TW202246493A - 區域分層的軟骨細胞層片的製備方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種製備區域分層的軟骨細胞層片的方法，包含以下步驟：(a)提供來自個體的軟骨樣本；(b)從該軟骨樣本中分離出軟骨細胞，再從該軟骨細胞分離出淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞；(c)培養該深層區軟骨細胞直至細胞滿盤以形成深層區軟骨層片；(d)接種該中層區軟骨細胞到該深層區軟骨層片上，並培養該中層區軟骨細胞直至細胞滿盤以形成中層區軟骨層片；及(e)接種該淺層區軟骨細胞到該中層區軟骨層片上，並培養該淺層區軟骨細胞直至細胞滿盤以形成淺層區軟骨層片，來獲得該區域分層的軟骨細胞層片。

Description

區域分層的軟骨細胞層片的製備方法及其用途
本發明係關於一種製備軟骨細胞層片的方法，其特徵在於從一個體所取得的軟骨樣本中分離出軟骨細胞，並從該軟骨細胞分離出淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞，再將上述三種軟骨細胞分別進行細胞增殖，而後按順序先以深層區軟骨細胞建構深層區軟骨層片，再在其上面植入中層區軟骨細胞建構中層區軟骨層片，最後再植入淺層區軟骨細胞來建構淺層區軟骨層片，從下到上堆疊以構建出具有三層結構的層片。
關節軟骨由於其沒有血管與神經組織，以及低細胞基質比的特性，一旦損傷後非常難以自我修復。關節軟骨損傷通常導致退行性關節疾病的早期發作。到目前為止，實現軟骨組織功能的完整修復仍面臨重大挑戰。自體軟骨細胞植入(autologous chondrocyte implantation，ACI)目前是一種很有前途的治療策略，也是美國食品藥物管理局(FDA)批准的唯一一種基於細胞的治療軟骨損傷的治療方法。與傳統的微骨折(microfracture)方法相比，自體軟骨細胞植入在一些臨床病例中已經成功地再生出類透明(hyaline-like)新軟骨。微骨折方法因其簡單性和低成本而 被廣泛使用，然而此方法僅對小病變有效，且因為形成的是纖維軟骨而不是透明關節軟骨，而僅能提供相對短期的功能改善。在短期研究中，對於更大的缺損及/或更嚴重的基線症狀(baseline symptom)，自體軟骨細胞植入方法已被證明比微骨折更有效。
考慮天然關節軟骨並重建複雜的區域組織對於設計合適的功能性組織修復策略至關重要。關節軟骨由含有豐富的膠原纖維及蛋白多醣(proteoglycan,PG)的基質組成，其中嵌有能生成軟骨細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的軟骨細胞。關節軟骨分為淺層區(superficial zone，SZ)、中層區(middle zone，MZ)、及深層區(deep zone，DZ)三個區域，各具有不同的細胞形態和密度、細胞外基質結構排列、組織複雜性、及生物力學特性。淺層區(由軟骨上方的10-15%組成)含有相對高密度及扁平的軟骨細胞，其中膠原纖維平行於關節表面。淺層區的軟骨細胞以相對較低的速率產生醣胺聚醣(glycosaminoglycan，GAG)，並分泌一種特定的淺層區蛋白(superficial zone protein，SZP)，該蛋白在關節運動過程中起到使滑動流暢的作用。中層區(表面至總軟骨厚度的40-50%)含有更多圓形軟骨細胞及隨機方向的膠原纖維。深層區(總軟骨厚度的30-40%)由呈垂直柱狀排列的大軟骨細胞及垂直於關節表面排列的膠原纖維所組成。深層區中存在幾種標記，例如在關節軟骨最深層中表現的Notch-Delta訊息傳遞路徑及X型膠原蛋白。膠原纖維以第二型膠原蛋白(collagen type II，Col 2)和聚集蛋白多醣(aggrecan，Aggr)為主，但也含有其他次要的第九型膠原蛋白(collagen type IX，Col 9)及第十一型膠原蛋白，它們在調節纖維大小、纖維間交聯、以及與蛋白多醣的相互作用方面很重要。由於膠原蛋 白和蛋白多醣結構排列的差異，導致生物力學特性的區域性顯著差異，包括與軟骨深度相對應的拉伸、壓縮、及剪力特性。此外，軟骨的特定區域結構在調節對不同軟骨組織層的適當訊息傳遞方面也很重要。例如，保留軟骨表層不僅對軟骨的完整性和降低關節軟骨表面的摩擦很重要，而且對調節深層區軟骨細胞的增殖和代謝活動也很重要。然而，自體軟骨細胞植入策略通常植入淺層、中層、深層混在一起的軟骨細胞在生物材料支架上，因此，昔日軟骨組織工程所建構的再生軟骨通常是同質而無分層構造，缺乏其天然淺層、中層、深層的結構。
回顧先前的研究可以得知，倘若能重建天然關節軟骨的分層特徵，就可以增強新軟骨的機械性能並保持再生軟骨的長期功能。近年來就有研究嘗試利用無支架和無基質、基於支架/基質、及混合方法…等技術來製造具有區域分層的關節軟骨。其中最簡單的就是微量顆粒培養法，顆粒確實會形成細胞和基質的區域組織，醣胺聚醣含量通常從外表面向中心增加。然而，這種方法不適合直接應用於臨床治療，因為顆粒很小，區域變化是球形的而非取決於深度，無法修復大於一平方公分的軟骨缺損。而支架/基質方法仍然有支架孔徑和互連性的控制問題，以及難以將細胞均勻地植入支架中(通常在外圍顯示高細胞密度，在中心顯示低細胞密度)；而且支架對身體來說是一種異物，可能會引起嚴重的發炎及免疫反應。另外，有研究嘗試使用具有硬度梯度或成分梯度的水凝膠來植入區域特異性軟骨細胞來構建分層框架，然而這種方法在臨床實踐經常發生各分層之間因連接較弱而剝離。為了克服上面所敘述問題，一種最為可行方法是利用細胞層片技術，因為細胞層片技術有助於有效堆疊不同區域的軟骨細胞，且它 的無框架特性不會引起發炎並消除免疫排斥的風險。最近，細胞層片已應用於再生醫學，例如心肌、角膜、及腎細胞的再生。此外，該技術也已被開發用於製造修復關節軟骨缺損的軟骨細胞層片，但之前的軟骨細胞層片並沒有具有表層、中層、深層的結構。
本發明提供一種製備區域分層的軟骨細胞層片的方法，包含以下步驟：(a)提供來自一個體的軟骨樣本；(b)從該軟骨樣本中分離出軟骨細胞，再從該軟骨細胞分離出淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞三種軟骨細胞；(c)接種該深層區軟骨細胞於一培養皿中的培養基內，且培養該深層區軟骨細胞直至達到細胞滿盤以形成一深層區軟骨層片；(d)接種該中層區軟骨細胞到步驟(c)所培養形成的深層區軟骨層片上，並培養該中層區軟骨細胞直至達到細胞滿盤以形成一中層區軟骨層片；及(e)接種該淺層區軟骨細胞到步驟(d)所培養形成的中層區軟骨層片上，並培養該淺層區軟骨細胞直至達到細胞滿盤以形成一淺層區軟骨層片，來獲得具有深層區軟骨層片、中層區軟骨層片、及淺層區軟骨層片的該區域分層的軟骨細胞層片。
本發明旨在利用細胞層片技術，藉由將軟骨細胞先分離為淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞三種族群，再利用細胞層片技術來製造具有結構的再生軟骨。
本發明使用不連續的Percoll梯度離心法，從軟骨細胞中分選出淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞三種族群軟骨細胞，以重建天然關節軟骨的分層結構，該結構被認為是在修復的關節軟 骨中重現生物力學特性及獲得長期組織完整性所需的關鍵因素。如圖1所示，從遠端股骨軟骨中獲得的軟骨細胞被分成含有形態及表型差異的三層細胞。最上面的部分主要來自關節軟骨的深層區，含有較大的細胞及高濃度的蛋白多醣。相較之下，最下面部分的細胞來自淺層區，其細胞最小，蛋白多醣濃度相對較低，分裂速度比來自中層區及深層區的細胞慢。此外，藉由檢測與不同軟骨區域相關的細胞外基質標記和分泌蛋白，本發明證實了密度梯度分類的亞群的個別的軟骨形成特性。在中間/最上面的部分發現聚蛋白多醣及Col-2a1相對於代表關節軟骨中層區及深層區的最下面的部分有顯著更高的表現。這些結果與先前使用解剖方法以及基於細胞大小的慣性螺旋微通道技術將淺層區、中層區、及深層區軟骨細胞從全層(full thickness，FT)軟骨塊分離的研究一致。相反地，淺層區PRG4被發現在最下面的部分中有高水平的特異性表現，這也證明了在最下面的部分中大部分的細胞是來自淺層區。
體外實驗顯示，分層的細胞層片的軟骨形成功能優於傳統不分層層片。研究結果發現有以下優點：(1)本發明製作的關節軟骨細胞的三層細胞層片(淺層區、中層區、深層區)，以即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析軟骨形成標記，發現分層細胞層片中的Col-2a1及聚蛋白多醣mRNA與不分層細胞層片相比顯著增加，相反地，分層細胞層片中的MMP13 mRNA表現水平則低於不分層細胞層片中的表現水平。此外，與不分層層片相比，分層層片的細胞增殖率更高。(2)與不分層層片相比，分層層片分泌的TIMP-1和TIMP-3濃度顯著較高，基質金屬蛋白酶(MMP)-3和MMP13的濃度較低。(3)與不分層層片相比，在分層層片中產生的 促發炎細胞激素(pro-inflammatory cytokine)如IL-6、IL-8、及TNF-α較少(圖1)。目前已知軟骨細胞能夠產生發炎細胞激素，其透過自分泌及旁分泌路徑對組織產生負面影響。多項研究證實，植入的軟骨細胞的IL-1β表現會顯著影響自體軟骨細胞移植後的臨床結果。因此，調節細胞層片內主要細胞激素(如IL-1β及TNF-α)表現的能力可能會改善自體軟骨細胞植入的表現。(4)藉由阿新藍染色(Alcian blue staining)評估和檢測醣胺聚醣含量的組織學評估，顯示分層層片比不分層層片產生更多的蛋白多醣沉積。(5)免疫螢光和西方墨點法(Western blot)分析顯示，在分層層片中，ADAMTS-4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4)、ADAMTS-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5)的染色較弱，Col-2a1和聚蛋白多醣的染色則較強。
此外，本發明使用豬缺損模型，利用區域分層的軟骨細胞層片修復軟骨缺損，並與利用不分層軟骨細胞層片作修補比較。從組織學評分顯示，將經Percoll密度分離的三層區域軟骨細胞層片，在植入12週後，新生軟骨呈現出透明狀以及呈現原生軟骨特徵的區域結構(圖2及圖3)。此外，所產生的軟骨質量更好，與植入未分層軟骨細胞或對照組相比有顯著的優良品質。
本文中所使用之術語「一」或「一個」係用於描述本發明之元素及組分。這樣做僅僅是為了方便並給出本發明的一般意義。該描述應理解為包括一個或至少一個，並且單數也包括複數，除非很明顯它另有含義。
本發明提供了一種製備區域分層的軟骨細胞層片的方法，包 含以下步驟：(a)提供來自一個體的軟骨樣本；(b)從該軟骨樣本中分離出軟骨細胞，再從該軟骨細胞分離出淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞；(c)接種該深層區軟骨細胞於一培養皿中的培養基內，且培養該深層區軟骨細胞直至達到90-100%細胞匯合(cell confluence)以形成一深層區軟骨層片；(d)接種該中層區軟骨細胞到步驟(c)所培養形成的深層區軟骨層片上，並培養該中層區軟骨細胞直至達到90-100%細胞匯合以形成一中層區軟骨層片；及(e)接種該淺層區軟骨細胞到步驟(d)所培養形成的中層區軟骨層片上，並培養該淺層區軟骨細胞直至達到90-100%細胞匯合以形成一淺層區軟骨層片，來獲得具有該深層區軟骨層片、該中層區軟骨層片、及該淺層區軟骨層片的該區域分層的軟骨細胞層片。
在一實施例中，該軟骨樣本係一關節軟骨樣本。在一較佳實施例中，該軟骨樣本係一軟骨組織。在一更佳實施例中，該軟骨樣本係一關節軟骨組織。
本文中所使用之術語「個體」係指一動物。在一較佳實施例中，該個體係指一哺乳動物。在一更佳實施例中，該個體係指一人類。
本發明透過密度梯度離心從該軟骨細胞中分離出該淺層區軟骨細胞、該中層區軟骨細胞以及該深層區軟骨細胞。在另一實施例中，步驟(b)中的分離方法包含透過密度梯度離心的細胞分離技術。在一較佳實施例中，該密度梯度的範圍包含1.015-1.07g/ml。在一更佳實施例中，該密度梯度離心的速率為400×g持續20-30分鐘。
在本發明中，分離出三種軟骨細胞後，該淺層區軟骨細胞、 該中層區軟骨細胞以及該深層區軟骨細胞會分別進行培養。在一實施例中，該培養基包含DMEM/F12、胎牛血清、抗壞血酸和抗生素。此培養的目的是在於讓細胞增殖以達到接種所需的細胞數目。在一實施例中，該步驟(b)進一步包含於該三種軟骨細胞分離後，將該淺層區軟骨細胞、該中層區軟骨細胞、及該深層區軟骨細胞分別進行培養。
在一實施例中，用於接種的淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞的細胞密度範圍為每平方公分1x104-5x104個細胞。
在一實施例中，將該深層區軟骨細胞培養3-5天以達到90-100%細胞匯合並形成該深層區軟骨細胞層片。
在另一實施例中，將該中層區軟骨細胞培養3-5天以達到90-100%細胞匯合並形成該中層區軟骨細胞層片。
將該淺層區軟骨細胞接種在所培養形成的該中層區軟骨細胞層片上後，將該淺層區軟骨細胞培養3-5天以達到90-100%細胞匯合，以形成該淺層區軟骨細胞層片。
在另一實施例中，該深層區軟骨細胞、該中層區軟骨細胞和該淺層區軟骨細胞會培養直至達到95-100%細胞匯合。在一較佳實施例中，該深層區軟骨細胞、該中層區軟骨細胞和該淺層區軟骨細胞會培養直至達到100%細胞匯合。
在該區域分層的軟骨細胞層片的製備過程中，該深層區軟骨細胞、該中層區軟骨細胞和該淺層區軟骨細胞會各自分泌細胞因子而形成個別的細胞外基質。因此，該區域分層的軟骨細胞層片的最終產物包含一具有不同區域特徵的軟骨細胞外基質。
在本發明中，該區域分層的軟骨細胞層片在該淺層區軟骨層片形成後還需要額外培養1-3週。在該區域分層的軟骨細胞層片的製備過程中，該淺層區軟骨細胞、該中層區軟骨細胞以及該深層區軟骨細胞都會持續培養。在一實施例中，在接種該淺層區軟骨細胞後，該區域分層的軟骨細胞層片的培養時間範圍為1-4週。在一較佳實施例中，在接種該淺層區軟骨細胞後，該區域分層的軟骨細胞層片的培養時間範圍為1-3週。
此外，用於培養該區域分層的軟骨細胞層片的培養基進一步添加蘇拉明(suramin)。蘇拉明可以透過增強Col-2a和聚集蛋白多醣的表現並降低Col-1a的合成來促進軟骨細胞分化。在培養該區域分層的軟骨細胞層片的過程中，蘇拉明顯著抑制基質破壞蛋白酶和發炎介質的表現，同時增強介白素-1β誘導的(IL-1β)軟骨細胞片中軟骨合成代謝因子的產生。在一實施例中，一用於培養在步驟(e)中的該區域分層的軟骨細胞層片的培養基包含蘇拉明。此外，在步驟(e)中，該區域分層的軟骨細胞層片會與該培養基進行分離，以獲得具有深層區軟骨層片、中層區軟骨層片、及淺層區軟骨層片的該區域分層的軟骨細胞層片。在另一實施例中，該步驟(e)進一步包含將該區域分層的軟骨細胞層片與該培養基進行分離。
透過本發明的製備方法，三層層片由下到上的排列方式依序為該深層區軟骨層片、該中層區軟骨層片、及該淺層區軟骨層片。因此，本發明的該區域分層的軟骨細胞層片是軟骨層片的複合體，其包含深層區軟骨細胞層片(內含具有深層區軟骨細胞特徵的軟骨細胞外基質)、中層區軟骨細胞層片(內含具有中層區軟骨細胞特徵的軟骨細胞外基質)、及淺層區軟骨細胞層片(內含具有淺層區軟骨細胞特徵的軟骨細胞外基質)。本發 明所製備的具有三層結構的該區域分層的軟骨細胞層片與天然軟骨相似。
本發明亦提供一種治療軟骨缺損的方法，包含將一組合物施用於一個體的軟骨缺損部位，其中該組合物包含區域分層的軟骨細胞層片。該區域分層的軟骨細胞層片係藉由本發明之方法製備。
術語「治療」是指疾病或病症的任何改善(亦指抑制疾病或改善其至少一種臨床症狀的表象、範圍、或嚴重程度)。
如本文所用，術語「軟骨缺損」包括但不限於因年齡、基因突變或外力引起的損傷所造成的軟骨退化或軟骨缺損/磨損的疾病。軟骨廣泛存在於骨關節面、肋軟骨、氣管、耳廓、腰椎間盤。在一實施例中，該軟骨缺損包含關節軟骨缺損。
本發明的組合物施用於該個體的較佳途徑包含關節內施予。
本發明進一步提供了一種包含區域分層的軟骨細胞層片的組合物。該區域分層的軟骨細胞層片係藉由本發明之方法製備。
此外，本發明提供一種組合物在製備用於治療軟骨缺損的醫藥組合物的用途，其中該組合物包含區域分層的軟骨細胞層片。該區域分層的軟骨細胞層片係藉由本發明之方法製備。在一實施例中，該區域分層的軟骨細胞層片包含一具有不同區域特徵的軟骨細胞外基質。
在另一實施例中，該軟骨缺損包含一關節軟骨缺損。在一較佳實施例中，該組合物的施用途徑包含關節內施予。
圖1顯示不分層關節軟骨細胞(Articular Chondrocytes，AC)層片與分層層片中促發炎細胞激素表現的比較。為了測定促發炎基因的表 現水平，在構建出三層的層片3週後提取全部的RNA。藉由qRT-PCR測量IL1-β(A)、TNF-α(B)、MIF(C)、IL-6(D)及IL-8(E)的mRNA水平。如果*p<0.05，***p<0.001，則數據在統計學上有顯著差異。
圖2顯示修復軟骨的肉眼及組織學觀察。圖2A顯示手術後12週，對照組、未分層的及分層的關節軟骨細胞(AC)層片植入組中豬膝關節缺損癒合的照片。紅色圓圈表示原始的缺損邊緣。圖2B顯示12週時修復軟骨的ICRS肉眼評估分數。數據表示為平均值±SD(n=5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。圖2C顯示H&E染色。左邊影像中的方框表示右邊影像中顯示的放大區域。圖2D顯示手術後12週，在對照組、未分層的、及分層的細胞層片植入組中番紅(Safranin O)/堅牢綠(Fast green)的染色結果；比例尺為100μM。圖2E顯示手術後12週，在對照組、未分層的及分層的細胞層片植入組中阿新藍(Alcian blue)的染色結果；比例尺為100μM。圖2F顯示用Mankin分數在小放大倍數(左邊影像)及大放大倍數(右邊影像(#))下對切片進行評分。箭頭表示陷窩(lacunae)。
圖3顯示再生軟骨12週時的免疫組織化學染色。圖3A顯示Col-2a1、Col-10a1、及聚集蛋白多醣(Aggrecan)的免疫組織化學染色的代表性圖像。藍色矩形表示原始缺損邊緣並在右側放大為較大的圖像。圖3B顯示細胞層片移植治療與未治療12週時三組Col-2a1染色的IOD定量分析。圖3C顯示細胞層片移植治療與未治療12週時三組聚集蛋白多醣(Aggrecan)染色的IOD定量分析。圖3D顯示細胞層片移植治療與未治療12週時三組Col-10a1染色的IOD定量分析。數據表示為平均值±SD(n=6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
本發明可以用許多不同的形式來實施並且不應被視為僅限於本文中所闡述之實例。所描述的實例並不限於如權利要求中所述之本發明範圍。
材料及方法
1.細胞製備及細胞層片的構建
所有動物程序均經過機構審查委員會(Institutional Review Board,IRB)的審查及批准。取5~8月齡豬遠端股骨的關節軟骨。使用組織打孔器(biopsy punch)在股骨髁的非承重區製作直徑8mm深5mm的軟骨缺損。用解剖刀將獲得的關節軟骨塊切成小塊，並在PBS中以0.1%(w/v)胰蛋白酶在溫和攪拌下於37℃培養20分鐘。除去胰蛋白酶，用培養基洗滌碎片，並在37℃攪拌下於含有0.01%(w/v)(0.166U/ml)膠原酶P(Boehringer/Roche Mannheim,Germany)及10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的培養基中消化整夜。然後將關節軟骨片在含有1.5mg/ml第二型膠原酶及5% FBS的補充DMEM/F12中於37℃消化10小時。在對細胞外基質進行10小時酶消化後，透過70-μm尼龍細胞過濾器(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)過濾將釋放的細胞與組織碎片分離，並藉由150×g離心5分鐘從濾液中收集。然後將細胞以1×PBS洗滌兩次並重新懸浮於1ml的DMEM/F12培養基中。各種區域軟骨細胞的分離係根據Byoung等人的報告(Min BH,Kim HJ,Lim H,Park SR.Characterization of subpopulated articular chondrocytes separated by Percoll density gradient.In vitro cellular & developmental biology Animal.2002；38(1)：35-40)並經過一些修改。簡言之， 將關節軟骨細胞在按重量製備的不連續等滲Percoll(GE Healthcare)密度梯度(密度為1.015-1.07g/ml)上分層，並在擺動桶轉子中以400×g離心20-30分鐘。為了製造不分層或分層的細胞層片，根據上述方法獲取關節或深層區軟骨細胞，在37℃、5% CO2及95%空氣的大氣中，將其以每平方公分1 x 104-5 x 104個細胞接種在6孔培養皿上，並置於添加有10%胎牛血清(FBS；GIBCO,NY,USA)、100μg/ml抗壞血酸、及1%抗生素-抗黴菌劑(antibiotics-antimycotic)(GIBCO,NY,USA)的DMEM/F12中。連續培養約3-5天，直到第一層軟骨細胞達到匯合，將第二層軟骨細胞(包括不分層軟骨細胞及中層區軟骨細胞)接種在第一層上並連續培養約3-5天直至100%匯合。隨後將第三層軟骨細胞(包括不分層軟骨細胞及淺層區軟骨細胞)接種在第二層上並繼續培養1-3週。此外，該培養皿的成分可以在此額外的1-3週內進一步添加蘇拉明(suramin)。三週後，細胞培養皿中形成一層薄膜，在倒置顯微鏡下發現其含有三層軟骨細胞及細胞外基質(ECM)。根據Yamato等人報導的方法(Yamato M,Utsumi M,Kushida A,et al.Tissue engineering.2001；7(4)：473-480)將該些薄片收集到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上。獲取不分層層片(未分層的)及分層層片(分層的)並進行生化、組織學、及免疫螢光評估。
2.細胞增殖和存活率
為檢測細胞增殖率，直接計算不分層層片(未分層的)及分層層片(分層的)的細胞數。將該些層片用TrypLE Express在37℃消化30分鐘，然後用0.25mg/mL膠原酶P在37℃培養30分鐘。收集分散的細胞並使用計數盤計數。藉由MTT測定來確定細胞存活率。
3.細胞層片的基因表現
使用TRIzol(Invitrogen)提取軟骨細胞層片的總RNA。根據製造商的說明，將2μg所純化的總RNA用Thermo Scientific Maxima第一鏈cDNA合成套組(ThermoFisher)進行反轉錄。簡言之，將該溶液在65℃培養5分鐘，將其與第一鏈緩衝液、DTT、及RNaseOUT混合並使最終體積為20μL。接著，將該溶液在42℃培養60分鐘，然後在70℃培養15分鐘以滅活反轉錄酶活性。使用SYBR Green PCR Master Mix(Qiagen)進行即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)，並在LightCycler PCR及檢測系統(Roche Diagnostics)上進行處理。每個反應(20μl)以一式兩份運行，且含有1μl的cDNA模板以及以下引子序列：Col-2a1：正向(ACTCCTGGCACGGATGGTC)及反向(CTTTCTCACCAACATCGCCC)；aggrecan：正向(CCCAACCAGCCTGACAACTT)及反向(CCTTCTCGTGCCAGATCATCA)；col-10a1：正向(TGAACTTGGTTCATGGAGTGTTTTA)及反向(TGCCTTGGTGTTGGATGGT)；gapdh：正向(TCACGACCATGGAGAAGGCT)及反向(CAGGAGGCATTGCTGATGATC)；col-1al：正向(CTGGTACGGCGAGAGCATGACC)及反向(GGAGGAGCAGGGCCTTCTTGAG)；sox5：正向(GGCCAAGCAGCAGCAAGAACAG)及反向(AGCTGAAGCCTGGAGGAAGGAG)； sox6：正向(CAGCCCTGTCAGTCTGCCTAACA)及反向(GCATCTTCCGAGCCTCCTGAATAGC)；sox9：正向(GGCAATCCCAGGGTCCACCAAC)及反向(TGGTCGAACTCGTTGACGTCGAAG)；mmp13：正向(ACCCAGGAGCCCTCATGTTTCC)及反向(CAGGGTTTCTCCTCGGAGACTG)；runx2：正向(CCAGACCAGCAGCACTCCATAC)及反向(GGGAACTGCTGTGGCTTCCATC)；prg4：正向(CTCCCAAGGAGCAGCTTCTAC)及反向(GGTGGTGGGAGCTGGTTCCTTG)；pcna：正向(GCGCCTGGTCCAGGGC)及反向(TCACGCCCATGGCCAAATTGC)；IL-1β：正向(GTACATGGTTGCTGCCTGAA)及反向(CTAGTGTGCCATGGTTTCCA)；IL-6：正向(GGCAGAAAACAACCTGAACC)及反向(GTGGTGGCTTTGTCTGGATT)；IL-8：正向(TAGGACCAGAGCCAGGAAGA)及反向(CAGTGGGGTCCACTCTCAAT)；TNFα：正向(ACTGCACTTCGAGGTTATCG)及反向(GCTGGTTGTCTTTCAGCTTC)；MIF：正向(CGTGCGCCCTTTGCAGTCTG)及反向(TGGCCGCGTTCATGTCGTAG)。 循環參數為95℃ 15分鐘以活化DNA聚合酶，隨後95℃ 15秒、60℃ 20秒、及72℃ 30秒共40個循環。在反應結束時產生熔解曲線。將每個測試基因的閾值循環數(C t)以持家GAPDH基因值(△C t )歸一化，並將每個實驗樣本參考其對照(△△C t )。倍數變化值表示為2-△△ C t 。
4.總糖胺聚醣(GAG)定量
使用1,9-二甲基亞甲藍(DMMB；Polysciences)測定總硫酸化糖胺聚醣含量。使用來自鯊魚軟骨的硫酸軟骨素C(Chondroitin sulfate C)作為標準。簡言之，將100μL消化後的樣本與1ml二甲基亞甲藍染料溶液混合，並立即測量656nm的吸光度。使用Hoechst 33258染料測量DNA。簡言之，將10μL消化後的樣本與200μL Hoechst染料溶液(0.7μg/mL)混合。在340nm的激發波長與465nm的發射波長下進行螢光測量。從小牛胸腺DNA獲得標準曲線。將糖胺聚醣含量以每個樣本測量的DNA量標準化，並表示為μg GAG/μg DNA。
5.體液性因子(humoral factor)的測量
在添加有1% FBS及1% AB的3mL DMEM/F12中培養不分層層片及分層層片72小時。收集上清液並以12,000g離心10分鐘以去除細胞碎片。使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)套組測量轉化生長因子β1(TGF-β1)、金屬蛋白酶組織抑制劑3(TIMP3)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)、基質金屬蛋白酶3(MMP3)、基質金屬蛋白酶13(MMP13)的濃度。由於FBS中含有蛋白質，減去含1% FBS的空白培養基所檢測到的訊號以作為校準。每個供體至少重複測量兩次，並使用平均值。
6.免疫螢光測定
將三層細胞層片的冰凍切片用OCT包埋劑(optimal cutting temperature compound)固定並冷凍。將細胞層片與Col-2a1初級抗體(Proteintech，15943-1-AP，1：100稀釋)、Aggrecan(Proteitech,13880-1-AP)、MMP3(Proteitech 66338-1-Ig)、MMP-13(Proteintech,18165-1-AP)、ADAMTS-4(ABclonal，A2525)、ADAMTS-5(ABclonal，A2836)、及二級抗體(LEADGENE®山羊抗兔IgG(H+L)-TAMRA及LEADGENE®山羊抗小鼠IgG(H+L)-FAM)一起培養。將細胞核用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。然後在高品質的螢光顯微鏡下觀察樣本並拍照。
7.阿新藍染色
在培養後獲取關節軟骨細胞層片及分層層片，然後在最佳切割溫度的複合物中包埋及冷凍。接著，使用標準方法用阿新藍對5μm厚的切片進行蛋白多醣染色。
8.軟骨細胞層片的移植
製備好細胞層片後，將該些細胞層片自體植入同一隻豬體內。植入手術前，肌肉內給予0.2mg/kg導美睡(Dormicum)及40μg/kg美托咪定(Medetomidine)。手術過程中會使用異氟醚(isoflurane)、一氧化二氮(dinitrogen monoxide)、及氧氣的混合體進行吸入麻醉。使用組織打孔器在動物的股骨內髁區域製作直徑8mm深5mm的軟骨缺損，並且將受損的全層軟骨用軟骨細胞層片覆蓋或不用軟骨細胞層片覆蓋。這將在移植組的6頭小型豬(7個月大)的膝蓋裡進行。六頭豬將分為三組。第1組(n=6)：接受股骨缺損並用三層分層的層片填充；第2組(n=6)：接受股骨缺損但未填充細胞；第3組(n=6)：接受股骨缺損並用不分層關節軟骨細胞層片 填充。12週後取出軟骨，用4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定1週，並脫鈣1個月。接下來，將標本包埋在石蠟中，切成5μm的切片，並用番紅(safranin-O)、阿新藍染色。
9. HE染色及免疫組織化學檢查
將獲取的軟骨片固定在4%多聚甲醛中，在分級的乙醇中脫水，然後包埋在石蠟中。將標本用蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin,H&E)、番紅及阿新藍染色。亦進行免疫組織學分析。將Col-2a1初級抗體(Proteintech，15943-1-AP，1：100稀釋)、Aggrecan(Proteitech,13880-1-AP)、Col-10a1(Abcam,ab49945)、及二級抗體(DAKO)依次用於免疫組織學檢測。然後在高品質的顯微鏡下觀察樣本並拍照。
10.用於評估軟骨修復的組織學分級分數
使用Mankin的組織學分級分數來評估組織切片(Mankin HJ,Dorfman H,Lippiello L,Zarins A.Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips.II.Correlation of morphology with biochemical and metabolic data.The Journal of bone and joint surgery American volume.1971；53(3)：523-537)，並如先前所述修改(Sakakibara Y,Miura T,Iwata H,et al.Effect of high-molecular-weight sodium hyaluronate on immobilized rabbit knee.Clinical orthopaedics and related research.1994(299)：282-292)。總分範圍從0到14，包括來自四個類別的分數：軟骨結構、細胞異常、基質染色、及潮線(tidemark)完整性。軟骨結構的分級為0(正常組織)到6(軟骨組織完全破壞)。細胞異常的分級為0(正常組織)到3(細胞過少)。基質染色(用番紅)的分級為0(正常組織或染色輕微減少)到4(無染色)。潮線完整性的分級為0(完 好)到1(破壞)。根據分數的總和，將每個切片分成四個組織學等級之一：正常(0-2)；輕度(3-6)；中度(7-10)；或嚴重(11-14)。
11.肉眼評估
在移植細胞層片後的第12週，犧牲各組中的豬並取得軟骨。對缺損部位拍照並使用國際軟骨修復協會(International Cartilage Repair Society，ICRS)評分系統評分。總分範圍從0到12，包括來自三個類別的分數：缺損修復程度、與邊界區的融合、及肉眼可見的外觀。缺損修復程度的分級為0(未修復)到4(與周圍軟骨一樣)。與邊界區的融合的分級為0(不接觸到1/4的移植物與周圍軟骨融合)到4(與周圍軟骨完全融合)。肉眼可見的外觀的分級為0(移植區域全部退化)到4(完整光滑的表面)。
結果
分離區域關節軟骨細胞並評估淺層區(SZ)、中層區(MZ)、及深層區(DZ)軟骨細胞的功能特性
將5個月大的豬的股骨關節軟骨全層切除並收集。股骨關節軟骨中存在三個不同的區域，即淺層區(SZ)、中層區(MZ)、及深層區(DZ)。而淺層區(SZ)、中層區(MZ)、及深層區構成軟骨總厚度的頂部10-15%、中部40-50%、深部30-40%。骨端軟骨三個區域中的那些軟骨細胞具有不同的細胞大小(數據未顯示)。基於物理特性，將來自三個區域的軟骨細胞透過不連續的Percoll梯度分級分離，並使密度固定在1.015-1.07g/ml。離心後，具有不同浮力的淺層區(SZ)、中層區(MZ)、及深層區(DZ)軟骨細胞會分佈在不同的Percoll密度層中。考慮到深層區(DZ)與中層區(MZ)及淺層區(SZ)相比具有較低的細胞密度，因此本發明收集最上層 部分中最大的細胞作為深層區(DZ)軟骨細胞、中間層的細胞作為中層區(MZ)軟骨細胞、及最下層尺寸最小的細胞作為淺層區(SZ)軟骨細胞(數據未顯示)。為了驗證密度梯度策略是否真能將軟骨細胞從不同區域中分離出來，本發明進一步分析了col-2a1、aggrecan、col-1a1、col-10a1、sox5、sox6、sox9、mmp13、runx2、及prg4的mRNA表現水平(數據未顯示)。數據中顯示，對軟骨細胞分化和軟骨維持重要的基因(包括col-2a1、aggrecan、sox5、sox6、及sox9)在中層區(MZ)中的顯著表現較高。相較之下，col-10a1、mmp13、及runx2在深層區(DZ)中的表現較高。Prg4則被發現在淺層區(SZ)中的表現最高。此外，與中層區(MZ)及深層區(DZ)相比，淺層區(SZ)具有較低的細胞生長速率、細胞存活率與由較低水平的糖胺聚醣和蛋白多醣所合成的軟骨基質。
分層的軟骨細胞層片促進細胞存活率、細胞增殖、及軟骨形成標記的表現
為了比較軟骨缺損的修復質量，將包括淺層區(SZ)、中層區(MZ)、及深層區(DZ)亞群的區域軟骨細胞在體外培養製成三層細胞層片(將淺層區(SZ)、中層區(MZ)、及深層區(DZ)從上到下依次堆疊，並將其稱為分層關節軟骨細胞層片)，並與由混合的軟骨細胞在體外培養所製成的傳統細胞層片(稱為不分層關節軟骨細胞層片)互相比較。經過額外3週的擴增後，收穫細胞並計數(數據未顯示)。結果表明，分層細胞層片中的細胞數量顯著高於不分層細胞層片中的細胞數量。此外，增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的轉錄分析顯示分層細胞層片組中比例升高了2.5倍(數據未顯示)。藉由使用MTT測定，顯示 分層細胞層片中的平均活細胞百分比略有增加(數據未顯示)。從早期的研究中發現，植入軟骨細胞的許多標記基因表現如Col-1a1、Col-2a1、聚集蛋白多醣(Aggrecan)、介白素1β(IL-1β)、及骨唾液酸蛋白2(bone sialoprotein-2,BSP-2)會影響自體軟骨細胞植入的臨床結果。為了比較兩種細胞層片的軟骨形成能力，本發明利用即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)分析軟骨形成標記，發現與不分層細胞層片相比，分層細胞層片中的col-2a1及aggrecan mRNA明顯增加(以col-2a1來說，分層關節軟骨細胞層片比上不分層關節軟骨細胞層片為4.8倍；以aggrecan來說，分層關節軟骨細胞層片比上不分層關節軟骨細胞層片為30倍)。相反地，分層細胞層片中的mmp13 mRNA表現水平則低於不分層細胞層片中的mmp13 mRNA表現水平(分層關節軟骨細胞層片比上不分層關節軟骨細胞層片為0.8倍)(數據未顯示)。
與不分層層片相比，分層層片分泌較低濃度的細胞外基質破壞酶
為了研究不分層關節軟骨細胞層片及分層關節軟骨細胞層片所產生的TGF-β、MMP-3、MMP-13、TIMP-1、及TIMP-3蛋白水平，收集細胞層片培養物的上清液並進行ELISA。將不分層關節軟骨細胞層片及分層關節軟骨細胞層片所分泌的體液細胞激素的濃度做出總結(數據未顯示)。分層關節軟骨細胞層片產生更高濃度的TIMP-3(分層層片6100至6200pg/mL；不分層層片5320至5470pg/mL)、TIMP-1(分層層片31至33ng/mL；不分層層片22至23ng/mL)(數據未顯示)，並且不分層關節軟骨細胞層片產生更高濃度的MMP3(分層層片7至8ng/mL；不分層層片22 至26ng/mL)(數據未顯示)、MMP-13(分層層片260至275ng/mL；不分層層片320至340ng/mL)(數據未顯示)。不分層層片及分層層片的TGF-β1濃度則沒有顯著差異(數據未顯示)。
促發炎細胞激素基因在分層層片中的表現低於不分層層片
從以前的報導中發現，移植物中促發炎細胞激素如IL-1β及TNF-α的表現水平對自體軟骨細胞植入治療後的臨床結果有負面影響。因此，本發明透過qRT-PCR檢測了分層層片及不分層層片中促發炎細胞激素基因的表現，包括IL1-β、TNF-α、IL-6、IL-8、及MIF。如圖1所示，IL1-β、TNF-α、IL-6、IL-8在分層層片中的基因表現明顯低於不分層層片(以IL1-β來說，不分層層片比上分層層片，分層層片是不分層層片的0.03倍；以TNF-α來說，分層層片是不分層層片的0.01倍；以IL-6來說，分層層片是不分層層片的0.4倍；以IL-8來說，分層層片是不分層層片的0.2倍)。
分層關節軟骨細胞層片及不分層關節軟骨細胞層片的基質生產能力和免疫組織化學分析的比較
為了研究分層關節軟骨細胞層片及不分層關節軟骨細胞層片上的軟骨形成特性，進行西方墨點法、阿新藍染色、及免疫螢光。作為軟骨特異性基質膠原蛋白的Col-2的表現在分層關節軟骨細胞層片中顯著更高(數據未顯示)。相比之下，蛋白酶MMP3及MMP13在分層關節軟骨細胞層片中的表現較低(數據未顯示)。ADAMTS-5(一種密切參與軟骨破壞進程的細胞外蛋白酶)的表現在分層關節軟骨細胞層片中也很低(數據未顯示)。阿新藍染色則證實，分層關節軟骨細胞層片中顯示出比不分層關節軟骨細胞層片中更深的藍色染色。這表明總蛋白多醣沉積(產生細胞外 基質能力的指標)在分層關節軟骨細胞層片中更高(數據未顯示)。此外，免疫螢光分析顯示，Col-2a1及聚集蛋白多醣(Aggrecan)在分層軟骨細胞層片中的染色高於在不分層層片中的染色。相比之下，MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、及ADAMTS-5在分層軟骨細胞層片中的染色低於在不分層層片中的染色(數據未顯示)。
由肉眼可見的外型及組織學進行體內修復評估
在手術後12週採集關節樣本進行肉眼及組織學評估。根據缺損覆蓋程度、新軟骨顏色、邊界區的融合、及表面光滑度進行平均肉眼評分。手術後12週，在植入不分層關節軟骨細胞層片(未分層的層片)及分層關節軟骨細胞層片(分層的層片)的組別中的骨軟骨缺損再生優於對照組(圖2A)。從肉眼看來，植入物為分層層片的組別，其缺損完全被修復組織覆蓋，而其他兩組的骨軟骨缺損只有被部分填充(圖2A)。此外，分層層片組別中新形成的組織幾乎與相鄰的正常組織融合在一起，植入組織和天然組織之間的界限比未分層組別中的更不清楚(圖2A)。此外，與未分層的組別相比，分層的組別中的關節表面更完整、更光滑、更類似於正常的關節組織(圖2A)。從數量上看，未分層組(9±0.3)與分層組(10.5±0.1)的ICRS肉眼評分明顯高於對照組(4±0.5)(圖2B)。此外，經分層的關節軟骨細胞層片處理的缺損的得分顯著高於經未分層的關節軟骨細胞層片處理的缺損的得分(p<0.05)(圖2B)。為了觀察不同植入組之間的細胞結構及基質組成，本發明用H&E(圖2C)、番紅(圖2D)、及阿新藍染色(圖2E)進行了顯微組織學。對照組中的缺損含有較少的細胞分佈並且被類似纖維組織的疏鬆結締組織包圍，對阿新藍及番紅的染色也非常弱。相比之 下，植入未分層層片的缺損，其修復區的大部分軟骨細胞比對照組更均勻地分佈在修復區，並且表現出更高的阿新藍及番紅染色強度。此外，在分層層片植入組中，新軟骨顯示更接近天然軟骨的區域結構，在淺層區，細胞分佈密集且蛋白多醣含量(如番紅所染色)較低。在中層區，蛋白多醣含量隨深度增加而增加，軟骨細胞呈圓形並且比淺層區更稀少。此外，也可清楚地觀察到陷窩(lacunae)(空心三角形)。在深層區，軟骨細胞排列成柱狀，且存在軟骨特異性陷窩(實心三角形)。並且也表現出三組中最強的阿新藍及番紅染色強度。最後，使用Mankin組織學評分系統對軟骨組織再生品質的相對定量評估分別為對照組13.2、未分層層片組4.3、及分層層片組1.8。這表明與無植入物或經未分層層片處理的缺損相比，經分層層片處理的缺損的組織學評分顯著提高(圖2F)。為了進一步表徵新軟骨的組成，本發明對Col-2a1、聚集蛋白多醣(Aggrecan)、及Col-10a1進行免疫組織化學染色(IHC)以分別檢測成熟軟骨基質及肥大軟骨基質。如圖3A所示，新軟骨的Col-2a1及聚集蛋白多醣(Aggrecan)含量在未分層組及分層組中呈陽性染色，但在對照組中則為陰性。此外，Col-2a1在缺損內再生組織的細胞外基質中表現。相反地，聚集蛋白多醣(Aggrecan)既保持在細胞內也沉積在細胞外基質中。此外，分層組比未分層組呈現出更多的Col-2a1及聚集蛋白多醣(Aggrecan)染色，這與累積光密度(integrated optical density，IOD)測量的結果一致(圖3B及圖3C)。然而，這些新軟骨在對照組及未分層組中對Col-10a1的染色呈現陽性(圖3A，圖3D)，表示它們是纖維軟骨。相比之下，分層組的新軟骨是透明軟骨，其可由大量的蛋白多醣與Col-2a1沉積以及缺乏Col-10a1來證實。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之方法及組合物、其製造程序與方法及其用途乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
<110> 高雄醫學大學
<120> 區域分層的軟骨細胞層片的製備方法及其用途
<130> 3833-KMU-TW
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> col-2a1正向引子
<400> 1
Figure 111110035-A0101-12-0026-1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> col-2a1反向引子
<400> 2
Figure 111110035-A0101-12-0027-2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aggrecan正向引子
<400> 3
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<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aggrecan反向引子
<400> 4
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<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> col-10a1正向引子
<400> 5
Figure 111110035-A0101-12-0028-5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> col-10a1反向引子
<400> 6
Figure 111110035-A0101-12-0029-6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gapdh正向引子
<400> 7
Figure 111110035-A0101-12-0029-7
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gapdh反向引子
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
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<220>
<223> col-1a1正向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> col-1a1反向引子
<400> 10
Figure 111110035-A0101-12-0031-10
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sox5正向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0031-11
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sox5反向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0032-12
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sox6正向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0032-13
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sox6反向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0033-14
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GGCAATCCCAGGGTCCACCAAC
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<213> 人工序列
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<220>
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Figure 111110035-A0101-12-0034-17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mmp13反向引子
<400> 18
Figure 111110035-A0101-12-0035-18
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> runx2正向引子
<400> 19
Figure 111110035-A0101-12-0035-19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> runx2反向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0036-20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prg4正向引子
<400> 21
Figure 111110035-A0101-12-0036-21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prg4反向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0037-22
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pcna forward primer
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Figure 111110035-A0101-12-0037-23
<210> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> pcna反向引子
<400> 24
Figure 111110035-A0101-12-0038-24
<210> 25
<211> 20
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<213> 人工序列
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<223> IL-1B正向引子
<400> 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-1B反向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0039-26
<210> 27
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<212> DNA
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<220>
<223> IL-6正向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0039-27
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6反向引子
<400> 28
Figure 111110035-A0101-12-0040-28
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-8正向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0040-29
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-8反向引子
<400> 30
Figure 111110035-A0101-12-0041-30
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> TNFa正向引子
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<210> 32
<211> 20
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<220>
<223> TNFa反向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0042-32
<210> 33
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<220>
<223> MIF正向引子
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Figure 111110035-A0101-12-0042-33
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MIF反向引子
<400> 34
Figure 111110035-A0101-12-0043-34

Claims (10)

  1. 一種製備區域分層的軟骨細胞層片的方法，包含以下步驟：
    (a)提供來自一個體的軟骨樣本；
    (b)從該軟骨樣本中分離出軟骨細胞，再從該軟骨細胞分離出淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞；
    (c)接種該深層區軟骨細胞於一培養皿中的培養基內，且培養該深層區軟骨細胞直至達到90-100%細胞匯合(cell confluence)以形成一深層區軟骨層片；
    (d)接種該中層區軟骨細胞到步驟(c)所培養形成的深層區軟骨層片上，並培養該中層區軟骨細胞直至達到90-100%細胞匯合以形成一中層區軟骨層片；及
    (e)接種該淺層區軟骨細胞到步驟(d)所培養形成的中層區軟骨層片上，並培養該淺層區軟骨細胞直至達到90-100%細胞匯合以形成一淺層區軟骨細胞層片，來獲得具有該深層區軟骨層片、該中層區軟骨層片、及該淺層區軟骨層片的該區域分層的軟骨細胞層片。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該軟骨樣本係關節軟骨樣本。
  3. 如請求項1所述之方法，其中步驟(b)中的分離方法包含透過密度梯度離心的細胞分離技術。
  4. 如請求項1所述之方法，其中用於接種的淺層區軟骨細胞、中層區軟骨細胞、及深層區軟骨細胞的細胞密度範圍為每平方公分1x104-5x104個細胞。
  5. 如請求項1所述之方法，其中在步驟(e)中，於接種該淺層區軟骨細胞後，該區域分層的軟骨細胞層片的培養時間為1-3週。
  6. 如請求項1所述之方法，其中用於培養在步驟(e)中的該區域分層的軟骨細胞層片的培養基包含蘇拉明(suramin)。
  7. 一種組合物在製備用於治療軟骨缺損的醫藥組合物的用途，其中該組合物包含由請求項1之方法製備的區域分層的軟骨細胞層片。
  8. 如請求項7所述之用途，其中該軟骨缺損包含一關節軟骨缺損。
  9. 如請求項8所述之用途，其中該組合物的施用途徑包含關節內施予。
  10. 一種包含區域分層的軟骨細胞層片的組合物，其係由請求項1之方法製備。
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