TW202246335A - 抗體及其用途 - Google Patents

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布萊恩 菲斯克
尼米敘 格拉
亞歷山大 尼科爾斯
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美商米西克治療公司
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Abstract

本文係提供抗體及抗體之用途。

Description

抗體及其用途
相關申請案之交互參照
本申請案係聲請2021年2月3日申請的美國臨時專利申請案序號63/145,348之優先權;其全文內容係以引用的方式併入本文中。
本揭示文係關於生物技術領域,且更特言之,係關於抗原-結合分子,例如抗體。
抗體-藥物接合物已設計用來對付各種疾病。此方法之一特別的優點為抗體-藥物接合物具有細胞抑制或細胞毒性效應之能力。儘管已發展數年,但改良的抗體-藥物接合物仍有需求。
本發明係以可產生展現提升的效用(例如,一或更多項增加(例如可察覺的增加)在標的哺乳動物細胞中釋放毒素,在標的哺乳動物細胞中增加(例如可察覺的增加)殺滅,以及增加(例如可察覺的增加)內溶酶體的遞送)之抗體的概念為基礎。
文中係提供包括下列之抗體:(a)由下列之群選出的重鏈可變區和輕鏈可變區:(i)分別為SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6;(ii)分別為SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8;(iii)分別為SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10;(iv)分別為SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12;(v)分別為SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14;(vi)分別為SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16;(vii)分別為SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18;(viii)分別為SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20;(ix)分別為SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22;(x)分別為SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24;(xi)分別為SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26;(xii)分別為SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28;(xiii)分別為SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30;(xiv)分別為SEQ ID NO: 31和SEQ ID NO: 32;(xv)分別為SEQ ID NO: 33和SEQ ID NO: 34;及(b)包括下列一或多項之SEQ ID NO: 155或SEQ ID NO: 189的重鏈CH1-CH2-CH3序列:(i)在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;(ii)在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸,(iii)在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸及在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;(iv)在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸;及/或包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸之SEQ ID NO: 157的輕鏈C L序列。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO: 155或SEQ ID NO: 189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:153。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:153。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:153。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中, SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及SEQ ID NO: 157的輕鏈C L序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:42;(ii)分別為SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50;(iii)分別為SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:58;(iv)分別為SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:66;(v)分別為SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:74;(vi)分別為SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:82;(vii)分別為SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:90;(viii)分別為SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:98;(ix)分別為SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:106;(x)分別為SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:114;(xi)分別為SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:122;(xii)分別為SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:130;(xiii)分別為SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:138;(xiv)分別為SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:146;或(xv)分別為SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:154。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中, SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及SEQ ID NO: 157的輕鏈C L序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:42;(ii)分別為SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50;(iii)分別為SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:58;(iv)分別為SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:66;(v)分別為SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:74;(vi)分別為SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:82;(vii)分別為SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:90;(viii)分別為SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:98;(ix)分別為SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106;(x)分別為SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:114;(xi)分別為SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:122;(xii)分別為SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:130;(xiii)分別為SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:138;(xiv)分別為SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:146;或(xv)分別為SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:154。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,和在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及SEQ ID NO: 157的輕鏈C L序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:42;(ii)分別為SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50;(iii)分別為SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:58;(iv)分別為SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:66;(v)分別為SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:74;(vi)分別為SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:82;(vii)分別為SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:90;(viii)分別為SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:98;(ix)分別為SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:106;(x)分別為SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:114;(xi)分別為SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:122;(xii)分別為SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:130;(xiii)分別為SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:138;(xiv)分別為SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:146;或(xv)分別為SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:154。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;和以半胱胺酸取代丙胺酸在胺基酸位置1。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:153。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;以白胺酸取代甲硫胺酸在胺基酸位置311及以絲胺酸取代天門冬醯胺酸在胺基酸位置317;及以半胱胺酸取代丙胺酸在胺基酸位置1。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:153。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,和在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體進一步係包括與下列一或多項接合的細胞毒性藥物:(a)SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3係包括下列一或多項:(i)在胺基酸位置103的半胱胺酸;(ii)在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸的半胱胺酸;(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸;及(iv)在胺基酸位置112的半胱胺酸;及/或(b)在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括與SEQ ID NO:157之位置98的半胱胺酸接合之細胞毒性劑或細胞抑制劑。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括與SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之位置1的半胱胺酸接合之細胞毒性劑或細胞抑制劑。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該細胞毒性劑或細胞抑制劑為接合的毒素、放射性同位素、藥物或小分子。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,(a)在約4.0至約6.5之pH時該抗體的解離速率比在約7.0至約8.0之pH時的解離速率更快;或(b)在約4.0至約6.5之pH時該抗體的解離常數(K D)比在約7.0至約8.0之pH時的K D更大。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,包括該抗體的組成物:係提供下列一或多項:相較於包括相同量對照抗體的組成物,增加標的哺乳動物細胞中的毒素釋放;相較於包括相同量對照抗體的組成物,增加標的哺乳動物細胞殺滅;及相較於包括相同量對照抗體的組成物,增加標的哺乳動物細胞中的內溶酶體遞送(endolysosomal delivery)。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,包括該抗體的組成物:相較於包括相同量對照抗體的組成物,造成呈現在標的哺乳動物細胞表面上的MET量較低的下降;或不會造成呈現在標的哺乳動物細胞表面上的MET量可察覺的下降。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係在抗體被標的哺乳動物細胞內化後,在標的哺乳動物細胞中降解。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該標的哺乳動物細胞為癌細胞。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體對該標的哺乳動物細胞具細胞毒性或細胞抑制性。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體具有造成對癌細胞選擇性增加優於非癌細胞之親和力。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係:與非人類靈長類MET和人類MET交叉反應;或與非人類靈長類MET、人類MET,及大鼠MET和小鼠MET其中之一或二者交叉反應。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,相較於對照抗體在活體內的半衰期,該抗體在活體內的半衰期為增加的。
文中亦提供包括一有效量之任何文中所述抗體的醫藥組成物。文中亦提供包括至少一劑之任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物的套組。
文中亦提供治療其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群之癌症的方法,該方法係包括將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
文中亦提供於一對象中降低腫瘤體積的方法,其中該腫瘤其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
文中亦提供於一對象之癌細胞中引發細胞死亡的方法,其中該癌細胞係具有呈現在其表面之MET或MET表位,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
文中亦提供於一具有癌症的對象中降低發生轉移風險或降低發生另外的轉移風險之方法,其中該癌症其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的細胞群,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
文中亦提供包括下列之抗體:(a)由下列組成之群中選出的重鏈可變區和輕鏈可變區:(i)分別為SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160;(ii)分別為SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162;及(iii)分別為SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164;以及(b)包括一或多項下列取代的SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列:(i)在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;(ii)在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸,(iii)在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸及在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;(iv)在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸;及/或包括在位置98以半胱胺酸取代纈胺酸之SEQ ID NO:157的輕鏈C L序列。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:187。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸及在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:187。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸, 在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:187。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:172;(ii)分別為SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:180;或(iii)分別為SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:188。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:172;(ii)分別為SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:180;或(iii)分別為SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:188。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:172;(ii)分別為SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:180;或(iii)分別為SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:188。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:187。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;以白胺酸取代甲硫胺酸在胺基酸位置311 和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:187。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體進一步係包括與下列一或多項接合的細胞毒性藥物:(a)包括下列一或多項之SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈CH1-CH2-CH3:(i)在胺基酸位置103的半胱胺酸;(ii)在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸的半胱胺酸;(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸;(iv)在胺基酸位置112的半胱胺酸;及/或(b) SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體進一步係包括與SEQ ID NO:157之位置98的半胱胺酸接合之細胞毒性劑或細胞抑制劑。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體進一步係包括與SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之位置1的半胱胺酸接合之細胞毒性劑或細胞抑制劑。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該細胞毒性劑或細胞抑制劑為接合的毒素、放射性同位素、藥物或小分子。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體對標的哺乳動物細胞具細胞毒性或細胞抑制性。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係在抗體被標的哺乳動物細胞內化後,在標的哺乳動物細胞中降解。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該標的哺乳動物細胞為癌細胞。在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體具有造成對癌細胞選擇性增加優於非癌細胞之親和力。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該抗體係:與非人類靈長類MET和人類MET交叉反應;或與非人類靈長類MET、人類MET,及大鼠MET和小鼠MET其中之一或二者交叉反應。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,相較於對照抗體在活體內的半衰期,該抗體在活體內的半衰期為增加的。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,該標的哺乳動物細胞為癌細胞。
文中亦提供包括一有效量之任何文中所述抗體的醫藥組成物。文中亦提供包括至少一劑之任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物的套組。
文中亦提供治療其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群之癌症的方法,該方法係包括將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
文中亦提供於一對象中降低腫瘤體積的方法,其中該腫瘤其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
文中亦提供於一對象之癌細胞中引發細胞死亡的方法,其中該癌細胞係具有呈現在其表面之MET或MET表位,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有癌細胞群之癌症的對象。
文中亦提供於一具有癌症的對象中降低發生轉移風險或降低發生另外的轉移風險之方法,其中該癌症其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
「抗原結合區」為能特異性結合一或更多種不同抗原之一或多個蛋白區(例如由來自單一多肽之胺基酸所形成或由來自二或更多個多肽(例如,相同或不同的多肽)之胺基酸所形成)。在某些實例中,抗原結合區可以類似天然生成的抗體之特異性和親和力與一抗原或表位結合。在某些具體實例中,該抗原結合區可為一抗體或其片段。在某些具體實例中,該抗原結合區可包括替代性支架。抗原結合區之非限定實例係描述於文中。抗原結合區之另外的實例已為本項技術所知。在某些實例中,該抗原結合區可與單一抗原結合。
術語「抗體」係以最廣義用於文中並包括特定類型的免疫球蛋白分子,其係包括一或多個與一抗原或表位特異性結合之抗原結合區。一抗體特言之係包括,例如完整抗體(例如完整免疫球蛋白,例如人類IgG(例如,人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4)),抗體片段及多-特異性抗體。抗原結合區之一實例為由VH–VL二聚體所形成的抗原結合區。另外的抗體之實例係描述於文中。另外的抗體之實例已為本項技術所知。
詞語「胞內體/溶酶體路徑」係指哺乳動物細胞之細胞質中胞內體(早期胞內體,多泡體、晚期胞內體、和溶酶體)的網絡,其中係將經由細胞媒介的內化過程,例如胞飲作用、微胞飲作用、受體媒介的內噬作用、及/或吞噬作用所內化的分子分類。
一旦胞內體/溶酶體路徑中的胞內體經純化或分離,則可使用本項技術中已知的方法(ELISA、西方墨點、免疫螢光和免疫沉澱接著蛋白濃度之分析)進行標的蛋白(例如,文中所述抗體)之分析,並可用於測定胞內體中標的蛋白的濃度或相對量。可替代地,胞內體/溶酶體路徑中的胞內體可使用免疫螢光顯微術造影,使用與呈現在胞內體中的特徵蛋白特異性結合之可偵測-標定抗體(例如,螢光團-標定,染劑標定、或GFP-標定的抗體,例如CellLight TM早期胞內體-GFP)(例如,用於早期胞內體之EEA1)和與感興趣蛋白(例如,抗體)特異性結合的螢光團-標定的抗體,且可藉由定量二種不同抗體之螢光發射中的重疊,測定胞內體中標的蛋白的量。
詞語「內溶酶體遞送(endolysosomal delivery)」係指在哺乳動物細胞(例如,任何文中所述之例示的標的哺乳動物細胞)之胞內體/溶酶體路徑中隨時間的抗體(例如,任何文中所述的抗體)累積率或在特定時間點的總累積量。
用於測量任何文中所述抗體之內溶酶體遞送的例示性分析係包括該等涉及以螢光染劑標定抗體,接著以細胞培養該標定的抗體並測量細胞螢光作為抗體之內溶酶體遞送的指標(例如,如Wustner, Traffic7(6):699-715, 2006中所述)。可替代地,可使用在酸性pH優先發出螢光但在中性pH則無的pH-敏感性染劑來標定任何文中所述的抗體,然後可將其以細胞培養並測量細胞螢光作為抗體遞送至酸性內溶酶體隔室的指標。
術語「群」當用於名詞前面時係指二或更多該特定的名詞。例如,詞語「癌細胞群」係指「二或更多種癌細胞」。癌細胞之非限定實例係描述於文中。
詞語「對細胞具細胞抑制性」係指在活體內或活體外直接或間接降低細胞(例如癌細胞)增生(細胞分裂)。當一試劑對細胞具細胞抑制性時,例如,可直接或間接造成細胞(例如癌細胞)的細胞週期停滯。在某些實例中,對細胞具細胞抑制性的試劑可降低處於S期之細胞群中的細胞數目(與接觸該試劑之前該處於S期之細胞群中的細胞數相比較)。在某些實例中,對細胞具細胞抑制性的試劑可降低處於S期之細胞的百分比至少20%,至少40%,至少60%,或至少80%(例如,與接觸該試劑之前該處於S期之細胞群中的細胞百分比相比較)。
詞語「對細胞具細胞毒性」係指直接或間接引發細胞(例如,哺乳動物細胞,例如癌細胞)死亡(例如,壞死或凋亡)。
「親和力」係指抗原結合位及其結合夥伴(例如抗原或表位)之間非共價相互作用的力量總和。除非另有指出,否則如文中所,「親和力」係指固有的結合親和力,其係反映抗原結合區的數目和抗原或表位之間1:1的相互作用。分子X對其夥伴Y的親和力可以解離平衡常數(K D)來表示。親和力可使用本項技術中已知的常用方法測量,包括該等文中所述的方法。親和力,例如,可使用表面電漿共振(SPR)技術(例如,BIACORE®)或生物膜干涉技術(例如,FORTEBIO®)來測定。用於測定抗原結合區及其對應抗原或表位之親和力的另外方法已為本項技術所知。
術語「表位」係指經由一組介於下列各物之間的物理相互作用與抗原結合區特異性結合的抗原部分:(i)在特異性結合抗原之抗原結合區部份上的所有單體(例如,個別胺基酸殘基、糖側鏈和轉譯後修飾的胺基酸殘基)以及(ii) 與抗原結合區特異性結合之抗原部分上的所有單體(例如,個別胺基酸殘基、糖側鏈和轉譯後修飾的胺基酸殘基)。表位可,例如,由表面可觸及的胺基酸殘基、糖側鏈、磷酸化胺基酸殘基、甲基化胺基酸殘基及/或乙醯化胺基酸殘基所組成並可具有特定的三維結構特性,以及特定的帶電特徵。構形和非構形表位其區別在於在變性溶劑的呈現在下,可能喪失與前者之結合,但非後者不會。在某些具體實例中,表位係以至少約3至6個胺基酸,或約10至15個胺基酸之線性胺基酸序列來定義。在某些具體實例中,表位係指全長蛋白的一部分或其以三維結構所定義的部分(例如蛋白摺疊)。在某些具體實例中,表位係以經由蛋白摺疊聚集一起之不連續的胺基酸序列來定義。在某些具體實例中,表位係以藉由四級結構聚集一起之不連續的胺基酸序列來定義(例如,藉由二條不同多肽鏈的相互作用所形成的裂隙)。定義表位之殘基間的胺基酸序列對於表位之三維結構可能不重要。使用比較抗體與變性版本的抗原之結合的分析,而得以產生線性表位,可測定和篩選構形表位。表位可包括直接涉及結合的胺基酸殘基,以及其他未直接涉及結合的胺基酸殘基。
用於鑑定與抗原結合區特異性結合之表位的方法已為本項技術所知,例如,以結構為基礎的分析(例如X-光結晶學,NMR及/或電子顯微技術)(例如在抗原及/或抗原-抗原結合區複合物上)及/或誘變-為基礎的分析(例如丙胺酸掃描誘變,甘胺酸掃描誘變,以及同源掃描誘變)其中係以一結合分析以結合夥伴來測量突變物,其許多已為本項技術所知。
術語「互補位(paratope)」係指經由一組介於下列各物之間的物理相互作用與抗原特異性結合的一部分抗原結合區:(i)在特異性結合抗原之抗原結合區部份上的所有單體(例如,個別胺基酸殘基、糖側鏈、轉譯後修飾的胺基酸殘基)以及(ii)與抗原結合區特異性結合之抗原部分上的所有單體(例如,個別胺基酸殘基,糖側鏈,轉譯後修飾的胺基酸殘基)。互補位,例如,可由表面可觸及的胺基酸殘基所組成並可具有特定的三維結構特性,以及特定的帶電特徵。在某些具體實例中,互補位係指全長抗原結合區的一部分或其以三維結構所定義的部分(例如蛋白摺疊)。在某些具體實例中,互補位係以經由蛋白摺疊聚集一起之不連續的胺基酸序列來定義。在某些具體實例中,互補位係以藉由四級結構聚集一起之不連續的胺基酸序列來定義(例如,藉由二條不同多肽鏈的相互作用所形成的裂隙)。定義互補位之殘基間的胺基酸序列對於互補位之三維結構可能不重要。互補位可包括直接涉及結合的胺基酸殘基,以及其他未直接涉及結合的胺基酸殘基。
用於鑑定與抗原結合區特異性結合之互補位的方法已為本項技術所知,例如,以結構為基礎的分析(例如X-光結晶學,NMR及/或電子顯微技術)(例如在抗原及/或抗原-抗原結合區複合物上)及/或誘變-為基礎的分析(例如丙胺酸掃描誘變,甘胺酸掃描誘變,以及同源掃描誘變)其中係以一結合分析以結合夥伴來測量突變物,其許多已為本項技術所知。
詞語「呈現在哺乳動物細胞表面上」係指(1)物理上連附或至少部分嵌入哺乳動物細胞的細胞膜的抗原(例如跨膜蛋白,膜周邊蛋白,脂錨定蛋白(例如,GPI-錨定蛋白),N-肉荳蔻醯化蛋白或S-棕櫚醯化蛋白)或(2)穩定與其同族受體結合之抗原,其中該同族受體係物理上連附哺乳動物細胞的細胞膜(例如,與其同族受體結合的配體,其中該同族受體係物理上連附該細胞膜)。用於測定哺乳動物細胞表面上呈現在的抗原之非限定方法包括螢光活化細胞分類(FACS)、免疫組織化學、細胞離拆分析和西方墨點。
詞語「對照抗體」係指(i)能與呈現在哺乳動物細胞(例如標的哺乳動物細胞)表面上的MET或MET之表位特異性結合的抗體,其中下列一或二項為確實的:(a)在約4.0至約6.5的pH時(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)第一抗原結合區的解離速率比在約7.0至約8.0的pH時(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)的解離速率快不超過3-倍(例如,不超過2.8-倍,不超過2.6-倍,不超過2.5-倍,不超過2.4-倍,不超過2.2-倍,不超過2.0-倍,不超過1.8-倍,不超過1.6-倍,不超過1.5-倍,不超過1.4-倍,不超過1.2-倍,不超過1.0-倍,不超過0.8-倍,不超過0.6-倍,不超過0.5-倍,不超過0.4-倍,不超過0.3-倍不超過0.2-倍,或不超過0.1-倍);或(b)在約4.0至約6.5的pH時(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)第一抗原結合區的解離常數(K D)比在約7.0至約8.0的pH時(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)的K D大不超過3-倍(例如,不超過2.8-倍,不超過2.6-倍,不超過2.5-倍,不超過2.4-倍,不超過2.2-倍,不超過2.0-倍,不超過1.8-倍,不超過1.6-倍,不超過1.5-倍,不超過1.4-倍,不超過1.2-倍,不超過1.0-倍,不超過0.8-倍,不超過0.6-倍,不超過0.5-倍,不超過0.4-倍,不超過0.3-倍不超過0.2-倍,或不超過0.1-倍);及/或(ii)特立妥珠單抗(Telisotuzumab);(iii)艾貝珠單抗(Emibetuzumab);及/或(iv) P3D12。
術語「胞外空間」係指哺乳動物細胞之細胞膜外部的液體。當哺乳動物細胞在活體外時,胞外空間可為液體培養基。當哺乳動物細胞在活體內時,胞外空間可為,例如,血漿、血清、血液、間質液或淋巴。
術語「內溶酶體空間」係指由構成哺乳動物細胞中的胞內體/溶酶體路徑之囊泡和胞器所包封的液體。
詞語「下降量」或「降低量」可為相較於一參照量或數值,下降或降低至少1%(例如,至少2%,至少4%,至少6%,至少8%,至少10%,至少12%,至少14%,至少16%,至少18%,至少20%,至少22%,至少24%,至少26%,至少30%,至少35%,至少40%,至少45%,至少50%,至少55%,至少60%,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或至少99%)下降。
術語「細胞殺滅效力」係指一試劑(例如,任何文中所述之抗體)直接或間接引發哺乳動物細胞(例如,癌細胞)凋亡及/或壞死之能力,如隨時間或一相關時間點之比率所測。用於測定細胞之細胞殺滅效力的方法已為本項技術所知(例如,台盼藍染色,顯微鏡法,螢光輔助細胞分類,以及偵測細胞凋亡之標記的分析(例如,Annexin V))。在非限定的實例中,可例如,藉由單一濃度試劑所殺滅的細胞,藉由試劑的IC50(亦即,達到半數最大細胞殺滅效力時的試劑濃度),或藉由哺乳動物細胞上的試劑解離常數KD除以其IC50之比率,來測量細胞殺滅效力。在某些非限定實例中,文中所述的IC50及/或KD比率係與對照抗體(如文中所定義)的IC50及/或KD比率相比較,及,視需要,相較於對照抗體,驗證了文中所述之抗體具有較高的細胞殺滅效力。
術語「毒素釋放」係指哺乳動物細胞(例如,非癌性哺乳動物細胞或癌細胞)內化(例如,經由胞飲作用及/或受體媒介的內吞作用)任何與一毒素接合的文中所述抗體(例如,任何文中所述抗體或對照抗體),及隨後釋放該與抗體接合的毒素之能力,如隨時間或在一特定時間點之比率所測。毒素釋放可使用各種不同的例示性分析來評估,例如,ELISA,免疫螢光殺滅分析,細胞殺滅分析,細胞週期阻滯分析,DNA損傷分析,質譜法,HPLC及/或同位素標定的毒素。
詞語「標的細胞」或「標的哺乳動物細胞」或「哺乳動物標的細胞」係指具有至少一MET呈現在其表面上的哺乳動物細胞。在某些實例中,哺乳動物標的細胞可為癌細胞。在標的哺乳動物細胞之某些具體實例中可具有總計約1至約10,000,000,約1至約9,000,000,約1至約8,000,000,約1至約7,000,000,約1至約6,000,000,約1至約5,000,000,約1至約4,000,000,約1至約3,000,000,約1至約2,000,000,約1至約1,000,000,約1至約800,000,約1至約600,000,約1至約400,000,約1至約200,000,約1至約100,000,約1至約80,000,約1至約80,000,約1至約75,000,約1至約70,000,約1至約65,000,約1至約60,000,約1至約55,000,約1至約50,000,約1至約45,000,約1至約40,000,約1至約35,000,約1至約30,000,約1至約25,000,約1至約20,000,約1至約15,000,約1至約10,000,約1至約7,500,約1至約5,000,約1至約4,000,約1至約3,000,約1至約2,000,約1至約1,000,約1至約500,約1至約100,約1至約50,約1至約10,約10至約10,000,000,約10至約9,000,000,約10至約8,000,000,約10至約7,000,000,約10至約6,000,000,約10至約5,000,000,約10至約4,000,000,約10至約3,000,000,約10至約2,000,000,約10至約1,000,000,約10至約800,000,約10至約600,000,約10至約400,000,約10至約200,000,約10至約100,000,約10至約80,000,約10至約80,000,約10至約75,000,約10至約70,000,約10至約65,000,約10至約60,000,約10至約55,000,約10至約50,000,約10至約45,000,約10至約40,000,約10至約35,000,約10至約30,000,約10至約25,000,約10至約20,000,約10至約15,000,約10至約10,000,約10至約7,500,約10至約5,000,約10至約4,000,約10至約3,000,約10至約2,000,約10至約1,000,約10至約500,約10至約100,約10至約50,約50至約10,000,000,約50至約9,000,000,約50至約8,000,000,約50至約7,000,000,約50至約6,000,000,約50至約5,000,000,約50至約4,000,000,約50至約3,000,000,約50至約2,000,000,約50至約1,000,000,約50至約800,000,約50至約600,000,約50至約400,000,約50至約200,000,約50至約100,000,約50至約80,000,約50至約80,000,約50至約75,000,約50至約70,000,約50至約65,000,約50至約60,000,約50至約55,000,約50至約50,000,約50至約45,000,約50至約40,000,約50至約35,000,約50至約30,000,約50至約25,000,約50至約20,000,約50至約15,000,約50至約10,000,約50至約7,500,約50至約5,000,約50至約4,000,約50至約3,000,約50至約2,000,約50至約1,000,約50至約500,約50至約100,約100至約10,000,000,約100至約9,000,000,約100至約8,000,000,約100至約7,000,000,約100至約6,000,000,約100至約5,000,000,約100至約4,000,000,約100至約3,000,000,約100至約2,000,000,約100至約1,000,000,約100至約800,000,約100至約600,000,約100至約400,000,約100至約200,000,約100至約100,000,約100至約80,000,約100至約75,000,約100至約70,000,約100至約65,000,約100至約60,000,約100至約55,000,約100至約50,000,約100至約45,000,約100至約40,000,約100至約35,000,約100至約30,000,約100至約25,000,約100至約20,000,約100至約15,000,約100至約10,000,約100至約7,500,約100至約5,000,約100至約4,000,約100至約3,000,約100至約2,000,約100至約1,000,約100至約500,約500至約10,000,000,約500至約9,000,000,約500至約8,000,000,約500至約7,000,000,約500至約6,000,000,約500至約5,000,000,約500至約4,000,000,約500至約3,000,000,約500至約2,000,000,約500至約1,000,000,約500至約800,000,約500至約600,000,約500至約400,000,約500至約200,000,約500至約100,000,約500至約80,000,約500至約75,000,約500至約70,000,約500至約65,000,約500至約60,000,約500至約55,000,約500至約50,000,約500至約45,000,約500至約40,000,約500至約35,000,約500至約30,000,約500至約25,000,約500至約20,000,約500至約15,000,約500至約10,000,約500至約7,500,約500至約5,000,約500至約4,000,約500至約3,000,約500至約2,000,約500至約1,000,約1,000至約10,000,000,約1,000至約9,000,000,約1,000至約8,000,000,約1,000至約7,000,000,約1,000至約6,000,000,約1,000至約5,000,000,約1,000至約4,000,000,約1,000至約3,000,000,約1,000至約2,000,000,約1,000至約1,000,000,約1,000至約800,000,約1,000至約600,000,約1,000至約400,000,約1,000至約200,000,約1,000至約100,000,約1,000至約80,000,約1,000至約75,000,約1,000至約70,000,約1,000至約65,000,約1,000至約60,000,約1,000至約55,000,約1,000至約50,000,約1,000至約45,000,約1,000至約40,000,約1,000至約35,000,約1,000至約30,000,約1,000至約25,000,約1,000至約20,000,約1,000至約15,000,約1,000至約10,000,約1,000至約7,500,約1,000至約5,000,約1,000至約4,000,約1,000至約3,000,約1,000至約2,000,約2,000至約10,000,000,約2,000至約9,000,000,約2,000至約8,000,000,約2,000至約7,000,000,約2,000至約6,000,000,約2,000至約5,000,000,約2,000至約4,000,000,約2,000至約3,000,000,約2,000至約2,000,000,約2,000至約1,000,000,約2,000至約800,000,約2,000至約600,000,約2,000至約400,000,約2,000至約200,000,約2,000至約100,000,約2,000至約80,000,約2,000至約75,000,約2,000至約70,000,約2,000至約65,000,約2,000至約60,000,約2,000至約55,000,約2,000至約50,000,約2,000至約45,000,約2,000至約40,000,約2,000至約35,000,約2,000至約30,000,約2,000至約25,000,約2,000至約20,000,約2,000至約15,000,約2,000至約10,000,約2,000至約7,500,約2,000至約5,000,約2,000至約4,000,約2,000至約3,000,約3,000至約10,000,000,約3,000至約9,000,000,約3,000至約8,000,000,約3,000至約7,000,000,約3,000至約6,000,000,約3,000至約5,000,000,約3,000至約4,000,000,約3,000至約3,000,000,約3,000至約2,000,000,約3,000至約1,000,000,約3,000至約800,000,約3,000至約600,000,約3,000至約400,000,約3,000至約200,000,約3,000至約100,000,約3,000至約80,000,約3,000至約75,000,約3,000至約70,000,約3,000至約65,000,約3,000至約60,000,約3,000至約55,000,約3,000至約50,000,約3,000至約45,000,約3,000至約40,000,約3,000至約35,000,約3,000至約30,000,約3,000至約25,000,約3,000至約20,000,約3,000至約15,000,約3,000至約10,000,約3,000至約7,500,約3,000至約5,000,約3,000至約4,000,約4,000至約10,000,000,約4,000至約9,000,000,約4,000至約8,000,000,約4,000至約7,000,000,約4,000至約6,000,000,約4,000至約5,000,000,約4,000至約4,000,000,約4,000至約3,000,000,約4,000至約2,000,000,約4,000至約1,000,000,約4,000至約800,000,約4,000至約600,000,約4,000至約400,000,約4,000至約200,000,約4,000至約100,000,約4,000至約80,000,約4,000至約75,000,約4,000至約70,000,約4,000至約65,000,約4,000至約60,000,約4,000至約55,000,約4,000至約50,000,約4,000至約45,000,約4,000至約40,000,約4,000至約35,000,約4,000至約30,000,約4,000至約25,000,約4,000至約20,000,約4,000至約15,000,約4,000至約10,000,約4,000至約7,500,約4,000至約5,000,約5,000至約10,000,000,約5,000至約9,000,000,約5,000至約8,000,000,約5,000至約7,000,000,約5,000至約6,000,000,約5,000至約5,000,000,約5,000至約4,000,000,約5,000至約3,000,000,約5,000至約2,000,000,約5,000至約1,000,000,約5,000至約800,000,約5,000至約600,000,約5,000至約400,000,約5,000至約200,000,約5,000至約100,000,約5,000至約80,000,約5,000至約75,000,約5,000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,000,000,約60,000至約8,000,000,約60,000至約7,000,000,約60,000至約6,000,000,約60,000至約5,000,000,約60,000至約4,000,000,約60,000至約3,000,000,約60,000至約2,000,000,約60,000至約1,000,000,約60,000至約800,000,約60,000至約600,000,約60,000至約400,000,約60,000至約200,000,約60,000至約100,000,約60,000至約80,000,約60,000至約75,000,約60,000至約70,000,約60,000至約65,000,約65,000至約10,000,000,約65,000至約9,000,000,約65,000至約8,000,000,約65,000至約7,000,000,約65,000至約6,000,000,約65,000至約5,000,000,約65,000至約4,000,000,約65,000至約3,000,000,約65,000至約2,000,000,約65,000至約1,000,000,約65,000至約800,000,約65,000至約600,000,約65,000至約400,000,約65,000至約200,000,約65,000至約100,000,約65,000至約80,000,約65,000至約75,000,約65,000至約70,000,約70,000至約10,000,000,約70,000至約9,000,000,約70,000至約8,000,000,約70,000至約7,000,000,約70,000至約6,000,000,約70,000至約5,000,000,約70,000至約4,000,000,約70,000至約3,000,000,約70,000至約2,000,000,約70,000至約1,000,000,約70,000至約800,000,約70,000至約600,000,約70,000至約400,000,約70,000至約200,000,約70,000至約100,000,約70,000至約90,000,約70,000至約80,000,約80,000至約10,000,000,約80,000至約9,000,000,約80,000至約8,000,000,約80,000至約7,000,000,約80,000至約6,000,000,約80,000至約5,000,000,約80,000至約4,000,000,約80,000至約3,000,000,約80,000至約2,000,000,約80,000至約1,000,000,約80,000至約800,000,約80,000至約600,000,約80,000至約400,000,約80,000至約200,000,約80,000至約100,000,約80,000至約90,000,約90,000至約10,000,000,約90,000至約9,000,000,約90,000至約8,000,000,約90,000至約7,000,000,約90,000至約6,000,000,約90,000至約5,000,000,約90,000至約4,000,000,約90,000至約3,000,000,約90,000至約2,000,000,約90,000至約1,000,000,約90,000至約800,000,約90,000至約600,000,約90,000至約400,000,約90,000至約200,000,約90,000至約100,000,約100,000至約10,000,000,約100,000至約9,000,000,約100,000至約8,000,000,約100,000至約7,000,000,約100,000至約6,000,000,約100,000至約5,000,000,約100,000至約4,000,000,約100,000至約3,000,000,約100,000至約2,000,000,約100,000至約1,000,000,約100,000至約800,000,約100,000至約600,000,約100,000至約400,000,約100,000至約200,000,約200,000至約10,000,000,約200,000至約9,000,000,約200,000至約8,000,000,約200,000至約7,000,000,約200,000至約6,000,000,約200,000至約5,000,000,約200,000至約4,000,000,約200,000至約3,000,000,約200,000至約2,000,000,約200,000至約1,000,000,約200,000至約800,000,約200,000至約600,000,約200,000至約400,000,約400,000至約10,000,000,約400,000至約9,000,000,約400,000至約8,000,000,約400,000至約7,000,000,約400,000至約6,000,000,約400,000至約5,000,000,約400,000至約4,000,000,約400,000至約3,000,000,約400,000至約2,000,000,約400,000至約1,000,000,約400,000至約800,000,約400,000至約600,000,約600,000至約10,000,000,約600,000至約9,000,000,約600,000至約8,000,000,約600,000至約7,000,000,約600,000至約6,000,000,約600,000至約5,000,000,約600,000至約4,000,000,約600,000至約3,000,000,約600,000至約2,000,000,約600,000至約1,000,000,約600,000至約800,000,約800,000至約10,000,000,約800,000至約9,000,000,約800,000至約8,000,000,約800,000至約7,000,000,約800,000至約6,000,000,約800,000至約5,000,000,約800,000至約4,000,000,約800,000至約3,000,000,約800,000至約2,000,000,約800,000至約1,000,000,約1,000,000至約10,000,000,約1,000,000至約9,000,000,約1,000,000至約8,000,000,約1,000,000至約7,000,000,約1,000,000至約6,000,000,約1,000,000至約5,000,000,約1,000,000至約4,000,000,約1,000,000至約3,000,000,約1,000,000至約2,000,000,約2,000,000至約10,000,000,約2,000,000至約9,000,000,約2,000,000至約8,000,000,約2,000,000至約7,000,000,約2,000,000至約6,000,000,約2,000,000至約5,000,000,約2,000,000至約4,000,000,約2,000,000至約3,000,000,約3,000,000至約10,000,000,約3,000,000至約9,000,000,約3,000,000至約8,000,000,約3,000,000至約7,000,000,約3,000,000至約6,000,000,約3,000,000至約5,000,000,約3,000,000至約4,000,000,約4,000,000至約10,000,000,約4,000,000至約9,000,000,約4,000,000至約8,000,000,約4,000,000至約7,000,000,約4,000,000至約6,000,000,約4,000,000至約5,000,000,約5,000,000至約10,000,000,約5,000,000至約9,000,000,約5,000,000至約8,000,000,約5,000,000至約7,000,000,約5,000,000至約6,000,000,約6,000,000至約10,000,000,約6,000,000至約9,000,000,約6,000,000至約8,000,000,約6,000,000至約7,000,000,約7,000,000至約10,000,000,約7,000,000至約9,000,000,約7,000,000至約8,000,000,約8,000,000至約10,000,000,約8,000,000至約9,000,000,或約9,000,000至約10,000,000的MET呈現在標的哺乳動物細胞的細胞膜上。
詞語「抗原密度」係指呈現在標的哺乳動物細胞表面上的MET數目或一群特定類型之標的哺乳動物細胞表面上的MET平均數目。其可,例如,使用Quantibright微珠套組或放射性標記(例如,BD Biosciences PE藻紅素螢光定量套組,型號340495)來測量。
詞語「經組胺酸取代的胺基酸」係指以組胺酸取代一參照多肽序列中非組胺酸之胺基酸殘基。用於以組胺酸取代一參照多肽中的胺基酸殘基之非限定方法係描述於文中。用於以組胺酸取代一參照多肽中的胺基酸殘基之另外方法已為本項技術所知。
詞語「經丙胺酸取代的胺基酸」係指以丙胺酸取代一參照多肽序列中為組胺酸之胺基酸殘基。用於以丙胺酸取代一參照多肽中的組胺基酸之非限定方法係描述於文中。用於以丙胺酸取代一參照多肽中的組胺酸之另外方法已為本項技術所知。
除非另有定義,否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。用於本發明的方法和材料係描述於文中;亦可使用本項技術中已知的其他、適合方法和材料。材料、方法和實例僅為舉例說明且不希望受限。文中所提及的所有刊物、專利申請案、專利、序列、資料庫條目及其他參考文獻係以全文引用的方式併入文中。若有衝突時,則以本說明書(包括定義)為主。
本發明之其他的特色和優點由下列實施方式和圖式和由申請專利範圍將更為顯見。
文中係提供能特異性結合呈現在標的哺乳動物細胞表面上的MET或MET表位之抗體,其中:(a)在約4.0至約6.5之pH時解離速率比在約7.0至約8.0之pH時的解離速率更快;及/或(b)在約4.0至約6.5之pH時解離常數(K D)比在約7.0至約8.0之pH時的K D更大。在這些抗體的某些實例中,抗體係在抗體被標的哺乳動物細胞內化後,在標的哺乳動物細胞中降解。任何文中所述之抗體的某些實例可進一步包括接合的毒素、放射性同位素、藥物或小分子(例如,螢光團或染劑)。
亦提供能特異性結合呈現在標的哺乳動物細胞表面上的MET或MET表位之抗體;以及接合的毒素、放射性同位素、藥物或小分子,其中:(a)在約4.0至約6.5之pH時解離速率比在約7.0至約8.0之pH時的解離速率更快;及/或在約4.0至約6.5之pH時解離常數(K D)比在約7.0至約8.0之pH時的K D更大;及(b)包括該抗體的組成物係提供下列一或多項(例如,二或三項):相較於包括相同量之對照抗體的組成物,增加(例如,可察覺的增加)標的哺乳動物細胞中的毒素釋放;相較於包括相同量之對照抗體的組成物,增加(例如,可察覺的增加)標的哺乳動物細胞殺滅;以及相較於包括相同量之對照抗體的組成物,增加(例如,可察覺的增加)標的哺乳動物細胞之內溶酶體遞送。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,該抗體係包括特立妥珠單抗之重鏈可變區和輕鏈可變區,或更多個特立妥珠單抗之重鏈CH1-CH2-CH3區及/或C L區中的取代。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該抗體係包括艾貝珠單抗之重鏈可變區和輕鏈可變區,及一或更多個艾貝珠單抗之重鏈CH1-CH2-CH3區及/或C L區中的胺基酸取代。在任何文中所述抗體之某些實例中,該抗體係包括P3D12抗-cMET之重鏈可變區和輕鏈可變區,及一或更多個P3D12-cMet之重鏈CH1-CH2-CH3區及/或C L區中的胺基酸取代。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,該抗體係包括(a)由下列之群選出的重鏈可變區和輕鏈可變區:(i)分別為SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;(ii)分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8;(iii)分別為SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10;(iv)分別為SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12;(v)分別為SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14;(vi)分別為SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16;(vii)分別為SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18;(viii)分別為SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20;(ix)分別為SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22;(x)分別為SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24;(xi)分別為SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26;(xii)分別為SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28;(xiii)分別為SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30;(xiv)分別為SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32;(xv)分別為SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34;及(b)包括下列一或多項之SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈CH1-CH2-CH3序列:(i)在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;(ii)在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸,(iii)在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;(iv)在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸;及/或包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸之SEQ ID NO:157的輕鏈C L序列。
在任何文中所述之抗體的某些實例中, SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:65; (v)分別為SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:81; (vii)分別為SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:153。
在任何文中所述之抗體的某些實例中, SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:153。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;和在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:145;或(xv). SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:153。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;而SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:42;(ii)分別為SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50;(iii)分別為SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:58;(iv)分別為SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:66;(v)分別為SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:74;(vi)分別為SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:82;(vii)分別為SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:90;(viii)分別為SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:98;(ix)分別為SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:106;(x)分別為SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:114;(xi)分別為SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:122;(xii)分別為SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:130;(xiii)分別為SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:138;(xiv)分別為SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:146;或(xv)分別為SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:154。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;而SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:42;(ii)分別為SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50;(iii)分別為SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:58;(iv)分別為SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:66;(v)分別為SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:74;(vi)分別為SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:82;(vii)分別為SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:90;(viii)分別為SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:98;(ix)分別為SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106;(x)分別為SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:114;(xi)分別為SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:122;(xii)分別為SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:130;(xiii)分別為SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:138;(xiv)分別為SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:146;或(xv)分別為SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:154。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;和在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;而SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:42;(ii)分別為SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50;(iii)分別為SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:58;(iv)分別為SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:66;(v)分別為SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:74;(vi)分別為SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:82;(vii)分別為SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:90;(viii)分別為SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:98;(ix)分別為SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:106;(x)分別為SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:114;(xi)分別為SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:122;(xii)分別為SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:130;(xiii)分別為SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:138;(xiv)分別為SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:146;或(xv)分別為SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:154。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:153。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:153。
在任何文中所述抗體之某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41;(ii)分別為SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49;(iii)分別為SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57;(iv)分別為SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65;(v)分別為SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73;(vi)分別為SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81;(vii)分別為SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89;(viii)分別為SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97;(ix)分別為SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105;(x)分別為SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113;(xi)分別為SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121;(xii)分別為SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129;(xiii)分別為SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137;(xiv)分別為SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:145;或(xv)分別為SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153。
在某些具體實例中,(a)在約4.0至約6.5之pH時該抗體的解離速率比在約7.0至約8.0之pH時的解離速率更快;或(b)在約4.0至約6.5之pH時該抗體的解離常數(K D)比在約7.0至約8.0之pH時的K D更大。
在此等實例中,該抗體係包括(a)由下列組成之群中選出的重鏈可變區和輕鏈可變區:(i)分別為SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160;(ii)分別為SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162;(iii)分別為SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164;(b)包括下列一或多項取代之SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈CH1-CH2-CH3序列:(i)在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;(ii)在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸, (iii)在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;以及(iv)在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸;及/或包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸之SEQ ID NO:157的輕鏈C L序列。
在此等實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸。在某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:187。
在某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈 CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸和在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸。在某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:187。
在某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;而SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:172;(ii)分別為SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:180;或(iii)分別為SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:188。
在某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;而SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:172;(ii)分別為SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:180;或(iii)分別為SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:188。
在某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸和在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;以及在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;而SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。在某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:172;(ii)分別為SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:180;或(iii)分別為SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:188。
在此等實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在此等實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:187。
在某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈 CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:187。
在某些實例中,SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括:在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。在某些實例中,該重鏈和輕鏈序列:(i)分別為SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171;(ii)分別為SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179;或(iii)分別為SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187。
文中亦提供包括任何文中所述之抗體的醫藥組成物。文中亦提供治療一有此需要之對象的方法,該方法係包括投予該對象一治療上有效量的任何文中所述之抗體。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於包括相同量對照抗體(例如,文中所述之任何例示對照抗體)之組成物,包括該抗體(例如,任何文中所述之抗體)的組成物可提供增加(例如,可察覺的增加)(例如,至少增加1%,至少增加2%,至少增加5%,至少增加10%,至少增加15%,至少增加20%,至少增加25%,至少增加30%,至少增加35%,至少增加40%,至少增加45%,至少增加50%,至少增加55%,至少增加60%,至少增加65%,至少增加70%,至少增加75%,至少增加80%,至少增加85%,至少增加90%,至少增加95%,至少增加100%,至少增加120%,至少增加140%,至少增加160%,至少增加180%,至少增加200%,至少增加250%,至少增加300%,至少增加350%,至少增加400%,至少增加450%,至少增加500%,至少增加1,000%,至少增加2,000%,至少增加3,000%,至少增加4,000%,至少增加5,000%,至少增加6,000%,至少增加7,000%,至少增加8,000%,至少增加9,000%,或至少增加10,000%,或約增加1%至約增加10,000%,約增加1%至約增加9,000%,約增加1%至約增加8,000%,約增加1%至約增加7,000%,約增加1%至約增加6,000%,約增加1%至約增加5,000%,約增加1%至約增加4,000%,約增加1%至約增加3,000%,約增加 1%至約增加2,000%,約增加1%至約增加1,000%,約增加1%至約增加500%,約增加1%至約增加450%,約增加1%至約增加400%,約增加1%至約增加350%,約增加1%至約增加300%,約增加1%至約增加250%,約增加1%至約增加200%,約增加1%至約增加180%,約增加1%至約增加160%,約增加1%至約增加140%,約增加1%至約增加120%,約增加1%至約增加100%,約增加1%至約增加95%,約增加1%至約增加90%,約增加1%至約增加85%,約增加1%至約增加80%,約增加1%至約增加75%,約增加1%至約增加70%,約增加1%至約增加65%,約增加1%至約增加60%,約增加1%至約增加55%,約增加1%至約增加50%,約增加1%至約增加45%,約增加1%至約增加40%,約增加1%至約增加35%,約增加1%至約增加25%,約增加1%至約增加20%,約增加1%至約增加15%,約增加1%至約增加10%,約增加1%至約增加5%,約增加2%至約增加10,000%,約增加2%至約增加9,000%,約增加2%至約增加8,000%,約增加2%至約增加7,000%,約增加2%至約增加6,000%,約增加2%至約增加5,000%,約增加2%至約增加4,000%,約增加2%至約增加3,000%,約增加 2%至約增加2,000%,約增加2%至約增加1,000%,約增加2%至約增加500%,約增加2%至約增加450%,約增加2%至約增加400%,約增加2%至約增加350%,約增加2%至約增加300%,約增加2%至約增加250%,約增加2%至約增加200%,約增加2%至約增加180%,約增加2%至約增加160%,約增加2%至約增加140%,約增加2%至約增加120%,約增加2%至約增加100%,約增加2%至約增加95%,約增加2%至約增加90%,約增加2%至約增加85%,約增加2%至約增加80%,約增加2%至約增加75%,約增加2%至約增加70%,約增加2%至約增加65%,約增加2%至約增加60%,約增加2%至約增加55%,約增加2%至約增加50%,約增加2%至約增加45%,約增加2%至約增加40%,約增加2%至約增加35%,約增加2%至約增加25%,約增加2%至約增加20%,約增加2%至約增加15%,約增加2%至約增加10%,約增加2%至約增加5%,約增加5%至約增加10,000%,約增加5%至約增加9,000%,約增加5%至約增加8,000%,約增加5%至約增加7,000%,約增加5%至約增加6,000%,約增加5%至約增加5,000%,約增加5%至約增加4,000%,約增加5%至約增加3,000%,約增加 5%至約增加2,000%,約增加5%至約增加1,000%,約增加5%至約增加500%,約增加5%至約增加450%,約增加5%至約增加400%,約增加5%至約增加350%,約增加5%至約增加300%,約增加5%至約增加250%,約增加5%至約增加200%,約增加5%至約增加180%,約增加5%至約增加160%,約增加5%至約增加140%,約增加5%至約增加120%,約增加5%至約增加100%,約增加5%至約增加95%,約增加5%至約增加90%,約增加5%至約增加85%,約增加5%至約增加80%,約增加5%至約增加75%,約增加5%至約增加70%,約增加5%至約增加65%,約增加5%至約增加60%,約增加5%至約增加55%,約增加5%至約增加50%,約增加5%至約增加45%,約增加5%至約增加40%,約增加5%至約增加35%,約增加5%至約增加25%,約增加5%至約增加20%,約增加5%至約增加15%,約增加5%至約增加10%,約增加10%至約增加10,000%,約增加10%至約增加9,000%,約增加10%至約增加8,000%,約增加10%至約增加7,000%,約增加10%至約增加6,000%,約增加10%至約增加5,000%,約增加10%至約增加4,000%,約增加10%至約增加3,000%,約增加 10%至約增加2,000%,約增加10%至約增加1,000%,約增加10%至約增加500%,約增加10%至約增加450%,約增加10%至約增加400%,約增加10%至約增加350%,約增加10%至約增加300%,約增加10%至約增加250%,約增加10%至約增加200%,約增加10%至約增加180%,約增加10%至約增加160%,約增加10%至約增加140%,約增加10%至約增加120%,約增加10%至約增加100%,約增加10%至約增加95%,約增加10%至約增加90%,約增加10%至約增加85%,約增加10%至約增加80%,約增加10%至約增加75%,約增加10%至約增加70%,約增加10%至約增加65%,約增加10%至約增加60%,約增加10%至約增加55%,約增加10%至約增加50%,約增加10%至約增加45%,約增加10%至約增加40%,約增加10%至約增加35%,約增加10%至約增加30%,約增加10%至約增加25%,約增加10%至約增加20%,約增加10%至約增加15%,約增加15%至約增加10,000%,約增加15%至約增加9,000%,約增加15%至約增加8,000%,約增加15%至約增加7,000%,約增加15%至約增加6,000%,約增加15%至約增加5,000%,約增加15%至約增加4,000%,約增加15%至約增加3,000%,約增加 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加65%至約增加9,000%,約增加65%至約增加8,000%,約增加65%至約增加7,000%,約增加65%至約增加6,000%,約增加65%至約增加5,000%,約增加65%至約增加4,000%,約增加65%至約增加3,000%,約增加65%至約增加2,000%,約增加65%至約增加1,000%,約增加65%至約增加500%,約增加65%至約增加450%,約增加65%至約增加400%,約增加65%至約增加350%,約增加65%至約增加300%,約增加65%至約增加250%,約增加65%至約增加200%,約增加65%至約增加180%,約增加65%至約增加160%,約增加65%至約增加140%,約增加65%至約增加120%,約增加65%至約增加100%,約增加65%至約增加95%,約增加65%至約增加90%,約增加65%至約增加85%,約增加65%至約增加80%,約增加65%至約增加75%,約增加65%至約增加70%,約增加70%至約增加10,000%,約增加70%至約增加9,000%,約增加70%至約增加8,000%,約增加70%至約增加7,000%,約增加70%至約增加6,000%,約增加70%至約增加5,000%,約增加70%至約增加4,000%,約增加70%至約增加3,000%,約增加70%至約增加2,000%,約增加70%至約增加1,000%,約增加70%至約增加500%,約增加70%至約增加450%,約增加70%至約增加400%,約增加70%至約增加350%,約增加70%至約增加300%,約增加70%至約增加250%,約增加70%至約增加200%,約增加70%至約增加180%,約增加70%至約增加160%,約增加70%至約增加140%,約增加70%至約增加120%,約增加70%至約增加100%,約增加70%至約增加95%,約增加70%至約增加90%,約增加70%至約增加85%,約增加70%至約增加80%,約增加70%至約增加75%,約增加75%至約增加10,000%,約增加75%至約增加9,000%,約增加75%至約增加8,000%,約增加75%至約增加7,000%,約增加75%至約增加6,000%,約增加75%至約增加5,000%,約增加75%至約增加4,000%,約增加75%至約增加3,000%,約增加75%至約增加2,000%,約增加75%至約增加1,000%,約增加75%至約增加500%,約增加75%至約增加450%,約增加75%至約增加400%,約增加75%至約增加350%,約增加75%至約增加300%,約增加75%至約增加250%,約增加75%至約增加200%,約增加75%至約增加180%,約增加75%至約增加160%,約增加75%至約增加140%,約增加75%至約增加120%,約增加75%至約增加100%,約增加75%至約增加95%,約增加75%至約增加90%,約增加75%至約增加85%,約增加75%至約增加80%,約增加80%至約增加10,000%,約增加80%至約增加9,000%,約增加80%至約增加8,000%,約增加80%至約增加7,000%,約增加80%至約增加6,000%,約增加80%至約增加5,000%,約增加80%至約增加4,000%,約增加80%至約增加3,000%,約增加80%至約增加2,000%,約增加80%至約增加1,000%,約增加80%至約增加500%,約增加80%至約增加450%,約增加80%至約增加400%,約增加80%至約增加350%,約增加80%至約增加300%,約增加80%至約增加250%,約增加80%至約增加200%,約增加80%至約增加180%,約增加80%至約增加160%,約增加80%至約增加140%,約增加80%至約增加120%,約增加80%至約增加100%,約增加80%至約增加95%,約增加80%至約增加90%,約增加80%至約增加85%,約增加85%至約增加10,000%,約增加85%至約增加9,000%,約增加85%至約增加8,000%,約增加85%至約增加7,000%,約增加85%至約增加6,000%,約增加85%至約增加5,000%,約增加85%至約增加4,000%,約增加85%至約增加3,000%,約增加85%至約增加2,000%,約增加85%至約增加1,000%,約增加85%至約增加500%,約增加85%至約增加450%,約增加85%至約增加400%,約增加85%至約增加350%,約增加85%至約增加300%,約增加85%至約增加250%,約增加85%至約增加200%,約增加85%至約增加180%,約增加85%至約增加160%,約增加85%至約增加140%,約增加85%至約增加120%,約增加85%至約增加100%,約增加85%至約增加95%,約增加85%至約增加90%,約增加90%至約增加10,000%,約增加90%至約增加9,000%,約增加90%至約增加8,000%,約增加90%至約增加7,000%,約增加90%至約增加6,000%,約增加90%至約增加5,000%,約增加90%至約增加4,000%,約增加90%至約增加3,000%,約增加90%至約增加2,000%,約增加90%至約增加1,000%,約增加90%至約增加500%,約增加90%至約增加450%,約增加90%至約增加400%,約增加90%至約增加350%,約增加90%至約增加300%,約增加90%至約增加250%,約增加90%至約增加200%,約增加90%至約增加180%,約增加90%至約增加160%,約增加90%至約增加140%,約增加90%至約增加120%,約增加90%至約增加100%,約增加90%至約增加95%,約增加95%至約增加10,000%,約增加95%至約增加9,000%,約增加95%至約增加8,000%,約增加95%至約增加7,000%,約增加95%至約增加6,000%,約增加95%至約增加5,000%,約增加95%至約增加4,000%,約增加95%至約增加3,000%,約增加95%至約增加2,000%,約增加95%至約增加1,000%,約增加95%至約增加500%,約增加95%至約增加450%,約增加95%至約增加400%,約增加95%至約增加350%,約增加95%至約增加300%,約增加95%至約增加250%,約增加95%至約增加200%,約增加95%至約增加180%,約增加95%至約增加160%,約增加95%至約增加140%,約增加95%至約增加120%,約增加95%至約增加100%,約增加100%至約增加10,000%,約增加100%至約增加9,000%,約增加100%至約增加8,000%,約增加100%至約增加7,000%,約增加100%至約增加6,000%,約增加100%至約增加5,000%,約增加100%至約增加4,000%,約增加100%至約增加3,000%,約增加100%至約增加2,000%,約增加100%至約增加1,000%,約增加100%至約增加500%,約增加100%至約增加450%,約增加100%至約增加400%,約增加100%至約增加350%,約增加100%至約增加300%,約增加100%至約增加250%,約增加100%至約增加200%,約增加100%至約增加180%,約增加100%至約增加160%,約增加100%至約增加140%,約增加100%至約增加120%,約增加120%至約增加10,000%,約增加120%至約增加9,000%,約增加120%至約增加8,000%,約增加120%至約增加7,000%,約增加120%至約增加6,000%,約增加120%至約增加5,000%,約增加120%至約增加4,000%,約增加120%至約增加3,000%,約增加120%至約增加2,000%,約增加120%至約增加1,000%,約增加120%至約增加500%,約增加120%至約增加450%,約增加120%至約增加400%,約增加120%至約增加350%,約增加120%至約增加300%,約增加120%至約增加250%,約增加120%至約增加200%,約增加120%至約增加180%,約增加120%至約增加160%,約增加120%至約增加140%,約增加140%至約增加10,000%,約增加140%至約增加9,000%,約增加140%至約增加8,000%,約增加140%至約增加7,000%,約增加140%至約增加6,000%,約增加140%至約增加5,000%,約增加140%至約增加4,000%,約增加140%至約增加3,000%,約增加140%至約增加2,000%,約增加140%至約增加1,000%,約增加140%至約增加500%,約增加140%至約增加450%,約增加140%至約增加400%,約增加140%至約增加350%,約增加140%至約增加300%,約增加140%至約增加250%,約增加140%至約增加200%,約增加140%至約增加180%,約增加140%至約增加160%,約增加160%至約增加10,000%,約增加160%至約增加9,000%,約增加160%至約增加8,000%,約增加160%至約增加7,000%,約增加160%至約增加6,000%,約增加160%至約增加5,000%,約增加160%至約增加4,000%,約增加160%至約增加3,000%,約增加160%至約增加2,000%,約增加160%至約增加1,000%,約增加160%至約增加500%,約增加160%至約增加450%,約增加160%至約增加400%,約增加160%至約增加350%,約增加160%至約增加300%,約增加160%至約增加250%,約增加160%至約增加200%,約增加160%至約增加180%,約增加180%至約增加10,000%,約增加180%至約增加9,000%,約增加180%至約增加8,000%,約增加180%至約增加7,000%,約增加180%至約增加6,000%,約增加180%至約增加5,000%,約增加180%至約增加4,000%,約增加180%至約增加3,000%,約增加180%至約增加2,000%,約增加180%至約增加1,000%,約增加180%至約增加500%,約增加180%至約增加450%,約增加180%至約增加400%,約增加180%至約增加350%,約增加180%至約增加300%,約增加180%至約增加250%,約增加180%至約增加200%,約增加200%至約增加10,000%,約增加200%至約增加9,000%,約增加200%至約增加8,000%,約增加200%至約增加7,000%,約增加200%至約增加6,000%,約增加200%至約增加5,000%,約增加200%至約增加4,000%,約增加200%至約增加3,000%,約增加200%至約增加2,000%,約增加200%至約增加1,000%,約增加200%至約增加500%,約增加200%至約增加450%,約增加200%至約增加400%,約增加200%至約增加350%,約增加200%至約增加300%,約增加200%至約增加250%,約增加250%至約增加10,000%,約增加250%至約增加9,000%,約增加250%至約增加8,000%,約增加250%至約增加7,000%,約增加250%至約增加6,000%,約增加250%至約增加5,000%,約增加250%至約增加4,000%,約增加250%至約增加3,000%,約增加250%至約增加2,000%,約增加250%至約增加1,000%,約增加250%至約增加500%,約增加250%至約增加450%,約增加250%至約增加400%,約增加250%至約增加350%,約增加250%至約增加300%,約增加300%至約增加10,000%,約增加300%至約增加9,000%,約增加300%至約增加8,000%,約增加300%至約增加7,000%,約增加300%至約增加6,000%,約增加300%至約增加5,000%,約增加300%至約增加4,000%,約增加300%至約增加3,000%,約增加300%至約增加2,000%,約增加300%至約增加1,000%,約增加300%至約增加500%,約增加300%至約增加450%,約增加300%至約增加400%,約增加300%至約增加350%,約增加350%至約增加10,000%,約增加350%至約增加9,000%,約增加350%至約增加8,000%,約增加350%至約增加7,000%,約增加350%至約增加6,000%,約增加350%至約增加5,000%,約增加350%至約增加4,000%,約增加350%至約增加3,000%,約增加350%至約增加2,000%,約增加350%至約增加1,000%,約增加350%至約增加500%,約增加350%至約增加450%,約增加350%至約增加400%,約增加400%至約增加10,000%,約增加400%至約增加9,000%,約增加400%至約增加8,000%,約增加400%至約增加7,000%,約增加400%至約增加6,000%,約增加400%至約增加5,000%,約增加400%至約增加4,000%,約增加400%至約增加3,000%,約增加400%至約增加2,000%,約增加400%至約增加1,000%,約增加400%至約增加500%,約增加400%至約增加450%,約增加450%至約增加10,000%,約增加450%至約增加9,000%,約增加450%至約增加8,000%,約增加450%至約增加7,000%,約增加450%至約增加6,000%,約增加450%至約增加5,000%,約增加450%至約增加4,000%,約增加450%至約增加3,000%,約增加450%至約增加2,000%,約增加450%至約增加1,000%,約增加450%至約增加500%,約增加500%至約增加10,000%,約增加500%至約增加9,000%,約增加500%至約增加8,000%,約增加500%至約增加7,000%,約增加500%至約增加6,000%,約增加500%至約增加5,000%,約增加500%至約增加4,000%,約增加500%至約增加3,000%,約增加500%至約增加2,000%,約增加500%至約增加1,000%,約增加1,000%至約增加10,000%,約增加1,000%至約增加9,000%,約增加1,000%至約增加8,000%,約增加1,000%至約增加7,000%,約增加1,000%至約增加6,000%,約增加1,000%至約增加5,000%,約增加1,000%至約增加4,000%,約增加1,000%至約增加3,000%,約增加1,000%至約增加2,000%,約增加2,000%至約增加10,000%,約增加2,000%至約增加9,000%,約增加2,000%至約增加8,000%,約增加2,000%至約增加7,000%,約增加2,000%至約增加6,000%,約增加2,000%至約增加5,000%,約增加2,000%至約增加4,000%,約增加2,000%至約增加3,000%,約增加3,000%至約增加10,000%,約增加3,000%至約增加9,000%,約增加3,000%至約增加8,000%,約增加3,000%至約增加7,000%,約增加3,000%至約增加6,000%,約增加3,000%至約增加5,000%,約增加3,000%至約增加4,000%,約增加4,000%至約增加10,000%,約增加4,000%至約增加9,000%,約增加4,000%至約增加8,000%,約增加4,000%至約增加7,000%,約增加4,000%至約增加6,000%,約增加4,000%至約增加5,000%,約增加5,000%至約增加10,000%,約增加5,000%至約增加9,000%,約增加5,000%至約增加8,000%,約增加5,000%至約增加7,000%,約增加5,000%至約增加6,000%,約增加6,000%至約增加10,000%,約增加6,000%至約增加9,000%,約增加6,000%至約增加8,000%,約增加6,000%至約增加7,000%,約增加7,000%至約增加10,000%,約增加7,000%至約增加9,000%,約增加7,000%至約增加8,000%,約增加8,000%至約增加10,000%,約增加8,000%至約增加9,000%,或約增加9,000%至約增加10,000%)標的哺乳動物細胞(例如,任何文中所述之標的哺乳動物細胞)中的毒素釋放。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於包括相同量對照抗體(例如,文中所述之任何例示對照抗體)之組成物,包括該抗體(例如,任何文中所述之抗體)的組成物可提供增加(例如,可察覺的增加)(例如,至少增加0.1-倍,至少增加0.2-倍,至少增加0.3-倍,至少增加0.4-倍,至少增加0.5-倍,至少增加0.6-倍,至少增加0.7-倍,至少增加0.8-倍,至少增加0.9-倍,至少增加1.0-倍,至少增加1.2-倍,至少增加1.4-倍,至少增加1.5-倍,至少增加1.6-倍,至少增加1.8-倍,至少增加2.0-倍,至少增加2.2-倍,至少增加2.4-倍,至少增加2.5-倍,至少增加2.6-倍,至少增加2.8-倍,至少增加3.0-倍,至少增加3.5-倍,至少增加4.0-倍,至少增加4.5-倍,至少增加5.0-倍,至少增加5.5-倍,至少增加6.0-倍,至少增加6.5-倍,至少增加7.0-倍,至少增加7.5-倍,至少增加8.0-倍,至少增加8.5-倍,至少增加9.0-倍,至少增加9.5-倍,至少增加10-倍,至少增加15-倍,至少增加20-倍,至少增加25-倍,至少增加30-倍,至少增加35-倍,至少增加40-倍,至少增加45-倍,至少增加50-倍,至少增加55-倍,至少增加60-倍,至少增加65-倍,至少增加70-倍,至少增加75-倍,至少增加80-倍,至少增加85-倍,至少增加90-倍,至少增加95-倍,或至少增加100-倍,或約增加0.1-倍至約增加100-倍,約增加0.1-倍至約增加90-倍,約增加0.1-倍至約增加80-倍,約增加0.1-倍至約增加70-倍,約增加0.1-倍至約增加60-倍,約增加0.1-倍至約增加50-倍,約增加0.1-倍至約增加40-倍,約增加0.1-倍至約增加30-倍,約增加0.1-倍至約增加20-倍,約增加0.1-倍至約增加10-倍,約增加0.1-倍至約增加9.5-倍,約增加0.1-倍至約增加9.0-倍,約增加0.1-倍至約增加8.5-倍,約增加0.1-倍至約增加8.0-倍,約增加0.1-倍至約增加7.5-倍,約增加0.1-倍至約增加7.0-倍,約增加0.1-倍至約增加6.5-倍,約增加0.1-倍至約增加6.0-倍,約增加0.1-倍至約增加5.5-倍,約增加0.1-倍至約增加5.0-倍,約增加0.1-倍至約增加4.5-倍,約增加0.1-倍至約增加4.0-倍,約增加0.1-倍至約增加3.5-倍,約增加0.1-倍至約增加3.0-倍,約增加0.1-倍 至約增加2.8-倍,約增加0.1-倍至約增加2.6-倍,約增加0.1-倍至約增加2.5-倍,約增加0.1-倍至約增加2.4-倍,約增加0.1-倍至約增加2.2-倍,約增加0.1-倍至約增加2.0-倍,約增加0.1-倍至約增加1.8-倍,約增加0.1-倍至約增加1.6-倍,約增加0.1-倍至約增加1.5-倍,約增加0.1-倍至約增加1.4-倍,約增加0.1-倍至約增加1.2-倍,約增加0.1-倍至約增加1.0-倍,約增加0.1-倍至約增加0.9-倍,約增加0.1-倍至約增加0.8-倍,約增加0.1-倍至約增加0.7-倍,約增加0.1-倍至約增加0.6-倍,約增加0.1-倍至約增加0.5-倍,約增加0.1-倍至約增加0.4-倍,約增加0.1-倍至約增加0.3-倍,約增加0.2-倍至約增加100-倍,約增加0.2-倍至約增加90-倍,約增加0.2-倍至約增加80-倍,約增加0.2-倍至約增加70-倍,約增加0.2-倍至約增加60-倍,約增加0.2-倍至約增加50-倍,約增加0.2-倍至約增加40-倍,約增加0.2-倍至約增加30-倍,約增加0.2-倍至約增加20-倍,約增加0.2-倍至約增加10-倍,約增加0.2-倍至約增加9.5-倍,約增加0.2-倍至約增加9.0-倍,約增加0.2-倍至約增加8.5-倍,約增加0.2-倍至約增加8.0-倍,約增加0.2-倍至約增加7.5-倍,約增加0.2-倍至約增加7.0-倍,約增加0.2-倍至約增加6.5-倍,約增加0.2-倍至約增加6.0-倍,約增加0.2-倍至約增加5.5-倍,約增加0.2-倍至約增加5.0-倍,約增加0.2-倍至約增加4.5-倍,約增加0.2-倍至約增加4.0-倍,約增加0.2-倍至約增加3.5-倍,約增加0.2-倍至約增加3.0-倍,約增加0.2-倍 至約增加2.8-倍,約增加0.2-倍至約增加2.6-倍,約增加0.2-倍至約增加2.5-倍,約增加0.2-倍至約增加2.4-倍,約增加0.2-倍至約增加2.2-倍,約增加0.2-倍至約增加2.0-倍,約增加0.2-倍至約增加1.8-倍,約增加0.2-倍至約增加1.6-倍,約增加0.2-倍至約增加1.5-倍,約增加0.2-倍至約增加1.4-倍,約增加0.2-倍至約增加1.2-倍,約增加0.2-倍至約增加1.0-倍,約增加0.2-倍至約增加0.9-倍,約增加0.2-倍至約增加0.8-倍,約增加0.2-倍至約增加0.7-倍,約增加0.2-倍至約增加0.6-倍,約增加0.2-倍至約增加0.5-倍,約增加0.2-倍至約增加0.4-倍,約增加0.3-倍至約增加100-倍,約增加0.3-倍至約增加90-倍,約增加0.3-倍至約增加80-倍,約增加0.3-倍至約增加70-倍,約增加0.3-倍至約增加60-倍,約增加0.3-倍至約增加50-倍,約增加0.3-倍至約增加40-倍,約增加0.3-倍至約增加30-倍,約增加0.3-倍至約增加20-倍,約增加0.3-倍至約增加10-倍,約增加0.3-倍至約增加9.5-倍,約增加0.3-倍至約增加9.0-倍,約增加0.3-倍至約增加8.5-倍,約增加0.3-倍至約增加8.0-倍,約增加0.3-倍至約增加7.5-倍,約增加0.3-倍至約增加7.0-倍,約增加0.3-倍至約增加6.5-倍,約增加0.3-倍至約增加6.0-倍,約增加0.3-倍至約增加5.5-倍,約增加0.3-倍至約增加5.0-倍,約增加0.3-倍至約增加4.5-倍,約增加0.3-倍至約增加4.0-倍,約增加0.3-倍至約增加3.5-倍,約增加0.3-倍至約增加3.0-倍,約增加0.3-倍 至約增加2.8-倍,約增加0.3-倍至約增加2.6-倍,約增加0.3-倍至約增加2.5-倍,約增加0.3-倍至約增加2.4-倍,約增加0.3-倍至約增加2.2-倍,約增加0.3-倍至約增加2.0-倍,約增加0.3-倍至約增加1.8-倍,約增加0.3-倍至約增加1.6-倍,約增加0.3-倍至約增加1.5-倍,約增加0.3-倍至約增加1.4-倍,約增加0.3-倍至約增加1.2-倍,約增加0.3-倍至約增加1.0-倍,約增加0.3-倍至約增加0.9-倍,約增加0.3-倍至約增加0.8-倍,約增加0.3-倍至約增加0.7-倍,約增加0.3-倍至約增加0.6-倍,約增加0.3-倍至約增加0.5-倍,約增加0.4-倍至約增加100-倍,約增加0.4-倍至約增加90-倍,約增加0.4-倍至約增加80-倍,約增加0.4-倍至約增加70-倍,約增加0.4-倍至約增加60-倍,約增加0.4-倍至約增加50-倍,約增加0.4-倍至約增加40-倍,約增加0.4-倍至約增加30-倍,約增加0.4-倍至約增加20-倍,約增加0.4-倍至約增加10-倍,約增加0.4-倍至約增加9.5-倍,約增加0.4-倍至約增加9.0-倍,約增加0.4-倍至約增加8.5-倍,約增加0.4-倍至約增加8.0-倍,約增加0.4-倍至約增加7.5-倍,約增加0.4-倍至約增加7.0-倍,約增加0.4-倍至約增加6.5-倍,約增加0.4-倍至約增加6.0-倍,約增加0.4-倍至約增加5.5-倍,約增加0.4-倍至約增加5.0-倍,約增加0.4-倍至約增加4.5-倍,約增加0.4-倍至約增加4.0-倍,約增加0.4-倍至約增加3.5-倍,約增加0.4-倍至約增加3.0-倍,約增加0.4-倍 至約增加2.8-倍,約增加0.4-倍至約增加2.6-倍,約增加0.4-倍至約增加2.5-倍,約增加0.4-倍至約增加2.4-倍,約增加0.4-倍至約增加2.2-倍,約增加0.4-倍至約增加2.0-倍,約增加0.4-倍至約增加1.8-倍,約增加0.4-倍至約增加1.6-倍,約增加0.4-倍至約增加1.5-倍,約增加0.4-倍至約增加1.4-倍,約增加0.4-倍至約增加1.2-倍,約增加0.4-倍至約增加1.0-倍,約增加0.4-倍至約增加0.9-倍,約增加0.4-倍至約增加0.8-倍,約增加0.4-倍至約增加0.7-倍,約增加0.4-倍至約增加0.6-倍,約增加0.5-倍至約增加100-倍,約增加0.5-倍至約增加90-倍,約增加0.5-倍至約增加80-倍,約增加0.5-倍至約增加70-倍,約增加0.5-倍至約增加60-倍,約增加0.5-倍至約增加50-倍,約增加0.5-倍至約增加40-倍,約增加0.5-倍至約增加30-倍,約增加0.5-倍至約增加20-倍,約增加0.5-倍至約增加10-倍,約增加0.5-倍至約增加9.5-倍,約增加0.5-倍至約增加9.0-倍,約增加0.5-倍至約增加8.5-倍,約增加0.5-倍至約增加8.0-倍,約增加0.5-倍至約增加7.5-倍,約增加0.5-倍至約增加7.0-倍,約增加0.5-倍至約增加6.5-倍,約增加0.5-倍至約增加6.0-倍,約增加0.5-倍至約增加5.5-倍,約增加0.5-倍至約增加5.0-倍,約增加0.5-倍至約增加4.5-倍,約增加0.5-倍至約增加4.0-倍,約增加0.5-倍至約增加3.5-倍,約增加0.5-倍至約增加3.0-倍,約增加0.5-倍 至約增加2.8-倍,約增加0.5-倍至約增加2.6-倍,約增加0.5-倍至約增加2.5-倍,約增加0.5-倍至約增加2.4-倍,約增加0.5-倍至約增加2.2-倍,約增加0.5-倍至約增加2.0-倍,約增加0.5-倍至約增加1.8-倍,約增加0.5-倍至約增加1.6-倍,約增加0.5-倍至約增加1.5-倍,約增加0.5-倍至約增加1.4-倍,約增加0.5-倍至約增加1.2-倍,約增加0.5-倍至約增加1.0-倍,約增加0.5-倍至約增加0.9-倍,約增加0.5-倍至約增加0.8-倍,約增加0.5-倍至約增加0.7-倍,約增加0.6-倍至約增加100-倍,約增加0.6-倍至約增加90-倍,約增加0.6-倍至約增加80-倍,約增加0.6-倍至約增加70-倍,約增加0.6-倍至約增加60-倍,約增加0.6-倍至約增加50-倍,約增加0.6-倍至約增加40-倍,約增加0.6-倍至約增加30-倍,約增加0.6-倍至約增加20-倍,約增加0.6-倍至約增加10-倍,約增加0.6-倍至約增加9.5-倍,約增加0.6-倍至約增加9.0-倍,約增加0.6-倍至約增加8.5-倍,約增加0.6-倍至約增加8.0-倍,約增加0.6-倍至約增加7.5-倍,約增加0.6-倍至約增加7.0-倍,約增加0.6-倍至約增加6.5-倍,約增加0.6-倍至約增加6.0-倍,約增加0.6-倍至約增加5.5-倍,約增加0.6-倍至約增加5.0-倍,約增加0.6-倍至約增加4.5-倍,約增加0.6-倍至約增加4.0-倍,約增加0.6-倍至約增加3.5-倍,約增加0.6-倍至約增加3.0-倍,約增加0.6-倍 至約增加2.8-倍,約增加0.6-倍至約增加2.6-倍,約增加0.6-倍至約增加2.5-倍,約增加0.6-倍至約增加2.4-倍,約增加0.6-倍至約增加2.2-倍,約增加0.6-倍至約增加2.0-倍,約增加0.6-倍至約增加1.8-倍,約增加0.6-倍至約增加1.6-倍,約增加0.6-倍至約增加1.5-倍,約增加0.6-倍至約增加1.4-倍,約增加0.6-倍至約增加1.2-倍,約增加0.6-倍至約增加1.0-倍,約增加0.6-倍至約增加0.9-倍,約增加0.6-倍至約增加0.8-倍,約增加0.7-倍至約增加100-倍,約增加0.7-倍至約增加90-倍,約增加0.7-倍至約增加80-倍,約增加0.7-倍至約增加70-倍,約增加0.7-倍至約增加60-倍,約增加0.7-倍至約增加50-倍,約增加0.7-倍至約增加40-倍,約增加0.7-倍至約增加30-倍,約增加0.7-倍至約增加20-倍,約增加0.7-倍至約增加10-倍,約增加0.7-倍至約增加9.5-倍,約增加0.7-倍至約增加9.0-倍,約增加0.7-倍至約增加8.5-倍,約增加0.7-倍至約增加8.0-倍,約增加0.7-倍至約增加7.5-倍,約增加0.7-倍至約增加7.0-倍,約增加0.7-倍至約增加6.5-倍,約增加0.7-倍至約增加6.0-倍,約增加0.7-倍至約增加5.5-倍,約增加0.7-倍至約增加5.0-倍,約增加0.7-倍至約增加4.5-倍,約增加0.7-倍至約增加4.0-倍,約增加0.7-倍至約增加3.5-倍,約增加0.7-倍至約增加3.0-倍,約增加0.7-倍 至約增加2.8-倍,約增加0.7-倍至約增加2.6-倍,約增加0.7-倍至約增加2.5-倍,約增加0.7-倍至約增加2.4-倍,約增加0.7-倍至約增加2.2-倍,約增加0.7-倍至約增加2.0-倍,約增加0.7-倍至約增加1.8-倍,約增加0.7-倍至約增加1.6-倍,約增加0.7-倍至約增加1.5-倍,約增加0.7-倍至約增加1.4-倍,約增加0.7-倍至約增加1.2-倍,約增加0.7-倍至約增加1.0-倍,約增加0.7-倍至約增加0.9-倍,約增加0.8-倍至約增加100-倍,約增加0.8-倍至約增加90-倍,約增加0.8-倍至約增加80-倍,約增加0.8-倍至約增加70-倍,約增加0.8-倍至約增加60-倍,約增加0.8-倍至約增加50-倍,約增加0.8-倍至約增加40-倍,約增加0.8-倍至約增加30-倍,約增加0.8-倍至約增加20-倍,約增加0.8-倍至約增加10-倍,約增加0.8-倍至約增加9.5-倍,約增加0.8-倍至約增加9.0-倍,約增加0.8-倍至約增加8.5-倍,約增加0.8-倍至約增加8.0-倍,約增加0.8-倍至約增加7.5-倍,約增加0.8-倍至約增加7.0-倍,約增加0.8-倍至約增加6.5-倍,約增加0.8-倍至約增加6.0-倍,約增加0.8-倍至約增加5.5-倍,約增加0.8-倍至約增加5.0-倍,約增加0.8-倍至約增加4.5-倍,約增加0.8-倍至約增加4.0-倍,約增加0.8-倍至約增加3.5-倍,約增加0.8-倍至約增加3.0-倍,約增加0.8-倍 至約增加2.8-倍,約增加0.8-倍至約增加2.6-倍,約增加0.8-倍至約增加2.5-倍,約增加0.8-倍至約增加2.4-倍,約增加0.8-倍至約增加2.2-倍,約增加0.8-倍至約增加2.0-倍,約增加0.8-倍至約增加1.8-倍,約增加0.8-倍至約增加1.6-倍,約增加0.8-倍至約增加1.5-倍,約增加0.8-倍至約增加1.4-倍,約增加0.8-倍至約增加1.2-倍,約增加0.8-倍至約增加1.0-倍,約增加1.0-倍至約增加100-倍,約增加1.0-倍至約增加90-倍,約增加1.0-倍至約增加80-倍,約增加1.0-倍至約增加70-倍,約增加1.0-倍至約增加60-倍,約增加1.0-倍至約增加50-倍,約增加1.0-倍至約增加40-倍,約增加1.0-倍至約增加30-倍,約增加1.0-倍至約增加20-倍,約增加1.0-倍至約增加10-倍,約增加1.0-倍至約增加9.5-倍,約增加1.0-倍至約增加9.0-倍,約增加1.0-倍至約增加8.5-倍,約增加1.0-倍至約增加8.0-倍,約增加1.0-倍至約增加7.5-倍,約增加1.0-倍至約增加7.0-倍,約增加1.0-倍至約增加6.5-倍,約增加1.0-倍至約增加6.0-倍,約增加1.0-倍至約增加5.5-倍,約增加1.0-倍至約增加5.0-倍,約增加1.0-倍至約增加4.5-倍,約增加1.0-倍至約增加4.0-倍,約增加1.0-倍至約增加3.5-倍,約增加1.0-倍至約增加3.0-倍,約增加1.0-倍 至約增加2.8-倍,約增加1.0-倍至約增加2.6-倍,約增加1.0-倍至約增加2.5-倍,約增加1.0-倍至約增加2.4-倍,約增加1.0-倍至約增加2.2-倍,約增加1.0-倍至約增加2.0-倍,約增加1.0-倍至約增加1.8-倍,約增加1.0-倍至約增加1.6-倍,約增加1.0-倍至約增加1.5-倍,約增加1.0-倍至約增加1.4-倍,約增加1.0-倍至約增加1.2-倍,約增加1.2-倍至約增加100-倍,約增加1.2-倍至約增加90-倍,約增加1.2-倍至約增加80-倍,約增加1.2-倍至約增加70-倍,約增加1.2-倍至約增加60-倍,約增加1.2-倍至約增加50-倍,約增加1.2-倍至約增加40-倍,約增加1.2-倍至約增加30-倍,約增加1.2-倍至約增加20-倍,約增加1.2-倍至約增加10-倍,約增加1.2-倍至約增加9.5-倍,約增加1.2-倍至約增加9.0-倍,約增加1.2-倍至約增加8.5-倍,約增加1.2-倍至約增加8.0-倍,約增加1.2-倍至約增加7.5-倍,約增加1.2-倍至約增加7.0-倍,約增加1.2-倍至約增加6.5-倍,約增加1.2-倍至約增加6.0-倍,約增加1.2-倍至約增加5.5-倍,約增加1.2-倍至約增加5.0-倍,約增加1.2-倍至約增加4.5-倍,約增加1.2-倍至約增加4.0-倍,約增加1.2-倍至約增加3.5-倍,約增加1.2-倍至約增加3.0-倍,約增加1.2-倍 至約增加2.8-倍,約增加1.2-倍至約增加2.6-倍,約增加1.2-倍至約增加2.5-倍,約增加1.2-倍至約增加2.4-倍,約增加1.2-倍至約增加2.2-倍,約增加1.2-倍至約增加2.0-倍,約增加1.2-倍至約增加1.8-倍,約增加1.2-倍至約增加1.6-倍,約增加1.2-倍至約增加1.5-倍,約增加1.2-倍至約增加1.4-倍,約增加1.4-倍至約增加100-倍,約增加1.4-倍至約增加90-倍,約增加1.4-倍至約增加80-倍,約增加1.4-倍至約增加70-倍,約增加1.4-倍至約增加60-倍,約增加1.4-倍至約增加50-倍,約增加1.4-倍至約增加40-倍,約增加1.4-倍至約增加30-倍,約增加1.4-倍至約增加20-倍,約增加1.4-倍至約增加10-倍,約增加1.4-倍至約增加9.5-倍,約增加1.4-倍至約增加9.0-倍,約增加1.4-倍至約增加8.5-倍,約增加1.4-倍至約增加8.0-倍,約增加1.4-倍至約增加7.5-倍,約增加1.4-倍至約增加7.0-倍,約增加1.4-倍至約增加6.5-倍,約增加1.4-倍至約增加6.0-倍,約增加1.4-倍至約增加5.5-倍,約增加1.4-倍至約增加5.0-倍,約增加1.4-倍至約增加4.5-倍,約增加1.4-倍至約增加4.0-倍,約增加1.4-倍至約增加3.5-倍,約增加1.4-倍至約增加3.0-倍,約增加1.4-倍 至約增加2.8-倍,約增加1.4-倍至約增加2.6-倍,約增加1.4-倍至約增加2.5-倍,約增加1.4-倍至約增加2.4-倍,約增加1.4-倍至約增加2.2-倍,約增加1.4-倍至約增加2.0-倍,約增加1.4-倍至約增加1.8-倍,約增加1.4-倍至約增加1.6-倍,約增加1.6-倍至約增加10-倍,約增加1.6-倍至約增加100-倍,約增加1.6-倍至約增加90-倍,約增加1.6-倍至約增加80-倍,約增加1.6-倍至約增加70-倍,約增加1.6-倍至約增加60-倍,約增加1.6-倍至約增加50-倍,約增加1.6-倍至約增加40-倍,約增加1.6-倍至約增加30-倍,約增加1.6-倍至約增加20-倍,約增加1.6-倍至約增加9.5-倍,約增加1.6-倍至約增加9.0-倍,約增加1.6-倍至約增加8.5-倍,約增加1.6-倍至約增加8.0-倍,約增加1.6-倍至約增加7.5-倍,約增加1.6-倍至約增加7.0-倍,約增加1.6-倍至約增加6.5-倍,約增加1.6-倍至約增加6.0-倍,約增加1.6-倍至約增加5.5-倍,約增加1.6-倍至約增加5.0-倍,約增加1.6-倍至約增加4.5-倍,約增加1.6-倍至約增加4.0-倍,約增加1.6-倍至約增加3.5-倍,約增加1.6-倍至約增加3.0-倍,約增加1.6-倍 至約增加2.8-倍,約增加1.6-倍至約增加2.6-倍,約增加1.6-倍至約增加2.5-倍,約增加1.6-倍至約增加2.4-倍,約增加1.6-倍至約增加2.2-倍,約增加1.6-倍至約增加2.0-倍,約增加1.6-倍至約增加1.8-倍,約增加1.8-倍至約增加100-倍,約增加1.8-倍至約增加90-倍,約增加1.8-倍至約增加80-倍,約增加1.8-倍至約增加70-倍,約增加1.8-倍至約增加60-倍,約增加1.8-倍至約增加50-倍,約增加1.8-倍至約增加40-倍,約增加1.8-倍至約增加30-倍,約增加1.8-倍至約增加20-倍,約增加1.8-倍至約增加10-倍,約增加1.8-倍至約增加9.5-倍,約增加1.8-倍至約增加9.0-倍,約增加1.8-倍至約增加8.5-倍,約增加1.8-倍至約增加8.0-倍,約增加1.8-倍至約增加7.5-倍,約增加1.8-倍至約增加7.0-倍,約增加1.8-倍至約增加6.5-倍,約增加1.8-倍至約增加6.0-倍,約增加1.8-倍至約增加5.5-倍,約增加1.8-倍至約增加5.0-倍,約增加1.8-倍至約增加4.5-倍,約增加1.8-倍至約增加4.0-倍,約增加1.8-倍至約增加3.5-倍,約增加1.8-倍至約增加3.0-倍,約增加1.8-倍 至約增加2.8-倍,約增加1.8-倍至約增加2.6-倍,約增加1.8-倍至約增加2.5-倍,約增加1.8-倍至約增加2.4-倍,約增加1.8-倍至約增加2.2-倍,約增加1.8-倍至約增加2.0-倍,約增加2.0-倍至約增加100-倍,約增加2.0-倍至約增加90-倍,約增加2.0-倍至約增加80-倍,約增加2.0-倍至約增加70-倍,約增加2.0-倍至約增加60-倍,約增加2.0-倍至約增加50-倍,約增加2.0-倍至約增加40-倍,約增加2.0-倍至約增加30-倍,約增加2.0-倍至約增加20-倍,約增加2.0-倍至約增加10-倍,約增加2.0-倍至約增加9.5-倍,約增加2.0-倍至約增加9.0-倍,約增加2.0-倍至約增加8.5-倍,約增加2.0-倍至約增加8.0-倍,約增加2.0-倍至約增加7.5-倍,約增加2.0-倍至約增加7.0-倍,約增加2.0-倍至約增加6.5-倍,約增加2.0-倍至約增加6.0-倍,約增加2.0-倍至約增加5.5-倍,約增加2.0-倍至約增加5.0-倍,約增加2.0-倍至約增加4.5-倍,約增加2.0-倍至約增加4.0-倍,約增加2.0-倍至約增加3.5-倍,約增加2.0-倍至約增加3.0-倍,約增加2.0-倍 至約增加2.8-倍,約增加2.0-倍至約增加2.6-倍,約增加2.0-倍至約增加2.5-倍,約增加2.0-倍至約增加2.4-倍,約增加2.0-倍至約增加2.2-倍,約增加2.2-倍至約增加100-倍,約增加2.2-倍至約增加90-倍,約增加2.2-倍至約增加80-倍,約增加2.2-倍至約增加70-倍,約增加2.2-倍至約增加60-倍,約增加2.2-倍至約增加50-倍,約增加2.2-倍至約增加40-倍,約增加2.2-倍至約增加30-倍,約增加2.2-倍至約增加20-倍,約增加2.2-倍至約增加10-倍,約增加2.2-倍至約增加9.5-倍,約增加2.2-倍至約增加9.0-倍,約增加2.2-倍至約增加8.5-倍,約增加2.2-倍至約增加8.0-倍,約增加2.2-倍至約增加7.5-倍,約增加2.2-倍至約增加7.0-倍,約增加2.2-倍至約增加6.5-倍,約增加2.2-倍至約增加6.0-倍,約增加2.2-倍至約增加5.5-倍,約增加2.2-倍至約增加5.0-倍,約增加2.2-倍至約增加4.5-倍,約增加2.2-倍至約增加4.0-倍,約增加2.2-倍至約增加3.5-倍,約增加2.2-倍至約增加3.0-倍,約增加2.2-倍 至約增加2.8-倍,約增加2.2-倍至約增加2.6-倍,約增加2.2-倍至約增加2.5-倍,約增加2.2-倍至約增加2.4-倍,約增加2.4-倍至約增加100-倍,約增加2.4-倍至約增加90-倍,約增加2.4-倍至約增加80-倍,約增加2.4-倍至約增加70-倍,約增加2.4-倍至約增加60-倍,約增加2.4-倍至約增加50-倍,約增加2.4-倍至約增加40-倍,約增加2.4-倍至約增加30-倍,約增加2.4-倍至約增加20-倍,約增加2.4-倍至約增加10-倍,約增加2.4-倍至約增加9.5-倍,約增加2.4-倍至約增加9.0-倍,約增加2.4-倍至約增加8.5-倍,約增加2.4-倍至約增加8.0-倍,約增加2.4-倍至約增加7.5-倍,約增加2.4-倍至約增加7.0-倍,約增加2.4-倍至約增加6.5-倍,約增加2.4-倍至約增加6.0-倍,約增加2.4-倍至約增加5.5-倍,約增加2.4-倍至約增加5.0-倍,約增加2.4-倍至約增加4.5-倍,約增加2.4-倍至約增加4.0-倍,約增加2.4-倍至約增加3.5-倍,約增加2.4-倍至約增加3.0-倍,約增加2.4-倍 至約增加2.8-倍,約增加2.4-倍至約增加2.6-倍,約增加2.6-倍至約增加100-倍,約增加2.6-倍至約增加90-倍,約增加2.6-倍至約增加80-倍,約增加2.6-倍至約增加70-倍,約增加2.6-倍至約增加60-倍,約增加2.6-倍至約增加50-倍,約增加2.6-倍至約增加40-倍,約增加2.6-倍至約增加30-倍,約增加2.6-倍至約增加20-倍,約增加2.6-倍至約增加10-倍,約增加2.6-倍至約增加9.5-倍,約增加2.6-倍至約增加9.0-倍,約增加2.6-倍至約增加8.5-倍,約增加2.6-倍至約增加8.0-倍,約增加2.6-倍至約增加7.5-倍,約增加2.6-倍至約增加7.0-倍,約增加2.6-倍至約增加6.5-倍,約增加2.6-倍至約增加6.0-倍,約增加2.6-倍至約增加5.5-倍,約增加2.6-倍至約增加5.0-倍,約增加2.6-倍至約增加4.5-倍,約增加2.6-倍至約增加4.0-倍,約增加2.6-倍至約增加3.5-倍,約增加2.6-倍至約增加3.0-倍,約增加2.6-倍至約增加2.8-倍,約增加2.8-倍至約增加100-倍,約增加2.8-倍至約增加90-倍,約增加2.8-倍至約增加80-倍,約增加2.8-倍至約增加70-倍,約增加2.8-倍至約增加60-倍,約增加2.8-倍至約增加50-倍,約增加2.8-倍至約增加40-倍,約增加2.8-倍至約增加30-倍,約增加2.8-倍至約增加20-倍,約增加2.8-倍至約增加10-倍,約增加2.8-倍至約增加9.5-倍,約增加2.8-倍至約增加9.0-倍,約增加2.8-倍至約增加8.5-倍,約增加2.8-倍至約增加8.0-倍,約增加2.8-倍至約增加7.5-倍,約增加2.8-倍至約增加7.0-倍,約增加2.8-倍至約增加6.5-倍,約增加2.8-倍至約增加6.0-倍,約增加2.8-倍至約增加5.5-倍,約增加2.8-倍至約增加5.0-倍,約增加2.8-倍至約增加4.5-倍,約增加2.8-倍至約增加4.0-倍,約增加2.8-倍至約增加3.5-倍,約增加2.8-倍至約增加3.0-倍,約增加3.0-倍至約增加100-倍,約增加3.0-倍至約增加90-倍,約增加3.0-倍至約增加80-倍,約增加3.0-倍至約增加70-倍,約增加3.0-倍至約增加60-倍,約增加3.0-倍至約增加50-倍,約增加3.0-倍至約增加40-倍,約增加3.0-倍至約增加30-倍,約增加3.0-倍至約增加20-倍,約增加3.0-倍至約增加10-倍,約增加3.0-倍至約增加9.5-倍,約增加3.0-倍至約增加9.0-倍,約增加3.0-倍至約增加8.5-倍,約增加3.0-倍至約增加8.0-倍,約增加3.0-倍至約增加7.5-倍,約增加3.0-倍至約增加7.0-倍,約增加3.0-倍至約增加6.5-倍,約增加3.0-倍至約增加6.0-倍,約增加3.0-倍至約增加5.5-倍,約增加3.0-倍至約增加5.0-倍,約增加3.0-倍至約增加4.5-倍,約增加3.0-倍至約增加4.0-倍,約增加3.0-倍至約增加3.5-倍,約增加3.5-倍至約增加100-倍,約增加3.5-倍至約增加90-倍,約增加3.5-倍至約增加80-倍,約增加3.5-倍至約增加70-倍,約增加3.5-倍至約增加60-倍,約增加3.5-倍至約增加50-倍,約增加3.5-倍至約增加40-倍,約增加3.5-倍至約增加30-倍,約增加3.5-倍至約增加20-倍,約增加3.5-倍至約增加10-倍,約增加3.5-倍至約增加9.5-倍,約增加3.5-倍至約增加9.0-倍,約增加3.5-倍至約增加8.5-倍,約增加3.5-倍至約增加8.0-倍,約增加3.5-倍至約增加7.5-倍,約增加3.5-倍至約增加7.0-倍,約增加3.5-倍至約增加6.5-倍,約增加3.5-倍至約增加6.0-倍,約增加3.5-倍至約增加5.5-倍,約增加3.5-倍至約增加5.0-倍,約增加3.5-倍至約增加4.5-倍,約增加3.5-倍至約增加4.0-倍,約增加4.0-倍至約增加100-倍,約增加4.0-倍至約增加90-倍,約增加4.0-倍至約增加80-倍,約增加4.0-倍至約增加70-倍,約增加4.0-倍至約增加60-倍,約增加4.0-倍至約增加50-倍,約增加4.0-倍至約增加40-倍,約增加4.0-倍至約增加30-倍,約增加4.0-倍至約增加20-倍,約增加4.0-倍至約增加10-倍,約增加4.0-倍至約增加9.5-倍,約增加4.0-倍至約增加9.0-倍,約增加4.0-倍至約增加8.5-倍,約增加4.0-倍至約增加8.0-倍,約增加4.0-倍至約增加7.5-倍,約增加4.0-倍至約增加7.0-倍,約增加4.0-倍至約增加6.5-倍,約增加4.0-倍至約增加6.0-倍,約增加4.0-倍至約增加5.5-倍,約增加4.0-倍至約增加5.0-倍,約增加4.0-倍至約增加4.5-倍,約增加4.5-倍至約增加100-倍,約增加4.5-倍至約增加90-倍,約增加4.5-倍至約增加80-倍,約增加4.5-倍至約增加70-倍,約增加4.5-倍至約增加60-倍,約增加4.5-倍至約增加50-倍,約增加4.5-倍至約增加40-倍,約增加4.5-倍至約增加30-倍,約增加4.5-倍至約增加20-倍,約增加4.5-倍至約增加10-倍,約增加4.5-倍至約增加9.5-倍,約增加4.5-倍至約增加9.0-倍,約增加4.5-倍至約增加8.5-倍,約增加4.5-倍至約增加8.0-倍,約增加4.5-倍至約增加7.5-倍,約增加4.5-倍至約增加7.0-倍,約增加4.5-倍至約增加6.5-倍,約增加4.5-倍至約增加6.0-倍,約增加4.5-倍至約增加5.5-倍,約增加4.5-倍至約增加5.0-倍,約增加5.0-倍至約增加100-倍,約增加5.0-倍至約增加90-倍,約增加5.0-倍至約增加80-倍,約增加5.0-倍至約增加70-倍,約增加5.0-倍至約增加60-倍,約增加5.0-倍至約增加50-倍,約增加5.0-倍至約增加40-倍,約增加5.0-倍至約增加30-倍,約增加5.0-倍至約增加20-倍,約增加5.0-倍至約增加10-倍,約增加5.0-倍至約增加9.5-倍,約增加5.0-倍至約增加9.0-倍,約增加5.0-倍至約增加8.5-倍,約增加5.0-倍至約增加8.0-倍,約增加5.0-倍至約增加7.5-倍,約增加5.0-倍至約增加7.0-倍,約增加5.0-倍至約增加6.5-倍,約增加5.0-倍至約增加6.0-倍,約增加5.0-倍至約增加5.5-倍,約增加5.5-倍至約增加100-倍,約增加5.5-倍至約增加90-倍,約增加5.5-倍至約增加80-倍,約增加5.5-倍至約增加70-倍,約增加5.5-倍至約增加60-倍,約增加5.5-倍至約增加50-倍,約增加5.5-倍至約增加40-倍,約增加5.5-倍至約增加30-倍,約增加5.5-倍至約增加20-倍,約增加5.5-倍至約增加10-倍,約增加5.5-倍至約增加9.5-倍,約增加5.5-倍至約增加9.0-倍,約增加5.5-倍至約增加8.5-倍,約增加5.5-倍至約增加8.0-倍,約增加5.5-倍至約增加7.5-倍,約增加5.5-倍至約增加7.0-倍,約增加5.5-倍至約增加6.5-倍,約增加5.5-倍至約增加6.0-倍,約增加6.0-倍至約增加100-倍,約增加6.0-倍至約增加90-倍,約增加6.0-倍至約增加80-倍,約增加6.0-倍至約增加70-倍,約增加6.0-倍至約增加60-倍,約增加6.0-倍至約增加50-倍,約增加6.0-倍至約增加40-倍,約增加6.0-倍至約增加30-倍,約增加6.0-倍至約增加20-倍,約增加6.0-倍至約增加10-倍,約增加6.0-倍至約增加9.5-倍,約增加6.0-倍至約增加9.0-倍,約增加6.0-倍至約增加8.5-倍,約增加6.0-倍至約增加8.0-倍,約增加6.0-倍至約增加7.5-倍,約增加6.0-倍至約增加7.0-倍,約增加6.0-倍至約增加6.5-倍,約增加6.5-倍至約增加100-倍,約增加6.5-倍至約增加90-倍,約增加6.5-倍至約增加80-倍,約增加6.5-倍至約增加70-倍,約增加6.5-倍至約增加60-倍,約增加6.5-倍至約增加50-倍,約增加6.5-倍至約增加40-倍,約增加6.5-倍至約增加30-倍,約增加6.5-倍至約增加20-倍,約增加6.5-倍至約增加10-倍,約增加6.5-倍至約增加9.5-倍,約增加6.5-倍至約增加9.0-倍,約增加6.5-倍至約增加8.5-倍,約增加6.5-倍至約增加8.0-倍,約增加6.5-倍至約增加7.5-倍,約增加6.5-倍至約增加7.0-倍,約增加7.0-倍至約增加100-倍,約增加7.0-倍至約增加90-倍,約增加7.0-倍至約增加80-倍,約增加7.0-倍至約增加70-倍,約增加7.0-倍至約增加60-倍,約增加7.0-倍至約增加50-倍,約增加7.0-倍至約增加40-倍,約增加7.0-倍至約增加30-倍,約增加7.0-倍至約增加20-倍,約增加7.0-倍至約增加10-倍,約增加7.0-倍至約增加9.5-倍,約增加7.0-倍至約增加9.0-倍,約增加7.0-倍至約增加8.5-倍,約增加7.0-倍至約增加8.0-倍,約增加7.0-倍至約增加7.5-倍,約增加7.5-倍至約增加100-倍,約增加7.5-倍至約增加90-倍,約增加7.5-倍至約增加80-倍,約增加7.5-倍至約增加70-倍,約增加7.5-倍至約增加60-倍,約增加7.5-倍至約增加50-倍,約增加7.5-倍至約增加40-倍,約增加7.5-倍至約增加30-倍,約增加7.5-倍至約增加20-倍,約增加7.5-倍至約增加10-倍,約增加7.5-倍至約增加9.5-倍,約增加7.5-倍至約增加9.0-倍,約增加7.5-倍至約增加8.5-倍,約增加7.5-倍至約增加8.0-倍,約增加8.0-倍至約增加100-倍,約增加8.0-倍至約增加90-倍,約增加8.0-倍至約增加80-倍,約增加8.0-倍至約增加70-倍,約增加8.0-倍至約增加60-倍,約增加8.0-倍至約增加50-倍,約增加8.0-倍至約增加40-倍,約增加8.0-倍至約增加30-倍,約增加8.0-倍至約增加20-倍,約增加8.0-倍至約增加10-倍,約增加8.0-倍至約增加9.5-倍,約增加8.0-倍至約增加9.0-倍,約增加8.0-倍至約增加8.5-倍,約增加8.5-倍至約增加100-倍,約增加8.5-倍至約增加90-倍,約增加8.5-倍至約增加80-倍,約增加8.5-倍至約增加70-倍,約增加8.5-倍至約增加60-倍,約增加8.5-倍至約增加50-倍,約增加8.5-倍至約增加40-倍,約增加8.5-倍至約增加30-倍,約增加8.5-倍至約增加20-倍,約增加8.5-倍至約增加10-倍,約增加8.5-倍至約增加9.5-倍,約增加8.5-倍至約增加9.0-倍,約增加9.0-倍至約增加100-倍,約增加9.0-倍至約增加90-倍,約增加9.0-倍至約增加80-倍,約增加9.0-倍至約增加70-倍,約增加9.0-倍至約增加60-倍,約增加9.0-倍至約增加50-倍,約增加9.0-倍至約增加40-倍,約增加9.0-倍至約增加30-倍,約增加9.0-倍至約增加20-倍,約增加9.0-倍至約增加10-倍,約增加9.0-倍至約增加9.5-倍,約增加9.5-倍至約增加100-倍,約增加9.5-倍至約增加90-倍,約增加9.5-倍至約增加80-倍,約增加9.5-倍至約增加70-倍,約增加9.5-倍至約增加60-倍,約增加9.5-倍至約增加50-倍,約增加9.5-倍至約增加40-倍,約增加9.5-倍至約增加30-倍,約增加9.5-倍至約增加20-倍,約增加9.5-倍至約增加10-倍,約增加10-倍至約增加100-倍,約增加10-倍至約增加90-倍,約增加10-倍至約增加80-倍,約增加10-倍至約增加70-倍,約增加10-倍至約增加60-倍,約增加10-倍至約增加50-倍,約增加10-倍至約增加40-倍,約增加10-倍至約增加30-倍,約增加10-倍至約增加20-倍,約增加20-倍至約增加100-倍,約增加20-倍至約增加90-倍,約增加20-倍至約增加80-倍,約增加20-倍至約增加70-倍,約增加20-倍至約增加60-倍,約增加20-倍至約增加50-倍,約增加20-倍至約增加40-倍,約增加20-倍至約增加30-倍,約增加30-倍至約增加100-倍,約增加30-倍至約增加90-倍,約增加30-倍至約增加80-倍,約增加30-倍至約增加70-倍,約增加30-倍至約增加60-倍,約增加30-倍至約增加50-倍,約增加30-倍至約增加40-倍,約增加40-倍至約增加100-倍,約增加40-倍至約增加90-倍,約增加40-倍至約增加80-倍,約增加40-倍至約增加70-倍,約增加40-倍至約增加60-倍,約增加40-倍至約增加50-倍,約增加50-倍至約增加100-倍,約增加50-倍至約增加90-倍,約增加50-倍至約增加80-倍,約增加50-倍至約增加70-倍,約增加50-倍至約增加60-倍,約增加60-倍至約增加100-倍,約增加60-倍至約增加90-倍,約增加60-倍至約增加80-倍,約增加60-倍至約增加70-倍,約增加70-倍至約增加100-倍,約增加70-倍至約增加90-倍,約增加70-倍至約增加80-倍,約增加80-倍至約增加100-倍,約增加80-倍至約增加90-倍,或約增加90-倍至約增加100-倍)標的哺乳動物細胞(例如,任何文中所述之標的哺乳動物細胞)中的毒素釋放。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於包括相同量對照抗體 (例如,文中所述之任何例示對照抗體)之組成物,包括該抗體的組成物(例如,任何文中所述之抗體)可提供增加(例如,可察覺的增加)(例如,至少增加1%,至少增加2%,至少增加5%,至少增加10%,至少增加15%,至少增加20%,至少增加25%,至少增加30%,至少增加35%,至少增加40%,至少增加45%,至少增加50%,至少增加55%,至少增加60%,至少增加65%,至少增加70%,至少增加75%,至少增加80%,至少增加85%,至少增加90%,至少增加95%,至少增加100%,至少增加120%,至少增加140%,至少增加160%,至少增加180%,至少增加200%,至少增加250%,至少增加300%,至少增加350%,至少增加400%,至少增加450%,至少增加500%,至少增加1,000%,至少增加2,000%,至少增加3,000%,至少增加4,000%,至少增加5,000%,至少增加6,000%,至少增加7,000%,至少增加8,000%,至少增加9,000%,或至少增加10,000%,或約增加1%至約增加10,000%(例如或此文中所述範圍之任何子範圍))標的哺乳動物細胞殺滅(例如,任何文中所述之例示標的哺乳動物細胞)。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於包括相同量對照抗體 (例如,文中所述之任何例示對照抗體)之組成物,包括該抗體的組成物(例如,任何文中所述之抗體)可提供增加(例如,可察覺的增加)(例如,至少增加0.1-倍,至少增加0.2-倍,至少增加0.3-倍,至少增加0.4-倍,至少增加0.5-倍,至少增加0.6-倍,至少增加0.7-倍,至少增加0.8-倍,至少增加0.9-倍,至少增加1.0-倍,至少增加1.2-倍,至少增加1.4-倍,至少增加1.5-倍,至少增加1.6-倍,至少增加1.8-倍,至少增加2.0-倍,至少增加2.2-倍,至少增加2.4-倍,至少增加2.5-倍,至少增加2.6-倍,至少增加2.8-倍,至少增加3.0-倍,至少增加3.5-倍,至少增加4.0-倍,至少增加4.5-倍,至少增加5.0-倍,至少增加5.5-倍,至少增加6.0-倍,至少增加6.5-倍,至少增加7.0-倍,至少增加7.5-倍,至少增加8.0-倍,至少增加8.5-倍,至少增加9.0-倍,至少增加9.5-倍,至少增加10-倍,至少增加15-倍,至少增加20-倍,至少增加25-倍,至少增加30-倍,至少增加35-倍,至少增加40-倍,至少增加40-倍,至少增加45-倍,至少增加50-倍,至少增加55-倍,至少增加60-倍,至少增加65-倍,至少增加70-倍,至少增加80-倍,至少增加85-倍,至少增加90-倍,至少增加95-倍,或至少增加100-倍,或約0.1-倍至約100-倍(或此文中所述範圍之任何子範圍)標的哺乳動物細胞殺滅(例如,任何文中所述之例示標的哺乳動物細胞)。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於包括相同量對照抗體(例如,文中所述之任何對照抗體)之組成物的IC 50(例如,在接觸相同的標的哺乳動物細胞後),包括任何文中所述之抗體的組成物(例如,在接觸在其表面上呈現MET之標的哺乳動物細胞後)造成IC 50(就標的哺乳動物細胞殺滅)下降(例如,至少下降1%,至少下降5%,至少下降10%,至少下降15%,至少下降20%,至少下降25%,至少下降30%,至少下降35%,至少下降40%,至少下降45%,至少下降50%,至少下降55%,至少下降60%,至少下降65%,至少下降70%,至少下降75%,至少下降80%,至少下降85%,至少下降90%,至少下降95%,或至少下降99%,約下降1%至約下降99%,或此文中所述範圍之任何子範圍)。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,例如,相較於對照抗體(例如,任何文中所述之例示對照抗體),包括任何文中所述抗體之組成物(例如,在接觸於其表面上呈現MET之標的哺乳動物細胞後)可提供增加(例如,至少增加0.1-倍,至少增加0.2-倍,至少增加0.4-倍,至少增加0.6-倍,至少增加0.8-倍,至少增加1-倍,至少增加2-倍,至少增加5-倍,至少增加10-倍,至少增加15-倍,至少增加20-倍,至少增加25-倍,至少增加30-倍,至少增加35-倍,至少增加40-倍,至少增加45-倍,至少增加50-倍,至少增加55-倍,至少增加60-倍,至少增加65-倍,至少增加70-倍,至少增加75-倍,至少增加80-倍,至少增加85-倍,至少增加90-倍,至少增加95-倍,或至少增加100-倍,或約增加0.1-倍至約增加500-倍(或此文中所述範圍之任何子範圍)在中性pH時(約7.0至約8.0之pH)在其表面呈現MET之標的哺乳動物細胞上的K D與在中性pH時在相同標的細胞上的IC 50之比率。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於包括相同量對照抗體(例如,任何文中所述之例示對照抗體)之組成物,包括該抗體的組成物(例如,任何文中所述之抗體)可提供增加(例如,可察覺的增加)(例如,至少增加1%,至少增加2%,至少增加5%,至少增加10%,至少增加15%,至少增加20%,至少增加25%,至少增加30%,至少增加35%,至少增加40%,至少增加45%,至少增加50%,至少增加55%,至少增加60%,至少增加65%,至少增加70%,至少增加75%,至少增加80%,至少增加85%,至少增加90%,至少增加95%,至少增加100%,至少增加120%,至少增加140%,至少增加160%,至少增加180%,至少增加200%,至少增加250%,至少增加300%,至少增加350%,至少增加400%,至少增加450%,至少增加500%,至少增加1,000%,至少增加2,000%,至少增加3,000%,至少增加4,000%,至少增加5,000%,至少增加6,000%,至少增加7,000%,至少增加8,000%,至少增加9,000%,或至少增加10,000%,或約1%至約10,000%(例如,或此文中所述範圍之任何子範圍))標的哺乳動物細胞(例如,任何文中所述之例示標的哺乳動物細胞)中的內溶酶體遞送。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於包括相同量對照抗體(例如,任何文中所述之例示對照抗體)之組成物,包括該抗體的組成物(例如,任何文中所述之抗體)可提供增加(例如,可察覺的增加) (例如,至少增加0.1-倍,至少增加0.2-倍,至少增加0.3-倍,至少增加0.4-倍,至少增加0.5-倍,至少增加0.6-倍,至少增加0.7-倍,至少增加0.8-倍,至少增加0.9-倍,至少增加1.0-倍,至少增加1.2-倍,至少增加1.4-倍,至少增加1.5-倍,至少增加1.6-倍,至少增加1.8-倍,至少增加2.0-倍,至少增加2.2-倍,至少增加2.4-倍,至少增加2.5-倍,至少增加2.6-倍,至少增加2.8-倍,至少增加3.0-倍,至少增加3.5-倍,至少增加4.0-倍,至少增加4.5-倍,至少增加5.0-倍,至少增加5.5-倍,至少增加6.0-倍,至少增加6.5-倍,至少增加7.0-倍,至少增加7.5-倍,至少增加8.0-倍,至少增加8.5-倍,至少增加9.0-倍,至少增加9.5-倍,至少增加10-倍,至少增加15-倍,至少增加20-倍,至少增加25-倍,至少增加30-倍,至少增加35-倍,至少增加40-倍,至少增加45-倍,至少增加50-倍,至少增加55-倍,至少增加60-倍,至少增加65-倍,至少增加70-倍,至少增加75-倍,至少增加80-倍,至少增加85-倍,至少增加90-倍,至少增加95-倍,或至少增加100-倍,或約0.1-倍至約100-倍(或此文中所述範圍之任何子範圍))標的哺乳動物細胞(例如,任何文中所述之例示標的哺乳動物細胞)中的內溶酶體遞送。
任何文中所述之抗體的實例中,相較於FcRn表現的對照細胞(例如,HUVEC–ThermoFisher #C0035C),該標的哺乳動物細胞不會表現FcRn受體,或表現較低(例如,可察覺較低)量(例如,至少下降1%,至少下降2%,至少下降5%,至少下降10%降低,至少下降15%,至少下降20%,至少下降25%,至少下降30%,至少下降35%,至少下降40%,至少下降45%,至少下降50%,至少下降55%,至少下降60%,至少下降65%,至少下降70%,至少下降75%,至少下降80%,至少下降85%,至少下降90%,至少下降95%,或至少下降99%量)的FcRn受體。在任何文中所述之抗體的某些實例中,標的哺乳動物細胞為癌細胞。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該抗體對標的哺乳動物細胞具有細胞毒性或細胞抑制性。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於包括相同量對照抗體(例如,任何文中所述之對照抗體)之組成物,包括任何文中所述抗體之組成物(例如,在投予一對象後)造成呈現在標的細胞表面上的MET之量較低的(例如,1%下降至約99%下降,或此文中所述範圍之任何子範圍)的下降。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該組成物不會造成呈現在標的哺乳動物細胞表面上的MET量可察覺的下降。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,該抗體係與非人類靈長類MET和人類MET交叉反應。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該抗體係與非人類靈長類MET、人類MET,及大鼠MET和小鼠MET其中之一或二者交叉反應。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該抗體係與非人類靈長類MET、人類MET、大鼠MET和小鼠MET交叉反應。在任何文中所述之抗體的某些實例中,該抗體係與小鼠MET和大鼠MET交叉反應。在任何文中所述之抗體的某些實例中,抗原結合區係與呈現在舊大陸猴(Old World Monkey)細胞表面上的MET之表位結合。
任何文中所述之抗體的某些實例可進一步包括一第二抗原結合區(例如,任何文中所述之例示抗原結合區)。
這些方法的非限定態樣係描述於下,並在無限制下可以任何組合來使用。這些方法之另外的態樣已為本項技術所知。 MET MET 之表位
MET原癌基因,受體酪胺酸激酶(MET)為本項技術中已知的腫瘤抗原,且為腫瘤學中治療抗體之標靶(Wang J et al (2017) ABBV-399, c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)。成熟的人類MET之序列可參見SEQ ID NO:1。編碼成熟的人類MET之cDNA序列可參見SEQ ID NO:2。MET之胞外區序列可參見SEQ ID NO:3。編碼MET之胞外區的cDNA序列可參見SEQ ID NO:4。 例示的抗體性質
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,在約4.0至約6.5之pH時的解離速率(例如,約4.0至約6.4,約4.0至約6.3,約4.0至約6.2,約4.0至約6.1,約4.0至約6.0,約4.0至約5.9,約4.0至約5.8,約4.0至約5.7,約4.0至約5.6,約4.0至約5.5,約4.0至約5.4,約4.0至約5.3,約4.0至約5.2,約4.0至約5.1,約4.0至約5.0,約4.0至約4.9,約4.0至約4.8,約4.0至約4.7,約4.0至約4.6,約4.0至約4.5,約4.0至約4.4,約4.0至約4.3,約4.0至約4.2,約4.0至約4.1,約4.1至約6.5,約4.1至約6.4,約4.1至約6.3,約4.1至約6.2,約4.1至約6.1,約4.1至約6.0,約4.1至約5.9,約4.1至約5.8,約4.1至約5.7,約4.1至約5.6,約4.1至約5.5,約4.1至約5.4,約4.1至約5.3,約4.1至約5.2,約4.1至約5.1,約4.1至約5.0,約4.1至約4.9,約4.1至約4.8,約4.1至約4.7,約4.1至約4.6,約4.1至約4.5,約4.1至約4.4,約4.1至約4.3,約4.1至約4.2,約4.2至約6.5,約4.2至約6.4,約4.2至約6.3,約4.2至約6.2,約4.2至約6.1,約4.2至約6.0,約4.2至約5.9,約4.2至約5.8,約4.2至約5.7,約4.2至約5.6,約4.2至約5.5,約4.2至約5.4,約4.2至約5.3,約4.2至約5.2,約4.2至約5.1,約4.2至約5.0,約4.2至約4.9,約4.2至約4.8,約4.2至約4.7,約4.2至約4.6,約4.2至約4.5,約4.2至約4.4,約4.2至約4.3,約4.3至約6.5,約4.3至約6.4,約4.3至約6.3,約4.3至約6.2,約4.3至約6.1,約4.3至約6.0,約4.3至約5.9,約4.3至約5.8,約4.3至約5.7,約4.3至約5.6,約4.3至約5.5,約4.3至約5.4,約4.3至約5.3,約4.3至約5.2,約4.3至約5.1,約4.3至約5.0,約4.3至約4.9,約4.3至約4.8,約4.3至約4.7,約4.3至約4.6,約4.3至約4.5,約4.3至約4.4,約4.4至約6.5,約4.4至約6.4,約4.4至約6.3,約4.4至約6.2,約4.4至約6.1,約4.4至約6.0,約4.4至約5.9,約4.4至約5.8,約4.4至約5.7,約4.4至約5.6,約4.4至約5.5,約4.4至約5.4,約4.4至約5.3,約4.4至約5.2,約4.4至約5.1,約4.4至約5.0,約4.4至約4.9,約4.4至約4.8,約4.4至約4.7,約4.4至約4.6,約4.4至約4.5,約4.5至約6.5,約4.5至約6.4,約4.5至約6.3,約4.5至約6.2,約4.5至約6.1,約4.5至約6.0,約4.5至約5.9,約4.5至約5.8,約4.5至約5.7,約4.5至約5.6,約4.5至約5.5,約4.5至約5.4,約4.5至約5.3,約4.5至約5.2,約4.5至約5.1,約4.5至約5.0,約4.5至約4.9,約4.5至約4.8,約4.5至約4.7,約4.5至約4.6,約4.6至約6.5,約4.6至約6.4,約4.6至約6.3,約4.6至約6.2,約4.6至約6.1,約4.6至約6.0,約4.6至約5.9,約4.6至約5.8,約4.6至約5.7,約4.6至約5.6,約4.6至約5.5,約4.6至約5.4,約4.6至約5.3,約4.6至約5.2,約4.6至約5.1,約4.6至約5.0,約4.6至約4.9,約4.6至約4.8,約4.6至約4.7,約4.7至約6.5,約4.7至約6.4,約4.7至約6.3,約4.7至約6.2,約4.7至約6.1,約4.7至約6.0,約4.7至約5.9,約4.7至約5.8,約4.7至約5.7,約4.7至約5.6,約4.7至約5.5,約4.7至約5.4,約4.7至約5.3,約4.7至約5.2,約4.7至約5.1,約4.7至約5.0,約4.7至約4.9,約4.7至約4.8,約4.8至約6.5,約4.8至約6.4,約4.8至約6.3,約4.8至約6.2,約4.8至約6.1,約4.8至約6.0,約4.8至約5.9,約4.8至約5.8,約4.8至約5.7,約4.8至約5.6,約4.8至約5.5,約4.8至約5.4,約4.8至約5.3,約4.8至約5.2,約4.8至約5.1,約4.8至約5.0,約4.8至約4.9,約4.9至約6.5,約4.9至約6.4,約4.9至約6.3,約4.9至約6.2,約4.9至約6.1,約4.9至約6.0,約4.9至約5.9,約4.9至約5.8,約4.9至約5.7,約4.9至約5.6,約4.9至約5.5,約4.9至約5.4,約4.9至約5.3,約4.9至約5.2,約4.9至約5.1,約4.9至約5.0,約5.0至約6.5,約5.0至約6.4,約5.0至約6.3,約5.0至約6.2,約5.0至約6.1,約5.0至約6.0,約5.0至約5.9,約5.0至約5.8,約5.0至約5.7,約5.0至約5.6,約5.0至約5.5,約5.0至約5.4,約5.0至約5.3,約5.0至約5.2,約5.0至約5.1,約5.1至約6.5,約5.1至約6.4,約5.1至約6.3,約5.1至約6.2,約5.1至約6.1,約5.1至約6.0,約5.1至約5.9,約5.1至約5.8,約5.1至約5.7,約5.1至約5.6,約5.1至約5.5,約5.1至約5.4,約5.1至約5.3,約5.1至約5.2,約5.2至約6.5,約5.2至約6.4,約5.2至約6.3,約5.2至約6.2,約5.2至約6.1,約5.2至約6.0,約5.2至約5.9,約5.2至約5.8,約5.2至約5.7,約5.2至約5.6,約5.2至約5.5,約5.2至約5.4,約5.2至約5.3,約5.3至約6.5,約5.3至約6.4,約5.3至約6.3,約5.3至約6.2,約5.3至約6.1,約5.3至約6.0,約5.3至約5.9,約5.3至約5.8,約5.3至約5.7,約5.3至約5.6,約5.3至約5.5,約5.3至約5.4,約5.4至約6.5,約5.4至約6.4,約5.4至約6.3,約5.4至約6.2,約5.4至約6.1,約5.4至約6.0,約5.4至約5.9,約5.4至約5.8,約5.4至約5.7,約5.4至約5.6,約5.4至約5.5,約5.5至約6.5,約5.5至約6.4,約5.5至約6.3,約5.5至約6.2,約5.5至約6.1,約5.5至約6.0,約5.5至約5.9,約5.5至約5.8,約5.5至約5.7,約5.5至約5.6,約5.6至約6.5,約5.6至約6.4,約5.6至約6.3,約5.6至約6.2,約5.6至約6.1,約5.6至約6.0,約5.6至約5.9,約5.6至約5.8,約5.6至約5.7,約5.7至約6.5,約5.7至約6.4,約5.7至約6.3,約5.7至約6.2,約5.7至約6.1,約5.7至約6.0,約5.7至約5.9,約5.7至約5.8,約5.8至約6.5,約5.8至約6.4,約5.8至約6.3,約5.8至約6.2,約5.8至約6.1,約5.8至約6.0,約5.8至約5.9,約5.9至約6.5,約5.9至約6.4,約5.9至約6.3,約5.9至約6.2,約5.9至約6.1,約5.9至約6.0,約6.0至約6.5,約6.0至約6.4,約6.0至約6.3,約6.0至約6.2,約6.0至約6.1,約6.1至約6.5,約6.1至約6.4,約6.1至約6.3,約6.1至約6.2,約6.2至約6.5,約6.2至約6.4,約6.2至約6.3,約6.3至約6.5,約6.3至約6.4,或約6.4至約6.5)比在約7.0至約8.0之pH時的解離速率(例如,約7.0至約7.9,約7.0至約7.8,約7.0至約7.7,約7.0至約7.6,約7.0至約7.5,約7.0至約7.4,約7.0至約7.3,約7.0至約7.2,約7.0至約7.1,約7.1至約8.0,約7.1至約7.9,約7.1至約7.8,約7.1至約7.7,約7.1至約7.6,約7.1至約7.5,約7.1至約7.4,約7.1至約7.3,約7.1至約7.2,約7.2至約8.0,約7.2至約7.9,約7.2至約7.8,約7.2至約7.7,約7.2至約7.6,約7.2至約7.5,約7.2至約7.4,約7.2至約7.3,約7.3至約8.0,約7.3至約7.9,約7.3至約7.8,約7.3至約7.7,約7.3至約7.6,約7.3至約7.5,約7.3至約7.4,約7.4至約8.0,約7.4至約7.9,約7.4至約7.8,約7.4至約7.7,約7.4至約7.6,約7.4至約7.5,約7.5至約8.0,約7.5至約7.9,約7.5至約7.8,約7.5至約7.7,約7.5至約7.6,約7.6至約8.0,約7.6至約7.9,約7.6至約7.8,約7.6至約7.7,約7.7至約8.0,約7.7至約7.9,約7.7至約7.8,約7.8至約8.0,約7.8至約7.9,或約7.9至約8.0)更快(例如,(例如,至少快5%,至少快10%,至少快15%,至少快20%,至少快25%,至少快30%,至少快35%,至少快40%,至少快45%,至少快50%,至少快55%,至少快60%,至少快65%,至少快70%,至少快75%,至少快80%,至少快85%,至少快90%,至少快95%,至少快100%,至少快120%,至少快140%,至少快160%,至少快180%,至少快200%,至少快220%,至少快240%,至少快260%,至少快280%,至少快300%,至少快320%,至少快340%,至少快360%,至少快380%,至少快400%,至少快420%,至少快440%,至少快460%,至少快480%,至少快500%,至少快1,000%,至少快2,000%,至少快3,000%,至少快4,000%,至少快5,000%,至少快6,000%,至少快7,000%,至少快8,000%,至少快9,000%,或至少快10,000%,或約快5%至約快10,000%,約快5%至約快9,000%,約快5%至約快8,000%,約快5%至約快7,000%,約快5%至約快6,000%,約快5%至約快5,000%,約快5%至約快4,000%,約快5%至約快3,000%,約快5%至約快2,000%,約快5%至約快1,000%,約快5%至約快500%,約快5%至約快480%,約快5%至約快460%,約快5%至約快440%,約快5%至約快420%,約快5%至約快400%,約快5%至約快380%,約快5%至約快360%,約快5%至約快340%,約快5%至約快320%,約快5%至約快300%,約快5%至約快280%,約快5%至約快260%,約快5%至約快240%,約快5%至約快220%,約快5%至約快200%,約快5%至約快180%,約快5%至約快160%,約快5%至約快140%,約快5%至約快120%,約快5%至約快100%,約快5%至約快95%,約快5%至約快90%,約快5%至約快85%,約快5%至約快80%,約快5%至約快75%,約快5%至約快70%,約快5%至約快65%,約快5%至約快60%,約快5%至約快55%,約快5%至約快50%,約快5%至約快45%,約快5%至約快40%,約快5%至約快35%,約快5%至約快30%,約快5%至約快25%,約快5%至約快20%,約快5%至約快15%,約快5%至約快10%,約快10%至約快10,000%,約快10%至約快9,000%,約快10%至約快8,000%,約快10%至約快7,000%,約快10%至約快6,000%,約快10%至約快5,000%,約快10%至約快4,000%,約快10%至約快3,000%,約快10%至約快2,000%,約快10%至約快1,00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,000%,約快440%至約快4,000%,約快440%至約快3,000%,約快440%至約快2,000%,約快440%至約快1,000%,約快440%至約快500%,約快440%至約快480%,約快440%至約快460%,約快460%至約快10,000%,約快460%至約快9,000%,約快460%至約快8,000%,約快460%至約快7,000%,約快460%至約快6,000%,約快460%至約快5,000%,約快460%至約快4,000%,約快460%至約快3,000%,約快460%至約快2,000%,約快460%至約快1,000%,約快460%至約快500%,約快460%至約快480%,約快480%至約快10,000%,約快480%至約快9,000%,約快480%至約快8,000%,約快480%至約快7,000%,約快480%至約快6,000%,約快480%至約快5,000%,約快480%至約快4,000%,約快480%至約快3,000%,約快480%至約快2,000%,約快480%至約快1,000%,約快480%至約快500%,約快500%至約快10,000%,約快500%至約快9,000%,約快500%至約快8,000%,約快500%至約快7,000%,約快500%至約快6,000%,約快500%至約快5,000%,約快500%至約快4,000%,約快500%至約快3,000%,約快500%至約快2,000%,約快500%至約快1,000%,約快1,000%至約快10,000%,約快1,000%至約快9,000%,約快1,000%至約快8,000%,約快1,000%至約快7,000%,約快1,000%至約快6,000%,約快1,000%至約快5,000%,約快1,000%至約快4,000%,約快1,000%至約快3,000%,約快1,000%至約快2,000%,約快2,000%至約快10,000%,約快2,000%至約快9,000%,約快2,000%至約快8,000%,約快2,000%至約快7,000%,約快2,000%至約快6,000%,約快2,000%至約快5,000%,約快2,000%至約快4,000%,約快2,000%至約快3,000%,約快3,000%至約快10,000%,約快3,000%至約快9,000%,約快3,000%至約快8,000%,約快3,000%至約快7,000%,約快3,000%至約快6,000%,約快3,000%至約快5,000%,約快3,000%至約快4,000%,約快4,000%至約快10,000%,約快4,000%至約快9,000%,約快4,000%至約快8,000%,約快4,000%至約快7,000%,約快4,000%至約快6,000%,約快4,000%至約快5,000%,約快5,000%至約快10,000%,約快5,000%至約快9,000%,約快5,000%至約快8,000%,約快5,000%至約快7,000%,約快5,000%至約快6,000%,約快6,000%至約快10,000%,約快6,000%至約快9,000%,約快6,000%至約快8,000%,約快6,000%至約快7,000%,約快7,000%至約快10,000%,約快7,000%至約快9,000%,約快7,000%至約快8,000%,約快8,000%至約快10,000%,約快8,000%至約快9,000%,或約9,000%至約快10,000%)。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,在約4.0至約6.5(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)之pH時的解離常數(K D)比在約7.0至約8.0(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)之pH時的K D更大(例如,可察覺的較大)(例如,至少大5%,至少大10%,至少大15%,至少大20%,至少大25%,至少大30%,至少大35%,至少大40%,至少大45%,至少大50%,至少大55%,至少大60%,至少大65%,至少大70%,至少大80%,至少大85%,至少大90%,至少大95%,至少大100%,至少大120%,至少大140%,至少大160%,至少大180%,至少大200%,至少大220%,至少大240%,至少大260%,至少大280%,至少大300%,至少大320%,至少大340%,至少大360%,至少大380%,至少大400%,至少大420%,至少大440%,至少大460%,至少大480%,至少大500%,至少大1,000%,至少大2,000%,至少大3,000%,至少大4,000%,至少大5,000%,至少大6,000%,至少大7,000%,至少大8,000%,至少大9,000%,或至少大10,000%,或約大5%至約大10,000%,約大5%至約大9,000%,約大5%至約大8,000%,約大5%至約大7,000%,約大5%至約大6,000%,約大5%至約大5,000%,約大5%至約大4,000%,約大5%至約大3,000%,約大5%至約大2,000%,約大5%至約大1,000%,約大5%至約大500%,約大5%至約大480%,約大5%至約大460%,約大5%至約大440%,約大5%至約大420%,約大5%至約大400%,約大5%至約大380%,約大5%至約大360%,約大5%至約大340%,約大5%至約大320%,約大5%至約大300%,約大5%至約大280%,約大5%至約大260%,約大5%至約大240%,約大5%至約大220%,約大5%至約大200%,約大5%至約大180%,約大5%至約大160%,約大5%至約大140%,約大5%至約大120%,約大5%至約大100%,約大5%至約大95%,約大5%至約大90%,約大5%至約大85%,約大5%至約大80%,約大5%至約大75%,約大5%至約大70%,約大5%至約大65%,約大5%至約大60%,約大5%至約大55%,約大5%至約大50%,約大5%至約大45%,約大5%至約大40%,約大5%至約大35%,約大5%至約大30%,約大5%至約大25%,約大5%至約大20%,約大5%至約大15%,約大5%至約大10%,約大10%至約大10,000%,約大10%至約大9,000%,約大10%至約大8,000%,約大10%至約大7,000%,約大10%至約大6,000%,約大10%至約大5,000%,約大10%至約大4,000%,約大10%至約大3,000%,約大10%至約大2,000%,約大10%至約大1,000%,約大10%至約大500%,約大10%至約大480%,約大10%至約大460%,約大10%至約大440%,約大10%至約大420%,約大10%至約大400%,約大10%至約大380%,約大10%至約大360%,約大10%至約大340%,約大10%至約大320%,約大10%至約大300%,約大10%至約大280%,約大10%至約大260%,約大10%至約大240%,約大10%至約大220%,約大10%至約大200%,約大10%至約大180%,約大10%至約大160%,約大10%至約大140%,約大10%至約大120%,約大10%至約大100%,約大10%至約大95%,約大10%至約大90%,約大10%至約大85%,約大10%至約大80%,約大10%至約大75%,約大10%至約大70%,約大10%至約大65%,約大10%至約大60%,約大10%至約大55%,約大10%至約大50%,約大10%至約大45%,約大10%至約大40%,約大10%至約大35%,約大10%至約大30%,約大10%至約大25%,約大10%至約大20%,約大10%至約大15%,約大15%至約大10,000%,約大15%至約大9,000%,約大15%至約大8,000%,約大15%至約大7,000%,約大15%至約大6,000%,約大15%至約大5,000%,約大15%至約大4,000%,約大15%至約大3,000%,約大15%至約大2,000%,約大15%至約大1,000%,約大15%至約大500%,約大15%至約大480%,約大15%至約大460%,約大15%至約大440%,約大15%至約大420%,約大15%至約大400%,約大15%至約大380%,約大15%至約大360%,約大15%至約大340%,約大15%至約大320%,約大15%至約大300%,約大15%至約大280%,約大15%至約大260%,約大15%至約大240%,約大15%至約大220%,約大15%至約大200%,約大15%至約大180%,約大15%至約大160%,約大15%至約大140%,約大15%至約大120%,約大15%至約大100%,約大15%至約大95%,約大15%至約大90%,約大15%至約大85%,約大15%至約大80%,約大15%至約大75%,約大15%至約大70%,約大15%至約大65%,約大15%至約大60%,約大15%至約大55%,約大15%至約大50%,約大15%至約大45%,約大15%至約大40%,約大15%至約大35%,約大15%至約大30%,約大15%至約大25%,約大15%至約大20%,約大20%至約大10,000%,約大20%至約大9,000%,約大20%至約大8,000%,約大20%至約大7,000%,約大20%至約大6,000%,約大20%至約大5,000%,約大20%至約大4,000%,約大20%至約大3,000%,約大20%至約大2,000%,約大20%至約大1,000%,約大20%至約大500%,約大20%至約大480%,約大20%至約大460%,約大20%至約大440%,約大20%至約大420%,約大20%至約大400%,約大20%至約大380%,約大20%至約大360%,約大20%至約大340%,約大20%至約大320%,約大20%至約大300%,約大20%至約大280%,約大20%至約大260%,約大20%至約大240%,約大20%至約大220%,約大20%至約大200%,約大20%至約大180%,約大20%至約大160%,約大20%至約大140%,約大20%至約大120%,約大20%至約大100%,約大20%至約大95%,約大20%至約大90%,約大20%至約大85%,約大20%至約大80%,約大20%至約大75%,約大20%至約大70%,約大20%至約大65%,約大20%至約大60%,約大20%至約大55%,約大20%至約大50%,約大20%至約大45%,約大20%至約大40%,約大20%至約大35%,約大20%至約大30%,約大20%至約大25%,約大25%至約大10,000%,約大25%至約大9,000%,約大25%至約大8,000%,約大25%至約大7,000%,約大25%至約大6,000%,約大25%至約大5,000%,約大25%至約大4,000%,約大25%至約大3,000%,約大25%至約大2,000%,約大25%至約大1,000%,約大25%至約大500%,約大25%至約大480%,約大25%至約大460%,約大25%至約大440%,約大25%至約大420%,約大25%至約大400%,約大25%至約大380%,約大25%至約大360%,約大25%至約大340%,約大25%至約大320%,約大25%至約大300%,約大25%至約大280%,約大25%至約大260%,約大25%至約大240%,約大25%至約大220%,約大25%至約大200%,約大25%至約大180%,約大25%至約大160%,約大25%至約大140%,約大25%至約大120%,約大25%至約大100%,約大25%至約大95%,約大25%至約大90%,約大25%至約大85%,約大25%至約大80%,約大25%至約大75%,約大25%至約大70%,約大25%至約大65%,約大25%至約大60%,約大25%至約大55%,約大25%至約大50%,約大25%至約大45%,約大25%至約大40%,約大25%至約大35%,約大25%至約大30%,約大30%至約大10,000%,約大30%至約大9,000%,約大30%至約大8,000%,約大30%至約大7,000%,約大30%至約大6,000%,約大30%至約大5,000%,約大30%至約大4,000%,約大30%至約大3,000%,約大30%至約大2,000%,約大30%至約大1,000%,約大30%至約大500%,約大30%至約大480%,約大30%至約大460%,約大30%至約大440%,約大30%至約大420%,約大30%至約大400%,約大30%至約大380%,約大30%至約大360%,約大30%至約大340%,約大30%至約大320%,約大30%至約大300%,約大30%至約大280%,約大30%至約大260%,約大30%至約大240%,約大30%至約大220%,約大30%至約大200%,約大30%至約大180%,約大30%至約大160%,約大30%至約大140%,約大30%至約大120%,約大30%至約大100%,約大30%至約大95%,約大30%至約大90%,約大30%至約大85%,約大30%至約大80%,約大30%至約大75%,約大30%至約大70%,約大30%至約大65%,約大30%至約大60%,約大30%至約大55%,約大30%至約大50%,約大30%至約大45%,約大30%至約大40%,約大30%至約大35%,約大35%至約大10,000%,約大35%至約大9,000%,約大35%至約大8,000%,約大35%至約大7,000%,約大35%至約大6,000%,約大35%至約大5,000%,約大35%至約大4,000%,約大35%至約大3,000%,約大35%至約大2,000%,約大35%至約大1,000%,約大35%至約大500%,約大35%至約大480%,約大35%至約大460%,約大35%至約大440%,約大35%至約大420%,約大35%至約大400%,約大35%至約大380%,約大35%至約大360%,約大35%至約大340%,約大35%至約大320%,約大35%至約大300%,約大35%至約大280%,約大35%至約大260%,約大35%至約大240%,約大35%至約大220%,約大35%至約大200%,約大35%至約大180%,約大35%至約大160%,約大35%至約大140%,約大35%至約大120%,約大35%至約大100%,約大35%至約大95%,約大35%至約大90%,約大35%至約大85%,約大35%至約大80%,約大35%至約大75%,約大35%至約大70%,約大35%至約大65%,約大35%至約大60%,約大35%至約大55%,約大35%至約大50%,約大35%至約大45%,約大35%至約大40%,約大40%至約大10,000%,約大40%至約大9,000%,約大40%至約大8,000%,約大40%至約大7,000%,約大40%至約大6,000%,約大40%至約大5,000%,約大40%至約大4,000%,約大40%至約大3,000%,約大40%至約大2,000%,約大40%至約大1,000%,約大40%至約大500%,約大40%至約大480%,約大40%至約大460%,約大40%至約大440%,約大40%至約大420%,約大40%至約大400%,約大40%至約大380%,約大40%至約大360%,約大40%至約大340%,約大40%至約大320%,約大40%至約大300%,約大40%至約大280%,約大40%至約大260%,約大40%至約大240%,約大40%至約大220%,約大40%至約大200%,約大40%至約大180%,約大40%至約大160%,約大40%至約大140%,約大40%至約大1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在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,在約4.0至約6.5(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)之pH時的解離速率比在約7.0至約8.0(例如,或此文中所述範圍之任何子範圍)之pH時的解離速率更快(例如,至少快0.2-倍,至少0.3-倍,至少0.4-倍,至少0.5-倍,至少0.6-倍,至少0.7-倍,至少0.8-倍,至少0.9-倍,至少1.0-倍,至少1.5-倍,至少2.0-倍,至少2.5-倍,至少3.0倍,至少3.5-倍,至少4.0-倍,至少4.5-倍,至少5.0-倍,至少5.5-倍,至少6.0-倍,至少6.5-倍,至少7.0-倍,至少7.5-倍,至少8.0-倍,至少8.5-倍,至少9.0-倍,至少9.5-倍,至少10.0-倍,至少10.5-倍,至少11.0-倍,至少11.5-倍,至少12.0-倍,至少12.5-倍,至少13.0-倍,至少13.5-倍,至少14.0-倍,至少14.5-倍,至少15.0-倍,至少15.5-倍,至少16.0-倍,至少16.5-倍,至少17.0-倍,至少17.5-倍,至少18.0-倍,至少18.5-倍,至少19.0-倍,至少19.5-倍,至少20-倍,至少25-倍,至少30-倍,至少35-倍,至少40-倍,至少45-倍,至少50-倍,至少55-倍,至少60-倍,至少65-倍,至少70-倍,至少75-倍,至少80-倍,至少85-倍,至少90-倍,至少95-倍,或至少快100-倍或約快0.2-倍至約快100-倍,約快0.2-倍至約快快90-倍,約快0.2-倍至約快80-倍,約快0.2-倍至約快70-倍,約快0.2-倍至約快60-倍,約快0.2-倍至約快50-倍,約快0.2-倍至約快40-倍,約快0.2-倍至約快30-倍,約快0.2-倍至約快20-倍,約快0.2-倍至約快15-倍,約快0.2-倍至約快10-倍,約快0.2-倍至約快5-倍,約快0.2-倍至約快2-倍,約快0.2-倍至約快1-倍,約快0.2-倍至約快0.5-倍,約快0.5-倍至約快100-倍,約快0.5-倍至約快90-倍,約快0.5-倍至約快80-倍,約快0.5-倍至約快70-倍,約快0.5-倍至約快60-倍,約快0.5-倍至約快50-倍,約快0.5-倍至約快40-倍,約快0.5-倍至約快30-倍,約快0.5-倍至約快20-倍,約快0.5-倍至約快15-倍,約快0.5-倍至約快10-倍,約快0.5-倍至約快5-倍,約快0.5-倍至約快2-倍,約快0.5-倍至約快1-倍,約快1-倍至約快100-倍,約快1-倍至約快90-倍,約快1-倍至約快80-倍,約快1-倍至約快70-倍,約快1-倍至約快60-倍,約快1-倍至約快50-倍,約快1-倍至約快40-倍,約快1-倍至約快30-倍,約快1-倍至約快20-倍,約快1-倍至約快15-倍,約快1-倍至約快10-倍,約快1-倍至約快5-倍,約快1-倍至約快2-倍,約快2-倍至約快100-倍,約快2-倍至約快90-倍,約快2-倍至約快80-倍,約快2-倍至約快70-倍,約快2-倍至約快60-倍,約快2-倍至約快50-倍,約快2-倍至約快40-倍,約快2-倍至約快30-倍,約快2-倍至約快20-倍,約快2-倍至約快15-倍,約快2-倍至約快10-倍,約快2-倍至約快5-倍,約快5-倍至約快100-倍,約快5-倍至約快90-倍,約快5-倍至約快80-倍,約快5-倍至約快70-倍,約快5-倍至約快60-倍,約快5-倍至約快50-倍,約快5-倍至約快40-倍,約快5-倍至約快30-倍,約快5-倍至約快20-倍,約快5-倍至約快15-倍,約快5-倍至約快10-倍,約快10-倍至約快100-倍,約快10-倍至約快90-倍,約快10-倍至約快80-倍,約快10-倍至約快70-倍,約快10-倍至約快60-倍,約快10-倍至約快50-倍,約快10-倍至約快40-倍,約快10-倍至約快30-倍,約快10-倍至約快20-倍,約快10-倍至約快15-倍,約快15-倍至約快100-倍,約快15-倍至約快90-倍,約快15-倍至約快80-倍,約快15-倍至約快70-倍,約快15-倍至約快60-倍,約快15-倍至約快50-倍,約快15-倍至約快40-倍,約快15-倍至約快30-倍,約快15-倍至約快20-倍,約快20-倍至約快100-倍,約快20-倍至約快90-倍,約快20-倍至約快80-倍,約快20-倍至約快70-倍,約快20-倍至約快60-倍,約快20-倍至約快50-倍,約快20-倍至約快40-倍,約快20-倍至約快30-倍,約快30-倍至約快100-倍,約快30-倍至約快90-倍,約快30-倍至約快80-倍,約快30-倍至約快70-倍,約快30-倍至約快60-倍,約快30-倍至約快50-倍,約快30-倍至約快40-倍,約快40-倍至約快100-倍,約快40-倍至約快90-倍,約快40-倍至約快80-倍,約快40-倍至約快70-倍,約快40-倍至約快60-倍,約快40-倍至約快50-倍,約快50-倍至約快100-倍,約快50-倍至約快90-倍,約快50-倍至約快80-倍,約快50-倍至約快70-倍,約快50-倍至約快60-倍,約快60-倍至約快100-倍,約快60-倍至約快90-倍,約快60-倍至約快80-倍,約快60-倍至約快70-倍,約快70-倍至約快100-倍,約快70-倍至約快90-倍,約快70-倍至約快80-倍,約快80-倍至約快100-倍,約快80-倍至約快90-倍,或約90-倍至約快100-倍)。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,在約4.0至約6.5(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)之pH時的解離常數(K D)比在約7.0至約8.0(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)之pH時的K D更大(例如,可察覺的較大)(例如,至少大0.2-倍,至少0.3-倍,至少0.4-倍,至少0.5-倍,至少0.6-倍,至少0.7-倍,至少0.8-倍,至少0.9-倍,至少1.0-倍,至少1.5-倍,至少2.0-倍,至少2.5-倍,至少3.0倍,至少3.5-倍,至少4.0-倍,至少4.5-倍,至少5.0-倍,至少5.5-倍,至少6.0-倍,至少6.5-倍,至少7.0-倍,至少7.5-倍,至少8.0-倍,至少8.5-倍,至少9.0-倍,至少9.5-倍,至少10.0-倍,至少10.5-倍,至少11.0-倍,至少11.5-倍,至少12.0-倍,至少12.5-倍,至少13.0-倍,至少13.5-倍,至少14.0-倍,至少14.5-倍,至少15.0-倍,至少15.5-倍,至少16.0-倍,至少16.5-倍,至少17.0-倍,至少17.5-倍,至少18.0-倍,至少18.5-倍,至少19.0-倍,至少19.5-倍,至少大20-倍,至少大25-倍,至少大30-倍,至少大35-倍,至少大40-倍,至少大45-倍,至少大50-倍,至少大55-倍,至少大60-倍,至少大65-倍,至少大70-倍,至少大75-倍,至少大80-倍,至少大85-倍,至少大90-倍,至少大95-倍,或至少大100-倍,或約大0.2-倍至約大100-倍,約大0.2-倍至約大90-倍,約大0.2-倍至約大80-倍,約大0.2-倍至約大70-倍,約大0.2-倍至約大60-倍,約大0.2-倍至約大50-倍,約大0.2-倍至約大40-倍,約大0.2-倍至約大30-倍,約大0.2-倍至約大25-倍,約大0.2-倍至約大20-倍,約大0.2-倍至約大15-倍,約大0.2-倍至約大10-倍,約大0.2-倍至約大8-倍,約大0.2-倍至約大5-倍,約大0.2-倍至約大2-倍,約大0.2-倍至約大1-倍,約大0.2-倍至約大0.5-倍,約大0.5-倍至約大100-倍,約大0.5-倍至約大90-倍,約大0.5-倍至約大80-倍,約大0.5-倍至約大70-倍,約大0.5-倍至約大60-倍,約大0.5-倍至約大50-倍,約大0.5-倍至約大40-倍,約大0.5-倍至約大30-倍,約大0.5-倍至約大25-倍,約大0.5-倍至約大20-倍,約大0.5-倍至約大15-倍,約大0.5-倍至約大10-倍,約大0.5-倍至約大8-倍,約大0.5-倍至約大5-倍,約大0.5-倍至約大2-倍,約大0.5-倍至約大1-倍,約大1-倍至約大100-倍,約大1-倍至約大90-倍,約大1-倍至約大80-倍,約大1-倍至約大70-倍,約大1-倍至約大60-倍,約大1-倍至約大50-倍,約大1-倍至約大40-倍,約大1-倍至約大30-倍,約大1-倍至約大25-倍,約大1-倍至約大20-倍,約大1-倍至約大15-倍,約大1-倍至約大10-倍,約大1-倍至約大8-倍,約大1-倍至約大5-倍,約大1-倍至約大2-倍,約大2-倍至約大100-倍,約大2-倍至約大90-倍,約大2-倍至約大80-倍,約大2-倍至約大70-倍,約大2-倍至約大60-倍,約大2-倍至約大50-倍,約大2-倍至約大40-倍,約大2-倍至約大30-倍,約大2-倍至約大25-倍,約大2-倍至約大20-倍,約大2-倍至約大15-倍,約大2-倍至約大10-倍,約大2-倍至約大8-倍,約大2-倍至約大5-倍,約大5-倍至約大100-倍,約大5-倍至約大90-倍,約大5-倍至約大80-倍,約大5-倍至約大70-倍,約大5-倍至約大60-倍,約大5-倍至約大50-倍,約大5-倍至約大40-倍,約大5-倍至約大30-倍,約大5-倍至約大25-倍,約大5-倍至約大20-倍,約大5-倍至約大15-倍,約大5-倍至約大10-倍,約大5-倍至約大8-倍,約大8-倍至約大100-倍,約大8-倍至約大90-倍,約大8-倍至約大80-倍,約大8-倍至約大70-倍,約大8-倍至約大60-倍,約大8-倍至約大50-倍,約大8-倍至約大40-倍,約大8-倍至約大30-倍,約大8-倍至約大25-倍,約大8-倍至約大20-倍,約大8-倍至約大15-倍,約大8-倍至約大10-倍,約大10-倍至約大100-倍,約大10-倍至約大90-倍,約大10-倍至約大80-倍,約大10-倍至約大70-倍,約大10-倍至約大60-倍,約大10-倍至約大50-倍,約大10-倍至約大40-倍,約大10-倍至約大30-倍,約大10-倍至約大25-倍,約大10-倍至約大20-倍,約大10-倍至約大15-倍,約大15-倍至約大100-倍,約大15-倍至約大90-倍,約大15-倍至約大80-倍,約大15-倍至約大70-倍,約大15-倍至約大60-倍,約大15-倍至約大50-倍,約大15-倍至約大40-倍,約大15-倍至約大30-倍,約大15-倍至約大25-倍,約大15-倍至約大20-倍,約大20-倍至約大100-倍,約大20-倍至約大90-倍,約大20-倍至約大80-倍,約大20-倍至約大70-倍,約大20-倍至約大60-倍,約大20-倍至約大50-倍,約大20-倍至約大40-倍,約大20-倍至約大30-倍,約大20-倍至約大25-倍,約大25-倍至約大100-倍,約大25-倍至約大90-倍,約大25-倍至約大80-倍,約大25-倍至約大70-倍,約大25-倍至約大60-倍,約大25-倍至約大50-倍,約大25-倍至約大40-倍,約大25-倍至約大30-倍,約大30-倍至約大100-倍,約大30-倍至約大90-倍,約大30-倍至約大80-倍,約大30-倍至約大70-倍,約大30-倍至約大60-倍,約大30-倍至約大50-倍,約大30-倍至約大40-倍,約大40-倍至約大100-倍,約大40-倍至約大90-倍,約大40-倍至約大80-倍,約大40-倍至約大70-倍,約大40-倍至約大60-倍,約大40-倍至約大50-倍,約大50-倍至約大100-倍,約大50-倍至約大90-倍,約大50-倍至約大80-倍,約大50-倍至約大70-倍,約大50-倍至約大60-倍,約大60-倍至約大100-倍,約大60-倍至約大90-倍,約大60-倍至約大80-倍,約大60-倍至約大70-倍,約大70-倍至約大100-倍,約大70-倍至約大90-倍,約大70-倍至約大80-倍,約大80-倍至約大100-倍,約大80-倍至約大90-倍,或約大90-倍至約大100-倍)。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,在約7.0至約8.0(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)之pH時的K D係介於約1 pM至約5 TM (例如,約1 pM至約2 TM,約1 pM至約1 TM,約1 pM至約500 nM,約1 pM至約250 nM,約1 pM至約240 nM,約1 pM至約230 nM,約1 pM至約220 nM,約1 pM至約210 nM,約1 pM至約200 nM,約1 pM至約190 nM,約1 pM至約180 nM,約1 pM至約170 nM,約1 pM至約160 nM,約1 pM至約150 nM,約1 pM至約140 nM,約1 pM至約130 nM,約1 pM至約120 nM,約1 pM至約110 nM,約1 pM至約100 nM,約1 pM至約95 nM,約1 pM至約90 nM,約1 pM至約85 nM,約1 pM至約80 nM,約1 pM至約75 nM,約1 pM至約70 nM,約1 pM至約65 nM,約1 pM至約60 nM,約1 pM至約55 nM,約1 pM至約50 nM,約1 pM至約45 nM,約1 pM至約40 nM,約1 pM至約35 nM,約1 pM至約30 nM,約1 pM至約25 nM,約1 pM至約20 nM,約1 pM至約15 nM,約1 pM至約10 nM,約1 pM至約5 nM,約1 pM至約2 nM,約1 pM至約1 nM,約1 pM至約950 pM,約1 pM至約900 pM,約1 pM至約850 pM,約1 pM至約800 pM,約1 pM至約750 pM,約1 pM至約700 pM,約1 pM至約650 pM,約1 pM至約600 pM,約1 pM至約550 pM,約1 pM至約500 pM,約1 pM至約450 pM,約1 pM至約400 pM,約1 pM至約350 pM,約1 pM至約300 pM,約1 pM至約250 pM,約1 pM至約200 pM,約1 pM至約150 pM,約1 pM至約100 pM,約1 pM至約90 pM,約1 pM至約80 pM,約1 pM至約70 pM,約1 pM至約60 pM,約1 pM至約50 pM,約1 pM至約40 pM,約1 pM至約30 pM,約1 pM至約20 pM,約1 pM至約10 pM,約1 pM至約5 pM,約1 pM至約4 pM,約1 pM至約3 pM,約1 pM至約2 pM,約2 pM至約5 TM,約2 pM至約2 TM,約2 pM至約1 TM,約2 pM至約500 nM,約2 pM至約250 nM,約2 pM至約240 nM,約2 pM至約230 nM,約2 pM至約220 nM,約2 pM至約210 nM,約2 pM至約200 nM,約2 pM至約190 nM,約2 pM至約180 nM,約2 pM至約170 nM,約2 pM至約160 nM,約2 pM至約150 nM,約2 pM至約140 nM,約2 pM至約130 nM,約2 pM至約120 nM,約2 pM至約110 nM,約2 pM至約100 nM,約2 pM至約95 nM,約2 pM至約90 nM,約2 pM至約85 nM,約2 pM至約80 nM,約2 pM至約75 nM,約2 pM至約70 nM,約2 pM至約65 nM,約2 pM至約60 nM,約2 pM至約55 nM,約2 pM至約50 nM,約2 pM至約45 nM,約2 pM至約40 nM,約2 pM至約35 nM,約2 pM至約30 nM,約2 pM至約25 nM,約2 pM至約20 nM,約2 pM至約15 nM,約2 pM至約10 nM,約2 pM至約5 nM,約2 pM至約2 nM,約2 pM至約1 nM,約2 pM至約950 pM,約2 pM至約900 pM,約2 pM至約850 pM,約2 pM至約800 pM,約2 pM至約750 pM,約2 pM至約700 pM,約2 pM至約650 pM,約2 pM至約600 pM,約2 pM至約550 pM,約2 pM至約500 pM,約2 pM至約450 pM,約2 pM至約400 pM,約2 pM至約350 pM,約2 pM至約300 pM,約2 pM至約250 pM,約2 pM至約200 pM,約2 pM至約150 pM,約2 pM至約100 pM,約2 pM至約90 pM,約2 pM至約80 pM,約2 pM至約70 pM,約2 pM至約60 pM,約2 pM至約50 pM,約2 pM至約40 pM,約2 pM至約30 pM,約2 pM至約20 pM,約2 pM至約10 pM,約2 pM至約5 pM,約2 pM至約4 pM,約2 pM至約3 pM,約5 pM至約5 TM,約5 pM至約2 TM,約5 pM至約1 TM,約5 pM至約500 nM,約5 pM至約250 nM,約5 pM至約240 nM,約5 pM至約230 nM,約5 pM至約220 nM,約5 pM至約210 nM,約5 pM至約200 nM,約5 pM至約190 nM,約5 pM至約180 nM,約5 pM至約170 nM,約5 pM至約160 nM,約5 pM至約150 nM,約5 pM至約140 nM,約5 pM至約130 nM,約5 pM至約120 nM,約5 pM至約110 nM,約5 pM至約100 nM,約5 pM至約95 nM,約5 pM至約90 nM,約5 pM至約85 nM,約5 pM至約80 nM,約5 pM至約75 nM,約5 pM至約70 nM,約5 pM至約65 nM,約5 pM至約60 nM,約5 pM至約55 nM,約5 pM至約50 nM,約5 pM至約45 nM,約5 pM至約40 nM,約5 pM至約35 nM,約5 pM至約30 nM,約5 pM至約25 nM,約5 pM至約20 nM,約5 pM至約15 nM,約5 pM至約10 nM,約5 pM至約5 nM,約5 pM至約2 nM,約5 pM至約1 nM,約5 pM至約950 pM,約5 pM至約900 pM,約5 pM至約850 pM,約5 pM至約800 pM,約5 pM至約750 pM,約5 pM至約700 pM,約5 pM至約650 pM,約5 pM至約600 pM,約5 pM至約550 pM,約5 pM至約500 pM,約5 pM至約450 pM,約5 pM至約400 pM,約5 pM至約350 pM,約5 pM至約300 pM,約5 pM至約250 pM,約5 pM至約200 pM,約5 pM至約150 pM,約5 pM至約100 pM,約5 pM至約90 pM,約5 pM至約80 pM,約5 pM至約70 pM,約5 pM至約60 pM,約5 pM至約50 pM,約5 pM至約40 pM,約5 pM至約30 pM,約5 pM至約20 pM,約5 pM至約10 pM,約10 pM至約5 TM,約10 pM至約2 TM,約10 pM至約1 TM,約10 pM至約500 nM,約10 pM至約250 nM,約10 pM至約240 nM,約10 pM至約230 nM,約10 pM至約220 nM,約10 pM至約210 nM,約10 pM至約200 nM,約10 pM至約190 nM,約10 pM至約180 nM,約10 pM至約170 nM,約10 pM至約160 nM,約10 pM至約150 nM,約10 pM至約140 nM,約10 pM至約130 nM,約10 pM至約120 nM,約10 pM至約110 nM,約10 pM至約100 nM,約10 pM至約95 nM,約10 pM至約90 nM,約10 pM至約85 nM,約10 pM至約80 nM,約10 pM至約75 nM,約10 pM至約70 nM,約10 pM至約65 nM,約10 pM至約60 nM,約10 pM至約55 nM,約10 pM至約50 nM,約10 pM至約45 nM,約10 pM至約40 nM,約10 pM至約35 nM,約10 pM至約30 nM,約10 pM至約25 nM,約10 pM至約20 nM,約10 pM至約15 nM,約10 pM至約10 nM,約10 pM至約5 nM,約10 pM至約2 nM,約10 pM至約1 nM,約10 pM至約950 pM,約10 pM至約900 pM,約10 pM至約850 pM,約10 pM至約800 pM,約10 pM至約750 pM,約10 pM至約700 pM,約10 pM至約650 pM,約10 pM至約600 pM,約10 pM至約550 pM,約10 pM至約500 pM,約10 pM至約450 pM,約10 pM至約400 pM,約10 pM至約350 pM,約10 pM至約300 pM,約10 pM至約250 pM,約10 pM至約200 pM,約10 pM至約150 pM,約10 pM至約100 pM,約10 pM至約90 pM,約10 pM至約80 pM,約10 pM至約70 pM,約10 pM至約60 pM,約10 pM至約50 pM,約10 pM至約40 pM,約10 pM至約30 pM,約10 pM至約20 pM,約15 pM至約5 TM,約15 pM至約2 TM,約15 pM至約1 TM,約15 pM至約500 nM,約15 pM至約250 nM,約15 pM至約240 nM,約15 pM至約230 nM,約15 pM至約220 nM,約15 pM至約210 nM,約15 pM至約200 nM,約15 pM至約190 nM,約15 pM至約180 nM,約15 pM至約170 nM,約15 pM至約160 nM,約15 pM至約150 nM,約15 pM至約140 nM,約15 pM至約130 nM,約15 pM至約120 nM,約15 pM至約110 nM,約15 pM至約100 nM,約15 pM至約95 nM,約15 pM至約90 nM,約15 pM至約85 nM,約15 pM至約80 nM,約15 pM至約75 nM,約15 pM至約70 nM,約15 pM至約65 nM,約15 pM至約60 nM,約15 pM至約55 nM,約15 pM至約50 nM,約15 pM至約45 nM,約15 pM至約40 nM,約15 pM至約35 nM,約15 pM至約30 nM,約15 pM至約25 nM,約15 pM至約20 nM,約15 pM至約15 nM,約15 pM至約10 nM,約15 pM至約5 nM,約15 pM至約2 nM,約15 pM至約1 nM,約15 pM至約950 pM,約15 pM至約900 pM,約15 pM至約850 pM,約15 pM至約800 pM,約15 pM至約750 pM,約15 pM至約700 pM,約15 pM至約650 pM,約15 pM至約600 pM,約15 pM至約550 pM,約15 pM至約500 pM,約15 pM至約450 pM,約15 pM至約400 pM,約15 pM至約350 pM,約15 pM至約300 pM,約15 pM至約250 pM,約15 pM至約200 pM,約15 pM至約150 pM,約15 pM至約100 pM,約15 pM至約90 pM,約15 pM至約80 pM,約15 pM至約70 pM,約15 pM至約60 pM,約15 pM至約50 pM,約15 pM至約40 pM,約15 pM至約30 pM,約15 pM至約20 pM,約20 pM至約5 TM,約20 pM至約2 TM,約20 pM至約1 TM,約20 pM至約500 nM,約20 pM至約250 nM,約20 pM至約240 nM,約20 pM至約230 nM,約20 pM至約220 nM,約20 pM至約210 nM,約20 pM至約200 nM,約20 pM至約190 nM,約20 pM至約180 nM,約20 pM至約170 nM,約20 pM至約160 nM,約20 pM至約150 nM,約20 pM至約140 nM,約20 pM至約130 nM,約20 pM至約120 nM,約20 pM至約110 nM,約20 pM至約100 nM,約20 pM至約95 nM,約20 pM至約90 nM,約20 pM至約85 nM,約20 pM至約80 nM,約20 pM至約75 nM,約20 pM至約70 nM,約20 pM至約65 nM,約20 pM至約60 nM,約20 pM至約55 nM,約20 pM至約50 nM,約20 pM至約45 nM,約20 pM至約40 nM,約20 pM至約35 nM,約20 pM至約30 nM,約20 pM至約25 nM,約20 pM至約20 nM,約20 pM至約15 nM,約20 pM至約10 nM,約20 pM至約5 nM,約20 pM至約2 nM,約20 pM至約1 nM,約20 pM至約950 pM,約20 pM至約900 pM,約20 pM至約850 pM,約20 pM至約800 pM,約20 pM至約750 pM,約20 pM至約700 pM,約20 pM至約650 pM,約20 pM至約600 pM,約20 pM至約550 pM,約20 pM至約500 pM,約20 pM至約450 pM,約20 pM至約400 pM,約20 pM至約350 pM,約20 pM至約300 pM,約20 pM至約250 pM,約20 pM至約20 pM,約200 pM至約150 pM,約20 pM至約100 pM,約20 pM至約90 pM,約20 pM至約80 pM,約20 pM至約70 pM,約20 pM至約60 pM,約20 pM至約50 pM,約20 pM至約40 pM,約20 pM至約30 pM,約30 pM至約5 TM,約30 pM至約2 TM,約30 pM至約1 TM,約30 pM至約500 nM,約30 pM至約250 nM,約30 pM至約240 nM,約30 pM至約230 nM,約30 pM至約220 nM,約30 pM至約210 nM,約30 pM至約200 nM,約30 pM至約190 nM,約30 pM至約180 nM,約30 pM至約170 nM,約30 pM至約160 nM,約30 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nM,約4 nM至約250 nM,約4 nM至約240 nM,約4 nM至約230 nM,約4 nM至約220 nM,約4 nM至約210 nM,約4 nM至約200 nM,約4 nM至約190 nM,約4 nM至約180 nM,約4 nM至約170 nM,約4 nM至約160 nM,約4 nM至約150 nM,約4 nM至約140 nM,約4 nM至約130 nM,約4 nM至約120 nM,約4 nM至約110 nM,約4 nM至約100 nM,約4 nM至約95 nM,約4 nM至約90 nM,約4 nM至約85 nM,約4 nM至約80 nM,約4 nM至約75 nM,約4 nM至約70 nM,約4 nM至約65 nM,約4 nM至約60 nM,約4 nM至約55 nM,約4 nM至約50 nM,約4 nM至約45 nM,約4 nM至約40 nM,約4 nM至約35 nM,約4 nM至約30 nM,約4 nM至約25 nM,約4 nM至約20 nM,約4 nM至約15 nM,約4 nM至約10 nM,約4 nM至約5 nM,約5 nM至約5 TM,約5 nM至約2 TM,約5 nM至約1 TM,約5 nM至約500 nM,約5 nM至約250 nM,約5 nM至約240 nM,約5 nM至約230 nM,約5 nM至約220 nM,約5 nM至約210 nM,約5 nM至約200 nM,約5 nM至約190 nM,約5 nM至約180 nM,約5 nM至約170 nM,約5 nM至約160 nM,約5 nM至約150 nM,約5 nM至約140 nM,約5 nM至約130 nM,約5 nM至約120 nM,約5 nM至約110 nM,約5 nM至約100 nM,約5 nM至約95 nM,約5 nM至約90 nM,約5 nM至約85 nM,約5 nM至約80 nM,約5 nM至約75 nM,約5 nM至約70 nM,約5 nM至約65 nM,約5 nM至約60 nM,約5 nM至約55 nM,約5 nM至約50 nM,約5 nM至約45 nM,約5 nM至約40 nM,約5 nM至約35 nM,約5 nM至約30 nM,約5 nM至約25 nM,約5 nM至約20 nM,約5 nM至約15 nM,約5 nM至約10 nM,約10 nM至約5 TM,約10 nM至約2 TM,約10 nM至約1 TM,約10 nM至約500 nM,約10 nM至約250 nM,約10 nM至約240 nM,約10 nM至約230 nM,約10 nM至約220 nM,約10 nM至約210 nM,約10 nM至約200 nM,約10 nM至約190 nM,約10 nM至約180 nM,約10 nM至約170 nM,約10 nM至約160 nM,約10 nM至約150 nM,約10 nM至約140 nM,約10 nM至約130 nM,約10 nM至約120 nM,約10 nM至約110 nM,約10 nM至約100 nM,約10 nM至約95 nM,約10 nM至約90 nM,約10 nM至約85 nM,約10 nM至約80 nM,約10 nM至約75 nM,約10 nM至約70 nM,約10 nM至約65 nM,約10 nM至約60 nM,約10 nM至約55 nM,約10 nM至約50 nM,約10 nM至約45 nM,約10 nM至約40 nM,約10 nM至約35 nM,約10 nM至約30 nM,約10 nM至約25 nM,約10 nM至約20 nM,約10 nM至約15 nM,約15 nM至約5 TM,約15 nM至約2 TM,約15 nM至約1 TM,約15 nM至約500 nM,約15 nM至約250 nM,約15 nM至約240 nM,約15 nM至約230 nM,約15 nM至約220 nM,約15 nM至約210 nM,約15 nM至約200 nM,約15 nM至約190 nM,約15 nM至約180 nM,約15 nM至約170 nM,約15 nM至約160 nM,約15 nM至約150 nM,約15 nM至約140 nM,約15 nM至約130 nM,約15 nM至約120 nM,約15 nM至約110 nM,約15 nM至約100 nM,約15 nM至約95 nM,約15 nM至約90 nM,約15 nM至約85 nM,約15 nM至約80 nM,約15 nM至約75 nM,約15 nM至約70 nM,約15 nM至約65 nM,約15 nM至約60 nM,約15 nM至約55 nM,約15 nM至約50 nM,約15 nM至約45 nM,約15 nM至約40 nM,約15 nM至約35 nM,約15 nM至約30 nM,約15 nM至約25 nM,約15 nM至約20 nM,約20 nM至約5 TM,約20 nM至約2 TM,約20 nM至約1 TM,約20 nM至約500 nM,約20 nM至約250 nM,約20 nM至約240 nM,約20 nM至約230 nM,約20 nM至約220 nM,約20 nM至約210 nM,約20 nM至約200 nM,約20 nM至約190 nM,約20 nM至約180 nM,約20 nM至約170 nM,約20 nM至約160 nM,約20 nM至約150 nM,約20 nM至約140 nM,約20 nM至約130 nM,約20 nM至約120 nM,約20 nM至約110 nM,約20 nM至約100 nM,約20 nM至約95 nM,約20 nM至約90 nM,約20 nM至約85 nM,約20 nM至約80 nM,約20 nM至約75 nM,約20 nM至約70 nM,約20 nM至約65 nM,約20 nM至約60 nM,約20 nM至約55 nM,約20 nM至約50 nM,約20 nM至約45 nM,約20 nM至約40 nM,約20 nM至約35 nM,約20 nM至約30 nM,約20 nM至約25 nM,約25 nM至約5 TM,約25 nM至約2 TM,約25 nM至約1 TM,約25 nM至約500 nM,約25 nM至約250 nM,約25 nM至約240 nM,約25 nM至約230 nM,約25 nM至約220 nM,約25 nM至約210 nM,約25 nM至約200 nM,約25 nM至約190 nM,約25 nM至約180 nM,約25 nM至約170 nM,約25 nM至約160 nM,約25 nM至約150 nM,約25 nM至約140 nM,約25 nM至約130 nM,約25 nM至約120 nM,約25 nM至約110 nM,約25 nM至約100 nM,約25 nM至約95 nM,約25 nM至約90 nM,約25 nM至約85 nM,約25 nM至約80 nM,約25 nM至約75 nM,約25 nM至約70 nM,約25 nM至約65 nM,約25 nM至約60 nM,約25 nM至約55 nM,約25 nM至約50 nM,約25 nM至約45 nM,約25 nM至約40 nM,約25 nM至約35 nM,約25 nM至約30 nM,約30 nM至約5 TM,約30 nM至約2 TM,約30 nM至約1 TM,約30 nM至約500 nM,約30 nM至約250 nM,約30 nM至約240 nM,約30 nM至約230 nM,約30 nM至約220 nM,約30 nM至約210 nM,約30 nM至約200 nM,約30 nM至約190 nM,約30 nM至約180 nM,約30 nM至約170 nM,約30 nM至約160 nM,約30 nM至約150 nM,約30 nM至約140 nM,約30 nM至約130 nM,約30 nM至約120 nM,約30 nM至約110 nM,約30 nM至約100 nM,約30 nM至約95 nM,約30 nM至約90 nM,約30 nM至約85 nM,約30 nM至約80 nM,約30 nM至約75 nM,約30 nM至約70 nM,約30 nM至約65 nM,約30 nM至約60 nM,約30 nM至約55 nM,約30 nM至約50 nM,約30 nM至約45 nM,約30 nM至約40 nM,約30 nM至約35 nM,約40 nM至約5 TM,約40 nM至約2 TM,約40 nM至約1 TM,約40 nM至約500 nM,約40 nM至約250 nM,約40 nM至約240 nM,約40 nM至約230 nM,約40 nM至約220 nM,約40 nM至約210 nM,約40 nM至約200 nM,約40 nM至約190 nM,約40 nM至約180 nM,約40 nM至約170 nM,約40 nM至約160 nM,約40 nM至約150 nM,約40 nM至約140 nM,約40 nM至約130 nM,約40 nM至約120 nM,約40 nM至約110 nM,約40 nM至約100 nM,約40 nM至約95 nM,約40 nM至約90 nM,約40 nM至約85 nM,約40 nM至約80 nM,約40 nM至約75 nM,約40 nM至約70 nM,約40 nM至約65 nM,約40 nM至約60 nM,約40 nM至約55 nM,約40 nM至約50 nM,約40 nM至約45 nM,約50 nM至約5 TM,約50 nM至約2 TM,約50 nM至約1 TM,約50 nM至約500 nM,約50 nM至約250 nM,約50 nM至約240 nM,約50 nM至約230 nM,約50 nM至約220 nM,約50 nM至約210 nM,約50 nM至約200 nM,約50 nM至約190 nM,約50 nM至約180 nM,約50 nM至約170 nM,約50 nM至約160 nM,約50 nM至約150 nM,約50 nM至約140 nM,約50 nM至約130 nM,約50 nM至約120 nM,約50 nM至約110 nM,約50 nM至約100 nM,約50 nM至約95 nM,約50 nM至約90 nM,約50 nM至約85 nM,約50 nM至約80 nM,約50 nM至約75 nM,約50 nM至約70 nM,約50 nM至約65 nM,約50 nM至約60 nM,約50 nM至約55 nM,約60 nM至約5 TM,約60 nM至約2 TM,約60 nM至約1 TM,約60 nM至約500 nM,約60 nM至約250 nM,約60 nM至約240 nM,約60 nM至約230 nM,約60 nM至約220 nM,約60 nM至約210 nM,約60 nM至約200 nM,約60 nM至約190 nM,約60 nM至約180 nM,約60 nM至約170 nM,約60 nM至約160 nM,約60 nM至約150 nM,約60 nM至約140 nM,約60 nM至約130 nM,約60 nM至約120 nM,約60 nM至約110 nM,約60 nM至約100 nM,約60 nM至約95 nM,約60 nM至約90 nM,約60 nM至約85 nM,約60 nM至約80 nM,約60 nM至約75 nM,約60 nM至約70 nM,約60 nM至約65 nM,約70 nM至約5 TM,約70 nM至約2 TM,約70 nM至約1 TM,約70 nM至約500 nM,約70 nM至約250 nM,約70 nM至約240 nM,約70 nM至約230 nM,約70 nM至約220 nM,約70 nM至約210 nM,約70 nM至約200 nM,約70 nM至約190 nM,約70 nM至約180 nM,約70 nM至約170 nM,約70 nM至約160 nM,約70 nM至約150 nM,約70 nM至約140 nM,約70 nM至約130 nM,約70 nM至約120 nM,約70 nM至約110 nM,約70 nM至約100 nM,約70 nM至約95 nM,約70 nM至約90 nM,約70 nM至約85 nM,約70 nM至約80 nM,約70 nM至約75 nM,約80 nM至約5 TM,約80 nM至約2 TM,約80 nM至約1 TM,約80 nM至約500 nM,約80 nM至約250 nM,約80 nM至約240 nM,約80 nM至約230 nM,約80 nM至約220 nM,約80 nM至約210 nM,約80 nM至約200 nM,約80 nM至約190 nM,約80 nM至約180 nM,約80 nM至約170 nM,約80 nM至約160 nM,約80 nM至約150 nM,約80 nM至約140 nM,約80 nM至約130 nM,約80 nM至約120 nM,約80 nM至約110 nM,約80 nM至約100 nM,約80 nM至約95 nM,約80 nM至約90 nM,約80 nM至約85 nM,約90 nM至約5 TM,約90 nM至約2 TM,約90 mM至約1 TM,約90 nM至約500 nM,約90 nM至約250 nM,約90 nM至約240 nM,約90 nM至約230 nM,約90 nM至約220 nM,約90 nM至約210 nM,約90 nM至約200 nM,約90 nM至約190 nM,約90 nM至約180 nM,約90 nM至約170 nM,約90 nM至約160 nM,約90 nM至約150 nM,約90 nM至約140 nM,約90 nM至約130 nM,約90 nM至約120 nM,約90 nM至約110 nM,約90 nM至約100 nM,約90 nM至約95 nM,約100 nM至約5 TM,約100 nM至約2 TM,約100 nM至約1 TM,約100 nM至約500 nM,約100 nM至約250 nM,約100 nM至約240 nM,約100 nM至約230 nM,約100 nM至約220 nM,約100 nM至約210 nM,約100 nM至約200 nM,約100 nM至約190 nM,約100 nM至約180 nM,約100 nM至約170 nM,約100 nM至約160 nM,約100 nM至約150 nM,約100 nM至約140 nM,約100 nM至約130 nM,約100 nM至約120 nM,約100 nM至約110 nM,約110 nM至約5 TM,約110 nM至約2 TM,約110 nM至約1 TM,約110 nM至約500 nM,約110 nM至約250 nM,約110 nM至約240 nM,約110 nM至約230 nM,約110 nM至約220 nM,約110 nM至約210 nM,約110 nM至約200 nM,約110 nM至約190 nM,約110 nM至約180 nM,約110 nM至約170 nM,約110 nM至約160 nM,約110 nM至約150 nM,約110 nM至約140 nM,約110 nM至約130 nM,約110 nM至約120 nM,約120 nM至約5 TM,約120 nM至約2 TM,約120 nM至約1 TM,約120 nM至約500 nM,約120 nM至約250 nM,約120 nM至約240 nM,約120 nM至約230 nM,約120 nM至約220 nM,約120 nM至約210 nM,約120 nM至約200 nM,約120 nM至約190 nM,約120 nM至約180 nM,約120 nM至約170 nM,約120 nM至約160 nM,約120 nM至約150 nM,約120 nM至約140 nM,約120 nM至約130 nM,約130 nM至約5 TM,約130 nM至約2 TM,約130 nM至約1 TM,約130 nM至約500 nM,約130 nM至約250 nM,約130 nM至約240 nM,約130 nM至約230 nM,約130 nM至約220 nM,約130 nM至約210 nM,約130 nM至約200 nM,約130 nM至約190 nM,約130 nM至約180 nM,約130 nM至約170 nM,約130 nM至約160 nM,約130 nM至約150 nM,約130 nM至約140 nM,約140 nM至約5 TM,約140 nM至約2 TM,約140 nM至約1 TM,約140 nM至約500 nM,約140 nM至約250 nM,約140 nM至約240 nM,約140 nM至約230 nM,約140 nM至約220 nM,約140 nM至約210 nM,約140 nM至約200 nM,約140 nM至約190 nM,約140 nM至約180 nM,約140 nM至約170 nM,約140 nM至約160 nM,約140 nM至約150 nM,約150 nM至約5 TM,約150 nM至約2 TM,約150 nM至約1 TM,約150 nM至約500 nM,約150 nM至約250 nM,約150 nM至約240 nM,約150 nM至約230 nM,約150 nM至約220 nM,約150 nM至約210 nM,約150 nM至約200 nM,約150 nM至約190 nM,約150 nM至約180 nM,約150 nM至約170 nM,約150 nM至約160 nM,約160 nM至約5 TM,約160 nM至約2 TM,約160 nM至約1 TM,約160 nM至約500 nM,約160 nM至約250 nM,約160 nM至約240 nM,約160 nM至約230 nM,約160 nM至約220 nM,約160 nM至約210 nM,約160 nM至約200 nM,約160 nM至約190 nM,約160 nM至約180 nM,約160 nM至約170 nM,約170 nM至約5 TM,約170 nM至約2 TM,約170 nM至約1 TM,約170 nM至約500 nM,約170 nM至約250 nM,約170 nM至約240 nM,約170 nM至約230 nM,約170 nM至約220 nM,約170 nM至約210 nM,約170 nM至約200 nM,約170 nM至約190 nM,約170 nM至約180 nM,約180 nM至約5 TM,約180 nM至約2 TM,約180 nM至約1 TM,約180 nM至約500 nM,約180 nM至約250 nM,約180 nM至約240 nM,約180 nM至約230 nM,約180 nM至約220 nM,約180 nM至約210 nM,約180 nM至約200 nM,約180 nM至約190 nM,約190 nM至約5 TM,約190 nM至約2 TM,約190 nM至約1 TM,約190 nM至約500 nM,約190 nM至約250 nM,約190 nM至約240 nM,約190 nM至約230 nM,約190 nM至約220 nM,約190 nM至約210 nM,約190 nM至約200 nM,約200 nM至約5 TM,約200 nM至約2 TM,約200 nM至約1 TM,約200 nM至約500 nM,約200 nM至約250 nM,約200 nM至約240 nM,約200 nM至約230 nM,約200 nM至約220 nM,約200 nM至約210 nM,約210 nM至約5 TM,約210 nM至約2 TM,約210 nM至約1 TM,約210 nM至約500 nM,約210 nM至約250 nM,約210 nM至約240 nM,約210 nM至約230 nM,約210 nM至約220 nM,約220 nM至約5 TM,約220 nM至約2 TM,約220 nM至約1 TM,約220 nM至約500 nM,約220 nM至約250 nM,約220 nM至約240 nM,約220 nM至約230 nM,約230 nM至約5 TM,約230 nM至約2 TM,約230 nM至約1 TM,約230 nM至約500 nM,約230 nM至約250 nM,約230 nM至約240 nM,約240 nM至約5 TM,約240 nM至約2 TM,約240 nM至約1 TM,約240 nM至約500 nM,約240 nM至約250 nM,約250 nM至約5 TM,約250 nM至約2 TM,約250 nM至約1 TM,約250 nM至約500 nM,約500 nM至約5 TM,約500 nM至約2 TM,約500 nM至約1 TM,約1 TM至約5 TM,約1 TM至約2 TM,或約2 TM至約5 TM)。
在文中所述的任何抗體之某些具體實例中,在約4.0至約6.5(例如,此文中所述範圍之任何子範圍)之pH時的K D可大於1 nM (例如,介於約1 nM至約1 mM,約1 nM至約900 μM,約1 nM至約800 μM,約1 nM至約700 μM,約1 nM至約600 μM,約1 nM至約500 μM,約1 nM至約400 μM,約1 nM至約300 μM,約1 nM至約200 μM,約1 nM至約100 μM,約1 nM至約90 μM,約1 nM至約80 μM,約1 nM至約70 μM,約1 nM至約60 μM,約1 nM至約50 μM,約1 nM至約40 μM,約1 nM至約30 μM,約1 nM至約20 μM,約1 nM至約10 μM,約1 nM至約5 μM,約1 nM至約4 μM,約1 nM至約2 μM,約1 nM至約1 μM,約1 nM至約900 nM,約1 nM至約800 nM,約1 nM至約700 nM,約1 nM至約600 nM,約1 nM至約500 nM,約1 nM至約400 nM,約1 nM至約300 nM,約1 nM至約200 nM,約1 nM至約100 nM,約1 nM至約90 nM,約1 nM至約80 nM,約1 nM至約70 nM,約1 nM至約60 nM,約1 nM至約50 nM,約1 nM至約40 nM,約1 nM至約30 nM,約2 nM至約1 mM,約2 nM至約900 μM,約2 nM至約800 μM,約2 nM至約700 μM,約2 nM至約600 μM,約2 nM至約500 μM,約2 nM至約400 μM,約2 nM至約300 μM,約2 nM至約200 μM,約2 nM至約100 μM,約2 nM至約90 μM,約2 nM至約80 μM,約2 nM至約70 μM,約2 nM至約60 μM,約2 nM至約50 μM,約2 nM至約40 μM,約2 nM至約30 μM,約2 nM至約20 μM,約2 nM至約10 μM,約2 nM至約5 μM,約2 nM至約4 μM,約2 nM至約2 μM,約2 nM至約1 μM,約2 nM至約900 nM,約2 nM至約800 nM,約2 nM至約700 nM,約2 nM至約600 nM,約2 nM至約500 nM,約2 nM至約400 nM,約2 nM至約300 nM,約2 nM至約200 nM,約2 nM至約100 nM,約2 nM至約90 nM,約2 nM至約80 nM,約2 nM至約70 nM,約2 nM至約60 nM,約2 nM至約50 nM,約2 nM至約40 nM,約2 nM至約30 nM,約5 nM至約1 mM,約5 nM至約900 μM,約5 nM至約800 μM,約5 nM至約700 μM,約5 nM至約600 μM,約5 nM至約500 μM,約5 nM至約400 μM,約5 nM至約300 μM,約5 nM至約200 μM,約5 nM至約100 μM,約5 nM至約90 μM,約5 nM至約80 μM,約5 nM至約70 μM,約5 nM至約60 μM,約5 nM至約50 μM,約5 nM至約40 μM,約5 nM至約30 μM,約5 nM至約20 μM,約5 nM至約10 μM,約5 nM至約5 μM,約5 nM至約4 μM,約5 nM至約2 μM,約5 nM至約1 μM,約5 nM至約900 nM,約5 nM至約800 nM,約5 nM至約700 nM,約5 nM至約600 nM,約5 nM至約500 nM,約5 nM至約400 nM,約5 nM至約300 nM,約5 nM至約200 nM,約5 nM至約100 nM,約5 nM至約90 nM,約5 nM至約80 nM,約5 nM至約70 nM,約5 nM至約60 nM,約5 nM至約50 nM,約5 nM至約40 nM,約5 nM至約30 nM,約10 nM至約1 mM,約10 nM至約900 μM,約10 nM至約800 μM,約10 nM至約700 μM,約10 nM至約600 μM,約10 nM至約500 μM,約10 nM至約400 μM,約10 nM至約300 μM,約10 nM至約200 μM,約10 nM至約100 μM,約10 nM至約90 μM,約10 nM至約80 μM,約10 nM至約70 μM,約10 nM至約60 μM,約10 nM至約50 μM,約10 nM至約40 μM,約10 nM至約30 μM,約10 nM至約20 μM,約10 nM至約10 μM,約10 nM至約5 μM,約10 nM至約4 μM,約10 nM至約2 μM,約10 nM至約1 μM,約10 nM至約900 nM,約10 nM至約800 nM,約10 nM至約700 nM,約10 nM至約600 nM,約10 nM至約500 nM,約10 nM至約400 nM,約10 nM至約300 nM,約10 nM至約200 nM,約10 nM至約100 nM,約10 nM至約90 nM,約10 nM至約80 nM,約10 nM至約70 nM,約10 nM至約60 nM,約10 nM至約50 nM,約10 nM至約40 nM,約10 nM至約30 nM,約20 nM至約1 mM,約20 nM至約900 μM,約20 nM至約800 μM,約20 nM至約700 μM,約20 nM至約600 μM,約20 nM至約500 μM,約20 nM至約400 μM,約20 nM至約300 μM,約20 nM至約200 μM,約20 nM至約100 μM,約20 nM至約90 μM,約20 nM至約80 μM,約20 nM至約70 μM,約20 nM至約60 μM,約20 nM至約50 μM,約20 nM至約40 μM,約20 nM至約30 μM,約20 nM至約20 μM,約20 nM至約10 μM,約20 nM至約5 μM,約20 nM至約4 μM,約20 nM至約2 μM,約20 nM至約1 μM,約20 nM至約900 nM,約20 nM至約800 nM,約20 nM至約700 nM,約20 nM至約600 nM,約20 nM至約500 nM,約20 nM至約400 nM,約20 nM至約300 nM,約20 nM至約200 nM,約20 nM至約100 nM,約20 nM至約90 nM,約20 nM至約80 nM,約20 nM至約70 nM,約20 nM至約60 nM,約20 nM至約50 nM,約20 nM至約40 nM,約20 nM至約30 nM;約1 μM至約1 mM,約1 μM至約900 μM,約1 μM至約800 μM,約1 μM至約700 μM,約1 μM至約600 μM,約1 μM至約500 μM,約1 μM至約400 μM,約1 μM至約300 μM,約1 μM至約200 μM,約1 μM至約100 μM,約1 μM至約90 μM,約1 μM至約80 μM,約1 μM至約70 μM,約1 μM至約60 μM,約1 μM至約50 μM,約1 μM至約40 μM,約1 μM至約30 μM,約1 μM至約20 μM,約1 μM至約10 μM,約1 μM至約5 μM,約1 μM至約4 μM,約1 μM至約3 μM,約1 μM至約2 μM,約2 μM至約1 mM,約2 μM至約900 μM,約2 μM至約800 μM,約2 μM至約700 μM,約2 μM至約600 μM,約2 μM至約500 μM,約2 μM至約400 μM,約2 μM至約300 μM,約2 μM至約200 μM,約2 μM至約100 μM,約2 μM至約90 μM,約2 μM至約80 μM,約2 μM至約70 μM,約2 μM至約60 μM,約2 μM至約50 μM,約2 μM至約40 μM,約2 μM至約30 μM,約2 μM至約20 μM,約2 μM至約10 μM,約2 μM至約5 μM,約2 μM至約4 μM,約2 μM至約3 μM,約5 μM至約1 mM,約5 μM至約900 μM,約5 μM至約800 μM,約5 μM至約700 μM,約5 μM至約600 μM,約5 μM至約500 μM,約5 μM至約400 μM,約5 μM至約300 μM,約5 μM至約200 μM,約5 μM至約100 μM,約5 μM至約90 μM,約5 μM至約80 μM,約5 μM至約70 μM,約5 μM至約60 μM,約5 μM至約50 μM,約5 μM至約40 μM,約5 μM至約30 μM,約5 μM至約20 μM,約5 μM至約10 μM,約10 μM至約1 mM,約10 μM至約900 μM,約10 μM至約800 μM,約10 μM至約700 μM,約10 μM至約600 μM,約10 μM至約500 μM,約10 μM至約400 μM,約10 μM至約300 μM,約10 μM至約200 μM,約10 μM至約100 μM,約10 μM至約90 μM,約10 μM至約80 μM,約10 μM至約70 μM,約10 μM至約60 μM,約10 μM至約50 μM,約10 μM至約40 μM,約10 μM至約30 μM,約10 μM至約20 μM,約20 μM至約1 mM,約20 μM至約900 μM,約20 μM至約800 μM,約20 μM至約700 μM,約20 μM至約600 μM,約20 μM至約500 μM,約20 μM至約400 μM,約20 μM至約300 μM,約20 μM至約200 μM,約20 μM至約100 μM,約20 μM至約90 μM,約20 μM至約80 μM,約20 μM至約70 μM,約20 μM至約60 μM,約20 μM至約50 μM,約20 μM至約40 μM,約20 μM至約30 μM,約30 μM至約1 mM,約30 μM至約900 μM,約30 μM至約800 μM,約30 μM至約700 μM,約30 μM至約600 μM,約30 μM至約500 μM,約30 μM至約400 μM,約30 μM至約300 μM,約30 μM至約200 μM,約30 μM至約100 μM,約30 μM至約90 μM,約30 μM至約80 μM,約30 μM至約70 μM,約30 μM至約60 μM,約30 μM至約50 μM,約30 μM至約40 μM,約40 μM至約1 mM,約40 μM至約900 μM,約40 μM至約800 μM,約40 μM至約700 μM,約40 μM至約600 μM,約40 μM至約500 μM,約40 μM至約400 μM,約40 μM至約300 μM,約40 μM至約200 μM,約40 μM至約100 μM,約40 μM至約90 μM,約40 μM至約80 μM,約40 μM至約70 μM,約40 μM至約60 μM,約40 μM至約50 μM,約50 μM至約1 mM,約50 μM至約900 μM,約50 μM至約800 μM,約50 μM至約700 μM,約50 μM至約600 μM,約50 μM至約500 μM,約50 μM至約400 μM,約50 μM至約300 μM,約50 μM至約200 μM,約50 μM至約100 μM,約50 μM至約90 μM,約50 μM至約80 μM,約50 μM至約70 μM,約50 μM至約60 μM,約60 μM至約1 mM,約60 μM至約900 μM,約60 μM至約800 μM,約60 μM至約700 μM,約60 μM至約600 μM,約60 μM至約500 μM,約60 μM至約400 μM,約60 μM至約300 μM,約60 μM至約200 μM,約60 μM至約100 μM,約60 μM至約90 μM,約60 μM至約80 μM,約60 μM至約70 μM,約70 μM至約1 mM,約70 μM至約900 μM,約70 μM至約800 μM,約70 μM至約700 μM,約70 μM至約600 μM,約70 μM至約500 μM,約70 μM至約400 μM,約70 μM至約300 μM,約70 μM至約200 μM,約70 μM至約100 μM,約70 μM至約90 μM,約70 μM至約80 μM,約80 μM至約1 mM,約80 μM至約900 μM,約80 μM至約800 μM,約80 μM至約700 μM,約80 μM至約600 μM,約80 μM至約500 μM,約80 μM至約400 μM,約80 μM至約300 μM,約80 μM至約200 μM,約80 μM至約100 μM,約80 μM至約90 μM,約90 μM至約1 mM,約90 μM至約900 μM,約90 μM至約800 μM,約90 μM至約700 μM,約90 μM至約600 μM,約90 μM至約500 μM,約90 μM至約400 μM,約90 μM至約300 μM,約90 μM至約200 μM,約90 μM至約100 μM,約100 μM至約1 mM,約100 μM至約900 μM,約100 μM至約800 μM,約100 μM至約700 μM,約100 μM至約600 μM,約100 μM至約500 μM,約100 μM至約400 μM,約100 μM至約300 μM,約100 μM至約200 μM,約200 μM至約1 mM,約200 μM至約900 μM,約200 μM至約800 μM,約200 μM至約700 μM,約200 μM至約600 μM,約200 μM至約500 μM,約200 μM至約400 μM,約200 μM至約300 μM,約300 μM至約1 mM,約300 μM至約900 μM,約300 μM至約800 μM,約300 μM至約700 μM,約300 μM至約600 μM,約300 μM至約500 μM,約300 μM至約400 μM,約400 μM至約1 mM,約400 μM至約900 μM,約400 μM至約800 μM,約400 μM至約700 μM,約400 μM至約600 μM,約400 μM至約500 μM,約500 μM至約1 mM,約500 μM至約900 μM,約500 μM至約800 μM,約500 μM至約700 μM,約500 μM至約600 μM,約600 μM至約1 mM,約600 μM至約900 μM,約600 μM至約800 μM,約600 μM至約700 μM,約700 μM至約1 mM,約700 μM至約900 μM,約700 μM至約800 μM,約800 μM至約1 mM,約800 μM至約900 μM,或約900 μM至約1 mM)。
各種本項技術中已知的方法可用於測定任何文中所述之抗體的K D值(例如,電泳移動偏移分析、濾膜結合分析、表面電漿共振、生物分子結合動力學分析、抗原表現細胞之活體外結合分析等等)。
在某些具體實例中,任何文中所述之抗體的半衰期,該抗體的活體內半衰期相對於對照抗體(例如,相同抗體但在不包括重鏈之CH1-CH2-CH3中的胺基酸取代或插入或C L區中的任何胺基酸取代)為增加的(例如,可察覺的增加)。在某些具體實例中,一或更多個胺基酸取代可能增加任何文中所述之抗體的半衰期。可增加活體內抗體半衰期之胺基酸取代的非限定實例包括在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸,及/或在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸。在某些具體實例中,相較於對照抗體(例如,相同抗體但在不包括重鏈之CH1-CH2-CH3中的胺基酸取代或插入或CL區中的任何胺基酸取代),該抗體的活體內半衰期為增加的(例如,可察覺的增加)(例如,至少增加1%,至少增加5%,至少增加10%,至少增加15%,至少增加20%,至少增加25%,至少增加30%,至少增加35%,至少增加40%,至少增加45%,至少增加50%,至少增加55%,至少增加60%,至少增加65%,至少增加70%,至少增加75%,至少增加80%,至少增加85%,至少增加90%,至少增加95%,或至少增加99%,或約增加1%至約增加99%,約增加1%至約增加95%,約增加1%至約增加90%,約增加1%至約增加85%,約增加1%至約增加 80%,約增加1%至約增加75%,約增加1%至約增加70%,約增加1%至約增加65%,約增加1%至約增加60%,約增加1%至約增加55%,約增加1%至約增加50%,約增加1%至約增加45%,約增加1%至約增加40%,約增加1%至約增加35%,約增加1%至約增加30%,約增加1%至約增加25%,約增加1%至約增加20%,約增加1%至約增加15%,約增加1%至約增加10%,約增加1%至約增加5%,約增加5%至約增加99%,約增加5%至約增加95%,約增加5%至約增加90%,約增加5%至約增加85%,約增加5%至約增加 80%,約增加5%至約增加75%,約增加5%至約增加70%,約增加5%至約增加65%,約增加5%至約增加60%,約增加5%至約增加55%,約增加5%至約增加50%,約增加5%至約增加45%,約增加5%至約增加40%,約增加5%至約增加35%,約增加5%至約增加30%,約增加5%至約增加25%,約增加5%至約增加20%,約增加5%至約增加15%,約增加5%至約增加10%,約增加10%至約增加99%,約增加10%至約增加95%,約增加10%至約增加90%,約增加10%至約增加85%,約增加10%至約增加 80%,約增加10%至約增加75%,約增加10%至約增加70%,約增加10%至約增加65%,約增加10%至約增加60%,約增加10%至約增加55%,約增加10%至約增加50%,約增加10%至約增加45%,約增加10%至約增加40%,約增加10%至約增加35%,約增加10%至約增加30%,約增加10%至約增加25%,約增加10%至約增加20%,約增加10%至約增加15%,約增加15%至約增加99%,約增加15%至約增加95%,約增加15%至約增加90%,約增加15%至約增加85%,約增加15%至約增加 80%,約增加15%至約增加75%,約增加15%至約增加70%,約增加15%至約增加65%,約增加15%至約增加60%,約增加15%至約增加55%,約增加15%至約增加50%,約增加15%至約增加45%,約增加15%至約增加40%,約增加15%至約增加35%,約增加15%至約增加30%,約增加15%至約增加25%,約增加15%至約增加20%,約增加20%至約增加99%,約增加20%至約增加95%,約增加20%至約增加90%,約增加20%至約增加85%,約增加20%至約增加 80%,約增加20%至約增加75%,約增加20%至約增加70%,約增加20%至約增加65%,約增加20%至約增加60%,約增加20%至約增加55%,約增加20%至約增加50%,約增加20%至約增加45%,約增加20%至約增加40%,約增加20%至約增加35%,約增加20%至約增加30%,約增加20%至約增加25%,約增加25%至約增加99%,約增加25%至約增加95%,約增加25%至約增加90%,約增加25%至約增加85%,約增加25%至約增加 80%,約增加25%至約增加75%,約增加25%至約增加70%,約增加25%至約增加65%,約增加25%至約增加60%,約增加25%至約增加55%,約增加25%至約增加50%,約增加25%至約增加45%,約增加25%至約增加40%,約增加25%至約增加35%,約增加25%至約增加30%,約增加30%至約增加99%,約增加30%至約增加95%,約增加30%至約增加90%,約增加30%至約增加85%,約增加30%至約增加 80%,約增加30%至約增加75%,約增加30%至約增加70%,約增加30%至約增加65%,約增加30%至約增加60%,約增加30%至約增加55%,約增加30%至約增加50%,約增加30%至約增加45%,約增加30%至約增加40%,約增加30%至約增加35%,約增加35%至約增加99%,約增加35%至約增加95%,約增加35%至約增加90%,約增加35%至約增加85%,約增加35%至約增加 80%,約增加35%至約增加75%,約增加35%至約增加70%,約增加35%至約增加65%,約增加35%至約增加60%,約增加35%至約增加55%,約增加35%至約增加50%,約增加35%至約增加45%,約增加35%至約增加40%,約增加40%至約增加99%,約增加40%至約增加95%,約增加40%至約增加90%,約增加40%至約增加85%,約增加40%至約增加 80%,約增加40%至約增加75%,約增加40%至約增加70%,約增加40%至約增加65%,約增加40%至約增加60%,約增加40%至約增加55%,約增加40%至約增加50%,約增加40%至約增加45%,約增加45%至約增加99%,約增加45%至約增加95%,約增加45%至約增加90%,約增加45%至約增加85%,約增加45%至約增加 80%,約增加45%至約增加75%,約增加45%至約增加70%,約增加45%至約增加65%,約增加45%至約增加60%,約增加45%至約增加55%,約增加45%至約增加50%,約增加50%至約增加99%,約增加50%至約增加95%,約增加50%至約增加90%,約增加50%至約增加85%,約增加50%至約增加 80%,約增加50%至約增加75%,約增加50%至約增加70%,約增加50%至約增加65%,約增加50%至約增加60%,約增加50%至約增加55%,約增加55%至約增加99%,約增加55%至約增加95%,約增加55%至約增加90%,約增加55%至約增加85%,約增加55%至約增加 80%,約增加55%至約增加75%,約增加55%至約增加70%,約增加55%至約增加65%,約增加55%至約增加60%,約增加60%至約增加99%,約增加60%至約增加95%,約增加60%至約增加90%,約增加60%至約增加85%,約增加60%至約增加 80%,約增加60%至約增加75%,約增加60%至約增加70%,約增加60%至約增加65%,約增加65%至約增加99%,約增加65%至約增加95%,約增加65%至約增加90%,約增加65%至約增加85%,約增加65%至約增加 80%,約增加65%至約增加75%,約增加65%至約增加70%,約增加70%至約增加99%,約增加70%至約增加95%,約增加70%至約增加90%,約增加70%至約增加85%,約增加70%至約增加 80%,約增加70%至約增加75%,約增加75%至約增加99%,約增加75%至約增加95%,約增加75%至約增加90%,約增加75%至約增加85%,約增加75%至約增加 80%,約增加80%至約增加99%,約增加80%至約增加95%,約增加80%至約增加90%,約增加80%至約增加85%,約增加85%至約增加99%,約增加85%至約增加95%,約增加85%至約增加90%,約增加90%至約增加99%,約增加90%至約增加95%,或約增加95%至約增加99%)。
在任何文中所述之抗體的某些實例中,相較於對照抗體(例如,相同抗體但在不包括重鏈之CH1-CH2-CH3中的胺基酸取代或插入或CL區的任何胺基酸取代),抗體的活體內半衰期為下降的(例如,可察覺的下降)(例如,至少下降1%,至少下降5%,至少下降10%,至少下降15%,至少下降20%,至少下降25%,至少下降30%,至少下降35%,至少下降40%,至少下降45%,至少下降50%,至少下降55%,至少下降60%,至少下降65%,至少下降70%,至少下降75%,至少下降80%,至少下降85%,至少下降90%,至少下降95%,或至少下降99%,或約下降1%至約下降99%,約下降1%至約下降95%,約下降1%至約下降90%,約下降1%至約下降85%,約下降1%至約下降 80%,約下降1%至約下降75%,約下降1%至約下降70%,約下降1%至約下降65%,約下降1%至約下降60%,約下降1%至約下降55%,約下降1%至約下降50%,約下降1%至約下降45%,約下降1%至約下降40%,約下降1%至約下降35%,約下降1%至約下降30%,約下降1%至約下降25%,約下降1%至約下降20%,約下降1%至約下降15%,約下降1%至約下降10%,約下降1%至約下降5%,約下降5%至約下降99%,約下降5%至約下降95%,約下降5%至約下降90%,約下降5%至約下降85%,約下降5%至約下降 80%,約下降5%至約下降75%,約下降5%至約下降70%,約下降5%至約下降65%,約下降5%至約下降60%,約下降5%至約下降55%,約下降5%至約下降50%,約下降5%至約下降45%,約下降5%至約下降40%,約下降5%至約下降35%,約下降5%至約下降30%,約下降5%至約下降25%,約下降5%至約下降20%,約下降5%至約下降15%,約下降5%至約下降10%,約下降10%至約下降99%,約下降10%至約下降95%,約下降10%至約下降90%,約下降10%至約下降85%,約下降10%至約下降 80%,約下降10%至約下降75%,約下降10%至約下降70%,約下降10%至約下降65%,約下降10%至約下降60%,約下降10%至約下降55%,約下降10%至約下降50%,約下降10%至約下降45%,約下降10%至約下降40%,約下降10%至約下降35%,約下降10%至約下降30%,約下降10%至約下降25%,約下降10%至約下降20%,約下降10%至約下降15%,約下降15%至約下降99%,約下降15%至約下降95%,約下降15%至約下降90%,約下降15%至約下降85%,約下降15%至約下降 80%,約下降15%至約下降75%,約下降15%至約下降70%,約下降15%至約下降65%,約下降15%至約下降60%,約下降15%至約下降55%,約下降15%至約下降50%,約下降15%至約下降45%,約下降15%至約下降40%,約下降15%至約下降35%,約下降15%至約下降30%,約下降15%至約下降25%,約下降15%至約下降20%,約下降20%至約下降99%,約下降20%至約下降95%,約下降20%至約下降90%,約下降20%至約下降85%,約下降20%至約下降 80%,約下降20%至約下降75%,約下降20%至約下降70%,約下降20%至約下降65%,約下降20%至約下降60%,約下降20%至約下降55%,約下降20%至約下降50%,約下降20%至約下降45%,約下降20%至約下降40%,約下降20%至約下降35%,約下降20%至約下降30%,約下降20%至約下降25%,約下降25%至約下降99%,約下降25%至約下降95%,約下降25%至約下降90%,約下降25%至約下降85%,約下降25%至約下降 80%,約下降25%至約下降75%,約下降25%至約下降70%,約下降25%至約下降65%,約下降25%至約下降60%,約下降25%至約下降55%,約下降25%至約下降50%,約下降25%至約下降45%,約下降25%至約下降40%,約下降25%至約下降35%,約下降25%至約下降30%,約下降30%至約下降99%,約下降30%至約下降95%,約下降30%至約下降90%,約下降30%至約下降85%,約下降30%至約下降 80%,約下降30%至約下降75%,約下降30%至約下降70%,約下降30%至約下降65%,約下降30%至約下降60%,約下降30%至約下降55%,約下降30%至約下降50%,約下降30%至約下降45%,約下降30%至約下降40%,約下降30%至約下降35%,約下降35%至約下降99%,約下降35%至約下降95%,約下降35%至約下降90%,約下降35%至約下降85%,約下降35%至約下降 80%,約下降35%至約下降75%,約下降35%至約下降70%,約下降35%至約下降65%,約下降35%至約下降60%,約下降35%至約下降55%,約下降35%至約下降50%,約下降35%至約下降45%,約下降35%至約下降40%,約下降40%至約下降99%,約下降40%至約下降95%,約下降40%至約下降90%,約下降40%至約下降85%,約下降40%至約下降 80%,約下降40%至約下降75%,約下降40%至約下降70%,約下降40%至約下降65%,約下降40%至約下降60%,約下降40%至約下降55%,約下降40%至約下降50%,約下降40%至約下降45%,約下降45%至約下降99%,約下降45%至約下降95%,約下降45%至約下降90%,約下降45%至約下降85%,約下降45%至約下降 80%,約下降45%至約下降75%,約下降45%至約下降70%,約下降45%至約下降65%,約下降45%至約下降60%,約下降45%至約下降55%,約下降45%至約下降50%,約下降50%至約下降99%,約下降50%至約下降95%,約下降50%至約下降90%,約下降50%至約下降85%,約下降50%至約下降 80%,約下降50%至約下降75%,約下降50%至約下降70%,約下降50%至約下降65%,約下降50%至約下降60%,約下降50%至約下降55%,約下降55%至約下降99%,約下降55%至約下降95%,約下降55%至約下降90%,約下降55%至約下降85%,約下降55%至約下降 80%,約下降55%至約下降75%,約下降55%至約下降70%,約下降55%至約下降65%,約下降55%至約下降60%,約下降60%至約下降99%,約下降60%至約下降95%,約下降60%至約下降90%,約下降60%至約下降85%,約下降60%至約下降 80%,約下降60%至約下降75%,約下降60%至約下降70%,約下降60%至約下降65%,約下降65%至約下降99%,約下降65%至約下降95%,約下降65%至約下降90%,約下降65%至約下降85%,約下降65%至約下降 80%,約下降65%至約下降75%,約下降65%至約下降70%,約下降70%至約下降99%,約下降70%至約下降95%,約下降70%至約下降90%,約下降70%至約下降85%,約下降70%至約下降 80%,約下降70%至約下降75%,約下降75%至約下降99%,約下降75%至約下降95%,約下降75%至約下降90%,約下降75%至約下降85%,約下降75%至約下降 80%,約下降80%至約下降99%,約下降80%至約下降95%,約下降80%至約下降90%,約下降80%至約下降85%,約下降85%至約下降99%,約下降85%至約下降95%,約下降85%至約下降90%,約下降90%至約下降99%,約下降90%至約下降95%,或約下降95%至約下降99%)。 接合物
在某些具體實例中,文中所提供的抗體可與藥物(例如,化療藥物、小分子)、毒素或放射性同位素接合。藥物、毒素和放射性同位素(例如,已知可用於治療癌症)之非限定實例已為本項技術所知。
在某些具體實例中,至少一任何文中所述之抗體的多肽係經由一可裂解連接子與毒素、放射性同位素或藥物接合。在某些具體實例中,該可裂解連接子係包括一蛋白酶裂解位置。在某些具體實例中,該可裂解連接子一旦運送至溶酶體或晚期胞內體則其係在抗體上被標的哺乳動物細胞裂解。在某些具體實例中,連接子的裂解係功能上活化該藥物或毒素。
在某些具體實例中,至少一任何文中所述之抗體的多肽係經由一非可裂解連接子與毒素、放射性同位素或藥物接合。在某些具體實例中,該接合的毒素、放射性同位素或藥物係在抗體之溶酶體及/或晚期胞內體降解期間釋放。
可裂解連接子之非限定實例包括:腙連接子、胜肽連接子和硫醚連接子。參見,例如,Carter et al., Cancer J.14(3):154-169, 2008;Sanderson et al., Clin. Cancer Res.11(2 Pt1):843-852, 2005;Chari et al., Acc. Chem. Res.41(1):98-107, 2008;Oflazoglu et al., Clin. Cancer Res.14(19):6171-6180, 2008;及Lu et al., Int. J. Mol. Sci.17(4):561, 2016。
非可裂解連接子之非限定實例包括:馬來亞醯胺烷-連接子和meleimide環烷-連接子(MMC)(參見,例如,該等描述於McCombs et al., AAPS J.17(2):339-351, 2015)。
在某些具體實例中,任何文中所述之抗體對標的哺乳動物細胞具細胞毒性或細胞抑制性。
在某些具體實例中,文中所提供的抗體可包括一或更多個胺基酸取代用以提供接合位置(例如,與藥物、毒素、放射性同位素接合)。在某些具體實例中,文中所提供的抗體可具有一個接合位置。在某些具體實例中,文中所述之抗體可具有二個接合位置。在某些具體實例中,文中所提供的抗體可具有三個或更多個接合位置。用於產生接合位置的胺基酸取代之非限定實例(例如,「三絞鏈」接合位置)係描述於美國專利申請案號2017/0348429中,其係以全文引用的方式併入文中。例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸可在任何文中所述之抗體中提供「三絞鏈」接合位置。在某些具體實例中,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸可提供任何文中所述之抗體接合位置。在某些具體實例中,在SEQ ID NO:157的胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸可提供任何文中所述之抗體接合位置。
天然生成的半胱胺酸胺基酸亦可提供接合(例如,與藥物、毒素、放射性同位素接合)。在某些具體實例中,文中所提供的抗體可在一或更多個(例如,一、二、三或四個)天然生成的接合位置具有接合的藥物、毒素或放射性同位素。在某些具體實例中,在SEQ ID NO:155或189之胺基酸位置103的半胱胺酸為一天然生成的接合位置。在某些具體實例中,在SEQ ID NO:155或189之胺基酸位置109的半胱胺酸為一天然生成的接合位置。在某些具體實例中,在SEQ ID NO:155或SEQ 189之胺基酸位置112的半胱胺酸為一天然生成的接合位置。在某些具體實例中,在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸為一天然生成的接合位置。
在某些具體實例中,文中所提供的抗體可在一或更多個(例如,一、二、三或四個)天然生成的接合位置具有接合的藥物、毒素或放射性同位素,例如,在SEQ ID NO:155或SEQ 189之胺基酸位置103的半胱胺酸,胺基酸位置109的半胱胺酸及/或胺基酸位置112的半胱胺酸,及/或在SEQ ID NO:157胺基酸位置107的半胱胺酸。在某些具體實例中,文中所提供的抗體可在一或更多個(例如,二、三或四個)天然生成的接合位置及一或更多個(例如,二或三個)工程改造的接合位置(例如,藉由胺基酸取代、刪除、加成等工程改造)具有接合的藥物、毒素或放射性同位素。
經由工程改造的半胱胺酸之接合係藉由本項技術中已知的方法來進行。簡言之,藉由以還原劑,例如,叁(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰乙醇(BME)處理來製備用於接合的工程改造含有半胱胺酸的抗體。在還原中還原劑與抗體中的雙硫鍵反應,破壞鏈間雙硫鍵並從工程改造的半胱胺酸移除雙硫鍵端帽。藉由將溶液暴露於空氣中所進行之視需要的再氧化步驟,或氧化劑例如去氫抗壞血酸,讓鏈間雙硫鍵再形成,留下帶有硫醇鹽反應性基團的工程改造半胱胺酸。在連接子-酬載馬來亞醯胺-vc-MMAE上的馬來亞醯胺官能基之接合係藉由在含有共溶劑,例如乙醇、二甲基乙醯胺(DMA)、二甲基亞碸(DMSO)之緩衝溶液中與酬載反應來進行。藉由粒徑排阻層析法或選擇性過濾法,例如切向流過濾將粗的接合抗體溶液純化。在此步驟中,從反應混合物中移除殘餘的未反應酬載、還原劑和氧化劑,且該接合的ADC產物可轉置於適用的調配物緩衝液中。
經由絞鏈半胱胺酸之接合係藉由類似的方法,使用有或無另外的工程改造半胱胺酸接合位置之抗體來進行。簡言之,藉由以還原劑,例如,叁(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)處理來製備用於接合的抗體。還原劑的還原力和濃度係經選擇,使得某些獲所有的鏈間雙硫鍵還原,留下用於接合的游離半胱胺酸。溶液可在過量的還原劑存在下直接接合。在連接子-酬載馬來亞醯胺-vc-MMAE上的馬來亞醯胺官能基之接合係藉由在含有共溶劑,例如乙醇、二甲基乙醯胺(DMA)、二甲基亞碸(DMSO)之緩衝溶液中與酬載反應來進行。未反應的連接子-酬載可藉由加入奉獻的硫醇鹽分子,例如乙醯基-半胱胺酸使其成為非反應性。粗的接合抗體溶液可進一步藉由本項技術中已知的方法來純化,包括疏水性作用層析、離子交換層析,或混合模式的層析,例如陶瓷羥磷灰石層析。分離層析的溶離份得以選擇所欲的抗體與酬載比率並移除未反應的抗體、蛋白沉積物和片段,以及酬載相關的反應副產物。純化的抗體藥物接合物可藉由粒徑排阻層析法或選擇性過濾法,例如切向流過濾進一步純化。在此步驟中接合的ADC產物亦可轉置於適用的調配物緩衝液中。
在某些實例中,可製造包括經由一纈胺酸-瓜胺酸(vc)連接子連接單甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatinE)(MMAE)之抗體的抗體接合物(此後稱為MET-IgG-DC)。抗原-結合蛋白結構與vcMMAE之接合係由MET-IgG的部分還原開始,接著與馬來亞醯胺己醯基-Val-Cit-PABC-MMAE(vcMMAE)反應。藉由加入TCEP(TCEP:mAb的莫耳當量為2:1)將MET-IgG (10 mg/mL)部分還原,接著於4°C培養至隔夜。然後將還原反應升溫至25°C。加入vcMMAE至1:10之最終的vcMMAE:還原的Cys莫耳比率,接合所有的硫醇。接合反應係於10% v/v之二甲基乙醯胺(DMA)的存在下進行並於25°C進行60分鐘。
在某些實例中,係製造包括經由一纈胺酸-瓜胺酸(vc)連接子連接單甲基澳瑞他汀E(MMAE)之文中所述MET-結合的IgG(此後稱為MET-IgG)之抗體接合物(ADC)(此後稱為MET-IgG-DC)。抗原-結合蛋白結構與vcMMAE之接合係由MET-IgG的部分還原開始,接著與馬來亞醯胺己醯基-Val-Cit-PABC-MMAE(vcMMAE)反應。藉由加入DTT(DTT:mAb的莫耳當量為100:1)將MET-IgG (10 mg/mL)還原,接著於25°C培養至隔夜。然後將還原的MET-IgG(10 mg/mL)藉由暴露於DHAA再氧化(DHAA:mAb的莫耳當量為10:1),接著於25°C培養2小時。加入vcMMAE至4:1之最終的vcMMAE:mAb莫耳比率,接合所有的硫醇。接合反應係於10% v/v之DMA的存在下進行並於25°C進行3小時。 細胞中的抗體表現
文中亦提供產生表現一抗體(例如,任何文中所述之抗體)之重組細胞的方法,該方法係包括:將一編碼該抗體的核酸導入一細胞,用以產生一重組的細胞;及於足以表現該抗體的條件下培養該重組的細胞。在某些具體實例中,導入步驟係包括將包括一編碼該抗體之核酸的表現載體導入一細胞中,產生一重組的細胞。
任何文中所述之抗體可藉由任何細胞來製造,例如,真核細胞或原核細胞。如文中所述,術語「真核細胞」係指具有明顯的膜結合胞核之細胞。此等細胞可包括,例如,哺乳動物(例如,嚙齒類、非人類靈長類或人類)、昆蟲、真菌或植物細胞。在某些具體實例中,真核細胞為酵母菌細胞,例如釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)。在某些具體實例中,該真核細胞為較高等真核生物,例如哺乳動物、禽類、植物或昆蟲細胞。如文中所述,術語「原核細胞」係指不具有明顯的膜結合胞核之細胞。在某些具體實例中,該原核細胞為細菌細胞。
培養細胞的方法已為本項技術所熟知。細胞可在活體外維養於有利增生、分化和生長之條件下。簡言之,可藉由將細胞(例如,任何細胞)與包括用於以支持細胞存活和生長之必需生長因子和添加物細胞的培養基接觸來培養細胞。
將核酸和表現載體導入細胞(例如,真核細胞)的方法已為本項技術所知。可用於將核酸導入細胞之方法的非限定實例包括脂質轉染、轉染、電穿孔、顯微注射、磷酸鈣轉染、樹枝狀聚合物為基礎的轉染、陽離子聚合物轉染、細胞擠壓、聲穿孔(sonoporation)、光學轉染、穿刺、流體動力學遞送、磁轉染、病毒轉導(例如,腺病毒和慢病毒轉導)和奈米粒子轉染。
文中係提供進一步包括使用本項技術所熟知的技術從細胞(例如,真核細胞)分離抗體之方法(例如,硫酸銨沉澱、聚乙二醇沉澱、離子交換層析(陰離子或陽離子)、以疏水性相互作用為基礎的層析、金屬親和力層析、配體親和力層析和粒徑排阻層析)。 治療方法
文中係提供治療其特徵為具有呈現在癌細胞表面上的MET或MET表位之癌細胞群之癌症的方法,該方法係包括:將一治療上有效量之任何文中所述醫藥組成物或任何文中所述之抗體投予一經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
文中亦提供於一對象中降低腫瘤體積的方法,其中該腫瘤其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群,該方法係包括:將一治療上有效量之任何文中所述醫藥組成物或任何文中所述抗體投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。在任何文中所述方法之某些具體實例中,相較於投予該抗體之前至少一腫瘤(例如,實體腫瘤)之大小,該至少一(例如,1、2、3、4或5)腫瘤(例如,實體腫瘤)之體積或腫瘤位置(例如,轉移位置)係下降(例如,可察覺的下降)至少1%,至少2%,至少3%,至少4%,至少5%,至少6%,至少8%,至少10%,至少12%,至少14%,至少16%,至少18%,至少20%,至少22%,至少24%,至少26%,至少28%,至少30%,至少35%,至少40%,至少45%,至少50%,至少55%,至少60%,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或至少99%)。
文中亦提供於一對象之癌細胞中引發細胞死亡的方法,其中該癌細胞係具有呈現在其表面之MET或MET表位,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述醫藥組成物或任何文中所述抗體投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。在某些具體實例中,所引發的細胞死亡為壞死。在某些具體實例中,所引發的細胞死亡為細胞凋亡。
在任何文中所述方法之某些具體實例中,該癌症為原發性腫瘤。
在任何文中所述方法之某些具體實例中,該癌症為轉移癌症。
在任何文中所述方法之某些具體實例中,該癌症為非-T-細胞-浸潤腫瘤。在任何文中所述方法之某些具體實例中,該癌症為T-細胞-浸潤腫瘤。
文中係提供於一具有癌症的對象中降低發生轉移風險或降低發生另外的轉移風險之方法,其中該癌症其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述醫藥組成物或任何文中所述抗體投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。在某些具體實例中,相較於具有類似癌症但未給予治療或給予不包括投予任何文中所述抗體之對象的風險,在該對象中發生轉移風險或發生另外的轉移風險係下降(例如,可察覺的下降)至少1%,至少2%,至少3%,至少4%,至少5%,至少6%,至少8%,至少10%,至少12%,至少14%,至少16%,至少18%,至少20%,至少25%,至少30%,至少35%,至少40%,至少45%,至少50%,至少55%,至少60%,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或至少99%。
在任何文中所述方法之某些具體實例中,該癌症為非-T-細胞-浸潤腫瘤。在任何文中所述方法之某些具體實例中,該癌症為T-細胞-浸潤腫瘤。在任何文中所述方法之某些具體實例中,該細胞隔室為部分的胞內體/溶酶體路徑。在任何文中所述方法之某些具體實例中,該細胞隔室為胞內體。
術語「對象」係指任何的哺乳動物。在某些具體實例中,對象或適合治療的「對象」可為犬類(例如,狗)、貓科動物(例如,貓)、馬(例如,馬)、綿羊、牛、豬、山羊、靈長類,例如,類人猿(例如,猴(例如,狨猴、狒狒或猿(例如,大猩猩、黑猩猩、紅毛猩猩或長臂猿)或人類;或嚙齒類(例如,小鼠、天竺鼠、倉鼠或大鼠)。在某些具體實例中,對象或「適合治療的對象」可為非人類哺乳動物,尤其是習用上可用作為驗證人類中治療效用之模型的哺乳動物(例如,鼠類、豬、犬類或靈長類動物)。
如文中所述,治療係包括在具有癌症(例如,任何文中所述的癌症)的病患中降低一或多個(例如,2、3、4或5)癌症徵象或徵候的數目、頻率或嚴重度。例如,治療可在具有癌症的病患中降低癌症的進程,降低癌症的嚴重度或降低癌症再復發的風險。
文中係提供於一對象(例如,任何文中所述的對象)中抑制實體腫瘤生長的方法,該方法係包括投予該對象一治療上有效量的任何文中所述之抗體或任何文中所述之醫藥組成物(例如,相較於治療前該對象中實體腫瘤的生長,或在接受不同治療或無接受治療的不同對象中類似的實體腫瘤生長)。
在任何文中所述方法之某些具體實例中,該實體腫瘤的生長為原生的實體腫瘤生長。在任何文中所述方法之某些具體實例中,該實體腫瘤的生長為再復發的實體腫瘤生長。在任何文中所述方法之某些具體實例中,該實體腫瘤的生長為轉移的實體腫瘤生長。在某些具體實例中,治療係造成該對象的實體腫瘤生長約下降1%至約下降99%(或此文中所述範圍之任何子範圍)(例如,相較於治療前該對象中實體腫瘤的生長,或在接受不同治療或無接受治療的不同對象中類似的實體腫瘤生長)。一對象中的實體腫瘤生長可藉由不同的造影方法來評估,例如,正子造影斷層掃描、X-光電腦斷層掃描、電腦軸向斷層掃描和磁振造影。
文中亦提供於一經鑑定具有癌症(例如,任何文中所述的例示癌症)的對象中降低發生轉移風險或在一段期間內降低發生另外的轉移風險之方法,該方法係包括投予該對象一治療上有效量的任何文中所述之蛋白或任何文中所述之醫藥組成物(例如,相較於具有類似癌症並接受不同治療或無接受治療的對象)。在任何文中所述方法之某些具體實例中,轉移或另外的轉移為一或多項轉移至骨骼、淋巴結、腦、肺、肝、皮膚、胸壁包括骨骼、軟骨和軟組織,腹腔、對側乳房、軟組織、肌肉、骨髓、卵巢、腎上腺和胰臟。
在任何文中所述方法之某些具體實例中,一段期間為大約1個月至約3年(例如,約1個月至約2.5年,約1個月至約2年,約2個月至約1.5年,約1個月至約1年,約1個月至約10個月,約1個月至約8個月,約1個月至約6個月,約1個月至約5個月,約1個月至約4個月,約1個月至約3個月,約1個月至約2個月,約2個月至約3年,約2個月至約2.5年,約2個月至約2年,約2個月至約1.5年,約2個月至約1年,約2個月至約10個月,約2個月至約8個月,約2個月至約6個月,約2個月至約5個月,約2個月至約4個月,約2個月至約3個月,約3個月至約3年,約3個月至約2.5年,約3個月至約2年,約3個月至約1.5年,約3個月至約1年,約3個月至約10個月,約3個月至約8個月,約3個月至約6個月,約3個月至約5個月,約3個月至約4個月,約4個月至約3年,約4個月至約2.5年,約4個月至約2年,約4個月至約1.5年,約4個月至約1年,約4個月至約10個月,約4個月至約8個月,約4個月至約6個月,約4個月至約5個月,約5個月至約3年,約5個月至約2.5年,約5個月至約2年,約5個月至約1.5年,約5個月至約1年,約5個月至約10個月,約5個月至約8個月,約5個月至約6個月,約6個月至約3年,約6個月至約2.5年,約6個月至約2年,約6個月至約1.5年,約6個月至約1年,約6個月至約10個月,約6個月至約8個月,約8個月至約3年,約8個月至約2.5年,約8個月至約2年,約8個月至約1.5年,約8個月至約1年,約8個月至約10個月,約10個月至約3年,約10個月至約2.5年,約10個月至約2年,約10個月至約1.5年,約10個月至約1年,約1年至約3年,約1年至約2.5年,約1年至約2年,約1年至約1.5年,約1.5年至約3年,約1.5年至約2.5年,約1.5年至約2年,約2年至約3年,約2年至約2.5年,或約2.5年至約3年)。
在某些具體實例中,在一經鑑定具有癌症的對象中發生轉移風險或在一段期間內發生另外的轉移風險係下降約1%至約99%(例如,或此文中所述範圍之任何子範圍),例如,與具有類似癌症並接受不同治療或無接受治療之對象的風險相比。
癌症的非限定實例包括:急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、腎上腺皮質癌、肛門癌、闌尾癌、星狀細胞瘤、基底細胞癌、腦腫瘤、膽管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、支氣管腫瘤、勃氏淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)、原發病灶不明的癌症、心臟腫瘤、子宮頸癌、脊索瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性腫瘤、大腸癌、大腸直腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、腺管癌、胚胎細胞瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、嗅神經母細胞瘤、纖維性組織細胞瘤、伊文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、眼癌、生殖細胞瘤、膽癌、胃癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸道基質腫瘤、妊娠滋養細胞疾病、神經膠質瘤、頭頸癌、髮細胞白血病、肝細胞癌、組織球增生病、何傑金氏淋巴瘤、下嚥癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎癌、蘭格罕細胞組織球增生症、喉癌、白血病、唇及口腔癌、肝癌、乳小葉原位癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、惡性纖維組織細胞瘤、黑色素瘤、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、間皮瘤、潛藏原發腫瘤之轉移性頸部鱗狀細胞癌、涉及NUT基因之中線癌、嘴部癌症、多發性內分泌腫瘤症候群、多發性骨髓瘤、蕈狀肉芽腫、骨髓增生不良症候群、骨髓增生不良/骨髓增生性腫瘤、鼻腔和副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非何傑金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、非小細胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、軟巢癌、胰臟癌、乳突瘤病、副神經節瘤、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、胸膜肺母細胞瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂和輸尿管癌、視網膜母細胞瘤、類橫紋肌瘤、唾腺癌、塞扎里症候群(Sezary syndrome)、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、脊椎腫瘤、胃癌、T-細胞淋巴瘤、類畸胎腫瘤、睪丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、陰道癌、外陰癌和威爾姆氏腫瘤(Wilms’ tumor)。另外的癌症實例已為本項技術所知。
在某些具體實例中,進一步係投予該病患一或更多種另外的治療劑(例如,一或更多種化療劑、重組的細胞激素或介白素蛋白、激酶抑制劑和檢查點抑制劑)。在某些具體實例中,該一或更多種另外的治療劑係在與任何文中所述之抗體投予該病患大約相同的時間投予該病患。在某些具體實例中,該一或更多種另外的治療劑係在任何文中所述之抗體投予該病患之後投予病患。在某些具體實例中,該一或更多種另外的治療劑係在任何文中所述之抗體投予該病患之前投予病患。
在任何文中所述方法之某些具體實例中,該癌症為實體癌症(例如,乳癌、前列腺癌或非小細胞肺癌)。 親合力(Avidity)
抗體及其抗原結合片段為多價的,且因此包括一個以上的結合位。一般而言,抗體在其結合位的總結合力之量度係稱為親合力。一般而言,術語「倍數親合力」和「選擇性」可指抗體親和力(affinity)和抗體親合力(avidity)之間的倍數差異,例如,如所見當測量具有高目標表現的細胞株上的抗體總結合力 (親合力;例如癌細胞,例如Detroit-562細胞 cells)相較於具有低目標表現的細胞株上的抗體總結合力(親和力,例如非癌細胞,例如HUVEC細胞)時。一般而言,親合力係由四種因子來決定:結合親和力(例如,在個別結合位置的結合力);價數(例如,結合位置的總數);結構排列(例如,抗原和抗體的結構);以及抗原密度(例如,每個細胞的抗原數目)。
文中係提供於一具有癌症的對象中降低發生轉移風險或降低發生另外的轉移風險之方法,其中該癌症其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群,該方法係包括:將一治療上有效量的任何文中所述抗體或任何文中所述醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。在某些具體實例中,文中所述之抗體,相較於非癌細胞,對癌細胞的選擇性可具有至少新的至少5%,至少10%,至少15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少100%,至少105%,至少110%,至少115%,至少120%,至少125%,至少130%,至少135%,至少140%,至少145%,至少150%,至少155%,至少160%,至少165%,至少170%,至少175%,至少18,0%,至少185%,至少190%,至少195%,或至少200%,至少205%,至少210%,至少215%,至少220%,至少225%,至少230%,至少235%,至少240%,至少245%,至少250%,至少255%,至少260%,至少265%,至少270%,至少275%,至少280%,至少285%,至少290%,至少295%,至少300%,至少305%,至少310%,至少315%,至少320%,至少325%,至少330%,至少335%,至少340%,至少345%,至少350%,至少355%,至少360%,至少365%,至少370%,至少375%,至少380%,至少385%,至少390%,至少395%,或至少400%增加。 組成物
文中亦提供包括至少一種任何文中所述之抗體的組成物(例如,醫藥組成物)。在某些具體實例中,組成物(例如,醫藥組成物)可配置於無菌小瓶或預充填注射器中。
在某些具體實例中,組成物(例如,醫藥組成物)係經調配供不同的路徑給藥(例如,靜脈內、皮下、肌肉內或腫瘤內)。在某些具體實例中,組成物(例如,醫藥組成物)可包括醫藥上可接受載劑(例如,磷酸鹽緩衝食鹽水)。依照,例如:所要求的劑量和頻率和病患的耐受性,任何文中所述之醫藥組成物可單次或多次投予一對象。醫藥組成物的劑量應提供足夠的抗體量用以有效治療或改善症狀、疾病或症候。
文中亦提供治療具有癌症(例如,任何文中所述的癌症)之對象的方法,該方法係包括投予一治療上有效量的至少一種文中所述的任何組成物或醫藥組成物。 套組
文中亦提供包括任何文中所述之抗體,任何文中所述之組成物或任何文中所述之醫藥組成物的套組。在某些具體實例中,該套組可包括執行任何文中所述之方法的說明書。在某些具體實例中,該套組可包括至少一劑的任何文中所述之組成物(例如,醫藥組成物)。在某些具體實例中,該套組可提供一注射器供投予任何文中所述之醫藥組成物。
本發明進一步描述於下列的實例中,這些實例並不會限制申請專利範圍中所描述的本發明之範圍。 實例 實例 1. 產生 MET 結合劑和工程改造 pH 結合依賴性
使用二種方法產生對MET具特異性的pH-工程改造抗體。在第一種方法中,係使用已發行的抗MET單株抗體作為導入另外突變的起始模板其能造成與MET之工程改造的pH-依賴結合和i)增進內溶酶體之接合毒素堆積以及ii)增進MET再循環回到細胞表面。第二種方法係涉及經由抗體展現法從帶有定義CDR組成的初始抗體庫或抗體庫找出對MET具特異性的原發(de novo)抗體並於經設計用於選擇對MET具特異性的pH-工程改造抗體之條件下篩選。在任一的情況下,組胺酸殘基在工程改造pH-依賴的結合蛋白中扮演重要角色。
組胺酸殘基由於其6.0的pKa,在低於6.5的pH時會至少部分質子化。因此,若在抗原結合區中組胺酸側鏈係與其抗原參與靜電結合作用,則其在pH 6.5或低於pH 6.5時將開始轉為帶正電。以抗原表位的對應電荷及相互作用為基準,此舉應會弱化或增進在pH低於6.5時相互作用之結合親和力。因此,系統性的將組胺酸導入一抗體或其他結合劑庫(例如,scFv庫)的抗體互補決定區(CDR)可用來鑑別在較低的pH值將會影響抗原結合區與抗原之相互作用的取代。因此第一種方法係涉及用於鑑別pH-依賴變體之已發行單株抗體之可變區序列的組胺酸掃描。
在文獻中已有描述多種MET-結合單株抗體並可用作為工程改造pH-依賴結合之模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。簡言之,就一亞群的抗體序列,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別各鏈中的CDR,且就各CDR,落在任一或二者之Kabat和IMGT CDR定義中的殘基係稱為CDR殘基。以組胺酸系統性取代重鏈及/或輕鏈CDR內的個別的胺基酸殘基,一次一個,用以工程改造pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一重鏈或輕鏈序列變體,及b)對應的起始抗體(例如,起始MET-結合單株抗體)個別的輕鏈或重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重/輕鏈CDR中僅具有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。在一段得以讓蛋白表現的時間後,收集細胞培養上清液,定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)或其他本項技術已知的方法評估變體的pH依賴。簡言之,將細胞培養上清液正常化至50 µg/mL的抗體表現量,並捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用1X動力學緩衝液(Forte Bio)建立基線,並將該感測器與100 nM的MET於pH 7.4之1X PBS中結合300秒,用以產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 5.5或pH 7.4之1X PBS歷時300-500秒。檢驗pH 5.5和pH 7.4時的起始抗體和個對應抗體變體之結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體,由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.5時解離提升(亦即較高的koff值),及b)相較於pH 5.5抗體變體本身及與起始抗體相比,在pH 7.4時解離下降(亦即較低的koff值)。選擇在pH 5.5顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者之變體供進一步分析。亦值得注意的是,當某些組胺酸和丙胺酸突變消除了MET結合的同時,其他的係耐受極小(例如,低於1-倍的KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。特言之,因為組胺酸為大的帶正電之胺基酸,所以將這些不具有改變之組胺酸變體和丙胺酸變體標註為可能耐受廣泛範圍突變的位置並產生帶有不同序列但類似結合性質之抗體(一項不明顯的指定)。大量表現供進一步分析之所選變體並使用蛋白A親和力層析純化。於pH 5.5和pH 7.4使用Biacore (GE Healthcare)測量純化的起始抗體和變體抗體之結合動力學(kon和koff)。亦使用抗體解離速率的比率( pH 7.4的koff除以pH 5.5的koff )作為pH-依賴結合的定量評估;同樣地使用以koff除以kon計算pH 5.5和pH 7.4時的解離常數KD和抗體的解離常數之比率(pH 7.4的KD除以pH 5.5的KD)作為pH-依賴結合的定量評估。選擇解離速率之比率低於起始抗體及/或解離常數之比率低於起始抗體的抗體進行進一步的組合取代評估。合意的組胺酸及/或丙胺酸胺基酸位置亦可組合用以增進pH依賴性;此項可藉由例如,用組合方法和比例方法組合一特定個別提升pH依賴性之重鏈和輕鏈上的組胺酸及/或丙胺酸取代,藉由,例如,用組合方法和比例方法組合修飾的重鏈和輕鏈使得在二鏈上出現組胺酸及/或丙胺酸取代,或其組合來進行。產生此等組合的變體並使用文中所述的方法和策略,或其他本項技術已知的方法和策略就差異的pH依賴性進行檢測/分析。選擇具有低的解離速率比率及/或解離常數比率之抗體變體作為供進一步分析的候選物(此後稱為「對MET具特異性的pH-工程改造抗體」)。
第二種用於選擇對MET具特異性的pH-工程改造抗體之方法係涉及篩選抗體庫用以鑑別出對MET具特異性的原發(de novo) pH-依賴抗體或能作為供工程改造如文中所述pH-依賴結合之模板的抗體。可使用二種抗體庫進行這些選擇:初始噬菌體/酵母菌展現抗體庫(例如,Fab、scFv、VHH、VL或可其他本項技術中已知的)或噬菌體/酵母菌展現庫,其中CDR係經突變用以表現一胺基酸殘基亞群。使用本項技術中已知的方法,針對可溶性重組MET胞外區,對於在pH 5.0時弱結合(例如,從微珠溶離)及在pH 7.4時強結合(例如,與微珠結合)之具有正選擇性的變體,篩選抗體庫。進行3回合的選擇。最後一回合的結合劑係使用ELISA就與人類MET和獼猴MET和小鼠MET結合或經由流式細胞術分析中的平均螢光強度進行篩選。若希望更多具有獼猴和鼠類交叉反應性的結合劑,則最終回的選擇可以在獼猴MET或鼠類MET上進行來替代。將所選的結合蛋白次選殖至哺乳動物的表現載體並在Expi293細胞中表現全長的IgG蛋白或Fc融合物。如文中所述進行BLI分析供選擇pH-依賴的結合劑變體並使用Biacore確認。 實例 2. 活體外驗證 MET pH- 依賴結合, MET pH- 依賴釋放,提升 MET+ 細胞中的內溶酶體遞送,及在暴露於對 MET 具特異性的 pH- 工程改造抗體後,相較於對 MET 具特異性的對照抗體, MET+ 細胞中的 MET 抗原密度增加
如文中所論述,對MET具特異性的pH-工程改造抗體具有在酸性pH(例如,pH 5.0,pH 5.5)MET結合下降,但在較高的pH(例如,pH 7.4)MET結合提升之合意的性質,提高了在生理條件下其於內溶酶體中的堆積。 與細胞上 MET pH- 依賴結合i. ii. iii. iv. v. vi.
進行一細胞 表面結合分析,用以驗證對MET具特異性的pH-工程改造抗體係在中性pH結合細胞表面MET。將一組MET+的人類細胞組合(例如,Hs 746T ATCC Cat#HTB-135,NCI-H441 ATCC Cat#HTB-174,NCI-H820 ATCC Cat#HTB-181)。用於鑑別和定量特定細胞株之基因表現(例如,MET)的方法已為本項技術所知並包括,例如,諮詢Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE;https://portals.broadinstitute.org/ccle)用以確定癌細胞株中特定基因的表現量及/或突變狀態),rtPCR,微陣列,或RNA-Seq分析,或本項技術中已知的抗體之細胞染色(例如,特立妥珠單抗或Cell Signaling Technology Met (D1C2) XP兔mAb Cat#8198,或用於MET之R&D Systems Human GFR/c-MET Antibody Clone#95106 Cat#MAB3582)。將細胞以大約每孔5-10,000個植入150 µL的pH 7.4培養基中並以含有下列其中一種抗體之從1 pM 至1 µM的數種劑量於37℃培養5分鐘(例如,2-倍連續稀釋):對MET具特異性的已知對照抗體(例如,抗體,特立妥珠單抗,艾貝珠單抗,hucMET27Gv1.3,或P3D12),對MET具特異性的pH-工程改造抗體,和適當的同型負對照mAb(例如,Biolegend公司的純化人類IgG1同型對照重組抗體,型號#403501)。在實驗開始前,使用本項技術中已知的方法驗證所有抗體的結合性質。培養5分鐘後,以4%甲醛固定細胞(室溫下20 min)並以適當的螢光團標定的二級抗體(例如,ThermoFisher公司的小鼠抗-人類IgG1 Fc二級抗體,Alexa Fluor 488,型號#A-10631)培養60分鐘。以PBS連續清洗未結合的試劑,並將細胞組使用共軛焦顯微鏡造影。造影分析後,在與對MET具特異性的已知對照抗體以及對MET具特異性的pH-工程改造抗體結合之細胞表面上觀察到明顯的螢光,但在同型負對照抗體上僅觀察到極少的表面結合。就分離pH對表面結合的效應,係以依次於較低的pH(例如,pH 6.5和5.5和5.0)進行的初級抗體培養,重複相同的實驗2次。所產生的共軛焦顯微鏡影像分析在與所有受試的mAb結合之細胞表面上顯現明顯的螢光,但同型負對照抗體除外,且當pH下降時對MET具特異性的pH-工程改造抗體之螢光亦下降。可替代地,藉由流式細胞術使用本項技術中已知的方法分析細胞之平均螢光強度。藉由本項技術中已知的線性回歸方法(例如,Scatchard圖示)測定所分析抗體於中性pH時在細胞上的解離常數KD。綜觀之,結果可顯示pH工程改造過程造成對MET具特異性的pH-工程改造抗體產生,而該抗體結合性質為pH-依賴,且相較於在更酸性的pH,在中性pH更有效結合。其他評估對MET具特異性的pH-工程改造抗體之pH依賴性的方法已為本項技術所知並包括,例如,使用流式細胞術測量抗體表面結合。 pH- 依賴的釋放細胞上的 MET
為了驗證對MET具特異性的pH-工程改造抗體能在中性pH結合後於低pH釋放MET,係使用本項技術中已知的方法(例如,一般描述於Gera N. (2012) PLoS ONE 7(11):e48928中)進行上述細胞表面結合分析之變化版。簡言之,收取適當的MET+細胞株(繼代數低於25)並以每孔50,000個細胞植入U-型底的96-孔微量盤中。試驗3種條件;pH 7.4時之結合和二級染色,pH 5.04時之結合和二級染色,及在pH 7.4接合接著在pH 5.0釋放30分鐘和pH 7.4時之二級染色。檢測對MET具特異性的pH-工程改造抗體以及對MET具特異性的對照抗體二者。依照試驗條件於pH 7.4或5.0以200 μL的FACS緩衝液(1x PBS,含3%的胎牛血清)將細胞清洗2次。將純化的蛋白樣本稀釋成適當pH的FACS緩衝液及加入細胞並使其於冰上結合1小時。以初級抗體培養後如之前將pH 7.4和pH 5.0條件清洗2次,及然後加入溶於適當pH之FACS緩衝液中的100 µl二級大鼠抗-人類Fc AF488 (BioLegend 410706)或以1:50稀釋的其他適合抗體,或以1:50稀釋的抗Myc-標籤小鼠mAb-AF488(Cell Signaling Technologies 2279S),並於冰上培養30分鐘。將pH 5.0釋放條件以pH 7.4的FACS緩衝液沖洗二次及然後再懸浮於100 µl的pH 5.0之FACS緩衝液,並於冰上培養30分鐘,接著如另一種條件所述於pH 7.4的FACS緩衝液中二級染色。如之前將微量盤清洗2次並再懸浮於溶於適當FACS緩衝液之1%多聚甲醛,將其固定供流式細胞分析。於流式細胞儀上(Accuri C6, BD Biosciences)讀取所有的條件。當比對單獨二級,FLl訊號(為平均螢光強度)移動時,觀察到結合。在數據分析後,可測定出對MET具特異性的pH-工程改造抗體以及對MET具特異性的對照抗體二者在中性pH時有效地結合MET+細胞之表面,但對MET具特異性的pH-工程改造抗體在pH 5.0結合性差;同樣地,可測定出對MET具特異性的pH-工程改造抗體在pH 7.4時有效的結合,而然後在pH 5.0時釋放/未結合MET。 相較於對 MET 具特異性的對照抗體,對 MET 具特異性的 pH- 工程改造抗體在 MET+ 細胞中提升內溶酶體遞送 (pHrodo)
為了證明和驗證對MET具特異性的抗體在細胞吸收後達到內溶酶體局部化,係使用本項技術中已知的方法(例如,Mahmutefendic et al., Int. J. Biochem. Cell Bio., 2011)進行一內化分析。簡言之,如文中所述,使用本項技術中已知的方法組合一組高表現MET之人類細胞。植入細胞,以PBS清洗3次,並於37℃於中性pH,添加濃度2 µg/mL對MET具特異性的已知對照抗體(例如,如文中所述),對MET具特異性的pH-工程改造抗體,和適當的同型負對照mAb(例如,如文中所述)的培養基中培養60分鐘。在一細胞亞群中,使用本項技術中已知的方法進行抗體內化和胞內體局部化之驗證;例如,如文中所述以4%甲醛固定細胞,使用TWEEN 20或本項技術中已知的方法滲透化(Jamur MC et al (2010) Permeabilization of cell membranes, Methods Mol Biol. 588:63-6),另外以一胞內體標記染色,例如,螢光RAB11抗體(RAB11抗體,Alexa Fluor 488,3H18L5,ABfinity™兔單株抗體),以適當的螢光標定抗-人類二級抗體染色(例如,如文中所述),及如文中所述,使用共軛焦螢光顯微鏡造影。可使用共軛焦影像之分析來顯示對MET具特異性的pH-工程改造抗體以及對MET具特異性的對照抗體二者在內溶酶體中內化及堆積。
為了驗證對MET具特異性的pH-工程改造抗體相對於對MET具特異性的對照抗體達到提升的內溶酶體堆積,係使用對MET具特異性的已知對照抗體(例如,如文中所述)以及對MET具特異性的pH-工程改造抗體進行一pHrodo-為基礎的內化分析。此分析係利用pHrodo™ iFL(P36014, ThermoFisher),一種隨著pH下降而螢光增加的染劑,使得在中性pH時其細胞外的螢光量係低於酸性pH環境之內溶酶體內的螢光量。簡言之,將適當的MET+細胞株(少於25繼代)懸浮於其重組的培養基中(例如,細胞銀行或細胞銀行數據庫ATCC,DSMZ或ExPASy Cellosaurus)並以2,000,000個細胞/mL之密度,每孔1 mL,植入24-孔盤中。在保持於冰上的同時,於各孔槽中加入1 mL的2x pHrodo iFL-標定抗體(依照製造商的說明書製備),將各孔吸量/混合5次,並將該盤於光-保護環境於冰上培養45分鐘。同樣將一相同但分開的24-孔盤於冰上培養,其係作為無內化的負對照。在培養後,將實驗盤移到37℃的培養箱,負對照盤保持在冰上以延緩或阻斷內化,於指定的時間點採取樣本,製造一內化的時程。將樣本置入U-型底96-孔盤,並經由加入200 µL/孔的冰冷FACS緩衝液中止內化反應。將分析盤以2000xg離心2分鐘,再懸浮於200 µL冰冷FACS緩衝液,再次離心,並再次懸浮於FACS緩衝液中。最後,將樣本載入流式細胞儀,使用符合激發和發射最大化pHrodo iFL紅色染劑之激發和發射波長(分別為566 nm和590 nm),讀取細胞的pHrodo螢光。在完成流式細胞實驗和數據分析後,可觀察到,相對於對MET具特異性的已知對照抗體,以對MET具特異性的pH-工程改造抗體處理的細胞具有較高的pHrodo iFL訊號,其表示相對於對MET具特異性的對照抗體,對MET具特異性的pH-工程改造抗體達到提升的內溶酶體堆積。
可替代地,就驗證相對於對MET具特異性的對照抗體,對MET具特異性的pH-工程改造抗體達到提升的內溶酶體堆積,係進行一上述實驗的變化版。植入MET+細胞,以PBS清洗3次,並於37℃中性pH,添加濃度2 µg/mL對MET具特異性的pH-工程改造抗體或對MET具特異性的對照抗體的培養基中培養60分鐘。培養後,將細胞以PBS清洗3次,固定和滲透化並以一組結合晚期胞內體標記以及溶酶體之適當選擇的抗體染色(例如,RAB7,和LAMP1;Cell Signaling Technology, Endosomal Marker Antibody Sampler Kit #12666;AbCam,抗-LAMP2抗體[GL2A7],ab13524)。初級抗體染色後,將細胞以適當的螢光標定二級抗體之混合物染色(例如,山羊抗-人類IgG (H&L)二級抗體(Alexa Fluor 647),型號#A-21445和Abcam山羊抗-兔IgG H&L (Alexa Fluor 488),型號#ab150077),使用共軛焦螢光顯微鏡造影,及將來自MET-特異性抗體和胞內體標記之訊號共定位的區域具體化並定量。在數據分析後,可揭露出,相對於以對MET具特異性的對照抗體處理的孔槽,在以對MET具特異性的pH-工程改造抗體處理的孔槽中具有增加的內溶酶體和MET-特異性抗體訊號之共定位,可由此驗證,相對於對MET具特異性的對照抗體,對MET具特異性的pH-工程改造抗體達到提升的內溶酶體堆積。 在暴露於對 MET 具特異性的 pH- 工程改造抗體後,相較於 MET 具特異性的對照抗體,在 MET+ 細胞中 MET 抗原密度增加
就驗證以對MET具特異性的pH-工程改造抗體處理之細胞,對比對MET具特異性的對照抗體,不會造成暴露於對MET具特異性的pH-工程改造抗體之細胞表面上MET之量可察覺的降低,或該處理造成暴露於對MET具特異性的pH-工程改造抗體之細胞表面上MET之量較少的下降,係使用流式細胞術進行一抗原密度研究。簡言之,將4.0x10^5個表現MET之細胞植入96-孔盤的每個孔槽的100 µL培養基中。將細胞以1 pM至1 µM之下列各物滴定進行處理:i)對MET具特異性的pH-工程改造抗體,ii)對MET具特異性的第一對照抗體,iii)適當的同型對照物,及iv)未處理的對照物。將細胞於37°C培養2小時,在此點所有的細胞係以200 nM螢光團標定之對MET具特異性的第二對照抗體(例如,如文中所述)於4°C培養30分鐘,而該第二對照抗體係具有不同於對MET具特異性之第一對照抗體的表位(如,例如,以細胞上的競爭結合研究所測),或以對MET具特異性的pH-工程改造抗體於4°C培養30分鐘。在此30-分鐘的培養後,使用例如,流式細胞術,使用本項技術之一般技術者已知的方法,讀取所有細胞的平均螢光強度(MFI)。同時,使用市售的定量套組(例如,BD Biosciences PE藻紅素螢光定量套組,型號#340495)產生可用來定量經處理細胞表面上呈現的MET作為MFI的函數之定量標準曲線;該定量標準曲線係依循製造商的說明書所產生。其他測定細胞表面上之MET絕對數目的方法已為本項技術所知並包括,例如,使用放射性同位素標定的試劑。在分析數據後,可顯露出,相對於同型和未處理的對照組,至少一抗體濃度,以對MET具特異性的對照抗體處理之細胞經歷了其表面上MET之量下降,而以對MET具特異性的pH-工程改造抗體處理的細胞明顯地下降量更小或無下降。 實例 3. MET 具特異性的 pH- 工程改造抗體和對照抗體與細胞毒性藥物之接合
製造包括經由一纈胺酸-瓜胺酸(vc)連接子連接單甲基澳瑞他汀E(MMAE)之文中所述MET-結合IgG(此後稱為MET-IgG)的抗體接合物(ADC)(此後稱為MET-IgG-DC)。抗原-結合蛋白結構與vcMMAE之接合係由MET-IgG的部分還原開始,接著與馬來亞醯胺己醯基-Val-Cit-PABC-MMAE(vcMMAE)反應。藉由加入TCEP(TCEP:mAb的莫耳當量為2:1)將MET-IgG (20 mg/mL)部分還原,接著於0°C培養至隔夜。然後將還原反應升溫至20°C。加入vcMMAE至1:15之最終的vcMMAE:還原的Cys莫耳比率,接合所有的硫醇。接合反應係於10% v/v的DMSO存在下進行並於20°C進行60分鐘。
接合反應後,加入過量的游離N(乙醯基)-半胱胺酸(2當量對比vcMMAE電荷)使未反應的vcMMAE淬滅,產生Cys-Val-Cit-MMAE加合物。Cys淬滅反應係在20°C進行約30分鐘。依下將Cys-淬滅反應混合物純化。亦可使用上述接合方法來接合馬來亞醯胺己醯基單甲基澳瑞他汀F(mcMMAF)與抗原結合蛋白結構。
使用批式純化法純化MET-IgG-DC。將反應混合物以經適量水沖洗的Bu-HIC樹脂(ToyoPearl;Tosoh Biosciences)處理,亦即於混合物中加入7重量份的樹脂。將樹脂/反應混合物攪拌一段適當的時間,並藉由分析式疏水性作用層析監測移除的藥物接合物產物,經由粗聚丙烯過濾器過濾,並以2床體積量的緩衝液沖洗(0.28 M氯化鈉,7 mM磷酸鉀,pH 7)。將組合的濾液和沖洗液組合並以HIC HPLC分析產物性質。將組合的濾液和沖洗液以超過濾/滲濾(UF/DF),以10個滲濾體積的15 nM組胺酸緩衝液,交換成15 mM的pH 6組胺酸。
可使用類似的方法將DNA毒素,例如SG3249和SGD-1910與MET-IgG接合(參見Tiberghien AC et al (2016) Design and Synthesis of Tesirine, a Clinical Antibody−Drug Conjugate Pyrrolobenzodiazepine Dimer Payload, ACS Med Chem Lett 7:983−987)。簡言之,就SG3249,係將MET-IgG(15 mg, 100奈米莫耳)稀釋成含有pH 8.4 10 mM硼酸鈉、2.5 mM EDTA之13.5 mL的還原緩衝液而最終濃度為1.11 mg/mL。加入10 mM的TCEP溶液(1.5莫耳當量/抗體,150奈莫耳,15微升)並將還原溶液於+37°C培養箱中加熱1.5小時。冷卻至室溫後,加入SG3249之DMSO溶液(5莫耳當量/抗體,500奈米莫耳,溶於1.5 mL DMSO)。於室溫將溶液混合1.25小時,然後加入N-乙醯基半胱胺酸(1微莫耳,100微升,10 mM)淬滅接合,並使用裝填Superdex 200 PG之GE Healthcare HiLoadTM 26/600管柱注射至AKTA™ Pure FPLC中,及以2.6 mL/min的無菌過濾磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)溶離。將對應MET-IgG-DC單體波峰的溶離份匯集,使用15 mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO旋轉過濾器濃縮,分析並無菌過濾。於Shimadzu Prominence系統上使用Phenomenex Aeris 3.6u XB-C18 150 x 2.1 mm管柱,以水和乙腈之梯度在280 nm和330 nm (SG3249特異性)於MET-IgG-DC還原樣本上溶離的UHPLC分析,可顯示連接數個分子之SG3249的輕鏈和重鏈混合物,符合每1個抗體對4個分子SG3249之藥物-每抗體比率(DAR)。於Shimadzu Prominence系統上使用Phenomenex Yarra 3u SEC-3000 300 mm x 4.60 mm管柱,以含有200 mM的pH 6.95磷酸鈉、250 mM氯化鉀和10%異丙醇(v/v)之無菌過濾SEC緩衝液於MET-IgG-DC樣本上以280 nm溶離的UHPLC分析可顯現純度超過90%無偵測到雜質的單體。UHPLC SEC分析可測得大於30%之最終MET-IgG-DC產率。
可替代地,經由離胺酸殘基接合毒素和抗體的方法已為本項技術所知(例如,參見Catcott KC et al (2016) Microscale screening of antibody libraries as maytansinoid antibody-drug conjugates, MAbs 8:513-23)。此外,可使用類似上述之方法以雙硫鍵將藥物和毒素與非-IgG型式接合,例如Vh-Fcs。 實例 4. 驗證在 MET+ 細胞中,相較於對 MET 具特異性的對照 ADC ,對 MET 具特異性的 pH- 工程改造 ADC 之提升的細胞毒性
於一組使用文中述方法所選的表現各種抗原密度之MET+細胞(例如,如文中所述)和MET-細胞株(例如,T-47D ATCC Cat#HTB-133)及視需要表現基因轉殖MET的細胞,例如,使用本項技術中已知的方法以MET轉染的HEK293細胞(例如,Expi293™表現系統套組ThermoFisher型號:A14635)上,分別評估對MET具特異性的pH-工程改造ADC(例如,pH-工程改造MET-IgG-DC)和對MET具特異性的對照抗體(例如,對照抗體MET-IgG-DC)二者之細胞毒性活性。就驗證之目的,在使用前,使用本項技術中已知的方法,例如,qPCR、流式細胞術、mRNA RPKM和使用本項技術已知的抗-MET抗體之抗體轉染(例如,如文中所述)檢測所有細胞株的MET表現,接著使用螢光顯微鏡技術、免疫組織化學、流式細胞術、ELISA或其他本項技術中已知的方法染色加以視像化。就評估化合物的細胞毒性,係以每孔150微升的培養基大約10-40,000個植入細胞,然後在分析開始時以四重複以從1pM至1 µM之分級的化合物劑量處理。在加入試驗化合物後,進行96小時的細胞毒性分析。在培養的最後4至6小時期間於各孔槽中加入50微升的刃天青染劑(resazurin dye),用以在培養終了時評估存活的細胞。藉由螢光光譜測定法分別使用波長535 nm和590 nm的激發光和發射光測定染劑還原。就分析,將處理過的細胞之刃天青的還原程度與未處理細胞的刃天青還原程度相比較,並測定細胞毒性的百分比。可替代地,使用WST-8套組,依照製造商的說明書(例如,Dojindo Molecular Technologies型號# CCK-8)測量細胞毒性。使用本項技術中已知的曲線擬合法計算IC50,其為觀察到半數最大致死率時的濃度。在分析數據後,可測定出對MET具特異性的pH-工程改造和對照抗體ADC實質上對於一或更多種MET+細胞株具細胞毒性,但對於 MET-細胞毒性較低。亦可測定出對MET具特異性的pH-工程改造ADC比對MET具特異性的對照抗體對於一或更多種MET+細胞株更具細胞毒性,因為:a)其以一或更多種濃度顯現更深的殺滅,或b)其顯示較低的IC50,或c)其在中性pH(如文中所述)於細胞上顯現較大的解離常數KD除以其在相同細胞上的IC50之比率。
另外,可以二級ADC分析測量對MET具特異性的抗體之細胞毒性活性。二級ADC分析已為本項技術所知(例如,Moradec型號# αHFc-NC-MMAF和型號# αHFc-CL-MMAE,以及相關製造商說明書)。簡言之,此分析係如前面段落來進行,但是以對MET具特異性的ADC取代對MET具特異性的抗體,並評估化合物的細胞毒性,以每孔150微升的培養基大約10-40,000個植入細胞,然後在分析開始時以四重複以從1pM至1 µM(最終培養基中的濃度,已與100 nM(最終培養基中的濃度)的Moradec型號# αHFc-NC-MMAF二級ADC試劑預混合,並於37°C預培養30 min,之後將混合物加到此培養基中)之分級劑量的對MET具特異性之抗體處理。
另外藉由細胞增生分析,應用下列方法(Promega Corp. Technical Bulletin TB288;Mendoza et al., Cancer Res. 62:5485-5488, 2002)測量對MET具特異性的pH-工程改造ADC和對MET接合物具特異性的對照抗體ADC,以及在二級ADC分析中對MET具特異性的抗體之細胞毒殺活性: 1.      將培養基中含有約104個細胞(例如,如文中所述的MET+細胞)之一等份100微升的細胞培養物放置於96-孔不透明壁盤的各孔槽中。 2.      製備含有培養基且無細胞的對照孔槽。 3.      將對MET具特異性的ADC以1pM-1uM之濃度範圍加到實驗孔槽中並培養1-5天。可替代地,在二級的ADC分析中,將100 nM二級ADC試劑(最終的培養基中濃度,Moradec型號# αHFc-NC-MMAF)和對MET具特異性的抗體以以1pM-1uM之濃度範圍(最的終培養基中濃度)預混合並於37°C預培養30 min,之後將混合物加到此培養基中並培養1-5天。 4.      將此盤平衡至室溫歷時大約30分鐘。 5.      加入與存在各孔槽中的細胞培養基相等體積的CellTiter-Glo試劑。 6.      於迴轉式振盪器上將二種內容物混合2分鐘用以引發細胞解離。 7.      將此盤於室溫培養10分鐘,使發光訊號安定。 8.      記錄發光並以圖式提出報告為RLU = 相對發光單位。 實例 5. 驗證在 MET+ 細胞中,相較於對 MET 具特異性的對照 ADC ,對 MET 具特異性的 pH- 工程改造 ADC 之提升的毒素釋放
亦可驗證相較於對MET具特異性的對照抗體ADC(例如,對照抗體MET-IgG-DC),在MET+細胞中對MET具特異性的pH-工程改造ADC(例如,pH-工程改造MET-IgG-DC)增加的毒素釋放。在以如文中所述之對MET具特異性的pH-工程改造和對照抗體ADC處理MET+細胞後,使用LC-MS/MS法定量處理過的MET+細胞中未接合的(亦即釋放的)MMAE(Singh, A.P. and Shah, D.K. Drug Metabolism and Disposition 45.11 (2017):1120-1132.)。使用帶有電灑界面和三段四極桿質譜儀的LC-MS/MS系統。就MMAE之偵測,係使用XBridge BEH Amide管柱(Waters, Milford, MA),其中移動相A為水(含5 mM甲酸銨和0.1%甲酸)及移動相B為95:5乙腈/水(含0.1%甲酸和1 mM甲酸銨),於40°C使用流速0.25 mL/min之梯度。總計層析進行的期間為12分鐘,以二次MRM掃描(718.5/686.5和 718.5/152.1 amu)監測。使用氘化的(d8)MMAE(MCE MedChem Express, Monmouth Junction, NJ)作為內標。首先,藉由將各藥物標準的波鋒面積除以內標所得到的波鋒面積,衍生一用於定量一生物樣本中未接合的MMAE之方程式。然後將所產生的波鋒面積比率作為標準濃度之函數作圖,並將數據點使用線性回歸與曲線擬合。在標準曲線的低、中和上限範圍中包括3個QC樣本,用以評估所開發之標準曲線的預測能力。然後使用所得到的標準曲線推斷生物樣本中觀察的MMAE濃度。就MMAE濃度之測量,係將處理過的細胞樣本沉澱後並以新鮮的培養基重建成25萬個細胞/100 μL之最終濃度。將樣本摻入d8-MMAE(1 ng/mL),之後藉由加入2-倍體積的冰冷甲醇進行細胞解離,接著-20°C之45分鐘的冷凍-解凍循環。藉由於4°C以13,000 rpm離心樣本15分鐘,得到最終的細胞解離物,接著收集上清液。就製備標準品和QC樣本,係將新鮮的細胞懸浮液(0.25 million/100 μl)摻入已知濃度的MMAE和內標準品(d8-MMAE),之後進行一類似上文所提及的細胞解離程序。然後蒸發所產生的細胞解離物並以移動相B重建,之後注射至LC-MS/MS。觀察到經對MET具特異性的pH-工程改造ADC處理的MET+細胞之解離物中未接合的MMAE濃度大於經對MET具特異性的對照抗體ADC處理的MET+細胞中未接合的MMAE濃度。
就微管素-抑制毒素,亦藉由監測細胞存活力和細胞週期階段來評估毒素釋放。將~2.0x10^5 MET+細胞植入96-孔平底盤並以如文中所述對MET具特異性的pH-工程改造和對照抗體ADC處理。處理後,將細胞轉置於96-孔圓底盤中,並將此盤以400 rcf離心2 min,用以傾析出上清液。將傾析過的細胞以Live/Dead eFluor 660染色。然後將細胞離心並以FACS緩衝液(含2%FBS之PBS)清洗,之後以BD Cycletest™ Plus DNA套組(型號# 340242)分析細胞週期分布。簡言之,將細胞再懸浮於76 ul溶液A並於室溫培養10 min。然後加入61 µL溶液 B,並將細胞於室溫另再培養 10 min。最後,加入61 µL冷的溶液C,及再次將細胞於室溫培養 10 min。在最後的培養步驟之後立刻藉由流式細胞術以10 µL/sec的流速分析細胞(無清洗)。相較於對MET具特異性的對照抗體ADC,在暴露於對MET具特異性的pH-工程改造ADC中可觀察到增加的G2/M-期停滯。
就DNA-損傷毒素(例如,吡咯并苯并二氮呯或「PBD」),係藉由測量磷酸化的組織蛋白H2AX (γH2AX)來評估DNA損傷。H2AX一般係回應DNA中雙股破壞而磷酸化;然而,亦可能由於以DNA-交聯的毒素,例如PBD或順鉑(cisplatin)處理而觀察到增加量的γH2AX(Huang, X. et al. 2004, Cytometry Part A 58A, 99–110)。將MET+細胞以如文中所述對MET具特異性的pH-工程改造和對照抗體ADC處理。處理後,以PBS沖洗細胞,及然後於0°C以1%無甲醇的甲醛(Polysciences, Warrington, PA)之PBS溶液於懸浮液中固定15 min。將細胞於-20°C再懸浮於70%乙醇至少2 h。然後以PBS清洗2次並懸浮於0.2% Triton X-100 (Sigma)溶於1% (w/v) BSA溶液(Sigma)之PBS溶液中歷時30 min,用以抑制非特異性Ab結合。再次將細胞離心(200 g, 5 min)並將細胞團塊懸浮於含有1:800稀釋的抗-組織蛋白 γH2AX多株Ab(Trevigen, Gaithersburg, MD)之100 µL的1% BSA中。然後將細胞於4°C培養至隔夜,以PBS清洗2次,並於黑暗室溫下再懸浮於100 µL之1:30稀釋的豬抗-兔免疫球蛋白之FITC-接合F(ab’)2片段(DAKO, Carpinteria, CA)歷時30 min。然後將細胞於室溫以5 µg/mL溶於含有100 µg/mL無DNA酶之RNA酶A(Sigma)之PBS的PI (Molecular Probes, Eugene, OR)對比染色20 min。使用流式細胞術使用本項技術中已知的方法測量FITC γH2AX訊號的細胞螢光和PI對比染色。當在細胞週期之相同階段內比較細胞時(以總DNA含量為基準),相對於未經處理的MET+細胞(作為基線),可觀察到處理過的MET+細胞具有增加的FITC γH2AX訊號。再者,可觀察到經對MET具特異性的pH-工程改造ADC處理過的MET+細胞超過基線之γH2AX增加量係大於經對MET具特異性的對照抗體ADC處理過的細胞。除了γH2AX分析外,DNA交叉連接可更直接以Comet分析來評估(Chandna, S. (2004) Cytometry 61A, 127–133)。
此外,如文中所揭示,在無直接藉由進行二級ADC分析接合取代使用初級接合的ADC下,pH-工程改造和對照抗體可使用此實例中的方法來分析。 實例 6. 在帶有腫瘤動物中驗證,相較於對 MET 具特異性的對照抗體,對 MET 具特異性的 pH- 工程改造抗體之下降的半衰期
本發明所描述之對MET具特異性的pH-工程改造抗體之驚人態樣之一可為其在胞內體或溶酶體內幫助增加抗體從MET解離之能力,使得在帶有腫瘤的動物中相對於對MET具特異性的對照抗體或對MET不具特異性的對照抗體,血清半衰期下降。此下降的血清半衰期係由於對MET具特異性的pH-工程改造抗體一旦與MET結合被腫瘤細胞的細胞內化提升,其從循環中清除的頻率提升,其可隨著時間經由在帶有腫瘤的動物中未結合之對MET具特異性的pH-工程改造抗體之血清濃度下降觀察到。就驗證這些性質,係使用對MET具特異性的pH-工程改造抗體和對MET具特異性的對照抗體使用本項技術中已知的方法於帶有腫瘤的小鼠中進行一系列的研究(例如,Gupta, P., et al. (2016), mAbs, 8:5, 991-997)。簡言之,經由尾靜脈單一靜脈內團注(例如,5 mg/kg)將對MET具特異性的pH-工程改造抗體或對MET具特異性的對照抗體投予2組異種移植MET+細胞(例如,如文中所述)的NOD SCID小鼠(例如,Jackson Labs NOD.CB17-Prkdcscid/J Stock No:001303)。異種移植小鼠係藉由在活體外培養1-5百萬個MET+細胞並皮下接種至小鼠的右脇所製備。腫瘤大小符合300 mm3。經由電子游標尺測量腫瘤的長(L)和寬(W)且體積係根據下列公式來計算:V=L×W^2/2。從各組在下列各時間點經由眼後採血收集血液樣本:15m、30m、1h、8h、24h和3d、7d、10d、14d、17d、21d及28d。處理樣本用以收集血清,並使用ELISA或其他本項技術中已知的方法(例如,PAC分析或MAC分析;Fischer, S.K. et al. (2012), mAbs, 4:5, 623-631,利用,例如抗-人類IgG抗體Jackson ImmunoResearch Labs,型號# 109–006–006)定量抗體濃度。將對MET具特異性的pH-工程改造抗體和對MET具特異性的對照抗體之抗體濃度作為時間函數作圖。在分析數據後,可觀察到相對於對MET具特異性的對照抗體,對MET具特異性的pH-工程改造抗體具有明顯較短的血清半衰期,因此驗證了相對於結合相同抗原但其pH依賴性不同的其他、類似結合劑(例如,對MET具特異性的對照抗體),對MET具特異性的pH-工程改造抗體的pH依賴性幫助提升胞內體或溶酶體內的解離之能力。
此外,可使用上述方法藉由以對MET具特異性的pH-工程改造和對照抗體ADC取代對MET具特異性的pH-工程改造和對照抗體,評估對MET具特異性的pH-工程改造和對照抗體ADC半衰期(亦即,如上所述,研究接合藥物或毒素後的抗體)。 實例 7. 在小鼠異種 移植模型中,對比對 MET 具特異性的對照抗體 ADC ,對 MET 具特異性的 pH- 工程改造 ADC 之增加的效力
對MET具特異性的pH-工程改造ADC對抗MET+腫瘤之提升的抗腫瘤活性可於MET+細胞之皮下異種移植模型中驗證。就實驗而言,係於活體外培養1-5百萬個MET+細胞並以皮下接種至每隻雌性免疫缺陷(例如,SCID-Beige或NOD scid)小鼠的右脇。腫瘤大小符合100-200 mm3,並以腹膜內(IP)給劑(每~4-7天給予1劑,總計~2-6劑)。經由電子游標尺測量腫瘤的長(L)和寬(W)且體積係根據下列公式來計算:V=L×W^2/2。經由尾靜脈團注(例如,5 mg/kg)投予對MET具特異性的pH-工程改造ADC或對MET具特異性的對照抗體ADC。在相同的療程中,相較於投予對MET具特異性的對照抗體ADC,投予對MET具特異性的pH-工程改造ADC之腫瘤生長抑制(TGI)和腫瘤生長延緩(TGD)及存活顯著提升。
視需要,於一犧牲的動物中測定擴散至各組織的腫瘤細胞。根據Schneider, T., et al., Clin. Exp. Metas. 19 (2002) 571-582測量轉移。簡言之,收取組織並藉由即時PCR定量人類Alu序列。藉由即時PCR所定量之較高的人類DNA量係相當於較高程度的轉移。在相同的療程中,相較於經對MET具特異性的對照抗體ADC治療的小鼠,在經對MET具特異性的pH-工程改造ADC治療的動物中人類Alu序列的量(與腫瘤細胞侵入二級組織相關)明顯較低,相當於轉移減低。可替代地,對MET具特異性的pH-工程改造ADC之提升的抗-腫瘤活性可顯示於MET+病患衍生的異種移植模型(例如,可得自The Jackson Laboratory)。 實例 8. 製造 pH- 工程改造雙特異性 MET 雙特異性抗體及與對照的雙特異性抗體相比,驗證例示的性質
就製造帶有修飾毒性和內化性質之對MET具特異性的pH-工程改造抗體,建構一結合MET上二個不同表位的雙特異性抗體。在本項技術中已知雙特異性抗體可顯現增加的抗原-依賴內化作用,且因此可用於,例如抗體-藥物接合物之應用(例如,參見Li et al (2016) A Biparatopic HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate Induces Tumor Regression in Primary Models Refractory to or Ineligible for HER2-Targeted Therapy, Cancer Cell 29:117-29)。簡言之,使用來自二種不同之對MET具特異性的pH-工程改造抗體之輕鏈/重鏈對,組配對MET具特異性的pH-工程改造MET x MET雙特異性、雙互補位抗體,其各自係與MET上彼此表位不重疊的不同表位結合。找出一組結合非重疊表位之對MET具特異性的pH-工程改造抗體,例如,使用文中所述之方法或其他本項技術之一般技術者已知的方法。簡言之,將二種結合劑以其結合實質上MET上的不同表位為基礎做選擇,如,藉由例如,Abdiche YN et al. (2009) Exploring blocking assays using Octet, ProteOn,以及Biacore biosensors, Anal Biochem 386:172-80的結合競爭分析中所測。可替代地,簡言之,如文中所述,將以對MET具特異性的第一抗體轉染之細胞的細胞培養上清液正常化至50 µg/mL之抗體表現量,並捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用1X動力學緩衝液(Forte Bio)建立一基線,並將此感測器與50 nM溶於pH 7.4之1X PBS的MET結合(已混合並以對MET具特異性的第二抗體轉染上清液或對MET具特異性的第一抗體轉染上清液於37℃預培養30 min,二者皆正常化至50ug/mL)歷時300秒,用以產生一結合曲線。若在對MET具特異性的第二抗體之存在下的結合速率明顯比在對MET具特異性的第一抗體之存在下的結合速率更快(如藉由儀器軟體所計算,或由隨著時間升高的結合量看出),則對MET具特異性的第二抗體實際上係與結合MET的非重疊表位。視需要,當各抗體與在表現MET細胞上的表位結合時,篩選其內化性質,並選擇完全內化的抗體。測定呈現於細胞表面上之分子的內化率分析已為本項技術所知。參見,例如,Wiley et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:11083-11094;及Sorkin and Duex (2010) Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter, Unit-15.14;Vainshtein et al. (2015) Pharm Res. 32:286-299。一旦選擇後,就二臂合成帶有用於重鏈和輕鏈配對之工程改造突變的重鏈和輕鏈結構(Spiess et al., “Alternative molecular formats and therapeutic applications of bispecific antibodies,” 2015)。藉由對應重鏈和輕鏈質體,於例如,Expi293細胞內的共表現製造對MET具特異性的雙特異性抗體。收取細胞上清液並進行蛋白A純化。經由另外的純化步驟,例如離子交換層析、疏水作用層析和混合模式的層析將對MET具特異性的異二聚體抗體與同二聚體抗體分離。將純化的對MET具特異性之pH-工程改造MET x MET雙特異性、雙互補位抗體經由質譜定性,用以確認純度和無同二聚體存在並以粒徑排組層析確認單體抗原-結合蛋白結構之存在。就與MET結合的產物抗體係經由Biacore分析確認。其他的雙特異性抗原之製造方法已為本項技術所知並亦可用來製造雙特異性抗體,例如,文中所述之對MET具特異性的MET x MET雙特異性、雙互補位抗體(例如,Labrijn et al (2014) “Controlled Fab-arm exchange for the generation of stable bispecific IgG1” Nature Protcols 9:2450–2463,可查閱http://www.nature.com/nprot/journal/v9/n10/abs/nprot.2014.169.html),對於本項技術之一般技術者應為顯見的。可替代地,取代對MET具特異性的MET x MET抗體,可使用熟習本項技術者了解的類似方法建構對MET具特異性的pH-工程改造MET x BINDER抗體,其中BINDER為任何本項技術中已發行的或使用類似該等文中或該等本項技術中已知的方法所發現的抗體(例如,展現-為基礎或免疫作用-為基礎的方法)。
接著,可使用文中所述的方法驗證對MET具特異性的pH-工程改造MET x MET抗體之例示性質,其中適合的對照物為對MET具特異性的單專一性或雙專一性對照抗體。簡言之,相較於對照物,對MET具特異性的pH-工程改造MET x MET抗體:a)以pH-依賴的方式與細胞結合,例如,在中性pH而非酸性pH下結合,及b)以pH-依賴的方式從細胞釋放,例如在中性pH下結合併於酸性pH下釋放,及c)在MET+細胞中顯現提升的內溶酶體堆積,及d)在暴露於MET+細胞後顯現增加的MET抗原密度,及e)當與毒素接合時,對MET+細胞顯現增加的細胞毒性,及f)當與毒素接合時,在以MET+細胞培養時顯現增加的毒素釋出,及g)在一相關的動物模型中當暴露於MET抗原時,顯現降低的半衰期,及h)當與毒素接合時,在MET+細胞之小鼠異體移模型中顯現增加效用。同樣地,對MET具特異性的pH-工程改造MET x BINDER抗體之例示性質可使用文中所述的方法來驗證,其中適合的對照物為對MET具特異性的MET x BINDER雙專一性對照抗體。 實例 9. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。吾等選擇了特立妥珠單抗(重鏈SEQ ID NO:159,輕鏈SEQ ID NO:160)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將重鏈CDR內的個別胺基酸殘基系統性以組胺酸取代,一次一個,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一重鏈序列變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中僅具有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 384儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,將15µL的細胞培養上清液稀釋成185µL的1x PBST pH 7.4供載入至感測器尖端。此舉產生41.1 µg/mL之高濃度,13.7 µg/mL之低濃度和26.5 µg/mL之平均濃度。然後將此稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H,批號LC11SE2008)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBS歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈變體供進一步分析。亦值得注意的是,當某些組胺酸和丙胺酸突變消除了MET結合的同時,其他的係耐受極小(例如,低於1-倍的KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。
特言之,因為組胺酸為大的帶正電之胺基酸,所以將這些不具有改變之變體標註為重鏈中的位置其可能耐受廣泛範圍突變並產生帶有不同序列但類似結合性質之抗體(一項不甚明顯的選派)。
實例 10. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。吾等選擇了特立妥珠單抗(重鏈SEQ ID NO:159,輕鏈SEQ ID NO:160)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將輕鏈CDR內的個別胺基酸殘基系統性以組胺酸取代,一次一個,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體,及b)對應的起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中僅具有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將此稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50 mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET(cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBS歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之輕鏈變體(例如,MYT2040)供進一步分析。亦值得注意的是,某些組胺酸和丙胺酸突變係耐受極小(例如,低於1-倍的KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。特言之,因為組胺酸為大的帶正電之胺基酸,所以將這些不具有改變之組胺酸變體和丙胺酸變體標註為輕鏈中的位置其可能耐受廣泛範圍突變並產生帶有不同序列但類似結合性質之抗體(一項不甚明顯的選派)。 實例 11. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。吾等選擇了特立妥珠單抗(重鏈SEQ ID NO:159,輕鏈SEQ ID NO:160)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例9中選擇用於進一步分析的重鏈CDR內之個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一重鏈組合序列變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBS歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈組合變體供進一步分析。 實例 12. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。吾等選擇了特立妥珠單抗(重鏈SEQ ID NO:159,輕鏈SEQ ID NO:160)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例10中選擇用於進一步分析的輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈組合序列變體,及b)對應的起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50 mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBS歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之輕鏈組合變體供進一步分析。 實例 13. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。吾等選擇了特立妥珠單抗(重鏈SEQ ID NO:159,輕鏈SEQ ID NO:160)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈和輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例9-12中選擇用於進一步分析的重鏈和輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體或輕鏈組合序列變體,及b)對應的重鏈序列變體或重鏈組合序列變體,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBS歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈和輕鏈變體對供進一步分析(MYT3463、MYT3477、MYT3491、MYT3603、MYT3604、MYT3606、MYT3607、MYT3608、MYT3609、MYT3610、MYT3611、MYT3612、MYT3614、MYT3615、MYT4211、MYT4212、MYT4214、MYT4217和MYT4220)。 實例 14. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。吾等選擇了特立妥珠單抗(重鏈SEQ ID NO:159,輕鏈SEQ ID NO:160)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例9中選擇用於進一步分析的重鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一含有分別描述於(Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)及(Dall, WF et al “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor:Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002);169:5171-5180)之三絞鏈(TH)和YTE突變的重鏈組合變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,使用蛋白A磁珠(Genscript L00273)純化,並於Detroit 562細胞(ATCC CCL-138)上評估內溶酶體遞送。收集Detroit 562細胞(ATCC;CCL-138)並再懸浮於EMEM培養基(ATCC;30-2003)+10% GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS) (Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。然後將細胞稀釋成100,000個細胞/mL並將100 ul植入96-孔平底細胞培養盤,及於37C 5% CO2使其連附至隔夜。然後以原本的培養基將初級抗體稀釋成20 nM及然後以1:1與60 nM Incucyte Human FabFluor-pH Red抗體標定試劑(Sartorius;4722)混合。將混合物於室溫培養20分鐘,接著加到細胞。然後將培養盤立即置入Incucyte S3活細胞分析系統進行影像擷取和分析。檢驗起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體之內溶酶體遞送,提報相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代之提升的內溶酶體遞送。選擇顯示提升的內溶酶體遞送(相較於起始抗體)之重鏈組合變體,例如,如圖1中所示,供進一步分析。使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估所選的變體之pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4或pH 5.4之1X PBST歷時300-600秒。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈組合變體,例如,如圖2中所示,供進一步分析。 實例 15. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。吾等選擇了特立妥珠單抗(重鏈SEQ ID NO:159,輕鏈SEQ ID NO:160)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例10中選擇用於進一步分析的輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈組合序列變體,和b)一含有分別描述於(Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)和(Dall, WF et al “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor:Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002);169:5171-5180)之三重絞鏈(TH)和YTE突變的對應起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中帶有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,使用蛋白A磁珠(Genscript L00273)純化,並於Detroit 562細胞(ATCC CCL-138)上評估內溶酶體遞送。收集Detroit 562細胞 (ATCC;CCL-138)並再懸浮於EMEM培養基(ATCC;30-2003) + 10% GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS) (Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。然後將細胞稀釋成100,000個細胞/mL並將100 μl植入96-孔平底細胞培養盤,及於37C 5% CO2使其連附至隔夜。然後以原本的培養基將初級抗體稀釋成20 nM及然後以1:1與60 nM Incucyte Human FabFluor-pH Red抗體標定試劑(Sartorius;4722)混合。將混合物於室溫培養20分鐘,接著加入細胞中。然後將培養盤立即置入Incucyte S3活細胞分析系統進行影像擷取和分析。檢驗起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體之內溶酶體遞送,提報相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代之提升的內溶酶體遞送。 實例 16. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” US Patent Application US 2020/0061204 A1 (2020))。吾等選擇了艾貝珠單抗(重鏈SEQ ID NO:161,輕鏈SEQ ID NO:162)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將重鏈CDR內的個別胺基酸殘基,一次一個,以組胺酸系統性取代,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一重鏈序列變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中僅帶有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體之pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈變體,供進一步分析(例如,MYT2319)。亦值得注意的是,當某些組胺酸和丙胺酸突變消除了MET結合的同時(例如,MYT2341),其他的係耐受極小(例如,低於1-倍的解離常數KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。
特言之,因為組胺酸為大的帶正電之胺基酸,所以將這些不具有改變之變體標註為重鏈中的位置其可能耐受廣泛範圍突變並產生帶有不同序列但類似結合性質之抗體(一項不甚明顯的選派)。 實例 17. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate“美國專利申請案US 2020/0061204 A1 (2020))。吾等選擇了艾貝珠單抗(重鏈SEQ ID NO:161,輕鏈SEQ ID NO:162)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136) 所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將輕鏈CDR內的個別胺基酸殘基,一次一個,以組胺酸系統性取代,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體,及b)對應的起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中僅帶有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4或pH 5.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於ABPC(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之輕鏈變體供進一步分析(例如,MYT3978)。亦值得注意的是,某些組胺酸和丙胺酸突變係耐受極小(例如,低於1-倍解離常數KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。特言之,因為組胺酸為大的帶正電之胺基酸,所以將這些不具有改變之變體標註為輕鏈中的位置其可能耐受廣泛範圍突變並產生帶有不同序列但類似結合性質之抗體(一項不甚明顯的選派)。 實例 18. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate”美國專利申請案US 2020/0061204 A1 (2020))。吾等選擇了艾貝珠單抗(重鏈SEQ ID NO:161,輕鏈SEQ ID NO:162)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例16中選擇用於進一步分析的重鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一重鏈組合序列變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中帶有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體之pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4的1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈組合變體,供進一步分析(例如,MYT2850、MYT2861)。 實例 19. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” 美國專利申請案US 2020/0061204 A1 (2020))。吾等選擇了艾貝珠單抗(重鏈SEQ ID NO:161,輕鏈SEQ ID NO:162)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例17中選擇用於進一步分析的輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體,及b)對應的起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中僅帶有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體之pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈組合變體,供進一步分析(例如,MYT4326)。 實例 20. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate” 美國專利申請案US 2020/0061204 A1 (2020))。吾等選擇了艾貝珠單抗(重鏈SEQ ID NO:161,輕鏈SEQ ID NO:162)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈和輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例16-19中選擇用於進一步分析的重鏈和輕鏈CDR內的個別胺基酸殘基,一次二或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體或輕鏈組合序列變體,及b)一重鏈序列變體或重鏈組合序列變體,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生帶有二或多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。 讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體之pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈和輕鏈變體對,供進一步分析(例如,MYT3999、MYT4001、MYT4007、MYT4010、MYT4011、MYT4012、MYT4013、MYT4014、MYT4015、MYT4016、MYT4017、MYT4018、MYT4019、MYT4023、MYT4032、MYT4034、MYT4040)。 實例 21. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Feng Y et al. “MET Antibody Drug Conjugate”美國專利申請案US 2020/0061204 A1 (2020))。吾等選擇了艾貝珠單抗(重鏈SEQ ID NO:161,輕鏈SEQ ID NO:162)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例16中選擇用於進一步分析的重鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一含有分別描述於(Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)和(Dall, WF et al “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor:Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002);169:5171-5180)之三絞鏈(TH)和YTE突變的重鏈組合變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR帶有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,使用蛋白A磁珠(Genscript L00273)純化,並於Detroit 562細胞(ATCC CCL-138)上評估內溶酶體遞送。收集Detroit 562細胞(ATCC;CCL-138)並再懸浮於EMEM培養基(ATCC;30-2003) + 10% GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS) (Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。然後將細胞稀釋成100,000個細胞/mL並將100 ul植入96-孔平底細胞培養盤,及於37C 5% CO2使其連附至隔夜。然後以原本的培養基將初級抗體稀釋成20 nM及然後以1:1與60 nM Incucyte Human FabFluor-pH Red抗體標定試劑(Sartorius;4722)混合。將混合物於室溫培養20分鐘,接著加入細胞中。然後將培養盤立即置入Incucyte S3活細胞分析系統進行影像擷取和分析。檢驗起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體之內溶酶體遞送,提報相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代之提升的內溶酶體遞送。 實例 22. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Hicks, SW and Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof”國際專利申請案WO 2020/014306 A1 (2020))。吾等選擇了hucMET27Gv1.3(重鏈SEQ ID NO:225,輕鏈SEQ ID NO:235)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將重鏈CDR內的個別胺基酸殘基以組胺酸系統性取代,一次一個,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一重鏈序列變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中僅具有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 384儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈變體,供進一步分析。亦值得注意的是,當某些組胺酸和丙胺酸突變消除了MET結合的同時,其他的係耐受極小(例如,低於1-倍的解離常數KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。
特言之,因為組胺酸為大的帶正電之胺基酸,所以將這些不具有改變之變體標註為重鏈中的位置其可能耐受廣泛範圍突變並產生帶有不同序列但類似結合性質之抗體(一項不甚明顯的選派)。 實例 23. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Hicks, SW and Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof” 國際專利申請案WO 2020/014306 A1 (2020))。吾等選擇了hucMET27Gv1.3(重鏈SEQ ID NO:225,輕鏈SEQ ID NO:235)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將輕鏈CDR內的個別胺基酸殘基以組胺酸系統性取代,一次一個,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體,及b)對應的起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中僅具有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之輕鏈變體,供進一步分析。亦值得注意的是,某些組胺酸和丙胺酸突變耐受極小(例如,低於1-倍的解離常數KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。特言之,因為組胺酸為大的帶正電之胺基酸,所以將這些不具有改變之變體標註為輕鏈中的位置其可能耐受廣泛範圍突變並產生帶有不同序列但類似結合性質之抗體(一項不甚明顯的選派)。 實例 24. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Hicks, SW and Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof”國際專利申請案WO 2020/014306 A1 (2020))。吾等選擇了hucMET27Gv1.3(重鏈SEQ ID NO:225,輕鏈SEQ ID NO:235)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例22中選擇用於進一步分析的重鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一重鏈組合序列變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈組合變體,供進一步分析。 實例 25. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Hicks, SW and Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof”國際專利申請案WO 2020/014306 A1 (2020))。吾等選擇了hucMET27Gv1.3(重鏈SEQ ID NO:225,輕鏈SEQ ID NO:235)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例23中選擇用於進一步分析的輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈組合序列變體,及b)對應的起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4時顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之輕鏈組合變體,供進一步分析(例如,MYT4230)。 實例 26. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Hicks, SW and Lai, K “MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof”國際專利申請案WO 2020/014306 A1 (2020))。吾等選擇了hucMET27Gv1.3(重鏈SEQ ID NO:225,輕鏈SEQ ID NO:235)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例22中選擇用於進一步分析的重鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一含有分別描述於(Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)和(Dall, WF et al “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor:Biological Consequences“ The Journal of Immunology (2002);169:5171-5180)之三絞鏈(TH)和YTE突變的重鏈組合變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,使用蛋白A磁珠(Genscript L00273)純化,並於Detroit 562細胞(ATCC CCL-138)上評估內溶酶體遞送。收集Detroit 562細胞(ATCC;CCL-138)並再懸浮於EMEM培養基(ATCC;30-2003) + 10% GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS) (Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。然後將細胞稀釋成100,000個細胞/mL並將100 ul植入96-孔平底細胞培養盤,及於37C 5% CO2使其連附至隔夜。然後以原本的培養基將初級抗體稀釋成20 nM及然後以1:1與60 nM Incucyte Human FabFluor-pH Red抗體標定試劑(Sartorius;4722)混合。將混合物於室溫培養20分鐘,接著加入細胞中。然後將培養盤立即置入Incucyte S3活細胞分析系統進行影像擷取和分析。檢驗起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體之內溶酶體遞送,提報相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代之提升的內溶酶體遞送。 實例 27. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Hicks, SW and Lai, K "MET Antibodies and Immunoconjugates and uses thereof"國際專利申請案WO 2020/014306 A1 (2020))。吾等選擇了hucMET27Gv1.3(重鏈SEQ ID NO:225,輕鏈SEQ ID NO:235)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例23中選擇用於進一步分析的輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈組合序列變體,及b)一含有分別描述於(Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)和(Dall, WF et al “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor:Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002);169:5171-5180)之三絞鏈(TH)和YTE突變的對應起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,使用蛋白A磁珠(Genscript L00273)純化,並於Detroit 562細胞(ATCC CCL-138)上評估內溶酶體遞送。收集Detroit 562細胞 (ATCC;CCL-138)並再懸浮於EMEM培養基(ATCC;30-2003) + 10% GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS) (Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。然後將細胞稀釋成100,000個細胞/mL並將100 ul植入96-孔平底細胞培養盤,及於37C 5% CO2使其連附至隔夜。然後以原本的培養基將初級抗體稀釋成20 nM及然後以1:1與60 nM Incucyte Human FabFluor-pH Red抗體標定試劑(Sartorius;4722)混合。將混合物於室溫培養20分鐘,接著加入細胞中。然後將培養盤立即置入Incucyte S3活細胞分析系統進行影像擷取和分析。檢驗起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體之內溶酶體遞送,提報相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代之提升的內溶酶體遞送。選擇顯示提升的內溶酶體遞送(相較於起始抗體)之輕鏈組合變體,供進一步分析。使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估所選的變體之pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4或pH 5.4之1X PBST歷時300-600秒。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之輕鏈組合變體,供進一步分析。 實例 28. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559)。吾等選擇了P3D12(重鏈SEQ ID NO:163,輕鏈SEQ ID NO:164)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136) 所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將重鏈CDR內的個別胺基酸殘基以組胺酸系統性取代,一次一個,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一重鏈序列變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中僅具有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈變體,供進一步分析(例如,MYT3698和MYT3701)。亦值得注意的是,某些組胺酸和丙胺酸耐受極小(例如,低於1-倍的解離常數KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。 實例 29. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559)。吾等選擇了P3D12(重鏈SEQ ID NO:163,輕鏈SEQ ID NO:164)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將輕鏈CDR內的個別胺基酸殘基以組胺酸系統性取代,一次一個,產生pH-依賴的序列變體。。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體,及b)對應的起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中僅具有一個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之輕鏈變體,供進一步分析(例如,MYT3735和MYT3740)。亦值得注意的是,某些組胺酸和丙胺酸突變耐受極小(例如,低於1-倍的解離常數KD或解離速率變化)或無MET結合動力學變化。特言之,因為組胺酸為大的帶正電之胺基酸,所以將這些不具有改變之變體標註為輕鏈中的位置其可能耐受廣泛範圍突變並產生帶有不同序列但類似結合性質之抗體(一項不甚明顯的選派)。 實例 30. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559)。吾等選擇了P3D12(重鏈SEQ ID NO:163,輕鏈SEQ ID NO:164)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例28中選擇用於進一步分析的重鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。To 藉由將Expi293細胞以a)一重輕鏈組合序列變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR中具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST(50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(亦即,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈組合變體,例如,如圖3A-3C中所示,供進一步分析(例如,MYT4313)。 實例 31. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559)。吾等選擇了P3D12(重鏈SEQ ID NO:163,輕鏈SEQ ID NO:164)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例29中選擇用於進一步分析的輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈組合序列變體,及b)對應的起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR中具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈組合變體,供進一步分析(例如,MYT4247)。 實例 32. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559)。吾等選擇了P3D12(重鏈SEQ ID NO:163,輕鏈SEQ ID NO:164)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈和輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例28-31中選擇用於進一步分析的重鏈和輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體或輕鏈組合序列變體,及b)一重鏈序列變體或重鏈組合序列變體,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4或pH 5.4之1X PBST歷時300-600秒。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈和輕鏈變體對,例如,如圖4A-4D中所示,供進一步分析(例如,MYT5342、MYT5343、MYT5344、MYT5345、MYT5346、MYT5350、MYT5351、MYT5352、MYT5353、MYT5354、MYT5355、MYT5356、MYT5357、MYT5359、MYT5360、MYT5366、MYT5367、MYT5369、MYT5370、MYT5372、MYT5373、MYT5375、MYT5376和MYT5381)。 實例 33. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559)。吾等選擇了P3D12(重鏈SEQ ID NO:163,輕鏈SEQ ID NO:164)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例28中選擇用於進一步分析的輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一含有分別描述於(Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000) and (Dall, WF et al “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor:Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002);169:5171-5180)之三絞鏈(TH)和YTE突變的重鏈組合變體,及b)對應的起始抗體輕鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在重鏈CDR具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,使用蛋白A磁珠(Genscript L00273)純化,並於Detroit 562細胞(ATCC CCL-138)上評估內溶酶體遞送。簡言之,收集Detroit 562細胞 (ATCC;CCL-138)並再懸浮於EMEM培養基(ATCC;30-2003) + 10% GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS)(Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。然後將細胞稀釋成100,000個細胞/mL並將100 ul植入96-孔平底細胞培養盤,及於37C 5% CO2使其連附至隔夜。然後以原本的培養基將初級抗體稀釋成20 nM及然後以1:1與60 nM Incucyte Human FabFluor-pH Red抗體標定試劑(Sartorius;4722)混合。將混合物於室溫培養20分鐘,接著加入細胞中。然後將培養盤立即置入Incucyte S3活細胞分析系統進行影像擷取和分析。檢驗起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體之內溶酶體遞送,提報相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代之提升的內溶酶體遞送。選擇顯示提升的內溶酶體遞送(相較於起始抗體)之重鏈組合變體,供進一步分析。使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估所選的變體之pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4或pH 5.4之1X PBST歷時300-600秒。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(亦即,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之重鏈組合變體,供進一步分析。 實例 34. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板(Fujita, R et al (2020) A Novel Non-Agonist c-Met Antibody Drug Conjugate with Superior Potency Over a c-Met Tyrosine Kinase Inhibitor in c-Met Amplified and Non-Amplified Cancers, Cancer Biology and Therapy, 21(6):549-559)。吾等選擇了P3D12(重鏈SEQ ID NO:163,輕鏈SEQ ID NO:164)作為經由組胺酸掃描用於pH工程改造之MET-結合單株抗體。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。將先前於實例29中選擇用於進一步分析的輕鏈CDR內的個別胺基酸突變,一次二個或更多個系統性組合,產生pH-依賴的序列變體。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈組合序列變體,及b)含有分別描述於(Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)和(Dall, WF et al “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor:Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002);169:5171-5180)之三絞鏈(TH)和YTE突變的對應起始抗體重鏈,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生在輕鏈CDR具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,使用蛋白A磁珠(Genscript L00273)純化,並於Detroit 562細胞(ATCC CCL-138)上評估內溶酶體遞送。簡言之,收集Detroit 562細胞 (ATCC;CCL-138)並再懸浮於EMEM培養基(ATCC;30-2003) + 10% GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS) (Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。然後將細胞稀釋成100,000個細胞/mL並將100 ul植入96-孔平底細胞培養盤,及於37C 5% CO2使其連附至隔夜。然後以原本的培養基將初級抗體稀釋成20 nM及然後以1:1與60 nM Incucyte Human FabFluor-pH Red抗體標定試劑(Sartorius;4722)混合。將混合物於室溫培養20分鐘,接著加入細胞中。然後將培養盤立即置入Incucyte S3活細胞分析系統進行影像擷取和分析。檢驗起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體之內溶酶體遞送,提報相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代之提升的內溶酶體遞送。選擇顯示提升的內溶酶體遞送(相較於起始抗體)之輕鏈組合變體,供進一步分析。使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估所選的變體之pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4或pH 5.4之1X PBST歷時300-600秒。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。選擇在pH 5.4顯示解離提升或在pH 7.4時顯示解離下降或二者(與起始抗體相比)之輕鏈組合變體,供進一步分析。 實例 35. 重構 (reformatting) -MET 抗體
選擇產生pH工程改造抗-MET變體為野生型IgG1分子(例如,實例9-13,16-2 0,22-25和28-32)和含有如(Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000)中所述之三絞鏈(TH),及如(Dall, WF et al “Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc Receptor:Biological Consequences” The Journal of Immunology (2002);169:5171-5180)所述之YTE突變的IgG1分子,藉由將Expi293細胞以編碼可變重鏈區的質體轉染,而該可變區係基因上與人類IgG1 Fc(有或無TH和YTE突變)融合。將Expi293細胞以a)由可變重鏈區和相當於野生型人類IgG1同型或相同的序列但帶有TH和YTE突變之恆定區所組成的重鏈序列,及b)一輕鏈序列,使用本項技術中已知的方法共轉染。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET (cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST 中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBST歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於其對應的起始抗體,在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),b)相較於pH 5.4時抗體變體本身,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值),及c)將野生型人類IgG1抗體與其含有TH和YTE的變體相比。野生型人類IgG1及含有TH和YTE突變的重構人類IgG1抗體顯示明顯類似的結合和解離曲線。從此數據吾等結論出,無論是IgG1模式或是帶有TH和YTE突變的IgG1模式保留了變體可變區序列之所希望的性質,包括(但不限於)pH依賴性和內溶酶體遞送。 實例 36. 定性 pH 工程改造的抗 -MET 抗體之細胞內化和內溶酶體遞送
於U-87 MG細胞(MET+)、SNU-5細胞(MET+)、NCI-H1373細胞(MET+)、NCI-H1573細胞(MET+)及/或Detroit 562細胞(MET+)中,將來自實例9-13,16-20,22-25和28-31所選擇的抗-MET pH工程改造抗體變體進行內化和內溶酶體遞送分析。收集U-87 MG細胞(ATCC HTB-14)、Detroit 562細胞(ATCC CCL-138)、NCI-H1373細胞(ATCC CRL-5866)、NCI-H1573細胞(ATCC CRL-5877)或SNU-5細胞(ATCC CRL-5973)並再懸浮於EMEM培養基(U-87 MG 和Detroit 562,ATCC;30-2003)、IMDM培養基(SNU-5,ATCC;30-2005)或RPMI培養基(NCI-H1373和NCI-H1573,ATCC 30-2001)加上5% (NCI-H1573)、10% (U-87 MG,Detroit 562,NCI-H1373)或20% (SNU-5) GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS)(Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。將細胞稀釋成200,000個細胞/mL並以50 µl/孔植入96-孔平底細胞培養盤(Genesee Scientific;25-109)。以原本的培養基稀釋抗-MET pH工程改造抗體變體,起始抗體,對照IgG1同型對照物(BP0297, Bioxcell)和媒劑對照物,及然後以1:1與3x莫耳比率Zenon pHrodo iFL人類IgG標定試劑(ThermoFisher;Z25611)混合。於室溫將混合物培養20分鐘,接著以1:1加入細胞,最終體積100 µL。將細胞、抗-MET抗體變體和Zenon pHrodo iFL人類IgG標定試劑之混合物於37°C、5% CO2培養1-24小時。培養後,將100 µL的pH 7.4冰冷流式細胞(FC)緩衝液(磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS) + 2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) + 2% (v/v) HI FBS加入各孔槽中。然後將細胞於4°C以2000 rpm離心2 min,以200 µL冰冷FC緩衝液清洗並再懸浮於100 µL冰冷FC緩衝液。使用BD Accuri C6流式細胞儀偵測平均綠色螢光強度。使用Flowjo分析軟體分析數據。pHrodo green為在胞內體和溶酶體之低pH環境發出螢光之pH敏感性染劑,且因此可用於定量抗體內化和內溶酶體遞送。藉由pHrodo green平均螢光強度測量在U-87 MG (MET+)、Detroit 562 (MET+)、SNU-5 (MET+)、NCI-H1573 (MET+)或NCI-H1373 (MET+)細胞中各濃度之抗-MET起始抗體和變體之內化和內溶酶體遞送。相對於其對應的起始抗體,數種pH工程改造抗-MET抗體變體顯示增加的平均螢光強度,其係驗證在較低pH時增加的解離,導致提升的內化和細胞內的內溶酶體遞送,如增加的螢光或相較於IgG1同型對照物螢光增加所示。就各柱體上方的pH工程改造抗-MET抗體變體,將增加的內溶酶體遞送加以定量,比率為:變體的平均螢光強度減去IgG對照物的平均螢光強度,然後除以變體的對照起始抗體平均螢光強度減去IgG對照物的平均螢光強度。例如MYT2040、MYT3609、MYT3611和MYT3615,特立妥珠單抗之抗體變體,相對於特立妥珠單抗(MYT0886),顯示增加的內化和內溶酶體遞送。例如MYT2319、MYT2850、MYT2861和MYT4326,艾貝珠單抗之抗體變體,相對於艾貝珠單抗,顯示增加的內化和內溶酶體遞送。例如MYT3698、MYT3735、MYT3740、MYT4247和MYT4325,P3D12之抗體變體,相對於P3D12,顯示增加的內化和內溶酶體遞送。選擇相對於其起始抗體,帶有增加的平均螢光強度之此等pH工程改造抗-MET抗體變體供進一步的分析。 實例 37. -MET mAb 之熱安定性
經由使用差異性掃描螢光法(DSF)測量蛋白熔解溫度(Tm)。DSF係藉由測量來自分子Sypro Orange (Thermo Scientific 型號S6650)之螢光訊號,將蛋白解折疊具體化,因為蛋白折疊係由於熱所致。因蛋白折疊,其將更多的親水區暴露於Sypro Orange染劑,該染劑轉而與這些親水區結合,造成訊號增加。蛋白的Tm經計算為半數最大解折疊轉變並可藉由第一衍生的Sypro Orange訊號作圖和找出此衍生圖之局部最大值加以具體化。將20 µL溶於pH 7.4的1xPBS之蛋白樣本與5 µL的25X Sypro Orange主混合液混合,產生5x Sypro Orange之最終濃度。將樣本加入96-孔PCR盤(Thermo Scientific Cat. No. AB-2400/W)並以光保護蓋(Thermo Scientific 型號4360954)密封。將PCR盤插入即時PCR機(Thermo Scientific Quant Studio 3)並將此盤的溫度於25°C穩定3分鐘,之後以0.2°C增加量,穩定1秒,之後測量Sypro Orange訊號,漸增至95°C。測定抗-MET起始抗體和變體的熔解溫度(Tm)值。數種變體顯示與其起始抗體類似的熔解溫度值,其確認了相較於其對應的起始抗體(例如,艾貝珠單抗、hucMET27Gv1.3或P3D12),經由pH工程改造所創造的變體在功能上保留適當的熱安定性。所有的受試變體具有大於或等於其對應起始抗體(例如,米維妥昔單抗(mirvetuximab))之熔解溫度減去10°C的熔解溫度且因此選用供進一步的分析。
文中的發現與其他抗原,例如CLEC12a和二種其他標靶上的類似工程改造相反,其中每個標靶的多種變體在低pH時顯示提升的解離,儘管這些變體的有利pH-依賴結合性質(特異性結合CLEC12a和二種其他標靶),當相較於對應的起始抗體(例如,起始抗體),其在細胞內化和內溶酶體遞送具有低於10%增加。這些變體(特異性結合CLEC12a和二種其他標靶)亦具有與對應的起始抗體(例如,起始抗體)類似的生物物理學特性(例如,抗體表現,熱安定性,在pH 7.4的親和力等),其確認了此項並非針對受試變體的生物物理學性質 (亦即,生物物理學與在pH 5.4時提昇的解離不相關)。 實例 38. 定性 MYT5351 恆定區取代
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸(例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT5351係包括一包含SEQ ID NO:5的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:6的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:35之重鏈和SEQ ID NO:41之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:36和輕鏈:SEQ ID NO:4)1;三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:37之重鏈和SEQ ID NO:41之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:35之重鏈和SEQ ID NO:42之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:36之重鏈和SEQ ID NO:42之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:37之重鏈和SEQ ID NO:42之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:38之重鏈和SEQ ID NO:41之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:39之重鏈和SEQ ID NO:41之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:40之重鏈和SEQ NO:41之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 39.MYT4313 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如,接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸(例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4313係包括一包含SEQ ID NO:7的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:8的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:43之重鏈和SEQ ID NO:49之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:44和輕鏈:SEQ ID NO:49);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:45之重鏈和SEQ ID NO:49之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:43之重鏈和SEQ ID NO:50之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代和V205取代(SEQ NO:44之重鏈和SEQ ID NO:50之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代和V205C取代(SEQ ID NO:45之重鏈和SEQ ID NO:50之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:46之重鏈和SEQ ID NO:49之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代和A118C取代(SEQ ID NO:47之重鏈和SEQ ID NO:49之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代和A118C取代(SEQ ID NO:48之重鏈和SEQ NO:49之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 40.MYT4325 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4325係包括一包含SEQ ID NO:9的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:10的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:51之重鏈和SEQ ID NO:57之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:51和輕鏈:SEQ ID NO:57);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:51之重鏈和SEQ ID NO:57之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:51之重鏈和SEQ ID NO:58之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:52之重鏈和SEQ ID NO:58之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:53之重鏈和SEQ ID NO:58之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:54之重鏈和SEQ ID NO:57之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:55之重鏈和SEQ ID NO:57之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:56之重鏈和SEQ NO:57之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 41.MYT4826 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4826係包括一包含SEQ ID NO:11的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:12的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:59之重鏈和SEQ ID NO:65之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:60和輕鏈:SEQ ID NO:65);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:61之重鏈和SEQ ID NO:65之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:59 之重鏈和SEQ ID NO:66之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代和V205取代(SEQ NO:60之重鏈和SEQ ID NO:66之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:61之重鏈和SEQ ID NO:66之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:62之重鏈和SEQ ID NO:65之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:63之重鏈和SEQ ID NO:65之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:64之重鏈和SEQ NO:65之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 42.MYT4837 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如,接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4837係包括一包含SEQ ID NO:13的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:14的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:67之重鏈和SEQ ID NO:73之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:68和輕鏈:SEQ ID NO:73);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:69之重鏈和SEQ ID NO:73之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:67之重鏈和SEQ ID NO:74之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(之重鏈SEQ NO:68和之輕鏈SEQ ID NO:74);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:69之重鏈和SEQ ID NO:74之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO之重鏈:70和SEQ ID NO:73之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:71之重鏈和SEQ ID NO:73之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:72之重鏈和SEQ NO:73之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 43.MYT4849 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如,接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸 (例如,「LS」取代)。
因此,MYT4849係包括一包含SEQ ID NO:15的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:16的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:75之重鏈和SEQ ID NO:81之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:76和輕鏈:SEQ ID NO:81);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:77之重鏈和SEQ ID NO:81之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:75之重鏈和SEQ ID NO:82之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:76之重鏈和SEQ ID NO:82之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:77之重鏈和SEQ ID NO:82之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:78之重鏈和SEQ ID NO:11之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:79之重鏈和SEQ ID NO:81之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:80之重鏈和SEQ NO:81之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 44.MYT4942 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如,接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4942係包括一包含SEQ ID NO:17的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:18的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:83之重鏈和SEQ ID NO:89之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:84和輕鏈:SEQ ID NO:89);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:85之重鏈和SEQ ID NO:89之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:83之重鏈和SEQ ID NO:90之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:84之重鏈和SEQ ID NO:90之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:85之重鏈和SEQ ID NO:90之輕鏈);三絞鏈取代和an A118C取代(SEQ ID NO:86之重鏈和SEQ ID NO:89之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:87之重鏈和SEQ ID NO:89之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:88之重鏈和SEQ NO:89之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 45.MYT5309 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如,接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT5309係包括一包含SEQ ID NO:19的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:20的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:91之重鏈和SEQ ID NO:97之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:92和輕鏈:SEQ ID NO:97);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:93之重鏈和SEQ ID NO:97之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:91之重鏈和SEQ ID NO:98之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:92之重鏈和SEQ ID NO:98之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:93之重鏈和SEQ ID NO:98之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:94之重鏈和SEQ ID NO:97之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:95之重鏈和SEQ ID NO:97之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:96之重鏈和SEQ NO:97之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 46.MYT5344 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如,接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT5344係包括一包含SEQ ID NO:21的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:22的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:99之重鏈和SEQ ID NO:105之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:100和輕鏈:SEQ ID NO:105);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:101之重鏈和SEQ ID NO:105之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:99之重鏈和SEQ ID NO:106之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:100之重鏈和SEQ ID NO:106之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:101之重鏈和SEQ ID NO:106之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:102之重鏈和SEQ ID NO:105之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:103之重鏈和SEQ ID NO:105之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:104之重鏈和SEQ NO:105之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 47.MYT5367 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT5367係包括一包含SEQ ID NO:23的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:24的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:107之重鏈和SEQ ID NO:113之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:108和輕鏈:SEQ ID NO:113);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:109之重鏈和SEQ ID NO:113之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:107之重鏈和SEQ ID NO:114之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:108之重鏈和SEQ ID NO:114之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:109之重鏈和SEQ ID NO:114之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:110之重鏈和SEQ ID NO:113之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:111之重鏈和SEQ ID NO:113之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:112之重鏈和SEQ NO:113之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 48.MYT4827 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4827係包括一包含SEQ ID NO:25的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:26的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:115之重鏈和SEQ ID NO:121之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:116和輕鏈:SEQ ID NO:121);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:117之重鏈和SEQ ID NO:121之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:115之重鏈和SEQ ID NO:122之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:116之重鏈和SEQ ID NO:122之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:117之重鏈和SEQ ID NO:122之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:118之重鏈和SEQ ID NO:121之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:119之重鏈和SEQ ID NO:121之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:120之重鏈和SEQ NO:121之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 49.MYT4312 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4312係包括一包含SEQ ID NO:27的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:28的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:123之重鏈和SEQ ID NO:129之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:124和輕鏈:SEQ ID NO:129);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:125之重鏈和SEQ ID NO:129之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:123之重鏈和SEQ ID NO:130之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:124之重鏈和SEQ ID NO:130之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:125之重鏈和SEQ ID NO:130之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:126之重鏈和SEQ ID NO:129之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:127之重鏈和SEQ ID NO:129之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:128之重鏈和SEQ NO:129之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 50.MYT4953 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4953係包括一包含SEQ ID NO:29的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:30的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:131之重鏈和SEQ ID NO:137之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:132和輕鏈:SEQ ID NO:137);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:133之重鏈和SEQ ID NO:137之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:131之重鏈和SEQ ID NO:138之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:132之重鏈和SEQ ID NO:138之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:133之重鏈和SEQ ID NO:138之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:134之重鏈和SEQ ID NO:137之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:135之重鏈和SEQ ID NO:137之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:136之重鏈和SEQ NO:137之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 51.MYT4940 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人 (Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4940係包括一包含SEQ ID NO:31的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:32的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:139之重鏈和SEQ ID NO:145之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:140和輕鏈:SEQ ID NO:145);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:141之重鏈和SEQ ID NO:145之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:139之重鏈和SEQ ID NO:146之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:140之重鏈和SEQ ID NO:146之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:141之重鏈和SEQ ID NO:146之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:142之重鏈和SEQ ID NO:145之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:143之重鏈和SEQ ID NO:145之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:144之重鏈和SEQ NO:145之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 52.MYT4888 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
因此,MYT4888係包括一包含SEQ ID NO:33的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:34的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:147之重鏈和SEQ ID NO:153之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:148和輕鏈:SEQ ID NO:153);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:149之重鏈和SEQ ID NO:153之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:147之重鏈和SEQ ID NO:154之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:148之重鏈和SEQ ID NO:154之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:149之重鏈和SEQ ID NO:154之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:150之重鏈和SEQ ID NO:153之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:151之重鏈和SEQ ID NO:153之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:152之重鏈和SEQ NO:153之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 53. 特立妥珠單抗( Telisotuzumab ) 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136) 所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
包括恆定區取代的特立妥珠單抗變異係包括一包含SEQ ID NO:159的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:160的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:159,SEQ ID NO:160)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:165之重鏈和SEQ ID NO:171之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:166和輕鏈:SEQ ID NO:171);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:167之重鏈和SEQ ID NO:171之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:165 之重鏈和SEQ ID NO:172之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:166之重鏈和SEQ ID NO:172之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:167 和SEQ ID NO:172之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:168之重鏈和SEQ ID NO:171之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:169之重鏈和SEQ ID NO:171之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:170之重鏈和SEQ NO:171之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 54. 艾貝珠單抗( Emibetuzumab ) 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
包括恆定區取代的艾貝珠單抗變異係包括一包含SEQ ID NO:161的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:162的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:161,SEQ ID NO:162)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:173之重鏈和SEQ ID NO:179之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:174和輕鏈:SEQ ID NO:179);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:175之重鏈和SEQ ID NO:179之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:173之重鏈和SEQ ID NO:180之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:174之重鏈和SEQ ID NO:180之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:175之重鏈和SEQ ID NO:180之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:176之重鏈和SEQ ID NO:179之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:177之重鏈和SEQ ID NO:179之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:178之重鏈和SEQ NO:179之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 55.P3D12 -cMET 恆定區取代之定性
如上所論述進行組胺酸掃描,其中輕鏈內的CDR係使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT(Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法來鑑別,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。選擇特定的重鏈可變區和輕鏈可變區進行另外的實驗。
另外,各種接合細胞毒性劑和細胞抑制劑與抗體的方法為已知的。例如接合可能在天然生成的胺基酸位置及/或在導入的位置(例如,工程改造的胺基酸)。如文中所論述,各種將接合位置導入一抗體之方法已為所知。
工程改造胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:產生「三絞鏈」接合位置的取代(例如,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸,產生三絞鏈接合位置,在SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸,及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
天然生成胺基酸接合位置之實例包括,但不限於下列:在胺基酸位置103的半胱胺酸,在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸,(iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸,及/或在胺基酸位置112的半胱胺酸及/或在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
文中所提供的抗體亦可包括修飾的恆定區。例如,可將一或更多個胺基酸取代、插入及/或刪除導入(例如,工程改造)至任何文中所提供的抗體之恆定區(例如,恆定重鏈及/或恆定輕鏈)。恆定區中的胺基酸取代對抗體可具有各種效應,包括,例如延長抗體的半衰期。此等取代之非限定實例包括下列:在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸 (例如,「YTE」取代)及在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸(例如,「LS」取代)。
包括恆定區取代的P3D12抗-cMET變異係包括一包含SEQ ID NO:163的可變重鏈區和一包含SEQ ID NO:164的可變輕鏈區。各種修飾的恆定區(例如,修飾的重鏈恆定區,修飾的輕鏈恆定區)可與文中所述的可變鏈(例如,分別為SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:164)組合。下列係代表就此而論之下列重鏈和輕鏈組合:僅三絞鏈接合(SEQ ID NO:181之重鏈和SEQ ID NO:187之輕鏈);三絞鏈接合和LS取代(重鏈:SEQ ID NO:182和輕鏈:SEQ ID NO:187);三絞鏈取代和YTE取代(SEQ ID NO:183之重鏈和SEQ ID NO:187之輕鏈);三絞鏈接合和V205取代(SEQ ID NO:181之重鏈和SEQ ID NO:188之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及V205取代(SEQ NO:182之重鏈和SEQ ID NO:188之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及V205C取代(SEQ ID NO:183之重鏈和SEQ ID NO:188之輕鏈);三絞鏈取代和A118C取代(SEQ ID NO:184之重鏈和SEQ ID NO:187之輕鏈);三絞鏈取代和LS取代及A118C取代(SEQ ID NO:185之重鏈和SEQ ID NO:187之輕鏈);三絞鏈取代和YTE取代及A118C取代(SEQ ID NO:186之重鏈和SEQ NO:187之輕鏈)。
上述組合可藉由在上述實例中所述的任何分析加以評估。 實例 56.pH 工程改造抗體之提升的選擇性結合親和力
藉由FACS分析於帶有一定範圍cMET表現的細胞株上測量對MET具特異性的pH-工程改造抗體之親和力;Detroit-562細胞(ATCC;CCL-138)、NCI-H1975(ATCC CRL-5908)和HUVEC (C2519A,Lonza)。從市售來源取得此研究所選用的細胞株並使用製造商建議的條件培養。收到後將所有的細胞株以類似的繼代數目培養,擴增及低溫保存,供用於親和力實驗。簡言之,將1.0x10^5個表現MET之細胞植入96-孔盤之每個孔槽的100 µL培養基中。將細胞以200 μL的pH 7.4.之FACS緩衝液(含有3%胎牛血清之1x PBS)清洗2次。將純化的蛋白樣本稀釋於pH 7.4之FAC緩衝液中,用於100 nM至1 pM之滴定,及加入細胞中並於冰上結合2小時。以初級抗體培養後,如同之前清洗細胞2次,及然後100 µl的二級山羊抗-人類AF488 (IgG交叉吸附二級抗體),以1:200稀釋,加入pH 7.4的FACS緩衝液中,並於冰上培養1小時。將培養盤清洗2次於流式細胞儀上(Accuri C6, BD Biosciences)讀取結合。觀察到的結合為比對單獨的二級之FLl訊號的變動(為平均螢光強度)。
與表現高量MET之Detroit-562細胞和表現較低量MET之HUVEC細胞結合的親代抗體,顯示類似的親和力。出乎意料地,選擇對MET具特異性的pH-工程改造抗體與帶有較高MET表現量之標的細胞Detroit-562結合,比與帶有較低MET表現之標的細胞HUVEC細胞結合更強。一系列試驗物體對數種細胞株之親和力係如表1所示。pH工程改造抗體結構因此與母化合物在其親和力上具有差異,其在治療cMET過度表現的惡性腫瘤上可預期轉譯成對高表現標的細胞之增加的選擇性,就所選的抗體對正常肝細胞具有與下降的結合。 表1.
  pH 7.4時之親和力(nM)
編號 # 親代 Detroit-562 (125K/ 細胞 ) HUVEC (8k/ 細胞 ) 親和力倍數
MYT4305 (P3D12) n/a 0.2925 0.2 0.7
MYT4813 (艾貝珠單抗) n/a 0.5267 0.2 0.4
MYT4325 P3D12 0.9031 >200 >220
MYT5351 P3D12 0.4864 >100 >200
MYT5309 艾貝珠單抗 1.343 >200 >50
MYT4837 艾貝珠單抗 1.021 >100 >100
實例 57. 驗證相較於對 MET 具特異性之對照 ADC ,對 MET 具特異性之 pH- 工程改造 ADC 的增加半衰期
本發明所描述之對MET具特異性之pH-工程改造ADC的另外方面可為相對於對MET具特異性之對照ADC其幫助增加血清半衰期之能力。就驗證這些性質,係使用對MET具特異性之pH-工程改造ADC和對MET具特異性之對照抗體ADC,使用本項技術中已知的方法(例如,Gupta, P., et al. (2016), mAbs, 8:5, 991-997),於食蟹獼猴中進行一系列的動物研究。將母猴(每個試驗物3隻)以2.7 mg/kg之劑量經由隱靜脈注射快速團注投予對MET具特異性之pH-工程改造ADC或對MET具特異性之對照抗體ADC。可替代地,於整組數隻的獼猴中投予數種不同劑量的MET-節核蛋白。在下列時間點經由週邊靜脈或股靜脈收集血液樣本:給劑前,給劑後15分鐘,12小時,2天,3天,4天,7天,10天,14天,17天,21天和28天。使用本項技術中已知的方法(例如,ELISA)分析血液樣本中存在的對MET具特異性之pH-工程改造ADC或對MET具特異性之對照抗體ADC。
將對MET具特異性之pH-工程改造ADC和對MET具特異性之對照抗體ADC的抗體濃度作為時間的函數作圖。在分析數據後,可觀察到相對於對MET具特異性之對照抗體ADC,對MET具特異性之pH-工程改造ADC具有明顯較長的半衰期,由此驗證了提升的血清安定性和暴露樣貌。 實例 58. 在小鼠異種移植模型中對比對 MET 具特異性之對照抗體 ADC ,對 MET 具特異性之 pH- 工程改造 ADC 之增加的效力
對MET具特異性之pH-工程改造ADC對抗MET+腫瘤之提升的抗-腫瘤活性可於MET+細胞之皮下異種移植模型中驗證。就實驗,係將5百萬個H1375人類肺腺癌細胞(part##),或H1975人類肺腺癌細胞(part#)於活體外培養並以皮下接種每隻小鼠至雌性免疫缺陷小鼠的右脇(例如,CB.17 SCID Jax vs Charles river part#)。另外,於活體外培養1千萬個Detroit 562人類鼻咽癌細胞(part##)並以皮下接種每隻小鼠至雌性無胸腺裸小鼠的右脇(NCr nu/nu, Jax/vs charles river part#)。就H1375和H1975異種移植,腫瘤大小為100-150 mm3,及就Detroit-562異種移植為125-175 mm3。經由電子游標尺測量腫瘤的長度(L)和寬度(W)並根據下列公式計算體積:V=L×W^2/2。經由尾靜脈投予一團注(4 mg/kg)對MET具特異性之pH-工程改造ADC或2或4 mg對MET具特異性之對照抗體ADC。相較於以相同的療法投予對MET具特異性之對照抗體ADC,投予對MET具特異性之pH-工程改造ADC,腫瘤生長抑制(TGI)和腫瘤生長延緩(TGD)和存活明顯提升。
視需要,經由下頜採血從各組在下列各時間點收集血液樣本:2d,7d,14d。處理樣本用以收集血清,並使用ELISA或其他本項技術中已知的方法 (例如,PAC分析或MAC分析;Fischer, S.K. et al. (2012), mAbs, 4:5, 623-631,利用,例如,抗人類IgG抗體Jackson ImmunoResearch Labs,型號# 109–006–006)定量抗體濃度。將對MET具特異性的pH-工程改造抗體和對MET具特異性的對照抗體之濃度作為時間的函數作圖。
視需要,於犧牲的動物中測定腫瘤細胞擴散至各種組織。根據Schneider, T., et al., Clin. Exp. Metas. 19 (2002) 571-582測量轉移。簡言之,收取組織並藉由即時PCR定量人類Alu序列。由即時PCR所定量之較高的人類DNA量係相當於較高程度的轉移。相較於以相同療法以對MET具特異性之對照抗體ADC治療的小鼠,在經對MET具特異性之pH-工程改造ADC治療的動物中人類Alu序列的量(與腫瘤細胞侵襲至二級組織有關)明顯較低。可替代地,對MET具特異性之pH-工程改造ADC之提升的抗-腫瘤活性可顯現在MET+病患衍生的異種移植模型中(例如,可得自The Jackson Laboratory)。 實例 59. 定性 pH 工程改造抗 -MET 抗體之細胞內化和內溶酶體遞送
將所選的抗-MET pH工程改造抗體變體於U-87 MG細胞(MET+),SNU-5細胞(MET+),NCI-H1373細胞(MET+),NCI-H1573細胞(MET+)及/或Detroit 562細胞(MET+)中進行內化和內溶酶體遞送分析。收集U-87 MG細胞(ATCC HTB-14),Detroit 562細胞(ATCC CCL-138),NCI-H1373細胞(ATCC CRL-5866),NCI-H1573細胞(ATCC CRL-5877)或SNU-5細胞(ATCC CRL-5973)並再懸浮於EMEM培養基(U-87 MG and Detroit 562, ATCC;30-2003),IMDM培養基(SNU-5, ATCC;30-2005)或RPMI培養基(NCI-H1373和NCI-H1573,ATCC 30-2001)加上5% (NCI-H1573),10% (U-87 MG, Detroit 562, NCI-H1373)或20% (SNU-5)GenClone熱失活胎牛血清(HI FBS)(Genesee Scientific;25-514H)。使用台盼藍染色和Countess II FL自動細胞計數儀(Thermofisher;AMQAF1000)測定細胞數。然後將細胞稀釋成2,000,000個細胞/mL並將50 µl/孔植入96-孔平底細胞培養盤(Genesee Scientific;25-109)。將抗-MET pH工程改造抗體變體,起始抗體,對照IgG1同型對照物(BP0297, Bioxcell)和媒劑對照物以原本的培養基稀釋,及然後以1:1與3x莫耳比的Zenon pHrodo iFL人類IgG標定試劑(ThermoFisher;Z25611)混合。將混合物於室溫培養20分鐘,接著以1:1加入細胞至100 µL之最終體積。將細胞、抗-MET抗體變體和Zenon pHrodo iFL人類IgG標定試劑之混合物於37°C,5% CO2培養1-24小時。培養後,於各孔槽中加入100 µL的冰冷流式細胞(FC)緩衝液(磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS),pH 7.4  + 2mM乙二胺四乙酸(EDTA) + 2% (v/v) HI FBS。然後將細胞於4°C以2000 rpm離心2 min ,以200 µL冰冷FC緩衝液清洗並再懸浮於100 µL冰冷FC緩衝液。使用BD Accuri C6 流式細胞儀偵測平均綠色螢光強度。使用Flowjo分析軟體分析數據。pHrodo green為在胞內體和溶酶體之低pH環境發出螢光之pH敏感性染劑,且因此可用於定量抗體內化和內溶酶體遞送。藉由pHrodo green平均螢光強度測量在U-87 MG (MET+)、Detroit 562 (MET+)、SNU-5 (MET+)、NCI-H1573 (MET+)或NCI-H1373 (MET+)細胞中各濃度之抗-MET起始抗體和變體之內化和內溶酶體遞送。相對於其對應的起始抗體,數種pH工程改造抗-MET抗體變體顯示增加的平均螢光強度,其係驗證在較低pH時增加的解離,導致提升的內化和細胞內的內溶酶體遞送,如增加的螢光或相較於IgG1同型對照物螢光增加所示。就各柱體上方的pH工程改造抗-MET抗體變體,定量增加的內溶酶體遞送,比率為:變體的平均螢光強度減去IgG對照物的平均螢光強度,然後除以變體的對照起始抗體平均螢光強度減去IgG對照物的平均螢光強度。
MYT4826、MYT4827、MYT4837、MYT4325、MYT5351、MYT4312、MYT5309、MYT4849、MYTH4888、MYT5344、MYT4313、MYT5367、MYT4942、MYT4953和MYT4940,相對於其對照抗體,顯示增加的內化和內溶酶體遞送。
例如MYT2040、MYT3609、MYT3611和MYT3615、特立妥珠單抗之抗體變體,相對於特立妥珠單抗(MYT0886),顯示增加的內化和內溶酶體遞送。例如MYT2319、MYT2850、MYT2861和MYT4326、艾貝珠單抗之抗體變體,相對於艾貝珠單抗,顯示增加的內化和內溶酶體遞送。例如MYT3698、MYT3735、MYT3740、MYT4247和MYT4325、P3D12之抗體變體,相對於P3D12,顯示增加的內化和內溶酶體遞送。選擇相對於其起始抗體,帶有增加的平均螢光強度之此等pH工程改造抗-MET抗體變體供進一步的的分析。 實例 60. 建構和篩選 pH- 工程改造 MET 抗體
多種MET-結合的單株抗體已描述於文獻中並可用作為工程改造pH-依賴結合的模板[Wang J et al (2017) ABBV-399, a c-Met Antibody-Drug Conjugate that Targets Both MET-Amplified and c-Met-Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence, Clin Cancer Res, 23:992-1000]。吾等選擇了MYT4940、MYT4942、MYT4888、MYT4827、MYT4837、MYT4849和MYT5309 MET-結合單株抗體用於經由組胺酸掃描之pH工程改造。簡言之,使用Kabat等人(Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE publishing)和IMGT (Lefranc MP (1999) “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist 7, 132-136)所述的方法鑑別重鏈和輕鏈中的CDR,並就各CDR,落在任一或二種Kabat和IMGT CDR定義中的殘基稱為CDR殘基。在其中起始CDR殘基為組胺酸的情況下,其係突變為丙胺酸。藉由將Expi293細胞以a)一輕鏈序列變體或輕鏈組合序列變體,及b)一重鏈序列變體或重鏈組合序列變體,使用本項技術中已知的方法共轉染,產生具有二或更多個組胺酸或丙胺酸突變的抗體變體。讓蛋白表現4天後,收集細胞培養上清液,以SDS-PAGE分析定量,並使用生物膜干涉技術(BLI)於Octet RED 96e儀器上評估變體的pH依賴性。簡言之,以藉由SDS-PAGE凝膠之目視檢驗所測定的變體之定性表現量為基準稀釋細胞培養上清液,將5 µL的細胞培養上清液稀釋於195 µL的1x PBST pH 7.4中用於高表現者,將25 µL的細胞培養上清液稀釋於175 µL的1x PBST pH 7.4中用於中度表現者及將100 µL的細胞培養上清液稀釋於100 µL的1x PBST pH 7.4中用於低表現者,供載入至感測器尖端。然後將稀釋的上清液捕捉至抗-人類Fc感測器上(Forte Bio)。使用pH 7.4的1X PBST (50mM磷酸鉀緩衝液 + 150mM NaCl  + 0.05% Tween 20)建立一基線,並將感測器與50 nM的MET(cMET, Sino Biological型號10692-H08H)於pH 7.4的1X PBST中結合120秒,產生一結合曲線。在解離相中,感測器上的抗體-抗原複合物係暴露於pH 7.4之1X PBS歷時300-600秒。基線、結合和解離係在個別的條件下整體使用pH 5.4的1xPBST重複。就基線和結合係使用另外的條件進行,而結合係使用pH 7.4之1xPBST,解離係使用pH 5.4之1xPBST。檢驗pH 5.4和pH 7.4時各起始抗體(不具有取代)和各對應抗體變體的結合和解離相曲線,以下列二項標準提報:a)相較於起始抗體(不具有取代),由於組胺酸或丙胺酸取代在pH 5.4時解離提升(例如,較高的koff值),及b)相較於pH 5.4時抗體變體本身及與起始抗體(不具有取代)相比,在pH 7.4時解離下降(例如,較低的koff值)。 其他具體實例
應了解,當本發明已結合其實施方式描述時,前述說明之目的為舉例說明而並非限制本發明之範圍,本發明之範圍係由所附的申請專利範圍來定義。其他方面、利益和修改係在下列申請專利範圍內。 序列附錄成熟人類MET (SEQ ID NO:1) ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS 編碼成熟人類MET之cDNA(SEQ ID NO:2) GAGTGTAAAGAGGCACTAGCAAAGTCCGAGATGAATGTGAATATGAAGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGCGGAAACACCCATCCAGAATGTCATTCTACATGAGCATCACATTTTCCTTGGTGCCACTAACTACATTTATGTTTTAAATGAGGAAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGCCTGTGCTGGAACACCCAGATTGTTTCCCATGTCAGGACTGCAGCAGCAAAGCCAATTTATCAGGAGGTGTTTGGAAAGATAACATCAACATGGCTCTAGTTGTCGACACCTACTATGATGATCAACTCATTAGCTGTGGCAGCGTCAACAGAGGGACCTGCCAGCGACATGTCTTTCCCCACAATCATACTGCTGACATACAGTCGGAGGTTCACTGCATATTCTCCCCACAGATAGAAGAGCCCAGCCAGTGTCCTGACTGTGTGGTGAGCGCCCTGGGAGCCAAAGTCCTTTCATCTGTAAAGGACCGGTTCATCAACTTCTTTGTAGGCAATACCATAAATTCTTCTTATTTCCCAGATCATCCATTGCATTCGATATCAGTGAGAAGGCTAAAGGAAACGAAAGATGGTTTTATGTTTTTGACGGACCAGTCCTACATTGATGTTTTACCTGAGTTCAGAGATTCTTACCCCATTAAGTATGTCCATGCCTTTGAAAGCAACAATTTTATTTACTTCTTGACGGTCCAAAGGGAAACTCTAGATGCTCAGACTTTTCACACAAGAATAATCAGGTTCTGTTCCATAAACTCTGGATTGCATTCCTACATGGAAATGCCTCTGGAGTGTATTCTCACAGAAAAGAGAAAAAAGAGATCCACAAAGAAGGAAGTGTTTAATATACTTCAGGCTGCGTATGTCAGCAAGCCTGGGGCCCAGCTTGCTAGACAAATAGGAGCCAGCCTGAATGATGACATTCTTTTCGGGGTGTTCGCACAAAGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCAATGGATCGATCTGCCATGTGTGCATTCCCTATCAAATATGTCAACGACTTCTTCAACAAGATCGTCAACAAAAACAATGTGAGATGTCTCCAGCATTTTTACGGACCCAATCATGAGCACTGCTTTAATAGGACACTTCTGAGAAATTCATCAGGCTGTGAAGCGCGCCGTGATGAATATCGAACAGAGTTTACCACAGCTTTGCAGCGCGTTGACTTATTCATGGGTCAATTCAGCGAAGTCCTCTTAACATCTATATCCACCTTCATTAAAGGAGACCTCACCATAGCTAATCTTGGGACATCAGAGGGTCGCTTCATGCAGGTTGTGGTTTCTCGATCAGGACCATCAACCCCTCATGTGAATTTTCTCCTGGACTCCCATCCAGTGTCTCCAGAAGTGATTGTGGAGCATACATTAAACCAAAATGGCTACACACTGGTTATCACTGGGAAGAAGATCACGAAGATCCCATTGAATGGCTTGGGCTGCAGACATTTCCAGTCCTGCAGTCAATGCCTCTCTGCCCCACCCTTTGTTCAGTGTGGCTGGTGCCACGACAAATGTGTGCGATCGGAGGAATGCCTGAGCGGGACATGGACTCAACAGATCTGTCTGCCTGCAATCTACAAGGTTTTCCCAAATAGTGCACCCCTTGAAGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTGGCTGGGACTTTGGATTTCGGAGGAATAATAAATTTGATTTAAAGAAAACTAGAGTTCTCCTTGGAAATGAGAGCTGCACCTTGACTTTAAGTGAGAGCACGATGAATACATTGAAATGCACAGTTGGTCCTGCCATGAATAAGCATTTCAATATGTCCATAATTATTTCAAATGGCCACGGGACAACACAATACAGTACATTCTCCTATGTGGATCCTGTAATAACAAGTATTTCGCCGAAATACGGTCCTATGGCTGGTGGCACTTTACTTACTTTAACTGGAAATTACCTAAACAGTGGGAATTCTAGACACATTTCAATTGGTGGAAAAACATGTACTTTAAAAAGTGTGTCAAACAGTATTCTTGAATGTTATACCCCAGCCCAAACCATTTCAACTGAGTTTGCTGTTAAATTGAAAATTGACTTAGCCAACCGAGAGACAAGCATCTTCAGTTACCGTGAAGATCCCATTGTCTATGAAATTCATCCAACCAAATCTTTTATTAGTGGTGGGAGCACAATAACAGGTGTTGGGAAAAACCTGAATTCAGTTAGTGTCCCGAGAATGGTCATAAATGTGCATGAAGCAGGAAGGAACTTTACAGTGGCATGTCAACATCGCTCTAATTCAGAGATAATCTGTTGTACCACTCCTTCCCTGCAACAGCTGAATCTGCAACTCCCCCTGAAAACCAAAGCCTTTTTCATGTTAGATGGGATCCTTTCCAAATACTTTGATCTCATTTATGTACATAATCCTGTGTTTAAGCCTTTTGAAAAGCCAGTGATGATCTCAATGGGCAATGAAAATGTACTGGAAATTAAGGGAAATGATATTGACCCTGAAGCAGTTAAAGGTGAAGTGTTAAAAGTTGGAAATAAGAGCTGTGAGAATATACACTTACATTCTGAAGCCGTTTTATGCACGGTCCCCAATGACCTGCTGAAATTGAACAGCGAGCTAAATATAGAGTGGAAGCAAGCAATTTCTTCAACCGTCCTTGGAAAAGTAATAGTTCAACCAGATCAGAATTTCACAGGATTGATTGCTGGTGTTGTCTCAATATCAACAGCACTGTTATTACTACTTGGGTTTTTCCTGTGGCTGAAAAAGAGAAAGCAAATTAAAGATCTGGGCAGTGAATTAGTTCGCTACGATGCAAGAGTACACACTCCTCATTTGGATAGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGTAAGCCCAACTACAGAAATGGTTTCAAATGAATCTGTAGACTACCGAGCTACTTTTCCAGAAGATCAGTTTCCTAATTCATCTCAGAACGGTTCATGCCGACAAGTGCAGTATCCTCTGACAGACATGTCCCCCATCCTAACTAGTGGGGACTCTGATATATCCAGTCCATTACTGCAAAATACTGTCCACATTGACCTCAGTGCTCTAAATCCAGAGCTGGTCCAGGCAGTGCAGCATGTAGTGATTGGGCCCAGTAGCCTGATTGTGCATTTCAATGAAGTCATAGGAAGAGGGCATTTTGGTTGTGTATATCATGGGACTTTGTTGGACAATGATGGCAAGAAAATTCACTGTGCTGTGAAATCCTTGAACAGAATCACTGACATAGGAGAAGTTTCCCAATTTCTGACCGAGGGAATCATCATGAAAGATTTTAGTCATCCCAATGTCCTCTCGCTCCTGGGAATCTGCCTGCGAAGTGAAGGGTCTCCGCTGGTGGTCCTACCATACATGAAACATGGAGATCTTCGAAATTTCATTCGAAATGAGACTCATAATCCAACTGTAAAAGATCTTATTGGCTTTGGTCTTCAAGTAGCCAAAGGCATGAAATATCTTGCAAGCAAAAAGTTTGTCCACAGAGACTTGGCTGCAAGAAACTGTATGCTGGATGAAAAATTCACAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTCTTGCCAGAGACATGTATGATAAAGAATACTATAGTGTACACAACAAAACAGGTGCAAAGCTGCCAGTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAGTCTGCAAACTCAAAAGTTTACCACCAAGTCAGATGTGTGGTCCTTTGGCGTGCTCCTCTGGGAGCTGATGACAAGAGGAGCCCCACCTTATCCTGACGTAAACACCTTTGATATAACTGTTTACTTGTTGCAAGGGAGAAGACTCCTACAACCCGAATACTGCCCAGACCCCTTATATGAAGTAATGCTAAAATGCTGGCACCCTAAAGCCGAAATGCGCCCATCCTTTTCTGAACTGGTGTCCCGGATATCAGCGATCTTCTCTACTTTCATTGGGGAGCACTATGTCCATGTGAACGCTACTTATGTGAACGTAAAATGTGTCGCTCCGTATCCTTCTCTGTTGTCATCAGAAGATAACGCTGATGATGAGGTGGACACACGACCAGCCTCCTTCTGGGAGACATCA MET之胞外區(SEQ ID NO:3) ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT 編碼MET之胞外區的cDNA(SEQ ID NO:4) GAGTGTAAAGAGGCACTAGCAAAGTCCGAGATGAATGTGAATATGAAGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGCGGAAACACCCATCCAGAATGTCATTCTACATGAGCATCACATTTTCCTTGGTGCCACTAACTACATTTATGTTTTAAATGAGGAAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGCCTGTGCTGGAACACCCAGATTGTTTCCCATGTCAGGACTGCAGCAGCAAAGCCAATTTATCAGGAGGTGTTTGGAAAGATAACATCAACATGGCTCTAGTTGTCGACACCTACTATGATGATCAACTCATTAGCTGTGGCAGCGTCAACAGAGGGACCTGCCAGCGACATGTCTTTCCCCACAATCATACTGCTGACATACAGTCGGAGGTTCACTGCATATTCTCCCCACAGATAGAAGAGCCCAGCCAGTGTCCTGACTGTGTGGTGAGCGCCCTGGGAGCCAAAGTCCTTTCATCTGTAAAGGACCGGTTCATCAACTTCTTTGTAGGCAATACCATAAATTCTTCTTATTTCCCAGATCATCCATTGCATTCGATATCAGTGAGAAGGCTAAAGGAAACGAAAGATGGTTTTATGTTTTTGACGGACCAGTCCTACATTGATGTTTTACCTGAGTTCAGAGATTCTTACCCCATTAAGTATGTCCATGCCTTTGAAAGCAACAATTTTATTTACTTCTTGACGGTCCAAAGGGAAACTCTAGATGCTCAGACTTTTCACACAAGAATAATCAGGTTCTGTTCCATAAACTCTGGATTGCATTCCTACATGGAAATGCCTCTGGAGTGTATTCTCACAGAAAAGAGAAAAAAGAGATCCACAAAGAAGGAAGTGTTTAATATACTTCAGGCTGCGTATGTCAGCAAGCCTGGGGCCCAGCTTGCTAGACAAATAGGAGCCAGCCTGAATGATGACATTCTTTTCGGGGTGTTCGCACAAAGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCAATGGATCGATCTGCCATGTGTGCATTCCCTATCAAATATGTCAACGACTTCTTCAACAAGATCGTCAACAAAAACAATGTGAGATGTCTCCAGCATTTTTACGGACCCAATCATGAGCACTGCTTTAATAGGACACTTCTGAGAAATTCATCAGGCTGTGAAGCGCGCCGTGATGAATATCGAACAGAGTTTACCACAGCTTTGCAGCGCGTTGACTTATTCATGGGTCAATTCAGCGAAGTCCTCTTAACATCTATATCCACCTTCATTAAAGGAGACCTCACCATAGCTAATCTTGGGACATCAGAGGGTCGCTTCATGCAGGTTGTGGTTTCTCGATCAGGACCATCAACCCCTCATGTGAATTTTCTCCTGGACTCCCATCCAGTGTCTCCAGAAGTGATTGTGGAGCATACATTAAACCAAAATGGCTACACACTGGTTATCACTGGGAAGAAGATCACGAAGATCCCATTGAATGGCTTGGGCTGCAGACATTTCCAGTCCTGCAGTCAATGCCTCTCTGCCCCACCCTTTGTTCAGTGTGGCTGGTGCCACGACAAATGTGTGCGATCGGAGGAATGCCTGAGCGGGACATGGACTCAACAGATCTGTCTGCCTGCAATCTACAAGGTTTTCCCAAATAGTGCACCCCTTGAAGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTGGCTGGGACTTTGGATTTCGGAGGAATAATAAATTTGATTTAAAGAAAACTAGAGTTCTCCTTGGAAATGAGAGCTGCACCTTGACTTTAAGTGAGAGCACGATGAATACATTGAAATGCACAGTTGGTCCTGCCATGAATAAGCATTTCAATATGTCCATAATTATTTCAAATGGCCACGGGACAACACAATACAGTACATTCTCCTATGTGGATCCTGTAATAACAAGTATTTCGCCGAAATACGGTCCTATGGCTGGTGGCACTTTACTTACTTTAACTGGAAATTACCTAAACAGTGGGAATTCTAGACACATTTCAATTGGTGGAAAAACATGTACTTTAAAAAGTGTGTCAAACAGTATTCTTGAATGTTATACCCCAGCCCAAACCATTTCAACTGAGTTTGCTGTTAAATTGAAAATTGACTTAGCCAACCGAGAGACAAGCATCTTCAGTTACCGTGAAGATCCCATTGTCTATGAAATTCATCCAACCAAATCTTTTATTAGTGGTGGGAGCACAATAACAGGTGTTGGGAAAAACCTGAATTCAGTTAGTGTCCCGAGAATGGTCATAAATGTGCATGAAGCAGGAAGGAACTTTACAGTGGCATGTCAACATCGCTCTAATTCAGAGATAATCTGTTGTACCACTCCTTCCCTGCAACAGCTGAATCTGCAACTCCCCCTGAAAACCAAAGCCTTTTTCATGTTAGATGGGATCCTTTCCAAATACTTTGATCTCATTTATGTACATAATCCTGTGTTTAAGCCTTTTGAAAAGCCAGTGATGATCTCAATGGGCAATGAAAATGTACTGGAAATTAAGGGAAATGATATTGACCCTGAAGCAGTTAAAGGTGAAGTGTTAAAAGTTGGAAATAAGAGCTGTGAGAATATACACTTACATTCTGAAGCCGTTTTATGCACGGTCCCCAATGACCTGCTGAAATTGAACAGCGAGCTAAATATAGAGTGGAAGCAAGCAATTTCTTCAACCGTCCTTGGAAAAGTAATAGTTCAACCAGATCAGAATTTCACA 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ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG** 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:190) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTREHGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab)之輕鏈IgG組胺酸掃描變體#2 (SEQ ID NO:191) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組胺酸掃描變體 #3 (SEQ ID NO:192) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:193) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組胺酸掃描變體#2 (SEQ ID NO:194) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDYWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab)之重鏈IgG組胺酸掃描變體#3 (SEQ ID NO:195) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDYWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab)之重鏈IgG組胺酸掃描變體#4 (SEQ ID NO:196) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDHWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab)之重鏈IgG組胺酸掃描變體#5 (SEQ ID NO:197) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDYWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#6 (SEQ ID NO:198) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDYWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#7 (SEQ ID NO:199) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDHWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#8 (SEQ ID NO:200) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITHEFDYWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#9 (SEQ ID NO:201) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITHEFDHWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#10 (SEQ ID NO:202) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITHEFDYWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體 #11 (SEQ ID NO:203) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITTEFDHWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#12 (SEQ ID NO:204) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARHEITHEFDHWGQGTLVTVSS 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:205) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#2 (SEQ ID NO:206) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSFLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#3 (SEQ ID NO:207) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTREHGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#4 (SEQ ID NO:208) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#5 (SEQ ID NO:209) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTREHGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#6 (SEQ ID NO:210) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTREHGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#7 (SEQ ID NO:211) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSHLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#8 (SEQ ID NO:212) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSHLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTREHGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#9 (SEQ ID NO:213) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYAHSFLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTREHGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之輕鏈組合組胺酸掃描變體#10 (SEQ ID NO:214) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSHLHWYQQKPGQPPKLLIYHASTREHGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之輕鏈組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:215) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIHLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之重鏈組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:216) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#2 (SEQ ID NO:217) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPHRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#3 (SEQ ID NO:218) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPNRRHTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#4 (SEQ ID NO:219) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRHTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變#5 (SEQ ID NO:220) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPHRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSS 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#6 (SEQ ID NO:221) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPHRRHTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSS 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#7 (SEQ ID NO:222) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVHPHRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAHWLDYWGQGTTVTVSS 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之輕鏈組胺酸掃描變體 #1 (SEQ ID NO:223) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVHSGYPLTFGGGTKVEIK 艾貝珠單抗(Emibetuzumab) IgG之輕鏈組胺酸掃描變體#2 (SEQ ID NO:224) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGHPLTFGGGTKVEIK hucMET27Gv1.3 IgG之重鏈 (SEQ ID NO:225) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVATINSNGVSIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEITTEMDYWGQGTLVTVSS hucMET27Gv1.3 IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:226) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSHIHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNEEHLTFGQGTKVELK P3D12 IgG之重鏈組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:227) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMAWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMDYWGQGTTVTVSS P3D12 IgG之重鏈組胺酸掃描變體#2 (SEQ ID NO:228) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYPLMDYWGQGTTVTVSS P3D12 IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:229) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTHTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMDYWGQGTTVTVSS P3D12 IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#2 (SEQ ID NO:230) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTHTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGYIKPSTDNTHYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGNYPLMHYWGQGTTVTVSS P3D12 IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#3 (SEQ ID NO:231) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLDWIGHIKPSTDNTEYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSYGHYPLMHYWGQGTTVTVSS P3D12 IgG之輕鏈組胺酸掃描變體#1 (SEQ ID NO:232) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTISSLEAEDAASYFCHQWSSYPHTFGSGTKLEIK P3D12 IgG之輕鏈組胺酸掃描變體 #1 (SEQ ID NO:233) QIVLTQSPAILSLSPGERATLSCSASSSVTSNYLYWYQQKPGSSPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYTLTISSLEAEDAASYFCHQWSHHHPTFGSGTKLEIK 特立妥珠單抗(Telisotuzumab) IgG之重鏈組合組胺酸掃描變體#13 (SEQ ID NO:234) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAHSEITHEFDHWGQGTLVTVSS hucMET27Gv1.3 IgG之輕鏈(SEQ ID NO:235) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFIHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNEEPLTFGQGTKVELK
1A-C Detroit 562 細胞中 艾貝珠單抗和 P3D12 之組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體的內化和內溶酶體遞送。將MYT4826(艾貝珠單抗)和MYT4325(P3D12),重鏈組合組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體,於Detroit 562細胞上使用Incucyte Human FabFluor-pH紅色抗體標定試劑於所示的時間點和最終的ABPC濃度進行內化分析。內化和內溶酶體遞送之增加倍數係以超過各變體的數目來表示。所有的變體包括TH和YTE取代模式。
2 :以生物膜干涉技術測定 艾貝珠單抗 組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體與 MET 的結合。將MYT4953重鏈組合組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體捕捉至抗-人類Fc生物感測器上並於pH 7.4時與MET結合。於pH 7.4(黑色軌跡)或pH 5.4(灰色軌跡)時解離。所有的變體包括TH和YTE取代模式。
3A 3C :以生物膜干涉技術測定 P3D12 之組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體與 MET 的結合。將MYT4312、MYT4313和MYT4325,重鏈組合組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體捕捉至抗-人類Fc生物感測器上並如圖所示於低pH或高pH時與MET結合。所有的變體包括TH和YTE取代模式。
4A 4D :以生物膜干涉技術測定 P3D12 艾貝珠單抗 組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體與 MET 的結合。將MYT5344、 MYT5351、MYT5367和MYT4826,成對的重鏈和輕鏈組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體,組合的輕鏈組胺酸和丙胺酸掃描變體,或輕鏈組合組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體與重鏈組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體,或重鏈組合組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體捕捉至抗-人類Fc生物感測器上並於pH 7.4時與MET結合。於pH 7.4(黑色軌跡)或pH 5.4(灰色軌跡)時解離。所有的變體包括TH和YTE取代模式。
5 :帶有所列之可變重鏈和可變輕鏈序列的不同受試抗體列表
6Detroit 562 細胞中 MYT 變體之組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體的內化和內溶酶體遞送。將MYT4826、MYT4827、MYT4837、MYT4325、MYT5351、MYT4312、MYT5309、MYT4849、MYTH4888、MYT5344、MYT4313、MYT5367、MYT4942、MYT4953和MYT4940,重鏈組合組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體,於Detroit 562細胞上使用Incucyte Human FabFluor-pH紅色抗體標定試劑於所示的時間點和最終的ABPC濃度進行內化分析。內化和內溶酶體遞送之增加倍數係以各變體旁的數目來表示。所有的變體包括TH和YTE取代模式。
7A-G :以生物膜干涉技術測定組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體與 MET 的結合將MYT4940、MYT4942、MYT4888、MYT4827、MYT4837、MYT4849和MYT5309、成對的重鏈和輕鏈組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體,組合的輕鏈組胺酸和丙胺酸掃描變體,或輕鏈組合組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體與重鏈組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體,或重鏈組合組胺酸掃描和丙胺酸掃描變體捕捉至抗-人類Fc生物感測器上並於pH 7.4時與MET結合。黑色軌跡代表pH 7.4,紅色軌跡代表在7.4時結合及於pH 6.4時解離,而橙色軌跡代表pH 6.4。所有的變體包括TH和YTE取代模式。
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Claims (74)

  1. 一種抗體,其中該抗體係包括: (a)     由下列之群選出的重鏈可變區和輕鏈可變區: (i)分別為SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6; (ii)分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8; (iii)分別為SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10; (iv)分別為SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12; (v)分別為SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14; (vi)分別為SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16; (vii)分別為SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18; (viii)分別為SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20; (ix)分別為SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22; (x)分別為SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24; (xi)分別為SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26; (xii)分別為SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28; (xiii)分別為SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30; (xiv)分別為SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32; (xv)分別為SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34;及 (b)   包括下列一或多項之SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈CH1-CH2-CH3序列: (i) 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸; (ii)在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸; (iii)在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;和 (iv)在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸; 及/或 包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸之SEQ ID NO:157的輕鏈C L序列。
  2. 如請求項1之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸。
  3. 如請求項2之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:41; (ii)分別為SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:49; (iii)分別為SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57 (iv)分別為SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:65; (v)分別為SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:73; (vi)分別為SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:81; (vii)分別為SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:89; (viii)分別為SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:97; (ix)分別為SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:105; (x)分別為SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:113; (xi)分別為SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:121; (xii)分別為SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:129; (xiii)分別為SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:137; (xiv)分別為SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:145;或 (xv)分別為SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:153。
  4. 如請求項1之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;和 在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸。
  5. 如請求項4之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:41; (ii)分別為SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:49; (iii)分別為SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57; (iv)分別為SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:65; (v)分別為SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:73; (vi)分別為SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:81; (vii)分別為SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:89; (viii)分別為SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:97; (ix)分別為SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:105; (x)分別為SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:113; (xi)分別為SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:121; (xii)分別為SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:129; (xiii)分別為SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:137; (xiv)分別為SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:145;或 (xv)分別為SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:153。
  6. 如請求項1之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;和 在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸。
  7. 如請求項6之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41; (ii)分別為SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:49; (iii)分別為SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:57; (iv)分別為SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:65; (v)分別為SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:73; (vi)分別為SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:81; (vii)分別為SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:89; (viii)分別為SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:97; (ix)分別為SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:105; (x)分別為SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:113; (xi)分別為SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:121; (xii)分別為SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:129; (xiii)分別為SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:137; (xiv)分別為SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:145;或 (xv)分別為SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:153。
  8. 如請求項1之抗體,其中: 該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 SEQ ID NO:157之輕鏈C L序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
  9. 如請求項8之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:42; (ii)分別為SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50; (iii)分別為SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:58; (iv)分別為SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:66; (v)分別為SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:74; (vi)分別為SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:82; (vii)分別為SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:90; (viii)分別為SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:98; (ix)分別為SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:106; (x)分別為SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:114; (xi)分別為SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:122; (xii)分別為SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:130; (xiii)分別為SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:138; (xiv)分別為SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:146;或 (xv)分別為SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:154。
  10. 如請求項1之抗體,其中: SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及 該SEQ ID NO:157之輕鏈C L序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
  11. 如請求項10之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:42; (ii)分別為SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50; (iii)分別為SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:58; (iv)分別為SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:66; (v)分別為SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:74; (vi)分別為SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:82; (vii)分別為SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:90; (viii)分別為SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:98; (ix)分別為SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106; (x)分別為SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:114; (xi)分別為SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:122; (xii)分別為SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:130; (xiii)分別為SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:138; (xiv)分別為SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:146;或 (xv)分別為SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:154。
  12. 如請求項1之抗體,其中: 該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及 該SEQ ID NO:157之輕鏈C L序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
  13. 如請求項12之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:42; (ii)分別為SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50; (iii)分別為SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:58; (iv)分別為SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:66; (v)分別為SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:74; (vi)分別為SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:82; (vii)分別為SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:90; (viii)分別為SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:98; (ix)分別為SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:106; (x)分別為SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:114; (xi)分別為SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:122; (xii)分別為SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:130; (xiii)分別為SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:138; (xiv)分別為SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:146;或 (xv)分別為SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:154。
  14. 如請求項1之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。
  15. 如請求項14之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41; (ii)分別為SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:49; (iii)分別為SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:57; (iv)分別為SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:65; (v)分別為SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:73; (vi)分別為SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:81; (vii)分別為SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:89; (viii)分別為SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:97; (ix)分別為SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105; (x)分別為SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113; (xi)分別為SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:121; (xii)分別為SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:129; (xiii)分別為SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:137; (xiv)分別為SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:145;或 (xv)分別為SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:153。
  16. 如請求項1之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸; 在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及 在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。
  17. 如請求項16之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41; (ii)分別為SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49; (iii)分別為SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57; (iv)分別為SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:65; (v)分別為SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73; (vi)分別為SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81; (vii)分別為SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89; (viii)分別為SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:97; (ix)分別為SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105; (x)分別為SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113; (xi)分別為SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:121; (xii)分別為SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:129; (xiii)分別為SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:137; (xiv)分別為SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:145;或 (xv)分別為SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:153。
  18. 如請求項1之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸; 在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及 在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。
  19. 如請求項18之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41; (ii)分別為SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49; (iii)分別為SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57; (iv)分別為SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65; (v)分別為SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73; (vi)分別為SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81; (vii)分別為SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89; (viii)分別為SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97; (ix)分別為SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105; (x)分別為SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113; (xi)分別為SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121; (xii)分別為SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129; (xiii)分別為SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137; (xiv)分別為SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:145;或 (xv)分別為SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153。
  20. 如請求項2-19中任一項之抗體,其中該抗體進一步係包括與下列一或多項接合之細胞毒性藥物: (a)包括下列一或多項之SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈CH1-CH2-CH3: (i)在胺基酸位置103的半胱胺酸; (ii)在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸之半胱胺酸; (iii)在胺基酸位置109的半胱胺酸; (iv)在胺基酸位置112的半胱胺酸;及/或 (b)在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
  21. 如請求項8-13和20中任一項之抗體,其中該抗體進一步係包括與SEQ ID NO:157之位置98的半胱胺酸接合之細胞毒性劑或細胞抑制劑。
  22. 如請求項14-20中任一項之抗體,其中該抗體進一步係包括與SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之位置1的半胱胺酸接合之細胞毒性劑或細胞抑制劑。
  23. 如請求項20-22之抗體,其中該細胞毒性劑或細胞抑制劑為一接合的毒素、放射性同位素、藥物或小分子。
  24. 如請求項1-23中任一項之抗體,其中: (a)  在約4.0至約6.5之pH時抗體的解離速率比在約7.0至約8.0之pH時的解離速率更快;或 (b) 在約4.0至約6.5之pH時抗體的解離常數(K D)比在約7.0至約8.0之pH時的K D更大。
  25. 如請求項20-24中任一項之抗體,其中包括該抗體的組成物:係提供下列一或多項: 相較於包括相同量之對照抗體的組成物,在標的哺乳動物細胞中增加毒素釋放; 相較於包括相同量之對照抗體的組成物,增加標的哺乳動物細胞殺滅;及 相較於包括相同量之對照抗體的組成物,在標的哺乳動物細胞中增加內溶酶體遞送。
  26. 如請求項1-25中任一項之抗體,其中包括該抗體的組成物: 相較於包括相同量之對照抗體的組成物,造成呈現在標的哺乳動物細胞表面上之MET量較低的下降;或 不會造成呈現在標的哺乳動物細胞表面上之MET量可察覺的下降。。
  27. 如請求項25或26之抗體,其中該抗體係在抗體被標的哺乳動物細胞內化後,於標的哺乳動物細胞中降解。
  28. 如請求項25-27中任一項之抗體,其中該標的哺乳動物細胞為癌細胞。
  29. 如請求項25-28中任一項之抗體,其中該抗體對該標的哺乳動物細胞係具有細胞毒性或細胞抑制性。
  30. 如請求項1-29中任一項之抗體,其中該抗體具有造成對癌細胞選擇性增加優於非癌細胞之親和力。
  31. 如請求項1-30中任一項之抗體,其中該抗體係: 與非人類靈長類MET和人類MET交叉反應;或 與非人類靈長類MET、人類MET,及大鼠MET和小鼠MET其中之一或二者交叉反應。
  32. 如請求項1-31中任一項之抗體,其中相較於對照抗體在活體內的半衰期,該抗體在活體內的半衰期為增加的。
  33. 一種醫藥組成物,其係包括一有效量之如請求項1-32中任一項之抗體。
  34. 一種套組,其係包括至少一劑之如請求項1-32中任一項之抗體或如請求項33之醫藥組成物。
  35. 一種治療其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群之癌症的方法,該方法係包括: 將一治療上有效量之如請求項1-32中任一項之抗體或如請求項33之醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
  36. 一種於一對象中降低腫瘤體積的方法,其中該腫瘤其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群,該方法係包括: 將一治療上有效量之如請求項1-32中任一項之抗體或如請求項33之醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
  37. 一種於一對象之癌細胞中引發細胞死亡的方法,其中該癌細胞係具有呈現在其表面之MET或MET表位,該方法係包括: 將一治療上有效量之如請求項1-32中任一項之抗體或如請求項33之醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
  38. 一種於一具有癌症的對象中降低發生轉移風險或降低發生另外的轉移風險之方法,其中該癌症其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的細胞群,該方法係包括: 將一治療上有效量之如請求項1-32中任一項之抗體或如請求項33之醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
  39. 一種抗體,其中該抗體係包括: (a)    由下列組成之群中選出的重鏈可變區和輕鏈可變區: (i)         分別為SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160; (ii)      分別為SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162; (iii)    分別為SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164; (b) 包括下列一或多項取代之SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈CH1-CH2-CH3序列: (i)    在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸; (ii)   在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸; (iv)     在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及 (iv)在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸; 及/或 包括在位置98以半胱胺酸取代纈胺酸之SEQ ID NO:157的輕鏈C L序列。
  40. 如請求項39之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸。
  41. 如請求項40之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:171; (ii)分別為SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:179;或 (iii)分別為SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:187。
  42. 如請求項39之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈 CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸; 在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸。
  43. 如請求項42之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:171; (ii)分別為SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:179;或 (iii)分別為SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:187。
  44. 如請求項39之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸。
  45. 如請求項44之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:171; (ii)分別為SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:179;或 (iii)分別為SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:187。
  46. 如請求項39之抗體,其中: 該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 該SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
  47. 如請求項46之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:172; (ii)分別為SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:180;或 (iii)分別為SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:188。
  48. 如請求項39之抗體,其中: 該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及 該SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
  49. 如請求項48之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:172; (ii)分別為SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:180;或 (iii)分別為SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:188。
  50. 如請求項39之抗體,其中: 該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及 該SEQ ID NO:157的輕鏈CL序列係包括在胺基酸位置98以半胱胺酸取代纈胺酸。
  51. 如請求項50之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:172; (ii)分別為SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:180;或 (iii)分別為SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:188。
  52. 如請求項39之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸;及 在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。
  53. 如請求項52之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:171; (ii)分別為SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:179;或 (iii)分別為SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:187。
  54. 如請求項39之抗體,其中該該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸; 在胺基酸位置311以白胺酸取代甲硫胺酸和在胺基酸位置317以絲胺酸取代天門冬醯胺酸;及 在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。
  55. 如請求項54之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:171; (ii)分別為SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:179;或 (iii)分別為SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:187。
  56. 如請求項39之抗體,其中該SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之重鏈CH1-CH2-CH3序列係包括: 在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸及在胺基酸位置106和108刪除蘇胺酸; 在胺基酸位置135以酪胺酸取代甲硫胺酸,在胺基酸位置137以蘇胺酸取代絲胺酸,及在胺基酸位置139以麩胺酸取代蘇胺酸;及 在胺基酸位置1以半胱胺酸取代丙胺酸。
  57. 如請求項56之抗體,其中該抗體係包括由下列之群選出的重鏈和輕鏈序列: (i)分別為SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171; (ii)分別為 SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179;或 (iii) SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187。
  58. 如請求項40-57中任一項之抗體,其中該抗體進一步係包括與下列一或多項接合之細胞毒性藥物: (a)包括下列一或多項之SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189的重鏈CH1-CH2-CH3: (i) 在胺基酸位置103的半胱胺酸; (ii)在胺基酸位置105以半胱胺酸取代離胺酸的半胱胺酸; (iii)  在胺基酸位置109的半胱胺酸;及 (iv) 在胺基酸位置112的半胱胺酸;及/或 (b) 在SEQ ID NO:157之胺基酸位置107的半胱胺酸。
  59. 如請求項46-51和58中任一項之抗體,其中該抗體進一步係包括與SEQ ID NO:157之位置98的半胱胺酸接合之細胞毒性劑或細胞抑制劑。
  60. 如請求項52-58中任一項之抗體,其中該抗體進一步係包括與SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:189之位置1的半胱胺酸接合之細胞毒性劑或細胞抑制劑。
  61. 如請求項58-60中任一項之抗體,其中該細胞毒性劑或細胞抑制劑為一接合的毒素、放射性同位素、藥物或小分子。
  62. 如請求項58-61中任一項之抗體,其中該抗體對於標的哺乳動物細胞係具有細胞毒性或細胞抑制性。
  63. 如請求項62之抗體,其中該抗體係在抗體被標的哺乳動物細胞內化後,於標的哺乳動物細胞中降解。
  64. 如請求項62或63之抗體,其中該標的哺乳動物細胞為癌細胞。
  65. 如請求項39-64中任一項之抗體,其中該抗體具有造成對癌細胞選擇性增加優於非癌細胞之親和力。
  66. 如請求項39-65中任一項之抗體,其中該抗體係: 與非人類靈長類MET和人類MET交叉反應;或 與非人類靈長類MET、人類MET,及大鼠MET和小鼠MET其中之一或二者。
  67. 如請求項39-66中任一項之抗體,其中相較於對照抗體在活體內的半衰期,該抗體在活體內的半衰期為增加的。
  68. 如請求項62-64之抗體,其中該標的哺乳動物細胞為癌細胞。
  69. 一種醫藥組成物,其係包括一有效量之如請求項39-68中任一項之抗體。
  70. 一種套組,其係包括至少一劑之如請求項39-68中任一項之抗體或如請求項69之醫藥組成物。
  71. 一種治療其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群之癌症的方法,該方法係包括: 將一治療上有效量之如請求項39-68中任一項之抗體或如請求項69之醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
  72. 一種於一對象中降低腫瘤體積的方法,其中該腫瘤其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的癌細胞群,該方法係包括: 將一治療上有效量之如請求項39-68中任一項之抗體或如請求項69之醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
  73. 一種於一對象之癌細胞中引發細胞死亡的方法,其中該癌細胞係具有呈現在其表面之MET或MET表位,其中該方法係包括: 將一治療上有效量之如請求項39-68中任一項之抗體或如請求項69之醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
  74. 一種於一具有癌症的對象中降低發生轉移風險或降低發生另外的轉移風險之方法,其中該癌症其特徵為具有呈現在癌細胞表面之MET或MET表位的細胞群,該方法係包括: 將一治療上有效量之如請求項39-68中任一項之抗體或如請求項69之醫藥組成物投予經鑑定具有其特徵為具有該癌細胞群之癌症的對象。
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