TW202239762A - 桿狀病毒表現系統 - Google Patents

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賽門 德拉葛瑞夫
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美商旗艦先鋒創新公司
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Abstract

本發明大體上係關於用於製造指環載體之組合物及其用途。舉例而言，本發明提供使用昆蟲細胞以產生指環病毒蛋白質(例如ORF1)之組合物及方法。

Description

桿狀病毒表現系統
持續需要開發用於製造適合之載體以向患者遞送治療效應子的組合物及方法。舉例而言，基於指環病毒之載體為用於治療遞送之有前景的模態。然而，該領域中之努力因難以生產全長、純化的指環病毒ORF1蛋白而受到阻礙。此項技術中需要生產純化指環病毒蛋白質之新穎方法。
本發明提供用於產生指環載體(例如合成指環載體)之組合物及方法，該指環載體可用作遞送媒劑，例如用於遞送遺傳物質、用於遞送效應子(例如有效負載)或用於遞送治療劑或治療效應子至真核細胞(例如人類細胞或人類組織)。本文描述例如桿狀病毒粒子及包含如本文所述之遺傳元件區域及適用於產生桿狀病毒之元件的核酸構築體(在本文中亦稱作穿梭載體)，諸如桿狀病毒基因體或其片段，以及適用於產生桿狀病毒之細胞(例如昆蟲細胞)，例如包含此類核酸構築體之細胞。亦描述供體載體，其包含遺傳元件區域及一或多個適用於將遺傳元件區域轉移至穿梭載體主鏈中之元件(例如同源重組酶識別位點，例如Tn7R及Tn7L位點)。本文亦描述例如使用此類核酸構築體(例如，穿梭載體及/或供體載體)、桿狀病毒及/或細胞產生指環載體之方法。另外，本文提供產生適用於產生指環載體之核酸構築體(例如，穿梭載體及/或供體載體)、桿狀病毒及細胞的方法。
指環載體(例如使用如本文所述之組合物或方法產生)一般包含囊封於蛋白質外部(例如包含指環病毒衣殼蛋白例如指環病毒ORF1蛋白或由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽的蛋白質外部)之遺傳元件(例如包含或編碼效應子之遺傳元件，例如外源或內源效應子，例如治療效應子)，該指環載體能夠將遺傳元件引入至細胞(例如哺乳動物細胞，例如人類細胞)中。在一些實施例中，指環載體為包含蛋白質外部之感染性媒劑或粒子，該蛋白質外部包含由指環病毒ORF1核酸(例如α細環病毒( Alphatorquevirus)、β細環病毒( Betatorquevirus)或γ細環病毒( Gammatorquevirus)之ORF1核酸，例如α細環病毒分枝系1、α細環病毒分枝系2、α細環病毒分枝系3、α細環病毒分枝系4、α細環病毒分枝系5、α細環病毒分枝系6或α細環病毒分枝系7之ORF1，例如如本文所述)編碼的多肽。本發明之指環載體的遺傳元件通常為環狀及/或單股DNA分子(例如，環狀及單股)，且一般包括與圍封其之蛋白質外部結合的蛋白質結合序列或與其連接之多肽，其可促進將遺傳元件圍封在蛋白質外部內及/或相對於蛋白質外部內之其他核酸富集遺傳元件。在一些實施例中，使用桿狀病毒、核酸構築體(例如穿梭載體及/或供體載體)及/或昆蟲細胞產生指環載體之遺傳元件，例如如本文所述。
在一些情況下，遺傳元件包含或編碼效應子(例如核酸效應子，諸如非編碼RNA，或多肽效應子，例如蛋白質)，其可在細胞中表現。在一些實施例中，效應子為治療劑或治療效應子，例如如本文所述。在一些實施例中，效應子為內源性效應子或外源性效應子，例如針對野生型指環病毒或目標細胞。在一些實施例中，效應子針對野生型指環病毒或目標細胞為外源性的。在一些實施例中，指環載體可藉由接觸細胞且將編碼效應子之遺傳元件引入細胞中而將效應子遞送至細胞中，使得效應子係由細胞製成或表現。在某些情況下，效應子為內源性效應子(例如針對靶細胞為內源性的，但例如藉由指環載體以增加量提供)。在其他情況下，效應子為外源性效應子。在一些情況下，效應子可調節細胞功能或調節細胞中靶分子之活性或水準。例如，效應子可降低細胞中目標蛋白之水準(例如，如PCT/US19/65995之實例3及4中所述)。在另一實例中，指環載體可活體內遞送及表現效應子，例如外源性蛋白質(例如，如PCT/US19/65995之實例19及28中所述)。指環載體可用於例如將遺傳物質遞送至目標細胞、組織或個體；將效應子遞送至目標細胞、組織或個體；或用於治療疾病及病症，例如藉由遞送可作為治療劑操作之效應子至所需細胞、組織或個體。
在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於在例如宿主細胞中產生合成指環載體之遺傳元件。合成指環載體與野生型病毒相比具有至少一個結構差異(例如野生型指環病毒，例如本文所述)，例如相對於野生型病毒的缺失、插入、取代、修飾(例如酶修飾)。一般而言，合成指環載體包括圍封於蛋白質外部內之外源性遺傳元件，其可用於將遺傳元件或其中所編碼之效應子(例如外源性效應子或內源性效應子) (例如多肽或核酸效應子)遞送至真核(例如人類)細胞中。在實施例中，指環載體不引起可偵測及/或非所需免疫或炎症反應，例如不會使炎症分子標記(例如TNF-α、IL-6、IL-12、IFN)以及B細胞反應(例如反應性或中和抗體)增加超過1%、5%、10%、15%，例如指環載體可基本上對目標細胞、組織或個體無免疫原性。
在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於產生指環載體之遺傳元件，其包含：(i)遺傳元件，該遺傳元件包含啟動子元件及編碼效應子(例如內源性或外源性效應子)之序列，及蛋白質結合序列(例如外部蛋白質結合序列，例如封裝信號)；及(ii)蛋白質外部；其中遺傳元件圍封於蛋白質外部(例如衣殼)內；且其中指環載體能夠將遺傳元件遞送至真核(例如哺乳動物，例如人類)細胞中。在一些實施例中，遺傳元件為單股及/或環狀DNA。替代地或組合地，遺傳元件具有以下特性之一者、兩者、三者或全部：為環狀，為單股，以小於進入細胞之遺傳元件的約0.0001%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合至細胞之基因體中，及/或以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，整合頻率藉由對自游離載體分離之基因體DNA的定量凝膠純化分析來測定，例如如Wang等人(2004, Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中所述。在一些實施例中，遺傳元件圍封於蛋白質外部內。在一些實施例中，指環載體能夠將遺傳元件遞送至真核細胞中。在一些實施例中，遺傳元件包含核酸序列(例如，300-4000個核苷酸之間、例如300-3500個核苷酸之間、300-3000個核苷酸之間、300-2500個核苷酸之間、300-2000個核苷酸之間、300-1500個核苷酸之間的核酸序列)，該核酸序列與野生型指環病毒之序列(例如野生型細環病毒(Torque Teno virus，TTV)、細小環病毒(Torque Teno mini virus，TTMV)或TTMDV序列，例如如本文所述之野生型指環病毒序列)具有至少75% (例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的序列一致性。在一些實施例中，遺傳元件包含核酸序列(例如至少300個核苷酸、500個核苷酸、1000個核苷酸、1500個核苷酸、2000個核苷酸、2500個核苷酸、3000個核苷酸或更多之核酸序列)，該核酸序列與野生型指環病毒之序列(例如如本文所述之野生型指環病毒序列)具有至少75% (例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的序列一致性。在一些實施例中，核酸序列經密碼子最佳化，例如用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現。在一些實施例中，核酸序列中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子經密碼子最佳化，例如用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現。
在一些實施例中，本文所述之核酸包含一或多個密碼子最佳化開讀框(例如編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3之序列，其中序列經密碼子最佳化，例如用於在哺乳動物細胞，例如昆蟲細胞中表現)。在一些實施例中，本文所述之核酸包含編碼指環病毒ORF1分子之密碼子最佳化序列。不希望受理論束縛，在一些實施例中，相較於非密碼子最佳化序列，針對昆蟲細胞之密碼子最佳化增加昆蟲細胞中指環病毒ORF1分子之表現。
在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於產生感染性(例如針對人類細胞)指環載體、媒劑或粒子之遺傳元件，該指環載體、媒劑或粒子包含衣殼(例如包含指環病毒ORF，例如ORF1，多肽之衣殼)，該衣殼囊封包含結合至衣殼之蛋白質結合序列及編碼治療性效應子之異源(針對指環病毒)序列的遺傳元件。在實施例中，指環載體能夠將遺傳元件遞送至哺乳動物，例如人類細胞中。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒基因體序列具有小於約6% (例如小於10%、9%、8%、7%、6%、5.5%、5%、4.5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%或更低)的一致性。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒基因體序列具有不超過1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%或6%的一致性。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒具有至少約2%至至少約5.5% (例如2%至5%、3%至5%、4%至5%)的一致性。在一些實施例中，遺傳元件具有大於約2000、3000、4000、4500或5000個核苷酸之非病毒序列(例如非指環病毒基因體序列)。在一些實施例中，遺傳元件具有大於約2000至5000、2500至4500、3000至4500、2500至4500、3500或4000、4500個(例如約3000至4500個之間)非病毒序列(例如非指環病毒基因體序列)之核苷酸。在一些實施例中，遺傳元件為單股環狀DNA。替代地或組合地，遺傳元件具有以下特性之一者、兩者、三者或全部：為環狀，為單股，以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合至細胞之基因體中，及/或以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至靶細胞之基因體中，或以小於進入細胞之遺傳元件之約0.0001%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合(例如相對於細胞溶解物之遺傳元件序列，藉由比較整合至基因體DNA中的頻率)。在一些實施例中，整合頻率藉由對自游離載體分離之基因體DNA的定量凝膠純化分析來測定，例如如Wang等人(2004, Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中所述。
在一些實施例中，如本文所述之指環病毒或指環載體可用作有效遞送媒劑，用於將藥劑，諸如本文所描述之效應子引入至目標細胞，例如待治療性或預防性治療之個體中的目標細胞。
在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於產生包含蛋白質外部之指環載體的遺傳元件，該蛋白質外部包含多肽(例如合成多肽，例如ORF1分子)，該多肽包含(例如串聯)： (i)包含富含精胺酸之第一區域，例如至少約40個胺基酸之序列，該序列包含至少60%、70%或80%鹼性殘基(例如精胺酸、離胺酸或其組合)， (ii)包含凝膠捲域(jelly-roll domain)之第二區域，例如包含至少6個β股之序列， (iii)包含本文所述之N22域序列之第三區域， (iv)包含本文所述之指環病毒ORF1 C端域(CTD)序列之第四區域，及 (v)視情況，其中該多肽具有與野生型指環病毒ORF1蛋白具有小於100%、99%、98%、95%、90%、85%、80%的序列一致性的胺基酸序列，例如如本文所述。
在一態樣中，本發明提供一種經分離核酸分子(例如核酸構築體，例如穿梭載體或供體載體)，其包含遺傳元件之序列，該遺傳元件包含可操作地連接於編碼效應子(例如有效負載)之序列的啟動子元件，及外部蛋白質結合序列。在一些實施例中，外部蛋白質結合序列包括與指環病毒之5'UTR序列具有至少75% (至少80%、85%、90%、95%、97%、100%)一致性的序列，例如如本文所揭示。在實施例中，遺傳元件為單股DNA，為環狀，以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合至細胞之基因體中，及/或以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中，或以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合。在一些實施例中，整合頻率藉由對自游離載體分離之基因體DNA的定量凝膠純化分析來測定，例如如Wang等人(2004, Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中所述。在實施例中，效應子不來源於TTV且不為SV40-miR-S1。在實施例中，核酸分子不包含TTMV-LY2之聚核苷酸序列。在實施例中，啟動子元件能夠導引效應子在真核(例如哺乳動物，例如人類)細胞中之表現。
在一些實施例中，核酸分子包含適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域，例如包含一或多個桿狀病毒元件)。在一些實施例中，核酸分子為穿梭載體。在一些實施例中，核酸分子包含桿狀病毒基因體或其功能片段。在一些實施例中，主鏈區域適用於複製細菌細胞(例如供體載體，例如如本文所述)中之核酸分子。
在一些實施例中，核酸分子為環狀的。在一些實施例中，核酸分子為線性的。在一些實施例中，本文所述之核酸分子包含一或多個經修飾之核苷酸(例如鹼基修飾、糖修飾或主鏈修飾)。
在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF1分子(例如指環病毒ORF1蛋白，例如如本文所述)之序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF2分子(例如指環病毒ORF2蛋白，例如如本文所述)之序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF3分子(例如指環病毒ORF3蛋白，例如如本文所述)之序列。在一態樣中，本發明提供包含以下中之一者、兩者或三者的遺傳元件：(i)啟動子元件及編碼效應子，例如外源性或內源性效應子之序列；(ii)至少72個與野生型指環病毒序列具有至少75% (例如至少75、76、77、78、79、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)序列一致性的連續核苷酸(例如至少72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100或150個核苷酸)；或至少100個(例如至少300、500、1000、1500個)與野生型指環病毒序列具有至少72% (例如至少72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)序列一致性的連續核苷酸；及(iii)蛋白質結合序列，例如外部蛋白質結合序列，且其中核酸構築體為單股DNA；且其中核酸構築體為環狀，以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合，及/或以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，編碼效應子(例如外源性或內源性效應子，例如如本文所述)之遺傳元件經密碼子最佳化。在一些實施例中，遺傳元件為環狀的。在一些實施例中，遺傳元件為線性的。在一些實施例中，本文所述之遺傳元件包含一或多個經修飾之核苷酸(例如鹼基修飾、糖修飾或主鏈修飾)。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF1分子(例如指環病毒ORF1蛋白，例如如本文所述)之序列。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF2分子(例如指環病毒ORF2蛋白，例如如本文所述)之序列。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF3分子(例如指環病毒ORF3蛋白，例如如本文所述)之序列。
在一態樣中，本發明提供包含例如如本文所述之穿梭載體或供體載體的宿主細胞。在一些實施例中，穿梭載體為核酸構築體，其包含適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域，例如包含桿狀病毒基因體或其元件)。在一些實施例中，穿梭載體之主鏈區域適用於在細菌細胞(例如大腸桿菌，例如DH 10Bac細胞)中複製核酸構築體。在一些實施例中，供體載體為包含適用於在細菌細胞(例如大腸桿菌，例如DH 10Bac細胞)中複製核酸構築體之主鏈區域的核酸構築體(例如質體)。在一些實施例中，宿主細胞為昆蟲細胞(例如Sf9細胞)，例如包含穿梭載體。在一些實施例中，宿主細胞為細菌細胞(例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)，例如包含供體載體及/或穿梭載體。在一些實施例中，宿主細胞包含：(a)穿梭載體及/或供體細胞，其包含編碼ORF1分子、ORF2分子或ORF3分子中之一或多者的序列(例如，編碼本文所述之指環病毒ORF1多肽的序列)；及(b)遺傳元件(例如包含相同穿梭載體及/或供體載體於中，或包含於第二穿梭載體及/或供體載體中)，其中遺傳元件包含(i)可操作地連接於編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)的啟動子元件及(ii)結合(a)之多肽的蛋白質結合序列，其中視情況，該遺傳元件不編碼ORF1多肽(例如ORF1蛋白)。例如，宿主細胞包含順式(相同核酸分子之兩部分)或反式(不同核酸分子之各部分)之(a)及(b)。在實施例中，(b)之遺傳元件為環狀單股DNA。在一些實施例中，宿主細胞為製造細胞株，例如如本文所述。在一些實施例中，宿主細胞為黏附的或懸浮的，或兩者。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞在微載體中生長。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞與cGMP製造實踐相容。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞在適合於促進細胞生長之培養基中生長。在某些實施例中，在宿主細胞或輔助細胞已充分生長(例如生長至適當細胞密度)後，培養基可與適合於宿主細胞或輔助細胞產生指環載體之培養基進行交換。
在一態樣中，本發明之特徵在於一種醫藥組合物，其包含如本文所述之指環載體(例如合成指環載體)。在實施例中，醫藥組成物進一步包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在實施例中，醫藥組合物包含單位劑量，該單位劑量包含每公斤目標個體之約10 5-10 14(例如約10 6-10 13、10 7-10 12、10 8-10 11或10 9-10 10)基因體當量之指環載體。在一些實施例中，包含製劑之醫藥組合物在可接受之時段及溫度內將為穩定的，及/或與所需投與途徑及/或此投與途徑將需要之任何裝置相容，例如針或注射器。在一些實施例中，醫藥組合物經調配而以單次劑量或多次劑量投與。在一些實施例中，醫藥組合物在投與部位調配，例如由保健專家調配。在一些實施例中，醫藥組合物包含所需濃度之指環載體基因體或基因體當量(例如如根據每體積之基因體數目所定義)。
在一態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向個體投與指環載體，例如合成指環載體，例如如本文所述。
在一態樣中，本發明提供一種向細胞、組織或個體遞送效應子或有效負載(例如內源性或外源性效應子)之方法，該方法包含向個體投與指環載體，例如合成指環載體，例如如本文所述，其中該指環載體包含編碼效應子之核酸序列。在實施例中，有效負載為核酸。在實施例中，有效負載為多肽。
在一態樣中，本發明提供一種將指環載體遞送至細胞之方法，其包含使指環載體，例如合成指環載體，例如如本文所述，與細胞，例如真核細胞，例如哺乳動物細胞，例如活體內或離體接觸。
在一態樣中，本發明提供一種製造指環病毒ORF分子之方法。該方法包括： (a)提供包含核酸分子之宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)，該核酸分子包含： (i)可操作地連接於編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之序列的啟動子；及 (ii)適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中主鏈區域亦適用於在細菌細胞中複製核酸構築體；及 (b)在適用於表現指環病毒ORF分子之條件下培育宿主細胞，從而產生指環病毒ORF分子。
在一些實施例中，宿主細胞為昆蟲細胞(例如Sf9細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為細菌細胞(例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)。
例如，此製造方法中提供之宿主細胞包含(a)核酸分子(例如穿梭載體或供體載體)，其包含編碼本文所述之指環病毒ORF1多肽的序列；及(b)核酸構築體(例如穿梭載體)，其能夠產生遺傳元件(例如包含遺傳元件序列及/或遺傳元件區域，例如如本文所述)，其中該遺傳元件包含(i)啟動子元件可操作地連接於編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)，及(ii)結合(a)之多肽的蛋白質結合序列(例如封裝序列)，其中宿主細胞包含順式或反式之(a)及(b)。在實施例中，(b)之遺傳元件為環狀單股DNA。在一些實施例中，宿主細胞為製造細胞株。
在一些實施例中，在生產時(例如藉由短暫轉染)將指環載體之組分引入宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞穩定表現指環載體之組分(例如其中編碼指環載體之組分的一或多種核酸例如藉由穩定轉染引入宿主細胞或其前驅細胞中)。
在一態樣中，本發明提供一種製造指環載體組合物之方法，其包含：a)提供複數個本文所述之指環載體或本文所述之指環載體製劑；及b)調配指環載體或其製劑，例如調配為適用於向個體投與之醫藥組合物。
在一態樣中，本發明提供一種製造宿主細胞，例如第一宿主細胞或生產細胞(例如，如PCT/US19/65995之圖12中所示) (例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)，例如包含指環載體之第一宿主細胞群體的方法，該方法包含將能夠產生遺傳元件(例如穿梭載體，例如如本文所述)之核酸構築體引入至宿主細胞且在適合於產生指環載體之條件下培養宿主細胞。在實施例中，該方法進一步包含向宿主細胞中引入輔助細胞，例如輔助病毒。在實施例中，該引入包含轉染(例如化學轉染)或電穿孔具有指環載體之宿主細胞。
在一態樣中，本發明提供一種製造指環載體之方法，其包含提供宿主細胞，例如第一宿主細胞或生產細胞(例如PCT/US19/65995之圖12中所示) (例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)，該宿主細胞包含例如如本文所述之指環載體，及自宿主細胞純化指環載體。在一些實施例中，在提供步驟之前，該方法進一步包含使宿主細胞與核酸構築體(例如穿梭載體)或例如如本文所述之指環載體接觸，且在適用於產生指環載體之條件下培育宿主細胞。在實施例中，宿主細胞為上述製備宿主細胞之方法中所述之第一宿主細胞或生產細胞。在實施例中，自宿主細胞純化指環載體包含溶解宿主細胞。
在一些實施例中，方法進一步包含使由第一宿主細胞或生產細胞產生之指環載體與第二宿主細胞，例如容許細胞(例如如PCT/US19/65995之圖12中所示)，例如第二宿主細胞群體接觸的第二步驟。在一些實施例中，方法進一步包含在適用於產生指環載體的條件下培育第二宿主細胞。在一些實施例中，方法進一步包含自第二宿主細胞純化指環載體，例如藉此產生指環載體種子群體。在實施例中，自第二宿主細胞群體產生之指環載體比自第一宿主細胞群體產生之指環載體多至少約2-100倍。在實施例中，自第二宿主細胞純化指環載體包含溶解第二宿主細胞。在一些實施例中，方法進一步包含使由第二宿主細胞產生之指環載體與第三宿主細胞，例如容許細胞(例如PCT/US19/65995之圖12中所示)，例如第三宿主細胞群體接觸的第二步驟。在一些實施例中，方法進一步包含在適用於產生指環載體之條件下培育第三宿主細胞。在一些實施例中，方法進一步包含自第三宿主細胞純化指環載體，例如藉此產生指環載體儲備群體。在實施例中，自第三宿主細胞純化指環載體包含溶解第三宿主細胞。在實施例中，自第三宿主細胞群體產生之指環載體比自第二宿主細胞群體產生之指環載體多至少約2-100倍。
在一些實施例中，宿主細胞在適用於促進細胞生長之培養基中生長。在某些實施例中，在宿主細胞已充分生長(例如生長至適當細胞密度)後，培養基可與適用於藉由宿主細胞產生指環載體之培養基交換。在一些實施例中，在與第二宿主細胞接觸之前，由宿主細胞產生之指環載體與宿主細胞分離(例如藉由溶解宿主細胞)。在一些實施例中，由宿主細胞產生之指環載體不經中間純化步驟即與第二宿主細胞接觸。
在一態樣中，本發明提供一種製造醫藥指環載體製劑之方法。該方法包含(a)製造如本文所述之指環載體製劑；(b)對製劑(例如醫藥指環載體製劑、指環載體種子群體或指環載體儲備群體)評估一或多個醫藥品質控制參數，例如標識、純度、效價、效力(例如以基因體當量/指環載體粒子計)及/或核酸序列，例如來自指環載體所包含之遺傳元件，及(c)調配製劑以使評估之醫藥用途滿足預定準則，例如滿足醫藥規範。在一些實施例中，評估標識包含評估(例如確認)指環載體之遺傳元件的序列，例如編碼效應子之序列。在一些實施例中，評估純度包含評估雜質之量，該雜質為例如黴漿菌、內毒素、宿主細胞核酸(例如宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、生物衍生之過程雜質(例如血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型試劑(RCA)，例如複製勝任型病毒或非所需指環載體(例如除所需指環載體以外的指環載體，例如如本文所述之合成指環載體)、游離病毒衣殼蛋白、偶然性物質及聚集體。在一些實施例中，評估效價包含評估製劑中功能性指環載體相對於非功能性指環載體(例如感染性相對於非感染性)之比率(例如如藉由HPLC所評估)。在一些實施例中，評估效力包含評估製劑中可偵測之指環載體功能(例如其中編碼之效應子的表現及/或功能或基因體當量)的水準。
在實施例中，調配製劑基本上不含病原體、宿主細胞污染物或雜質；具有預定水準之非感染性粒子或非感染性粒子:感染性單位之預定比率(例如＜300:1、＜200:1、＜100:1或＜50:1)。在一些實施例中，可在單一批次中產生多個指環載體。在實施例中，可評估批次中產生之指環載體之水準(例如單獨或一起)。
在一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含： (i)包含如本文所述之核酸構築體(例如穿梭載體或供體載體)之第一核酸分子，及 (ii)視情況，第二核酸分子(例如穿梭載體或供體載體)，其編碼選自ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2之胺基酸序列中之一或多者，例如如本文所述，或與其具有至少約70% (例如至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的胺基酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種反應混合物，其包含本文所述之指環載體及輔助病毒，其中該輔助病毒包含例如編碼外部蛋白質(例如能夠結合至外部蛋白質結合序列之外部蛋白質及視情況脂質包膜)之聚核苷酸、編碼複製蛋白(例如聚合酶)之聚核苷酸或其任何組合。
在一些實施例中，指環載體(例如合成指環載體)經分離，例如自宿主細胞分離及/或自溶液(例如上清液)中之其他成分分離。在一些實施例中，指環載體(例如合成指環載體)例如自溶液(例如上清液)純化。在一些實施例中，相對於溶液中之其他成分，指環載體在溶液中富集。
在前述指環載體、組合物或方法中之任一者之一些實施例中，提供指環載體包含自包含產生指環載體細胞之組合物分離(例如收集)指環載體，例如如本文所述。在其他實施例中，提供指環載體包含例如自第三方獲得指環載體或其製劑。
在前述指環載體、組合物或方法中之任一者的一些實施例中，遺傳元件包含抗體-指環載體基因體，例如如根據本文所述之方法鑑定。在實施例中，指環載體基因體包含TTV-tth8核酸序列，例如如下之TTV-tth8核酸：例如TTV-tth8核酸序列之核苷酸3436-3707中之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%經缺失。在實施例中，指環載體基因體包含TTMV-LY2核酸序列，例如如下之TTMV-LY2核酸序列：例如TTMV-LY2核酸序列之核苷酸574-1371、1432-2210、574-2210及/或2610-2809中之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%經缺失。在實施例中，遺傳元件能夠自我複製及/或自我擴增。在實施例中，遺傳元件不能夠自我複製及/或自我擴增。在實施例中，遺傳元件能夠反式複製及/或擴增，例如在輔助物，例如輔助病毒存在下。
前述指環載體、組合物或方法中之任一者之額外特徵包括以下所列舉實施例中之一或多者。
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所述之本發明特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲由以下所列舉實施例涵蓋。 所列舉實施例1. 一種組合物，其包含 (i)核酸(例如DNA)構築體，其包含： a)可操作地連接於編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之序列的啟動子；及 b)適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中主鏈區域亦適用於在細菌細胞中複製核酸構築體；及 (ii)指環病毒遺傳元件，其包含可操作地連接於編碼外源性效應子之序列的啟動子。 2. 如實施例1之組合物，其中指環病毒遺傳元件為核酸構築體之一部分。 3. 如實施例1之組合物，其含有包含指環病毒遺傳元件之第二核酸構築體。 4. 一種核酸(例如DNA)構築體，其包含： a)指環病毒遺傳元件區域，其包含可操作地連接於編碼外源性效應子之序列的啟動子；及 b)適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中主鏈區域亦適用於在細菌細胞中複製核酸構築體。 5. 如實施例4之核酸構築體，其進一步包含一或多個卡匣，該一或多個卡匣包含可操作地連接於編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之序列的啟動子。 6. 如實施例5之核酸構築體，其中該啟動子為指環病毒啟動子或外源性啟動子(例如多面體啟動子)。 7. 如前述實施例中任一項之核酸構築體，其中該核酸構築體為分離之核酸構築體。 8. 一種細菌細胞，其包含如前述實施例中任一項之核酸構築體或核酸製劑。 9. 一種昆蟲細胞，其包含如前述實施例中任一項之核酸構築體或核酸製劑。 10.   一種昆蟲細胞，其包含指環病毒ORF1分子，該分子包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區域及指環病毒ORF1 C端域。 11.    如實施例10之昆蟲細胞，其中指環病毒ORF1分子包含指環病毒ORF1凝膠捲域。 12.   如實施例10或11之昆蟲細胞，其中指環病毒ORF1分子包含指環病毒ORF1高變域。 13.   如實施例10至12中任一項之昆蟲細胞，其中指環病毒ORF1分子包含指環病毒ORF1 N22域。 14.   如實施例9至13中任一項之昆蟲細胞，其包含指環病毒ORF1分子之至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、10,000、50,000或100,000個複本。 15.   一種包含如實施例4至7中任一項之核酸構築體的昆蟲細胞，其進一步含有包含以下者之核酸構築體： a)編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之序列；及 b)適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中主鏈區域亦適用於在細菌細胞中複製核酸構築體。 16.   一種組合物，其包含分離之指環病毒ORF1分子，該分子包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區域及指環病毒C端域，且不包含可偵測水準之指環病毒遺傳元件。 17.   如實施例16之組合物，其中指環病毒ORF1分子包含指環病毒ORF1凝膠捲域。 18.   如實施例16至17中任一項之組合物，其中指環病毒ORF1分子包含指環病毒ORF1高變域。 19.   如實施例16至18中任一項之組合物，其中指環病毒ORF1分子包含指環病毒ORF1 N22域。 20.   如實施例16至19中任一項之組合物，其中相對於野生型指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述)，指環病毒ORF1分子或編碼其之核酸分子包含至少一個差異(例如突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如域(例如富含精胺酸之區域、凝膠捲域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所述)之缺失。 21.   一種組合物，其包含分子量為至少101 kDa之分離之指環病毒ORF1分子，且不包含可偵測水準之指環病毒遺傳元件。 22.   如實施例21之組合物，其中相對於野生型指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述)，指環病毒ORF1分子或編碼其之核酸分子包含至少一個差異(例如突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如域(例如富含精胺酸之區域、凝膠捲域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所述)之缺失。 23.   一種桿狀病毒粒子，其包含如前述實施例中任一項之核酸構築體。 24.   一種桿狀病毒粒子群體，其包含如前述實施例中任一項之核酸構築體。 25.   一種反應混合物，其包含如實施例24之桿狀病毒粒子群體及複數個昆蟲細胞。 26.   一種核酸構築體，其依序包含： a)第一轉位酶識別序列(例如Tn7R序列)； b)指環病毒遺傳元件區域，其包含可操作地連接於編碼外源性效應子之序列的啟動子； c)第二轉位酶識別序列(例如Tn7L序列)；及 d)視情況存在之主鏈區域，例如其中主鏈區域適用於DNA構築體之複製。 27.   如實施例26之核酸構築體，其進一步包含編碼指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子之序列。 28.   一種核酸構築體，其依序包含： a)第一轉位酶識別序列(例如Tn7R序列)； b)可操作地連接於編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之序列的啟動子； c)第二轉位酶識別序列(例如Tn7L序列)；及 d)視情況存在之主鏈區域，例如其中主鏈區域適用於DNA構築體之複製。 29.   如實施例28之核酸構築體，其進一步包含指環病毒遺傳元件區域，該區域包含可操作地連接於編碼外源性效應子之序列的啟動子。 30.   一種細菌細胞，其包含如實施例26至29中任一項之核酸構築體。 31.   一種反應混合物，其包含如實施例26至30中任一例之核酸構築體及細菌細胞(例如大腸桿菌細胞)。 32.   一種昆蟲細胞，其包含指環病毒遺傳元件。 33.   一種包含指環病毒遺傳元件之昆蟲細胞，該遺傳元件包含可操作地連接於編碼外源性效應子之序列的啟動子。 34.   如實施例32或33之昆蟲細胞，其進一步包含一或多個ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)。 35.   如實施例34之昆蟲細胞，其中ORF1分子圍封指環病毒遺傳元件。 36.   一種製造桿狀病毒粒子之方法，該方法包含： (i)提供昆蟲細胞(例如Sf9細胞)，其包如前述實施例中任一項之核酸構築體；及 (ii)在適用於產生包含核酸構築體或其複本之桿狀病毒粒子的條件下培育該昆蟲細胞； 由此製造桿狀病毒粒子。 37.   如實施例36之方法，其中提供包含核酸構築體之昆蟲細胞包含將核酸構築體引入(例如轉染或感染)至昆蟲細胞中。 38.   如實施例36或37之方法，其進一步包含分離桿狀病毒粒子。 39.   如實施例36至38中任一項之方法，其進一步包含使桿狀病毒粒子與第二昆蟲細胞接觸。 40.   如實施例39之方法，其進一步包含在適用於產生包含核酸構築體或其複本之第二桿狀病毒粒子的條件下培育第二昆蟲細胞。 41.   一種將如前述實施例中任一項之核酸構築體引入至昆蟲細胞中之方法，該方法包含使昆蟲細胞與包含該核酸構築體之桿狀病毒粒子接觸。 42.   一種製造桿狀病毒粒子之方法，該方法包含： (i)將如前述實施例中任一項之核酸構築體引入(例如轉染)至第一昆蟲細胞中； (ii)在適用於產生包含核酸構築體或其複本之第一桿狀病毒粒子的條件下培育該昆蟲細胞； (iii)分離該第一桿狀病毒粒子； (iv)使第一桿狀病毒粒子與第二昆蟲細胞接觸；以及 (v)在適用於產生包含核酸構築體或其複本之第二桿狀病毒粒子的條件下培育第二昆蟲細胞。 43.   一種製造包含指環病毒遺傳元件之穿梭載體構築體之昆蟲細胞的方法，該方法包含： (i)提供昆蟲細胞(例如Sf9細胞)，其包含如前述實施例中任一項之核酸構築體及空穿梭載體構築體；及 (ii)在適用於核酸構築體與空穿梭載體構築體之間的重組之條件下培育昆蟲細胞； 由此製造含有包含指環病毒遺傳元件之穿梭載體構築體的昆蟲細胞。 44.   一種製造包含指環病毒遺傳元件之穿梭載體構築體之昆蟲細胞的方法，該方法包含： (i)提供包含空穿梭載體構築體及核酸構築體之昆蟲細胞(例如Sf9細胞)，該核酸構築體依序包含： a)第一轉位酶識別序列(例如Tn7R序列)； b)指環病毒遺傳元件區域，其包含可操作地連接於編碼外源性效應子之序列的啟動子； c)第二轉位酶識別序列(例如Tn7L序列)；及 d)視情況存在之主鏈區域，例如其中主鏈區域適用於DNA構築體之複製；及 (ii)在適用於核酸構築體與空穿梭載體構築體之間的重組之條件下培育昆蟲細胞； 由此製造含有包含指環病毒遺傳元件之穿梭載體構築體的昆蟲細胞。 45.   一種製造指環載體之方法，該方法包含： (i)提供一種昆蟲細胞，其包含： a)指環病毒遺傳元件，其包含可操作地連接於編碼外源性效應子之序列的啟動子，及 b)指環病毒ORF1分子； (ii)在適用於將指環病毒遺傳元件圍封在包含指環病毒ORF1分子之蛋白質外部中的條件下培育昆蟲細胞。 46.   如實施例45之方法，其中該方法進一步包含將指環病毒遺傳元件引入(例如轉染)至該昆蟲細胞中。 47.   如實施例46之方法，其中該昆蟲細胞在該引入之前包含ORF1分子。 48.   如實施例45至47中任一項之方法，其中昆蟲細胞包含編碼ORF1分子之核酸構築體(例如穿梭載體)。 49.   如實施例48之方法，其中ORF1分子係由編碼ORF1分子之核酸構築體表現。 50.   如實施例45至49中任一項之方法，其在步驟(i)之前進一步包含將核酸構築體引入昆蟲細胞中，該核酸構築體包含指環病毒遺傳元件及適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中主鏈區域亦適用於在細菌細胞中複製核酸構築體。 51.   如實施例45至50中任一項之方法，其在步驟(i)之前進一步包含將核酸構築體引入昆蟲細胞中，該核酸構築體包含編碼指環病毒ORF1分子之序列及適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中主鏈區域亦適用於在細菌細胞中複製核酸構築體。 52.   如實施例45至51中任一項之方法，其在步驟(i)之前進一步包含將核酸構築體引入昆蟲細胞中，該核酸構築體包含： 編碼指環病毒ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子的序列，及 適用於在昆蟲細胞中複製核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中主鏈區域亦適用於在細菌細胞中複製核酸構築體。 53.   如實施例45至52中任一項之方法，其中產生至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、5000、10,000、50,000或100,000個指環載體。 54.   如實施例45至53中任一項之方法，其進一步包含自昆蟲細胞分離指環載體。 55.   如實施例45至54中任一項之方法，其中昆蟲細胞與cGMP作業規範相容。 56.   一種製造兩種或更多種不同指環病毒ORF分子之方法，該方法包含： (i)提供包含編碼兩種或更多種不同指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子中之兩者或更多者)之核酸構築體的昆蟲細胞； (ii)在適用於表現兩種或更多種不同指環病毒ORF分子之條件下培育昆蟲細胞。 57.   如實施例56之方法，其中指環病毒遺傳元件包含編碼ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子中之所有者的序列。 58.   如實施例56之方法，其中指環病毒遺傳元件包含全長指環病毒基因體(例如如表A1、B1或C1中之任一者中所列)，視情況其中該全長指環病毒基因體進一步包含編碼外源性效應子之序列。 59.   如實施例56之方法，其中該指環病毒遺傳元件包含全長指環病毒編碼區。 60.   如實施例56之方法，其進一步包含在適用於分泌指環病毒ORF分子之條件下培育該昆蟲細胞。 61.   如實施例56之方法，其進一步自昆蟲細胞分離指環病毒ORF分子。 62.   如實施例61之方法，其中分離步驟包含溶解昆蟲細胞。 63.   如實施例56至62中任一項之方法，其中指環病毒ORF包含指環病毒ORF1分子。 64.   一種製造指環病毒ORF1分子之方法，該方法包含： (i)提供包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸構築體的昆蟲細胞，其中： (a)指環病毒ORF1分子之分子量為至少101 kDa， (b)指環病毒ORF1分子為全長指環病毒ORF1蛋白， (c)當存在指環病毒遺傳元件時，複數個指環病毒ORF1分子圍封指環病毒遺傳元件， (d)該指環病毒ORF1分子不為TTV ORF1蛋白， (e)指環病毒ORF1分子為β細環病毒或γ細環病毒ORF1分子；或 (f)指環病毒ORF1分子包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區域及指環病毒C端域； (ii)在適用於表現指環病毒ORF1分子之條件下培育該昆蟲細胞。 65.   如實施例64之方法，其進一步包含在適用於分泌指環病毒ORF1分子之條件下培育該昆蟲細胞。 66.   如實施例64之方法，其進一步自昆蟲細胞分離指環病毒ORF1分子。 67.   如實施例66之方法，其中分離步驟包含溶解昆蟲細胞。 68.   如前述實施例中任一項之方法，其中該培育步驟產生可藉由西方墨點偵測之一定量的指環病毒ORF1分子，例如如實例1或2中所述。 69.   一種根據如實施例36至42中任一項之方法產生之桿狀病毒粒子。 70.   一種組合物，其包含複數個根據如實施例36至42中任一項之方法產生之桿狀病毒粒子。 71.   一種根據如實施例45至68中任一項之方法產生之指環載體。 72.   一種組合物，其包含複數個根據如實施例45至68中任一項之方法產生之指環載體。 73.   如實施例第72項之組成物，其具有預定水準之非感染性粒子或非感染性粒子:感染性單位之預定比率(例如小於300:1、200:1、100:1或50:1)。 74.   一種根據如實施例45至68中任一項之方法產生之指環病毒ORF分子。 75.   一種組合物，其包含複數個根據如實施例45至68中任一項之方法產生之指環病毒ORF分子。 76.   如實施例69至75中任一項之組合物、指環載體或指環病毒ORF分子，其滿足醫藥或良好作業規範(GMP)標準。 77.   如實施例69至76中任一項之組合物、指環載體或指環病毒ORF分子，其係根據醫藥或良好作業規範(GMP)標準製得。 78.   如實施例69至77中任一項之組合物、指環載體或指環病毒ORF分子，其病原體水準低於預定參考值，例如基本上不含病原體。 79.   如實施例69至78中任一項之組合物、指環載體或指環病毒ORF分子，其污染物水準低於預定參考值，例如基本上不含污染物。 80.   如實施例69至79中任一項之組合物、指環載體或指環病毒ORF分子，其為基本上非免疫原性的。 81.   一種治療個體之方法，該方法包含向該個體投與如實施例71之指環載體。 82.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒不為細環病毒(TTV)。 83.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中昆蟲細胞為鱗翅目( Lepidoptera)細胞。 84.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中昆蟲細胞為夜蛾總科( Noctuoidea)細胞。 85.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中昆蟲細胞為夜蛾科( Noctuidae)細胞。 86.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中昆蟲細胞為夜蛾( Spodoptera)細胞。 87.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中昆蟲細胞為草地貪夜蛾( S. frugiperda)細胞。 88.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中昆蟲細胞為Sf9細胞。 89.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF1之分子量為至少101 kDa。 90.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF1分子為全長指環病毒ORF1蛋白。 91.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中當存在指環病毒遺傳元件時，複數個指環病毒ORF1分子圍封指環病毒遺傳元件。 92.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF分子不為TTV ORF蛋白。 93.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF1分子不為TTV ORF1蛋白。 94.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF分子為β細環病毒或γ細環病毒ORF1分子。 95.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF1分子為β細環病毒或γ細環病毒ORF1分子。 96.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF1分子包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區域及指環病毒C端域。 97.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中遺傳元件或遺傳元件區域包含： a)包含編碼外源性效應子之序列的第一視情況突變之指環病毒基因體； b)與該第一指環病毒基因體串聯置放之第二指環病毒基因體或其片段；及 c)視情況，位於(a)與(b)之間的間隔序列。 98.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中遺傳元件或遺傳元件區域包含： a)第一指環病毒遺傳元件區域，其包含編碼外源性效應子之序列； b)第二指環病毒遺傳元件區域或其片段；及 c)視情況，位於(a)與(b)之間的間隔序列。 99.   如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中遺傳元件為環狀的(例如其中遺傳元件藉由活體外環化產生)，例如如實例5中所述。 100.  如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF1分子之富含精胺酸之區域經缺失或截短(例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60或65個胺基酸)。 101.  如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中指環病毒ORF分子藉由等密度離心分離、純化或富集，例如如實例6中所述。 102.  如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中各自包含指環病毒ORF1分子及遺傳元件之複合物藉由等密度離心分離、純化或富集，例如如實例6中所述。 103.  如前述實施例中任一項之核酸構築體、細胞、組合物、桿狀病毒粒子、群體、反應混合物、指環載體、指環病毒ORF分子或方法，其中編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1分子)之序列經密碼子最佳化以在動物細胞(例如昆蟲細胞)中表現。 104.  一種製造指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之方法，該方法包含： (i)提供包含編碼指環病毒病毒ORF分子之核酸構築體的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)； (ii)在適用於表現複數個指環病毒ORF分子之條件下培育該昆蟲細胞；及 (iii)視情況分離、純化及/或富集來自昆蟲細胞之複數個指環病毒ORF分子或其其他組分或成分； 由此製造指環病毒ORF分子。 105.  如實施例104之方法，其中指環病毒ORF分子與標記(例如His標籤)融合，例如在其N端或在其C端(例如如表X及/或實例1中所述)。 106.  如實施例104至105中任一項之方法，其中昆蟲細胞進一步包含編碼一或多個額外指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子中之一或多者)的核酸構築體，且其中該方法進一步包含： 在適用於表現複數個一或多個額外指環病毒ORF分子之條件下，例如在步驟(ii)之前、與其同時或在其之後培育該昆蟲細胞；及 視情況分離、純化及/或富集來自昆蟲細胞之複數個一或多個額外指環病毒ORF分子或其其他組分或成分，例如在步驟(iii)之前、與其同時或在其之後。 107.  如實施例106之方法，其中編碼一或多個額外指環病毒ORF分子之核酸構築體與(i)之核酸構築體相同。 108.  如實施例107之方法，其中(i)之核酸構築體包含編碼指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子中之2、3、4、5或所有6者的序列。 109.  如實施例107之方法，其中(i)之核酸構築體編碼指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子。 110.  如實施例107之方法，其中(i)之該核酸構築體包含指環病毒基因體之完整開讀框區。 111.  如實施例106之方法，其中編碼一或多個額外指環病毒ORF分子之核酸構築體不同於(i)之核酸構築體。 112.  如實施例106至111中任一項之方法，其中指環病毒ORF分子來自相同的指環病毒基因體。 113.  如實施例106至111中任一項之方法，其中指環病毒ORF分子來自複數個指環病毒基因體(例如其中ORF1分子來自一個指環病毒基因體且ORF2分子來自不同的指環病毒基因體)。 114.  如實施例106至113中任一項之方法，其中指環病毒ORF分子中之一或多者來自α細環病毒(例如如表Y中所列)。 115.  如實施例106至114中任一項之方法，其中指環病毒ORF分子中之一或多者來自β細環病毒(例如如表Y中所列)。 116.  如實施例106至115中任一項之方法，其中指環病毒ORF分子中之一或多者來自γ細環病毒(例如如表Y中所列)。 117.  如實施例104至116中任一者之方法，其中一或多個核酸構築體各自包含啟動子(例如控制指環病毒ORF分子中之一或多者之表現的啟動子，例如桿狀病毒多面體啟動子)。 118.  如實施例104至117中任一項之方法，其進一步包含在適用於分泌指環病毒ORF分子之條件下培育昆蟲細胞。 119.  如實施例104至118中任一項之方法，其中分離步驟包含溶解昆蟲細胞。 120.  如實施例104至119中任一項之方法，其中該培育步驟產生可藉由西方墨點偵測之一定量的指環病毒ORF分子(例如ORF1分子)，例如如實例1或2中所述。 121.  如實施例104至120中任一項之方法，其中培育步驟產生每1 L細胞培養物(例如Sf9培養物)至少1、2、3、4、5或6 mg指環病毒ORF1分子。 122.  如前述實施例中任一項之方法，其中指環病毒ORF分子係藉由等密度離心分離、純化或富集。 123.  如前述實施例中任一項之方法，其中指環病毒ORF分子為指環病毒ORF1分子，且其中該方法進一步包含： 在適用於藉由包含指環病毒ORF1分子之蛋白質外部圍封遺傳元件之條件下，在活體外使分離、純化或富集之指環病毒ORF1分子與遺傳元件接觸，例如如實例8中所述。
本發明之其他特徵、目標及優點將自實施方式及圖式及自申請專利範圍顯而易知。
除非另外定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解相同的含義。所有公開案、專利申請案、專利及本文中所提及之其他參考文獻均以全文引用之方式併入。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年6月12日申請之美國臨時申請案第63/038,603號及2021年2月8日申請之美國臨時申請案第63/147,056號的權益。前述申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 定義
將關於特定實施例及參考某些圖式描述本發明，但本發明不限於此，而僅僅受申請專利範圍限制。除非另外指明，否則如下文所闡述之術語一般應按其常識來理解。
當術語「包含」用於本說明書及申請專利範圍時，其不排除其他要素。出於本發明之目，將術語「由……組成(consisting of)」視為術語「包含(comprising of)」之一較佳實施例。若下文中將群組定義為包含至少一定數目個實施例，則此亦理解為揭示較佳僅由此等實施例組成之群組。
除非另外明確規定，否則當參考單數名詞使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a/an)」或「該(the)」時，此包括該名詞之複數。
措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」應理解為係指適用於治療、調節等指示目的之化合物、組合物、產物等本身。措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」另外揭示，作為一實施例，此類化合物、組合物、產物等用於治療、調節等。
措辭「用於……之化合物、組合物、產物等」、「化合物、組合物、產物等在製造用於……之藥物、醫藥組合物、獸醫組合物、診斷組合物等中的用途」或「用作藥劑……之化合物、組合物、產物等」指示此類化合物、組合物、產物等將待用於可在人類或動物體上實施之治療方法中。其被視為與關於治療方法等的實施例及技術方案等效之揭示內容。若實施例或技術方案因此係指「用於治療疑似患有疾病之人類或動物的化合物」，則此亦被視為揭示「化合物在製造供治療疑似患有疾病之人類或動物用之藥劑中的用途」或「藉由向疑似患有疾病之人類或動物投與化合物進行治療之方法」。措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」應理解為係指適用於治療、調節等指示目的之化合物、組合物、產物等本身。
若在下文中將術語、值、數目等的實例提供於括號中，則此應理解為括號中提及之實例可構成實施例之指示。例如，若陳述「在實施例中，核酸分子包含與表1之編碼指環病毒ORF1的核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列(例如，表1之核酸序列的核苷酸571-2613)」，則隨後一些實施例係關於包含與表1之核酸序列的核苷酸571-2613具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列的核酸分子。
如本文所用，術語「擴增」係指複製核酸分子或其部分以產生核酸分子或其部分之一或多個額外複本(例如遺傳元件或遺傳元件區域)。在一些實施例中，擴增引起核酸序列部分複製。在一些實施例中，經由滾環複製進行擴增。
如本文所用，術語「指環載體」係指包含圍封於蛋白質外部中之遺傳元件(例如環狀DNA)的媒劑，例如遺傳元件基本上經保護免於被蛋白質外部之DNA酶I消化。如本文所用，「合成指環載體」通常係指非天然存在的指環載體，例如具有相對於野生型病毒(例如如本文所述之野生型指環病毒)不同的序列。在一些實施例中，合成指環載體經工程化或重組，例如包含相對於野生型病毒基因體(例如如本文所述之野生型病毒基因體)包含差異或修飾的遺傳元件。在一些實施例中，圍封於蛋白質外部內涵蓋由蛋白質外部100%覆蓋以及小於100%，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更小覆蓋。例如，只要遺傳元件保留在蛋白質外部或受保護而不被DNA酶I消化，例如在進入宿主細胞之前，則蛋白質外部中可存在間隙或不連續處(例如使蛋白質外部對水、離子、肽或小分子可透)。在一些實施例中，指環載體經純化，例如其與其原始來源分離及/或基本上不含(＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)其他組分。在一些實施例中，指環載體能夠將遺傳元件引入至目標細胞中(例如經由感染)。在一些實施例中，指環載體為感染性合成指環病毒病毒粒子。
如本文所用，術語「抗體分子」係指蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段，其包含至少一個免疫球蛋白可變域序列。術語「抗體分子」涵蓋全長抗體及抗體片段(例如scFv)。在一個實施例中，抗體分子為多特異性抗體分子，例如該抗體分子包含複數個免疫球蛋白可變域序列，其中該複數個中之第一免疫球蛋白可變域序列對第一抗原決定基具有結合特異性且該複數個中之第二免疫球蛋白可變域序列對第二抗原決定基具有結合特異性。在實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體分子之一般特徵為對於第一抗原決定基具有結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及對於第二抗原決定基具有結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列。
如本文所用，術語「主鏈」或「主鏈區域」係指包含一或多個參與在宿主細胞中複製及/或維持核酸分子(例如對其為必需及/或足夠的)之元件的核酸分子內(例如在例如如本文所述之穿梭載體或供體載體內)的區域。在一些實施例中，主鏈區域，諸如「桿狀病毒主鏈區域」包含一或多種桿狀病毒元件(例如桿狀病毒基因體或其功能片段)，例如適用於在昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中複製核酸構築體。在一些實施例中，主鏈進一步包含可選標記。在一些實施例中，核酸分子包含遺傳元件區域及主鏈區域(例如適用於在細菌細胞中進行複製的桿狀病毒主鏈區域及/或主鏈區域)。
如本文所用，術語「穿梭載體」係指包含足夠桿狀病毒主鏈元件，以使其適用於在昆蟲細胞中複製，且此外適用於在細菌細胞中複製的核酸分子。在一些實施例中，核酸分子適用於在細菌細胞(例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)中複製。
如本文所用，「編碼」之核酸係指編碼胺基酸序列或聚核苷酸，例如mRNA或功能性聚核苷酸(例如非編碼RNA，例如siRNA或miRNA)的核酸序列。
如本文所用，「外源性」試劑(例如效應子、核酸(例如RNA)、基因、有效負載、蛋白質)係指不包含相應野生型病毒(例如如本文所述之指環病毒)或不由其編碼的試劑。在一些實施例中，外源性試劑並非天然存在，諸如具有相對於天然存在之蛋白質或核酸改變(例如藉由插入、缺失或取代)之序列的蛋白質或核酸。在一些實施例中，外源性試劑不天然存在於宿主細胞中。在一些實施例中，外源性試劑天然存在於宿主細胞中，但對於病毒為外源性的。在一些實施例中，外源性試劑天然存在於宿主細胞中，但不以所需水準或以所需時間存在。
如本文所用之關於另一試劑或元件(例如效應子、核酸序列、胺基酸序列)的「異源」試劑或元件(例如效應子、核酸序列、胺基酸序列)係指例如在野生型病毒(例如指環病毒)中未天然發現於一起的試劑或元件。在一些實施例中，異源核酸序列可與天然存在之核酸序列(例如指環病毒中天然存在之序列)存在於相同核酸中。在一些實施例中，異源試劑或元件相對於指環病毒為外源性的，其中指環載體之其他元件(例如剩餘部分)係基於該指環病毒。
如本文所用，術語「遺傳元件」係指圍封於或可圍封於(例如保護免於被DNA酶I消化)蛋白質外部內，例如以形成如本文所述之指環載體的核酸分子。應理解，遺傳元件可以裸DNA形式產生且視情況進一步組裝成蛋白質外部。亦應理解，指環載體可將其遺傳元件插入細胞中，使得遺傳元件存在於細胞中且蛋白質外部不一定進入細胞。
如本文所用，「遺傳元件構築體」係指包含遺傳元件序列或其片段之核酸構築體(例如質體、穿梭載體、供體載體、黏質體或微型環)。在一些實施例中，如本文所述之穿梭載體或供體載體為包含遺傳元件序列或其片段之遺傳元件構築體。
如本文所用，術語「遺傳元件區域」係指包含遺傳元件之序列的構築體區域。在一些實施例中，遺傳元件區域包含與野生型指環病毒序列或其片段具有足夠一致性之序列，以由蛋白質外部圍封，藉此形成指環載體(例如與野生型指環病毒序列或其片段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列)。在實施例中，遺傳元件區域包含蛋白質結合序列，例如如本文所述(例如如本文所述之5' UTR、3' UTR及/或富含GC之區域，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列)。在一些實施例中，遺傳元件區域可經歷滾環複製。在一些實施例中，遺傳元件包含Rep蛋白結合位點。在一些實施例中，遺傳元件包含Rep蛋白置換位點。在一些實施例中，包含遺傳元件區域之構築體不圍封於蛋白質外部中，但由構築體產生之遺傳元件可圍封於蛋白質外部中。在一些實施例中，包含遺傳元件區域之構築體進一步包含載體主鏈(例如，穿梭載體主鏈或供體載體主鏈)。在一些實施例中，構築體(例如穿梭載體)包含一或多個桿狀病毒元件(例如桿狀病毒基因體，例如包含遺傳元件區域)。
如本文所用，當相對於基因體(例如指環病毒基因體)或其片段使用時，術語「突變體」係指相對於對應野生型指環病毒序列具有至少一種變化的序列。在一些實施例中，相對於對應野生型指環病毒序列，突變基因體或其片段包含至少一種單核苷酸多型性、添加、缺失或框移。在一些實施例中，相對於對應野生型指環病毒序列，突變基因體或其片段包含至少一個指環病毒ORF (例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2中之一或多者)的缺失。在一些實施例中，相對於對應野生型指環病毒序列，突變基因體或其片段包含所有指環病毒ORF (例如所有ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及ORF1/2)的缺失。在一些實施例中，相對於對應野生型指環病毒序列，突變基因體或其片段包含至少一個指環病毒非編碼區域(例如5' UTR、3' UTR及/或富含GC之區域中之一或多者)的缺失。在一些實施例中，突變基因體或其片段包含或編碼外源性效應子。
如本文所用，術語「ORF分子」係指具有指環病毒ORF蛋白(例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2蛋白)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。當一般使用(亦即「ORF分子」)時，多肽可包含本文所述之指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2)或其功能片段中之任一者的活性及/或結構特徵。當與修飾劑一起用於指示特定開讀框(例如「ORF1分子」、「ORF2分子」、「ORF2/2分子」、「ORF2/3分子」、「ORF1/1分子」或「ORF1/2分子」)時，通常意謂多肽包含對應指環病毒ORF蛋白或其功能片段(例如如下文所定義之「ORF1分子」)之活性及/或結構特徵。舉例而言，「ORF2分子」包含指環病毒ORF2蛋白質或其功能片段的活性及/或結構特徵。
如本文所用，術語「ORF1分子」係指具有指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。在一些情況下，ORF1分子可包含以下中之一或多者(例如1、2、3或4者)：包含至少60%鹼性殘基(例如至少60%精胺酸殘基)之第一區域、包含至少約六個β股(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個β股)之第二區域、包含指環病毒N22域(例如如本文所述，例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白的N22域)之結構或活性的第三區域、及/或包含指環病毒C端域(CTD) (例如如本文所述，例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白的CTD)之結構或活性的第四區域。在一些實施例中，ORF1分子以N端至C端之次序包含第一、第二、第三及第四區域。在一些實施例中，指環載體包含ORF1分子，該分子以N端至C端之次序包含第一、第二、第三及第四區域。在一些情況下，ORF1分子可包含由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽。在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含異源序列，例如高變區(HVR)，例如來自指環病毒ORF1蛋白之HVR，例如如本文所述。如本文所用，「指環病毒ORF1蛋白」係指由指環病毒基因體(例如野生型指環病毒基因體，例如如本文所述)編碼之ORF1蛋白。
如本文所用，術語「ORF2分子」係指具有指環病毒ORF2蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF2蛋白)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。如本文所用，「指環病毒ORF2蛋白」係指由指環病毒基因體(例如野生型指環病毒基因體，例如如本文所述)編碼之ORF2蛋白。
如本文所用，術語「蛋白質外部」係指主要為(例如＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)蛋白質之外部組分。
如本文所用，術語「調節核酸」係指修飾編碼表現產物之DNA序列之表現(例如轉錄及/或轉譯)的核酸序列。在實施例中，表現產物包含RNA或蛋白質。
如本文所用，術語「調節序列」係指修飾目標基因產物之轉錄的核酸序列。在一些實施例中，調節序列為啟動子或強化子。
如本文所用，術語「Rep」或「複製蛋白」係指促進病毒基因體複製之蛋白質，例如病毒蛋白。在一些實施例中，複製蛋白為指環病毒Rep蛋白。
如本文所用，術語「Rep結合位點」係指由Rep蛋白(例如指環病毒Rep蛋白)識別且結合之核酸分子內的核酸序列。在一些實施例中，Rep結合位點包含5' UTR (例如包含髮夾環)。在一些實施例中，Rep結合位點包含複製起點(ORI)。
如本文所用，術語「Rep置換位點」係指核酸分子內之核酸序列，其能夠使得與核酸分子相關聯(例如結合)之Rep蛋白(例如指環病毒Rep蛋白)在到達Rep置換位點後釋放核酸分子。在一些實施例中，Rep置換位點包含5' UTR (例如包含髮夾環)。在一些實施例中，Rep置換位點包含複製起點(ORI)。
如本文所用，「基本上非致病性」生物體、粒子或組分係指不會例如在宿主生物體(例如哺乳動物，例如人類)中引起或誘導不可接受之疾病或病原性病狀的生物體、粒子(例如病毒或指環載體，例如如本文所述)或其組分。在一些實施例中，向個體投與指環載體可引起作為標準照護之一部分可接受的輕微反應或副作用。
如本文所用，術語「非致病性」係指例如在宿主生物體(例如哺乳動物，例如人類)中不會引起或誘導不可接受之疾病或病原性病狀的生物體或其組分。
如本文所用，「基本上非整合型」遺傳元件係指一種遺傳元件，例如病毒或指環載體中之遺傳元件，例如如本文所述，其中進入宿主細胞(例如真核細胞)或生物體(例如哺乳動物，例如人類)中之小於約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%或1%之遺傳元件整合至基因體中。在一些實施例中，遺傳元件不會以可偵測方式整合至例如宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，可使用如本文所述之技術，例如核酸定序、PCR偵測及/或核酸雜交來偵測遺傳元件至基因體中之整合。在一些實施例中，整合頻率藉由對自游離載體分離之基因體DNA的定量凝膠純化分析來測定，例如如Wang等人(2004, Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中所述。
如本文所用，「基本上非免疫原性」生物體、粒子或組分係指不會例如在宿主組織或生物體(例如哺乳動物，例如人類)中引起或誘導非所需或非靶向免疫反應的生物體、粒子(例如病毒或指環載體，例如如本文所述)或其組分。在實施例中，基本上非免疫原性生物體、粒子或組分不產生臨床顯著免疫反應。在實施例中，基本上非免疫原性指環載體不產生針對蛋白質的臨床顯著免疫反應，該蛋白質包含胺基酸序列或由指環病毒或指環載體遺傳元件之核酸序列編碼。在實施例中，免疫反應(例如非所需或非靶向免疫反應)係藉由分析個體中之抗體(例如中和抗體)存在或水準(例如抗指環載體抗體之存在或水準，例如針對如本文所述之指環載體之抗體的存在或水準)來偵測，例如根據Tsuda等人(1999; J. Virol. Methods77: 199-206；以引用之方式併入本文中)中所述之抗TTV抗體偵測方法及/或Kakkola等人(2008; Virology382: 182-189；以引用之方式併入本文中)中所述之用於測定抗TTV IgG水準之方法。針對指環病毒或基於其之指環載體的抗體(例如中和抗體)亦可藉由此項技術中用於偵測抗病毒抗體之方法來偵測，例如用偵測抗AAV抗體之方法，例如如Calcedo等人(2013; Front. Immunol. 4(341): 1-7；以引用之方式併入本文中)中所述。
如本文所用之「子序列」係指分別包含於較大核酸序列或胺基酸序列中的核酸序列或胺基酸序列。在一些情況下，子序列可包含較大序列之域或功能片段。在一些情況下，子序列可包含當與較大序列分離時能夠形成二級及/或三級結構之較大序列的片段，類似於當與較大序列之其餘部分一起存在時由子序列形成之二級及/或三級結構。在一些情況下，子序列可經另一序列替換(例如，包含外源性序列之子序列或與較大序列之其餘部分異源的序列，例如來自不同指環病毒之對應子序列)。
如本文所用，「轉位酶識別序列」係指由轉位酶識別(例如能夠特異性結合)之核酸序列。在一些實施例中，轉位酶為Tn7轉位酶。在一些實施例中，核酸分子(例如穿梭載體或供體載體，例如如本文所述)包含第一轉位酶識別序列(例如Tn7R或Tn7L序列)。在一些實施例中，核酸分子(例如穿梭載體或供體載體，例如如本文所述)包含第二轉位酶識別序列(例如第一轉位酶識別序列之同源序列，例如Tn7R或Tn7L序列中之另一者)。
本發明大體上係關於指環載體，例如合成指環載體，及其用途。本發明提供指環載體、包含指環載體之組合物及製造或使用指環載體之方法。指環載體通常可用作遞送媒劑，例如用於將治療劑遞送至真核細胞。一般而言，指環載體將包括遺傳元件，該遺傳元件包含圍封於蛋白質外部內之核酸序列(例如編碼效應子，例如外源性效應子或內源性效應子)。指環載體可包括相對於指環病毒序列(例如如本文所述)之一或多個序列缺失(例如如本文所述之區或域)。指環載體可用作基本上非免疫原性媒劑，用於將遺傳元件或其中編碼之效應子(例如多肽或核酸效應子，例如如本文所述)遞送至真核細胞中，例如用於治療包含該等細胞之個體的疾病或病症。 目錄I. 用於製造指環載體之組合物及方法 A. 桿狀病毒表現系統 B. 昆蟲細胞 C. 指環載體之組分及組裝 i. 用於組裝指環載體之ORF1分子 ii. 用於組裝指環載體之ORF2分子 D. 遺傳元件構築體 i.  質體 ii.  環狀核酸構築體 iii.  活體外環化 iv.  順式/反式構築體 v.  表現卡匣 vi.  遺傳元件構築體之設計及生產 C.  效應子 D.  宿主細胞 i.  將遺傳元件引入宿主細胞中 ii.  提供呈順式或反式之指環病毒蛋白質的方法 iii.  輔助 iv.  例示性細胞類型 E.  培養條件 F.  收集 G.  富集及純化 II. 指環載體 A. 指環病毒 B. ORF1分子 C. ORF2分子 D. 遺傳元件 E. 蛋白質結合序列 F. 5' UTR區域 G. 富含GC之區域 H. 效應子 I. 調節序列 J.  複製蛋白 K.  其他序列 L.  蛋白質外部 III. 核酸構築體 IV. 組合物 V. 宿主細胞 VI. 使用方法 VII. 投與/遞送 I. 用於製造指環載體之組合物及方法
在一些態樣中，本發明提供可用於產生例如如本文所述之指環載體的組合物(例如，穿梭載體、供體載體、桿狀病毒粒子及包含其之細胞)及方法。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於產生遺傳元件或遺傳元件構築體。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可以用於產生一或多個指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2分子，或其功能片段或剪接變異體)。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於例如在宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)中產生蛋白質外部或其組分(例如ORF1分子)。
在一些實施例中，穿梭載體為包含遺傳元件序列(例如遺傳元件區域)及一或多個桿狀病毒元件(例如桿狀病毒基因體)之核酸構築體。在一些實施例中，穿梭載體可用於桿狀病毒表現系統中，例如昆蟲細胞中，例如如本文所述，例如用於產生遺傳元件構築體及/或指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2分子，或其功能片段或剪接變異體)。
不希望受理論所束縛，滾環擴增可經由Rep蛋白與Rep結合位點(例如包含5' UTR，例如包含髮夾環及/或複製起點，例如如本文所述)結合而發生，該結合位點位於相對於遺傳元件區域(例如在穿梭載體中，例如如本文所述)之5' (或在5'區域內)。Rep蛋白可接著繼續通過遺傳元件區域，引起遺傳元件之合成。遺傳元件可接著環化且接著圍封於蛋白質外部內以形成指環載體。 桿狀病毒表現系統
病毒表現系統，例如桿狀病毒表現系統，可用於表現蛋白質(例如用於產生指環載體)，例如如本文所述。桿狀病毒為桿形病毒，具有環狀、超螺旋雙股DNA基因體。桿狀病毒屬包括：α桿狀病毒(自鱗翅目昆蟲分離之核多角體病毒(NPV))、β桿狀病毒(自鱗翅目昆蟲分離之顆粒體病毒(GV))、γ桿狀病毒(自膜翅目昆蟲分離之NPV)及λ桿狀病毒(自雙翅目昆蟲分離之NPV)。雖然GV通常每個包膜僅含有一個核衣殼，但NPV通常每個包膜含有單個(SNPV)或多個(MNPV)核衣殼。包膜病毒粒子在GV中進一步包涵於顆粒體蛋白基質中且在NPV中進一步包涵於多角體蛋白中。桿狀病毒通常具有溶解及包涵的生命週期。在一些實施例中，溶解及包涵的生命週期貫穿三個病毒複製階段獨立地表現：早期、晚期及極晚期階段。在一些實施例中，在早期內，病毒DNA複製發生在病毒進入宿主細胞、早期病毒基因表現及宿主基因表現機制關閉之後。在一些實施例中，在表現編碼病毒DNA複製之晚期基因的晚期內，病毒粒子經組裝，且由宿主細胞產生細胞外病毒(EV)。在一些實施例中，在表現多角體蛋白及p10基因之極晚期內，包涵體病毒(OV)由宿主細胞產生，且宿主細胞經溶解。由於桿狀病毒感染昆蟲物種，因此其可用作生物製劑以在桿狀病毒病毒容許之昆蟲細胞或幼蟲中產生外源性蛋白質。不同桿狀病毒分離株，諸如加洲苜蓿夜蛾( Autographa californica)多核多角體病毒(AcMNPV)及家蠶(蠶)核多角體病毒(BmNPV)可用於外源性蛋白質表現。各種桿狀病毒表現系統為市售的，例如獲自ThermoFisher。
在一些實施例中，本文所述之蛋白質(例如指環病毒ORF分子，例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或其功能片段或剪接變異體)可使用包含一或多種本文所述之組分的桿狀病毒表現載體(例如穿梭載體)表現。舉例而言，桿狀病毒表現載體可包括以下中之一或多者(例如全部)：可選標記(例如kanR)、複製起點(例如細菌複製起點及昆蟲細胞複製起點中之一或兩者)、重組酶識別位點(例如att位點)及啟動子。在一些實施例中，桿狀病毒表現載體(例如如本文所述之穿梭載體)可藉由用編碼本文所述之蛋白質的基因替換編碼桿狀病毒包涵體的天然存在之野生型多角體蛋白基因產生。在一些實施例中，將編碼本文所述之蛋白質的基因選殖至含有桿狀病毒啟動子之桿狀病毒表現載體(例如如本文所述之穿梭載體)中。在一些實施例中，桿狀病毒載體包含一或多種非桿狀病毒啟動子，例如哺乳動物啟動子或指環病毒啟動子。在一些實施例中，將編碼本文所述之蛋白質的基因選殖至供體載體(例如如本文所述)中，接著使該供體載體與空桿狀病毒表現載體(例如空穿梭載體)接觸，使得編碼本文所述之蛋白質的基因自供體載體轉移(例如藉由同源重組或轉位酶活性)至桿狀病毒表現載體(例如穿梭載體)中。在一些實施例中，桿狀病毒啟動子由來自非必需多角體蛋白基因座之桿狀病毒DNA側接。在一些實施例中，本文所述之蛋白質在處於病毒複製極晚期之AcNPV多角體蛋白啟動子的轉錄控制下。在一些實施例中，適用於昆蟲細胞中之桿狀病毒表現的強啟動子包括但不限於桿狀病毒p10啟動子、多角體蛋白(polh)啟動子、p6.9啟動子及衣殼蛋白啟動子。適用於昆蟲細胞中之桿狀病毒表現的弱啟動子包括桿狀病毒之ie1、ie2、ie0、et1、39K (亦稱為pp31)及gp64啟動子。
在一些實施例中，重組桿狀病毒由桿狀病毒基因體(例如，野生型或突變型桿狀病毒基因體)與轉移載體之間的同源重組產生。在一些實施例中，將一或多個編碼本文所述之蛋白質的基因選殖至轉移載體中。在一些實施例中，轉移載體進一步含有由來自非必需基因座(例如多角體蛋白基因)之DNA側接的桿狀病毒啟動子。在一些實施例中，藉由桿狀病毒基因體與轉移載體之間的同源重組將一或多個編碼本文所述之蛋白質的基因插入至桿狀病毒基因體中。在一些實施例中，桿狀病毒基因體在一或多個獨特位點經線性化。在一些實施例中，線性化位點位於用於將編碼本文所述之蛋白質的基因插入至桿狀病毒基因組中的目標位點附近。在一些實施例中，在基因(例如多角體蛋白基因)下游缺失桿狀病毒基因體之片段的線性化桿狀病毒基因體可用於同源重組。在一些實施例中，桿狀病毒基因體及轉移載體共轉染至昆蟲細胞中。在一些實施例中，產生重組桿狀病毒之方法包含以下步驟：製備桿狀病毒基因體，以與含有編碼一或多種本文所述之蛋白質之基因的轉移載體進行同源重組，且將轉移載體及桿狀病毒基因體DNA共轉染至昆蟲細胞中。在一些實施例中，桿狀病毒基因體包含與轉移載體之區域同源的區域。此等同源區域可增強桿狀病毒基因體與轉移載體之間的重組機率。在一些實施例中，轉移載體中之同源區域位於啟動子上游或下游。在一些實施例中，為誘導同源重組，將桿狀病毒基因體及轉移載體以約1:1至10:1之重量比混合。
在一些實施例中，重組桿狀病毒由包含藉由Tn7進行位點特異性轉座的方法產生，例如藉此將編碼本文所述之蛋白質的基因插入至穿梭載體DNA中，例如在細菌，例如大腸桿菌(例如DH 10Bac細胞)中繁殖。在一些實施例中，將編碼本文所述之蛋白質的基因選殖至pFASTBAC®載體中且轉型至含有具有微型 attTn7目標位點之穿梭載體DNA的勝任細胞，例如DH10BAC®勝任細胞中。在一些實施例中，桿狀病毒表現載體，例如pFASTBAC®載體可具有啟動子，例如雙啟動子(例如多角體蛋白啟動子、p10啟動子)。市售之pFASTBAC®供體質體包括：pFASTBAC 1、pFASTBAC HT及pFASTBAC DUAL。在一些實施例中，鑑定含有重組穿梭載體DNA之菌落且分離穿梭載體DNA以轉染昆蟲細胞。
在一些實施例中，桿狀病毒載體連同輔助核酸一起引入至昆蟲細胞中。引入可為同時的或依序的。在一些實施例中，輔助核酸提供一或多種桿狀病毒蛋白質，例如以促進桿狀病毒載體之封裝。
在一些實施例中，昆蟲細胞中產生之重組桿狀病毒(例如藉由同源重組)經擴增且用於感染用於重組蛋白表現的昆蟲細胞(例如在對數生長中期內)。在一些實施例中，藉由細菌(例如大腸桿菌)中之位點特異性轉座產生的重組穿梭載體DNA用於使用轉染劑(例如Cellfectin® II)轉染昆蟲細胞。關於桿狀病毒表現系統之額外資訊論述於美國專利申請案第14/447,341號、第14/277,892號及第12/278,916號中，該等申請案以引用之方式併入本文中。 昆蟲細胞
本文所述之蛋白質可在經重組桿狀病毒或穿梭載體DNA感染或轉染之昆蟲細胞中表現，例如如上文所述。在一些實施例中，昆蟲細胞包括：衍生自草地黏蟲之Sf9及Sf21細胞以及衍生自粉紋夜蛾之Tn-368及High Five™ BTI-TN-5B1-4細胞(亦稱為Hi5細胞)。在一些實施例中，衍生自草地黏蟲蛹秋黏蟲之卵巢的昆蟲細胞株Sf21及Sf9可用於使用桿狀病毒表現系統來表現重組蛋白。在一些實施例中，Sf21及Sf9昆蟲細胞可在市售補充血清或無血清培養基中培養。適用於培養昆蟲細胞之培養基包括：格里斯氏補充(Grace's Supplemented) (TNM-FH)、IPL-41、TC-100、施奈德果蠅(Schneider's Drosophila)、SF-900 II SFM或及EXPRESS-FIVE™ SFM。在一些實施例中，一些無血清培養基調配物利用磷酸鹽緩衝液系統將培養物pH維持在6.0-6.4範圍內(Licari等人 Insect cell hosts for baculovirus expression vectors contain endogenous exoglycosidase activity. Biotechnology Progress 9: 146-152 (1993)及Drugmand等人 Insect cells as factories for biomanufacturing. Biotechnology Advances 30:1140-1157 (2012))，以用於培養及重組蛋白生產。在一些實施例中，可使用6.0-6.8之pH培養各種昆蟲細胞株。在一些實施例中，昆蟲細胞在25℃至30℃之間的溫度下、在充氣下懸浮培養或以單層形式培養。關於昆蟲細胞之額外資訊論述於例如美國專利申請案第14/564,512號及第14/775,154號中，其各自以引用的方式併入本文中。 指環載體之組分及組裝
本文中之組合物及方法可用於產生指環載體。如本文所述，指環載體一般包含圍封於蛋白質外部(例如包含由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)內之遺傳元件(例如單股環狀DNA分子，例如包含如本文所述之5' UTR區)。在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個編碼指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2中之一或多者)的序列。如本文所用，指環病毒ORF或ORF分子(例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2)包括多肽，該多肽包含與對應指環病毒ORF序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，例如如PCT/US2018/037379或PCT/US19/65995中所述(其各自以全文引用之方式併入本文中)。在實施例中，遺傳元件包含編碼指環病毒ORF1或其剪接變異體或功能片段的序列(例如凝膠捲區，例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含由指環病毒ORF1核酸(例如指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段)編碼之多肽。
在一些實施例中，藉由在蛋白質外部(例如如本文所述)內圍封遺傳元件(例如如本文所述)來組裝指環載體。在一些實施例中，遺傳元件圍封於宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)中之蛋白質外部內。在一些實施例中，宿主細胞表現蛋白質外部中所含之一或多種多肽(例如由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如ORF1分子)。舉例而言，在一些實施例中，宿主細胞包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列，該分子例如指環病毒ORF1多肽之剪接變異體或功能片段(例如野生型指環病毒ORF1蛋白或由野生型指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。在實施例中，編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列包含於核酸構築體(例如質體、病毒載體、病毒、微型環、穿梭載體或人工染色體)中，該核酸構築體包含於宿主細胞中。在實施例中，編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列整合至宿主細胞之基因體中。
在一些實施例中，宿主細胞包含遺傳元件及/或包含遺傳元件之序列的核酸構築體。在一些實施例中，核酸構築體係選自質體、病毒核酸、微型環、穿梭載體或人工染色體。在一些實施例中，遺傳元件自核酸構築體(例如穿梭載體)切除，且視情況自雙股形式轉化成單股形式(例如藉由變性)。在一些實施例中，遺傳元件由基於核酸構築體(例如穿梭載體)中之模板序列的聚合酶產生。在一些實施例中，聚合酶產生遺傳元件序列之單股複本，其可視情況環化以形成如本文所述之遺傳元件。
在一些實施例中，宿主細胞包含遺傳元件構築體(例如穿梭載體、質體或微型環)及包含一或多個編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2 ORF分子)或其功能片段之序列的穿梭載體。在一些實施例中，蛋白質外部蛋白質由穿梭載體表現。在實施例中，蛋白質外部蛋白質由圍封遺傳元件之穿梭載體表現，藉此形成指環載體。在一些實施例中，穿梭載體包含適用於在昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中複製核酸構築體之主鏈，例如桿狀病毒主鏈區域。在一些實施例中，穿梭載體包含適用於在細菌細胞(例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)中複製遺傳元件構築體之主鏈區域。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含適用於在昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中複製核酸構築體之主鏈，例如桿狀病毒主鏈區域。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含適用於在細菌細胞(例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)中複製遺傳元件構築體之主鏈區域。在一些實施例中，經由桿狀病毒粒子將穿梭載體引入至宿主細胞中。在實施例中，穿梭載體藉由生產細胞，例如昆蟲細胞(例如Sf9細胞)或細菌細胞(例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)產生。在實施例中，生產細胞包含穿梭載體及/或供體載體，例如如本文所述。在實施例中，生產細胞進一步包含用於複製穿梭載體及/或供體載體之充足細胞機構。 例如用於組裝指環載體之 ORF1 分子
指環載體可例如藉由將遺傳元件圍封在蛋白質外部內而製得。在一些實施例中，該圍封發生於昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中。指環載體之蛋白質外部一般包含由指環病毒ORF1核酸(例如指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段，例如如本文所述)編碼之多肽。在一些實施例中，指環病毒ORF1核酸包含於例如如本文所述之穿梭載體或供體載體中。在一些實施例中，穿梭載體進一步包含編碼外源性效應子(例如遺傳元件區域，例如如本文所述)之序列。在其他實施例中，穿梭載體不包含編碼外源性效應子之序列(例如穿梭載體不包含遺傳元件區域，例如如本文所述)。在一些實施例中，ORF1分子可包含以下中之一或多者：包含富含精胺酸之區域的第一區域，例如具有至少60%鹼性殘基(例如至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%鹼性殘基；例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70-80%鹼性殘基)之區域，及包含凝膠捲域之第二區域，例如至少六個β股(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12個β股)。在實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區域、凝膠捲區、N22域、高變區及/或C端域中之一或多者(例如1、2、3、4或全部5者)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1凝膠捲區(例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區域(例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1 N22域(例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒高變區(例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1C端域(例如如本文所述)。
在一些實施例中，指環載體包含ORF1分子及/或編碼ORF1分子之核酸。一般而言，ORF1分子包含具有指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)或其功能片段之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF1分子包含相對於指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)的截短。在一些實施例中，ORF1分子經截短指環病毒ORF1蛋白之至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700個胺基酸。在一些實施例中，ORF1分子包含與例如如本文所述之α細環病毒、β細環病毒或γ細環病毒ORF1蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。ORF1分子通常可結合至核酸分子，諸如DNA (例如遺傳元件，例如如本文所述)。在一些實施例中，ORF1分子定位至細胞核。在某些實施例中，ORF1分子定位至細胞核仁。
不希望受理論所束縛，ORF1分子可能能夠結合至其他ORF1分子，例如以形成蛋白質外部(例如如本文所述)。此類ORF1分子可描述為能夠形成衣殼。在一些實施例中，蛋白質外部可圍封核酸分子(例如如本文所述之遺傳元件，例如使用穿梭載體、供體載體、桿狀病毒或包含其之細胞產生，例如如本文所述)。在一些實施例中，複數個ORF1分子可形成多聚體，例如以產生蛋白質外部。在一些實施例中，多聚體可為均多聚體。在其他實施例中，多聚體可為雜多聚體。 例如用於組裝指環載體之 ORF2 分子
使用本文所述之組合物或方法產生指環載體可涉及表現指環病毒ORF2分子(例如如本文所述)或其剪接變異體或功能片段。在一些實施例中，指環載體包含ORF2分子或其剪接變異體或功能片段，及/或編碼ORF2分子或其剪接變異體或功能片段之核酸。在一些實施例中，指環載體不包含ORF2分子或其剪接變異體或功能片段，及/或編碼ORF2分子或其剪接變異體或功能片段之核酸。在一些實施例中，產生指環載體包含表現ORF2分子或其剪接變異體或功能片段，但ORF2分子不併入至指環載體中。 包含 ORF 分子編碼序列之構築體
在一些實施例中，一或多個ORF分子(例如ORF1、ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及ORF1/2分子)或其剪接變異體或功能片段由可與遺傳元件分離之核酸構築體(例如穿梭載體)或包含遺傳元件區域之核酸構築體提供。編碼一或多個ORF分子或其剪接變異體或片段之核酸構築體可包含主鏈區域。在一些實施例中，主鏈區域適用於在昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中複製核酸構築體，例如桿狀病毒主鏈區域。在實施例中，核酸構築體為穿梭載體。在一些實施例中，主鏈區域適用於在細菌細胞中複製核酸構築體。在一些實施例中，核酸構築體編碼ORF1分子或其剪接變異體或功能片段。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含遺傳元件區域(例如包含待由蛋白質外部圍封之遺傳元件的序列，例如包含ORF1分子或其剪接變異體或功能片段，例如由核酸構築體編碼)。
在一些實施例中，本文所述之方法涉及包含編碼一或多個ORF分子(例如如上所述)之核酸構築體的宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)。宿主細胞可表現一或多個ORF分子。在一些實施例中，宿主細胞表現能夠例如自核酸構築體形成指環載體蛋白質外部(例如ORF1分子，或其剪接變異體或功能片段)的多肽。在一些實施例中，將遺傳元件構築體(例如如本文所述)引入至宿主細胞中(例如在表現能夠形成指環載體蛋白質外部之多肽之前、與其同時或在其之後)。在其他實施例中，編碼一或多個ORF分子之核酸構築體亦為遺傳元件構築體(例如包含遺傳元件區域，例如如本文所述)。在一些實施例中，遺傳元件(例如，由遺傳元件構築體產生，例如如本文所述)圍封於宿主細胞中之蛋白質外部內，由此產生指環載體。在一些實施例中，指環載體收集自宿主細胞或周圍上清液，例如如本文所述。在一些實施例中，宿主細胞產生包含核酸構築體之桿狀病毒粒子。
在一些實施例中，本文所述之方法涉及包含核酸構築體(例如供體載體)之宿主細胞(例如細菌細胞，例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)，該核酸構築體包含編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)或其功能片段或剪接變異體的序列，及/或遺傳元件區域。在一些實施例中，宿主細胞進一步包含穿梭載體(例如缺乏編碼指環病毒ORF分子之序列及/或遺傳元件區域的穿梭載體)。在一些實施例中，將編碼指環病毒ORF分子或其功能片段或剪接變異體之序列轉移至宿主細胞內之穿梭載體中。在一些實施例中，宿主細胞產生包含穿梭載體之桿狀病毒粒子，該穿梭載體包含編碼指環病毒ORF分子或其功能片段或剪接變異體的轉移序列。在一些實施例中，將遺傳元件區域轉移至宿主細胞內之穿梭載體中。在一些實施例中，宿主細胞產生含有包含轉移之遺傳元件區域之穿梭載體的桿狀病毒粒子。 例如用於組裝指環載體之遺傳元件構築體
如本文所述之指環載體之遺傳元件可由遺傳元件構築體產生，該構築體包含遺傳元件區域及視情況存在之其他序列，諸如穿梭載體(例如包含桿狀病毒基因體或其片段，例如一或多個桿狀病毒元件)或供體載體主鏈。一般而言，遺傳元件構築體包含指環病毒5' UTR (例如如本文所述)。遺傳元件構築體可為適用於將遺傳元件之序列遞送至宿主細胞中之任何核酸構築體，其中遺傳元件可圍封於蛋白質外部內。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含啟動子。在一些實施例中，遺傳元件構築體為線性核酸分子。在一些實施例中，遺傳元件構築體為環狀核酸分子(例如質體、穿梭載體、供體載體或微型環，例如如本文所述)。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含桿狀病毒序列(例如使得包含遺傳元件構築體之昆蟲細胞可產生包含遺傳元件構築體之遺傳元件序列或其片段的桿狀病毒)。在一些實施例中，遺傳元件構築體可為雙股的。在其他實施例中，遺傳元件為單股的。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含DNA。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含RNA。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含一或多個經修飾之核苷酸。
在一些態樣中，本發明提供一種複製及繁殖如本文所述之指環載體(例如)之方法，其可包含以下步驟中之一或多者：(a)將遺傳元件(例如線性化)引入(例如轉染)至對指環載體感染敏感之細胞株中；(b)收集細胞且視情況分離展示遺傳元件存在之細胞；(c)培養步驟(b)中獲得之細胞(例如持續至少三天，諸如至少一週或更久)，其取決於實驗條件及基因表現；及(d)收集步驟(c)之細胞，例如如本文所述。 質體
在一些實施例中，遺傳元件構築體為質體。質體將一般包含如本文所述之遺傳元件之序列以及適用於在宿主細胞中複製之複製起點(例如細菌細胞中複製之細菌複製起點)及可選標記(例如抗生素抗性基因)。在一些實施例中，遺傳元件之序列可自質體切除。在一些實施例中，質體能夠在細菌細胞中複製。在一些實施例中，質體能夠在哺乳動物細胞(例如人類細胞)中複製。在一些實施例中，質體之長度為至少300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000 bp。在一些實施例中，質體之長度為小於600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000 bp。在一些實施例中，質體之長度在300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-4000或4000-5000 bp之間。在一些實施例中，遺傳元件可自質體切除(例如藉由活體外環化)，例如以形成微型環，例如如本文所述。在實施例中，遺傳元件之切除將遺傳元件序列與質體主鏈分開(例如將遺傳元件與細菌主鏈分開)。在一些實施例中，質體包含一或多個桿狀病毒元件(例如桿狀病毒基因體)。 小環狀核酸構築體
在一些實施例中，遺傳元件構築體為環狀核酸構築體，例如缺乏主鏈(例如缺乏細菌複製起點及/或可選標記)。在實施例中，遺傳元件為雙股環狀核酸構築體。在實施例中，雙股環狀核酸構築體係藉由活體外環化(IVC)產生，例如如本文所述。在實施例中，雙股環狀核酸構築體可引入至宿主細胞中，在其中其可轉化為或用作用於產生單股環狀遺傳元件之模板，例如如本文所述。在一些實施例中，環狀核酸構築體不包含質體主鏈或其功能片段。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度為至少2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400或4500 bp。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度為小於2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5500或6000 bp。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度在2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、2900-3000、3000-3100、3100-3200、3200-3300、3300-3400、3400-3500、3500-3600、3600-3700、3700-3800、3800-3900、3900-4000、4000-4100、4100-4200、4200-4300、4300-4400或4400-4500 bp之間。在一些實施例中，環狀核酸構築體為微型環。 活體外環化
在一些情況下，待封裝至蛋白質外部中之遺傳元件為單股環狀DNA。在一些情況下，遺傳元件可經由具有除單股環狀DNA以外之形式的遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。舉例而言，遺傳元件構築體可為雙股環狀DNA。雙股環狀DNA可接著在宿主細胞(例如包含適用於滾環複製之酶的宿主細胞，例如指環病毒Rep蛋白，例如Rep68/78、Rep60、RepA、RepB、Pre、MobM、TraX、TrwC、Mob02281、Mob02282、NikB、ORF50240、NikK、TecH、OrfJ或TraI，例如如Wawrzyniak等人 2017, Front. Microbiol.8: 2353中所述；其就所列酶而言以引用的方式併入本文中)中轉化為單股環狀DNA。在一些實施例中，雙股環狀DNA係藉由活體外環化(IVC)產生，例如如PCT/US19/65995之實例35中所述。
一般而言，活體外環化DNA構築體可藉由消化包含待封裝之遺傳元件之序列的質體產生，使得遺傳元件序列作為線性DNA分子切除。所得線性DNA可接著例如使用DNA連接酶連接，以形成雙股環狀DNA。在一些情況下，藉由活體外環化產生之雙股環狀DNA可經歷滾環複製，例如如本文所述。不希望受理論所束縛，經考慮活體外環化產生可在無進一步修飾之情況下經歷滾環複製之雙股DNA構築體，由此能夠產生具有適合封裝於指環載體中之尺寸的單股環狀DNA，例如如本文所述。在一些實施例中，雙股DNA構築體小於質體(例如細菌質體)。在一些實施例中，雙股DNA構築體自質體(例如細菌質體)切除且接著例如藉由活體外環化而環化。 順式 / 反式構築體
在一些實施例中，如本文所述之遺傳元件構築體(例如穿梭載體或供體載體)包含一或多個編碼一或多個指環病毒ORF之序列，例如蛋白質外部組分(例如由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。舉例而言，遺傳元件構築體可包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列。此類遺傳元件構築體可適用於以順式將遺傳元件及指環病毒ORF引入至宿主細胞中。在其他實施例中，如本文所述之遺傳元件構築體不包含編碼一或多個指環病毒ORF之序列，例如蛋白質外部組分(例如由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。舉例而言，遺傳元件構築體可不包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列。此類遺傳元件構築體可適用於將遺傳元件引入至宿主細胞中，其中一或多個指環病毒ORF以反式提供(例如經由引入編碼指環病毒ORF中之一或多者的第二核酸構築體，或經由整合至宿主細胞之基因體中的指環病毒ORF卡匣)。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含適用於在昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中複製核酸構築體之主鏈，例如桿狀病毒主鏈區域。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含適用於在細菌細胞(例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)中複製遺傳元件構築體之主鏈區域。
在一些實施例中，遺傳元件構築體(例如穿梭載體或供體載體)包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段(例如凝膠捲區域，例如如本文所述)的序列。在實施例中，不包含遺傳元件序列之遺傳元件部分包含編碼指環病毒ORF1分子之序列或其剪接變異體或功能片段(例如在包含啟動子及編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段之序列的卡匣中)。在其他實施例中，包含遺傳元件序列之構築體部分包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段(例如凝膠捲區域，例如如本文所述)的序列。在實施例中，將此類遺傳元件包封於蛋白質外部(例如如本文所述)中產生複製勝任型指環載體(例如在感染細胞時使得細胞能夠產生指環載體之另外複本而不需將其他核酸構築體(例如編碼如本文所述之一或多個指環病毒ORF)引入至細胞中的指環載體)。
在其他實施例中，遺傳元件不包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段的序列(例如凝膠捲區域，例如如本文所述)。在實施例中，將此類遺傳元件圍封於蛋白質外部(例如如本文所述)中產生複製缺陷型指環載體(例如在感染細胞後不能使感染細胞產生額外指環載體之指環載體，例如在不存在一或多種額外構築體，例如編碼如本文所述之一或多個指環病毒ORF的情況下)。 表現卡匣
在一些實施例中，遺傳元件構築體(例如穿梭載體或供體載體)包含一或多個用於表現多肽或非編碼RNA(例如miRNA或siRNA)的卡匣。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含用於表現效應子(例如外源性或內源性效應子)，例如如本文所述之多肽或非編碼RNA的卡匣。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含用於表現指環病毒蛋白質(例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或其功能片段)的卡匣。在一些實施例中，表現卡匣可位於遺傳元件序列內。在實施例中，效應子之表現卡匣位於遺傳元件序列內。在實施例中，指環病毒蛋白質之表現卡匣位於遺傳元件序列內。在其他實施例中，表現卡匣位於遺傳元件構築體內遺傳元件序列之外的位置處(例如主鏈中)。在實施例中，指環病毒蛋白質之表現卡匣位於遺傳元件構築體內遺傳元件序列之外的位置處(例如主鏈中)。
多肽表現卡匣一般包含啟動子及編碼多肽之編碼序列，該多肽例如效應子(例如如本文所述之外源性或內源性效應子)或指環病毒蛋白質(例如編碼指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或其功能片段的序列)。可包括於多肽表現卡匣中(例如以驅動多肽表現)之例示性啟動子包括但不限於組成性啟動子(例如CMV、RSV、PGK、EF1a或SV40)、細胞或組織特異性啟動子(例如骨骼α-肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白輕鏈2A啟動子、肌肉萎縮蛋白啟動子、肌肉肌酸激酶啟動子、肝白蛋白啟動子、B型肝炎病毒核心啟動子、骨鈣化素啟動子、骨唾液蛋白啟動子、CD2啟動子、免疫球蛋白重鏈啟動子、T細胞受體a鏈啟動子、神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子或神經絲輕鏈啟動子)及誘導性啟動子(例如鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子；地塞米松(Dex)誘導性小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子；T7聚合酶啟動子系統、四環素抑制性系統、四環素誘導性系統、RU486誘導性系統、雷帕黴素誘導性系統)，例如如本文所述。在一些實施例中，表現卡匣進一步包含增強子，例如如本文所述。 遺傳元件構築體之設計及生產
可使用各種方法合成遺傳元件構築體(例如穿梭載體或供體載體)。舉例而言，遺傳元件構築體序列可分成更易於合成之較小重疊片段(例如在約100 bp至約10 kb區段或個別ORF範圍內)。此等DNA區段由一組重疊單股寡核苷酸合成。接著將所得重疊合成子組裝成較大DNA片段，例如遺傳元件構築體。區段或ORF可例如藉由活體外重組或5'及3'末端處之獨特限制位點組裝成遺傳元件構築體，以實現連接。
遺傳元件構築體可由設計演算法合成，該演算法將構築體序列解析為寡核苷酸長度的片段，產生適用於合成之設計條件，其考慮序列空間之複雜性。隨後在基於半導體之高密度晶片上化學合成寡核苷酸，其中每個晶片合成超過200,000個個別寡核苷酸。用諸如BioFab®之組裝技術組裝寡核苷酸，以自較小寡核苷酸建構較長DNA區段。此係以並行方式進行，因此一次性建構數百至數千個合成DNA區段。
各遺傳元件構築體或遺傳元件構築體區段可經序列驗證。在一些實施例中，RNA或DNA之高通量定序可使用允許監測生物過程(例如miRNA表現或對偶基因變化性(SNP偵測)之AnyDot.chips (Genovoxx, Germany)進行。其他高產量定序系統包括Venter, J., 等人 Science 2001年2月16日；Adams, M.等人, Science 2000年3月24日；及M. J, Levene等人 Science 299:682-686, 2003年1月以及美國公開申請案第20030044781號及第2006/0078937號中所揭示之彼等定序系統。總體而言，此類系統涉及經由在核酸分子上量測之聚合反應藉由暫時添加鹼基來定序具有複數個鹼基之目標核酸分子，亦即，即時追蹤核酸聚合酶在欲定序之模板核酸分子上的活性。在一些實施例中，進行鳥槍定序(shotgun sequencing)。
遺傳元件構築體可經設計以使得用於複製或封裝之因子可相對於遺傳元件以順式或反式提供。舉例而言，當以順式提供時，遺傳元件可包含編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3之一或多個基因，例如如本文所述。在一些實施例中，複製及/或封裝信號可併入至遺傳元件中，例如以誘導擴增及/或囊封。在一些實施例中，將效應子插入至基因體中之特定位點中。在一些實施例中，一或多個病毒ORF經效應子置換。
在另一實例中，當複製或封裝因子以反式提供時，遺傳元件可缺乏編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3中之一或多者的基因，例如如本文所述；此一或多種蛋白質可例如由另一核酸，例如輔助核酸提供。在一些實施例中，最小順式信號(例如5' UTR及/或富含GC之區域)存在於遺傳元件中。在一些實施例中，遺傳元件不編碼複製或封裝因子(例如，複製酶及/或衣殼蛋白)。在一些實施例中，此類因子可由一或多種輔助核酸(例如輔助病毒核酸、輔助質體或整合至宿主細胞基因體中之輔助核酸)提供。在一些實施例中，輔助核酸表現足以誘導擴增及/或封裝之蛋白質及/或RNA，但可能缺乏其自身的封裝信號。在一些實施例中，將遺傳元件及輔助核酸引入至宿主細胞中(例如同時或分開)，引起遺傳元件之擴增及/或封裝，但不引起輔助核酸之擴增及/或封裝。
在一些實施例中，可使用電腦輔助設計工具設計遺傳元件構築體。 製造構築體之一般方法描述於例如Khudyakov及Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)；Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (第一版), Academic Press (2013)；及Egli及Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (第一版), Wiley-VCH (2012)中。 效應子
本文所述之組合物(例如穿梭載體、供體載體、細胞及桿狀病毒)及方法可用於產生包含編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之序列的指環載體之遺傳元件，例如如本文所述。在一些情況下，效應子可為內源性效應子或外源性效應子。在一些實施例中，效應子為治療效應子。在一些實施例中，效應子包含多肽(例如治療多肽或肽，例如如本文所述)。在一些實施例中，效應子包含非編碼RNA (例如miRNA、siRNA、shRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA或gRNA)。在一些實施例中，效應子包含例如如本文所述之調節核酸。
在一些實施例中，效應子編碼序列可例如在非編碼區域處插入至遺傳元件中，例如安置於遺傳元件之開讀框之3'及富含GC之區域之5'的非編碼區域、在TATA盒上游之5'非編碼區域中、在5' UTR中、在poly-A信號下游之3'非編碼區域中或在富含GC之區域上游。在一些實施例中，效應子編碼序列可插入至遺傳元件中，例如在編碼序列中(例如在編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3之序列中，例如如本文所述)。在一些實施例中，效應子編碼序列替代開讀框之全部或一部分。在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接於效應子編碼序列之調節序列(例如啟動子或增強子，例如如本文所述)。
在一些實施例中，包含效應子之遺傳元件係由如本文所述之遺傳元件構築體(例如穿梭載體)產生，例如藉由滾環複製安置於其上之遺傳元件序列。在一些實施例中，穿梭載體包含效應子編碼序列之一個複本。在一些實施例中，穿梭載體包含一或多個(例如1、2、3、4、5個或全部)編碼指環病毒ORF蛋白(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2)或其功能片段的序列。在一些實施例中，穿梭載體不包含一或多個編碼指環病毒ORF蛋白(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2)或其功能片段的序列。在實施例中，穿梭載體不包含編碼指環病毒ORF蛋白或其功能片段之任何序列。 宿主細胞
本文所述之抗體可例如在宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)中產生。一般而言，提供包含指環載體遺傳元件及指環載體蛋白質外部組分(例如由指環病毒ORF1核酸或指環病毒ORF1分子編碼之多肽)的宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含編碼指環載體蛋白質外部組分中之一或多者的穿梭載體。在實施例中，指環載體蛋白質外部組分在宿主細胞中由穿梭載體表現。在一些實施例中，宿主細胞含有包含指環載體遺傳元件之序列的穿梭載體(例如相同穿梭載體或不同穿梭載體)。在實施例中，遺傳元件由包含其序列之穿梭載體產生。接著在適用於將遺傳元件圍封於蛋白質外部內之條件(例如如本文所述之培養條件)下培育宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞在適用於將指環載體自宿主細胞釋放至例如周圍上清液中之條件下進一步培育。在一些實施例中，溶解宿主細胞以自細胞溶解物收集指環載體。在一些實施例中，可將指環載體引入生長至高細胞密度的宿主細胞株中。 將遺傳元件引入宿主細胞中
遺傳元件或包含遺傳元件之序列的核酸構築體可引入宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)中，例如包含指環載體蛋白質外部之一或多種組分(例如ORF1分子或其功能片段)的宿主細胞。在一些實施例中，將遺傳元件本身引入宿主細胞中。在一些實施例中，將包含遺傳元件(例如如本文所述)之序列的遺傳元件構築體引入宿主細胞中。遺傳元件或遺傳元件構築體可例如使用此項技術中已知之方法引入宿主細胞中。舉例而言，可藉由轉染(例如穩定轉染或瞬時轉染)將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在實施例中，藉由脂染胺轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在實施例中，藉由磷酸鈣轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，藉由電穿孔將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，使用基因槍將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，藉由核轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，藉由PEI轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，藉由使宿主細胞與包含遺傳元件之指環載體接觸而將遺傳元件引入宿主細胞中。
在實施例中，遺傳元件構築體一旦引入至宿主細胞中便能夠複製。在實施例中，一旦引入宿主細胞中，遺傳元件便可由遺傳元件構築體產生。在一些實施例中，遺傳元件藉由聚合酶，例如使用遺傳元件構築體作為模板在宿主細胞中產生。
在一些實施例中，將遺傳元件或包含遺傳元件之載體引入(例如轉染)至表現病毒聚合酶蛋白質之細胞株中，以實現指環載體之表現。為此目的，表現指環載體聚合酶蛋白質之細胞株可用作適當宿主細胞。宿主細胞可類似地經工程化以提供其他病毒功能或額外功能。
為製備本文揭示之指環載體，遺傳元件構築體可用於轉染提供複製及生產所需之指環載體蛋白質及功能的宿主細胞。或者，宿主細胞可用提供指環載體蛋白質及功能之第二構築體(例如穿梭載體)轉染，在藉由本文揭示之該遺傳元件或包含該遺傳元件之載體轉染之前、期間或之後。在一些實施例中，第二構築體可適用於補充生產不完全病毒粒子。第二構築體(例如穿梭載體)可具有條件性生長缺陷，諸如宿主範圍限制或溫度敏感度，例如其允許轉染病毒之後續選擇。在一些實施例中，第二構築體可提供宿主細胞所利用之一或多種複製蛋白以實現指環載體之表現。在一些實施例中，宿主細胞可經編碼病毒蛋白質，諸如一或多種複製蛋白之載體轉染。在一些實施例中，第二構築體包含抗病毒敏感性。
在一些情況下，使用此項技術中已知之技術，本文所揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體可複製且產生至指環載體中。舉例而言，各種病毒培養方法描述於例如美國專利第4,650,764號；美國專利第5,166,057號；美國專利第5,854,037號；歐洲專利公開案EP 0702085A1；美國專利申請案序列號09/152,845；國際專利公開案PCT WO97/12032；WO96/34625；歐洲專利公開案EP-A780475；WO 99/02657；WO 98/53078；WO 98/02530；WO 99/15672；WO 98/13501；WO 97/06270；及EPO 780 47SA1中，其各自以全文引用的方式併入本文中。 提供呈順式或反式之指環病毒蛋白質的方法
在一些實施例(例如本文所述之順式實施例)中，遺傳元件構築體(例如穿梭載體)進一步包含一或多個表現卡匣，該一或多個表現卡匣包含指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或其功能片段)之編碼序列。在實施例中，遺傳元件構築體包含表現卡匣，該表現卡匣包含指環病毒ORF1或其剪接變異體或功能片段之編碼序列。包含效應子以及一或多個指環病毒ORF之表現卡匣的此類遺傳元件構築體可引入至宿主細胞中。在一些情況下，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)可能能夠產生用於蛋白質外部之遺傳元件及組分，且能夠在蛋白質外部內圍封遺傳元件，而無需額外核酸構築體或將表現卡匣整合至宿主細胞基因體中。換言之，例如如本文所述，此類遺傳元件構築體可用於宿主細胞中之順式指環載體產生方法。
在一些實施例(例如本文所述之反式實施例)中，遺傳元件構築體不包含表現卡匣，該表現卡匣包含一或多個指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2，或其功能片段)之編碼序列。在實施例中，遺傳元件構築體為穿梭載體。在實施例中，遺傳元件構築體不為穿梭載體。在實施例中，遺傳元件構築體不包含表現卡匣，該表現卡匣包含指環病毒ORF1或其剪接變異體或功能片段之編碼序列。包含效應子之表現卡匣但缺乏一或多個指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1或其剪接變異體或功能片段)之表現卡匣的此類遺傳元件構築體可引入至宿主細胞中。在一些情況下，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞可能需要額外核酸構築體或將表現卡匣整合至宿主細胞基因體中以用於產生指環載體之一或多種組分(例如蛋白質外部蛋白質)。在一些實施例中，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)不能在不存在編碼指環病毒ORF1分子之額外核酸構築體的情況下在蛋白質外部內圍封遺傳元件。換言之，例如如本文所述，此類遺傳元件構築體可用於宿主細胞中之反式指環載體產生方法。 輔助
在一些實施例中，將輔助構築體引入至宿主細胞(例如包含如本文所述之遺傳元件構築體或遺傳元件的宿主細胞)，例如昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中。在一些實施例中，在引入遺傳元件構築體之前將輔助構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，在引入遺傳元件構築體的同時將輔助構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，在引入遺傳元件構築體之後將輔助構築體引入至宿主細胞中。 例示性細胞類型
適用於產生指環載體之例示性宿主細胞包括但不限於昆蟲細胞(例如Sf9細胞、Sf21細胞或Hi5細胞)，例如如本文所述。在一些實施例中，昆蟲細胞衍生自家蠶( Bombyx mori)、甘藍夜蛾( Mamestra brassicae)、草地黏蟲( Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾( Trichoplusia ni)或黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)。 在一些實施例中，指環載體在連續昆蟲細胞株(例如可連續繁殖之永生化細胞株)中培養。 培養條件
包含遺傳元件及蛋白質外部組分之宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)可在適用於將遺傳元件圍封在蛋白質外部內之條件下培育，藉此產生指環載體。適合的培養條件包括例如實例1、9至11及13-15中所述之彼等。在一些實施例中，宿主細胞在液體培養基(例如，格里斯氏補充(Grace's Supplemented) (TNM-FH)、IPL-41、TC-100、施奈德果蠅(Schneider's Drosophila)、SF-900 II SFM或及EXPRESS-FIVE™ SFM)中培育。在一些實施例中，宿主細胞在黏附培養物中培育。在一些實施例中，宿主細胞在懸浮培養物中培育。在一些實施例中，宿主細胞在管、瓶、微載體或燒瓶中培育。在一些實施例中，宿主細胞在培養皿或孔(例如盤上之孔)中培育。在一些實施例中，宿主細胞在適合於宿主細胞增殖之條件下培育。在一些實施例中，宿主細胞在適合於宿主細胞之條件下培育以將其中產生之指環載體釋放至周圍上清液中。
根據本發明之含有指環載體之細胞培養物的產生可以不同規模(例如在燒瓶、滾瓶或生物反應器中)進行。用於培養待感染細胞之培養基一般包含細胞存活率所需之標準營養物，但亦可包含視細胞類型而定之額外營養物。視情況，培養基可不含蛋白質及/或不含血清。視細胞類型而定，細胞可在懸浮液中或在受質上培養。在一些實施例中，不同培養基用於宿主細胞之生長及用於指環載體之產生。 收集
可例如根據此項技術中已知之方法收集由宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)產生之指環載體。舉例而言，培養物中宿主細胞釋放至周圍上清液中的指環載體可自上清液收集(例如如實例10中所述)。在一些實施例中，上清液與宿主細胞分離以獲得指環載體。在一些實施例中，在收集之前或期間溶解宿主細胞。在一些實施例中，自宿主細胞溶解物收集指環載體(例如如實例16中所述)。在一些實施例中，自宿主細胞溶解物及上清液兩者收集指環載體。在一些實施例中，指環載體之純化及分離係根據病毒生產中已知之方法進行，例如如以全文引用之方式併入本文中的Rinaldi等人, DNA Vaccines: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), 第3版. 2014, Humana Press中所述)。在一些實施例中，在用醫藥賦形劑調配之前，可基於生物物理學特性，例如離子交換層析或切向流過濾，藉由分離溶質來收集及/或純化指環載體。 富集及純化
可純化及/或富集收集之指環載體，例如以產生指環載體製劑。在一些實施例中，所收集之指環載體與存在於收集溶液中之其他成分或污染物分離，例如使用此項技術中已知用於純化病毒粒子之方法(例如藉由沈降、層析及/或超濾進行純化)。在一些實施例中，純化步驟包含自製劑中移除血清、宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、缺乏遺傳元件之粒子及/或酚紅中之一或多者。在一些實施例中，收集之指環載體相對於收集溶液中存在之其他成分或污染物富集，例如使用此項技術中已知用於富集病毒粒子之方法。
在一些實施例中，所得製備或包含製劑之醫藥組合物在可接受之時段及溫度內將為穩定的，及/或與所需投與途徑及/或此投與途徑將需要之任何裝置，例如針或注射器相容。 II. 指環載體
在一些態樣中，本文所述之本發明包含使用及製造指環載體、指環載體製劑及治療組合物之組合物及方法。在一些實施例中，指環載體使用如本文所述之穿梭載體製得。在某些實施例中，指環載體之遺傳元件。在一些實施例中，指環載體包含一或多種核酸或多肽，其包含基於指環病毒(例如如本文所述之指環病毒)或其片段或部分，或其他基本上非致病性病毒，例如共生性病毒、共生病毒、天然病毒之序列、結構及/或功能。在一些實施例中，基於指環病毒之指環載體包含至少一個該指環病毒之外源性元件，例如外源性效應子或編碼安置於指環載體之遺傳元件內之外源性效應子的核酸序列。在一些實施例中，基於指環病毒之指環載體包含至少一個與來自指環病毒之另一元件異源的元件，例如與另一連接核酸序列，諸如啟動子元件異源之效應子編碼核酸序列。在一些實施例中，指環載體包含遺傳元件(例如環狀DNA，例如單股DNA)，其包含相對於遺傳元件及/或蛋白質外部之其餘部分異源的至少一個元件(例如編碼效應子之外源性元件，例如如本文所述)。指環載體可為用於有效負載至宿主(例如人類)中之遞送媒劑(例如基本上非致病性遞送媒劑)。在一些實施例中，指環載體能夠在真核細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞中複製。在一些實施例中，指環載體為基本上非致病性的及/或基本上非整合於哺乳動物(例如人類)細胞中。在一些實施例中，指環載體在哺乳動物(例如人類)中基本上為非免疫原性的。在一些實施例中，指環載體為複製缺陷型的。在一些實施例中，指環載體為複製勝任型的。
在一些實施例中，指環載體包含curon或其組分(例如遺傳元件，例如包含編碼效應子之序列及/或蛋白質外部)，例如如PCT申請案第PCT/US2018/037379中所述，該案以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，指環載體包含指環載體或其組分(例如遺傳元件，例如包含編碼效應子之序列及/或蛋白質外部)，例如如PCT申請案第PCT/US19/65995中所述，該案以全文引用之方式併入本文中。
在一態樣中，本發明包括一種指環載體，其包含(i)包含啟動子元件之遺傳元件、編碼效應子之序列(例如內源性效應子或外源性效應子，例如有效負載)及蛋白質結合序列(例如外部蛋白質結合序列，例如封裝信號)，其中遺傳元件為單股DNA，且具有以下特性中之一或兩者：為環狀及/或以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合至真核細胞之基因體中；及(ii)蛋白質外部；其中遺傳元件圍封於蛋白質外部內；且其中指環載體能夠將遺傳元件遞送至真核細胞中。
在本文所述之指環載體之一些實施例中，遺傳元件以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合。在一些實施例中，來自投與至個體之複數個指環載體之小於約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%或5%的遺傳元件將整合至個體之一或多個宿主細胞的基因體中。在一些實施例中，例如如本文所述之指環載體群體之遺傳元件以小於類似AAV病毒群體之頻率的頻率，例如以比類似AAV病毒群體低約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多的頻率整合至宿主細胞之基因體中。
在一態樣中，本發明包括一種指環載體，其包含：(i)遺傳元件，該遺傳元件包含啟動子元件及編碼效應子(例如內源性效應子或外源性效應子，例如有效負載)之序列及蛋白質結合序列(例如外部蛋白質結合序列)，其中該遺傳元件與野生型指環病毒序列(例如野生型細環病毒(TTV)、細小環病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如如本文所述之野生型指環病毒序列)具有至少75% (例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性；及(ii)蛋白質外部；其中遺傳元件圍封於蛋白質外部內；且其中指環載體能夠將遺傳元件遞送至真核細胞中。
在一個態樣中，本發明包括一種指環載體，其包含： a)遺傳元件，其包含(i)編碼外部蛋白質(例如非致病性外部蛋白質)之序列、(ii)將遺傳元件結合至非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列及(iii)編碼效應子(例如內源性或外源性效應子)之序列；及 b)與遺傳元件相關聯，例如圍封或包封該遺傳元件之蛋白質外部。
在一些實施例中，指環載體包括來自無包膜、環狀、單股DNA病毒(或與其具有＞70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%同源性)之序列或表現產物。動物環狀單股DNA病毒一般係指單股DNA (ssDNA)病毒之子組，其感染真核非植物宿主且具有環狀基因體。因此，動物環狀ssDNA病毒可與感染原核生物之ssDNA病毒(亦即微小噬菌體科(Microviridae)及絲狀噬菌體科(Inoviridae))及感染植物之ssDNA病毒(亦即雙生病毒科(Geminiviridae)及矮化病毒科(Nanoviridae))區分開。其亦可與感染非植物真核生物之線性ssDNA病毒(亦即小病毒科(Parvoviridiae))區分開。
在一些實施例中，指環載體例如短暫或長期地調節宿主細胞功能。在某些實施例中，細胞功能經穩定改變，諸如調節持續至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或其間的任何時間。在某些實施例中，細胞功能短暫改變，例如諸如調節持續至多約30分鐘至約7天，或至多約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、7天或其間的任何時間。
在一些實施例中，遺傳元件包含啟動子元件。在實施例中，啟動子元件係選自RNA聚合酶II依賴性啟動子、RNA聚合酶III依賴性啟動子、PGK啟動子、CMV啟動子、EF-1α啟動子、SV40啟動子、CAGG啟動子或UBC啟動子、TTV病毒啟動子、組織特異性U6 (pollIII)、具有活化蛋白之上游DNA結合位點的最小CMV啟動子(TetR-VP16、Gal4-VP16、dCas9-VP16等)。在實施例中，啟動子元件包含TATA盒。在實施例中，啟動子元件對於野生型指環病毒為內源性的，例如如本文所述。
在一些實施例中，遺傳元件包含以下特徵中之一或多者：單股、環狀、負股及/或DNA。在實施例中，遺傳元件包含游離基因體。在一些實施例中，不包括效應子之遺傳元件部分具有約2.5-5 kb (例如約2.8-4 kb、約2.8-3.2 kb、約3.6-3.9 kb或約2.8-2.9 kb)、小於約5 kb (例如，小於約2.9 kb、3.2 kb、3.6 kb、3.9 kb或4kb)或至少100個核苷酸(例如至少1 kb)之組合尺寸。
如本文所述之指環載體、包含指環載體之組合物、使用此類指環載體之方法等，在一些情況下，部分基於實例不同效應子，例如miRNA (例如針對IFN或miR-625)、shRNA等及蛋白質結合序列，例如將結合至衣殼蛋白(如Q99153)之DNA序列與蛋白質外部結合，例如於Arch Virol (2007) 152: 1961-1975中所揭示之衣殼，以產生指環載體，其可接著用於將效應子遞送至細胞(例如動物細胞，例如人類細胞或非人類動物細胞，諸如豬或小鼠細胞)中。在實施例中，效應子可沉默因子(諸如干擾素)之表現。實例進一步描述可如何藉由將效應子插入至衍生自例如指環病毒之序列中來製備指環載體。基於此等實例，下文描述涵蓋實例中所考慮之特定發現及組合的各種變化形式。例如，熟習此項技術者將自實例理解，特定miRNA僅用作效應子之一個實例且其他效應子可為例如其他調節核酸或治療性肽。類似地，實例中所用之特定衣殼可經下文所述之基本上非致病性蛋白質置換。實例中所述之特定指環病毒序列亦可經下文所述之指環病毒序列置換。此等考慮因素類似地適用於蛋白質結合序列、諸如啟動子之調節序列及其類似者。獨立於此，熟習此項技術者將尤其考慮與實例密切相關之此類實施例。
在一些實施例中，將指環載體或包含於指環載體中之遺傳元件引入至細胞(例如人類細胞)中。在一些實施例中，例如在指環載體或遺傳元件已引入至細胞中之後，例如由指環載體之遺傳元件編碼之效應子(例如RNA，例如miRNA)表現於細胞(例如人類細胞)中。在實施例中，將指環載體或包含於其中之遺傳元件引入至細胞中以調節(例如增加或降低)細胞中之目標分子(例如目標核酸，例如RNA或目標多肽)之水準，例如藉由改變細胞之目標分子的表現量。在實施例中，引入指環載體或包含於其中之遺傳元件會降低細胞所產生之干擾素水準。在實施例中，將指環載體或包含於其中之遺傳元件引入至細胞中會調節(例如增加或降低)細胞之功能。在實施例中，將指環載體或包含於其中之遺傳元件引入至細胞中會調節(例如增加或降低)細胞之存活率。在實施例中，將指環載體或包含於其中之遺傳元件引入至細胞中會降低細胞(例如癌細胞)之存活率。
在一些實施例中，本文所述之指環載體(例如合成指環載體)誘導小於70%之抗體發病率(例如小於約60%、50%、40%、30%、20%或10%抗體發病率)。在實施例中，抗體發病率係根據此項技術中已知之方法測定。在實施例中，抗體發病率係藉由偵測生物樣品中針對指環病毒(例如如本文所述)之抗體或基於指環病毒之抗體來測定，例如根據Tsuda等人(1999; J. Virol. Methods77: 199-206；以引用之方式併入本文中)所述之抗TTV抗體偵測方法，及/或根據Kakkola等人(2008; Virology382: 182-189；以引用之方式併入本文中)所述之用於測定抗TTV IgG血清陽性率之方法。針對指環病毒或基於指環病毒之指環載體的抗體亦可藉由此項技術中用於偵測抗病毒抗體之方法來偵測，例如偵測抗AAV抗體之方法，例如如Calcedo等人(2013; Front. Immunol.4(341): 1-7；以引用之方式併入本文中)中所述。
在一些實施例中，複製缺陷型、複製缺失型或複製非勝任型遺傳元件不編碼複製遺傳元件所需之所有必需機構或組分。在一些實施例中，複製缺失型遺傳元件不編碼複製因子。在一些實施例中，複製缺失型遺傳元件不編碼一或多個ORF (例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3，例如如本文所述)。在一些實施例中，不由遺傳元件編碼之機構或組分可以反式提供(例如使用輔助，例如輔助病毒或輔助質體，或在包含宿主細胞之核酸中編碼，例如整合至宿主細胞之基因體中)，例如使得遺傳元件可在以反式提供之機構或組分存在下經歷複製。
在一些實施例中，封裝缺陷型、封裝缺失型或封裝非勝任型遺傳元件無法封裝至蛋白質外部中(例如其中蛋白質外部包含衣殼或其一部分，例如包含由ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。在一些實施例中，相比於野生型指環病毒(例如如本文所述)，封裝缺陷型遺傳元件以小於10% (例如小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%)之效率封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，封裝缺失型遺傳元件即使在准許封裝野生型指環病毒(例如如本文所述)之遺傳元件的因子(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下亦無法封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，相比於野生型指環病毒(例如如本文所述)，封裝缺陷型遺傳元件以小於10% (例如小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%)之效率封裝至蛋白質外部中，即使在准許封裝野生型指環病毒(例如如本文所述)之遺傳元件的因子(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下亦如此。
在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件可封裝至蛋白質外部中(例如其中蛋白質外部包含衣殼或其一部分，例如包含由ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。在一些實施例中，相比於野生型指環病毒(例如如本文所述)，封裝勝任型遺傳元件以至少20% (例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或更高)的效率封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件可在准許封裝野生型指環病毒(例如如本文所述如)之遺傳元件的因子(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，在准許封裝野生型指環病毒(例如如本文所述如)之遺傳元件的因子(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下，相比於野生型指環病毒(例如如本文所述)，封裝勝任型遺傳元件以至少20% (例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或更高)的效率封裝至蛋白質外部中。 指環病毒
在一些實施例中，例如如本文所述之指環載體包含衍生自指環病毒之序列或表現產物。在一些實施例中，指環載體包括相對於指環病毒為外源性的一或多種序列或表現產物。在一些實施例中，指環載體包括相對於指環病毒為內源性的一或多種序列或表現產物。在一些實施例中，指環載體包括相對於指環載體中之一或多種其他序列或表現產物為異源的一或多種序列或表現產物。指環病毒一般具有帶負極性之單股環狀DNA基因體。指環病毒通常不與任何人類疾病相關聯。然而，將指環病毒感染與人類疾病關聯起來的嘗試被以下各者混淆：對照組群體中無症狀指環病毒病毒血症之高發病率、指環病毒病毒家族內之顯著基因體多樣性、歷史上無法在活體外繁殖該病原體以及缺乏指環病毒疾病動物模型(Yzebe等人, Panminerva Med. (2002) 44:167-177；Biagini, P., Vet. Microbiol. (2004) 98:95-101)。
指環病毒通常藉由口鼻或糞口感染、母嬰及/或子宮內傳播來傳播(Gerner等人, Ped. Infect. Dis. J. (2000) 19:1074-1077)。在一些情況下，感染者之特徵可為長期(數月至數年)的指環病毒病毒血症。人類可同時感染超過一個基因體或菌株(Saback等人, Scad. J. Infect. Dis. (2001) 33:121-125)。有跡象表明此等基因體可在感染人體內重組(Rey等人, Infect. (2003) 31:226-233)。已在若干組織，諸如肝臟、周邊血液單核細胞及骨髓中發現雙股同功型(複製型)中間物(Kikuchi等人, J. Med. Virol. (2000) 61:165-170；Okamoto等人, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2002) 270:657-662；Rodriguez-lnigo等人, Am. J. Pathol. (2000) 156:1227-1234)。
在一些實施例中，遺傳元件包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼胺基酸序列或其功能片段，或與本文所述之胺基酸序列中之任一者(例如指環病毒胺基酸序列)具有至少約60%、70% 80%、85%、90% 95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體包含一或多個核酸分子(例如如本文所述之遺傳元件)，其包含與例如如本文所述之指環病毒序列或其片段具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體包含一或多個核酸分子(例如如本文所述之遺傳元件)，其包含與以下中之一或多者具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列：指環病毒之TATA盒、加帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開讀框區、poly(A)信號、富含GC之區域或其任何組合，例如如本文所述。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白例如本文所述之任一指環病毒的ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3序列。在實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白包含與指環病毒ORF1蛋白(或其剪接變異體或功能片段)或由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF1/1核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF1/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF2/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF2/3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF2t/3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒TATA盒核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒起始元件核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒轉錄起始位點核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒三個開讀框區核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒poly(A)信號核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒富含GC之核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF1/1核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF1/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF2/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF2/3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒TATA盒核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒起始元件核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒轉錄起始位點核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒三個開讀框區核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒poly(A)信號核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒富含GC之核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF1/1核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF1/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF2/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF2/3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒TAIP核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒TATA盒核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒起始元件核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒轉錄起始位點核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒三個開讀框區核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒poly(A)信號核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒富含GC之核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼胺基酸序列或其功能片段，或與本文所述之胺基酸序列中之任一者(例如指環病毒胺基酸序列)具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體包含一或多個核酸分子(例如本文所述之遺傳元件)，其包含與指環病毒序列(例如本文所述)或其片段具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在實施例中，指環載體包含選自以下之核酸序列：表A1-M2之任一者中所示之序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在實施例中，指環載體包含多肽，該多肽包含如表A2-M2之任一者中所示之序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體包含一或多個核酸分子(例如如本文所述之遺傳元件)，其包含與以下之一或多者具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列：本文所述之任一指環病毒之TATA盒、帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2，ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開讀框區、poly(A)信號、富含GC之區域或其任何組合(例如表A-M之任一者中所註釋或所列序列編碼的指環病毒序列)。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，例如本文所述之任一指環病毒之ORF1、ORF1/1、ORF1/2，ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3序列(例如表A-M之任一者中所註釋或所列序列編碼的指環病毒序列)。在實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白質之序列，該衣殼蛋白質包含與指環病毒ORF1或ORF2蛋白(例如表A2-M2之任一者中所示之ORF1或ORF2胺基酸序列，或由表A1-M1之任一者中所示核酸序列編碼的ORF1或ORF2胺基酸序列)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白質之序列，該衣殼蛋白質包含與指環病毒ORF1蛋白(例如表A2-M2之任一者中所示之ORF1胺基酸序列，或由表A1-M1之任一者中所示核酸序列編碼的ORF1胺基酸序列)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體為嵌合指環載體。在一些實施例中，嵌合指環載體進一步包含一或多種來自除指環病毒以外之病毒的元件、多肽或核酸。
在實施例中，嵌合指環載體包含複數個多肽(例如指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)，該等多肽包含來自複數個不同指環病毒(例如如本文所述)之序列。舉例而言，嵌合指環載體可包含來自一種指環病毒之ORF1分子(例如環1 ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1分子)，及來自不同指環病毒之ORF2分子(例如環2 ORF2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF2分子)。在另一實例中，嵌合指環載體可包含來自一種指環病毒之第一ORF1分子(例如環1 ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1分子)，及來自不同指環病毒之第二ORF1分子(例如環2 ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1分子)。
在一些實施例中，指環載體包含嵌合多肽(例如指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)，例如包含來自指環病毒(例如如本文所述)之至少一部分及來自不同病毒(例如如本文所述)之至少一部分。
在一些實施例中，指環載體包含嵌合多肽(例如指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)，例如包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之至少一部分及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之至少一部分。在實施例中，指環載體包含嵌合ORF1分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1分子的至少一部分。在實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1凝膠捲域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1富含精胺酸之區域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1高變域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1 N22域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1 C端域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。
在實施例中，指環載體包含嵌合ORF1/1分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF1/1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1/1分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF1/1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1/1分子的至少一部分。在實施例中，指環載體包含嵌合ORF1/2分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF1/2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1/2分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF1/2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1/2分子的至少一部分。在實施例中，指環載體包含嵌合ORF2分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2分子的至少一部分。在實施例中，指環載體包含嵌合ORF2/2分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF2/2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/2分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF2/2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/2分子的至少一部分。在實施例中，指環載體包含嵌合ORF2/3分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF2/3分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/3分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF2/3分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/3分子的至少一部分。在實施例中，指環載體包含嵌合ORF2T/3分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF2T/3分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2T/3分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF2T/3分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2T/3分子的至少一部分。
其中包含之序列或子序列可用於本文所述之組合物及方法中(例如以形成指環載體之遺傳元件或作為穿梭載體中之遺傳元件序列，例如如本文所述)之其他例示性指環病毒基因體描述於例如PCT申請案第PCT/US2018/037379號及PCT/US19/65995號(以全文引用之方式併入本文中)中。在一些實施例中，例示性指環病毒序列包含以引用之方式併入本文中之PCT/US19/65995之表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1-B5、1、3、5、7、9、11、13、15或17中之任一者中所列的核酸序列。在一些實施例中，例示性指環病毒序列包含以引用之方式併入本文中之PCT/US19/65995之表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16或18中之任一者中所列的胺基酸序列。在一些實施例中，例示性指環病毒序列包含ORF1分子序列或編碼其之核酸序列，例如如以引用之方式併入本文中之PCT/US19/65995之表21、23、25、27、29、31、33、35、D2、D4、D6、D8、D10或37A-37C中之任一者中所列。 表 A1. 例示性指環病毒核酸序列 (α 細環病毒 ，分枝系 3)
名稱 環1
屬/分枝系 α細環病毒，分枝系3
寄存編號 AJ620231.1
完整序列：3753 bp
  1        10        20        30        40        50  |        |         |         |         |         |  TGCTACGTCACTAACCCACGTGTCCTCTACAGGCCAATCGCAGTCTATGT  CGTGCACTTCCTGGGCATGGTCTACATAATTATATAAATGCTTGCACTTC  CGAATGGCTGAGTTTTTGCTGCCCGTCCGCGGAGAGGAGCCACGGCAGGG  GATCCGAACGTCCTGAGGGCGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGAAG  TCAAGGGGCAATTCGGGCTCAGGACTGGCCGGGCTTTGGGCAAGGCTCTT  AAAAATGCACTTTTCTCGAATAAGCAGAAAGAAAAGGAAAGTGCTACTGC  TTTGCGTGCCAGCAGCTAAGAAAAAACCAACTGCTATGAGCTTCTGGAAA  CCTCCGGTACACAATGTCACGGGGATCCAACGCATGTGGTATGAGTCCTT  TCACCGTGGCCACGCTTCTTTTTGTGGTTGTGGGAATCCTATACTTCACA  TTACTGCACTTGCTGAAACATATGGCCATCCAACAGGCCCGAGACCTTCT  GGGCCACCGGGAGTAGACCCCAACCCCCACATCCGTAGAGCCAGGCCTGC  CCCGGCCGCTCCGGAGCCCTCACAGGTTGATTCGAGACCAGCCCTGACAT  GGCATGGGGATGGTGGAAGCGACGGAGGCGCTGGTGGTTCCGGAAGCGGT  GGACCCGTGGCAGACTTCGCAGACGATGGCCTCGATCAGCTCGTCGCCGC  CCTAGACGACGAAGAGTAAGGAGGCGCAGACGGTGGAGGAGGGGGAGACG  AAAAACAAGGACTTACAGACGCAGGAGACGCTTTAGACGCAGGGGACGAA  AAGCAAAACTTATAATAAAACTGTGGCAACCTGCAGTAATTAAAAGATGC  AGAATAAAGGGATACATACCACTGATTATAAGTGGGAACGGTACCTTTGC  CACAAACTTTACCAGTCACATAAATGACAGAATAATGAAAGGCCCCTTCG  GGGGAGGACACAGCACTATGAGGTTCAGCCTCTACATTTTGTTTGAGGAG  CACCTCAGACACATGAACTTCTGGACCAGAAGCAACGATAACCTAGAGCT  AACCAGATACTTGGGGGCTTCAGTAAAAATATACAGGCACCCAGACCAAG  ACTTTATAGTAATATACAACAGAAGAACCCCTCTAGGAGGCAACATCTAC  ACAGCACCCTCTCTACACCCAGGCAATGCCATTTTAGCAAAACACAAAAT  ATTAGTACCAAGTTTACAGACAAGACCAAAGGGTAGAAAAGCAATTAGAC  TAAGAATAGCACCCCCCACACTCTTTACAGACAAGTGGTACTTTCAAAAG  GACATAGCCGACCTCACCCTTTTCAACATCATGGCAGTTGAGGCTGACTT  GCGGTTTCCGTTCTGCTCACCACAAACTGACAACACTTGCATCAGCTTCC  AGGTCCTTAGTTCCGTTTACAACAACTACCTCAGTATTAATACCTTTAAT  AATGACAACTCAGACTCAAAGTTAAAAGAATTTTTAAATAAAGCATTTCC  AACAACAGGCACAAAAGGAACAAGTTTAAATGCACTAAATACATTTAGAA  CAGAAGGATGCATAAGTCACCCACAACTAAAAAAACCAAACCCACAAATA  AACAAACCATTAGAGTCACAATACTTTGCACCTTTAGATGCCCTCTGGGG  AGACCCCATATACTATAATGATCTAAATGAAAACAAAAGTTTGAACGATA  TCATTGAGAAAATACTAATAAAAAACATGATTACATACCATGCAAAACTA  AGAGAATTTCCAAATTCATACCAAGGAAACAAGGCCTTTTGCCACCTAAC  AGGCATATACAGCCCACCATACCTAAACCAAGGCAGAATATCTCCAGAAA  TATTTGGACTGTACACAGAAATAATTTACAACCCTTACACAGACAAAGGA  ACTGGAAACAAAGTATGGATGGACCCACTAACTAAAGAGAACAACATATA  TAAAGAAGGACAGAGCAAATGCCTACTGACTGACATGCCCCTATGGACTT  TACTTTTTGGATATACAGACTGGTGTAAAAAGGACACTAATAACTGGGAC  TTACCACTAAACTACAGACTAGTACTAATATGCCCTTATACCTTTCCAAA  ATTGTACAATGAAAAAGTAAAAGACTATGGGTACATCCCGTACTCCTACA  AATTCGGAGCGGGTCAGATGCCAGACGGCAGCAACTACATACCCTTTCAG  TTTAGAGCAAAGTGGTACCCCACAGTACTACACCAGCAACAGGTAATGGA  GGACATAAGCAGGAGCGGGCCCTTTGCACCTAAGGTAGAAAAACCAAGCA  CTCAGCTGGTAATGAAGTACTGTTTTAACTTTAACTGGGGCGGTAACCCT  ATCATTGAACAGATTGTTAAAGACCCCAGCTTCCAGCCCACCTATGAAAT  ACCCGGTACCGGTAACATCCCTAGAAGAATACAAGTCATCGACCCGCGGG  TCCTGGGACCGCACTACTCGTTCCGGTCATGGGACATGCGCAGACACACA  TTTAGCAGAGCAAGTATTAAGAGAGTGTCAGAACAACAAGAAACTTCTGA  CCTTGTATTCTCAGGCCCAAAAAAGCCTCGGGTCGACATCCCAAAACAAG  AAACCCAAGAAGAAAGCTCACATTCACTCCAAAGAGAATCGAGACCGTGG  GAGACCGAGGAAGAAAGCGAGACAGAAGCCCTCTCGCAAGAGAGCCAAGA  GGTCCCCTTCCAACAGCAGTTGCAGCAGCAGTACCAAGAGCAGCTCAAGC  TCAGACAGGGAATCAAAGTCCTCTTCGAGCAGCTCATAAGGACCCAACAA  GGGGTCCATGTAAACCCATGCCTACGGTAGGTCCCAGGCAGTGGCTGTTT  CCAGAGAGAAAGCCAGCCCCAGCTCCTAGCAGTGGAGACTGGGCCATGGA  GTTTCTCGCAGCAAAAATATTTGATAGGCCAGTTAGAAGCAACCTTAAAG  ATACCCCTTACTACCCATATGTTAAAAACCAATACAATGTCTACTTTGAC  CTTAAATTTGAATAAACAGCAGCTTCAAACTTGCAAGGCCGTGGGAGTTT  CACTGGTCGGTGTCTACCTCTAAAGGTCACTAAGCACTCCGAGCGTAAGC  GAGGAGTGCGACCCTCCCCCCTGGAACAACTTCTTCGGAGTCCGGCGCTA  CGCCTTCGGCTGCGCCGGACACCTCAGACCCCCCCTCCACCCGAAACGCT  TGCGCGTTTCGGACCTTCGGCGTCGGGGGGGTCGGGAGCTTTATTAAACG  GACTCCGAAGTGCTCTTGGACACTGAGGGGGTGAACAGCAACGAAAGTGA  GTGGGGCCAGACTTCGCCATAAGGCCTTTATCTTCTTGCCATTTGTCAGT  GTCCGGGGTCGCCATAGGCTTCGGGCTCGTTTTTAGGCCTTCCGGACTAC  AAAAATCGCCATTTTGGTGACGTCACGGCCGCCATCTTAAGTAGTTGAGG  CGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAA  TGGTGGACAATTTCTTCCGGGTCAAAGGTTACAGCCGCCATGTTAAAACA  CGTGACGTATGACGTCACGGCCGCCATTTTGTGACACAAGATGGCCGACT  TCCTTCCTCTTTTTCAAAAAAAAGCGGAAGTGCCGCCGCGGCGGCGGGGG  GCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCGCCCCCCCCC  GCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCC  CCG (SEQ ID NO: 16)  
註釋：
推定域 鹼基範圍
TATA盒 83 – 88
加帽位點 104 – 111
轉錄起始位點 111
5' UTR保守域 170 – 240
ORF2 336 – 719
ORF2/2 336 – 715 ; 2363 – 2789
ORF2/3 336 – 715 ; 2565 – 3015
ORF2t/3 336 – 388 ; 2565 – 3015
ORF1 599 – 2830
ORF1/1 599 – 715 ; 2363 – 2830
ORF1/2 599 – 715 ; 2565 – 2789
三個開讀框區 2551 – 2786
多(A)信號 3011 – 3016
富含GC之區域 3632 – 3753
表 A2. 例示性指環病毒胺基酸序列 (α 細環病毒 ，分枝系 3)
環1 (α細環病毒分枝系3)
ORF2 MSFWKPPVHNVTGIQRMWYESFHRGHASFCGCGNPILHITALAETYGHPTGPRPSGPPGVDPNPHIRRARPAPAAPEPSQVDSRPALTWHGDGGSDGGAGGSGSGGPVADFADDGLDQLVAALDDEE (SEQ ID NO: 17)
ORF2/2 MSFWKPPVHNVTGIQRMWYESFHRGHASFCGCGNPILHITALAETYGHPTGPRPSGPPGVDPNPHIRRARPAPAAPEPSQVDSRPALTWHGDGGSDGGAGGSGSGGPVADFADDGLDQLVAALDDEELLKTPASSPPMKYPVPVTSLEEYKSSTRGSWDRTTRSGHGTCADTHLAEQVLRECQNNKKLLTLYSQAQKSLGSTSQNKKPKKKAHIHSKENRDRGRPRKKARQKPSRKRAKRSPSNSSCSSSTKSSSSSDRESKSSSSSS (SEQ ID NO: 18)
ORF2/3 MSFWKPPVHNVTGIQRMWYESFHRGHASFCGCGNPILHITALAETYGHPTGPRPSGPPGVDPNPHIRRARPAPAAPEPSQVDSRPALTWHGDGGSDGGAGGSGSGGPVADFADDGLDQLVAALDDEEPKKASGRHPKTRNPRRKLTFTPKRIETVGDRGRKRDRSPLAREPRGPLPTAVAAAVPRAAQAQTGNQSPLRAAHKDPTRGPCKPMPTVGPRQWLFPERKPAPAPSSGDWAMEFLAAKIFDRPVRSNLKDTPYYPYVKNQYNVYFDLKFE (SEQ ID NO: 19)
ORF2t/3 MSFWKPPVHNVTGIQRMWPKKASGRHPKTRNPRRKLTFTPKRIETVGDRGRKRDRSPLAREPRGPLPTAVAAAVPRAAQAQTGNQSPLRAAHKDPTRGPCKPMPTVGPRQWLFPERKPAPAPSSGDWAMEFLAAKIFDRPVRSNLKDTPYYPYVKNQYNVYFDLKFE (SEQ ID NO: 20)
ORF1 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGRRKTRTYRRRRRFRRRGRKAKLIIKLWQPAVIKRCRIKGYIPLIISGNGTFATNFTSHINDRIMKGPFGGGHSTMRFSLYILFEEHLRHMNFWTRSNDNLELTRYLGASVKIYRHPDQDFIVIYNRRTPLGGNIYTAPSLHPGNAILAKHKILVPSLQTRPKGRKAIRLRIAPPTLFTDKWYFQKDIADLTLFNIMAVEADLRFPFCSPQTDNTCISFQVLSSVYNNYLSINTFNNDNSDSKLKEFLNKAFPTTGTKGTSLNALNTFRTEGCISHPQLKKPNPQINKPLESQYFAPLDALWGDPIYYNDLNENKSLNDIIEKILIKNMITYHAKLREFPNSYQGNKAFCHLTGIYSPPYLNQGRISPEIFGLYTEIIYNPYTDKGTGNKVWMDPLTKENNIYKEGQSKCLLTDMPLWTLLFGYTDWCKKDTNNWDLPLNYRLVLICPYTFPKLYNEKVKDYGYIPYSYKFGAGQMPDGSNYIPFQFRAKWYPTVLHQQQVMEDISRSGPFAPKVEKPSTQLVMKYCFNFNWGGNPIIEQIVKDPSFQPTYEIPGTGNIPRRIQVIDPRVLGPHYSFRSWDMRRHTFSRASIKRVSEQQETSDLVFSGPKKPRVDIPKQETQEESSHSLQRESRPWETEEESETEALSQESQEVPFQQQLQQQYQEQLKLRQGIKVLFEQLIRTQQGVHVNPCLR (SEQ ID NO: 21)
ORF1/1 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRIVKDPSFQPTYEIPGTGNIPRRIQVIDPRVLGPHYSFRSWDMRRHTFSRASIKRVSEQQETSDLVFSGPKKPRVDIPKQETQEESSHSLQRESRPWETEEESETEALSQESQEVPFQQQLQQQYQEQLKLRQGIKVLFEQLIRTQQGVHVNPCLR (SEQ ID NO: 22)
ORF1/2 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRAQKSLGSTSQNKKPKKKAHIHSKENRDRGRPRKKARQKPSRKRAKRSPSNSSCSSSTKSSSSSDRESKSSSSSS (SEQ ID NO: 23)
表 B1. 例示性指環病毒核酸序列 (β 細環病毒 )
名稱 環2
屬/分枝系 β 細環病毒
寄存編號 JX134045.1
完整序列：2797 bp
  1        10        20        30        40        50  |        |         |         |         |         |  TAATAAATATTCAACAGGAAAACCACCTAATTTAAATTGCCGACCACAAA  CCGTCACTTAGTTCCCCTTTTTGCAACAACTTCTGCTTTTTTCCAACTGC  CGGAAAACCACATAATTTGCATGGCTAACCACAAACTGATATGCTAATTA  ACTTCCACAAAACAACTTCCCCTTTTAAAACCACACCTACAAATTAATTA  TTAAACACAGTCACATCCTGGGAGGTACTACCACACTATAATACCAAGTG  CACTTCCGAATGGCTGAGTTTATGCCGCTAGACGGAGAACGCATCAGTTA  CTGACTGCGGACTGAACTTGGGCGGGTGCCGAAGGTGAGTGAAACCACCG  AAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGTTCAGTCTAGCGGAACGGGCAAGAAA  CTTAAAATTATTTTATTTTTCAGATGAGCGACTGCTTTAAACCAACATGC  TACAACAACAAAACAAAGCAAACTCACTGGATTAATAACCTGCATTTAAC  CCACGACCTGATCTGCTTCTGCCCAACACCAACTAGACACTTATTACTAG  CTTTAGCAGAACAACAAGAAACAATTGAAGTGTCTAAACAAGAAAAAGAA  AAAATAACAAGATGCCTTATTACTACAGAAGAAGACGGTACAACTACAGA  CGTCCTAGATGGTATGGACGAGGTTGGATTAGACGCCCTTTTCGCAGAAG  ATTTCGAAGAAAAAGAAGGGTAAGACCTACTTATACTACTATTCCTCTAA  AGCAATGGCAACCGCCATATAAAAGAACATGCTATATAAAAGGACAAGAC  TGTTTAATATACTATAGCAACTTAAGACTGGGAATGAATAGTACAATGTA  TGAAAAAAGTATTGTACCTGTACATTGGCCGGGAGGGGGTTCTTTTTCTG  TAAGCATGTTAACTTTAGATGCCTTGTATGATATACATAAACTTTGTAGA  AACTGGTGGACATCCACAAACCAAGACTTACCACTAGTAAGATATAAAGG  ATGCAAAATAACATTTTATCAAAGCACATTTACAGACTACATAGTAAGAA  TACATACAGAACTACCAGCTAACAGTAACAAACTAACATACCCAAACACA  CATCCACTAATGATGATGATGTCTAAGTACAAACACATTATACCTAGTAG  ACAAACAAGAAGAAAAAAGAAACCATACACAAAAATATTTGTAAAACCAC  CTCCGCAATTTGAAAACAAATGGTACTTTGCTACAGACCTCTACAAAATT  CCATTACTACAAATACACTGCACAGCATGCAACTTACAAAACCCATTTGT  AAAACCAGACAAATTATCAAACAATGTTACATTATGGTCACTAAACACCA  TAAGCATACAAAATAGAAACATGTCAGTGGATCAAGGACAATCATGGCCA  TTTAAAATACTAGGAACACAAAGCTTTTATTTTTACTTTTACACCGGAGC  AAACCTACCAGGTGACACAACACAAATACCAGTAGCAGACCTATTACCAC  TAACAAACCCAAGAATAAACAGACCAGGACAATCACTAAATGAGGCAAAA  ATTACAGACCATATTACTTTCACAGAATACAAAAACAAATTTACAAATTA  TTGGGGTAACCCATTTAATAAACACATTCAAGAACACCTAGATATGATAC  TATACTCACTAAAAAGTCCAGAAGCAATAAAAAACGAATGGACAACAGAA  AACATGAAATGGAACCAATTAAACAATGCAGGAACAATGGCATTAACACC  ATTTAACGAGCCAATATTCACACAAATACAATATAACCCAGATAGAGACA  CAGGAGAAGACACTCAATTATACCTACTCTCTAACGCTACAGGAACAGGA  TGGGACCCACCAGGAATTCCAGAATTAATACTAGAAGGATTTCCACTATG  GTTAATATATTGGGGATTTGCAGACTTTCAAAAAAACCTAAAAAAAGTAA  CAAACATAGACACAAATTACATGTTAGTAGCAAAAACAAAATTTACACAA  AAACCTGGCACATTCTACTTAGTAATACTAAATGACACCTTTGTAGAAGG  CAATAGCCCATATGAAAAACAACCTTTACCTGAAGACAACATTAAATGGT  ACCCACAAGTACAATACCAATTAGAAGCACAAAACAAACTACTACAAACT  GGGCCATTTACACCAAACATACAAGGACAACTATCAGACAATATATCAAT  GTTTTATAAATTTTACTTTAAATGGGGAGGAAGCCCACCAAAAGCAATTA  ATGTTGAAAATCCTGCCCACCAGATTCAATATCCCATACCCCGTAACGAG  CATGAAACAACTTCGTTACAGAGTCCAGGGGAAGCCCCAGAATCCATCTT  ATACTCCTTCGACTATAGACACGGGAACTACACAACAACAGCTTTGTCAC  GAATTAGCCAAGACTGGGCACTTAAAGACACTGTTTCTAAAATTACAGAG  CCAGATCGACAGCAACTGCTCAAACAAGCCCTCGAATGCCTGCAAATCTC  GGAAGAAACGCAGGAGAAAAAAGAAAAAGAAGTACAGCAGCTCATCAGCA  ACCTCAGACAGCAGCAGCAGCTGTACAGAGAGCGAATAATATCATTATTA  AAGGACCAATAACTTTTAACTGTGTAAAAAAGGTGAAATTGTTTGATGAT  AAACCAAAAAACCGTAGATTTACACCTGAGGAATTTGAAACTGAGTTACA  AATAGCAAAATGGTTAAAGAGACCCCCAAGATCCTTTGTAAATGATCCTC  CCTTTTACCCATGGTTACCACCTGAACCTGTTGTAAACTTTAAGCTTAAT  TTTACTGAATAAAGGCCAGCATTAATTCACTTAAGGAGTCTGTTTATTTA  AGTTAAACCTTAATAAACGGTCACCGCCTCCCTAATACGCAGGCGCAGAA  AGGGGGCTCCGCCCCCTTTAACCCCCAGGGGGCTCCGCCCCCTGAAACCC  CCAAGGGGGCTACGCCCCCTTACACCCCC (SEQ ID NO: 54)  
註釋：
推定域 鹼基範圍
TATA盒 237- 243
加帽位點 260 - 267
轉錄起始位點 267
5' UTR保守域 323 - 393
ORF2 424 - 723
ORF2/2 424 - 719；2274 - 2589
ORF2/3 424 - 719；2449 - 2812
ORF1 612 - 2612
ORF1/1 612 - 719；2274 - 2612
ORF1/2 612 - 719；2449 - 2589
三個開讀框區 2441 - 2586
多(A)信號 2808 - 2813
富含GC之區域 2868 - 2929
表 B2. 例示性指環病毒胺基酸序列 (β 細環病毒 )
環2 ( β 細環病毒)
ORF2 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEG (SEQ ID NO: 55)
ORF2/2 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEGFNIPYPVTSMKQLRYRVQGKPQNPSYTPSTIDTGTTQQQLCHELAKTGHLKTLFLKLQSQIDSNCSNKPSNACKSRKKRRRKKKKKYSSSSATSDSSSSCTESE (SEQ ID NO: 56)
ORF2/3 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEGARSTATAQTSPRMPANLGRNAGEKRKRSTAAHQQPQTAAAAVQRANNIIIKGPITFNCVKKVKLFDDKPKNRRFTPEEFETELQIAKWLKRPPRSFVNDPPFYPWLPPEPVVNFKLNFTE (SEQ ID NO: 57)
ORF1 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVRPTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNTISIQNRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNPRINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSLKSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAGTMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFKWGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 58)
ORF1/1 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 59)
ORF1/2 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRSQIDSNCSNKPSNACKSRKKRRRKKKKKYSSSSATSDSSSSCTESE (SEQ ID NO: 60)
表 C1. 例示性指環病毒核酸序列 (γ 細環病毒 )
名稱 環4
屬/分枝系 γ 細環病毒
寄存編號   
完整序列：3176 bp
1        10        20        30        40        50|        |         |         |         |         |TAAAATGGCGGGAGCCAATCATTTTATACTTTCACTTTCCAATTAAAAATGGCCACGTCACAAACAAGGGGTGGAGCCATTTAAACTATATAACTAAGTGGGGTGGCGAATGGCTGAGTTTACCCCGCTAGACGGTGCAGGGACCGGATCGAGCGCAGCGAGGAGGTCCCCGGCTGCCCATGGGCGGGAGCCGAGGTGAGTGAAACCACCGAGGTCTAGGGGCAATTCGGGCTAGGGCAGTCTAGCGGAACGGGCAAGAAACTTAAAACAATATTTGTTTTACAGATGGTTAGTATATCCTCAAGTGATTTTTTTAAGAAAACGAAATTTAATGAGGAGACGCAGAACCAAGTATGGATGTCTCAAATTGCTGACTCTCATGATAATATCTGCAGTTGCTGGCATCCATTTGCTCACCTTCTTGCTTCCATATTTCCTCCTGGCCACAAAGATCGTGATCTTACTATTAACCAAATTCTTCTAAGAGATTATAAAGAAAAATGCCATTCTGGTGGAGAAGAAGGAGAAAATTCTGGACCAACAACAGGTTTAATTACACCAAAAGAAGAAGATATAGAAAAAGATGGCCCAGAAGGCGCCGCAGAAGAAGACCATACAGACGCCCTGTTCGCCGCCGCCGTAGAAAACTTCGAAAGGTAAAGAGAAAAAAAAAATCTTTAATTGTTAGACAATGGCAACCAGACAGTATAAGAACTTGTAAAATTATAGGACAGTCAGCTATAGTTGTTGGGGCTGAAGGAAAGCAAATGTACTGTTATACTGTCAATAAGTTAATTAATGTGCCCCCAAAAACACCATATGGGGGAGGCTTTGGAGTAGACCAATACACACTGAAATACTTATATGAAGAATACAGATTTGCACAAAACATTTGGACACAATCTAATGTACTGAAAGACTTATGCAGATACATAAATGTTAAGCTAATATTCTACAGAGACAACAAAACAGACTTTGTCCTTTCCTATGACAGAAACCCACCTTTTCAACTAACAAAATTTACATACCCAGGAGCACACCCACAACAAATCATGCTTCAAAAACACCACAAATTCATACTATCACAAATGACAAAGCCTAATGGAAGACTAACAAAAAAACTCAAAATTAAACCTCCTAAACAAATGCTTTCTAAATGGTTCTTTTCAAAACAATTCTGTAAATACCCTTTACTATCTCTTAAAGCTTCTGCACTAGACCTTAGGCACTCTTACCTAGGCTGCTGTAATGAAAATCCACAGGTATTTTTTTATTATTTAAACCATGGATACTACACAATAACAAACTGGGGAGCACAATCCTCAACAGCATACAGACCTAACTCCAAGGTGACAGACACAACATACTACAGATACAAAAATGACAGAAAAAATATTAACATTAAAAGCCATGAATACGAAAAAAGTATATCATATGAAAACGGTTATTTTCAATCTAGTTTCTTACAAACACAGTGCATATATACCAGTGAGCGTGGTGAAGCCTGTATAGCAGAAAAACCACTAGGAATAGCTATTTACAATCCAGTAAAAGACAATGGAGATGGTAATATGATATACCTTGTAAGCACTCTAGCAAACACTTGGGACCAGCCTCCAAAAGACAGTGCTATTTTAATACAAGGAGTACCCATATGGCTAGGCTTATTTGGATATTTAGACTACTGTAGACAAATTAAAGCTGACAAAACATGGCTAGACAGTCATGTACTAGTAATTCAAAGTCCTGCTATTTTTACTTACCCAAATCCAGGAGCAGGCAAATGGTATTGTCCACTATCACAAAGTTTTATAAATGGCAATGGTCCGTTTAATCAACCACCTACACTGCTACAAAAAGCAAAGTGGTTTCCACAAATACAATACCAACAAGAAATTATTAATAGCTTTGTAGAATCAGGACCATTTGTTCCCAAATATGCAAATCAAACTGAAAGCAACTGGGAACTAAAATATAAATATGTTTTTACATTTAAGTGGGGTGGACCACAATTCCATGAACCAGAAATTGCTGACCCTAGCAAACAAGAGCAGTATGATGTCCCCGATACTTTCTACCAAACAATACAAATTGAAGATCCAGAAGGACAAGACCCCAGATCTCTCATCCATGATTGGGACTACAGACGAGGCTTTATTAAAGAAAGATCTCTTAAAAGAATGTCAACTTACTTCTCAACTCATACAGATCAGCAAGCAACTTCAGAGGAAGACATTCCCAAAAAGAAAAAGAGAATTGGACCCCAACTCACAGTCCCACAACAAAAAGAAGAGGAGACACTGTCATGTCTCCTCTCTCTCTGCAAAAAAGATACCTTCCAAGAAACAGAGACACAAGAAGACCTCCAGCAGCTCATCAAGCAGCAGCAGGAGCAGCAGCTCCTCCTCAAGAGAAACATCCTCCAGCTCATCCACAAACTAAAAGAGAATCAACAAATGCTTCAGCTTCACACAGGCATGTTACCTTAACCAGATTTAAACCTGGATTTGAAGAGCAAACAGAGAGAGAATTAGCAATTATATTTCATAGGCCCCCTAGAACCTACAAAGAGGACCTTCCATTCTATCCCTGGCTACCACCTGCACCCCTTGTACAATTTAACCTTAACTTCAAAGGCTAGGCCAACAATGTACACTTAGTAAAGCATGTTTATTAAAGCACAACCCCCAAAATAAATGTAAAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAAAATTGCAAAAATTCGGCGCTCGCGCGCATGTGCGCCTCTGGCGCAAATCACGCAACGCTCGCGCGCCCGCGTATGTCTCTTTACCACGCACCTAGATTGGGGTGCGCGCGCTAGCGCGCGCACCCCAATGCGCCCCGCCCTCGTTCCGACCCGCTTGCGCGGGTCGGACCACTTCGGGCTCGGGGGGGCGCGCCTGCGGCGCTTTTTTACTAAACAGACTCCGAGCCGCCATTTGGCCCCCTAAGCTCCGCCCCCCTCATGAATATTCATAAAGGAAACCACATAATTAGAATTGCCGACCACAAACTGCCATATGCTAATTAGTTCCCCTTTTACAAAGTAAAAGGGGAAGTGAACATAGCCCCACACCCGCAGGGGCAAGGCCCCGCACCCCTACGTCACTAACCACGCCCCCGCCGCCATCTTGGGTGCGGCAGGGCGGGGGC (SEQ ID NO: 886)  
註釋：
推定域 鹼基範圍
TATA盒 87- 93
加帽位點 110 - 117
轉錄起始位點 117
5' UTR保守域 185 - 254
ORF2 286 - 660
ORF2/2 286 - 656；1998 - 2442
ORF2/3 TAIP 286 - 656；2209 - 2641 385 - 484
ORF1 501 - 2489
ORF1/1 501 - 656；1998 - 2489
ORF1/2 501 - 656；2209 - 2442
三個開讀框區 2209 - 2439
多(A)信號 2672 - 2678
富含GC之區域 3076 - 3176
表 C2. 例示性指環病毒胺基酸序列 (γ 細環病毒 )
環4 ( γ 細環病毒)
ORF2 MVSISSSDFFKKTKFNEETQNQVWMSQIADSHDNICSCWHPFAHLLASIFPPGHKDRDLTINQILLR DYKEKCHSGGEEGENSGPTTGLITPKEEDIEKDGPEGAAEEDHTDALFAAAVENFER (SEQ ID NO: 887)
ORF2/2 MVSISSSDFFKKTKFNEETQNQVWMSQIADSHDNICSCWHPFAHLLASIFPPGHKDRDLTINQILLRDYKEKCHSGGEEGENSGPTTGLITPKEEDIEKDGPEGAAEEDHTDALFAAAVENFESGVDHNSMNQKLLTLANKSSMMSPILSTKQYKLKIQKDKTPDLSSMIGTTDEALLKKDLLKECQLTSQLIQISKQLQRKTFPKRKRELDPNSQSHNKKKRRHCHVSSLSAKKIPSKKQRHKKTSSSSSSSSRSSSSSSRETSSSSSTN (SEQ ID NO: 888)
ORF2/3 MVSISSSDFFKKTKFNEETQNQVWMSQIADSHDNICSCWHPFAHLLASIFPPGHKDRDLTINQILLRDYKEKCHSGGEEGENSGPTTGLITPKEEDIEKDGPEGAAEEDHTDALFAAAVENFERSASNFRGRHSQKEKENWTPTHSPTTKRRGDTVMSPLSLQKRYLPRNRDTRRPPAAHQAAAGAAAPPQEKHPPAHPQTKRESTNASASHRHVTLTRFKPGFEEQTERELAIIFHRPPRTYKEDLPFYPWLPPAPLVQFNLNFKG (SEQ ID NO: 889)
TAIP MRRRRTKYGCLKLLTLMIISAVAGIHLLTFLLPYFLLATKIVILLLTKFF (SEQ ID NO: 890)
ORF1 MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKVKRKKKSLIVRQWQPDSIRTCKIIGQSAIVVGAEGKQMYCYTVNKLINVPPKTPYGGGFGVDQYTLKYLYEEYRFAQNIWTQSNVLKDLCRYINVKLIFYRDNKTDFVLSYDRNPPFQLTKFTYPGAHPQQIMLQKHHKFILSQMTKPNGRLTKKLKIKPPKQMLSKWFFSKQFCKYPLLSLKASALDLRHSYLGCCNENPQVFFYYLNHGYYTITNWGAQSSTAYRPNSKVTDTTYYRYKNDRKNINIKSHEYEKSISYENGYFQSSFLQTQCIYTSERGEACIAEKPLGIAIYNPVKDNGDGNMIYLVSTLANTWDQPPKDSAILIQGVPIWLGLFGYLDYCRQIKADKTWLDSHVLVIQSPAIFTYPNPGAGKWYCPLSQSFINGNGPFNQPPTLLQKAKWFPQIQYQQEIINSFVESGPFVPKYANQTESNWELKYKYVFTFKWGGPQFHEPEIADPSKQEQYDVPDTFYQTIQIEDPEGQDPRSLIHDWDYRRGFIKERSLKRMSTYFSTHTDQQATSEEDIPKKKKRIGPQLTVPQQKEEETLSCLLSLCKKDTFQETETQEDLQQLIKQQQEQQLLLKRNILQLIHKLKENQQMLQLHTGMLP (SEQ ID NO: 891)
ORF1/1 MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKWGGPQFHEPEIADPSKQEQYDVPDTFYQTIQIEDPEGQDPRSLIHDWDYRRGFIKERSLKRMSTYFSTHTDQQATSEEDIPKKKKRIGPQLTVPQQKEEETLSCLLSLCKKDTFQETETQEDLQQLIKQQQEQQLLLKRNILQLIHKLKENQQMLQLHTGMLP (SEQ ID NO: 892)
ORF1/2 MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKISKQLQRKTFPKRKR ELDPNSQSHNKKKRRHCHVSSLSAKKIPSKKQRHKKTSSSSSSSSRSSSSSSRETSSSSSTN (SEQ ID NO: 893)
在一些實施例中，指環載體包含核酸，其包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US2018/037379號中所列之序列。在一些實施例中，指環載體包含多肽，其包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US2018/037379號中所列之序列。在一些實施例中，指環載體包含核酸，其包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US19/65995號中所列之序列。在一些實施例中，指環載體包含多肽，其包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US19/65995號中所列之序列。 ORF1 分子
在一些實施例中，指環載體包含ORF1分子及/或編碼ORF1分子之核酸。一般而言，ORF1分子包含具有指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF1分子包含相對於指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)的截短。ORF1分子可能能夠結合至其他ORF1分子，例如以形成蛋白質外部(例如如本文所述)，例如衣殼。在一些實施例中，蛋白質外部可圍封核酸分子(例如，如本文所述之遺傳元件)。在一些實施例中，複數個ORF1分子可形成多聚體，例如以形成蛋白質外部。在一些實施例中，多聚體可為均多聚體。在其他實施例中，多聚體可為雜多聚體。
在一些實施例中，ORF1分子可包含以下中之一或多者：包含富含精胺酸之區域的第一區域，例如具有至少60%鹼性殘基(例如至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%鹼性殘基；例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70-80%鹼性殘基)之區域，及包含凝膠捲域之第二區域，例如至少六個β股(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12個β股)。 富含精胺酸之區域
富含精胺酸之區域與本文所述之富含精胺酸之區域序列或包含至少60%、70%或80%鹼性殘基(例如精胺酸、離胺酸或其組合)之至少約40個胺基酸的序列具有至少70% (例如至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性。 凝膠捲域
凝膠捲域或區包含多肽(例如包含於較大多肽中之域或區) (例如由其組成)，該多肽包含以下特徵中之一或多者(例如1、2或3者)： (i)凝膠捲域之胺基酸中之至少30% (例如至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%或更多)為一或多個β片之一部分； (ii)凝膠捲域之二級結構包含至少四個(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個) β股；及/或 (iii)凝膠捲域之三級結構包含至少兩個(例如至少2、3或4個) β片；及/或 (iv)凝膠捲域包含至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1之β片與α螺旋之比。
在某些實施例中，凝膠捲域包含兩個β片。
在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含約八個(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12個) β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含八個β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含七個β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含六個β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含五個β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含四個β股。
在一些實施例中，凝膠捲域包含與第二β片呈反平行定向之第一β片。在某些實施例中，第一β片包含約四個(例如3、4、5或6個) β股。在某些實施例中，第二β片包含約四個(例如3、4、5或6個) β股。在實施例中，第一及第二β片總共包含約八個(例如6、7、8、9、10、11或12個) β股。
在某些實施例中，凝膠捲域為衣殼蛋白(例如如本文所述之ORF1分子)之組分。在某些實施例中，凝膠捲域具有自組裝活性。在一些實施例中，包含凝膠捲域之多肽結合至包含凝膠捲域之多肽的另一複本。在一些實施例中，第一多肽之凝膠捲域結合至該多肽之第二複本之凝膠捲域。 N22 域
ORF1分子亦可包括包含指環病毒N22域(例如如本文所述，例如來自如本文所述之指環病毒ORF1蛋白的N22域)之結構或活性的第三區域，及/或包含指環病毒C端域(CTD) (例如如本文所述，例如來自如本文所述之指環病毒ORF1蛋白的CTD)之結構或活性的第四區域。在一些實施例中，ORF1分子以N端至C端次序包含第一、第二、第三及第四區域。 高變區 ( HVR )
在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含高變區(HVR)，例如來自指環病毒ORF1蛋白之HVR，例如如本文所述。在一些實施例中，HVR位於第二區域與第三區域之間。在一些實施例中，HVR包含至少約55個(例如至少約45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或65個)胺基酸(例如約45-160、50-160、55-160、60-160、45-150、50-150、55-150、60-150、45-140、50-140、55-140或60-140個胺基酸)。 例示性 ORF1 序列
例示性指環病毒ORF1胺基酸序列及例示性ORF1域之序列提供於下表中。在一些實施例中，本文所述之多肽(例如ORF1分子)包含與一或多個指環病毒ORF1子序列(例如如表N-Z中之任一者中所述)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所述之指環載體包含ORF1分子，其包含與一或多個指環病毒ORF1子序列(例如如表N-Z中之任一者中所述)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所述之指環載體包含編碼ORF1分子之核酸分子(例如遺傳元件)，該ORF1分子包含與一或多個指環病毒ORF1子序列(例如如表N-Z中之任一者中所述)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，一或多個指環病毒ORF1子序列包含以下中之一或多者：富含精胺酸(Arg)之域、凝膠捲域、高變區(HVR)、N22域或C端域(CTD) (例如如表N-Z中之任一者中所列)，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，ORF1分子包含來自不同指環病毒之複數個子序列(例如選自表N-Z中所列之α細環病毒分枝系1-7子序列的ORF1子序列之任何組合)。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、凝膠捲域、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種之HVR。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：凝膠捲域、HVR、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種之富含Arg之域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、HVR、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種之凝膠捲域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、凝膠捲域、HVR及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種之N22域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、凝膠捲域、HVR及來自一種指環病毒之N22域及來自另一種之CTD。
ORF1分子或其剪接變異體或功能片段可用於本文所述之組合物及方法中(例如以形成指環載體之蛋白質外部，例如藉由圍封遺傳元件)的其他例示性指環病毒描述於例如PCT申請案第PCT/US2018/037379號及第PCT/US19/65995號(以全文引用之方式併入本文中)中。 表 N. 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 (α 細環病毒，分枝系 3)
名稱 環1
屬/分枝系 α細環病毒，分枝系3
寄存編號 AJ620231.1
蛋白質寄存編號 CAF05750.1
完整序列：743 AA    1        10        20        30        40        50 |        |         |         |         |         | MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGR RKTRTYRRRRRFRRRGRKAKLIIKLWQPAVIKRCRIKGYIPLIISGNGTF ATNFTSHINDRIMKGPFGGGHSTMRFSLYILFEEHLRHMNFWTRSNDNLE LTRYLGASVKIYRHPDQDFIVIYNRRTPLGGNIYTAPSLHPGNAILAKHK ILVPSLQTRPKGRKAIRLRIAPPTLFTDKWYFQKDIADLTLFNIMAVEAD LRFPFCSPQTDNTCISFQVLSSVYNNYLSINTFNNDNSDSKLKEFLNKAF PTTGTKGTSLNALNTFRTEGCISHPQLKKPNPQINKPLESQYFAPLDALW GDPIYYNDLNENKSLNDIIEKILIKNMITYHAKLREFPNSYQGNKAFCHL TGIYSPPYLNQGRISPEIFGLYTEIIYNPYTDKGTGNKVWMDPLTKENNI YKEGQSKCLLTDMPLWTLLFGYTDWCKKDTNNWDLPLNYRLVLICPYTFP KLYNEKVKDYGYIPYSYKFGAGQMPDGSNYIPFQFRAKWYPTVLHQQQVM EDISRSGPFAPKVEKPSTQLVMKYCFNFNWGGNPIIEQIVKDPSFQPTYE IPGTGNIPRRIQVIDPRVLGPHYSFRSWDMRRHTFSRASIKRVSEQQETS DLVFSGPKKPRVDIPKQETQEESSHSLQRESRPWETEEESETEALSQESQ              EVPFQQQLQQQYQEQLKLRQGIKVLFEQLIRTQQGVHVNPCLR              (SEQ ID NO: 185)
  
註釋：
推定域 AA 範圍
富含Arg之區域 1 - 68
凝膠捲域 69 - 280
高變區 281 - 413
N22 414 - 579
C端域 580 - 743
表 O. 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 (α 細環病毒，分枝系 3)
環1 ORF1 (α細環病毒分枝系3)
富含Arg之區域 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGRRKTRTYRRRRRFRRRGRK (SEQ ID NO: 186)
凝膠捲域 AKLIIKLWQPAVIKRCRIKGYIPLIISGNGTFATNFTSHINDRIMKGPFGGGHSTMRFSLYILFEEHLRHMNFWTRSNDNLELTRYLGASVKIYRHPDQDFIVIYNRRTPLGGNIYTAPSLHPGNAILAKHKILVPSLQTRPKGRKAIRLRIAPPTLFTDKWYFQKDIADLTLFNIMAVEADLRFPFCSPQTDNTCISFQVLSSVYNNYLSI (SEQ ID NO: 187)
高變區 NTFNNDNSDSKLKEFLNKAFPTTGTKGTSLNALNTFRTEGCISHPQLKKPNPQINKPLESQYFAPLDALWGDPIYYNDLNENKSLNDIIEKILIKNMITYHAKLREFPNSYQGNKAFCHLTGIYSPPYLNQGR (SEQ ID NO: 188)
N22 ISPEIFGLYTEIIYNPYTDKGTGNKVWMDPLTKENNIYKEGQSKCLLTDMPLWTLLFGYTDWCKKDTNNWDLPLNYRLVLICPYTFPKLYNEKVKDYGYIPYSYKFGAGQMPDGSNYIPFQFRAKWYPTVLHQQQVMEDISRSGPFAPKVEKPSTQLVMKYCFNFN (SEQ ID NO: 189)
C端域 WGGNPIIEQIVKDPSFQPTYEIPGTGNIPRRIQVIDPRVLGPHYSFRSWDMRRHTFSRASIKRVSEQQETSDLVFSGPKKPRVDIPKQETQEESSHSLQRESRPWETEEESETEALSQESQEVPFQQQLQQQYQEQLKLRQGIKVLFEQLIRTQQGVHVNPCLR (SEQ ID NO: 190)
表 P. 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 (β 細環病毒 )
名稱 環2
屬/分枝系 β 細環病毒
寄存編號 JX134045.1
蛋白質寄存編號 AGG91484.1
完整序列：666 AA    1        10        20        30        40        50 |        |         |         |         |         | MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVRPTYTTIPLKQWQ PPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSML TLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTE LPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQF ENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNTISIQ NRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNP RINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSL KSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAGTMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGED TQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNID TNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQV QYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFKWGGSPPKAINVEN PAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQ DWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQ              QQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 215)   
  
註釋：
推定域 AA 範圍
富含Arg之區域 1 - 38
凝膠捲域 39 - 246
高變區 247 - 374
N22 375 - 537
C端域 538 - 666
表 Q. 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 (β 細環病毒 )
環2 ORF1 ( β 細環病毒)
富含Arg之區域 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR (SEQ ID NO: 216)
凝膠捲域 PTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNT (SEQ ID NO: 217)
高變區 ISIQNRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNPRINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSLKSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAG (SEQ ID NO: 218)
N22 TMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFK (SEQ ID NO: 219)
C端域 WGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 220)
表 R. 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 (γ 細環病毒 )
名稱 環4
屬/分枝系 γ 細環病毒
寄存編號   
蛋白質寄存編號      
完整序列：662 AA    1        10        20        30        40        50|        |         |         |         |         |MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKVKRKKKSLIVRQWQPDSIRTCKIIGQSAIVVGAEGKQMYCYTVNKLINVPPKTPYGGGFGVDQYTLKYLYEEYRFAQNIWTQSNVLKDLCRYINVKLIFYRDNKTDFVLSYDRNPPFQLTKFTYPGAHPQQIMLQKHHKFILSQMTKPNGRLTKKLKIKPPKQMLSKWFFSKQFCKYPLLSLKASALDLRHSYLGCCNENPQVFFYYLNHGYYTITNWGAQSSTAYRPNSKVTDTTYYRYKNDRKNINIKSHEYEKSISYENGYFQSSFLQTQCIYTSERGEACIAEKPLGIAIYNPVKDNGDGNMIYLVSTLANTWDQPPKDSAILIQGVPIWLGLFGYLDYCRQIKADKTWLDSHVLVIQSPAIFTYPNPGAGKWYCPLSQSFINGNGPFNQPPTLLQKAKWFPQIQYQQEIINSFVESGPFVPKYANQTESNWELKYKYVFTFKWGGPQFHEPEIADPSKQEQYDVPDTFYQTIQIEDPEGQDPRSLIHDWDYRRGFIKERSLKRMSTYFSTHTDQQATSEEDIPKKKKRIGPQLTVPQQKEEETLSCLLSLCKKDTFQETETQEDLQQLIKQQQEQQLLLKRNILQLIHKLKENQQMLQLHTGMLP (SEQ ID NO: 925)   
  
註釋：
推定域 AA 範圍
富含Arg之區域 1 - 58
凝膠捲域 59 - 260
高變區 261 - 339
N22 340 - 499
C端域 500 - 662
表 S. 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 (γ 細環病毒 )
環4 ( γ 細環病毒)
富含Arg之區域 MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKVKRKKK (SEQ ID NO: 926)
凝膠捲域 SLIVRQWQPDSIRTCKIIGQSAIVVGAEGKQMYCYTVNKLINVPPKTPYGGGFGVDQYTLKYLYEEYRFAQNIWTQSNVLKDLCRYINVKLIFYRDNKTDFVLSYDRNPPFQLTKFTYPGAHPQQIMLQKHHKFILSQMTKPNGRLTKKLKIKPPKQMLSKWFFSKQFCKYPLLSLKASALDLRHSYLGCCNENPQVFFYYL (SEQ ID NO: 927)
高變區 NHGYYTITNWGAQSSTAYRPNSKVTDTTYYRYKNDRKNINIKSHEYEKSISYENGYFQSSFLQTQCIYTSERGEACIAE (SEQ ID NO: 928)
N22 KPLGIAIYNPVKDNGDGNMIYLVSTLANTWDQPPKDSAILIQGVPIWLGLFGYLDYCRQIKADKTWLDSHVLVIQSPAIFTYPNPGAGKWYCPLSQSFINGNGPFNQPPTLLQKAKWFPQIQYQQEIINSFVESGPFVPKYANQTESNWELKYKYVFTFK (SEQ ID NO: 929)
C端域 WGGPQFHEPEIADPSKQEQYDVPDTFYQTIQIEDPEGQDPRSLIHDWDYRRGFIKERSLKRMSTYFSTHTDQQATSEEDIPKKKKRIGPQLTVPQQKEEETLSCLLSLCKKDTFQETETQEDLQQLIKQQQEQQLLLKRNILQLIHKLKENQQMLQLHTGMLP (SEQ ID NO: 930)
在一些實施例中，第一區域可結合至核酸分子(例如DNA)。在一些實施例中，鹼性殘基係選自精胺酸、組胺酸或離胺酸或其組合。在一些實施例中，第一區域包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%精胺酸殘基(例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70%-80%精胺酸殘基)。在一些實施例中，第一區域包含約30-120個胺基酸(例如約40-120、40-100、40-90、40-80、40-70、50-100、50-90、50-80、50-70、60-100、60-90或60-80個胺基酸)。在一些實施例中，第一區域包含病毒ORF1富含精胺酸之區域(例如來自指環病毒ORF1蛋白之富含精胺酸之區域，例如如本文所述)的結構或活性。在一些實施例中，第一區域包含核定位信號。
在一些實施例中，第二區域包含凝膠捲域，例如病毒ORF1凝膠捲域(例如來自指環病毒ORF1蛋白之凝膠捲域，例如如本文所述)之結構或活性。在一些實施例中，第二區域能夠結合至另一ORF1分子之第二區域，例如以形成蛋白質外部(例如衣殼)或其一部分。
在一些實施例中，第四區域暴露於蛋白質外部(例如包含ORF1分子之多聚體的蛋白質外部，例如如本文所述)之表面上。
在一些實施例中，第一區域、第二區域、第三區域、第四區域及/或HVR各自包含少於四個(例如0、1、2或3個) β片。
在一些實施例中，第一區域、第二區域、第三區域、第四區域及/或HVR中之一或多者可由異源胺基酸序列(例如來自異源ORF1分子之對應區域)替換。在一些實施例中，異源胺基酸序列具有所需功能性，例如如本文所述。
在一些實施例中，ORF1分子包含複數個保守模體(例如，包含約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個胺基酸的模體) (例如，如PCT/US19/65995之圖34中所示)。在一些實施例中，保守模體可與一或多種野生型指環病毒分枝系(例如α細環病毒，分枝系1；α細環病毒，分枝系2；α細環病毒，分枝系3；α細環病毒，分枝系4；α細環病毒，分枝系5；α細環病毒，分枝系6；α細環病毒，分枝系7；β細環病毒；及/或γ細環病毒)之ORF1蛋白展示60、70、80、85、90、95或100%序列一致性。在實施例中，保守模體之長度各為1-1000個(例如5-10、5-15、5-20、10-15、10-20、15-20、5-50、5-100、10-50、10-100、10-1000、50-100、50-1000或100-1000個)胺基酸。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約2-4% (例如約1-8%、1-6%、1-5%、1-4%、2-8%、2-6%、2-5%或2-4%)組成，且各自與野生型指環病毒分枝系之ORF1蛋白中之對應模體展示100%序列一致性。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約5-10% (例如約1-20%、1-10%、5-20%或5-10%)組成，且各自與野生型指環病毒分枝系之ORF1蛋白中之對應模體展示80%序列一致性。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約10-50% (例如約10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、20-40%、20-50%或30-50%)組成，且各自與野生型指環病毒分枝系之ORF1蛋白中之對應模體展示60%序列一致性。在一些實施例中，保守模體包含一或多個如表19中所列之胺基酸序列。
在一些實施例中，相對於野生型ORF1蛋白，ORF1分子或編碼其之核酸分子包含至少一個差異(例如突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如如本文所述。 N22 域中之保守 ORF1 模體
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如ORF1分子)包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。舉例而言，X 2指示任何兩個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)包含於ORF1分子之N22域內，例如如本文所述。在一些實施例中，本文所述之遺傳元件包含編碼胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)之核酸序列(例如編碼ORF1分子之核酸序列，例如如本文所述)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。
在一些實施例中，多肽(例如ORF1分子)包含保守二級結構，例如側接及/或包含YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之一部分，例如在N22域中。在一些實施例中，保守二級結構包含第一β股及/或第二β股。在一些實施例中，第一β股之長度為約5-6個(例如3、4、5、6、7或8個)胺基酸。在一些實施例中，第一β股在YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之N端包含酪胺酸(Y)殘基。在一些實施例中，YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體包含無規捲曲(例如約8-9個胺基酸之無規捲曲)。在一些實施例中，第二β股之長度為約7-8個(例如5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二β股在YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之C端包含天冬醯胺(N)殘基。
例示性YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體側接二級結構描述於PCT/US19/65995之實例47及圖48中；該案以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，ORF1分子含有包含PCT/US19/65995之圖48中所示之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如β股)的區域。在一些實施例中，ORF1分子含有包含PCT/US19/65995之圖48中所示之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如β股)的區域，側接YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體(例如如本文所述)。 ORF1 凝膠捲域中之保守二級結構模體
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如ORF1分子)包含指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述)所包含之一或多個二級結構元件。在一些實施例中，ORF1分子包含指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述)之凝膠捲域所包含之一或多個二級結構元件。通常，ORF1凝膠捲域包含二級結構，該二級結構按N端至C端方向之次序包含第一β股、第二β股、第一α螺旋、第三β股、第四β股、第五β股、第二α螺旋、第六β股、第七β股、第八β股及第九β股。在一些實施例中，ORF1分子包含二級結構，該二級結構按N端至C端方向之次序包含第一β股、第二β股、第一α螺旋、第三β股、第四β股、第五β股、第二α螺旋、第六β股、第七β股、第八β股及/或第九β股。
在一些實施例中，一對保守二級結構元件(亦即β股及/或α螺旋)由間隙胺基酸序列分隔開，例如包含無規捲曲序列、β股或α螺旋或其組合。保守二級結構元件之間的胺基酸序列可包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個胺基酸。在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含一或多個額外β股及/或α螺旋(例如在凝膠捲域中)。在一些實施例中，可組合連續β股或連續α螺旋。在一些實施例中，第一β股及第二β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第三β股及第四β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第四β股及第五β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第六β股及第七β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第七β股及第八β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第八β股及第九β股包含於較大β股中。
在一些實施例中，第一β股之長度為約5-7個(例如3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二β股之長度為約15-16個(例如13、14、15、16、17、18或19個)胺基酸。在一些實施例中，第一α螺旋之長度為約15-17個(例如13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸。在一些實施例中，第三β股之長度為約3-4個(例如1、2、3、4、5或6個)胺基酸。在一些實施例中，第四β股之長度為約10-11個(例如8、9、10、11、12或13個)胺基酸。在一些實施例中，第五β股之長度為約6至7個(例如4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二α螺旋之長度為約8-14個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個)胺基酸。在一些實施例中，第二α螺旋可分解為兩個較小α螺旋(例如由無規捲曲序列分隔開)。在一些實施例中，兩個較小α螺旋中之每一者之長度為約4-6個(例如2、3、4、5、6、7或8個)胺基酸。在一些實施例中，第六β股之長度為約4-5個(例如，2、3、4、5、6或7個)胺基酸。在一些實施例中，第七β股之長度為約5-6個(例如3、4、5、6、7、8或9個)胺基酸。在一些實施例中，第八β股之長度為約7-9個(例如5、6、7、8、9、10、11、12或13個)胺基酸。在一些實施例中，第九β股之長度為約5-7個(例如，3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。
例示性凝膠捲域二級結構描述於PCT/US19/65995之實例47及圖47中。在一些實施例中，ORF1分子含有包含PCT/US19/65995之圖47中所示之任一凝膠捲域二級結構之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如β股及/或α螺旋)的區域。 共同 ORF1 域序列
在一些實施例中，例如如本文所述之ORF1分子包含凝膠捲域、N22域及/或C端域(CTD)中之一或多者。在一些實施例中，凝膠捲域包含具有如本文所述(例如如表37A-37C中之任一者中所列)之凝膠捲域共同序列的胺基酸序列。在一些實施例中，N22域包含具有如本文所述(例如如表37A-37C中之任一者中所列)之N22域共同序列的胺基酸序列。在一些實施例中，CTD域包含具有如本文所述(例如如表37A-37C中之任一者中所列)之CTD域共同序列的胺基酸序列。在一些實施例中，呈型式「(X a-b )」的表37A-37C中之任一者中所列之胺基酸包含一系列連續胺基酸，其中該系列包含至少 a個且至多 b個胺基酸。在某些實施例中，該系列中之所有胺基酸均相同。在其他實施例中，該系列包含至少兩個(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個)不同胺基酸。 表 37A. α 細環病毒 ORF1 域共同序列
域 序列 SEQ ID NO:
凝膠捲 LVLTQWQPNTVRRCYIRGYLPLIICGEN(X 0‑3)TTSRNYATHSDDTIQKGPFGGGMSTTTFSLRVLYDEYQRFMNRWTYSNEDLDLARYLGCKFTFYRHPDXDFIVQYNTNPPFKDTKLTAPSIHP(X 1‑5)GMLMLSKRKILIPSLKTRPKGKHYVKVRIGPPKLFEDKWYTQSDLCDVPLVXLYATAADLQHPFGSPQTDNPCVTFQVLGSXYNKHLSISP;    其中X=任何胺基酸。 227
N22 SNFEFPGAYTDITYNPLTDKGVGNMVWIQYLTKPDTIXDKTQS(X 0‑3)KCLIEDLPLWAALYGYVDFCEKETGDSAIIXNXGRVLIRCPYTKPPLYDKT(X 0‑4)NKGFVPYSTNFGNGKMPGGSGYVPIYWRARWYPTLFHQKEVLEDIVQSGPFAYKDEKPSTQLVMKYCFNFN;    其中X=任何胺基酸。 228
CTD WGGNPISQQVVRNPCKDSG(X 0‑3)SGXGRQPRSVQVVDPKYMGPEYTFHSWDWRRGLFGEKAIKRMSEQPTDDEIFTGGXPKRPRRDPPTXQXPEE(X 1‑4)QKESSSFR(X 2‑14)PWESSSQEXESESQEEEE(X 0‑30)EQTVQQQLRQQLREQRRLRVQLQLLFQQLLKT(X 0-4)QAGLHINPLLLSQA(X 0-40)*;    其中X=任何胺基酸。 229
表 37B. β 細環病毒 ORF1 域共同序列
域 序列 SEQ ID NO:
凝膠捲 LKQWQPSTIRKCKIKGYLPLFQCGKGRISNNYTQYKESIVPHHEPGGGGWSIQQFTLGALYEEHLKLRNWWTKSNDGLPLVRYLGCTIKLYRSEDTDYIVTYQRCYPMTATKLTYLSTQPSRMLMNKHKIIVPSKXT(X 1‑4)NKKKKPYKKIFIKPPSQMQNKWYFQQDIANTPLLQLTXTACSLDRMYLSSDSISNNITFTSLNTNFFQNPNFQ;    其中X=任何胺基酸。 230
N22 (X 4‑10)TPLYFECRYNPFKDKGTGNKVYLVSNN(X 1‑8)TGWDPPTDPDLIIEGFPLWLLLWGWLDWQKKLGKIQNIDTDYILVIQSXYYIPP(X 1‑3)KLPYYVPLDXD(X 0‑2)FLHGRSPY(X 3‑16)PSDKQHWHPKVRFQXETINNIALTGPGTPKLPNQKSIQAHMKYKFYFK;    其中X=任何胺基酸。 231
CTD WGGCPAPMETITDPCKQPKYPIPNNLLQTTSLQXPTTPIETYLYKFDERRGLLTKKAAKRIKKDXTTETTLFTDTGXXTSTTLPTXXQTETTQEEXTSEEE(X 0‑5)ETLLQQLQQLRRKQKQLRXRILQLLQLLXLL(X 0-26)*;    其中X=任何胺基酸。 232
表 37C. γ 細環病毒 ORF1 域共同序列
域 序列 SEQ ID NO:
凝膠捲 TIPLKQWQPESIRKCKIKGYGTLVLGAEGRQFYCYTNEKDEYTPPKAPGGGGFGVELFSLEYLYEQWKARNNIWTKSNXYKDLCRYTGCKITFYRHPTTDFIVXYSRQPPFEIDKXTYMXXHPQXLLLRKHKKIILSKATNPKGKLKKKIKIKPPKQMLNKWFFQKQFAXYGLVQLQAAACBLRYPRLGCCNENRLITLYYLN;    其中X=任何胺基酸。 233
N22 LPIVVARYNPAXDTGKGNKXWLXSTLNGSXWAPPTTDKDLIIEGLPLWLALYGYWSYJKKVKKDKGILQSHMFVVKSPAIQPLXTATTQXTFYPXIDNSFIQGKXPYDEPJTXNQKKLWYPTLEHQQETINAIVESGPYVPKLDNQKNSTWELXYXYTFYFK;    其中X=任何胺基酸。 234
CTD WGGPQIPDQPVEDPKXQGTYPVPDTXQQTIQIXNPLKQKPETMFHDWDYRRGIITSTALKRMQENLETDSSFXSDSEETP(X 0‑2)KKKKRLTXELPXPQEETEEIQSCLLSLCEESTCQEE(X 1‑6)ENLQQLIHQQQQQQQQLKHNILKLLSDLKZKQRLLQLQTGILE(X 1-10)*;    其中X=任何胺基酸。 235
在一些實施例中，凝膠捲域包含如表21、23、25、27、29、31、33、35、D2、D4、D6、D8、D10或37A-37C中之任一者中所列之凝膠捲域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，N22域包含如表21、23、25、27、29、31、33、35、D2、D4、D6、D8、D10或37A-37C中之任一者中所列之N22域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CTD域包含如表21、23、25、27、29、31、33、35、D2、D4、D6、D8、D10或37A-37C中之任一者中所列之CTD域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。 鑑定 ORF1 蛋白序列
在一些實施例中，可自指環病毒之基因體(例如鑑定之推定指環病毒基因體，例如藉由核酸定序技術，例如深度定序技術)鑑定指環病毒ORF1蛋白序列或編碼ORF1蛋白之核酸序列。在一些實施例中，ORF1蛋白序列係藉由以下選擇標準中之一或多者(例如1、2或全部3者)鑑定： (i) 長度選擇 ：蛋白質序列(例如符合以下(ii)或(iii)中所述之準則的推定指環病毒ORF1序列)可對於大於約600個胺基酸殘基之彼等進行大小選擇，以鑑定推定指環病毒ORF1蛋白。在一些實施例中，指環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約600、650、700、750、800、850、900、950或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，α細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，β細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約650、660、670、680、690、700、750、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，γ細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約650、660、670、680、690、700、750、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，編碼指環病毒ORF1蛋白之核酸序列的長度為至少約1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500個核苷酸。在一些實施例中，編碼α細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500個核苷酸。在一些實施例中，編碼β細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約1900、1950、2000、2500、2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500或1000個核苷酸。在一些實施例中，編碼γ細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約1900、1950、2000、2500、2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500或1000個核苷酸。 (ii) ORF1 模體之存在 ：蛋白質序列(例如符合以上(i)或以下(iii)中所述之準則的推定指環病毒ORF1序列)可經過濾以鑑定在上文所述之N22域中含有保守ORF1模體之彼等。在一些實施例中，推定指環病毒ORF1序列包含序列YNPXXDXGXXN。在一些實施例中，推定指環病毒ORF1序列包含序列Y[NCS]P XXD X[GASKR] XX[NTSVAK]。 (iii) 富含 精胺酸之區域之存在 ：蛋白質序列(例如符合以上(i)及/或(ii)中所述之準則的推定指環病毒ORF1序列)可對於包括富含精胺酸之區域(例如如本文所述)之彼等進行過濾。在一些實施例中，推定指環病毒ORF1序列包含至少約30、35、40、45、50、55、60、65或70個胺基酸之連續序列，其包含至少30% (例如至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)精胺酸殘基。在一些實施例中，推定指環病毒ORF1序列包含約35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65或65-70個胺基酸之連續序列，其包含至少30% (例如至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)精胺酸殘基。在一些實施例中，富含精胺酸之區域位於推定指環病毒ORF1蛋白之起始密碼子下游至少約30、40、50、60、70或80個胺基酸處。在一些實施例中，富含精胺酸之區域位於推定指環病毒ORF1蛋白之起始密碼子下游至少約50個胺基酸處。 ORF2 分子
在一些實施例中，指環載體包含ORF2分子及/或編碼ORF2分子之核酸。一般而言，ORF2分子包含具有指環病毒ORF2蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF2蛋白，例如如表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16或18中之任一者中所列)或其功能片段之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF2分子包含與表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1C5、2、4、6、8、10、12、14、16或18中之任一者中所示之指環病毒ORF2蛋白序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，ORF2分子包含與α細環病毒、β細環病毒或γ細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2分子(例如與α細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為250個或更少胺基酸(例如約150-200個胺基酸)。在一些實施例中，ORF2分子(例如與β細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為約50-150個胺基酸。在一些實施例中，ORF2分子(例如與γ細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為約100-200個胺基酸(例如約100-150個胺基酸)。在一些實施例中，ORF2分子包含螺旋-轉角-螺旋模體(例如包含兩個側接轉角區之α螺旋的螺旋-轉角-螺旋模體)。在一些實施例中，ORF2分子不包含TTV分離株TA278或TTV分離株SANBAN之ORF2蛋白的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2分子具有蛋白質磷酸酶活性。在一些實施例中，相對於野生型ORF2蛋白，例如如本文所述(例如如表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16或18中之任一者中所示)，ORF2分子或編碼其之核酸分子包含至少一個差異(例如突變、化學修飾或表觀遺傳改變)。 保守 ORF2 模體
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如ORF2分子)包含胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。在實施例中，X 7指示任何七個胺基酸之連續序列。在實施例中，X 3指示任何三個胺基酸之連續序列。在實施例中，X 1指示任何單一胺基酸。在實施例中，X 5指示任何五個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，[W/F]可為色胺酸或苯丙胺酸。在一些實施例中，[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)包含於ORF2分子之N22域內，例如如本文所述。在一些實施例中，本文所述之遺傳元件包含編碼胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)之核酸序列(例如編碼ORF2分子之核酸序列，例如如本文所述)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。 遺傳元件
在一些實施例中，指環載體包含遺傳元件。在一些實施例中，遺傳元件具有以下特徵中之一或多者：與宿主細胞之基因體基本上不整合，為游離型核酸，為單股DNA，為環狀，為約1至10 kb，存在於細胞核內，可與內源性蛋白結合，產生靶向宿主或目標細胞之基因、活性或功能的效應子，諸如多肽或核酸(例如RNA、iRNA、微小RNA)。在一個實施例中，遺傳元件為基本上非整合DNA。在一些實施例中，遺傳元件包含封裝信號，例如結合衣殼蛋白之序列。在一些實施例中，在封裝或衣殼結合序列之外，遺傳元件與野生型指環病毒核酸序列具有小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%序列一致性，例如與指環病毒核酸序列(例如如本文所述)具有小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%序列一致性。在一些實施例中，在封裝或衣殼結合序列之外，遺傳元件具有小於500、450、400、350、300、250、200、150或100個連續核苷酸，該等連續核苷酸與指環病毒核酸序列至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在某些實施例中，遺傳元件為環狀單股DNA，其包含啟動子序列、編碼治療效應子之序列及衣殼結合蛋白。
在一些實施例中，遺傳元件之長度為小於20 kb (例如小於約19 kb、18 kb、17kb、16kb、15kb、14kb、13kb、12kb、11kb、10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb或更小)。在一些實施例中，遺傳元件之長度獨立地或另外為大於1000b (例如至少約1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.5-4.6、2.8-4.0、3.0-3.8或3.2-3.7 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約1.5-2.0、1.5-2.5、1.5-3.0、1.5-3.5、1.5-3.8、1.5-3.9、1.5-4.0、1.5-4.5或1.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.0-2.5、2.0-3.0、2.0-3.5、2.0-3.8、2.0-3.9、2.0-4.0、2.0-4.5或2.0-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.5-3.0、2.5-3.5、2.5-3.8、2.5-3.9、2.5-4.0、2.5-4.5或2.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約3.0-5.0、3.5-5.0、4.0-5.0或4.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.1-3.6、3.2-3.7、3.3-3.8、3.4-3.9、3.5-4.0、4.0-4.5或4.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約3.6-3.9 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.8-2.9 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.0-3.2 kb。
在一些實施例中，遺傳元件包含本文所述之特徵中之一或多者，例如編碼基本上非致病性蛋白之序列、蛋白結合序列、編碼調節核酸之一或多個序列、一或多個調節序列、編碼複製蛋白之一或多個序列及其他序列。
在實施例中，遺傳元件由雙股環狀DNA產生(例如由活體外環化產生)。在一些實施例中，遺傳元件藉由自雙股環狀DNA滾環複製而產生。在實施例中，滾環複製發生在細胞(例如宿主細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞，例如HEK293T細胞、A549細胞或Jurkat細胞)中。在實施例中，遺傳元件可藉由細胞中之滾環複製以指數方式擴增。在實施例中，遺傳元件可藉由在細胞中滾動環複製以線性方式擴增。在實施例中，雙股環狀DNA或遺傳元件能夠藉由細胞中之滾環複製產生原始量的至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、518倍、1024倍或更多倍。在實施例中，將雙股環狀DNA引入至細胞中，例如如本文所述。
在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含一或多個細菌質體元件(例如細菌複製起點或可選標記，例如細菌抗性基因)。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含細菌質體主鏈。
在一個實施例中，本發明包括一種遺傳元件，其包含編碼以下各者之核酸序列(例如DNA序列)：(i)基本上非致病性外部蛋白質；(ii)將遺傳元件結合至基本上非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列；及(iii)調節核酸。在此類實施例中，遺傳元件可包含一或多個與天然病毒序列(例如天然指環病毒序列，例如如本文所述)之核苷酸序列中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。 蛋白質結合序列
許多病毒採用之策略為病毒衣殼蛋白識別其基因體中之特異性蛋白質結合序列。舉例而言，在具有未分段基因體之病毒(諸如酵母之L-A病毒)中，在基因體之5'端處存在二級結構(莖-環)及特定序列，兩者均用於結合病毒衣殼蛋白。然而，具有分段基因體之病毒，諸如呼腸孤病毒科( Reoviridae)、正黏液病毒科( Orthomyxoviridae) (流感)、崩芽病毒( Bunyaviruses)及沙粒狀病毒( Arenaviruses)需要封裝基因體區段中之每一者。一些病毒利用區段之互補區域以幫助病毒包括各基因體分子中之一者。其他病毒對不同區段中之每一者具有特異性結合位點。參見例如Curr Opin Struct Biol. 2010 Feb; 20(1): 114-120；及Journal of Virology (2003), 77(24), 13036-13041。
在一些實施例中，遺傳元件編碼結合至基本上非致病性蛋白質之蛋白質結合序列。在一些實施例中，蛋白質結合序列有助於將遺傳元件封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，蛋白質結合序列特異性結合基本上非致病性蛋白質之富含精胺酸之區域。在一些實施例中，遺傳元件包含如PCT/US19/65995之實例8中所述的蛋白質結合序列。
在一些實施例中，遺傳元件包含與指環病毒序列之5' UTR保守域或富含GC之域具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的蛋白質結合序列，例如如本文所述。
在實施例中，蛋白質結合序列與指環病毒5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，例如如本文所述。 5 ' UTR 區
在一些實施例中，如本文所述之核酸分子(例如遺傳元件、遺傳元件構築體或遺傳元件區域)包含5' UTR序列，例如如本文(例如在表A1、B1或C1中的任一者中)所述之5' UTR保守域序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。
在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGGGX 1CAGTCT，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGGGX 1CAGTCT，或相對於其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異(例如取代、缺失或添加)的核酸序列。在實施例中，X 1為A。在實施例中，X 1不存在。
在一些實施例中，5' UTR序列包含α細環病毒(例如環1)之5' UTR之核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在實施例中，5' UTR序列包含表A1中所列之5' UTR保守域的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1中所列之5' UTR保守域具有至少95%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1中所列之5' UTR保守域具有至少95.775%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1中所列之5' UTR保守域具有至少97%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1中所列之5' UTR保守域具有至少97.183%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTTTACACA CCGCAGTCAAGGGGCA ATTCGGGCTCGGGACTGGC，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTTTAC ACACCGCAGTCAAGGGGCAATT CGGGCTCGGGACTGGC，或相對於其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異(例如取代、缺失或添加)的核酸序列。
在一些實施例中，5' UTR序列包含β細環病毒(例如環2)之5' UTR的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在實施例中，5' UTR序列包含表B1中所列之5' UTR保守域的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少85%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少87%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少87.324%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少88%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少88.732%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少91%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少91.549%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少92%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少92.958%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少94%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少94.366%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少95%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少95.775%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少97%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少97.183%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAA ACCACCGAA GTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGATCAGTCT，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACC ACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGATCAGTCT，或相對於其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異(例如取代、缺失或添加)的核酸序列。
在一些實施例中，5' UTR序列包含γ細環病毒(例如環4)之5' UTR的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在實施例中，5' UTR序列包含表C1中所列之5' UTR保守域的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1中所列之5' UTR保守域具有至少97%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1中所列之5' UTR保守域具有至少97.183%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAAC CACCGAGGTCTAGGG GCAATTCGGGCTAGGGCAGTCT，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGA AACCACCGAGGTCTAGGGGCA ATTCGGGCTAGGGCAGTCT，或相對於其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異(例如取代、缺失或添加)的核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與指環病毒5' UTR序列(例如表38中所示之核酸序列)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含表38中所示之共同5' UTR序列的核酸序列，其中X 1、X 2、X 3、X 4及X 5各自獨立地為任何核苷酸，例如其中X 1=G或T，X 2=C或A，X 3=G或A，X 4=T或C，且X 5=A、C或T)。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之共同5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之例示性TTV 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-CT30F 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-HD23a 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-JA20 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-TJN02 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-tth8 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。
在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒共同5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒分枝系1 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒分枝系2 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒分枝系3 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒分枝系4 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒分枝系5 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒分枝系6 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒分枝系7 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。 表 38. 來自指環病毒之例示性 5' UTR 序列
源 序列 SEQ ID NO:
共同序列 CGGGTGCCGX 1AGGTGAGTTTACACACCGX 2AGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCX 3GGACTGGCCGGGCX 4X 5TGGG X 1= G或T X 2= C或A X 3= G或A X 4= T或C X 5= A、C或T 105
例示性TTV序列 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTWTGGG 106
TTV-CT30F CGGGTGCCGTAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 107
TTV-HD23a CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCTGGG 108
TTV-JA20 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTTTGGG 109
TTV-TJN02 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 110
TTV-tth8 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCAGGACTGGCCGGGCTTTGGG 111
α細環病毒 共同5' UTR CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGC X 1X 2TGGG；其中X 1包含T或C，且其中X 2包含A、C或T。 112
α細環病毒 分枝系1 5' UTR (例如TTV-CT30F) CGGGTGCCGTAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 113
α細環病毒 分枝系2 5' UTR (例如TTV-P13-1) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCGGG 114
α細環病毒 分枝系3 5' UTR (例如TTV-tth8) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCAGGACTGGCCGGGCTTTGGG 115
α細環病毒 分枝系4 5' UTR (例如TTV-HD20a) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGAGGCCGGGCCATGGG 116
α細環病毒 分枝系5 5' UTR (例如TTV-16) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCCGGG 117
α細環病毒 分枝系6 5' UTR (例如TTV-TJN02) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 118
α細環病毒 分枝系7 5' UTR (例如TTV-HD16d) CGGGTGCCGAAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 119
鑑定 5' UTR 序列
在一些實施例中，可在指環病毒之基因體(例如鑑定之推定指環病毒基因體，例如藉由核酸定序技術，例如深度定序技術)內鑑定指環病毒5' UTR序列。在一些實施例中，藉由以下步驟中之一或兩者鑑定指環病毒5' UTR序列： (i) 鑑定環化接合點：在一些實施例中，5' UTR將位於全長、環化指環病毒基因體之環化接合點附近。可例如藉由鑑定序列之重疊區域來鑑定環化接合點。在一些實施例中，序列之重疊區域可自序列修整以產生已環化之全長指環病毒基因體序列。在一些實施例中，基因體序列以此方式使用軟體環化。不希望受理論所束縛，計算環化基因體可導致序列之起始位置在非生物中定向。序列內之地標可用於在恰當方向上重新定向序列。舉例而言，地標序列可包括與如本文所述之指環病毒基因體內之一或多個元件(例如以下中之一或多者：指環病毒之TATA盒、加帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開讀框區、poly(A)信號或富含GC之區域，例如如本文所述)具有實質性同源性的序列。 (ii) 鑑定 5' UTR 序列 ：一旦已獲得推定指環病毒基因體序列，則可將序列(或其部分，例如長度為約40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100個核苷酸)與一或多個指環病毒5' UTR序列(例如如本文所述)相比，以鑑定與其具有實質性同源性之序列。在一些實施例中，推定指環病毒5' UTR區域與如本文所述之指環病毒5' UTR序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。 富含 GC 之 區域
在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之核酸序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之富含GC之序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。
在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之36個核苷酸之富含GC之序列(例如36個核苷酸之共同富含GC之區域序列1、36個核苷酸之共同富含GC之區域序列2、TTV分枝系1 36個核苷酸之區域、TTV分枝系3 36個核苷酸之區域、TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區域、TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區域、TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區域、TTV分枝系5 36個核苷酸之區域、TTV分枝系6 36個核苷酸之區域或TTV分枝系7 36個核苷酸之區域)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含一核酸序列，該核酸序列包含如表39中所示之36個核苷酸之富含GC之序列(例如36個核苷酸之共同富含GC之區域序列1、36個核苷酸之共同富含GC之區域序列2、TTV分枝系1 36個核苷酸之區域、TTV分枝系3 36個核苷酸之區域、TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區域、TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區域、TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區域、TTV分枝系5 36個核苷酸之區域、TTV分枝系6 36個核苷酸之區域或TTV分枝系7 36個核苷酸之區域)的至少10、15、20、25、30、31、32、33、34、35或36個連續核苷酸。
在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與α細環病毒富含GC之區域序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列，該α細環病毒富含GC之區域序列例如選自TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02或TTV-HD16d，例如如表39中所列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含一核酸序列，該核酸序列包含α細環病毒富含GC之區域序列之至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、104、105、108、110、111、115、120、122、130、140、145、150、155或156個連續核苷酸，該α細環病毒富含GC之區域序列例如選自TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02或TTV-HD16d，例如如表39中所列。
在實施例中，36個核苷酸之富含GC之序列係選自： (i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160)， (ii) GCGCTX 1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 164)，其中X 1係選自T、G或A； (iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG (SEQ ID NO: 165)； (iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG (SEQ ID NO: 166)； (v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT (SEQ ID NO: 167)； (vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC (SEQ ID NO: 168)； (vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 169)； (viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 170)； (ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 171)；或 (x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC (SEQ ID NO: 172).
在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含核酸序列CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160)。
在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含表39中所示之共同富含GC之序列的核酸序列，其中X 1、X 4、X 5、X 6、X 7、X 12、X 13、X 14、X 15、X 20、X 21、X 22、X 26、X 29、X 30及X 33各自獨立地為任何核苷酸，且其中X 2、X 3、X 8、X 9、X 10、X 11、X 16、X 17、X 18、X 19、X 23、X 24、X 25、X 27、X 28、X 31、X 32及X 34各自獨立地不存在或為任何核苷酸。在一些實施例中，X 1至X 34中之一或多者(例如全部)各自獨立地為表39中所指定之核苷酸(或不存在)。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之例示性TTV富含GC之序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3或其任何組合，例如依序之片段1-3)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-CT30F富含GC之序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何組合，例如依序之片段1-7)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-HD23a富含GC之序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6或其任何組合，例如依序之片段1-6)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-JA20富含GC之序列(例如全序列、片段1、片段2或其任何組合，例如依序之片段1及2)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-TJN02富含GC之序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何組合，例如依序之片段1-8)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-tth8富含GC之序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8、片段9或其任何組合，例如依序之片段1-6)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段7具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段8具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段9具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。 表 39. 來自指環病毒之例示性富含 GC 之 序列
源 序列 SEQ ID NO:
共同序列 CGGCGGX 1GGX 2GX 3X 4X 5CGCGCTX 6CGCGCGCX 7X 8X 9X 10CX 11X 12X 13X 14GGGGX 15X 16X 17X 18X 19X 20X 21GCX 22X 23X 24X 25CCCCCCCX 26CGCGCATX 27X 28GCX 29CGGGX 30CCCCCCCCCX 31X 32X 33GGGGGGCTCCGX 34CCCCCCGGCCCCCC    X 1= G或C X 2= G、C或不存在 X 3= C或不存在 X 4= G或C X 5= G或C X 6= T、G或A X 7= G或C X 8= G或不存在 X 9= C或不存在 X 10= C或不存在 X 11= G、A或不存在 X 12= G或C X 13= C或T X 14= G或A X 15= G或A X 16= A、G、T或不存在 X 17= G、C或不存在 X 18= G、C或不存在 X 19= C、A或不存在 X 20= C或A X 21= T或A X 22= G或C X 23= G、T或不存在 X 24= C或不存在 X 25= G、C或不存在 X 26= G或C X 27= G或不存在 X 28= C或不存在 X 29= G或A X 30= G或T X 31= C、T或不存在 X 32= G、C、A或不存在 X 33= G或C X 34= C或不存在 120
例示性TTV序列 完整序列 GCCGCCGCGGCGGCGGSGGNGNSGCGCGCTDCGCGCGCSNNNCRCCRGGGGGNNNNCWGCSNCNCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGKCCCCCCCCCNNCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 121
片段1 GCCGCCGCGGCGGCGGSGGNGNSGCGCGCTDCGCGCGCSNNNCRCCRGGGGGNNNNCWGCSNCNCCCCCCCCCGCGCAT 122
片段2 GCGCGGGKCCCCCCCCCNNCGGGGGGCTCCG 123
片段3 CCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 124
TTV-CT30F 完整序列 GCGGCGG-GGGGGCG-GCCGCG- TTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTG-- CTGCG-CGCCCCCCCCCGCGCAT  GCGCGGGGCCCCCCCCC— GGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 125
片段1 GCGGCGG 126
片段2 GGGGGCG 127
片段3 GCCGCG 128
片段4 TTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTG 129
片段5 CTGCG 130
片段6 CGCCCCCCCCCGCGCAT 131
片段7 GCGCGGGGCCCCCCCCC 132
片段8 GGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 133
TTV-HD23a 完整序列 CGGCGGCGGCGGCG- CGCGCGCTGCGCGCGCG--- CGCCGGGGGGGCGCCAGCG- CCCCCCCCCCCGCGCAT  GCACGGGTCCCCCCCCCCACGGGGGGCTCCG CCCCCCGGCCCCCCCCC 134
片段1 CGGCGGCGGCGGCG 135
片段2 CGCGCGCTGCGCGCGCG 136
片段3 CGCCGGGGGGGCGCCAGCG 137
片段4 CCCCCCCCCCCGCGCAT 138
片段5 GCACGGGTCCCCCCCCCCACGGGGGGCTCCG 139
片段6 CCCCCCGGCCCCCCCCC 140
TTV-JA20 完整序列 CCGTCGGCGGGGGGGCCGCGCGCTGCGCGCGCGGCCC-CCGGGGGAGGCACAGCCTCCCCCCCCCGCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCTCCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCC 141
片段1 CCGTCGGCGGGGGGGCCGCGCGCTGCGCGCGCGGCCC 142
片段2 CCGGGGGAGGCACAGCCTCCCCCCCCCGCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCTCCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCC 143
TTV-TJN02 完整序列 CGGCGGCGGCG-CGCGCGCTACGCGCGCG---CGCCGGGGGG----CTGCCGC- CCCCCCCCCGCGCAT  GCGCGGGGCCCCCCCCC- GCGGGGGGCTCCG  CCCCCCGGCCCCCC 144
片段1 CGGCGGCGGCG 145
片段2 CGCGCGCTACGCGCGCG 146
片段3 CGCCGGGGGG 147
片段4 CTGCCGC 148
片段5 CCCCCCCCCGCGCAT 149
片段6 GCGCGGGGCCCCCCCCC 150
片段7 GCGGGGGGCTCCG  151
片段8 CCCCCCGGCCCCCC 152
TTV-tth8 完整序列 GCCGCCGCGGCGGCGGGGG- GCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCG---CCCCCCCCCGCGCAT  GCGCGGGGCCCCCCCCC- GCGGGGGGCTCCG CCCCCCGGCCCCCCCCG 153
片段1 GCCGCCGCGGCGGCGGGGG 154
片段2 GCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCG 155
片段3 CCCCCCCCCGCGCAT 156
片段4 GCGCGGGGCCCCCCCCC 157
片段5 GCGGGGGGCTCCG 158
片段6 CCCCCCGGCCCCCCCCG 159
片段7 CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC 160
片段8 CCGCCATCTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGG 161
片段9 CTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGGACAATTTCTTCCGGGTCAAAGGTTACAGCCGCCATGTTAAAACACGTGACGTATGACGTCACGGCCGCCATTTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCC 162
額外富含GC之序列 36個核苷酸之共同富含GC之區域序列1 CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC 163
36個核苷酸之區域共同序列2 GCGCTX 1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC，其中X 1係選自T、G或A 164
TTV分枝系1 36個核苷酸之區域 GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG 165
TTV分枝系3 36個核苷酸之區域 GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG 166
TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區域 GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT 167
 TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區域 GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC 168
TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區域 GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC 169
TTV分枝系5 36個核苷酸之區域 GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC 170
TTV分枝系6 36個核苷酸之區域 GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC 171
TTV分枝系7 36個核苷酸之區域 GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC 172
額外α細環病毒富含GC之區域序列 TTV-CT30F GCGGCGGGGGGGCGGCCGCGTTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTGCTGCGCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 801
TTV-P13-1 CCGAGCGTTAGCGAGGAGTGCGACCCTACCCCCTGGGCCCACTTCTTCGGAGCCGCGCGCTACGCCTTCGGCTGCGCGCGGCACCTCAGACCCCCGCTCGTGCTGACACGCTTGCGCGTGTCAGACCACTTCGGGCTCGCGGGGGTCGGG 802
TTV-tth8 GCCGCCGCGGCGGCGGGGGGCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCG 803
TTV-HD20a CGGCCCAGCGGCGGCGCGCGCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGTCCCCCCCCG 804
TTV-16 CGGCCGTGCGGCGGCGCGCGCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGCTGCCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCCCCG 805
TTV-TJN02 CGGCGGCGGCGCGCGCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCCGCCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCC 806
TTV-HD16d GGCGGCGGCGCGCGCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGAGCTCTGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGTCCCCCCCCCG 807
效應子
在一些實施例中，遺傳元件可包括一或多個編碼效應子，例如功能性效應子，例如內源性效應子或外源性效應子，例如治療多肽或核酸，例如細胞毒性或細胞溶解RNA或蛋白質的序列。在一些實施例中，功能性核酸為非編碼RNA。在一些實施例中，功能性核酸為編碼RNA。效應子可調節生物活性，例如增加或減少酶活性、基因表現、細胞信號傳導及細胞或器官功能。效應子活性亦可包括結合調節蛋白以調節調節子之活性，諸如轉錄或轉譯。效應子活性亦可包括活化子或抑制子功能。舉例而言，效應子可藉由觸發酶中受質親和力的增加來誘導酶活性，例如果糖2,6-雙磷酸活化磷酸果糖激酶1且增加響應於胰島素之糖酵解速率。在另一實例中，效應子可抑制受質與受體結合且抑制其活化，例如納曲酮(naltrexone)及那若松(naloxone)在不活化類鴉片受體之情況下結合類鴉片受體且阻斷受體結合類鴉片之能力。效應子活性亦可包括調節蛋白質穩定性/降解及/或轉錄本穩定性/降解。舉例而言，蛋白質可經靶向以藉由多肽輔因子泛素降解至蛋白質上，以標記蛋白質用於降解。在另一實例中，效應子藉由阻斷酶活性位點來抑制酶活性，例如甲胺喋呤為四氫葉酸之結構類似物，四氫葉酸為酶二氫葉酸還原酶之輔酶，與二氫葉酸還原酶之結合比天然受質更緊密1000倍，且抑制核苷酸鹼基合成。
在一些實施例中，編碼效應子之序列為遺傳元件之一部分，例如其可插入如本文所述之插入位點。在實施例中，編碼效應子之序列在非編碼區域處插入至遺傳元件中，例如安置於遺傳元件之開讀框之3'及富含GC之區域之5'的非編碼區域、在TATA盒上游之5'非編碼區域中、在5' UTR中、在poly-A信號下游之3'非編碼區域中或在富含GC之區域上游。在實施例中，編碼效應子之序列在例如如本文所述之TTV-tth8質體之約核苷酸3588處，或在例如如本文所述之TTMV-LY2質體之約核苷酸2843處插入至遺傳元件中。在實施例中，編碼效應子之序列在例如如本文所述之TTV-tth8質體之核苷酸336-3015處或其內，或在例如如本文所述之TTMV-LY2質體之核苷酸242-2812處或其內插入至遺傳元件中。在一些實施例中，編碼效應子之序列替代開讀框(例如如本文所述之ORF，例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)之部分或全部。
在一些實施例中，編碼效應子之序列包含100-2000、100-1000、100-500、100-200、200-2000、200-1000、200-500、500-1000、500-2000或1000-2000個核苷酸。在一些實施例中，效應子為例如如本文所述之核酸或蛋白質有效負載。 調節核酸
在一些實施例中，效應子為調節核酸。調節核酸修飾內源基因及/或外源基因之表現。在一個實施例中，調節核酸靶向宿主基因。調節核酸可包括但不限於與內源性基因雜交之核酸(例如如本文其他地方所述之miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA、gRNA)、與諸如病毒DNA或RNA之外源核酸雜交之核酸、與RNA雜交之核酸、干擾基因轉錄之核酸、干擾RNA轉譯之核酸、使RNA穩定或使RNA不穩定諸如經由靶向降解之核酸、及調節DNA或RNA結合因子之核酸。在實施例中，調節核酸編碼miRNA。在一些實施例中，調節核酸對野生型指環病毒為內源性的。在一些實施例中，調節核酸對野生型指環病毒為外源性的。
在一些實施例中，調節核酸包含通常含有5-500個鹼基對之RNA或RNA樣結構(視特定RNA結構而定，例如miRNA 5-30 bp、lncRNA 200-500 bp)，且可具有與細胞內表現之目標基因中之編碼序列或編碼細胞內表現之目標基因之序列一致(或互補)或幾乎一致(或大體上互補)的核鹼基序列。
在一些實施例中，調節核酸包含核酸序列，例如嚮導RNA (gRNA)。在一些實施例中，DNA靶向部分包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA之核酸。gRNA短合成RNA由與不完全效應部分結合所必需的「主鏈」序列及使用者定義之基因體目標之約20個核苷酸靶向序列構成。實際上，嚮導RNA序列通常經設計以具有17-24個核苷酸之間(例如19、20或21個核苷酸)的長度且與靶向核酸序列互補。常規gRNA產生器及演算法可購得，用於設計有效嚮導RNA。亦使用嵌合「單嚮導RNA」(「sgRNA」)實現基因編輯，該單嚮導RNA為模擬天然存在之crRNA-tracrRNA複合物且含有tracrRNA (用於結合核酸酶)及至少一種crRNA (以將核酸酶導引至經靶向以進行編輯之序列)的經工程改造(合成)之單RNA分子。亦已證明經化學修飾之sgRNA在基因體編輯中有效；參見例如Hendel等人 (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991。
調節核酸包含識別特異性DNA序列(例如鄰近於基因之啟動子、增強子、緘默子或抑制子或在其內之序列)的gRNA。
某些調節核酸可經由RNA干擾(RNAi)之生物過程抑制基因表現。RNAi分子包含RNA或RNA樣結構，該等結構通常含有15-50個鹼基對(諸如約18-25個鹼基對)且具有與細胞內所表現之目標基因中之編碼序列一致(互補)或幾乎一致(大體上互補)的核鹼基序列。RNAi分子包括但不限於：短干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、部分雙螺旋體(meroduplex)及切丁酶(dicer)受質(美國專利第8,084,599號、第8,349,809號及第8,513,207號)。
長非編碼RNA (lncRNA)被定義為長於100個核苷酸之非蛋白質編碼轉錄本。此略微任意之限制將lncRNA與小調節RNA (諸如微小RNA (miRNA)、短干擾RNA (siRNA)及其他短RNA)區分開來。一般而言，大部分(約78%)之lncRNA表徵為組織特異性的。在與附近蛋白質編碼基因相反之方向上轉錄之發散lncRNA (佔哺乳動物基因體中總lncRNA之顯著比例，約20%)可能調節鄰近基因之轉錄。
遺傳元件可編碼具有與內源基因或基因產物(例如mRNA)之全部或片段大體上互補或完全互補之序列的調節核酸。調節核酸可與內含子與外顯子之間的邊界處之序列互補，以防止特定基因之新產生的核RNA轉錄本成熟為mRNA進行轉錄。與特定基因互補之調節核酸可與該基因之mRNA雜交且防止其轉譯。反義調節核酸可為DNA、RNA或其衍生物或雜合物。
雜合至所關注轉錄本之調節核酸之長度可為5至30個核苷酸、約10至30個核苷酸或約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個核苷酸。調節核酸與靶向轉錄本之一致性程度應為至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
遺傳元件可編碼調節核酸，例如與目標基因之約5至約25個連續核苷酸一致的微小RNA (miRNA)分子。在一些實施例中，miRNA序列靶向mRNA且以二核苷酸AA開始，包含約30-70% (約30-60%、約40-60%或約45-55%)之GC含量，且與欲引入之哺乳動物基因體中除目標以外之任何核苷酸序列不具有高比例一致性，例如如藉由標準BLAST搜尋所測定。
siRNA及shRNA類似內源性微小RNA (miRNA)基因之加工路徑中之中間物(Bartel, Cell 116:281-297, 2004)。在一些實施例中，siRNA可充當miRNA且反之亦然(Zeng等人, Mol Cell 9:1327-1333, 2002；Doench等人, Genes Dev 17:438-442, 2003)。微小RNA，如siRNA一般，使用RISC下調目標基因，但不同於siRNA，大部分動物miRNA不使mRNA裂解。實際上，miRNA經由轉譯遏制或polyA移除及mRNA降解來減少蛋白質輸出(Wu等人, Proc Natl Acad Sci USA 103:4034-4039, 2006)。已知的miRNA結合位點在mRNA 3' UTR內；miRNA似乎靶向與來自miRNA 5'端之核苷酸2-8具有接近完美互補性的位點(Rajewsky, Nat Genet 38 增刊:S8-13, 2006；Lim等人, Nature 433:769-773, 2005)。此區稱為種子區。由於siRNA及miRNA為可互換的，因此外源性siRNA下調與siRNA具有種子互補性之mRNA(Birmingham等人, Nat Methods 3:199-204, 2006。3' UTR內之多個目標位點提供較強下調(Doench等人, Genes Dev 17:438-442, 2003)。
已知miRNA序列之清單可見於諸如以下之研究組織所維護之資料庫中：Wellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center及European Molecule Biology Laboratory。已知的有效siRNA序列及同源結合位點亦充分呈現於相關文獻中。RNAi分子容易藉由此項技術中已知之技術設計及產生。此外，存在增加發現有效及特定序列模體之機率的計算工具(Lagana等人, Methods Mol. Bio., 2015, 1269:393-412)。
調節核酸可調節由基因編碼之RNA的表現。因為多個基因可彼此共用一定程度之序列同源性，所以在一些實施例中，調節核酸可經設計以靶向具有足夠序列同源性之一類基因。在一些實施例中，調節核酸可含有與在不同基因靶標中共用或特定基因靶標所獨有之序列互補的序列。在一些實施例中，調節核酸可經設計以靶向在若干基因之間具有同源性之RNA序列的保守區，藉此靶向基因家族中之若干基因(例如不同基因同功型、剪接變異體、突變基因等)。在一些實施例中，調節核酸可經設計以靶向單個基因之特定RNA序列所獨有的序列。
在一些實施例中，遺傳元件可包括一或多個編碼調節一或多個基因之表現之調節核酸的序列。
在一個實施例中，本文中他處所述之gRNA用作用於基因編輯之CRISPR系統的一部分。出於基因編輯之目的，指環載體可經設計以包括一或多個對應於所需目標DNA序列的嚮導RNA序列；參見例如Cong等人 (2013) Science, 339:819-823；Ran等人 (2013) Nature Protocols, 8:2281 - 2308。gRNA序列之至少約16或17個核苷酸通常允許發生Cas9介導之DNA裂解；對於Cpf1，需要gRNA序列之至少約16個核苷酸來實現可偵測DNA裂解。 治療效應子 ( 例如肽或多肽 )
在一些實施例中，遺傳元件包含治療性表現序列，例如編碼治療性肽或多肽之序列，例如胞內肽或胞內多肽、分泌型多肽或蛋白質替代療法。在一些實施例中，遺傳元件包括編碼蛋白質(例如治療性蛋白質)之序列。治療性蛋白質之一些實例可包括但不限於激素、細胞介素、酶、抗體(例如編碼至少重鏈或輕鏈之一種或複數種多肽)、轉錄因子、受體(例如膜受體)、配位體、膜轉運體、分泌型蛋白質、肽、載體蛋白、結構蛋白、核酸酶或其組分。
在一些實施例中，遺傳元件包括編碼肽(例如治療性肽)之序列。肽可為線性的或分支的。肽之長度為約5至約500個胺基酸、約15至約400個胺基酸、約20至約325個胺基酸、約25至約250個胺基酸、約50至約200個胺基酸或其間的任何範圍。
在一些實施例中，由治療性表現序列編碼之多肽可為以上中之任一者的功能變異體或其片段，例如與參考其UniProt ID揭示於本文之表中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的蛋白質。
在一些實施例中，治療性表現序列可編碼結合以上中之任一者之抗體或抗體片段，例如針對與參考其UniProt ID揭示於本文之表中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之蛋白質的抗體。術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。「抗體片段」係指包括至少一個重鏈或輕鏈且結合抗原之分子。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。 例示性胞內多肽效應子
在一些實施例中，效應子包含細胞溶質多肽或細胞溶質肽。在一些實施例中，效應子包含細胞溶質肽，其為DPP-4抑制劑、GLP-1信號傳導之活化劑或嗜中性球彈性蛋白酶之抑制劑。在一些實施例中，效應子增加生長因子或其受體(例如FGF受體，例如FGFR3)之含量或活性。在一些實施例中，效應子包含n-myc相互作用蛋白質活性之抑制劑(例如，n-myc相互作用蛋白質抑制劑)；EGFR活性之抑制劑(例如，EGFR抑制劑)；IDH1及/或IDH2活性之抑制劑(例如，IDH1抑制劑及/或IDH2抑制劑)；LRP5及/或DKK2活性之抑制劑(例如，LRP5及/或DKK2抑制劑)；KRAS活性之抑制劑；HTT活性之活化劑；或DPP-4活性之抑制劑(例如，DPP-4抑制劑)。
在一些實施例中，效應子包含調節性胞內多肽。在一些實施例中，調節性胞內多肽結合對目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)。在一些實施例中，調節性胞內多肽增加對目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)之含量或活性。在一些實施例中，調節性胞內多肽減少對目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)之含量或活性。 例示性分泌型多肽效應子
例示性分泌型治療劑描述於本文中，例如下表中。 表 50. 例示性細胞介素及細胞介素受體
細胞介素 細胞介素受體 Entrez 基因ID UniProt ID
IL-1α、IL-1β或其雜二聚體 IL-1 1型受體、IL-1 2型受體 3552、3553 P01583、P01584
IL-1Ra IL-1 1型受體、IL-1 2型受體 3454、3455 P17181、P48551
IL-2 IL-2R 3558 P60568
IL-3 IL-3受體α + β c (CD131) 3562 P08700
IL-4 IL-4R I型、IL-4R II型 3565 P05112
IL-5 IL-5R 3567 P05113
IL-6 IL-6R (sIL-6R) gp130 3569 P05231
IL-7 IL-7R及sIL-7R 3574 P13232
IL-8 CXCR1及CXCR2 3576 P10145
IL-9 IL-9R 3578 P15248
IL-10 IL-10R1/IL-10R2複合物 3586 P22301
IL-11 IL-11Rα 1 gp130 3589 P20809
IL-12 (例如p35、p40或其雜二聚體) IL-12Rβ1及IL-12Rβ2 3593、3592 P29459、P29460
IL-13 IL-13R1α1及IL-13R1α2 3596 P35225
IL-14 IL-14R 30685 P40222
IL-15 IL-15R 3600 P40933
IL-16 CD4 3603 Q14005
IL-17A IL-17RA 3605 Q16552
IL-17B IL-17RB 27190 Q9UHF5
IL-17C IL-17RA至L-17RE 27189 Q9P0M4
e SEF 53342 Q8TAD2
IL-17F IL-17RA、IL-17RC 112744 Q96PD4
IL-18 IL-18受體 3606 Q14116
IL-19 IL-20R1/IL-20R2 29949 Q9UHD0
IL-20 L-20R1/IL-20R2及IL-22R1/ IL-20R2 50604 Q9NYY1
IL-21 IL-21R 59067 Q9HBE4
IL-22 IL-22R 50616 Q9GZX6
IL-23 (例如p19、p40或其雜二聚體) IL-23R 51561 Q9NPF7
IL-24 IL-20R1/IL-20R2及IL-22R1/ IL-20R2 11009 Q13007
IL-25 IL-17RA及IL-17RB 64806 Q9H293
IL-26 IL-10R2鏈及IL-20R1鏈 55801 Q9NPH9
IL-27 (例如p28、EBI3或其雜二聚體) WSX-1及gp130 246778 Q8NEV9
IL-28A、IL-28B及IL29 IL-28R1/IL-10R2 282617、282618 Q8IZI9、Q8IU54
IL-30 IL6R/gp130 246778 Q8NEV9
IL-31 IL-31RA/OSMRβ 386653 Q6EBC2
IL-32   9235 P24001
IL-33 ST2 90865 O95760
IL-34 群落刺激因子1受體 146433 Q6ZMJ4
IL-35 (例如p35、EBI3或其雜二聚體) IL-12Rβ2/gp130；IL-12Rβ2/IL-12Rβ2；gp130/gp130 10148 Q14213
IL-36 IL-36Ra 27179 Q9UHA7
IL-37 IL-18Rα及IL-18BP 27178 Q9NZH6
IL-38 IL-1R1、IL-36R 84639 Q8WWZ1
IFN-α IFNAR 3454 P17181
IFN-β IFNAR 3454 P17181
IFN-γ IFNGR1/IFNGR2 3459 P15260
TGF-β TβR-I及TβR-II 7046、7048 P36897、P37173
TNF-α TNFR1、TNFR2 7132、7133 P19438、P20333
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表50之細胞介素或其功能變異體，例如同源物(例如異種同源物或同種同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表50中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體以比在相同條件下對應野生型細胞介素對相同受體之Kd高或低不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至對應細胞介素受體。在一些實施例中，效應子包含融合蛋白，其包含第一區域(例如表50之細胞介素多肽或其功能變異體或片段)及第二異源區域。在一些實施例中，第一區域為表50之第一細胞介素多肽。在一些實施例中，第二區域為表50之第二細胞介素多肽，其中第一及第二細胞介素多肽在野生型細胞中彼此形成細胞介素雜二聚體。在一些實施例中，表50之多肽或其功能變異體包含信號序列，例如對效應子為內源性的信號序列，或異源信號序列。在一些實施例中，編碼表50之細胞介素或其功能變異體的指環載體用於治療本文所述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表50之細胞介素的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表50之細胞介素受體之抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含信號序列。
例示性細胞介素及細胞介素受體描述於例如Akdis等人, 「Interleukins (from IL-1 to IL-38), interferons, transforming growth factor β, and TNF-α: Receptors, functions, and roles in diseases」 October 2016 第138卷, 第4期, 第984-1010頁中，其以全文引用之方式併入本文中，包括其中之表I。 表 51. 例示性多肽激素及受體
激素 受體 Entrez 基因ID UniProtID
利尿鈉肽，例如心房利尿鈉肽(ANP) NPRA、NPRB、NPRC 4878 P01160
腦利尿鈉肽(BNP) NPRA、NPRB 4879 P16860
 C型利尿鈉肽(CNP) NPRB 4880 P23582
生長激素(GH) GHR 2690 P10912
人類生長激素(hGH) hGH受體(人類GHR) 2690 P10912
促乳素(PRL) PRLR 5617 P01236
甲狀腺刺激激素(TSH) TSH受體 7253 P16473
促腎上腺皮質激素(ACTH) ACTH受體 5443 P01189
促卵泡激素(FSH) FSHR 2492 P23945
促黃體生成激素(LH) LHR 3973 P22888
抗利尿激素(ADH) 升壓素受體，例如V2；AVPR1A；AVPR1B；AVPR3；AVPR2 554 P30518
催產素 OXTR 5020 P01178
降鈣素 降鈣素受體(CT) 796 P01258
副甲狀腺激素(PTH) PTH1R及PTH2R 5741 P01270
胰島素 胰島素受體(IR) 3630 P01308
升糖素 升糖素受體 2641 P01275
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表51之激素或其功能變異體，例如同源物(例如異種同源物或同種同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表51中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體以比在相同條件下對應野生型激素對相同受體之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至對應受體。在一些實施例中，表51之多肽或其功能變異體包含信號序列，例如對效應子為內源性的信號序列，或異源信號序列。在一些實施例中，編碼表51之激素或其功能變異體的指環載體用於治療本文所述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表51之激素的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表51之激素受體的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含信號序列。 表 52. 例示性生長因子
生長因子 Entrez 基因ID UniProt ID
PDGF家族
PDGF (例如PDGF-1、PDGF-2或其雜二聚體) PDGF受體，例如PDGFRα、PDGFRβ 5156 P16234
CSF-1 CSF1R 1435 P09603
SCF CD117 3815 P10721
VEGF家族      
VEGF (例如同功型VEGF 121、VEGF 165、VEGF 189及VEGF 206) VEGFR-1、VEGFR-2 2321 P17948
VEGF-B VEGFR-1 2321 P17949
VEGF-C VEGFR-2及VEGFR -3 2324 P35916
PlGF VEGFR-1 5281 Q07326
EGF家族      
EGF EGFR 1950 P01133
TGF-α EGFR 7039 P01135
雙調蛋白 EGFR 374 P15514
HB-EGF EGFR 1839 Q99075
β細胞調節素 EGFR、ErbB-4 685 P35070
表皮調節素 EGFR、ErbB-4 2069 O14944
調蛋白 EGFR、ErbB-4 3084 Q02297
FGF家族      
FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9 FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4 2246、2247、2248、2249、2250、2251、2252、2253、2254 P05230、P09038、P11487、P08620、P12034、P10767、P21781、P55075、P31371
胰島素家族      
胰島素 IR 3630 P01308
IGF-I IGF-I受體、IGF-II受體 3479 P05019
IGF-II IGF-II受體 3481 P01344
HGF家族      
HGF MET受體 3082 P14210
MSP RON 4485 P26927
神經營養因子家族      
NGF LNGFR、trkA 4803 P01138
BDNF trkB 627 P23560
NT-3 trkA、trkB、trkC 4908 P20783
NT-4 trkA、trkB 4909 P34130
NT-5 trkA、trkB 4909 P34130
血管生成素家族      
ANGPT1 HPK-6/TEK 284 Q15389
ANGPT2 HPK-6/TEK 285 O15123
ANGPT3 HPK-6/TEK 9068 O95841
ANGPT4 HPK-6/TEK 51378 Q9Y264
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表52之生長因子或其功能變異體，例如同源物(例如異種同源物或同種同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表52中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體以比在相同條件下對應野生型生長因子對相同受體之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至對應受體。在一些實施例中，表52之多肽或其功能變異體包含信號序列，例如對效應子為內源性的信號序列，或異源信號序列。在一些實施例中，編碼表52之生長因子或其功能變異體的指環載體用於治療本文所述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表52之生長因子的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表52之生長因子受體的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含信號序列。
例示性生長因子及生長因子受體描述於例如Bafico等人, 「Classification of Growth Factors and Their Receptors」 Holland-Frei Cancer Medicine. 第6版中，其以全文引用之方式併入本文中。 表 53. 凝血相關因子
效應子 適應症 Entrez 基因ID UniProt ID
因子I (血纖維蛋白原) 無纖維蛋白原血症 2243、2266、2244 P02671、P02679、P02675
因子II 因子II缺乏症 2147 P00734
因子IX  B型血友病 2158 P00740
因子V 奧倫氏病(Owren's disease) 2153 P12259
因子VIII A型血友病 2157 P00451
因子X 斯圖亞特因子缺乏症(Stuart-Prower Factor Deficiency) 2159 P00742
因子XI C型血友病 2160 P03951
因子XIII 纖維蛋白穩定因子缺乏症 2162、2165 P00488、P05160
vWF 馮威里氏病(von Willebrand disease) 7450 P04275
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表53之多肽或其功能變異體，例如同源物(例如異種同源物或同種同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表53中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體催化與對應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，表53之多肽或其功能變異體包含信號序列，例如對效應子為內源性的信號序列，或異源信號序列。在一些實施例中，編碼表53之多肽或其功能變異體的指環載體用於治療表53之疾病或病症。 例示性蛋白質置換治療劑
例示性蛋白質置換治療劑描述於本文中，例如下表中。 表 54. 例示性酶效應子及對應適應症
效應子 缺乏症 Entrez 基因ID UniProt ID
3-甲基巴豆醯基-CoA羧化酶 3-甲基巴豆醯基-CoA羧化酶缺乏症 56922、64087 Q96RQ3、Q9HCC0
乙醯基-CoA-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo's syndrome))第III-C型 138050 Q68CP4
ADAMTS13 血栓性血小板減少性紫癲 11093 Q76LX8
腺嘌呤磷酸核糖轉移酶 腺嘌呤磷酸核糖轉移酶缺乏症 353 P07741
腺苷去胺酶 腺苷去胺酶缺乏症 100 P00813
 ADP-核糖蛋白水解酶 麩胺醯基核糖-5-磷酸貯積病 26119、54936 Q5SW96、Q9NX46
α葡糖苷酶 2型肝糖貯積病(龐貝氏病(Pompe's disease)) 2548 P10253
精胺酸酶 家族性高精胺酸血症 383、384 P05089、P78540
芳基硫酸酯酶A 異染性腦白質營養不良 410 P15289
組織蛋白酶K 密骨發育障礙 1513 P43235
神經醯胺酶 法伯氏病(Farber's disease) (脂肪肉芽腫病) 125981、340485、55331 Q8TDN7、Q5QJU3、Q9NUN7
胱硫醚B合成酶 高胱胺酸尿 875 P35520
多萜醇-P-甘露糖合成酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ie 8813、54344 O60762、Q9P2X0
多萜醇-P-Glc:Man9GlcNAc2-PP-多萜醇葡萄糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ic 84920 Q5BKT4
多萜醇-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-多萜醇甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Id 10195 Q92685
多萜醇基-P-葡萄糖:Glc-1-Man-9-GlcNAc-2-PP-多萜醇基-α-3-葡萄糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ih 79053 Q9BVK2
多萜醇基-P-甘露糖:Man-7-GlcNAc-2-PP-多萜醇基-α-6-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ig 79087 Q9BV10
因子II 因子II缺乏症 2147 P00734
因子IX B型血友病 2158 P00740
因子V 奧倫氏病(Owren's disease) 2153 P12259
因子VIII A型血友病 2157 P00451
因子X 斯圖亞特因子缺乏症(Stuart-Prower Factor Deficiency) 2159 P00742
因子XI  C型血友病 2160 P03951
因子XIII 纖維蛋白穩定因子缺乏症 2162、2165 P00488、P05160
半乳胺糖-6-硫酸酯硫酸酯酶 黏多糖病MPS IV (莫奎歐氏症候群(Morquio's syndrome))第IV-A型 2588 P34059
半乳糖基神經醯胺β-半乳糖苷酶 克拉伯氏病(Krabbe's disease) 2581 P54803
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 全身性GM1神經節苷脂貯積病 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 GM2神經節苷脂貯積病 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 I型神經鞘脂貯積症 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 II型神經鞘脂貯積症(幼年型) 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 III型神經鞘脂貯積症(成人型) 2720 P16278
葡糖苷酶I 先天性N-醣基化障礙CDG IIb 2548 P10253
葡糖神經醯胺β-葡糖苷酶 高歇氏病(Gaucher's disease) 2629 P04062
乙醯肝素-S-硫酸酯硫酸醯胺酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群)第III-A型 6448 P51688
尿黑酸氧化酶 黑尿症 3081 Q93099
玻尿酸酶 黏多糖病MPS IX (玻尿酸酶缺乏症) 3373、8692、8372、23553 Q12794、Q12891、O43820、Q2M3T9
艾杜糖醛硫酸酯硫酸酯酶 黏多糖病MPS II (亨特氏症候群(Hunter's syndrome)) 3423 P22304
卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(LCAT) 完全LCAT缺乏症、魚眼病、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症 3931 606967
離胺酸氧化酶 戊二酸血症I型 4015 P28300
溶酶體酸性脂肪酶 膽甾醇酯貯積病(CESD) 3988 P38571
溶酶體酸性脂肪酶 溶酶體酸性脂肪酶缺乏症 3988 P38571
溶酶體酸性脂肪酶 沃爾曼氏病(Wolman's disease) 3988 P38571
溶酶體胃酶抑素不敏感性肽酶 幼兒型蠟樣脂褐質沈積症(CLN2、詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)) 1200 O14773
甘露糖(Man)磷酸酯(P)異構酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ib 4351 P34949
甘露糖基-α-1,6-糖蛋白-β-1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDGIIa 4247 Q10469
金屬蛋白酶-2 溫徹斯特症候群(Winchester syndrome) 4313 P08253
甲基丙二醯基-CoA變位酶 甲基丙二酸血症(維生素b12無反應型) 4594 P22033
 N-乙醯基半乳糖胺α-4-硫酸酯硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶B) 黏多糖病MPS VI (馬洛特-拉米症候群(Maroteaux-Lamy syndrome)) 411 P15848
 N-乙醯基-D-胺基葡糖苷酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群)第III-B型 4669 P54802
 N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶 I型辛德勒氏病(Schindler's disease) (嬰兒嚴重型) 4668 P17050
 N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶 II型辛德勒氏病(神琦病(Kanzaki disease)，成年發作型) 4668 P17050
 N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶  III型辛德勒氏病(中間型) 4668 P17050
N-乙醯基-葡萄糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群)第III-D型 2799 P15586
 N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶 黏脂貯積症ML III (假賀勒氏多種營養不良(pseudo-Hurler's polydystrophy)) 79158 Q3T906
N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶催化次單位 黏脂貯積症ML II (I細胞病) 79158 Q3T906
N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶，受質識別次單位 黏脂貯積症ML III (假賀勒氏多種營養不良)第III-C型 84572 Q9UJJ9
 N-天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶 天冬胺醯葡萄糖胺尿症 175 P20933
神經胺糖酸苷酶1 (唾液酸酶) 唾液腺病 4758 Q99519
軟脂醯基-蛋白質硫酯酶-1 成人型蠟樣脂褐質沈積症(CLN4、庫夫斯病(Kufs'disease)) 5538 P50897
軟脂醯基-蛋白質硫酯酶-1 嬰兒型蠟樣脂褐質沈積症(CLN1、桑塔沃里-哈爾蒂亞病(Santavuori-Haltia disease)) 5538 P50897
苯丙胺酸羥化酶 苯酮尿症 5053 P00439
磷酸甘露糖酶-2 先天性N-糖基化障礙CDG Ia (僅神經及神經-多內臟型) 5373 O15305
膽色素原去胺酶 急性間歇卟啉症 3145 P08397
嘌呤核苷磷酸化酶 嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症 4860 P00491
嘧啶5'核苷酸酶 溶血性貧血及/或嘧啶5'核苷酸酶缺乏症 51251 Q9H0P0
神經磷脂酶 尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease) A型 6609 P17405
神經磷脂酶 尼曼-匹克病B型 6609 P17405
固醇27-羥化酶 腦腱黃瘤病(膽甾醇脂沈積症) 1593 Q02318
胸苷磷酸化酶 粒線體神經胃腸道腦肌病(MNGIE) 1890 P19971
三己糖神經醯胺α-半乳糖苷酶 法布立氏病(Fabry's disease) 2717 P06280
酪胺酸酶，例如OCA1 白化病，例如眼白化病 7299 P14679
 UDP-GlcNAc:多萜醇基-P NAcGlc磷酸轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ij 1798 Q9H3H5
UDP-N-乙醯基葡糖胺-2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶，唾液酸轉運蛋白(sialin) 法國型涎尿(Sialuria French type) 10020 Q9Y223
尿酸酶 萊尼症候群(Lesch-Nyhan syndrome)、痛風 391051 無蛋白質
二磷酸尿苷葡萄糖醛酸轉移酶(例如UGT1A1) 克果-納傑氏症候群(Crigler-Najjar syndrome) 54658 P22309
α-1,2-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Il (608776) 79796 Q9H6U8
α-1,2-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙，I型(前高基體醣基化缺陷) 79796 Q9H6U8
α-1,3-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDGIi 440138 Q2TAA5
α-D-甘露糖苷酶 α-甘露糖苷貯積病I型(重度)或II型(輕度) 10195 Q92685
α-L-岩藻糖苷酶 岩藻糖苷貯積症 4123 Q9NTJ4
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPS I H/S (賀勒-沙伊侯症群(Hurler-Scheie syndrome)) 2517 P04066
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPS I-H (賀勒氏症候群) 3425 P35475
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPSI-S (施艾氏症候群(Scheie's syndrome) 3425 P35475
β-1,4-半乳糖苷基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG IId 3425 P35475
β-1,4-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ik 2683 P15291
β-D-甘露糖苷酶 β-甘露糖苷貯積病 56052 Q9BT22
β-半乳糖苷酶 黏多糖病MPS IV (莫奎歐氏症候群)第IV-B型 4126 O00462
β-葡萄糖醛酸苷酶 黏多糖病MPS VII (斯利症候群(Sly's syndrome)) 2720 P16278
β-己糖苷酶A 泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease) 2990 P08236
β-己糖苷酶B 桑德霍夫氏病(Sandhoff's disease) 3073 P06865
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表54之酶，或其功能變異體，例如同源物(例如異種同源物或同種同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表54中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體催化與對應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，編碼表54之酶之指環載體或其功能變異體用於治療表54之疾病或病症。在一些實施例中，指環載體用於將葡萄糖醛酸苷轉移酶或其功能變異體遞送至目標細胞，例如肝細胞。在一些實施例中，指環載體用於將OCA1或其功能變異體遞送至目標細胞，例如視網膜細胞。 表 55. 例示性非酶效應子及對應適應症
效應子 適應症 Entrez 基因ID UniProt ID
存活運動神經元蛋白(SMN) 脊髓性肌萎縮 6606 Q16637
肌肉萎縮蛋白或微肌肉萎縮蛋白 肌肉萎縮症(例如杜氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)或貝氏肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy)) 1756 P11532
補體蛋白，例如補體因子C1 補體因子I缺乏症 3426 P05156
補體因子H 非典型性溶血性尿毒癥症候群 3075 P08603
胱胺酸素(溶酶體胱胺酸轉運體) 胱胺酸症 1497 O60931
附睾分泌蛋白1 (HE1；NPC2蛋白) 尼曼-匹克病C2型 10577 P61916
 GDP-岩藻糖轉運體-1 先天性N-糖基化障礙CDG IIc(拉瑪-哈薩隆症候群(Rambam-Hasharon syndrome)) 55343 Q96A29
GM2活化蛋白 GM2活化蛋白缺乏症(泰-薩克斯病AB變異體，GM2A) 2760 Q17900
溶酶體跨膜CLN3蛋白 幼年型蠟樣脂褐質沈積症(CLN3、巴氏病(Batten disease)、沃格特-施皮耳麥耶病(Vogt-Spielmeyer disease)) 1207 Q13286
溶酶體跨膜CLN5蛋白 幼兒型蠟樣脂褐質沈積症變異體，芬蘭型(CLN5) 1203 O75503
Na磷酸協同轉運蛋白，唾液酸轉運蛋白 嬰兒唾液酸貯積病 26503 Q9NRA2
 Na磷酸協同轉運蛋白，唾液酸轉運蛋白 芬蘭型涎尿(薩拉病(Salla disease)) 26503 Q9NRA2
NPC1蛋白 尼曼-匹克病C1型/D型 4864 O15118
寡聚高基體複合物-7 先天性N-醣基化障礙CDG IIe 91949 P83436
鞘脂激活蛋白原 鞘脂激活蛋白原缺乏症 5660 P07602
保護蛋白/組織蛋白酶A (PPCA) 半乳糖唾液酸貯積症(戈德堡症候群(Goldberg's syndrome)、神經胺糖酸苷酶與β-半乳糖苷酶組合缺乏症) 5476 P10619
與甘露糖-P-多萜醇利用有關之蛋白質 先天性N-醣基化障礙CDG If 9526 O75352
鞘脂激活蛋白B 鞘脂激活蛋白B缺乏症(硫苷脂活化子缺乏症) 5660 P07602
鞘脂激活蛋白C 鞘脂激活蛋白C缺乏症(高歇氏活化子缺乏症(Gaucher's activator deficiency)) 5660 P07602
硫酸酯酶修飾因子-1 黏硫脂病(多硫酸酯酶缺乏症) 285362 Q8NBK3
跨膜CLN6蛋白 幼兒型蠟樣脂褐質沈積症變異體(CLN6) 54982 Q9NWW5
跨膜CLN8蛋白 蠟樣脂褐質沈積症進展性癲癇症伴智力障礙 2055 Q9UBY8
vWF 馮威里氏病(von Willebrand disease) 7450 P04275
因子I (血纖維蛋白原) 無纖維蛋白原血症 2243、2244、2266 P02671、P02675、P02679
紅血球生成素(hEPO)         
在一些實施例中，本文所述之效應子包含紅血球生成素(EPO)，例如人類紅血球生成素(hEPO)或其功能變異體。在一些實施例中，編碼紅血球生成素或其功能變異體之指環載體用於刺激紅血球生成。在一些實施例中，編碼紅血球生成素或其功能變異體之指環載體用於治療疾病或病症，例如貧血。在一些實施例中，指環載體用於將EPO或其功能變異體遞送至目標細胞，例如紅血球。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表55之多肽或其功能變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt標識在表55中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，編碼表55之多肽或其功能變異體的指環載體用於治療表55之疾病或病症。在一些實施例中，指環載體用於將SMN或其功能變異體遞送至目標細胞，例如脊髓之細胞及/或運動神經元。在一些實施例中，指環載體用於將微肌肉萎縮蛋白遞送至目標細胞，例如肌細胞。
例示性微肌肉萎縮蛋白描述於Duan, 「Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.」 Mol Ther. 2018年10月3日; 26(10):2337-2356. doi: 10.1016/j.ymthe. 2018.07.011. 電子版2018年7月17日中。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含凝血因子，例如本文之表54或表55中所列之凝血因子。在一些實施例中，本文所述之效應子包含突變時引起溶酶體貯積病之蛋白質，例如本文之表54或表55中所列之蛋白質。在一些實施例中，本文所述之效應子包含轉運蛋白，例如本文之表55中所列之轉運蛋白。
在一些實施例中，野生型蛋白質之功能變異體包含具有野生型蛋白質之一或多種活性的蛋白質，例如功能變異體催化與對應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，功能變異體結合至野生型蛋白質結合之相同結合搭配物，例如以比在相同條件下對應野生型蛋白質對相同結合搭配物之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd。在一些實施例中，功能變異體之多肽序列與野生型多肽至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，功能變異體包含對應野生型蛋白質之同源物(例如異種同源物或同種同源物)。在一些實施例中，功能變異體為融合蛋白。在一些實施例中，融合物包含第一區域與對應野生型蛋白質具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性及第二異源區域。在一些實施例中，功能變異體包含對應野生型蛋白質之片段或由其組成。 再生、修復及纖維化因子
本文所述之治療多肽包含例如如表56中所揭示之生長因子，或其功能變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表56中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的蛋白質。亦包括針對此類生長因子之抗體或其片段，或促進再生及修復之miRNA。 表 56. 例示性再生、修復及纖維化因子
靶標 基因寄存編號 蛋白質寄存編號
VEGF-A NG_008732 NP_001165094
NRG-1 NG_012005 NP_001153471
FGF2 NG_029067 NP_001348594
FGF1 基因ID：2246 NP_001341882
miR-199-3p MIMAT0000232   
miR-590-3p MIMAT0004801   
mi-17-92 MI0000071 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2732113/figure/F1/
miR-222 MI0000299   
miR-302-367 MIR302A And MIR367 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4400607/
轉型因子
本文所述之治療多肽亦包括轉型因子，例如將纖維母細胞轉型成分化細胞之蛋白質因子，例如如表57中所揭示之因子，或其功能變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表57中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的蛋白質。 表 57. 例示性轉型因子
靶標 適應症 基因寄存編號 蛋白質寄存編號
MESP1 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：55897 EAX02066
ETS2 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：2114 NP_005230
HAND2 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：9464 NP_068808
MYOCARDIN 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：93649 NP_001139784
ESRRA 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：2101 AAH92470
miR-1 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 MI0000651 n/a
miR-133 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 MI0000450 n/a
TGFb 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：7040 NP_000651.3
WNT 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：7471 NP_005421   
JAK 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：3716 NP_001308784
NOTCH 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：4851 XP_011517019
刺激細胞再生之蛋白質
本文所述之治療多肽亦包括刺激細胞再生之蛋白質，例如如表58中所揭示之蛋白質，或其功能變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表58中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、98%、97%、99%一致性的蛋白質。 表 58. 刺激細胞再生之例示性蛋白質
靶標 基因寄存編號 蛋白質寄存編號
MST1 NG_016454 NP_066278
STK30 基因ID：26448 NP_036103
MST2 基因ID：6788 NP_006272
SAV1 基因ID：60485 NP_068590
LATS1 基因ID：9113 NP_004681
LATS2 基因ID：26524 NP_055387
YAP1 NG_029530 NP_001123617
CDKN2b NG_023297 NP_004927
CDKN2a NG_007485 NP_478102
STING 調節物效應子
在一些實施例中，本文所述之分泌效應子調節STING/cGAS信號傳導。在一些實施例中，STING調節物為多肽，例如病毒多肽或其功能變異體。舉例而言，效應子可包含描述於Maringer等人 「Message in a bottle: lessons learned from antagonism of STING signalling during RNA virus infection」 Cytokine & Growth Factor Reviews 第25卷, 第6期, 2014年12月, 第669-679頁中之STING調節物(例如抑制劑)，該文獻以全文引用的方式併入本文中。額外STING調節物(例如活化劑)描述於例如Wang等人 「STING activator c-di-GMP enhances the anti-tumor effects of peptide vaccines in melanoma-bearing mice.」  Cancer Immunol Immunother. 2015年8月;64(8):1057-66. doi: 10.1007/s00262-015-1713-5. 電子版2015年5月19日；Bose 「cGAS/STING Pathway in Cancer: Jekyll and Hyde Story of Cancer Immune Response」 Int J Mol Sci. 2017年11月; 18(11): 2456；及Fu等人. 「STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumors resistant to PD-1 blockade」 Sci Transl Med. 2015年4月15日; 7(283): 283ra52中，其各自以全文引用的方式併入本文中。
肽之一些實例包括但不限於螢光標籤或標記、抗原、治療性肽、來自天然生物活性肽之合成或模擬肽、促效性或拮抗性肽、抗微生物肽、靶向或細胞毒性肽、一種降解或自毀肽及多種降解或自毀肽。本文所述之適用於本發明之肽亦包括抗原結合肽，例如抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體(參見例如Steeland等人. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113)。此類抗原結合肽可結合細胞溶質抗原、細胞核抗原或細胞器內抗原。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼小肽、肽模擬物(例如，類肽)、胺基酸及胺基酸類似物之序列。此類治療劑通常具有每莫耳低於約5,000公克之分子量、每莫耳低於約2,000公克之分子量、每莫耳低於約1,000公克之分子量、每莫耳低於約500公克之分子量及此類化合物之鹽、酯及其他醫藥學上可接受之形式。此類治療劑可包括但不限於神經傳遞質、激素、藥物、毒素、病毒或微生物粒子、合成分子及其促效劑或拮抗劑。
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體包括連接至能夠靶向特定位置、組織或細胞之配位體的多肽。 基因編輯組分
指環載體之遺傳元件可包括編碼基因編輯系統之組分的一或多個基因。例示性基因編輯系統包括成簇規律間隔短回文重複序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR)系統、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFN)及基於類轉錄活化因子效應子之核酸酶(Transcription Activator-Like Effector-based Nucleases，TALEN)。基於ZFN、TALEN及CRISPR之方法描述於例如Gaj等人 Trends Biotechnol. 31.7(2013):397-405中；基因編輯之CRISPR方法描述於例如Guan等人, Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair 2016年10月;46:1-8. doi: 10.1016/j.dnarep.2016.07.004；Zheng等人, Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques, 第57卷, 第3期, 2014年9月, 第115-124頁中。
CRISPR系統為最初在細菌及古菌中發現的適應性防禦系統。CRISPR系統使用稱為CRISPR相關或「Cas」核酸內切酶(例如，Cas9或Cpf1)之RNA引導之核酸酶以裂解外來DNA。在典型CRISPR/Cas系統中，核酸內切酶係藉由靶向單股或雙股DNA序列之序列特異性、非編碼「導引RNA」指向目標核苷酸序列(例如，待進行序列編輯之基因體中的位點)。已鑑定出三類(I-III) CRISPR系統。II類CRISPR系統使用單一Cas核酸內切酶(而非多個Cas蛋白)。一個II類CRISPR系統包括II型Cas核酸內切酶，諸如Cas9、CRISPR RNA (「crRNA」)及反式活化crRNA (「tracrRNA」)。crRNA含有「嚮導RNA」，通常約20個對應於目標DNA序列之核苷酸RNA序列。crRNA亦含有結合至tracrRNA以形成由RNase III裂解之部分雙股結構之區域，產生crRNA/tracrRNA雜合物。crRNA/tracrRNA雜合物隨後引導Cas9核酸內切酶識別及裂解目標DNA序列。目標DNA序列通常必須鄰近於對指定Cas核酸內切酶具有特異性之「原間隔序列相鄰模體」(「PAM」)；然而，PAM序列出現在整個給定基因體中。
在一些實施例中，指環載體包括CRISPR核酸內切酶之基因。舉例而言，自多種原核物種鑑別之一些CRISPR核酸內切酶具有不同PAM序列要求；PAM序列之實例包括5'-NGG (化膿性鏈球菌)、5'-NNAGAA (嗜熱鏈球菌CRISPR1)、5'-NGGNG (嗜熱鏈球菌CRISPR3)及5'-NNNGATT (腦膜炎雙球菌)。一些核酸內切酶，例如Cas9核酸內切酶係與富含G之PAM位點，例如5'-NGG相關，且在PAM位點上游(5')之位置3核苷酸處執行目標DNA之平端裂解。另一II類CRISPR系統包括V型核酸內切酶Cpf1，其小於Cas9；實例包括AsCpf1 (來自胺基酸球菌屬物種)及LbCpf1 (來自毛螺菌科物種)。Cpf1核酸內切酶與富含T之PAM位點，例如5'-TTN相關。Cpf1亦可識別5'-CTA PAM模體。Cpf1如下地裂解目標DNA：藉由引入具有4-或5-核苷酸5'突出物之偏移或交錯雙股斷裂，例如使用位於編碼股上之PAM位點下游(3') 18個核苷酸及互補股上之PAM位點下游23個核苷酸的5-核苷酸偏移或交錯切口裂解目標DNA；由此類偏移裂解產生之5-核苷酸突出物使得藉由同源重組之DNA插入與藉由插入平端裂解的DNA相比更精確的基因體編輯。參見例如Zetsche等人 (2015) Cell, 163:759 - 771。
多種CRISPR相關(Cas)基因可包括於指環載體中。基因之特定實例為編碼來自包括Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、C2C1或C2C3之II類系統之Cas蛋白的彼等基因。在一些實施例中，指環載體包括編碼Cas蛋白，例如Cas9蛋白之基因，可來自多種原核物種中之任一者。在一些實施例中，指環載體包括編碼Cas蛋白，例如Cas9蛋白之基因，經選擇以識別特定前間隔子相鄰模體(PAM)序列。在一些實施例中，指環載體包括編碼兩個或更多個不同Cas蛋白或兩個或更多個Cas蛋白之核酸，可引入至細胞、受精卵、胚胎或動物中，例如以允許識別及修飾包含相同、類似或不同PAM模體之位點。在一些實施例中，指環載體包括編碼具有去活化核酸酶之經修飾Cas蛋白，例如核酸酶缺陷型Cas9的基因。
儘管野生型Cas9蛋白質在由gRNA靶向之特定DNA序列處產生雙股斷裂(DSB)，但已知具有經修飾功能之多種CRISPR核酸內切酶，例如：Cas核酸內切酶之「切口酶」型式(例如Cas9)僅產生單股斷裂；無催化活性Cas核酸內切酶，例如Cas9 (「dCas9」)不切割目標DNA。編碼dCas9之基因可與編碼效應子域之基因融合以抑制(CRISPRi)或活化(CRISPRa)目標基因之表現。舉例而言，基因可使用轉錄緘默子(例如，KRAB域)或轉錄活化子(例如，dCas9-VP64融合)編碼Cas9融合物。可包括編碼融合至FokI核酸酶之無催化活性Cas9 (dCas9)之基因(「dCas9-FokI」)，以在與兩個gRNA同源之目標序列處產生DSB。參見例如揭示於Addgene repository (Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/)中且可自其公開購得之許多CRISPR/Cas9質體。引入兩個單獨雙股斷裂(各自藉由單獨嚮導RNA引導)之「雙切口酶」Cas9由Ran等人 (2013) Cell, 154:1380 - 1389描述為達成更精確的基因體編輯。
用於編輯真核生物之基因的CRISPR技術揭示於美國專利申請公開案2016/0138008A1及US2015/0344912A1中，及美國專利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965及8,906,616中。Cpf1核酸內切酶及對應嚮導RNA及PAM位點揭示於美國專利申請公開案2016/0208243 A1中。
在一些實施例中，指環載體包含編碼本文所述之多肽，例如靶向核酸酶，例如Cas9，例如野生型Cas9、切口酶Cas9 (例如Cas9 D10A)、死亡Cas9 (dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1或C2C3及gRNA的基因。編碼核酸酶及gRNA之基因的選擇係藉由靶向突變是否為核苷酸缺失、取代或添加，例如靶向序列之核苷酸缺失、取代或添加來確定。編碼無催化活性核酸內切酶之基因，例如與(一或多個)效應子域(例如VP64)之全部或一部分(例如，生物活性部分)系留之死亡Cas9 (dCas9，例如D10A；H840A)產生可調節一或多個目標核酸序列之活性及/或表現的嵌合蛋白質。
在一些實施例中，指環載體包括編碼dCas9與一或多個效應子域(例如，全長野生型效應子域或其片段或變異體，例如其生物活性部分)之全部或一部分之融合物的基因以產生適用於本文所述之方法的嵌合蛋白。因此，在一些實施例中，指環載體包括編碼dCas9甲基化酶融合物之基因。在其他一些實施例中，指環載體包括編碼與位點特異性gRNA之dCas9-酶融合物的基因以靶向內源基因。
在其他態樣中，指環載體包括編碼與dCas9融合之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個效應子域(全部或生物活性部分)的基因。 調節序列
在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接於編碼效應子之序列的調節序列，例如啟動子或增強子。
在一些實施例中，啟動子包括與編碼表現產物之DNA序列相鄰定位的DNA序列。啟動子可以操作方式連接於相鄰DNA序列。相比於不存在啟動子時表現產物之量，啟動子通常增加自DNA序列表現之產物的量。來自一個生物體之啟動子可用於增強來自來源於另一生物體之DNA序列的產物表現。舉例而言，脊椎動物啟動子可用於在脊椎動物中表現水母GFP。因此，一個啟動子元件可增強一或多種產物之表現。多個啟動子元件為一般熟習此項技術者熟知的。
在一個實施例中，需要高水準組成性表現。此類啟動子之實例包括但不限於反轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)長末端重複序列(LTR)啟動子/增強子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期啟動子/增強子(參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985))、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、細胞質.β.-肌動蛋白啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
在另一實施例中，可能需要誘導性啟動子。誘導性啟動子為由外源提供之化合物調節之彼等，例如以順式或反式提供，包括但不限於鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子；地塞米松(Dex)誘導性小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子；T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；四環素抑制性系統(Gossen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992))；四環素誘導性系統(Gossen等人, Science, 268:1766-1769 (1995)；亦參見Harvey等人, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998))；RU486誘導性系統(Wang等人, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)及Wang等人, Gene Ther., 4:432-441 (1997)]；及雷帕黴素誘導性系統(Magari等人, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)；Rivera等人, Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))。在此情形下可適用之其他類型之誘導性啟動子為藉由特定生理狀態，例如溫度、急性期或僅在複製細胞中調節之啟動子。
在一些實施例中，使用所關注基因或核酸序列之天然啟動子。當期望基因或核酸序列之表現應模擬天然表現時，可使用天然啟動子。當基因或其他核酸序列之表現必須在時間上或發育上，或以組織特異性方式，或回應於特定轉錄刺激進行調節時，可使用天然啟動子。在另一實施例中，其他天然表現控制元件，諸如增強子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共同序列，亦可用於模擬天然表現。
在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接至組織特異性啟動子的基因。例如，若期望骨胳肌肉中之表現，則可使用在肌肉中有活性之啟動子。此等啟動子包括來自編碼骨骼α-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌肉萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶之基因的啟動子，以及具有高於天然存在之啟動子之活性的合成肌肉啟動子。參見Li等人, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)。組織特異性啟動子之實例為吾人所知：肝白蛋白，Miyatake等人 J. Virol., 71:5124-32 (1997)；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig等人, Gene Ther. 3:1002-9 (1996)；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人, Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)]；骨(骨鈣化素，Stein等人, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)；骨唾液蛋白，Chen等人, J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996))；淋巴細胞(CD2，Hansal等人, J. Immunol., 161:1063-8 (1998)；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體a鏈)；神經元(神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子，Andersen等人 Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)；神經絲輕鏈基因，Piccioli等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)；神經元特異性vgf基因，Piccioli等人, Neuron, 15:373-84 (1995)]；以及其他。
遺傳元件可包括增強子，例如與編碼基因之DNA序列相鄰定位的DNA序列。增強子元件通常位於啟動子元件上游或可位於編碼DNA序列(例如，轉錄或轉譯成一或多種產物之DNA序列)下游或其內。因此，增強子元件可位於編碼產物之DNA序列上游或下游100個鹼基對、200個鹼基對或300個或更多個鹼基對處。增強子元件可將自DNA序列表現之重組產物之量增加至高於由啟動子元件提供之增加的表現。多個增強子元件可易於供一般熟習此項技術者使用。
在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個側接編碼本文所述之表現產物之序列的反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個側接編碼本文所述之表現產物之序列的長末端重複序列(LTR)。可使用之啟動子序列之實例包括但不限於猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子及勞氏肉瘤病毒啟動子。 複製蛋白
在一些實施例中，指環載體，例如合成指環載體之遺傳元件可包括編碼一或多種複製蛋白之序列。在一些實施例中，指環載體可藉由滾環複製方法複製，例如前導股及滯後股之合成為非偶聯的。在此類實施例中，指環載體包含三個元件額外元件：i)編碼起始蛋白之基因，ii)雙股起點，及iii)單股起點。包含複製蛋白之滾環複製(RCR)蛋白複合物結合至前導股且使複製起點不穩定。RCR複合物裂解基因體以產生游離3'OH末端。細胞DNA聚合酶自游離3'OH末端起始病毒DNA複製。在基因體已複製後，RCR複合物共價閉合環。此引起正環狀單股親本DNA分子及由負親本股及新合成之正股構成之環狀雙股DNA分子的釋放。單股DNA分子可經衣殼化或參與第二輪複製。參見例如Virology Journal 2009, 6:60 doi:10.1186/1743-422X-6-60。
遺傳元件可包含編碼聚合酶，例如RNA聚合酶或DNA聚合酶之序列。 其他序列
在一些實施例中，遺傳元件進一步包括編碼產物(例如核糖核酸酶、編碼蛋白質之治療性mRNA、外源基因)之核酸。
在一些實施例中，遺傳元件包括一或多個影響以下各者之序列：物種及/或組織及/或細胞向性(例如衣殼蛋白序列)、感染性(例如衣殼蛋白序列)、免疫抑制/活化(例如調節核酸)、病毒基因體結合及/或封裝、免疫逃避(非免疫原性及/或耐受性)、藥物動力學、內吞作用及/或細胞附著、核進入、細胞內調節及定位、胞外分泌調節、繁殖及宿主或宿主細胞中指環載體之核酸保護。
在一些實施例中，遺傳元件可包含包括DNA、RNA或人工核酸之其他序列。其他序列可包括但不限於基因體DNA、cDNA或編碼tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子之序列。在一個實施例中，遺傳元件包括編碼siRNA以靶向與調節核酸相同之基因表現產物之不同基因座的序列。在一個實施例中，遺傳元件包括編碼siRNA以靶向與調節核酸不同之基因表現產物的序列。
在一些實施例中，遺傳元件進一步包含以下序列中之一或多者：編碼一或多個miRNA之序列、編碼一或多個複製蛋白之序列、編碼外源基因之序列、編碼治療劑之序列、調控序列(例如啟動子、增強子)、編碼一或多個靶向內源基因(siRNA、lncRNA、shRNA)之調節序列的序列以及編碼治療性mRNA或蛋白質之序列。
其他序列之長度可為約2至約5000 nts、約10至約100 nts、約50至約150 nts、約100至約200 nts、約150至約250 nts、約200至約300 nts、約250至約350 nts、約300至約500 nts、約10至約1000 nts、約50至約1000 nts、約100至約1000 nts、約1000至約2000 nts、約2000至約3000 nts、約3000至約4000 nts、約4000至約5000 nts，或其間任何範圍。 經編碼之基因
舉例而言，遺傳元件可包括與信號傳導生化途徑相關之基因，例如信號傳導生化途徑相關基因或聚核苷酸。實例包括疾病相關基因或聚核苷酸。「疾病相關」基因或聚核苷酸係指相比於非疾病對照之組織或細胞，在衍生自受疾病影響之組織的細胞中以異常水準或以異常形式產生轉錄或轉譯產物的任何基因或聚核苷酸。其可為以異常高水準表現之基因；其可為以異常低水準表現之基因，其中改變之表現與疾病之出現及/或進展相關。疾病相關基因亦指具有直接負責或與負責疾病病因之基因處於連鎖不平衡之突變或遺傳變異的基因。
疾病相關基因及聚核苷酸之實例可獲自McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)及National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.)。疾病相關基因及聚核苷酸之實例列於美國專利第8,697,359號之表A及B中，該專利以全文引用之方式併入本文中。疾病特定資訊可獲自McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)及National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.)。信號傳導生化途徑相關基因及聚核苷酸之實例列於美國專利第8,697,359號之表A-C中，該專利以全文引用之方式併入本文中。
此外，遺傳元件可編碼靶向部分，如本文他處所述。此可例如藉由插入編碼糖、醣脂或蛋白質，諸如抗體之聚核苷酸來達成。熟習此項技術者已知用於產生靶向部分之額外方法。 病毒序列
在一些實施例中，遺傳元件包含至少一個病毒序列。在一些實施例中，序列與一或多個來自單股DNA病毒，例如指環病毒(Anellovirus)、雙DNA病毒(Bidnavirus)、環狀病毒(Circovirus)、雙生病毒(Geminivirus)、基因體病毒(Genomovirus)、絲狀病毒(Inovirus)、微小病毒(Microvirus)、矮化病毒(Nanovirus)、小病毒(Parvovirus)及螺旋病毒(Spiravirus)的序列具有同源性或一致性。在一些實施例中，序列與一或多個來自雙股DNA病毒，例如腺病毒(Adenovirus)、壺腹病毒(Ampullavirus)、囊泡病毒(Ascovirus)、非洲豬瘟病毒(Asfarvirus)、桿狀病毒(Baculovirus)、微小紡錘形病毒(Fusellovirus)、球狀病毒(Globulovirus)、滴狀病毒(Guttavirus)、肥大唾腺炎病毒(Hytrosavirus)、疱疹病毒(Herpesvirus)、虹彩病毒(Iridovirus)、脂毛病毒(Lipothrixvirus)、線極病毒(Nimavirus)及痘病毒(Poxvirus)的序列具有同源性或一致性。在一些實施例中，序列與一或多個來自RNA病毒，例如α病毒(Alphavirus)、真菌傳棒狀病毒(Furovirus)、肝炎病毒(Hepatitis virus)、大麥病毒(Hordeivirus)、煙草花葉病毒(Tobamovirus)、煙草脆裂病毒(Tobravirus)、三角病毒(Tricornavirus)、風疹病毒(Rubivirus)、雙RNA病毒(Birnavirus)、囊狀病毒(Cystovirus)、分病毒(Partitivirus)及里奧病毒(Reovirus)的序列具有同源性或一致性。
在一些實施例中，遺傳元件可以包含一或多個來自非致病性病毒，例如共生性病毒，例如共生病毒，例如天然病毒，例如指環病毒之序列。命名法之近期變化將能夠感染人類細胞之三種指環病毒分類為病毒之指環病毒科的α細環病毒(TT)、β細環病毒(TTM)及γ細環病毒(TTMD)屬。迄今，指環病毒尚未與任何人類疾病相關聯。在一些實施例中，遺傳元件可包含與細環病毒(TT)，一種具有環狀、反義基因體之無包膜、單股DNA病毒具有同源性或一致性的序列。在一些實施例中，遺傳元件可包含與SEN病毒、哨兵病毒(Sentinel virus)、TTV樣微型病毒及TT病毒具有同源性或一致性之序列。已描述不同類型之TT病毒，包括TT病毒基因型6、TT病毒組、TTV樣病毒DXL1及TTV樣病毒DXL2。在一些實施例中，遺傳元件可包含與以下各者具有同源性或一致性之序列：較小病毒細環樣微型病毒(TTM)，或基因體大小介於TTV與TTMV之間的第三病毒，稱為細環樣中型病毒(TTMD)。在一些實施例中，遺傳元件可包含一或多個來自非致病性病毒之序列或序列片段，其與本文所述之核苷酸序列中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性。
在一些實施例中，遺傳元件可包含一或多個來自基本上非致病性病毒之序列或序列片段，其與本文，例如表41中所述之核苷酸序列中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性。 表 41 ： 指環病毒及其序列之實例。寄存編號及相關序列資訊可在www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/獲得，如2018年12月11日參考。
寄存編號 描述
AB017613.1 細環病毒16 DNA，完全基因體，分離株：TUS01
AB026345.1 ORF1及ORF2之TT病毒基因，完全cds，分離株：TRM1
AB026346.1 ORF1及ORF2之TT病毒基因，完全cds，分離株：TK16
AB026347.1 ORF1及ORF2之TT病毒基因，完全cds，分離株：TP1-3
AB028669.1 ORF1及ORF2之TT病毒基因，完全基因體，分離株：TJN02
AB030487.1 pORF2a、pORF2b、pORF1之TT病毒基因，完全cds，純系：JaCHCTC19
AB030488.1 pORF2a、pORF2b、pORF1之TT病毒基因，完全cds，純系：JaBD89
AB030489.1 pORF2a、pORF2b、pORF1之TT病毒基因，完全cds，純系：JaBD98
AB038340.1 ORF2s、ORF1、ORF3之TT病毒基因，完全cds
AB038622.1 ORF2、ORF1、ORF3之TT病毒基因，完全cds，分離株：TTVyon-LC011
AB038623.1 ORF2、ORF1、ORF3之TT病毒基因，完全cds，分離株：TTVyon-KC186
AB038624.1 ORF2、ORF1、ORF3之TT病毒基因，完全cds，分離株：TTVyon-KC197
AB041821.1 VP1之TT病毒mRNA，完全cds
AB050448.1 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4之細環病毒基因，完全cds，分離株：TYM9
AB060592.1 細環病毒基因ORF1、ORF2、ORF3、ORF4，純系：SAa-39
AB060593.1 細環病毒基因ORF1、ORF2、ORF3、ORF4，完全cds，純系：SAa-38
AB060595.1 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4之TT病毒基因，完全cds，純系：SAj-30
AB060596.1 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4之TT病毒基因，完全cds，純系：SAf-09
AB064596.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：CT25F
AB064597.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：CT30F
AB064599.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：JT03F
AB064600.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：JT05F
AB064601.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：JT14F
AB064602.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：JT19F
AB064603.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：JT41F
AB064604.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：CT39F
AB064606.1 細環病毒DNA、完全基因體，分離株：JT33F
AB290918.1 細中環病毒1 DNA，完全基因體，分離株：MD1-073
AF079173.1 TT病毒株TTVCHN1，完全基因體
AF116842.1 TT病毒株BDH1，完全基因體
AF122914.3 TT病毒分離株JA20，完全基因體
AF122917.1 TT病毒分離株JA4，完全基因體
AF122919.1 TT病毒分離株JA10未知基因
AF129887.1 TT病毒TTVCHN2，完全基因體
AF247137.1 TT病毒分離株TUPB，完全基因體
AF254410.1 TT病毒ORF2蛋白及ORF1蛋白基因，完全cds
AF298585.1 TT病毒波蘭分離株P/1C1，完全基因體
AF315076.1 TTV樣病毒DXL1未知基因
AF315077.1 TTV樣病毒DXL2未知基因
AF345521.1 TT病毒分離株TCHN-G1 Orf2及Orf1基因，完全cds
AF345522.1 TT病毒分離株TCHN-E Orf2及Orf1基因，完全cds
AF345525.1 TT病毒分離株TCHN-D2 Orf2及Orf1基因，完全cds
AF345527.1 TT病毒分離株TCHN-C2 Orf2及Orf1基因，完全cds
AF345528.1 TT病毒分離株TCHN-F Orf2及Orf1基因，完全cds
AF345529.1 TT病毒分離株TCHN-G2 Orf2及Orf1基因，完全cds
AF371370.1 TT病毒ORF1、ORF3及ORF2基因，完全cds
AJ620212.1 細環病毒，分離株tth6，完全基因體
AJ620213.1 細環病毒，分離株tth10，完全基因體
AJ620214.1 細環病毒，分離株tth11g2，完全基因體
AJ620215.1 細環病毒，分離株tth18，完全基因體
AJ620216.1 細環病毒，分離株tth20，完全基因體
AJ620217.1 細環病毒，分離株tth21，完全基因體
AJ620218.1 細環病毒，分離株tth3，完全基因體
AJ620219.1 細環病毒，分離株tth9，完全基因體
AJ620220.1 細環病毒，分離株tth16，完全基因體
AJ620221.1 細環病毒，分離株tth17，完全基因體
AJ620222.1 細環病毒，分離株tth25，完全基因體
AJ620223.1 細環病毒，分離株tth26，完全基因體
AJ620224.1 細環病毒，分離株tth27，完全基因體
AJ620225.1 細環病毒，分離株tth31，完全基因體
AJ620226.1 細環病毒，分離株tth4，完全基因體
AJ620227.1 細環病毒，分離株tth5，完全基因體
AJ620228.1 細環病毒，分離株tth14，完全基因體
AJ620229.1 細環病毒，分離株tth29，完全基因體
AJ620230.1 細環病毒，分離株tth7，完全基因體
AJ620231.1 細環病毒，分離株tth8，完全基因體
AJ620232.1 細環病毒，分離株tth13，完全基因體
AJ620233.1 細環病毒，分離株tth19，完全基因體
AJ620234.1 細環病毒，分離株tth22g4，完全基因體
AJ620235.1 細環病毒，分離株tth23，完全基因體
AM711976.1 TT病毒sle1957完全基因體
AM712003.1 TT病毒sle1931完全基因體
AM712004.1 TT病毒sle1932完全基因體
AM712030.1 TT病毒sle2057完全基因體
AM712031.1 TT病毒sle2058完全基因體
AM712032.1 TT病毒sle2072完全基因體
AM712033.1 TT病毒sle2061完全基因體
AM712034.1 TT病毒sle2065完全基因體
AY026465.1 TT病毒分離株L01 ORF2及ORF1基因，完全cds
AY026466.1 TT病毒分離株L02 ORF2及ORF1基因，完全cds
DQ003341.1 細環病毒純系P2-9-02 ORF2 (ORF2)、ORF1A (ORF1A)及ORF1B (ORF1B)基因，完全cds
DQ003342.1 細環病毒純系P2-9-07 ORF2 (ORF2)、ORF1A (ORF1A)及ORF1B (ORF1B)基因，完全cds
DQ003343.1 細環病毒純系P2-9-08 ORF2 (ORF2)、ORF1A (ORF1A)及ORF1B (ORF1B)基因，完全cds
DQ003344.1 細環病毒純系P2-9-16 ORF2 (ORF2)、ORF1A (ORF1A)及ORF1B (ORF1B)基因，完全cds
DQ186994.1 細環病毒純系P601 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ186995.1 細環病毒純系P605 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ186996.1 細環病毒純系BM1A-02 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ186997.1 細環病毒純系BM1A-09 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ186998.1 細環病毒純系BM1A-13 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ186999.1 細環病毒純系BM1B-05 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ187000.1 細環病毒純系BM1B-07 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ187001.1 細環病毒純系BM1B-11 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ187002.1 細環病毒純系BM1B-14 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ187003.1 細環病毒純系BM1B-08 ORF2 (ORF2)基因，完全cds；及非功能性ORF1 (ORF1)基因，完全序列
DQ187004.1 細環病毒純系BM1C-16 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ187005.1 細環病毒純系BM1C-10 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cds
DQ187007.1 細環病毒純系BM2C-25 ORF2 (ORF2)基因，完全cds；及非功能性ORF1 (ORF1)基因，完全序列
DQ361268.1 細環病毒分離株ViPi04 ORF1基因，完全cds
EF538879.1 細環病毒分離株CSC5 ORF2及ORF1基因，完全cds
EU305675.1 細環病毒分離株LTT7 ORF1基因，完全cds
EU305676.1 細環病毒分離株LTT10 ORF1基因，完全cds
EU889253.1 細環病毒分離株ViPi08非功能性ORF1基因，完全序列
FJ392105.1 細環病毒分離株TW53A25 ORF2基因，部分cds；及ORF1基因，完全cds
FJ392107.1 細環病毒分離株TW53A27 ORF2基因，部分cds；及ORF1基因，完全cds
FJ392108.1 細環病毒分離株TW53A29 ORF2基因，部分cds；及ORF1基因，完全cds
FJ392111.1 細環病毒分離株TW53A35 ORF2基因，部分cds；及ORF1基因，完全cds
FJ392112.1 細環病毒分離株TW53A39 ORF2基因，部分cds；及ORF1基因，完全cds
FJ392113.1 細環病毒分離株TW53A26 ORF2基因，完全cds；及非功能性ORF1基因，完全序列
FJ392114.1 細環病毒分離株TW53A30 ORF2及ORF1基因，完全cds
FJ392115.1 細環病毒分離株TW53A31 ORF2及ORF1基因，完全cds
FJ392117.1 細環病毒分離株TW53A37 ORF1基因，完全cds
FJ426280.1 細環病毒株SIA109，完全基因體
FR751500.1 細環病毒完全基因體，分離株TTV-HD23a (rheu215)
GU797360.1 細環病毒純系8-17，完全基因體
HC742700.1 來自專利WO2010044889之序列7
HC742710.1 來自專利WO2010044889之序列17
JX134044.1 TTV樣微型病毒分離株TTMV_LY1，完全基因體
JX134045.1 TTV樣微型病毒分離株TTMV_LY2，完全基因體
KU243129.1 TTV樣微型病毒分離株TTMV-204，完全基因體
KY856742.1 TTV樣微型病毒分離株zhenjiang，完全基因體
LC381845.1 細環病毒人類/日本/KS025/2016 DNA，完全基因體
MH648892.1 指環病毒科種屬分離株ctdc048，完全基因體
MH648893.1 指環病毒科種屬分離株ctdh007，完全基因體
MH648897.1 指環病毒科種屬分離株ctcb038，完全基因體
MH648900.1 指環病毒科種屬分離株ctfc019，完全基因體
MH648901.1 指環病毒科種屬分離株ctbb022，完全基因體
MH648907.1 指環病毒科種屬分離株ctcf040，完全基因體
MH648911.1 指環病毒科種屬分離株cthi018，完全基因體
MH648912.1 指環病毒科種屬分離株ctea38，完全基因體
MH648913.1 指環病毒科種屬分離株ctbg006，完全基因體
MH648916.1 指環病毒科種屬分離株ctbg020，完全基因體
MH648925.1 指環病毒科種屬分離株ctci019，完全基因體
MH648932.1 指環病毒科種屬分離株ctid031，完全基因體
MH648946.1 指環病毒科種屬分離株ctdb017，完全基因體
MH648957.1 指環病毒科種屬分離株ctch017，完全基因體
MH648958.1 指環病毒科種屬分離株ctbh011，完全基因體
MH648959.1 指環病毒科種屬分離株ctbc020，完全基因體
MH648962.1 指環病毒科種屬分離株ctif015，完全基因體
MH648966.1 指環病毒科種屬分離株ctei055，完全基因體
MH648969.1 指環病毒科種屬分離株ctjg000，完全基因體
MH648976.1 指環病毒科種屬分離株ctcj064，完全基因體
MH648977.1 指環病毒科種屬分離株ctbj022，完全基因體
MH648982.1 指環病毒科種屬分離株ctbf014，完全基因體
MH648983.1 指環病毒科種屬分離株ctbd027，完全基因體
MH648985.1 指環病毒科種屬分離株ctch016，完全基因體
MH648986.1 指環病毒科種屬分離株ctbd020，完全基因體
MH648989.1 指環病毒科種屬分離株ctga035，完全基因體
MH648990.1 指環病毒科種屬分離株cthf001，完全基因體
MH648995.1 指環病毒科種屬分離株ctbd067，完全基因體
MH648997.1 指環病毒科種屬分離株ctce026，完全基因體
MH648999.1 指環病毒科種屬分離株ctfb058，完全基因體
MH649002.1 指環病毒科種屬分離株ctjj046，完全基因體
MH649006.1 指環病毒科種屬分離株ctcf030，完全基因體
MH649008.1 指環病毒科種屬分離株ctbg025，完全基因體
MH649011.1 指環病毒科種屬分離株ctbh052，完全基因體
MH649014.1 指環病毒科種屬分離株ctba003，完全基因體
MH649017.1 指環病毒科種屬分離株ctbb016，完全基因體
MH649022.1 指環病毒科種屬分離株ctch023，完全基因體
MH649023.1 指環病毒科種屬分離株ctbd051，完全基因體
MH649028.1 指環病毒科種屬分離株ctbf9，完全基因體
MH649038.1 指環病毒科種屬分離株ctbi030，完全基因體
MH649039.1 指環病毒科種屬分離株ctca057，完全基因體
MH649040.1 指環病毒科種屬分離株ctch033，完全基因體
MH649042.1 指環病毒科種屬分離株ctjd005，完全基因體
MH649045.1 指環病毒科種屬分離株ctdc021，完全基因體
MH649051.1 指環病毒科種屬分離株ctdg044，完全基因體
MH649056.1 指環病毒科種屬分離株ctcc062，完全基因體
MH649061.1 指環病毒科種屬分離株ctid009，完全基因體
MH649062.1 指環病毒科種屬分離株ctdc018，完全基因體
MH649063.1 指環病毒科種屬分離株ctbf012，完全基因體
MH649068.1 指環病毒科種屬分離株ctcc066，完全基因體
MH649070.1 指環病毒科種屬分離株ctda011，完全基因體
MH649077.1 指環病毒科種屬分離株ctbh034，完全基因體
MH649083.1 指環病毒科種屬分離株ctdg028，完全基因體
MH649084.1 指環病毒科種屬分離株ctii061，完全基因體
MH649085.1 指環病毒科種屬分離株cteh021，完全基因體
MH649092.1 指環病毒科種屬分離株ctbg012，完全基因體
MH649101.1 指環病毒科種屬分離株ctif053，完全基因體
MH649104.1 指環病毒科種屬分離株ctei657，完全基因體
MH649106.1 指環病毒科種屬分離株ctca015，完全基因體
MH649114.1 指環病毒科種屬分離株ctbf050，完全基因體
MH649122.1 指環病毒科種屬分離株ctdc002，完全基因體
MH649125.1 指環病毒科種屬分離株ctbb15，完全基因體
MH649127.1 指環病毒科種屬分離株ctba013，完全基因體
MH649137.1 指環病毒科種屬分離株ctbb000，完全基因體
MH649141.1 指環病毒科種屬分離株ctbc019，完全基因體
MH649142.1 指環病毒科種屬分離株ctid026，完全基因體
MH649144.1 指環病毒科種屬分離株ctfj004，完全基因體
MH649152.1 指環病毒科種屬分離株ctcj13，完全基因體
MH649156.1 指環病毒科種屬分離株ctci006，完全基因體
MH649157.1 指環病毒科種屬分離株ctbd025，完全基因體
MH649158.1 指環病毒科種屬分離株ctbf005，完全基因體
MH649161.1 指環病毒科種屬分離株ctcf045，完全基因體
MH649165.1 指環病毒科種屬分離株ctcc29，完全基因體
MH649169.1 指環病毒科種屬分離株ctib021，完全基因體
MH649172.1 指環病毒科種屬分離株ctbh857，完全基因體
MH649174.1 指環病毒科種屬分離株ctbj049，完全基因體
MH649178.1 指環病毒科種屬分離株ctfc006，完全基因體
MH649179.1 指環病毒科種屬分離株ctbe000，完全基因體
MH649183.1 指環病毒科種屬分離株ctbb031，完全基因體
MH649186.1 指環病毒科種屬分離株ctcb33，完全基因體
MH649189.1 指環病毒科種屬分離株ctcc12，完全基因體
MH649196.1 指環病毒科種屬分離株ctci060，完全基因體
MH649199.1 指環病毒科種屬分離株ctbb017，完全基因體
MH649203.1 指環病毒科種屬分離株cthc018，完全基因體
MH649204.1 指環病毒科種屬分離株ctbj003，完全基因體
MH649206.1 指環病毒科種屬分離株ctbg010，完全基因體
MH649208.1 指環病毒科種屬分離株ctid008，完全基因體
MH649209.1 指環病毒科種屬分離株ctbg056，完全基因體
MH649210.1 指環病毒科種屬分離株ctda001，完全基因體
MH649212.1 指環病毒科種屬分離株ctcf004，完全基因體
MH649217.1 指環病毒科種屬分離株ctbe029，完全基因體
MH649223.1 指環病毒科種屬分離株ctci016，完全基因體
MH649224.1 指環病毒科種屬分離株ctce11，完全基因體
MH649228.1 指環病毒科種屬分離株ctcf013，完全基因體
MH649229.1 指環病毒科種屬分離株ctcb036，完全基因體
MH649241.1 指環病毒科種屬分離株ctda027，完全基因體
MH649242.1 指環病毒科種屬分離株ctbf003，完全基因體
MH649254.1 指環病毒科種屬分離株ctjb007，完全基因體
MH649255.1 指環病毒科種屬分離株ctbb023，完全基因體
MH649256.1 指環病毒科種屬分離株ctca002，完全基因體
MH649258.1 指環病毒科種屬分離株ctcg010，完全基因體
MH649263.1 指環病毒科種屬分離株ctgh3，完全基因體
MK012439.1 指環病毒科種屬分離株cthe000，完全基因體
MK012440.1 指環病毒科種屬分離株ctjd008，完全基因體
MK012448.1 指環病毒科種屬分離株ctch012，完全基因體
MK012457.1 指環病毒科種屬分離株ctda009，完全基因體
MK012458.1 指環病毒科種屬分離株ctcd015，完全基因體
MK012485.1 指環病毒科種屬分離株ctfd011，完全基因體
MK012489.1 指環病毒科種屬分離株ctba003，完全基因體
MK012492.1 指環病毒科種屬分離株ctbb005，完全基因體
MK012493.1 指環病毒科種屬分離株ctcj014，完全基因體
MK012500.1 指環病毒科種屬分離株ctcb001，完全基因體
MK012504.1 指環病毒科種屬分離株ctcj010，完全基因體
MK012516.1 指環病毒科種屬分離株ctcf003，完全基因體
NC_038336.1 細環病毒5分離株TCHN-C1 Orf2及Orf1基因，完全cds
NC_038338.1 細環病毒11分離株TCHN-D1 Orf2及Orf1基因，完全cds
NC_038339.1 細環病毒13分離株TCHN-A Orf2及Orf1基因，完全cds
NC_038340.1 細環病毒20 ORF4、ORF3、ORF2、ORF1基因，完全cds，純系：SAa-10
NC_038341.1 細環病毒21分離株TCHN-B ORF2及ORF1基因，完全cds
NC_038342.1 細環病毒23 ORF2、ORF1基因，完全cds，分離株：s-TTV CH65-2
NC_038343.1 細環病毒24 ORF4、ORF3、ORF2、ORF1基因，完全cds，純系：SAa-01
NC_038344.1 細環病毒29 ORF2、ORF1、ORF3基因，完全cds，分離株：TTVyon-KC009
NC_038345.1 細小環病毒10分離株LIL-y1 ORF2、ORF1、ORF3及ORF4基因，完全cds
NC_038346.1 細小環病毒11分離株LIL-y2 ORF2、ORF1及ORF3基因，完全cds
NC_038347.1 細小環病毒12分離株LIL-y3 ORF2、ORF1、ORF3及ORF4基因，完全cds
NC_038350.1 細中環病毒3分離株2PoSMA ORF2及ORF1基因，完全cds
NC_038351.1 細中環病毒4分離株6PoSMA ORF2、ORF1及ORF3基因，完全cds
NC_038352.1 細中環病毒5 DNA，完全基因體，分離株：MDJHem2
NC_038353.1 細中環病毒6 DNA，完全基因體，分離株：MDJHem3-1
NC_038354.1 細中環病毒7 DNA，完全基因體，分離株：MDJHem3-2
NC_038355.1 細中環病毒8 DNA，完全基因體，分離株：MDJN1
NC_038356.1 細中環病毒9 DNA，完全基因體，分離株：MDJN2
NC_038357.1 細中環病毒10 DNA，完全基因體，分離株：MDJN14
NC_038358.1 細中環病毒11 DNA，完全基因體，分離株：MDJN47
NC_038359.1 細中環病毒12 DNA，完全基因體，分離株：MDJN51
NC_038360.1 細中環病毒13 DNA，完全基因體，分離株：MDJN69
NC_038361.1 細中環病毒14 DNA，完全基因體，分離株：MDJN97
NC_038362.1 細中環病毒15 DNA，完全基因體，分離株：Pt-TTMDV210
在一些實施例中，遺傳元件包含與來自以下之一或多個序列具有同源性或一致性的一或多個序列：一或多個非指環病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、痘瘡病毒、SV40、乳頭狀瘤病毒；RNA病毒，諸如反轉錄病毒，例如慢病毒；單股RNA病毒，例如肝炎病毒；或雙股RNA病毒，例如輪狀病毒。在一些實施例中，由於缺乏重組反轉錄病毒，因此可提供輔助以產生感染性粒子。此類輔助可例如藉由使用輔助細胞株來提供，該等輔助細胞株含有在LTR內之調節序列控制下編碼反轉錄病毒之所有結構基因的質體。適合於複製本文所述之指環載體的細胞株包括此項技術中已知之細胞株，例如A549細胞，其可如本文所述地修飾。該遺傳元件可另外含有編碼可選標記之基因，以使得可鑑定所需遺傳元件。
在一些實施例中，遺傳元件包括非靜默突變，例如在編碼多肽中產生胺基酸差異之鹼基取代、缺失或添加，只要序列保持與由第一核苷酸序列編碼之多肽至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或以其他方式適用於實踐本發明。就此而言，可進行通常認為不使總體蛋白質功能不活化的某些保守胺基酸取代，諸如關於帶正電荷的胺基酸(且反之亦然)：離胺酸、精胺酸及組胺酸；關於帶負電荷的胺基酸(且反之亦然)：天冬胺酸及麩胺酸；以及關於帶中性電荷之某些胺基酸群組(且在所有情況下，亦反之亦然)：(1)丙胺酸及絲胺酸，(2)天冬醯胺、麩醯胺酸及組胺酸，(3)半胱胺酸及絲胺酸，(4)甘胺酸及脯胺酸，(5)異白胺酸、白胺酸及纈胺酸，(6)甲硫胺酸、白胺酸及異白胺酸，(7)苯丙胺酸、甲硫胺酸、白胺酸及酪胺酸，(8)絲胺酸及蘇胺酸，(9)色胺酸及酪胺酸，以及(10)例如酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸。可根據物理特性及對二級與三級蛋白質結構的影響來對胺基酸進行分類。保守取代在此項技術中公認為一個胺基酸取代具有類似特性之另一胺基酸。
具有相同或指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基的兩個或更多個核酸或多肽序列之一致性(例如在指定區域上之約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性，當在比較窗口或指示區域上比較及比對最大一致性時)可使用BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法在下文所述之預設參數下，或藉由手動比對及目視檢查來量測(參見例如NCBI網站www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或其類似者)。一致性亦可指或可應用於測試序列之互補序列。一致性亦包括具有缺失及/或添加之序列以及具有取代之彼等者。如本文所述，演算法考慮空隙及其類似物。一致性可存在於以下區域上：長度為至少約10個胺基酸或核苷酸、約15個胺基酸或核苷酸、約20個胺基酸或核苷酸、約25個胺基酸或核苷酸、約30個胺基酸或核苷酸、約35個胺基酸或核苷酸、約40個胺基酸或核苷酸、約45個胺基酸或核苷酸、約50個胺基酸或核苷酸或更多個胺基酸或核苷酸。由於遺傳密碼簡併，因此同源核苷酸序列可包括任意數目個靜默鹼基變化，亦即仍然編碼相同胺基酸的核苷酸取代。 蛋白質外部
在一些實施例中，指環載體，例如合成指環載體，包含包封遺傳元件之蛋白質外部。蛋白質外部可包含未能在哺乳動物中引發非所需免疫反應之基本上非致病性外部蛋白質。指環載體之蛋白質外部通常包含可自組裝成構成蛋白質外部之二十面體結構的基本上非致病性蛋白質。
在一些實施例中，蛋白質外部蛋白質由指環載體之遺傳元件之序列(例如，與遺傳元件呈順式)編碼。在其他實施例中，蛋白質外部蛋白質由與指環載體之遺傳元件分離(例如，與遺傳元件呈反式)之核酸(例如如本文所述之穿梭載體)編碼。
在一些實施例中，蛋白質，例如基本上非致病性蛋白質及/或蛋白質外部蛋白質，包含一或多個醣基化胺基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個。
在一些實施例中，蛋白質，例如基本上非致病性蛋白質及/或蛋白質外部蛋白質，包含至少一個親水性DNA結合區、富含精胺酸之區域、富含蘇胺酸之區域、富含麩醯胺酸之區域、N端聚精胺酸序列、可變區、C端聚麩醯胺酸/麩胺酸序列及一或多個二硫橋鍵。
在一些實施例中，蛋白質為衣殼蛋白，例如具有如下之序列：與由編碼本文所述之衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1分子及/或衣殼蛋白序列(例如如本文所述)之核苷酸序列中之任一者編碼之蛋白質具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，蛋白質或衣殼蛋白之功能片段由與例如如本文所述之指環病毒ORF1核酸具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，指環載體包含編碼衣殼蛋白或衣殼蛋白之功能片段的核苷酸序列，或與如本文所述之指環病毒ORF1分子具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，具有較低序列一致性之胺基酸的範圍可提供本文所述之特性及細胞/組織/物種特異性(例如向性)之差異中之一或多者。
在一些實施例中，指環載體缺乏蛋白質外部之脂質。在一些實施例中，指環載體缺乏脂質雙層，例如病毒包膜。在一些實施例中，指環載體之內部完全由蛋白質外部覆蓋(例如，100%覆蓋度)。在一些實施例中，指環載體之內部低於100%由蛋白質外部覆蓋，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更低覆蓋度。在一些實施例中，蛋白質外部包含間隔或不連續處，例如允許水、離子、肽或小分子滲透，只要遺傳元件保留於指環載體中即可。
在一些實施例中，蛋白質外部包含一或多種蛋白質或多肽，其特異性識別及/或結合宿主細胞，例如互補蛋白質或多肽，以介導遺傳元件進入宿主細胞中。
在一些實施例中，蛋白質外部包含以下中之一或多者：富含精胺酸之區域、凝膠捲區域、N22域、高變區及/或C端域，例如ORF1分子，例如如本文所述。在一些實施例中，蛋白質外部包含以下中之一或多者：一或多種醣基化蛋白質、親水性DNA結合區、富含精胺酸之區域、富含蘇胺酸之區域、富含麩醯胺酸之區域、N端聚精胺酸序列、可變區、C端聚麩醯胺酸/麩胺酸序列及一或多個二硫橋鍵。舉例而言，蛋白質外部包含由指環病毒ORF1核酸編碼之蛋白質，例如如本文所述。
在一些實施例中，蛋白質外部包含以下特徵中之一或多者：二十面體對稱性，識別及/或結合與一或多個宿主細胞分子相互作用以介導進入宿主細胞中之分子，缺乏脂質分子，缺乏碳水化合物，pH及溫度穩定性、耐清潔劑，及在宿主中為基本上非免疫原性或非致病性的。 III. 核酸構築體
本文所述之遺傳元件可包括於核酸構築體(例如穿梭載體或供體載體，例如如本文所述)中。
在一個態樣中，本發明包括核酸遺傳元件構築體(例如穿梭載體或供體載體)，其含有包含以下各者之遺傳元件：(i)編碼非致病性外部蛋白質(例如，指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段)之序列，(ii)將遺傳元件結合至非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列，及(iii)編碼效應子之序列。在一些實施例中，核酸遺傳元件構築體包含一或多個桿狀病毒元件(例如桿狀病毒基因體)。在實施例中，在引入至適合宿主細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)中時，核酸遺傳元件構築體包含足以驅動在宿主細胞中產生桿狀病毒(例如包含核酸構築體，例如穿梭載體)的元件。
遺傳元件或遺傳元件內之序列中之任一者可使用任何適合之方法獲得。各種重組方法為此項技術中已知的，諸如自具有病毒序列之細胞中篩選庫、自已知包括序列之核酸構築體中衍生該序列、或使用標準技術自含有其之細胞及組織中直接分離。替代地或組合地，遺傳元件之一部分或全部可以合成方式產生，而非選殖。
在一些實施例中，核酸構築體包括調節元件、與目標基因同源之核酸序列及/或用於在活細胞內及/或當胞內分子存在於目標細胞內時引起報導分子之表現的各種報導子構築體。
報導基因用於識別潛在經轉染細胞及評估調節序列功能。一般而言，報導基因為受體生物體或組織中不存在或表現且編碼表現藉由一些可易於偵測之特性(例如，酶促活性)體現之多肽的基因。在DNA已引入接受者細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tei等人, 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適合之表現系統已熟知且可使用已知技術製備或商業購買。一般而言，將具有展示最高報導基因表現量之最小5'側接區域的構築體鑑定為啟動子。此類啟動子區域可連接至報導基因且用於評估試劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。
在一些實施例中，核酸構築體在宿主細胞中為基本上非致病性及/或基本上非整合的，或在宿主中為基本上非免疫原性的。
在一些實施例中，核酸構築體呈足以調節表型、病毒含量、基因表現、與其他病毒之競爭、疾病病狀等中之一或多者的量，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。 IV. 組合物
本文所述之指環載體亦可包括於具有例如如本文所述之醫藥賦形劑的醫藥組合物中。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14或10 15個指環載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含約10 5-10 15、10 5-10 10或10 10-10 15個指環載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含約10 8(例如，約10 5、10 6、10 7、10 8、10 9或10 10)個基因體當量/毫升之指環載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含10 5-10 10、10 6-10 10、10 7-10 10、10 8-10 10、10 9-10 10、10 5-10 6、10 5-10 7、10 5-10 8、10 5-10 9、10 5-10 11、10 5-10 12、10 5-10 13、10 5-10 14、10 5-10 15或10 10-10 15個基因體當量/毫升之指環載體，例如根據如PCT/US19/65995之實例18之方法所確定。在一些實施例中，醫藥組合物包含足以將每個細胞至少1、2、5、或10、100、500、1000、2000、5000、8,000、1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7或更多個包含於指環載體中之遺傳元件之複本遞送至真核細胞群體的指環載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含足以將每個細胞至少約1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、或約1×10 4-1×10 5、1×10 4-1×10 6、1×10 4-1×10 7、1×10 5-1×10 6、1×10 5-1×10 7或1×10 6-1×10 7個包含於指環載體中之遺傳元件之複本遞送至真核細胞群體的指環載體。
在一些實施例中，醫藥組合物具有以下特徵中之一或多者：醫藥組合物符合醫藥或良好作業規範(GMP)標準；醫藥組合物根據良好作業規範(GMP)製得；醫藥組合物具有低於預定參考值之病原體含量，例如基本上不含病原體；醫藥組合物具有低於之污染物含量，例如基本上不含污染物；或醫藥組合物具有較低免疫原性或基本上無免疫原性，例如如本文所述。
在一些實施例中，醫藥組合物包含低於臨限量之一或多種污染物。醫藥組合物中宜排除或降至最低之例示性污染物包括但不限於宿主細胞核酸(例如，宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、動物衍生之組分(例如血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型病毒、非感染性粒子、游離病毒衣殼蛋白、偶然性物質及聚集體。在實施例中，污染物為宿主細胞DNA。在實施例中，組合物包含每劑量小於約10 ng之宿主細胞DNA。在實施例中，組合物中之宿主細胞DNA之含量藉由過濾及/或酶降解宿主細胞DNA而降低。在實施例中，醫藥組合物由小於10重量% (例如，低於約10重量%、5重量%、4重量%、3重量%、2重量%、1重量%、0.5重量%、或0.1重量%)之污染物組成。
在一個態樣中，本文所述之本發明包括一種醫藥組合物，其包含： a)指環載體，其包含遺傳元件，該遺傳元件包含(i)編碼非致病性外部蛋白質之序列、(ii)將該遺傳元件結合至非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列及(iii)編碼調節核酸之序列；及與遺傳元件相關，例如包封或圍封遺傳元件之蛋白質外部；及 b)醫藥賦形劑。 囊泡
在一些實施例中，組合物進一步包含載劑組分，例如微粒、脂質體、囊泡或外泌體。在一些實施例中，脂質體為由圍繞內部水性隔室之單層或多層脂質雙層及相對不可滲透之外部親脂性磷脂雙層構成的球狀囊泡結構。脂質體可為陰離子型、中性或陽離子型的。脂質體一般具有生物相容性，無毒性，可遞送親水性及親脂性藥物分子，保護其負荷不被血漿酶降解，且將其負載轉運穿過生物膜(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可由數種不同類型之脂質製成；然而，磷脂最常用於生成脂質體作為藥物載劑。劑量可包含但不限於單獨的DOTMA、DOTAP、DOTIM、DDAB，或連同膽固醇產生DOTMA及膽固醇、DOTAP及膽固醇、DOTIM及膽固醇以及DDAB及膽固醇。用於製備多層囊泡脂質之方法為此項技術中已知的(參見例如美國專利第6,693,086號，其關於多層囊泡脂質製備之教示內容以引用的方式併入本文中)。雖然當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可為自發的，但其亦可藉由使用均質機、音波處理器或擠壓設備以震盪形式施加力來加快(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。擠壓脂質可藉由擠壓穿過尺寸減小之過濾器來製備，如Templeton等人, Nature Biotech, 15:647-652, 1997中所述，其中與擠壓脂質製備有關之教示內容以引用之方式併入本文中。
如本文所述，可將添加劑添加至囊泡中以修改其結構及/或特性。舉例而言，可將膽固醇或神經鞘磷脂中之任一者添加至混合物中以幫助使結構穩定及防止內部負荷洩漏。此外，囊泡可由氫化卵磷脂醯膽鹼或卵磷脂醯膽鹼、膽固醇及磷酸二鯨蠟酯製備。(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。此外，囊泡可在合成期間或之後經表面修飾以包括與受體細胞上之反應性基團互補的反應性基團。此類反應性基團包括但不限於順丁烯二醯亞胺基。舉例而言，可合成囊泡以包括順丁烯二醯亞胺結合磷脂，諸如但不限於DSPE-MaL-PEG2000。
囊泡調配物可主要包含天然磷脂及脂質，諸如1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DSPC)、神經鞘磷脂、卵磷脂醯膽鹼及單唾液酸神經節苷脂。由磷脂構成之調配物僅在血漿中較不穩定。然而，用膽固醇操縱脂質膜減少經囊封負荷之快速釋放或1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)增加穩定性(關於綜述，參見例如Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。
在實施例中，脂質可用於形成脂質微粒。脂質包括但不限於DLin-KC2-DMA4、C12-200及共脂質二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(disteroylphosphatidyl choline)、膽固醇及PEG-DMG可使用自發性囊泡形成程序調配(參見例如Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3)。組分莫耳比可為約50/10/38.5/1.5 (DLin-KC2-DMA或C12-200/二硬脂醯基磷脂醯膽鹼/膽固醇/PEG-DMG)。Tekmira在美國及海外具有約95個專利系列，涉及脂質微粒及脂質微粒調配物之各種態樣(參見例如美國專利第7,982,027；7,799,565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,915,399；8,236,943及7,838,658號，及歐洲專利第1766035；1519714；1781593及1664316號)，其均可用於及/或適用於本發明。
在一些實施例中，微粒包含以隨機方式配置之一或多種固化聚合物。微粒可為可生物降解的。可使用例如此項技術中已知之方法合成可生物降解之微粒，包括但不限於溶劑蒸發、熱熔微囊封裝、溶劑移除及噴霧乾燥。用於合成微粒之例示性方法係由Bershteyn等人, Soft Matter 4:1787-1787, 2008及在US 2008/0014144 A1中描述，其與微粒合成相關之特定教示內容以引用的方式併入本文中。
可用以形成可生物降解微粒之例示性合成聚合物包括但不限於脂族聚酯、聚(乳酸) (PLA)、聚(乙醇酸) (PGA)、乳酸與乙醇酸之共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)、聚酸酐、聚(鄰)酯、聚胺基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)及聚(丙交酯-共-己內酯)、及天然聚合物，諸如白蛋白、海藻酸鹽及其他多醣，包括聚葡萄糖及纖維素、膠原蛋白、其化學衍生物，包括化學基團之取代、添加，諸如烷基、伸烷基、羥基化、氧化、及藉由熟習此項技術者常規進行之其他改質)、白蛋白及其他親水性蛋白質、玉米蛋白及其他醇溶蛋白及疏水性蛋白，其共聚物及混合物。一般而言，此等材料藉由酶水解或暴露於水、藉由表面或整體侵蝕而降解。
微粒之直徑範圍介於0.1-1000微米(µm)。在一些實施例中，其直徑之大小範圍為1-750 µm，或50-500 µm，或100-250 µm。在一些實施例中，其直徑之大小範圍為50-1000 µm、50-750 µm、50-500 µm或50-250 µm。在一些實施例中，其直徑之大小範圍為.05-1000 µm、10-1000 µm、100-1000 µm或500-1000 µm。在一些實施例中，其直徑為約0.5 µm、約10 µm、約50 µm、約100 µm、約200 µm、約300 µm、約350 µm、約400 µm、約450 µm、約500 µm、約550 µm、約600 µm、約650 µm、約700 µm、約750 µm、約800 µm、約850 µm、約900 µm、約950 µm或約1000 µm。如在微粒直徑之情形下所用，術語「約」意謂所陳述之絕對值+/-5%。
在一些實施例中，配位體經由存在於粒子表面上且存在於待連接之配位體上的官能性化學基團(羧酸、醛類、胺硫氫基及羥基)與微粒之表面結合。可藉由例如在微粒之乳液製備期間將穩定劑與官能性化學基團合併而將官能基引入至微粒中。
將官能基引入至微粒之另一實例為在粒子製備後期間藉由使粒子及配位體與同型或異型雙官能交聯劑直接交聯來進行。此程序可使用適合之化學及一類交聯劑(如下文更詳細地論述之CDI、EDAC、戊二醛等)或在製備之後經由粒子表面之化學改質將配位體偶聯至粒子表面的任何其他交聯劑。此亦包括兩親媒性分子，諸如脂肪酸、脂質或功能性穩定劑藉此可被動地吸附且黏附至粒子表面，藉此引入用於系留至配位體之功能性端基的方法。
在一些實施例中，微粒可經合成以在其外部表面上包含一或多個靶向基團以靶向特定細胞或組織類型(例如心肌細胞)。此等靶向基團包括但不限於受體、配位體、抗體及其類似基團。此等靶向基團結合細胞表面上之其搭配物。在一些實施例中，微粒將整合至包含細胞表面之脂質雙層中且將粒線體遞送至細胞。
微粒亦可在其最外表面上包含脂質雙層。此雙層可由一或多種相同或不同類型之脂質組成。實例包括但不限於磷脂，諸如磷酸膽鹼及磷酸肌醇。特定實例包括但不限於DMPC、DOPC、DSPC及各種其他脂質，諸如本文針對脂質體所述之脂質。
在一些實施例中，載劑包含奈米粒子，例如如本文所述。
在一些實施例中，本文所述之囊泡或微粒係用診斷劑功能化。診斷劑之實例包括但不限於用於正電子發射斷層攝影術(PET)、電腦輔助斷層攝影術(CAT)、單光子發射電腦斷層攝影術、x射線、螢光檢查及磁共振成像(MRI)之市售成像劑；及造影劑。適用作MRI中之造影劑之適合的材料之實例包括釓螯合物，以及鐵、鎂、錳、銅及鉻。 載劑
本文所述之組合物(例如醫藥組合物)可包含用載劑調配及/或在載劑中遞送。在一個態樣中，本發明包括一種含有包含(例如囊封)本文所述之組合物(例如本文所述之指環載體、指環病毒或遺傳元件)之載劑(例如囊泡、脂質體、脂質奈米粒子、外泌體、紅血球、外泌體(例如哺乳動物或植物外泌體)、融質體)的組合物，例如醫藥組合物。
在一些實施例中，本文所述之組合物及系統可在脂質體或其他類似囊泡中調配。通常，脂質體為由圍繞內部水性區室之單層或多層脂質雙層及相對不可滲透之外部親脂性磷脂雙層構成的球狀囊泡結構。脂質體可為陰離子型、中性或陽離子型的。脂質體通常具有以下特徵中之一或多者(例如全部)：生物相容性、無毒性、可遞送親水性及親油性藥物分子二者、可保護其負荷免於受血漿酶降解，且可將其負載轉運穿過生物膜及血腦障壁(BBB) (參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679；及Zylberberg及Matosevic. 2016. Drug Delivery, 23:9, 3319-3329, doi: 10.1080/10717544.2016.1177136)。
囊泡可由數種不同類型之脂質製成；然而，磷脂最常用於生成脂質體作為藥物載劑。用於製備多層囊泡脂質之方法為已知的(參見例如美國專利第6,693,086號，其關於多層囊泡脂質製備之教示內容以引用的方式併入本文中)。雖然當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可為自發的，但其亦可藉由使用均質機、音波處理器或擠壓設備以震盪形式施加力來加快(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。擠壓脂質可藉由擠壓穿過尺寸減小之過濾器來製備，如Templeton等人, Nature Biotech, 15:647-652, 1997中所述。
脂質奈米粒子(LNP)為向本文所述之醫藥組合物提供生物相容及可生物降解遞送系統之載劑的另一實例。參見例如Gordillo-Galeano等人. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 第133卷, 2018年12月, 第285-308頁。奈米結構脂質載劑(NLC)為保留SLN特徵、改良藥物穩定性及負載能力且防止藥物洩漏之經修飾固體脂質奈米粒子(SLN)。聚合物奈米粒子(PNP)為藥物遞送之重要組成部分。此等奈米粒子可有效地將藥物遞送引導至特定目標，且改良藥物穩定性及受控藥物釋放。亦可採用脂質-聚合物奈米粒子(PLN)，其為組合脂質體及聚合物之一種新型載劑。此等奈米粒子具有PNP及脂質體之互補優點。PLN由核殼結構構成；聚合物核提供穩定結構，且磷脂殼提供良好生物相容性。因此，兩種組分增加藥物囊封效率，促進表面修飾，且防止水溶性藥物洩漏。關於評述，參見例如Li等人 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122。
外泌體亦可用作本文所述之組合物及系統的藥物遞送媒劑。關於評述，參見Ha等人 2016年7月. Acta Pharmaceutica Sinica B. 第6卷, 第4期, 第287-296頁；doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
離體分化之紅血球亦可用作本文所述之組合物的載劑。參見例如WO2015073587；WO2017123646；WO2017123644；WO2018102740；WO2016183482；WO2015153102；WO2018151829；WO2018009838；Shi等人 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136；美國專利9,644,180；Huang等人 2017. Nature Communications 8: 423；Shi等人 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136。
例如如WO2018208728中所述之融質體組合物亦可用作載劑以遞送本文所述之組合物。 膜滲透多肽
在一些實施例中，組合物進一步包含膜滲透多肽(MPP)，以攜帶組分進入細胞中或穿過膜，例如細胞或細胞核膜。能夠促進將物質轉運穿過膜之膜滲透多肽包括但不限於細胞穿透肽(CPP) (參見例如美國專利第8,603,966號)、用於植物胞內遞送之融合肽(參見例如Ng等人, PLoS One, 2016, 11:e0154081)、蛋白質轉導域、Trojan肽及膜易位信號(MTS) (參見例如Tung等人, Advanced Drug Delivery Reviews 55:281-294 (2003))。一些MPP富含具有帶正電側鏈之胺基酸，諸如精胺酸。
膜滲透多肽具有誘導組分之膜滲透及允許在全身性投與時在多個組織之細胞內大分子活體內易位的能力。膜滲透多肽亦可指當在適當條件下與細胞接觸時以遠大於被動擴散所能達到的量自外部環境進入胞內環境，包括細胞質、細胞器(諸如粒線體)或細胞核的肽。
轉運穿過膜之組分可以可逆或不可逆方式連接至膜滲透多肽。連接子可為化學鍵，例如一或多個共價鍵或非共價鍵。在一些實施例中，連接子為肽連接子。此類連接子可介於2-30個胺基酸之間或更長。連接子包括可撓性、剛性或可裂解連接子。 組合
在一個態樣中，本文所述之指環載體或包含指環載體之組合物亦可包括一或多個異源部分。在一個態樣中，本文所述之指環載體或包含指環載體之組合物亦可包括融合物中之一或多個異源部分。在一些實施例中，異源部分可與遺傳元件連接。在一些實施例中，異源部分可圍封於蛋白質外部中作為指環載體之部分。在一些實施例中，異源部分可與指環載體一起投與。
在一個態樣中，本發明包括細胞或組織，其包含本文所述之指環載體及異源部分中之任一者。
在另一態樣中，本發明包括一種醫藥組合物，其包含本文所述之指環載體及異源部分。
在一些實施例中，異源部分可為病毒(例如效應子(例如藥物、小分子)、靶向劑(例如DNA靶向劑、抗體、受體配位體)、標籤(例如螢光團、感光劑，諸如KillerRed)或本文所述之編輯或靶向部分。在一些實施例中，本文所述之膜易位多肽連接至一或多個異源部分。在一個實施例中，異源部分為小分子(例如肽模擬物或分子量低於2000道爾頓之小有機分子)、肽或多肽(例如抗體或其抗原結合片段)、奈米粒子、適體或藥劑。 病毒
在一些實施例中，指環載體或組合物(例如如本文所述)可進一步包含來自除指環病毒以外之病毒的一或多個組分或元件(例如核酸或多肽)，例如作為異源部分，例如單股DNA病毒，例如雙DNA病毒、環狀病毒、雙生病毒、基因體病毒、絲狀病毒、微小病毒、矮化病毒、小病毒及螺旋病毒。在一些實施例中，該組合物可進一步包含雙股DNA病毒，例如腺病毒(Adenovirus)、壺腹病毒(Ampullavirus)、囊泡病毒(Ascovirus)、非洲豬瘟病毒(Asfarvirus)、桿狀病毒(Baculovirus)、微小紡錘形病毒(Fusellovirus)、球狀病毒(Globulovirus)、滴狀病毒(Guttavirus)、肥大唾腺炎病毒(Hytrosavirus)、疱疹病毒(Herpesvirus)、虹彩病毒(Iridovirus)、脂毛病毒(Lipothrixvirus)、線極病毒(Nimavirus)及痘病毒(Poxvirus)。在一些實施例中，該組合物可進一步包含RNA病毒，例如α病毒(Alphavirus)、真菌傳棒狀病毒(Furovirus)、肝炎病毒(Hepatitis virus)、大麥病毒(Hordeivirus)、煙草花葉病毒(Tobamovirus)、煙草脆裂病毒(Tobravirus)、三角病毒(Tricornavirus)、風疹病毒(Rubivirus)、雙RNA病毒(Birnavirus)、囊狀病毒(Cystovirus)、分病毒(Partitivirus)及里奧病毒(Reovirus)。在一些實施例中，指環載體係與作為異源部分之病毒一起投與。
在一些實施例中，異源部分可包含非致病性，例如共生性、共生、天然病毒。在一些實施例中，非致病性病毒為一或多種指環病毒，例如α細環病毒(TT)、β細環病毒(TTM)及γ細環病毒(TTMD)。在一些實施例中，指環病毒可包括細環病毒(TT)、SEN病毒、哨兵病毒、TTV樣微型病毒、TT病毒、TT病毒基因型6、TT病毒組、TTV樣病毒DXL1、TTV樣病毒DXL2、細環樣微型病毒(TTM)或細環樣中型病毒(TTMD)。在一些實施例中，非致病性病毒包含與本文所述之核苷酸序列中之任一者具有至少至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的一或多個序列。
在一些實施例中，異源部分可包含鑑定為在個體中缺乏之一或多個病毒。舉例而言，可向鑑定為具有病毒病(dyvirosis)之個體投與包含指環載體及在該個體中不平衡或具有不同於參考值之比率的一或多個病毒組分或病毒之組合物，例如健康個體。
在一些實施例中，異源部分可包含一或多個非指環病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、痘瘡病毒、SV40、乳頭狀瘤病毒；RNA病毒，諸如反轉錄病毒，例如慢病毒；單股RNA病毒，例如肝炎病毒；或雙股RNA病毒，例如輪狀病毒。在一些實施例中，指環載體或病毒為有缺陷的，或需要輔助以便產生感染性粒子。此類輔助可例如藉由使用輔助細胞株來提供，該等輔助細胞株含有在LTR內之調節序列控制下編碼複製缺陷性指環載體或病毒之結構基因中之一或多者(例如全部)的核酸，例如整合至基因體中之質體或DNA。適合於複製本文所述之指環載體的細胞株包括此項技術中已知之細胞株，例如A549細胞，其可如本文所述地修飾。 靶向部分
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含靶向部分，例如特異性結合至存在於目標細胞上之所關注分子的靶向部分。靶向部分可調節所關注分子或細胞之特定功能，調節特定分子(例如酶、蛋白質或核酸)，例如路徑中之所關注分子下游的特定分子，或特異性結合至目標以定位指環載體或遺傳元件。舉例而言，靶向部分可包括與所關注特定分子相互作用以提高、降低或以其他方式調節其功能的治療劑。 標記或監測部分
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含用以標記或監測本文所述之指環載體或遺傳元件的標籤。標記或監測部分可藉由化學劑或酶裂解，諸如蛋白分解或內含肽剪接移除。親和標籤可適用於使用親和技術純化經標記多肽。一些實例包括幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)及聚(His)標籤。溶解標籤可適用於輔助在伴隨蛋白缺陷型物種，諸如大腸桿菌中表現之重組蛋白質以幫助蛋白質之恰當摺疊且阻止其沈澱。一些實例包括硫氧還蛋白(TRX)及聚(NANP)。標記或監測部分可包括光敏標籤，例如螢光。螢光標籤可用於觀測。GFP及其變異體為常用作螢光標籤之一些實例。蛋白質標籤可允許發生特異性酶修飾(諸如藉由生物素連接酶進行之生物素標記)或化學修飾(諸如與FlAsH-EDT2反應以便螢光成像)。通常合併標記或監測部分，以便將蛋白質連接至多個其他組分。標記或監測部分亦可藉由特異性蛋白分解或酶裂解(例如藉由TEV蛋白酶、凝血酶、Xa因子或腸肽酶)移除。 奈米粒子
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含奈米粒子。奈米粒子包括尺寸在約1與約1000奈米之間、尺寸在約1與約500奈米之間、尺寸在約1與約100 nm之間、尺寸在約50 nm與約300 nm之間、尺寸在約75 nm與約200 nm之間、尺寸在約100 nm與約200 nm之間及其間任何範圍的無機材料。奈米粒子通常具有奈米尺度尺寸之複合結構。在一些實施例中，奈米粒子通常為球形的，但取決於金屬奈米粒子組合物，不同形態為可能的。與奈米粒子之外部環境接觸的奈米粒子之部分通常鑑定為奈米粒子之表面。在本文所述之奈米粒子中，尺寸限制可限於二維，且因此，奈米粒子包括直徑為約1至約1000 nm之複合結構，其中特定直徑取決於金屬奈米粒子組合物及根據實驗設計之奈米粒子的預期用途。舉例而言，用於治療性應用之奈米粒子通常具有約200 nm或更低之尺寸。
奈米粒子之額外所需特性，諸如表面電荷及空間穩定性，亦可鑒於所關注之特定應用而變化。諸如癌症治療之臨床應用中可能需要的例示性特性描述於Davis等人, Nature 2008 第7卷, 第771-782頁; Duncan, Nature 2006 第6卷, 第688-701頁; and Allen, Nature 2002 第2卷，第750-763頁中，其各自以全文引用的方式併入本文中。在閱讀本發明時，熟習此項技術者可鑑定額外特性。奈米粒子尺寸及特性可藉由此項技術中已知之技術來偵測。用以偵檢粒子尺寸之例示性技術包括但不限於動態光散射(DLS)及多種顯微法，諸如穿透式電子顯微法(TEM)及原子力顯微法(AFM)。用於偵測粒子形態之例示性技術包括但不限於TEM及AFM。用於偵測奈米粒子之表面電荷的例示性技術包括但不限於ζ電位方法。適合於偵測其他化學特性之額外技術包含 1H、 11B及 13C及 19F NMR、UV/Vis及紅外線/拉曼光譜法(Raman spectroscopy)及螢光光譜法(在奈米粒子與螢光標記組合使用時)及可藉由熟習此項技術者鑑定之額外技術。 小分子
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含小分子。小分子部分包括但不限於小肽、肽模擬物(例如類肽)、胺基酸、胺基酸類似物、合成聚核苷酸、聚核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、通常具有低於約5,000公克/莫耳之分子量的有機及無機化合物(包括異質性及/或有機金屬化合物)，例如具有低於約2,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，例如具有低於約1,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，例如具有低於約500公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，及此類化合物之鹽、酯及其他醫藥學上可接受之形式。小分子可包括但不限於神經傳遞質、激素、藥物、毒素、病毒或微生物粒子、合成分子及促效劑或拮抗劑。
適合之小分子的實例包括描述於「The Pharmacological Basis of Therapeutics」, Goodman及Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), 第九版, 根據以下部分: Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites；Drugs Acting on the Central Nervous System；Autacoids: Drug Therapy of Inflammation；Water, Salts and Ions；Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism；Cardiovascular Drugs；Drugs Affecting Gastrointestinal Function；Drugs Affecting Uterine Motility；Chemotherapy of Parasitic Infections；Chemotherapy of Microbial Diseases；Chemotherapy of Neoplastic Diseases；Drugs Used for Immunosuppression；Drugs Acting on Blood-Forming organs；Hormones and Hormone Antagonists；Vitamins, Dermatology; and Toxicology中之彼等小分子，其全部以引用的方式併入本文中。小分子之一些實例包括但不限於朊病毒藥物，諸如他克莫司(tacrolimus)、泛蛋白連接酶或HECT接合酶抑制劑，諸如heclin；組蛋白修飾藥物，諸如丁酸鈉；酶抑制劑，諸如5-氮雜-胞苷；蒽環黴素，諸如小紅莓；β-內醯胺，諸如青黴素；抗菌劑；化學治療劑；抗病毒劑；來自其他生物體之調節劑，諸如VP64；及具有不充分生物可用性之藥物，諸如具有缺陷型藥物動力學之化學治療劑。
在一些實施例中，小分子為表觀遺傳調節劑，例如de Groote等人 Nuc. Acids Res. (2012):1-18中所述之彼等。例示性小分子表觀遺傳調節劑描述於例如Lu等人 J. Biomolecular Screening 17.5(2012):555-71中，例如表1或2中，以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含伏立諾他(vorinostat)或羅米地辛(romidepsin)。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含I、II、III及/或IV類組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含SirTI之活化劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含山竹醇(Garcinol)、Lys-CoA、C646、(+)-JQI、I-BET、BICI、MS120、DZNep、UNC0321、EPZ004777、AZ505、AMI-I、吡唑醯胺7b、苯并[d]咪唑17b、醯基化二胺苯碸衍生物(例如PRMTI)、甲基司他(methylstat)、4,4'-二羧基-2,2'-聯吡啶、SID 85736331、氧肟酸鹽類似物8、丹尼賽普羅米(tanylcypromie)、雙胍及二胍多元胺類似物、UNC669、維達紮(Vidaza)、地西他濱(decitabine)、苯丁酸鈉(SDB)、類脂酸(LA)、槲皮素、丙戊酸、聯胺肼(hydralazine)、複方新諾明(bactrim)、綠茶提取物(例如表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG))、薑黃素(curcumin)、蘿蔔硫素(sulforphane)及/或大蒜素/二烯丙基二硫化物。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑抑制DNA甲基化，例如為DNA甲基轉移酶之抑制劑(例如為5-氮胞苷及/或地西他濱(decitabine))。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑調節組蛋白修飾，例如組蛋白乙醯化、組蛋白甲基化、組蛋白類泛素化及/或組蛋白磷酸化。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑為組蛋白脫乙醯基酶之抑制劑(例如，為伏立諾他(vorinostat)及/或曲古黴素A(trichostatin A))。
在一些實施例中，小分子為醫藥活性劑。在一個實施例中，小分子為代謝活性或組分之抑制劑。適用類別之醫藥活性劑包括但不限於抗生素、消炎藥、血管生成或血管活性劑、生長因子及化學治療(抗贅生)劑(例如腫瘤抑制劑)。可使用來自本文所述之類別及實例或來自(Orme-Johnson 2007, Methods Cell Biol. 2007;80:813-26)之一個分子或分子之組合。在一個實施例中，本發明包括包含抗生素、消炎藥、血管生成或血管活性劑、生長因子或化學治療劑之組合物。 肽或蛋白質
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含肽或蛋白質。肽部分可包括但不限於肽配位體或抗體片段(例如結合受體，諸如胞外受體之抗體片段)、神經肽、激素肽、肽藥物、毒性肽、病毒或微生物肽、合成肽及促效性或拮抗性肽。
肽部分可為線性的或分支的。肽之長度為約5至約200個胺基酸、約15至約150個胺基酸、約20至約125個胺基酸、約25至約100個胺基酸或其間任何範圍。
肽之一些實例包括但不限於螢光標籤或標記、抗原、抗體、抗體片段(諸如單域抗體)、配位體及受體(諸如類升糖素肽-1 (GLP-1)、GLP-2受體2、膽囊收縮素B (CCKB)及生長抑素受體)、肽治療劑(諸如結合至特定細胞表面受體，諸如G蛋白偶聯受體(GPCR)或離子通道之彼等)、合成肽或來自天然生物活性肽之類似物肽、抗微生物肽、成孔肽、靶向腫瘤或細胞毒性肽及降解或自毀肽(諸如誘導細胞凋亡之肽信號或感光劑肽)。
本文所述之適用於本發明之肽亦包括小抗原結合肽，例如抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體(參見例如Steeland等人. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113)。此類小抗原結合肽可結合細胞溶質抗原、細胞核抗原或細胞器內抗原。
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體包括連接至能夠靶向特定位置、組織或細胞之配位體的多肽。 寡核苷酸適體
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含寡核苷酸適體。適體部分為寡核苷酸或肽適體。寡核苷酸適體為單股DNA或RNA (ssDNA或ssRNA)分子，其可結合至包括具有高親和力及特異性之蛋白質及肽的預先選擇目標。
寡核苷酸適體為可經由重複數輪之活體外選擇或同等方法，SELEX (指數富集的配位體系統進化)工程化以便結合於諸如小分子、蛋白質、核酸及甚至細胞、組織及生物體之多種分子目標的核酸物種。適體提供辨別性分子識別，且可由化學合成產生。另外，適體可具有所需儲存特性，且在治療性應用中引發極少免疫原性或無免疫原性。
DNA及RNA適體均可對各種目標展現出穩固的結合親和力。舉例而言，已選擇DNA及RNA適體用於t溶菌酶、凝血酶、人類免疫不全病毒反式作用反應元件(HIV TAR) (參見en.wikipedia.org/wiki/Aptamer - cite_note-10)、氯化血紅素、干擾素γ、血管內皮生長因子(VEGF)、前列腺特異性抗原(PSA)、多巴胺及非典型致癌基因、熱休克因子1 (HSF1)。 肽適體
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含肽適體。肽適體具有一個(或多個)短可變肽域，包括具有低分子量12-14 kDa之肽。肽適體可經設計以特異性結合至且干擾細胞內之蛋白質-蛋白質相互作用。
肽適體為經選擇或工程化以結合特定目標分子之人工蛋白質。此等蛋白質包括可變序列之一或多個肽環。其通常自組合庫分離，且通常隨後藉由定向突變或數輪可變區突變誘發及選擇來改良。肽適體可活體內結合細胞蛋白質目標且發揮生物效應，包括干擾其經靶向分子與其他蛋白質之正常蛋白質相互作用。特定言之，針對連接至轉錄因子活化域之目標蛋白質篩選連接至轉錄因子結合域之不同肽適體環。經由此選擇策略將肽適體活體內結合至其目標係偵測為下游酵母標記基因之表現。此類實驗鑑定由適體結合之特定蛋白質，及適體破壞以引起表型之蛋白質相互作用。另外，用適當功能性部分衍生之肽適體可引起其目標蛋白質之特異性轉譯後修飾，或改變目標之亞細胞定位。
肽適體亦可活體外識別目標。其已發現代替生物感測器中之抗體使用且用於偵測來自含有無活性及活性蛋白質形式兩者之群體的蛋白質之活性同功型。稱為蝌蚪之衍生物，其中肽適體「頭部」經共價連接至特異性序列雙股DNA「尾部」，允許藉由其DNA尾部之PCR (使用例如定量即時聚合酶鏈反應)在混合物中定量稀有的目標分子。
可使用不同系統選擇肽適體，但當前酵母雙雜交系統使用最多。肽適體亦可選自藉由噬菌體呈現及其他表面呈現技術，諸如mRNA呈現、核糖體呈現、細菌呈現及酵母呈現構築之組合肽庫。此等實驗程序亦稱為生物淘選(biopannings)。在自生物淘選獲得之肽中，可將模擬抗原決定基(mimotope)視為一種肽適體。自組合肽庫淘選之所有肽已儲存於名為MimoDB之特殊資料庫中。 V. 宿主細胞
本發明進一步關於包含例如如本文所述之指環載體、穿梭載體或供體載體的宿主或宿主細胞。在一些實施例中，宿主或宿主細胞為昆蟲細胞(例如Sf9細胞、Sf21細胞或Hi5細胞)。在一些實施例中，昆蟲細胞衍生自家蠶( Bombyx mori)、甘藍夜蛾( Mamestra brassicae)、草地黏蟲( Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾( Trichoplusia ni)或黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)。在一些實施例中，宿主或宿主細胞為細菌細胞(例如大腸桿菌細胞，例如DH 10Bac細胞)。在某些實施例中，如本文所證實，所提供之指環載體感染一系列不同目標宿主細胞(例如植物細胞、昆蟲細胞、細菌細胞、真菌細胞或動物細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞)。目標宿主細胞包括中胚層、內胚層或外胚層來源之細胞。目標宿主細胞包括例如上皮細胞、肌肉細胞、白血球(例如淋巴細胞)、腎臟組織細胞、肺組織細胞。
在一些實施例中，指環載體在宿主中為基本上非免疫原性的。指環載體或遺傳元件未能藉由宿主之免疫系統產生非所需實質性反應。一些免疫反應包括但不限於體液免疫反應(例如抗原特異性抗體之產生)及細胞介導之免疫反應(例如淋巴細胞增殖)。
在一些實施例中，宿主或宿主細胞與指環載體接觸(例如感染)。在一些實施例中，宿主為哺乳動物，諸如人類。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞，例如人類細胞。宿主中之指環載體的量可在投與之後的任何時間量測。在某些實施例中，確定指環載體在培養物中生長之時程。
在一些實施例中，指環載體，例如如本文所述之指環載體為可遺傳的。在一些實施例中，指環載體在流體及/或細胞中自母親至孩童線性地傳輸。在一些實施例中，來自原始宿主細胞之子細胞包含指環載體。在一些實施例中，母體以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之效率，或自宿主細胞至子細胞之至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率將指環載體傳輸至兒童。在一些實施例中，宿主細胞中之指環載體在減數分裂期間具有25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率。在一些實施例中，宿主細胞中之指環載體在有絲分裂期間具有至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率。在一些實施例中，細胞中之指環載體具有約10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-99%或其間之任何百分比的傳輸效率。
在一些實施例中，指環載體，例如指環載體在宿主細胞內複製。在實施例中，宿主細胞為昆蟲細胞(例如Sf9細胞、Sf21細胞或Hi5細胞)。在一個實施例中，指環載體能夠在哺乳動物細胞，例如人類細胞中複製。在其他實施例中，指環載體為複製缺陷型或複製非勝任型。
雖然在一些實施例中，指環載體在宿主細胞中複製，但指環載體不例如與宿主之染色體一起整合至宿主之基因體中。在一些實施例中，指環載體例如與宿主之染色體具有可忽略的重組頻率。在一些實施例中，指環載體例如與宿主之染色體的重組頻率為例如低於約1.0 cM/Mb、0.9 cM/Mb、0.8 cM/Mb、0.7 cM/Mb、0.6 cM/Mb、0.5 cM/Mb、0.4 cM/Mb、0.3 cM/Mb、0.2 cM/Mb、0.1 cM/Mb或更低。 VI. 使用方法
本文所述之指環載體及包含指環載體之組合物可用於治療例如有需要之個體(例如哺乳動物個體，例如人類個體)之病症、疾病或病狀的方法中。投與本文所述之醫藥組合物可例如藉助於非經腸(包括靜脈內、瘤內、腹膜內、肌肉內、腔內及皮下)投與。指環載體可單獨投與或調配為醫藥組合物。
指環載體可以單位劑量組合物，諸如單位劑量非經腸組合物形式投與。此類組合物通常藉由摻合來製備，且可適合地經調適用於非經腸投與。此類組合物可例如呈可注射及可輸注溶液或懸浮液或栓劑或氣溶膠形式。
在一些實施例中，投與例如如本文所述之指環載體或包含其之組合物可使得將包含指環載體之遺傳元件遞送至目標細胞，例如個體之目標細胞。
本文所述之指環載體或其組合物，例如包含效應子(例如，內源性或外源性效應子)，可用於將效應子遞送至細胞、組織或個體。在一些實施例中，指環載體或其組合物用於將效應子遞送至骨髓、血液、心臟、GI或皮膚。藉由投與本文所述之指環載體組合物遞送效應子可調節(例如增加或降低)細胞、組織或個體之非編碼RNA或多肽的表現量。以此方式調節表現量可引起效應子遞送至之細胞中的功能活性改變。在一些實施例中，經調節功能活性在本質上可為酶、結構或調節性的。
在一些實施例中，指環載體或其複本可在遞送至細胞中之後24小時(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、30天或1個月)在細胞中偵測到。在實施例中，指環載體或其組合物介導對目標細胞之作用，且該作用持續至少1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。在一些實施例中(例如，其中該指環載體或其組合物包含編碼外源性蛋白質之遺傳元件)，該作用持續低於1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。
可用本文所述之指環載體或包含指環載體之組合物治療之疾病、病症及病狀的實例包括但不限於：免疫病症、干擾素病變(例如I型干擾素病變)、傳染病、發炎性病症、自體免疫病狀、癌症(例如實體腫瘤，例如肺癌；非小細胞肺癌，例如表現對mIR-625反應之基因，例如凋亡蛋白酶-3的腫瘤)及腸胃疾病。在一些實施例中，指環載體調節(例如增加或降低)與指環載體接觸之細胞中之活性或功能。在一些實施例中，指環載體調節(例如增加或降低)與指環載體接觸之細胞中之分子(例如核酸或蛋白質)的含量或活性。在一些實施例中，指環載體降低與指環載體接觸之細胞(例如癌細胞)的存活率，例如降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。在一些實施例中，指環載體包含降低與指環載體接觸之細胞(例如癌細胞)之存活率，例如降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的效應子，例如miRNA，例如miR-625。在一些實施例中，指環載體例如藉由增加凋亡蛋白酶-3活性來增加與指環載體接觸之細胞(例如癌細胞)的細胞凋亡，例如增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。在一些實施例中，指環載體包含例如藉由增加凋亡蛋白酶-3活性來增加與指環載體接觸之細胞(例如癌細胞)的細胞凋亡，例如增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的效應子，例如miRNA，例如miR-625。 VII. 投與 / 遞送
組合物(例如包含如本文所述之指環載體的醫藥組合物)可經調配以包括醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥組合物可視情況包含一或多種額外活性物質，例如治療性及/或預防性活性物質。本發明之醫藥組合物可無菌及/或不含熱原質。在調配及/或製造藥劑中之一般考慮因素可見於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (以引用之方式併入本文中)中。
儘管本文中所提供之醫藥組合物之說明主要針對適用於向人類投與之醫藥組合物，但熟習此項技術者應理解，此類組合物通常適用於向任何其他動物投與，例如向非人類動物，例如非人類哺乳動物投與。應充分理解，為使組合物適用於向各種動物投與，對適用於向人類投與之醫藥組合物進行修改，且一般熟練的獸醫藥理學家可僅用一般實驗(若存在)設計及/或進行此類修改。醫藥組合物之投與所涵蓋的個體包括但不限於人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠及/或大鼠；及/或鳥類，包括商業相關之鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。
本文所述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後研發之任何方法來進行製備。一般而言，此類製備方法包括使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分結合，且隨後必要時及/或需要時將產物分割、成型及/或封裝之步驟。
在一個態樣中，本發明提供一種向個體遞送指環載體之方法。該方法包括向個體投與包含如本文所述之指環載體的醫藥組合物。在一些實施例中，所投與之指環載體在個體中複製(例如，成為個體之病毒體的一部分)。
醫藥組合物可包括野生型或天然病毒元件及/或經修飾病毒元件。指環載體可包括一或多個指環病毒序列(例如，核酸序列或編碼其胺基酸序列之核酸序列)或與其具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。指環載體可包含與一或多個指環病毒序列(例如，指環病毒ORF1核酸序列)具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性之核酸序列的核酸分子。指環載體可包含編碼與指環病毒胺基酸序列(例如，指環病毒ORF1分子之胺基酸序列)具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性之胺基酸序列的核酸分子。指環載體可含有包含與指環病毒胺基酸序列(例如，指環病毒ORF1分子之胺基酸序列)具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。
在一些實施例中，指環載體足以增加(刺激)內源基因及蛋白質表現，例如與參考，例如健康對照相比，增加至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在某些實施例中，指環載體足以降低(抑制)內源基因及蛋白質表現，例如與參考，例如健康對照相比，降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
在一些實施例中，指環載體抑制/增強宿主或宿主細胞中之一或多種病毒特性，例如向性、感染性、免疫抑制/活化，例如與參考，例如健康對照相比，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
在一些實施例中，向個體投與進一步包含未在病毒遺傳資訊中表示之一或多個病毒株的醫藥組合物。
在一些實施例中，包含本文所述之指環載體的醫藥組合物以足以調節病毒感染之劑量及時間投與。病毒感染之一些非限制性實例包括腺相關病毒、愛知病毒(Aichi virus)、澳大利亞蝙蝠狂犬病毒、BK多瘤病毒、班納病毒(Banna virus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest virus)、布尼安維拉病毒(Bunyamwera virus)、拉克羅斯布尼亞病毒(Bunyavirus La Crosse)、雪足野兔布尼亞病毒(Bunyavirus snowshoe hare)、獼猴疱疹病毒、金迪普拉病毒(Chandipura virus)、屈公病毒、科薩奇病毒A、牛痘病毒、柯薩奇病毒、克里米亞-岡果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、登革熱病毒、多理病毒(Dhori virus)、達格畢病毒(Dugbe virus)、杜文海格病毒(Duvenhage virus)、東部馬腦炎病毒、埃博拉病毒、埃可病毒、腦心肌炎病毒、埃-巴二氏病毒、歐洲蝙蝠狂犬病毒、GB病毒C/G型肝炎病毒、漢坦病毒(Hantaan virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、E型肝炎病毒、D型肝炎病毒、馬痘病毒、人類腺病毒、人類星狀病毒、人類冠狀病毒、人類巨細胞病毒、人類腸病毒68、人類腸病毒70、人類疱疹病毒1、人類疱疹病毒2、人類疱疹病毒6、人類疱疹病毒7、人類疱疹病毒8、人類免疫不全病毒、人類乳頭狀瘤病毒1、人類乳頭狀瘤病毒2、人類乳頭狀瘤病毒16、人類乳頭狀瘤病毒18、人類副流感、人類小病毒B19、人類呼吸道融合病毒、人類鼻病毒、人類SARS冠狀病毒、人類泡沫病毒、人類T-嗜淋巴細胞病毒、人類環曲病毒屬、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、JC多瘤病毒、日本腦炎病毒、胡甯沙狀病毒(Junin arenavirus)、KI多瘤病毒、庫京病毒(Kunjin virus)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus)、維多利亞湖馬堡病毒(Lake Victoria marburgvirus)、蘭加特病毒(Langat virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、洛茲達雷病毒(Lordsdale virus)、跳躍病(Louping ill)病毒、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、馬丘波病毒(Machupo virus)、馬雅羅病毒(Mayaro virus)、MERS冠狀病毒、麻疹病毒、門戈腦心肌炎病毒(Mengo encephalomyocarditis virus)、梅克爾細胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus)、莫科拉病毒(Mokola virus)、傳染性軟疣病毒、猴痘病毒、腮腺炎病毒、莫雷穀腦炎病毒(Murray valley encephalitis virus)、紐約病毒(New York virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、諾沃克病毒(Norwalk virus)、奧尼永-尼永病毒(O'nyong-nyong virus)、口瘡病毒(Orf virus)、奧羅普切病毒(Oropouche virus)、皮欽德病毒(Pichinde virus)、脊髓灰白質炎病毒、龐塔托魯靜脈病毒(Punta toro phlebovirus)、撲嗎拉病毒(Puumala virus)、狂犬病病毒、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒(Rift valley fever virus)、羅沙病毒(Rosavirus) A、羅斯河病毒(Ross river virus)、輪狀病毒A、輪狀病毒B、輪狀病毒C、風疹病毒、鷺山病毒(Sagiyama virus)、薩利病毒(Salivirus) A、西西里白蛉熱病毒(Sandfly fever sicilian virus)、劄幌病毒(Sapporo virus)、勝利基森林病毒(Semliki forest virus)、首爾病毒(Seoul virus)、猴泡沫病毒、猴病毒5、辛得比斯病毒(Sindbis virus)、南安普頓病毒(Southampton virus)、聖路易腦炎病毒(St. louis encephalitis virus)、蜱傳波瓦生病毒(Tick-borne powassan virus)、細環病毒、托斯卡納病毒(Toscana virus)、尤尤庫尼米病毒(Uukuniemi)、痘瘡病毒、水痘-帶狀疱疹病毒、天花病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、水泡性口炎病毒、西部馬腦炎病毒、WU多瘤病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、亞巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)、亞巴樣疾病病毒、黃熱病病毒及茲卡病毒(Zika Virus)。在某些實施例中，指環載體足以勝過及/或取代已存在於個體中之病毒，例如與參考相比至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在某些實施例中，指環載體足以與慢性或急性病毒感染競爭。在某些實施例中，可預防性投與指環載體以保護免於病毒感染(例如前病毒)。在一些實施例中，指環載體之量足以調節(例如，表型、病毒含量、基因表現、與其他病毒競爭、疾病病狀等，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多)。在一些實施例中，治療(treatment)、治療(treating)及其同源詞包含個體之醫療管理(例如，藉由投與指環載體，例如如本文所述製得之指環載體)，例如意欲改善、改進、穩定、預防或治癒疾病、病理性病狀或病症。在一些實施例中，治療包含積極治療(針對改善疾病、病理性病狀或病症之治療)；病因治療(針對相關疾病、病理性病狀或病症之病因的治療)；姑息性治療(經設計用於緩解症狀之治療)；預防性治療(針對預防、最小化或部分或完全抑制相關疾病、病理性病狀或病症之發展的治療)；及/或支持性治療(用於補充另一療法之治療)。
本文引用之所有參考文獻及出版物以引用的方式併入本文中。
提供以下實例以進一步說明本發明之一些實施例，但不意欲限制本發明之範疇；藉由其例示性性質，應瞭解，可替代地使用熟習此項技術者已知之其他程序、方法或技術。 實例 目錄實例1: 在桿狀病毒表現系統中產生指環病毒蛋白質 實例2：在Sf9細胞中表現環1 ORF 實例3：在Sf9細胞中表現環2 ORF 實例4：在Sf9細胞中同時表現所有環2 ORF 實例5：在Sf9細胞中共遞送及獨立表現指環病毒基因體及重組指環病毒ORF 實例6：指環病毒ORF1與Sf9細胞中之DNA結合以形成藉由等密度離心分離之複合物 實例7：使用桿狀病毒自一系列不同的指環病毒表現ORF1蛋白 實例8：桿狀病毒構築體之活體外組裝 實例9：合成指環載體構築體之製備 實例10：指環載體之組裝及感染 實例11：指環載體之選擇性 實例12：複製缺陷型指環載體及輔助病毒 實例13：複製勝任型指環載體之製造方法 實例14：複製缺陷型指環載體之製造方法 實例15：使用懸浮液細胞產生指環載體 實例16：利用指環載體在小鼠中表現外源性蛋白質 實例17：表現外源性微小RNA序列之指環載體的功能效應 實例18：用於表現外源性非編碼RNA之指環載體的製備及產生 實例19：來自指環載體之內源性miRNA的表現及內源性miRNA之缺失 實例20：活體內外源性蛋白質之指環載體遞送 實例21：活體外環化指環病毒基因體 實例22：產生含有具有來自不同細環病毒菌株之高變域之嵌合ORF1的指環載體 實例23：產生含有非TTV蛋白質/肽而非高變域之嵌合ORF1 實例24：基於tth8及LY2之指環載體各自成功地將EPO基因轉導至肺癌細胞中 實例25：在靜脈內(i.v.)投與之後可活體內偵測到具有治療性轉殖基因之指環載體 實例26：活體外環化基因體作為用於活體外產生指環載體之輸入材料 實例 1 ： 在桿狀病毒表現系統中產生指環病毒蛋白質
在此實例中，來自ThermoFisher Scientific之桿狀病毒表現系統(目錄號A38841)適用於表現指環病毒蛋白質。簡言之，將所關注基因(例如編碼如本文所述之指環病毒ORF的基因)選殖至pFastBac質體中，其接著轉型至含有桿狀病毒基因體之DH10Bac大腸桿菌細胞中。轉型體係根據製造商說明書在指示盤上生長且選擇白色菌落用於液體培養及提取穿梭載體DNA。藉由PCR驗證指環病毒ORF重組至穿梭載體中。
接著將展示指環病毒ORF基因之成功重組的經驗證穿梭載體構築體轉染至ExpiSf9昆蟲細胞中。細胞在27℃非加濕、非CO 2氛圍培育箱中在設定為125 rpm之定軌振盪器上培育。轉染後72小時之後，自上清液收集第0代(P0)重組桿狀病毒。
使用25-100 μL P0桿狀病毒儲備液感染ExpiSf9細胞以製備用於蛋白質生產之第1代(P1)桿狀病毒。在感染後96小時(約4天)之後，收集上清液以獲得P1桿狀病毒。
P1重組桿狀病毒藉由在新鮮ExpiSf CD培養基中以1200 μL總體積製備測試病毒之五個10倍連續稀釋液進行滴定。將800 μL Expisf9細胞以1.25×10 6個活細胞/毫升接種於深孔盤中，且將1000 μL測試病毒之不同稀釋液添加至各孔中。將一個孔設定為陰性對照。接著將盤在27℃下在以225±5 rpm之振盪平台上的非加濕培育箱中培育隔夜。在培育大約14-16小時後，自培育箱中移出盤且將所有物質轉移至微量離心管中，且以300×g旋轉5分鐘。抽吸上清液且將各細胞集結粒再懸浮於100 μL含有0.15 μg/mL之最終濃度之抗桿狀病毒包膜gp64 APC抗體的稀釋緩衝液(PBS+2%胎牛血清)中。將管在室溫下培育30分鐘。樣品接著用1 mL PBS洗滌，接著以300×g離心10分鐘。抽吸上清液且將細胞集結粒再懸浮於1 mL稀釋緩衝液中。在流式細胞儀上使用以下參數分析樣品：紅色雷射激發：633-647 nm；發射：660 nm。記錄表現陽性gp64百分比之具有不同病毒稀釋度的樣品且用於計算病毒效價。
對於此實例及以下實例，使用上文所述之方法產生一系列重組穿梭載體及桿狀病毒載體用於表現。如下表X中所示，將來自LY2、tth8及其他指環病毒株之各種ORF選殖至穿梭載體中。ORF用有或無人類鼻病毒3C (HRV 3C)蛋白水解裂解位點之N端His標籤、C端His標籤標記或保持未標記，如所指示。 表 X. 產生之重組穿梭載體構築體。「 FullORF 」 = 含完全 ORF 之 區域，其中非編碼區域經移除； ORF2/3 經 標記。
構築體編號 / 名稱 菌株 環編號 ORF 標籤類型 標籤位置 pFastBac 穿梭載體 桿狀病毒 製造
tth8 ORF1 tth8 環1 ORF1 無標籤 NA 是 是 否 自產
tth8 ORF1 N-His tth8 環1 ORF1 6xHis N-ter 是 是 是 自產
tth8 ORF1 C-His tth8 環1 ORF1 6xHis C-ter 是 是 是 自產
tth8 ORF2 tth8 環1 ORF2 無標籤 NA 是 是 是 自產
tth8 ORF2 C-His tth8 環1 ORF2 6xHis C-ter 是 是 是 自產
tth8 ORF1/1 tth8 環1 ORF1/1 無標籤 NA 是 是 是 自產
tth8 ORF1/1 C-His tth8 環1 ORF1/1 6xHis C-ter 是 是 是 自產
tth8 ORF1/2 tth8 環1 ORF1/2 無標籤 NA 是 是 是 自產
tth8 ORF1/2 C-His tth8 環1 ORF1/2 6xHis C-ter 是 是 是 自產
tth8 ORF2/2 tth8 環1 ORF2/2 無標籤 NA 是 是 是 自產
tth8 ORF2/2 C-His tth8 環1 ORF2/2 6xHis C-ter 是 是 是 自產
tth8 ORF2/3 tth8 環1 ORF2/3 無標籤 NA 是 是 是 自產
tth8 ORF2/3 C-His tth8 環1 ORF2/3 6xHis C-ter 是 是 是 自產
tth8 FullORF tth8 環1 FullORF 無標籤 NA 是 是 是 自產
tth8 FullORF C-His tth8 環1 FullORF 6xHis C-ter 是 是 是 自產
tth8 ORF2 C-His tth8 環1 ORF2/ORF1 6xHis C-ter 是 是 是 自產
環 3.1 ORF1 6B.CD8.contig3 環3.1 ORF1 無標籤 NA 否 否 否 自產
環 3.1 ORF1 C-His 6B.CD8.contig3 環3.1 ORF1 6xHis C-ter 是 是 是 自產
環 3.1 ORF2 6B.CD8.contig3 環3.1 ORF2 無標籤 NA 否 否 否 自產
環 3.1 ORF2 C-His 6B.CD8.contig3 環3.1 ORF2 6xHis C-ter 是 是 是 自產
環 3.1 ORF2/ORF1 C-His 6B.CD8.contig3 環3.1 ORF2/ORF1 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 FullORF LY2 環2 FullORF 無標籤 NA 是 是 否 自產
LY2 FullORF N-His LY2 環2 FullORF 6xHis N-ter 是 是 是 自產
LY2 FullORF C-His LY2 環2 FullORF 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1 LY2 環2 ORF1 無標籤 NA 是 是 否 自產
LY2 ORF1 N-His LY2 環2 ORF1 6xHis N-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1 C-His LY2 環2 ORF1 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1(dR) LY2 環2 ORF1 (富含δ-精胺酸之區域) 無標籤 NA 是 否 否 自產
LY2 ORF1(dR) N-His LY2 環2 ORF1 (富含δ-精胺酸之區域) 6xHis N-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1(dR) C-His LY2 環2 ORF1 (富含δ-精胺酸之區域) 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1/1 LY2 環2 ORF1/1 無標籤 NA 是 是 否 自產
LY2 ORF1/1 N-His LY2 環2 ORF1/1 6xHis N-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1/1 C-His LY2 環2 ORF1/1 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1/2 LY2 環2 ORF1/2 無標籤 NA 是 是 否 自產
LY2 ORF1/2 N-His LY2 環2 ORF1/2 6xHis N-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1/2 C-His LY2 環2 ORF1/2 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF2 LY2 環2 ORF2 無標籤 NA 是 是 否 自產
LY2 ORF2 N-His LY2 環2 ORF2 6xHis N-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF2 C-His LY2 環2 ORF2 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF2/2 LY2 環2 ORF2/2 無標籤 NA 是 是 否 自產
LY2 ORF2/2 N-His LY2 環2 ORF2/2 6xHis N-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF2/2 C-His LY2 環2 ORF2/2 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF2/3 LY2 環2 ORF2/3 無標籤 NA 是 是 否 自產
LY2 ORF2/3 N-His LY2 環2 ORF2/3 6xHis N-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF2/3 C-His LY2 環2 ORF2/3 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF2/ORF1 C-His LY2 環2 ORF2/ORF1 6xHis C-ter 是 是 是 自產
LY2 ORF1 HisE354 LY2 環2 ORF1 6xHis After E354 是 是 否 自產
LY2 ORF1 HisN299 LY2 環2 ORF1 6xHis After N299 是 是 否 自產
LY2 ORF1 HisL267 LY2 環2 ORF1 6xHis After L267 是 是 否 自產
tth8 ORF1 (JA20 HVR) tth8 環1 ORF1 (具有JA20之高變區) 6xHis C-ter 是 否 否 自產
tth8 ORF1 (TJN02 HVR) tth8 環1 ORF1 (具有TJN02之高變區) 6xHis C-ter 是 否 否 自產
tth8 ORF1 (TTV16 HVR) tth8 環1 ORF1 (具有TTV16之高變區) 6xHis C-ter 是 否 否 自產
環2 ORF1 (CodOpt) LY2 環2 ORF1 (密碼子最佳化) 無標籤 NA 是 是 是 Medigen
環2 ORF1 (CodOpt) HRV3C-6His LY2 環2 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis C-ter 是 是 是 Medigen
環4 ORF1 (CodOpt) 6B.CD8.contig2 環4 ORF1 (密碼子最佳化) 無標籤 NA 是 是 是 Medigen
RIng4 ORF1 (CodOpt) HRV3C-6His 6B.CD8.contig2 環4 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis C-ter 是 是 是 Medigen
RIng5.2 ORF1 (CodOpt) CT30F 環5.2 ORF1 (密碼子最佳化) 無標籤 NA 是 是 是 Medigen
環5.2 ORF1 (CodOpt) HRV3C-6His CT30F RIng5.2 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis C-ter 是 是 是 Medigen
環6 ORF1 (CodOpt) 190783.3 環6 ORF1 (密碼子最佳化) 無標籤 NA 是 是 是 Medigen
環6 ORF1 (CodOpt) HRV3C-6His 190783.3 環6 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis C-ter 是 是 是 Medigen
環1 ORF1 (CosOpt) His tth8 環1 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis C-ter 是 是 是 Medigen
Rig3.1 ORF1 (CodOpt) His 6B.CD8.contig3 環3.1 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis C-ter 是 是 是 Medigen
環7 ORF1 (CodOpt) His 190783.4 環7 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis C-ter 是 是 是 Medigen
環2 (CodOpt) N-His LY2 環2 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis N-ter 是 是 是 Medigen
環2 (CodOpt) N-His (PS) LY2 環2 ORF1 (密碼子最佳化) 6xHis-PreScision蛋白酶識別序列) N-ter 是 是 是 Medigen
環2串聯 LY2 環2 2×全基因體(無多角體蛋白啟動子) 無標籤 NA 是 是 是 Medigen
WTLY2 LY2 環2 全基因體 無標籤 NA 是 是 是 自產
WTtth8 tth8 環1 全基因體 無標籤 NA 是 是 是 自產
WTtth8 (反向) tth8 環1 全基因體(具有反向5'多角體蛋白啟動子) 無標籤 NA 是 是 是 自產
LoxPWTLY2 LY2 環2 LoxP-全基因體-LoxP 無標籤 NA 是 是 是 自產
Cre-R NA NA Cre重組酶 無標籤 NA 是 是 是 自產
在感染前一天，ExpiSf9細胞在125 ml Nalgene單次用PETG Erlenmeyer平底燒瓶[Thermofisher Scientific目錄號：4115-0125]中以5x10 6個細胞/毫升接種於25 ml室溫ExpiSf9 CD培養基中。監測細胞存活率以確保其維持在95%或更高。以逐滴方式將100 μL ExpiSf Enhancer溶液添加至細胞中。將細胞在27℃非加濕、空氣調節、非CO 2氛圍培育箱中使用定軌振盪器以125±5 rpm振盪培育隔夜。在第1天，在添加ExpiSf Enhancer之後大約18-24小時，用指定桿狀病毒以5之感染倍率(MOI)感染細胞且在相同條件下培育。在感染後72小時收集細胞且發現存活率在60%與80%之間的範圍內。為分析樣品，藉由添加1× Bolt LDS樣品緩衝液[Invitrogen目錄號：B0007]及1× Bolt還原劑[Invitrogen目錄號：B0009]且音波處理2.5分鐘來溶解細胞。如圖1中所示，C-His標記之LY2 ORF1截至感染後第2天成功表現於感染ExpiSf9細胞中，如由使用抗聚組胺酸抗體之西方墨點法所測定。另外，藉由考馬斯染色偵測到桿狀病毒蛋白質，指示成功感染。
如圖2中所示，C-His標記之tth8 ORF1及ORF1/1截至感染後第2天亦成功表現於經感染ExpiSf9細胞中。
亦在感染之ExpiSf9細胞中偵測到N端His標記之LY2 ORF1表現(圖3)。此處，構築體包含N端His標籤，其後緊接著為野生型ORF1序列(泳道1、2、9、10或14)；或N端His標籤，其後接著為鼻病毒3C裂解序列(泳道3、11)。泳道1至7中之樣品為直接負載至凝膠上之溶解物，而泳道9至15中之樣品係藉由首先經由超速離心自條件培養基粒化蛋白質且以小100倍之體積再懸浮集結粒來製備。以小(5 mL)規模生長泳道1至3及9至11中所示之樣品。泳道6及14中之樣品係獲自10 L培養物。因此，此實例展示自複數個具有N端或C端聚組胺酸標籤之菌株產生ORF1可以5 mL至10 L範圍內之規模成功進行，且ORF1可見於Sf9溶解物或培養物上清液(條件培養基)中。 實例 2 ：在 Sf9 細胞中表現環 1 ORF
在此實例中，用tth8 ORF之替代佈置產生一系列重組桿狀病毒，各標記有C端聚組胺酸(圖4)。重組桿狀病毒設計包括針對各tth8 ORF剪接變異體(亦即，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3)之一個桿狀病毒構築體，以及含有由桿狀病毒多角體蛋白啟動子驅動之來自tth8之完全ORF區域的「FullORF」構築體。此等桿狀病毒係如實例1中所述地產生。
接著藉由西方墨點使用抗聚組胺酸抗體來偵測蛋白質表現。如圖4中所示，偵測到His標記之tth8 ORF ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3。 實例 3 ：在 Sf9 細胞中表現環 2 ORF
在一個實例中，用環2 ORF之替代佈置產生一系列重組桿狀病毒，各自在C端用聚組胺酸標籤進行標記(圖5)。重組桿狀病毒設計包括針對環2 ORF剪接變異體(亦即，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3)中之每一者的一個桿狀病毒構築體、其中N端富含精胺酸之區域(RRR)缺失的變異體(ORF1ΔRRR)以及含有由桿狀病毒多角體蛋白啟動子驅動之來自環2之完全ORF區域的「FullORF」構築體。對於各實驗條件，ExpiSf9細胞用表現個別環2變異體之重組桿狀病毒以5之MOI感染。此實驗條件如實例1及2中所述。
隨後使用抗His，藉由西方墨點偵測蛋白質表現。如圖5中所示，His標記之環2 ORF ORF1、ORF1ΔRRR、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3全部被偵測到。
在作為此實例之一部分的另一實驗中，包含環2 ORF1編碼序列及/或環2 ORF2剪接變異體編碼序列之重組桿狀病毒用於感染Sf9細胞。測試之表現條件包括單獨的ORF1，或ORF1+「FullORF」、ORF1+ORF2、ORF1+ORF2/2及ORF1+ORF2/3之共感染，以及陰性對照標記之『Neg』。對於各條件，ExpiSf9細胞以5之MOI與桿狀病毒共感染。實驗條件如實例1及2中所述。接著針對各條件藉由西方墨點使用抗His或抗環2 N22評估ORF1、ORF2、ORF2/2及ORF2/3之蛋白質表現。後者為藉由用大腸桿菌中產生之環2 ORF1之N22片段使小鼠免疫且接著產生融合瘤而獲得的單株抗體。
如圖6中所示，在各ORF1感染條件下，兩個西方法(Western)均偵測到作為約81 kD處之帶的ORF1。ORF1帶在抗N22西方法中由虛線框突出顯示，且在陰性對照(Neg)樣品中不可見。由兩種抗體偵測到的較低分子量(約10 kD)帶被視為ORF1之C端片段。亦在對應樣品中偵測到ORF2、ORF2/2及ORF2/3 (抗His墨點)。因此，此實例說明ORF1以及ORF2之個別剪接變異體均可在昆蟲細胞中共表現。 實例 4 ：在 Sf9 細胞中同時表現所有環 2 ORF
在一個實例中，產生一系列六種重組桿狀病毒，其各自經設計以表現特定環2 ORF(亦即ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3)，各自用His標籤標記(圖7)，如實例3中所述。Sf9細胞用環2 ORF桿狀病毒之各種組合感染，特定言之，各情況涉及用除一個ORF構築體以外的所有構築體感染細胞，如圖7中所指示。接著使用抗His藉由全細胞懸浮液之西方墨點來偵測蛋白質表現。如圖7中所示，以預期模式偵測到His標記之環2 ORF。偵測到所有ORF，或除省略之一個ORF以外的所有ORF。 實例 5 ： 在 Sf9 細胞中共遞送及獨立表現指環病毒基因體及重組指環病毒 ORF
在此實例中，藉由轉染活體外環化(IVC)指環病毒基因體且用編碼在C端用六-組胺酸標記之ORF1的桿狀病毒感染細胞而在Sf9細胞中共遞送指環病毒ORF及基因體(圖8)。接著藉由西方墨點使用靶向N22片段之抗His、抗ORF2及抗ORF1單株抗體來偵測蛋白質表現。如(圖8，項目編號1)所示，在此製劑中偵測到His標記之ORF1，展示自桿狀病毒載體之成功重組ORF1表現。與此結果一致，使用抗ORF1抗體偵測到相同ORF1蛋白(圖8，下圖，最右泳道)。
在經處理細胞之相同樣品中，天然指環病毒啟動子在Sf9細胞中展示轉錄活性，因為偵測到ORF2表現(圖8，項目編號3)且僅可藉由轉染至細胞中之IVC基因體產生。
另外，使用活體外環化(IVC)構築體及FullORF桿狀病毒，指環病毒ORF共遞送且表現於Sf9細胞中。接著藉由西方墨點，使用抗His、抗環2 ORF2及抗環2 ORF1 N22來偵測蛋白質表現。在細胞中偵測到ORF1蛋白(圖8，項目編號4)且可為IVC或FullORF桿狀病毒構築體之產物。出人意料地，容易偵測到ORF2蛋白且其強度表明該表現源自FullORF桿狀病毒構築體(圖8，項目編號2)。
作為指環病毒基因體在昆蟲細胞中表現其基因之能力的另一測試，將tth8指環病毒編碼區在兩個方向上選殖至pFastBac載體中。此產生『FullORF』tth8桿狀病毒構築體，其中多角體蛋白啟動子定位於編碼區之有義或反義方向上游。後一組態極不可能起始指環病毒基因轉錄。與吾人在環2中出人意料的觀測結果一致，tth8 ORF2之表現獨立於編碼區相對於桿狀病毒多角體蛋白啟動子之定向，表明表現係由指環病毒啟動子驅動(圖9，約15及20 kDa之帶)。
此實例展示IVC轉染及桿狀病毒感染可將功能性指環病毒基因共遞送至Sf9昆蟲細胞，且天然指環病毒啟動子在此等細胞中為活性的。 實例 6 ： 指環病毒 ORF1 與 Sf9 細胞中 之 DNA 結合以形成藉由等密度離心分離之複合物
在此實例中，Sf9細胞經IVC指環病毒基因體LY2轉染，經具有C端聚-組胺酸標籤之編碼LY2 ORF1的桿狀病毒感染，且接著分級分離以確定使用桿狀病毒表現系統表現之ORF1是否形成可在活體外分離之蛋白質-DNA複合物。
藉由將8 ml 1.2 g/ml CsCl溶液(於TN緩衝液中；20 mM Tris pH 8.0、140 mM NaCl)添加至SW32.1 Ti轉子之超速離心管(Ultra-Clear 17 ml-Beckman #344061)中來製備CsCl梯度。管用8 ml 40% CsCl (於TN緩衝液中)覆蓋，接著蓋上蓋子且在Gradient Master程式5-50%上運行13分鐘以製備線性梯度。移除蓋子，且梯度用0.5 ml-2 ml Sf9溶解物覆蓋至各管中，且用含有0.001% Poloxamer-188之TN緩衝液加滿至接近頂部。超速離心在22,500×RPM下持續18.5小時。藉由刺穿管底部且允許約600 μl級分流入深孔區塊之孔中而自梯度收集級分。量測各樣品之折射率以測定其密度。
接著藉由首先自級分提取DNA，且接著藉由進行qPCR來測定級分中之指環病毒DNA含量。Pure Link Viral DNA提取套組[ThermoFisher Scientific目錄號12280050]用於自50 μL級分純化病毒DNA。樣品用蛋白酶K處理且使用溶解緩衝液藉由在56℃下培育15分鐘溶解，用99%乙醇洗滌且轉移至Viral Spin Column。樣品以6800×g離心，用套組提供之500 μL洗滌緩衝液洗滌兩次且再次離心。將100 μL無RNA酶之水添加至管柱中以溶離DNA。
對於qPCR，將2×TaqMan基因表現預混液、100μM LY2引子正向(AGCAACAGGTAATGGAGGAC)、100μM LY2反向(TGAA GCTGGGGTCTTTAAC)連同100μM LY2探針(TCTAC CTAGGTGCAAA GGGCC)一起稀釋於5.83 μL無核酸酶之水中以用於各反應。以下條件用於各qPCR循環：在Applied Biosystems Quant Studio 3 Real-Time PCR Machine上50℃保持2分鐘，95℃保持10分鐘，接著為95℃保持15秒及60℃保持1分鐘的40個循環。一式三份地運行各樣品且重複整個分析三次且用於繪製圖表。
如圖10中所示，等密度級分由西方墨點法、定量PCR及穿透式電子顯微法表徵。梯度級分之抗his西方墨點法在密度為1.32 g/mL及1.21 g/mL之級分中針對LY2 ORF1展示明顯的預期分子量之帶。另外，介於1.25至1.29 g/mL範圍內的級分具有明顯的比預期分子量更高及更低之帶。此外，qPCR指示在某些級分中存在LY2基因體DNA，其中峰位於大約1.21 g/mL、1.29 g/mL及1.32 g/mL處。
對1.32 g/mL及1.21 g/mL級分以及1.25至1.29 g/mL範圍內之級分進行陰性染色穿透式電子顯微法。該池展示大量粒子，包括具有蛋白酶體外觀的若干粒子。蛋白酶體之存在可解釋在低分子量及高分子量下之西方墨點帶。前者可歸因於蛋白水解降解且後者歸因於泛素化ORF1，或在降解過程中與蛋白酶體蛋白質共價結合的ORF1片段。1.21 g/mL級分展示各種尺寸之粒子，包括似乎與基於脂質之粒子一致的若干粒子。1.32 g/mL級分顯示顯著DNA樣結構，其與裸DNA不同地染色，表明與諸如蛋白質之大分子相關。
為確定LY2 ORF1是否與電子顯微照片中觀測到的結構相關，使用抗聚組胺酸抗體進行免疫金偵測。圖11展示在1.32及1.21 g/mL級分中觀測到的結構上之金標記積聚，與在1.32 g/mL級分中可見的與DNA相關之ORF1-His及在1.21 g/mL級分中可見之粒子的存在一致。
綜合而言，此等結果展示，Sf9細胞中表現之ORF1可與DNA結合以形成密度與指環病毒粒子一致的複合物。 實例 7 ： 使用桿狀病毒自一系列不同的指環病毒表現 ORF1 蛋白
在此實例中，Sf9細胞經桿狀病毒感染，該等桿狀病毒經工程化以表現來自指環病毒株環3.1、環4、環5.2、環6以及環1及環2的C端His標記之ORF1蛋白。如圖12中所示，源自各指環病毒株之ORF1蛋白均成功表現於Sf9細胞中。如 表 Y中所示，測試來自代表所有三個屬(α細環病毒、β細環病毒及γ細環病毒)之病毒株的指環病毒ORF1，且其表現量見於圖1、2、3及12中。一般而言，吾人發現在此系統中，來自β細環病毒之ORF1的表現量最高，γ細環病毒中等，且α細環病毒最低。 表 Y. 重組 ORF1 表現成功之菌株
名稱 屬
環1 α
環2 β
環3.1 γ
環4 γ
環5.2 α
環6 α
HLH β
ctgh3 β
LY1 β
實例 8 ： 桿狀病毒構築體之活體外組裝
在此實例中，藉由活體外組裝產生適用於表現指環病毒蛋白質(例如ORF1)之桿狀病毒構築體。
編碼指環病毒ORF1 (野生型蛋白、嵌合蛋白或其片段)之DNA表現於昆蟲細胞株(Sf9及/或HighFive)中，該ORF可未加標籤或包含在N端、C端融合之標籤，或在ORF1蛋白本身中具有突變以引入標籤，以經由免疫染色分析(諸如但不限於ELISA或西方墨點)幫助純化及/或身分確定。指環病毒ORF1可單獨或與任何數目之輔助蛋白質組合表現，該等輔助蛋白質包括但不限於指環病毒ORF2及/或ORF3蛋白質。
蛋白質使用開發的純化技術純化，該等技術潛在地包括但不限於螯合純化、肝素純化、梯度沈降純化及/或尺寸排阻純化。評估ORF1形成衣殼體或VLP及用於核酸衣殼化之後續步驟中的能力。
在一個實例中，編碼與N端HIS 6-標籤融合之環2 ORF1 (HIS-ORF1)的DNA經密碼子最佳化以用於昆蟲表現，且選殖至桿狀病毒表現載體pFASTbac系統中，以根據製造商的方法使用Bac-BAC表現系統(ThermoFisher Scientific)產生表現環2 ORF-HIS重組蛋白質的桿狀病毒。10公升昆蟲細胞(Sf9)經環2 HIS-ORF1桿狀病毒感染且在感染後3天藉由離心收集細胞。細胞經溶解，且使用本領域中之標準技術，使用螯合劑樹脂管柱純化溶解物。對含有HIS-ORF1之溶離份進行滲析且用DNA酶處理以消化宿主細胞DNA。所得物質再次使用螯合樹脂管柱純化且保留含有ORF1之溶離份用於核酸衣殼化及病毒載體純化。
核酸衣殼化及病毒載體純化 ：環ORF1 (野生型蛋白、嵌合蛋白或其片段)用足以解離VLP或病毒衣殼之條件處理，以使得能夠與核酸負荷重組。核酸負荷可定義為雙股DNA、單股DNA或編碼希望遞送作為治療劑之所關注基因的RNA。足以解離VLP或病毒衣殼之潛在條件可為但不限於不同pH之緩衝液、限定電導率之條件(鹽含量)、含有洗滌劑之條件(諸如SDS、Tween、Triton)、含有離液劑之條件(諸如脲)或涉及限定溫度及時間之條件(重結合溫度)。限定濃度之核酸負荷與限定濃度之環ORF1組合且用足以允許核酸衣殼化之條件處理。所得粒子(定義為病毒載體)隨後例如使用開發的標準病毒純化程序純化。
在一個實例中，將GFP表現質體之單股環狀DNA添加至環2 HIS-ORF1之溶液中，且將所得樣品在37℃下用含0.1% SDS之50 mM Tris pH 8緩衝液處理30分鐘。所得溶液使用肝素管柱進一步純化且使用增加NaCl濃度之梯度自管柱溶離病毒載體。病毒載體之完整性藉由轉導細胞株EKVX及HEK293，且藉由螢光顯微法觀測至少一個細胞株中的GFP產生來測試，表明藉由ORF1蛋白對核酸負荷之衣殼化以形成病毒載體。 實例 9 ： 合成指環載體構築體之製備
此實例表明合成指環載體構築體之活體外產生。
將來自TTMiniV之LY1及LY2菌株的EcoRV限制酶位點之間的DNA序列(Eur Respir J. 2013 Aug;42(2):470-9 )選殖至康黴素載體(Integrated DNA Technologies)中。在實例6及7中，基於來自TTMiniV之LY1及LY2菌株的DNA序列之所得遺傳元件構築體分別被稱為指環載體1 (Anello 1)及指環載體2 (Anello 2)。將選殖構築體轉型至10-β勝任型大腸桿菌(New England Biolabs Inc.)中，接著根據製造商的方案進行質體純化(Qiagen)。
DNA構築體(圖13及圖14)在37℃下經EcoRV限制消化物(New England Biolabs, Inc.)線性化6小時，產生含有TTMiniV基因體且不包括細菌主鏈元件(諸如複製起點及可選標記)的雙股線性DNA片段。此後接著為瓊脂糖凝膠電泳，切除TTMiniV基因體片段(2.9千鹼基對)之恰當尺寸DNA帶，且根據製造商的方案使用凝膠提取套組(Qiagen)對來自所切除瓊脂糖帶的DNA進行凝膠純化。
在一些實施例中，可進行根據此實例之方法，其中DNA構築體可包含一或多個桿狀病毒元件。在一些實施例中，DNA構築體可為穿梭載體，例如適用於轉染至昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中，例如適用於產生如本文所述之指環載體。 實例 10 ： 指環載體之組裝及感染
此實例表明使用如實例5中所述之合成DNA序列成功活體外產生感染性指環載體。
使用脂質轉染劑(Thermo Fisher Scientific)將雙股線性化凝膠純化的指環病毒基因體DNA (在實例5中獲得)轉染至在完整質體中或呈線性化形式的HEK293T細胞(人類胚胎腎細胞株)或A549細胞(人類肺癌細胞株)中。使用6 μg質體或1.5 μg線性化指環病毒基因體DNA來轉染T25燒瓶中70%匯合的細胞。包括於指環載體中之缺乏病毒序列的空載體主鏈係用作陰性對照。轉染後六小時，將細胞用PBS洗滌兩次，且使其在37℃及5%二氧化碳下在新鮮生長培養基中生長。由IDT合成編碼人類EF1α啟動子繼之以YFP基因的DNA序列。此DNA序列鈍端接合至選殖載體(Thermo Fisher Scientific)。所得載體用作對照以評定轉染效率。轉染後72小時使用細胞成像系統(Thermo Fisher Scientific)偵測YFP。HEK293T及A549細胞之轉染效率分別計算為85%及40% (圖15)。在一些實施例中，可替代地藉由將指環病毒基因體DNA插入至穿梭載體主鏈中且將所得穿梭載體引入至昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中而製得指環載體。在其他實施例中，可將指環病毒病毒基因體DNA引入至昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中，例如含有包含一或多個編碼指環病毒病毒ORF分子(例如ORF1分子)或其功能片段之序列的穿梭載體。
轉染後96小時收集經指環載體轉染之293T及A549細胞的上清液。收集之上清液在4℃下在2000 rpm下短暫離心10分鐘以移除任何細胞碎片。收集之上清液中之每一者分別用於感染在24孔盤中70%匯合的新293T及A549細胞。在37℃及5%二氧化碳下培育24小時之後，洗掉上清液，接著用PBS洗滌兩次，且用新鮮生長培養基替換。在37℃及5%二氧化碳下再培育此等細胞48小時之後，單獨地收集細胞用於基因體DNA提取。根據製造商的方案，使用基因體DNA提取套組(Thermo Fisher Scientific)收集來自樣品中之每一者的基因體DNA。
為了確認藉由活體外產生之指環載體對293T及A549細胞之成功感染，使用對β-細環病毒或LY2特異性序列具有特異性之引物，將100 ng如本文所述收集之基因體DNA用於進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)。按照製造商的方案，將SYBR綠色試劑(Thermo Fisher Scientific)用於進行qPCR。對GAPDH之基因體DNA序列具有特異性之引子的qPCR用於標準化。使用之所有引子的序列列於表42中。 表 42 ：
引子序列(5' ＞ 3')
目標 正向 反向
β細環病毒 ATTCGAATGGCTGAGTTTATGC (SEQ ID NO: 690) CCTTGACTACGGTGGTTTCAC (SEQ ID NO: 693)
LY2 TTMiniV菌株 CACGAATTAGCCAAGACTGGGCAC (SEQ ID NO: 691) TGCAGGCATTCGAGGGCTTGTT (SEQ ID NO: 694)
GAPDH GCTCCCACTCCTGATTTCTG (SEQ ID NO: 692) TTTAACCCCCTAGTCCCAGG (SEQ ID NO: 695)
如圖16A、16B、17A及17B中所描繪之qPCR結果中所示，活體外產生且如實例中所述之指環載體為感染性的。 實例 11 ： 指環載體之選擇性
此實例表明活體外產生之合成指環載體感染多種組織來源之細胞株的能力。
在37℃及5%二氧化碳下在24孔盤之各孔中，將具有感染性TTMiniV指環載體之上清液(描述於實例5中)與70%匯合的293T、A549、Jurkat (急性T細胞白血病細胞株)、Raji (伯基特氏淋巴瘤B細胞株)及Chang細胞株一起培育。感染後24小時，用PBS洗滌細胞兩次，接著用新鮮生長培養基替換。隨後再次在37℃及5%二氧化碳下再培育細胞48小時，接著收集用於基因體DNA提取。根據製造商的方案，使用基因體DNA提取套組(Thermo Fisher Scientific)收集來自樣品中之每一者的基因體DNA。
為了確認藉由先前實例中產生之指環載體對此等細胞株之成功感染，使用對β-細環病毒或LY2特異性序列具有特異性之引子，將100 ng如本文所述收集之基因體DNA用於進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)。按照製造商的方案，將SYBR綠色試劑(Thermo Fisher Scientific)用於進行qPCR。對GAPDH之基因體DNA序列具有特異性之引子的qPCR用於標準化。使用之所有引子的序列列於表42中。
如圖16A-20B中所描繪之qPCR結果中所示，活體外產生之指環載體不僅具有感染性，其亦能夠感染多種細胞株，包括上皮細胞、肺組織細胞、肝臟細胞、癌細胞、淋巴球、淋巴母細胞、T細胞、B細胞及腎細胞之實例。亦觀測到合成指環載體能夠感染HepG2細胞(肝細胞株)，使得相對於對照增加超過100倍。
或者，此實例之方法可使用例如如本文所述之穿梭載體/昆蟲細胞系統產生。 實例 12 ： 複製缺陷型指環載體及輔助病毒
為了複製及封裝指環載體，一些元件可以反式提供。此等包括導引或支持DNA複製或封裝之蛋白質或非編碼RNA。在一些情況下，反式元件可自指環載體之替代來源(諸如穿梭載體、輔助病毒、質體)或自細胞基因體提供。在一些實施例中，元件以反式提供於獨立構築體中(例如獨立穿梭載體中)。在一些實施例中，反式元件及遺傳元件包含於昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中。
其他元件通常以順式提供。此等元件可為例如充當複製起點(例如以允許擴增指環載體DNA)或封裝信號(例如以結合至蛋白質以將基因體負載至衣殼中)之指環載體DNA中之序列或結構。通常，複製缺陷型病毒或指環載體將缺失此等元件中之一或多者，使得即使以反式提供其他元件，DNA仍無法封裝至感染性病毒粒子或指環載體中。在一些實施例中，順式元件包含於遺傳元件構築體(例如穿梭載體或非穿梭載體構築體)中，例如如本文所述。
複製缺陷型病毒可適用作輔助病毒，例如用於控制相同細胞中之指環載體(例如，複製缺陷型或封裝缺陷型指環載體)的複製。在某些情況下，輔助病毒將缺乏順式複製或封裝元件，但表現反式元件，諸如蛋白質及非編碼RNA。通常，治療性指環載體將缺乏此等反式元件中之一些或全部，且因此將無法自行複製，但將保留順式元件。在共轉染/感染至細胞中時，複製缺陷型輔助病毒將驅動指環載體之擴增及封裝。收集之封裝粒子因此將僅包含治療性指環載體，而無輔助病毒污染。
為產生複製缺陷型指環載體，將移除指環病毒之非編碼區中之保守元件。詳言之，將分別及一起測試保守5' UTR域及富含GC之域的缺失。預期兩種元件對於病毒複製或封裝均為重要的。另外，將在整個非編碼區上進行缺失系列以鑑定先前未知的所關注區。
複製元件之成功缺失將引起細胞內之指環載體DNA擴增降低，例如藉由qPCR所量測，但將支持一些感染性指環載體產生，例如如藉由對感染細胞之分析所監測，該等分析可包括qPCR、西方墨點、螢光分析或發光分析中之任一者或全部。封裝元件之成功缺失將不破壞指環載體DNA擴增，因此藉由qPCR在經轉染細胞中將觀測到指環載體DNA之增加。然而，指環載體基因體將未囊封，因此不會觀測到感染性指環載體產生。 實例 13 ： 複製勝任型指環載體之製造方法
此實例描述一種用於回收且按比例擴大複製勝任型指環載體之生產的方法。當指環載體在其基因體中編碼在細胞中複製所需的所有必需遺傳元件及ORF時，指環載體為複製勝任型。由於此等指環載體在其複製中無缺陷，所以其不需要以反式提供的補充活性。然而，其可能需要輔助活性，諸如轉錄增強子(例如丁酸鈉)或病毒轉錄因子(例如腺病毒E1、E2、E4、VA；HSV Vp16及即刻早期蛋白質)。在一些實施例中，由昆蟲細胞(例如Sf9細胞)產生複製勝任型指環載體，例如使用如本文所述之穿梭載體。
在此實例中，將編碼呈線性或環狀形式之合成指環載體之全序列的雙股DNA藉由化學轉染引入至T75燒瓶中之5E+05黏附哺乳動物細胞中，或藉由電穿孔引入至懸浮液中之5E+05細胞中。在最佳時段(例如，轉染後3-7天)之後，藉由將細胞刮至上清液培養基中來收集細胞及上清液。將諸如膽鹽之溫和清潔劑添加至最終濃度為0.5%，且在37℃下培育30分鐘。將氯化鈣及氯化鎂添加至最終濃度分別為0.5mM及2.5mM。添加核酸內切酶(例如DNA酶I，核酸酶)，且在25-37℃下培育0.5-4小時。將指環載體懸浮液在4℃下在1000×g下離心10分鐘。將澄清上清液轉移至新管中，且用低溫保護緩衝液(亦稱為穩定緩衝液) 1:1稀釋，且必要時儲存於-80℃下。此產生第0代指環載體(P0)。為了使清潔劑濃度低於待在經培養細胞上使用之安全限制，取決於指環載體效價，將此接種物在無血清培養基(SFM)中稀釋至少100倍或更多倍。
使T225燒瓶中之新鮮哺乳動物細胞單層與足以覆蓋培養物表面之最小體積重疊，且在37℃及5%二氧化碳下在平緩搖動下培育90分鐘。用於此步驟之哺乳動物細胞可或可不與P0回收所用之細胞類型相同。在此培育之後，接種物經40 ml無血清、無動物來源之培養基置換。將細胞在37℃及5%二氧化碳下培育3-7天。添加4 mL先前使用之相同溫和清潔劑的10×溶液以達成0.5%之最終清潔劑濃度，且隨後在平緩攪拌下在37℃下培育混合物30分鐘。添加核酸內切酶，且在25-37℃下培育0.5-4小時。隨後收集培養基且在4℃下在1000×g下離心10分鐘。將澄清上清液與40 mL穩定緩衝液混合，且儲存於-80℃下。此產生種子儲備液或第1代指環載體(P1)。
取決於儲備液之效價，其在SFM中稀釋不少於100倍，且添加至在所需尺寸之多層燒瓶上生長的細胞。感染倍率(MOI)及培育時間以較小標度最佳化以確保最大指環載體生產。收集後，可接著純化指環載體且視需要濃縮。展示工作流程(例如如此實例中所述)之示意圖提供於圖21中。 實例 14 ： 複製缺陷型指環載體之製造方法
此實例描述一種用於回收且按比例擴大複製缺陷型指環載體之生產的方法。
指環載體可藉由參與複製之一或多個ORF (例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)的缺失而呈現複製缺陷型。複製缺陷型指環載體可生長於補充細胞株中。此類細胞株組成性表現促進指環載體生長但在指環載體之基因體中缺失或無功能的組分。在一些實施例中，複製缺陷型指環載體生長於例如包含如本文所述之穿梭載體的昆蟲細胞株(例如Sf9細胞)中。
在一個實例中，將參與指環載體繁殖之任何ORF的序列選殖至適用於產生編碼選擇標記之穩定細胞株的慢病毒表現系統中，且如本文所述地產生慢病毒載體。能夠支持指環載體繁殖之哺乳動物細胞株經此慢病毒載體感染，且藉由選擇標記(例如嘌呤黴素或任何其他抗生素)經受選擇性壓力以選擇已穩定整合經選殖ORF的細胞群體。一旦此細胞株經表徵及認證以補充工程化指環載體中之缺陷，且因此支持此類指環載體之生長及繁殖，便將其擴增且儲備於低溫儲存器中。在此等細胞之擴增及維持期間，將選擇抗生素添加至培養基中以維持選擇性壓力。一旦將指環載體引入至此等細胞中，便可停止選擇抗生素。
一旦建立此細胞株，便進行複製缺陷型指環載體之生長及生產，例如實例15如中所述。 實例 15 ： 使用懸浮液細胞產生指環載體
此實例描述在懸浮細胞中產生指環載體。
在此實例中，使經調適以在懸浮條件下生長之A549或293T生產細胞株在37℃及5%二氧化碳下在WAVE生物反應器袋中在無動物組分且無抗生素之懸浮培養基(Thermo Fisher Scientific)中生長。以1×10 6個活細胞/毫升接種之此等細胞在當前良好作業規範(cGMP)下使用脂染胺2000 (Thermo Fisher Scientific)用包含指環載體序列之質體以及適合封裝指環載體(例如，在複製缺陷型指環載體之情況下，例如如實例16中所述)或封裝指環載體所需的任何補充質體轉染。補充質體可在一些情況下編碼已自指環載體基因體(例如基於病毒基因體之指環載體基因體，例如指環病毒基因體，例如如本文所述)刪除，但適合複製及封裝指環載體或其所需的病毒蛋白質。使經轉染細胞在WAVE生物反應器袋中生長且在以下時間點收集上清液：轉染後48、72及96小時。使用離心自各樣品之細胞集結粒分離上清液。隨後使用離子交換層析自收集之上清液及溶解之細胞集結粒純化封裝之指環載體粒子。
可例如如下地確定指環載體之純化製備物中之基因體當量：藉由使用純化製備物之小等分試樣以使用病毒基因體提取套組(Qiagen)收集指環載體基因體，接著使用靶向指環載體DNA序列之引子及探針進行qPCR，例如如實例18中所述。
可藉由製備純化製備物之連續稀釋液以感染新A549細胞來定量純化製備物中之指環載體的感染性。轉染後72小時收集此等細胞，接著使用對指環載體DNA序列具有特異性之引子及探針對基因體DNA進行qPCR分析。
在一些實施例中，指環載體產生於例如包含如本文所述之穿梭載體的懸浮昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中。 實例 16 ： 利用指環載體在小鼠中表現外源性蛋白質
此實例描述指環載體之用途，其中細小環病毒(TTMV)基因體經工程化以在小鼠中表現螢火蟲螢光素酶蛋白質。
將編碼編碼螢火蟲螢光素酶基因之工程化TTMV之DNA序列的質體藉由化學轉染引入至A549細胞(人類肺癌細胞株)中。18 μg質體DNA用於轉染10 cm組織培養盤中70%匯合的細胞。缺乏TTMV序列之空載體主鏈用作陰性對照。轉染後五小時，用PBS洗滌細胞兩次，且使其在37℃及5%二氧化碳下在新鮮生長培養基中生長。
轉染後96小時收集轉染之A549細胞，以及其上清液。在37℃下用0.5%去氧膽酸鹽(體積重量)處理收集之物質1小時，接著進行核酸內切酶處理。使用離子交換層析自此溶解物純化指環載體粒子。為測定指環載體濃度，使指環載體儲備液之樣品穿過病毒DNA純化套組，且使用靶向指環載體DNA序列之引子及探針藉由qPCR來量測基因體當量/毫升。
經由多種注射途徑(例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內)在8-10週齡小鼠中進行1×磷酸鹽緩衝鹽水中指環載體之基因體當量的劑量-範圍。注射後3、7、10及15天，對各動物進行腹側及背側生物發光成像。藉由根據製造商的方案將螢光素酶受質(Perkin-Elmer)在指定時間點腹膜內添加至各動物，接著活體內成像進行成像。
在一些實施例中，使用例如如本文所述之穿梭質體及昆蟲細胞產生指環載體。 實例 17 ： 表現外源性微小 RNA 序列之指環載體的功能效應
此實例表明使用天然啟動子自指環載體基因體成功表現外源性miRNA (miR-625)。
在24孔盤中將500 ng以下質體DNA轉染至HEK293T細胞之60%匯合的孔中： i) 空質體主鏈 ii)        含有TTV-tth8基因體之質體，其中基因剔除(KO)內源性miRNA iii)      TTV-tth8，其中內源性miRNA經非靶向加擾miRNA替換 iv)       TTV-tth8，其中內源性miRNA序列經編碼miR-625之miRNA替換
轉染後72小時，使用Qiagen miRNeasy套組自經轉染細胞中收集總miRNA，接著使用miRNA Script RT II套組進行反轉錄。使用應特異性偵測miRNA-625或RNU6小RNA之引子對反轉錄DNA進行定量PCR。RNU6小RNA用作管家基因，且資料在圖22中繪製為相對於空載體之倍數變化。如圖22中所繪示，miR-625指環載體使得miR-625之表現增加約100倍，而未偵測到空載體、miR-基因剔除(KO)及加擾miR之信號。
在一些實施例中，細胞替代地可用使用穿梭載體及昆蟲細胞產生之指環載體感染，例如如本文所述。 實例 18 ： 用於表現外源性非編碼 RNA 之 指環載體的製備及產生
此實例描述用於表現外源性小非編碼RNA之指環載體的合成及產生。
將來自TTV之tth8菌株的DNA序列(Jelcic等人, Journal of Virology, 2004)合成且選殖至含有細菌複製起點及細菌抗生素抗性基因之載體中。在此載體中，編碼TTV miRNA髮夾之DNA序列經替換為編碼外源性小非編碼RNA，諸如miRNA或shRNA的DNA序列。隨後將工程化構築體轉化為電勝任型細菌，接著根據製造商的方案使用質體純化套組進行質體分離。在一些實施例中，載體為穿梭載體或供體載體，例如如本文所述。
將編碼外源性小非編碼RNA之指環載體DNA轉染至真核生產細胞株(例如昆蟲細胞)中以產生指環載體粒子。在轉染後不同時間點收集含有指環載體粒子之經轉染細胞的上清液。來自過濾上清液或純化之後的指環載體粒子用於下游應用，例如如本文所述。 實例 19 ： 來自指環載體之內源性 miRNA 的表現及內源性 miRNA 之缺失
在一個實例中，將包含其中TTV-tth8基因體經實例27中所述之富含GC之區域中的缺失修飾之經修飾TTV-tth8基因體的指環載體用於感染培養物中之Raji B細胞。此等指環載體包含編碼TTV-tth8指環病毒(其為靶向編碼n-myc相互作用蛋白質(NMI)之mRNA的miRNA)之內源性有效負載的序列，且由將包含指環病毒基因體之質體引入至宿主細胞中產生。NMI在JAK/STAT途徑下游操作以調節各種細胞內信號之轉錄，包括經干擾素刺激之基因、增殖及生長基因及發炎反應之介體。如圖23中所示，在目標Raji B細胞中偵測到病毒基因體。與對照細胞相比，亦在目標Raji B細胞中觀測到NMI之成功減弱(圖24)。與對照細胞相比，包含針對NMI之miRNA的指環載體誘導NMI蛋白質含量降低超過75%。此實例表明，具有天然指環病毒miRNA之指環載體可阻斷宿主細胞中之目標分子的基因表現。
在另一實例中，基於指環病毒之指環載體的內源性miRNA經缺失。隨後將所得指環載體(Δ miR)與宿主細胞一起培育。隨後將Δ miR指環載體遺傳元件之基因體當量與其中保留內源性miRNA之相應指環載體的基因體當量進行比較。如圖25中所繪示，在與針對其中仍存在內源性miRNA之指環載體基因體所觀測到的含量相當的含量下之細胞中偵測到其中缺失內源性miRNA之指環載體基因體。此實例表明，基於指環病毒之指環載體的內源性miRNA可經突變或完全缺失，且仍可在目標細胞中偵測到指環載體基因體。
在一些實施例中，細胞替代地可用使用穿梭載體及昆蟲細胞產生之指環載體感染，例如如本文所述。 實例 20 ： 活體內外源性蛋白質之指環載體遞送
此實例表明在投與之後指環載體之活體內效應功能(例如蛋白質之表現)。
製備包含編碼奈米-螢光素酶(nLuc)之轉殖基因的指環載體(圖26A-圖26B)。簡言之，將具有TTMV-LY2非編碼區及nLuc表現卡匣之雙股DNA質體與編碼完整TTMV-LY2基因體之雙股DNA質體一起轉染至HEK293T細胞中，以充當反式複製及封裝因子。在轉染之後，培育細胞以允許指環載體產生，且收集指環載體物質且經由核酸酶處理、超濾/透濾及無菌過濾進行富集。額外HEK293T細胞經具有nLuc表現卡匣及TTMV-LY2 ORF轉染卡匣但缺乏複製及封裝必需之非編碼域的非複製DNA質體轉染，以充當「非病毒」陰性對照。根據與指環載體物質相同的方案製備非病毒樣品。
向三隻健康小鼠之群組肌肉內投與指環載體製劑，且藉由IVIS Lumina成像(Bruker)歷經九天進行監測(圖27A)。作為非病毒對照，向三隻額外小鼠投與非複製製劑(圖27B)。第0天向左後腿投與25 µL指環載體注射液或非病毒製劑，且在第4天向右後腿重新投與(參見圖27A及27B中之箭頭)。在IVIS成像9天之後，與非病毒製劑(圖27B)相比，在注射指環載體製劑(圖27A)之小鼠中觀測到nLuc發光信號出現更多，其與在活體內指環載體轉導之後的反式基因表現一致。
在一些實施例中，可替代地向小鼠投與使用穿梭載體及昆蟲細胞產生之指環載體，例如如本文所述。 實例 21 ： 活體外環化指環病毒基因體
此實例描述包含具有最小非病毒DNA之環狀雙股指環病毒基因體DNA的構築體。此等環狀病毒基因體更密切地匹配在野生型指環病毒複製期間發現的雙股DNA中間物。當引入至細胞中時，具有最小非病毒DNA之此類環狀雙股指環病毒基因體DNA可經歷滾環複製以產生例如如本文所述之遺傳元件。
在一個實例中，具有TTV-tth8變異體及TTMV-LY2之質體經識別側接基因體DNA之位點的限制性核酸內切酶消化。隨後使所得線性化基因體連接以形成環狀DNA。此等連接反應在改變的DNA濃度下進行，以最佳化分子內連接。將連接之環直接轉染至哺乳動物細胞中，或藉由用限制性核酸內切酶消化以裂解質體主鏈且用核酸外切酶消化以降解線性DNA來進一步處理，以移除非環狀基因體DNA。對於TTV-tth8，XmaI核酸內切酶用於使DNA線性化；連接環在富含GC之區域與5'非編碼區域之間含有53 bp非病毒DNA。對於TTMV-LY2，使用IIS型限制酶 Esp3I，產生不含非病毒DNA之病毒基因體DNA環。此方案改編自先前公佈之TTV-tth8環化(Kincaid等人., 2013, PLoS Pathogens 9(12): e1003818)。為表明指環病毒產生之改良，將環化TTV-tth8及TTMV-LY2轉染至HEK293T細胞中。在培育7天之後，溶解細胞，且進行qPCR以比較環化與基於質體之指環病毒基因體之間的指環病毒基因體之含量。增加含量之指環病毒基因體顯示，病毒DNA之環化為適用於增加指環病毒產生之策略。
在另一實例中，TTMV-LY2質體(pVL46-240)及TTMV-LY2-nLuc分別經Esp3I或EcoRV-HF線性化。在電溶離或Qiagen管柱純化且用T4 DNA連接酶連接之前，在1%瓊脂糖凝膠上純化經消化質體。在轉染之前在100 kDa UF/DF膜上濃縮環化DNA。如28A圖中所繪示，環化藉由凝膠電泳確認。在用脂染胺2000進行脂質體轉染之前一天，以3×10 4個細胞/平方公分用HEK293T接種T-225燒瓶。在燒瓶接種後一天，九微克環化TTMV-LY2 DNA及50 μg環化TTMV-LY2-nLuc經共轉染。作為比較，額外T-225燒瓶經50 μg線性化TTMV-LY2及50 μg線性化TTMV-LY2-nLuc共轉染。
在Triton X-100收集緩衝劑中收集細胞之前，進行指環載體產生持續八天。通常，指環載體可例如藉由宿主細胞之溶解、溶解物之澄清、過濾及層析進行富集。在此實例中，收集之細胞在氯化鈉調節及1.2 μm/0.45 μm正常流過濾之前經核酸酶處理。濃縮澄清的收集物，且在750 kDa MWCO mPES中空纖維膜上緩衝交換至PBS中。TFF保留物在負載於在PBS中預先平衡的Sephacryl S-500 HR SEC管柱上之前使用0.45 μm過濾器進行過濾。指環載體在30 cm/hr下在SEC管柱中處理。收集個別溶離份，且藉由qPCR分析病毒基因體複本數及轉殖基因複本數，如圖28B中所示。在SEC層析圖之空隙體積(級分7)開始觀測到病毒基因體及轉殖基因複本。在級分15處觀測到殘餘質體峰。TTMV-LY2基因體及TTMV-LY2-nLuc轉殖基因之複本數與使用在級分7-級分10處之環化輸入DNA產生的指環載體良好一致，表明含有nLuc轉殖基因之封裝指環載體。SEC級分經合併且使用100 kDa MWCO PVDF膜濃縮，且隨後在活體內投與之前進行0.2 μm過濾。
在與線性化指環載體DNA相比時，輸入指環載體DNA之環化引起在整個純化過程中受核酸酶保護之基因體的回收百分比增加三倍，表明使用如表46中所示之環化輸入指環載體DNA具有改良的製造效率。
在一些實施例中，IVC指環載體基因體可引入至昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中且圍封於由穿梭載體表現之蛋白質外部蛋白質內，例如如本文所述。 表 46. 純化過程產率
步驟 線性化TTMV-LY2 環化TTMV-LY2
總病毒基因體複本 總 nLuc 轉殖基因基因體複本 總病毒基因體複本 總 nLuc 轉殖基因基因體複本
收集預先核酸酶 2.78E+12 2.17E+12 1.04E+11 4.39E+11
澄清的收集物 9.96E+09 5.48E+09 6.55E+08 9.81E+08
TFF 1.01E+10 7.66E+09 2.58E+08 3.56E+08
SEC 3.18E+07 8.73E+06 9.16E+06 7.75E+06
UF/DF 8.82E+06 3.25E+06 1.78E+06 2.73E+06
無菌過濾 5.60E+06 2.64E+06 8.66E+05 1.63E+06
純化過程產率(%) 0.0002% 0.0001% 0.0006% 0.0004%
實例 22 ： 產生含有具有來自不同細環病毒菌株之高變域之嵌合 ORF1 的 指環載體
此實例描述ORF1之高變區的域交換以產生含有以下各者之嵌合指環載體：ORF1富含精胺酸之區域、凝膠捲域、N22及一個TTV菌株之C端域，及來自不同TTV菌株之ORF1蛋白的高變域。
已將β細環病毒之全長基因體LY2菌株選殖至表現載體中以用於在哺乳動物細胞中表現。此基因體經突變以移除LY2之高變域，且將其用遠親β細環病毒之高變域置換(圖28C)。隨後使含有具有交換高變域(pTTMV-LY2-HVRa-z)之LY2基因體的質體線性化，且使用先前公佈之方法(Kincaid等人, PLoS Pathogens 2013)環化。使HEK293T細胞經環化基因體轉染，且培育5-7天以允許指環載體產生。在培育期之後，藉由梯度超速離心自經轉染細胞之上清液及細胞集結粒純化指環載體。
為了確定嵌合指環載體是否仍具有感染性，將分離的病毒粒子添加至未感染細胞中。培育細胞5-7天以允許病毒複製。在培育之後，嵌合指環載體建立感染之能力將藉由免疫螢光法、西方墨點及qPCR監測。嵌合病毒之結構完整性藉由陰性染色及低溫電子顯微法評定。可進一步測試嵌合指環載體活體內感染細胞之能力。建立經由高變域交換產生功能性嵌合指環載體之能力可允許病毒之工程化以改變向性且潛在地避開免疫偵測。
在一些實施例中，嵌合指環載體及/或嵌合ORF1可引入至昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中且圍封於由穿梭載體表現之蛋白質外部蛋白質內，例如如本文所述。 實例 23 ： 產生含有非 TTV 蛋白質 / 肽而非高變域之嵌合 ORF1
此實例描述用其他所關注蛋白質或肽替代ORF1之高變區以產生含有以下各者之嵌合ORF1蛋白：富含精胺酸之區域、凝膠捲域、N22及一個TTV菌株之C端域，及非TTV蛋白質/肽而非高變域。
如實例B中所示，LY2之高變域自基因體中缺失且可將所關注蛋白質或肽插入至此區域中(圖28D)。可引入至此區域中之序列類型的實例包括但不限於親和標籤、抗體之單鏈可變區(scFv)及抗原肽。如實例B中所述使質體中之突變基因體(pTTMV-LY2-ΔHVR-POI)線性化及環化。將環化基因體轉染至HEK293T細胞中且培育5-7天。在培育之後，適當時經由超速離心及/或親和性層析法自上清液及細胞集結粒純化含有POI之嵌合指環載體。
使用多種技術評定產生含有POI之功能性嵌合指環載體的能力。首先，將純化病毒添加至未感染細胞，以確定嵌合指環載體是否可將有效負載複製及/或遞送至初始細胞。另外，使用電子顯微法評定嵌合指環載體之結構完整性。對於具有活體外功能性之嵌合指環載體，亦評定活體內複製/遞送有效負載的能力。
在一些實施例中，嵌合指環載體及/或嵌合ORF1可引入至昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中且圍封於由穿梭載體表現之蛋白質外部蛋白質內，例如如本文所述。 實例 24 ： 基於 tth8 及 LY2 之指環載體各自成功地將 EPO 基因轉導至肺癌細胞中
在此實例中，使用攜帶紅血球生成素基因(EPO)之兩個不同指環載體轉導非小細胞肺癌株(EKVX)。指環載體係藉由如本文所述之活體外環化來產生，且包括基於LY2或tth8主鏈之兩種類型的指環載體。LY2-EPO及tth8-EPO指環載體中之每一者包括遺傳元件，其分別包括EPO編碼卡匣及LY2或tth8基因體之非編碼區(5' UTR，富含GC之區域)，但不包括指環病毒ORF，例如實例39如中所述。使細胞接種純化指環載體或陽性對照(在較高劑量或與指環載體相同之劑量下的AAV2-EPO)且培育7天。指環病毒ORF以反式提供於單獨活體外環化DNA中。接種後3、5.5及7天對培養物上清液取樣且使用商業ELISA套組進行分析以偵測EPO。LY2-EPO及tth8-EPO指環載體均成功地轉導細胞，顯示出與未處理(陰性)對照細胞相比顯著更高的EPO效價(在所有時間點P＜0.013) (圖29)。
在一些實施例中，細胞替代地可用使用穿梭載體及昆蟲細胞產生之指環載體感染，例如如本文所述。 實例 25 ： 在靜脈內 (i.v.) 投與之後可活體內偵測到具有治療性轉殖基因之指環載體
在此實例中，在靜脈內(i.v.)投與之後活體內偵測到編碼人類生長激素(hGH)之指環載體。基於LY2主鏈及編碼外源性hGH (LY2-hGH)之複製缺陷型指環載體係由如本文所述之活體外環化來產生。LY2-hGH指環載體之遺傳元件包括LY2非編碼區(5' UTR，富含GC之區域)及hGH編碼卡匣，但不包括指環病毒ORF，例如如實例39中所述。向小鼠靜脈內投與LY2-hGH指環載體。指環病毒ORF以反式提供於單獨活體外環化DNA中。簡言之，在第0天靜脈內注射指環載體(LY2-hGH)或PBS (n=4隻小鼠/組)。以每隻小鼠4.66E+07個指環載體基因體向獨立動物組投與指環載體。
在第一實例中，偵測到指環載體病毒基因體DNA複本。在第7天，收集血液及血漿，且藉由qPCR分析hGH DNA擴增子。在活體內感染後7天之後，LY2-hGH指環載體存在於全血之細胞級分中(圖30A)。此外，血漿中不存在指環載體表明此等指環載體無法在活體內複製(圖30B)。
在第二實例中，在活體內轉導之後偵測到hGH mRNA轉錄物。在第7天，收集血液且藉由qRT-PCR分析hGH mRNA轉錄物擴增子。GAPDH用作對照管家基因。在全血之細胞級分中量測hGH mRNA轉錄物。活體內偵測來自經指環載體編碼之轉殖基因的mRNA(圖31)。
在一些實施例中，可替代地向小鼠投與使用穿梭載體及昆蟲細胞產生之指環載體，例如如本文所述。 實例 26 ： 活體外環化基因體作為用於活體外產生指環載體之輸入材料
此實例表明，作為如本文所述之指環載體遺傳元件的活體外環化(IVC)雙股指環病毒DNA在質體中比指環病毒基因體DNA更穩固，得到預期密度之經封裝指環載體基因體。
在T75燒瓶中之1.2E+07 HEK293T細胞(人類胚胎腎細胞株)經11.25 μg (i)活體外環化雙股TTV-tth8基因體(IVC TTV-tth8)、(ii)質體主鏈中之TTV-tth8基因體，或(iii)含有僅TTV-tth8 (非複製TTV-tth8)之ORF1序列的質體轉染。轉染後7天收集細胞，用0.1% Triton溶解，且用100單位/毫升核酸酶處理。溶解物用於氯化銫密度分析；量測密度且對各級分之氯化銫線性梯度進行TTV-tth8複本定量。如圖32中所示，與TTV-tth8質體相比，IVC TTV-tth8在1.33之預期密度下產生顯著更多的病毒基因體複本。
1E+07個Jurkat細胞(人類T淋巴細胞細胞株)經活體外環化LY2基因體(LY2 IVC)或質體中之LY2基因體核轉染。轉染後4天收集細胞且使用含有0.5% triton及300 mM氯化鈉之緩衝液溶解，接著進行兩輪瞬時凍融。溶解物用100單位/毫升核酸酶處理，接著進行氯化銫密度分析。對各級分之氯化銫線性梯度進行密度量測及LY2基因體定量。如圖33中所示，Jurkat細胞中之活體外環化LY2基因體的轉染與含有LY2基因體之質體的轉染相比引起在預期密度處之尖峰，其在圖33中未展示可偵測峰。
在一些實施例中，IVC指環載體遺傳元件構築體可引入至昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中且圍封於由穿梭載體表現之蛋白質外部蛋白質內，例如如本文所述。
圖1描繪具有C端His標籤之環2 ORF1於昆蟲細胞中之表現。
圖2描繪具有C端His標籤之環1 ORF1及ORF1/1於昆蟲細胞中之表現。
圖3描繪具有N端His標籤，具有或不具有PreScission裂解序列之環2 ORF1於昆蟲細胞中之表現。
圖4描繪呈C端HIS標記之重組蛋白形式之環1 ORF 1/1、1/2、2、2/2及2/3於昆蟲細胞中之表現。
圖5描繪個別環2 ORF於昆蟲細胞中之表現。同一墨點之兩次曝光展示於中圖及右圖中。左圖展示如所指示測試之環2構築體的結構。
圖6描繪昆蟲細胞中環2 ORF1 + 「完全ORF」、ORF1 + ORF2、ORF1 + ORF2/2及ORF1 + ORF2/3之桿狀病毒介導之共表現。
圖7描繪使用桿狀病毒在昆蟲細胞中多個環2蛋白質之同時共表現。
圖8描繪來自藉由桿狀病毒及藉由轉染遞送至昆蟲細胞中之指環病毒基因體之ORF的表現。
圖9展示環1 ORF2之表現獨立於Sf9細胞中之多面體啟動子(箭頭標記之pH)。
圖10描繪將環2 ORF1-His及環2基因體DNA共遞送至Sf9細胞中，接著以CsCl線性密度梯度培育及分級分離。在圖式頂部展示級分之抗His標籤西方墨點，以及各級分之qPCR分析。下圖展示兩個個別級分及一個級分池之穿透式電子顯微鏡影像，如由西方墨點上之方框指示。中間圖中之插圖為展示蛋白酶體樣結構之放大視圖。
圖11描繪Sf9等密度級分藉由免疫金電子顯微法之表徵。
圖12描繪來自額外指環病毒菌株之ORF1的表現。
圖13描繪編碼TTMiniV之LY1菌株之康黴素載體(「指環載體1」)的示意圖。
圖14描繪編碼TTMiniV之LY2菌株之康黴素載體(「指環載體2」)的示意圖。
圖15描繪293T及A549細胞中之合成指環載體的轉染效率。
圖16A及16B描繪說明合成指環載體對293T細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖17A及17B描繪說明合成指環載體對A549細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖18A及18B描繪說明合成指環載體對Raji細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖19A及19B描繪說明合成指環載體對Jurkat細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖20A及20B描繪說明合成指環載體對Chang細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖21為展示用於產生指環載體(例如，如本文所述之複製勝任型或複製缺陷型指環載體)之例示性工作流的示意圖。
圖22為展示在經指定質體轉染之HEK293T細胞中miR-625表現之倍數變化的圖。
圖23為展示用編碼靶向n-myc相互作用蛋白質(NMI)之miRNA的指環載體感染Raji B細胞之圖式。展示在用編碼NMI miRNA之指環載體感染Raji B細胞(箭頭)或對照細胞之後偵測到的指環載體之基因體當量的定量。
圖24為展示用編碼靶向n-myc相互作用蛋白質(NMI)之miRNA的指環載體感染Raji B細胞之圖式。西方墨點展示編碼針對NMI之miRNA的指環載體降低Raji B細胞之NMI蛋白質表現，而經缺乏miRNA之指環載體感染的Raji B細胞展示與對照相當的NMI蛋白質表現。
圖25為展示在用包含內源性miRNA編碼序列之指環載體及其中缺失內源性miRNA編碼序列之對應指環載體感染之後，在宿主細胞中產生之指環載體粒子之定量的一系列圖式。
圖26A-26B為展示用於產生表現奈米-螢光素酶之指環載體(A)及用於轉染細胞之一系列指環載體/質體組合(B)之構築體的一系列圖式。
圖27A-27C為展示在注射指環載體之小鼠中之奈米-螢光素酶表現的一系列圖式。(A)在注射之後第0-9天時小鼠中之奈米-螢光素酶表現。(B)注射如所指示之各種指環載體/質體構築體組合的小鼠中之奈米-螢光素酶表現。(C)在注射後小鼠中偵測到的奈米-螢光素酶發光之定量。A組接受TTMV-LY2載體+奈米-螢光素酶。B組接受奈米-螢光素酶蛋白質及TTMV-LY2 ORF。
圖28A為展示TTMV-LY2質體pVL46-063及pVL46-240之環化的凝膠電泳影像。
圖28B為展示如由尺寸排阻層析法(SEC)所確定之線性及環狀TTMV-LY2構築體之複本數的層析圖。
圖28C為展示指環病毒ORF1分子之域及經來自不同指環病毒之高變域置換之高變區的示意圖。
圖28D為展示ORF1之域及將經來自非指環病毒來源之所關注蛋白質或肽(POI)置換之高變區的示意圖。
圖29為展示經工程化以含有編碼人類紅血球生成素(hEpo)之序列之基於tth8或LY2的指環載體可將功能性轉殖基因遞送至哺乳動物細胞的圖。
圖30A及30B為展示在靜脈內注射之後七天向小鼠投與之工程化指環載體為可偵測的一系列圖式。
圖31為展示在靜脈內投與編碼hGH之工程化指環載體之後七天在全血之細胞級分中偵測到hGH mRNA的圖。
圖32為展示活體外環化(IVC) TTV-tth8基因體(IVC TTV-tth8)與質體中之TTV-tth8基因體相比在HEK293T細胞中以預期密度產生TTV-tth8基因體複本之能力的圖。
圖33為展示活體外環化(IVC) LY2基因體(WT LY2 IVC)及質體中之野生型LY2基因體(WT LY2質體)在Jurkat細胞中以預期密度產生LY2基因體複本之能力的一系列圖。
當結合附圖閱讀時，將更好地理解本發明之實施例的以下詳細描述。出於說明本發明之目的，在圖式中展示本發明例示之實施例。然而，應理解，本發明不限於圖式中所示實施例之精確佈置及工具。
 

          <![CDATA[<110> 美商旗艦先鋒創新公司(FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC.)]]>
          <![CDATA[<120> 桿狀病毒表現系統]]>
          <![CDATA[<130> V2057-7006TW]]>
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          tgctacgtca ctaacccacg tgtcctctac aggccaatcg cagtctatgt cgtgcacttc       60
          ctgggcatgg tctacataat tatataaatg cttgcacttc cgaatggctg agtttttgct      120
          gcccgtccgc ggagaggagc cacggcaggg gatccgaacg tcctgagggc gggtgccgga      180
          ggtgagttta cacaccgaag tcaaggggca attcgggctc aggactggcc gggctttggg      240
          caaggctctt aaaaatgcac ttttctcgaa taagcagaaa gaaaaggaaa gtgctactgc      300
          tttgcgtgcc agcagctaag aaaaaaccaa ctgctatgag cttctggaaa cctccggtac      360
          acaatgtcac ggggatccaa cgcatgtggt atgagtcctt tcaccgtggc cacgcttctt      420
          tttgtggttg tgggaatcct atacttcaca ttactgcact tgctgaaaca tatggccatc      480
          caacaggccc gagaccttct gggccaccgg gagtagaccc caacccccac atccgtagag      540
          ccaggcctgc cccggccgct ccggagccct cacaggttga ttcgagacca gccctgacat      600
          ggcatgggga tggtggaagc gacggaggcg ctggtggttc cggaagcggt ggacccgtgg      660
          cagacttcgc agacgatggc ctcgatcagc tcgtcgccgc cctagacgac gaagagtaag      720
          gaggcgcaga cggtggagga gggggagacg aaaaacaagg acttacagac gcaggagacg      780
          ctttagacgc aggggacgaa aagcaaaact tataataaaa ctgtggcaac ctgcagtaat      840
          taaaagatgc agaataaagg gatacatacc actgattata agtgggaacg gtacctttgc      900
          cacaaacttt accagtcaca taaatgacag aataatgaaa ggccccttcg ggggaggaca      960
          cagcactatg aggttcagcc tctacatttt gtttgaggag cacctcagac acatgaactt     1020
          ctggaccaga agcaacgata acctagagct aaccagatac ttgggggctt cagtaaaaat     1080
          atacaggcac ccagaccaag actttatagt aatatacaac agaagaaccc ctctaggagg     1140
          caacatctac acagcaccct ctctacaccc aggcaatgcc attttagcaa aacacaaaat     1200
          attagtacca agtttacaga caagaccaaa gggtagaaaa gcaattagac taagaatagc     1260
          accccccaca ctctttacag acaagtggta ctttcaaaag gacatagccg acctcaccct     1320
          tttcaacatc atggcagttg aggctgactt gcggtttccg ttctgctcac cacaaactga     1380
          caacacttgc atcagcttcc aggtccttag ttccgtttac aacaactacc tcagtattaa     1440
          tacctttaat aatgacaact cagactcaaa gttaaaagaa tttttaaata aagcatttcc     1500
          aacaacaggc acaaaaggaa caagtttaaa tgcactaaat acatttagaa cagaaggatg     1560
          cataagtcac ccacaactaa aaaaaccaaa cccacaaata aacaaaccat tagagtcaca     1620
          atactttgca cctttagatg ccctctgggg agaccccata tactataatg atctaaatga     1680
          aaacaaaagt ttgaacgata tcattgagaa aatactaata aaaaacatga ttacatacca     1740
          tgcaaaacta agagaatttc caaattcata ccaaggaaac aaggcctttt gccacctaac     1800
          aggcatatac agcccaccat acctaaacca aggcagaata tctccagaaa tatttggact     1860
          gtacacagaa ataatttaca acccttacac agacaaagga actggaaaca aagtatggat     1920
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          tgacatgccc ctatggactt tactttttgg atatacagac tggtgtaaaa aggacactaa     2040
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          taaggtagaa aaaccaagca ctcagctggt aatgaagtac tgttttaact ttaactgggg     2340
          cggtaaccct atcattgaac agattgttaa agaccccagc ttccagccca cctatgaaat     2400
          acccggtacc ggtaacatcc ctagaagaat acaagtcatc gacccgcggg tcctgggacc     2460
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          Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 
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          Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 
                  35                  40                  45              
          Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 
              50                  55                  60                  
          His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 
                          85                  90                  95      
          Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu 
                  115                 120                 125         
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          1               5                   10                  15      
          Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 
                      20                  25                  30          
          Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 
                  35                  40                  45              
          Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 
              50                  55                  60                  
          His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 
                          85                  90                  95      
          Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Thr Pro Ala Ser Ser Pro Pro Met Lys Tyr Pro Val Pro Val 
              130                 135                 140                 
          Thr Ser Leu Glu Glu Tyr Lys Ser Ser Thr Arg Gly Ser Trp Asp Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Thr Arg Ser Gly His Gly Thr Cys Ala Asp Thr His Leu Ala Glu 
                          165                 170                 175     
          Gln Val Leu Arg Glu Cys Gln Asn Asn Lys Lys Leu Leu Thr Leu Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ser Gln Ala Gln Lys Ser Leu Gly Ser Thr Ser Gln Asn Lys Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Lys Lys Lys Ala His Ile His Ser Lys Glu Asn Arg Asp Arg Gly Arg 
              210                 215                 220                 
          Pro Arg Lys Lys Ala Arg Gln Lys Pro Ser Arg Lys Arg Ala Lys Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Pro Ser Asn Ser Ser Cys Ser Ser Ser Thr Lys Ser Ser Ser Ser 
                          245                 250                 255     
          Ser Asp Arg Glu Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser 
                      260                 265             
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 276]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 
          1               5                   10                  15      
          Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 
                      20                  25                  30          
          Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 
                  35                  40                  45              
          Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 
              50                  55                  60                  
          His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 
                          85                  90                  95      
          Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Lys Ala Ser Gly Arg His Pro Lys Thr Arg Asn Pro Arg Arg Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Phe Thr Pro Lys Arg Ile Glu Thr Val Gly Asp Arg Gly Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Arg Asp Arg Ser Pro Leu Ala Arg Glu Pro Arg Gly Pro Leu Pro 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Val Ala Ala Ala Val Pro Arg Ala Ala Gln Ala Gln Thr Gly 
                      180                 185                 190         
          Asn Gln Ser Pro Leu Arg Ala Ala His Lys Asp Pro Thr Arg Gly Pro 
                  195                 200                 205             
          Cys Lys Pro Met Pro Thr Val Gly Pro Arg Gln Trp Leu Phe Pro Glu 
              210                 215                 220                 
          Arg Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ser Gly Asp Trp Ala Met Glu Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Ala Ala Lys Ile Phe Asp Arg Pro Val Arg Ser Asn Leu Lys Asp 
                          245                 250                 255     
          Thr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Val Lys Asn Gln Tyr Asn Val Tyr Phe Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Lys Phe Glu 
                  275     
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 167]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 
          1               5                   10                  15      
          Met Trp Pro Lys Lys Ala Ser Gly Arg His Pro Lys Thr Arg Asn Pro 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Lys Leu Thr Phe Thr Pro Lys Arg Ile Glu Thr Val Gly Asp 
                  35                  40                  45              
          Arg Gly Arg Lys Arg Asp Arg Ser Pro Leu Ala Arg Glu Pro Arg Gly 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Pro Thr Ala Val Ala Ala Ala Val Pro Arg Ala Ala Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Thr Gly Asn Gln Ser Pro Leu Arg Ala Ala His Lys Asp Pro Thr 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Pro Cys Lys Pro Met Pro Thr Val Gly Pro Arg Gln Trp Leu 
                      100                 105                 110         
          Phe Pro Glu Arg Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ser Gly Asp Trp Ala 
                  115                 120                 125             
          Met Glu Phe Leu Ala Ala Lys Ile Phe Asp Arg Pro Val Arg Ser Asn 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Asp Thr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Val Lys Asn Gln Tyr Asn Val 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Phe Asp Leu Lys Phe Glu 
                          165         
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 743]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Arg Lys Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Lys Arg Cys Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Thr Phe Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile 
                      100                 105                 110         
          Met Lys Gly Pro Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Tyr Ile Leu Phe Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg 
              130                 135                 140                 
          Ser Asn Asp Asn Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Tyr Arg His Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg 
                          165                 170                 175     
          Thr Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly 
                      180                 185                 190         
          Asn Ala Ile Leu Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Pro Lys Gly Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr 
              210                 215                 220                 
          Leu Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Phe Asn Ile Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys 
                          245                 250                 255     
          Ser Pro Gln Thr Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser 
                      260                 265                 270         
          Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Ile Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser 
                  275                 280                 285             
          Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly 
              290                 295                 300                 
          Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys 
                          325                 330                 335     
          Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp 
                      340                 345                 350         
          Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile 
                  355                 360                 365             
          Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr Leu Asn Gln Gly Arg Ile Ser Pro 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro Tyr Thr Asp 
                      420                 425                 430         
          Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr Lys Glu Asn 
                  435                 440                 445             
          Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr Asp Met Pro 
              450                 455                 460                 
          Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys Lys Asp Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu Ile Cys Pro 
                          485                 490                 495     
          Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp Tyr Gly Tyr 
                      500                 505                 510         
          Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro Asp Gly Ser 
                  515                 520                 525             
          Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro Thr Val Leu 
              530                 535                 540                 
          His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly Pro Phe Ala 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe 
                          565                 570                 575     
          Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp 
                      580                 585                 590         
          Pro Ser Phe Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro 
                  595                 600                 605             
          Arg Arg Ile Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser 
              610                 615                 620                 
          Phe Arg Ser Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Arg Val Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly 
                          645                 650                 655     
          Pro Lys Lys Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu 
                      660                 665                 670         
          Ser Ser His Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu 
                  675                 680                 685             
          Glu Ser Glu Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe 
              690                 695                 700                 
          Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Ile Lys Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val 
                          725                 730                 735     
          His Val Asn Pro Cys Leu Arg 
                      740             
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 194]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Ile Val Lys Asp Pro Ser Phe Gln Pro 
                  35                  40                  45              
          Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro Arg Arg Ile Gln Val 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser Phe Arg Ser Trp Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile Lys Arg Val Ser Glu 
                          85                  90                  95      
          Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly Pro Lys Lys Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu Ser Ser His Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu Glu Ser Glu Thr Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe Gln Gln Gln Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln Gly Ile Lys Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val His Val Asn Pro Cys 
                      180                 185                 190         
          Leu Arg 
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 113]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Ala Gln Lys Ser Leu Gly Ser Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gln Asn Lys Lys Pro Lys Lys Lys Ala His Ile His Ser Lys Glu Asn 
              50                  55                  60                  
          Arg Asp Arg Gly Arg Pro Arg Lys Lys Ala Arg Gln Lys Pro Ser Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Arg Ala Lys Arg Ser Pro Ser Asn Ser Ser Cys Ser Ser Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Ser Ser Ser Ser Asp Arg Glu Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser 
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
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          <![CDATA[<400> 25]]>
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          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
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          <![CDATA[<400> 27]]>
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          <![CDATA[<400> 30]]>
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          <![CDATA[<210> 35]]>
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          <![CDATA[<210> 36]]>
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          <![CDATA[<210> 37]]>
          <![CDATA[<400> 37]]>
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          <![CDATA[<210> 39]]>
          <![CDATA[<400> 39]]>
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          <![CDATA[<210> 40]]>
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          <![CDATA[<210> 42]]>
          <![CDATA[<400> 42]]>
          000
          <![CDATA[<210> 43]]>
          <![CDATA[<400> 43]]>
          000
          <![CDATA[<210> 44]]>
          <![CDATA[<400> 44]]>
          000
          <![CDATA[<210> 45]]>
          <![CDATA[<400> 45]]>
          000
          <![CDATA[<210> 46]]>
          <![CDATA[<400> 46]]>
          000
          <![CDATA[<210> 47]]>
          <![CDATA[<400> 47]]>
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          <![CDATA[<210> 48]]>
          <![CDATA[<400> 48]]>
          000
          <![CDATA[<210> 49]]>
          <![CDATA[<400> 49]]>
          000
          <![CDATA[<210> 50]]>
          <![CDATA[<400> 50]]>
          000
          <![CDATA[<210> 51]]>
          <![CDATA[<400> 51]]>
          000
          <![CDATA[<210> 52]]>
          <![CDATA[<400> 52]]>
          000
          <![CDATA[<210> 53]]>
          <![CDATA[<400> 53]]>
          000
          <![CDATA[<210> 54]]>
          <![CDATA[<211> 2979]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 54]]>
          taataaatat tcaacaggaa aaccacctaa tttaaattgc cgaccacaaa ccgtcactta       60
          gttccccttt ttgcaacaac ttctgctttt ttccaactgc cggaaaacca cataatttgc      120
          atggctaacc acaaactgat atgctaatta acttccacaa aacaacttcc ccttttaaaa      180
          ccacacctac aaattaatta ttaaacacag tcacatcctg ggaggtacta ccacactata      240
          ataccaagtg cacttccgaa tggctgagtt tatgccgcta gacggagaac gcatcagtta      300
          ctgactgcgg actgaacttg ggcgggtgcc gaaggtgagt gaaaccaccg aagtcaaggg      360
          gcaattcggg ctagttcagt ctagcggaac gggcaagaaa cttaaaatta ttttattttt      420
          cagatgagcg actgctttaa accaacatgc tacaacaaca aaacaaagca aactcactgg      480
          attaataacc tgcatttaac ccacgacctg atctgcttct gcccaacacc aactagacac      540
          ttattactag ctttagcaga acaacaagaa acaattgaag tgtctaaaca agaaaaagaa      600
          aaaataacaa gatgccttat tactacagaa gaagacggta caactacaga cgtcctagat      660
          ggtatggacg aggttggatt agacgccctt ttcgcagaag atttcgaaga aaaagaaggg      720
          taagacctac ttatactact attcctctaa agcaatggca accgccatat aaaagaacat      780
          gctatataaa aggacaagac tgtttaatat actatagcaa cttaagactg ggaatgaata      840
          gtacaatgta tgaaaaaagt attgtacctg tacattggcc gggagggggt tctttttctg      900
          taagcatgtt aactttagat gccttgtatg atatacataa actttgtaga aactggtgga      960
          catccacaaa ccaagactta ccactagtaa gatataaagg atgcaaaata acattttatc     1020
          aaagcacatt tacagactac atagtaagaa tacatacaga actaccagct aacagtaaca     1080
          aactaacata cccaaacaca catccactaa tgatgatgat gtctaagtac aaacacatta     1140
          tacctagtag acaaacaaga agaaaaaaga aaccatacac aaaaatattt gtaaaaccac     1200
          ctccgcaatt tgaaaacaaa tggtactttg ctacagacct ctacaaaatt ccattactac     1260
          aaatacactg cacagcatgc aacttacaaa acccatttgt aaaaccagac aaattatcaa     1320
          acaatgttac attatggtca ctaaacacca taagcataca aaatagaaac atgtcagtgg     1380
          atcaaggaca atcatggcca tttaaaatac taggaacaca aagcttttat ttttactttt     1440
          acaccggagc aaacctacca ggtgacacaa cacaaatacc agtagcagac ctattaccac     1500
          taacaaaccc aagaataaac agaccaggac aatcactaaa tgaggcaaaa attacagacc     1560
          atattacttt cacagaatac aaaaacaaat ttacaaatta ttggggtaac ccatttaata     1620
          aacacattca agaacaccta gatatgatac tatactcact aaaaagtcca gaagcaataa     1680
          aaaacgaatg gacaacagaa aacatgaaat ggaaccaatt aaacaatgca ggaacaatgg     1740
          cattaacacc atttaacgag ccaatattca cacaaataca atataaccca gatagagaca     1800
          caggagaaga cactcaatta tacctactct ctaacgctac aggaacagga tgggacccac     1860
          caggaattcc agaattaata ctagaaggat ttccactatg gttaatatat tggggatttg     1920
          cagactttca aaaaaaccta aaaaaagtaa caaacataga cacaaattac atgttagtag     1980
          caaaaacaaa atttacacaa aaacctggca cattctactt agtaatacta aatgacacct     2040
          ttgtagaagg caatagccca tatgaaaaac aacctttacc tgaagacaac attaaatggt     2100
          acccacaagt acaataccaa ttagaagcac aaaacaaact actacaaact gggccattta     2160
          caccaaacat acaaggacaa ctatcagaca atatatcaat gttttataaa ttttacttta     2220
          aatggggagg aagcccacca aaagcaatta atgttgaaaa tcctgcccac cagattcaat     2280
          atcccatacc ccgtaacgag catgaaacaa cttcgttaca gagtccaggg gaagccccag     2340
          aatccatctt atactccttc gactatagac acgggaacta cacaacaaca gctttgtcac     2400
          gaattagcca agactgggca cttaaagaca ctgtttctaa aattacagag ccagatcgac     2460
          agcaactgct caaacaagcc ctcgaatgcc tgcaaatctc ggaagaaacg caggagaaaa     2520
          aagaaaaaga agtacagcag ctcatcagca acctcagaca gcagcagcag ctgtacagag     2580
          agcgaataat atcattatta aaggaccaat aacttttaac tgtgtaaaaa aggtgaaatt     2640
          gtttgatgat aaaccaaaaa accgtagatt tacacctgag gaatttgaaa ctgagttaca     2700
          aatagcaaaa tggttaaaga gacccccaag atcctttgta aatgatcctc ccttttaccc     2760
          atggttacca cctgaacctg ttgtaaactt taagcttaat tttactgaat aaaggccagc     2820
          attaattcac ttaaggagtc tgtttattta agttaaacct taataaacgg tcaccgcctc     2880
          cctaatacgc aggcgcagaa agggggctcc gcccccttta acccccaggg ggctccgccc     2940
          cctgaaaccc ccaagggggc tacgccccct tacaccccc                            2979
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          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 55]]>
          Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 
                      20                  25                  30          
          Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 
                  35                  40                  45              
          Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Gly 
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          <![CDATA[<211> 203]]>
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          <![CDATA[<400> 56]]>
          Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 
                      20                  25                  30          
          Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 
                  35                  40                  45              
          Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Gly Phe Asn Ile Pro Tyr Pro Val Thr Ser Met Lys Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Arg Tyr Arg Val Gln Gly Lys Pro Gln Asn Pro Ser Tyr Thr Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Thr Ile Asp Thr Gly Thr Thr Gln Gln Gln Leu Cys His Glu Leu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Thr Gly His Leu Lys Thr Leu Phe Leu Lys Leu Gln Ser Gln Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ser Asn Cys Ser Asn Lys Pro Ser Asn Ala Cys Lys Ser Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Lys Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Ser Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Ser Asp Ser Ser Ser Ser Cys Thr Glu Ser Glu 
                  195                 200             
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          <![CDATA[<400> 57]]>
          Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 
                      20                  25                  30          
          Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 
                  35                  40                  45              
          Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Gly Ala Arg Ser Thr Ala Thr Ala Gln Thr Ser Pro Arg Met 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Asn Leu Gly Arg Asn Ala Gly Glu Lys Arg Lys Arg Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ala His Gln Gln Pro Gln Thr Ala Ala Ala Ala Val Gln Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Asn Asn Ile Ile Ile Lys Gly Pro Ile Thr Phe Asn Cys Val Lys Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Val Lys Leu Phe Asp Asp Lys Pro Lys Asn Arg Arg Phe Thr Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Phe Glu Thr Glu Leu Gln Ile Ala Lys Trp Leu Lys Arg Pro Pro 
                      180                 185                 190         
          Arg Ser Phe Val Asn Asp Pro Pro Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Pro Glu 
                  195                 200                 205             
          Pro Val Val Asn Phe Lys Leu Asn Phe Thr Glu 
              210                 215                 
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          <![CDATA[<400> 58]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln 
                  35                  40                  45              
          Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser 
                          85                  90                  95      
          Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys 
                      100                 105                 110         
          Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 
              130                 135                 140                 
          Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile 
                      180                 185                 190         
          Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr 
                  195                 200                 205             
          Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe 
                      260                 265                 270         
          Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln 
                  275                 280                 285             
          Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg 
              290                 295                 300                 
          Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn 
                          325                 330                 335     
          Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn 
                  355                 360                 365             
          Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro 
              370                 375                 380                 
          Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro 
                          405                 410                 415     
          Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile 
                      420                 425                 430         
          Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys 
              450                 455                 460                 
          Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp 
                          485                 490                 495     
          Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln 
                      500                 505                 510         
          Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile 
                  515                 520                 525             
          Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys 
              530                 535                 540                 
          Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro 
                          565                 570                 575     
          Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr 
                      580                 585                 590         
          Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val 
                  595                 600                 605             
          Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu 
              610                 615                 620                 
          Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu 
          625                 630                 635                 640 
          Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg 
                          645                 650                 655     
          Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 
                      660                 665     
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          <![CDATA[<211> 148]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<400> 59]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Ile Gln Tyr Pro Ile Pro Arg Asn Glu His Glu Thr 
                  35                  40                  45              
          Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro 
                          85                  90                  95      
          Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser 
                  115                 120                 125             
          Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Asp Gln 
          145             
          <![CDATA[<210> 60]]>
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          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Ser Gln Ile Asp Ser Asn Cys Ser Asn Lys Pro Ser 
                  35                  40                  45              
          Asn Ala Cys Lys Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Lys 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ser Asp Ser Ser Ser Ser Cys Thr Glu 
          65                  70                  75                  80  
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          <![CDATA[<400> 88]]>
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          <![CDATA[<210> 106]]>
          <![CDATA[<211> 71]]>
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          cgggctwtgg g                                                            71
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          <![CDATA[<211> 71]]>
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          <![CDATA[<400> 118]]>
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          <![CDATA[<400> 119]]>
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          cgggctatgg g                                                            71
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          cgcgcatgcg cggggccccc ccccgggggg gctccgcccc cccggccccc ccccgtgcta      120
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<211> 7]]>
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          gggggcg                                                                  7
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 169]]>
          gcgcttcgcg cgcgcgccgg ggggctccgc cccccc                                 36
          <![CDATA[<210> 170]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 170]]>
          gcgcttcgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc                                 36
          <![CDATA[<210> 171]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 171]]>
          gcgctacgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc                                 36
          <![CDATA[<210> 172]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<400> 172]]>
          gcgctacgcg cgcgcgccgg ggggctctgc cccccc                                 36
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          <![CDATA[<400> 178]]>
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          <![CDATA[<400> 180]]>
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          <![CDATA[<400> 183]]>
          000
          <![CDATA[<210> 184]]>
          <![CDATA[<400> 184]]>
          000
          <![CDATA[<210> 185]]>
          <![CDATA[<211> 743]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 185]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Arg Lys Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Lys Arg Cys Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Thr Phe Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile 
                      100                 105                 110         
          Met Lys Gly Pro Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Tyr Ile Leu Phe Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg 
              130                 135                 140                 
          Ser Asn Asp Asn Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Tyr Arg His Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg 
                          165                 170                 175     
          Thr Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly 
                      180                 185                 190         
          Asn Ala Ile Leu Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Pro Lys Gly Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr 
              210                 215                 220                 
          Leu Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Phe Asn Ile Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys 
                          245                 250                 255     
          Ser Pro Gln Thr Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser 
                      260                 265                 270         
          Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Ile Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser 
                  275                 280                 285             
          Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly 
              290                 295                 300                 
          Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys 
                          325                 330                 335     
          Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp 
                      340                 345                 350         
          Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile 
                  355                 360                 365             
          Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr Leu Asn Gln Gly Arg Ile Ser Pro 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro Tyr Thr Asp 
                      420                 425                 430         
          Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr Lys Glu Asn 
                  435                 440                 445             
          Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr Asp Met Pro 
              450                 455                 460                 
          Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys Lys Asp Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu Ile Cys Pro 
                          485                 490                 495     
          Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp Tyr Gly Tyr 
                      500                 505                 510         
          Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro Asp Gly Ser 
                  515                 520                 525             
          Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro Thr Val Leu 
              530                 535                 540                 
          His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly Pro Phe Ala 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe 
                          565                 570                 575     
          Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp 
                      580                 585                 590         
          Pro Ser Phe Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro 
                  595                 600                 605             
          Arg Arg Ile Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser 
              610                 615                 620                 
          Phe Arg Ser Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Arg Val Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly 
                          645                 650                 655     
          Pro Lys Lys Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu 
                      660                 665                 670         
          Ser Ser His Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu 
                  675                 680                 685             
          Glu Ser Glu Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe 
              690                 695                 700                 
          Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Ile Lys Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val 
                          725                 730                 735     
          His Val Asn Pro Cys Leu Arg 
                      740             
          <![CDATA[<210> 186]]>
          <![CDATA[<211> 68]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 186]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Arg Lys 
          65              
          <![CDATA[<210> 187]]>
          <![CDATA[<211> 212]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 187]]>
          Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val Ile Lys Arg Cys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly Asn Gly Thr Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile Met Lys Gly Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu Tyr Ile Leu Phe 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg Ser Asn Asp Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys Ile Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg Thr Pro Leu Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly Asn Ala Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr Arg Pro Lys Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr Leu Phe Thr Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr Leu Phe Asn Ile 
                          165                 170                 175     
          Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys Ser Pro Gln Thr 
                      180                 185                 190         
          Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser Val Tyr Asn Asn 
                  195                 200                 205             
          Tyr Leu Ser Ile 
              210         
          <![CDATA[<210> 188]]>
          <![CDATA[<211> 133]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 188]]>
          Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys 
                  35                  40                  45              
          Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Asn Gln Gly Arg 
              130             
          <![CDATA[<210> 189]]>
          <![CDATA[<211> 166]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 189]]>
          Ile Ser Pro Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Thr Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr 
                      20                  25                  30          
          Lys Glu Asn Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr 
                  35                  40                  45              
          Asp Met Pro Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Thr Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Cys Pro Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp 
                          85                  90                  95      
          Tyr Gly Tyr Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro 
                      100                 105                 110         
          Asp Gly Ser Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro 
                  115                 120                 125             
          Thr Val Leu His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Pro Phe Ala Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Cys Phe Asn Phe Asn 
                          165     
          <![CDATA[<210> 190]]>
          <![CDATA[<211> 164]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 190]]>
          Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp Pro Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro Arg Arg Ile 
                      20                  25                  30          
          Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser Phe Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile Lys Arg Val 
              50                  55                  60                  
          Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly Pro Lys Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu Ser Ser His 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu Glu Ser Glu 
                      100                 105                 110         
          Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe Gln Gln Gln 
                  115                 120                 125             
          Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln Gly Ile Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val His Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Cys Leu Arg 
          <![CDATA[<210> 191]]>
          <![CDATA[<400> 191]]>
          000
          <![CDATA[<210> 192]]>
          <![CDATA[<400> 192]]>
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          <![CDATA[<210> 193]]>
          <![CDATA[<400> 193]]>
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          <![CDATA[<210> 194]]>
          <![CDATA[<400> 194]]>
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          <![CDATA[<400> 195]]>
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          <![CDATA[<400> 196]]>
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          <![CDATA[<400> 197]]>
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          <![CDATA[<210> 198]]>
          <![CDATA[<400> 198]]>
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          <![CDATA[<210> 199]]>
          <![CDATA[<400> 199]]>
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          <![CDATA[<400> 200]]>
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          <![CDATA[<210> 201]]>
          <![CDATA[<400> 201]]>
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          <![CDATA[<210> 202]]>
          <![CDATA[<400> 202]]>
          000
          <![CDATA[<210> 203]]>
          <![CDATA[<400> 203]]>
          000
          <![CDATA[<210> 204]]>
          <![CDATA[<400> 204]]>
          000
          <![CDATA[<210> 205]]>
          <![CDATA[<400> 205]]>
          000
          <![CDATA[<210> 206]]>
          <![CDATA[<400> 206]]>
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          <![CDATA[<210> 207]]>
          <![CDATA[<400> 207]]>
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          <![CDATA[<400> 208]]>
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          <![CDATA[<210> 209]]>
          <![CDATA[<400> 209]]>
          000
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          <![CDATA[<400> 210]]>
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          <![CDATA[<400> 211]]>
          000
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          <![CDATA[<400> 212]]>
          000
          <![CDATA[<210> 213]]>
          <![CDATA[<400> 213]]>
          000
          <![CDATA[<210> 214]]>
          <![CDATA[<400> 214]]>
          000
          <![CDATA[<210> 215]]>
          <![CDATA[<211> 666]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 215]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln 
                  35                  40                  45              
          Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser 
                          85                  90                  95      
          Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys 
                      100                 105                 110         
          Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 
              130                 135                 140                 
          Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile 
                      180                 185                 190         
          Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr 
                  195                 200                 205             
          Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe 
                      260                 265                 270         
          Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln 
                  275                 280                 285             
          Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg 
              290                 295                 300                 
          Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn 
                          325                 330                 335     
          Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn 
                  355                 360                 365             
          Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro 
              370                 375                 380                 
          Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro 
                          405                 410                 415     
          Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile 
                      420                 425                 430         
          Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys 
              450                 455                 460                 
          Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp 
                          485                 490                 495     
          Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln 
                      500                 505                 510         
          Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile 
                  515                 520                 525             
          Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys 
              530                 535                 540                 
          Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro 
                          565                 570                 575     
          Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr 
                      580                 585                 590         
          Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val 
                  595                 600                 605             
          Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu 
              610                 615                 620                 
          Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu 
          625                 630                 635                 640 
          Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg 
                          645                 650                 655     
          Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 
                      660                 665     
          <![CDATA[<210> 216]]>
          <![CDATA[<211> 38]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 216]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Val Arg 
                  35              
          <![CDATA[<210> 217]]>
          <![CDATA[<211> 208]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 217]]>
          Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro 
                  35                  40                  45              
          Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser Val Ser Met Leu Thr Leu 
              50                  55                  60                  
          Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Val Arg Ile His Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu 
                  115                 120                 125             
          Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr 
              130                 135                 140                 
          Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val 
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr 
                  195                 200                 205             
          <![CDATA[<210> 218]]>
          <![CDATA[<211> 128]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 218]]>
          Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp 
          1               5                   10                  15      
          Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn 
              50                  55                  60                  
          Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn Lys His Ile Gln Glu His 
                          85                  90                  95      
          Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn 
                      100                 105                 110         
          Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210> 219]]>
          <![CDATA[<211> 163]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 219]]>
          Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu 
                          85                  90                  95      
          Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys 
                      100                 105                 110         
          Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro 
              130                 135                 140                 
          Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Phe Lys 
          <![CDATA[<210> 220]]>
          <![CDATA[<211> 129]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 220]]>
          Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp 
              50                  55                  60                  
          Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr 
                          85                  90                  95      
          Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg 
                      100                 105                 110         
          Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Gln 
          <![CDATA[<210> 221]]>
          <![CDATA[<400> 221]]>
          000
          <![CDATA[<210> 222]]>
          <![CDATA[<400> 222]]>
          000
          <![CDATA[<210> 223]]>
          <![CDATA[<400> 223]]>
          000
          <![CDATA[<210> 224]]>
          <![CDATA[<400> 224]]>
          000
          <![CDATA[<210> 225]]>
          <![CDATA[<400> 225]]>
          000
          <![CDATA[<210> 226]]>
          <![CDATA[<400> 226]]>
          000
          <![CDATA[<210> 227]]>
          <![CDATA[<211> 220]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (29)..(31)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (29)..(31)]]>
          <![CDATA[<223> 此區域可能包括0-3個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (100)..(100)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (125)..(129)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (125)..(129)]]>
          <![CDATA[<223> 此區域可能包括1-5個殘基]]>
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          Leu Val Leu Thr Gln Trp Gln Pro Asn Thr Val Arg Arg Cys Tyr Ile 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Tyr Leu Pro Leu Ile Ile Cys Gly Glu Asn Xaa Xaa Xaa Thr 
                      20                  25                  30          
          Thr Ser Arg Asn Tyr Ala Thr His Ser Asp Asp Thr Ile Gln Lys Gly 
                  35                  40                  45              
          Pro Phe Gly Gly Gly Met Ser Thr Thr Thr Phe Ser Leu Arg Val Leu 
              50                  55                  60                  
          Tyr Asp Glu Tyr Gln Arg Phe Met Asn Arg Trp Thr Tyr Ser Asn Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Gly Cys Lys Phe Thr Phe Tyr Arg 
                          85                  90                  95      
          His Pro Asp Xaa Asp Phe Ile Val Gln Tyr Asn Thr Asn Pro Pro Phe 
                      100                 105                 110         
          Lys Asp Thr Lys Leu Thr Ala Pro Ser Ile His Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 
                  115                 120                 125             
          Xaa Gly Met Leu Met Leu Ser Lys Arg Lys Ile Leu Ile Pro Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Lys Thr Arg Pro Lys Gly Lys His Tyr Val Lys Val Arg Ile Gly Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Lys Leu Phe Glu Asp Lys Trp Tyr Thr Gln Ser Asp Leu Cys Asp 
                          165                 170                 175     
          Val Pro Leu Val Xaa Leu Tyr Ala Thr Ala Ala Asp Leu Gln His Pro 
                      180                 185                 190         
          Phe Gly Ser Pro Gln Thr Asp Asn Pro Cys Val Thr Phe Gln Val Leu 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Xaa Tyr Asn Lys His Leu Ser Ile Ser Pro 
              210                 215                 220 
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          Ser Asn Phe Glu Phe Pro Gly Ala Tyr Thr Asp Ile Thr Tyr Asn Pro 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Asp Lys Gly Val Gly Asn Met Val Trp Ile Gln Tyr Leu Thr 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Asp Thr Ile Xaa Asp Lys Thr Gln Ser Xaa Xaa Xaa Lys Cys 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Glu Asp Leu Pro Leu Trp Ala Ala Leu Tyr Gly Tyr Val Asp 
              50                  55                  60                  
          Phe Cys Glu Lys Glu Thr Gly Asp Ser Ala Ile Ile Xaa Asn Xaa Gly 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Lys Gly Phe Val Pro Tyr Ser Thr Asn Phe 
                      100                 105                 110         
          Gly Asn Gly Lys Met Pro Gly Gly Ser Gly Tyr Val Pro Ile Tyr Trp 
                  115                 120                 125             
          Arg Ala Arg Trp Tyr Pro Thr Leu Phe His Gln Lys Glu Val Leu Glu 
              130                 135                 140                 
          Asp Ile Val Gln Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Lys Asp Glu Lys Pro Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe Asn Phe Asn 
                          165                 170         
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          Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ser Gln Gln Val Val Arg Asn Pro Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp Ser Gly Xaa Xaa Xaa Ser Gly Xaa Gly Arg Gln Pro Arg Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Gln Val Val Asp Pro Lys Tyr Met Gly Pro Glu Tyr Thr Phe His Ser 
                  35                  40                  45              
          Trp Asp Trp Arg Arg Gly Leu Phe Gly Glu Lys Ala Ile Lys Arg Met 
              50                  55                  60                  
          Ser Glu Gln Pro Thr Asp Asp Glu Ile Phe Thr Gly Gly Xaa Pro Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Arg Arg Asp Pro Pro Thr Xaa Gln Xaa Pro Glu Glu Xaa Xaa 
                          85                  90                  95      
          Xaa Xaa Gln Lys Glu Ser Ser Ser Phe Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                      100                 105                 110         
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Trp Glu Ser Ser Ser Gln Glu 
                  115                 120                 125             
          Xaa Glu Ser Glu Ser Gln Glu Glu Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
              130                 135                 140                 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
          145                 150                 155                 160 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gln Thr Val Gln Gln Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Arg Gln Gln Leu Arg Glu Gln Arg Arg Leu Arg Val Gln Leu Gln Leu 
                      180                 185                 190         
          Leu Phe Gln Gln Leu Leu Lys Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Ala Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          His Ile Asn Pro Leu Leu Leu Ser Gln Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
              210                 215                 220                 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
          225                 230                 235                 240 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                          245                 250                 255     
          Xaa Xaa 
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          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222> (138)..(141)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
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          <![CDATA[<222> (179)..(179)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 230]]>
          Leu Lys Gln Trp Gln Pro Ser Thr Ile Arg Lys Cys Lys Ile Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Leu Pro Leu Phe Gln Cys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Asn Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Gln Tyr Lys Glu Ser Ile Val Pro His His Glu Pro Gly Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ser Ile Gln Gln Phe Thr Leu Gly Ala Leu Tyr Glu Glu His 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Leu Arg Asn Trp Trp Thr Lys Ser Asn Asp Gly Leu Pro Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Val Arg Tyr Leu Gly Cys Thr Ile Lys Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Thr 
                          85                  90                  95      
          Asp Tyr Ile Val Thr Tyr Gln Arg Cys Tyr Pro Met Thr Ala Thr Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Tyr Leu Ser Thr Gln Pro Ser Arg Met Leu Met Asn Lys His 
                  115                 120                 125             
          Lys Ile Ile Val Pro Ser Lys Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          Lys Lys Pro Tyr Lys Lys Ile Phe Ile Lys Pro Pro Ser Gln Met Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Lys Trp Tyr Phe Gln Gln Asp Ile Ala Asn Thr Pro Leu Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Leu Thr Xaa Thr Ala Cys Ser Leu Asp Arg Met Tyr Leu Ser Ser Asp 
                      180                 185                 190         
          Ser Ile Ser Asn Asn Ile Thr Phe Thr Ser Leu Asn Thr Asn Phe Phe 
                  195                 200                 205             
          Gln Asn Pro Asn Phe Gln 
              210                 
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          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Leu Tyr Phe Glu 
          1               5                   10                  15      
          Cys Arg Tyr Asn Pro Phe Lys Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Ser Asn Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Gly Trp 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Pro Thr Asp Pro Asp Leu Ile Ile Glu Gly Phe Pro Leu Trp 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Leu Trp Gly Trp Leu Asp Trp Gln Lys Lys Leu Gly Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Asn Ile Asp Thr Asp Tyr Ile Leu Val Ile Gln Ser Xaa Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile Pro Pro Xaa Xaa Xaa Lys Leu Pro Tyr Tyr Val Pro Leu Asp Xaa 
                      100                 105                 110         
          Asp Xaa Xaa Phe Leu His Gly Arg Ser Pro Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                  115                 120                 125             
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ser Asp Lys Gln 
              130                 135                 140                 
          His Trp His Pro Lys Val Arg Phe Gln Xaa Glu Thr Ile Asn Asn Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Lys Leu Pro Asn Gln Lys Ser Ile 
                          165                 170                 175     
          Gln Ala His Met Lys Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys 
                      180                 185         
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          <![CDATA[<400> 232]]>
          Trp Gly Gly Cys Pro Ala Pro Met Glu Thr Ile Thr Asp Pro Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Lys Tyr Pro Ile Pro Asn Asn Leu Leu Gln Thr Thr Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Xaa Pro Thr Thr Pro Ile Glu Thr Tyr Leu Tyr Lys Phe Asp Glu 
                  35                  40                  45              
          Arg Arg Gly Leu Leu Thr Lys Lys Ala Ala Lys Arg Ile Lys Lys Asp 
              50                  55                  60                  
          Xaa Thr Thr Glu Thr Thr Leu Phe Thr Asp Thr Gly Xaa Xaa Thr Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Thr Leu Pro Thr Xaa Xaa Gln Thr Glu Thr Thr Gln Glu Glu Xaa 
                          85                  90                  95      
          Thr Ser Glu Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Thr Leu Leu Gln Gln 
                      100                 105                 110         
          Leu Gln Gln Leu Arg Arg Lys Gln Lys Gln Leu Arg Xaa Arg Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Leu Gln Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
              130                 135                 140                 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
          145                 150                 155                 160 
          Xaa Xaa Xaa 
          <![CDATA[<210> 233]]>
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          <![CDATA[<400> 233]]>
          Thr Ile Pro Leu Lys Gln Trp Gln Pro Glu Ser Ile Arg Lys Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Tyr Gly Thr Leu Val Leu Gly Ala Glu Gly Arg Gln Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Cys Tyr Thr Asn Glu Lys Asp Glu Tyr Thr Pro Pro Lys Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Phe Gly Val Glu Leu Phe Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Gln Trp Lys Ala Arg Asn Asn Ile Trp Thr Lys Ser Asn Xaa Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Thr Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Pro Thr Thr Asp Phe Ile Val Xaa Tyr Ser Arg Gln Pro Pro Phe Glu 
                      100                 105                 110         
          Ile Asp Lys Xaa Thr Tyr Met Xaa Xaa His Pro Gln Xaa Leu Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Arg Lys His Lys Lys Ile Ile Leu Ser Lys Ala Thr Asn Pro Lys Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Phe Phe Gln Lys Gln Phe Ala Xaa Tyr Gly Leu Val Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ala Ala Ala Cys Asx Leu Arg Tyr Pro Arg Leu Gly Cys Cys Asn 
                      180                 185                 190         
          Glu Asn Arg Leu Ile Thr Leu Tyr Tyr Leu Asn 
                  195                 200             
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          Leu Pro Ile Val Val Ala Arg Tyr Asn Pro Ala Xaa Asp Thr Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly Asn Lys Xaa Trp Leu Xaa Ser Thr Leu Asn Gly Ser Xaa Trp Ala 
                      20                  25                  30          
          Pro Pro Thr Thr Asp Lys Asp Leu Ile Ile Glu Gly Leu Pro Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Leu Tyr Gly Tyr Trp Ser Tyr Xaa Lys Lys Val Lys Lys Asp 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Ile Leu Gln Ser His Met Phe Val Val Lys Ser Pro Ala Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Leu Xaa Thr Ala Thr Thr Gln Xaa Thr Phe Tyr Pro Xaa Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Asn Ser Phe Ile Gln Gly Lys Xaa Pro Tyr Asp Glu Pro Xaa Thr 
                      100                 105                 110         
          Xaa Asn Gln Lys Lys Leu Trp Tyr Pro Thr Leu Glu His Gln Gln Glu 
                  115                 120                 125             
          Thr Ile Asn Ala Ile Val Glu Ser Gly Pro Tyr Val Pro Lys Leu Asp 
              130                 135                 140                 
          Asn Gln Lys Asn Ser Thr Trp Glu Leu Xaa Tyr Xaa Tyr Thr Phe Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Lys 
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          Trp Gly Gly Pro Gln Ile Pro Asp Gln Pro Val Glu Asp Pro Lys Xaa 
          1               5                   10                  15      
          Gln Gly Thr Tyr Pro Val Pro Asp Thr Xaa Gln Gln Thr Ile Gln Ile 
                      20                  25                  30          
          Xaa Asn Pro Leu Lys Gln Lys Pro Glu Thr Met Phe His Asp Trp Asp 
                  35                  40                  45              
          Tyr Arg Arg Gly Ile Ile Thr Ser Thr Ala Leu Lys Arg Met Gln Glu 
              50                  55                  60                  
          Asn Leu Glu Thr Asp Ser Ser Phe Xaa Ser Asp Ser Glu Glu Thr Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Xaa Xaa Lys Lys Lys Lys Arg Leu Thr Xaa Glu Leu Pro Xaa Pro Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Glu Thr Glu Glu Ile Gln Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Cys Gln Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asn Leu Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Ile His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Lys His Asn 
              130                 135                 140                 
          Ile Leu Lys Leu Leu Ser Asp Leu Lys Glx Lys Gln Arg Leu Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Gln Thr Gly Ile Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                          165                 170                 175     
          Xaa 
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<400> 801]]>
          gcggcggggg ggcggccgcg ttcgcgcgcc gcccaccagg gggtgctgcg cgcccccccc       60
          cgcgcatgcg cggggccccc ccccgggggg gctccgcccc cccggccccc ccccgtgcta      120
          aacccaccgc gcatgcgcga ccacgccccc gccgcc                                156
          <![CDATA[<210> 802]]>
          <![CDATA[<211> 150]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 802]]>
          ccgagcgtta gcgaggagtg cgaccctacc ccctgggccc acttcttcgg agccgcgcgc       60
          tacgccttcg gctgcgcgcg gcacctcaga cccccgctcg tgctgacacg cttgcgcgtg      120
          tcagaccact tcgggctcgc gggggtcggg                                       150
          <![CDATA[<210> 803]]>
          <![CDATA[<211> 122]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 803]]>
          gccgccgcgg cggcgggggg cggcgcgctg cgcgcgccgc ccagtagggg gagccatgcg       60
          cccccccccg cgcatgcgcg gggccccccc ccgcgggggg ctccgccccc cggccccccc      120
          cg                                                                     122
          <![CDATA[<210> 804]]>
          <![CDATA[<211> 111]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 804]]>
          cggcccagcg gcggcgcgcg cgcttcgcgc gcgcgccggg gggctccgcc cccccccgcg       60
          catgcgcggg gccccccccc gcggggggct ccgccccccg gtcccccccc g               111
          <![CDATA[<210> 805]]>
          <![CDATA[<211> 115]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 805]]>
          cggccgtgcg gcggcgcgcg cgcttcgcgc gcgcgccggg ggctgccgcc cccccccgcg       60
          catgcgcgcg gggccccccc ccgcgggggg ctccgccccc cggccccccc ccccg           115
          <![CDATA[<210> 806]]>
          <![CDATA[<211> 104]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 806]]>
          cggcggcggc gcgcgcgcta cgcgcgcgcg ccggggggct gccgcccccc ccccgcgcat       60
          gcgcggggcc cccccccgcg gggggctccg ccccccggcc cccc                       104
          <![CDATA[<210> 807]]>
          <![CDATA[<211> 108]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 807]]>
          ggcggcggcg cgcgcgctac gcgcgcgcgc cggggagctc tgcccccccc cgcgcatgcg       60
          cgcgggtccc ccccccgcgg ggggctccgc cccccggtcc cccccccg                   108
          <![CDATA[<210> 808]]>
          <![CDATA[<400> 808]]>
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          <![CDATA[<400> 809]]>
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          <![CDATA[<400> 817]]>
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          <![CDATA[<400> 819]]>
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          <![CDATA[<400> 825]]>
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          <![CDATA[<400> 828]]>
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          <![CDATA[<210> 829]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (4)..(5)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (9)..(10)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 829]]>
          Tyr Asn Pro Xaa Xaa Asp Xaa Gly Xaa Xaa Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 830]]>
          <![CDATA[<400> 830]]>
          000
          <![CDATA[<210> 831]]>
          <![CDATA[<400> 831]]>
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          <![CDATA[<210> 832]]>
          <![CDATA[<400> 832]]>
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          <![CDATA[<210> 833]]>
          <![CDATA[<400> 833]]>
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          <![CDATA[<210> 834]]>
          <![CDATA[<400> 834]]>
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          <![CDATA[<210> 835]]>
          <![CDATA[<400> 835]]>
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          <![CDATA[<400> 837]]>
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          <![CDATA[<400> 838]]>
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          <![CDATA[<400> 884]]>
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          <![CDATA[<400> 885]]>
          000
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          <![CDATA[<211> 3176]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 886]]>
          taaaatggcg ggagccaatc attttatact ttcactttcc aattaaaaat ggccacgtca       60
          caaacaaggg gtggagccat ttaaactata taactaagtg gggtggcgaa tggctgagtt      120
          taccccgcta gacggtgcag ggaccggatc gagcgcagcg aggaggtccc cggctgccca      180
          tgggcgggag ccgaggtgag tgaaaccacc gaggtctagg ggcaattcgg gctagggcag      240
          tctagcggaa cgggcaagaa acttaaaaca atatttgttt tacagatggt tagtatatcc      300
          tcaagtgatt tttttaagaa aacgaaattt aatgaggaga cgcagaacca agtatggatg      360
          tctcaaattg ctgactctca tgataatatc tgcagttgct ggcatccatt tgctcacctt      420
          cttgcttcca tatttcctcc tggccacaaa gatcgtgatc ttactattaa ccaaattctt      480
          ctaagagatt ataaagaaaa atgccattct ggtggagaag aaggagaaaa ttctggacca      540
          acaacaggtt taattacacc aaaagaagaa gatatagaaa aagatggccc agaaggcgcc      600
          gcagaagaag accatacaga cgccctgttc gccgccgccg tagaaaactt cgaaaggtaa      660
          agagaaaaaa aaaatcttta attgttagac aatggcaacc agacagtata agaacttgta      720
          aaattatagg acagtcagct atagttgttg gggctgaagg aaagcaaatg tactgttata      780
          ctgtcaataa gttaattaat gtgcccccaa aaacaccata tgggggaggc tttggagtag      840
          accaatacac actgaaatac ttatatgaag aatacagatt tgcacaaaac atttggacac      900
          aatctaatgt actgaaagac ttatgcagat acataaatgt taagctaata ttctacagag      960
          acaacaaaac agactttgtc ctttcctatg acagaaaccc accttttcaa ctaacaaaat     1020
          ttacataccc aggagcacac ccacaacaaa tcatgcttca aaaacaccac aaattcatac     1080
          tatcacaaat gacaaagcct aatggaagac taacaaaaaa actcaaaatt aaacctccta     1140
          aacaaatgct ttctaaatgg ttcttttcaa aacaattctg taaataccct ttactatctc     1200
          ttaaagcttc tgcactagac cttaggcact cttacctagg ctgctgtaat gaaaatccac     1260
          aggtattttt ttattattta aaccatggat actacacaat aacaaactgg ggagcacaat     1320
          cctcaacagc atacagacct aactccaagg tgacagacac aacatactac agatacaaaa     1380
          atgacagaaa aaatattaac attaaaagcc atgaatacga aaaaagtata tcatatgaaa     1440
          acggttattt tcaatctagt ttcttacaaa cacagtgcat atataccagt gagcgtggtg     1500
          aagcctgtat agcagaaaaa ccactaggaa tagctattta caatccagta aaagacaatg     1560
          gagatggtaa tatgatatac cttgtaagca ctctagcaaa cacttgggac cagcctccaa     1620
          aagacagtgc tattttaata caaggagtac ccatatggct aggcttattt ggatatttag     1680
          actactgtag acaaattaaa gctgacaaaa catggctaga cagtcatgta ctagtaattc     1740
          aaagtcctgc tatttttact tacccaaatc caggagcagg caaatggtat tgtccactat     1800
          cacaaagttt tataaatggc aatggtccgt ttaatcaacc acctacactg ctacaaaaag     1860
          caaagtggtt tccacaaata caataccaac aagaaattat taatagcttt gtagaatcag     1920
          gaccatttgt tcccaaatat gcaaatcaaa ctgaaagcaa ctgggaacta aaatataaat     1980
          atgtttttac atttaagtgg ggtggaccac aattccatga accagaaatt gctgacccta     2040
          gcaaacaaga gcagtatgat gtccccgata ctttctacca aacaatacaa attgaagatc     2100
          cagaaggaca agaccccaga tctctcatcc atgattggga ctacagacga ggctttatta     2160
          aagaaagatc tcttaaaaga atgtcaactt acttctcaac tcatacagat cagcaagcaa     2220
          cttcagagga agacattccc aaaaagaaaa agagaattgg accccaactc acagtcccac     2280
          aacaaaaaga agaggagaca ctgtcatgtc tcctctctct ctgcaaaaaa gataccttcc     2340
          aagaaacaga gacacaagaa gacctccagc agctcatcaa gcagcagcag gagcagcagc     2400
          tcctcctcaa gagaaacatc ctccagctca tccacaaact aaaagagaat caacaaatgc     2460
          ttcagcttca cacaggcatg ttaccttaac cagatttaaa cctggatttg aagagcaaac     2520
          agagagagaa ttagcaatta tatttcatag gccccctaga acctacaaag aggaccttcc     2580
          attctatccc tggctaccac ctgcacccct tgtacaattt aaccttaact tcaaaggcta     2640
          ggccaacaat gtacacttag taaagcatgt ttattaaagc acaaccccca aaataaatgt     2700
          aaaaataaaa aaaaaaaaaa aaaaataaaa aattgcaaaa attcggcgct cgcgcgcatg     2760
          tgcgcctctg gcgcaaatca cgcaacgctc gcgcgcccgc gtatgtctct ttaccacgca     2820
          cctagattgg ggtgcgcgcg ctagcgcgcg caccccaatg cgccccgccc tcgttccgac     2880
          ccgcttgcgc gggtcggacc acttcgggct cgggggggcg cgcctgcggc gcttttttac     2940
          taaacagact ccgagccgcc atttggcccc ctaagctccg cccccctcat gaatattcat     3000
          aaaggaaacc acataattag aattgccgac cacaaactgc catatgctaa ttagttcccc     3060
          ttttacaaag taaaagggga agtgaacata gccccacacc cgcaggggca aggccccgca     3120
          cccctacgtc actaaccacg cccccgccgc catcttgggt gcggcagggc gggggc         3176
          <![CDATA[<210> 887]]>
          <![CDATA[<211> 124]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 887]]>
          Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 
                  35                  40                  45              
          Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 
                          85                  90                  95      
          Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Arg 
                  115                 120                 
          <![CDATA[<210> 888]]>
          <![CDATA[<211> 271]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 888]]>
          Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 
                  35                  40                  45              
          Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 
                          85                  90                  95      
          Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Ser Gly Val Asp His 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Met Asn Gln Lys Leu Leu Thr Leu Ala Asn Lys Ser Ser Met 
              130                 135                 140                 
          Met Ser Pro Ile Leu Ser Thr Lys Gln Tyr Lys Leu Lys Ile Gln Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Lys Thr Pro Asp Leu Ser Ser Met Ile Gly Thr Thr Asp Glu Ala 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Lys Lys Asp Leu Leu Lys Glu Cys Gln Leu Thr Ser Gln Leu 
                      180                 185                 190         
          Ile Gln Ile Ser Lys Gln Leu Gln Arg Lys Thr Phe Pro Lys Arg Lys 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Leu Asp Pro Asn Ser Gln Ser His Asn Lys Lys Lys Arg Arg 
              210                 215                 220                 
          His Cys His Val Ser Ser Leu Ser Ala Lys Lys Ile Pro Ser Lys Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Arg His Lys Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser 
                          245                 250                 255     
          Ser Ser Ser Ser Ser Arg Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Asn 
                      260                 265                 270     
          <![CDATA[<210> 889]]>
          <![CDATA[<211> 267]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 889]]>
          Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 
                  35                  40                  45              
          Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 
                          85                  90                  95      
          Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Arg Ser Ala Ser Asn 
                  115                 120                 125             
          Phe Arg Gly Arg His Ser Gln Lys Glu Lys Glu Asn Trp Thr Pro Thr 
              130                 135                 140                 
          His Ser Pro Thr Thr Lys Arg Arg Gly Asp Thr Val Met Ser Pro Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Gln Lys Arg Tyr Leu Pro Arg Asn Arg Asp Thr Arg Arg Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Ala His Gln Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Pro Pro Gln Glu 
                      180                 185                 190         
          Lys His Pro Pro Ala His Pro Gln Thr Lys Arg Glu Ser Thr Asn Ala 
                  195                 200                 205             
          Ser Ala Ser His Arg His Val Thr Leu Thr Arg Phe Lys Pro Gly Phe 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Thr Glu Arg Glu Leu Ala Ile Ile Phe His Arg Pro Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Thr Tyr Lys Glu Asp Leu Pro Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Pro Ala 
                          245                 250                 255     
          Pro Leu Val Gln Phe Asn Leu Asn Phe Lys Gly 
                      260                 265         
          <![CDATA[<210> 890]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 890]]>
          Met Arg Arg Arg Arg Thr Lys Tyr Gly Cys Leu Lys Leu Leu Thr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Met Ile Ile Ser Ala Val Ala Gly Ile His Leu Leu Thr Phe Leu Leu 
                      20                  25                  30          
          Pro Tyr Phe Leu Leu Ala Thr Lys Ile Val Ile Leu Leu Leu Thr Lys 
                  35                  40                  45              
          Phe Phe 
              50  
          <![CDATA[<210> 891]]>
          <![CDATA[<211> 662]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 891]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys Ser Leu Ile Val Arg Gln 
              50                  55                  60                  
          Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys Ile Ile Gly Gln Ser Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met Tyr Cys Tyr Thr Val Asn 
                          85                  90                  95      
          Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro Tyr Gly Gly Gly Phe Gly 
                      100                 105                 110         
          Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr Glu Glu Tyr Arg Phe Ala 
                  115                 120                 125             
          Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu Lys Asp Leu Cys Arg Tyr 
              130                 135                 140                 
          Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Asp Phe Val 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln Leu Thr Lys Phe Thr Tyr 
                          165                 170                 175     
          Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu Gln Lys His His Lys Phe 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly Arg Leu Thr Lys Lys Leu 
                  195                 200                 205             
          Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser Lys Trp Phe Phe Ser Lys 
              210                 215                 220                 
          Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu Lys Ala Ser Ala Leu Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn Glu Asn Pro Gln Val Phe 
                          245                 250                 255     
          Phe Tyr Tyr Leu Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala 
                      260                 265                 270         
          Gln Ser Ser Thr Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr 
                  275                 280                 285             
          Tyr Tyr Arg Tyr Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His 
              290                 295                 300                 
          Glu Tyr Glu Lys Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Leu Gln Thr Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ile Ala Glu Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp 
                      340                 345                 350         
          Asn Gly Asp Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr 
                  355                 360                 365             
          Trp Asp Gln Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro 
              370                 375                 380                 
          Ile Trp Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Asp Lys Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro 
                          405                 410                 415     
          Ala Ile Phe Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro 
                      420                 425                 430         
          Leu Ser Gln Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro 
                  435                 440                 445             
          Thr Leu Leu Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln 
              450                 455                 460                 
          Glu Ile Ile Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Asn Gln Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe 
                          485                 490                 495     
          Thr Phe Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp 
                      500                 505                 510         
          Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr 
                  515                 520                 525             
          Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His 
              530                 535                 540                 
          Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu 
                          565                 570                 575     
          Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val 
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys 
                  595                 600                 605             
          Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln 
              610                 615                 620                 
          Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu 
                          645                 650                 655     
          His Thr Gly Met Leu Pro 
                      660         
          <![CDATA[<210> 892]]>
          <![CDATA[<211> 215]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 892]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala 
              50                  55                  60                  
          Asp Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          His Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Arg Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Val Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln 
                  195                 200                 205             
          Leu His Thr Gly Met Leu Pro 
              210                 215 
          <![CDATA[<210> 893]]>
          <![CDATA[<211> 129]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 893]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Ile Ser Lys Gln Leu Gln Arg Lys Thr Phe Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Arg Lys Arg Glu Leu Asp Pro Asn Ser Gln Ser His Asn Lys Lys Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg His Cys His Val Ser Ser Leu Ser Ala Lys Lys Ile Pro Ser 
                          85                  90                  95      
          Lys Lys Gln Arg His Lys Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Asn 
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          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 925]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys Ser Leu Ile Val Arg Gln 
              50                  55                  60                  
          Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys Ile Ile Gly Gln Ser Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met Tyr Cys Tyr Thr Val Asn 
                          85                  90                  95      
          Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro Tyr Gly Gly Gly Phe Gly 
                      100                 105                 110         
          Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr Glu Glu Tyr Arg Phe Ala 
                  115                 120                 125             
          Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu Lys Asp Leu Cys Arg Tyr 
              130                 135                 140                 
          Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Asp Phe Val 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln Leu Thr Lys Phe Thr Tyr 
                          165                 170                 175     
          Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu Gln Lys His His Lys Phe 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly Arg Leu Thr Lys Lys Leu 
                  195                 200                 205             
          Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser Lys Trp Phe Phe Ser Lys 
              210                 215                 220                 
          Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu Lys Ala Ser Ala Leu Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn Glu Asn Pro Gln Val Phe 
                          245                 250                 255     
          Phe Tyr Tyr Leu Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala 
                      260                 265                 270         
          Gln Ser Ser Thr Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr 
                  275                 280                 285             
          Tyr Tyr Arg Tyr Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His 
              290                 295                 300                 
          Glu Tyr Glu Lys Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Leu Gln Thr Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ile Ala Glu Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp 
                      340                 345                 350         
          Asn Gly Asp Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr 
                  355                 360                 365             
          Trp Asp Gln Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro 
              370                 375                 380                 
          Ile Trp Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Asp Lys Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro 
                          405                 410                 415     
          Ala Ile Phe Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro 
                      420                 425                 430         
          Leu Ser Gln Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro 
                  435                 440                 445             
          Thr Leu Leu Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln 
              450                 455                 460                 
          Glu Ile Ile Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Asn Gln Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe 
                          485                 490                 495     
          Thr Phe Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp 
                      500                 505                 510         
          Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr 
                  515                 520                 525             
          Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His 
              530                 535                 540                 
          Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu 
                          565                 570                 575     
          Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val 
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys 
                  595                 600                 605             
          Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln 
              610                 615                 620                 
          Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu 
                          645                 650                 655     
          His Thr Gly Met Leu Pro 
                      660         
          <![CDATA[<210> 926]]>
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          <![CDATA[<400> 926]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys 
              50                  55              
          <![CDATA[<210> 927]]>
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          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 927]]>
          Ser Leu Ile Val Arg Gln Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ile Gly Gln Ser Ala Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met 
                      20                  25                  30          
          Tyr Cys Tyr Thr Val Asn Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Gly Gly Phe Gly Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Tyr Arg Phe Ala Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp 
                          85                  90                  95      
          Asn Lys Thr Asp Phe Val Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Lys Phe Thr Tyr Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu 
                  115                 120                 125             
          Gln Lys His His Lys Phe Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Leu Thr Lys Lys Leu Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Phe Phe Ser Lys Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Lys Ala Ser Ala Leu Asp Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn 
                      180                 185                 190         
          Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Tyr Tyr Leu 
                  195                 200         
          <![CDATA[<210> 928]]>
          <![CDATA[<211> 79]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 928]]>
          Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala Gln Ser Ser Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr Tyr Tyr Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His Glu Tyr Glu Lys 
                  35                  40                  45              
          Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser Phe Leu Gln Thr 
              50                  55                  60                  
          Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys Ile Ala Glu 
          65                  70                  75                  
          <![CDATA[<210> 929]]>
          <![CDATA[<211> 160]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 929]]>
          Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp Asn Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr Trp Asp Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro Ile Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys Ala Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro Ala Ile Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro Leu Ser Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro Thr Leu Leu 
                      100                 105                 110         
          Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln Glu Ile Ile 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr Ala Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe Thr Phe Lys 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210> 930]]>
          <![CDATA[<211> 163]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 930]]>
          Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp Pro Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr Ile Gln Ile 
                      20                  25                  30          
          Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His Asp Trp Asp 
                  35                  40                  45              
          Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg Met Ser Thr 
              50                  55                  60                  
          Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu Glu Asp Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val Pro Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys Lys Lys Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln Leu Ile Lys 
                  115                 120                 125             
          Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile Leu Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu His Thr Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Met Leu Pro 
          <![CDATA[<210> 931]]>
          <![CDATA[<400> 931]]>
          000
          <![CDATA[<210> 932]]>
          <![CDATA[<400> 932]]>
          000
          <![CDATA[<210> 933]]>
          <![CDATA[<400> 933]]>
          000
          <![CDATA[<210> 934]]>
          <![CDATA[<400> 934]]>
          000
          <![CDATA[<210> 935]]>
          <![CDATA[<400> 935]]>
          000
          <![CDATA[<210> 936]]>
          <![CDATA[<400> 936]]>
          000
          <![CDATA[<210> 937]]>
          <![CDATA[<400> 937]]>
          000
          <![CDATA[<210> 938]]>
          <![CDATA[<400> 938]]>
          000
          <![CDATA[<210> 939]]>
          <![CDATA[<400> 939]]>
          000
          <![CDATA[<210> 940]]>
          <![CDATA[<400> 940]]>
          000
          <![CDATA[<210> 941]]>
          <![CDATA[<400> 941]]>
          000
          <![CDATA[<210> 942]]>
          <![CDATA[<400> 942]]>
          000
          <![CDATA[<210> 943]]>
          <![CDATA[<400> 943]]>
          000
          <![CDATA[<210> 944]]>
          <![CDATA[<400> 944]]>
          000
          <![CDATA[<210> 945]]>
          <![CDATA[<400> 945]]>
          000
          <![CDATA[<210> 946]]>
          <![CDATA[<400> 946]]>
          000
          <![CDATA[<210> 947]]>
          <![CDATA[<400> 947]]>
          000
          <![CDATA[<210> 948]]>
          <![CDATA[<400> 948]]>
          000
          <![CDATA[<210> 949]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223> W或F]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (2)..(8)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (10)..(12)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (16)..(20)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 949]]>
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa 
          1               5                   10                  15      
          Xaa Xaa Xaa Xaa His 
                      20      
          <![CDATA[<210> 950]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知物]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒ORF1序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (4)..(5)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (9)..(10)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 950]]>
          Tyr Asn Pro Xaa Xaa Asp Xaa Gly Xaa Xaa Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 951]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知物]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒ORF1序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (6)..(7)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (9)..(9)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (15)..(16)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 951]]>
          Tyr Asn Cys Ser Pro Xaa Xaa Asp Xaa Gly Ala Ser Lys Arg Xaa Xaa 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Ser Val Ala Lys 
                      20          
          <![CDATA[<210> 952]]>
          <![CDATA[<211> 51]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> modified_base]]>
          <![CDATA[<222> (45)..(45)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、t、g、未知物或其他]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 關於取代及較佳實施例之詳細描述，請參見申請的說明書]]>
          <![CDATA[<400> 952]]>
          aggtgagtga aaccaccgaa gtcaaggggc aattcgggct agggncagtc t                51
          <![CDATA[<210> 953]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 953]]>
          aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc                  50
          <![CDATA[<210> 954]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 954]]>
          aggtgagtga aaccaccgaa gtcaaggggc aattcgggct agatcagtct                  50
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          aggtgagtga aaccaccgag gtctaggggc aattcgggct agggcagtct                  50
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          His His His His His His 
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          agcaacaggt aatggaggac                                                   20
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          tgaagctggg gtctttaac                                                    19
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          tctacctagg tgcaaagggc c                                                 21
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Claims (16)

  1. 一種組合物，其包含 (i)核酸(例如DNA)構築體，其包含： a)可操作地連接於編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之序列；及 b)適於在昆蟲細胞中複製該核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中該主鏈區域亦適於在細菌細胞中複製該核酸構築體；及 (ii)指環病毒遺傳元件，其包含啟動子可操作地連接於編碼外源性效應子之序列。
  2. 一種核酸(例如DNA)構築體，其包含： a)指環病毒遺傳元件區域，其包含啟動子可操作地連接於編碼外源性效應子之序列；及 b)適於在昆蟲細胞中複製該核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中該主鏈區域亦適於在細菌細胞中複製該核酸構築體。
  3. 一種細菌細胞，其包含如請求項1或2之核酸構築體或核酸製劑。
  4. 一種昆蟲細胞，其包含如請求項1至3中任一項之核酸構築體或核酸製劑。
  5. 一種昆蟲細胞，其包含指環病毒ORF1分子，該分子包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區域及指環病毒ORF1 C端域。
  6. 一種包含如請求項2之核酸構築體的昆蟲細胞，其進一步含有包含以下之核酸構築體： a)編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之序列；及 b)適於在昆蟲細胞中複製該核酸構築體之主鏈區域(例如桿狀病毒主鏈區域)，視情況其中該主鏈區域亦適於在細菌細胞中複製該核酸構築體。
  7. 一種組合物，其包含分離之指環病毒ORF1分子，該分子包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區域及指環病毒C端域，且不包含可偵測量之指環病毒遺傳元件。
  8. 一種組合物，其包含分子量為至少101 kDa之分離之指環病毒ORF1分子，且不包含可偵測量之指環病毒遺傳元件。
  9. 一種桿狀病毒粒子，其包含如請求項2之核酸構築體。
  10. 一種包含如請求項2之核酸構築體之桿狀病毒粒子之群體。
  11. 一種反應混合物，其包含如請求項10之桿狀病毒粒子群體及複數個昆蟲細胞。
  12. 一種核酸構築體，其依序包含： a)第一轉位酶識別序列(例如Tn7R序列)； b)指環病毒遺傳元件區域，其包含啟動子可操作地連接於編碼外源性效應子之序列； c)第二轉位酶識別序列(例如Tn7L序列)；及 d)視情況存在之主鏈區域，例如其中該主鏈區域適於該DNA構築體之複製。
  13. 一種核酸構築體，其依序包含： a)第一轉位酶識別序列(例如Tn7R序列)； b)啟動子可操作地連接於編碼指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子)之序列； c)第二轉位酶識別序列(例如Tn7L序列)；及 d)視情況存在之主鏈區域，例如其中該主鏈區域適於該DNA構築體之複製。
  14. 一種製造桿狀病毒粒子之方法，該方法包含： (i)提供昆蟲細胞(例如Sf9細胞)，其包含如請求項2之核酸構築體；及 (ii)該昆蟲細胞在適於產生包含該核酸構築體或其複本之桿狀病毒粒子的條件下培育； 由此製造桿狀病毒粒子。
  15. 一種製造包含指環病毒遺傳元件之穿梭載體(bacmid)構築體之昆蟲細胞的方法，該方法包含： (i)提供包含如請求項2之核酸構築體及空穿梭載體構築體之昆蟲細胞(例如Sf9細胞)；及 (ii)該昆蟲細胞在適於該核酸構築體與該空穿梭載體構築體之間重組之條件下培育； 由此製造含有包含指環病毒遺傳元件之穿梭載體構築體的昆蟲細胞。
  16. 一種製造指環載體之方法，該方法包含： (i)提供一種昆蟲細胞，其包含： a)指環病毒遺傳元件，其包含啟動子可操作地連接於編碼外源性效應子之序列，及 b)指環病毒ORF1分子； (ii)該昆蟲細胞在適於將該指環病毒遺傳元件包封在包含該指環病毒ORF1分子之蛋白質外部中的條件下培育。
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