TW202303150A

TW202303150A - Mhc分子的絕對定量方法

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Publication number: TW202303150A
Application number: TW111107638A
Authority: TW
Inventors: 克里斯托夫施拉德; 海科舒斯特; 莉娜弗洛伊登曼; 利達羅斯托克; 萊納斯貝克特; 邁克爾羅曼斯; 丹尼爾科瓦萊夫斯基
Original assignee: 德商英麥提克生物技術股份有限公司
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2022-03-03
Publication date: 2023-01-16
Also published as: EP4302097A2; WO2022184832A2; KR20230154216A; CA3209522A1; WO2022184832A3; AU2022231377A1; US20220283176A1

Abstract

本發明係關於一種用以對一測試樣品中之一或多個MHC分子進行絕對定量之方法，所述測試樣品包含至少一細胞，且該方法至少包含以下步驟：對測試樣品進行均質化處理；將一內標準品添加至測試樣品內；在將內標準品添加至測試樣品之前或之後，以一蛋白酶對均質化之測試樣品進行消化處理；對經由消化處理所取得之測試樣品進行純化處理，使其進行一色層分析及/或光譜分析之步驟；以及對該測試樣品中之一或多個MHC分子進行定量。本發明亦關於用以判定一測試樣品中細胞數之方法。

Description

MHC分子的絕對定量方法

本發明係關於MHC分子之絕對定量方法。

主要組織相容複合體(major histocompatibility complex，MHC)是多數脊椎動物所共有6號染色體上之基因簇，用以編碼不同基因，對組織相容性及後天免疫系統具有重要影響。在人體中，此基因簇通常亦稱為人類白血球抗原(human leukocyte antigen，HLA)。MHC第一型分子表達於哺乳動物體內除紅血球以外之所有細胞，其主要功能為將源自細胞內或內吞蛋白質之短肽呈遞至胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL) (參見「Boniface and Davis, 1995」、「Goldberg and Rizzo, 2015b」、「Gruen and Weissman, 1997」、「Rock and Shen, 2005」)。除T細胞受體 (T cell receptor，TCR)之外，CTL亦表達CD8輔助受體。當一CTL之CD8受體對接至目標細胞上之MHC第一型分子時，若CTL之TCR符合MHC第一型分子與所呈遞胜肽之複合體所代表之表位，CTL會藉由釋出大量細胞溶解酵素或使細胞經歷由細胞凋亡造成之計畫性細胞死亡而觸發目標細胞裂解(參見「Boniface and Davis, 1995」、「Delves and Roitt, 2000」、「Lustgarten et al., 1991」)。因此，MHC第一型分子可幫助調節細胞免疫力，做為人體對抗細胞內病原體之主要手段，例如病毒及包括L型細菌或志賀氏屬(Shigella)及立克次體屬(Rickettsia)等細菌種類在內之些許細菌(參見「Goldberg and Rizzo, 2015b」、「Madden et al., 1993」、「Ray et al., 2009」)。此程序對於免疫反應及對例如癌症等腫瘤疾病之防禦亦極為重要 (參見「Coley, 1991」、「Coulie et al., 2014」、「Urban and Schreiber, 1992」)。

異質二聚結構之MHC第一型分子，係由一編碼在MHC基因簇中之多態重α亞基與一基因在MHC基因座之外位於染色體15號之小型恆定β2微球蛋白(β2m)亞基所組成。多態α鏈具有一由三個結構域α1、α2及α3所構成之N端胞外區域、一使MHC分子得以連接細胞表面之穿膜螺旋、及一短胞質尾。其中兩個結構域α1與α2在兩個長α螺旋之間形成一胜肽結合槽，其槽底是由八個β股構成。類免疫球蛋白域α3涉及與CD8輔助受體之相互作用。恆定β2m使複合體具有穩定性，且參與CD8輔助受體對胜肽-MHC第一型分子複合體之辨識。β2m與α亞基為非共價鍵結，且為位於胜肽結合槽底部之若干口袋所固定。在不同人類HLA對偶基因之間差異很大之胺基酸(AA)側鏈填補結合槽之中央及最寬部分，而保守側鏈則聚集於結合槽之狹窄兩端。多態胺基酸殘基完全左右個別HLA分子所結合胜肽之生物化學特性(參見「Boniface and Davis, 1995」、「Falk et al., 1991」、「Goldberg and Rizzo, 2015a」、「Rammensee et al., 1995」)。

在人體中，MHC第一型基因簇之特徵為其多態性(polymorphism)及多基因性(polygenicity)。每一染色體將HLA-A、-B及-C對偶基因共同編碼以構成HLA第一型單倍型。因此，最多六個標準HLA第一型分子可表達在同一細胞表面；HLA-A、-B與-C同種異型(allotype)之實施例組合示於下表。IPD-IMGT/HLA資料庫(3.42.0號發布，2020-10-15)於2020年12月共包含6,291種HLA-A對偶基因 (3,896種蛋白質)、7,562種 HLA-B對偶基因(4,803種蛋白質)、及6,223種HLA-C對偶基因(3,618種蛋白質) (參見「Robinson et al., 2015」)。

HLA-A	HLA-B	HLA-C
A*02:01	B*40:02	C*03:04
A*24:02	B*52:01	C*12:02

於多因子疾病發展中，遺傳預先傾向性(genetic predisposition)代表一包括但不限於個體HLA對偶基因之組成之共同元素。例如僵直性脊椎炎(HLA-B*27)等自體免疫疾患、腹腔疾病(HLA-DQA1*05:01–DQB1*02:01或HLA-DQA1*03:01–DQB1*03:02)、猝睡症(HLA-DQB1*06:02)、或第一型糖尿病(HLA-DRB1*04:01–DQB1*03:02)均與HLA頗有淵源(參見「Caillat-Zucman, 2009」)。此外，特定HLA同種異型顯然於對人類免疫缺乏病毒或瘧疾寄生物之接觸傳染風險及感染途徑方面有所影響(參見「Hill et al., 1991」、「The International HIV Controllers Study et al., 2010」、「Trachtenberg et al., 2003」)。除此之外，個別HLA基因型亦決定對於癌症免疫療法之反應：雖然HLA-A、-B與-C對偶基因之最大雜合性有利於檢查點抑制，HLA-B*15:01據報會減弱新抗原導向的CTL反應 (參見「Chowell et al., 2018」)。

MHC分子是允許免疫系統結合以辨識並耐受其本身(自動辨識)之組織抗原。MHC分子並對於與MHC異二聚體複合並作為潛在外來抗原型態呈遞予T細胞之胞內胜肽具有分子伴侶之功能(參見「Felix and Allen, 2007」、「Stern and Wiley, 1994」)。

MHC分子與TCR及不同輔助受體相互作用，以於抗原結合親和力及特異性以及訊號轉導效力等方面優化TCR與抗原相互作用之結合條件(參見「Boniface and Davis, 1995」、「Gao et al., 2000」、「Lustgarten et al., 1991」)。

MHC-胜肽複合體本質上為自體抗原/同種抗原之複合體。結合時，T細胞原則上容許自體抗原，但接觸同種抗原時則會發生作用。當此原則崩壞時即會出現疾病狀態(特別是自體免疫) (參見「Basu et al., 2001」、「Felix and Allen, 2007」、「Whitelegg et al., 2005」)。

在MHC第一型分子上，細胞呈遞之胞質溶膠胜肽主要是來自蛋白質轉換更新及缺陷核醣體產物之自體胜肽(參見「Goldberg and Rizzo, 2015b」、「Schwanhausser et al., 2011, 2013」、「Yewdell, 2003」、「Yewdell et al., 1996」)。此等胜肽多半具有延長構造，通常為8至12個胺基酸殘基長，但亦可能稍長於此(參見「Guo et al., 1992」、「Madden et al., 1993」、「Rammensee, 1995」)。感染病毒及微生物等胞內病原體時以及在癌變過程中，外源蛋白或與惡性轉化有關之蛋白亦會在MHC第一型分子所承載之蛋白酶體中降解，並進一步展現於細胞表面(參見「Goldberg and Rizzo, 2015b」、「Madden et al., 1993」、「Urban and Schreiber, 1992」)。此外，一種名為交叉呈遞之現象可將胞外抗原裝載於MHC第一型分子，藉此可使樹突細胞(dendritic cell，DC)啟動初始CTL (參見「Rock and Shen, 2005」)。T細胞可偵測在MHC分子中展現0.1%-1%之胜肽，且能以此喚起免疫反應 (參見「Davenport et al., 2018」、「Sharma and Kranz, 2016」、「Siller-Farfan and Dushek, 2018」、「van der Merwe and Dushek, 2011」)。

由MHC第一型分子展現之胜肽依其起源而可分為「腫瘤相關胜肽」(tumor-associated peptide，TUMAP)、「病毒衍生胜肽」、或更常見之「病原體衍生胜肽」(參見「Coulie et al., 2014」、「Freudenmann et al., 2018」、「Kirner et al., 2014」、「Urban and Schreiber, 1992」)。

目前技術已將MHC第一型分子、藉其所呈遞之胜肽、及T細胞受體間之相互影響用於治療介入，包括 (i) 疫苗接種、(ii) TCR療法、及(iii) 過繼性T細胞療法 (參見「Dahan and Reiter, 2012」、「He et al., 2019」、「Hilf et al., 2019」、「Kuhn et al., 2019」、「Rosenberg et al., 2011」、「Velcheti and Schalper, 2016」)。

TUMAP之疫苗接種已用於預備並啟動免疫系統以對抗癌症，其活化反應之過程包含疫苗接種、引發、增殖與排除。於疫苗接種步驟，將TUMAP連同佐劑/免疫調節劑經皮膚內施用，以創造發炎反應而召集免疫細胞(樹突細胞)並促其成熟。於引發步驟，再次施用TUMAP使其結合真皮內樹突細胞(DC)，並於此將之加載到MHC第一型分子上。而後DC遷移至淋巴結，在此活化(「啟動」)初始T細胞，使T細胞經由其TCR特別辨識疫苗中所用之TUMAP。T細胞備妥後，其數量會迅速增加(株落增殖)，並離開淋巴結，而開始搜尋在其MHC上出現與引發過程時促使活化者完全相同TUMAP之腫瘤細胞。一旦覓得目標細胞，T細胞即對腫瘤細胞展開溶解/凋亡攻擊(參見「Hilf et al., 2019」、「Kirner et al., 2014」、「Molenkamp et al., 2005」)。

另一類替代治療方式採用經改造之可溶TCR，使其呈遞於MHC上時辨識特定病源體衍生胜肽或腫瘤相關胜肽(參見「Dahan and Reiter, 2012」、「He et al., 2019」)。此種TCR帶有能夠結合T細胞之免疫調節部分，例如對CD3具有親和力之片段，CD3是一種在T細胞上大量存在的分子。藉由此一機制，可將T細胞導向疾病所在之處，並對目標細胞展開溶解/凋亡攻擊(參見「Chang et al., 2016」、「Dao et al., 2015」、「He et al., 2019」)。可溶TCR勝於抗體類 (免疫)療法之最大優勢在於將可能目標範圍擴大至胞內蛋白質，而非僅限於一般抗體形式所可觸及之細胞表面抗原(參見「Dahan and Reiter, 2012」、「He et al., 2019」)。

於過繼性T細胞療法中，先分離出病患本身之T細胞，任選地富集具有所需抗原特異性的克隆，於體外擴增，而後再次注入病患體內。分離出之自體取得T細胞可再經修改，以表達經再造後可辨識特定病源體衍生胜肽或腫瘤相關胜肽之TCR。以此方式，可教導此等T細胞結合疾病部位之細胞，並對目標細胞發起溶解/凋亡攻擊。亦可對配備有嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)之T細胞加入共刺激分子(例如CD40配體)，以進一步強化觸發之抗腫瘤免疫反應(參見「Kuhn et al., 2019」、「Rosenberg et al., 2011」)。

上述所有方案皆以MHC第一型分子為關鍵元素。因此，若能對樣品中之特定MHC第一型亞型分子進行絕對定量，應可更利於評估MHC第一型分子在特定治療方案中之質與量關聯性。

例如，具備以下能力將極有助益：

a) 預測上述治療方法之治療範圍(therapeutic window)，及/或

b) 判斷樣品中是否表達特定MHC亞型，進而得以評估特定治療方法是否適用，及/或

c) 評估特定疾病狀態或所用治療方法是否與MHC數量變化相關。

Caron等人(2015)提供一種MHC定量方法，其先以非變性洗滌劑處理並溶解細胞，隨後將複合體裂解物施用於結合有對MHC類型或同種異型特異性之單株抗體(mAb)之親和管柱，使MHC胜肽複合體沉澱(參見「Caron et al., 2015」)。但由於樣品材料易於損失，此一免疫沉澱步驟容易發生失誤，因而導致定量不精確。

Apps等人(2015)提供正常細胞與感染HIV細胞中不同HLA第一型蛋白質之相對定量方法。為此目的，其利用來自培養所得B-LCL (B淋巴母細胞) 或PBL(外周血淋巴细胞)的經消化免疫沉澱物，所述PBL用胰蛋白酶從正常捐贈者身上新鮮分離後經分析、消化，並以液相層析法結合使用LTQ Orbitrap XL質譜儀(Thermo Fisher Scientific)之串聯式質譜法(LC-MS/MS)純化(參見「Apps et al., 2015」)。

為鑑別MHC亞型HLA-A*02:01、HLA-B*44:02、HLA-C*05:01及 HLA-E，並對之進行相對定量，上述作者採用分別包含每一MHC亞型兩種及四種胜肽之胜肽組。此等胜肽之序列對應於HLA-A*02:01、HLA-B*44:02、HLA-C*05:01、及HLA-E各自之延伸部分、結構域、或表位(對於整組四種不同HLA總計使用十一種胜肽)。「重型」同位素標記胜肽組及「輕型」未標記胜肽組均有使用(參見「Apps et al., 2015」)。

將重型同位素標記胜肽添加於樣品中。以增量之合成「輕型」胜肽混合定量之「重型」胜肽，加入生物樣品後進行分析，藉此產生每種胜肽之校正曲線，並據此為各種免疫沉澱MHC蛋白質進行相對定量(參見「Apps et al., 2015」)。

因此，上述作者能夠於取自正常捐贈者之新鮮分離PBL上判定，HLA-A與HLA-B蛋白質之表達程度相仿，但較HLA-C高出四至五倍。HLA-E之表達程度較HLA-C低25倍。在感染HIV之細胞上，HLA-A及HLA-B減少的幅度因受感染之培養細胞而異 (參見「Apps et al., 2015」)。

然而，Apps等人之方法並不適合用於樣品中MHC分子之絕對定量，原因在於：

a) 待分析樣品係以免疫沉澱方式取得，但部分MHC蛋白質體會在此過程中損失，以及

b) 所用校正曲線並未考慮MHC蛋白質，僅是以定量之「重型」胜肽為背景滴定增量之合成「輕型」胜肽。

再者，Apps等人之方法亦不適用於不同樣品中MHC分子之全稱量化。

並且，Apps等人並未考量細胞密度計數，因此無法達成本發明較佳實施例所可實施之絕對定量。

又，Apps等人之方法無法擴展至其他包含其他HLA同種異型之樣品，僅適用於在此所揭露之個別樣品。

更何況，就技術上而言，所定量之對象為胜肽，並非整個HLA蛋白質，通過計算不同數量之中位數而確定一組代表特定HLA亞型之各個胜肽之數量變化。但每組僅包含二至四種胜肽，使得此種方法可靠度較差。

因此，本發明之另一目的在於，提供用以預測上述任一治療方法之治療範圍之手段。

本發明之另一目的在於，提供用以判斷樣品中是否表達特定MHC亞型，進而得以評估是否能夠使用特定治療方法之手段。

本發明之再一目的在於，提供針對特定樣品中至少一MHC亞型之數量判定之手段。

下文將就本發明及其特徵之整體優點詳細說明。

以下討論本發明之第一態樣，其關於一種新穎且具發明性之方法，用以判定樣品中之MHC含量。就技術上而言，此方法與根據本發明第二態樣之樣品中細胞數定量方法多所重疊。因此，就本發明第一態樣所討論之較佳實施例應視為亦就第二態樣揭露，反之亦然。

根據本發明之所述第一態樣，一種對包含至少一細胞之測試樣品中一或多個MHC分子進行絕對定量之方法，其至少包含以下步驟：

a) 對測試樣品進行均質化處理；

b) 將一內標準品添加至該測試樣品內；

c) 在將該內標準品添加至該測試樣品之前或之後，以一蛋白酶對該均質化之測試樣品進行消化處理；

d) 使消化後之測試樣品進行一色層分析及/或光譜分析之步驟；以及

e) 對該測試樣品中之該一或多個MHC分子進行定量。

於本文中，「MHC分子」意指主要組織相容複合體分子。此類分子存在於多數細胞之細胞表面，並於此展現短肽，所述短肽即蛋白質之分子片段。例如，其可呈現病原體衍生胜肽，導致免疫系統之T細胞藉由T細胞受體辨識特定胜肽-MHC複合體(pMHC)後，對受感染細胞加以消滅。

於本文中，「測試樣品」意指其中具有一或多個待定量MHC分子之樣品。此種測試樣品可例如為組織樣品，隨選為腫瘤組織樣品、細胞株(初代細胞株或永生細胞系)。測試樣品(在此亦稱為「樣品」)之其他較佳實施例見本文之其他說明。

於本文中，「校正樣品」意指包含一變化濃度之MHC分子標準品之樣品。

於本文中，「MHC分子標準品」意指HLA單體。此等HLA單體為pHLA單體，亦即胜肽與其複合之HLA單體。可選地，所述HLA單體可以重組方式製作而成。可選地，所述以重組方式製作而成之HLA單體可經重新摺疊。

於本文中，「樣品胜肽類似物」意指摻入(「添加入(spiked)」)測試樣品之胜肽，所述胜肽與測試樣品經蛋白酶消化後所取得之胜肽具有相同或相似特徵(例如序列)。

在一實施例中，於步驟c)之後及步驟d)之前，對經消化處理取得之測試樣品進行純化處理。

於些許實施例中，所述樣品胜肽類似物係經同位素標記，如本文另行說明者。於些許實施例中，所述樣品胜肽類似物至少於C端或N端包含一胺基酸之外伸，如本文另行說明者，因此於蛋白酶消化作用之後，產生之消化作用產物在長度及序列上均與測試樣品經蛋白酶消化所取得之胜肽完全相同。

於些許實施例中，上述樣品胜肽類似物係包含在所稱內標準品之中。

於本文中，「詢問蛋白(query proteins)」意指待確定數量之蛋白。此係關於，例如，(i) β-2-微球蛋白(β2m)、(ii) MHC蛋白(例如不同的HAL同種異型)、及(iii)其蛋白之豐度(abundance)大致與該測試樣品中之總細胞數成比例(例如組蛋白)。

與Apps等人及Caron等人之方法相反，本實施例方法中待分析之樣品並非經免疫沉澱取得(此程序會造成MHC蛋白質體損失)，而是直接處理，因此確實適用於樣品中MHC分子之絕對定量。其他勝於Apps等人方法之優點詳見本文之其他說明。

根據一種實施例，用於消化測試樣品之蛋白酶為胰蛋白酶。胰蛋白酶之些許特性使其特別適用於本發明之方法。其切割模體(cleavage motives)示於下表，箭號指示切割位點： ↓ N’-[…]-X1-K/R-X2-[…]-C’ N’-[…]-W--K---P-[…]-C’ N’-[…]-M--R---P-[…]-C’

其中，X ₂不可為P (Pro)。由於切割位點相對簡易，胰蛋白酶所切成之片段較短，且因切割位點包含帶電荷胺基酸(K (Lys)或R (Arg))，切割後之片段具有相對固定之質荷比(mass-to-charge ratio)。

在質譜法中，固定質荷比(符號為m/z、m/e)有助於確保光譜之解析度不受電荷誘發之假影所影響。

根據一種實施例，將蛋白酶，特別是胰蛋白酶，固定於一基質上，例如具特異性之微珠。以此方式，可於進一步處理程序前將蛋白酶自樣品中移除。

適用於以上目的之可商購套件例如為SMART Digest™套件(Thermo Scientific™)。此套件包含固定在特定微珠上之豬胰蛋白酶。

根據一種實施例，消化作用於≥ 45與≤ 75 °C間之溫度下進行。根據一種實施例，利用平面迴轉式震盪器以≥ 1000且≤ 2000 rpm之速度進行消化。根據一種實施例，消化作用之持續時間為≥ 80且≤ 120分鐘間。

於一特定實施例中，利用平面迴轉式震盪器於70°C以1400 rpm之速度進行消化105分鐘。

根據一種實施例，所述方法進一步包含在消化處理前判定該測試樣品中總蛋白質濃度之步驟。

根據一種實施例，測試樣品中之總蛋白質濃度係經由BCA (bicinchoninic acid)測定法判定。BCA測定主要仰賴兩種反應。首先，蛋白質中之胜肽鍵將硫酸銅(II)中的Cu ²⁺離子還原為Cu ⁺(溫度依賴性反應)。所還原之Cu ²⁺量與溶液中之蛋白質含量成比例。其次，BCA之兩種分子與同一Cu ⁺離子螯合，形成能夠強力吸收波長562 nm光線之紫色複合物。

溶液中之蛋白質含量，係可經由測量吸收光譜並與已知濃度之蛋白質溶液比較而定量。

該方法詳情如Olson與Markwell之文獻所載，其內容經參照合併於此以利本發明之實施(參見「Olson and Markwell, 2007」)。

根據本發明方法之一種實施例，在均質化處理之前或之後，該測試樣品並不經免疫沉澱處理且不是由免疫沉澱取得。

根據本發明方法之一種實施例，測試樣品係選自由下列項目所構成之群組：

1) 一包含蛋白質之生物樣品萃取物；

2) 一初代非培養而得之樣品；及/或

3) 取自一或多個細胞株之樣品。

根據一種實施例，所述初代非培養樣品係選自由下列項目所構成之群組：一組織樣品、一血液樣品、一腫瘤樣品、或一受感染組織之樣品。

根據一種實施例，所述初代非培養樣品為一塊組織。根據一種實施例，初代非培養樣品為切片。根據一種實施例，初代非培養為抹片樣品。根據一種實施例，初代非培養樣品為細針抽取活檢 (FNA)或採樣(FNS)

根據一種實施例，所述初代非培養樣品為新鮮樣品。根據一種實施例，所述初代非培養樣品為冷凍樣品。在又一實施例中，所述初代非培養樣品為以其他方式保存之樣品，例如包埋或冷凍樣品(例如FFPE保存樣品、Bambanker ^TM保存冷凍樣品)。

根據一種實施例，所述細胞株為取自腫瘤之細胞株。於另一實施例中，此細胞株可進一步於體外(例如細胞培養)或體內(例如小鼠異種移植)繼代。於另一實施例中，所述細胞株為取自人類組織之永生細胞株。在又一實施例中，所述細胞株為幹細胞株。

根據本發明方法之一種實施例，該初代樣品係選自由下列項目所構成之群組：組織樣品、血液樣品、腫瘤樣品、或受感染組織之樣品。

根據本發明方法之一種實施例，所述MHC為MHC第一型(MHC-I)。

根據本發明方法之一種實施例，所MHC為人類MHC蛋白，較佳者，為人類白血球抗原A (HLA-A)及/或人類白血球抗原B (HLA-B)。

於其他實施例中，所述MHC為人類白血球抗原C (HLA-C)及/或人類白血球抗原E (HLA-E)。

上述者涉及不同HLA同種異型，亦包括不同HLA同種異型之混合物。

根據本發明方法之一種實施例，所述HLA同種異型為HLA-A*02。

根據本發明方法之一種實施例，MHC係選自由下列項目所構成之群組之至少一HLA同種異型：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02及/或HLA-B*44:03。

根據本發明方法另一實施例，所述HLA-A為HLA-A*02:01。

下表1所列胜肽特別適合用於HLA-A*02:01之定量。

下表4所列胜肽特別適合用於以下至少一者之定量：HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02及/或HLA-B*44:03。

根據本發明方法之一種實施例，於消化作用之後，以強酸處理測試樣品，以中斷消化作用及/或使蛋白酶沉澱或變性或失去活性。

根據一種實施例，為上述目的添加三氟乙酸(TFA)至樣品中達到介於≥ 0.05與≤ 5 % v/v間之濃度。

藉由添加上述酸質，產生酸鹼值調整，藉此失活例如最適宜條件為pH 7 與 8間之胰蛋白酶。

根據本發明方法之一種實施例，對經消化作用取得之測試樣品進行純化處理，包含固相萃取。於此種方案中，可隨選使用C18樹脂。

固相萃取(solid-phase extraction，SPE)係一種提取技術，溶解或懸浮於液態混合物中的各化合物可依據其物理及化學性質與混合物中的其他化合物分離。分析實驗室利用SPE濃縮並純化樣品以利分析。SPE可用於自包括尿液、血液、水、飲品、土壤、及動物組織在內之多種基質中分離出目標分析物。

SPE利用溶解或懸浮於液體(稱為移動相)中溶質對樣品所通過固體(稱為固定相)之親和力，將混合物分離為所需成分及不需要之成分。分離後所需目標分析物或樣品中不需要之雜質會留置於固定相上。視通過固定相之部分是否包含所需分析物或包含不需要之雜質，而予以收集或丟棄。若留置於固定相上之部分包含所需分析物，可利用額外步驟，以適當沖提液沖洗固定相，將之自固定相上取下後加以收集。

SPE之許多吸附劑/材料均與色層分析所用者相同，但SPE其目標與色層分析不同，因而於現代化學科學中有其獨特地位。

根據一種實施例，固相萃取利用十八烷基二氧化矽，藉由強烈疏水反應留置非極性化合物。此方法亦稱為C18 SPE。

適用於上述目的之商購可得工具為Thermo Scientific™ SOLAµ™ 固相萃取(SPE)盤。

根據一種實施例，SPE可用於去除雜質，例如鹽及高分子量化合物，例如胰蛋白酶微珠(見實施例1及2)。

根據本發明方法之一種實施例，於純化測試樣品後，對產生之純化產物進行乾燥，較佳者為經由冷凍乾燥。

根據一種實施例，於將純化產物乾燥後，將純化產物重新懸浮。根據一種實施例，是利用甲酸(FA)水溶液進行所述重新懸浮，其濃度介於1 – 10 %。於一特定實施例中，濃度為5 %。

根據本發明方法之一種實施例，所述色層分析及/或光譜分析之步驟包含LC-MS/MS分析。

於本文中，「LC-MS/MS」包括兩項程序步驟，亦即：

a) 液相層析法(主要為HPLC)，及

b) 串聯式質譜法，亦稱為MS/MS或MS2。

液相層析法(主要為HPLC)與串聯式質譜法之組合，對於複雜的蛋白質或胜肽分析極有助益。此方法兼具液相層析法(或HPLC)之物理分離能力與質譜儀(MS)之質量分析能力。

液相層析法係根據分子質量或所含胜肽之大小及/或疏水度分離胜肽樣品。經由界面，分離成分自LC管柱轉移至MS離子源。質譜法具有高分子特異性及偵測靈敏度，能夠鑑別個別成分之組成(例如判定胺基酸序列)。

質譜法為靈敏技術，可基於分子之質荷比 ( m/z)對其進行偵測、鑑別、與量化。

包括電噴灑游離法(ESI)及大氣壓力化學游離法(APCI)等大分子離子化方法之發展，促成利用MS技術之蛋白質結構之研究。質譜法可測量離子之m/z比，以對樣品及複合混合物中之分子進行鑑別及定量。

MS/MS技術是利用二或多台相連質量分析儀，透過額外反應步驟增加其分析樣品之化學成分之能力。

在胜肽分析中，先將樣品之胜肽分子離子化，並以第一分析儀(稱為MS1)將離子依其質荷比(通常為m/z或m/Q)分離。而後選擇經MSI處理過之特定m/z比之離子，並利用例如經由碰撞誘發解離(CID)、較高能量碰撞解離(HCD)或電子轉移解離(ECD)等方式將之分離為更小之片段離子。藉此打斷胜肽中之三種骨架鍵結以形成胜肽片段：烷羰鍵(CHR-CO)、胜肽醯胺鍵(CO-NH)、及胺烷鍵(NH-CHR)。

隨後將上述片段導入第二台質量分析儀(MS2)，由其按片段之m/z比加以分離並進行偵測。由於胜肽經過斷裂處理，在此步驟能夠對在標準MS1質量分析儀中m/z比十分相似之前驅物離子進行鑑別與分離。

串聯式質譜法產生之胜肽序列標籤可用於鑑別蛋白質資料庫中之胜肽。目前對於出自串聯質譜之胜肽片段已有一套固定之標示法。若N端保有電荷，胜肽片段離子以a、b、或c標示，若電荷保留於C端，則以x、y、或z標示。下標符號表示片段中之胺基酸殘基數。

已知多種基於LC-MS/MS之蛋白質體學應用之方法，例如可見於US9343278B2者，該專利之內容經參照合併於此以利本發明之實施。

根據本發明方法之一種實施例，色層分析及/或光譜分析之步驟包含利用胜肽從頭定序法(de novo sequencing)，對測試樣品中之至少一胜肽進行定序。

胜肽從頭定序係利用二片段離子間之質量差計算胜肽骨架上胺基酸殘基之質量。質量可完全判定殘基。以圖7所示者為例，y ₇與y ₆離子間之質量差等於113 Da，此即為胺基酸殘基L (Leu)之分子質量。持續所述程序直到所有殘基判定完成為止。表6為一胺基酸之質量表。 [表6]

名稱	3字母代碼	1字母代碼	平均質量(Da)
丙胺酸(Alanine)	Ala	A	71.08
精胺酸(Arginine)	Arg	R	156.2
天門冬醯胺(Asparagine)	Asn	N	114.1
天門冬胺酸(Aspartic Acid)	Asp	D	115.1
半胱胺酸(Cysteine)	Cys	C	103.1
麩胺酸(Glutamic Acid)	Glu	E	129.1
麩醯胺(Glutamine)	Gln	Q	128.1
甘胺酸(Glycine)	Gly	G	57.05
組胺酸(Histidine)	His	H	137.1
異白胺酸(Isoleucine)	Ile	I	113.2
白胺酸(Leucine)	Leu	L	113.2
離胺酸(Lysine)	Lys	K	128.2
甲硫胺酸(Methionine)	Met	M	131.2
苯基丙胺酸(Phenylalanine)	Phe	F	147.2
脯胺酸(Proline)	Pro	P	97.12
絲胺酸(Serine)	Ser	S	87.08
蘇胺酸(Threonine)	Thr	T	101.1
色胺酸(Tryptophan)	Trp	W	186.2
酪胺酸(Tyrosine)	Tyr	Y	163.2
纈胺酸(Valine)	Val	V	99.13

利用MS從頭定序之相關演算法及方法可見於，例如US20190018019A1，其內容經參照合併於此以利本發明之實施。

雖然質譜法於判定分子質量上極為有效，但本質上並不適合用於測得分子之定量。

內標準品是在色層分析及/或光譜分析步驟前加入測試樣品中。此程序稱為「添加(spiking)」，且加入測試樣品中之內標準品量稱為「添加量(spike)」。

內標準品中所含設定濃度之分子亦稱為「樣品分子類似物」，其獲選之原因即在於，其沖提及斷裂性質能夠反應待定量之取自測試樣品中經消化後分子之胜肽。

預設濃度中所含分子之數量/濃度可輕易調整，且至少部分取決於待添加之樣品及所用分析方法。

根據本發明方法之一種實施例，內標準品包含已定義濃度之至少一胜肽。

將內標準品中之一或多個胜肽(亦稱為「樣品胜肽類似物」)與來自測試樣品之胜肽同時進行共同沖提，並同時以MS及MS/MS進行分析。

根據本發明方法之一種實施例，內標準品包含一組具有三或更多胜肽之胜肽組(亦稱為「樣品胜肽類似物」)，其中，各該胜肽之序列對應於一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位，其中，該HLA同種異型係選自由下列項目所構成之群組：人類白血球抗原A (HLA-A)及/或人類白血球抗原B (HLA-B)。

於其他實施例中，各胜肽之序列對應於一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位，該HLA同種異型係選自由下列項目所構成之群組：人類白血球抗原C (HLA-C)及/或人類白血球抗原E (HLA-E)。

根據本發明方法之一種實施例，該MHC為MHC第一型(MHC-I)。

此即表示，於此種實施例中，每一HLA同種異型至少使用五種胜肽。發明人發現，此一基本數量能夠於HLA同種異型之所有成員確保可靠且可複製之定量。

根據本發明方法之一種實施例，上述胜肽之序列對應之延伸部分、結構域、或表位所屬之HLA為HLA-A*02。

根據本發明方法之一種實施例，上述胜肽之序列對應之延伸部分、結構域、或表位所屬之HLA，係選自由下列項目所構成之群組中之至少一者： HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02及/或HLA-B*44:03。

根據本發明方法之一種實施例，上述胜肽之序列對應之延伸部分、結構域、或表位所屬之HLA為HLA-A*02:01。

於本文中，HLA基因型，意指完整之遺傳HLA基因組。

於本文中，HLA對偶基因，意指不同個體之相同基因座中所存在之替代形式HLA基因。由於人類HLA基因之高度多態性，對偶基因之數量極高。IPD-IMGT/HLA資料庫(3.42.0號發布，2020-10-15)於2020年12月共包含6,291種HLA-A對偶基因(3,896同種異型)、7,562種HLA-B對偶基因 (4,803同種異型)、及6,223種HLA-C對偶基因 (3,618同種異型) (參見「Robinson et al., 2015」)。

於本文中，HLA同種異型，意指由個別HLA對偶基因所編碼之不同HLA蛋白形式。由於簡併遺傳密碼，不同HLA對偶基因可為相同之HLA同種異型編碼。

於本文中，HLA單倍型，意指由一病患所捐獻且編碼於同一染色體上之HLA對偶基因組。

HLA-A*02:01 (Uniprot ID P01892)為HLA對偶基因HLA-A*02在HLA-A基因群中之同種異型。HLA-A*02為HLA-A基因座上一特定第一型主要組織相容複合體(MHC)對偶基因群。HLA-A*02對偶基因群包含1,454個編碼較少數量蛋白質之對偶基因(同種異型；IPD-IMGT/HLA資料庫發布號3.42.0，2020-10-15) (參見「Robinson et al., 2015」)。HLA-A*02為全球共通，但特定的變體可以通過地理顯著性來區分。HLA-A*02:01具有全球最高頻率，例如在包含39,689個體數之德國研究群中佔26.7 % (參見「Allele Frequency Net Database; Germany pop 8; n=39,689; (Gonzalez-Galarza et al., 2015)」)。

根據一種實施例，所述胜肽組包含至少兩種胜肽，其序列對應於至少兩種不同HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位。在此實施例中，本發明之方法可為另外一HLA同種異型定量。

根據一種實施例，係使用具有三或更多胜肽(亦稱為「樣品胜肽類似物」)之另一胜肽組，該等胜肽之序列對應於該另外一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位。

根據本發明方法之一種實施例，所述內標準品中之至少一胜肽於N端及/或C端包含一胺基酸之外伸，其中，該胺基酸之外伸包含一蛋白酶切割位點。

在一實施例中，所述蛋白酶切割位點係一胰蛋白酶切割位點，如本文另行說明者。

據此，於本說明書中，凡所敘及胜肽並無上述外伸(例如SEQ ID NO: 1 – 17或44 – 62)之處，均視同敘及具有外伸之胜肽(例如SEQ ID NO: 18 – 34或63 – 81)。此即表示具有外伸之胜肽組及不具外伸之胜肽組均可用於本發明，且為本發明所揭露。

於本文中，「胺基酸之外伸」意指胜肽係經選擇，因此其至少在用於模板蛋白消化作用之C端或N端蛋白酶切割位點之外尚包含一或多個其他胺基酸殘基。

根據一種實施例，所述外伸同時存在於N端及C端。根據一種實施例，各外伸之長度可在≥ 1 AA與≤ 10 AA殘基之間。應知於外伸中可能包含C或M殘基。

於上述所有案例中，內標準品(IS)之胜肽，或內標準品整體，係在與測試樣品完全相同之條件下接受蛋白酶消化，尤其是使用相同蛋白酶。

下表顯示兩種實施例，其中具有長度3 AA殘基之外伸以斜體字加底線顯示(在此案例中，蛋白酶為胰蛋白酶)：

模板蛋白質序列	[Xn]PLVEEPQNLI K QNCELFEQLGEY K FQNALLV[Xn]
IS之胜肽	LIK QNCELFEQLGEY K FQN
模板蛋白質序列	[Xn]TLFGD K LCTVATL R ETYGE[Xn]
IS之胜肽	GDK LCTVATL R ETY

若在內標準品中使用具有外伸之胜肽，則在消化作用前將內標準品加入至測試樣品，可確保內標準品之胜肽亦隨測試樣品接受相同之蛋白酶消化過程，並同樣經歷蛋白酶切割。若無外伸，胜肽不會受蛋白酶處理所影響。如此有助於模擬程序之消化效率，以確定內標準品之胜肽忠實反應如同蛋白酶消化所造成之測試樣品之胜肽組成。

根據本發明方法之一種實施例，所述胜肽組進一步包含至少一胜肽，其序列對應於β-2-微球蛋白(β2m)之延伸部分、結構域、或表位。

β2m (Uniprot ID P61769)為異二聚MHC第一型複合體之一部分，對複合體提供穩定度，並參與CD8輔助受體辨識胜肽-MHC第一型複合體之過程。所述胜肽以非共價鍵結方式連接於α亞基，由胜肽結合槽底部之數個口袋將之固定。在細胞表面上，β2m位置緊鄰HLA之α ₃鏈。不同於α ₃，β2m並無穿膜區域。

令人玩味之處在於，雖然HLA具有不同對偶基因(基因型)及蛋白質(同種異型)，但卻無任何β2m之變體存在。換言之，所有HLA同種異型均包含相同之β2m分子，或與相同之β2m分子形成複合體。因此，可利用測試樣品中之β2m定量，確定測試樣品中所有HLA第一型同種異型之整體數量。

以此方式，所述方法可用於判定測試樣品中HLA第一型分子全體內之特定HLA同種異型之佔比，例如HLA-A*02:01。

根據本發明一種實施例，所述方法進一步包含判定該測試樣品中總細胞數之步驟。

依確切測試樣品類型，可用不同方法判定細胞數。若為培養而得細胞(亦即細胞株樣品)，可先以顯微鏡確定細胞數，而後納入考量。

估計測試樣品特定細胞數之另一方式乃是以其組織重量反向關聯於細胞數。具體方法為，將基於組織重量之迴歸曲線關聯於其細胞數已事先利用螢光染色DNA定量方式判定之資料。

另一方式是，對於初代非培養樣品(例如組織或血液)，可先判定一胜肽之濃度，並據此濃度判定細胞數，所述胜肽之序列對應於一或多個蛋白之延伸部分、結構域、或表位，所述蛋白之豐度大致與該測試樣品中總細胞數成比例。

根據本發明方法之一種實施例，所述胜肽組進一步包含至少一胜肽，該胜肽之序列對應於一或多個蛋白之延伸部分、結構域、或表位，所述蛋白之豐度大致與該測試樣品中總細胞數成比例。

「其豐度大致與該測試樣品中之總細胞數成比例之蛋白」一語係關於一蛋白，其每一細胞之濃度大致固定不變。

此條件適用於例如組蛋白。組蛋白為存在於真核細胞核中之高鹼性蛋白質，真核細胞核將DNA包裝整理成稱為核小體之結構單元。組蛋白為染色質之首要蛋白質成分，如同線軸可供DNA纏繞，且影響基因調控。由於二倍體細胞中之DNA量恆定，組蛋白量亦固定不變。組蛋白分為五大家族：H1/H5、H2A、H2B、H3、及H4。組蛋白H2A、H2B、H3、及H4稱為核心組蛋白，組蛋白H1/H5稱為連接組蛋白。

根據本發明方法之一種實施例，其豐度大致與該測試樣品中之總細胞數成比例之至少一蛋白為組蛋白，例如組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。

組蛋白H2A (UniProt ID B2R5B3)為涉及真核細胞中染色質結構之主要組蛋白。H2A利用稱為「組蛋白摺疊」之蛋白質摺疊。組蛋白摺疊為由兩個環(loop)連接之三螺旋(helix)核心結構域。此連接形成「握手排列(handshake arrangement)」。尤其，此部分稱為螺旋轉折螺旋模體(helix-turn-helix motif)，可與H2B二聚化。

組蛋白H2B (UniProt ID B4DR52)為另一涉及真核細胞中染色質結構之主要組蛋白。組蛋白H2B之兩個拷貝數與組蛋白H2A、組蛋白H3、及組蛋白H4之各兩個拷貝數結合可形成核小體之八聚體核心[2]，構成DNA之結構。

組蛋白H4 (UniProt ID Q6B823)為又一涉及真核細胞中染色質結構之主要組蛋白。組蛋白H3及H4結合而形成H3-H4二聚體，兩個H3-H4二聚體組合可形成一個四聚體。此四聚體再與兩個H2a-H2b二聚體結合則形成緊緻之組蛋白八聚體核心。

一般而言，組蛋白之豐度，由於其DNA結合能力，係與樣品中之總細胞數成比例。因此，為測試樣品中之組蛋白定量可用於估計其中所包含之總細胞數。

為此目的，根據一種實施例，如通過本文公開的質譜法獲得的，通過滴定一或多個細胞對照於基於組蛋白之訊號建立一校正曲線。更精確而言，即是判定胰蛋白酶消化後所得內生組蛋白胜肽與其重型同位素標記內標準品胜肽間之比率。

在一實施例中，內標準品(IS)包含一胜肽組，其胜肽之序列對應於下表所示蛋白之延伸部分、結構域、或表位：

模板蛋白	實施例	IS 中不同胜肽之數量
β-2-微球蛋白		≥ 1 - ≤ 4
HLA	HLA-A*02:01	≥ 5 - ≤ 20
蛋白大致與總細胞數成比例	組蛋白，例如組蛋白H2A、組蛋白H2B、及組蛋白H4中之至少一者	≥ 5 - ≤ 10

可選地，所述胜肽組包含一或多個其他具有≥ 5 - ≤ 20個胜肽之胜肽組，所述胜肽之序列對應於與HLA-A*02:01不同之另一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位。以此方式，可對超過一種HLA同種異型進行定量。

在判定測試樣品中細胞數之外，亦可加上或改為判定測試樣品中之DNA含量，如McCaffrey等人(1988)( 參見「McCaffrey et al., 1988」)所揭露者。

根據一種實施例，與其中一種詢問蛋白相符之內標準品中至少一胜肽之序列，是經由電腦模擬（ in silico）蛋白酶消化作用而自模板蛋白中取得。

於本文中，電腦模擬蛋白酶消化作用，意指分析模板蛋白之可能蛋白酶切割位點，而後根據蛋白酶活性所可能創造之蛋白片段選擇胜肽序列。

例如，如上所述，胰蛋白酶在K及R殘基之C端切割。因此，分析模板蛋白之可能胰蛋白酶切割位點時，可得知蛋白酶活性所可能創造之蛋白片段，C端上應有K或R。

下表提供兩種實施例(僅為舉例，模板蛋白序列選自人類血清白蛋白，K及R加粗且加劃底線，X為任何蛋白胺基酸(在此案例中，所述蛋白酶為胰蛋白酶)：

模板蛋白質序列	[Xn]PLVEEPQNLI K QNCELFEQLGEY K FQNALLV[Xn]
IS之胜肽	QNCELFEQLGEY K
模板蛋白質序列	[Xn]TLFGD K LCTVATL R ETYGE[Xn]
IS之胜肽	LCTVATL R

根據一種實施例，內標準品中至少一胜肽係經選擇，使其不包含C殘基。

C (Cys)包含一硫醇基，其能夠與同一胜肽或其他胜肽中其他半胱胺酸共同建立雙硫鍵。因此，在內標準品中具有包含半胱胺酸之胜肽可能因異質聚體之形成而導致假影，造成錯誤分析結果。

根據一種實施例，內標準品中至少一胜肽係經選擇而使其不包含M殘基。M (Met)包含一硫醚，且在樣品製備過程中會部分氧化，因此導致兩種不同胜肽產生(還原M及氧化M)，兩者皆必須量化。

或者，可用甲硫胺酸硫氧化物(methionine sulfoxide，MetO)取代M，此時使用一字母代碼「B」。

根據一種實施例，內標準品中至少一胜肽係經選擇而使其不包含轉譯後修飾。

此限制尤其適用於N醣基化。N醣基化模體為NXS及NXT，故而在本實施例中，應注意內標準品所用胜肽不包含任何此種模體。

較佳者，亦應藉由適當選擇用於內標準品中之胜肽，避免以下轉譯後修飾(同時避免可能發生所述轉譯後修飾之胺基酸殘基)，包括但不限於：

1) 例如離胺酸或精胺酸之單、二或三甲基化，

2) 例如離胺酸或天門冬醯胺之乙醯化，或

3) 例如酪胺酸、蘇胺酸或絲胺酸之磷酸化。

根據一種實施例，內標準品中之胜肽係以合成方式製作。

根據一種實施例，內標準品之胜肽不包含外伸部分之長度介於≥ 4 與≤ 50 AA之間。根據一種實施例，內標準品之胜肽不包含外伸部分之分子量介於 ≥ 400與≤ 5000 Da之間。

當然，內標準品中胜肽之長度或重量亦受蛋白酶之切割特徵所影響，有些蛋白酶產生之片段整體而言較長，有些則較短。

關於內標準品中之胜肽，請進一步參照所請胜肽組之較佳實施例及限制。未免冗長，於此不再重複說明相關實施例之優點及特徵。

於以下，(i) β-2-微球蛋白(β2m)、(ii) HLA同種異型、及(iii) 其豐度大致與該測試樣品中之總細胞數成比例之蛋白亦將稱為「詢問蛋白」，其與內標準品中胜肽所匹配。

根據本發明方法之一種實施例，內標準品是在以一蛋白酶對均質化之測試樣品進行消化處理之步驟前添加至測試樣品中。

根據本發明方法之一種實施例，內標準品中至少一分子係經標記。

根據一種實施例，所用標記是以下至少一者：

1) 金屬編碼標籤，及/或

2) 同位素標籤。

金屬編碼標籤(MeCAT)是以化學標記法為根據，但並非使用穩定之同位素，而是使用大環化合物中之鑭系元素離子。標記胜肽之量化資訊可經感應藕合式電漿MS測量。MeCAT可配合元素質譜法ICP-MS使用，藉以對由MeCAT試劑連接至蛋白質或生物分子之金屬進行初次絕對定量。因此，透過利用金屬標準溶液之外部校正，對蛋白質絕對數量之判定可準確至阿莫耳(attomol)等級。此方法可相當於多因子實驗中以2D電泳及色層分析達成之蛋白分離。

以同位素標籤標記分子可供質譜儀分辨例如不同測試樣品中之相同蛋白質。

同位素標籤為一種標記方式，此種標籤是在可使受標記蛋白或胜肽在質譜中產生已知質量偏移之蛋白交聯劑中加入穩定同位素。將經差示標記之樣品結合並同時分析，同位素對峰質強度之差亦即可準確反映對應蛋白質之豐度差異。

另一種方法是利用同位素胜肽。此方法必須將目標胜肽之已知濃度之合成、重型類同位素分子加入實驗樣品中，而後進行LC-MS/MS。相同化學物之胜肽自LC共同沖提後，由MS同時分析。但實驗樣品中目標胜肽之豐度是與其類同位素分子比較，而後倒算回標準品之初始濃度。

根據本發明方法之一種實施例，在合成過程中納入13C及/或15N，而對內標準品中至少一胜肽內之一胺基酸進行同位素標記。

根據一種實施例，每種胜肽中僅有一胺基酸以此方式標記。為此，各胜肽之待標記胺基酸殘基必須為該胜肽中獨一無二者。此種標記可用於區分光譜訊號是屬於來自樣品之內生胜肽或是屬於來自內標準品之胜肽。一般而言，針對低於2,000 Da之胜肽，由同位素標記導致之質量偏移應使納入胺基酸之質量偏移6 Da以上，以免同位素包覆(isotopic envelope)間之外伸。若胜肽大於2,000 Da，則標記之胺基酸應產生10 Da以上之質量偏移，例如經標記之F (Phe )或Y (Tyr )，以避免同位素包覆外伸。

下表提供標記胺基酸之典型實施例及產生之質量偏移：

AA ( 單字母代碼 )	AA ( 三字母代碼 )	¹³ C/ ¹⁵N 通用標記游離胺基酸之分子式	相對於未標劑時之質量偏移 (Da)
A	ala	( ¹³C) ₃H ₇( ¹⁵N)O ₂	(+4)
R	arg	( ¹³C) ₆H ₁₄( ¹⁵N) ₄O ₂	(+10)
N	asn	( ¹³C) ₄H ₈( ¹⁵N) ₂O ₃	(+6)
D	asp	( ¹³C) ₄H ₇( ¹⁵N)O ₄	(+5)
C	cys	( ¹³C) ₃H ₇( ¹⁵N)O ₂S	(+4)
Q	gln	( ¹³C) ₅H ₁₀( ¹⁵N) ₂O ₃	(+7)
E	glu	( ¹³C) ₅H ₉( ¹⁵N)O ₄	(+6)
G	gly	( ¹³C) ₂H5( ¹⁵N)O ₂	(+3)
I	ile	( ¹³C) ₆H ₁₃( ¹⁵N)O ₂	(+7)
L	leu	( ¹³C) ₆H ¹³( ¹⁵N)O ₂	(+7)
K	lys	( ¹³C) ₆H ₁₄( ¹⁵N) ₂O ₂	(+8)
M	met	( ¹³C) ₅H ₁₁( ¹⁵N)O ₂S	(+6)
F	phe	( ¹³C) ₉H ₁₁( ¹⁵N)O ₂	(+10)
P	pro	( ¹³C) ₅H ₉( ¹⁵N)O ₂	(+6)
S	ser	( ¹³C) ₃H ₇( ¹⁵N)O ₃	(+4)
T	thr	( ¹³C) ₄H ₉( ¹⁵N)O ₃	(+5)
Y	tyr	( ¹³C) ₉H ₁₁( ¹⁵N)O ₃	(+10)
V	val	( ¹³C) ₅H ₁₁( ¹⁵N)O ₂	(+6)

根據本發明方法之一種實施例，建立一校正例程，其包含以下步驟：

1) 提供至少二校正樣品，所述校正樣品包含一具變化濃度之MHC分子標準品及一加入其中且具固定濃度之內標準品；

2) 於添加內標準品之前或之後，以一蛋白酶對所述校正樣品進行消化處理；

3) 對經消化作用取得之校正樣品進行純化處理；以及

4) 使消化後之校正樣品進行一色層分析及/或光譜分析之步驟。

根據本發明方法之一種實施例，其中，

a) 該MHC分子標準品係一HLA單體，及/或

b) 該等校正樣品進一步包含酵母蛋白裂解物。

在一實施例中，所述HLA單體為一pHLA單體，亦即與一胜肽複合之一HLA單體。在一實施例中，所述HLA單體係以重組方式產生。在一實施例中，所述以重組方式產生之HLA單體係經重新摺疊。

HLA單體之重新摺疊可如Garboczi等人(1992)所揭露者，其內容經參照合併於此以利本發明之實施。

酵母蛋白裂解物是用於模擬測試樣品之蛋白質組成之一蛋白質背景(protein background)。發明人已證實，酵母蛋白裂解物在經胰蛋白酶消化後並不會釋出任何與MHC序列相同之胜肽。

HLA單體(在此亦稱為MRF，其中R代表「重新摺疊」)在其主要結構中包含所有以胜肽延伸部分之型態包含在內標準品中之相關胜肽序列。

根據一種實施例，用為MHC分子標準品之HLA單體是一重新摺疊pHLA-A*02:01單體。

因此，在校正樣品中，內標準品保持不變而重新摺疊HLA單體之濃度有所變化。如此一來，用為MHC分子標準品之HLA單體可做為用於定量之滴定標準品。

與Apps等人之方法相反，本實施例方法中所用校正曲線確實考量MHC蛋白質且不僅是比對固定數量之「重型」胜肽而滴定增量之合成「輕型」胜肽，因此確實適用於樣品中MHC分子之絕對定量。

下表提供校正樣品系列之實施例：

校正樣品	總 MRF 濃度 [fmol]	內標準品 [fmol]
1	-	1000
2	2	1000
3	10	1000
4	50	1000
5	100	1000
6	1000	1000
7	5000	1000
8	20000	1000

校正樣品隨後接受胰蛋白酶消化，並接受如同「真實」測試樣品之其他處理，例如視情況，可添加例如TFA等酸質中斷反應，可利用固相萃取純化樣品，且可利用凍乾及重新懸浮等方式便於LC-MS/MS分析。

根據本發明方法之一種實施例，校正曲線是根據取自MHC分子標準品消化後之胜肽(亦稱為「MRF衍生胜肽」)之光譜訊號對照來自內標準品之胜肽之光譜訊號兩者間之比率，經計算後繪製而成。

隨後計算MRF衍生胜肽之MS訊號與內標準品之胜肽之MS訊號兩者間之比率，並繪製成圖。製圖時，每次消化之MRF總量繪製於x軸，對照於未標記單體衍生胜肽MS面積除以對應同位素標記內標準品面積之比率(見圖7B)。各MRF胜肽數量轉換為特定MS比率，與以固定濃度添加至樣品中之IS比較。

一般而言，由於消化後樣品中特定胜肽與消化前存在於樣品中之MHC蛋白間為1:1化學計量學，因此MHC之數量可自其胜肽多寡直接推知。

根據本發明方法之一種實施例，MHC濃度係基於該正規化之蛋白質濃度(1/µg)計算而得。

若內標準品添加之濃度與用於校正曲線者相同，則胜肽特定校正曲線等式之轉換可用於計算特定分析物胜肽之胜肽濃度：

式1

其中「a」及「b」示於圖7。

以此方式可取得各MHC胜肽之濃度，並以例如fmol/µg之單位表達。

根據本發明方法之一種實施例，MHC蛋白濃度對照於測試樣品體積之關係，係基於測試樣品在消化作用前之總蛋白質濃度計算而得。

以此方式，每一MHC胜肽之濃度可換算為fmol/µL，若每一裂解物之總蛋白質濃度已事先確定，可將之納入考量，例如經由BCA測定：

式2

根據本發明方法之一種實施例，測試樣品中每一細胞之MHC分子之數量係基於測試樣品中之總細胞數而計算。

為進一步將胜肽濃度自fmol/µL換算為每一裂解物之總蛋白拷貝數(total protein copies)，則必須進一步將總裂解物之體積及每一裂解物之細胞數連同亞佛加厥常數納入考量：

式3

本發明另一態樣提供一種具有三或更多胜肽之胜肽組(亦稱為「樣品胜肽類似物」)，其中，各胜肽之序列係對應於一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位，所述HLA同種異型係選自由下列項目所構成之群組：HLA-A、HLA-B、HLA-C、及/或HLA-E。此具有三或更多胜肽之胜肽組可補足本發明其他部分所描述之內標準品。

關於此等亞型，請參照關於本發明方法之其他說明。未免冗長，於此不再重複說明相關實施例之優點及特徵。本發明如上文所述之內標準品(IS)可採用此胜肽組及以下胜肽組。

根據本發明之胜肽組之一種實施例，各胜肽之序列係對應於一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位，其中，該HLA同種異型係選自由下列項目所構成之群組：HLA-A、HLA-B、HLA-C、及/或HLA-E。

根據本發明之胜肽組之一種實施例，所述胜肽之序列對應之延伸部分、結構域、或表位所屬之HLA為HLA-A*02。

根據本發明之胜肽組之一種實施例，所述胜肽之序列對應之延伸部分、結構域、或表位所屬之HLA，係選自由下列項目所構成之群組中之至少一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02、及/或HLA-B*44:03。

在一實施例中，此等胜肽係選自由下列項目所構成之群組：

1) SEQ ID NO: 1 – 10 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 18 – 27)，及

2) SEQ ID NO: 44 – 62 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 63 – 81)。

關於此等胜肽特異性及匹配之其他資訊亦請見圖4及圖10與表1及表4。一般而言，可用於本發明之較佳胜肽組可為例如圖8、圖9及圖10所揭示者。

根據本發明之胜肽組之一種實施例，所述胜肽之序列對應之延伸部分、結構域、或表位所屬之HLA為HLA-A*02:01。

在一實施例中，此等胜肽係選自由下列項目所構成之群組：SEQ ID NO: 1 – 10 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 18 – 27)。關於此等胜肽特異性及匹配之其他資訊亦請見圖4及圖10與表1。

關於此亞型，請參照關於本發明之方法之其他說明。未免冗長，於此不再重複說明相關實施例之優點及特徵。

以下描述所述胜肽組之若干實施例。此等實施例之優點及特徵已於上文關於本發明之方法之說明中討論，未免冗長，於此不再重複說明。

根據一種實施例，所述胜肽組包含至少兩個胜肽，其具有一序列對應於至少兩個HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位。在此實施例中，所述方法可用於定量另一HLA同種異型。根據一種實施例，可利用另一個具有三或更多胜肽之胜肽組，以其序列對應於上述另一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位。

可選地，所述胜肽組包含一或多個包含介於≥ 5與 ≤ 20 個其他胜肽之胜肽組，所述胜肽之序列對應於與HLA-A*02:01不同之另一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位。以此方式可對超過一種HLA同種異型進行定量。

根據一種實施例，所述胜肽組中至少一胜肽之序列係由電腦模擬蛋白酶消化作用而自模板蛋白中取得。

根據一種實施例，所述胜肽組中之至少一種胜肽係經選擇而使其並不包含C (Cys)殘基。根據一種實施例，所述胜肽組中之至少一種胜肽係經選擇而使其並不包含M (Met)殘基。根據一種實施例，所述胜肽組中之至少一種胜肽係經選擇而使其並不包含轉譯後修飾，例如N醣基化。根據一種實施例，所述胜肽組中之胜肽係以合成方式製作。

根據一種實施例，所述胜肽組中胜肽不包含可能外伸之長度介於≥ 4與≤ 50 AA之間。根據一種實施例，所述胜肽組中胜肽不包含可能外伸之分子量介於≥ 500與≤ 4000 Da之間。

根據一種實施例，胜肽組中至少一胜肽係經標記。根據一種實施例，所用標記是以下至少一者：金屬編碼標籤及/或同位素標籤。

在一實施例中，所述胜肽組中胜肽之序列對應於以下蛋白質之延伸部分、結構域、或表位，如下表所示：

模板蛋白	實施例	IS 中不同胜肽之數量
β-2-微球蛋白		≥ 1 - ≤ 4
HLA	HLA-A*02:01	≥ 2 - ≤ 20
蛋白大致與總細胞數成比例	組蛋白，例如組蛋白H2A、組蛋白H2B、及組蛋白H4中之至少一者	≥ 2 - ≤ 10

可選地，所述胜肽組包含一或多個其他具有≥ 3 - ≤ 20個胜肽之胜肽組，所述胜肽之序列對應於與HLA-A*02:01不同之另一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位。以此方式，可對超過一種HLA同種異型進行定量。

用以定量HLA-A*02:01之內標準品中胜肽組，根據一種實施例，所述胜肽組包含以下至少一者：

1) 5、6、7、8、9或10種胜肽，各個肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸： SEQ ID NO: 1 – SEQ ID NO: 10，及/或

2) 5、6、7、8、9或10種胜肽，各個肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸： SEQ ID NO: 18 – SEQ ID NO: 27。

應知，於所有樣品胜肽類似物胜肽組中，具有外伸之胜肽可由非外伸對應物加以取代，反之亦然。例如可將SEQ ID NO: 1之胜肽以SEQ ID NO: 18之胜肽取代，或將SEQ ID NO: 27之胜肽以SEQ ID NO: 10之胜肽取代。

當然，不僅可使用具有外伸之胜肽(SEQ ID NO: 18及27)，亦可使用具有更長N端及C端外伸之胜肽，只要能夠在蛋白酶消化後產生相同之胜肽即可。

根據本發明胜肽之一種實施例，所述胜肽組更包含至少一胜肽，其序列對應於β-2-微球蛋白(β2m)之延伸部分、結構域、或表位。

在一實施例中，所述胜肽係選自由下列項目所構成之群組：SEQ ID NO: 11 – 12 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 28 – 29)。亦請見圖4及表2或關於特異性及此等胜肽匹配之進一步資訊。

關於此實施例，請參照關於本發明之方法之其他說明。未免冗長，重複之優點及特徵於此不再贅述。

根據一種實施例，所述胜肽組包含以下至少一者：

1) 1或2種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 11 – SEQ ID NO: 12，及/或

2) 1或2種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 28 – SEQ ID NO: 29。

應知，於所有樣品胜肽類似物胜肽組中，具有外伸之胜肽可由非外伸對應物加以取代，反之亦然。例如，可將SEQ ID NO: 11之胜肽以SEQ ID NO: 28之胜肽取代，或將SEQ ID NO: 29之胜肽以SEQ ID NO: 12之胜肽取代。

當然，不僅可使用具有外伸之胜肽 (SEQ ID NO: 28及29)，亦可使用具有更長N端及C端外伸之胜肽，只要能夠在蛋白酶消化後產生相同之胜肽即可。

根據本發明胜肽之一種實施例，所述胜肽組更包含至少一胜肽，其序列對應於一或多個蛋白之延伸部分、結構域或表位，所述蛋白之豐度大致與該測試樣品中總細胞數成比例。

關於「其豐度大致與該測試樣品中之總細胞數成比例之蛋白」，請參照關於本發明方法之其他說明。未免冗長，重複之優點及特徵於此不再贅述。

根據本發明胜肽之一種實施例，其豐度大致與該測試樣品中之總細胞數成比例之所述至少一蛋白為組蛋白，例如H2A、H2B、或H4。

在一實施例中，該等胜肽係選自由下列項目所構成之群組：SEQ ID NO: 13 – 17 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 30 – 34)。關於此等胜肽之特異性及匹配亦請見圖4及表3或進一步資訊。

此等實施例之優點及特徵已於上文本發明方法部分討論，未免冗長，於此不再贅述。

因此，針對其豐度大致與該測試樣品中之總細胞數成比例之蛋白進行定量後，其結果可用於確定測試樣品中之細胞總數，並進而評估每一細胞之HLA豐度。

根據本發明之胜肽組之一種實施例，所述胜肽組中至少一胜肽之序列至少在N端及/或C端包含一胺基酸之外伸，其中，該胺基酸之外伸包含一蛋白酶切割位點。

在一實施例中，所述蛋白酶切割位點為胰蛋白酶切割位點，如本文另行說明者。

於本文中，「胺基酸之外伸」意指所述胜肽係經選擇，而使其在用於模板蛋白消化作用之蛋白酶之至少C端或N端切割位點以外還包含一或多個其他胺基酸殘基。

本實施例之優點及特徵已於上文本發明方法部分討論，未免冗長，於此不再贅述。

根據一種實施例，所述胜肽組包含至少一胜肽，所述胜肽包含一選自由下列項目所構成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO: 1 – SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 44 – SEQ ID NO: 81。其可更包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30種胜肽，所述胜肽包含一選自由下列項目所構成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO: 1 – SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 44 – SEQ ID NO: 81。

當然，不僅可使用具有外伸之胜肽 (SEQ ID NO: 18 – 34及63 – 81)，亦可使用具有更長N端及C端外伸之胜肽，只要能夠在蛋白酶消化後產生相同之胜肽即可(亦即SEQ ID NO: 1 – 17及44 – 62之胜肽)。

依據上述胜肽，以及圖4及圖10連同表1及表4所揭露之資訊，熟悉此技藝人士可設計各種樣品胜肽類似物胜肽組，用以為樣品中之不同HLA同種異型進行個別或同時定量。

為能夠進行絕對定量，可將圖4中取自β2微球蛋白及/或組蛋白(亦見表2及表3)之樣品胜肽類似物加入樣品胜肽類似物胜肽組。

因此，圖4及圖10，連同表1至4，提供可為特定樣品中一或多個HLA同種異型進行絕對定量之工具。

用以定量HLA-A*02:01之內標準品中樣品胜肽類似物胜肽組，根據一種實施例，所述胜肽組包含以下至少一者：

1) 5、6、7、8、9或10種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸： SEQ ID NO: 1 – SEQ ID NO: 10，及/或

2) 5、6、7、8、9或10種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸： SEQ ID NO: 18 – SEQ ID NO: 27。

根據一種實施例，所述胜肽組包含以下至少一者：

1) 1、2、3、4或5種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸： SEQ ID NO: 13 – SEQ ID NO: 17，及/或

2) 1、2、3、4或5種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 30 – SEQ ID NO: 34。

應知，於所有樣品胜肽類似物胜肽組中，具有外伸之胜肽可由非外伸對應物加以取代，反之亦然。例如，可將SEQ ID NO: 13之胜肽以SEQ ID NO: 30之胜肽取代，或將SEQ ID NO: 33之胜肽以SEQ ID NO: 16之胜肽取代。

根據一種實施例，所述胜肽組包含：

1) 5、6、7、8、9或10種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 1 – SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 18 – SEQ ID NO: 27，

2) 1或2種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 11 – SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 28 – SEQ ID NO: 29，

3) 1、2、3、4或5種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 13 – SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 30 – SEQ ID NO: 34。

根據一種實施例，其中，至少一胜肽以其對應序列構成。

此即表示，於本發明中，所有胜肽與其各自序列具有完全相同之長度。根據一種實施例，其中之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17種胜肽以其各自的序列構成。

根據一種實施例，所有胜肽均由其各自的序列構成。

用於定量HLA-A*02:01及/或其他HLA同種異型之內標準品中樣品胜肽類似物胜肽組，根據一種實施例，所述胜肽組包含以下至少一者：

1) 5、6、7、8、9或10種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 1 – SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 44 – SEQ ID NO: 62，及/或

2) 5、6、7、8、9或10種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 18 – SEQ ID NO: 27及SEQ ID NO: 63 – SEQ ID NO: 81。

根據一種實施例，所述胜肽組包含以下至少一者：

2) 1或2種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下列項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 28 – SEQ ID NO: 29。

根據一種實施例，所述胜肽組包含以下至少一者：

1) 1、2、3、4或5種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 13 – SEQ ID NO: 17，及/或

應知，於所有樣品胜肽類似物胜肽組中，具有外伸之胜肽可由非外伸對應物加以取代，反之亦然。例如可將SEQ ID NO: 13之胜肽以SEQ ID NO: 30之胜肽取代，或將SEQ ID NO: 33之胜肽以SEQ ID NO: 16之胜肽取代。

根據一種實施例，所述胜肽組包含：

2) 5、6、7、8、9或10種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 18 – SEQ ID NO: 27及SEQ ID NO: 63 – SEQ ID NO: 81，及

3) 1或2種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 11 – SEQ ID NO: 12及 SEQ ID NO: 28 – SEQ ID NO: 29，

4) 1、2、3、4或5種胜肽，各個胜肽包含一選自由以下項目任一所構成之群組之胺基酸：SEQ ID NO: 13 – SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 30 – SEQ ID NO: 34。

以下將說明本發明之第二態樣，其關於一種新穎且具發明性之方法，用以判定一樣品中之細胞數。此種方法可例如用於判定一確診腫瘤中待攻擊之細胞量，且因此有助於判定個人化之治療範圍。其亦可在已知每一細胞的目標密度之條件下，協助判定特定組織中之總數或可治療目標。

就技術上而言，此方法與根據本發明第一態樣之樣品中MHC含量定量方法多所重疊。因此，就本發明第二態樣所討論之較佳實施例應視為亦就第一態樣揭露，反之亦然。

根據第二態樣，本發明提供一種用以判定一測試樣品中細胞數之方法，所述測試樣品包含至少一細胞。所述方法至少包含以下步驟：

a) 對測試樣品進行均質化處理；

b) 在將一內標準品添加至該測試樣品之前或之後，以一蛋白酶對該均質化之測試樣品進行消化處理；

c) 使消化後之測試樣品進行一色層分析及/或光譜分析之步驟；

d) 判定該消化後之測試樣品中至少一組蛋白之含量；以及

e) 據此判定該測試樣品中之細胞數。

較佳者，所述測試樣品為取自受試者之樣品，以取自人類受試者為佳。所述測試樣品可例如經切片取得，或可為液態樣品(尿液、血液、精液、浸出液、淋巴液)。

於不同實施例中，所述測試樣品為取自健康組織之樣品，或為取自腫瘤組織之樣品或液態樣品。例如肉瘤、上皮癌、淋巴瘤、及白血病。

根據一種實施例，在步驟b)之後及步驟c)之前對測試樣品進行純化處理。

根據一種實施例，組蛋白係選自由下列項目所構成之群組中之至少一者：組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。

根據一種實施例，判定至少兩種組蛋白之含量，其中，所述兩種組蛋白係選自由下列項目所構成之群組：組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。

根據一種實施例，判定三種組蛋白之含量，其中，該組蛋白為組蛋白H2A、組蛋白H2B、及組蛋白H4。

根據一種實施例，所述方法進一步包含將一內標準品添加至該測試樣品內。

根據一種實施例，內標準品包含已定義濃度之至少一胜肽。

根據一種實施例，至少一胜肽之序列係對應於一組蛋白之延伸部分、結構域、或表位，所述組蛋白係選自由下列項目所構成之群組：組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。

根據一種實施例，內標準品包含具有已定義濃度之至少兩種胜肽。較佳者，所述二或多種胜肽各自之序列係分別對應於二或多種組蛋白之延伸部分、結構域、或表位，其中，所述組蛋白係選自由下列項目所構成之群組：組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。

根據一種實施例，內標準品包含具有已定義濃度之至少三種胜肽。較佳者，所述三或多種胜肽各自之序列係分別對應於三或多種組蛋白之延伸部分、結構域、或表位，其中，所述組蛋白係選自由下列項目所構成之群組：組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。

根據一種實施例，所述內標準品中之至少一胜肽包含一選自由下列項目所構成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、及/或SEQ ID NO: 34。

於此種情況中，應注意之處是，SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17關於樣品經蛋白酶消化後最終判定存在於樣品中之胜肽。除上述胜肽外，亦可改用具有經蛋白酶消化後即去除之N端及C端外伸之胜肽。此類胜肽例如為SEQ ID NO: 30，SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 34，其經胰蛋白酶處理後發生斷裂，因而產生SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17之胜肽。

當然，在SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 34之胜肽外，亦可改用具有更長N端及C端外伸之胜肽，只要此等胜肽經蛋白酶消化後能夠產生與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17相同之胜肽即可。

可用於本發明之優選胜肽組可如圖11所示。

根據一種實施例，內標準品中至少一胜肽係經選擇而使其不包含M 殘基。M (Met)包含一硫醚，且在樣品製備過程中會部分氧化，因此導致兩種不同胜肽產生(還原M及氧化M)，兩者皆必須量化。

或者，可用甲硫胺酸硫氧化物(MetO)取代M，此時使用一字母代碼「B」。

1) 例如離胺酸或精胺酸之單、二或三甲基化，

2) 例如離胺酸或天門冬醯胺之乙醯化，或

3) 例如酪胺酸、蘇胺酸或絲胺酸之磷酸化。

根據一種實施例，在均質化處理之前或之後，測試樣品並不經免疫沉澱處理或由免疫沉澱取得。

根據一種實施例，用於消化該測試樣品之蛋白酶為胰蛋白酶。

根據一種實施例，測試樣品係選自由下列項目所構成之群組：

1) 一包含蛋白質之生物樣品萃取物；

2) 一初代非培養而得之樣品；及/或

3) 取自一或多個細胞株之樣品。

根據一種實施例，色層分析及/或光譜分析之步驟包含LC-MS/MS分析。

根據一種實施例，所述方法進一步包含提供一經下列方式建立之校正表、校正曲線或校正演算法：

1) 提供懸浮、分散或以其他方式可數細胞之至少二樣品，其中，所述至少二樣品具有不同之細胞濃度；

2) 判定所述至少二樣品中之細胞數；

3) 根據上述任一實施例之方法，判定所述至少二樣品中至少一組蛋白之含量；以及

4) 藉由將所述至少二樣品中之組蛋白含量與細胞數相關聯，建立一校正表、校正曲線或校正演算法。

此種方法可為，例如，一或多個細胞相對於基於組蛋白之訊號進行之滴定，如以上述質譜法所取得。更精確而言，係判定經胰蛋白酶消化後所取得內生組蛋白胜肽相對於其重型同位素標記內標準品胜肽之比例，並將結果之組蛋白含量關聯於細胞數。

根據數種實施例，所述樣品中之細胞數係以選自由下列項目所組成之群組之至少一方法判定：

1) 人工(光學)計數；

2) 使用一細胞計數器之自動化計數；

3) 使用影像分析計數。

細胞計數方法通常可分為幾種。人工(光學)計數通常採用計數盤(counting chamber)進行，其是一種特別為細胞計數需求所設計之顯微鏡載玻片。血球計及Sedgewick Rafter計數盤為兩種類型之計數盤。血球計中央設有兩個格盤，在計數時，格盤上覆蓋有特殊蓋玻片。將一滴細胞培養物放置在格盤與蓋玻片之間，經由毛細作用填滿。在顯微鏡下觀察樣品，利用網格以人工方式計算已知大小區域中之細胞數量。格盤與蓋玻片間之相隔距離係經預先設定，因此能夠算出所計數培養物之體積，並據以計算細胞濃度。若於流體中加入細胞存活力染劑，則亦可計算細胞存活力。

自動化細胞計數通常使用庫爾特計數器。此裝置可計算細胞數並測量其體積。其原理係利用細胞展現之強大電阻；換言之，細胞幾乎不導電。在庫爾特計數器中，細胞在具有導電性之溶液中游動，並逐一被吸入狹縫中。狹縫兩側為具有導電能力之電極。當狹縫中沒有細胞存在時，電流不會減弱，但當細胞遭狹縫吸入時，電流遭到阻力。庫爾特計數器計算上述現象發生之次數，並測量電流(因此亦知電阻)，此數值與受陷細胞之體積直接相關。CASY細胞計數技術提供類似系統。或可使用流式細胞術，其係使細胞以細流方式通過雷射光束前方，因而光束能夠逐一照射於細胞上，並利用光偵測器接收由細胞所反射之光線。

影像分析計數，係取得高品質顯微鏡影像後交由數位影像處理器進行分析，例如偵測細胞邊緣及/或細胞核，而後運用統計分類演算法在影像分析任務中進行自動化細胞偵測及計數。

根據數種實施例，該懸浮、分散或以其他方式可數細胞之樣品中之細胞為以下至少一者：

1) 二倍體細胞，及/或

2) 單核細胞。

如此可確保判定之組蛋白含量對於標準細胞類型具有代表性。

根據一種實施例，該懸浮、分散或以其他方式可數細胞之樣品為一血液樣品。

較佳者，血液樣品包含，或實質上包含，PBMC(外周血單核細胞)。

於其他實施例中，該懸浮、分散或以其他方式可數細胞之樣品中之細胞可為已分離並置於懸浮狀態之其他細胞類型，例如經由胞外基質之酵素消化作用。此種細胞可包含懸浮肝細胞、懸浮卵巢細胞等等，不以此為限。

因此，應知本發明之方法與Edfors等人(2016)所揭露之方法具有實質上之差異。先前文獻之作者並未考量樣品處理過程中之任何蛋白/組蛋白損失或不完整細胞裂解，其係經由「每一細胞之組蛋白數量」之積分，將組蛋白之絕對數量(如經由加入(spike-in)內標準品而判定者)轉換為細胞數目(見圖1；式5)。由於此總組蛋白數目值係建立於DNA與組蛋白之1:1關聯，其為一任意值，因此，認定所有組蛋白均與DNA結合且對於未結合之組蛋白全然不考量(參見「Edfors et al., 2016」)。

與之相反，本發明之方法將這些處理過程中之損失納入考量。

實施例

雖然本發明已於圖式及以上敘述中詳細說明，但此等圖說及敘述僅屬說明或實施例性質，不具限制性；本發明並不限於上述實施例。熟悉此技藝人士於實施所請發明時，可經由對圖式、揭露內容及請求項之研究而領會並得出對於所述實施例之其他變化。於請求項中，「包含」一詞並不排除其他元件或步驟，且不定冠詞「一」並不排除複數。不同依附項中雖引述特定測量值，但不表示不可利用此等測量值之組合發揮優點。請求項中之所有參考符號不應對本發明之範圍構成限制。

在此揭露之所有胺基酸序列均是自N端顯示至C端。

實施例 1

使用人類急性骨髓性白血病細胞株MUTZ-3，做為細胞株中MHC蛋白質之生物來源。

收集500×10 ⁶個細胞，置於含CHAPS清潔劑之緩衝液中進行細胞裂解，並利用超音波技術均質化。以超高速離心去除不溶化合物，並將澄清後裂解物存放於-80°C以待後續處理。

進行後續下游分析之前，利用BCA檢測判定澄清後裂解物中之蛋白質濃度。50 mM碳酸氫銨中牛血清白蛋白之滴定系列用為校正曲線，以計算細胞裂解物中之總蛋白質濃度。澄清後裂解物中之蛋白質濃度為13.4 µg µL ^-1。

在樣品消化之前，使用50 mM碳酸氫銨為稀釋液，將含有相關外伸胜肽的內標準品混合物以25 pmol µL ^-1之儲備濃度稀釋至100 fmol µL ^-1，所述外伸胜肽如表1所示(亦可隨選為表2–表4所示者)。

隨後，將150 µL SMART Digest緩衝液、10 µL之100 fmol µL ^-1內標準品混合物、20 µg來自MUTZ-3細胞株裂解物之總蛋白(亦即如先前判定之1.49 µL之13.4 µg µL ^-1裂解物)加入至對應SMART Digest胰蛋白酶試樣管，以啟動蛋白水解消化反應。最後加入H ₂O _dd直至總體積為200 µL，並將反應管攪動3秒。

將樣品轉移至預熱後之加熱組件，於70°C以1,400 rpm之轉速培養90分鐘，以進行高效率之蛋白水解消化。而後為了使胰蛋白酶變性以對蛋白水解消化作用達成不可逆之中止，將TFA加入反應管達到最終濃度0.5%，使得pH降低至＜ 3。

為在LC-MS/MS分析之前淨化樣品(亦即去除鹽及例如胰蛋白酶珠等其他高分子量化合物)，以0.1 % TFA為C18結合胜肽之清洗溶劑，進行C18 反相固相萃取。經以70% ACN沖提胜肽後，將樣品以凍乾法處理至完全乾燥，並隨後重溶於5% FA，達到500 ng µL ^-1之濃度。

而後將胜肽混合物交付LC-MS/MS，所用之奈米ACQUITY UPLC系統(Waters)線上耦接於Orbitrap Fusion™ Tribrid™質譜儀(Thermo Fisher Scientific)，流速設定為300 nl min ^-1。經由三次技術性重複取得數據，每輪LC-MS/MS均以總計250 ng之樣品載入管柱。

質譜儀以預定排程平行反應監測(sPRM)模式操作，以對預選探針組進行標定分析。利用以溶劑A (0.1 % FA之水溶液)與溶劑B (0.1 % FA之ACN溶液)構成之42分鐘三階段線性二元梯度，執行奈米流sPRM測定。

為順利進行胜肽離子解離，採用較高能量碰撞解離(HCD)，實施條件為27之正規化碰撞能量(NCE)、200 ms之最大注入時間、以及50,000之自動增益控制(AGC)目標。在軌道阱(orbitrap)經以120,000解析度取得完整MS數據，HCD FTMS2則是以30,000之解析度掃描。在四極中以2 m/z之分離窗(isolation window)執行前驅物離子分離。將先前就各胜肽所判定之最強前驅物離子(z = 2-4)用於目標分析。

於分析並產生前驅物離子納入清單時，選擇未標記內生性及重標記之內標準品胜肽變體，額外採用一預設滯留時間長度，在此期間自管柱取得待沖提之胜肽。若為含Met胜肽，取得未標記及同位素標記氧化形式，亦取得未標記還原變體。

納入清單最終總計包含36個前驅物離子。設定重複觸發前驅物之滯留時間框時應注意不超過3秒週期時間，使得每一峰值至少包含8個數據點。

利用Skyline軟體執行數據分析(參見「MacLean et al., 2010」) 以人工方式調整並檢視譜峰積分、過渡干涉及譜峰邊緣。為每一前驅物離子至少考量四個過渡，且視情況排除a _n、b _n、y _n離子(其中n ≤ 2)。其他成功偵測之過濾條件包括10 ppm之最大質量偏離，以及以0.9以上資料庫點積表示之未標記與同位素標記胜肽形式之光譜相似性。將前驅物離子數據匯入進行後續驗證，但因缺乏特異性，並不繼續用於量化分析。

將內生光形式之總片段離子強度除以同位素標記內標準品之總片段離子強度的總和，計算總胜肽強度。使用內部建立腳本進行後續數據處理。

簡言之，利用先前取得、不含HLA酵母裂解物中消化重新摺疊HLA-A*02:01/β2m單體滴定系列後所建立之胜肽中心校正曲線，先將每一胜肽中心比率換算成每一總蛋白之胜肽濃度，單位為fmol µg ^-1。

先後利用RNAseq資料及TRON上之電腦模擬計算，判定細胞株MUTZ-3之樣品特定HLA同種異型組成。篩選MUTZ-3中所存在之各樣品非HLA-A*02:01同種異型蛋白質序列 (A*03:01、B*44:02、C*04:01、C*07:04)，以判斷是否出現九種分析中HLA-A*02:01胜肽之任一種(表1)，並據以指派同種異型特定胜肽群。

由於β2m並未展現任何序列多態性，而是較為恆定，將兩種胜肽(SEQ ID NO: 11與SEQ ID NO: 12)合併，不進行樣品特定分型檢視。

利用樣品依賴性HLA同種異型組成物結合相對於SEQ ID NO: 01至SEQ ID NO: 10之電腦模擬胰蛋白酶消化爆破，最終可將九種分析中HLA-A*02:01 (因不在此討論之理由排除SEQ ID NO: 7)胜肽結簇為不同子群，依其於樣品中之匹配HLA同種異型而定。

舉例而言，在MUTZ-3中，僅有胜肽SEQ ID NO: 4、6及8為HLA-A*02:01所獨有，而例如SEQ ID NO: 1、3及5另與HLA-A*03:01匹配，因此排除於HLA-A*02:01之分析外。如此可得出MUTZ-3細胞裂解物中β2m之絕對豐度64.7 fmol µg ^-1，HLA-A*02:01為12.9 fmol µg ^-1，兩者之標準差均低於20%。

利用HLA-A*02:01對照[HLA-A*02:01 + HLA-A*03:01；17.8 fmol µg ^-1]之差示定量可間接得知HLA-A*03:01在MUTZ-3中之總豐度，其值為17.8-12.9 fmol µg ^-1= 4.9 fmol µg ^-1。同理，HLA-C*07:04蛋白含量之分析雖僅提供0.8 fmol µg ^-1之含量，可換算出HLA-C*07:04與HLA-A*02:01含量在MUTZ-3中之差多達十倍。

進一步納入蛋白質濃度及總裂解物體積可得知每一細胞裂解物之總胜肽量，如式2所示。藉由進一步將樣品細胞數納入考量，在此為500×10 ⁶細胞，最終可取得每一細胞之蛋白質拷貝數。於MUTZ-3中，β2m為5.6×10 ⁶，HLA-A*02:01為1.1×10 ⁶個分子。在MUTZ-3中β2m與HLA-A*02:01總蛋白豐度之差多達五倍。

實施例 2 ：

使用人類肝細胞上皮癌樣品(以下稱為「HCC-1」)，做為初代非培養組織中MHC蛋白質之生物來源。

將於德國圖賓根大學醫院(University Hospital Tuebingen)收集而得之總計0.68 g腫瘤組織，置於含CHAPS清潔劑之緩衝液中進行細胞裂解，並利用超音波技術均質化。以超高速離心去除不溶化合物，並將澄清後裂解物存放於-80°C以待後續處理。

進行後續下游分析之前，利用BCA檢測判定澄清後裂解物中之蛋白質濃度。50 mM碳酸氫銨中牛血清白蛋白之滴定系列用為校正曲線，以計算細胞裂解物中之總蛋白質濃度。澄清後裂解物中之蛋白質濃度為18.9 µg µL ^-1。

依據樣品中總DNA含量之定量判定對應樣品細胞數。使用均質化未離心細胞裂解物之等分試樣進行DNA分離。簡言之，使用螢光Qubit檢驗(Thermo Fisher Scientific)對DNA進行分離及量化。利用已知細胞數之外周血單核細胞之滴定系列，自DNA含量換算細胞數。

在樣品消化之前，使用50 mM 碳酸氫銨為稀釋液，將含有相關外伸胜肽的內標準品混合物以25 pmol µL ^-1之儲備濃度稀釋至100 fmol µL ^-1，所述外伸胜肽如表1所示(亦可隨選為表2–表4所示者)。

隨後，將150 µL SMART Digest緩衝液、10 µL之100 fmol µL ^-1內標準品混合物、20 µg來自HCC-1細胞裂解物之總蛋白(亦即如先前判定之1.1 µL之18.9 µg µL ^-1裂解物)加入至對應SMART Digest胰蛋白酶試樣管，以啟動蛋白水解消化反應。最後加入H ₂O _dd直至總體積為200 µL，並將反應管攪動3秒。

為在LC-MS/MS分析之前淨化樣品(亦即去除鹽及例如胰蛋白酶珠等其他高分子量化合物)，以0.1 % TFA為C18結合胜肽之清洗溶劑，進行C18反相固相萃取。經以70% ACN沖提胜肽後，將樣品以凍乾法處理至完全乾燥，並隨後重溶於5% FA，達到500 ng µL ^-1之濃度。

而後將胜肽混合物交付液相層析耦接質譜分析(LC-MS/MS)，所用之奈米ACQUITY UPLC系統 (Waters)線上耦接於Orbitrap Fusion™ Tribrid™質譜儀(Thermo Fisher Scientific)，流速設定為300 nl min ^-1。經由三次技術性重複取得數據，每輪LC-MS/MS均以總計250 ng之樣品載入管柱。

質譜儀以預定排程平行反應監測(sPRM)模式操作，以對預選探針組進行標定分析。利用以溶劑A (0.1 % FA之水溶液)與溶劑B (0.1 % FA之ACN溶液)構成之42分鐘三階段線性二元梯度，執行奈米流sPRM測定。為順利進行胜肽離子解離，採用較高能量碰撞解離(HCD)，實施條件為27之正規化碰撞能量(NCE)、200 ms之最大注入時間、以及50,000之自動增益控制(AGC)目標。在軌道阱經以120,000解析度取得完整MS數據，HCD FTMS2則是以30,000之解析度掃描。在四極中以2b m/z之分離窗執行前驅物離子分離。將先前就各胜肽所判定之最強前驅物離子(z = 2-4)用於目標分析。

簡言之，利用先前取得、不含HLA酵母裂解物中消化重新摺疊HLA-A*02:01/β2m單體滴定系列後所建立之胜肽中心校正曲線，先將每一胜肽中心比率換算成每一總蛋白之胜肽濃度，單位為fmol µg ^-1。結果示於圖7。

先後利用RNAseq資料及TRON伺服器(Seq2HLA演算法；分型示於圖9B)上之電腦模擬計算，判定非培養初代組織樣品HCC-1之樣品特定HLA同種異型組成。篩選HCC-1中所存在之各樣品非HLA-A*02:01同種異型蛋白質序列 (A*23:01、B*15:01、B*44:03、C*01:02、C*04:01)，以判斷是否出現九種分析中HLA-A*02:01胜肽之任一種(表1)，並據以指派同種異型特定胜肽群(圖9B下方表及圖9C)。

利用樣品依賴性HLA同種異型組成物結合相對於SEQ ID NO: 01至SEQ ID NO: 10之電腦模擬胰蛋白酶消化爆破，最終可將九種分析中HLA-A*02:01胜肽結簇為不同子群，依其於樣品中之匹配HLA同種異型而定。

在此，僅有胜肽SEQ ID NO: 4、5、8及10為HLA-A*02:01所獨有，而例如SEQ ID NO: 3、6及9則另與HLA-A*23:01匹配，因此排除於HLA-A*02:01之分析外。如此可得出HCC-1細胞裂解物中β2m之絕對豐度為35.5 fmol µg ^-1，HLA-A*02:01為7.0 fmol µg ^-1，兩者之標準差均低於15%。

利用HLA-A*02:01對照[HLA-A*02:01 + HLA-A*23:01；13.2 fmol µg ^-1]之差示定量可間接得知HLA-A*23:01在HCC-1中之總豐度，其值為13.2-7.0 fmol µg ^-1= 6.2 fmol µg ^-1。同理，HLA-C*01:02蛋白含量之分析雖僅提供0.7 fmol µg ^-1之含量，可換算出HLA-C*01:02與HLA-A*02:01含量在HCC-1中之差多達十倍。此觀察證實實施例1關於HLA-C比較HLA-A相對表達之發現，兩種情況下皆為十倍。

進一步納入蛋白質濃度及總裂解物體積可得知每一細胞裂解物之總胜肽量，如式2所示。藉由進一步將樣品細胞數納入考量，在此為240×10 ⁶細胞，最終可取得每一細胞之蛋白質拷貝數。於HCC-1中，β2m為5.6×10 ⁶，HLA-A*02:01為1.1×10 ⁶個分子，恰巧與實施例1數值相符。在HCC-1中β2m與HLA-A*02:01 總蛋白豐度之差亦多達五倍。

實施例 3

使用人類小細胞肺上皮癌(以下稱為「SCLC-1」)為初代非培養組織中MHC蛋白質之生物來源。由Asterand Bioscience所提供總計0.61 g之腫瘤組織置於含CHAPS清潔劑之緩衝液中進行細胞裂解，並利用超音波技術均質化。以超高速離心去除不溶化合物，並將澄清後裂解物存放於-80°C以待後續處理。進行後續下游分析之前，利用BCA測定判定澄清後裂解物中之蛋白質濃度。50 mM碳酸氫銨中牛血清白蛋白之滴定系列用為校正曲線，以計算細胞裂解物中之總蛋白質濃度。澄清後裂解物中之蛋白質濃度為12.4 μg μL ^-1。相應的樣本細胞數是基於其組織重量的反向相關性通過與一組數據相關的基於組織重量的迴歸曲線確定的，其中細胞數先前已通過螢光染色DNA定量確定。

將來自SCLC-1細胞裂解物之20 μg總蛋白(亦即如先前判定之1.6 μL之12.4 μg μL ^-1裂解物)加入反應管，藉此啟動蛋白水解作用。為使半胱胺酸雙硫鍵還原並烷化，將三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)及氯乙醯胺(CAA)分別添加至最終濃度10 mM及40 mM，而後於70°C培養10分鐘。隨後，加入200 µg羧化順磁珠，以達成蛋白富集與純化。

添加ACN至50% (V/V)之最終濃度，而後於24°C培養10分鐘並以1,000 rpm之速度攪動，使蛋白結合於珠體。將樣品置於磁性分離架，去除上清液，再加入80% EtOH以去除清潔劑。

去除上清液，添加EtOH，再於磁性分離架上去除上清液。使用50 mM 碳酸氫銨為稀釋液，將含有如表1-4所示外伸胜肽之內標準品混合物稀釋至100 fmol µL ^-1，而後將10 µL稀釋之內標準品混合物加入反應管。

將100 µL AmBic (100 mM)及2 µg胰蛋白酶/LysC (Promega)加入，並將ProteaseMax (Promega)添加至0.03 %之最終濃度，以進行蛋白水解消化作用。隨後將樣品置於37°C，並以1,000 rpm之轉速培養18小時。

蛋白水解消化作用完成後，將樣品置於磁性分離架上，並將含有胜肽混合物之上清液移至新反應管。

而後對胜肽混合物進行液相層析耦接質譜分析(LC-MS/MS)，所用之EvoSep One (Evosep)線上耦接於Orbitrap Eclipse™質譜儀(Thermo Fisher Scientific)。取得兩次技術重複數據，每輪LC-MS/MS均以總計500 ng之樣品載入管柱。

質譜儀以預定排程平行反應監測(sPRM)模式操作，以對預選探針組進行標定分析。使用由溶劑A (0.1 % FA之水溶液)與溶劑B(0.1 % FA之ACN溶液)所構成之正規化預形成44分鐘二元梯度，執行奈米流sPRM測定。

為順利進行胜肽離子解離，進行較高能量碰撞解離(HCD)，操作條件為27之正規化碰撞能量(NCE)、54 ms之最大注入時間、以及1,000%之自動增益控制(AGC)目標。在軌道阱經以120,000解析度取得完整MS數據，HCD FTMS2則是以30,000之解析度掃描。在四極中以1.6 m/z之分離窗執行前驅物離子分離。將先前就各胜肽所判定之最強前驅物離子(z = 2-4)用於目標分析。

納入清單總計包含66個前驅物離子。設定重複觸發前驅物之滯留時間框時應注意不超過3秒週期時間，使得每一峰值至少包含7個數據點。

利用Skyline軟體執行數據分析(參見「MacLean et al., 2010」)以人工方式調整並檢視譜峰積分、過渡干涉及譜峰邊緣。為每一前驅物離子至少考量四個過渡，且視情況排除a _n、b _n、y _n離子(其中n ≤ 2)。其他成功偵測之過濾條件包括10 ppm之最大質量偏離，以及以0.9以上資料庫點積表示之未標記與同位素標記胜肽形式之光譜相似性。將前驅物離子數據匯入進行後續驗證，但因缺乏特異性，並不繼續用於量化分析。

簡言之，利用先前取得、不含HLA酵母裂解物中消化重新摺疊HLA-A*02:01/β2m單體或HLA-B*07:02/β2m單體滴定系列後所建立之胜肽中心校正曲線，先將每一胜肽中心比率換算成每一總蛋白之胜肽濃度，單位為fmol µg ^-1。結果示於圖11。

先後利用RNAseq資料及TRON伺服器(Seq2HLA演算法；分型示於圖11)上之電腦模擬計算，判定非培養初代組織樣品SCLC-1之樣品特定HLA同種異型組成。篩選SCLC-1中所存在之各樣品非HLA A*02:01 / B*07:02同種異型蛋白質序列 (A*11:01、B*35:01、C*04:01及C*07:02)，以判斷是否出現九種分析中HLA-A*02:01胜肽(表1)或八種B*07:02特定胜肽(表4)之任一種，並據以指派同種異型特定胜肽群(圖11 B下方表及圖11 C)。

利用樣品依賴性HLA同種異型組成物結合相對於各自的SEQ ID之電腦模擬胰蛋白酶消化和爆破，最終可將九種分析中HLA-A*02:01及八種B*07:02胜肽結簇為不同子群，依其於樣品中之匹配HLA同種異型而定。

在此，僅有胜肽SEQ ID NO: 4、6及8為HLA-A*02:01所獨有，而例如SEQ ID NO: 3及5則另與HLA-A*11:01匹配，且因此排除於HLA-A*02:01之定量外。SEQ ID NO: 53胜肽在此單獨匹配於B*07:02。如此可得知SCLC-1細胞裂解物中，β2m之絕對豐度為41.6 fmol μg ^-1，HLA-A*02:01為19.4 fmol μg ^-1，且HLA-B*07:02為11.4 fmol μg ^-1，三者之計算標準差均低於25%。

實施例 4 ：組蛋白衍生細胞數

組蛋白為存在於真核細胞核中之高鹼性蛋白質，真核細胞核將DNA包裝整理成稱為核小體之結構單元。組蛋白為染色質之首要蛋白質成分，如同線軸可供DNA纏繞，且影響基因調控。由於二倍體細胞中之DNA量恆定，組蛋白量亦固定不變。組蛋白分為五大家族：H1/H5、H2A、H2B、H3、及H4。組蛋白H2A、H2B、H3、及H4稱為核心組蛋白，組蛋白H1/H5稱為連接組蛋白。

根據本發明方法之一種實施例，其豐度大致與該樣品中之總細胞數成比例之至少一蛋白為組蛋白，例如組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。組蛋白H2A (UniProt ID B2R5B3)為涉及真核細胞中染色質結構之主要組蛋白。H2A利用稱為「組蛋白摺疊」之蛋白質摺疊。組蛋白摺疊為由兩個環(loop)連接之三螺旋(helix)核心結構域。此連接形成「握手排列(handshake arrangement)」。尤其，此部分稱為螺旋轉折螺旋模體(helix-turn-helix motif)，可與H2B二聚化。組蛋白H2B (UniProt ID B4DR52)為另一涉及真核細胞中染色質結構之主要組蛋白。組蛋白H2B之兩個拷貝數與組蛋白H2A、組蛋白H3、及組蛋白H4之各兩個拷貝數結合可形成核小體之八聚體核心[2]，構成DNA之結構。組蛋白H4 (UniProt ID Q6B823)為又一涉及真核細胞中染色質結構之主要組蛋白。組蛋白H3及H4結合而形成H3-H4二聚體，兩個H3-H4二聚體組合可形成一個四聚體。此四聚體再與兩個H2a-H2b二聚體結合則形成緊緻之組蛋白八聚體核心。一般而言，組蛋白之豐度，由於其DNA結合能力，係與樣品中之總細胞數成比例。因此，為樣品中之組蛋白定量可用於估計其中所包含之總細胞數。

以下胜肽序列可用於不同組蛋白之定量

組蛋白H2A	SEQ ID NO: 13/30
組蛋白H2B	SEQ ID NO: 14/31
組蛋白H4	SEQ ID NO: 15/32
組蛋白H4	SEQ ID NO: 16/33
組蛋白H4	SEQ ID NO: 17/34

以 PBMC 校正

於判定組蛋白胜肽之校正曲線時，校正物必須具備預設之二倍體細胞數。因此，選擇外周血單核細胞為校正物，因其細胞數可經人工細胞計數輕易評估。為取得校正曲線，自全血中分離PBMC，而後再將之分為5 Mio、10 Mio、50 Mio、100 Mio、200 Mio、及500 Mio細胞之等分試樣(見圖12A及圖13)。將結果之細胞沉澱物(cell pellet)置於含CHAPS清潔劑之緩衝液中進行細胞裂解，並利用超音波技術均質化。以超高速離心去除不溶化合物，並將澄清後裂解物存放於-80°C以待後續處理。進行後續下游分析之前，利用BCA檢測判定澄清後裂解物中之蛋白質濃度。50 mM碳酸氫銨中牛血清白蛋白之滴定系列用為校正曲線，以計算細胞裂解物中之總蛋白質濃度。澄清後裂解物中蛋白質濃度測量如下：

細胞數	蛋白質濃度 [µg µL- ¹]
1 mio	0.12
5 Mio	0.33
10 Mio	0.78
50 Mio	2.35
100 Mio	3.23
200 Mio	4.61
250 Mio	4.33
350 Mio	3.79
500 Mio	5.21

隨後，將150 µL SMART Digest緩衝液、10 µL之100 fmol µL ^-1內標準品混合物、20 µg來自各自PBMC裂解物之總蛋白加入至對應SMART Digest胰蛋白酶試樣管，以啟動蛋白水解消化反應。

最後加入H ₂O _dd直至總體積為200 µL，並將反應管攪動3秒。將樣品轉移至預熱後之加熱組件，於70°C以1,400 rpm之轉速培養90分鐘，以進行高效率之蛋白水解消化。而後為了使胰蛋白酶變性以對蛋白水解消化作用達成不可逆之中止，將TFA加入反應管達到最終濃度0.5%，使得pH降低至＜ 3。

而後將胜肽混合物交付液相層析耦接質譜分析(LC-MS/MS)，所用之奈米ACQUITY UPLC系統(Waters)線上耦接於Orbitrap Fusion™ Tribrid™質譜儀(Thermo Fisher Scientific)，流速設定為300 nl min ^-1。經由三次技術性重複取得數據，每輪LC-MS/MS均以總計250 ng之樣品載入管柱。

質譜儀以預定排程平行反應監測(sPRM)模式操作，以對預選探針組進行標定分析。利用以溶劑A (0.1 % FA之水溶液)與溶劑B (0.1 % FA之ACN溶液)構成之42分鐘三階段線性二元梯度，執行奈米流sPRM測定。為使胜肽離子順利解離，採用較高能量碰撞解離(HCD)，實施條件為27之正規化碰撞能量(NCE)、200 ms之最大注入時間、以及50,000之自動增益控制(AGC)目標。在軌道阱經以120,000解析度取得完整MS數據，HCD FTMS2則是以30,000之解析度掃描。在四極中以2 m/z之分離窗執行前驅物離子分離。將先前為每一組蛋白胜肽判定之最強前驅物離子(z = 2-4)用於目標分析。

使用Skyline軟體進行數據分析(參見「MacLean et al., 2010」)。以人工方式調整並檢視譜峰積分、過渡干涉及譜峰邊緣。為每一前驅物離子至少考量四個過渡，且視情況排除a _n、b _n、y _n離子(其中≤ 2)。其他成功偵測之過濾條件包括10 ppm之最大質量偏離，以及以0.9以上資料庫點積表示之未標記(「輕」)與同位素標記(「重」)胜肽形式之光譜相似性。將前驅物離子數據匯入進行後續驗證，但因缺乏特異性，並不繼續用於量化分析。將內生光形式之總片段離子強度除以同位素標記內標準品之總片段離子強度的總和，計算總胜肽強度。使用內部建立腳本進行後續數據處理。

轉移至其他組織

取自脾臟、軟骨、脂肪組織、心臟、腎臟及肝細胞上皮癌(HCC)之組織樣品係以類似方式處理，用以判定組蛋白含量。基於以PBMC取得之校正曲線(見例如圖13)計算總細胞數。結果示於圖12B。

本發明之關鍵在於不僅是取得組蛋白之數量(經由樣品MS分析，並使用及添加內標準品進行絕對定量所判定者，如揭露於Edfors等人(2016))，更利用此一組蛋白數量，將之視為某種「任意值」，並將之關聯於樣品之實際細胞數。藉此，本發明不僅考量樣品處理過程中之蛋白/組蛋白損失，亦考量可能存在於細胞核中之所有未連接組蛋白。利用PBMC(可加入於例如酵母等不含組蛋白之蛋白基質中，或直接為純PBMC)之滴定系列產生一校正曲線，藉此計算組蛋白之總數。

圖12 A及圖12 B顯示健康及罹癌初代組織之若干實施例，發明人已就此經由添加標準品計算總組蛋白數量，並利用先前取得校正曲線將之換算回總細胞數。H2ATR-001為SEQ ID NO: 13，H2BTR-001為SEQ ID NO: 14，H4TR-001為SEQ ID NO: 15，H4TR-002為SEQ ID NO: 16。但應知，於此方法中，添加之胜肽包含用於胰蛋白酶消化作用之N端及C端外伸(H2ATR-001為SEQ ID NO: 30，H2BTR-001為SEQ ID NO: 31，H4TR-001為SEQ ID NO: 32，及H4TR-002為SEQ ID NO: 33)。

圖13顯示利用PBMC細胞數所建立之基於組蛋白的校正曲線。

實施例 5

如上所述，其他樣品胜肽類似物亦經確認可用於為同種異型HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02及HLA-B*44:03定量。上述胜肽示於表4。

依據圖4及圖10連同表1及表4所揭露之樣品胜肽類似物，熟悉此技藝人士可設計各種樣品胜肽類似物胜肽組，用以為樣品中之不同HLA同種異型進行個別或同時定量。

參考文獻

下列文件之整體揭露內容經參照合併於此。

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序列

以下序列構成本發明揭露內容之一部分。本發明亦提供有符合WIPO ST 25規定之電子序列列表。為免疑義，若下表與電子序列列表之間有所衝突，應以下表之序列為準。

SEQ ID NO	HLA 同種異型或蛋白 ( 實施例 )	無外伸之序列	SEQ ID NO	用於胰蛋白酶消化之有外伸之序列 ( 「外伸胜肽」 )
表 1 ：用於 *HLA-A02:01 及其他之定量之胜肽**
1	HLA-A02:01；HLA-A03:01	YFFTSV*SRPGR	18	SMRYFFTSV*SRPGR GEP
2	HLA-A*02:01	FIAV*GYVDDTQFVR	19	EPRFIAV*GYVDDTQFVR FDS
3	HLA-A02:01；HLA-A23:01；HLA-A*03:01	FDSDAASQ*R	20	FVRFDSDAASQ*R MEP
4	HLA-A*02:01	APWIEQEGPEY*WDGETR	21	EPRAPWIEQEGPEY*WDGETR KVK
5	HLA-A02:01；HLA-A03:01	VDLGTL*R	22	THRVDLGTL*R GYY
6	HLA-A02:01；HLA-A23:01	GYHQYAYDGK*	23	FLRGYHQYAYDGK* DYI
7	HLA-A*02:01	SWTAADBAAQTTK*	24	DLR SWTAADBAAQTTK HKW*
8	HLA-A*02:01	WEAAHVAEQL*R	25	KHKWEAAHVAEQL*R AYL
9	HLA-A02:01；HLA-A23:01	DGEDQTQDTELVETRPAGDGTF*QK	26	WQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTF*QK WAA
10	HLA-A*02:01	WAAVVVPSGQEQ*R	27	FQKWAAVVVPSGQEQ*R YTC
表 2 ：用於 β2m 之定量之胜肽
11	β2m	VEHSDL*SFSK	28	IEKVEHSDL*SFSK DWS
12	β2m	VNHVTL*SQPK	29	ACRVNHVTL*SQPK IVK
表 3 ：用於組蛋白之定量之胜肽
13	取自組蛋白H2A	AGL*QFPVGR	30	SSRAGL*QFPVGR VHR
14	取自組蛋白H2B	LLLPGEL*AK	31	AVRLLLPGEL*AK HAV
15	取自組蛋白H4	ISGL*IYEETR	32	VKRISGL*IYEETR GVL
16	取自組蛋白H4	VFL*ENVIR	33	VLKVFL*ENVIR DAV
17	取自組蛋白H4	TVTABDVVYAL*K	34	KRKTVTABDVVYAL*K RQG
表 4 ：用於其他 HLA 同種異型之定量之胜肽
44	HLA-A*01:01	ANL*GTLR	63	TDRANL*GTLR GYY
45	HLA-A*24:02	APWIEQEGPEY*WDEETGK	64	EPRAPWIEQEGPEY*WDEETGK VKA
46	HLA-B07:02；HLA-B08:01；HLA-B44:02；HLA-B44:03	AP*WIEQEGPEYWDR	65	EPRAP*WIEQEGPEYWDR NTQ
47	HLA-A01:01；HLA-A03:01；HLA-B07:02；HLA-B08:01	DYI*ALNEDLR	66	DGKDYI*ALNEDLR SWT
48	HLA-A*01:01	FDSDAASQK*	67	FVRFDSDAASQK* MEP
49	HLA-A*24:02	DYIAL*K	68	DGKDYIAL*K EDL
50	HLA-B07:02；HLA-B08:01	FDSDAASP*R	69	FVRFDSDAASP*R EEP
51	HLA-B07:02；HLA-B08:01	FI*SVGYVDDTQFVR	70	EPRFI*SVGYVDDTQFVR FDS
52	HLA-B44:02；HLA-B44:03	FITVGYVDDTL*FVR	71	EPRFITVGYVDDTL*FVR FDS
53	HLA-B*07:02	GHDQYAYDGK*	72	LLRGHDQYAYDGK* DYI
54	HLA-B*08:01	GHNQYAYDGK*	73	LLRGHNQYAYDGK* DYI
55	HLA-B44:02；HLA-B44:03	GYDQDAYDGK*	74	LLRGYDQDAYDGK* DYI
56	HLA-B07:02；HLA-B08:01	SWTAADTAAQI*TQR	75	DLRSWTAADTAAQI*TQR KWE
57	HLA-B44:02；HLA-B44:03	TNTQ*TYR	76	ISKTNTQ*TYR ENL
58	HLA-B08:01；HLA-B44:02	V*AEQDR	77	AARV*AEQDR AYL
59	HLA-A01:01；HLA-A03:01；HLA-A24:02；HLA-B07:02；HLA-B08:01；HLA-B44:02；HLA-B*44:03	WAAVVVP*SGEEQR	78	FQKWAAVVVP*SGEEQR YTC
60	HLA-A*24:02	YFSTSV*SRPGR	79	SMRYFSTSV*SRPGR GEP
61	HLA-B*07:02	YFYTSV*SRPGR	80	SMRYFYTSV*SRPGR GEP
62	HLA-B44:02；HLA-B44:03	YYNQSEAGSHIIQ*R	81	ALRYYNQSEAGSHIIQ*R MYG
表 5 ：其他胜肽 / 蛋白質序列
35	HLA A*02:01，UniProt ID P01892	MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMYGCDVGSDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHEAEQLRAYLDGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPTIPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKV
36	β-2-微球蛋白(β2m)，Uniprot ID P61769	MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
37	組蛋白H2A UniProt ID B2R5B3	MSGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVRRLLRKGNYAERVGAGAPVYLAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGKVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTESHHKAKGK
38	組蛋白H2B UniProt ID B4DR52	MPDPAKSAPAPKKGSKKAVTKVQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQVHPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRSTITSREIQTAVRLLLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSNPRNLSPTKPGGSEDRQPPPSQLSAIPPFCLVLRAGIAGQV
39	組蛋白H4 UniProt ID Q6B823	KPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKVFLENVIRDAVTYT
40	模板蛋白質序列	PLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLV
41	IS(內標準品)之胜肽	QNCELFEQLGEYK
42	模板蛋白質序列	TLFGDKLCTVATLRETYGE
43	IS(內標準品)之胜肽	LCTVATLR

B代表甲硫胺酸硫氧化物(MetO)，可用於取代甲硫胺酸。加底線之AA殘基顯示外伸(見內文)。可隨選以同位素標記之胺基酸殘基於後方加註星號。

本發明所引用全部出版品、專利、專利申請及其他文件無論出於任何目的而予以參照，均以其全部內容合併於此，如同個別所述出版品、專利、專利申請及其他文件各自出於任何目的而受參照所併入之程度。若在此併入之一或多個參考文獻與本發明之教示有所衝突，應以本說明書之教示為準。

無

[圖1] 為根據本發明一種實施例之流程概要。 [圖2] 為本發明一種實施例中液相層析法結合串聯式質譜法(LC-MS/MS)之流程圖。此流程包含將樣品注入LC系統(主要為HPLC，即高效LC)，藉此依據胜肽之大小將其分離，而後送入質譜儀，在此對胜肽進行離子化、加速、並以質譜(MS1)分析。隨後將來自MS1光譜之離子選擇性分段，並交由第二階段質譜法(MS2)進行分析，以產生離子片段之光譜。雖然圖中顯示者為分離之質量分析儀(MS1及MS2)，但亦有部分儀器係以單一質量分析儀完成兩階段之MS。 [圖3] 顯示HLA-A*02:01經胰蛋白酶(體外實驗或電腦模擬)消化作用產生之胜肽片段。如本發明其他處所述，胰蛋白酶切割於胺基酸K (Lys)及R (Arg)之C端。以各種方式取得且可用為內標準品之胜肽在此稱為「樣品胜肽類似物」(標以SEQ ID NO: 1 – 10)。樣品胜肽類似物用為內標準品之條件包括：(i)不含C (Cys)，(ii)較佳者不含M (Met)，但後者可由甲硫胺酸硫氧化物 (MetO)取代 (見SEQ ID NO: 7)，且(iii)不含例如NXS或NXT等N醣基化模體。為清楚顯示，M、C及NXT/NXS以加底線方式標示。 [圖4] 顯示可用於本發明方法中內標準品之樣品胜肽類似物(在此亦稱為胜肽)。B代表甲硫胺酸硫氧化物，星號顯示隨選以同位素標記之胺基酸殘基。應知，技術上，胜肽中除丙胺酸及甘胺酸外之其他殘基亦可以同位素標記。應知，於所有樣品胜肽類似物胜肽組中，具有外伸之胜肽可由非外伸對應物取代，反之亦然。例如可將SEQ ID NO: 3之胜肽以SEQ ID NO: 20之胜肽取代，或將SEQ ID NO: 30之胜肽以SEQ ID NO: 13之胜肽取代。SEQ ID NO: 1 – 10 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 18 – 27)及SEQ ID NO: 44 – 62 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 63 – 81)之胜肽可用於測量HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02及/或HLA-B*44:03，SEQ ID NO: 11 – 12 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 28 – 29)之胜肽可用於測量β-2微球蛋白，且SEQ ID NO: 13 – 17 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 30 – 34)之胜肽可用於測量H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4中之至少一者。 [圖5] 顯示LC-MS之分析步驟，繼以包含MS1及MS2之MS/MS。取自MS1之胜肽經較高能量碰撞解離(HCD)分割成段。同一胜肽(YLLPAIVHI)之多個拷貝數於胜肽骨架切割成段，以形成a、b、y離子。光譜由對應片段離子的m/z（質荷比）值處的峰組成。 [圖6] 顯示內標準品方法原理。就各分析對應樣品產生一校正曲線。為每一待分析樣品製備一組校正樣品，其中包含：(i) 升高濃度之重新摺疊單體(MRF)，其包含一MHC同種異型 (例如MHC A*02:01)及β2M、(ii) 固定濃度之內標準品、(iii) 隨選地，蛋白質裂解物，例如取自酵母者，其經胰蛋白酶消化後不會釋放任何與MHC序列完全相同之胜肽，作用為蛋白質背景。校正樣品之處理方式與實際樣品相同，特別是消化作用部分，且後續接受色層分析及/或光譜分析。經由邏輯迴歸依據MS訊號之比率計算校正曲線函數。 [圖7] 顯示假設性胜肽特定校正曲線連同其線性迴歸及對應等式。 [圖8] 顯示人類急性骨髓性白血病細胞株MUTZ-3中HLA-A*02:01與β2m之絕對定量。(A) 為各種胜肽之定量結果。根據樣品特定分型之HLA-A*02:01特有胜肽以格柱顯示。亦映射至其他HLA同種異型者以白柱顯示。(B) 顯示基礎樣品HLA分型及其對應資訊。(C) 顯示合併各種胜肽並產生對應蛋白質濃度，例如於此實施例中，SEQ ID NO: 4、6與8之平均產生HLA-A*02:01之絕對豐度。(D) 顯示考量個別樣品蛋白質濃度、總細胞裂解物體積、及細胞數，將絕對蛋白質濃度轉換為每一細胞之絕對數量(分子數量)。 [圖9] 顯示人類肝細胞上皮癌樣品中HLA-A*02:01與β2m之絕對定量。(A) 為各種胜肽之定量結果。根據樣品特定分型之HLA-A*02:01特有胜肽以格柱顯示。亦映射至其他HLA同種異型者以白柱顯示。(B) 顯示基礎樣品HLA分型及其對應資訊。(C) 顯示合併各種胜肽並產生對應蛋白質濃度，例如於此實施例中，SEQ ID NO: 4、5、8與10之平均產生HLA-A*02:01之絕對豐度。(D) 顯示考量個別樣品蛋白質濃度、總細胞裂解物體積、及細胞數，將絕對蛋白質濃度轉換為每一細胞之絕對數量(分子數量)。 [圖10] 顯示可用於本發明方法中內標準品之樣品胜肽類似物(於此亦稱為胜肽)。應知，於所有樣品胜肽類似物胜肽組中，具有外伸之胜肽可由非外伸對應物加以取代，反之亦然。例如可將SEQ ID NO: 1之胜肽以SEQ ID NO: 18之胜肽取代，或將SEQ ID NO: 26之胜肽以SEQ ID NO: 9之胜肽取代。不同樣品胜肽類似物可用於為不同HLA同種異型定量。為對樣品中超過一種同種異型進行定量，可基於此表選擇特定樣品胜肽類似物胜肽組。些許樣品胜肽類似物可能為特定同種異型所獨有，但亦有些樣品胜肽類似物出現於一種以上之同種異型。並且，因為在存在不同同種異型的樣品中，各同種異型呈不平均分布(其中一者佔絕大多數)，即便是那些並無「特有」樣品胜肽類似物之同種異型亦可被定量。B代表甲硫胺酸硫氧化物，星號顯示隨選以同位素標記之胺基酸殘基。應知，技術上，胜肽中除丙胺酸及甘胺酸外之其他殘基亦可以同位素標記。當然，上述樣品胜肽類似物可結合允許β-2微球蛋白測量之樣品胜肽類似物。例如，SEQ ID NO: 11 – 12 (或其包含外伸之對應物SEQ ID NO: 28 – 29)之胜肽亦可用於此目的。並且，可將此等樣品胜肽類似物與能夠測量H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4中至少一者之樣品胜肽類似物結合。例如，SEQ ID NO: 13 – 17之胜肽(或其包含外伸之SEQ ID NO: 30 – 34對應物)即可用於此目的。 [圖11] 顯示人類小細胞肺癌中HLA-A*02:01、HLA-B*07:02與β2m之絕對定量。(A) 為各種胜肽之定量結果。根據樣品特定分型之HLA-A*02:01或HLA-B*07:02特有胜肽分別以大方格柱或小方格柱顯示。亦映射至其他HLA同種異型者以白柱顯示。(B) 顯示基礎樣品HLA分型及其對應資訊。(C) 顯示合併各種胜肽並產生對應蛋白質濃度，例如於此實施例中，SEQ ID NO: 1、4、6與8之平均產生HLA-A*02:01之絕對豐度。(D) 顯示考量個別樣品蛋白質濃度、總細胞裂解物體積、及細胞數，將絕對蛋白質濃度轉換為每一細胞之絕對數量(分子數量)。 [圖12] 顯示不同類型組織選定樣品之絕對細胞數計算結果。經由以LC-MS所判定的樣品特定絕對組蛋白豐度取得個別細胞數，並將之反向關聯於個別PBMC校正曲線。(A) 為脾臟、PBMC、肝細胞癌(HCC)、腎臟、脂肪組織、心臟及軟骨組織之樣品絕對細胞數。四種選定組蛋白胜肽H2ATR-001、H2BTR-001、H4TR-001及H4TR-002之細胞數獨立計算，且分別繪製為對應條柱。每一樣品之四種組蛋白之中位數細胞數以一黑柱顯示。Y軸刻度表示每一樣品之絕對細胞數。(B) 顯示每一樣品之中位數細胞數，如(A)部分所示，以及每一樣品之蛋白質濃度及絕對組織重量。在血球細胞/PBMC方面，是依據已知人工計算細胞數而非組織重量進行繪圖。 [圖13] 描繪各個基於PBMC之校正曲線，用以將組蛋白拷貝數轉換為絕對細胞數。PBMC細胞數(經由人工細胞計數判定)示於x 軸，以LC-MS判定之各PBMC樣品之總組蛋白顯示於y軸。每一組蛋白胜肽(H2ATR-001、H2BTR-001、H4TR-001及H4TR-002)具有一條校正曲線。各組蛋白胜肽之擬合迴歸曲線以虛線顯示。

Claims

一種用以對一測試樣品中之一或多個MHC分子進行絕對定量之方法，該測試樣品包含至少一細胞，且該方法至少包含以下步驟： a) 對該測試樣品進行均質化處理； b) 將一內標準品添加至該測試樣品內； c) 在將該內標準品添加至該測試樣品之前或之後，以一蛋白酶對該均質化之測試樣品進行消化處理； d) 使該消化後之測試樣品進行一色層分析及/或光譜分析之步驟；以及 e) 對該測試樣品中之該一或多個MHC分子進行定量。
如請求項1所述之方法，其中，用於消化該測試樣品之該蛋白酶為胰蛋白酶。
如請求項1或2所述之方法，進一步包含在消化處理前判定該測試樣品中總蛋白質濃度之步驟。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，於均質化處理之前或之後，該測試樣品並不經免疫沉澱處理且不是由免疫沉澱取得。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該測試樣品係選自由下列項目所構成之群組： 1) 一包含蛋白質之生物樣品萃取物； 2) 一初代非培養而得之樣品；及/或 3) 取自一或多個細胞株之樣品。
如請求項5所述之方法，其中，該初代樣品係選自由下列項目所構成之群組：一組織樣品、一血液樣品、一腫瘤樣品、或一受感染組織之樣品。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該MHC為MHC第一型(MHC-I)，其係選自由下列項目所構成之群組之至少一HLA同種異型：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02及/或HLA-B*44:03。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該MHC為一人類MHC蛋白，其為人類白血球抗原A (HLA-A)及/或人類白血球抗原B (HLA-B)。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該MHC係選自由下列項目所構成之群組之至少一HLA同種異型：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02及/或HLA-B*44:03。
如請求項8或9所述之方法，其中，該HLA-A為HLA-A*02:01。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，在消化處理之後，以一強酸處理該測試樣品，以中斷該消化作用及/或使該蛋白酶沉澱或變性。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，對經由該消化處理所取得之測試樣品進行純化處理，包含固相萃取。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，在純化該測試樣品後，對所獲得之純化產物進行乾燥處理，其係經由冷凍乾燥。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該色層分析及/或光譜分析之步驟包含LC-MS/MS分析。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該色層分析及/或光譜分析之步驟包含藉由從頭定序法，對該經純化之測試樣品中之至少一胜肽進行定序。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該內標準品包含已定義濃度之至少一胜肽。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該內標準品包含一組具有三或更多胜肽之胜肽組，各該胜肽之序列對應於一HLA同種異型之延伸部分、結構域、或表位，該HLA同種異型係選自由下列項目所構成之群組：人類白血球抗原A (HLA-A) 及/或人類白血球抗原B (HLA-B)。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該胜肽之該序列對應之延伸部分、結構域、或表位所屬之HLA，係選自由下列項目所構成之群組中之至少一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02、及/或HLA-B*44:03。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該胜肽之該序列對應之延伸部分、結構域、或表位所屬之HLA為HLA-A*02:01。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該內標準品中至少一胜肽在N端及/或C端包含一胺基酸之外伸，該胺基酸之外伸包含一蛋白酶切割位點。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該胜肽組進一步包含至少一胜肽，其序列對應於β-2-微球蛋白(β2m)之一延伸部分、結構域、或表位。
如以上請求項中任一項所述之方法，進一步包含判定該測試樣品中總細胞數之步驟。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該胜肽組進一步包含至少一胜肽，其序列對應於一或多個蛋白之一延伸部分、結構域、或表位，所述蛋白之豐度大致與該測試樣品中總細胞數成比例；其豐度大致與該測試樣品中之總細胞數成比例之至少一蛋白為組蛋白，例如組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該內標準品是在以一蛋白酶對該均質化之測試樣品進行消化處理之步驟前加入至該測試樣品中。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該內標準品內之至少一胜肽係經標記。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，在該內標準品中至少一胜肽內之一胺基酸係於合成過程中納入 ¹³C及/或 ¹⁵N而具有同位素標記。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，更建立一校正例程，該校正例程包含以下步驟： 1) 提供至少二校正樣品，該等校正樣品包含一變化濃度之MHC分子標準品及一以一固定濃度加入其中之內標準品； 2) 在添加該內標準品之前或之後，以一蛋白酶對該等校正樣品進行消化處理； 3) 對以消化作用取得之校正樣品進行純化處理；以及 4) 使該消化後之校正樣品進行一色層分析及/或光譜分析之步驟。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中， 1) 該MHC分子標準品係一HLA單體，及/或 2) 該等校正樣品進一步包含酵母蛋白裂解物。
如以上請求項中任一項所述之方法，進一步包含產生一校正曲線，其基於取自該MHC分子標準品消化後之胜肽之光譜訊號與來自該內標準品之胜肽之光譜訊號兩者間之比率。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該MHC濃度係基於該正規化之蛋白質濃度而計算。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該MHC蛋白濃度對比於該測試樣品體積，係基於該測試樣品在消化處理前之總蛋白質濃度而計算。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，該測試樣品中每一細胞之MHC分子數，係基於該測試樣品之總細胞數而計算。
一種具有三或更多胜肽之胜肽組，其中，各該胜肽之序列係對應於一HLA同種異型之一延伸部分、結構域、或表位，該HLA同種異型係選自由下列項目所構成之群組：HLA-A、HLA-B、HLA-C、及/或HLA-E。
如請求項33所述之胜肽組，其中，該胜肽之該序列對應之該延伸部分、結構域、或表位所屬之該HLA為HLA-A*02。
如請求項33或34所述之胜肽組，其中，該胜肽之該序列對應之該延伸部分、結構域、或表位所屬之該HLA，係選自由下列項目所構成之群組中之至少一者：HLA-A*02:01；HLA-A*01:01；HLA-A*03:01；HLA-A*24:02；HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02、及/或HLA-B*44:03。
如請求項33至35中任一項所述之胜肽組，其中，該胜肽之該序列對應之該延伸部分、結構域、或表位所屬之該HLA為HLA-A*02:01。
如請求項33至36中任一項所述之胜肽組，進一步包含至少一胜肽，其序列對應於β-2-微球蛋白(β2m)之一延伸部分、結構域、或表位。
如請求項33至37中任一項所述之胜肽組，進一步包含至少一胜肽，其序列對應於一或多個蛋白之一延伸部分、結構域、或表位，所述蛋白之豐度大致與該測試樣品中總細胞數成比例；其豐度大致與該測試樣品中之總細胞數成比例之至少一蛋白為組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。
如請求項33至38中任一項所述之胜肽組，其中，該胜肽組中至少一胜肽之序列至少在N端及/或C端包含一胺基酸之外伸，該胺基酸之外伸包含一蛋白酶切割位點。
如請求項33至39中任一項所述之胜肽組，其包含至少一胜肽，所述胜肽包含一選自由下列項目所構成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO: 1 – SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 44 – SEQ ID NO: 81。
一種判定一測試樣品中細胞數之方法，該測試樣品包含至少一細胞，且該方法至少包含以下步驟： a) 對該測試樣品進行均質化處理； b) 在將一內標準品添加至該測試樣品之前或之後，以一蛋白酶對該均質化之測試樣品進行消化處理； c) 使該消化後之測試樣品進行一色層分析及/或光譜分析之步驟； d) 判定該消化後之測試樣品中至少一組蛋白之含量；以及 e) 據此判定該測試樣品中之細胞數。
如請求項41所述之方法，其中，該組蛋白係選自由下列項目所構成之群組中之至少一者：組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。
如請求項41或42所述之方法，進一步包含將一內標準品添加至該測試樣品內。
如請求項43所述之方法，其中，該內標準品包含已定義濃度之至少一胜肽。
如請求項44所述之方法，其中，該至少一胜肽之序列係對應於一組蛋白之一延伸部分、結構域、或表位，該組蛋白係選自由下列項目所構成之群組：組蛋白H2A、組蛋白H2B、或組蛋白H4。
如請求項44或45所述之方法，其中，該內標準品中之至少一胜肽包含一選自由下列項目所構成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、及/或SEQ ID NO: 34。
如以上請求項中任一項所述之方法，其中，於該均質化處理之前或之後，該測試樣品並不經免疫沉澱處理且不是由免疫沉澱取得。
如請求項41至47中任一項所述之方法，其中，用於消化該測試樣品之該蛋白酶為胰蛋白酶。
如請求項41至48中任一項所述之方法，其中，該測試樣品係選自由下列項目所構成之群組： 1) 一包含蛋白質之生物樣品萃取物； 2) 一初代非培養而得之樣品；及/或 3) 取自一或多個細胞株之樣品。
如請求項41至49中任一項所述之方法，其中，該色層分析及/或光譜分析之步驟包含LC-MS/MS分析。
如請求項41至50中任一項所述之方法，其進一步包含提供一經由以下方式建立之校正表、校正曲線或校正演算法： 1) 提供懸浮、分散或以其他方式可數細胞之至少二樣品，其中，所述至少二樣品具有不同之細胞濃度； 2) 判定所述至少二樣品中之細胞數； 3) 根據如請求項41至50中任一項所述之方法，判定所述至少二樣品中至少一組蛋白之含量；以及 4) 藉由將所述至少二樣品中之組蛋白含量與細胞數相關聯，建立一校正表、校正曲線或校正演算法。
如請求項51所述之方法，其中，所述樣品中之細胞數係以選自由下列項目所組成之群組之至少一方法判定： 1) 人工(光學)計數； 2) 使用一細胞計數器之自動化計數；及 3) 使用影像分析計數。
如請求項51或52所述之方法，其中，該懸浮、分散或以其他方式可數細胞之樣品中之細胞為以下之至少一者： 1) 二倍體細胞；及/或 2) 單核細胞。
如請求項50至53中任一項所述之方法，其中，該懸浮、分散或以其他方式可數細胞之樣品為一血液樣品。