TW202241461A - 微胞奈米粒子及其用途 - Google Patents

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林有娜
閔現綉
高漢碩
金大勳
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Abstract

本揭示案包括陽離子載體單元，其包含(i)水溶性聚合物，(ii)帶正電荷之載體，(iii)疏水性部分，及(iv)交聯部分，其中當該陽離子載體單元與同該陽離子載體單元靜電相互作用之陰離子有效載荷(例如RNA及/或DNA)混合時，所得組合物自組織成將該陰離子有效載荷囊封於核心中之微胞。該等陽離子載體單元亦可包含組織特異性靶向部分，該靶向部分將展示在該微胞之表面上。本揭示案亦包括包含本揭示案之陽離子載體單元之微胞、製造陽離子載體單元及微胞之方法、包含該等微胞之醫藥組合物以及治療疾病或疾患之方法，該等方法包括向有需要之個體投與該等微胞。

Description

微胞奈米粒子及其用途
本揭示案提供陽離子載體單元及微胞系統，其可用於遞送陰離子有效載荷(例如RNA及/或DNA)穿過生理滲透障壁，例如血腦障壁。
細胞內藥物遞送往往具有挑戰性，此乃因欲到達胞質液，外源性分子必須首先穿過細胞膜。細胞膜對脂溶性且可穿過細胞膜之非極性治療劑具有選擇性滲透性。另一方面，諸如mRNA等高電荷治療劑則被細胞膜有效地排除在外。
由於帶負電荷之膜與多核苷酸上之高負電荷之間的電荷排斥，故多核苷酸不易於滲透細胞膜。因此，多核苷酸具有較差之生物利用度及細胞攝取率，通常小於1%(Dheur等人，Nucleic Acid Drug Dev., 9:522 (1999)；Park等人，J Controlled Release, 93:188 (2003))。由於大多數多核苷酸通常在5,000 Da以上，故其無法容易地擴散穿過細胞膜，且進入細胞中之攝取主要限於胞飲或胞吞過程。一旦進入細胞內部，多核苷酸即可在溶酶體區室中累積，限制其進入細胞質或細胞核。非經腸投與之多核苷酸亦對細胞質內外之快速核酸酶降解高度敏感。研究顯示， i.v.投與後，血液中之多核苷酸快速降解，半衰期為約30分鐘(Geary等人，J. Pharmacol. Exp. Ther. 296:890-897 (2001))。
因此，遞送多核苷酸(例如mRNA)所面臨之問題可大致分成兩部分。第一，治療性多核苷酸之調配方式必須使得其可遞送至細胞質，且第二，多核苷酸必須完整地到達細胞核且具有完全功能。儘管在應用核苷酸(例如基因療法)作為治療劑方面已取得進展，但仍存在對提供改良之藥理學性質(例如血清穩定性、遞送至正確器官、組織或細胞以及跨膜遞送)之遞送系統之需求。
旨在改良核酸之跨膜遞送之嘗試已利用蛋白質載體、抗體載體、脂質體遞送系統、電穿孔、直接注射、細胞融合、病毒載體及磷酸鈣介導之轉型。然而，許多該等技術受能夠進行跨膜轉運之細胞類型及達成此轉運所需條件之限制。因此，業內需要可選擇性地將帶電荷之治療劑(例如mRNA)引導至特定靶細胞或組織且穿過滲透障壁(例如質膜或BBB)，同時改良血清穩定性及/或對內源性溶解酶(例如RNA酶)之抗性之遞送系統。
本揭示案提供陽離子載體單元，其包含 [CC]-L1-[CM]-L2-[HM] (圖式I)； [CC]-L1-[HM]-L2-[CM] (圖式II)； [HM]-L1-[CM]-L2-[CC] (圖式III)； [HM]-L1-[CC]-L2-[CM] (圖式IV)； [CM]-L1-[CC]-L2-[HM] (圖式V)；或 [CM]-L1-[HM]-L2-[CC] (圖式VI)； 其中 CC為帶正電荷之載體部分； CM為交聯部分； HM為疏水性部分；且， L1及L2獨立地為視情況選用之連接體，且 其中HM之數目相對於[CC]及[CM]少於40%。
在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]少於39%、少於約35%、少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或約1%。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]介於約35%與約1%之間、約35%與約5%之間、約35%與約10%之間、約35%與約15%之間、約35%與約20%之間、約35%與約25%之間、約35%與約30%之間、約30%與約1%之間、約30%與約5%之間、約30%與約10%之間、約30%與約15%之間、約30%與約20%之間、約30%與約25%之間、約25%與約1%之間、約25%與約5%之間、約25%與約10%之間、約25%與約15%之間、約25%與約20%之間、約20%與約1%之間、約20%與約5%之間、約20%與約10%之間、約20%與約15%之間、約15%與約1%之間、約15%與約5%之間、約15%與約10%之間、約10%與約1%之間或約10%與約5%之間。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]介於約39%與約30%之間、約30%與約20%之間、約20%與約10%之間、約10%與約5%之間及約5%與約1%之間。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]為約39%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%或約1%。在一些態樣中，陽離子載體單元能夠與陰離子有效載荷相互作用。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度小於4000個、小於約3500個、小於約3000個、小於約2500個、小於約2000個、小於約1500個、小於約1000個、小於約900個、小於約800個、小於約700個、小於約600個、小於約500個、小於約400個、小於約200個或小於約150個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約20之間、約1與約19之間、約1與約18之間、約1與約17之間、約1與約16之間、約1與約15之間、約1與約14之間、約1與約13之間、約1與約12之間、約1與約11之間、約1與約10之間、約1與約9之間、約1與約8之間、約1與約7之間、約1與約6之間或約1與約5之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度為約100個核苷酸至約1000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]介於39%與約30%之間、約30%與約20%之間、約20%與約10%之間、約10%與約5%之間及約5%與約1%之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約10之間或約3與約7之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約2之間、約2與約3之間、約3與約4之間或約4與約5之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約1、約2、約3、約4或約5。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度為約1000個核苷酸至約2000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約5%或少於約1%。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]介於約30%與約20%之間、約30%與約25%之間、約25%與約20%之間、約25%與約15%之間、約20%與約10%之間、約20%與約5%之間、約10%與約1%之間、約10%與約5%之間及約5%與約1%之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約7之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約5之間或約5與約6之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約4、約5、約6或約7。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度為約2000個核苷酸至約3000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]少於約20%、少於約19%、少於約18%、少於約17%、少於約16%、少於約15%、少於約14%、少於約13%、少於約12%、少於約11%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1%。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]少於核苷酸之約20%至約1%、約20%至約5%、約20%至約10%、約20%至約15%、約15%至約1%、約15%至約5%、約15%至10%、約10%至約1%、約10%至約5%或約5%至約1%。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]為約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約14%、約13%、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約9之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約7之間或約7與約8之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約6、約7、約8或約9。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度為約3000個核苷酸至約4000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1%。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]為核苷酸之約10%至約1%、約10%至約5%或約5%至約1%。在一些態樣中，HM之數目相對於[CC]及[CM]為約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約10之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約8之間或約8與約9之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約7、約8、約9或約10。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含mRNA、cDNA或其任何組合。
在一些態樣中，陽離子載體進一步包含水溶性聚合物(WP)。在一些態樣中，水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]或[CM]。在一些實施例中，水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]或[CM]之N末端。在一些實施例中，水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]或[CM]之C末端。
在一些實施例中，載體單元包含： [WP]-L3]-[CC]-L1-[CM]-L2-[HM] (圖式I’)； [WP]-L3]-[CC]-L1-[HM]-L2-[CM] (圖式II’)； [WP]-L3]-[HM]-L1-[CM]-L2-[CC] (圖式III’)； [WP]-L3]-[HM]-L1-[CC]-L2-[CM] (圖式IV’)； [WP]-L3]-[CM]-L1-[CC]-L2-[HM] (圖式V’)；或 [WP]-L3]-[CM]-L1-[HM]-L2-[CC] (圖式VI’)。
在一些態樣中，水溶性聚合物包含聚(伸烷基二醇)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸羥基烷基酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚磷腈、聚噁唑啉(「POZ」)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)或其任何組合。在一些態樣中，水溶性聚合物包含聚乙二醇(「PEG」)、聚甘油或聚(丙二醇)(「PPG」)。在一些態樣中，水溶性聚合物包含：
Figure 02_image001
， 其中n為1至1000。
在一些態樣中，n為至少約110、至少約111、至少約112、至少約113、至少約114、至少約115、至少約116、至少約117、至少約118、至少約119、至少約120、至少約121、至少約122、至少約123、至少約124、至少約125、至少約126、至少約127、至少約128、至少約129、至少約130、至少約131、至少約132、至少約133、至少約134、至少約135、至少約136、至少約137、至少約138、至少約139、至少約140或至少約141。在一些態樣中，n為約80至約90、約90至約100、約100至約110、約110至約120、約120至約130、約140至約150或約150至約160。
在一些態樣中，水溶性聚合物為線性、分支或樹枝狀的。在一些態樣中，陽離子載體部分包含一或多個胺基酸。在一些態樣中，陽離子載體部分包含至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個、至少30個、至少31個、至少32個、至少33個、至少34個、至少35個、至少36個、至少37個、至少38個、至少39個、至少40個、至少41個、至少42個、至少43個、至少44個、至少45個、至少46個、至少47個、至少48個、至少49個、至少50個鹼性胺基酸、至少約51個、至少約52個、至少約53個、至少約54個、至少約55個、至少約56個、至少約57個、至少約58個、至少約59個、至少約60個、至少約61個、至少約62個、至少約63個、至少約64個、至少約65個、至少約66個、至少約67個、至少約68個、至少約69個、至少約70個、至少約71個、至少約72個、至少約73個、至少約74個、至少約75個、至少約76個、至少約77個、至少約78個、至少約79個或至少約80個胺基酸。在一些態樣中，陽離子載體部分包含至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個、至少約100個、至少約110個、至少約120個、至少約130個、至少約140個或至少約150個胺基酸。在一些態樣中，陽離子載體部分包含約10至約60個、約15至約60個、約20至約60個、約25至約60個、約30至約60個、約35至約60個、約40至約60個、約10至約55個、約15至約55個、約20至約55個、約25至約55個、約30至約55個、約35至約55個、約40至約55個、約10至約50個、約15至約50個、約20至約50個、約25至約50個、約30至約50個、約35至約50個、約40至約50個、約10至約45個、約15至約45個、約20至約45個、約25至約45個、約30至約45個、約35至約45個、約40至約45個、約10至約40個、約15至約40個、約20至約40個、約25至約40個、約30至約40個、約35至約40個、約10至約35個、約15至約35個、約20至約35個、約25至約35個、約30至約35個、約35至約35個、約40至約35個或約40至約35個胺基酸。
在一些態樣中，陽離子載體部分包含約10、約20、約30、約40、約50或約60個胺基酸。在一些態樣中，胺基酸包含精胺酸、離胺酸、組胺酸或其任何組合。在一些態樣中，陽離子載體部分包含約20、約30、約40、約50或約60個離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體部分包含約40個離胺酸單體。
在一些態樣中，交聯部分包含一或多個連接至交聯劑之胺基酸。在一些態樣中，交聯劑包含硫醇基、硫醇衍生物或其任何組合。在一些態樣中，交聯劑包含硫醇基。在一些態樣中，交聯部分中之胺基酸包含至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個、至少30個、至少31個、至少32個、至少33個、至少34個、至少35個、至少36個、至少37個、至少38個、至少39個、至少40個、至少41個、至少42個、至少43個、至少44個、至少45個、至少46個、至少47個、至少48個、至少49個或至少50個胺基酸。在一些態樣中，交聯部分中之胺基酸包含約1至約40個、約5至約40個、約10至約40個、約15至約40個、約20至約40個、約1至約35個、約5至約35個、約10至約35個、約15至約35個、約20至約35個、約10至約50個、約15至約50個、約20至約50個、約25至約50個、約30至約40個、約10至約45個、約15至約45個、約20至約45個、約25至約45個、約30至約45個、約10至約40個、約15至約40個、約20至約40個、約25至約40個或約30至約40個胺基酸。在一些態樣中，交聯部分中之胺基酸包含約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50個胺基酸。在一些態樣中，交聯部分中之胺基酸包含精胺酸、離胺酸、組胺酸或其任何組合。在一些態樣中，交聯部分中之胺基酸包含約35個離胺酸。在一些態樣中，交聯部分中之胺基酸包含約23個離胺酸。在一些態樣中，其中交聯部分中之胺基酸包含約16個離胺酸。
在一些態樣中，疏水性部分能夠調節免疫反應、發炎反應及/或組織微環境。在一些態樣中，疏水性部分能夠調節免疫反應。在一些態樣中，疏水性部分能夠調節患有腫瘤之個體中的腫瘤微環境。
在一些態樣中，疏水性部分能夠抑制或減少腫瘤微環境中之缺氧。在一些態樣中，疏水性部分包含一或多個連接至咪唑衍生物、胺基酸、維生素或其任何組合之胺基酸。
在一些態樣中，疏水性部分能夠抑制或減少發炎反應。在一些態樣中，疏水性部分為一或多個連接至維生素之胺基酸。在一些態樣中，維生素包含環或雜原子環及羧基或羥基。
在一些態樣中，維生素包含：
Figure 02_image003
其中Y 1及Y 2中之每一者獨立地選自C、N、O及S，且其中n為1或2。
在一些態樣中，維生素選自由以下組成之群：維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6、維生素B7、維生素B9、維生素B12、維生素C、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素M、維生素H及其任何組合。在一些態樣中，維生素為維生素B3。
在一些態樣中，疏水性部分包含至少約兩個、至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約六個、至少約七個、至少約八個、至少約九個、至少約十個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個、至少約30個、至少約31個或至少32個胺基酸，其各自連接至維生素。在一些態樣中，疏水性部分包含約1至約35個、約1至約30個、約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個、約1至約5個、約5至約35個、約5至約30個、約5至約25個、約5至約20個、約5至約15個、約5至約10個、約10至約35個、約10至約30個、約10至約25個、約10至約20個、約10至約15個、約15至約35個、約15至約30個、約15至約25個、約15至約20個、約20至約35個、約20至約30個、約20至約25個、約25至約30個或約25至約30個胺基酸，其各自連接至維生素。在一些態樣中，疏水性部分包含約2個維生素B3、約3個維生素B3、約4個維生素B3、約5個維生素B3、約6個維生素B3、約7個維生素B3、約8個維生素B3、約9個維生素B3、約10個維生素B3、約11個維生素B3、約12個維生素B3、約13個維生素B3、約14個維生素B3、約15個維生素B3、約16個維生素B3、約17個維生素B3、約18個維生素B3、約19個維生素B3、約20個維生素B3、約21個維生素B3、約22個維生素B3、約23個維生素B3、約24個維生素B3、約25個維生素B3、約26個維生素B3、約27個維生素B3、約28個維生素B3、約29個維生素B3、約30個、約31個、約32個、約33個、約34個或約35個胺基酸，其各自連接至維生素B3。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含約35至約45個離胺酸，交聯部分包含約20至約40個離胺酸-硫醇，且疏水性部分包含約1至約10個離胺酸-維生素B3。在一些態樣中，陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，交聯部分包含約10至約20個離胺酸-硫醇，且疏水性部分包含約1至約10個離胺酸-維生素B3。在一些態樣中，陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，交聯部分包含約10至約30個離胺酸-硫醇，且疏水性部分包含約1至約10個離胺酸-維生素B3。在一些態樣中，陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，交聯部分包含約13至約25個離胺酸-硫醇，且疏水性部分包含約1至約20個離胺酸-維生素B3。在一些態樣中，陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，交聯部分包含約13至約25個離胺酸-硫醇，且疏水性部分包含約1至約20個離胺酸-維生素B3。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含含有約120至約130個PEG單元之水溶性生物聚合物部分。在一些態樣中，陽離子載體單元進一步包含靶向部分(TM)。在一些態樣中，靶向部分能夠靶向組織。在一些態樣中，組織為肝臟、腦、腎臟、肺、卵巢、胰臟、甲狀腺、乳房、胃或其任何組合。在一些態樣中，靶向部分能夠由大型中性胺基酸轉運蛋白1(LAT1)轉運。在一些態樣中，靶向部分為胺基酸。在一些態樣中，靶向部分包含具支鏈或芳香族胺基酸。在一些態樣中，靶向部分為苯丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及/或異白胺酸。在一些態樣中，胺基酸為苯丙胺酸。在一些態樣中，靶向部分連接至水溶性聚合物。在一些態樣中，靶向部分藉由連接體連接至水溶性聚合物。
本揭示案亦提供包含本文所揭示之陽離子載體單元及陰離子有效載荷之微胞，其中陽離子載體複合物之陽離子載體部分與陰離子有效載荷彼此締合。在一些態樣中，締合係共價鍵。在其他態樣中，締合係非共價鍵。在一些態樣中，締合係離子鍵。
在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當混合在一起時能夠形成微胞，且其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約20之間。在一些態樣中，溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20。在一些態樣中，陽離子載體單元之陽離子載體部分之正電荷當與陰離子有效載荷在溶液中混合時足以形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約3、約4、約5、約6、約7、約8或約9。在一些態樣中，陽離子載體單元能夠保護陰離子有效載荷免受DNA酶及/或RNA酶之降解。在一些態樣中，陰離子有效載荷不藉由共價鍵與陽離子載體單元結合，及/或陰離子有效載荷僅經由離子相互作用與陽離子載體單元之陽離子載體部分相互作用。
在一些態樣中，與未併入至微胞中之游離陰離子有效載荷之半衰期相比，陰離子有效載荷之半衰期延長。
在一些態樣中，可與陽離子載體單元混合以形成微胞之陰離子有效載荷包含長度為約1000個核苷酸至約2000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約7之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約5之間或約5與約6之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約4、約5、約6或約7。
在一些態樣中，可與陽離子載體單元混合以形成微胞之陰離子有效載荷包含長度為約2000個核苷酸至約3000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，且其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約9之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約7之間或約7與約8之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約6、約7、約8或約9。
在一些態樣中，可與陽離子載體單元混合以形成微胞之陰離子有效載荷包含長度為約3000個核苷酸至約4000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約10之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約8之間或約8與約9之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約7、約8、約9或約10。
在一些態樣中，微胞之直徑介於約10 nm與約200 nm之間、介於約20 nm與約200 nm之間、介於約1 nm與100 nm之間、介於約10 nm與約100 nm之間、介於約10 nm與約90 nm之間、介於約10 nm與約80 nm之間、介於約10 nm與約70 nm之間、介於約20 nm與約100 nm之間、介於約20 nm與約90 nm之間、介於約20 nm與約80 nm之間、介於約20 nm與約70 nm之間、介於約30 nm與約100 nm之間、介於約30 nm與約90 nm之間、介於約30 nm與約80 nm之間、介於約30 nm與約70 nm之間、介於約40 nm與約100 nm之間、介於約40 nm與約90 nm之間、介於約40 nm與約80 nm之間或介於約40 nm與約70 nm之間。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含核酸。在一些態樣中，核酸包含mRNA、miRNA海綿、強韌誘餌miRNA、cDNA、pDNA、PNA、BNA、(ASO)、適配體或其任何組合。在一些態樣中，核酸包含至少一種核苷類似物。在一些態樣中，核苷類似物包含鎖核酸(LNA)；2'-0-烷基-RNA；2'-胺基-DNA；2'-氟-DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'-氟-ANA、己糖醇核酸(HNA)、嵌入核酸(INA)、約束乙基核苷(cEt)、2'-0-甲基核酸(2'-OMe)、2'-0-甲氧基乙基核酸(2'-MOE)或其任何組合。
在一些態樣中，核酸包含長度為至少約100個、至少約500個、至少約1000個、至少約1500個、至少約2000個、至少約2500個、至少約3000個、至少約3500個或至少約4000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，核苷酸序列具有主鏈，該主鏈包含磷酸二酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯及其組合。在一些態樣中，陽離子載體單元進一步包含靶向部分，該靶向部分視情況經由連接體連接至水溶性聚合物。
本揭示案亦提供組合物，其包含本文所揭示之陽離子載體單元以及陰離子有效載荷。亦提供醫藥組合物，其包含本文所揭示之陽離子載體單元、組合物或微胞以及醫藥學上可接受之載劑。
本揭示案亦提供製備本文所揭示之陽離子載體單元之方法，該方法包括使陽離子載體部分連接至交聯部分及疏水性部分。在一些態樣中，該方法進一步包括連接水溶性聚合物及靶向部分。在一些態樣中，本文所揭示之製備微胞之方法包括將陽離子載體單元與陰離子有效載荷在溶液中混合。在一些態樣中，該方法進一步包括純化微胞。
本揭示案亦提供治療有需要之個體之疾病或疾患的方法，其包括向該個體投與本揭示案之微胞或醫藥組合物。在一些態樣中，在微胞的核心中之陰離子有效載荷展現比未整合至微胞中之相應陰離子有效載荷長之半衰期。在一些態樣中，個體為哺乳動物。
相關申請案之交叉參考
本PCT申請案主張2020年12月30日提出申請之美國臨時申請案第63/199,470號之優先權益，該臨時申請案係以全文引用的方式併入本文中。 電子提交序列表之參考
與本申請案一起提出申請之以ASCII文本檔案電子提交之序列表(名稱：4366_040PC01_Seqlisting _ST25；大小：3,414個位元組；創建日期：2021年12月27日)之內容係以全文引用的方式併入本文中。
本揭示案係關於載體單元，其包含水溶性生物聚合物部分(例如PEG)、帶電荷之部分(例如聚離胺酸)、交聯部分及疏水性部分。當陽離子載體單元與陰離子有效載荷相互作用時，可將該等單元包裝成微胞，其中有效載荷位於微胞之核心且水溶性生物聚合物部分面向溶劑，且其中交聯部分將一個單元與其他載體單元交聯。本揭示案中示出各個態樣之非限制性實例。
在更詳細地闡述本揭示案之前，應理解，本揭示案並不限於所闡述之特定組合物或製程步驟，此乃因其當然可變化。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案後將明瞭，本文所闡述及說明之個別態樣中之每一者具有分立之組件及特徵，該等組件及特徵可在不背離本揭示案之範圍或精神之情形下容易地與其他若干態樣中之任一者之特徵分離或組合。任何所列舉之方法可按所列舉事件之順序或按在邏輯上可能之任何其他順序來實施。
本文所提供之標題不為對本揭示案之各個態樣之限制，該等態樣可藉由參考整個說明書來界定。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定態樣之目的，且不意欲具有限制性，此乃因本揭示案之範圍將僅受隨附申請專利範圍限制。
因此，藉由參考說明書全文更全面地定義下文緊接定義之術語。 I. 定義
為更容易地理解本說明書，首先定義某些術語。其他定義在整個詳細說明中予以陳述。
應注意，術語「一(a或an)」實體係指一或多個該實體；舉例而言，「核苷酸序列」應理解為代表一或多個核苷酸序列。因此，術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。此外應注意，技術方案可設計為不包括任何視情況選用之要素。因此，此陳述意欲用作前置基礎以結合技術方案要素之列舉使用諸如「僅僅」、「僅」及諸如此類等排他性術語，或使用負面限制。
此外，「及/或」在本文中使用時應視為兩種指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之具體揭示內容。因此，在本文中諸如「A及/或B」之片語中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，在諸如「A、B及/或C」之片語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
應理解，凡是本文利用言語「包含」來闡述態樣之處，均亦提供以「由......組成」及/或「基本上由......組成」闡述之其他類似態樣。
除非另有定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與熟習本揭示案相關領域技術者所通常理解相同之含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show，第2版，2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999, Academic Press；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology，修訂版，2000, Oxford University Press向熟習此項技術者提供本揭示案中所使用許多術語之一般性字典。
單位、前綴及符號係以其國際單位制(Système International de Unites，SI)接受之形式來表示。數值範圍包括界定該範圍之數值。倘若列舉值範圍，則應理解，亦具體地揭示在該範圍之所列舉上限與下限之間的每一居間整數值及其每一分率，以及此等值之間的每一子範圍。任何範圍之上限及下限可獨立地包括在該範圍中或自該範圍中排除，且本揭示案內亦涵蓋包括任一限值、兩個限值均不包括或兩個限值均包括在內之每一範圍。因此，本文所列舉之範圍應理解為該範圍內之所有值之簡寫，包括所列舉之端點。舉例而言，1至10之範圍應理解為包括來自由1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群之任何數值、數值組合或子範圍。
倘若明確列舉一值，則應理解，與所列舉值之數量或量大約相同之值亦在本揭示案之範圍內。倘若揭示一組合，則亦具體地揭示該組合之要素之每一子組合，且其在本揭示案之範圍內。相反，倘若個別地揭示不同要素或要素群，則亦揭示其組合。倘若揭示內容之任何要素被揭示為具有複數個替代形式，則在此亦揭示該揭示內容中每一替代形式被單獨地或以與其他替代形式之任何組合排除之實例；揭示內容之一個以上要素可具有此等排除，且在此揭示具有此等排除之要素之所有組合。
核苷酸係由其公認之單字母代碼來提及。除非另有指示，否則核苷酸序列係以5'至3'定向自左向右書寫。核苷酸在本文中係由其普遍已知之由IUPAC-IUB生化命名委員會(Biochemical Nomenclature Commission)推薦之單字母符號來提及。因此，『a』代表腺嘌呤，『c』代表胞嘧啶，『g』代表鳥嘌呤，『t』代表胸腺嘧啶，且『u』代表尿嘧啶。
胺基酸序列係以胺基至羧基定向自左向右書寫。胺基酸在本文中係由其普遍已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生化命名委員會推薦之單字母符號來提及。
術語「約」在本文中用於意指大約、大致、左右或在附近。當術語「約」在結合數值範圍使用時，其藉由將邊界延伸至高於及低於所陳述之數值來修飾該範圍。一般而言，術語「約」可以上下(更高或更低)例如10%之方差修飾高於及低於所述值之數值。
術語「投與(administration、administering)」及其文法變體係指經由醫藥學上可接受之途徑將組合物(諸如本揭示案之微胞)引入至個體中。將組合物(諸如本揭示案之微胞)引入至個體中係藉由任何適宜途徑，包括腫瘤內、經口、經肺、鼻內、非經腸(靜脈內、動脈內、肌內、腹膜內或皮下)、經直腸、淋巴內、鞘內、眼周或外用。投與包括自投與及由另一者投與。適宜投與途徑容許組合物或劑發揮其預期功能。舉例而言，若適宜途徑為靜脈內，則藉由將組合物或劑引入至個體靜脈中來投與組合物。
如本文所用，術語「大約」在應用於一或多個所關注之值時，係指與所述參考值相似之值。在某些態樣中，除非另有說明或自上下文另外明顯可見，否則術語「大約」係指在任一方向(大於或小於)上處於所述參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小以內之值範圍(此數值將超過可能值之100%之情形除外)。
如本文所用，術語「保守」係指多核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基分別在所比較之兩個或更多個序列之相同位置中出現而不改變。相對保守之核苷酸或胺基酸係相較於序列中其他處出現的核苷酸或胺基酸在更相關之序列中保守之彼等核苷酸或胺基酸。
在一些態樣中，若兩個或更多個序列彼此100%一致，則稱其為「完全保守」或「一致」的。在一些態樣中，若兩個或更多個序列彼此至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則稱其為「高度保守」的。在一些態樣中，若兩個或更多個序列彼此約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則稱其為「高度保守」的。在一些態樣中，若兩個或更多個序列彼此至少30%一致、至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則稱其為「保守」的。在一些態樣中，若兩個或更多個序列彼此約30%一致、約40%一致、約50%一致、約60%一致、約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則稱其為「保守」的。序列保守性可適用於多核苷酸或多肽之整個長度或可適用於其部分、區域或特徵。
如本文所用，術語「源自」係指自指定分子或生物體分離或使用指定分子或生物體製得之組分，或來自指定分子或生物體之資訊(例如胺基酸或核酸序列)。舉例而言，源自第二核酸序列之核酸序列可包括與第二核酸序列之核苷酸序列一致或實質上類似之核苷酸序列。在核苷酸或多肽之情形下，衍生物質可藉由(例如)天然誘變、人工定向誘變或人工隨機誘變來獲得。用於衍生核苷酸或多肽之誘變可為有意定向的或有意隨機的，或兩者均有。使核苷酸或多肽誘變以產生源自第一核苷酸或多肽之不同核苷酸或多肽可為隨機事件(例如由聚合酶失真引起)，且所衍生之核苷酸或多肽可藉由適當篩選方法來鑑別，例如如本文所論述之篩選方法。使多肽誘變通常需要操縱編碼該多肽之多核苷酸。在一些態樣中，源自第二核苷酸或胺基酸序列之核苷酸或胺基酸序列與該第二核苷酸或胺基酸序列分別具有至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%、至少約57%、至少約58%、至少約59%、至少約60%、至少約61%、至少約62%、至少約63%、至少約64%、至少約65%、至少約66%、至少約67%、至少約68%、至少約69%、至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%之序列一致性，其中第一核苷酸或胺基酸序列保留第二核苷酸或胺基酸序列之生物活性。
術語「互補」及「互補性」係指兩個或更多個寡聚物(亦即各自包含核鹼基序列)或寡聚物與靶基因之間藉由沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基配對法則彼此相關。舉例而言，核鹼基序列「T-G-A (5’→3’)」與核鹼基序列「A-C-T (3’→5’)」互補。互補可為「部分」的，其中根據鹼基配對法則，給定核鹼基序列之少於所有核鹼基與另一核鹼基序列匹配。舉例而言，在一些態樣中，給定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間的互補性可為約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。另一方面，在給定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間可存在「完全」或「完美」(100%)互補性以使實例繼續。核鹼基序列之間的互補程度對序列之間的雜交效率及強度具有顯著效應。
術語「下游」係指位於參考核苷酸序列3’之核苷酸序列。在某些態樣中，下游核苷酸序列係指轉錄起始點後之序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點之下游。
術語「賦形劑」及「載劑」可互換使用，且係指添加至醫藥組合物中以進一步有助於化合物投與之惰性物質。
如本文所用，術語「同源性」係指聚合分子之間的總體相關性，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間。通常，術語「同源性」隱含兩個分子之間的演化關係。因此，同源之兩個分子將具有共同之演化祖先。在本揭示案之背景中，術語同源性涵蓋一致性及相似性二者。
在一些態樣中，若分子中至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%之單體一致(完全相同之單體)或相似(保守取代)，則視聚合分子彼此「同源」。術語「同源」必然係指至少兩個序列(多核苷酸或多肽序列)之間的比較。
如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間的總體單體保守性，例如多肽分子或多核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間。沒有任何額外限定符之術語「一致」，例如蛋白質A與蛋白質B一致，意味著序列100%一致(100%序列一致性)。將兩個序列描述為例如「70%一致」等效於將其描述為具有例如「70%序列一致性」。
舉例而言，出於最佳比較目的，可藉由將兩個序列對齊來計算兩個多肽或多核苷酸序列之一致性百分比(例如，可將空位引入第一及第二多肽或多核苷酸序列中之一者或兩者中以達成最佳對齊，且出於比較目的可忽視非一致序列)。在某些態樣中，出於比較目的對齊之序列長度為參考序列長度之至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或約100%。接著比較相應胺基酸位置處之胺基酸，或在多核苷酸之情形下為鹼基。
當第一序列中之位置由與第二序列中相應位置處之相同胺基酸佔據時，則分子在該位置處為一致的。兩個序列之間的一致性百分比隨該等序列共享之一致位置數而變化，其中考慮到為達成兩個序列之最佳對齊而需要引入之空位數及每一空位之長度。兩個序列之間的序列比較及一致性百分比測定可使用數學演算法來完成。
適宜軟體程式可自各種來源獲得，且用於蛋白質及核苷酸序列二者之對齊。測定序列一致性百分比之一個適宜程式係bl2seq，其為可自美國政府之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) BLAST網站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得之BLAST程式套件之一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP演算法實施兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他適宜程式係(例如) Needle、Stretcher、Water或Matcher，其為EMBOSS生物資訊學程式套件之一部分，且亦可自歐洲生物資訊學研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)在www.ebi.ac.uk/ Tools/psa獲得。
序列對齊可使用此項技術中已知之方法來進行，諸如MAFFT、Clustal (ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等。
單一多核苷酸或多肽靶序列內與多核苷酸或多肽參考序列對齊之不同區域可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，序列一致性百分比之值舍入至小數點後一位。舉例而言，將80.11、80.12、80.13及80.14向下舍入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上舍入至80.2。亦應注意，長度值將始終為整數。
在某些態樣中，將第一胺基酸序列(或核酸序列)與第二胺基酸序列(或核酸序列)之一致性百分比(ID%)計算為ID% = 100 × (Y/Z)，其中Y為在第一與第二序列之對齊(如藉由目視檢查或特定序列對齊程式進行對齊)中評定為一致匹配之胺基酸殘基(或核鹼基)數目，且Z為第二序列中之殘基總數。若第一序列之長度長於第二序列，則第一序列與第二序列之一致性百分比將高於第二序列與第一序列之一致性百分比。
熟習此項技術者應瞭解，用於計算序列一致性百分比之序列對齊之生成並不限於僅由一級序列資料驅動之二元序列-序列比較。亦應瞭解，序列對齊可藉由將序列資料與來自異源來源之資料(諸如結構資料(例如結晶蛋白結構)、功能資料(例如突變位置)或譜系學資料)整合來生成。整合異源資料以生成多個序列對齊之適宜程式為T-Coffee，其可在www.tcoffee.org獲得，且替代地可自(例如) EBI獲得。亦應瞭解，用於計算序列一致性百分比之最終對齊可自動或手動進行。
如本文所用，術語「分離」、「純化」、「提取」及其文法變體可互換使用，且係指已經歷一或多個純化製程之本揭示案之期望組合物之製備狀態。在一些態樣中，如本文所用之分離或純化係自含有污染物之樣品中去除、部分去除(例如一部分)本揭示案之組合物之製程。在一些態樣中，經分離之組合物不具有可偵測到之不期望活性，或替代地，不期望活性之水準或量為可接受之水準或量或低於可接受之水準或量。在其他態樣中，經分離之組合物所具有之本揭示案之期望組合物之量及/或濃度為可接受之量及/或濃度及/或活性，或高於可接受之量及/或濃度及/或活性。在其他態樣中，與組合物所獲自之起始材料相比，經分離之組合物被富集。與起始材料相比，此富集可為至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.9%、至少約99.99%、至少約99.999%、至少約99.9999%或大於99.9999%。在一些態樣中，經分離之製劑實質上不含殘餘生物產物。在一些態樣中，經分離之製劑100%不含、至少約99%不含、至少約98%不含、至少約97%不含、至少約96%不含、至少約95%不含、至少約94%不含、至少約93%不含、至少約92%不含、至少約91%不含或至少約90%不含任何污染性生物物質。殘餘生物產物可包括非生物性材料(包括化學品)或不需要之核酸、蛋白質、脂質或代謝物。
如本文所用之術語「連接」係指第一胺基酸序列或多核苷酸序列分別共價或非共價接合至第二胺基酸序列或多核苷酸序列。第一胺基酸或多核苷酸序列可與第二胺基酸或多核苷酸序列直接接合或並置，或替代地插入序列可將第一序列共價接合至第二序列。術語「連接」不僅意指第一多核苷酸序列與第二多核苷酸序列在5’端或3’端融合，且亦包括將整個第一多核苷酸序列(或第二多核苷酸序列)插入至第二多核苷酸序列(或分別第一多核苷酸序列)中之任兩個核苷酸間。第一多核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接體連接至第二多核苷酸序列。連接體可為(例如)多核苷酸。
術語「錯配(mismatch或mismatches)」係指根據鹼基配對法則，寡聚物核鹼基序列中不與靶標前mRNA匹配之一或多個核鹼基(無論為鄰接的還是單獨的)。雖然通常期望完美互補，但一些態樣可包括一或多個但較佳6、5、4、3、2或1個關於靶標前mRNA之錯配。寡聚物內任何位置處之變異包括在內。在某些態樣中，本揭示案之反義寡聚物包括末端附近之核鹼基序列中之變異、內部之變異，且若存在，則通常在5'及/或3'末端之約6、5、4、3、2或1個亞單元內。在某些態樣中，可去除一個、兩個或三個核鹼基，且仍提供靶控結合。
如本文所用，術語「調節」、「修飾」及其文法變體在應用於具體濃度、水準、表現、功能或行為時，通常係指藉由增加或減少進行改變之能力，例如直接或間接促進/刺激/上調或干擾/抑制/下調具體濃度、水準、表現、功能或行為，諸如作為拮抗劑或促效劑。在一些情況中，相對於對照、或相對於通常將預期之平均活性水準或相對於對照活性水準，調節劑可增加及/或減少某一濃度、水準、活性或功能。
「核酸」、「核酸分子」、「核苷酸序列」、「多核苷酸」及其文法變體可互換使用，且係指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；「RNA分子」)或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷或去氧胞苷；「DNA分子」)之磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯及硫酯，其呈單股形式或雙股螺旋。單股核酸序列係指單股DNA(ssDNA)或單股RNA(ssRNA)。雙股DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋係可能的。術語核酸分子且特定而言DNA或RNA分子僅係指分子之一級及二級結構，且不將其限於任何特定之三級形式。因此，此術語包括尤其在線性或環狀DNA分子(例如限制片段)、質體、超螺旋DNA及染色體中發現之雙股DNA。在論述特定雙股DNA分子之結構時，本文可根據正常慣例描述序列，亦即僅給出沿DNA之非轉錄股5’至3’方向上之序列(亦即具有與mRNA同源之序列之股)。「重組DNA分子」係已經歷分子生物學操縱之DNA分子。DNA包括(但不限於) cDNA、基因體DNA、質體DNA、合成DNA及半合成DNA。本揭示案之「核酸組合物」包含如本文所闡述之一或多種核酸。
如本文所用之片語「非經腸投與(parenteral administration及administered parenterally)」意指除腸內及外用投與以外之投與模式，通常藉由注射來進行，且包括(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、框內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內及胸骨內注射及輸注。
術語「醫藥學上可接受之載劑」、「醫藥學上可接受之賦形劑」及其文法變化形式涵蓋由美國聯邦政府之管理機構批准或美國藥典中所列示之用於動物(包括人類)之任何劑，以及不會引起產生在某種程度上阻止將組合物投與給個體之不合意生理效應且不會消除所投與化合物之生物活性及性質之任何載劑或稀釋劑。包括可用於製備醫藥組合物且通常安全、無毒及合意之賦形劑及載劑。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指本文所闡述化合物中之一或多者，諸如本揭示案之微胞，其與一或多種其他化學組分(諸如醫藥學上可接受之載劑及賦形劑)混合或摻和或懸浮於其中。醫藥組合物之一個目的係有助於向個體投與微胞製劑。
如本文所用之術語「多核苷酸」係指任何長度之核苷酸聚合物，包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物。此術語係指分子之一級結構。因此，該術語包括三股、雙股及單股去氧核糖核酸(「DNA」)，以及三股、雙股及單股核糖核酸(「RNA」)。其亦包括多核苷酸之經修飾(例如藉由烷基化及/或藉由封端)及未經修飾之形式。
更特定而言，術語「多核苷酸」包括多去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)；多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA及mRNA，無論為剪接的還是未剪接的；任何其他類型之作為嘌呤或嘧啶鹼基之N-糖苷或C-糖苷之多核苷酸；及含有非核苷酸(normucleotidic)主鏈之其他聚合物，例如聚醯胺(例如肽核酸「PNA」)及聚嗎啉基聚合物；及其他合成序列特異性核酸聚合物，條件係該等聚合物含有核鹼基，其構形容許鹼基配對及鹼基層疊，諸如在DNA及RNA中所發現的。
在本揭示案之一些態樣中，多核苷酸可為(例如)RNA，例如mRNA，或DNA。在一些態樣中，RNA為合成RNA。在一些態樣中，合成RNA包含至少一個非天然核鹼基。在一些態樣中，某一類別之所有核鹼基均已經非天然核鹼基替代(例如本文所揭示之多核苷酸中之所有尿苷均可經非天然核鹼基(例如5-甲氧基尿苷)替代)。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，以指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可包含經修飾之胺基酸。該等術語亦涵蓋經天然或間插修飾之胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾(諸如與標記組分結合)。該定義內亦包括(例如)含有胺基酸(包括例如非天然胺基酸，諸如高半胱胺酸、鳥胺酸、對乙醯基苯丙胺酸、D-胺基酸及肌酸)之一或多種類似物之多肽，以及此項技術中已知之其他修飾。如本文所用，術語「多肽」係指任何大小之蛋白質、多肽及肽、結構或功能。多肽包括基因產物、天然多肽、合成多肽、同系物、異種同源物、同種同源物、片段及前述物質之其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單一多肽或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽。最常見地，在多鏈多肽中發現二硫鍵聯。術語多肽亦可應用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然胺基酸之人工化學類似物。在一些態樣中，「肽」之長度可小於或等於50個胺基酸，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
在陽離子載體之背景中使用之任何胺基酸(例如離胺酸)藉由具有其天然側基(例如離胺酸之-NH 3 +)或藉由具有經修飾之側基而具有正電荷。在交聯部分或疏水性部分之背景中使用之任何胺基酸(例如離胺酸)可不具有任何正電荷，且可藉由醯胺鍵或連接體分別連接至交聯劑(例如硫醇)或疏水劑(例如維生素B3)。
如本文所用，本文所用之術語「N/P比」意指當陽離子載體單元與陰離子有效載荷在溶液中混合在一起時，陽離子載體單元之陽離子載體部分中之質子化胺對陰離子有效載荷中之磷酸酯之莫耳比。
如本文所用之術語「預防(prevent、preventing)」及其變體係指部分或完全地延遲疾病、病症及/或疾患之發作；部分或完全地延遲特定疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀、特徵或臨床表現之發作；部分或完全地延遲特定疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀、特徵或表現之發作；部分或完全地延遲自特定疾病、病症及/或疾患進展；及/或降低發生與疾病、病症及/或疾患相關之病理之風險。在一些態樣中，經由預防性治療達成預防結果。
如本文所用，「預防性」係指用於預防疾病或疾患之發作或用於預防或延遲與疾病或疾患相關之症狀之治療或作用過程。
如本文所用，「預防」係指為維持健康且預防或延遲出血事件之發作，或為預防或延遲與疾病或疾患相關之症狀而採取之措施。
如本文所用，術語「相似性」係指聚合分子之間的總體相關性，例如多核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間。可以與計算一致性百分比相同之方式來計算聚合分子彼此之相似性百分比，只是相似性百分比之計算考慮如此項技術中所理解之保守取代。應理解，相似性百分比取決於所使用之比較量表，亦即是否例如根據以下來比較胺基酸：其演化接近度、電荷、體積、撓性、極性、疏水性、芳香性、等電點、抗原性或其組合。
術語「個體(subject)」、「患者」、「個體(individual)」及「宿主」以及其變體在本文中可互換使用，且係指期望診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體，包括(但不限於)人類、家養動物(例如狗、貓及諸如此類)、農場動物(例如牛、綿羊、豬、馬及諸如此類)及實驗室動物(例如猴、大鼠、小鼠、兔、天竺鼠及諸如此類)，特定而言人類。本文所闡述之方法適用於人類療法及獸醫學應用二者。
如本文所用，片語「有需要之個體」包括將受益於投與本揭示案之微胞(例如改良止血)之個體，諸如哺乳動物個體。
如本文所用之片語「全身投與(systemic administration、administered systemically)」及「外周投與(peripheral administration、administered peripherally)」意指以除直接進入中樞神經系統以外之方式投與化合物、藥物或其他材料，使得其進入患者全身且由此經受代謝及其他類似過程，例如皮下投與。
如本文所用，術語「治療有效量」係包含本揭示案之微胞之試劑或醫藥化合物足以對有需要之個體產生期望治療性效應、藥理學及/或生理學效應之量。治療有效量可為「預防有效量」，此乃因預防可視為療法。
如本文所用之術語「治療(treat、treatment或treating)」係指例如降低疾病或疾患之嚴重程度；縮短疾病過程之持續時間；改善或消除與疾病或疾患相關之一或多種症狀；向患有疾病或疾患之個體提供有益效應，而不一定治癒該疾病或疾患。該術語亦包括預防(prophylaxis或prevention)疾病或疾患或其症狀。在一態樣中，術語「治療(treating或treatment)」意指在個體中誘導針對抗原之免疫反應。
術語「上游」係指位於參考核苷酸序列5’之核苷酸序列。 II. 載體單元
本揭示案提供可自組裝成微胞或併入至微胞中之載體單元。本揭示案之載體單元包含水溶性生物聚合物部分(例如PEG)、帶電荷之載體部分、交聯部分及疏水性部分。在一些態樣中，如 圖 1中所例示，帶電荷之載體部分為陽離子的(例如聚離胺酸)。
本揭示案之載體單元可用於遞送帶負電荷之有效載荷(例如治療劑或診斷劑)。在一些態樣中，可藉由微胞遞送之帶負電荷之有效載荷包含至少約100、至少約1000、至少約2000、至少約3000或至少約4000長度之核苷酸。具有帶陽離子電荷之載體部分之載體單元可用於遞送陰離子有效載荷，例如多核苷酸。具有帶陰離子電荷之載體部分之載體單元可用於遞送陽離子有效載荷，例如帶正電荷之小分子藥物。參見 圖 1。在一些態樣中，帶陽離子電荷之載體部分與陰離子有效載荷可彼此靜電相互作用。
所得載體單元:有效載荷複合物可具有包含水溶性生物聚合物部分之「頭」及包含靜電結合至有效載荷之陽離子載體部分之「尾」。
載體單元：有效載荷複合物單獨或與其他分子組合時可自締合，以產生微胞，其中陰離子有效載荷位於微胞之核心且水溶性生物聚合物部分面向溶劑。術語「本揭示案之微胞」不僅涵蓋經典微胞，且亦涵蓋小顆粒、小微胞、微胞、桿狀結構或聚合物囊泡。鑑於聚合物囊泡包含腔空間，應理解，與經典微胞之「核心」相關之所有揭示內容同樣適用於包含本揭示案之載體單元之聚合物囊泡中之腔空間。
本揭示案之載體單元亦可包含經由一或多個視情況選用之連接體共價連接至水溶性生物聚合物部分之靶向部分(例如靶向配位體)。一旦形成微胞，靶向部分可位於微胞之表面上，且可將微胞遞送至特定靶組織、特定細胞類型及/或有助於跨生理障壁(例如細胞質膜)轉運。在一些態樣中，本揭示案之微胞可包含一種以上類型之靶向部分。
本揭示案之載體單元亦可包含共價連接至帶電荷之陽離子載體部分之疏水性部分(HM)。疏水性部分可具有(例如)治療、共治療效應，或正向影響靶細胞或靶組織之穩態。在一些態樣中，HM包含一或多個胺基酸。在一些態樣中，HM包含一或多個連接至疏水性分子(例如維生素)之胺基酸。在一些態樣中，HM包含一或多個共價結合至疏水性分子(例如維生素)之離胺酸殘基。
在一些態樣中，陰離子有效載荷不與載體單元共價連接。然而，在其他態樣中，陰離子有效載荷可共價連接至陽離子載體單元，例如連接體，諸如可裂解連接體。
本揭示案中示出各個態樣之非限制性實例。本揭示案特定而言係關於陽離子載體單元之用途，例如用於遞送陰離子有效載荷，諸如核酸。然而，熟習此項技術者將明瞭，藉由逆轉載體部分與有效載荷之電荷(亦即，使用載體單元中之陰離子載體部分遞送陽離子有效載荷)，或藉由使用連接至將分別與陰離子或陽離子載體部分靜電相互作用之陽離子或陰離子適配體之中性有效載荷，本揭示案可同樣應用於陽離子有效載荷之遞送或中性有效載荷之遞送。
因此，在一態樣中，本揭示案提供圖式I至圖式VI之陽離子載體單元 [CC]-L1-[CM]-L2-[HM] (圖式I)； [CC]-L1-[HM]-L2-[CM] (圖式II)； [HM]-L1-[CM]-L2-[CC] (圖式III)； [HM]-L1-[CC]-L2-[CM] (圖式IV)； [CM]-L1-[CC]-L2-[HM] (圖式V)；或 [CM]-L1-[HM]-L2-[CC] (圖式VI)； 其中 CC為陽離子載體部分，例如聚離胺酸； CM為交聯部分； HM為疏水性部分，例如維生素，例如維生素B3；且， L1及L2獨立地為視情況選用之連接體。
在一些態樣中，陽離子載體單元進一步包含水溶性聚合物(WP)。在一些態樣中，水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]及/或[CM]。在一些態樣中，水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]或[CM]之N末端。在一些態樣中，水溶性聚合物附接至[CC]之N末端。在一些態樣中，水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]或[CM]之C末端。在一些態樣中，水溶性聚合物附接至[CC]之C末端。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含： [WP]-L3-[CC]-L1-[CM]-L2-[HM] (圖式I’)； [WP]-L3-[CC]-L1-[HM]-L2-[CM] (圖式II’)； [WP]-L3-[HM]-L1-[CM]-L2-[CC] (圖式III’)； [WP]-L3-[HM]-L1-[CC]-L2-[CM] (圖式IV’)； [WP]-L3-[CM]-L1-[CC]-L2-[HM] (圖式V’)；或 [WP]-L3-[CM]-L1-[HM]-L2-[CC] (圖式VI’)。
在上文所示圖式I’至VI’之構築體之一些態樣中，[WP]組分可與至少一個靶向部分連結，亦即[T] n-[WP]-……，其中n為整數，例如1、2或3。
圖 2A- 圖 2E呈現本揭示案之陽離子載體單元之示意圖示。為簡單起見， 圖 2A- 圖 2E中之單元以線性方式表示。然而，在一些態樣中，載體單元可包含以分支骨架排列組織之CC、CM及HM部分(參見 圖 2及 圖 3)，例如具有(i)聚合CC部分，其包含帶正電荷之單元(例如聚離胺酸)及(ii)CM(例如連接至交聯劑之離胺酸，例如離胺酸-硫醇)，其附接至該CC部分之N或C末端及(iii)HM(例如連接至疏水劑之離胺酸，例如連接至維生素B3之離胺酸)，其附接至該CM部分之N或C末端。
當本揭示案之陽離子載體單元與陰離子有效載荷(例如核酸)以約20:約1(亦即陰離子有效載荷中之負電荷數為陽離子載體部分中之正電荷數之約20倍)至約20:1(亦即陽離子載體部分中之正電荷數為陰離子有效載荷中之負電荷數之約十倍)之離子比混合時，主要經由靜電相互作用由陽離子載體部分中之正電荷中和陰離子有效載荷中之負電荷導致形成陽離子載體單元：陰離子有效載荷複合物，該複合物具有未改變之親水性部分(包含WP部分)及實質上更疏水之部分(由陽離子載體部分加上疏水性部分與陰離子有效載荷之間的締合產生)。
在一些態樣中，疏水性部分可將其自身之正電荷貢獻給陽離子載體部分之正電荷，其將與陰離子有效載荷之負電荷相互作用。應理解，對陽離子載體部分與陰離子有效載荷之間的相互作用(例如靜電相互作用)之提及亦涵蓋陽離子載體部分加上疏水性部分之電荷與陰離子有效載荷之電荷之間的相互作用。
由於陽離子載體單元之陽離子載體部分之正電荷經由與陰離子有效載荷之負電荷靜電相互作用而被中和，其疏水性增加，此產生兩親性複合物。此等兩親性複合物可單獨或與其他兩親性組分組合自組織成微胞。所得微胞包含面向溶劑之WP部分(亦即WP部分面向微胞之外表面)，而CC及HM部分以及所締合之有效載荷(例如核苷酸序列，例如RNA、DNA或其任何組合)處於微胞之核心中。
在一些具體態樣中，陽離子載體單元包含： (a) WP部分，其中水溶性生物聚合物為式III之聚乙二醇(PEG)(參見下文)，其中 n介於約120至約PEG 130之間(例如PEG為PEG5000或PEG6000)； (b) CC部分，其中陽離子載體部分包含(例如)約20至約100個離胺酸(例如線性聚(L-離胺酸)n，其中n介於約30與約40之間)、聚乙烯亞胺(PEI)或幾丁聚糖； (c) CM部分，其中交聯部分包含約10至約50個離胺酸，其各自連接至交聯劑，例如10-40個離胺酸-硫醇，及 (d) HM部分，其中疏水性部分具有約1至約20個離胺酸，其各自連接至維生素B3單元。
在一些具體態樣中，陽離子載體單元包含： (a) WP部分，其中水溶性生物聚合物為式III之聚乙二醇(PEG)(參見下文)，其中 n介於約120至約PEG 130之間(例如PEG為PEG5000或PEG6000)； (b) CC部分，其中陽離子載體部分包含(例如)約20至約100個離胺酸(例如線性聚(L-離胺酸)n，其中n介於約30與約40之間)、聚乙烯亞胺(PEI)或幾丁聚糖； (c) CM部分，其中交聯部分包含約10至約50個離胺酸，其各自連接至交聯劑，例如10-40個離胺酸-硫醇，及 (d) HM部分，其中疏水性部分具有約1至約10個離胺酸，其各自連接至維生素B3單元。
在一些具體態樣中，陽離子載體單元包含： (a) WP部分，其中水溶性生物聚合物為式III之聚乙二醇(PEG)(參見下文)，其中 n介於約120至約PEG 130之間(例如PEG為PEG5000或PEG6000)； (b) CC部分，其中陽離子載體部分包含(例如)約20至約100個離胺酸(例如線性聚(L-離胺酸)n，其中n介於約30與約40之間)、聚乙烯亞胺(PEI)或幾丁聚糖； (c) CM部分，其中交聯部分包含約10至約50個離胺酸，其各自連接至交聯劑，例如10-40個離胺酸-硫醇，及 (d) HM部分，其中疏水性部分具有約5至約10個離胺酸，其各自連接至維生素B3單元。
在一些具體態樣中，陽離子載體單元包含： (a) WP部分，其中水溶性生物聚合物為式III之聚乙二醇(PEG)(參見下文)，其中 n介於約120至約PEG 130之間(例如PEG為PEG5000或PEG6000)； (b) CC部分，其中陽離子載體部分包含(例如)約20至約100個離胺酸(例如線性聚(L-離胺酸)n，其中n介於約30與約40之間，例如約40)、聚乙烯亞胺(PEI)或幾丁聚糖； (c) CM部分，其中交聯部分包含約10至約50個離胺酸，其各自連接至交聯劑，例如10-40個離胺酸-硫醇，例如35個離胺酸-硫醇，及 (d) HM部分，其中疏水性部分具有約1至約5個離胺酸，其各自連接至維生素B3單元。
在一些態樣中，陽離子載體單元進一步包含至少一個附接至陽離子載體單元之WP部分之靶向部分。在一些態樣中，微胞表面上展示之靶向部分之數目及/或密度可藉由使用具有靶向部分之陽離子載體單元對不具有靶向部分之陽離子載體單元之特定比率來調節。在一些態樣中，具有靶向部分之陽離子載體單元對不具有靶向部分之陽離子載體單元之比率為至少約1:5、至少約1:10、至少約1:20、至少約1:30、至少約1:40、至少約1:50、至少約1:60、至少約1:70、至少約1:80、至少約1:90、至少約1:100、至少約1:120、至少約1:140、至少約1:160、至少約1:180、至少約1:200、至少約1:250、至少約1:300、至少約1:350、至少約1:400、至少約1:450、至少約1:500、至少約1:600、至少約1:700、至少約1:800、至少約1:900或至少約1:1000。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含 (i) 靶向部分(A)，其靶向轉運蛋白LAT1(例如苯丙胺酸)， (ii) 水溶性聚合物，其為PEG， (iii) 陽離子載體部分，其包含為離胺酸之陽離子聚合物嵌段， (iv) 交聯部分，其包含交聯聚合物嵌段，該等嵌段為連接至交聯部分之離胺酸，及 (v) 疏水性部分，其包含疏水性聚合物嵌段，該等嵌段為連接至維生素B3之離胺酸。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含 (i) 靶向部分(A)，其靶向轉運蛋白LAT1(例如苯丙胺酸)， (ii) 水溶性聚合物，其為PEG，其中n= 100-200，例如100-150，例如120-130， (iii) 陽離子載體部分，其包含陽離子聚合物嵌段，例如聚離胺酸， (iv) 交聯部分，其包含交聯聚合物嵌段，該等嵌段為連接至交聯部分之離胺酸，及 (iv) 疏水性部分，其包含疏水性聚合物嵌段，該等嵌段為連接至維生素B3之離胺酸。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含 (i) 靶向部分(A)，其靶向轉運蛋白LAT1(例如苯丙胺酸)， (ii) 水溶性聚合物，其為PEG，其中n=100-200，例如100-150，例如120-130， (iii) 陽離子載體部分，其包含陽離子聚合物嵌段，例如10-100個離胺酸，例如10-50個離胺酸，例如30-40個離胺酸， (iv) 交聯部分，其包含交聯聚合物嵌段，該等嵌段為連接至交聯部分之離胺酸，及 (iv) 疏水性部分，其包含疏水性聚合物嵌段，該等嵌段為連接至維生素B3之離胺酸。
在一些態樣中，HM之數目(百分比)相對於[CC]及[CM]少於39%、少於約35%、少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或約1%。在一些態樣中，HM之數目(百分比)相對於[CC]及[CM]介於約35%與約1%之間、約35%與約5%之間、約35%與約10%之間、約35%與約15%之間、約35%與約20%之間、約35%與約25%之間、約35%與約30%之間、約30%與約1%之間、約30%與約5%之間、約30%與約10%之間、約30%與約15%之間、約30%與約20%之間、約30%與約25%之間、約25%與約1%之間、約25%與約5%之間、約25%與約10%之間、約25%與約15%之間、約25%與約20%之間、約20%與約1%之間、約20%與約5%之間、約20%與約10%之間、約20%與約15%之間、約15%與約1%之間、約15%與約5%之間、約15%與約10%之間、約10%與約1%之間或約10%與約5%之間。在一些態樣中，HM之數目(百分比)相對於[CC]及[CM]介於約39%與約30%之間、約30%與約20%之間、約20%與約10%之間、約10%與約5%之間及約5%與約1%之間。在一些態樣中，HM之數目(百分比)相對於[CC]及[CM]為約39%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%或約1%。在一些態樣中，HM之數目表述為[HM]相對於[CC]及[CM]之百分比。
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元與長度為約100至約1000個核苷酸之核苷酸有效載荷相互作用。在一些態樣中，長度為約100至約1000個核苷酸之核苷酸有效載荷編碼一或多種蛋白質或其片段，例如PAPD5/7或其任何片段。在一些態樣中，載體單元與長度為約100至約1000個核苷酸之核苷酸有效載荷複合形成微胞。
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元與長度為約1000至約2000個核苷酸之核苷酸有效載荷相互作用。在一些態樣中，長度為約1000至約2000個核苷酸之核苷酸有效載荷編碼一或多種蛋白質或其片段，例如G蛋白或其任何片段。在一些態樣中，載體單元與長度為約1000至約2000個核苷酸之核苷酸有效載荷複合形成微胞。
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元與長度為約2000至約3000個核苷酸之核苷酸有效載荷相互作用。在一些態樣中，長度為約2000至約3000個核苷酸之核苷酸有效載荷編碼一或多種蛋白質或其片段，例如Gephyrin或其任何片段。在一些態樣中，載體單元與長度為約2000至約3000個核苷酸之核苷酸有效載荷複合形成微胞。
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元與長度為約3000至約4000個核苷酸之核苷酸有效載荷相互作用。在一些態樣中，長度為約3000至約4000個核苷酸之核苷酸有效載荷編碼一或多種蛋白質或其片段，例如MDA5(IFIH1)或其任何片段。在一些態樣中，載體單元與長度為約3000至約4000個核苷酸之核苷酸有效載荷複合形成微胞。
在一些態樣中，在適宜結合試劑(例如1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS))存在下，例如藉由離胺酸中之NH 2基團與維生素B3之COOH基團之間的偶合反應，將維生素B3單元引入至HM部分之側鏈中。
本揭示案提供組合物，其包含本揭示案之載體單元(例如陽離子載體單元)。在其他態樣中，本揭示案提供複合物，其包含非共價附接至有效載荷(例如陰離子有效載荷，諸如核苷酸序列，例如RNA、DNA或其任何組合)之本揭示案之載體單元(例如陽離子載體單元)，其中該載體單元與該有效載荷靜電相互作用。在其他態樣中，本揭示案提供結合物，其包含共價附接至有效載荷(例如陰離子有效載荷，諸如核苷酸序列，例如RNA、DNA或其任何組合)之本揭示案之載體單元(例如陽離子載體單元)，其中該載體單元與該有效載荷靜電相互作用。在一些態樣中，載體單元與有效載荷可經由可裂解連接體連接。在一些態樣中，載體單元與有效載荷除靜電相互作用以外，亦可共價相互作用(例如，在靜電相互作用之後，載體單元與有效載荷可經由二硫鍵或可裂解鍵「鎖定」)。
在一些具體態樣中，陽離子載體單元包含水溶性聚合物，其包含具有約120至約130個單元之PEG；陽離子載體部分，其包含具有約20至約60個離胺酸單元之聚離胺酸；交聯部分，其包含約3至約40個離胺酸-硫醇單元；及疏水性部分，其包含約1至約20個連接至維生素B3單元之離胺酸。
在一些態樣中，陽離子載體單元與帶負電荷之有效載荷(例如核苷酸序列，例如RNA、DNA或其任何組合)締合，該帶負電荷之有效載荷經由至少一個與陽離子載體單元之陽離子載體部分之離子鍵(亦即經由靜電相互作用)與陽離子載體單元相互作用。
下文詳細地揭示本揭示案之陽離子載體單元之具體組分。 a. 水溶性生物聚合物
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元包含至少一個水溶性生物聚合物。如本文所用之術語「水溶性生物聚合物」係指生物相容性、生物惰性、非免疫原性、無毒及親水性聚合物，例如PEG。
在一些態樣中，水溶性聚合物包含聚(伸烷基二醇)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸羥基烷基酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚磷腈、聚噁唑啉(「POZ」)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)或其任何組合。在一些態樣中，水溶性生物聚合物為線性、分支或樹枝狀的。
在一些態樣中，水溶性生物聚合物包含聚乙二醇(「PEG」)、聚甘油(「PG」)或聚(丙二醇)(「PPG」)。PPG之毒性小於PEG，故現在許多生物產物以PPG而非PEG產生。
在一些態樣中，水溶性生物聚合物包含以式R 3-(O-CH 2-CH 2) n-或R 3-(0-CH 2-CH 2) n-O-為特徵之PEG，其中R 3為氫、甲基或乙基且n具有2至200之值。在一些態樣中，PEG具有式
Figure 02_image005
(式III) 其中n為1至1000。
在一些態樣中，PEG之n值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200。
在一些態樣中，n為至少約10、至少約20、至少約30、至少約40、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、至少約100、至少約110、至少120、至少約130、至少約140、至少約150、至少約160、至少約170、至少約180、至少約190、至少約200、至少約210、至少約220、至少約230、至少約240、至少約250、至少約260、至少約270、至少約280、至少約290、至少約300、至少約310、至少約320、至少約330、至少約340、至少約350、至少約360、至少約370、至少約380、至少約390、至少約400、至少約410、至少約420、至少約430、至少約440、至少約450、至少約460、至少約470、至少約480、至少約490、至少約500、至少約510、至少約520、至少約530、至少約540、至少約550、至少約560、至少約670、至少約580、至少約590、至少約600、至少約610、至少約620、至少約630、至少約640、至少約650、至少約660、至少約670、至少約680、至少約690、至少約700、至少約710、至少約720、至少約730、至少約740、至少約750、至少約760、至少約770、至少約780、至少約790、至少約800、至少約810、至少約820、至少約830、至少約840、至少約850、至少約860、至少約870、至少約880、至少約890、至少約900、至少約910、至少約920、至少約930、至少約940、至少約950、至少約960、至少約970、至少約980、至少約990或約1000。
在一些態樣中，n介於約50與約100之間、介於約100與約150之間、介於約150與約200之間、介於約200與約250之間、介於約250與約300之間、介於約300與約350之間、介於約350與約400之間、介於約400與約450之間、介於約450與約500之間、介於約500與約550之間、介於約550與約600之間、介於約600與約650之間、介於約650與約700之間、介於約700與約750之間、介於約750與約800之間、介於約800與約850之間、介於約850與約900之間、介於約900與約950之間或介於約950與約1000之間。
在一些態樣中，n為至少約80、至少約81、至少約82、至少約83、至少約84、至少約85、至少約86、至少約87、至少約88、至少約89、至少約90、至少約91、至少約92、至少約93、至少約94、至少約95、至少約96、至少約97、至少約98、至少約99、至少約100、至少約101、至少約102、至少約103、至少約104、至少約105、至少約106、至少約107、至少約108、至少約109、至少110、至少約111、至少約112、至少約113、至少約114、至少約115、至少約116、至少約117、至少約118、至少約119、至少約120、至少約121、至少約122、至少約123、至少約124、至少約125、至少約126、至少約127、至少約128、至少約129、至少約130、至少約131、至少約132、至少約133、至少約134、至少約135、至少約136、至少約137、至少約138、至少約139、至少約140、至少約141、至少約142、至少約143、至少約144、至少約145、至少約146、至少約147、至少約148、至少約149、至少約150、至少約151、至少約152、至少約153、至少約154、至少約155、至少約156、至少約157、至少約158、至少約159或至少約160。
在一些態樣中，n為約80至約90、約90至約100、約100至約110、約110至約120、約120至約130、約130至約140、約140至約150、約150至約160、約85至約95、約95至約105、約105至約115、約115至約125、約125至約135、約135至約145、約145至約155、約155至約165、約80至約100、約100至約120、約120至約140、約140至約160、約85至約105、約105至約125、約125至約145或約145至約165。
在一些態樣中，n為約100至約150。在一些態樣中，n為約100至約140。在一些態樣中，n為約100至約130。在一些態樣中，n為約110至約150。在一些態樣中，n為約110至約140。在一些態樣中，n為約110至約130。在一些態樣中，n為約110至約120。在一些態樣中，n為約120至約150。在一些態樣中，n為約120至約140。在一些態樣中，n為約120至約130。在一些態樣中，n為約130至約150。在一些態樣中，n為約130至約140。
因此，在一些態樣中，PEG為分支PEG。分支PEG具有三至十個自中央核心基團發出之PEG鏈。在某些態樣中，PEG部分為單分散聚乙二醇。在本揭示案之背景中，單分散聚乙二醇(mdPEG)係具有單一、確定鏈長及分子量之PEG。mdPEG通常藉由層析自聚合混合物中分離而生成。在某些式中，將單分散PEG部分指定為縮寫mdPEG。
在一些態樣中，PEG為星形PEG。星形PEG具有10至100個自中央核心基團發出之PEG鏈。在一些態樣中，PEG為梳形PEG。梳形PEG具有多個通常接枝至聚合物主鏈上之PEG鏈。
在某些態樣中，PEG之莫耳質量介於約1000 g/mol與約2000 g/mol之間、介於約2000 g/mol與約3000 g/mol之間、介於約3000 g/mol至約4000 g/mol之間、介於約4000 g/mol與約5000 g/mol之間、介於約5000 g/mol與約6000 g/mol之間、介於約6000 g/mol與約7000 g/mol之間或介於7000 g/mol與約8000 g/mol之間。
在一些態樣中，PEG為PEG 100、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 500、PEG 600、PEG 700、PEG 800、PEG 900、PEG 1000、PEG 1100、PEG 1200、PEG 1300、PEG 1400、PEG 1500、PEG 1600、PEG 1700、PEG 1800、PEG 1900、PEG 2000、PEG 2100、PEG 2200、PEG 2300、PEG 2400、PEG 2500、PEG 1600、PEG 1700、PEG 1800、PEG 1900、PEG 2000、PEG 2100、PEG 2200、PEG 2300、PEG 2400、PEG 2500、PEG 2600、PEG 2700、PEG 2800、PEG 2900、PEG 3000、PEG 3100、PEG 3200、PEG 3300、PEG 3400、PEG 3500、PEG 3600、PEG 3700、PEG 3800、PEG 3900、PEG 4000、PEG 4100、PEG 4200、PEG 4300、PEG 4400、PEG 4500、PEG 4600、PEG 4700、PEG 4800、PEG 4900、PEG 5000、PEG 5100、PEG 5200、PEG 5300、PEG 5400、PEG 5500、PEG 5600、PEG 5700、PEG 5800、PEG 5900、PEG 6000、PEG 6100、PEG 6200、PEG 6300、PEG 6400、PEG 6500、PEG 6600、PEG 6700、PEG 6800、PEG 6900、PEG 7000、PEG 7100、PEG 7200、PEG 7300、PEG 7400、PEG 7500、PEG 7600、PEG 7700、PEG 7800、PEG 7900或PEG 8000。在一些態樣中，PEG為PEG 5000。在一些態樣中，PEG為PEG 6000。在一些態樣中，PEG為PEG 4000。
在一些態樣中，PEG為單分散的，例如mPEG 100、mPEG 200、mPEG 300、mPEG 400、mPEG 500、mPEG 600、mPEG 700、mPEG 800、mPEG 900、mPEG 1000、mPEG 1100、mPEG 1200、mPEG 1300、mPEG 1400、mPEG 1500、mPEG 1600、mPEG 1700、mPEG 1800、mPEG 1900、mPEG 2000、mPEG 2100、mPEG 2200、mPEG 2300、mPEG 2400、mPEG 2500、mPEG 1600、mPEG 1700、mPEG 1800、mPEG 1900、mPEG 2000、mPEG 2100、mPEG 2200、mPEG 2300、mPEG 2400、mPEG 2500、mPEG 2600、mPEG 2700、mPEG 2800、mPEG 2900、mPEG 3000、mPEG 3100、mPEG 3200、mPEG 3300、mPEG 3400、mPEG 3500、mPEG 3600、mPEG 3700、mPEG 3800、mPEG 3900、mPEG 4000、mPEG 4100、mPEG 4200、mPEG 4300、mPEG 4400、mPEG 4500、mPEG 4600、mPEG 4700、mPEG 4800、mPEG 4900、mPEG 5000、mPEG 5100、mPEG 5200、mPEG 5300、mPEG 5400、mPEG 5500、mPEG 5600、mPEG 5700、mPEG 5800、mPEG 5900、mPEG 6000、mPEG 6100、mPEG 6200、mPEG 6300、mPEG 6400、mPEG 6500、mPEG 6600、mPEG 6700、mPEG 6800、mPEG 6900、mPEG 7000、mPEG 7100、mPEG 7200、mPEG 7300、mPEG 7400、mPEG 7500、mPEG 7600、mPEG 7700、mPEG 7800、mPEG 7900或mPEG 8000。在一些態樣中，mPEG為mPEG 5000。在一些態樣中，mPEG為mPEG 6000。在一些態樣中，mPEG為mPEG 4000。
在一些態樣中，水溶性生物聚合物部分係由式((R 3-O-(CH 2-CHOH-CH 2O)n-)描述之聚甘油(PG)，其中R 3為氫、甲基或乙基，且n具有3至200之值。在一些態樣中，水溶性生物聚合物部分係由式(R 3-O-(CH 2-CHOR 5-CH 2-O) n-)描述之分支聚甘油，其中R 5為氫或由式(R 3-O-(CH 2-CHOH-CH 2-O) n-)描述之線性甘油鏈，且R 3為氫、甲基或乙基。在一些態樣中，水溶性生物聚合物部分係由式(R 3-O-(CH 2-CHOR 5-CH 2-O) n-)描述之超分支聚甘油，其中R 5為氫或由式(R 3-O-(CH 2-CHOR 6-CH 2-O) n-)描述之甘油鏈，其中R 6為氫或由式(R 3-O-(CH 2-CHOR 7-CH 2-O) n-)描述之甘油鏈，其中R 7為氫或由式(R 3-O-(CH 2-CHOH-CH 2-O) n-)描述之線性甘油鏈，且R 3為氫、甲基或乙基。超分支甘油及其合成方法闡述於Oudshorn等人(2006) Biomaterials 27:5471-5479；Wilms等人(20100 Acc. Chem. Res. 43, 129-41及其中所引用之參考文獻中。
在某些態樣中，PG之莫耳質量介於約1000 g/mol與約2000 g/mol之間、介於約2000 g/mol與約3000 g/mol之間、介於約3000 g/mol至約4000 g/mol之間、介於約4000 g/mol與約5000 g/mol之間、介於約5000 g/mol與約6000 g/mol之間、介於約6000 g/mol與約7000 g/mol之間或介於7000 g/mol與約8000 g/mol之間。
在一些態樣中，PG為PG 100、PG 200、PG 300、PG 400、PG 500、PG 600、PG 700、PG 800、PG 900、PG 1000、PG 1100、PG 1200、PG 1300、PG 1400、PG 1500、PG 1600、PG 1700、PG 1800、PG 1900、PG 2000、PG 2100、PG 2200、PG 2300、PG 2400、PG 2500、PG 1600、PG 1700、PG 1800、PG 1900、PG 2000、PG 2100、PG 2200、PG 2300、PG 2400、PG 2500、PG 2600、PG 2700、PG 2800、PG 2900、PG 3000、PG 3100、PG 3200、PG 3300、PG 3400、PG 3500、PG 3600、PG 3700、PG 3800、PG 3900、PG 4000、PG 4100、PG 4200、PG 4300、PG 4400、PG 4500、PG 4600、PG 4700、PG 4800、PG 4900、PG 5000、PG 5100、PG 5200、PG 5300、PG 5400、PG 5500、PG 5600、PG 5700、PG 5800、PG 5900、PG 6000、PG 6100、PG 6200、PG 6300、PG 6400、PG 6500、PG 6600、PG 6700、PG 6800、PG 6900、PG 7000、PG 7100、PG 7200、PG 7300、PG 7400、PG 7500、PG 7600、PG 7700、PG 7800、PG 7900或PG 8000。在一些態樣中，PG為PG 5000。在一些態樣中，PG為PG 6000。在一些態樣中，PG為PG 4000。
在一些態樣中，PG為單分散的，例如mPG 100、mPG 200、mPG 300、mPG 400、mPG 500、mPG 600、mPG 700、mPG 800、mPG 900、mPG 1000、mPG 1100、mPG 1200、mPG 1300、mPG 1400、mPG 1500、mPG 1600、mPG 1700、mPG 1800、mPG 1900、mPG 2000、mPG 2100、mPG 2200、mPG 2300、mPG 2400、mPG 2500、mPG 1600、mPG 1700、mPG 1800、mPG 1900、mPG 2000、mPG 2100、mPG 2200、mPG 2300、mPG 2400、mPG 2500、mPG 2600、mPG 2700、mPG 2800、mPG 2900、mPG 3000、mPG 3100、mPG 3200、mPG 3300、mPG 3400、mPG 3500、mPG 3600、mPG 3700、mPG 3800、mPG 3900、mPG 4000、mPG 4100、mPG 4200、mPG 4300、mPG 4400、mPG 4500、mPG 4600、mPG 4700、mPG 4800、mPG 4900、mPG 5000、mPG 5100、mPG 5200、mPG 5300、mPG 5400、mPG 5500、mPG 5600、mPG 5700、mPG 5800、mPG 5900、mPG 6000、mPG 6100、mPG 6200、mPG 6300、mPG 6400、mPG 6500、mPG 6600、mPG 6700、mPG 6800、mPG 6900、mPG 7000、mPG 7100、mPG 7200、mPG 7300、mPG 7400、mPG 7500、mPG 7600、mPG 7700、mPG 7800、mPG 7900或mPG 8000。
在一些態樣中，水溶性生物聚合物包含聚(丙二醇)(「PPG」)。在一些態樣中，PPG以下式為特徵，其中n值為1至1000。
Figure 02_image007
(式IV)
在一些態樣中，PPG之n值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200。
在一些態樣中，PPG之n為至少約10、至少約20、至少約30、至少約40、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、至少約100、至少約110、至少120、至少約130、至少約140、至少約150、至少約160、至少約170、至少約180、至少約190、至少約200、至少約210、至少約220、至少約230、至少約240、至少約250、至少約260、至少約270、至少約280、至少約290、至少約300、至少約310、至少約320、至少約330、至少約340、至少約350、至少約360、至少約370、至少約380、至少約390、至少約400、至少約410、至少約420、至少約430、至少約440、至少約450、至少約460、至少約470、至少約480、至少約490、至少約500、至少約510、至少約520、至少約530、至少約540、至少約550、至少約560、至少約670、至少約580、至少約590、至少約600、至少約610、至少約620、至少約630、至少約640、至少約650、至少約660、至少約670、至少約680、至少約690、至少約700、至少約710、至少約720、至少約730、至少約740、至少約750、至少約760、至少約770、至少約780、至少約790、至少約800、至少約810、至少約820、至少約830、至少約840、至少約850、至少約860、至少約870、至少約880、至少約890、至少約900、至少約910、至少約920、至少約930、至少約940、至少約950、至少約960、至少約970、至少約980、至少約990或約1000。
在一些態樣中，PPG之n介於約50與約100之間、介於約100與約150之間、介於約150與約200之間、介於約200與約250之間、介於約250與約300之間、介於約300與約350之間、介於約350與約400之間、介於約400與約450之間、介於約450與約500之間、介於約500與約550之間、介於約550與約600之間、介於約600與約650之間、介於約650與約700之間、介於約700與約750之間、介於約750與約800之間、介於約800與約850之間、介於約850與約900之間、介於約900與約950之間或介於約950與約1000之間。
在一些態樣中，PPG之n為至少約80、至少約81、至少約82、至少約83、至少約84、至少約85、至少約86、至少約87、至少約88、至少約89、至少約90、至少約91、至少約92、至少約93、至少約94、至少約95、至少約96、至少約97、至少約98、至少約99、至少約100、至少約101、至少約102、至少約103、至少約104、至少約105、至少約106、至少約107、至少約108、至少約109、至少110、至少約111、至少約112、至少約113、至少約114、至少約115、至少約116、至少約117、至少約118、至少約119、至少約120、至少約121、至少約122、至少約123、至少約124、至少約125、至少約126、至少約127、至少約128、至少約129、至少約130、至少約131、至少約132、至少約133、至少約134、至少約135、至少約136、至少約137、至少約138、至少約139、至少約140、至少約141、至少約142、至少約143、至少約144、至少約145、至少約146、至少約147、至少約148、至少約149、至少約150、至少約151、至少約152、至少約153、至少約154、至少約155、至少約156、至少約157、至少約158、至少約159或至少約160。
在一些態樣中，PPG之n為約80至約90、約90至約100、約100至約110、約110至約120、約120至約130、約130至約140、約140至約150、約150至約160、約85至約95、約95至約105、約105至約115、約115至約125、約125至約135、約135至約145、約145至約155、約155至約165、約80至約100、約100至約120、約120至約140、約140至約160、約85至約105、約105至約125、約125至約145或約145至約165。
因此，在一些態樣中，PPG為分支PPG。分支PPG具有三至十個自中央核心基團發出之PPG鏈。在某些態樣中，PPG部分為單分散聚乙二醇。在本揭示案之背景中，單分散聚乙二醇(mdPPG)係具有單一、確定鏈長及分子量之PPG。mdPEG通常藉由層析自聚合混合物中分離而生成。在某些式中，將單分散PPG部分指定為縮寫mdPPG。
在一些態樣中，PPG為星形PPG。星形PPG具有10至100個自中央核心基團發出之PPG鏈。在一些態樣中，PPG為梳形PPG。梳形PPG具有多個通常接枝至聚合物主鏈上之PPG鏈。
在某些態樣中，PPG之莫耳質量介於約1000 g/mol與約2000 g/mol之間、介於約2000 g/mol與約3000 g/mol之間、介於約3000 g/mol至約4000 g/mol之間、介於約4000 g/mol與約5000 g/mol之間、介於約5000 g/mol與約6000 g/mol之間、介於約6000 g/mol與約7000 g/mol之間或介於7000 g/mol與約8000 g/mol之間。
在一些態樣中，PPG為PPG 100、PPG 200、PPG 300、PPG 400、PPG 500、PPG 600、PPG 700、PPG 800、PPG 900、PPG 1000、PPG 1100、PPG 1200、PPG 1300、PPG 1400、PPG 1500、PPG 1600、PPG 1700、PPG 1800、PPG 1900、PPG 2000、PPG 2100、PPG 2200、PPG 2300、PPG 2400、PPG 2500、PPG 1600、PPG 1700、PPG 1800、PPG 1900、PPG 2000、PPG 2100、PPG 2200、PPG 2300、PPG 2400、PPG 2500、PPG 2600、PPG 2700、PPG 2800、PPG 2900、PPG 3000、PPG 3100、PPG 3200、PPG 3300、PPG 3400、PPG 3500、PPG 3600、PPG 3700、PPG 3800、PPG 3900、PPG 4000、PPG 4100、PPG 4200、PPG 4300、PPG 4400、PPG 4500、PPG 4600、PPG 4700、PPG 4800、PPG 4900、PPG 5000、PPG 5100、PPG 5200、PPG 5300、PPG 5400、PPG 5500、PPG 5600、PPG 5700、PPG 5800、PPG 5900、PPG 6000、PPG 6100、PPG 6200、PPG 6300、PPG 6400、PPG 6500、PPG 6600、PPG 6700、PPG 6800、PPG 6900、PPG 7000、PPG 7100、PPG 7200、PPG 7300、PPG 7400、PPG 7500、PPG 7600、PPG 7700、PPG 7800、PPG 7900或PPG 8000。在一些態樣中，PPG為PPG 5000。在一些態樣中，PPG為PPG 6000。在一些態樣中，PPG為PPG 4000。
在一些態樣中，PPG為單分散的，例如mPPG 100、mPPG 200、mPPG 300、mPPG 400、mPPG 500、mPPG 600、mPPG 700、mPPG 800、mPPG 900、mPPG 1000、mPPG 1100、mPPG 1200、mPPG 1300、mPPG 1400、mPPG 1500、mPPG 1600、mPPG 1700、mPPG 1800、mPPG 1900、mPPG 2000、mPPG 2100、mPPG 2200、mPPG 2300、mPPG 2400、mPPG 2500、mPPG 1600、mPPG 1700、mPPG 1800、mPPG 1900、mPPG 2000、mPPG 2100、mPPG 2200、mPPG 2300、mPPG 2400、mPPG 2500、mPPG 2600、mPPG 2700、mPPG 2800、mPPG 2900、mPPG 3000、mPPG 3100、mPPG 3200、mPPG 3300、mPPG 3400、mPPG 3500、mPPG 3600、mPPG 3700、mPPG 3800、mPPG 3900、mPPG 4000、mPPG 4100、mPPG 4200、mPPG 4300、mPPG 4400、mPPG 4500、mPPG 4600、mPPG 4700、mPPG 4800、mPPG 4900、mPPG 5000、mPPG 5100、mPPG 5200、mPPG 5300、mPPG 5400、mPPG 5500、mPPG 5600、mPPG 5700、mPPG 5800、mPPG 5900、mPPG 6000、mPPG 6100、mPPG 6200、mPPG 6300、mPPG 6400、mPPG 6500、mPPG 6600、mPPG 6700、mPPG 6800、mPPG 6900、mPPG 7000、mPPG 7100、mPPG 7200、mPPG 7300、mPPG 7400、mPPG 7500、mPPG 7600、mPPG 7700、mPPG 7800、mPPG 7900或mPPG 8000。在一些態樣中，mPPG為mPPG 5000。在一些態樣中，mPPG為mPPG 6000。在一些態樣中，mPPG為mPPG 4000。 b. 陽離子載體
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元包含至少一個陽離子載體部分。術語「陽離子載體」係指本揭示案之陽離子載體單元之部分或一部分，其包含複數個正電荷，該等正電荷可與陰離子有效載荷(或附接至有效載荷之陰離子載體)相互作用且靜電結合。在一些態樣中，陽離子載體上之正電荷或帶正電荷之基團之數目與陰離子有效載荷(或附接至有效載荷之陰離子載體)上之負電荷或帶負電荷之基團之數目相似。在一些態樣中，陽離子載體包含生物聚合物，例如肽(例如聚離胺酸)。
在一些態樣中，陽離子載體包含一或多個鹼性胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸或其組合)。在一些態樣中，陽離子載體包含至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約六個、至少約七個、至少約八個、至少約九個、至少約十個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個、至少約30個、至少約31個、至少約32個、至少約33個、至少約34個、至少約35個、至少約36個、至少約37個、至少約38個、至少約39個、至少約40個、至少約41個、至少約42個、至少約43個、至少約44個、至少約45個、至少約46個、至少約47個、至少約48個、至少約49個、至少約50個、至少約51個、至少約52個、至少約53個、至少約54個、至少約55個、至少約56個、至少約57個、至少約58個、至少約59個、至少約60個、至少約61個、至少約62個、至少約63個、至少約64個、至少約65個、至少約66個、至少約67個、至少約68個、至少約69個、至少約70個、至少約71個、至少約72個、至少約73個、至少約74個、至少約75個、至少約76個、至少約77個、至少約78個、至少約79個、至少約80個鹼性胺基酸，例如離胺酸、精胺酸或其組合。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約40個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約45個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約50個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約55個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約60個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約65個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約70個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約75個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，陽離子載體單元包含至少約80個鹼性胺基酸，例如離胺酸。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含約30至約1000個、約30至約900個、約30至約800個、約30至約700個、約30至約600個、約30至約500個、約30至約400個、約30至約300個、約30至約200個、約30至約100個、約40至約1000個、約40至約900個、約40至約800個、約40至約700個、約40至約600個、約40至約500個、約40至約400個、約40至約300個、約40至約200個或約40至約100個鹼性胺基酸，例如離胺酸。在一些態樣中，鹼性胺基酸(例如離胺酸)未經修飾，使得其具有-NH3+(例如正電荷)。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含約30至約100個、約30至約90個、約30至約80個、約30至約70個、約30至約60個、約30至約50個、約30至約40個、約40至約100個、約40至約90個、約40至約80個、約40至約70個、約40至約60個、約70至約80個、約75至約85個、約65至約75個、約65至約80個、約60至約85個或約40至約500個鹼性胺基酸，例如離胺酸。
在一些態樣中，陽離子載體單元包含約100至約1000個、約100至約900個、約100至約800個、約100至約700個、約100至約600個、約100至約500個、約100至約400個、約100至約300個、約100至約200個、約200至約1000個、約200至約900個、約200至約800個、約200至約700個、約200至約600個、約200至約500個、約200至約400個、約200至約300個、約300至約1000個、約300至約900個、約300至約800個、約300至約700個、約300至約600個、約300至約500個、約300至約400個、約400至約1000個、約400至約900個、約400至約800個、約400至約700個、約400至約600個、約400至約500個、約500至約1000個、約500至約900個、約500至約800個、約500至約700個、約500至約600個、約600至約1000個、約600至約900個、約600至約800個、約600至約700個、約700至約1000個、約700至約900個、約700至約800個、約800至約1000個、約800至約900個或約900至約1000個鹼性胺基酸，例如離胺酸。
在一些態樣中，可基於陰離子有效載荷之長度調整鹼性胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸或其組合)之數目。舉例而言，具有較長序列之陰離子有效載荷可與較高數目之鹼性胺基酸(例如離胺酸)配對。在一些態樣中，可計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為至少約1、至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約11、至少約12、至少約13、至少約14、至少約15、至少約16、至少約17、至少約18、至少約19或至少約20。在一些態樣中，聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為介於約1至約20之間、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約1至約10，例如約3至約4、約4至約5、約5至約6、約6至約7或約7至約8。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約1至約2。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約3至約4。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約2至約3。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約4至約5。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約5至約6。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約6至約7。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約7至約8。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約8至約9。在一些態樣中，計算陽離子載體單元中之鹼性胺基酸(例如離胺酸)之數目，使得聚合物中之質子化胺對陰離子有效載荷(例如mRNA)中之磷酸酯之莫耳比(N/P比)為約9至約10。
熟習此項技術者應理解，由於陽離子載體部分之作用係經由靜電相互作用中和有效載荷上之負電荷(例如mRNA之磷酸酯主鏈中之負向變化)，故在一些態樣中(例如當有效載荷為諸如安提妙(antimir)等核酸時)，陽離子載體之長度、陽離子載體上帶正電荷基團之數目以及陽離子載體上存在之電荷之分佈及定向將取決於有效載荷分子上之長度及電荷分佈。
在一些態樣中，陽離子載體包含約5至約10個、約10至約15個、約15至約20個、約20至約25個、約25至約30個、約30至約35個、約35至約40個、約40至約45個、約45至約50個、約50至約55個、約55至約60個、約60至約65個、約至約70個、約70至約75個或約75至約80個鹼性胺基酸。在一些具體態樣中，帶正電荷之載體包含30至約50個鹼性胺基酸。在一些具體態樣中，帶正電荷之載體包含70至約80個鹼性胺基酸。
在一些態樣中，鹼性胺基酸包含精胺酸、離胺酸、組胺酸或其任何組合。在一些態樣中，鹼性胺基酸為D-胺基酸。在一些態樣中，鹼性胺基酸為L-胺基酸。在一些態樣中，帶正電荷之載體包含D-胺基酸及L-胺基酸。在一些態樣中，鹼性胺基酸包含至少一個非天然胺基酸或其衍生物。在一些態樣中，鹼性胺基酸為精胺酸、離胺酸、組胺酸、L-4-胺基甲基-苯丙胺酸、L-4-胍-苯丙胺酸、L-4-胺基甲基-N-異丙基-苯丙胺酸、L-3-吡啶基-丙胺酸、L-反式-4-胺基甲基環己基-丙胺酸、L-4-六氫吡啶基-丙胺酸、L-4-胺基環己基-丙胺酸、4-胍基丁酸、L-2-胺基-3-胍基丙酸、DL-5-羥基離胺酸、吡咯離胺酸、5-羥基-L-離胺酸、甲基離胺酸、羥腐胺離胺酸(hypusine)或其任何組合。在特定態樣中，帶正電荷之載體包含約40個離胺酸。在特定態樣中，帶正電荷之載體包含約50個離胺酸。在特定態樣中，帶正電荷之載體包含約60個離胺酸。在特定態樣中，帶正電荷之載體包含約70個離胺酸。在特定態樣中，帶正電荷之載體包含約80個離胺酸。
在其他態樣中，陽離子載體包含含有至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個、至少30個、至少31個、至少32個、至少33個、至少34個、至少35個、至少36個、至少37個、至少38個、至少39個、至少40個、至少41個、至少42個、至少43個、至少44個、至少45個、至少46個、至少47個、至少48個、至少49個、至少50個、至少51個、至少52個、至少53個、至少54個、至少55個、至少56個、至少57個、至少58個、至少59個、至少60個、至少61個、至少62個、至少63個、至少64個、至少65個、至少66個、至少67個、至少68個、至少69個、至少70個、至少71個、至少72個、至少73個、至少74個、至少75個、至少76個、至少77個、至少78個、至少79個或至少80個陽離子基團(例如胺基)之聚合物或共聚物。在一些態樣中，陽離子載體包含含有約5至約10個陽離子基團、約10至約15個陽離子基團、約15至約20個陽離子基團、約20至約25個陽離子基團、約25至約30個陽離子基團、約30至約35個陽離子基團、約35至約40個陽離子基團、約40至約45個陽離子基團、約45至約50個陽離子基團、約50至約55個陽離子基團、約55至約60個陽離子基團、約60至約65個陽離子基團、約65至約70個陽離子基團、約70至約75個陽離子基團或約45至約50個陽離子基團(例如胺基)之聚合物或共聚物。在一些具體態樣中，陽離子載體包含含有30至約50個陽離子基團(例如胺基)之聚合物或共聚物。在一些具體態樣中，陽離子載體包含含有70至約80個陽離子基團(例如胺基)之聚合物或共聚物。在一些態樣中，聚合物或共聚物為丙烯酸酯、多元醇或多醣。
在一些態樣中，陽離子載體部分結合至單一有效載荷分子。在其他態樣中，陽離子載體部分可結合至多個有效載荷分子，該等有效載荷分子可相同或不同。
在一些態樣中，陽離子載體部分之正電荷與核酸有效載荷之負電荷之離子比為約20:1、約19:1、約18:1、約17:1、約16:1、約15:1、約14:1、約13:1、約12:1、約11:1、約10:1、約9:1、約8:1 約7:1、約6:1 約5:1、約4:1、約3:1、約2:1或約1:1。在一些態樣中，核酸有效載荷之負電荷與陽離子載體部分之正電荷之離子比為約20:1、約19:1、約18:1、約17:1、約16:1、約15:1、約14:1、約13:1、約12:1、約11:1、約10:1、約9:1、約8:1 約7:1、約6:1 約5:1、約4:1、約3:1、約2:1或約1:1。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度為約10至約1000(例如約100至約1000)之核苷酸序列，其中陽離子載體部分與陰離子有效載荷之N/P比為約2至約10，例如約2至約9、約2至約8、約2至約7、約2至約6、約2至約5、約2至約4、約2至約3，例如約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10。在一些態樣中，陽離子載體部分與長度為約10至約1000個核苷酸之陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約10之間，例如約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度為約1000至約2000之核苷酸序列，其中陽離子載體部分與陰離子有效載荷之N/P比為約3至約12，例如約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11或約12。在一些態樣中，陽離子載體部分與陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約7之間，例如約4、約5、約6或約7。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度為約2000至約3000之核苷酸序列，其中陽離子載體部分與陰離子有效載荷之N/P比為約3至約16，例如約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16。在一些態樣中，其中陽離子載體部分與陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約9之間，例如約6、約7、約8或約9。
在一些態樣中，陰離子有效載荷包含長度為約3000至約4000之核苷酸序列，其中陽離子載體部分與陰離子有效載荷之N/P比為約3至約20，例如約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20。在一些態樣中，其中陽離子載體部分與陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約10之間，例如約7、約8、約9或約10。
在一些態樣中，陽離子載體部分具有游離末端，其中末端基團為反應性基團。在一些態樣中，陽離子載體部分具有游離末端(例如聚離胺酸陽離子載體部分中之C末端)，其中末端基團為胺基(-NH 2)。在一些態樣中，陽離子載體部分具有游離末端，其中末端基團為硫氫基。在一些態樣中，陽離子載體部分之反應性基團附接至疏水性部分，例如維生素B3疏水性部分。 c. 交聯部分
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元包含至少一個交聯部分。術語「交聯部分」係指包含能夠形成交聯之複數种劑之聚合物嵌段之部分或一部分。在一些態樣中，能夠形成交聯之劑之數目包含具有交聯劑側鏈之胺基酸。在一些態樣中，CM包含生物聚合物，例如連接至交聯劑之肽(例如聚離胺酸)。
在一些態樣中，交聯部分包含一或多個胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸或其組合)。在一些態樣中，交聯部分包含至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約六個、至少約七個、至少約八個、至少約九個、至少約十個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個、至少約30個、至少約31個、至少約32個、至少約33個、至少約34個、至少約35個、至少約36個、至少約37個、至少約38個、至少約39個、至少約40個、至少約41個、至少約42個、至少約43個、至少約44個、至少約45個、至少約46個、至少約47個、至少約48個、至少約49個或至少約50個胺基酸，例如離胺酸、精胺酸或其組合，其各自連接至交聯劑。
在一些態樣中，交聯部分包含至少約10個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約11個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約12個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約13個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約14個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約15個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約16個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約17個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約18個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約19個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。在一些態樣中，交聯部分包含至少約20個胺基酸，例如離胺酸，其各自連接至交聯劑。
在一些態樣中，交聯劑為硫醇。在一些態樣中，交聯劑為硫醇衍生物。 d. 疏水性部分
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元包含至少一個疏水性部分。如本文所用，術語「疏水性部分」係指分子實體，其可例如(i)補充有效載荷之治療或預防活性，(ii)調節有效載荷之治療或預防活性，(iii)在靶組織或靶細胞中起治療劑及/或預防劑之作用，(iv)有助於陽離子載體單元跨生理障壁(例如BBB及/或質膜)轉運，(v)改良靶組織或靶細胞之穩態，(vi)向陽離子載體部分貢獻正電荷基團，或(vii)其任何組合。
在一些態樣中，疏水性部分能夠調節(例如)免疫反應、發炎反應或組織微環境。
在一些態樣中，能夠調節免疫反應之疏水性部分可包含(例如)酪胺酸或多巴胺(dopamine)。酪胺酸可轉變成L-多巴(L-DOPA)，且接著經由2步酶促反應轉化成多巴胺。通常，在帕金森氏病(Parkinson’s disease)患者中，多巴胺水準較低。因此，在一些態樣中，酪胺酸係用於治療帕金森氏病之陽離子載體單元中之疏水性部分。色胺酸可轉化成血清素，一種被認為在食慾、情緒及運動、認知及自主功能中起作用之神經傳遞質。因此，在一些態樣中，用於治療與低血清素水準相關之疾病或疾患的本揭示案之陽離子載體單元包含色胺酸作為疏水性部分。
在一些態樣中，疏水性部分可調節患有腫瘤之個體中之腫瘤微環境，例如藉由抑制或減少腫瘤微環境中之缺氧。
在一些態樣中，疏水性部分包含(例如)連接至咪唑衍生物、維生素或其任何組合之胺基酸。
在一些態樣中，疏水性部分包含連接至咪唑衍生物之胺基酸(例如離胺酸)，該咪唑衍生物包含：
Figure 02_image009
(式VI)， 其中G 1及G 2中之每一者獨立地為H、芳香族環或1-10烷基，或G 1與G 2一起形成芳香族環，且其中n為1至10。
在一些態樣中，疏水性部分包含連接至硝基咪唑之胺基酸(例如離胺酸)。硝基咪唑起抗生素之作用。硝基咪唑中之硝基雜環可在缺氧細胞中還原活化，且接著經歷氧化還原再循環或分解成細胞毒性產物。還原通常僅發生在厭氧細菌或缺氧組織中，因此，其對人類細胞或需氧細菌之效應相對較小。在一些態樣中，疏水性部分包含連接至甲硝唑、替硝唑(tinidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、地美硝唑(dimetridazole)、普托馬尼(pretomanid)、奧硝唑(ornidazole)、麥加唑(megazol)、阿扎硝唑(azanidazole)、苄硝唑(benznidazole)、硝基咪唑或其任何組合之胺基酸(例如離胺酸)。
在一些態樣中，疏水性部分包含
Figure 02_image011
(式VII)， 其中Ar為
Figure 02_image013
或
Figure 02_image015
，且 其中Z1及Z2中之每一者為H或OH。
在一些態樣中，疏水性部分能夠抑制或減少發炎反應。
在一些態樣中，疏水性部分為連接至維生素之胺基酸(例如離胺酸)。在一些態樣中，維生素包含環或雜原子環及羧基或羥基。在一些態樣中，維生素包含：
Figure 02_image003
(式VIII)， 其中Y1及Y2中之每一者為C、N、O或S，且其中n為1或2。
在一些態樣中，維生素選自由以下組成之群：維生素A(視黃醇)、維生素B1(氯化硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B3(菸鹼醯胺)、維生素B6(吡哆醛)、維生素B7(生物素)、維生素B9(葉酸)、維生素B12(鈷胺素)、維生素C(抗壞血酸)、維生素D2、維生素D3、維生素E(生育酚)、維生素M、維生素H、其衍生物及其任何組合。
在一些態樣中，維生素為維生素B3(亦稱為菸鹼酸(niacin或nicotinic acid))。
Figure 02_image018
(式IX)
在一些態樣中，疏水性部分包含至少約一個、至少約兩個、至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約六個、至少約七個、至少約八個、至少約九個、至少約十個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個或至少約20個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約1個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約2個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約3個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約4個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約5個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約6個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約7個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約8個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約9個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約10個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約11個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約12個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約13個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約14個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約15個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約16個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約17個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約18個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約19個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。在一些態樣中，疏水性部分包含約20個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。
在一些態樣中，疏水性部分包含約1至約10個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3；約5至約10個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3；約10至約15個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3；約15至約20個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3；約1至約20個維生素胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至B3；約1至約15個維生素胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至B3；約1至約10個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3；約1至約5個胺基酸(例如離胺酸)，其各自連接至維生素B3。
菸鹼酸係活體內輔酶菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)之前體。在酶NAD+激酶存在下，NAD藉由磷酸化轉化成NADP。NADP及NAD係許多去氫酶之輔酶，參與許多氫轉移過程。NAD在脂肪、碳水化合物、蛋白質及醇之分解代謝以及細胞信號傳導及DNA修復中係重要的，且NADP主要在合成代謝反應(諸如脂肪酸及膽固醇合成)中起作用。高能量需求器官(腦)或高周轉率器官(腸、皮膚)通常最易受到NAD及NADP缺乏之影響。
菸鹼酸經由使NIACR1活化在多種組織(包括腦、胃腸道、皮膚及血管組織)中產生顯著之抗炎效應。已顯示菸鹼酸減弱神經發炎，且可具有治療諸如多發性硬化症及帕金森氏病等神經免疫病症之功效。參見Offermanns及Schwaninger (2015) Trends in Molecular Medicine 21:245-266；Chai等人(2013) Current Atherosclerosis Reports 15:325；Graff等人(2016) Metabolism 65:102-13；以及Wakade及Chong (2014) Journal of the Neurological Sciences 347:34-8，其係以全文引用的方式併入本文中。 e. 靶向部分
在一些態樣中，陽離子載體單元包含靶向部分，該靶向部分視情況經由連接體連接至水溶性聚合物。如本文所用，術語「靶向部分」係指結合至特定生物物質或位點之生物識別分子。在一些態樣中，靶向部分對某一靶分子(例如靶向受體之配位體，或靶向表面蛋白質之抗體)、組織(例如將優先攜帶微胞至特定器官或組織(例如肝臟、腦或內皮)之分子)或有助於轉運穿過生理障壁(例如可有助於跨血腦障壁或質膜轉運之肽或其他分子)係特異性的。
根據本揭示案，為使有效載荷(例如核苷酸分子，例如mRNA)具有靶向性，可使靶向部分與陽離子載體單元偶合，且因此與微胞之外表面偶合，而微胞將有效載荷包裹在其核心內。
在一些態樣中，靶向部分係能夠將本揭示案之微胞靶向至組織之靶向部分。在一些態樣中，組織為肝臟、腦、腎臟、肺、卵巢、胰臟、甲狀腺、乳房、胃或其任何組合。在一些態樣中，組織為癌組織，例如肝癌、腦癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、甲狀腺癌、乳癌、胃癌或其任何組合。
在具體態樣中，組織為肝臟。在具體態樣中，靶向肝臟之靶向部分為膽固醇。在其他態樣中，靶向肝臟之靶向部分為結合去唾液酸糖蛋白受體靶向部分之配位體。在一些態樣中，去唾液酸糖蛋白受體靶向部分包含GalNAc簇。在一些態樣中，GalNAc簇為單價、二價、三價或四價GalNAc簇。
在另一態樣中，組織為胰臟。在一些態樣中，靶向胰臟之靶向部分包含靶向胰臟細胞上之αvβ3整聯蛋白受體之配位體。在一些態樣中，靶向部分包含精胺醯基甘胺醯基天冬胺酸(RGD)肽序列(L-精胺醯基-甘胺醯基-L-天冬胺酸；Arg-Gly-Asp)。
在一些態樣中，組織為中樞神經系統中之組織，例如神經組織。在一些態樣中，靶向中樞神經系統之靶向部分能夠由大型中性胺基酸轉運蛋白1(LAT1)轉運。LAT1(SLC7A5)係攝取大型中性胺基酸及多種醫藥藥物之轉運蛋白。LAT1可轉運諸如L-多巴或加巴噴丁(gabapentin)等藥物。
在一些態樣中，靶向部分包含葡萄糖，例如D-葡萄糖，其可結合至葡萄糖轉運蛋白1(或GLUT1)且穿過BBB。GLUT1亦稱為溶質載體家族2促葡萄糖轉運蛋白成員1(SLC2A1)，其係由人類SLC2A1基因編碼之單向運輸蛋白。GLUT1有助於葡萄糖跨哺乳動物細胞之質膜轉運。此基因編碼哺乳動物血腦障壁中之主要葡萄糖轉運蛋白。
在一些態樣中，靶向部分包含半乳糖，例如D-半乳糖，其可結合至GLUT1轉運蛋白以穿過BBB。在一些態樣中，靶向部分包含麩胺酸，其可結合至乙醯膽鹼酯酶抑制劑(AChEI)及/或EAAT抑制劑且穿過BBB。乙醯膽鹼酯酶係膽鹼酯酶家族之主要成員。乙醯膽鹼酯酶抑制劑(AChEI)係一種抑制乙醯膽鹼酯酶將乙醯膽鹼分解成膽鹼及乙酸鹽，藉此提高神經傳遞質乙醯膽鹼在富含乙醯膽鹼受體之中樞神經系統、自主神經節及神經肌肉接點中之水準及作用持續時間之抑制劑。乙醯膽鹼酯酶抑制劑係兩種類型之膽鹼酯酶抑制劑中之一者；另一類為丁醯膽鹼酯酶抑制劑。
在一些態樣中，靶向部分所靶向之組織為骨骼肌。在一些態樣中，靶向骨骼肌之靶向部分能夠由大型中性胺基酸轉運蛋白1(LAT1)轉運。
LAT1在眾多種細胞類型中表現，包括T細胞、癌細胞及腦內皮細胞。LAT1在腦微血管內皮細胞中始終以高水準表現。作為主要位於BBB中之溶質載體，將本揭示案之微胞靶向至LAT1容許穿過BBB遞送。在一些態樣中，將本揭示案之微胞靶向至LAT1轉運蛋白之靶向部分為胺基酸，例如具支鏈或芳香族胺基酸。在一些態樣中，胺基酸為纈胺酸、白胺酸及/或異白胺酸。在一些態樣中，胺基酸為色胺酸及/或酪胺酸。在一些態樣中，胺基酸為色胺酸。在其他態樣中，胺基酸為酪胺酸。
在一些態樣中，靶向部分為選自以下之LAT1配位體：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、甲狀腺素、美法崙(melphalan)、L-多巴、加巴噴丁、3,5-I-二碘酪胺酸、3-碘-I-酪胺酸、芬克洛寧(fenclonine)、阿西維辛(acivicin)、白胺酸、BCH、甲硫胺酸、組胺酸、纈胺酸或其任何組合。
參見Singh及Ecker (2018)「Insights into the Structure, Function, and Ligand Discovery of the Large Neutral Amino Acid Transporter 1, LAT1」, Int. J. Mol. Sci. 19:1278；Geier等人(2013)「Structure-based ligand discovery for the Large-neutral Amino Acid Transporter 1, LAT-1」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:5480-85；及Chien等人(2018)「Reevaluating the Substrate Specificity of the L-type Amino Acid Transporter (LAT1)」, J. Med. Chem. 61:7358-73，該等參考文獻係以全文引用的方式併入本文中。
下文闡述靶向部分之非限制性實例。 i. 配位體
配位體作為一類靶向部分起作用，其定義為對另一物質具有選擇性(或特異性)親和力之選擇性可結合材料。配位體通常(但不一定)由更大特異性結合體或「結合搭配物」或「受體」識別並結合。適於靶向之配位體之實例為抗原、半抗原、生物素、生物素衍生物、凝集素、半乳糖胺及岩藻糖胺部分、受體、受質、輔酶及輔因子等。
當應用於本揭示案之微胞時，配位體包括能夠由其相應抗體或抗體部分或與其相應抗體或抗體部分結合之抗原或半抗原。亦包括病毒抗原或血球凝集素以及神經胺酸酶及核酸蛋白殼，包括來自任一DNA及RNA病毒、AIDS、HIV及肝炎病毒、腺病毒、阿爾法病毒(alphavirus)、沙粒病毒、冠狀病毒、黃病毒、疱疹病毒、黏液病毒、致癌性核糖核酸病毒、乳多泡病毒、副黏液病毒、微小病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、里奧病毒(reovirus)、棒狀病毒、鼻病毒、披衣病毒及類病毒之彼等物質；任何細菌抗原，包括革蘭氏(gram)陰性及革蘭氏陽性細菌不動菌屬( Acinetobacter)、無色菌屬( Achromobacter)、類桿菌屬( Bacteroides)、梭菌屬( Clostridium)、披衣菌屬( Chlamydia)、腸內細菌、嗜血桿菌屬( Haemophilus)、乳桿菌屬( Lactobacillus)、奈瑟菌屬( Neisseria)、葡萄球菌屬( Staphyloccus)或鏈球菌屬( Streptoccocus)之彼等抗原；任何真菌抗原，包括麴菌屬( Aspergillus)、念珠菌屬( Candida)、球孢子菌屬( Coccidiodes)、真菌病、藻菌類(phycomycetes)及酵母之彼等抗原；任何黴漿菌抗原；任何立克次體抗原；任何原生動物抗原；任何寄生蟲抗原；任何人類抗原，包括血球、病毒感染細胞、遺傳標記物、心臟病、致癌蛋白、血漿蛋白質、補體因子、類風濕因子之彼等抗原。包括癌症及腫瘤抗原，諸如甲型胎兒蛋白、前列腺特異性抗原(PSA)及CEA、癌症標記物及致癌蛋白等。
可作為靶向本揭示案之微胞之配位體起作用的其他物質為某些維生素(亦即葉酸、B 12)、類固醇、前列腺素、碳水化合物、脂質、抗生素、藥物、地高辛(digoxin)、殺蟲劑、麻醉劑、神經傳遞質以及經使用或修飾使得其起配位體作用之物質。
在一些態樣中，靶向部分包含蛋白質或蛋白質片段(例如激素、毒素)，以及具有細胞親和力之合成或天然多肽。配位體亦包括對經由重組DNA、遺傳及分子工程產生之連接子具有選擇性親和力之各種物質。除非另有說明，否則本揭示案之配位體亦包括如美國專利第3,817,837號中所定義之配位體，該專利係以全文引用的方式併入本文中。 ii. 連接子
連接子作為一類靶向部分起作用，其在本揭示案中定義為特異性結合體或「搭配物」或「受體」，通常(但不一定)大於其可結合之配位體。出於本揭示案之目的，連接子可為能夠與特定配位體選擇性親和結合之特異性物質或材料或化學品或「反應物」。連接子可為蛋白質，諸如抗體、非蛋白質結合體或「特異性反應器」。
當應用於本揭示案時，連接子包括抗體，其定義為包括所有類別之抗體、單株抗體、嵌合抗體、Fab部分、其片段及衍生物。術語「抗體」涵蓋天然或者部分或全部合成產生之免疫球蛋白，及其片段。該術語亦涵蓋具有與免疫球蛋白結合結構域同源之結合結構域之任何蛋白質。「抗體」進一步包括多肽，該多肽包含來自免疫球蛋白基因或其片段中特異性結合並識別抗原之框架區。術語抗體之使用意欲包括全抗體、多株、單株及重組抗體、其片段，且進一步包括單鏈抗體、人類化抗體、鼠類抗體、嵌合、小鼠-人類、小鼠-靈長類動物、靈長類動物-人類單株抗體、抗個體遺傳型抗體、抗體片段(諸如scFv、scFab、(scFab) 2、(scFv) 2、Fab、Fab'及F(ab') 2、F(ab1) 2、Fv、dAb及Fd片段)、雙價抗體及抗體相關多肽。抗體包括雙特異性抗體及多特異性抗體，只要其展現期望生物活性或功能即可。在本揭示案之一些態樣中，靶向部分為抗體或包含其抗原結合片段之分子。在一些態樣中，抗體為奈米抗體。在一些態樣中，抗體為ADC。術語「抗體-藥物結合物」及「ADC」可互換使用，且係指例如共價連接至一或多種治療劑(在本文中有時稱為劑、藥物或活性醫藥成分)之抗體。在本揭示案之一些態樣中，靶向部分為抗體-藥物結合物。
在某些條件下，本揭示案亦適用於使用其他物質作為連接子。舉例而言，其他適於靶向之連接子包括天然受體、任何血球凝集素以及細胞膜及核衍生物，其特異性結合至激素、維生素、藥物、抗生素、癌症標記物、遺傳標記物、病毒及組織相容性標記物。另一組連接子包括任何RNA及DNA結合物質，諸如聚乙烯亞胺(PEI)，以及多肽或蛋白質，諸如組織蛋白及魚精蛋白。
其他連接子亦包括酶、尤其細胞表面酶，諸如神經胺酸酶；血漿蛋白質；抗生物素蛋白；鏈黴抗生物素蛋白；抑素；窩穴體大環(cavitand)；甲狀腺球蛋白；內在因子；球蛋白；螯合劑；表面活性劑；有機金屬物質；葡萄球菌蛋白質A；蛋白質G；核糖體；噬菌體；細胞色素；凝集素；某些樹脂；及有機聚合物。
靶向部分亦包括各種物質，諸如經由重組DNA、遺傳及分子工程產生之對任何細胞、組織或微生物之表面具有親和力之任何蛋白質、蛋白質片段或多肽。因此，在一些態樣中，靶向部分將本揭示案之微胞引導至特定組織(亦即肝臟組織或腦組織)、特定類型之細胞(例如某一類型之癌細胞)或生理區室或生理障壁(例如BBB)。 f. 連接體
如上文所闡述，本文所揭示之陽離子載體單元可包含如例如圖2中所示之一或多個連接體。如本文所用，術語「連接體」係指肽或多肽序列(例如合成肽或多肽序列)或非肽連接體，其主要功能為連結本文所揭示之陽離子載體單元中之兩個部分。在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元可包含至少一個連結組織特異性靶向部分(TM)與水溶性聚合物(WS)之連接體、至少一個連結水溶性生物聚合物(WP)與陽離子載體(CC)或疏水性部分(HM)或交聯部分(CM)之連接體、至少一個連結陽離子載體(CC)與疏水性部分(HM)之連接體或其任何組合。在一些態樣中，兩個或更多個連接體可串聯連接。
當本文所揭示之陽離子載體單元中存在多個連接體時，每一連接體可相同或不同。通常，連接體為陽離子載體單元提供撓性。連接體通常不裂解；然而，在某些態樣中，此裂解可為合意的。因此，在一些態樣中，連接體可包含一或多個蛋白酶可裂解位點，該等位點可位於連接體之序列內或在連接體序列之任一端側接連接體。
在一態樣中，連接體為肽連接體。在一些態樣中，肽連接體可包含至少約兩個、至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約55個、至少約60個、至少約65個、至少約70個、至少約75個、至少約80個、至少約85個、至少約90個、至少約95個或至少約100個胺基酸。
在一些態樣中，肽連接體可包含至少約110個、至少約120個、至少約130個、至少約140個、至少約150個、至少約160個、至少約170個、至少約180個、至少約190個或至少約200個胺基酸。
在其他態樣中，肽連接體可包含至少約200個、至少約250個、至少約300個、至少約350個、至少約400個、至少約450個、至少約500個、至少550個、至少約600個、至少約650個、至少約700個、至少約750個、至少約800個、至少約850個、至少約900個、至少約950個或至少約1,000個胺基酸。
肽連接體可包含1至約5個胺基酸、1至約10個胺基酸、1至約20個胺基酸、約10至約50個胺基酸、約50至約100個胺基酸、約100至約200個胺基酸、約200至約300個胺基酸、約300至約400個胺基酸、約400至約500個胺基酸、約500至約600個胺基酸、約600至約700個胺基酸、約700至約800個胺基酸、約800至約900個胺基酸或約900至約1000個胺基酸。
肽連接體之實例為此項技術中所熟知。在一些態樣中，連接體為甘胺酸/絲胺酸連接體。在一些態樣中，肽連接體為根據式[(Gly)n-Ser]m之甘胺酸/絲胺酸連接體，其中n為1至100之任一整數且m為1至100之任一整數。在其他態樣中，甘胺酸/絲胺酸連接體係根據式[(Gly)x-Sery]z (SEQ ID NO: 1)，其中x為1至4之整數，y為0或1，且z為1至50之整數。在一態樣中，肽連接體包含序列Gn，其中n可為1至100之整數。在具體態樣中，肽連接體之序列為GGGG (SEQ ID NO: 2)。
在一些態樣中，肽連接體可包含序列(GlyAla)n (SEQ ID NO: 3)，其中n為介於1與100之間的整數。在其他態樣中，肽連接體可包含序列(GlyGlySer)n (SEQ ID NO: 4)，其中n為介於1與100之間的整數。
在其他態樣中，肽連接體包含序列(GGGS)n (SEQ ID NO: 5)。在其他態樣中，肽連接體包含序列(GGS)n(GGGGS)n (SEQ ID NO: 6)。在該等情況中，n可為1至100之整數。在其他情況中，n可為1至20之整數，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
連接體之實例包括(但不限於)GGG、SGGSGGS (SEQ ID NO: 7)、GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 8)、GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11)。在其他態樣中，連接體為聚-G序列(GGGG)n (SEQ ID NO: 12)，其中n可為1至100之整數。
在一態樣中，肽連接體係合成的，亦即為非天然的。在一態樣中，肽連接體包括肽(或多肽)(例如天然或非天然肽)，其包含將第一線性胺基酸序列連接或遺傳融合至在自然界中不與之天然連接或遺傳融合之第二線性胺基酸序列之胺基酸序列。舉例而言，在一態樣中，肽連接體可包含非天然多肽，其為天然多肽之修飾形式(例如包含諸如添加、取代或缺失等突變)。在另一態樣中，肽連接體可包含非天然胺基酸。在另一態樣中，肽連接體可包含以在自然界中不存在之線性序列存在之天然胺基酸。在另一態樣中，肽連接體可包含天然多肽序列。
在一些態樣中，連接體包含非肽連接體。在其他態樣中，連接體係由非肽連接體組成。在一些態樣中，非肽連接體可為(例如)馬來醯亞胺基己醯基(MC)、馬來醯亞胺基丙醯基(MP)、甲氧基聚乙二醇(MPEG)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸琥珀醯亞胺基酯(SMPB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、6-[3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸琥珀醯亞胺基酯(LC-SPDP)、4-琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)等(例如，參見美國專利第7,375,078號)。
可使用此項技術中已知之技術將連接體引入至多肽序列中(例如化學結合、重組技術或肽合成)。修飾可藉由DNA序列分析予以確認。在一些態樣中，可使用重組技術引入連接體。在其他態樣中，可使用固相肽合成引入連接體。在某些態樣中，本文所揭示之陽離子載體單元可同時含有一或多個使用重組技術引入之連接體及一或多個使用固相肽合成或此項技術中已知之化學結合方法引入之連接體。在一些態樣中，連接體包含裂解位點。 III. 有效載荷
如本文所用，術語「有效載荷」係指生物活性分子，例如治療劑，其可自身或經由適配體與本揭示案之陽離子載體單元相互作用，且包括在本揭示案之微胞之核心內。
其他生物活性分子為抗病毒藥物、核酸及其他抗病毒物質，包括針對任一DNA及RNA病毒、AIDS、HIV及肝炎病毒、腺病毒、阿爾法病毒、沙粒病毒、冠狀病毒、黃病毒、疱疹病毒、黏液病毒、致癌性核糖核酸病毒、乳多泡病毒、副黏液病毒、微小病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、里奧病毒、棒狀病毒、鼻病毒、披衣病毒及類病毒之彼等物質；任何抗細菌藥物、核酸及其他抗細菌物質，包括針對革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌不動菌屬、無色菌屬、類桿菌屬、梭菌屬、披衣菌屬、腸內細菌、嗜血桿菌屬、乳桿菌屬、奈瑟菌屬、葡萄球菌屬或鏈球菌屬之彼等物質；任何抗真菌藥物、核酸及其他抗真菌物質，包括針對麴菌屬、念珠菌屬、球孢子菌屬、真菌病、藻菌類及酵母之彼等物質；針對黴漿菌及立克次體之任何藥物、核酸及其他物質；任何抗原生動物藥物、核酸及其他物質；任何抗寄生蟲藥物、核酸及其他物質；針對心臟病、腫瘤及病毒感染細胞之任何藥物、核酸及其他物質等。 (a) 核酸
在一些態樣中，生物活性分子(有效載荷)為核酸，例如RNA或DNA。適於使用本揭示案之微胞遞送之核酸活性劑包括所有類型之RNA及所有類型之DNA。在一些態樣中，核酸包含mRNA、miRNA海綿、強韌誘餌miRNA (TD)、cDNA、pDNA、PNA、BNA、適配體或其任何組合。
在一些態樣中，生物活性分子(例如陰離子有效載荷)包含長度小於4,000個核苷酸之核苷酸序列。在一些態樣中，生物活性分子(例如陰離子有效載荷)包含長度小於約3,500、小於約3,000、小於約2,500、小於約2,000、小於約1,500、小於約1,000、小於約900、小於約800、小於約700、小於約600、小於約500、小於約400、小於約200或小於約150之核苷酸序列。
在一些態樣中，核酸為磷酸二酯核苷酸，以及糖-磷酸酯「主鏈」已經「主鏈類似物」(諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷醯胺酯、烷基磷酸三酯或甲基膦酸酯鍵聯)衍生化或替代之任何核苷酸。在一些態樣中，核酸具有非磷主鏈類似物，諸如胺基磺酸酯、3'-硫基甲縮醛、亞甲基(甲基亞胺基)(MMI)、3'-N-胺基甲酸酯或嗎啉基胺基甲酸酯。
在一些態樣中，陰離子有效載荷係多核苷酸，亦可稱為核苷酸或核酸。術語「多核苷酸」在其最廣泛意義上包括包含核苷酸聚合物之任何化合物及/或物質。本揭示案之例示性多核苷酸包括(但不限於)核糖核酸(RNA)、去氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA，包括具有β-D-核糖構形之LNA、具有α-L-核糖構形之α-LNA(LNA之非鏡像異構物)、具有2’-胺基官能化之2’-胺基-LNA及具有2’-胺基官能化之2’-胺基-α-LNA)或其雜合體。
在一些態樣中，合成多核苷酸為合成信使RNA(mRNA)。如本文所用，術語「信使RNA」(mRNA)係指任何多核苷酸，其可為合成的，編碼多肽，例如G蛋白，且能夠經轉譯以在活體外、活體內、原位或離體產生所編碼之多肽。
本揭示案藉由提供合成多核苷酸而擴展了傳統mRNA分子之功能範圍，該等合成多核苷酸包含賦予該等多核苷酸有用性質之一或多種結構及/或化學修飾或改變，該等有用性質在一些態樣中包括不會實質性誘導引入該多核苷酸之細胞的先天性免疫反應。如本文所用，「結構」特徵或修飾係兩個或更多個連接之核苷酸在合成多核苷酸、一級構築體或mmRNA中插入、缺失、重複、倒置或隨機化而不對核苷酸本身進行顯著化學修飾之特徵或修飾。由於化學鍵必然會斷裂並重新形成以實現結構修飾，故結構修飾具有化學性質，且因此為化學修飾。然而，結構修飾可產生不同的核苷酸序列。舉例而言，多核苷酸「ATCG」可化學修飾成「AT-5meC-G」。該相同多核苷酸可自「ATCG」結構修飾成「ATCCCG」。
在一些態樣中，陰離子有效載荷可包括非轉譯區。基因之非轉譯區(UTR)轉錄而不轉譯。5’ UTR起始於轉錄起始位點且延續至起始密碼子但不包括起始密碼子；而3’ UTR緊接在終止密碼子之後起始且延續至轉錄終止信號。愈來愈多之證據表明，UTR在核酸分子之穩定性及轉譯方面起調控性作用。可將UTR之調控性特徵併入至本發明之多核苷酸、一級構築體及/或mmRNA中，以增強分子之穩定性。亦可併入該等特定特徵以確保在轉錄本被錯誤引導至不期望之器官部位之情形下其受到受控下調。
應理解，所列示之彼等為實例，且來自任何基因之任何UTR均可併入至一級構築體之各別第一或第二側翼區中。此外，可利用任何已知基因之多種野生型UTR。本發明之範圍內亦提供人工UTR，其不為野生型基因之變異體。該等UTR或其部分可置於與其所選自之轉錄本相同之定向上，或可改變其定向或位置。因此，5’或3’ UTR可倒置、縮短、延長、與一或多個其他5’ UTR或3’ UTR嵌合。如本文所用，當涉及UTR序列時，術語「改變」意指UTR相對於參考序列已在某些方面發生變化。舉例而言，相對於野生型或天然UTR，3’或5’ UTR可如上文所教示因定向或位置發生變化而改變，或可因納入額外核苷酸、缺失核苷酸、交換或轉位核苷酸而改變。任何產生「改變之」UTR(無論3’還是5’)之該等變化構成變異體UTR。
在一些態樣中，核苷酸亦包括聚A尾、miRNA結合位點、AU元件或其任何組合。
在一些態樣中，長度為約100至約1000個核苷酸之陰離子有效載荷可為長度為約30個胺基酸或更短之任何蛋白質或其片段。舉例而言，長度為約100至約1000個核苷酸之陰離子有效載荷編碼PAPD5/7(0.8 kb)或其任何片段。
在一些態樣中，長度為約1000至約2000個核苷酸之陰離子有效載荷可為長度為約660個胺基酸或更短之任何蛋白質或其片段。舉例而言，長度為約1000至約2000個核苷酸之陰離子有效載荷可編碼G蛋白(1.5 kb)。
在一些態樣中，長度為約2000至約3000個核苷酸之陰離子有效載荷可為長度為約1000個胺基酸或更短之任何蛋白質或其片段。舉例而言，長度為約2000至約3000個核苷酸之陰離子有效載荷可編碼Gephyrin蛋白錨(2.2 kb)。
在一些態樣中，長度為約3000至約4000個核苷酸之陰離子有效載荷可為長度為約1330個胺基酸或更短之任何蛋白質或其片段。舉例而言，長度為約3000至約4000個核苷酸之陰離子有效載荷可編碼MDA5 (IFIH1) (3.0 kb)。 i. 經化學修飾之多核苷酸
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)包含至少一個經化學修飾之核苷及/或核苷酸。當本揭示案之多核苷酸經化學修飾時，該等多核苷酸可稱為「經修飾之多核苷酸」。
「核苷」係指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物與有機鹼(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中亦稱為「核鹼基」)之組合之化合物。
「核苷酸」係指包括磷酸酯基之核苷。經修飾之核苷酸可藉由任何可用方法(諸如化學、酶促或重組)合成，以包括一或多個經修飾或非天然之核苷。
多核苷酸可包含一或多個連接核苷區。此等區可具有可變主鏈鍵聯。該等鍵聯可為標準磷酸二酯鍵聯，在該情形下，多核苷酸將包含核苷酸區。
本文所揭示之經修飾之多核苷酸可包含各種不同的修飾。在一些態樣中，經修飾之多核苷酸含有一個、兩個或更多個(視情況不同)之核苷或核苷酸修飾。在一些態樣中，經修飾之多核苷酸可展現一或多種合意性質，例如與未經修飾之多核苷酸相比，熱穩定性或化學穩定性改良、免疫原性降低、降解減少、與靶基因或靶蛋白之結合增加、與其他基因或其他分子之非特異性結合減少。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸經化學修飾。如本文關於多核苷酸所用，術語「化學修飾」或適當時「經化學修飾」係指關於腺苷(A)、鳥苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或去氧核糖核苷就其位置、模式、百分比或群體中之一或多者之修飾，包括(但不限於)其核鹼基、糖、主鏈或其任何組合之修飾。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)可在所有或任何相同核苷類型中具有均一化學修飾，或在所有或任何相同核苷類型中藉由下移(downward titration)相同起始修飾產生修飾群體，或在具有隨機併入之所有或任何相同核苷類型中具有審慎衡量之化學修飾百分比。在另一態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)在遍及整個多核苷酸中之兩個、三個或四個相同核苷類型可具有均一化學修飾(諸如所有尿苷及/或所有胞苷等係以相同方式經修飾)。
經修飾之核苷酸鹼基配對不僅涵蓋標準腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶或鳥嘌呤-胞嘧啶鹼基對，且亦涵蓋核苷酸及/或包含非標準或經修飾鹼基之經修飾核苷酸之間形成的鹼基對，其中氫鍵供體與氫鍵受體之排列允許在非標準鹼基與標準鹼基之間或在兩個互補非標準鹼基結構之間形成氫鍵。此非標準鹼基配對之一個實例係在經修飾之核鹼基肌苷與腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之間的鹼基配對。鹼基/糖或連接體之任何組合均可併入至本揭示案之多核苷酸中。
熟習此項技術者應瞭解，除非另有註明，否則本申請案中所示之多核苷酸序列將在代表性DNA序列中引用「T」，但倘若序列代表RNA，則「T」將由「U」取代。舉例而言，本揭示案之TD可作為RNA、DNA或包含RNA及DNA單元二者之雜交分子投與。
在一些態樣中，多核苷酸(例如mRNA)包括至少兩個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個)經修飾之核鹼基之組合。 1. 鹼基修飾
在某些態樣中，化學修飾係在本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)中之核鹼基處。在一些態樣中，至少一種化學修飾之核苷為經修飾之尿苷(例如假尿苷(ψ)、2-硫尿苷(s2U)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)或5-甲氧基-尿苷(mo5U))、經修飾之胞嘧啶(例如5-甲基-胞苷(m5C))、經修飾之腺苷(例如1-甲基-腺苷(m1A)、N6-甲基-腺苷(m6A)或2-甲基-腺嘌呤(m2A))、經修飾之鳥苷(例如7-甲基-鳥苷(m7G)或1-甲基-鳥苷(m1G))或其組合。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)對於特定修飾而言係均一修飾的(例如完全修飾，遍及整個序列經修飾)。舉例而言，多核苷酸可經相同類型之鹼基修飾(例如5-甲基-胞苷(m5C))進行均一修飾，此意味著多核苷酸序列中之所有胞嘧啶殘基均經5-甲基-胞苷(m5C)替代。類似地，可藉由用經修飾之核苷(諸如上文所示彼等經修飾之核苷中之任一者)進行替代對多核苷酸序列中存在之任何類型之核苷殘基進行均一修飾。 2. 主鏈修飾
在一些態樣中，有效載荷可包含「本揭示案之多核苷酸」(例如包含mRNA)，其中多核苷酸包括任何對核苷之間的鍵聯有用之修飾。可用於本揭示案之組合物中之此等鍵聯(包括主鏈修飾)包括(但不限於)以下：3'-伸烷基膦酸酯、3'-胺基胺基磷酸酯、含有烯烴之主鏈、胺基烷基胺基磷酸酯、胺基烷基磷酸三酯、硼烷磷酸酯、-CH 2-O-N(CH 3)-CH 2-、-CH 2-N(CH 3)-N(CH 3)-CH 2-、-CH 2-NH-CH 2-、手性膦酸酯、手性硫代磷酸酯、甲醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基主鏈、亞甲基(甲基亞胺基)、亞甲基甲醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基主鏈、亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈、嗎啉基鍵聯、-N(CH 3)-CH 2-CH 2-、具有雜原子核苷間鍵聯之寡核苷、亞膦酸酯、胺基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯核苷間鍵聯、硫代磷酸酯、磷酸三酯、PNA、矽氧烷主鏈、胺基磺酸酯主鏈、硫化物亞砜及砜主鏈、磺酸酯及磺醯胺主鏈、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及硫羰基胺基磷酸酯。
Figure 02_image020
在一些態樣中，上文所揭示之主鏈鍵聯之存在提高本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)之穩定性(例如熱穩定性)及/或抗降解性(例如酶降解)。在一些態樣中，與沒有修飾之相應多核苷酸(參考或對照多核苷酸)相比，經修飾之多核苷酸之穩定性及/或抗降解性提高至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)中之至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%之主鏈鍵聯經修飾(例如所有該等主鏈鍵聯均為硫代磷酸酯)。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個主鏈鍵聯經修飾(例如硫代磷酸酯)。
在一些態樣中，主鏈包含選自由以下組成之群之鍵聯：磷酸二酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯及其組合。 3. 糖修飾
可併入至本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)中的經修飾之核苷及核苷酸可在核酸之糖上經修飾。因此，在一些態樣中，有效載荷包含核酸，其中該核酸包含至少一種核苷類似物(例如具有糖修飾之核苷)。
在多核苷酸中併入增強親和力之核苷酸類似物(諸如LNA或2’-取代之糖)可使多核苷酸之長度減小，且亦可降低非特異性或異常結合發生之前多核苷酸之大小上限。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)中之至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%之核苷酸含有糖修飾(例如LNA)。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸單元係糖修飾的(例如LNA)。
通常，RNA包括糖基核糖，其為具有氧之5員環。例示性非限制性經修飾之核苷酸包括核糖中氧之替代(例如用S、Se或伸烷基諸如亞甲基或伸乙基替代)；雙鍵之加成(例如用環戊烯基或環己烯基替代核糖)；核糖之環縮(例如形成環丁烷或氧雜環丁烷之4員環)；核糖之擴環(例如形成具有額外碳或雜原子之6員或7員環，諸如亦具有胺基磷酸酯主鏈之去水己糖醇、阿卓糖醇(altritol)、甘露醇、環己烷基、環己烯基及嗎啉基)；多環形式(例如三環；及「非鎖定」形式，諸如二醇核酸(GNA)(例如R-GNA或S-GNA，其中核糖經與磷酸二酯鍵附接之二醇單元替代)、蘇糖核酸(TNA，其中核糖經α-L-蘇呋喃糖基-(3’→2’)替代)及肽核酸(PNA，其中2-胺基-乙基-甘胺酸鍵聯替代核糖及磷酸二酯主鏈)。糖基亦可含有一或多個碳，該(等)碳之立體化學構形與核糖中相應碳之立體化學構形相反。因此，多核苷酸分子可包括含有(例如)阿拉伯糖作為糖之核苷酸。
核糖之2’羥基(OH)可經多個不同取代基修飾或替代。在2’-位置處之例示性取代包括(但不限於) H、鹵基、視情況經取代之C 1-6烷基；視情況經取代之C 1-6烷氧基；視情況經取代之C 6-10芳基氧基；視情況經取代之C 3-8環烷基；視情況經取代之C 3-8環烷氧基；視情況經取代之C 6-10芳基氧基；視情況經取代之C 6-10芳基-C 1-6烷氧基、視情況經取代之C 1-12(雜環基)氧基；糖(例如核糖、戊糖或本文所闡述之任何糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH 2CH 2O) nCH 2CH 2OR，其中R為H或視情況經取代之烷基，且n為0至20之整數(例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)；「鎖」核酸(LNA)，其中2′-羥基由C 1-6伸烷基或C 1-6伸雜烷基橋連結至同一核糖之4'-碳，其中例示性橋包括亞甲基、伸丙基、醚、胺基橋、胺基烷基、胺基烷氧基、胺基及胺基酸。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如mRNA)中存在之核苷類似物包含(例如)2’-O-烷基-RNA單元、2’-OMe-RNA單元、2’-O-烷基-SNA、2’-胺基-DNA單元、2’-氟-DNA單元、LNA單元、阿拉伯核酸(ANA)單元、2’-氟-ANA單元、HNA單元、INA(嵌入核酸)單元、2’MOE單元或其任何組合。在一些態樣中，LNA為(例如)氧基-LNA(諸如β-D-氧基-LNA或α-L-氧基-LNA)、胺基-LNA(諸如β-D-胺基-LNA或α-L-胺基-LNA)、硫基-LNA(諸如β-D-硫基-LNA或α-L-硫基-LNA)、ENA(諸如β-D-ENA或α-L-ENA)或其任何組合。
在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸中存在之核苷類似物包含鎖核酸(LNA)；2'-0-烷基-RNA；2'-胺基-DNA；2'-氟-DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'-氟-ANA、己糖醇核酸(HNA)、嵌入核酸(INA)、約束乙基核苷(cEt)、2'-0-甲基核酸(2'-OMe)、2'-0-甲氧基乙基核酸(2'-MOE)或其任何組合。 IV. 微胞
本揭示案亦提供包含本揭示案之陽離子載體單元之微胞。本揭示案之微胞包含本揭示案之陽離子載體單元以及帶負電荷之有效載荷，其中該帶負電荷之有效載荷與該陽離子載體單元彼此締合。在一些態樣中，締合包含共價鍵。在其他態樣中，締合不包含共價鍵。在其他態樣中，締合係經由離子鍵，亦即經由靜電相互作用。在一些態樣中，帶負電荷之有效載荷(例如DNA及/或RNA)不藉由共價鍵與陽離子載體單元結合，及/或帶負電荷之有效載荷僅經由離子相互作用與陽離子載體單元之陽離子載體部分相互作用。
在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元及微胞保護有效載荷(例如DNA及/或RNA)免於降解(例如由DNA酶及/或RNA酶降解)。首先，陽離子載體單元能夠經由靜電相互作用保護有效載荷。其次，微胞將有效載荷鉗合至微胞之核心，亦即，DNA酶及/或RNA酶無法觸及。在一些態樣中，與游離有效載荷相比，保護有效載荷免受循環酶(例如核酸酶)影響可延長帶負電荷之有效載荷(例如DNA及/或RNA)之半衰期。在一些態樣中，與游離有效載荷相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使有效載荷之血漿半衰期延長至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍、至少約25倍、至少約26倍、至少約27倍、至少約28倍、至少約29倍或至少約30倍。
在一些態樣中，陽離子載體單元之正電荷且特定而言陽離子載體部分之電荷與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)在溶液中混合時足以形成微胞，其中陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約20:1、約19:1、約18:1、約17:1、約16:1、約15:1、約14:1、約13:1、約12:1、約11:1、約10:1、約9:1、約8:1、約7:1、約6:1、約5:1、約4:1、約3:1、約2:1或約1:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約1:20、約1:19、約1:18、約1:17、約1:16、約1:15、約1:14、約1:13、約1:12、約1:11、約1:10、約1:9、約1:8、約1:7、約1:6、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2或約1:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約2:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約3:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約4:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約5:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約6:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約7:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約8:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約9:1。在一些態樣中，陽離子載體單元、特定而言其陽離子載體部分與帶負電荷之有效載荷(例如核酸)之間的總離子比為約10:1。
在一些態樣中，微胞之陰離子有效載荷包含長度為約10至約1000(例如約100至約1000)之核苷酸序列，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約2至約10，例如約2至約9、約2至約8、約2至約7、約2至約6、約2至約5、約2至約4、約2至約3，例如約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10。在一些態樣中，陽離子載體單元與長度為約10至約1000個核苷酸之陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約10之間，例如約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10。
在一些態樣中，微胞之陰離子有效載荷包含長度為約1000至約2000之核苷酸序列，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約3至約12，例如約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11或約12。在一些態樣中，陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約7之間，例如約4、約5、約6或約7。
在一些態樣中，微胞之陰離子有效載荷包含長度為約2000至約3000之核苷酸序列，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約3至約16，例如約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16。在一些態樣中，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約9之間，例如約6、約7、約8或約9。
在一些態樣中，微胞之陰離子有效載荷包含長度為約3000至約4000之核苷酸序列，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約3至約20，例如約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20。在一些態樣中，其中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約10之間，例如約7、約8、約9或約10。
在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約10之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約8之間或約8與約9之間。在一些態樣中，陰離子有效載荷與陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中溶液中陽離子載體單元與陰離子有效載荷之N/P比為約7、約8、約9或約10。
在一些態樣中，與適宜緩衝液(例如PBS)組合後，本揭示案之陽離子載體單元與有效載荷(例如mRNA)之間形成的複合物自組織以產生微胞。
微胞係由一或多種兩親性分子構成之水溶性或膠體結構或聚集體。兩親性分子係含有至少一個親水性(極性)部分及至少一個疏水性(非極性)部分之彼等分子。「經典微胞」具有由親水層或「殼」包圍之單一、中心且主要疏水之區域或「核心」。在水溶液中，微胞與同周圍溶劑接觸之兩親性分子之親水性「頭部」區形成聚集體，從而將兩親性分子之疏水性單尾區鉗合在微胞核心中。微胞之形狀近似球形。其他形狀(例如橢球形、圓柱體、桿狀結構或聚合物囊泡)亦係可能的。可藉由改變水溶性生物聚合物(例如PEG)與陽離子載體(例如聚離胺酸)之間的比率來修改所揭示微胞之形狀及大小，且因此修改負載容量。端視於比率而定，載體單元可組織為小顆粒、小微胞、微胞、桿狀結構或聚合物囊泡。因此，術語「本揭示案之微胞」不僅涵蓋經典微胞，且亦涵蓋小顆粒、小微胞、微胞、桿狀結構或聚合物囊泡。
本揭示案之微胞可由在極性(亦即水性)溶液中以臨界微胞濃度(CMC)或高於臨界微胞濃度(CMC)形成之含有疏水性及親水性部分之單一單分子聚合物或含有許多兩親性(亦即表面活性劑)分子之聚集體混合物構成。微胞係自一或多種兩親性分子自組裝而成，其中各部分經定向以提供主要疏水之內部核心及主要親水之外部。
本揭示案之微胞之大小可在5奈米至約2000奈米範圍內。在一些態樣中，微胞之直徑介於約10 nm與約200 nm之間。在一些態樣中，微胞之直徑介於約1 nm與約100 nm之間、介於約10 nm與約100 nm之間、介於約10 nm與約90 nm之間、介於約10 nm與約80 nm之間、介於約10 nm與約70 nm之間、介於約20 nm與約100 nm之間、介於約20 nm與約90 nm之間、介於約20 nm與約80 nm之間、介於約20 nm與約70 nm之間、介於約30 nm與約100 nm之間、介於約30 nm與約90 nm之間、介於約30 nm與約80 nm之間、介於約30 nm與約70 nm之間、介於約40 nm與約100 nm之間、介於約40 nm與約90 nm之間、介於約40 nm與約80 nm之間或介於約40 nm與約70 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約30 nm與約60 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約15 nm與約90 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約15 nm與約80 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約15 nm與約70 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約15 nm與約60 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約15 nm與約50 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約20 nm與約60 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約20 nm與約50 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約20 nm與約40 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約25 nm與約35 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑為約32 nm。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約100 nm與約200 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約40 nm與約50 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約50 nm與約60 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約60 nm與約70 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約70 nm與約80 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約80 nm與約90 nm之間。在一些態樣中，本揭示案之微胞之直徑介於約90 nm與約100 nm之間。
在一些態樣中，本揭示案之微胞包含單一類型之陽離子載體單元。在其他態樣中，本揭示案之微胞包含一種以上類型之陽離子載體單元(例如靶向靶細胞表面上之不同受體)。在一些態樣中，本揭示案之微胞可包含具有不同靶向部分、不同陽離子載體部分(例如以適應不同有效載荷)及/或不同疏水性及/或交聯單元之陽離子載體單元。
為了形成具有有效載荷之微胞，可將不同類型之陽離子或陰離子載體單元組合在一起。舉例而言，為靶向血腦障壁，本揭示案之微胞可包含與靶向部分連接之陽離子(或陰離子)載體單元及不與靶向部分連接之陽離子(或陰離子)載體單元。在一些態樣中，微胞包含約50至約200個陽離子或陰離子載體單元。在其他態樣中，微胞包含約50至約150個、約50至約140個、約50至約130個、約50至約120個、約50至約110個或約50至約100個陽離子或陰離子載體單元。在一些態樣中，微胞包含約60至約200個陽離子或陰離子載體單元。在其他態樣中，微胞包含約60至約150個、約60至約140個、約60至約130個、約60至約120個、約60至約110個、約60至約100個、約60至約90個、約60至約80個或約60至約70個陽離子或陰離子載體單元。在一些態樣中，微胞包含約70至約200個陽離子或陰離子載體單元。在其他態樣中，微胞包含約70至約150個、約70至約140個、約70至約130個、約70至約120個、約70至約110個、約70至約100個、約70至約90個或約70至約80個陽離子或陰離子載體單元。在一些態樣中，微胞包含約80至約200個陽離子或陰離子載體單元。在其他態樣中，微胞包含約80至約150個、約80至約140個、約80至約130個、約80至約120個、約80至約110個、約80至約100個或約80至約90個陽離子或陰離子載體單元。在一些態樣中，微胞包含約90至約200個陽離子或陰離子載體單元。在其他態樣中，微胞包含約90至約150個、約90至約140個、約90至約130個、約90至約120個、約90至約110個或約90至約100個陽離子或陰離子載體單元。在一些態樣中，微胞包含約100至約200個陽離子或陰離子載體單元。在其他態樣中，微胞包含約100至約150個、約100至約140個、約100至約130個、約100至約120個、約100至約110個或約100至約100個陽離子或陰離子載體單元。
本揭示案亦包括包含以下之微胞：(i)核苷酸序列(例如長度小於4000個核苷酸之mRNA)及(ii)本文所闡述之陽離子載體單元。在一些態樣中，本揭示案係關於包含以下之微胞：(i)核苷酸序列，例如長度小於4000個核苷酸之mRNA，及(ii)約80至約120個(例如約85至約115個、約90至約110個、約95至約105個)本文所闡述之陽離子載體單元，例如圖式I-圖式VI、圖式I’-圖式VI’或其組合(參見 圖 2A- 圖 2E)。在一些態樣中，微胞包含(i)核苷酸序列，例如mRNA，及(ii)約80至約120個(例如約80、約85、約90、約95、約100、約105或約110個)本文所闡述之陽離子載體單元，例如視情況選用之[CC]-L1-[CM]-L2-[HM](參見 圖 2)。在一些態樣中，微胞包含(i)核苷酸序列，例如mRNA，及(ii)約60至約110個(例如約80個)陽離子載體單元，其中(a)約45至約90個(例如約80個)陽離子載體單元包含[CC]-L1-[CM]-L2-[HM]及(b)約45至約55個(例如約50個)陽離子載體單元包含TM-[CC]-L1-[CM]-L2-[HM]，其中TM為苯丙胺酸，WP為(PEG) 5000，且CC為約40至約50個離胺酸，例如約45、約46、約47、約48、約49或約50個離胺酸，且其中約5至約15個離胺酸、約5個離胺酸中之每一者與維生素B3(菸鹼醯胺)融合。
在一些態樣中，微胞可包含單一有效載荷(例如單一mRNA)。在其他態樣中，微胞可包含一種以上之有效載荷(例如多種mRNA)。 V. 製造方法
本揭示案亦提供製備本揭示案之陽離子載體單元及微胞之方法。一般而言，本揭示案提供製備本揭示案之陽離子載體單元之方法，該方法包括合成如例如在實例部分中所闡述之陽離子載體單元。如本文所用，術語「合成」係指使用此項技術中已知之方法組裝陽離子載體單元。舉例而言，可重組製備蛋白質組分(例如抗體靶向部分)，且隨後使其與陽離子載體單元之其他組分結合。在一些態樣中，陽離子載體單元之每一組分可使用此項技術中已知之方法來製備，例如重組蛋白質產生、固相肽或核酸合成、化學合成、酶促合成或其任何組合，且所得組分可使用此項技術中已知之化學及/或酶促方法結合。
本揭示案之陽離子載體單元可經純化以去除污染物。在一些態樣中，陽離子載體單元包含陽離子載體單元之均勻群體。然而，在其他態樣中，陽離子載體單元可包含多種物質(例如其中一些包含靶向部分，且一些包含剩餘部分但不含靶向部分)。在一些態樣中，本揭示案之陽離子載體單元之製造包含凍乾或任何其他形式之適於重構之乾燥儲存。在一些態樣中，製備乾燥形式之陽離子載體單元發生在陽離子載體單元與有效載荷(例如核酸)組合之後。
在一些態樣中，製備本揭示案之微胞之方法包括以1:1之離子比混合陽離子載體單元與帶負電荷之有效載荷(例如核酸，諸如mRNA)。在一些態樣中，陽離子載體單元與帶負電荷之有效載荷係在溶液中組合。在一些態樣中，在將陽離子載體與帶負電荷之有效載荷在溶液中組合後，使所得溶液凍乾或乾燥。在一些態樣中，將陽離子載體與帶負電荷之有效載荷組合係以乾燥形式進行。
水溶性聚合物(例如PEG)中單體單元之數目 n對陽離子載體部分(例如聚離胺酸)中單體單元(例如離胺酸)之數目 m之比率影響所得微胞之大小及形狀，其中單元數目 n或 m在每一情形下可高達1,000個單元。在mB/(nA+mB)比率為0.5時，所獲得之微胞為經典微胞。若mB/(nA+mB)高於0.5，則所獲得之微胞為棒狀微胞或聚合物囊泡。若mB/(nA+mB)低於0.5，則所獲得之微胞為小微胞或小顆粒。
本揭示案之微胞可使用此項技術中已知之任一技術來生成，例如渦旋、擠出或音波處理。微胞之形成取決於應用高於包含本揭示案之陽離子載體單元之溶液之臨界微胞濃度(CMC)之條件。在達到一定濃度值後，表面活性劑開始締合且將其自身組織成更複雜之單元，諸如微胞。包含本揭示案之陽離子載體之溶液的CMC可藉由顯示出圍繞CMC之明顯轉變之任何物理性質(例如表面張力)來確定。
眾所周知之Smith-Ewart理論預測，在CMC以上導致形成微胞之成核顆粒之數目與表面活性劑(在本揭示案中為與陰離子有效載荷複合或締合之陽離子載體單元)濃度成0.6次方比例。此係由於對於給定之表面活性劑，所形成之微胞之數目通常隨表面活性劑濃度之增加而增加。
在一些態樣中，本揭示案之微胞可經純化，例如以去除污染物及/或生成均勻微胞群體(例如具有相同大小之微胞，或具有相同有效載荷或相同靶向部分之微胞)。 VI. 醫藥組合物
本揭示案亦提供包含本揭示案之陽離子載體單元及/或微胞(亦即包含本揭示案之陽離子載體單元之微胞)之醫藥組合物，其適於投與給個體。如上文所論述，本揭示案之微胞可為均質的(亦即，所有微胞均包含相同類型之陽離子載體單元，具有相同靶向部分及相同有效載荷)。然而，在其他態樣中，該等微胞可包含多個靶向部分、多個有效載荷等。
醫藥組合物通常包含本揭示案之陽離子載體單元及/或微胞以及醫藥學上可接受之賦形劑或載劑，其形式適於投與給個體。醫藥學上可接受之賦形劑或載劑部分地根據所投與之特定組合物以及根據用於投與組合物之特定方法來確定。
包含本揭示案之微胞之醫藥組合物有眾多種適宜調配物(例如，參見Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.，第18版(1990))。醫藥組合物通常無菌調配，且完全符合美國食品藥品管理局(U.S. Food and Drug Administration)之所有優良製造規範(Good Manufacturing Practice，GMP)法規。在一些態樣中，醫藥組合物包含一或多種本文所闡述之微胞。
在某些態樣中，本文所闡述之微胞與一或多種額外治療劑一起在醫藥學上可接受之載劑中共投與。在一些態樣中，包含本文所闡述微胞之醫藥組合物係在投與額外治療劑之前投與。在其他態樣中，包含本文所闡述微胞之醫藥組合物係在投與額外治療劑之後投與。在其他態樣中，包含本文所闡述微胞之醫藥組合物係與額外治療劑同時投與。
在一些態樣中，在微胞形成後添加醫藥載劑。在其他態樣中，在微胞形成前添加醫藥載劑。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者(例如動物或人類)無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
載劑或稀釋劑之實例包括(但不限於)水、鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。用於醫藥活性物質之此等介質及化合物之使用為此項技術中所熟知。除非任何習用介質或化合物與本文所揭示之陽離子載體單元或微胞不相容，否則考慮其用於組合物中。
亦可將補充性治療劑併入至本揭示案之組合物中。通常，醫藥組合物經調配以與其預期投與途徑相容。本文所闡述之微胞可藉由非經腸、外用、靜脈內、經口、皮下、動脈內、真皮內、經皮、經直腸、顱內、腹膜內、鼻內、腫瘤內、肌內途徑或作為吸入劑投與。在某些態樣中，靜脈內投與本文所闡述之醫藥組合物微胞，例如藉由注射。本文所闡述之微胞可視情況與其他治療劑組合投與，該等其他治療劑在治療本文所闡述之微胞意欲治療之疾病、病症或疾患方面至少部分有效。
溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌化合物，諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合化合物，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於調整張力之化合物，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可經酸或鹼(諸如鹽酸或氫氧化鈉)調整。可將製劑包封在安瓿、拋棄式注射器或由玻璃或塑膠製得之多劑量小瓶中。
適於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(若為水溶性)或分散液及無菌粉末。對於靜脈內投與，適宜載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。組合物通常無菌，且流動程度使其具有易注射性。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)以及其適宜混合物。可(例如)藉由使用諸如卵磷脂等包衣、藉由在分散液之情形中維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由各種抗細菌及抗真菌化合物來達成對微生物作用之預防，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)及諸如此類。若期望，可將等滲化合物(例如糖、諸如甘露醇、山梨醇等多元醇及氯化鈉)添加至組合物中。可藉由在組合物中納入延遲吸收之化合物(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成可注射組合物之延長吸收。
本揭示案之醫藥組合物可藉由習用、眾所周知之滅菌技術來滅菌。水溶液可包裝使用，或在無菌條件下過濾並凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水溶液合併。
可藉由將有效量之本文所闡述之微胞與本文所列舉之一種成分或成分組合視期望併入在適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。通常，藉由將本文所闡述之微胞併入至含有基本分散介質及任何期望之其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情形中，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，該等方法自先前經無菌過濾之溶液中產生活性成分加上任何額外期望成分之粉末。本文所闡述之微胞可以儲積注射或植入物製劑之形式投與，其調配方式可允許持續或脈衝式釋放本文所闡述之微胞。
亦可藉由經黏膜方式全身投與包含本文所闡述微胞之組合物。對於經黏膜投與，在調配物中使用適合於欲滲透障壁之滲透劑。此等滲透劑在此項技術中眾所周知，且對於經黏膜投與而言，包括(例如)清潔劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投與可使用(例如)鼻用噴霧來完成。
在某些態樣中，將包含本文所闡述微胞之醫藥組合物靜脈內投與給將受益於該醫藥組合物之個體。在某些態樣中，將組合物投與至淋巴系統，例如藉由淋巴內注射或藉由結內注射(例如，參見Senti等人，PNAS 105(46): 17908 (2008))，或藉由肌內注射，藉由皮下投與，藉由腫瘤內注射，藉由直接注射至胸腺中或直接注射至肝臟中。
在某些態樣中，包含本文所闡述微胞之醫藥組合物係以液體懸浮液形式投與。在某些態樣中，醫藥組合物係以能夠在投與後形成儲積物之調配物形式投與。在某些較佳態樣中，儲積物將本文所闡述之微胞緩慢釋放至循環中，或保持儲積物形式。
通常，醫藥學上可接受之組合物經高度純化以不含污染物，生物相容且無毒，且適於投與給個體。若水為載劑之成分，則對水進行高度純化並處理以不含污染物(例如內毒素)。
醫藥學上可接受之載劑可為乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及/或礦物油，但不限於此。醫藥組合物可進一步包括潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、增味劑、乳化劑、懸浮劑及/或防腐劑。
本文所闡述之醫藥組合物包含本文所闡述之微胞及視情況醫藥活性劑或治療劑。治療劑可為生物劑、小分子劑或核酸劑。
提供包含本文所闡述微胞之劑型。在一些態樣中，將劑型調配為用於靜脈內注射之液體懸浮液。
本文所揭示之微胞或包含該等微胞之醫藥組合物可與其他藥物同時使用。具體而言，本揭示案之微胞或醫藥組合物可與諸如以下等藥劑一起使用：激素治療劑、化學治療劑、免疫治療劑、抑制細胞生長因子或細胞生長因子受體作用之藥劑及諸如此類。 VII. 治療方法及用途
本揭示案亦提供治療有需要之個體之疾病或疾患的方法，其包括將本揭示案之微胞或其組合投與給個體，例如哺乳動物，諸如人類個體。在一些態樣中，本揭示案提供治療有需要之個體之神經退化性病症或癌症之方法，其包括向該個體投與治療有效量的本揭示案之微胞或本揭示案之醫藥組合物。
在一些態樣中，本揭示案之微胞可經由靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、框內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內及胸骨內注射及輸注投與。
在一些態樣中，本揭示案之微胞可與適於治療本文所揭示之疾病及疾患之其他藥劑或治療同時使用。
本揭示案亦提供囊封遞送用有效載荷之方法，其包括將該有效載荷(例如陰離子有效載荷，諸如核酸(例如mRNA))併入至本揭示案之微胞中。
本揭示案亦提供提高有效載荷之抗降解性(例如核酸酶介導之降解)之方法，其包括將該有效載荷(例如陰離子有效載荷，諸如核酸(例如mRNA))併入至本揭示案之微胞中。
在一些態樣中，本揭示案提供穿過血腦障壁(BBB)之方法，其包括投與本文所揭示之微胞，例如包含色胺酸及/或酪胺酸作為靶向部分之微胞。如上文所揭示，裝載有mRNA之本揭示案之微胞可靶向BBB受體，例如LAT1。
在一些態樣中，與游離有效載荷(亦即不處於微胞中，例如游離於溶液中)相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使有效載荷之抗降解性提高至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些態樣中，與游離有效載荷相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使有效載荷之抗降解性提高至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍、至少約25倍、至少約26倍、至少約27倍、至少約28倍、至少約29倍或至少約30倍。
本揭示案亦提供提高有效載荷在投與期間(例如在個體之血流中時)之穩定性之方法，其包括將該有效載荷(例如陰離子有效載荷，諸如核酸(例如mRNA))併入至本揭示案之微胞中。
在一些態樣中，與游離有效載荷相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使有效載荷之穩定性提高(例如使對核酸酶之抗性提高)至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些態樣中，與游離有效載荷相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使有效載荷之穩定性提高(例如使對核酸酶之抗性提高)至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍、至少約25倍、至少約26倍、至少約27倍、至少約28倍、至少約29倍或至少約30倍。
本揭示案亦提供延長有效載荷之血漿半衰期之方法，其包括將該有效載荷(例如陰離子有效載荷，諸如核酸(例如mRNA))併入至本揭示案之微胞中。
在一些態樣中，與游離有效載荷相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使有效載荷之血漿半衰期延長至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%、至少約600%、至少約700%、至少約800%、至少約900%、至少約1000%、至少約1100%、至少約1200%、至少約1300%、至少約1400%、至少約1500%、至少約1600%、至少約1700%、至少約1800%、至少約1900%或至少約2000%。
在一些態樣中，與游離有效載荷相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使有效載荷之血漿半衰期延長至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍、至少約25倍、至少約26倍、至少約27倍、至少約28倍、至少約29倍或至少約30倍。
在一些態樣中，與游離有效載荷相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使該有效載荷穿過生理障壁(例如BBB或質膜)之滲透、遞送、運送或轉運增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些態樣中，與游離有效載荷相比，將有效載荷囊封在本揭示案之微胞中可使該有效載荷穿過生理障壁(例如BBB或質膜)之滲透、遞送、運送或轉運增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍、至少約25倍、至少約26倍、至少約27倍、至少約28倍、至少約29倍或至少約30倍。
在一些態樣中，本揭示案之微胞可用於靶向幹細胞，例如以遞送治療性分子(例如治療性多核苷酸)或基因療法組分。在其他態樣中，本揭示案之微胞可用於治療癌症。舉例而言，本揭示案之微胞可靶向對某一類型之癌症(例如神經膠質瘤、乳癌、胰臟癌、肝癌、皮膚癌或子宮頸癌)具有特異性之標記物，且攜帶治療性分子(例如治療性多核苷酸、肽或小分子)作為有效載荷。
在具體態樣中，本揭示案之微胞可用於治療胰臟癌。在一些態樣中，將本揭示案之微胞引導至胰臟組織之靶向部分為環狀RGD肽。在其他態樣中，將本揭示案之微胞引導至胰臟組織之靶向部分為主要或專門在正常或癌性胰臟細胞之表面上表現之生物標記物。 VIII. 套組
本揭示案亦提供套組或製造產品，其包含本揭示案之陽離子載體單元、微胞或醫藥組合物以及視情況使用說明書。在一些態樣中，套組或製造產品包含在一或多個容器中之本揭示案之陽離子載體單元、微胞或醫藥組合物。在一些態樣中，套組或製造產品包含本揭示案之陽離子載體單元、微胞或醫藥組合物以及小冊子。在一些態樣中，套組或製造產品包含本揭示案之陽離子載體單元、微胞或醫藥組合物以及使用說明書。熟習此項技術者將容易地認識到，本揭示案之陽離子載體單元、微胞或醫藥組合物或其組合可容易地併入至此項技術中所熟知之已建立套組形式中之一者中。
在一些態樣中，套組或製造產品包含於容器(例如玻璃小瓶)中之呈乾燥形式之本揭示案之陽離子載體單元，及視情況含有適於水合乾燥陽離子載體單元之溶劑之小瓶，及視情況關於陽離子載體單元水合及微胞形成之說明書。在一些態樣中，套組或製造產品進一步包含至少一個額外容器(例如玻璃小瓶)，其含有微胞之陰離子有效載荷(例如mRNA)。在一些態樣中，套組或製造產品包含呈乾燥形式之本揭示案之陽離子載體單元及亦呈乾燥形式之微胞之陰離子有效載荷，其於同一容器或於不同容器中。在一些態樣中，套組或製造產品包含呈溶液之本揭示案之陽離子載體單元及亦呈溶液之微胞之陰離子有效載荷，其於同一容器或於不同容器中。在一些態樣中，套組或製造產品包含呈溶液之本揭示案之微胞，及使用說明書。在一些態樣中，套組或製造產品包含呈乾燥形式之本揭示案之微胞，及使用說明書(例如關於重構及投與之說明書)。 ***
除非另有指示，否則本揭示案之實踐將採用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、基因轉殖生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習用技術，該等技術為熟習此項技術者所熟知。此等技術在文獻中充分解釋。例如，參見Sambrook等人編輯(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編輯(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover編輯(1985) DNA Cloning，第I卷及第II卷；Gait編輯(1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人，美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編輯(1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編輯(1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning；論文Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller及Calos編輯(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人編輯，Methods In Enzymology，第154卷及第155卷；Mayer及Walker編輯(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir及Blackwell編輯(1986) Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)；)；Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications，第2版，CRC Press (2007)及Ausubel等人(1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)。
上文所引用之所有參考文獻以及本文所引用之所有參考文獻均係以全文引用的方式併入本文中。
以下實例係以說明方式而非限制方式提供。 實例 實例 1
炔烴修飾之酪胺酸之合成：將N-(第三丁氧基羰基)-L-酪胺酸甲基酯(Boc-Tyr-OMe)(0.5 g, 1.69 mmol)及K 2CO 3(1.5當量，2.54 mmol)於乙腈(4.0 ml)中之混合物逐滴添加至3-溴丙炔(1.2當量，2.03 mmol)中。
將反應混合物在60℃下加熱16小時。反應後，藉由水與乙酸乙酯(EA)萃取反應混合物。接著，用鹽水溶液洗滌有機層。藉由急速管柱(EA於10%己烷中)純化粗製材料。接下來，將所得產物溶解於四氫呋喃(7.0 ml)及6.0 M HCl(7.0 ml)中，且在65℃下加熱16小時。然後，去除二噁烷且使用EA萃取產物。接著，將NaOH(1.0 M)水溶液添加至混合物中，直至pH值變為7為止。藉由蒸發儀濃縮反應物，且在0℃下以12,000 rpm離心。用去離子水洗滌沈澱物且在使用前凍乾。
( 甲氧基或 ) 疊氮基 - 聚 ( 乙二醇 )- b- 聚 (L- 離胺酸 )(PEG-PLL) 之合成：利用疊氮基PEG(N3-PEG)作為大分子起始劑，藉由Lys(TFA)-NCA之開環聚合來合成聚(乙二醇)- b-聚(L-離胺酸)。簡言之，將N3-PEG(600 mg, 0.12 mmol)及Lys(TFA)-NCA(1447 mg, 5.4 mmol)分別溶解於含有1 M硫脲之DMF及DMF中。藉由微量注射器針頭將Lys(TFA)-NCA溶液滴入至N3-PEG溶液中，且將反應混合物在37℃下攪拌3天。反應瓶用Ar及真空吹掃。所有反應均在Ar氣氛下進行。
反應後，使混合物沈澱至過量之二乙醚中。接著，過濾混合物且在真空中乾燥後獲得白色粉末。對於PEG-PLL(TFA)中之TFA基團之去保護，將N3-PEG-PLL(500 mg)溶解於甲醇(60 mL)中，且在攪拌下將1 N NaOH(6 mL)滴入至聚合物溶液中。在攪拌下使混合物在37℃維持1天。將反應混合物用10 mM HEPES及蒸餾水透析4次。在凍乾後獲得N3-PEG-PLL(NH 2)之白色粉末。
( 甲氧基或 ) 疊氮基聚 ( 乙二醇 )- b- 聚 (L- 離胺酸 / 巰基丙醯胺 )(PEG 5K-PLL 80(SH 16)( 化合物 A) 之合成：為增強微胞之穩定性，將硫醇化末端基團作為疏水性部分引入至聚合物主鏈中。首先，在EDC/NHS存在下，藉由化學修飾PEG 5K-PLL 80-NH 2及3,3’-二硫基二丙酸合成(甲氧基或)疊氮基-聚(乙二醇)- b-聚(L-離胺酸/巰基丙醯胺)((MeO-或) N 3-PEG 5K-PLL 80(SH 16))： (a) 將PEG 5K-PLL 80-NH 2(100 mg)溶解於去離子水與甲醇(1:1)之混合物中。 (b) 將3,3’-二硫基二丙酸(65.6 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.17當量)溶解於MeOH中。 (c) 向(b)之3,3’-二硫基二丙酸溶液中添加EDC(20.5 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.2當量)及NHS(12.3 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.2當量)，將其與(a)之PEG 5K-PLL 80-NH 2溶液合併。
將所得混合物在37℃下攪拌4小時後，將反應物用MeOH透析2小時(MWCO = 7,000~8,000)，且將1,4-二硫蘇糖醇(DTT, 20.6 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.14當量)直接添加至膜中以裂解聚合物側鏈之二硫鍵。
使膜培育30 min，且用50% MeOH透析2小時，且用去離子水透析24小時。利用注射器式過濾器(0.45 µm)過濾溶液且凍乾2天。(PEG 5K-PLL 80(SH 16)之示意圖示於 圖 2A中。
( 甲氧基或 ) 疊氮基聚 ( 乙二醇 )- b- 聚 (L- 離胺酸 / 菸鹼醯胺 / 巰基丙醯胺 )(PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35)( 化合物 B) 之合成：為增強微胞之穩定性，將包含菸鹼醯胺之硫醇化末端基團作為疏水性部分引入至聚合物主鏈中。首先，在EDC/NHS存在下，藉由化學修飾PEG 5K-PLL 80-NH 2及菸鹼酸合成(甲氧基或)疊氮基-聚(乙二醇)- b-聚(L-離胺酸/菸鹼醯胺/巰基丙醯胺)((MeO-或)N3-PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35))。
將PEG 5K-PLL 80-NH 2(200 mg)及菸鹼酸(88 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.7當量)分別溶解於去離子水與甲醇(1:1)之混合物中。將EDC(205.2 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1當量)添加至菸鹼酸溶液中，且將NHS(123.2 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1當量)逐步添加至混合物中。在室溫下培育30 min後，將反應混合物添加至N3-PEG-PLL(NH 2)溶液中。
在攪拌下使反應混合物在37℃下維持16小時。其次，將3,3’-二硫基二丙酸(65.6 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.17當量)、EDC(41.8 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.25當量)及NHS(25.1 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.25當量)溶解於MeOH中且直接添加至反應混合物中。將混合物在37℃下攪拌4小時後，將反應物用MeOH透析2小時(MWCO = 7,000~8,000)，且將1,4-二硫蘇糖醇(DTT, 20.6 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.14當量)直接添加至膜中以裂解聚合物側鏈之二硫鍵。使膜培育30 min，且用50% MeOH透析2小時，且用去離子水透析24小時。利用注射器式過濾器(0.45 µm)過濾溶液且凍乾2天。(PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35)之示意圖示於 圖 2B中。
( 甲氧基或 ) 疊氮基聚 ( 乙二醇 )- b- 聚 (L- 離胺酸 / 菸鹼醯胺 / 巰基丙醯胺 )(PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23)( 化合物 C) 之合成：為增強微胞之穩定性，將菸鹼醯胺及硫醇化末端基團作為疏水性部分引入至聚合物主鏈中。首先，在EDC/NHS存在下，藉由化學修飾PEG 5K-PLL 80-NH 2及菸鹼酸合成(甲氧基或)疊氮基-聚(乙二醇)- b-聚(L-離胺酸/菸鹼醯胺/巰基丙醯胺)((MeO-或)N 3-PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23))。將PEG 5K-PLL 80-NH 2(200 mg)及菸鹼酸(88 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.7當量)分別溶解於去離子水與甲醇(1:1)之混合物中。將EDC(205.2 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1當量)添加至菸鹼酸溶液中，且將NHS(123.2 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1當量)逐步添加至混合物中。在室溫下培育30 min後，將反應混合物添加至N3-PEG-PLL(NH 2)溶液中。
在攪拌下使反應混合物在37℃下維持16小時。其次，將3,3’-二硫基二丙酸(18.8 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.17當量)、EDC(41.8 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.25當量)及NHS(25.1 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.25當量)溶解於MeOH中且直接添加至反應混合物中。將混合物在37℃下攪拌4小時後，將反應物用MeOH透析2小時(MWCO = 7,000~8,000)，且將1,4-二硫蘇糖醇(DTT, 20.5 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.14當量)直接添加至膜中以裂解聚合物側鏈之二硫鍵。使膜培育30 min，且用50% MeOH透析2小時，且用去離子水透析24小時。利用注射器式過濾器(0.45 µm)過濾溶液且凍乾2天。(PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23)之示意圖示於 圖 2C中。
( 甲氧基或 ) 疊氮基聚 ( 乙二醇 )- b- 聚 (L- 離胺酸 / 菸鹼醯胺 / 巰基丙醯胺 )(PEG 5K-PLL 80(Nic 32/SH 16)( 化合物 D) 之合成：為增強微胞之穩定性，將菸鹼醯胺及硫醇化末端基團作為疏水性部分引入至聚合物主鏈中。首先，在EDC/NHS存在下，藉由化學修飾PEG 5K-PLL 80-NH 2及菸鹼酸合成(甲氧基或)疊氮基-聚(乙二醇)- b-聚(L-離胺酸/菸鹼醯胺/巰基丙醯胺)((MeO-或)N3-PEG 5K-PLL 80(Nic 32/SH 16))。將PEG 5K-PLL 80-NH 2(200 mg)及菸鹼酸(131 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1.0當量)分別溶解於去離子水與甲醇(1:1)之混合物中。將EDC(307.8 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1當量)添加至菸鹼酸溶液中，且將NHS(184.8 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1當量)逐步添加至混合物中。在室溫下培育30 min後，將反應混合物添加至N 3-PEG 5K-PLL 80(NH 2)溶液中。
在攪拌下使反應混合物在37℃下維持16小時。其次，將3,3’-二硫基二丙酸(9.4 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.17當量)、EDC(41.8 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.25當量)及NHS(25.1 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.25當量)溶解於MeOH中且直接添加至反應混合物中。將混合物在37℃下攪拌4小時後，將反應物用MeOH透析2小時(MWCO = 7,000~8,000)，且將1,4-二硫蘇糖醇(DTT, 10.3 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.14當量)直接添加至膜中以裂解聚合物側鏈之二硫鍵。使膜培育30 min，且用50% MeOH透析2小時，且用去離子水透析24小時。利用注射器式過濾器(0.45 µm)過濾溶液且凍乾2天。(PEG 5K-PLL 80(Nic 32/SH 16)之示意圖示於 圖 2D中。
( 甲氧基或 ) 疊氮基聚 ( 乙二醇 )- b- 聚 (L- 離胺酸 / 菸鹼醯胺 )(PEG 5K-PLL 80(Nic 17)( 化合物 E) 之合成：為增強微胞之穩定性，將菸鹼醯胺及硫醇化末端基團作為疏水性部分引入至聚合物主鏈中。首先，在EDC/NHS存在下，藉由化學修飾PEG 5K-PLL 80-NH 2及菸鹼酸合成(甲氧基或)疊氮基-聚(乙二醇)- b-聚(L-離胺酸/菸鹼醯胺)((MeO-或)N 3-PEG 5K-PLL 80(Nic 17))。將PEG 5K-PLL 80-NH 2(150 mg)及菸鹼酸(79.1 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為0.8當量)分別溶解於去離子水與甲醇(1:1)之混合物中。將EDC(184.9 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1.2當量)添加至菸鹼酸溶液中，且將NHS(111.0 mg，相對於PEG-PLL之NH 2為1.2當量)逐步添加至混合物中。在室溫下培育30 min後，將反應混合物添加至N 3-PEG-PLL(NH 2)溶液中。
在攪拌下使反應混合物在37℃下維持16小時。將粗產物用去離子水透析24小時。利用注射器式過濾器(0.45 µm)過濾溶液且凍乾2天。(PEG 5K-PLL 80(Nic 17)之示意圖示於中 圖 2E中。
苯丙胺酸 - 聚 ( 乙二醇 )- b- 聚 (L- 離胺酸 / 菸鹼醯胺 / 巰基丙醯胺 )(Phe-PEG-PLL(Nic/SH)) 之合成：為在血流中靶向腦內皮組織，在銅觸媒存在下，藉由N 3-PEG-PLL(Nic/ss)與炔烴修飾之酪胺酸之間的點擊反應引入作為LAT1靶向胺基酸之苯丙胺酸。
簡言之，將N 3-PEG-PLL(Nic/ss)(30 mg, 3.2 µmol)及炔烴修飾之苯丙胺酸(1.31 mg, 6.4 µmol)溶解於去離子水中。接著，將CuSO4・H2O (0.172 mg, 0.69 µmol)及抗壞血酸(0.3 mg, 1.7 µmol)添加至混合物溶液中。在攪拌下使反應混合物在室溫下維持16小時。反應後，將混合物轉移至透析膜(MWCO = 7,000)中且用去離子水透析1天。在凍乾後獲得最終產物。 實例 2 聚離子複合物 (PIC) 微胞製備
在如實例1中所闡述生成本揭示案之陽離子載體單元後即產生微胞。本實例中所闡述之微胞包含與具有不同長度之mRNA有效載荷組合之陽離子載體單元。
(a) mRNA 800 個核苷酸與化合物 B ：藉由混合MeO-或Phe-PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35)以1.26 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.5 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為3.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.33 μM)在使用前儲存在4℃。
(b) mRNA 800 個核苷酸與化合物 C ：藉由混合MeO-或Phe-PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23)以1.32 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.38 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為4.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.25 μM)在使用前儲存在4℃。
(c) mRNA 800 個核苷酸與化合物 D ：藉由混合MeO-或Phe-PEG5K-PLL80(Nic 32/SH 16)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG5K-PLL 80(Nic 32/SH 16)以1.59 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.3 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為5.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.2 μM)在使用前儲存在4℃。
(d) mRNA 1,800 個核苷酸與化合物 B ：藉由混合MeO-或Phe-PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35)以2.73 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.25 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為6.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.17 μM)在使用前儲存在4℃。
(e) mRNA 1,800 個核苷酸與化合物 C：藉由混合MeO-或Phe-PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23)以2.85 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.25 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為6.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.17 μM)在使用前儲存在4℃。
(f) mRNA 1,800 個核苷酸與化合物 D：藉由混合MeO-或Phe-PEG 5K-PLL 80(Nic 32/SH 16)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG 5K-PLL 80(Nic 32/SH 16)以3.44 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.21 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為7.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.14 μM)在使用前儲存在4℃。
(g) mRNA 3,800 個核苷酸與化合物 B ：藉由混合MeO-或Phe-PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG 5K-PLL 80(Nic 5/SH 35)以6.03 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.21 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為7.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.14 μM)在使用前儲存在4℃。
(h) mRNA 3,800 個核苷酸與化合物 C：藉由混合MeO-或Phe-PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG 5K-PLL 80(Nic 19/SH 23)以6.3 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.19 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為8.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.13 μM)在使用前儲存在4℃。
(i) mRNA 3,800 個核苷酸與化合物 D：藉由混合MeO-或Phe-PEG 5K-PLL 80(Nic 32/SH 16)與mRNA製備奈米級PIC微胞。將PEG 5K-PLL 80(Nic 32/SH 16)以7.59 mg/mL溶解於200 mM DTT(於10 mM HEPES緩衝液中)中。接著，將於無RNA酶水中之mRNA溶液(0.15 μM)與聚合物溶液以2:1(v/v)之mRNA對聚合物比率混合。藉由最佳化聚合物中之胺(N)與mRNA中之磷酸酯(P)之間的微胞形成比率，確定聚合物與mRNA之混合比率。最佳N:P比為10.0。藉由以3000 rpm多次渦旋將聚合物與mRNA之混合物劇烈混合3 min，且在室溫下保持30 min以穩定微胞。藉由Zeta-sizer以634 nm波長量測粒徑分佈及散射光強度(SLI)。將所得微胞(mRNA濃度為0.1 μM)在使用前儲存在4℃。 實例 3 活體外 mRNA 表現
細胞株及培養：使人類胚腎細胞株(HEK-293T)及人類肺癌細胞株(A549)在補充有10% FBS(Gibco 26140-079)及青黴素-鏈黴素(Gibco 15140-122)之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)(Welgene, LM 001-05)及RPMI 1640(Welgene, LM 011-01)培養基中培養。將細胞以1×10 6個細胞/孔之密度接種至6孔板中。使細胞在含有2% FBS及0.5%青黴素-鏈黴素之培養基中培養24 h。將載mRNA微胞或作為陽性對照之Lipofectamine 2000/mRNA複合物轉染至細胞中。
細胞株之轉染：將細胞以1×10 6個細胞/孔之密度接種至6孔板中。使細胞在含有2% FBS及0.5%青黴素-鏈黴素之培養基中培養24 h，且用PBS、載mRNA微胞或Lipofectamine 2000/mRNA複合物(作為陽性對照)轉染。
藉由將10 μL原液稀釋至100 μL Opti-MEM中來製備Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen, 11668019)。對於mRNA調配物，將Lipofectamine 2000與5 µg mRNA混合。用吸量管輕輕吸取混合物且在室溫下培育15 min，以形成Lipofectamine/mRNA複合物。
用Opti-MEM稀釋mRNA微胞以調整mRNA之濃度，使得其與Lipofectamine/mRNA複合物之濃度相同。
將5 ug含mRNA之Lipofectamine/mRNA複合物或mRNA微胞分別添加至細胞中。在培育30 min後，收穫細胞，且分離RNA。
RNA 提取及 qRT-PCR：使用TRIzol試劑(Thermofisher, 15596018)根據製造商之方案自細胞中分離總RNA。使用TOPscript™ RT DryMIX(加上dN6) (Enzynomics, RT210)根據製造商之方案將500 ng RNA反轉錄成cDNA。在Bio-Rad CFX96循環儀(Bio-Rad Laboratories, Inc.)中，根據製造商之方案，使用TOPreal qPCR 2×PreMIX(SYBR綠與低ROX)(Enzynomics, RT500M)以所得cDNA作為模板實施RT-qPCR。使用2-ΔΔCt法以hGAPDH作正規化計算HA mRNA之相對水準。
結果：轉染後30 min，藉由qRT-PCR幾乎偵測不到mRNA。經載mRNA微胞處理之群組顯示mRNA水準為大約1×10 3。相比之下，在經Lipofectamine 2000/mRNA複合物處理之群組中觀察到相對mRNA水準為1×10 6~1×10 7。Lipofectamine 2000係用於活體外實驗之市售轉染試劑。儘管專門為活體內遞送而設計，但在活體外載mRNA微胞被細胞攝取。參見 圖 11。 實例 4 LAT-1 活體內表現水準
LAT-1 在小鼠組織中之分佈：將動物麻醉，且收集肌肉(腓腸肌，GAS；股四頭肌，QF；股二頭肌，BF；脛骨前肌，TA)。使用含有蛋白酶抑制劑之RIPA溶解及提取緩衝液將均質組織溶解，且使用BCA蛋白質分析套組測定蛋白質濃度。
藉由10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳拆分等量之總蛋白質且電泳轉移至聚偏氟乙烯膜上。使膜與LAT1(Santa Cruz, SC-374232)或GAPDH(Santa Cruz, SC-32233)一級抗體一起在4℃下培育隔夜，且接著與辣根過氧化物酶(HRP)結合之二級抗體一起在室溫下培育1 h。
結果：為評價LAT1在小鼠肌肉中之分佈水準，吾人實施西方墨點分析。每個西方墨點使用50 µg蛋白質。作為評估結果，顯示LAT1在所有GAS、QF、BF及TA部位中表現。BALB/c小鼠與DBA/2J小鼠之表現模式存在差異，但差異不顯著。該等結果指示，使用LAT1靶向之聚合媒劑可靶向該等肌肉。參見圖 12A- 圖 12D。 實例 5 活體內 mRNA 表現
將5 μg編碼螢火蟲螢光素酶(Luc)之mRNA與聚合載體、Lipofectamine 2000(Themo Fisher Scientific)及活體內-jetRNA(Polyplus)一起調配，總體積為50 μl。
經由肌內投與(雙側)將Luc mRNA注射至BALB/c小鼠中。以150 mg/kg之劑量向小鼠腹膜內注射VivoGlo螢光素(Promega)。利用IVIS成像系統(PerkinElmer)實施生物發光成像。
結果：在注射後大約6小時，開始觀察到囊封於Lipofectamine2000(Lipo+Luc)或活體內jetRNA (jetRNA+Luc，未示出)中之Luc-mRNA之螢光素酶信號。信號水準在第一天即降低，且在2天或3天後幾乎無信號殘留。 圖 13A。
相比之下，儘管載mRNA微胞處理組中之最大螢光素酶信號並不高於使用其他遞送試劑所觀察到之信號，但隨著時間推移，反應係不同的。在6小時時，信號強度與囊封於Lipofectamine2000(Lipo+Luc)或活體內jetRNA(jetRNA+Luc，未示出)中之Luc-mRNA所觀察到之信號強度相似，但在24小時後，其開始增加。觀察到高表現水準持續3至5天，且信號強度逐漸降低。表現維持長達7天。參見 圖 13B。
該等結果指示，使用聚合微胞系統之mRNA遞送較使用其他遞送試劑之遞送更穩定。持續之mRNA表現指示，本揭示案之陽離子載體(諸如聚合微胞)可有效地用於遞送mRNA並長時期釋放所附接之mRNA，此使得其適用於例如mRNA疫苗遞送。 ***
應瞭解，實施方式部分而非發明內容及發明摘要部分意欲用於解釋申請專利範圍。發明內容及發明摘要部分可陳述發明人所考慮之本揭示案之一或多個但並非所有之例示性態樣，且因此不意欲以任何方式限制本揭示案及隨附申請專利範圍。
上文已藉助說明執行指定功能及其關係之功能構建組元對本揭示案予以闡述。為便於描述，本文已任意界定該等功能構建組元之邊界。只要指定功能及其關係得到適當實施，則可界定替代邊界。
具體实施例之前述說明将完整地揭露本揭示案之一般性质，使得他人可在不背离本揭示案之一般概念之情形下藉由应用此項技術中之知识无需过多实验即可容易地修改及/或调整此等具體实施例之各種应用。因此，基於本文所呈現之教示及指導，此等調整及修改意欲在所揭示實施例之等效內容之意義及範圍內。應理解，本文之片語或術語係出於說明而非限制之目的，使得熟習此項技術者根據教示及指導理解本說明書之術語或片語。
本揭示案之廣度及範圍不應受上文所闡述之例示性實施例中之任一者限制，而是應僅根據隨附申請專利範圍及其等效內容來界定。
[ 圖 1A- 圖 1C]顯示本揭示案之載體單元及微胞之例示性架構。例示性載體單元包含視情況選用之組織特異性靶向部分、水溶性聚合物及陽離子載體單元(其可分別與陰離子有效載荷相互作用)( 圖 1A)。在一些態樣中，陽離子載體與陰離子有效載荷並未拴系，而是靜電相互作用。 圖 1B顯示陰離子有效載荷之示意圖。在一些態樣中，陽離子載體與陰離子有效載荷並未拴系，而是靜電相互作用。 圖 1C顯示包含 圖 1A及 圖 1B之陽離子載體及陰離子有效載荷之微胞之示意圖。 [ 圖 2A- 圖 2E]顯示陽離子載體單元之例示性組成。 圖 2A顯示載體單元，其包含靶向部分、水溶性聚合物(例如聚乙二醇)及包含80個離胺酸殘基之陽離子載體單元，其中64個離胺酸殘基未經修飾(例如含有帶正電荷之-NH3+)且其中16個離胺酸殘基經修飾以供交聯(例如連接至硫醇、烷基硫醇或離胺酸-硫醇)。 圖 2B顯示載體單元，其包含靶向部分、水溶性聚合物(例如聚乙二醇)及包含80個離胺酸殘基之陽離子載體單元，其中40個離胺酸殘基未經修飾(例如含有帶正電荷之胺基，例如-NH3+)且其中35個離胺酸殘基經修飾以供交聯(例如連接至硫醇、烷基硫醇或離胺酸-硫醇)且其中5個離胺酸殘基經修飾以含有疏水性部分(例如維生素)。 圖 2C顯示載體單元，其包含靶向部分、水溶性聚合物(例如聚乙二醇)及包含80個離胺酸殘基之陽離子載體單元，其中38個離胺酸殘基未經修飾(例如含有帶正電荷之胺基，例如-NH3+)且其中23個離胺酸殘基經修飾以供交聯(例如連接至硫醇、烷基硫醇或離胺酸-硫醇)且其中19個離胺酸殘基經修飾以含有疏水性部分(例如維生素)。 圖 2D顯示載體單元，其包含靶向部分、水溶性聚合物(例如聚乙二醇)及包含80個離胺酸殘基之陽離子載體單元，其中32個離胺酸殘基未經修飾(例如含有帶正電荷之胺基，例如-NH3+)且其中16個離胺酸殘基經修飾以供交聯(例如連接至硫醇、烷基硫醇或離胺酸-硫醇)且其中32個離胺酸殘基經修飾以含有疏水性部分(例如維生素)。 圖 2E顯示載體單元，其包含靶向部分、水溶性聚合物(例如聚乙二醇)及包含80個離胺酸殘基之陽離子載體單元，其中63個離胺酸殘基未經修飾(例如含有帶正電荷之胺基，例如-NH3+)且其中17個離胺酸殘基經修飾以含有疏水性部分(例如維生素)。 [ 圖 3]顯示用於核苷酸微胞遞送之組織特異性靶向聚合物結構以及載體單元之 1H-NMR特徵。與靶向部分(標記為「靶分子」)相對應之 1H-NMR圖顯示，靶向部分(含有與腦內皮上之LAT1靶標結合之環結構之胺基酸部分)已成功合成。第二 1H-NMR圖(標記為「聚合物」)顯示亦已合成陽離子PEG嵌段共聚物(亦包含陽離子載體部分及疏水性部分)。 [ 圖 4A- 圖 4D]顯示藉由Zeta-sizer量測的化合物A與核苷酸之微胞在漸增N/P比下之粒徑及計數率。 圖 4A顯示化合物A之示意圖示(圖2A)。 圖 4B- 圖 4D顯示微胞之計數率及大小，該等微胞分別包含800個核苷酸、1,800個核苷酸及3,800個核苷酸(例如陰離子有效載荷)以及作為陽離子載體單元之化合物A，N/P比為1-10。 [ 圖 5A- 圖 5D]顯示藉由Zeta-sizer量測的化合物B與核苷酸之微胞在漸增N/P比下之粒徑及計數率。 圖 5A顯示化合物B之示意圖示(圖2B)。 圖 5B- 圖 5D顯示微胞之計數率及大小，該等微胞分別包含800個核苷酸、1,800個核苷酸及3,800個核苷酸(例如陰離子有效載荷)以及作為陽離子載體單元之化合物A，N/P比為1-10。 [ 圖 6A- 圖 6D]顯示藉由Zeta-sizer量測的化合物C與核苷酸之微胞在漸增N/P比下之粒徑及計數率。 圖 6A顯示化合物C之示意圖示(圖2C)。 圖 6B- 圖 6D顯示微胞之計數率及大小，該等微胞分別包含800個核苷酸、1,800個核苷酸及3,800個核苷酸(例如陰離子有效載荷)以及作為陽離子載體單元之化合物A，N/P比為1-10。 [ 圖 7A- 圖 7D]顯示藉由Zeta-sizer量測的化合物D與核苷酸之微胞在漸增N/P比下之粒徑及計數率。 圖 7A顯示化合物D之示意圖示(圖2D)。 圖 7B- 圖 7D顯示微胞之計數率及大小，該等微胞分別包含800個核苷酸、1,800個核苷酸及3,800個核苷酸(例如陰離子有效載荷)以及作為陽離子載體單元之化合物D，N/P比為1-10。 [ 圖 8A- 圖 8D]顯示藉由Zeta-sizer量測的化合物E與核苷酸之微胞在漸增N/P比下之粒徑及計數率。 圖 8A顯示化合物E之示意圖示(圖2E)。圖8B-圖8D顯示微胞之計數率及大小，該等微胞分別包含800個核苷酸、1,800個核苷酸及3,800個核苷酸(例如陰離子有效載荷)以及作為陽離子載體單元之化合物E，N/P比為1-10。 [ 圖 9A- 圖 9B]顯示在聚合物(化合物B、C、D)與mRNA(800 nt、1800 nt、3800 nt)之間個別進行微胞調配後，在最佳化N/P比( 圖 9A)及固定N/P比( 圖 9B)下mRNA微胞之粒徑。 [ 圖 10A- 圖 10C]顯示利用化合物B及長度為800( 圖 10A)、1,800( 圖 10B)及3,800( 圖 10C)之mRNA核苷酸製備的含mRNA之微胞之粒徑分佈。 [ 圖 11]顯示在HEK 293T細胞中轉染PBS、mRNA囊封之微胞及含有mRNA之Lipofectamine 2000後之相對mRNA表現水準。將用PBS、聚合載體或Lipofectamine 2000調配之5 µg mRNA轉染至HEK-293T細胞中30 min。基於hGAPDH基因表現對基因之mRNA水準作正規化。使用2-ΔΔCt法計算基因之相對mRNA表現水準。 [ 圖 12A- 圖 12D]顯示LAT1在BALB/c及DBA/2J小鼠肌肉中之蛋白質表現水準。實施西方墨點(Western blot)分析以量測BALB/c( 圖 12A)及DBA/2J小鼠( 圖 12B)中之LAT1表現。對LAT1在BALB/c( 圖 12C)及DBA/2J小鼠( 圖 12D)中之相對表現水準進行量化，且以GAPDH水準對LAT1之表現水準作正規化。腓腸肌，GAS；股四頭肌，QF；股二頭肌，BF；脛骨前肌，TA。 [ 圖 13A- 圖 13B]分別顯示在投與囊封於聚合微胞( 圖 13A)或Lipofectamine( 圖 13B)中之Luc-mRNA後，小鼠之生物發光影像。在肌內注射後拍攝發光影像長達8天。 
                         
          <![CDATA[<110>  南韓商生物歐賽加有限責任公司(Biorchestra Co., Ltd.)]]>
          <![CDATA[<120>  微胞奈米粒子及其用途]]>
          <![CDATA[<140>  TW 110149741]]>
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          Gly Ser 
          1                  
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          <![CDATA[<400>  2]]>
          Gly Gly Gly Gly 
          1               
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          Gly Ala  
          1           
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          Gly Gly Ser  
          1               
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          Gly Gly Gly Ser  
          1                  
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          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser  
          1               5                 
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          <![CDATA[<400>  7]]>
          Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  8]]>
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          <![CDATA[<400>  8]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接體]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接體]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接體]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 聚G連接體序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  其中該單元可重複1至100次 ]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Gly Gly Gly Gly  
          1
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005

Claims (134)

  1. 一種陽離子載體單元，其包含 [CC]-L1-[CM]-L2-[HM] (圖式I)； [CC]-L1-[HM]-L2-[CM] (圖式II)； [HM]-L1-[CM]-L2-[CC] (圖式III)； [HM]-L1-[CC]-L2-[CM] (圖式IV)； [CM]-L1-[CC]-L2-[HM] (圖式V)；或 [CM]-L1-[HM]-L2-[CC] (圖式VI)； 其中 CC為帶正電荷之載體部分； CM為交聯部分； HM為疏水性部分；且， L1及L2獨立地為視情況選用之連接體，且 其中HM之數目相對於[CC]及[CM]少於40%。
  2. 如請求項1之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]少於39%、少於約35%、少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或約1%。
  3. 如請求項1之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]介於約35%與約1%之間、約35%與約5%之間、約35%與約10%之間、約35%與約15%之間、約35%與約20%之間、約35%與約25%之間、約35%與約30%之間、約30%與約1%之間、約30%與約5%之間、約30%與約10%之間、約30%與約15%之間、約30%與約20%之間、約30%與約25%之間、約25%與約1%之間、約25%與約5%之間、約25%與約10%之間、約25%與約15%之間、約25%與約20%之間、約20%與約1%之間、約20%與約5%之間、約20%與約10%之間、約20%與約15%之間、約15%與約1%之間、約15%與約5%之間、約15%與約10%之間、約10%與約1%之間或約10%與約5%之間。
  4. 如請求項1之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]介於約39%與約30%之間、約30%與約20%之間、約20%與約10%之間、約10%與約5%之間及約5%與約1%之間。
  5. 如請求項1之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]為約39%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%或約1%。
  6. 如請求項1至5中任一項之陽離子載體單元，其中該陽離子載體單元能夠與陰離子有效載荷相互作用。
  7. 如請求項6之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷包含長度小於4000個、小於約3500個、小於約3000個、小於約2500個、小於約2000個、小於約1500個、小於約1000個、小於約900個、小於約800個、小於約700個、小於約600個、小於約500個、小於約400個、小於約200個或小於約150個核苷酸之核苷酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約20、約1與約19之間、約1與約18之間、約1與約17之間、約1與約16之間、約1與約15之間、約1與14之間、約1與約13之間、約1與約12之間、約1與約11之間、約1與約10之間、約1與約9之間、約1與約8之間、約1與約7之間、約1與約6之間或約1與約5之間。
  9. 如請求項1至7中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10。
  10. 如請求項6或7之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷包含長度為約100個核苷酸至約1000個核苷酸之核苷酸序列。
  11. 如請求項10之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]介於39%與約30%之間、約30%與約20%之間、約20%與約10%之間、約10%與約5%之間及約5%與約1%之間。
  12. 如請求項10或11之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約10之間或約3與約7之間。
  13. 如請求項10或11之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約2之間、約2與約3之間、約3與約4之間或約4與約5之間。
  14. 如請求項10或11之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約1、約2、約3、約4或約5。
  15. 如請求項6或7之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷包含長度為約1000個核苷酸至約2000個核苷酸之核苷酸序列。
  16. 如請求項15之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約5%或少於約1%。
  17. 如請求項15之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]介於約30%與約20%之間、約30%與約25%之間、約25%與約20%之間、約25%與約15%之間、約20%與約10%之間、約20%與約5%之間、約10%與約1%之間、約10%與約5%之間及約5%與約1%之間。
  18. 如請求項15至17中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約7之間。
  19. 如請求項15至17中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約5之間或約5與約6之間。
  20. 如請求項15至17中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約4、約5、約6或約7。
  21. 如請求項6或7之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷包含長度為約2000個核苷酸至約3000個核苷酸之核苷酸序列。
  22. 如請求項21之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]少於約20%、少於約19%、少於約18%、少於約17%、少於約16%、少於約15%、少於約14%、少於約13%、少於約12%、少於約11%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1%。
  23. 如請求項21之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]少於核苷酸之約20%至約1%、約20%至約5%、約20%至約10%、約20%至約15%、約15%至約1%、約15%至約5%、約15%至10%、約10%至約1%、約10%至約5%或約5%至約1%。
  24. 如請求項21之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]為約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約14%、約13%、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%。
  25. 如請求項21至24中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約9之間。
  26. 如請求項21至24中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約7之間或約7與約8之間。
  27. 如請求項21至24中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約6、約7、約8或約9。
  28. 如請求項6或7之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷包含長度為約3000個核苷酸至約4000個核苷酸之核苷酸序列。
  29. 如請求項28之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1%。
  30. 如請求項28之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]為核苷酸之約10%至約1%、約10%至約5%或約5%至約1%。
  31. 如請求項28之陽離子載體單元，其中HM之數目相對於[CC]及[CM]為約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%。
  32. 如請求項28至31中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約10之間。
  33. 如請求項28至31中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約8之間或約8與約9之間。
  34. 如請求項28至31中任一項之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該溶液中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約7、約8、約9或約10。
  35. 如請求項6至34之陽離子載體單元，其中該陰離子有效載荷包含mRNA、cDNA或其任何組合。
  36. 如請求項1至35中任一項之陽離子載體單元，其進一步包含水溶性聚合物(WP)。
  37. 如請求項36之陽離子載體單元，其中該水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]或[CM]。
  38. 如請求項36或37之陽離子載體單元，其中該水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]或[CM]之N末端。
  39. 如請求項36或37之陽離子載體單元，其中該水溶性聚合物附接至[CC]、[HM]或[CM]之C末端。
  40. 如請求項36至39中任一項之陽離子載體單元，其包含： [WP]-L3-[CC]-L1-[CM]-L2-[HM] (圖式I’)； [WP]-L3-[CC]-L1-[HM]-L2-[CM] (圖式II’)； [WP]-L3-[HM]-L1-[CM]-L2-[CC] (圖式III’)； [WP]-L3-[HM]-L1-[CC]-L2-[CM] (圖式IV’)； [WP]-L3-[CM]-L1-[CC]-L2-[HM] (圖式V’)；或 [WP]-L3-[CM]-L1-[HM]-L2-[CC] (圖式VI’)。
  41. 如請求項36至40中任一項之陽離子載體單元，其中該水溶性聚合物包含聚(伸烷基二醇)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸羥基烷基酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚磷腈、聚噁唑啉(「POZ」)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)或其任何組合。
  42. 如請求項36至41中任一項之陽離子載體單元，其中該水溶性聚合物包含聚乙二醇(「PEG」)、聚甘油或聚(丙二醇) (「PPG」)。
  43. 如請求項36至42中任一項之陽離子載體單元，其中該水溶性聚合物包含：
    Figure 03_image001
    ， 其中n為1至1000。
  44. 如請求項43之陽離子載體單元，其中該n為至少約110、至少約111、至少約112、至少約113、至少約114、至少約115、至少約116、至少約117、至少約118、至少約119、至少約120、至少約121、至少約122、至少約123、至少約124、至少約125、至少約126、至少約127、至少約128、至少約129、至少約130、至少約131、至少約132、至少約133、至少約134、至少約135、至少約136、至少約137、至少約138、至少約139、至少約140或至少約141。
  45. 如請求項43之陽離子載體單元，其中該n為約80至約90、約90至約100、約100至約110、約110至約120、約120至約130、約140至約150或約150至約160。
  46. 如請求項36至45中任一項之陽離子載體單元，其中該水溶性聚合物為線性、分支或樹枝狀的。
  47. 如請求項1至46中任一項之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含一或多個胺基酸。
  48. 如請求項47之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約六個、至少約七個、至少約八個、至少約九個、至少約十個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個、至少約30個、至少約31個、至少約32個、至少約33個、至少約34個、至少約35個、至少約36個、至少約37個、至少約38個、至少約39個、至少約40個、至少約41個、至少約42個、至少約43個、至少約44個、至少約45個、至少約46個、至少約47個、至少約48個、至少約49個、至少約50個、至少約51個、至少約52個、至少約53個、至少約54個、至少約55個、至少約56個、至少約57個、至少約58個、至少約59個、至少約60個、至少約61個、至少約62個、至少約63個、至少約64個、至少約65個、至少約66個、至少約67個、至少約68個、至少約69個、至少約70個、至少約71個、至少約72個、至少約73個、至少約74個、至少約75個、至少約76個、至少約77個、至少約78個、至少約79個或至少約80個胺基酸。
  49. 如請求項47之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個、至少約100個、至少約110個、至少約120個、至少約130個、至少約140個或至少約150個胺基酸。
  50. 如請求項47之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約10至約60個、約15至約60個、約20至約60個、約25至約60個、約30至約60個、約35至約60個、約40至約60個、約10至約55個、約15至約55個、約20至約55個、約25至約55個、約30至約55個、約35至約55個、約40至約55個、約10至約50個、約15至約50個、約20至約50個、約25至約50個、約30至約50個、約35至約50個、約40至約50個、約10至約45個、約15至約45個、約20至約45個、約25至約45個、約30至約45個、約35至約45個、約40至約45個、約10至約40個、約15至約40個、約20至約40個、約25至約40個、約30至約40個、約35至約40個、約10至約35個、約15至約35個、約20至約35個、約25至約35個、約30至約35個、約35至約35個、約40至約35個或約40至約35個胺基酸。
  51. 如請求項47之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約10、約20、約30、約40、約50或約60個胺基酸。
  52. 如請求項47至51中任一項之陽離子載體單元，其中該胺基酸包含精胺酸、離胺酸、組胺酸或其任何組合。
  53. 如請求項1至52中任一項之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約20、約30、約40、約50或約60個離胺酸。
  54. 如請求項1至52中任一項之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約40個離胺酸。
  55. 如請求項1至54中任一項之陽離子載體單元，其中該交聯部分包含一或多個連接至交聯劑之胺基酸。
  56. 如請求項55之陽離子載體單元，其中該交聯劑包含硫醇基、硫醇衍生物或其任何組合。
  57. 如請求項55之陽離子載體單元，其中該交聯劑包含硫醇基。
  58. 如請求項55至57之陽離子載體單元，其中該交聯部分中之該等胺基酸包含至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個、至少30個、至少31個、至少32個、至少33個、至少34個、至少35個、至少36個、至少37個、至少38個、至少39個、至少40個、至少41個、至少42個、至少43個、至少44個、至少45個、至少46個、至少47個、至少48個、至少49個或至少50個胺基酸。
  59. 如請求項55至57中任一項之陽離子載體單元，其中該交聯部分中之該等胺基酸包含約1至約40個、約5至約40個、約10至約40個、約15至約40個、約20至約40個、約1至約35個、約5至約35個、約10至約35個、約15至約35個、約20至約35個、約10至約50個、約15至約50個、約20至約50個、約25至約50個、約30至約40個、約10至約45個、約15至約45個、約20至約45個、約25至約45個、約30至約45個、約10至約40個、約15至約40個、約20至約40個、約25至約40個或約30至約40個胺基酸。
  60. 如請求項55至57之陽離子載體單元，其中該交聯部分中之該等胺基酸包含約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50個胺基酸。
  61. 如請求項55至60中任一項之陽離子載體單元，其中該交聯部分中之該等胺基酸包含精胺酸、離胺酸、組胺酸或其任何組合。
  62. 如請求項55至61中任一項之陽離子載體單元，其中該交聯部分中之該等胺基酸包含約35個離胺酸。
  63. 如請求項55至61中任一項之陽離子載體單元，其中該交聯部分中之該等胺基酸包含約23個離胺酸。
  64. 如請求項55至61中任一項之陽離子載體單元，其中該交聯部分中之該等胺基酸包含約16個離胺酸。
  65. 如請求項1至64中任一項之陽離子載體單元，其中該疏水性部分能夠調節免疫反應、發炎反應及/或組織微環境。
  66. 如請求項65之陽離子載體單元，其中該疏水性部分能夠調節免疫反應。
  67. 如請求項65之陽離子載體單元，其中該疏水性部分能夠調節患有腫瘤之個體中的腫瘤微環境。
  68. 如請求項65之陽離子載體單元，其中該疏水性部分能夠抑制或減少該腫瘤微環境中之缺氧。
  69. 如請求項65至68中任一項之陽離子載體單元，其中該疏水性部分包含一或多個連接至咪唑衍生物、胺基酸、維生素或其任何組合之胺基酸。
  70. 如請求項65之陽離子載體單元，其中該疏水性部分能夠抑制或減少發炎反應。
  71. 如請求項70之陽離子載體單元，其中該疏水性部分係一或多個連接至維生素之胺基酸。
  72. 如請求項71之陽離子載體單元，其中該維生素包含環或雜原子環及羧基或羥基。
  73. 如請求項71之陽離子載體單元，其中該維生素包含：
    Figure 03_image003
    其中Y1及Y2中之每一者為C、N、O或S，且其中n為1或2。
  74. 如請求項71至73中任一項之陽離子載體單元，其中該維生素選自由以下組成之群：維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6、維生素B7、維生素B9、維生素B12、維生素C、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素M、維生素H及其任何組合。
  75. 如請求項74中任一項之陽離子載體單元，其中該維生素為維生素B3。
  76. 如請求項1至75中任一項之陽離子載體單元，其中該疏水性部分包含至少約兩個、至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約六個、至少約七個、至少約八個、至少約九個、至少約十個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、至少約20個、至少約21個、至少約22個、至少約23個、至少約24個、至少約25個、至少約26個、至少約27個、至少約28個、至少約29個、至少約30個、至少約31個或至少約32個胺基酸，其各自連接至維生素。
  77. 如請求項1至75中任一項之陽離子載體單元，其中該疏水性部分包含約1至約35個、約1至約30個、約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個、約1至約5個、約5至約35個、約5至約30個、約5至約25個、約5至約20個、約5至約15個、約5至約10個、約10至約35個、約10至約30個、約10至約25個、約10至約20個、約10至約15個、約15至約35個、約15至約30個、約15至約25個、約15至約20個、約20至約35個、約20至約30個、約20至約25個、約25至約30個或約25至約30個胺基酸，其各自連接至維生素。
  78. 如請求項1至77中任一項之陽離子載體單元，其中該疏水性部分包含約2個維生素B3、約3個維生素B3、約4個維生素B3、約5個維生素B3、約6個維生素B3、約7個維生素B3、約8個維生素B3、約9個維生素B3、約10個維生素B3、約11個維生素B3、約12個維生素B3、約13個維生素B3、約14個維生素B3、約15個維生素B3、約16個維生素B3、約17個維生素B3、約18個維生素B3、約19個維生素B3、約20個維生素B3、約21個維生素B3、約22個維生素B3、約23個維生素B3、約24個維生素B3、約25個維生素B3、約26個維生素B3、約27個維生素B3、約28個維生素B3、約29個維生素B3、約30、約31、約32、約33、約34或約35個胺基酸，該等胺基酸各自連接至維生素B3。
  79. 如請求項1至9之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，該交聯部分包含約20至約40個離胺酸-硫醇，且該疏水性部分包含約1至約10個離胺酸-維生素B3。
  80. 如請求項1至9之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，該交聯部分包含約10至約20個離胺酸-硫醇，且該疏水性部分包含約1至約10個離胺酸-維生素B3。
  81. 如請求項1至9之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，該交聯部分包含約10至約30個離胺酸-硫醇，且該疏水性部分包含約1至約10個離胺酸-維生素B3。
  82. 如請求項1至9中任一項之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，該交聯部分包含約13至約25個離胺酸-硫醇，且該疏水性部分包含約1至約20個離胺酸-維生素B3。
  83. 如請求項1至9中任一項之陽離子載體單元，其中該陽離子載體部分包含約35至約45個離胺酸，該交聯部分包含約13至約25個離胺酸-硫醇，且該疏水性部分包含約1至約20個離胺酸-維生素B3。
  84. 如請求項1至83中任一項之陽離子載體單元，其中該水溶性生物聚合物部分包含約120至約130個PEG單元。
  85. 如請求項1至84中任一項之陽離子載體單元，其進一步包含靶向部分(TM)。
  86. 如請求項85之陽離子載體單元，其中該靶向部分能夠靶向組織。
  87. 如請求項86之陽離子載體單元，其中該組織為肝臟、腦、腎臟、肺、卵巢、胰臟、甲狀腺、乳房、胃或其任何組合。
  88. 如請求項87之陽離子載體單元，其中該靶向部分能夠由大型中性胺基酸轉運蛋白1 (LAT1)轉運。
  89. 如請求項88之陽離子載體單元，其中該靶向部分為胺基酸。
  90. 如請求項88之陽離子載體單元，其中該靶向部分包含具支鏈或芳香族胺基酸。
  91. 如請求項90之陽離子載體單元，其中該靶向部分為苯丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及/或異白胺酸。
  92. 如請求項91之陽離子載體單元，其中該胺基酸為苯丙胺酸。
  93. 如請求項85至92中任一項之陽離子載體單元，其中該靶向部分連接至該水溶性聚合物。
  94. 如請求項93之陽離子載體單元，其中該靶向部分藉由連接體連接至該水溶性聚合物。
  95. 一種微胞，其包含如請求項1至94中任一項之陽離子載體單元以及陰離子有效載荷，其中陽離子載體複合物之該陽離子載體部分與該陰離子有效載荷彼此締合。
  96. 如請求項95之微胞，其中該締合為共價鍵。
  97. 如請求項95之微胞，其中該締合為非共價鍵。
  98. 如請求項95之微胞，其中該締合為離子鍵。
  99. 如請求項95至98中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當混合在一起時能夠形成微胞，且其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約1與約20之間。
  100. 如請求項99之微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20。
  101. 如請求項99之微胞，其中該陽離子載體單元之該陽離子載體部分之正電荷當與陰離子有效載荷在溶液中混合時足以形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約3、約4、約5、約6、約7、約8或約9。
  102. 如請求項95至101中任一項之微胞，其中該陽離子載體單元能夠保護該陰離子有效載荷免受DNA酶及/或RNA酶之降解。
  103. 如請求項95至102中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷不藉由共價鍵與該陽離子載體單元結合，及/或該陰離子有效載荷僅經由離子相互作用與該陽離子載體單元之該陽離子載體部分相互作用。
  104. 如請求項95至103中任一項之微胞，其中與未併入至微胞中之游離陰離子有效載荷之半衰期相比，該陰離子有效載荷之半衰期延長。
  105. 如請求項95至104中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷包含長度為約1000個核苷酸至約2000個核苷酸之核苷酸序列。
  106. 如請求項105之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約7之間。
  107. 如請求項105或106之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約4與約5之間或約5與約6之間。
  108. 如請求項105至107中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約4、約5、約6或約7。
  109. 如請求項95至104中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷包含長度為約2000個核苷酸至約3000個核苷酸之核苷酸序列。
  110. 如請求項109之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，且其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約9之間。
  111. 如請求項109或110之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約6與約7之間或約7與約8之間。
  112. 如請求項109至111中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約6、約7、約8或約9。
  113. 如請求項95至104中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷包含長度為約3000個核苷酸至約4000個核苷酸之核苷酸序列。
  114. 如請求項113之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約10之間。
  115. 如請求項113或114之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比介於約7與約8之間或約8與約9之間。
  116. 如請求項113至115中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷與該陽離子載體單元當一起混合於溶液中時能夠形成微胞，其中該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷之N/P比為約7、約8、約9或約10。
  117. 如請求項95至116中任一項之微胞，其中該微胞之直徑介於約10 nm與約200 nm之間、介於約20 nm與約200 nm之間、介於約1 nm與100 nm之間、介於約10 nm與約100 nm之間、介於約10 nm與約90 nm之間、介於約10 nm與約80 nm之間、介於約10 nm與約70 nm之間、介於約20 nm與約100 nm之間、介於約20 nm與約90 nm之間、介於約20 nm與約80 nm之間、介於約20 nm與約70 nm之間、介於約30 nm與約100 nm之間、介於約30 nm與約90 nm之間、介於約30 nm與約80 nm之間、介於約30 nm與約70 nm之間、介於約40 nm與約100 nm之間、介於約40 nm與約90 nm之間、介於約40 nm與約80 nm之間或介於約40 nm與約70 nm之間。
  118. 如請求項95至117中任一項之微胞，其中該陰離子有效載荷包含核酸。
  119. 如請求項118之微胞，其中該核酸包含mRNA、miRNA海綿、強韌誘餌miRNA、gDNA、cDNA、pDNA、PNA、BNA、適配體或其任何組合。
  120. 如請求項118或119之微胞，其中該核酸包含至少一種核苷類似物。
  121. 如請求項120之微胞，其中該核苷類似物包含鎖核酸(LNA)；2'-0-烷基-RNA；2'-胺基-DNA；2'-氟-DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'-氟-ANA、己糖醇核酸(HNA)、嵌入核酸(INA)、約束乙基核苷(cEt)、2'-0-甲基核酸(2'-OMe)、2'-0-甲氧基乙基核酸(2'-MOE)或其任何組合。
  122. 如請求項118至121中任一項之微胞，其中該核酸包含長度為5至30個核苷酸之核苷酸序列。
  123. 如請求項122之微胞，其中該核苷酸序列之長度少於4000、少於3000、少於2000或少於1000個核苷酸。
  124. 如請求項122或123之微胞，其中該核苷酸序列具有主鏈，該主鏈包含磷酸二酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯及其組合。
  125. 如請求項122之微胞，其中該核酸包含編碼PAPD5/7、G蛋白、Gephyrin蛋白錨或MDA5 (IFIH1)之核苷酸序列。
  126. 一種組合物，其包含如請求項1至94中任一項之陽離子載體單元以及陰離子有效載荷。
  127. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至94中任一項之陽離子載體單元、如請求項95至125中任一項之微胞、如請求項126之組合物或及醫藥學上可接受之載劑。
  128. 一種製備如請求項1至94中任一項之陽離子載體單元之方法，其包括使該陽離子載體部分連接至該交聯部分及該疏水性部分。
  129. 如請求項128之方法，其進一步連接水溶性聚合物及靶向部分。
  130. 一種製備如請求項128至129中任一項之微胞之方法，其包括在溶液中混合該陽離子載體單元與該陰離子有效載荷。
  131. 如請求項130之方法，其進一步包括純化該微胞。
  132. 一種治療有需要之個體之疾病或疾患之方法，其包括向該個體投與如請求項95至125中任一項之微胞或如請求項126中任一項之醫藥組合物。
  133. 如請求項132之方法，其中在該微胞的核心中之該陰離子有效載荷展現比未整合至微胞中之相應陰離子有效載荷長之半衰期。
  134. 如請求項132或133之方法，其中該個體為哺乳動物。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102658962B1 (ko) 2019-06-26 2024-04-23 주식회사 바이오오케스트라 미셀 나노입자 및 이의 용도

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3045131A1 (en) * 2016-12-14 2018-06-21 Ligandal, Inc. Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery
WO2018144022A1 (en) * 2017-02-03 2018-08-09 Farokhzad Omid C Particles as delivery systems
CN110156971A (zh) * 2018-02-13 2019-08-23 上海时莱生物技术有限公司 一种两亲性嵌段共聚物及其制备方法和纳米胶束载药系统
WO2019204799A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 University Of Pittsburgh -Of The Commonwealth System Of Higher Education Cationic amphiphilic polymers for codelivery of hydrophobic agents and nucleic acids
CN111632153B (zh) * 2020-06-23 2023-02-24 宁夏医科大学 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法

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