0000063、0.0000062、0.0000061、0.000006、0.0000059、0.0000058、0.0000057、0.0000056、0.0000055、0.0000054、0.0000053、0.0000052、0.0000051、0.000005、0.0000049、0.0000048、0.0000047、0.0000046、0.0000045、0.0000044、0.0000043、0.0000042、0.0000041、0.000004、0.0000039、0.0000038、0.0000037、0.0000036、0.0000035、0.0000034、0.0000033、0.0000032、0.0000031、0.000003、0.0000029、0.0000028、0.0000027、0.0000026、0.0000025、0.0000024、0.0000023、0.0000022、0.0000021、0.000002、0.0000019、0.0000018、0.0000017、0.0000016、0.0000015、0.0000014、0.0000013、0.0000012、0.0000011、0.000001、0.000001、9e-7、8e-7、7e-7、6e-7、5e-7、4e-7、3e-7、2e-7、1e-7、9e-8、8e-8、7e-8、6e-8、5e-8、4e-8、3e-8、2e-8、1e-8、9e-9、8e-9、7e-9、6e-9、5e-9、4e-9、3e-9、2e-9、1e-9、9e-10、8e-10、7e-10、6e-10、5e-10、4e-10、3e-10、2e-10、1e-10。在其他實施例中，MOI為所提供之任何兩個MOI之間的範圍。在其他實施例中，添加至培養物中之rBV粒子的數目為1個病毒粒子、2個病毒粒子、3個病毒粒子、4個病毒粒子、5個病毒粒子、6個病毒粒子、7個病毒粒子、8個病毒粒子、9個病毒粒子或10個病毒粒子。在其他實施例中，添加至培養物中之rBV粒子的數目在0.01 MOI至1個病毒粒子、0.01 MOI至2個病毒粒子、0.01 MOI至3個病毒粒子、0.01 MOI至4個病毒粒子、0.01 MOI至5個病毒粒子、0.01 MOI至6個病毒粒子、0.01 MOI至7個病毒粒子、0.01 MOI至8個病毒粒子、0.01 MOI至9個病毒粒子、0.01 MOI至10個病毒粒子之間的範圍內。

在各種實施例中，使用P0 rBV或rBV MOI低於0.01引起rAAV效價增加至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%、至少600%、至少700%、至少800%、至少900%、至少1000%、至少5000%、至少10000%、至少100000%、至少7 log增加、至少8 log增加或至少9 log。舉例而言，rAAV效價之增加相對於在繼代時之rBV ≥ 1或rBV MOI ≥ 0.01。

在各種實施例中，用於感染用於rAAV產生之細胞的rBV包括具有用於rAAV載體基因體之核苷酸序列的第一rBV及一個或多個具有編碼Rep及Cap蛋白質之核苷酸序列的第二rBV。在各種實施例中，細胞以介於0.01至10.0、0.05至7.5、0.1至5、0.5至5、0.7至3.0、0.8至3.0、0.9至3.0或1.0至3.0之範圍內之第一rBV MOI:該一個或多個第二rBV MOI的比率感染。在其他實施例中，第一rBV MOI:該一個或多個第二rBV MOI的比率為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10。在其他實施例中，比率在上文所列之任何兩個比率之間的範圍。

在各種實施例中，由不同實施例之方法產生的rAAV具有低於1E-9奈克/奈克之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-10奈克/奈克之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-11奈克/奈克之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-12奈克/奈克之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-13奈克/奈克之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-14奈克/奈克之衣殼化rAAV載體基因體或低於1E-15奈克/奈克之衣殼化rAAV載體基因體之濃度的衣殼化桿狀病毒核苷酸序列。在其他實施例中，由不同實施例之方法產生的rAAV具有至少在管制機構（例如，美國食品藥物管理局（FDA）、歐洲藥物管理局（EMA）等）調節性批准可接受含量之衣殼化桿狀病毒核苷酸序列濃度。

在各種實施例中，由不同實施例之方法產生的rAAV具有低於1E-3複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-4複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-6複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-7複本、低於1E-8複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-9複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體或低於1E-10複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體之濃度的編碼桿狀病毒DNA聚合酶之至少一部分的衣殼化桿狀病毒核苷酸序列。在其他實施例中，由不同實施例之方法產生的rAAV具有至少在管制機構（例如，FDA、EMA等）調節性批准可接受含量之濃度的編碼桿狀病毒DNA聚合酶之至少一部分的衣殼化桿狀病毒核苷酸序列。

在各種實施例中，由不同實施例之方法產生的rAAV具有低於1E-3複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於5E-3複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-4複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於5E-4複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於2E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於3E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於4E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於5E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於6E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於7E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於8E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於9E-5複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-6複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於5E-6複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-7複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於5E-7複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於1E-8複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體、低於5E-8複本/複本之衣殼化rAAV載體基因體之濃度的衣殼化細胞18S核糖體RNA（rRNA）基因核苷酸序列。在其他實施例中，由不同實施例之方法產生的rAAV具有至少在管制機構（例如，FDA、EMA等）調節性批准可接受含量之濃度的衣殼化細胞18S rRNA基因核苷酸序列。

在各種實施例中，感染rBV之細胞係在收集rAAV之前培養預定時間段。舉例而言，可在轉染之後約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約72小時、約96小時、約120小時、約144小時、約168小時、約192小時、約216小時、約240小時或任何此兩個時間點之間的時間收集rAAV粒子。

在各種實施例中，各種實施例之培養步驟（例如，Sf9細胞或大腸桿菌）在至少5 mL、至少10 mL、至少20 mL、至少50 mL、至少100 mL、至少500 mL、至少1公升（L）、至少10 L、至少50 L、至少100L、至少250 L、至少500 L、至少1000 L、至少1500 L、至少2000 L或至少2500 L之體積下進行。

在實例中，培養步驟（例如，Sf9細胞或大腸桿菌）可在旋轉管或搖瓶中進行。在各種實施例中，任何範疇或實施例之培養步驟係在0.0001 mL、0.0005 mL、0.001 mL 0.005 mL、0.01 mL 0.05 mL、0.1 mL、0.5 mL、1 mL、5 mL、10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1 L、2 L、3 L、4 L或5 L之體積中進行。在其他實施例中，培養步驟之體積在以上提供之任兩個體積之間的範圍內。

在其他實例中，培養步驟（例如，Sf9細胞或大腸桿菌）可在一個或多個生物反應器中進行。在各種實施例中，任何範疇或實施例之培養步驟係在以下之體積中進行：1 L、2 L、3 L、4 L、5 L、6L、7L、8 L、9 L、10 L、11 L、12 L、13 L、14 L、15 L、16 L、17 L、18 L、19 L、20 L、21 L、22 L、23 L、24 L、25 L、26 L、27 L、28 L、29 L、30 L、31 L、32 L、33 L、34 L、35 L、36 L、37 L、38 L、39 L、40 L、41 L、42 L、43 L、44 L、45 L、46 L、47 L、48 L、49 L、50 L、51 L、52 L、53 L、54 L、55 L、56 L、57 L、58 L、59 L、60 L、61 L、62 L、63 L、64 L、65 L、66 L、67 L、68 L、69 L、70 L、71 L、72 L、73 L、74 L、75 L、76 L、77 L、78 L、79 L、80 L、81 L、82 L、83 L、84 L、85 L、86 L、87 L、88 L、89 L、90 L、91 L、92 L、93 L、94 L、95 L、96 L、97 L、98 L、99 L、100 L、110 L、120 L、130 L、140 L、150 L、160 L、170 L、180 L、190 L、200 L、210 L、220 L、230 L、240 L、250 L、260 L、270 L、280 L、290 L、300 L、310 L、320 L、330 L、340 L、350 L、360 L、370 L、380 L、390 L、400 L、410 L、420 L、430 L、440 L、450 L、460 L、470 L、480 L、490 L、500 L、510 L、520 L、530 L、540 L、550 L、560 L、570 L、580 L、590 L、600 L、610 L、620 L、630 L、640 L、650 L、660 L、670 L、680 L、690 L、700 L、710 L、720 L、730 L、740 L、750 L、760 L、770 L、780 L、790 L、800 L、810 L、820 L、830 L、840 L、850 L、860 L、870 L、880 L、890 L、900 L、910 L、920 L、930 L、940 L、950 L、960 L、970 L、980 L、990 L、1000 L、1010 L、1020 L、1030 L、1040 L、1050 L、1060 L、1070 L、1080 L、1090 L、1100 L、1110 L、1120 L、1130 L、1140 L、1150 L、1160 L、1170 L、1180 L、1190 L、1200 L、1210 L、1220 L、1230 L、1240 L、1250 L、1260 L、1270 L、1280 L、1290 L、1300 L、1310 L、1320 L、1330 L、1340 L、1350 L、1360 L、1370 L、1380 L、1390 L、1400 L、1410 L、1420 L、1430 L、1440 L、1450 L、1460 L、1470 L、1480 L、1490 L、1500 L、1510 L、1520 L、1530 L、1540 L、1550 L、1560 L、1570 L、1580 L、1590 L、1600 L、1610 L、1620 L、1630 L、1640 L、1650 L、1660 L、1670 L、1680 L、1690 L、1700 L、1710 L、1720 L、1730 L、1740 L、1750 L、1760 L、1770 L、1780 L、1790 L、1800 L、1810 L、1820 L、1830 L、1840 L、1850 L、1860 L、1870 L、1880 L、1890 L、1900 L、1910 L、1920 L、1930 L、1940 L、1950 L、1960 L、1970 L、1980 L、1990 L、2000 L、2010 L、2020 L、2030 L、2040 L、2050 L、2060 L、2070 L、2080 L、2090 L、2100 L、2110 L、2120 L、2130 L、2140 L、2150 L、2160 L、2170 L、2180 L、2190 L、2200 L、2210 L、2220 L、2230 L、2240 L、2250 L、2260 L、2270 L、2280 L、2290 L、2300 L、2310 L、2320 L、2330 L、2340 L、2350 L、2360 L、2370 L、2380 L、2390 L、2400 L、2410 L、2420 L、2430 L、2440 L、2450 L、2460 L、2470 L、2480 L、2490 L、2500 L、2510 L、2520 L、2530 L、2540 L、2550 L、2560 L、2570 L、2580 L、2590 L、2600 L、2610 L、2620 L、2630 L、2640 L、2650 L、2660 L、2670 L、2680 L、2690 L、2700 L、2710 L、2720 L、2730 L、2740 L、2750 L、2760 L、2770 L、2780 L、2790 L、2800 L、2810 L、2820 L、2830 L、2840 L、2850 L、2860 L、2870 L、2880 L、2890 L、2900 L、2910 L、2920 L、2930 L、2940 L、2950 L、2960 L、2970 L、2980 L、2990 L或3000 L。在其他實施例中，培養步驟之體積在以上提供之任兩個體積之間的範圍內。

在各種實施例中，rBV之效價使用焦點/病毒斑塊分析（foci/viral plaque assay）來確定。此分析法首先包括用含有rBV之溶液之連續稀釋液來感染細胞之步驟。感染發生預定時間後，自培養物移除rBV且培育細胞預定時間。在預定時間過去之後，將成斑培養基（例如含有瓊脂糖）添加至培養物且使其硬化。使細胞進一步培育預定時間且在預定時間之後對斑塊數目進行計數。效價使用以下式計算

效價（空斑形成單位/mL）=斑塊數目x稀釋因子x（1/（mL之接種物/孔）

對於產生rAAV之任何方法，包括上文所描述之方法，亦在具有治療有效rAAV粒子之組合物中產生或發現雜質。因此，rAAV產生雜質可包括治療無效rAAV粒子、外源高分子量DNA、小聚核苷酸、蛋白質、緩衝組分等。

亦揭示與基於rBV產生rAAV相關之其他實施例。

在各種實施例中，揭示一種用於增加rAAV產生且減少在該所產生之rAAV內經衣殼化之聚核苷酸雜質的方法。該方法包含用具有用於rAAV載體基因體之核苷酸序列的rBV及一個或多個具有編碼Rep及Cap蛋白質之核苷酸序列的第二rBV感染不同細胞培養物之步驟。以第一rBV感染倍率（MOI）:一個或多個第二rBV MOI之不同比率用該第一rBV及該一個或多個第二rBV感染各細胞培養物。該方法亦包含以下步驟：自該等不同細胞培養物中分離rAAV，確定自該等不同細胞培養物中分離之rAAV的效價，確定自該等不同細胞培養物中分離之rAAV內之衣殼化核苷酸雜質的濃度；及根據兩種確定步驟鑑別該第一rBV MOI:該一個或多個第二rBV MOI之一種或多種比率。

在各種實施例中，用於量測rBV效價之細胞包含可操作地連接至由桿狀病毒感染活化之誘導性桿狀病毒啟動子序列的報導核苷酸序列。誘導性桿狀病毒啟動子序列選自早期桿狀病毒啟動子序列及中間桿狀病毒啟動子序列中之至少一者。該報導核苷酸序列及該誘導性桿狀病毒啟動子序列穩定地維持於該指示細胞內。各種實施例之報導核苷酸序列及各種實施例之誘導性桿狀病毒啟動子序列穩定地維持於指示細胞內（例如，游離型表現，諸如游離型微型環）。在其他實施例中，報導核苷酸序列及誘導性桿狀病毒啟動子序列穩定地併入至指示細胞之基因體中。在各種實例中，不同實施例之報導核苷酸序列編碼報導蛋白。報導蛋白質之實例包括螢光蛋白質、發光蛋白質或用於組織化學反應（例如，免疫組織化學、免疫組織化學等）中之蛋白質。此類蛋白質之其他實例包括青藍色螢光蛋白質、綠色螢光蛋白質、黃色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質、DsRed、mCherry、螢光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、氯胺苯醇乙醯基轉移酶及葡萄糖氧化酶。在各個實例中，該誘導性桿狀病毒啟動子序列選自39K啟動子、p6.9啟動子、gp64啟動子、Polh啟動子及p10啟動子中之至少一者。不同實施例之誘導性桿狀病毒啟動子序列亦定位至其他表現控制元件以控制轉錄物表現。

在不同實例中，指示細胞包含與SEQ ID NO: 1、2或3具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99+%或100%一致性之啟動子核苷酸序列。

在各種實施例中，不同實施例之報導核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒衍生之強化子序列，且該桿狀病毒衍生之強化子序列係穩定地維持於指示細胞內。各種實施例之桿狀病毒衍生之強化子序列穩定維持於指示細胞內（例如，游離型表現，諸如游離型微型環）。在其他實施例中，桿狀病毒衍生之強化子序列穩定地併入至指示細胞之基因體中。各種實施例之桿狀病毒衍生之強化子序列的實例包括同源區域（HR）強化子序列，諸如HR1、HR1a、HR2、HR2a、HR3、HR4a、HR4b、HR4c、HR5。舉例而言，具有啟動子、同源區元件及/或編碼乙醯基轉移酶之核苷酸序列的表現卡匣可穩定地併入至昆蟲細胞之基因體中，使得昆蟲細胞之桿狀病毒感染誘導來自表現卡匣之轉錄物表現（參見US2012/0100606）。

在各種實施例中，用於量測不同實施例之rBV效價的指示細胞進一步包含一個或多個提供或編碼一個或多個用於選擇具有不同實施例之報導核苷酸序列之細胞之元件的核苷酸序列、不同實施例之誘導性桿狀病毒啟動子序列或不同實施例之桿狀病毒衍生之強化子序列（例如，陽性抗生素選擇、選擇標記物等）。在不同實例中，一個選擇元件可用於一個細胞類型（例如，Sf9細胞）中之選擇及另一選擇元件可用於另一細胞類型（例如，大腸桿菌）中之選擇。不同實施例之核苷酸序列以及用於選擇不同實施例之細胞之元件的實例提供於下文中。可獲得抗性基因及元件，諸如蛋白質之真核選擇抗生素的實例包括殺稻瘟菌素（編碼殺稻瘟菌素-S去胺酶之殺稻瘟菌素抗性基因（ bsr））、遺傳黴素（來自編碼胺基醣苷3'-磷酸轉移酶，APH 3' II之Tn5之新黴素抗性基因（ neo））、潮黴素B（編碼潮黴素-B 4-O-激酶之 hph基因）、嘌呤黴素（編碼嘌呤黴素N-乙醯基-轉移酶之Pac基因）、博來黴素（ Sh ble基因）或吉歐黴素（ Sh ble基因）。可獲得抗性基因及元件，諸如蛋白質之細菌選擇抗生素的實例包括康黴素（Kan ^R-Tn5基因產物（胺基醣苷磷酸轉移酶））、大觀黴素、鏈黴素、安比西林（編碼β-內醯胺酶之 bla基因）、卡本西林、博萊黴素、紅黴素、多黏菌素B、四環素（編碼四環素抑制劑蛋白質之Tet ^R-Tn10基因）及氯胺苯醇。

在各種實施例中，揭示一種用於產生用於量測不同實施例之rBV效價之指示細胞的方法。該方法包括轉染包含可操作地連接至由桿狀病毒感染活化之誘導性桿狀病毒啟動子序列的報導核苷酸序列之載體的步驟。不同實施例之報導核苷酸序列可操作地連接至不同實施例之桿狀病毒衍生之強化子序列。在各種實施例中，載體進一步包含可操作地連接至表現控制序列之抗性核苷酸序列，且該方法進一步包含培養細胞及陽性選擇至少一個細胞之步驟，其中載體穩定地維持。在其他實施例中，該方法進一步包含培養細胞、自培養物分離細胞及分開培養經分離之細胞的步驟。

在各種實施例中，一種用於量測rBV效價之方法包含用rBV感染細胞之步驟。各種實施例之指示細胞包含可操作地連接至由桿狀病毒感染活化之誘導性桿狀病毒啟動子序列的報導核苷酸序列。誘導性桿狀病毒啟動子序列選自早期桿狀病毒啟動子序列及中間桿狀病毒啟動子序列中之至少一者。不同實施例之報導核苷酸序列可操作地連接至不同實施例之桿狀病毒衍生之強化子序列。各種實施例之方法亦包含量測報導核苷酸序列之表現且自報導核苷酸序列之表現確定rBV效價的步驟。舉例而言，報導核苷酸序列係使用流動式細胞測量術來量測。在其他實施例中，該確定步驟在該感染之後3小時或更久、4小時或更久、5小時或更久、6小時或更久、7小時或更久、8小時或更久、9小時或更久、10小時或更久、11小時或更久、12小時或更久、13小時或更久、14小時或更久、15小時或更久、16小時或更久、17小時或更久、18小時或更久、19小時或更久、20小時或更久進行。

一般而言，vg及衣殼（cp）效價可以適合於量測相應vg及衣殼之任何方式評估。例如，可使用定量聚合酶鏈反應（qPCR）量測vg效價且可使用酶聯免疫吸附分析（ELISA）量測Cp效價。可替代地，可使用SEC（尺寸排阻層析）-HPLC量測vg及cp效價。另外，可使用RP（逆相）-HPLC分析評估製程參數對VP比率之潛在影響。

藉由定量聚合酶鏈反應（qPCR），使用標準qPCR系統，諸如Applied Biosystems 7500快速即時PCR系統，qPCR可用於定量vg。可替代地，微滴式數位PCR（ddPCR）可用於定量Vg。引子及探針可經設計以靶向AAV之DNA，在其在PCR期間積聚時允許定量其。ddPCR之實例描述於以下中：Pasi, K. John,等人 「Multiyear Follow-Up of AAV5-hFVIII-SQ Gene Therapy for Hemophilia A.」「 New England Journal of Medicine」382.1 (2020): 29-40; Regan, John F.,等人「A Rapid Molecular Approach for Chromosomal Phasing.」 PloS one10.3 (2015): e0118270；及Furuta-Hanawa, Birei, Teruhide Yamaguchi及Eriko Uchida. 「Two-Dimensional Droplet Digital PCR as a Tool for Titration and Integrity Evaluation of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors」 Human gene therapy methods30.4 (2019): 127-136。其他用於定量vg之系統包括SEC、SEC-HPLC及尺寸交換層析法多角度光散射，均描述於以引用的方式全文併入之WO 2021/062164中。

衣殼ELISA（cp-ELISA）分析使用例如AAV5衣殼ELISA方法量測完整衣殼，且可利用市售套組（例如Progen PRAAV5）。此套組ELISA採用對組裝AAV5或其他衣殼上之構形抗原決定基具有特異性的單株抗體。衣殼可捕捉在培養盤結合之單株抗體上，接著，偵測抗體隨後結合。分析訊號可藉由添加結合之鏈黴抗生物素蛋白過氧化酶來產生，接著添加比色TMB受質溶液，且添加硫酸來終止反應。自目標衣殼標準之四參數校準曲線內推測試樣品之效價。另一用於定量衣殼效價之系統為SEC-MALS，其描述於WO 2021/062164中。

本發明將進一步描述於以下實施例中，其不限制申請專利範圍中所描述之本發明範疇。 實例 1

在超低MOI下使用0代（P0）rBV用於rAAV產生

穿梭載體構築及產生：將編碼Rep蛋白質及衣殼蛋白質及提供具有所關注之基因（GOI）之rAAV載體基因體的DNA序列選殖至供體質體中。供體質體隨後用於轉型DH10Bac勝任型大腸桿菌細胞，以產生具有編碼rep及cap之DNA序列的穿梭載體且提供由兩個ITR側接之在啟動子下具有GOI的rAAV載體基因體。分離來自不同大腸桿菌純系之穿梭載體且經由桑格定序技術進行分析以選擇具有校正核苷酸序列之純系。使用具有校正核苷酸序列之大腸桿菌純系以產生主穿梭載體大腸桿菌細胞庫及工作穿梭載體大腸桿菌細胞庫。

為產生用於P0 rBV產生之穿梭載體，將來自主穿梭載體大腸桿菌細胞或工作穿梭載體大腸桿菌細胞庫之小瓶解凍且置於培養物中。在將大腸桿菌細胞培養至預定細胞密度之後，濃縮細胞且溶解。使用不同層析及過濾方法自溶解之細胞分離出載體。

P0 rBV產生：對於0代（P0）rBV產生步驟，Sf9細胞被置放於培養物中且擴增至預定細胞密度。隨後使用轉染劑將Sf9細胞用所產生之穿梭載體轉染。培養經轉染之Sf9細胞持續預定時間以產生P0 rBV。P0 rBV使用數位液滴聚合酶連鎖反應（ddPCR）分析，以確定P0 rBV之基因體是否含有用於rAAV產生之核苷酸序列缺失。應注意，rBV之後續繼代引起含有編碼Rep蛋白質或衣殼蛋白質或提供具有GOI之rAAV載體基因體之DNA序列的rBV基因體缺失。在預定時間，使用離心自細胞培養物中分離rBV且儲存於＜15℃下。

rAAV產生：對於rAAV產生，將Sf9細胞放入培養物中且擴增至預定細胞密度。當經培養Sf9細胞達至預定細胞密度時，將含有編碼Rep蛋白質及衣殼蛋白質之DNA序列及提供具有GOI之rAAV載體基因體的rBV添加至培養物中。在不同rAAV產生中，以選自0.1至1e-10之範圍內的不同MOI（例如，rBV粒子之數目比細胞之數目）將rBV添加至培養物中。

在Sf9細胞經rBV感染之後，培養該等細胞持續預定時間以產生rAAV。在經過預定時間之後，回收含有rAAV之上清液，用核酸酶處理且使用不同深度過濾器進行過濾。隨後使用親和層析自上清液中分離rAAV。使用穿梭載體大腸桿菌細胞庫用於產生P0 rBV、在大腸桿菌中繁殖穿梭載體且對其分離用於轉染、在Sf9細胞（≥ 5 mL）中轉染穿梭載體以產生P0 rBV或以低於0.01之MOI用rBV感染Sf9細胞實質上改進rBV之穩定性且實質上改進rAAV在Sf9細胞中之產生以及所產生之rAAV的感染性。

在rAAV產生上rBV繼代的分析：使用經桿狀病毒感染之昆蟲細胞系統（baculovirus infected insect cell system, BIIC），分析含有不同繼代rBV之BIIC。特定言之，跨越4個繼代含量且提供/編碼GOI、Rep及Cap之BIIC用於產生rAAV。BIIC與初始Sf9細胞以1:500之MOI共培養，其中各BIIC應理解為能夠釋放約數百個rBV。最低繼代BIIC產生AAV效價為約9.55 x 10e11 vg/mL。下一代BIIC產生AAV效價為約1.8 x 10e11 vg/mL。下一代BIIC產生AAV效價為約3.8 x 10e10 vg/mL。最高代BIIC產生AAV效價為約5.2 x 10e9 vg/mL。因此，rBV之連續繼代降低AAV效價，使得BIIC不足以大規模產生rAAV。

為了克服與BIIC相關之侷限性，研發出使用穿梭載體作為用於產生高效價rBV之起始物質的新穎rAAV產生方法。rBV儲備液藉由在各生產運作期間在震盪懸浮液培養物中轉染Sf9細胞過程內產生，且產生足以以較低MOI感染2,000 L生產槽之rBV效價。藉由消除rBV繼代，以BIIC繁殖或rBV儲備液擴增形式，在rBV固有不穩定性可顯著影響所得rAAV效價之前利用rBV感染Sf9產生培養物。因此，實現與使用衍生自低繼代BIICS之rBV可實現相當或大於彼等的rAAV效價，但不限制可擴展性及供應。

提供/編碼GOI、Rep及Cap之P0 rBV隨後用於產生rAAV。如圖1中所示，初始sf9細胞以0.1、0.01、0.001、0.0001及0.00001經rBV感染。圖1展示以≤ 0.01之MOI用P0 rBV感染Sf9細胞顯著改進rAAV效價。 實例 2

指示細胞株之產生

質體構築：Gibson組裝用於連接片段，包括大腸桿菌選擇卡匣及來自pIB CMV GFP之昆蟲細胞選擇卡匣，來自AcMNPV E2基因體KM667940及39k（SEQ ID NO: 1）、p6.9（SEQ ID NO: 2）及Polh（SEQ ID NO: 3）啟動子之同源區域5序列。最初，構築三個質體，各自使用不同啟動子39k（圖2）、p6.9（圖3）或Polh（圖4）。質體中之每一者含有報導卡匣、大腸桿菌（ E. coli）選擇卡匣及昆蟲細胞選擇卡匣。報導卡匣含有可操作地連接至編碼報導蛋白（例如，綠色螢光蛋白（GFP））之核苷酸序列的39k啟動子、p6.9啟動子或Polh啟動子。大腸桿菌選擇卡匣為安比西林抗性卡匣，其包括可操作地連接至安比西林抗性基因之安比西林抗性啟動子。昆蟲細胞選擇卡匣含有可操作地連接EM7啟動子之殺稻瘟菌素抗性基因。隨後，構築第二組三個質體，其中GFP基因用針對昆蟲細胞中之表現最佳化的GFP基因置換。檢驗質體微型製劑之精確組裝，且使攜有校正構築體之大腸桿菌純系按比例擴大，且使用maxi製劑提取及純化質體。另外，含有經最佳化GFP基因之構築體在轉染之前隨後用ScaI線性化。

轉染：轉染在6孔盤中進行。將2 mL/孔之Sf9細胞以0.5E6個細胞/mL接種於SF900 III中，得到1e6個細胞/孔。將56 µL之Cellfectin II試劑稀釋於700 uL之PBS中且將3 µg各質體稀釋至100 µL之PBS中。將100 µl經稀釋Cellfectin添加至經稀釋質體溶液中之每一者，隨後使其在室溫下培育30分鐘。隨後將Sf900III（0.8 ml）添加至質體溶液中，且移除盤中之培養基且用質體溶液置換。隨後在28℃下培育該等盤4-5小時，之後自該等孔移除轉染混合物，且視孔而定，用具有25或50 µg/ml殺稻瘟菌素的3 ml之Sf900III培養基置換該等盤。隨後將其在28℃下再培育72至96小時。

選擇：在轉染期間，在具有25或50 µg/ml之殺稻瘟菌素的培養基中進行選擇。在使細胞轉移至搖瓶中之後，對於所有培養物，使殺稻瘟菌素之濃度保持在25 µg/ml下以便維持選擇性壓力。

初始純系鑑別及篩選：來自搖瓶之分裂物在較高MOI下經重組桿狀病毒（rBV）感染，且隨後在15-96小時之間的各種時間藉由流動式細胞測量術分析用於GFP表現。稀釋來自39k-unoptGFP培養物之細胞且接種至96孔盤上用於次選殖。將細胞稀釋至改良性培養基中之5個細胞/mL+ 25 µg/mL殺稻瘟菌素，且以200 µL/孔（1個細胞/孔）接種於20盤中。以相同方式接種另外10個盤，但添加1e4個飼養細胞/孔（未經轉染之Sf9細胞）。

細胞儲備：將細胞以0.5E6個細胞/mL在第0天接種且在接種之後第2天儲備。以30E6個細胞/小瓶製備五個小瓶。自其搖瓶中移除細胞且在300 g下在4℃下離心10分鐘。在50%新鮮培養基及具有7.5% DMSO之50%消耗培養基之濃度下製備冷凍培養基。過濾冷凍培養基且使用5 mL再懸浮細胞。將1 mL細胞添加至各小瓶中且將其在-80℃下置於低溫冷凍容器中持續24小時，隨後轉移至低溫槽。

39k-GFP穩定池之次選殖：自初始Sf9細胞（4e6個細胞/mL，第3天培養）中收穫改良性培養基且無菌過濾。將經39k-GFP質體轉染之Sf9細胞稀釋至在改良性培養基中之5個細胞/mL+ 25 µg/mL殺稻瘟菌素，且以200 µL/孔（1個細胞/孔）接種於20盤中。將單細胞純系分選至96孔盤中且擴增。提取純系之樣品且以不同MOI用rBV感染。經由流動式細胞測量術量測GFP表現。

指示細胞株之分析

將指示細胞接種於96孔深孔培養盤上，且隨後用桿狀病毒之連續稀釋液感染，且使其在28℃下在震盪器上培育18小時。指示細胞用具有GFP表現卡匣之質體轉染，該GFP表現卡匣含有39k啟動子核苷酸序列、p6.9啟動子核苷酸序列或聚角體蛋白啟動子核苷酸序列。

感染之後，藉由流動式細胞測量術分析細胞之GFP表現。圖5為初始Sf9細胞之流動式細胞測量術分析的圖。圖6為經含有39k啟動子核苷酸序列之GFP表現卡匣轉染之Sf9細胞之流動式細胞測量術分析的圖。此等Sf9細胞未經rBV感染。對於兩個圖，虛線展示綠色螢光，且原初Sf9細胞或未經39k質體感染之Sf9細胞均無螢光。特定而言，約0.1%之細胞展現出綠色螢光。

圖7為經含有39k啟動子核苷酸序列之GFP表現卡匣轉染之Sf9細胞之流動式細胞測量術分析的圖。圖8為經含有p6.9啟動子核苷酸序列之GFP表現卡匣轉染之Sf9細胞之流動式細胞測量術分析的圖。圖9為經含有聚角體蛋白啟動子核苷酸序列之GFP表現卡匣轉染之Sf9細胞之流動式細胞測量術分析的圖。此等Sf9細胞經rBV感染。對於此等圖，虛線展示綠色螢光且不同細胞展現出螢光。對於圖7，55.5%之39k啟動子細胞展現出綠色螢光。對於圖8，11%之p6.9啟動子細胞展現出綠色螢光。對於圖9，2%之Polh啟動子細胞展現出綠色螢光。

隨時間量測在各啟動子核苷酸序列下之GFP表現。在如圖10中所示之rBV感染後19小時，55.5%之39k啟動子細胞展現出綠色螢光，11%之p6.9啟動子細胞展現出綠色螢光，且2%之Polh啟動子細胞展現出綠色螢光。在如圖11中所示之rBV感染後40小時，65.4%之39k啟動子細胞展現出綠色螢光，19%之p6.9啟動子細胞展現出綠色螢光，且11%之Polh啟動子細胞展現出綠色螢光。在如圖12中所示之rBV感染後68小時，66.3%之39k啟動子細胞展現出綠色螢光，19%之p6.9啟動子細胞展現出綠色螢光，且15%之Polh啟動子細胞展現出綠色螢光。如圖10、11及12中所示，p6.9及聚角體蛋白啟動子序列均展現出GFP表現之極大增加，但該表現晚於39K啟動子序列。此外，39K啟動子序列展現出最高GFP表現。

圖13展示39k啟動子分析之資料，其中在用rBV感染昆蟲細胞且培育預定時間段之後，經由流動式細胞量測術分析含有具有39k啟動子之報導卡匣之昆蟲細胞的GFP表現。表現eGFP之39k啟動子細胞的百分比為41.1%（15小時）、39.9%（18小時）、40.7%（24小時）、68.0%（43小時）、66.4%（65小時）、67.3%（70小時）及69.3%（94小時）。亦如圖13中所示，39k啟動子下之GFP表現早在感染之後15小時時表現。應注意，維持GFP表現，其可歸因於24小時之後的二次rBV感染。在此程度上，分析可在二次rBV感染（例如，24小時）之前進行。

亦用含有編碼GFP之核苷酸序列的質體轉染細胞，其中核苷酸序列針對昆蟲細胞中之GFP表現進行密碼子最佳化。此等核苷酸序列可操作地連接至39K及Polh啟動子。如圖14、15及16中所示，經密碼子最佳化之GFP核苷酸序列的使用增加39K及Polh啟動子之GFP表現。在如圖14中所示之20小時時，針對39k啟動子細胞之密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自56.5%增加至57.8%，及針對PolH啟動子細胞之經密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自4.0%增加至10.5%。在如圖15中所示之25小時時，針對39k啟動子細胞之密碼子最佳化eGFP序列的使用引起基本上無差異eGFP表現（56.6%及55.9%），及針對PolH啟動子細胞之經密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自4.8%增加至12.0%。在如圖16中所示之48小時時，針對39k啟動子細胞之密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自58.5%增加至59.3%，及針對Polh啟動子細胞之經密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自10.9%增加至17.5%。仍注意到39K啟動子之GFP表現更大。

以下為使用指示細胞株之rBV滴定的實例。使用基於流動式細胞測量術之桿狀病毒感染效價分析（FC-BITA）來量測P0桿狀病毒感染效價，以計算感染Sf9細胞以起始產生所需的rBV之體積。此分析使用在用rBV感染後表現GFP（綠色螢光蛋白）之Sf9細胞株。藉由流動式細胞測量術偵測GFP含量，且使用泊松分佈將螢光細胞之百分比轉換成rBV濃度。在每個分析中進行陽性對照，以確定分析效能。 實例 3

桿狀病毒MOI對AAV生產率及衣殼化桿狀病毒衍生之DNA概況的影響

重組型腺相關病毒（rAAV）之基於昆蟲細胞的產生係通常藉由用編碼AAV Rep基因、AAV Cap基因及相關轉殖基因之rBV感染Sf9細胞來實現。評估rBV MOI對Sf9產生之AAV載體產率及DNA雜質之封裝的影響。在生物反應器中進行全因數3層級實驗，接著小規模研究，以在較低MOI下研究獨立效果。研究在10倍MOI範圍（0.003-0.03）之所有rBV。統計分析證實，AAV5生產率受Rep及Cap初始基因含量積極影響，但受GOI初始含量不利影響。觀測到總衣殼產生之類似趨勢，其轉譯至在條件下類似衣殼與載體基因體比率（cp:vg）。AAV5中BV DNA雜質之封裝係藉由追蹤距離AAV ITR近（α及β）及遠（γ及δ）之BV基因標記物的複本數來計算。結果表明MOI作用視與ITR之距離而定。增加所有rBV之MOI對接近ITR之基因座的DNA積聚發揮輕度的負面影響（α:vg及β:vg比率）。在另一方面，遠離ITR之基因座的DNA積聚（γ:vg及δ:vg比率）積極地受Rep初始基因含量影響及不利地受GOI初始含量影響。所鑑別之趨勢強調BV MOI對載體生產率及產物品質之主要影響。總體而言，吾人之資料表明，較高Rep及Cap初始含量可能引起較高生產率，但以共封裝rBV DNA雜質之額外增加為代價。此負面影響可藉由用所有rBV以類似MOI感染來緩解。吾人推測，rBV DNA雜質之封裝為Rep依賴性的，且衣殼化rBV DNA雜質之含量視Rep濃度而定。 概述

rAAV表示旨在治癒或緩解多種單基因病症之影響的最有前景的治療模式中之一者。聚焦於AAV生物學之理解以及rAAV安全性及功效之臨床評估的廣泛科學證據支持當前進行可供患者使用之基因療法的努力[Aguti S等人 Expert Opin Biol Ther 2018; 18:681-93; Ramlogan-Steel CA et. Clin Experiment Ophthalmol 2019; 47:521-36; Li C and Samulski RJ. Nat Rev Genet 2020; 21:255-72]。傳統上已藉由質體轉染在諸如HEK293之錨定依賴性哺乳動物細胞株中產生rAAV。改進特異性生產率、製程穩定性及可擴展性的需要引起使用多種宿主開發替代細胞培養方法。昆蟲細胞/rBV系統被眾人視為用於rAAV製備之最具可擴展性及生產性的系統之一。來自Robert Kotin及Masashi Urabe之開創性論文奠定昆蟲細胞/BV系統作為病毒載體產生之有效方式的基礎[Urabe M等人 Hum Gene Ther 2002; 13:1935-43; Urabe M etal. J Virol 2006; 80:1874-85]。其方法包含由昆蟲特異性啟動子控制且由其順式或反式調節性活性分佈於兩種或三種桿狀病毒中之AAV基因的排列。隨時間推移，若干組標識改進重組BV之分子設計的方式，其轉譯至更穩固的載體產生[Chen H. Mol Ther 2008; 16:924-30; Smith RH等人 Mol Ther 2009; 17:1888-96; Mietzsch M等人 Hum Gene Ther Methods 2017; 28:15-22]。

如同大多數生物製劑生產平台，詳盡的製程特性化為鑑別影響製程效能及產物品質之參數的關鍵。MOI定義為感染rBV除以細胞之總數目，熟知其在重組蛋白表現期間發揮重要作用。若干研究已描述不同MOI濃度如何影響rBV複製動力學、宿主-rBV代謝相互作用及整體蛋白質表現[Radford KM等人 Cytotechnology 1997; 24:73-81; Pastor AR等人 Vaccine 2019; 37:6962-9; Virag T等人 Hum Gene Ther 2009; 20:807-17]。在rAAV產生之情形下，此資訊僅部分適用，因為在蛋白質表現之後必須進行後續載體特異性分子事件（例如，蛋白殼組裝、rAAV DNA複製及封裝）以產生感染性載體粒子[Aponte-Ubillus JJ等人 Appl Microbiol Biotechnol 2018; 102:1045-54]。存在評估MOI對重組AAV產生之作用的大量研究。Meghrous及Aucoin使用3個rBV評估總MOI及MOI比率之作用以提供AAV基因。初始評價突出顯示使用較高MOI策略的益處（MOI ＞ 3），以及平衡的BV MOI比率對較高生產率的重要性[Meghrous J等人 Biotechnol Prog 2005; 21:154-60]。稍後報導強化較高MOI策略之研究且確認Rep BV及Cap BV MOI對感染性載體產率之積極作用[Aucoin MG等人 Biotechnol Bioeng 2006; 95:1081-92]。缺乏表徵rAAV產生方法中之異步較低MOI BV感染的研究。在較低MOI感染中，在病毒添加之後，感染一小部分細胞。二次感染回合為病毒複製之結果且引起全部細胞群體之感染。Mena等人 [Mena JA等人 J Gene Med 2010; 12:157-67]描述在3-rBV製程中使用低MOI（0.3）或高MOI（9）時相當的AAV感染性產率。接種細胞密度及進料策略之額外最佳化引起進一步產率增加。較少所瞭解的為BV MOI對rAAV產物品質之影響。載體品質與載體生產率一樣重要，因為其保證AAV衍生之轉殖基因之穩健表現及活性。DNA雜質之封裝為在rAAV產生期間已記載的現象，其中衍生自輔助質體或BV DNA之序列錯誤地衣殼化[Chadeuf G等人 Molecular Therapy 2005; 12:744-53; Wright JF. Biomedicines 2014; 2:80-97]。研究已報導，質體主鏈及rBV主鏈序列可以高達6%及3%之百分比分別存在於rAAV載體原料中[Lecomte E al. Molecular Therapy - Nucleic Acids 2015; 4:e260; Penaud-Budloo M等人 Hum Gene Ther Methods 2017; 28:148-62]。在昆蟲細胞系統之情形下，咸信不僅rBV分子設計，且上游過程參數亦可在DNA雜質封裝中起作用。需要進行更多研究以獲得關於生物輸入及細胞培養參數對形成此產物相關雜質之貢獻的線索。

大規模時，低rBV MOI策略可簡化BV擴增操作，降低操作成本且改進BV基因穩定性。因此，對低MOI策略對rAAV產生之影響的理解具有重要性。在本研究中，吾等藉由監測特定輸出，諸如單細胞生產率、衣殼與載體基因體比及rBV衍生DNA雜質之封裝，研究不同低BV MOI及基因初始比率如何影響生產率及rAAV品質。執行追蹤評估，從而構建可解釋所識別趨勢之假設。 材料及方法細胞株及培養維持

將來自草地貪夜蛾細胞株Sf9之次純系用於本發明研究。細胞在含有以5x10 ⁵個細胞/mL之初始細胞密度為目標的專用無血清培養基之搖瓶（Corning，NY）中繼代一週兩次。搖瓶在28℃下培育。 重組BV產生

設計重組穿梭載體及rBV且使用bac與bac表現系統（Thermo Fisher Scientific，CA）產生。Bac-GOI-A（轉殖基因A）及Bac-GFP-GOI-B（轉殖基因B）含有長度分別為4.6及4.8kb之側接ITR的轉殖基因。Bac-GFP-GOI-B含有由GP64啟動子控制之GFP基因，除轉殖基因B之外。桿狀病毒經由不同桿狀病毒啟動子經設計以表現Rep（例如，Rep78及Rep52）及Cap基因。另一構築體含有由另一桿狀病毒啟動子調節之dTomato螢光蛋白質表現卡匣。使用在39k啟動子控制下表現GFP之Sf9衍生的指示細胞株，藉由流動式細胞測量術確定感染性BV之定量。此滴定方法已針對其他公認方案進行評估，以確保後續實驗（資料未示出）期間所用感染倍率值（MOI）之準確性。 實驗設計

進行生物反應器研究以評估rBV MOI對AAV5生產率及BV衍生之衣殼化DNA雜質的作用。全因數實驗矩陣設計成具有JMP 14（SAS）。MOI評估範圍定義為一種對數，以防止因細胞生長或養分消耗的顯著差異所致的過程變化。在所有情況下，每器皿添加之BV體積的量表示比工作體積（3L）之0.1%低的分率。使用Dasgip控制器（Eppendorf，CT）操作生物反應器。所有接種細胞密度、感染時間、收穫時間及物理化學參數（pH、DO、溫度）在條件之間一致。上清液經歷化學處理以促進額外rAAV粒子釋放及透明的製程相關雜質。在4000×g下離心15分鐘且進行深度過濾以進一步澄清收穫物材料。

進行搖瓶中之後續研究以使在生物反應器研究期間所觀測到之趨勢一般化。測試兩種不同的GOI BV。125mL搖瓶用於測試在先前研究中所鑑別之四種代表性條件。遵循與生物反應器研究一致之接種、感染及收穫時程，獲得澄清的收集物作為最終上游物質。 AAV親和純化

將各澄清的收集物質之等分試樣與AVB瓊脂糖樹脂（賽默飛世爾科技，CA）之漿料一起在室溫及恆定攪拌下培育2小時。隨後將各AVB樹脂/收穫物混合物離心，且將粒化樹脂轉移至Acroprep過濾板（Pall Corporation，NY）中，其中將其平行處理。將樹脂用磷酸鹽緩衝溶液洗滌三次，且與低pH緩衝液一起培育3.5分鐘以溶離rAAV衣殼。使用多盤真空歧管（Pall Corporation，NY），將液體內容物自過濾板移除至96深孔培養盤。收集之溶離份在儲存之前經pH調節至7.0-7.2。 藉由數位液滴PCR之DNA定量（ddPCR）

受保護之轉殖基因及BV-衍生之DNA雜質的存在藉由ddPCR追蹤，根據Barajas等人中所描述之方案 。[Barajas D等人 PLoS One 2017;12]。進行AVB溶離劑之連續稀釋液以覆蓋所測試目標序列之廣泛濃度範圍。產生低於5000個複本/微升反應之稀釋液用於定量。適當的非模板對照總是展示低於1之複本數。使用自動化液滴產生器及讀取器（Bio-Rad Laboratories，CA）。陽性液滴之偵測及複本數確定係藉由Quantasoft軟體（Bio-Rad Laboratories，CA）進行。為確定來自細胞之VP3/18s比率，2mL細胞培養物在500×g下旋轉2分鐘，且回收細胞集結粒且在-80℃下冷凍。冷凍集結粒稍後再懸浮於TE緩衝液+ 0.5% SDS中，且在室溫下培育1小時。將此懸浮液用作ddPCR定量之起始物質。 衣殼定量

基於Octet系統（分子裝置，CA）高通量方法用於基於自抗體與衣殼結合動力學資訊使用在不同濃度下之AAV5標準材料建構之標準曲線定量總衣殼。進行稀釋以符合分析動態範圍。各樣品沿著三種稀釋液一式兩份地分析。包括陽性對照以追蹤分析精確度。 流動式細胞測量術分析

Attune NxT（Thermo Fisher Scientific，CA）用於監測表現GFP及表現dTomato之細胞隨培養時間的百分比。通道YL1及BL1用以追蹤不同訊號。在分析器上每個樣品操作收集一百萬個細胞/條件。在分析期間包括GFP陽性、dTomato陽性及陰性（未感染）對照。在BV感染後不同時間點獲取樣品。分析至少20,000個事件/樣本以計算感染百分比。 結果

在產生AAV-轉殖基因A之生物反應器中進行初步研究。決定涵蓋10倍MOI範圍以使由不同病毒負荷所引起之對細胞培養物生長效能之影響降至最低。存活率及生長速率趨勢支持所測試條件中之細胞生長及死亡趨勢的潛在可變性不顯著且不應影響關於BV MOI對生產率及產物品質之作用所產生的結論。

針對rAAV轉殖基因A vg效價及衣殼-比-載體基因體（cp:vg）比率分析澄清的收集物及親和力純化材料。使生產率標準化且其顯示於圖17中。當在rBV MOI為：GOI 0.003 / Rep 0.03 / Cap 0.03下提供AAV基因時獲得最高生產率值，而當在初始基因含量GOI 0.03 / Rep 0.003 / Cap 0.003下提供其時獲得最低值。開發統計模型以描述提供/編碼GOI、Rep及Cap之rBV之MOI及其在單細胞生產率上之相互作用的效應。在測試體積下，Cp:vg比率之範圍為1.5-3（圖18）。起初假設具有較高Rep及Cap BV MOI之條件可能由於空衣殼產生之可能性增加而展示較高比率；然而，此實驗中未證明現象。似乎合理的是，大於10倍之評估範圍可偵測衣殼化效率之顯著差異。

rBV MOI對rAAV材料品質之影響的特徵在於量化純化產物中存在之四種特異性核酸酶抗性、rBV衍生之遺傳標記物。標記物α及β定位於與AAV ITR相鄰但在桿狀病毒基因體中之rAAV載體基因體核苷酸序列外部之10千鹼基（kb）區域內，而標記物γ及δ遠離ITR，覆蓋約135kb之BV DNA基因體。表1顯示以標記物:vg比率及rBV衍生之cDNA雜質百分比形式確定之結果。表1展示rBV MOI對rBV衍生之DNA雜質的衣殼化之影響。基於個別rBV MOI及rBV MOI比率呈現實驗條件。求比率平均值（α-β，γ-δ）且標準化至條件#10。另外，推斷存在於經純化載體中之rBV-衍生之DNA雜質的百分比，使用來自Penaud-Budloo [Grosse S等人 J Virol 2017; 91]之方法論作為參考。DNA污染物之百分比係由rAAV轉殖基因之複本數、平均α-β及平均γ-δ計算；且標準化至各參考大小（AAV轉殖基因= 4.8kb；α-β接近-ITR區域= 10kb；γ-δ主鏈區域= 135kb）。平均αβ:vg或γ-δ:vg比率用於提供各區域之BV衍生之DNA雜質頻率之封裝的更代表性評估。吾人估計，增加Rep及Cap含量會促成在10kb區段內圍繞ITR之標記物的較低濃度。在較低GOI含量（0.003）下，Rep及Cap BV MOI含量自較低（0.003）至較高（0.03）變化使標準化α-β DNA比率自1.55降低至0.75（52%降低）。此外，γ-δ標記物之濃度模式不利地受GOI BV MOI影響。在經評估條件內之標準化γ-δ:vg濃度在0.98至16.09之範圍內，表明BV MOI對遠離ITR之遺傳序列具有更強影響，其不太可能成為反向封裝事件之一部分。在rAAV粒子中之BV衍生之DNA雜質百分比的估算展示（α-β + γ-δ）值在0.22-0.60%範圍內，其與先前報導比對[Penaud-Budloo M等人 Hum Gene Ther Methods 2017; 28:148-62]。總體而言，其表明，較高Rep及Cap初始含量可能引起較高生產率，但以共封裝rBV DNA雜質之額外增加為代價。此負面影響可藉由保持rBV比率更接近1來減輕。 表1

BV 比率	BV DNA 雜質之封裝
條件	GOI	Rep	Cap	標準化 α-β :vg 比率	標準化 γ - δ : vg 比率	rBV 主鏈 α-β%	rBV 主鏈 γ-δ %	rBV 主鏈總 %
1	0.003	0.03	0.03	0.75	16.09	0.18	0.42	0.6
2	0.003	0.01	0.01	1.17	9.55	0.28	0.25	0.53
3	0.01	0.03	0.03	0.99	7.09	0.24	0.19	0.43
4	0.003	0.003	0.03	1.55	4.68	0.38	0.12	0.5
5	0.03	0.03	0.03	0.76	1.48	0.18	0.04	0.22
6	0.01	0.01	0.01	0.96	2.28	0.23	0.06	0.29
7	0.01	0.01	0.01	1.27	3.21	0.31	0.08	0.39
8	0.03	0.01	0.01	0.99	0.98	0.24	0.03	0.27
9	0.01	0.003	0.003	1.28	2	0.31	0.05	0.36
10	0.03	0.003	0.003	1	1	0.24	0.03	0.27

在搖瓶中進行追蹤研究以增加對BV衍生之DNA雜質之生產率及趨勢的理解。使用不同BV集複製不同BV MOI條件：提供/編碼GOI-A、Rep及Cap（與上文相同）之rBV及提供/編碼Rep、Cap及GFP-GOI-B之經螢光標記之dTomato-rBV，以證實先前生產率趨勢。使用流動式細胞測量術及ddPCR監測感染產生螢光蛋白質之BV集的所有條件以鑑別編碼Rep或Cap感染含量之rBV、Cap表現及生產率之間的潛在相關性。流動式細胞測量術分析強調在產生AAV-GFP-GOI-B期間在感染後（hpi）90小時之經共感染細胞的百分比。BV MOI比率之顯著不平衡可引起較低共感染百分比（對於GOI 0.03 / Rep 0.003/ Cap 0.003及GOI 0.003 / Rep 0.03/ Cap 0.03條件分別為32.2%及28.9%），而在1:1:1之BV比率下的條件展示共感染百分比在68.8 - 70.6%之間。與旨在蛋白質產生之昆蟲細胞/BV製程相比，成功產生rAAV粒子需要細胞經所有BV共感染。因此，BV共感染速率可理論上影響每細胞生產率。圖19展示在具有1:1:1或更低（例如，1:＜ 1:＜ 1）之GOI/Rep/Cap BV MOI比率的條件下相當的生產率，無關於轉殖基因一致性。因為先前結果表明編碼Rep或Cap之rBV之MOI對載體產率的積極影響，所以量測感染後細胞集結粒中之VP3基因複本數。在此情況下，VP3充當用於細胞Rep或Cap複本數之代理。亦追蹤宿主細胞18s核糖體RNA基因標記物以考慮不同細胞密度。圖20比較針對各種BV MOI組合之AAV-GOI-B生產率及VP3/18s比率。生產率及VP3/18s比率基於僅共感染細胞產生「完整」AAV粒子且僅感染編碼Rep或Cap之rBV的細胞含有可偵測含量之AAV VP3 DNA的假設來調節。此等結果表明，在經調節VP3/18s DNA比率與經調節單細胞生產率之間的正相關性。總而言之，由圖19及圖20之結果確認編碼Rep或Cap之rBV的MOI對生產率之強影響。儘管在低於1:1:1（例如，1:＜ 1:＜ 1）之GOI/Rep/Cap rBV MOI比率下操作之條件似乎共感染更低數目之細胞，但此亞群含有更高Rep或Cap複本數。此作用似乎改進該特定亞群之載體生產率，使塊體細胞生產率達到類似於使用BV MOI比率等於1:1:1之條件的含量。

最後，證實編碼Rep或Cap之rBV的MOI對BV衍生之DNA雜質之衣殼化的影響。純化由提供/編碼Rep、Cap及GFP-GOI-B MOI條件之不同dTomato-rBV製備的載體粒子，且確定BV衍生之DNA雜質/衣殼含量（res DNA:cp比率）。圖21及圖22分別呈現平均α-β及γ-δ標記物之標準化、BV衍生之DNA:cp比率。與生物反應器研究類似，編碼Rep或Cap之rBV的MOI增加對α-β:cp比率具有負面影響，從而引起當GOI/Rep/Cap BV MOI比率自10（例如，10:1:1）變換至0.1（例如，0.1:1:1）時50%降低。在僅編碼Rep或Cap之rBV下產生之衣殼中BV衍生之DNA雜質的濃度與此聚集趨勢良好對齊。GOI/Rep/Cap BV MOI自10切換至0.1引起γ-δ DNA:cp比率增加約15倍，及在僅編碼Rep或Cap之rBV產生的rAAV粒子中所見之至多30倍增加。此外，不管精確MOI，用1之GOI/Rep/Cap BV MOI比率感染之條件展示類似結果。另外，編碼Rep或Cap之rBV%——在90 hpi下僅感染細胞與α-β DNA:cp比率負相關，且與γ-δ DNA:cp比率正相關。總體而言，此等結果表明，BV MOI比率不平衡朝向編碼Rep或Cap之rBV的更高MOI引起細胞亞群之偏移，其中增加細胞之百分比可能產生無轉殖基因衣殼，且無轉殖基因衣殼中之BV衍生之DNA的不成比例積聚可能轉變成rAAV衣殼中之BV衍生之DNA雜質的整體增加。此等結果亦確認BV衍生之DNA雜質之衣殼化的對比傾向，此視BV基因體中標記物之位置而定。

低rBV MOI感染策略之概念為病毒儲備製備帶來重要優點。BV儲備液之100至1000倍減少表示桿狀病毒產生之顯著操作緩解，其在大規模操作時變得最終重要性[Virag T等人 Hum Gene Ther 2009; 20:807-17]。其亦對BV遺傳穩定性具有積極影響，因為較低的BV接種物會由於接種物擴增期間之「繼代效應」而使缺陷干擾性粒子之產生降至最低[Krell PJ. Cytotechnology 1996; 20:125-37]。在rAAV製備之情形下，低BV MOI策略在昆蟲細胞/BV操作期間之效用證明關於變化MOI可影響載體粒子之產率及品質的方式之徹底研究。

隨著總BV MOI降低，在初始病毒感染期間共感染之細胞的百分比下降。後續異步感染過程受其他輸入影響，諸如細胞株行為、所用OV之數目及感染時間[Mena JA等人 BMC Biotechnol 2007; 7:39; Lee DF等人 J Virol 2000; 74:11873-80; Sokolenko S等人 Biotechnol Adv 2012; 30:766-81]。物理化學參數，諸如培養溫度亦對AAV蛋白質表現及載體產生之時序發揮作用，表明此參數可能會影響BV複製及細胞死亡動力學[Aucoin MG等人 Biotechnol Bioeng 2007; 97:1501-9]。本發明研究探索含有Rep、Cap及GOI序列之rBV之變化的MOI值，而所有其他製程參數保持恆定。資料分析突出顯示在感染過程期間Rep及Cap基因對vg生產率之積極作用。此結果與在較高MOI下藉由Meghrous及Aucoin進行之先前實驗一致[Meghrous J等人 Biotechnol Prog 2005; 21:154-60; Aucoin MG等人 Biotechnol Bioeng 2006; 95:1081-92]。Rep及Cap BV之成功感染促進rAAV DNA複製、基因體解析及封裝至預先形成之衣殼中所需之Rep蛋白質的強表現[Samulski RJ and Muzyczka N. Annual Review of Virology 2014; 1:427-51]。其亦促進AAV VP蛋白及組裝活化蛋白（AAP）之表現，後者對用於適當衣殼組裝之伴侶蛋白轉運至關重要[Grosse S等人 J Virol 2017; 91]。相關文獻之綜述顯示，以1之BV MOI比率操作為較佳的，因為其產生一致的方法效能。所獲得之結果支持安培右手定則；然而，其亦有助於相對於彼比率存在可撓性之概念。Aucoin [Aucoin MG等人 Biotechnol Bioeng 2006; 95:1081-92]表明將GOI:Rep:Cap BV比率自10:10:10（總MOI為30）降低至3:10:10（總MOI為23）產生類似的感染性效價結果，表明在同步感染過程中提供之初始轉殖基因數目（GOI）複本以相對於Rep及Cap複本數較低量需要。雖然不束縛於此理論，但本發明人假設，在低初始GOI複本數之條件下，Rep驅動之轉殖基因複製可供應豐富的經ITR側接之DNA用於後續封裝。在具有較低GOI但具有較高Rep及Cap含量之條件下，流動式細胞測量術資料表明受病毒感染位準及重複感染位準感染之細胞百分比均受潛在影響（資料未示出）。有趣的是，此類比率改進整體細胞生產率。

在本研究中亦評估BV衍生之DNA雜質的衣殼化。在Sf9生產系統中，藉由下一代定序及基於PCR之技術評估DNA雜質，以在基因體之0.2-2%範圍內之總百分比鑑別出BV及宿主細胞衍生之DNA序列，其中BV DNA為最豐富的[Penaud-Budloo M等人 Hum Gene Ther Methods 2017; 28:148-62; Kondratov O等人 Mol Ther 2017; 25:2661-75]。儘管DNA雜質以較小百分比存在，但監管衛生當局建議製造商控制此產物相關之雜質以降低任何潛在的遺傳毒性風險[FDA Briefing Document: Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting: September 19, 2012: Cell Lines Derived from Human Tumors for Vaccine Manufacture n.d.:30]。咸信上游及下游rAAV產生操作對原料藥中之DNA雜質含量具有影響。然而，缺乏評估此等假設的研究。咸信此為首次報導，其系統地表徵BV MOI對BV衍生之昆蟲細胞培養物中之經封裝DNA雜質的作用。初步結果表明，Rep及Cap BV MOI相對於GOI MOI增加會降低來自ITR相鄰基因座之BV DNA的包裝，同時增加遠離ITR之基因座的衣殼化；且此等作用不僅對比鮮明，且強度不同。此等資料描述BV衍生之DNA雜質封裝的兩種潛在機制：1）先前報導之反向封裝，其高度受ITR序列之存在影響；及2）適用於所有桿狀病毒基因體序列之Rep依賴性機制。雖然以上描述例示性實施例，但並不意欲此等實施例描述本發明之所有可能形式。相反地，說明書中使用之字詞為描述而非限制之字詞，且應理解，在不脫離本發明之精神及範疇的情況下可進行各種改變。另外，各種實施性實施例之特徵可經組合以形成本發明之另外實施例。

無

圖1為展示由提供/編碼具有所關注之基因（gene of interest, GOI）、Rep及Cap之載體基因體（vector genome, vg）的rBV產生之AAV效價（載體基因體（vg）/毫升（mL））之圖形表示。將rBV用初始Sf9細胞以0.1、0.01、0.001、0.0001及0.00001之MOI培養rBV。

圖2、3及4為用於產生指示細胞株之質體圖。圖2具有可操作地連接至39k啟動子序列之編碼增強之綠色螢光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）的核苷酸序列。圖3具有可操作地連接至p6.9啟動子序列之編碼eGFP的核苷酸序列。圖4具有可操作地連接至聚角體蛋白（polyhedrin, Polh）啟動子序列之編碼eGFP的核苷酸序列。

圖5展示未經轉染之Sf9細胞的流動式細胞測量術資料。虛線為展示綠色螢光之閘，其中約0.1%之細胞展現出螢光。

圖6展示經含有可操作地連接至39k啟動子序列之eGFP核苷酸序列的質體轉染之Sf9細胞之流動式細胞測量術資料。細胞尚未經rBV轉染。虛線為展示綠色螢光之閘，其中約0.1%之細胞展現出螢光。

圖7、8及9展示經含有可操作地連接至39k啟動子序列、p6.9啟動子序列或Polh啟動子序列之eGFP核苷酸序列之質體轉染的Sf9細胞之流動式細胞測量術資料。此等細胞經rBV感染。虛線為展示綠色螢光之閘。對於圖7，55.5%之39k啟動子細胞展現出綠色螢光。對於圖8，11%之p6.9啟動子細胞展現出綠色螢光。對於圖9，2%之Polh啟動子細胞展現出綠色螢光。

圖10、11及12為展示rBV感染後之時eGFP表現的圖形表示。在如圖10中所示之rBV感染後19小時，55.5%之39k啟動子細胞展現出綠色螢光，11%之p6.9啟動子細胞展現出綠色螢光，且2%之Polh啟動子細胞展現出綠色螢光。在如圖11中所示之rBV感染後40小時，65.4%之39k啟動子細胞展現出綠色螢光，19%之p6.9啟動子細胞展現出綠色螢光，且11%之Polh啟動子細胞展現出綠色螢光。在如圖12中所示之rBV感染後68小時，66.3%之39k啟動子細胞展現出綠色螢光，19%之p6.9啟動子細胞展現出綠色螢光，且15%之Polh啟動子細胞展現出綠色螢光。

圖13為展示在rBV感染後之時39k啟動子細胞之eGFP表現的圖形表示。表現eGFP之39k啟動子細胞的百分比為41.1%（15小時）、39.9%（18小時）、40.7%（24小時）、68.0%（43小時）、66.4%（65小時）、67.3%（70小時）及69.3%（94小時）。

圖14、15及16為比較含有編碼eGFP或針對昆蟲細胞中之表現最佳化的eGFP密碼子之核苷酸序列之表現細胞的圖形表示。在如圖14中所示之20小時時，針對39k啟動子細胞之密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自56.5%增加至57.8%，及針對PolH啟動子細胞之經密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自4.0%增加至10.5%。在如圖15中所示之25小時時，針對39k啟動子細胞之密碼子最佳化eGFP序列的使用引起表現eGFP之細胞的百分比基本上無差異（56.6%及55.9%），及針對PolH啟動子細胞之經密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自4.8%增加至12.0%。在如圖16中所示之48小時時，針對39k啟動子細胞之密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自58.5%增加至59.3%，及針對PolH啟動子細胞之經密碼子最佳化eGFP序列的使用使表現eGFP之細胞的百分比自10.9%增加至17.5%。

圖17及18突顯rBV MOI對rAAV5生產率之作用的統計分析。圖17為展示標準化生產率之圖形表示，值相對於第一條件而表示（GOI 0.01 / Rep 0.01 / Cap 0.01）。圖18為展示自經rBV感染之不同實驗細胞培養條件獲得之衣殼與vg比率的圖形表示。

圖19及20展示rBV MOI及rBV共感染對AAV5生產率之影響。圖19為展示使用兩種不同rBV轉殖基因集在四個實驗條件間之生產率的圖示。對於各集，值相對於其GOI 0.03 / Rep 0.003 / Cap 0.003條件而標準化。圖20為展示在標準化生產率與Cap複本數（VP3/18s）之間比較之圖形表示。峰值細胞密度基於經共感染細胞之百分比而調整。對於VP3/18s比率（菱形顯示），基於表現dTomato之細胞的百分比而調節終值。經調節輸出之間的相關係數為0.849。

圖21及22展示Rep及Cap BV MOI對封裝桿狀病毒DNA雜質之影響。圖21為展示在經GOI-B-rBV、Rep rBV及Cap rBV感染之條件下平均α-β:cp的圖形表示。圖22為展示在經GOI-B-rBV、Rep rBV及Cap BV感染之條件下平均δ-γ:cp的圖形表示。值經標準化至第一條件，GOI 0.03 / Rep 0.003 / Cap 0.003。自經核酸酶處理之澄清的收集物進行分析。包括僅GOI-B-rBV及僅Rep Cap-rBV及僅Cap-rBV條件作為對照。

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Claims (41)

1. 一種用於產生重組腺相關病毒（rAAV）之方法，該方法包含以下步驟： 用至少一種重組桿狀病毒（rBV）感染細胞，其中該至少一種rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列；及 培養經感染細胞以產生rAAV； 其中在感染步驟之前，至少一種rBV係自至少一種包含經該等核苷酸序列中之至少一者轉染的細胞之細胞培養物分離。
2. 一種用於產生重組腺相關病毒（rAAV）之方法，該方法包含以下步驟： 用至少一種重組桿狀病毒（rBV）感染細胞，其中該至少一種rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列；及 培養該等經感染細胞以產生rAAV； 其中在該感染步驟之前，該至少一種rBV係 自至少一種包含細胞的細胞培養物分離，該細胞 具有桿狀病毒基因體之至少一部分，且 經至少一種核苷酸序列轉染，該至少一種核苷酸序列與桿狀病毒基因體之至少一部分組合以形成能夠產生rBV之桿狀病毒基因體。
3. 一種用於產生重組腺相關病毒（rAAV）之方法，該方法包含以下步驟： 用第零代（P0）重組桿狀病毒（rBV）感染細胞，其中該rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列；及 培養該等經感染細胞以產生rAAV。
4. 一種用於產生重組腺相關病毒（rAAV）之方法，該方法包含以下步驟： 用以低於0.01之感染倍率（MOI）之重組桿狀病毒（rBV）感染細胞，其中該rBV具有用於產生rAAV之核苷酸序列；及 培養該等經感染細胞以產生rAAV。
5. 如請求項4之方法，其中該MOI為0.002或更低。
6. 如請求項4之方法，其中該MOI低於10 E-4。
7. 如請求項4之方法，其中該MOI低於10 E-5。
8. 如請求項4之方法，其中該rBV為第零代（P0）rBV。
9. 如請求項4之方法，其中該rBV包含具有用於rAAV載體基因體之核苷酸序列的第一rBV及一個或多個具有編碼Rep及Cap蛋白質之核苷酸序列的第二rBV，且該等細胞係以介於0.01至10.0範圍內之該第一rBV MOI:該一個或多個第二rBV MOI之比率感染。
10. 如請求項4之方法，其中所產生之rAAV具有低於1E-9奈克/奈克衣殼化rAAV載體基因體之濃度的衣殼化桿狀病毒核苷酸序列。
11. 如請求項4之方法，其中所產生之rAAV具有低於1E-2複本/衣殼化rAAV載體基因體之複本之濃度的編碼桿狀病毒DNA聚合酶之至少一部分的衣殼化桿狀病毒核苷酸序列。
12. 如請求項4之方法，其中所產生之rAAV具有低於1E-3複本/衣殼化rAAV載體基因體之複本之濃度的衣殼化細胞18S核糖體RNA基因核苷酸序列。
13. 一種用於增加重組腺相關病毒（rAAV）之產生且減少在所產生之rAAV內之衣殼化之核苷酸雜質的方法，該方法包含以下步驟： 用具有用於rAAV載體基因體之核苷酸序列的第一重組桿狀病毒（rBV）及一個或多個具有編碼Rep及Cap蛋白質之核苷酸序列的第二rBV感染不同細胞培養物，其中各細胞培養物經該第一rBV及該一個或多個第二rBV以該第一rBV感染倍率（MOI）:該一個或多個第二rBV MOI之不同比率感染； 自該等不同細胞培養物中分離rAAV； 確定自該等不同細胞培養物中分離之rAAV的效價； 確定自該等不同細胞培養物中分離之rAAV內之衣殼化核苷酸雜質的濃度；及 根據兩種確定步驟鑑別一種或多種該第一rBV MOI:該一個或多個第二rBV MOI之一種或多種比率。
14. 一種量測重組桿狀病毒（rBV）效價之方法，該方法包含以下步驟： 用rBV感染指示細胞，其中該等指示細胞具有可操作地連接至由桿狀病毒感染活化之誘導性桿狀病毒啟動子序列的報導核苷酸序列，其中該誘導性桿狀病毒啟動子序列選自早期桿狀病毒啟動子序列及中間桿狀病毒啟動子序列中之至少一者； 量測該報導核苷酸序列之表現；及 自該報導核苷酸序列之表現確定rBV效價。
15. 如請求項14之方法，其中該報導核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒衍生之強化子序列。
16. 如請求項14之方法，其中該報導核苷酸序列之表現係使用流動式細胞測量術來量測。
17. 如請求項14之方法，其中該確定步驟在該感染步驟之後3小時或更久進行。
18. 一種用於產生用於量測重組桿狀病毒（rBV）效價之指示細胞的方法，該方法包含將包含可操作地連接至由桿狀病毒感染活化之誘導性桿狀病毒啟動子序列之報導核苷酸序列之載體轉染至細胞中之步驟，其中該誘導性桿狀病毒啟動子序列選自早期桿狀病毒啟動子序列及中間桿狀病毒啟動子序列中之至少一者。
19. 如請求項18之方法，其中該報導核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒衍生之強化子序列。
20. 如請求項18之方法，其中該載體進一步包含可操作地連接至表現控制序列之抗性核苷酸序列。
21. 如請求項20之方法，其進一步包含培養該細胞且陽性選擇至少一個其中穩定地維持該載體之細胞的步驟。
22. 如請求項18之方法，其進一步包含培養該細胞、自該培養物中分離一細胞且單獨地培養該經分離之細胞的步驟。
23. 如請求項14或18之方法，其中該報導核苷酸序列編碼報導蛋白。
24. 如請求項14或18之方法，其中該誘導性桿狀病毒啟動子序列選自39K啟動子、p6.9啟動子、gp64啟動子、Polh啟動子及p10啟動子中之至少一者。
25. 如請求項18之方法，其中該報導核苷酸序列及該誘導性桿狀病毒啟動子序列穩定地維持於該細胞內。
26. 如請求項19之方法，其中該報導核苷酸序列、該誘導性桿狀病毒啟動子序列及該桿狀病毒衍生之強化子序列穩定地維持於該細胞內。
27. 如請求項1、2、3、4、14及18中任一項之方法，其中該等細胞為昆蟲細胞。
28. 如請求項1、2、3、4、14及18中任一項之方法，其中該等細胞為源自草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）、白線斑蚊（ Aedes albopictus） 、家蠶（ Bombyxmori） 、粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni） 、黑巫婆飛蛾（ Ascalapha odorata） 、果蠅屬（ Drosphila） 、瘧蚊屬（ Anophele） 、家蚊屬（ Culex）或斑蚊屬（ Aedes）之昆蟲細胞。
29. 如請求項1、2、3、4、14及18中任一項之方法，其中該等細胞為Sf9細胞、High Five細胞、Se301細胞、SeIZD2109細胞、SeUCR1細胞、Sf900+細胞、Sf21細胞、BTI-TN-5B1-4細胞、MG-1細胞、Tn368細胞、HzAm1細胞、BM-N細胞、Ha2302細胞、Hz2E5細胞或Ao38細胞。
30. 如請求項13之方法，其中該等細胞培養物各自包含昆蟲細胞。
31. 如請求項13之方法，其中該等細胞培養物各自包含源自草地貪夜蛾、白線斑蚊、家蠶、粉紋夜蛾、黑巫婆飛蛾、果蠅屬、瘧蚊屬、家蚊屬或斑蚊屬之昆蟲細胞。
32. 如請求項13之方法，其中該等細胞培養物各自包含選自Sf9細胞、High Five細胞、Se301細胞、SeIZD2109細胞、SeUCR1細胞、Sf900+細胞、Sf21細胞、BTI-TN-5B1-4細胞、MG-1細胞、Tn368細胞、HzAm1細胞、BM-N細胞、Ha2302細胞、Hz2E5細胞或Ao38細胞之細胞。
33. 一種細胞，其包含可操作地連接至由桿狀病毒感染活化之誘導性桿狀病毒啟動子序列之報導核苷酸序列，其中該誘導性桿狀病毒啟動子選自早期桿狀病毒啟動子序列及中間桿狀病毒啟動子序列中之至少一者； 其中該報導核苷酸序列及該誘導性桿狀病毒啟動子序列穩定地維持於該細胞內。
34. 如請求項33之細胞，其中該報導核苷酸序列可操作地連接至桿狀病毒衍生之強化子序列，且該桿狀病毒衍生之強化子序列係穩定地維持於該細胞內。
35. 如請求項33之細胞，其中該報導核苷酸序列編碼報導蛋白。
36. 如請求項31之細胞，其中該誘導性桿狀病毒啟動子序列選自39K啟動子、p6.9啟動子、gp64啟動子、Polh啟動子及p10啟動子中之至少一者。
37. 如請求項33之細胞，其中該細胞為昆蟲細胞。
38. 如請求項33之細胞，其中該細胞為源自草地貪夜蛾、白線斑蚊、家蠶、粉紋夜蛾、黑巫婆飛蛾、果蠅屬、瘧蚊屬、家蚊屬或斑蚊屬之昆蟲細胞。
39. 如請求項33之細胞，其中該細胞為Sf9細胞、High Five細胞、Se301細胞、SeIZD2109細胞、SeUCR1細胞、Sf900+細胞、Sf21細胞、BTI-TN-5B1-4細胞、MG-1細胞、Tn368細胞、HzAm1細胞、BM-N細胞、Ha2302細胞、Hz2E5細胞或Ao38細胞。
40. 如請求項33之細胞，其進一步包含可操作地連接至表現控制序列之抗性核苷酸序列。
41. 如請求項40之細胞，其中該抗性核苷酸序列及表現控制序列穩定地維持於該細胞內。

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