TW202334431A - 新穎指環載體(anellovector)組合物及方法 - Google Patents

新穎指環載體(anellovector)組合物及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202334431A
TW202334431A TW111138702A TW111138702A TW202334431A TW 202334431 A TW202334431 A TW 202334431A TW 111138702 A TW111138702 A TW 111138702A TW 111138702 A TW111138702 A TW 111138702A TW 202334431 A TW202334431 A TW 202334431A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
orf1
molecule
vector
sequence
Prior art date
Application number
TW111138702A
Other languages
English (en)
Inventor
內森 勞倫斯 佑茲偉艾克
凱撒 Ａ 阿爾塞
達南傑 馬尼克拉爾 納彎達
賽門 德拉葛瑞夫
羅傑 喬瑟夫 哈捷爾
秉泉 翁
Original Assignee
美商旗艦先鋒創新公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商旗艦先鋒創新公司 filed Critical 美商旗艦先鋒創新公司
Publication of TW202334431A publication Critical patent/TW202334431A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/00043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明大體上關於指環病毒科家族載體(例如，指環載體)及其組合物及用途。

Description

新穎指環載體(ANELLOVECTOR)組合物及方法
持續需要開發適合之載體以向患者遞送治療性遺傳物質。
本發明提供一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，該載體可用作遞送媒劑，例如用於遞送遺傳物質、用於遞送效應子(例如，有效負載)或用於遞送治療劑或治療效應子至真核生物細胞(例如，人類細胞或人類組織)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體) (例如，粒子，例如病毒粒子，例如指環病毒粒子)包含囊封於蛋白質外部(例如，包含指環病毒科家族病毒衣殼蛋白(例如，指環病毒衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1蛋白質或由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽；或雞貧血病毒(CAV) VP1蛋白質或由CAV VP1核酸編碼之多肽，例如如本文所描述)之蛋白質外部，其能夠將該遺傳元件引入細胞(例如，哺乳動物細胞，例如人類細胞)中)中之遺傳元件(例如，包含治療性DNA序列之遺傳元件)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)為包含蛋白質外部之粒子，該蛋白質外部包含由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽(例如，甲型細環病毒( Alphatorquevirus)、乙型細環病毒( Betatorquevirus)或丙型細環病毒( Gammatorquevirus)之ORF1核酸，例如如本文所描述)或由CAV VP1核酸編碼之多肽(例如，如本文所描述)。本發明之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的遺傳元件通常為環狀及/或單股DNA分子(例如，環狀及單股的)，且一般包括與包圍其之蛋白質外部結合的蛋白質結合序列或包括與其連接之多肽，此可促進遺傳元件包封在蛋白質外部內及/或使遺傳元件相對於其他核酸在蛋白質外部內富集。在一些情況下，遺傳元件為環狀或線性的。在一些情況下，遺傳元件包含或編碼效應子(例如核酸效應子，諸如非編碼RNA，或多肽效應子，例如蛋白質)，其可在細胞中表現。在一些實施例中，效應子為治療劑或治療性效應子，例如如本文所描述。在一些情況下，效應子為內源性效應子或外源性效應子，例如針對野生型指環病毒或目標細胞。在一些實施例中，效應子針對野生型指環病毒或目標細胞為外源性的。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)載體可藉由接觸細胞且將編碼效應子之遺傳元件引入至細胞中而將效應子遞送至細胞中，使得該效應子係由細胞產生或表現。在某些情況下，效應子為內源性效應子(例如，針對目標細胞具有內源性，但例如以指環病毒科家族載體(例如，指環載體)增加的量提供)。在其他情況下，效應子為外源性效應子。在一些情況下，效應子可調節細胞功能或調節細胞中目標分子之活性或水準。舉例而言，效應子可降低細胞中之目標蛋白質的含量(例如，如實例3及4中所描述)。在另一實例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可活體內遞送及表現效應子，例如外源性蛋白質(例如，如實例19及28中所描述)。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可用於例如將遺傳物質遞送至目標細胞、組織或個體；將效應子遞送至目標細胞、組織或個體；或用於治療疾病及病症，例如藉由遞送可作為治療劑操作之效應子至所需細胞、組織或個體。
本發明進一步提供合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)與野生型病毒(例如，野生型指環病毒，例如本文所描述)相比具有至少一個結構差異，例如相對於野生型病毒的缺失、插入、取代、修飾(例如，酶修飾)。通常，合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括包封於蛋白質外部內之外源性遺傳元件，其可用於將遺傳元件或其中經編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)(例如，多肽或核酸效應子)遞送至真核(例如，人類)細胞中。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)未引起可偵測及/或非所需免疫或反應性反應，例如未引起發炎分子標記物，例如TNF-α、IL-6、IL-12、IFN以及B細胞反應，例如反應性或中和抗體增加超過1%、5%、10%、15%，例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可針對目標細胞、組織或個體實質上非免疫原性。
在一態樣中，本發明提供一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含：(i)包含啟動子元件及編碼效應子(例如，內源性或外源性效應子)之序列，及蛋白質結合序列(例如，外部蛋白質結合序列，例如封裝訊號)的遺傳元件；及(ii)蛋白質外部；其中該遺傳元件包封於蛋白質外部(例如，衣殼)內；且其中指環病毒科家族載體(例如，指環載體)能夠將遺傳元件遞送至真核(例如，哺乳動物，例如人類)細胞中。在一些實施例中，遺傳元件為單股及/或環形DNA。替代地或組合地，遺傳元件具有以下特性之一者、兩者、三者或全部：為環形，為單股，以小於進入細胞之遺傳元件的約0.0001%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合至細胞之基因體中，及/或以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，整合頻率如Wang等人. (2004, Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中所描述確定。在一些實施例中，遺傳元件包封於蛋白質外部內。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)能夠將遺傳元件遞送至真核生物細胞中。在一些實施例中，遺傳元件包含核酸序列(例如，300-4000個核苷酸之間、例如300-3500個核苷酸之間、300-3000個核苷酸之間、300-2500個核苷酸之間、300-2000個核苷酸之間、300-1500個核苷酸之間的核酸序列)，該核酸序列與野生型指環病毒之序列(例如，野生型細環病毒(Torque Teno virus，TTV)、小細環病毒(Torque Teno mini virus，TTMV)、野生型TTMDV序列或野生型CAV，例如如表N1-N4所列之野生型指環病毒序列)具有至少75% (例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的序列一致性。在一些實施例中，遺傳元件包含核酸序列(例如，至少300個核苷酸、500個核苷酸、1000個核苷酸、1500個核苷酸、2000個核苷酸、2500個核苷酸、3000個核苷酸或更多個之核酸序列)，該核酸序列與野生型指環病毒科家族病毒之序列(例如，如本文所描述之野生型指環病毒或CAV序列，例如如表N1-N4中所列具有至少75% (例如，至少75、76、77、78、79、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)序列一致性。在一些實施例中，核酸序列例如針對在哺乳動物(例如人類)細胞中之表現而經密碼子最佳化。在一些實施例中，核酸序列中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子經密碼子最佳化，例如用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現。
在一態樣中，本發明提供一種感染性(針對人類細胞)粒子，其包含指環病毒科家族病毒衣殼，例如指環病毒衣殼(例如，包含指環病毒ORF，例如ORF1多肽之衣殼)或CAV衣殼(例如，包含CAV VP1多肽之衣殼)，其囊封包含結合至衣殼之蛋白質結合序列及編碼治療性效應子之異源(針對指環病毒)序列的遺傳元件。在一些實施例中，粒子能夠將遺傳元件遞送至哺乳動物(例如人類)細胞中。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒或CAV具有低於約6% (例如，低於6%、5.5%、5%、4.5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%或更低)一致性。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒或CAV具有不超過1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%或6%一致性。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒或CAV具有至少約2%至至少約5.5% (例如，2至5%、3%至5%、4%至5%)一致性。在一些實施例中，遺傳元件具有大於約2000、3000、4000、4500或5000個核苷酸之非病毒序列(例如非指環病毒基因體序列)。在一些實施例中，遺傳元件具有大於約2000至5000、2500至4500、3000至4500、2500至4500、3500或4000、4500個(例如約3000至4500個之間)核苷酸之非病毒序列(例如非指環病毒基因體序列)。在一些實施例中，遺傳元件為單股環狀DNA。替代地或組合地，遺傳元件具有以下特性之一者、兩者或3者：為環形，為單股，以小於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合至細胞之基因體中，以每個基因體低於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中，或以低於進入細胞之遺傳元件的約0.0001%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合。在一些實施例中，整合頻率如Wang等人. (2004, Gene Therapy 11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中所描述確定。
本文亦描述基於指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)之病毒載體及病毒粒子，其可用於向細胞(例如，待治療之個體的細胞)遞送藥劑(例如，外源性效應子或內源性效應子，例如治療性效應子)。在一些實施例中，指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)可用作用於向目標細胞(例如，待接受治療性或預防性治療之個體的目標細胞)引入藥劑(諸如，本文所描述之效應子)的有效遞送媒劑。
在一態樣中，本發明提供一種多肽(例如，合成性多肽，例如ORF1分子或VP1分子)，其包含(例如，串聯)： (i)包含富含精胺酸之區之第一區域，例如與本文所描述之富含精胺酸之區序列或包含至少60%、70%或80%鹼性殘基(例如，精胺酸、離胺酸或其組合)之至少約40個胺基酸序列具有至少70% (例如，至少約70、80、90、95、96、97、98、99或100%)序列一致性的胺基酸序列， (ii)包含果凍卷域之第二區域，例如與本文所描述之果凍卷區域序列或包含至少6個β股之序列具有至少30% (例如，至少約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或100%)序列一致性的胺基酸序列， (iii)包含與本文所描述之N22域序列具有至少30% (例如，至少約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或100%)序列一致性之胺基酸序列的第三區域， (iv)包含與本文所描述之指環病毒ORF1或CAV VP1 C端域(CTD)序列具有至少70% (例如，至少約70、80、90、95、96、97、98、99或100%)序列一致性之胺基酸序列的第四區，及 (v)視情況其中，該多肽具有與本文所描述之野生型指環病毒ORF1或CAV VP1蛋白質具有低於100%、99%、98%、95%、90%、85%、80%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種多肽(例如，合成性多肽，例如VP1分子)，其包含(例如，串聯)： (i)第一區域，其包含富含精胺酸之區，例如至少約40個胺基酸之序列，該序列包含至少60%、70%或80%鹼性殘基(例如，精胺酸、離胺酸或其組合)， (ii)第二區域，其包含果凍卷域，例如包含排列成兩個反向平行β褶板形式之至少6個β股(例如6、7或8個β股)之序列，該等β股跨疏水性界面包裝在一起，及 (iii)視情況，其中該多肽與例如如本文所描述之野生型CAV VP1蛋白具有低於100%、99%、98%、95%、90%、85%、80%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，多肽包含與如本文所描述之指環病毒ORF1分子或CAV VP1分子(例如，如表A1-A3中之任一者中所列)至少約70、80、90、95、96、97、98、99或100%序列一致性。在一些實施例中，多肽包含與如本文所描述之指環病毒ORF1或CAV VP1分子(例如，如表A1-A3中之任一者中所列出)之子序列(例如，富含精胺酸(Arg)域、果凍卷域、高變區(HVR)、N22域或C端域(CTD))至少約70、80、90、95、96、97、98、99或100%序列一致性。在一個實施例中，(i)、(ii)、(iii)及(iv)區域之胺基酸序列與其相應參考具有至少90%序列一致性，且其中多肽具有與本文所描述之野生型指環病毒ORF1或CAV VP1蛋白質具有低於100%、99%、98%、95%、90%、85%、80%序列一致性的胺基酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種複合物，其包含如本文所描述之多肽(例如，如本文所描述之指環病毒ORF1分子或CAV VP1分子)及遺傳元件，該遺傳元件包含啟動子元件及編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)及蛋白質結合序列。
本發明進一步提供核酸分子(例如，包括如本文所描述之遺傳元件的核酸分子，或包括如本文所描述之編碼蛋白質外部蛋白質之序列的核酸分子)。本發明之核酸分子可包括以下中之一者或兩者：(a)如本文所描述之遺傳元件；及(b)編碼如如本文所描述之蛋白質外部蛋白質的核酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種經分離核酸分子，其包含含有可操作地連接至編碼效應子(例如，有效負載)之序列之啟動子元件及外部蛋白質結合序列的遺傳元件。在一些實施例中，外部蛋白質結合序列包括與如本文所揭示之指環病毒或CAV之5'UTR序列至少75% (至少80%、85%、90%、95%、97%、100%)一致的序列。在一些實施例中，遺傳元件為單股DNA，為環狀，以低於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合，及/或以每個基因體低於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中，或以低於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合。在一些實施例中，整合頻率如Wang等人. (2004, Gene Therapy 11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中所描述確定。在實施例中，效應子不來源於TTV且不為SV40-miR-S1。在實施例中，核酸分子不包含TTMV-LY2之聚核苷酸序列。在實施例中，啟動子元件能夠導引效應子在真核(例如哺乳動物，例如人類)細胞中之表現。
在一些實施例中，核酸分子為環狀的。在一些實施例中，核酸分子為線性的。在一些實施例中，本文所描述之核酸分子包含一或多個經修飾之核苷酸(例如鹼基修飾、糖修飾或主鏈修飾)。
在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF1分子(例如指環病毒ORF1蛋白質，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF2分子(例如指環病毒ORF2蛋白質，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF3分子(例如指環病毒ORF3蛋白，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼VP1分子(例如，CAV VP1蛋白質，例如如本文所描述)之序列。在一態樣中，本發明提供一種包含以下中之一者、兩者或三者的遺傳元件：(i)啟動子元件及編碼效應子，例如外源性或內源性效應子之序列；(ii)與野生型指環病毒或CAV序列具有至少75% (例如，至少75、76、77、78、79、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)序列一致性的至少72個連續核苷酸(例如，至少72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100或150個核苷酸)；或與野生型指環病毒或CAV序列具有至少72% (例如，至少72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)序列一致性的至少100個(例如，至少300、500、1000、1500)連續核苷酸；及(iii)蛋白質結合序列，例如外部蛋白質結合序列，且其中該核酸構築體為單股DNA；且其中該核酸構築體為環狀，以低於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合，及/或以每個基因體低於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，編碼效應子(例如，外源性或內源性效應子，例如如本文所描述)之遺傳元件經密碼子最佳化。在一些實施例中，遺傳元件為環狀的。在一些實施例中，遺傳元件為線性的。在一些實施例中，本文所描述之遺傳元件包含一或多個經修飾之核苷酸(例如鹼基修飾、糖修飾或主鏈修飾)。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF1分子(例如指環病毒ORF1蛋白，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF2分子(例如指環病毒ORF2蛋白，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF3分子(例如指環病毒ORF3蛋白，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼VP1分子(例如，CAV VP1蛋白質，例如如本文所描述)之序列。
在一態樣中，本發明提供一種宿主細胞或輔助細胞，其包含：(a)包含編碼ORF1分子、ORF2分子、ORF3、VP1分子、VP2分子或VP3分子中之一或多者之序列(例如，編碼指環病毒ORF1多肽或本文所描述之CAV VP1多肽之序列)的核酸，其中該核酸為質體，為病毒核酸，整合至輔助細胞染色體中；及(b)遺傳元件，其中該遺傳元件包含(i)可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件及(ii)結合(a)之多肽的蛋白質結合序列，其中視情況地，該遺傳元件未編碼ORF1或VP1多肽(例如，ORF1蛋白質或VP1蛋白質)。舉例而言，宿主細胞或輔助細胞包含呈順式(同一核酸分子之一部分)或反式(不同核酸分子之各部分)的(a)及(b)。在實施例中，(b)之遺傳元件為環狀單股DNA。在一些實施例中，宿主細胞為製造細胞株。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞為黏附的或懸浮的，或兩者。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞在微載體中生長。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞與cGMP製造規範相容。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞在適合於促進細胞生長之培養基中生長。在某些實施例中，在宿主細胞或輔助細胞已充分生長(例如生長至適當細胞密度)後，培養基可與適合於宿主細胞或輔助細胞產生指環載體之培養基進行交換。
在一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體) (例如，合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體))。在實施例中，醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在實施例中，醫藥組合物包含單位劑量，其包含每公斤目標個體約10 5-10 14個基因體當量之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，包含製劑之醫藥組合物在可接受之時段及溫度內將為穩定的，及/或與所需投與途徑及/或此投與途徑將需要之任何裝置相容，例如針或注射器。在一些實施例中，醫藥組合物經調配而以單次劑量或多次劑量投與。在一些實施例中，醫藥組合物例如由醫療專家在投與部位處調配。在一些實施例中，醫藥組合物包含所需濃度之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)基因體或基因體當量(例如，如每體積之基因體數目所定義)。
在一態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病或病症的方法，該方法包含向該個體投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如如本文所描述。在一態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病或病症的方法，該方法包含向該個體之該眼睛投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科家族載體，指環載體)，例如如本文所描述。
在一態樣中，本發明提供一種向細胞、組織或個體遞送效應子或有效負載(例如，內源性或外源性效應子)之方法，該方法包含向該個體投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如如本文所描述，其中該指環載體包含編碼效應子之核酸序列。在實施例中，有效負載為核酸。在實施例中，有效負載為多肽。在一些實施例中，細胞為眼睛之細胞。在某些實施例中，眼睛之細胞為感光細胞、視網膜細胞、後眼杯(PEC)細胞、視神經細胞、視神經頭細胞、視網膜神經節細胞或視網膜色素上皮(RPE)細胞。在一些實施例中，組織為眼睛之組織。在某些實施例中，眼睛之組織為視網膜、後眼杯、視網膜神經節、視網膜色素上皮、視神經、視神經頭、視網膜下腔或玻璃體內空間。
在一態樣中，本發明提供一種將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遞送至細胞之方法，其包含使該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如如本文所描述，與細胞，例如真核生物細胞，例如哺乳動物細胞，例如活體內或活體外接觸。在一些實施例中，細胞為眼睛之細胞。在某些實施例中，眼睛之細胞為感光細胞、視網膜細胞、後眼杯(PEC)細胞、視神經細胞、視神經頭細胞、視網膜神經節細胞或視網膜色素上皮(RPE)細胞。
在一態樣中，本發明提供一種產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如合成性指環載體之方法。該方法包括： a)提供宿主細胞，其包含： (i)第一核酸分子，其包含如本文所描述之指環載體，例如合成性指環載體之遺傳元件的核酸序列，及 (ii)編碼例如如表A1-A3中所列出之選自ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、ORF1/2、VP1、VP2或VP3之胺基酸序列中之一或多者，或與其具有至少70% (例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性之胺基酸序列的第一核酸或第二核酸分子；及 b)在適合於產生該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培育該宿主細胞。
在一些實施例中，方法在步驟(a)之前進一步包括將第一核酸分子及/或第二核酸分子引入至宿主細胞中。在一些實施例中，第二核酸分子係在第一核酸分子之前、與其同時或在其之後引入宿主細胞中。在其他實施例中，第二核酸分子整合至宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，第二核酸分子為輔助細胞(例如，輔助質體或輔助病毒之基因體)。
在另一態樣中，本發明提供一種產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物之方法，其包含： a)提供包含，例如表現指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之一或多種組分(例如，所有組分)的宿主細胞，例如合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如如本文所描述。舉例而言，宿主細胞包含(a)核酸，該核酸包含編碼本文所描述之指環病毒ORF1或CAV VP1多肽之序列，其中該核酸為質體、病毒核酸或整合至輔助細胞染色體中；及(b)遺傳元件，其中該遺傳元件包含(i)啟動子元件，其可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)及(i)結合(a)之多肽的蛋白質結合序列(例如，封裝序列)，其中該宿主細胞或輔助細胞包含呈順式或反式之(a)及(b)。在實施例中，(b)之遺傳元件為環狀單股DNA。在一些實施例中，宿主細胞為製造細胞株； b)在適用於由宿主細胞產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)製劑的條件下培養宿主細胞，其中該製劑之該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含囊封該遺傳元件(例如，如本文所描述)之蛋白質外部(例如，包含ORF1分子)，從而產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之製劑；及 視情況，c)調配指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之製劑，例如作為適合於向個體投與之醫藥組合物。
在一些實施例中，在產生時(例如，藉由短暫轉染)將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之組分引入宿主細胞中。在一些實施例中，穩定表現指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之組分的宿主細胞(例如，其中將編碼指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之組分的一或多種核酸引入至宿主細胞或其祖細胞中，例如藉由穩定的轉染)。
在一些實施例中，該方法進一步包含一或多個純化步驟(例如，藉由沈降、層析及/或超過濾純化)。在一些實施例中，純化步驟包含自製劑中移除血清、宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、缺乏遺傳元件之粒子及/或酚紅中之一或多者。在一些實施例中，所得製備或包含製劑之醫藥組合物在可接受之時段及溫度內將為穩定的，及/或與所需投與途徑及/或此投與途徑將需要之任何裝置，例如針或注射器相容。
在一態樣中，本發明提供一種產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物之方法，其包含：a)提供複數個本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，或本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之製劑；及b)調配指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其製劑，例如適合於向個體投與之醫藥組合物。
在一態樣中，本發明提供一種產生宿主細胞，例如第一宿主細胞或生產細胞(例如，如圖12中所示)，例如第一宿主細胞群體之方法，該細胞包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，該方法包含將例如如本文所描述之遺傳元件引入至宿主細胞，且在適合於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培養該宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向宿主細胞中引入輔助細胞，例如輔助病毒。在一些實施例中，引入包含用指環病毒科家族載體(例如，指環載體)轉染(例如，化學轉染)或電穿孔宿主細胞。
在一態樣中，本發明提供一種產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之方法，其包含提供宿主細胞，例如第一宿主細胞或生產細胞(例如，如圖12中所示)，其包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如如本文所描述，及自宿主細胞純化指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，在提供步驟之前，該方法進一步包含使宿主細胞與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如如本文所描述之載體接觸，且在適用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培育宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為上述產生宿主細胞之方法中所描述之第一宿主細胞或生產細胞。在一些實施例中，自宿主細胞純化指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含溶解宿主細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含使由第一宿主細胞或生產細胞產生之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)與第二宿主細胞(例如，容許細胞(例如，如圖12中所示)，例如，第二宿主細胞群體)接觸的第二步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在適用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培育第二宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含自第二宿主細胞純化指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如從而產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)種子群體。在一些實施例中，至少約2至100倍更多之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)自第二宿主細胞群體，而非自第一宿主細胞群體產生。在一些實施例中，自第二宿主細胞純化指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含溶解第二宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含使由第二宿主細胞產生之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)與第三宿主細胞(例如，容許細胞(例如，如圖12中所示)，例如，第三宿主細胞群體)接觸的第二步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在適用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培育第三宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含自第三宿主細胞純化指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如從而產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)儲備群體。在一些實施例中，自第三宿主細胞純化指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含溶解第三宿主細胞。在一些實施例中，至少約2至100倍更多之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)自第三宿主細胞群體，而非自第二宿主細胞群體產生。
在一些實施例中，宿主細胞在適用於促進細胞生長之培養基中生長。在某些實施例中，在宿主細胞已充分生長(例如，達到適當細胞密度)後，該培養基可與適合於藉由宿主細胞產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的培養基交換。在一些實施例中，在與第二宿主細胞接觸之前，由與宿主細胞分離(例如，藉由溶解宿主細胞)之宿主細胞產生的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，宿主細胞產生之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)不經中間純化步驟與第二宿主細胞接觸。
在一態樣中，本發明之特徵在於一種製造醫藥指環病毒科家族載體(例如，指環載體)製劑之方法。該方法包含(a)產生如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)製劑，(b)評估製劑(例如，醫藥指環病毒科家族載體(例如，指環載體)製劑、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)種子群體或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)儲備群體)之一或多個醫藥品質控制參數，例如標識、純度、滴度、效能(例如，每個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)粒子之基因體當量)及/或核酸序列，例如來自包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件，及(c)調配用於該評估之醫藥用途的該製劑滿足預定標準，例如滿足醫藥說明書。在一些實施例中，評估標識包含評估(例如，確認)指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件的序列，例如編碼效應子之序列。在一些實施例中，評估純度包含評估雜質之量，例如黴漿菌、內毒素、宿主細胞核酸(例如，宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、動物衍生之過程雜質(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型藥劑(RCA)，例如，複製勝任型病毒或非所需指環病毒科家族載體(例如，指環載體) (例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，除所需指環病毒科家族載體(例如，指環載體)外，例如，如本文所描述之合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體))、游離病毒衣殼蛋白、偶然性物質及凝集物。在一些實施例中，評估效價包含評估製劑中功能性指環病毒科家族載體相對於非功能性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)(例如感染性相對於非感染性)之比率(例如，以藉由HPLC所評估)。在一些實施例中，評估效能包含評估製劑中可偵測的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)功能之含量(例如，其中編碼之效應子之表現及/或功能或基因體當量)。
在一些實施例中，經調配之製劑實質上不含病原體、宿主細胞污染物或雜質；具有預定含量之非感染性粒子或具有粒子:感染單位之預定比率(例如＜300:1、＜200:1、＜100:1或＜50:1)。在一些實施例中，多個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可在單一批次中產生。在一些實施例中，可評估批料中產生之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的含量(例如，單獨或一起)。
在一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含： (i)第一核酸分子，其包含如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件的核酸序列，及 (ii)視情況，編碼如表N1-A3中所列出之選自ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、ORF1/2、VP1、VP2或VP3之胺基酸序列，或與其具有至少約70% (例如，至少約70、80、90、95、96、97、98、99或100%)序列一致性的胺基酸序列中之一或多者的第二核酸分子。
在一態樣中，本發明提供一種反應混合物，其包含本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)及輔助病毒，其中該輔助病毒包含聚核苷酸，例如，編碼外部蛋白質(例如，能夠結合至外部蛋白質結合序列之外部蛋白質，及視情況脂質包膜)之聚核苷酸、編碼複製蛋白質之聚核苷酸(例如，聚合酶)或其任何組合。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)(例如，合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體))經分離，例如自宿主細胞分離及/或自溶液中之其他組分(例如，上清液)分離。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體) (例如，合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體))自溶液(例如，上清液)中純化。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)相對於溶液中之其他組分在溶液中富集。
在前述指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、組合物或方法中之任一者的一些實施例中，提供指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含自包含產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之細胞，例如如本文所描述之細胞的組合物分離(例如，收穫)指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在其他實施例中，提供指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含例如自第三方獲得指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其製劑。
在前述指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、組合物或方法中之任一者的一些實施例中，遺傳元件包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)基因體，例如如根據實例9中所描述之方法所鑑別。在實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)基因體為能夠自複製及/或自擴增之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)基因體。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)基因體未能夠自複製及/或自擴增。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)基因體能夠例如在輔助病毒(例如，輔助病毒)存在下反式複製及/或擴增。
應理解，本文所描述關於指環載體之適用的實施例亦可應用於指環病毒科家族載體(例如，基於或源自雞貧血病毒(CAV)之載體，例如如本文所描述)。
在前述指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、組合物或方法中之任一者的額外特徵包括以下所列舉實施例中之一或多者。
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所描述之本發明特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由以下所列舉之實施例涵蓋。
所列舉實施例1.一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (i)包含如表A1或A2中所列出之指環病毒ORF1蛋白質，或如表A3中所列出之CAV VP1蛋白質，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之多肽的蛋白質外部，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。 2.一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (i)包含如表A1或A2中所列出之指環病毒ORF1蛋白質，或如表A3中所列出之CAV VP1蛋白質，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之多肽的蛋白質外部，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件； 其中該蛋白質外部及/或該遺傳元件相對於野生型指環病毒ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒基因體或分別相對於野生型CAV VP1蛋白質及/或野生型CAV基因體(例如，如本文所描述)分別包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域(例如，富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述)或基因體區(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者，例如如本文所描述)之缺失。 3.一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (i)包含由如表N1-N2中之任一者中所列出之指環病毒ORF1核酸序列或由表N3或N4之CAV VP1核酸序列編碼之多肽，或由與指環病毒ORF1核酸序列或CAV VP1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼之多肽的蛋白質外部，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。 4.一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (i)包含由如表N1-N2中之任一者中所列出之指環病毒ORF1核酸序列或由表N3或N4之CAV VP1核酸序列編碼之多肽，或由與指環病毒ORF1核酸序列或CAV核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼之多肽的蛋白質外部，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件； 其中該蛋白質外部及/或該遺傳元件相對於野生型指環病毒ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒基因體或分別野生型CAV VP1蛋白質及/或野生型CAV基因體(例如，如本文所描述)分別包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域(例如，富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述)或基因體區(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者，例如如本文所描述)之缺失。 5.一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (i)蛋白質外部(例如，其包含如本文所描述之指環病毒ORF1分子或VP1分子，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含：(a)如表N1-N4中之任一者中所列出之5' UTR保守域，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列，或其互補序列，及(b)可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。 6.一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (i)蛋白質外部(例如，其包含如本文所描述之指環病毒ORF1分子或VP1分子，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含：(a)如表N1-N4中之任一者中所列出之5' UTR保守域，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列，或其互補序列，及(b)可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件； 其中該蛋白質外部及/或該遺傳元件相對於野生型指環病毒ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒基因體或分別野生型CAV VP1蛋白質及/或野生型CAV VP1基因體(例如，如本文所描述)分別包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域(例如，富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述)或基因體區(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者，例如如本文所描述)之缺失。 7. 一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (i)蛋白質外部(例如，其包含如本文所描述之指環病毒科家族衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1分子或CAV VP1蛋白質，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件，且其中該遺傳元件與如表N1-N4中所列出之指環病毒科家族病毒基因體序列或其互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。 8. 一種指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (i)蛋白質外部(例如，其包含如本文所描述之指環病毒科衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1分子或CAV VP1分子，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件，且其中該遺傳元件與如表N1-N4中之任一者中所列出之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體序列或其互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性； 其中該蛋白質外部及/或該遺傳元件相對於野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體(例如，如本文所描述)分別包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域(例如，富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述)或基因體區(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者，例如如本文所描述)之缺失。 9.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其中相對於野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體的至少一個差異包含編碼外源性效應子。 10.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其中該蛋白質外部包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。 11.一種經分離ORF1分子，其包含如表A1或A2中所列出之ORF1的胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列； 其中該ORF1分子包含相對於野生型ORF1蛋白質(例如，如本文所描述)的至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域(例如，富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述)之缺失。 12.一種經分離ORF1分子，其包含如表A1或A2中所列出之ORF1之果凍卷域的胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列； 其中該ORF1分子包含相對於野生型ORF1蛋白質(例如，如本文所描述)的至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域(例如，富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述)之缺失。 13.一種經分離ORF1分子，其包含如表A3中所列出之VP1的胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列； 其中該VP1分子包含相對於野生型VP1蛋白質(例如，如本文所描述)的至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域(例如，富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述)之缺失。 14.一種經分離VP1分子，其包含如表A3中所列出之VP1之果凍卷域的胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列； 其中該VP1分子包含相對於野生型VP1蛋白質(例如，如本文所描述)的至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域(例如，富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述)之缺失。 15.如實施例13-14中任一項之ORF1或VP1分子，其中該ORF1或VP1分子包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)，其中X n 為具有任何 n個胺基酸之連續序列。 16.如實施例15之ORF1或VP1分子，其中該胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)包含於ORF1或VP1分子之N22域中。 17.如實施例13-16中任一項之ORF1或VP1分子，其中該ORF1或VP1分子包含一或多個(例如，1、2、3、4或所有5個)以下指環病毒ORF1或CAV VP1子域：富含精胺酸之區、果凍卷區域、高變區、N22域、C端域(CTD) (例如，如本文所描述)，例如如表A1或A2中所列出之指環病毒ORF1蛋白質或如表A3中所列出之CAV VP1蛋白質(或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列)。 18.一種經分離ORF2分子，其包含如表A1或A2中所列出之ORF2的胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列； 其中該ORF2分子包含相對於野生型ORF2蛋白質(例如，如本文所描述)的至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域之缺失。 19.如實施例18之ORF2分子，其中該ORF2分子包含胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)，其中X n 為具有任何 n個胺基酸之連續序列。 20.一種經分離核酸分子(例如，遺傳元件構築體或遺傳元件)，其包含如表N1-N4中之任一者中所列出之5' UTR保守域的核酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列，或其互補序列。 21.一種經分離核酸分子(例如，遺傳元件構築體或用於提供呈反式之ORF1分子或VP1分子的構築體，例如如本文所描述)，其包含如表N1-N4中之任一者中所列出之ORF1基因或VP1基因的核酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列，或其互補序列。 22.一種經分離核酸分子(例如，遺傳元件構築體或用於提供呈反式形式之ORF2分子的構築體，例如如本文所描述)，其包含如表N1-N2中所列出之ORF2基因的核酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列，或其互補序列。 23.一種經分離核酸分子(例如，遺傳元件構築體、遺傳元件或用於提供呈反式形式之ORF1、ORF2、VP1或VP2分子的構築體，例如如本文所描述)，其包含如表N1-N4中之任一者中所列出之指環病毒基因體序列，或與其具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列，或其互補序列。 24.如實施例20-23中任一項之經分離核酸分子，其中該經分離核酸分子包含相對於野生型指環病毒基因體序列(例如，如本文所描述)之至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)。 25.如實施例24之經分離核酸分子，其中該至少一個差異包含缺失(例如，缺乏以下中之一或多者：5' UTR保守域、ORF1基因、ORF2基因、VP1基因、VP2基因、富含GC之區、ORF3基因、VP3基因或其功能片段)。 26.如實施例20-25中任一項之經分離核酸分子，其中該經分離核酸分子實質上無法包覆於指環病毒或CAV衣殼中(例如，如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之蛋白質外部)。 27.如實施例20-26中任一例之經分離核酸分子，其中該經分離核酸分子編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)。 28.一種遺傳元件，其包含： (a)如表N1-N4中之任一者中所列出之5' UTR保守域，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列，或其互補序列，及 (b)可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。 29.一種遺傳元件，其包含(例如，呈5'至3'順序)： (i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1-71，或與其具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列； (ii) ORF2核酸序列之5'部分； (iii)啟動子元件； (iv)編碼外源性效應子(例如，治療性外源性效應子)之核酸序列；及 (v) ORF1核酸序列之3'部分； 或(i)至(v)之互補序列； 其中該遺傳元件未編碼全長ORF1多肽或全長ORF2多肽。 30.如實施例29之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之3'包含SEQ ID NO: 7之核苷酸4367-5358，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 31.如實施例29或30之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之3'部分包含SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之序列的0-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900或900-1000個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 32.如實施例29-31中任一項之遺傳元件，其中該遺傳元件不包含來自SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之5'端的1-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900或900-1000個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 33.如實施例29之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之3'部分包含SEQ ID NO: 11之核苷酸4890-5284，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 34.如實施例29或30之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之3'部分包含SEQ ID NO: 11之核苷酸4890-5284之序列的0-100、100-200、200-300或300-350、350-360、360-370、370-380、380-390或390-395個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 35.如實施例29-34中任一項之遺傳元件，其中該ORF2核酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸101-391，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 36.如實施例29-35中任一項之遺傳元件，其中該ORF2核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 3之ORF2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。 37.如實施例29-36中任一項之遺傳元件，其中該ORF2核酸序列之5'部分包含SEQ ID NO: 7之核苷酸3218-3385，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 38.如實施例29-37中任一項之遺傳元件，其中該ORF2核酸序列之5'部分包含SEQ ID NO: 7之核苷酸3218-3385之序列的0-50、50-100、100-150、150-160、160-165或165-168個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 39.如實施例29-38中任一項之遺傳元件，其中該遺傳元件不包含來自SEQ ID NO: 1之核苷酸59-391之3'端的0-50、50-100、100-150、150-160、160-166、166-170、170-180、180-190、190-200、200-225、225-250、250-275、275-300、300-310、310-320、320-330、330-333個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 40.如實施例29-39中任一項之遺傳元件，其進一步包含在ORF2核酸之5'部分與啟動子之間的至少一個核苷酸(例如，1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-110、110-120、120-130、130-132、132-135、135-139、139-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190或190-200個核苷酸)。 41.如技術方案29-40中任一項之遺傳元件，其進一步包含在編碼外源性效應子之核酸序列與ORF1核酸序列之3'部分之間的至少一個核苷酸(例如，1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-110、110-120、120-130、130-135、135-139、139-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-250、250-300、300-310、310-320、320-323、323-330、330-340、340-350或350-400個核苷酸)。 42.如實施例29-41中任一項之遺傳元件，其進一步包含聚-A尾部，例如安置於編碼外源性效應子之核酸序列與ORF1核酸序列之3'部分之間。 43.如實施例42之遺傳元件，其進一步包含在聚-A尾部與ORF1核酸序列之3'部分之間的至少一個核苷酸(例如，1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-110、110-120、120-130、130-135、135-139、139-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-250、250-300、300-310、310-320、320-323、323-330、330-340、340-350或350-400個核苷酸)。 44.一種遺傳元件，其包含(例如，呈5'至3'順序)： (i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1-71，或與其具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列； (ii) ORF1核酸序列之5'部分； (iii)啟動子元件； (iv)編碼外源性效應子(例如，治療性外源性效應子)之核酸序列；及 (v) ORF1核酸序列之3'部分； 或(i)至(v)之互補序列； 其中該遺傳元件未編碼全長ORF1多肽。 45.如實施例44之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之5'部分包含SEQ ID NO: 8之核苷酸3400-3684，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 46.如實施例44-45中任一項之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之5'部分包含SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之序列的0-100、100-200、200-300、250-260、260-270、270-280、280-284、284-290或290-300個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 47.如實施例44-46中任一項之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之3'部分包含SEQ ID NO: 8之核苷酸4663-5358，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 48.如實施例44-47中任一項之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之3'部分包含SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之序列的0-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600或600-700個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 49.如實施例44-48中任一項之遺傳元件，其中該遺傳元件未包含對應於由nLuc表現卡匣置換之SEQ ID NO: 8之部分的來自SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之部分的1-100、100-200、200-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-960、960-970、970-980、980-987、987-990或990-1000個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 50.如實施例44-49中任一項之遺傳元件，其中(iii)及(iv)之該核酸序列包含於對應於由nLuc表現卡匣置換之SEQ ID NO: 8之部分的SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之部分中。 51.如實施例44之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之5'部分包含SEQ ID NO: 9之核苷酸3400-3984，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 52.如實施例44或51之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之5'部分包含SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之序列的0-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、550-560、560-570、570-580、580-584、584-590或590-600個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 53.如實施例44或51-52中任一項之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之3'部分包含SEQ ID NO: 9之核苷酸4964-5358，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 54.如實施例44或51-53中任一項之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之3'部分包含SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之序列的0-100、100-200、200-300、300-400、350-360、360-370、370-380、380-390、390-394或394-400個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 55.如實施例44或51-54中任一項之遺傳元件，其中該遺傳元件不包含來自對應於由nLuc表現卡匣置換之SEQ ID NO: 9之部分的SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之部分的1-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900或900-1000個連續核苷酸，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 56.如實施例44或51-55中任一項之遺傳元件，其中(iii)及(iv)之該核酸序列包含於對應於由nLuc表現卡匣置換之SEQ ID NO: 9之部分的SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250之部分中。 57.如實施例44-56中任一項之遺傳元件，其進一步包含在ORF1核酸之5'部分與啟動子之間的至少一個核苷酸(例如，1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-110、110-120、120-130、130-135、135-139、139-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190或190-200個核苷酸)。 58.如實施例57之遺傳元件，其進一步包含在編碼外源性效應子之核酸序列與ORF1核酸序列之3'部分之間的至少一個核苷酸(例如，1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-110、110-120、120-130、130-135、135-139、139-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-250、250-300、300-310、310-320、320-323、323-330、330-340、340-350或350-400個核苷酸)。 59.如實施例44-58中任一項之遺傳元件，其進一步包含聚-A尾部，例如安置於編碼外源性效應子之核酸序列與ORF1核酸序列之3'部分之間。 60.如實施例59之遺傳元件，其進一步包含在聚-A尾部與ORF1核酸序列之3'部分之間的至少一個核苷酸(例如，1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-110、110-120、120-130、130-135、135-139、139-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-250、250-300、300-310、310-320、320-323、323-330、330-340、340-350或350-400個核苷酸)。 61.如實施例44-60中任一項之遺傳元件，其進一步包含ORF2核酸序列。 62.如實施例61之遺傳元件，其中該ORF2核酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸101-391，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 63.如實施例61之遺傳元件，其中該ORF2分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。 64.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸283-2250，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 65.如實施例64之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之5'密碼子為ATG。 66.如實施例64之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之5'密碼子不為ATG (例如，其中該ORF1核酸序列之5'密碼子為AAA)。 67.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其中該經編碼ORF1分子包含SEQ ID NO: 2，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。 68.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其進一步包含SEQ ID NO: 1之核苷酸2277-2462，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 69.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其進一步包含編碼SEQ ID NO: 4之序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。 70.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其進一步包含SEQ ID NO: 1之核苷酸2515-2615，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 71.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其進一步包含啟動子。 72.如實施例71之遺傳元件，其中該啟動子包含CMV啟動子，例如包含SEQ ID NO: 8之核苷酸3525-3728的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 73.如實施例71之遺傳元件，其中該啟動子包含hEF1a啟動子(例如，最小hEF1a啟動子)、UbC啟動子、MSCV啟動子、SFFV啟動子、hPGK啟動子、CMV啟動子(例如，最小CMV啟動子)、INS84啟動子或U1a啟動子。 74.如實施例71之遺傳元件，其中該啟動子包含SV40啟動子，例如包含SEQ ID NO: 11之核苷酸3417-3613的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。 75.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其進一步包含聚A序列(例如，SV40聚A序列，例如包含SEQ ID NO: 7之核苷酸4301-4349的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列)。 76.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其中該ORF2核酸序列之5'密碼子為ATG。 77.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其中該ORF2核酸序列之5'密碼子不為ATG (例如，其中該ORF2核酸序列之5'密碼子為AAA)。 78.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之5'密碼子為ATG。 79.如前述實施例中任一項之遺傳元件，其中該ORF1核酸序列之5'密碼子不為ATG (例如，其中該ORF1核酸序列之5'密碼子為AAA)。 80.一種核酸分子，其包含(例如，以5'至3'順序)： (a)指環病毒基因體序列(例如，包含核酸序列SEQ ID NO: 1，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列；及 (b)如前述實施例中任一項之遺傳元件的核酸序列。 81.如實施例80之核酸分子，其為質體。 82.一種指環載體，其包含： (i)蛋白質外部(例如，包含指環病毒ORF1蛋白質，例如如表A1中所列出，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)如前述實施例中任一項之遺傳元件； 其中該遺傳元件被該蛋白質外部包覆。 83.一種產生指環載體之方法，該方法包含： (a)提供細胞，例如如本文所描述之宿主細胞；(a) (b)將編碼ORF1多肽之核酸分子(例如，包含如表A1中所列出之ORF1蛋白質之胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列)引入至細胞中； (c)將如實施例80或81之核酸分子引入至該細胞中(例如，在(b)之前、之後或同時)， (d)在允許該細胞產生指環載體之條件下培育該細胞；及 從而產生該指環載體。 84.一種產生指環載體之方法，該方法包含： (a)提供包含編碼ORF1多肽(例如，包含如表A1中所列出之ORF1蛋白質之胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列)之核酸分子的細胞(例如，如本文所描述之宿主細胞)； (b)將如實施例80或81之核酸分子引入至該細胞中， (c)在允許該細胞產生指環載體之條件下培育該細胞；及 從而產生該指環載體。 85.如實施例83或84之方法，其進一步包含調配該等指環載體，例如呈適合於向個體投與之醫藥組合物形式。 86.一種醫藥組合物，其包含如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、遺傳元件或核酸分子，及醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。 87.如實施例86之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有以下特徵中之一或多者： a)  該醫藥組合物滿足醫藥或優良製造規範(GMP)標準； b)  根據優良製造規範(GMP)製得該醫藥組合物； c)  該醫藥組合物具有低於預定參考值之病原體含量，例如實質上不含病原體； d)  該醫藥組合物具有低於預定參考值之污染物含量，例如實質上不含污染物； e) 該醫藥組合物具有預定含量之非感染性粒子或預定比率之粒子:感染性單元(例如＜300:1、＜200:1、＜100:1或＜50:1)，或 f)  該醫藥組合物具有較低免疫原性或實質上為非免疫原性的，例如如本文所描述。 88.如實施例86至87中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物之污染物含量低於預定參考值，例如實質上不含污染物。 89.如實施例88之醫藥組合物，其中該污染物係選自由以下組成之群：黴漿菌、內毒素、宿主細胞核酸(例如，宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、動物衍生之過程雜質(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型藥劑(RCA)，例如，複製勝任型病毒或非所需指環病毒科家族載體(例如，指環載體) (例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，除所需指環病毒科家族載體(例如，指環載體)外，例如，如本文所描述之合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體))、游離病毒衣殼蛋白、偶然性物質及凝集物。 90.如實施例88之醫藥組合物，其中該污染物為宿主細胞DNA，且該臨限量為每劑量該醫藥組合物約10 ng宿主細胞DNA。 91.如實施例86-90中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含小於10重量% (例如，低於約10重量%、5重量%、4重量%、3重量%、2重量%、1重量%、0.5重量%或0.1重量%)之污染物。 92.一種經眼遞送系統，其包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體，例如如本文所描述)。 93.一種經分離細胞，例如宿主細胞，其包含： (a)編碼如前述實施例中任一項之ORF1多肽及/或ORF2多肽或VP1多肽及/或VP2多肽的核酸分子，其中該核酸為質體，為病毒核酸或整合至細胞染色體中，及 (b)遺傳元件構築體，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)及蛋白質結合序列， 其中視情況該遺傳元件未編碼ORF1多肽(例如，ORF1蛋白質)或VP1多肽。 94.一種經分離細胞，例如宿主細胞，其包含： (i)第一核酸分子，其包含如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件的核酸序列(視情況其中該遺傳元件未編碼ORF1分子或VP1分子)，及 (ii)第二核酸分子，其編碼如表A1或A2中所列出之ORF1或ORF2的胺基酸序列，或如表A3中所列出之VP1或VP2的胺基酸序列，或與其具有至少70% (例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的胺基酸序列。 95.一種製備指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物之方法，該方法包含： (a)提供細胞，例如如本文所描述之宿主細胞； (b)將編碼如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件的遺傳元件構築體引入至該細胞中； (c)在允許該細胞產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培育該細胞，及 (d)將該等指環載體調配成例如適合於向個體投與之醫藥組合物， 從而產生該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物。 96.一種製備指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物之方法，該方法包含： (a)提供細胞，例如如本文所描述之宿主細胞； (b)將編碼如表A1或A2中所列出之ORF1或ORF2多肽，或如表A3中所列出之VP1多肽(或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)的核酸分子引入至該細胞中； (c)將遺傳元件構築體引入至該細胞中(例如，在(b)之前、之後或同時)， (d)在允許該細胞產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培育該細胞；及 (e)將該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)調配成例如適合於向個體投與之醫藥組合物， 從而產生該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物。 97.一種製備指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物之方法，該方法包含： (a)提供細胞，例如如本文所描述之宿主細胞； (b)將編碼ORF1、ORF2、VP1或VP2多肽之核酸分子引入至該細胞中； (c)將遺傳元件構築體引入至如表N1-N4中之任一者中所列出之細胞中(或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列) (例如，在(b)之前、之後或同時)， (d)在允許該細胞產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培育該細胞；及 (e)將該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)調配成例如適合於向個體投與之醫藥組合物， 從而產生該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物。 98.一種產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之方法，例如合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含： (a)提供宿主細胞，其包含： (i)核酸分子，例如第一核酸分子，其包含至如表N1-N4中之任一者中所列出之指環病毒基因體的核酸序列(或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列)，及 (ii)編碼例如如表A1-A3中所列出之選自ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、ORF1/2、VP1或VP2之胺基酸序列中之一或多者，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的核酸分子，例如第二核酸分子；及 (b)在適合於產生該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之條件下培養該宿主細胞。 99.如實施例98之方法，其在步驟(a)之前進一步包含將該第一核酸分子及/或該第二核酸分子引入至該宿主細胞中。 100.如實施例98或99之方法，其中該第二核酸分子係在該第一核酸分子之前、與其同時或在其之後引入宿主細胞中。 101.如實施例95-100中任一項之方法，其進一步包含自細胞中分離該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。 102.一種製備ORF1或VP1分子之方法，該方法包含： (a)提供包含編碼如前述實施例中任一項之ORF1多肽或VP1多肽之核酸的宿主細胞(例如，本文所描述之宿主細胞)，及 (b)將該宿主細胞維持在允許該細胞產生該多肽之條件下； 從而製備該ORF1或VP1分子。 103.如實施例95-102中任一項之方法，其中該方法包含使用CsCl梯度(例如，如實例20中所描述)純化該指環病毒科家族載體。 104.如實施例95-103中任一項之方法，其中該方法包含使用碘克沙醇線性梯度(例如，如實例20中所描述)純化該指環病毒科家族載體。 105.一種向個體(例如，向該個體之眼睛，例如向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜色素上皮(RPE)、玻璃體內空間或視網膜下腔)遞送效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子，例如過度表現內源性效應子)之方法，該方法包含向該個體(例如，向該個體之眼睛，例如向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間或視網膜色素上皮(RPE))投與該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或如前述實施例中任一項之醫藥組合物。 106.一種向目標細胞(例如，該眼睛之細胞，例如感光細胞、視網膜細胞、後眼杯(PEC)細胞、視網膜神經節細胞、視神經細胞、視神經頭細胞或視網膜色素上皮(RPE)細胞)遞送效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子，例如過度表現內源性效應子)之方法，該方法包含使該目標細胞與如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸。 107.一種向目標細胞(例如，自個體，例如患者中分離之目標細胞)活體外遞送效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子，例如過度表現內源性效應子)之方法，該方法包含使該目標細胞與如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸。 108.一種調節，例如增強或抑制個體(例如，該個體之眼睛，例如該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間或視網膜色素上皮(RPE))之生物功能(例如，如本文所描述)的方法，該方法包含向該個體(例如，向該個體之該眼睛，例如向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間或視網膜色素上皮(RPE))投與該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或如前述實施例中任一項之醫藥組合物。 109.一種治療有需要之個體之疾病或病症(例如，眼睛疾病或病症)的方法，該方法包含向個體(例如，向該個體之眼睛，例如向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間、或視網膜色素上皮(RPE))投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或如前述實施例中任一項之醫藥組合物。 110.一種如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物之用途，其用於治療個體之疾病或病症(例如，如本文所描述)，其中視情況該疾病或病症為眼睛之疾病或病症。 111.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物，其用於治療個體之疾病或病症(例如，如本文所描述)，其中視情況該疾病或病症為眼睛之疾病或病症。 112.一種如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物之用途，其用於製備用以治療個體之疾病或病症(例如，如本文所描述)之藥劑，其中視情況該疾病或病症為眼睛之疾病或病症。 113.一種向該個體之眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間、或視網膜色素上皮(RPE))遞送效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子，例如過度表現內源性效應子)之方法，該方法包含向該個體之該眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間、或視網膜色素上皮(RPE))投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。 114.一種向眼睛之細胞(例如，感光細胞、視網膜細胞、後眼杯(PEC)細胞、視網膜神經節細胞、視神經細胞、視神經頭細胞或視網膜色素上皮(RPE)細胞)遞送效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子，例如過度表現內源性效應子)之方法，該方法包含使該眼睛之細胞與如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸。 115.一種向目標眼睛細胞(例如，自個體，例如患者中分離之目標眼睛細胞)遞送效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子，例如過度表現內源性效應子)之方法，該方法包含使該目標細胞與如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸。 116.一種調節，例如增強或抑制該個體之眼睛的(例如，該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間、或視網膜色素上皮(RPE)的)生物功能(例如，如本文所描述)之方法，該方法包含向該個體之該眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間或視網膜色素上皮(RPE))投與該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或如前述實施例中任一項之醫藥組合物。 117.如實施例116之方法，其中該生物功能包含以下中之一或多者：最佳矯正視力(BCVA)視網膜感光靈敏度(例如，藉由視野測量或微視野測量所量測，例如在黑暗及光適應狀態下、全視野、多焦點、焦點或圖案視網膜電圖學ERG)、對比敏感性、讀速及/或色覺。 118.如實施例116或117之方法，其中該生物功能使用臨床生物顯微鏡檢查、眼底攝影、光學同調斷層掃描(OCT)、眼底自體螢光(FAF)、紅外及/或多色成像、螢光素或ICG血管造影及/或過繼性光學裝置來量測。 119.一種治療有需要之個體之疾病或病症(例如，眼睛疾病或病症)的方法，該方法包含向該個體之眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間或視網膜色素上皮(RPE))投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或如前述實施例中任一項之醫藥組合物。 120.一種如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物之用途，其用於治療個體之疾病或病症(例如，如本文所描述)，其中該疾病或病症為眼睛之疾病或病症。 121.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物，其用於治療個體之疾病或病症(例如，如本文所描述)，其中該疾病或病症為眼睛之疾病或病症。 122.一種如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物之用途，其用於製備用以治療個體之疾病或病症(例如，如本文所描述)之藥劑，其中該疾病或病症為眼睛之疾病或病症。 123.如技術方案109-122中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該疾病或病症為單基因性疾病。 124.如技術方案109-123中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該疾病或病症為多基因性疾病(例如，青光眼)。 125.如技術方案109-124中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該疾病或病症為黃斑變性(例如，老年性黃斑變性(AMD)、斯特格氏病或近視性黃斑變性)。 126.如技術方案125之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該黃斑變性為濕性AMD。 127.如技術方案125之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該黃斑變性為乾性AMD (例如，具有地圖狀萎縮之AMD)。 128.如技術方案109-127中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該疾病或病症為視網膜疾病。 129.如技術方案128之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該視網膜疾病為遺傳性視網膜疾病(IRD)，例如如以下中所描述：Stone等人. (2017, Ophthalmology；關於其中所描述之疾病及病症以引用的方式併入本文中)。 130.如技術方案128之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該視網膜疾病為色素性視網膜炎(例如，X性聯色素性視網膜炎(XLRP))。 131.如技術方案109-130中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該疾病或病症為VEGF相關病症(例如，癌症，例如如本文所描述；黃斑部水腫；或增殖性視網膜病)。 132.如技術方案109-131中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該疾病或病症係選自由以下組成之群：視網膜洩漏、萊伯氏先天性黑朦症(LCA) (例如，其中該遺傳元件包含人類RPE65序列，例如編碼人類RPE65蛋白質之序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列)、先天性黑朦症、視錐視桿細胞營養不良、無脈絡膜症、卵黃狀黃斑變性、高鐵蛋白血症-白內障症候群、光學萎縮症、XLR視網膜劈裂症、巨細胞病毒視網膜炎、色盲、雷伯氏遺傳性光學神經病變、角膜炎、葡萄膜炎、葛瑞夫茲氏眼病變、糖尿病性視網膜病變或糖尿病黃斑水腫。 133.如技術方案109-132中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該指環病毒科家族載體係向該個體視網膜下或向視網膜下腔、玻璃體內或向玻璃體內空間、脈絡膜上或向脈絡膜上腔投與。 134.如技術方案109-133中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該指環病毒科家族載體係向該個體視網膜下或向視網膜下腔投與。 135.如技術方案109-134中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該指環病毒科家族載體係向該個體玻璃體內或向玻璃體內空間投與。 136.如技術方案109-135中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該指環病毒科家族載體係向該個體脈絡膜上或向脈絡膜上腔投與。 137.如技術方案109-136中任一項之方法、用途或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物或用途，其中該指環病毒科家族載體向該個體經由SCS微小注射器，經由插管及/或經由針投與。 138.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件為單股的。 139.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件為環狀的。 140.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件包含DNA。 141.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件為雙股的。 142.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件為線性的。 143.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件包含RNA。 144.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件包含編碼指環病毒科衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1分子或CAV VP1分子之核酸序列(例如，如表A1-A3中所列出之ORF1或VP1蛋白質，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)。 145.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件不包含編碼指環病毒科衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1分子或CAV VP1分子之核酸序列(例如，如表A1-A3中所列出之ORF1或VP1蛋白質，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)。 146.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件包含編碼指環病毒ORF2分子或VP2分子之核酸序列(例如，如表A1或A2中所列出之ORF2蛋白質，或如表A3中所列出之VP2分子，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)。 147.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件不包含編碼指環病毒ORF2分子或CAV VP2分子之核酸序列(例如，如表N1-A3中所列出之ORF2蛋白質或VP1蛋白質，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)。 148.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件包含具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%之GC含量的至少20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個連續核苷酸。 149.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該蛋白質外部包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。 150.如實施例149之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)包含於N22域中。 151.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該ORF1或VP1分子包含富含精胺酸之區(例如，與表A1-A3中所列出之ORF1蛋白質或VP1蛋白質之富含精胺酸之區序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)。 152.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該蛋白質外部包含至少15、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45或50個連續核苷酸的胺基酸序列，該等連續核苷酸包含至少40% (例如，至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、55%、60%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%或95%)精胺酸殘基。 153.如實施例151或152之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該富含精胺酸之區域位於該ORF1或VP1分子之N端或C端處。 154.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該ORF1或VP1分子包含與表A1-A3中所列出之ORF1或VP1蛋白質之果凍卷域序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一致性的果凍卷域。 155.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該ORF1或VP1分子包含與表A1-A3中所列出之ORF1或VP1蛋白質之N22域序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一致性的N22域。 156.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該ORF1或VP1分子包含與表A1-A3中所列出之ORF1或VP1蛋白質之CTD域序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一致性的C端域(CTD)。 157.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件包含以下中之一或多者：來自本文所描述之指環病毒或CAV之TATA盒、起始子元件、加帽位點、轉錄起始位點、編碼ORF1/1序列、編碼ORF1/2序列、編碼ORF2/2序列、編碼ORF2/3序列、編碼ORF2/3t序列、三個開讀框區域、聚(A)訊號及/或富含GC之區(例如，如表N1-N4中之任一者中所列出)，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。 158.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件包含與如表N1-N4中之任一者中所列出之5'UTR保守域序列具有至少75% (例如，至少75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)序列一致性。 159.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該蛋白質外部包含以下中之一或多者：一或多個醣基化蛋白質、親水性DNA-結合區、富含精胺酸之區、富含蘇胺酸之區、富含麩醯胺之區、N端聚精胺酸序列、可變區、C端聚麩醯胺酸/麩胺酸序列及一或多個二硫橋鍵。 160.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該蛋白質外部包含以下特徵中之一或多者：二十面體對稱性，識別及/或結合與一或多個宿主細胞分子相互作用之分子以介導進入宿主細胞中，缺乏脂質分子、缺乏碳水化合物、包含一或多種碳水化合物(例如，糖基化)、pH及溫度穩定性、耐清潔性，及在宿主中為非免疫原性或非致病性的。 161.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該啟動子包含RNA聚合酶II依賴性啟動子、RNA聚合酶III依賴性啟動子、PGK啟動子、CMV啟動子、EF-1α啟動子、SV40啟動子、CAGG啟動子或UBC啟動子、TTV病毒啟動子、組織特異性U6 (pollIII)、具有活化蛋白質之上游DNA結合位點的最小CMV啟動子(TetR-VP16、Gal4-VP16、dCas9-VP16等)。 162.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該效應子編碼治療劑，例如治療性肽或多肽或治療性核酸。 163.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該效應子為外源性效應子。 164.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該效應子係內源性效應子(例如，其中該指環載體過度表現目標細胞中之內源性效應子)。 165.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該效應子包含調節性核酸，例如miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反股RNA、gRNA；螢光標籤或標記物、抗原、肽、來自天然生物活性肽之合成性或類似物肽、促效性或拮抗性肽、抗微生物肽、成孔肽、雙環肽、靶向或細胞毒性肽、降解或自毀壞肽、小分子、免疫效應子(例如，影響對免疫反應/訊號的易感性)、死亡蛋白質(例如，細胞凋亡或壞死之誘導劑)、腫瘤之非裂解抑制劑(例如，致癌蛋白之抑制劑)、表觀遺傳調節劑、表觀遺傳酶、轉錄因子、DNA或蛋白修飾酶、DNA-嵌入劑、流出泵抑制劑、細胞核受體活化劑或抑制劑、蛋白酶體抑制劑、用於酶之競爭性抑制劑、蛋白質合成性效應子或抑制劑、核酸酶、蛋白質片段或域、配位體、抗體、受體或CRISPR系統或組分。 166.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該效應子包含miRNA，例如其中該miRNA降低目標基因之表現。 167.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該效應子調節基因或蛋白質之表現或活性，例如增加或降低基因或蛋白質之表現或活性。 168.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體能夠自主地複製 169.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體係複製缺陷型(例如，不能自主地複製)。 170.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該遺傳元件以低於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合至真核生物細胞之基因體中。 171.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體為實質上非致病性的，例如未誘導個體之可偵測的有害症狀(例如，升高的細胞死亡或毒性，例如相對於未暴露於指環載體之個體)。 172.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體為實質上非免疫原性的，例如不誘導可偵測及/或非所需免疫反應。 173.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中至少1000個該指環病毒科家族載體之群體能夠將遺傳元件之至少約100個複本(例如，至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900個1000複本)遞送至一或多個真核細胞(例如，哺乳動物細胞，例如人類細胞)中。 174.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體之群體(例如，每細胞至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個基因體當量之遺傳元件)能夠將遺傳元件遞送至至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多之真核細胞群體(例如，哺乳動物細胞，例如人類細胞)中。 175.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體之群體(例如，每細胞至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個基因體當量之遺傳元件)能夠將每細胞至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、8,000、1 x 10 4、1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7或更多個複本之遺傳元件遞送至真核細胞群體(例如，哺乳動物細胞，例如人類細胞)中。 176.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體之群體(例如，每細胞至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個基因體當量之遺傳元件)能夠將每細胞1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、5-10、10-20、20-50、50-100、100-1000、1000-10 4、1 x 10 4-1 x 10 5、1 x 10 4-1 x 10 6、1 x 10 4-1 x 10 7、1 x 10 5-1 x 10 6、1 x 10 5-1 x 10 7或1 x 10 6-1 x 10 7個複本之遺傳元件遞送至真核細胞群體(例如，哺乳動物細胞，例如人類細胞)中。 177.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中遞送該遺傳元件至其中之該等目標細胞各接收遺傳元件之至少10、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或更多個複本。 178.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體對清潔劑(例如，輕度清潔劑，例如膽鹽，例如去氧膽酸鈉)之降解具有抗性，此係相對於包含外部脂質雙層之病毒粒子，例如反轉錄病毒而言。 179.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中被該蛋白質外部包覆之該遺傳元件對藉由核酸酶(例如，DNA酶)之降解具有抗性。 180.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體能夠例如活體外、活體內或離體感染哺乳動物細胞，例如人類細胞。 181.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該指環病毒科家族載體將效應子選擇性地遞送至或以較高含量存在於(例如，優先積聚於)所需細胞類型、組織或器官(例如骨髓、血液、心臟、GI、皮膚、視網膜中之感光體、上皮內層或胰臟)中。 182.如前述實施例中任一項之遺傳元件、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中遺傳元件或遺傳元件構築體能夠複製(例如，藉由滾環複製)，例如能夠產生每細胞至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、10 2、2 x 10 2、5 x 10 2、10 3、2 x 10 3、5 x 10 3或10 4個基因體當量之遺傳元件，例如藉由定量PCR分析所量測。 183.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該蛋白質外部相對於遺傳元件以順式形式提供。 184.如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、ORF1分子、ORF2分子、VP1分子、VP2分子、核酸分子或方法，其中該蛋白質外部相對於遺傳元件以反式形式提供。
本發明之其他特徵、目標及優點將自實施方式及圖式及自申請專利範圍顯而易知。
除非另外規定，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。所有公開案、專利申請案、專利及本文所提及之其他參考案均以全文引用的方式併入。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。
定義 將關於特定實施例及參考某些圖式描述本發明，但本發明不限於此，而僅僅受申請專利範圍限制。除非另外指明，否則如下文所闡述之術語一般應按其常識來理解。
當術語「包含」用於本發明說明書及申請專利範圍時，其不排除其他要素。出於本發明之目的，將術語「由…組成(consisting of)」視為術語「包含(comprising of)」之較佳實施例。若下文中將群組定義為包含至少某一數目之實施例，則此亦理解為揭示較佳僅由此等實施例組成之群組。
除非另外具體規定，否則若在提及單數名詞時使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a/an)」或「該(the)」，則其包括複數個該名詞。
措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」應理解為係指適用於治療、調節等指示目的之化合物、組合物、產物等本身。措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」另外揭示，作為一實施例，此類化合物、組合物、產物等用於治療、調節等。
措辭「用於…之化合物、組合物、產物等」、「化合物、組合物、產物等在製造用於…之藥劑、醫藥組合物、獸醫組合物、診斷組合物等中的用途」或「用作藥劑…之化合物、組合物、產物等」指示此類化合物、組合物、產物等將待用於可在人類或動物身體上實踐之治療方法中。其被視為與關於治療方法等的實施例及技術方案等效之揭示內容。若實施例或技術方案因此係指「用於治療疑似患有疾病之人類或動物的化合物」，則此亦被視為揭示「化合物在製造供治療疑似患有疾病之人類或動物用之藥劑中的用途」或「藉由向疑似患有疾病之人類或動物投與化合物進行治療之方法」。措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」應理解為係指適用於治療、調節等指示目的之化合物、組合物、產物等本身。
若在下文中將術語、值、數目等的實例提供於括號中，則此應理解為括號中提及之實例可構成實施例之指示。舉例而言，若「在實施例中，核酸分子包含與表1之編碼指環病毒ORF1之核苷酸序列(例如，表1之核酸序列的核苷酸571 - 2613)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列」，則一些實施例係關於核酸分子，其包含與表1之核酸序列之核苷酸571 - 2613具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
如本文中所用，術語「指環病毒科家族載體」係指由指環病毒科家族病毒(例如，甲型細環病毒、乙型細環病毒、丙型細環病毒或雞貧血病毒)衍生或類似於其之媒劑，其中該媒劑包含包覆於蛋白質外部中之遺傳元件(例如，蛋白質外部基本上保護遺傳元件不被DNA酶I消化)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含衍生自甲型細環病毒、乙型細環病毒、丙型細環病毒或雞貧血病毒(CAV)之遺傳元件或與其高度類似(例如，與其至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)之遺傳元件。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含蛋白質外部，其包含衍生自甲型細環病毒、乙型細環病毒、丙型細環病毒或雞貧血病毒(例如，甲型細環病毒ORF1、乙型細環病毒ORF1、丙型細環病毒ORF1或CAV VP1)之衣殼蛋白或與其類似(例如，與其至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)的蛋白質。在一些實施例中，包封於蛋白質外部內涵蓋由蛋白質外部100%覆蓋以及低於100%，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更低覆蓋。例如，只要遺傳元件保留在蛋白質外部或受保護而不被DNA酶I消化，例如在進入宿主細胞之前，則蛋白質外部中可存在間隙或不連續處(例如使蛋白質外部對水、離子、肽或小分子可透)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體經純化，例如其與其原始來源分離及/或實質上不含(＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)其他組分。在一些實施例中，指環病毒科家族載體能夠將遺傳元件遞送至目標細胞(例如，經由感染)中。在一些實施例中，指環病毒科家族載體為感染性合成病毒粒子。
如本文所用，術語「指環載體」係指包含遺傳元件，例如游離基因體，例如環狀DNA的媒劑，該遺傳元件包覆於蛋白質外部中。如本文所用，「合成指環載體」通常係指非天然存在的指環載體，例如具有相對於野生型病毒(例如如本文所描述之野生型指環病毒)不同的序列。在一些實施例中，合成指環載體經工程化或重組，例如包含相對於野生型病毒基因體(例如如本文所描述之野生型指環病毒基因體)包含差異或修飾的遺傳元件。在一些實施例中，包封於蛋白質外部內涵蓋由蛋白質外部100%覆蓋以及低於100%，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更低覆蓋。例如，只要遺傳元件保留在蛋白質外部，例如在進入宿主細胞之前，則蛋白質外部中可存在間隙或不連續處(例如使蛋白質外部對水、離子、肽或小分子可透)。在一些實施例中，指環載體經純化，例如其與其原始來源分離及/或實質上不含(＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)其他組分。
在一些實施例中，指環載體可包含核酸載體，其包含衍生自指環病毒基因體序列或其相鄰部分或與其高度類似(例如，與其至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)之足夠的核酸序列，以允許封裝至蛋白質外部(例如，衣殼)中，且進一步包含異源序列。在一些實施例中，核酸載體為病毒載體或裸核酸。在一些實施例中，核酸載體包含原生指環病毒序列或與其高度類似(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)之序列的至少約50、60、70、71、72、73、74、75、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或3500個連續核苷酸。在一些實施例中，指環載體進一步包含指環病毒ORF1、ORF2或ORF3中之一或多者。在一些實施例中，異源序列包含多選殖位點，包含異源啟動子，包含治療性蛋白質之編碼區，或編碼治療性核酸。在一些實施例中，衣殼為野生型指環病毒衣殼。在實施例中，指環載體包含本文所描述之遺傳元件，例如包含含有啟動子、編碼治療性效應子之序列及衣殼結合序列之遺傳元件。
如本文所用，術語「抗體分子」係指蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段，其包含至少一個免疫球蛋白可變域序列。術語「抗體分子」涵蓋全長抗體及抗體片段(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子為多特異性抗體分子，例如該抗體分子包含複數個免疫球蛋白可變域序列，其中該複數個中之第一免疫球蛋白可變域序列對第一抗原決定基具有結合特異性且該複數個中之第二免疫球蛋白可變域序列對第二抗原決定基具有結合特異性。在實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體分子之一般由對於第一抗原決定基具有結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及對於第二抗原決定基具有結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列特徵化。
如本文所用，「編碼」之核酸係指編碼胺基酸序列或功能性聚核苷酸(例如非編碼RNA，例如siRNA或miRNA)的核酸序列。
如本文所用，「外源性」試劑(例如效應子、核酸(例如RNA)、基因、有效負載、蛋白質)係指不包含相應野生型病毒(例如如本文所描述之指環病毒)或不由其編碼的試劑。在一些實施例中，外源性試劑並非天然存在，諸如具有相對於天然存在之蛋白質或核酸改變(例如藉由插入、缺失或取代)之序列的蛋白質或核酸。在一些實施例中，外源性試劑並不天然存在於宿主細胞中。在一些實施例中，外源性試劑天然存在於宿主細胞中但對於病毒為外源性的。在一些實施例中，外源性試劑天然存在於宿主細胞中，但不以所需水準或以所需時間存在。
如本文所用之關於另一試劑或元件(例如效應子、核酸序列、胺基酸序列)的「異源」試劑或元件(例如效應子、核酸序列、胺基酸序列)係指例如在野生型病毒(例如指環病毒)中未天然發現於一起的試劑或元件。在一些實施例中，異源核酸序列可與天然存在之核酸序列(例如指環病毒中天然存在之序列)存在於相同核酸中。在一些實施例中，異源性試劑或元件相對於指環病毒為外源性的，其中指環載體之其他元件(例如剩餘部分)係基於該指環病毒。
如本文所使用，術語「遺傳元件」係指一般在指環載體中之核酸序列。應理解，遺傳元件可以裸DNA形式產生且視情況進一步組裝成蛋白質外部。亦應理解，指環載體可將其遺傳元件插入細胞中，使得遺傳元件存在於細胞中且蛋白質外部不一定進入細胞。
如本文所用，術語「ORF1分子」係指具有指環病毒ORF1蛋白質(例如，如本文所描述，例如如表A1或A2中所列出之指環病毒ORF1蛋白質)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。在一些情況下，ORF1分子可包含以下中之一或多者(例如1、2、3或4者)：包含至少60%鹼性殘基(例如，至少60%精胺酸殘基)之第一區域、包含至少約六個β股(例如，至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個β股)之第二區域、包含指環病毒N22域(例如如本文所描述，例如如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白的N22域)之結構或活性的第三區域、及/或包含指環病毒C端域(CTD) (例如如本文所描述，例如如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白的CTD)之結構或活性的第四區域。在一些實施例中，ORF1分子以N端至C端之次序包含第一、第二、第三及第四區域。在一些實施例中，指環載體包含ORF1分子，該分子以N端至C端之次序包含第一、第二、第三及第四區域。在一些情況下，ORF1分子可包含由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽(例如，如表N1-N2中之任一者中所列出)。在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含異源序列，例如高變區(HVR)，例如來自指環病毒ORF1蛋白之HVR，例如如本文所描述。如本文中所用，「指環病毒ORF1蛋白質」係指由指環病毒基因體(例如，野生型指環病毒基因體，例如如本文所描述)編碼之ORF1蛋白質，例如具有如表A1或A2中所列出，或由如在表N1-N2中之任一者中所列出之ORF1基因編碼之胺基酸序列的ORF1蛋白質。
如本文所用，術語「ORF2分子」係指具有指環病毒ORF2蛋白質(例如，如本文所描述之指環病毒ORF2蛋白質，例如如表A1或A2中所列出)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。如本文中所用，「指環病毒ORF2蛋白質」係指由指環病毒基因體(例如，野生型指環病毒基因體，例如如本文所描述)編碼的ORF2蛋白質，例如具有如表A1或A2中所列出之胺基酸序列或以藉由表N1-N2中之任一者中所列的ORF2基因編碼的ORF2蛋白質。
如本文所使用，術語「VP1分子」係指具有CAV VP1蛋白(例如如本文所描述之CAV VP1蛋白)或其功能性片段之活性及/或結構特徵的多肽。在一些情況下，VP1分子可包含由CAV VP1核酸編碼之多肽。在一些情況下，VP1分子可進一步包含例如來自例如如本文所描述之CAV VP1蛋白的異源序列。在一些實施例中，VP1分子由CAV基因體(例如野生型CAV基因體，例如如本文所描述)編碼。在一些實施例中，VP1分子為由CAV VP1核酸(例如VP1基因，例如如本文所描述)編碼之多肽。在一些實施例中，VP1分子為剪接變異體或包含轉譯後修飾。
如本文所使用，術語「VP2分子」係指具有CAV VP2蛋白(例如如本文所描述之CAV VP2蛋白)或其功能性片段之活性及/或結構特徵的多肽。在一些實施例中，VP2分子由CAV基因體(例如野生型CAV基因體，例如如本文所描述)編碼。在一些實施例中，VP2分子為由CAV VP2核酸(例如VP2基因，例如如本文所描述)編碼之多肽。在一些實施例中，VP2分子為剪接變異體或包含轉譯後修飾。
如本文所用，術語「凋亡蛋白分子」及「VP3分子」可互換使用且係指具有CAV凋亡蛋白(例如，如本文所描述之CAV凋亡蛋白或其功能片段)之活性及/或結構特徵的多肽。在一些實施例中，凋亡蛋白分子由CAV基因體(例如野生型CAV基因體，例如如本文所描述)編碼。在一些實施例中，凋亡蛋白分子為由CAV凋亡蛋白核酸(例如凋亡蛋白基因)編碼之多肽。在一些實施例中，凋亡蛋白分子為剪接變異體或包含轉譯後修飾。
如本文所使用，術語「CAV衣殼多肽」係指存在於野生型CAV之衣殼中的多肽，或具有該多肽之活性及/或結構特徵的多肽。在一些實施例中，CAV衣殼多肽為VP1分子。
如本文所使用，術語「VP1核酸」係指編碼VP1分子之核酸或其反向互補序列。核酸可為單股或雙股的。在一些實施例中，VP1核酸包含例如如本文所描述之CAV VP1基因。「VP1基因」通常係指編碼野生型VP1分子之核酸序列或其反向互補序列。在一些實施例中，VP1基因包含有義股。在一些實施例中，VP1基因包含反義股。在一些實施例中，VP1基因為雙股的。
如本文所使用，術語「VP2核酸」係指編碼VP2分子之核酸或其反向互補序列。核酸可為單股或雙股的。在一些實施例中，VP2核酸包含例如如本文所描述之CAV VP2基因。「VP2基因」通常係指編碼野生型VP2分子之核酸序列或其反向互補序列。在一些實施例中，VP2基因包含有義股。在一些實施例中，VP2基因包含反義股。在一些實施例中，VP2基因為雙股的。
如本文所使用，術語「凋亡蛋白核酸」及「VP3核酸」可互換地使用，且係指編碼凋亡蛋白分子或其反向互補序列的核酸。核酸可為單股或雙股的。在一些實施例中，凋亡蛋白核酸包含例如如本文所描述之CAV凋亡蛋白基因。「凋亡蛋白基因」或「VP3基因」通常係指編碼野生型凋亡蛋白分子之核酸序列或其反向互補序列。在一些實施例中，凋亡蛋白基因包含有義股。在一些實施例中，凋亡蛋白基因包含反義股。在一些實施例中，凋亡蛋白基因為雙股的。
如本文所使用，術語「CAV基因體序列」係指包含來自例如如本文所描述之野生型CAV之全長基因體序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的核酸序列。在一些實施例中，CAV基因體包含如本文所描述之CAV基因體序列(例如，野生型CAV基因體序列，例如如表N3-N4中之任一者中所列)。
如本文所使用，術語「CAV UTR」係指包含來自CAV (例如，野生型CAV，例如如本文所描述，例如如表N3-N4中所列出)之非轉譯區(UTR)序列(例如，5' UTR或3' UTR之序列)，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列的核酸序列。
如本文所用，術語「蛋白質外部」係指主要為(例如＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)蛋白質之外部組分。
如本文所用，術語「調節核酸」係指修飾編碼表現產物之DNA序列之表現(例如轉錄及/或轉譯)的核酸序列。在實施例中，表現產物包含RNA或蛋白質。
如本文所用，術語「調節序列」係指修飾目標基因產物之轉錄的核酸序列。在一些實施例中，調節序列為啟動子或強化子。
如本文所使用，術語「複製蛋白質」係指在感染、病毒基因體複製/表現、病毒蛋白質合成及/或組裝病毒組分期間利用之蛋白質，例如病毒蛋白質。
如本文所用，「實質上非病原性」生物體、粒子或組分係指不會例如在宿主生物體(例如哺乳動物，例如人類)中引起或誘導可偵測之疾病或病原性病狀之生物體、粒子(例如病毒或指環載體，例如如本文所描述)或其組分。在一些實施例中，向個體投與指環載體可引起作為標準照護之一部分可接受的輕微反應或副作用。
如本文所用，術語「非病原性」係指例如在宿主生物體(例如哺乳動物，例如人類)中不會引起或誘導可偵測之疾病或病原性病況的生物體或其組分。
如本文所用，「實質上非整合型」遺傳元件係指一種遺傳元件，例如病毒或指環載體中之遺傳元件，例如如本文所描述，其中進入宿主細胞(例如真核細胞)或生物體(例如哺乳動物，例如人類)中之小於約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%或1%之遺傳元件整合至基因體中。在一些實施例中，遺傳元件不會以可偵測方式整合至例如宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，可使用如本文所描述之技術，例如核酸定序、PCR偵測及/或核酸雜交來偵測遺傳元件至基因體中之整合。
如本文所用，「基本上非免疫原性」生物體、粒子或組分係指不會例如在宿主組織或生物體(例如哺乳動物，例如人類)中引起或誘導非所需或非靶向免疫反應的生物體、粒子(例如病毒或指環載體，例如如本文所描述)或其組分。在一些實施例中，實質上非免疫原性生物體、粒子或組分不產生可偵測的免疫反應。在一些實施例中，實質上非免疫原性指環載體不產生針對包含胺基酸序列或由表N1-N4中之任一者中所示之核酸序列編碼之蛋白質的可偵測免疫反應。在一些實施例中，免疫反應(例如，非所需或非靶向免疫反應)係藉由分析個體中之抗體存在或含量(例如，抗指環載體抗體之存在或含量，例如針對如本文所描述之指環載體之抗體的存在或含量)來偵測，例如根據Tsuda等人中所描述之抗TTV抗體偵測方法(1999; J. Virol. Methods 77: 199-206；以引用之方式併入本文中)及/或Kakkola等人中所描述之用於測定抗TTV IgG含量之方法(2008; Virology 382: 182-189；以引用之方式併入本文中)。針對指環病毒或基於指環病毒之指環載體的抗體亦可藉由此項技術中用於偵測抗病毒抗體之方法來偵測，例如偵測抗AAV抗體之方法，例如如Calcedo等人(2013; Front. Immunol. 4(341): 1-7；以引用之方式併入本文中)中所描述。
如本文所用之「子序列」係指分別包含於較大核酸序列或胺基酸序列中的核酸序列或胺基酸序列。在一些情況下，子序列可包含較大序列之域或功能片段。在一些情況下，子序列可包含當與較大序列分離時能夠形成二級及/或三級結構之較大序列的片段，類似於當與較大序列之其餘部分一起存在時由子序列形成之二級及/或三級結構。在一些情況下，子序列可經另一序列置換(例如，包含外源性序列之子序列或與較大序列之其餘部分異源的序列，例如來自不同指環病毒之對應子序列)。
如本文所用，「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其同源詞係指對意欲改善、減輕、穩定、預防或治癒疾病、病理性病狀或病症之個體的醫療管理。此術語包括積極治療(針對改善疾病、病理性病狀或病症之治療)；病因治療(針對相關疾病、病理性病狀或病症之病因的治療)；姑息性治療(經設計用於緩解症狀之治療)；預防性治療(針對預防、最小化或部分或完全抑制相關疾病、病理性病狀或病症之發展的治療)；及支援性治療(用於補充另一療法之治療)。
如本文所使用，術語「病毒組(virome)」係指特定環境中，例如身體之一部分，例如生物體中，例如細胞中，例如組織中之病毒。
本發明大體上關於指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，及其用途。本發明提供指環病毒科家族載體(例如，指環載體)；包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之組合物；及製備或使用指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之方法。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)通常適用作遞送媒劑，例如用於遞送治療劑至真核生物細胞。一般而言，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)將包括包含包封於蛋白質外部內之核酸序列(例如，編碼效應子，例如外源性效應子或內源性效應子)的遺傳元件。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可包括相對於指環病毒序列(例如，如本文所描述)之序列(例如，如本文所描述之區域或域)的一或多個缺失。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可用作用於將遺傳元件或其中編碼之效應子(例如，多肽或核酸效應子，例如如本文所描述)遞送至真核細胞中，例如以治療包含細胞之個體的疾病或病症的實質上非免疫原性媒劑。
目錄I.指環病毒科家族載體(例如，指環載體) A.指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒及CAV) B.衣殼蛋白質(例如，ORF1分子及VP1分子) C.ORF2分子 D.遺傳元件 E.蛋白質結合序列 F.5'UTR區域 G.富含GC之區 H.效應子 I.蛋白質外部 II.用於產生指環病毒科家族載體之組合物及方法 A.指環病毒科家族載體之組分及組裝 i.用於組裝指環載體之衣殼蛋白質(例如，ORF1分子及VP1分子) ii.用於組裝指環載體之ORF2分子 iii.蛋白質組分之產生 B.遺傳元件構築體 i.質體 ii.環形核酸構築體 iii.活體外環化 iv.串聯構築體 v.順式/反式構築體 vi.表現卡匣 vii.遺傳元件構築體之設計及產生 C.效應子 D.宿主細胞 i.將遺傳元件引入至宿主細胞中 ii.提供呈順式或反式之蛋白質的方法 iii.例示性細胞類型 E.培養條件 F.收穫 G.活體外組裝方法 H.富集及純化 III.載體 IV.組合物 V.宿主細胞 VI.使用方法 VII.產生方法 VIII.投與/遞送
I.指環病毒科家族載體(例如，指環載體)  在一些態樣中，本文所描述之本發明包含使用及製備指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、指環病毒科家族載體(例如，指環載體)製劑及治療性組合物的組合物及方法。在一些實施例中，指環載體具有基於指環病毒科病毒(例如，如本文所描述之指環病毒或CAV)的序列、結構及/或功能。應理解，本文所描述關於指環載體之適用的實施例亦可應用於指環病毒科家族載體(例如，基於或源自雞貧血病毒(CAV)之載體，例如如本文所描述)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含含有如表A1-A3 (例如，表A1、A1.1、A2或A3)；或表N1-N4 (例如，表N1、N1.1、N2、N3或N4)中所示之序列或其片段或部分之核酸或多肽，或其他實質上非致病性病毒，例如共生病毒、共生病毒、原生病毒。在一些實施例中，基於指環病毒科家族病毒之載體包含至少一個針對指環病毒科家族病毒具有外源性之元件，例如安置於載體之遺傳元件內的外源性效應子或編碼外源性效應子之核酸序列。在一些實施例中，基於指環病毒科家族病毒之載體包含至少一個針對來自指環病毒科家族病毒之另一元件具有異源性的元件，例如對另一連接的核酸序列，諸如啟動子元件，具有異源性之編碼效應子的核酸序列。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含遺傳元件(例如，環狀DNA，例如單股DNA)，其包含至少一個相對於遺傳元件之其餘部分及/或蛋白質外部(例如，編碼效應子(例如，如本文所描述)之外源性元件)為異源的元件。指環病毒科家族載體可為用於有效負載至宿主(例如，人類)中之遞送媒劑(例如，實質上非病原性遞送媒劑)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體能夠在真核生物細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞中複製。在一些實施例中，指環病毒科家族載體在哺乳動物(例如，人類)細胞中為基本上非病原性的及/或基本上非整合。在一些實施例中，指環病毒科家族載體在哺乳動物(例如，人類)中基本上為非免疫原性的。在一些實施例中，指環病毒科家族載體為複製缺陷型。在一些實施例中，指環病毒科家族載體為複製勝任型。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含curon或其組分(例如遺傳元件，例如包含編碼效應子之序列及/或蛋白質外部)，例如如PCT申請案第PCT/US2018/037379中所描述，其以全文引用之方式併入本文中。
在一態樣中，本發明包括指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含(i)遺傳元件，其包含啟動子元件、編碼效應子(例如，內源性效應子或外源性效應子，例如有效負載)之序列及蛋白質結合序列(例如，外部蛋白質結合序列，例如封裝訊號)，其中該遺傳元件為單股DNA，且具有以下特性中之一者或兩者：為環狀及/或以低於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合至真核生物細胞之基因體中；及(ii)蛋白質外部；其中該遺傳元件包封於蛋白質外部內；且其中該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)能夠遞送遺傳元件至真核生物細胞中。
在本文所描述之指環病毒科家族載體的一些實施例中，該遺傳元件以低於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合。在一些實施例中，將來自向個體投與之複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的低於約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%或5%之遺傳元件整合至該個體之一或多個宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，例如如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)群體之遺傳元件以低於AAV病毒之相當的群體之頻率，例如以比AAV病毒之相當的群體低約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多之頻率整合至宿主細胞之基因體中。
在一態樣中，本發明包括指環病毒科家族載體(例如指環載體)，其包含：(i)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如，內源性效應子或外源性效應子，例如有效負載)之序列，及蛋白質結合序列(例如，外部蛋白質結合序列)，其中該遺傳元件與野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)序列(例如，野生型細環病毒(TTV)、小細環病毒(TTMV)、TTMDV或CAV序列，例如如表N1-N4中之任一者，例如表N1、N1.1、N2、N3或N4中所列出之野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)序列)具有至少75% (例如，至少75、76、77、78、79、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)序列一致性；及(ii)蛋白質外部；其中該遺傳元件包封於蛋白質外部內；且其中該指環病毒科家族載體能夠將遺傳元件遞送至真核生物細胞中。
在一個態樣中，本發明包括一種指環病毒科家族載體，其包含： a)遺傳元件，其包含(i)編碼外部蛋白質(例如，非致病性外部蛋白質)之序列，(ii)將遺傳元件結合至非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列及(iii)編碼效應子(例如內源性或外源性效應子)之序列；及 b)與遺傳元件相關聯，例如圍封或包封該遺傳元件之蛋白質外部。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如指環載體)包括來自無包膜環狀單股DNA病毒(或與其具有＞70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%同源性)之序列或表現產物。動物環狀單股DNA病毒一般係指單股DNA (ssDNA)病毒之子組，其感染真核非植物宿主且具有環狀基因體。因此，動物環狀ssDNA病毒可與感染原核生物之ssDNA病毒(亦即，微小噬菌體科(Microviridae)及絲狀噬菌體科(Inoviridae))及感染植物之ssDNA病毒(亦即，雙生病毒科(Geminiviridae)及矮化病毒科(Nanoviridae))區分。其亦可與感染非植物真核生物之線性ssDNA病毒(亦即小病毒科(Parvoviridiae))區分。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如指環載體)例如短暫或長期地調節宿主細胞功能。在某些實施例中，細胞功能經穩定改變，諸如調節持續至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或其間的任何時間。在某些實施例中，細胞功能短暫改變，例如諸如調節持續不超過約30分鐘至約7天，或不超過約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、7天或其間的任何時間。
在一些實施例中，遺傳元件包含啟動子元件。在一些實施例中，啟動子元件選自RNA聚合酶II依賴性啟動子、RNA聚合酶III依賴性啟動子、PGK啟動子、CMV啟動子、EF-1α啟動子、SV40啟動子、CAGG啟動子或UBC啟動子、TTV病毒啟動子、組織特異性U6 (pollIII)、具有活化蛋白質之上游DNA結合位點的最小CMV啟動子(TetR-VP16、Gal4-VP16、dCas9-VP16等)。在一些實施例中，啟動子元件包含TATA盒。在一些實施例中，啟動子元件對野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)，例如如本文所描述之野生型指環病毒科家族病毒為內源性的。
在一些實施例中，遺傳元件包含以下特徵中之一或多者：單股、環狀、負股及/或DNA。在一些實施例中，遺傳元件包含游離基因體。在一些實施例中，不包括效應子之遺傳元件部分具有約2.5-5 kb (例如約2.8-4 kb、約2.8-3.2 kb、約3.6-3.9 kb或約2.8-2.9 kb)、小於約5 kb (例如，小於約2.9 kb、3.2 kb、3.6 kb、3.9 kb或4 kb)或至少100個核苷酸(例如至少1 kb)之組合尺寸。
如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如指環載體)、包含指環病毒科家族載體(例如指環載體)之組合物、使用此類指環病毒科家族載體(例如指環載體)之方法等在一些情況下係部分地基於說明不同效應子，例如miRNA (例如，針對IFN或miR-625)、shRNA等及蛋白質結合序列，例如結合至衣殼蛋白，諸如Q99153之DNA序列如何與蛋白質外部，例如揭露於Arch Virol (2007) 152: 1961-1975中之衣殼組合，以產生指環病毒科家族載體，其可隨後用於將效應子遞送至細胞(例如，動物細胞，例如人類細胞或非人類動物細胞，諸如豬或小鼠細胞)的實例。在實施例中，效應子可沉默因子(諸如干擾素)之表現。實例進一步描述可如何藉由將效應子插入至衍生自例如指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)之序列中來製備指環病毒科家族載體。基於此等實例，下文描述涵蓋實例中所考慮之特定發現及組合的各種變化形式。例如，熟習此項技術者將自實例理解，特定miRNA僅用作效應子之一個實例且其他效應子可為例如其他調節核酸或治療性肽。類似地，實例中所用之特定衣殼可經下文所描述之基本上非致病性蛋白質置換。實例中所描述之特異性指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)序列亦可由下文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)序列置換。此等考慮因素類似地適用於蛋白質結合序列、諸如啟動子之調節序列及其類似者。獨立於此，熟習此項技術者將尤其考慮與實例密切相關之此類實施例。
在一些實施例中，將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)中所包含之遺傳元件引入至細胞(例如，人類細胞)中。在一些實施例中，例如由指環病毒科家族載體(例如指環載體)之遺傳元件編碼的效應子(例如，RNA，例如miRNA)表現於細胞(例如，人類細胞)中，例如指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或遺傳元件已引入至細胞中後。在一些實施例中，將指環病毒科家族載體(例如指環載體)或其中包含之遺傳元件引入至細胞中調節(例如，增加或降低)細胞中之目標分子(例如，目標核酸，例如RNA或目標多肽)含量，例如藉由改變細胞對目標分子之表現量。在一些實施例中，將指環病毒科家族載體(例如指環載體)或其中包含之遺傳元件引入降低由細胞產生之干擾素含量。在一些實施例中，將指環病毒科家族載體(例如指環載體)或其中包含之遺傳元件引入至細胞中調節(例如，增加或降低)細胞之功能。在一些實施例中，將指環病毒科家族載體(例如指環載體)或其中包含之遺傳元件引入至細胞中調節(例如，增加或降低)細胞之存活率。在一些實施例中，將指環病毒科家族載體(例如指環載體)或其中包含之遺傳元件引入至細胞中降低細胞(例如，癌細胞)之存活率。
在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科家族載體(例如指環載體) (例如，合成性指環載體)誘導低於70%之抗體流行率(例如，低於約60%、50%、40%、30%、20%或10%抗體流行率)。在一些實施例中，抗體流行率係根據此項技術中已知之方法測定。在一些實施例中，抗體流行率係例如根據Tsuda等人. (1999; J. Virol. Methods 77: 199-206；以引用之方式併入本文中)所描述之抗TTV抗體偵測方法，及/或Kakkola等人(2008; Virology 382: 182-189；以引用之方式併入本文中)所描述之用於確定抗TTV IgG血清陽性率之方法，藉由偵測生物樣品中針對指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)(例如，如本文所描述)或基於其之指環病毒科家族載體來確定。針對指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)或基於其之指環病毒科家族載體的抗體亦可藉由此項技術中用於偵測抗病毒抗體之方法，例如偵測抗AAV抗體之方法來偵測，例如如Calcedo等人. (2013; Front. Immunol.4(341): 1-7；以引用之方式併入本文中)中所描述。
在一些實施例中，複製缺失型、複製缺陷型或複製不勝任型遺傳元件不編碼複製遺傳元件所需之所有必需機構或組分。在一些實施例中，複製缺陷型遺傳元件不編碼複製因子。在一些實施例中，複製缺陷型遺傳元件不編碼一或多個ORF (例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2及/或VP3，例如如本文所描述)。在一些實施例中，不由遺傳元件編碼之機構或組分可以反式提供(例如使用輔助物，例如輔助病毒或輔助質體，或在包含宿主細胞之核酸中編碼，例如整合至宿主細胞之基因體中)，例如使得遺傳元件可在以反式提供之機構或組分存在下經歷複製。
在一些實施例中，封裝缺失型、封裝缺陷型或封裝非勝任型遺傳元件無法封裝至蛋白質外部(例如，其中蛋白質外部包含衣殼或其一部分，例如包含由ORF1或VP1核酸編碼之多肽，例如如本文所描述)。在一些實施例中，封裝缺失型遺傳元件係以與野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)(例如，如本文所描述)相比低於10% (例如，低於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%)之效率封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，封裝缺陷性遺傳元件甚至在因子(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2或VP3)存在下不可被封裝至蛋白質外部中，從而將准許封裝野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)(例如，如本文所描述)之遺傳元件。在一些實施例中，封裝缺失型遺傳元件係甚至在因子(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2或VP3)存在下以與野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) (例如，如本文所描述)相比低於10% (例如，低於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%)之效率封裝至蛋白質外部中，從而將准許封裝野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) (例如，如本文所描述)之遺傳元件。
在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件可封裝至蛋白質外部中(例如，其中蛋白質外部包含衣殼或其一部分，例如包含由ORF1或VP1核酸編碼之多肽，例如如本文所描述)。在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件係以與野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)(例如，如本文所描述)相比至少20% (例如，至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或更高)之效率封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件在因子(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2或VP3)存在下可被封裝至蛋白質外部中，從而將准許封裝野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)(例如，如本文所描述)之遺傳元件。在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件係在因子(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2或VP3)存在下以與野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) (例如，如本文所描述)相比至少20% (例如，至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或更高)之效率封裝至蛋白質外部中，從而將准許封裝野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) (例如，如本文所描述)之遺傳元件。
指環病毒科家族病毒 ( 例如， 指環病毒及 CAV) 在一些實施例中，例如如本文所描述之指環病毒科家族載體包含由指環病毒衍生之序列或表現產物。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包括相對於指環病毒為外源性的一或多種序列或表現產物。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包括相對於指環病毒為內源性的一或多種序列或表現產物。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包括相對於指環病毒科家族載體中之一或多種其他序列或表現產物為異源的一或多種序列或表現產物。指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) 通常具有帶有負極性之單股環狀DNA基因體。指環病毒通常不與任何人類疾病相關聯。然而，將指環病毒感染與人類疾病關聯起來的嘗試被以下各者混淆：對照組群體中無症狀指環病毒病毒血症之高發病率、指環病毒病毒家族內之顯著基因體多樣性、歷史上無法在活體外繁殖該病原體以及缺乏指環病毒疾病動物模型(Yzebe等人, Panminerva Med. (2002) 44:167-177；Biagini, P., Vet. Microbiol. (2004) 98:95-101)。
指環病毒通常藉由口鼻或糞口感染、母嬰及/或子宮內傳播來傳播(Gerner等人, Ped. Infect. Dis. J. (2000) 19:1074-1077)。在一些情況下，感染者之特徵可為長期(數月至數年)的指環病毒病毒血症。人類可經超過一個基因組或病毒株共感染(Saback等人, Scad. J. Infect. Dis. (2001) 33:121-125)。有跡象表明此等基因組可在感染人類體內重組(Rey等人, Infect. (2003) 31:226-233)。已在若干組織，諸如肝臟、周邊血液單核球及骨髓中發現雙股同功型(複製型)中間物(Kikuchi等人, J. Med. Virol. (2000) 61:165-170；Okamoto等人, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2002) 270:657-662；Rodriguez-lnigo等人, Am. J. Pathol. (2000) 156:1227-1234)。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼胺基酸序列或其功能片段，或與本文所描述之胺基酸序列中之任一者，例如指環病毒胺基酸序列具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的核苷酸序列。
在一些實施例中，如本文所描述之指環病毒科家族載體包含含有與指環病毒序列，例如如本文所描述之指環病毒序列或其片段具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的一或多個核酸分子(例如，如本文所描述之遺傳元件)。在實施例中，指環病毒科家族載體包含選自如表N1-N4中之任一者中所示之序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的核酸序列。在實施例中，指環病毒科家族載體包含含有如表A1-A3中所示之序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的多肽。
在一些實施例中，如本文所描述之指環病毒科家族載體包含一或多個核酸分子(例如，如本文所描述之遺傳元件)，其包含與本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)中之任一者(例如，如所標註，或如由表N1-N4中之任一者所列之序列編碼的指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)序列)的TATA盒、加帽位點、起始子元件、轉錄起始位點、5'UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2、VP3 (凋亡蛋白)、三個開讀框區域、聚(A)訊號、富含GC之區或其任何組合中之一或多者具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，例如本文所描述之指環病毒中的任一者(例如，如所標註，或如由表N1-N4中之任一者所列之序列編碼的指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)序列)之ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3或VP1序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白包含與指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1 ORF2、VP1、VP2或凋亡蛋白(例如，ORF1、ORF2、VP1、VP2或如表A1-A3中所示之凋亡蛋白胺基酸序列，或由如表N1-N4中之任一者中所示之核酸序列編碼的ORF1、ORF2、VP1、VP2或凋亡蛋白胺基酸序列)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白包含與指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1蛋白質(例如，如表A1-A3中所示之ORF1或VP1胺基酸序列，或由如表N1-N4中之任一者中所示之核酸序列編碼的ORF1或VP1胺基酸序列)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
核酸序列 在一些實施例中，核酸分子包含與表N1-N4中之任一者的指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表N1-N4中之任一者之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表N1-N4中之任一者之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表N1-N4中之任一者之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)富含GC之區核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表N1-N4中之任一者之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) 5'UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
由核酸序列編碼之胺基酸序列 在一些實施例中，核酸分子包含編碼與表A1或A2之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼與表A1或A2之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼與表A1或A2之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的核酸序列。
包含胺基酸序列之蛋白質 在實施例中，本文所描述之指環病毒科家族載體包含具有與表A1-A3之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質。在實施例中，本文所描述之指環病毒科家族載體包含具有與表A1或A2之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質。在實施例中，本文所描述之指環病毒科家族載體包含具有與表A1或A2之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質。在一些實施例中，ORF1或VP1分子(例如，包含於指環病毒科家族載體中)包含由表N1-N4中之任一者之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1核酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，ORF1或VP1分子(例如，包含於指環病毒科家族載體中)包含表A1-A3之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1蛋白質或剪接變異體或其轉譯後處理(例如，經蛋白分解處理)之變異體。在一些實施例中，ORF2或VP2分子(例如，包含於指環病毒科家族載體中)包含由表N1-N4中之任一者之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2核酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，ORF2或VP2分子(例如，包含於指環病毒科家族載體中)包含表A1-A3之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2蛋白質或剪接變異體或其轉譯後處理(例如，經蛋白分解處理)之變異體。在一些實施例中，ORF3或VP3分子(例如，包含於指環病毒科家族載體中)包含由表N1-N4中之任一者之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3核酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，ORF3或VP3分子(例如，包含於指環病毒科家族載體中)包含表A1-A3之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3蛋白質或剪接變異體或其轉譯後處理(例如，經蛋白分解處理)之變異體。
包含胺基酸序列之多肽 在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在實施例中，本文所描述之多肽包含與表A1-A3之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1核酸編碼之ORF1或VP1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由如表N1-N4中所列之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF1或VP1核酸編碼之ORF1或VP1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與表A1或A2之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2核酸編碼之ORF2或VP2分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由如表N1-N4中所列之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF2或VP2核酸編碼之ORF2或VP2分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與表A1或A2之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3核酸編碼之ORF3或VP3分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由如表N1-N4中所列之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) ORF3或VP3核酸編碼之ORF3或VP3分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，多肽包含如表A1-A3中所示之胺基酸序列(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2、VP3序列)，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
表 N1. 新穎指環病毒核酸序列 ( 乙型細環病毒 )
名稱 RING 19
屬/ 分支 乙型細環病毒
登錄號 N/A
全序列：2876 bp
註釋：   
假定域 鹼基範圍
ORF1 283 - 2250
ORF2 59 - 391
ORF3 2277 - 2462
富含GC之區或其一部分 2515 - 2615
5'UTR保守域或其一部分 1 - 71
表 A1. 新穎指環病毒胺基酸序列 ( 乙型細環病毒 )
RING 19 (乙型細環病毒)
ORF1 MPWYPRRRYPRRRYRWLRRWRARRPFRPRYRRRYWVRNYSRKRKLFKITTKEWQPKVIRKTHVKGTYPLFLCTKHRINNNMIQYLDSIAPEHYYGGGGFSIMQFSLQALYEEFIKAKNWWTNTNCFLPLVRYMGCSFKFYKTEFYDYIVLIERCYPLACTDEMYLSTQPSIMMLTRKCIFVPCKQNSKGKKPYKKVRVRPPSQMTTGWHFSQDLANMPLVVLKTSVCSFDRYYTDSTAKSTTIGFKTLNTQTFRYHDWQEPPTTGYKPQNLLWFYGAENGSPVDPNNTIVSNLIYLGGTGPYEKGTPIKTNISNYFSEPKLWGNIFHDDYTSGTSPVFVTNKSPSEIKTAWNTIKDLTVKASGVFTLRTIPLWLPCRYNPFADKATNNKIWLVSIHSDHTEWKPIDNPLLQRTDLPLWLLVWGWQDWQKKNQQTSQPDINYLTVISSPYISCYPKLDYYVLLDEGFWEGHSTYIESITDSDKKHWYPKNRFQIETLNLIANTGPGTVKLRENQAAEGHMVYRFNFKLGGCPAPMEKICDPSKQSKYPIPNNQQQTTSLQSPENPIQTYLYDFDERRGLLTERATKRIKQDHTSEKTVLPFTGAATDLPILQTTSQEESSSEEEEEQQAEKKLLQLRRKQHRLRERILQLLDIQNT (SEQ ID NO: 2)
ORF2 MAERARNLNIIILQMQIQPPIRTFKQTISDWKNLIVHVHDNICNCNKPLEHTIDTCITNPDELRLNKSTKQQLQKCLGTPEEDTQEDVIDGFADGELDALFAQDTEEDTG (SEQ ID NO: 3)
ORF3 MFGDTHVPNRRMTPEEFEQELIVAGVFRRPPCYYIKDRPTYPYVPKPTDEKCMVNFDLNFP (SEQ ID NO: 4)
表 N1.1. 新穎指環病毒核酸序列 ( 乙型細環病毒 )
名稱  RING 19替代
屬/ 分支 乙型細環病毒
登錄號 N/A
全序列：2876 bp
註釋：   
假定域 鹼基範圍
ORF1 283 - 2250
ORF2 101 - 391
ORF3 2277 - 2462
富含GC之區或其一部分 2515 - 2615
5'UTR保守域或其一部分 1 - 71
表 A1.1. 新穎指環病毒胺基酸序列 ( 乙型細環病毒 )
RING 19 (乙型細環病毒)
ORF1 MPWYPRRRYPRRRYRWLRRWRARRPFRPRYRRRYWVRNYSRKRKLFKITTKEWQPKVIRKTHVKGTYPLFLCTKHRINNNMIQYLDSIAPEHYYGGGGFSIMQFSLQALYEEFIKAKNWWTNTNCFLPLVRYMGCSFKFYKTEFYDYIVLIERCYPLACTDEMYLSTQPSIMMLTRKCIFVPCKQNSKGKKPYKKVRVRPPSQMTTGWHFSQDLANMPLVVLKTSVCSFDRYYTDSTAKSTTIGFKTLNTQTFRYHDWQEPPTTGYKPQNLLWFYGAENGSPVDPNNTIVSNLIYLGGTGPYEKGTPIKTNISNYFSEPKLWGNIFHDDYTSGTSPVFVTNKSPSEIKTAWNTIKDLTVKASGVFTLRTIPLWLPCRYNPFADKATNNKIWLVSIHSDHTEWKPIDNPLLQRTDLPLWLLVWGWQDWQKKNQQTSQPDINYLTVISSPYISCYPKLDYYVLLDEGFWEGHSTYIESITDSDKKHWYPKNRFQIETLNLIANTGPGTVKLRENQAAEGHMVYRFNFKLGGCPAPMEKICDPSKQSKYPIPNNQQQTTSLQSPENPIQTYLYDFDERRGLLTERATKRIKQDHTSEKTVLPFTGAATDLPILQTTSQEESSSEEEEEQQAEKKLLQLRRKQHRLRERILQLLDIQNT (SEQ ID NO: 2)
ORF2 MQIQPPIRTFKQTISDWKNLIVHVHDNICNCNKPLEHTIDTCITNPDELRLNKSTKQQLQKCLGTPEEDTQEDVIDGFADGELDALFAQDTEEDTG (SEQ ID NO: 173)
ORF3 MFGDTHVPNRRMTPEEFEQELIVAGVFRRPPCYYIKDRPTYPYVPKPTDEKCMVNFDLNFP (SEQ ID NO: 4)
表 N2. 例示性指環病毒核酸序列 ( 乙型細環病毒 )
名稱 Ring2
屬/ 分支 乙型細環病毒
登錄號 JX134045.1
全序列：2797 bp
  
註釋：
假定域 鹼基範圍
TATA盒 237- 243
加帽位點 260 - 267
轉錄起始位點 267
5'UTR保守域 323 - 393
ORF2 424 - 723
ORF2/2 424 – 719；2274 - 2589
ORF2/3 424 – 719；2449 - 2812
ORF1 612 - 2612
ORF1/1 612 – 719；2274 - 2612
ORF1/2 612 – 719；2449 - 2589
三個開讀框區 2441 - 2586
聚(A)訊號 2808 - 2813
富含GC之區 2868 - 2929
表 A2. 例示性指環病毒胺基酸序列 ( 乙型細環病毒 )
Ring2 (乙型細環病毒)
ORF2 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEG (SEQ ID NO: 55)
ORF2/2 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEGFNIPYPVTSMKQLRYRVQGKPQNPSYTPSTIDTGTTQQQLCHELAKTGHLKTLFLKLQSQIDSNCSNKPSNACKSRKKRRRKKKKKYSSSSATSDSSSSCTESE (SEQ ID NO: 56)
ORF2/3 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEGARSTATAQTSPRMPANLGRNAGEKRKRSTAAHQQPQTAAAAVQRANNIIIKGPITFNCVKKVKLFDDKPKNRRFTPEEFETELQIAKWLKRPPRSFVNDPPFYPWLPPEPVVNFKLNFTE (SEQ ID NO: 57)
ORF1 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVRPTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNTISIQNRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNPRINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSLKSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAGTMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFKWGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 58)
ORF1/1 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 59)
ORF1/2 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRSQIDSNCSNKPSNACKSRKKRRRKKKKKYSSSSATSDSSSSCTESE (SEQ ID NO: 60)
表 N3. 例示性雞貧血病毒 (CAV) 核酸序列
名稱  CAV分離株Cuxhaven 1
屬/ 分支 環病毒( Gyrovirus)
登錄號 M55918
全序列：2313 bp   
  
註釋：
假定域 鹼基範圍
5' UTR 1 - 374
重複區域 138 - 254
 CAAT訊號 255 - 260
TATA盒 317 - 322
VP2 374 - 1024
VP3 (凋亡蛋白) 480 - 845
VP1 847 - 2196
3' UTR 2197 - 2313
富含GC之區 2200 - 2266
聚A訊號序列 2281-2286
表 N4. 替代性例示性雞貧血病毒 (CAV) 核酸序列
名稱 CAV分離株Cuxhaven 1
屬/ 分支 環病毒
登錄號 M55918
全序列：2319 bp   
  
註釋：
假定域 鹼基範圍
5' UTR 1 - 379
VP2 380 - 1030
VP3 (凋亡蛋白) 485 - 851
VP1 853 - 2202
3' UTR 2203 - 2319
表A3.例示性CAV胺基酸序列
CAV
VP1 MARRARRPRGRFYSFRRGRWHHLKRLRRRYKFRHRRRQRYRRRAFRKAFHNPRPGTYSVRLPNPQSTMTIRFQGVIFLTEGLILPKNSTAGGYADHMYGARVAKISVNLKEFLLASMNLTYVSKIGGPIAGELIADGSKSQAADNWPNCWLPLDNNVPSATPSAWWRWALMMMQPTDSCRFFNHPKQMTLQDMGRMFGGWHLFRHIETRFQLLATKNEGSFSPVASLLSQGEYLTRRDDVKYSSDHQNRWQKGGQPMTGGIAYATGKMRPDEQQYPAMPPDPPIITATTAQGTQVRCMNSTQAWWSWDTYMSFATLTALGAQWSFPPGQRSVSRRSFNHHKARGAGDPKGQRWHTLVPLGTETITDSYMSAPASELDTNFFTLYVAQGTNKSQQYKFGTATYALKEPVMKSDAWAVVRVQSVWQLGNRQRPYPWDVNWANSTMYWGTQP
VP2 MHGNGGQPAAGGSESALSREGQPGPSGAAQGQVISNERSPRRYSTRTINGVQATNKFTAVGNPSLQRDPDWYRWNYNHSIAVWLRECSRSHAKICNCGQFRKHWFQECAGLEDRSTQASLEEAILRPLRVQGKRAKRKLDYHYSQPTPNRKKAYKTVRWQDELADREADFTPSEEDGGTTSSDFDEDINFDIGGDSGIVDELLGRPFTTPAPVRIV*
VP3 (凋亡蛋白) MNALQEDTPPGPSTVFRPPTSSRPLETPHCREIRIGIAGITITLSLCGCANARAPTLRSATADNSESTGFKNVPDLRTDQPKPPSKKRSCDPSEYRVSELKESLITTTPSRPRTAKRRIRL*
在一些實施例中，如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如指環載體)為嵌合指環病毒科家族載體(例如指環載體)。在一些實施例中，嵌合指環病毒科家族載體進一步包含來自除指環病毒科家族病毒外之病毒的一或多個元件、多肽或核酸。
在一些實施例中，嵌合指環病毒科家族載體包含複數個多肽(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2及/或VP3)，該等多肽包含來自複數個不同指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之序列。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含嵌合多肽(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2及/或VP3)，例如包含來自指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之至少一部分及來自不同病毒(例如，如本文所描述)之至少一部分。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含嵌合多肽(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、VP1、VP2及/或VP3)，例如包含來自指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之至少一部分及來自不同指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之至少一部分。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含含有來自指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之ORF1或VP1分子之至少一部分的嵌合ORF1或VP1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1或VP1分子，及來自不同指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之ORF1或VP1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1或VP1分子的至少一部分。在一些實施例中，嵌合ORF1或VP1分子包含來自一個指環病毒科家族病毒之ORF1或VP1果凍卷域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒科家族病毒之ORF1或VP1胺基酸子序列(例如，如本文所描述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，嵌合ORF1或VP1分子包含來自一個指環病毒科家族病毒之ORF1或VP1富含精胺酸之區域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒科家族病毒之ORF1或VP1胺基酸子序列(例如，如本文所描述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，嵌合ORF1或VP1分子包含來自一個指環病毒科家族病毒之ORF1或VP1高變域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒科家族病毒之ORF1或VP1胺基酸子序列(例如，如本文所描述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一個指環病毒科家族病毒之ORF1 N22域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒科家族病毒之ORF1胺基酸子序列(例如，如本文所描述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，嵌合ORF1或VP1分子包含來自一個指環病毒科家族病毒之ORF1或VP1 C端域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒科家族病毒之ORF1或VP1胺基酸子序列(例如，如本文所描述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含含有來自一個指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之ORF1/1分子之至少一部分的嵌合ORF1/1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1/1分子，及來自不同指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之ORF1/1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1/1分子的至少一部分。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含含有來自一個指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之ORF1/2分子之至少一部分的嵌合ORF1/2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1/2分子，及來自不同指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之ORF1/2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1/2分子的至少一部分。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含含有來自一個指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之ORF2或VP2分子之至少一部分的嵌合ORF2或VP2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF2或VP2分子，及來自不同指環病毒科家族病毒(例如，如本文所描述)之ORF2或VP2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF2或VP2分子的至少一部分。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含嵌合ORF2/2分子，該分子包含來自一種指環病毒科家族載體(例如，如本文所描述)之ORF2/2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/2分子的至少一部分，及來自不同指環病毒科家族載體(例如，如本文所描述)之ORF2/2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/2分子的至少一部分。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含嵌合ORF2/3分子，該分子包含來自一種指環病毒科家族載體(例如，如本文所描述)之ORF2/3分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/3分子的至少一部分，及來自不同指環病毒科家族載體(例如，如本文所描述)之ORF2/3分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/3分子的至少一部分。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含嵌合ORF2T/3分子，該分子包含來自一種指環病毒科家族載體(例如，如本文所描述)之ORF2T/3分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2T/3分子的至少一部分，及來自不同指環病毒科家族載體(例如，如本文所描述)之ORF2T/3分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2T/3分子的至少一部分。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含核酸，其包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US2018/037379號中所列之序列。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含多肽，其包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US2018/037379號中所列之序列。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含指環病毒科家族病毒基因體，例如如根據實例9中所描述之方法所鑑別。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含如實例13中所描述之指環病毒科家族病毒序列，或其一部分。
在一些實施例中，指環載體包含含有共有指環病毒模體之遺傳元件，例如如表19中所示。在一些實施例中，指環載體包含含有共有指環病毒ORF1模體之遺傳元件，例如如表19中所示。在一些實施例中，指環載體包含含有共有指環病毒ORF1/1模體之遺傳元件，例如如表19中所示。在一些實施例中，指環載體包含含有共有指環病毒ORF1/2模體之遺傳元件，例如如表19中所示。在一些實施例中，指環載體包含含有共有指環病毒ORF2/2模體之遺傳元件，例如如表19中所示。在一些實施例中，指環載體包含含有共有指環病毒ORF2/3模體之遺傳元件，例如如表19中所示。在一些實施例中，指環載體包含含有共有指環病毒ORF2t/3模體之遺傳元件，例如如表19中所示。在一些實施例中，如表19中所示之X指示任何胺基酸。在一些實施例中，如表19中所示之Z指示麩胺酸或麩醯胺酸。在一些實施例中，如表19中所示之B指示天冬胺酸或天冬醯胺。在一些實施例中，如表19中所示之J指示白胺酸或異白胺酸。 表 19. 指環病毒之開讀框 (ORF) 的共有模體
共有臨限值 開讀框 位置 模體 SEQ ID NO:
50 ORF1 79 LIJRQWQPXXIRRCXIXGYXPLIXC 68
50 ORF1 111 NYXXHXD 69
50 ORF1 135 FSLXXLYDZ 70
50 ORF1 149 NXWTXSNXDLDLCRYXGC 71
50 ORF1 194 TXPSXHPGXMXLXKHK 72
50 ORF1 212 IPSLXTRPXG 73
50 ORF1 228 RIXPPXLFXDKWYFQXDL 74
50 ORF1 250 LLXIXATA 75
50 ORF1 260 LXXPFXSPXTD 76
50 ORF1 448 YNPXXDKGXGNXIW 77
50 ORF1 519 CPYTZPXL 78
50 ORF1 542 XFGXGXMP 79
50 ORF1 569 HQXEVXEX 80
50 ORF1 600 KYXFXFXWGGNP 81
50 ORF1 653 HSWDXRRG 82
50 ORF1 666 AIKRXQQ 83
50 ORF1 750 XQZQXXLR 84
50 ORF1/1 73 PRXJQXXDP 85
50 ORF1/1 91 HSWDXRRG 86
50 ORF1/1 105 AIKRXQQ 87
50 ORF1/1 187 QZQXXLR 88
50 ORF1/2 97 KXKRRRR 89
50 ORF2/2 158 PIXSLXXYKXXTR 90
50 ORF2/2 189 LAXQLLKECXKN 91
50 ORF2/3 39 HLNXLA 92
50 ORF2/3 272 DRPPR 93
50 ORF2/3 281 DXPFYPWXP 94
50 ORF2/3 300 VXFKLXF 95
50 ORF2t/3 4 WXPPVHBVXGIERXW 96
50 ORF2t/3 37 AKRKLX 97
50 ORF2t/3 140 PSSXDWXXEY 98
50 ORF2t/3 156 DRPPR 99
50 ORF2t/3 167 PFYPW 100
50 ORF2t/3 183 NVXFKLXF 101
50 ORF1 84 JXXXXWQPXXXXXCXIXGXXXJWQP 102
50 ORF1 149 NXWXXXNXXXXLXRY 103
50 ORF1 448 YNPXXDXG 104
衣殼蛋白質 ( 例如， ORF1 分子及 VP1 分子 )在一些實施例中，指環載體包含ORF1分子或VP1分子及/或編碼ORF1分子或VP1分子之核酸。
通常，ORF1分子包含具有指環病毒ORF1蛋白質(例如，如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白質，例如如表A1或A2中所列出)之結構特點及/或活性的多肽，或其功能片段。在一些實施例中，ORF1分子包含相對於指環病毒ORF1蛋白質(例如，如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白質，例如如表A1或A2中所列出)之截斷。在一些實施例中，ORF1分子經截短指環病毒ORF1蛋白質之至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700個胺基酸。在一些實施例中，ORF1分子包含與如表A1或A2中所示之指環病毒ORF1蛋白質序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子包含與例如如本文所描述之乙型細環病毒ORF1蛋白質具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。ORF1分子通常可結合至核酸分子，諸如DNA (例如遺傳元件，例如如本文所描述)。在一些實施例中，ORF1分子定位至細胞核。在某些實施例中，ORF1分子定位至細胞之細胞核。在一些實施例中，ORF1分子由ORF1核酸編碼。在一些實施例中，ORF1核酸包含反義股，其可直接經轉錄以產生編碼ORF1分子之mRNA。在一些實施例中，ORF1核酸包含有義股。
一般而言，VP1分子包含具有CAV VP1蛋白(例如，如本文所描述之CAV VP1蛋白，例如如表A3中所列出)或其功能性片段之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，VP1分子包含相對於CAV VP1蛋白(例如，如本文所描述之CAV VP1蛋白質，例如如表A3中所列出)之截短。在一些實施例中，VP1分子經截短CAV VP1蛋白之至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700個胺基酸。在一些實施例中，VP1分子包含與如表A3中所示之CAV VP1蛋白質序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。VP1分子可一般結合至核酸分子，諸如DNA (例如，遺傳元件，例如如本文所描述)。在一些實施例中，VP1分子定位至細胞之細胞核。在某些實施例中，VP1分子定位至細胞之細胞核。在一些實施例中，VP1分子由VP1核酸編碼。在一些實施例中，VP1核酸包含反義股，其可直接經轉錄以產生編碼VP1分子之mRNA。在一些實施例中，VP1核酸包含有義股。
在一些實施例中，如本文所描述之ORF1分子包含如PCT公開案第WO2020/123816號(以全文引用的方式併入本文中)之表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20-37或D1-D10中所列出之胺基酸序列(例如，ORF1序列或富含精胺酸之區域、果凍卷域、HVR、N22或C端域序列)，或與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。
不希望受理論所束縛，ORF1或VP1分子可能能夠結合至其他ORF1或VP1分子，例如以形成蛋白質外部(例如，如本文所描述)。此類ORF1或VP1分子可描述為能夠形成衣殼。在一些實施例中，蛋白質外部可用衣殼包裹核酸分子(例如，如本文所描述之遺傳元件)。在一些實施例中，複數個ORF1或VP1分子可形成多聚體，例如以產生蛋白質外部。在一些實施例中，多聚體可為均多聚體。在其他實施例中，多聚體可為雜多聚體(例如，包含複數個不同ORF1或VP1分子)。亦考慮，ORF1或VP1分子可具有複製酶活性。
在一些實施例中，ORF1或VP1分子可包含以下中之一或多者：包含富含精胺酸之區之第一區域，例如具有至少60%鹼性殘基(例如，至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%鹼性殘基；例如在60%-90%、60%-80%、70%-90%或70-80%鹼性殘基之間)之區域，及包含果凍卷域之第二區域，例如至少六個β股(例如，4、5、6、7、8、9、10、11或12個β股)。在一些實施例中，VP1分子在一些實施例中可包含以下中之一或多者：富含精胺酸區，例如具有至少60%鹼性殘基(例如，至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%鹼性殘基；例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70%-80%鹼性殘基)之區；及果凍卷域。
富含精胺酸之區域富含精胺酸之區域(例如，包含如本文所描述之ORF1分子或VP1分子)與本文所描述之富含精胺酸之區域序列或包含至少60%、70%或80%鹼性殘基(例如，精胺酸、離胺酸或其組合)之至少約40個胺基酸之序列具有至少70% (例如，至少約70、80、90、95、96、97、98、99或100%)序列一致性。
果凍卷域果凍卷域或區域(例如，包含如本文所描述之ORF1分子或VP1分子)包含(例如，由以下組成)含有一或多個(例如，1、2或3)以下特性之多肽(例如，包含於較大多肽中之域或區域)： (i)果凍卷域之胺基酸中之至少30% (例如至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%或更多)為一或多個β片之一部分； (ii)果凍卷域之二級結構包含至少四條(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12條) β股；及/或 (iii)果凍卷域之三級結構包含至少兩個(例如至少2、3或4個) β片；及/或 (iv)果凍卷域包含至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1之β片與α螺旋之比率。
在某些實施例中，果凍卷域包含兩個β片。
在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含約八條(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12條) β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含八條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含七條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含六條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含五條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含四條β股。
在一些實施例中，果凍卷域包含與第二β片呈反平行定向之第一β片。在某些實施例中，第一β片包含約四條(例如3、4、5或6條) β股。在某些實施例中，第二β片包含約四條(例如3、4、5或6條) β股。在實施例中，第一及第二β片總共包含約八條(例如6、7、8、9、10、11或12條) β股。
在某些實施例中，果凍卷域為衣殼蛋白(例如如本文所描述之ORF1分子)之組分。在某些實施例中，果凍卷域具有自組裝活性。在一些實施例中，包含果凍卷域之多肽結合至包含果凍卷域之多肽的另一複本。在一些實施例中，第一多肽之果凍卷域結合於多肽之第二複本之果凍卷域。
ORF1分子亦可包括包含指環病毒N22域(例如如本文所描述，例如來自如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白質的N22域)之結構或活性的第三區，及/或包含指環病毒C端域(CTD) (例如如本文所描述，例如來自如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白質的CTD)之結構或活性的第四區。在一些實施例中，ORF1分子以N端至C端之順序包含第一、第二、第三及第四區。
在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含高變區(HVR)，例如來自指環病毒ORF1蛋白質之HVR，例如如本文所描述。在一些實施例中，HVR位於第二區與第三區之間。在一些實施例中，HVR包含至少約55個(例如至少約45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或65個)胺基酸(例如約45-160、50-160、55-160、60-160、45-150、50-150、55-150、60-150、45-140、50-140、55-140或60-140個胺基酸)。
在一些實施例中，第一區可結合至核酸分子(例如DNA)。在一些實施例中，鹼性殘基係選自精胺酸、組胺酸或離胺酸或其組合。在一些實施例中，第一區域包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%精胺酸殘基(例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70%-80%精胺酸殘基)。在一些實施例中，第一區包含約30-120個胺基酸(例如約40-120、40-100、40-90、40-80、40-70、50-100、50-90、50-80、50-70、60-100、60-90或60-80個胺基酸)。在一些實施例中，第一區包含病毒ORF1富含精胺酸之區(例如來自指環病毒ORF1蛋白質之富含精胺酸之區，例如如本文所描述)的結構或活性。在一些實施例中，第一區包含核定位信號。
在一些實施例中，第二區包含果凍卷域，例如病毒ORF1果凍卷域(例如來自指環病毒ORF1蛋白質之果凍卷域，例如如本文所描述)的結構或活性。在一些實施例中，第二區能夠結合至另一ORF1分子之第二區，例如以形成蛋白質外部(例如衣殼)或其一部分。
在一些實施例中，第四區暴露於蛋白質外部(例如包含ORF1分子之多聚體的蛋白質外部，例如如本文所描述)之表面上。
在一些實施例中，第一區、第二區、第三區、第四區及/或HVR各自包含少於四個(例如0、1、2或3個) β片。
在一些實施例中，第一區、第二區、第三區、第四區及/或HVR中之一或多者可由異源胺基酸序列(例如來自異源ORF1分子之對應區域)替換。在一些實施例中，異源胺基酸序列具有所需功能性，例如如本文所描述。
在一些實施例中，ORF1分子包含複數個保守模體(例如，包含約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個胺基酸的模體) (例如，如圖34中所示)。在一些實施例中，保守模體可與一或多個野生型指環病毒分枝系(例如，乙型細環病毒)之ORF1蛋白質展現出60、70、80、85、90、95或100%序列一致性。在一些實施例中，保守模體之長度各自在1-1000個胺基酸之間(例如，在5-10、5-15、5-20、10-15、10-20、15-20、5-50、5-100、10-50、10-100、10-1000、50-100、50-1000或100-1000之間)。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約2-4% (例如約1-8%、1-6%、1-5%、1-4%、2-8%、2-6%、2-5%或2-4%)組成，且各自與野生型指環病毒進化枝之ORF1蛋白質中之對應模體展現出100%序列一致性。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約5-10% (例如約1-20%、1-10%、5-20%或5-10%)組成，且各自展示出與野生型指環病毒分枝系之ORF1蛋白質中之對應模體的80%序列一致性。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約10-50% (例如約10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、20-40%、20-50%或30-50%)組成，且各自展示出與野生型指環病毒分枝系之ORF1蛋白質中之對應模體的60%序列一致性。在一些實施例中，保守模體包含一或多個如表19中所列之胺基酸序列。
在一些實施例中，ORF1分子包含相對於野生型ORF1蛋白質，例如如本文所描述(例如，如表A1或A2中所示)之至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)。
N22 域中之保守 ORF1 模體在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如ORF1分子)包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)，其中X n為任何 n個胺基酸之連續序列。舉例而言，X 2指示任何兩個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)包含於ORF1分子之N22域內，例如如本文所描述。在一些實施例中，本文所描述之遺傳元件包含編碼胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)之核酸序列(例如編碼ORF1分子之核酸序列，例如如本文所描述)，其中X n為任何 n個胺基酸之連續序列。
在一些實施例中，多肽(例如ORF1分子)包含保守二級結構，例如側接及/或包含YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之一部分，例如在N22域中。在一些實施例中，保守二級結構包含第一β股及/或第二β股。在一些實施例中，第一β股之長度為約5-6個(例如3、4、5、6、7或8個)胺基酸。在一些實施例中，第一β股包含在YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之N端的酪胺酸(Y)殘基。在一些實施例中，YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體包含無規捲曲(例如約8-9個胺基酸之無規捲曲)。在一些實施例中，第二β股之長度為約7-8個(例如5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二β股包含在YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之C端的天冬醯胺(N)殘基。
例示性側接YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體二級結構描述於實例47及圖48中。在一些實施例中，ORF1分子含有包含圖48中所示之一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如，β股)的區域。在一些實施例中，ORF1分子包含有包含圖48中所示之一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如，β股)的區，側接YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體(例如，如本文所描述)。
ORF1 果凍卷域中之保守二級結構模體在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如ORF1分子)包含指環病毒ORF1蛋白質(例如如本文所描述)所包含之一或多個二級結構元件。在一些實施例中，ORF1分子包含指環病毒ORF1蛋白質之果凍卷域所包含之一或多個二級結構元件(例如如本文所描述)。通常，ORF1果凍卷域包含二級結構，該二級結構按N端至C端方向之順序包含第一β股、第二β股、第一α螺旋、第三β股、第四β股、第五β股、第二α螺旋、第六β股、第七β股、第八β股及第九β股。在一些實施例中，ORF1分子包含二級結構，該二級結構按N端至C端方向之順序包含第一β股、第二β股、第一α螺旋、第三β股、第四β股、第五β股、第二α螺旋、第六β股、第七β股、第八β股及/或第九β股。
在一些實施例中，一對保守二級結構元件(亦即β股及/或α螺旋)由間隙胺基酸序列隔開，例如包含無規捲曲序列、β股或α螺旋或其組合。保守二級結構元件之間的間隙胺基酸序列可包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個胺基酸。在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含一或多個額外β股及/或α螺旋(例如在果凍卷域中)。在一些實施例中，可組合連續β股或連續α螺旋。在一些實施例中，第一β股及第二β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第三β股及第四β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第四β股及第五β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第六β股及第七β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第七β股及第八β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第八β股及第九β股包含於較大β股中。
在一些實施例中，第一β股之長度為約5-7個(例如，3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二β股之長度為約15-16個(例如13、14、15、16、17、18或19個)胺基酸。在一些實施例中，第一α螺旋之長度為約15-17個(例如13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸。在一些實施例中，第三β股之長度為約3-4個(例如1、2、3、4、5或6個)胺基酸。在一些實施例中，第四β股之長度為約10-11個(例如8、9、10、11、12或13個)胺基酸。在一些實施例中，第五β股之長度為約6-7個(例如4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二α螺旋之長度為約8-14個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個)胺基酸。在一些實施例中，第二α螺旋可分解為兩個較小α螺旋(例如由無規捲曲序列分隔開)。在一些實施例中，兩個較小α螺旋中之每一者之長度為約4-6個(例如2、3、4、5、6、7或8個)胺基酸。在一些實施例中，第六β股之長度為約4-5個(例如，2、3、4、5、6或7個)胺基酸。在一些實施例中，第七β股之長度為約5-6個(例如3、4、5、6、7、8或9個)胺基酸。在一些實施例中，第八β股之長度為約7-9個(例如5、6、7、8、9、10、11、12或13個)胺基酸。在一些實施例中，第九β股之長度為約5-7個(例如，3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。
例示性果凍卷域二級結構描述於實例47及圖47中。在一些實施例中，ORF1分子含有包含圖47中所示之任一果凍卷域二級結構之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如β股及/或α螺旋)的區域。
例示性 ORF1 及 VP1 序列在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如，ORF1或VP1分子)包含與例如如本文所描述之一或多個指環病毒ORF1或CAV VP1子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含ORF1或VP1分子，其包含與例如如本文所描述之一或多個指環病毒ORF1或CAV VP1子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之指環載體包含編碼ORF1或VP1分子之核酸分子(例如，遺傳元件)，該分子包含與例如如本文所描述之一或多個指環病毒ORF1或CAV VP1子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該一或多種指環病毒ORF1或CAV VP1子序列包含以下中之一或多者：富含精胺酸(Arg)域、果凍卷域、高變區(HVR)、N22域或C端域(CTD) (例如，如本文所列)或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，ORF1分子包含複數個來自不同指環病毒之子序列。在一些實施例中，ORF1或VP1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、N22域及來自一種指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒)之CTD及來自另一者之HVR。在一些實施例中，ORF1或VP1分子包含以下中之一或多者：果凍卷域、HVR、N22域及來自一種指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒)之CTD及來自另一者之富含Arg之域。在一些實施例中，ORF1或VP1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、HVR、N22域及來自一種指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒)之CTD及來自另一者之果凍卷域。在一些實施例中，ORF1或VP1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、HVR及來自一種指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒)之CTD及來自另一者之N22域。在一些實施例中，ORF1或VP1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、HVR、來自一種指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒)之N22域及來自另一者之CTD。
例示性指環病毒ORF1胺基酸序列及例示性ORF1域之序列提供於下表中。在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如，ORF1分子)包含與一或多個指環病毒ORF1子序列，例如如表P-Q)中之任一者中所描述之子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之指環載體包含ORF1分子，其包含與一或多個指環病毒ORF1子序列，例如如表P-Q中之任一者中所描述之子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之指環載體包含編碼ORF1分子之核酸分子(例如，遺傳元件)，該分子包含與一或多個指環病毒ORF1子序列，例如如表P-Q中之任一者中所描述之子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該一或多種指環病毒ORF1子序列包含以下中之一或多者：富含精胺酸(Arg)之域、果凍卷域、高變區(HVR)、N22域或C端域(CTD) (例如，如表P-Q中之任一者中所列出)或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，ORF1分子包含來自不同指環病毒之複數個子序列(例如，選自表P-Q中所列之甲型細環病毒進化枝1-7子序列的ORF1子序列之任何組合)。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種指環病毒之HVR。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：果凍卷域、HVR、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種指環病毒之富含Arg之域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、HVR、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種指環病毒之果凍卷域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、HVR及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種指環病毒之N22域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、HVR及來自一種指環病毒之N22域及來自另一種指環病毒之CTD。
在一些實施例中，該一或多種指環病毒ORF1子序列包含以下中之一或多者：富含精胺酸(Arg)之域、果凍卷域、高變區(HVR)、N22域或C端域(CTD)，如PCT公開案第WO2020/123816號中所描述(以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，該一或多種CAV VP1子序列包含以下中之一或多者：富含精胺酸(Arg)之域或果凍卷域，如PCT申請案第PCT/US2021/057292號中所描述(以全文引用之方式併入本文中)。
表 P. 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 ( 乙型細環病毒 )
名稱 Ring2
屬/分支 乙型細環病毒
登錄號 JX134045.1
蛋白質登錄號 AGG91484.1   
全序列：666 AA      
  
註釋：
假定域 AA range
富含Arg之區域 1 - 38
果凍卷域 39 - 246
高變區 247 - 374
N22 375 - 537
 C端域 538 - 666
表 Q. 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 ( 乙型細環病毒 )
Ring2 ORF1 (乙型細環病毒)
富含Arg之區域 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR (SEQ ID NO: 216)
果凍卷域 PTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNT (SEQ ID NO: 217)
高變域 ISIQNRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNPRINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSLKSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAG (SEQ ID NO: 218)
N22 TMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFK (SEQ ID NO: 219)
C端域 WGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 220)
共有ORF1域序列  在一些實施例中，例如如本文所描述之ORF1分子包含果凍卷域、N22域及/或C端域(CTD)中之一或多者。在一些實施例中，果凍卷域包含具有如本文所描述之(例如，如表37A-37C中之任一者中所列)之果凍卷域共有序列的胺基酸序列。在一些實施例中，N22域包含具有如本文所描述之N22域共有序列的胺基酸序列(例如，如表37A-37C中之任一者中所列)。在一些實施例中，CTD域包含具有如本文所描述之(例如，如表37A-37C中之任一者中所列)之CTD域共有序列的胺基酸序列。在一些實施例中，呈型式「(X a-b )」的表37A-37C中之任一者中所列之胺基酸包含一系列連續胺基酸，其中該系列包含至少 a個且至多 b個胺基酸。在某些實施例中，該系列中之所有胺基酸均相同。在其他實施例中，該系列包含至少兩個(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個)不同胺基酸。
表 37A. 甲型細環病毒 ORF1 域共有序列
域 序列 SEQ ID NO:
果凍卷 LVLTQWQPNTVRRCYIRGYLPLIICGEN(X 0-3)TTSRNYATHSDDTIQKGPFGGGMSTTTFSLRVLYDEYQRFMNRWTYSNEDLDLARYLGCKFTFYRHPDXDFIVQYNTNPPFKDTKLTAPSIHP(X 1-5)GMLMLSKRKILIPSLKTRPKGKHYVKVRIGPPKLFEDKWYTQSDLCDVPLVXLYATAADLQHPFGSPQTDNPCVTFQVLGSXYNKHLSISP；    其中X=任何胺基酸。 227
N22 SNFEFPGAYTDITYNPLTDKGVGNMVWIQYLTKPDTIXDKTQS(X 0-3)KCLIEDLPLWAALYGYVDFCEKETGDSAIIXNXGRVLIRCPYTKPPLYDKT(X 0-4)NKGFVPYSTNFGNGKMPGGSGYVPIYWRARWYPTLFHQKEVLEDIVQSGPFAYKDEKPSTQLVMKYCFNFN；    其中X=任何胺基酸。 228
CTD WGGNPISQQVVRNPCKDSG(X 0-3)SGXGRQPRSVQVVDPKYMGPEYTFHSWDWRRGLFGEKAIKRMSEQPTDDEIFTGGXPKRPRRDPPTXQXPEE(X 1-4)QKESSSFR(X 2-14)PWESSSQEXESESQEEEE(X 0-30)EQTVQQQLRQQLREQRRLRVQLQLLFQQLLKT(X 0-4)QAGLHINPLLLSQA(X 0-40)*；    其中X=任何胺基酸。 229
表 37B. 乙型細環 病毒 ORF1 域共有序列
域 序列 SEQ ID NO:
果凍卷 LKQWQPSTIRKCKIKGYLPLFQCGKGRISNNYTQYKESIVPHHEPGGGGWSIQQFTLGALYEEHLKLRNWWTKSNDGLPLVRYLGCTIKLYRSEDTDYIVTYQRCYPMTATKLTYLSTQPSRMLMNKHKIIVPSKXT(X 1-4)NKKKKPYKKIFIKPPSQMQNKWYFQQDIANTPLLQLTXTACSLDRMYLSSDSISNNITFTSLNTNFFQNPNFQ；    其中X=任何胺基酸。 230
N22 (X 4-10)TPLYFECRYNPFKDKGTGNKVYLVSNN(X 1-8)TGWDPPTDPDLIIEGFPLWLLLWGWLDWQKKLGKIQNIDTDYILVIQSXYYIPP(X 1-3)KLPYYVPLDXD(X 0-2)FLHGRSPY(X 3-16)PSDKQHWHPKVRFQXETINNIALTGPGTPKLPNQKSIQAHMKYKFYFK；    其中X=任何胺基酸。 231
CTD WGGCPAPMETITDPCKQPKYPIPNNLLQTTSLQXPTTPIETYLYKFDERRGLLTKKAAKRIKKDXTTETTLFTDTGXXTSTTLPTXXQTETTQEEXTSEEE(X 0-5)ETLLQQLQQLRRKQKQLRXRILQLLQLLXLL(X 0-26)*；    其中X=任何胺基酸。 232
表 37C. 丙型細環 病毒 ORF1 域共有序列
域 序列 SEQ ID NO:
果凍卷 TIPLKQWQPESIRKCKIKGYGTLVLGAEGRQFYCYTNEKDEYTPPKAPGGGGFGVELFSLEYLYEQWKARNNIWTKSNXYKDLCRYTGCKITFYRHPTTDFIVXYSRQPPFEIDKXTYMXXHPQXLLLRKHKKIILSKATNPKGKLKKKIKIKPPKQMLNKWFFQKQFAXYGLVQLQAAACBLRYPRLGCCNENRLITLYYLN；    其中X=任何胺基酸。 233
N22 LPIVVARYNPAXDTGKGNKXWLXSTLNGSXWAPPTTDKDLIIEGLPLWLALYGYWSYJKKVKKDKGILQSHMFVVKSPAIQPLXTATTQXTFYPXIDNSFIQGKXPYDEPJTXNQKKLWYPTLEHQQETINAIVESGPYVPKLDNQKNSTWELXYXYTFYFK；    其中X=任何胺基酸。 234
CTD WGGPQIPDQPVEDPKXQGTYPVPDTXQQTIQIXNPLKQKPETMFHDWDYRRGIITSTALKRMQENLETDSSFXSDSEETP(X 0-2)KKKKRLTXELPXPQEETEEIQSCLLSLCEESTCQEE(X 1-6)ENLQQLIHQQQQQQQQLKHNILKLLSDLKZKQRLLQLQTGILE(X 1-10)*；    其中X=任何胺基酸。 235
在一些實施例中，果凍卷域包含如表37A-37C中之任一者中所列之果凍卷域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，N22域包含如表37A-37C中之任一者中所列之N22域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CTD域包含如表37A-37C中之任一者中所列之CTD域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
鑑定 ORF1 或 VP1 蛋白序列在一些實施例中，ORF1或VP1蛋白質序列或編碼ORF1或VP1蛋白質之核酸序列可自指環病毒科家族病毒，例如指環病毒之基因體(例如，例如藉由核酸定序技術，例如深度定序技術所鑑別之假定指環病毒科家族病毒基因體)中鑑別。在一些實施例中，ORF1或VP1蛋白質序列係藉由以下選擇標準中之一或多者(例如，1、2或全部3者)鑑別： (i)長度選擇 ：蛋白質序列(例如，通過以下(ii)或(iii)中所描述之準則的假定ORF1或VP1序列)可對大於約600個胺基酸殘基的彼等進行大小選擇，以鑑別假定ORF1或VP1蛋白質。在一些實施例中，ORF1或VP1蛋白質序列長度為至少約600、650、700、750、800、850、900、950或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，甲型細環病毒屬ORF1蛋白質序列之長度為至少約700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，乙型細環病毒屬ORF1蛋白質序列之長度為至少約650、660、670、680、690、700、750、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，丙型細環病毒屬ORF1蛋白質序列之長度為至少約650、660、670、680、690、700、750、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，編碼ORF1或VP1蛋白質之核酸序列的長度為至少約1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500個核苷酸。在一些實施例中，編碼甲型細環病毒屬ORF1蛋白質序列之核酸序列的長度為至少約2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500個核苷酸。在一些實施例中，編碼乙型細環病毒屬ORF1蛋白質序列之核酸序列的長度為至少約1900、1950、2000、2500、2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500或1000個核苷酸。在一些實施例中，編碼丙型細環病毒屬ORF1蛋白質序列之核酸序列的長度為至少約1900、1950、2000、2500、2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500或1000個核苷酸。 (ii) ORF1 模體之存在 ：蛋白質序列(例如，符合以上(i)或以下(iii)中所描述之準則的假定ORF1或VP1序列)可經過濾以鑑別在上文所描述之N22域中含有保守ORF1模體之彼等。在一些實施例中，假定指環病毒ORF1序列包含序列YNPXXDXGXXN。在一些實施例中，假定指環病毒ORF1序列包含序列Y[NCS]PXXDX[GASKR]XX[NTSVAK]。 (iii)富含精胺酸之區域之存在：蛋白質序列(例如，符合以上(i)及/或(ii)中所描述之準則的假定ORF1或VP1序列)可對於包括富含精胺酸之區域(例如，如本文所描述)之彼等進行過濾。在一些實施例中，假定ORF1或VP1序列包含至少約30、35、40、45、50、55、60、65或70個胺基酸之連續序列，該連續序列包含至少30% (例如，至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)精胺酸殘基。在一些實施例中，假定ORF1或VP1序列包含約35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65或65-70個胺基酸之連續序列，該連續序列包含至少30% (例如，至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)精胺酸殘基。在一些實施例中，富含精胺酸之區域位於假定ORF1或VP1蛋白質之起始密碼子下游至少約30、40、50、60、70或80個胺基酸處。在一些實施例中，富含精胺酸之區域位於假定ORF1或VP1蛋白之起始密碼子下游至少約50個胺基酸處。
在一些實施例中，在如PCT公開案第WO2020/123816號(以全文引用的方式併入本文中)之實例36中所描述之指環病毒基因體序列中鑑別ORF1蛋白質。
ORF2 或 VP2 分子在一些實施例中，指環載體包含ORF2或VP2分子及/或編碼ORF2或VP2分子之核酸。通常，ORF2或VP2分子包含具有指環病毒ORF2蛋白質(例如，如本文所描述之指環病毒ORF2蛋白質，例如如表A1或A2中所列出)或CAV VP2蛋白質(例如，如本文所描述之CAV VP2蛋白質，例如如表A3中所列出)或其功能片段之結構特點及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF2或VP2分子包含與如表A1-A3中所示之指環病毒ORF2蛋白質或CAV蛋白質序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2分子由ORF2核酸編碼。在一些實施例中，ORF2核酸包含反義股，該反義股可經直接轉錄以產生編碼ORF2分子的mRNA。在一些實施例中，ORF2核酸包含有義股。
在一些實施例中，ORF2分子包含與甲型細環病毒、乙型細環病毒或丙型細環病毒ORF2蛋白質具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2或VP2分子(例如與甲型細環病毒ORF2蛋白質具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為250個或更少胺基酸(例如約150-200個胺基酸)。在一些實施例中，ORF2分子(例如與乙型細環病毒ORF2蛋白質具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為約50-150個胺基酸。在一些實施例中，ORF2或VP2分子(例如與丙型細環病毒ORF2蛋白質具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為約100-200個胺基酸(例如約100-150個胺基酸)。在一些實施例中，ORF2或VP2分子包含螺旋-轉角-螺旋模體(例如包含兩個側接轉角區之α螺旋的螺旋-轉角-螺旋模體)。在一些實施例中，ORF2分子不包含TTV分離株TA278或TTV分離株SANBAN之ORF2蛋白質的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2或VP2分子具有蛋白質磷酸酶活性。在一些實施例中，ORF2或VP2分子包含相對於野生型ORF2或CAV蛋白質，例如如本文所描述(例如，如表A1-A3中所示)之至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)。
保守 ORF2 模體在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如ORF2分子)包含胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)，其中X n為任何n個胺基酸之連續序列。在實施例中，X 7指示任何七個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，X 3指示任何三個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，X 1指示任何單一胺基酸。在一些實施例中，X 5指示任何五個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，[W/F]可為色胺酸或苯丙胺酸。在一些實施例中，[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)包含於ORF2分子之N22域內，例如如本文所描述。在一些實施例中，本文所描述之遺傳元件包含編碼胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX5 H(SEQ ID NO: 949)之核酸序列(例如編碼ORF2分子之核酸序列，例如如本文所描述)，其中X n為任何n個胺基酸之連續序列。
遺傳元件在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含遺傳元件。在一些實施例中，遺傳元件具有以下特徵中之一或多者：與宿主細胞之基因體基本上不整合，為游離型核酸，為單股DNA，為環形，為約1至10 kb，存在於細胞核內，可與內源性蛋白結合，產生靶向宿主或靶細胞之基因、活性或功能的效應子，諸如多肽或核酸(例如RNA、iRNA、微小RNA)。在一個實施例中，遺傳元件為基本上非整合DNA。在一些實施例中，遺傳元件包含封裝信號，例如結合衣殼蛋白之序列。在一些實施例中，在封裝或衣殼結合序列外，遺傳元件與野生型指環病毒或CAV核酸序列具有低於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%序列一致性，例如與例如如本文所描述之指環病毒或CAV核酸序列具有低於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%序列一致性。在一些實施例中，在封裝或衣殼結合序列外，遺傳元件具有與指環病毒或CAV核酸序列具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的低於500、450、400、350、300、250、200、150或100個連續核苷酸。在某些實施例中，遺傳元件為環形單股DNA，其包含啟動子序列、編碼治療效應子之序列及衣殼結合蛋白。
在一些實施例中，遺傳元件與例如如本文所描述(例如，如表N1-N4中之任一者中所描述)之指環病毒或CAV核酸序列或其片段具有至少約70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，或編碼與指環病毒或CAV胺基酸序列(例如，如表A1-A3中之任一者中所描述)或其片段具有至少約70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該遺傳元件包含編碼效應子(例如，內源性效應子或外源性效應子，例如有效負載)，例如多肽效應子(例如，蛋白質)或核酸效應子(例如，非編碼RNA，例如miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA、gRNA)的序列。
在一些實施例中，遺傳元件之長度為低於20 kb (例如小於約19 kb、18 kb、17 kb、16 kb、15 kb、14 kb、13 kb、12 kb、11 kb、10 kb、9 kb、8 kb、7 kb、6 kb、5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb或更低)。在一些實施例中，遺傳元件之長度獨立地或另外大於1000b (例如，至少約1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.5-4.6、2.8-4.0、3.0-3.8或3.2-3.7 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約1.5-2.0 kb、1.5-2.5 kb、1.5-3.0 kb、1.5-3.5 kb、1.5-3.8 kb、1.5-3.9 kb、1.5-4.0 kb、1.5-4.5 kb或1.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.0-2.5、2.0-3.0、2.0-3.5、2.0-3.8、2.0-3.9、2.0-4.0、2.0-4.5或2.0-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.5-3.0 kb、2.5-3.5 kb、2.5-3.8 kb、2.5-3.9 kb、2.5-4.0 kb、2.5-4.5 kb或2.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約3.0-5.0、3.5-5.0、4.0-5.0或4.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約1.5-2.0 kb、2.0-2.5 kb、2.5-3.0 kb、3.0-3.5 kb、3.1-3.6 kb、3.2-3.7 kb、3.3-3.8 kb、3.4-3.9 kb、3.5-4.0 kb、4.0-4.5 kb或4.5-5.0 kb。
在一些實施例中，遺傳元件包含本文所描述之特徵中之一或多者，例如編碼實質上非病原性蛋白質之序列、蛋白質結合序列、編碼調控性核酸之一或多個序列、一或多個調控性序列、編碼複製蛋白之一或多個序列及其他序列。在一些實施例中，實質上非致病性蛋白質包含胺基酸序列或其功能片段或與本文所描述之胺基酸序列中之任一者，指環病毒或CAV胺基酸序列，例如如表A1-A3中之任一者中所列出之序列具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，遺傳元件由雙股環狀DNA產生(例如由活體外環化產生)。在一些實施例中，遺傳元件藉由自雙股環形DNA滾環複製而產生。在一些實施例中，滾環複製發生在細胞(例如宿主細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞，例如HEK293T細胞、A549細胞或Jurkat細胞)中。在一些實施例中，遺傳元件可藉由細胞中之滾環複製以指數方式擴增。在一些實施例中，遺傳元件可藉由細胞中之滾環複製以線性方式擴增。在一些實施例中，雙股環狀DNA或遺傳元件能夠藉由細胞中之滾環複製產生原始量的至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、518倍、1024倍或更多倍。在一些實施例中，將雙股環狀DNA引入至細胞中，例如如本文所描述。
在一些實施例中，雙股環形DNA及/或遺傳元件不包含一或多個細菌質體元件(例如細菌複製起點或可選標記物，例如細菌抗性基因)。在一些實施例中，雙股環形DNA及/或遺傳元件不包含細菌質體主鏈。
在一個實施例中，本發明包括一種遺傳元件，其包含編碼以下各者之核酸序列(例如DNA序列)：(i)實質上非致病性外部蛋白質；(ii)將遺傳元件結合至實質上非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列；及(iii)調節核酸。在此類實施例中，遺傳元件可包含一或多個與核苷酸序列中之任一者至原生病毒序列(例如，原生指環病毒或CAV序列，例如如本文所描述)具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所描述之遺傳元件包含如PCT公開案第WO2020/123816號(以全文引用的方式併入本文中)之表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1-B5、1、3、5、7、9、11、13、15或17中之任一者中所列出之序列(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區序列)，或尤其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性之序列。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼效應子(例如，外源性效應子)之序列。在一些實施例中，編碼效應子之序列被插入至指環病毒或CAV基因體序列(例如，如本文所描述)中。在一些實施例中，編碼效應子之序列替換來自指環病毒或CAV基因體序列之連續序列(例如，具有至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多個核苷酸)。在一些實施例中，編碼效應子之序列替換TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區序列，或其一部分(例如，由至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多個核苷酸組成之一部分)，例如如PCT公開案第WO2020/123816號(以全文引用的方式併入本文中)之表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1-B5、1、3、5、7、9、11、13、15或17中之任一者中所列出之序列，或與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性之序列。
在一些實施例中，包含於遺傳元件(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區)中之第一核酸元件的序列與第二核酸元件(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區)之序列重疊，例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400或500個核苷酸。在一些實施例中，包含於遺傳元件(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區)中之第一核酸元件的序列與第二核酸元件(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區)之序列重疊。
蛋白質結合序列 許多病毒採用之策略為病毒衣殼蛋白識別其基因體中之特異性蛋白質結合序列。舉例而言，在具有未分段基因體之病毒(諸如酵母之L-A病毒)中，在基因體之5'端處存在二級結構(莖-環)及特定序列，兩者均用於結合病毒衣殼蛋白。然而，具有分段基因體之病毒，諸如呼腸孤病毒科(Reoviridae)、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae) (流感)、布尼亞病毒(Bunyavirus)及沙粒狀病毒(Arenavirus)需要包裝基因體區段中之每一者。一些病毒利用區段之互補區以幫助病毒包括各基因體分子中之一者。其他病毒對不同區段中之每一者具有特異性結合位點。參見例如Curr Opin Struct Biol. 2010年2月; 20(1): 114-120；及Journal of Virology (2003), 77(24), 13036-13041。
在一些實施例中，遺傳元件編碼結合至實質上非病原性蛋白質之蛋白質結合序列。在一些實施例中，蛋白質結合序列有助於將遺傳元件封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，蛋白質結合序列特異性結合基本上非病原性蛋白質之富含精胺酸之區。在一些實施例中，遺傳元件包含如實例8中所描述之蛋白質結合序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與指環病毒或CAV序列(例如，如表N1-N4中之任一者中所示)之5'UTR保守域或富含GC之域具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的蛋白質結合序列。
在實施例中，蛋白質結合序列與表N1-N4中之任一者之指環病毒或CAV 5'UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
5'UTR 區域 在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白結合序列)包含與表38及/或圖20中所示之核酸序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含表38中所示之共有5' UTR序列的核酸序列，其中X 1、X 2、X 3、X 4及X 5各自獨立地為任何核苷酸，例如其中X 1=G或T，X 2=C或A，X 3=G或A，X 4=T或C，且X 5=A、C或T)。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白結合序列)包含與表38中所示之共有5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之例示性TTV 5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-CT30F 5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-HD23a 5' UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-JA20 5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-TJN02 5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-tth8 5' UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之甲型細環病毒共有5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之甲型細環病毒分枝系1 5'UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之甲型細環病毒分枝系2 5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之甲型細環病毒分枝系3 5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之甲型細環病毒分枝系4 5'UTR序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之甲型細環病毒分枝系5 5'UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之甲型細環病毒分枝系6 5'UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之甲型細環病毒分枝系7 5'UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件包含與表N1-N4中之任一者之指環病毒或CAV 5'UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。 表 38. 來自指環病毒之例示性 5'UTR 序列
源 序列 SEQ ID NO:
共有 CGGGTGCCGX 1AGGTGAGTTTACACACCGX 2AGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCX 3GGACTGGCCGGGCX 4X 5TGGG X 1= G或T X 2= C或A X 3= G或A X 4= T或C X 5= A、C或T 105
例示性TTV序列 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTWTGGG 106
TTV-CT30F CGGGTGCCGTAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 107
TTV-HD23a CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCTGGG 108
TTV-JA20 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTTTGGG 109
TTV-TJN02 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 110
TTV-tth8 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCAGGACTGGCCGGGCTTTGGG 111
甲型細環病毒 共有5' UTR CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGC X 1X 2TGGG；其中X 1包含T或C，且其中X 2包含A、C或T。 112
甲型細環病毒 分枝系1 5' UTR (例如，TTV-CT30F) CGGGTGCCGTAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 113
甲型細環病毒 分枝系2 5' UTR (例如，TTV-P13-1) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCGGG 114
甲型細環病毒 分枝系3 5' UTR (例如，TTV-tth8) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCAGGACTGGCCGGGCTTTGGG 115
甲型細環病毒 分枝系4 5' UTR (例如，TTV-HD20a) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGAGGCCGGGCCATGGG 116
甲型細環病毒 分枝系5 5' UTR (例如，TTV-16) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCCGGG 117
甲型細環病毒 分枝系6 5' UTR (例如，TTV-TJN02) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 118
甲型細環病毒 分枝系7 5' UTR (例如，TTV-HD16d) CGGGTGCCGAAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 119
鑑別 5' UTR 序列在一些實施例中，指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) 5' UTR序列可在指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) (例如，例如藉由核酸定序技術，例如深度定序技術所鑑別之假定指環病毒科家族病毒基因體)之基因體內。在一些實施例中，指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) 5' UTR序列藉由以下步驟中之一者或兩者所鑑別： (i) (i) 鑑別環化接合點 ：在一些實施例中，5'UTR將位於全長環化指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體之環化接合點附近。可例如藉由鑑別序列之重疊區來鑑別環化接合點。在一些實施例中，序列之重疊區可自序列中修整，以產生已經環化之全長指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體序列。在一些實施例中，基因體序列以此方式使用軟體環化。不希望受理論所束縛，計算環化基因體可使得序列之起始位置在非生物中定向。序列內之地標可用於在恰當方向上重新定向序列。舉例而言，標誌序列可包括與如本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體內之一或多個元件具有實質性同源性的序列(例如，例如如本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)之TATA盒、加帽位點、起始子元件、轉錄起始位點、5'UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開讀框區域、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者)。 (ii) 5 ' UTR 序列之鑑別 ：一旦已獲得假定指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體序列，則可將序列(或其部分，例如長度在約40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100個核苷酸之間)與一或多個指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) 5' UTR序列(例如，如本文所描述)進行比較，以鑑別與其具有實質性同源性的序列。在一些實施例中，假定指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) 5' UTR區域與如本文所描述之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV) 5'UTR序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
富含 GC 之區 在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白結合序列)包含與表39及/或圖20及32中之任一者中所示之核酸序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之富含GC之序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之36個核苷酸之GC富集序列(例如，36個核苷酸之共有富含GC之區序列1、36個核苷酸之共有富含GC之區序列2、TTV分枝系1 36個核苷酸之區、TTV分枝系3 36個核苷酸之區、TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區、TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區、TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區、TTV分枝系5 36個核苷酸之區、TTV分枝系6 36個核苷酸之區或TTV分枝系7 36個核苷酸之區)具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含一核酸序列，該核酸序列包含具有如表39中所示之36個核苷酸之GC富集序列(例如36個核苷酸之共有富含GC之區序列1、36個核苷酸之共有富含GC之區序列2、TTV分枝系1 36個核苷酸之區、TTV分枝系3 36個核苷酸之區、TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區、TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區、TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區、TTV分枝系5 36個核苷酸之區、TTV分枝系6 36個核苷酸之區或TTV分枝系7 36個核苷酸之區)的至少10、15、20、25、30、31、32、33、34、35或36個連續核苷酸。
在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與甲型細環病毒富含GC之區序列具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列，該甲型細環病毒富含GC之區序列例如選自TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02或TTV-HD16d，例如如表39中所列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含核酸序列，該核酸序列包含具有甲型細環病毒富含GC之區序列之至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、104、105、108、110、111、115、120、122、130、140、145、150、155或156個連續核苷酸，該甲型細環病毒富含GC之區序列例如選自TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02或TTV-HD16d，例如如表39中所列。
在一些實施例中，36個核苷酸之GC富集序列係選自： (i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160)， (ii) GCGCTX 1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 164)，其中X 1係選自T、G或A； (iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG (SEQ ID NO: 165)； (iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG (SEQ ID NO: 166)； (v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT (SEQ ID NO: 167)； (vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC (SEQ ID NO: 168)； (vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 169)； (viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 170)； (ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 171)；或 (x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC (SEQ ID NO: 172).
在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含核酸序列CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160).
在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含具有表39中所示之共有GC富集序列的核酸序列，其中X 1、X 4、X 5、X 6、X 7、X 12、X 13、X 14、X 15、X 20、X 21、X 22、X 26、X 29、X 30及X 33各自獨立地為任何核苷酸，且其中X 2、X 3、X 8、X 9、X 10、X 11、X 16、X 17、X 18、X 19、X 23、X 24、X 25、X 27、X 28、X 31、X 32及X 34各自獨立地不存在或為任何核苷酸。在一些實施例中，X 1至X 34中之一或多者(例如全部)各自獨立地為表39中所指定之核苷酸(或不存在)。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3或其任何組合，例如依序片段1-3)具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-CT30F富含GC之序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何組合，例如依序片段1-7)具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-HD23a GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6或其任何組合，例如依序片段1-6)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-JA20 GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2或其任何組合，例如依序片段1及片段2)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-TJN02 GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何組合，例如依序片段1-8)具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-tth8富含GC之序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8、片段9或其任何組合，例如依序片段1-6)具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段7具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段8具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段9具有至少約75% (例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。
表 39. 來自指環病毒之例示性富含 GC 之序列
源 序列 SEQ ID NO:
共有 CGGCGGX 1GGX 2GX 3X 4X 5CGCGCTX 6CGCGCGCX 7X 8X 9X 10CX 11X 12X 13X 14GGGGX 15X 16X 17X 18X 19X 20X 21GCX 22X 23X 24X 25CCCCCCCX 26CGCGCATX 27X 28GCX 29CGGGX 30CCCCCCCCCX 31X 32X 33GGGGGGCTCCGX 34CCCCCCGGCCCCCC    X 1= G或C X 2= G、C或不存在 X 3= C或不存在 X 4= G或C X 5= G或C X 6= T、G或A X 7= G或C X 8= G或不存在 X 9= C或不存在 X 10= C或不存在 X 11= G、A或不存在 X 12= G或C X 13= C或T X 14= G或A X 15= G或A X 16= A、G、T或不存在 X 17= G、C或不存在 X 18= G、C或不存在 X 19= C、A或不存在 X 20= C或A X 21= T或A X 22= G或C X 23= G、T或不存在 X 24= C或不存在 X 25= G、C或不存在 X 26= G或C X 27= G或不存在 X 28= C或不存在 X 29= G或A X 30= G或T X 31= C、T或不存在 X 32= G、C、A或不存在 X 33= G或C X 34= C或不存在 120
例示性TTV序列 完整序列 GCCGCCGCGGCGGCGGSGGNGNSGCGCGCTDCGCGCGCSNNNCRCCRGGGGGNNNNCWGCSNCNCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGKCCCCCCCCCNNCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 121
片段1 GCCGCCGCGGCGGCGGSGGNGNSGCGCGCTDCGCGCGCSNNNCRCCRGGGGGNNNNCWGCSNCNCCCCCCCCCGCGCAT 122
片段2 GCGCGGGKCCCCCCCCCNNCGGGGGGCTCCG 123
片段3 CCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 124
TTV-CT30F 完整序列 GCGGCGG-GGGGGCG-GCCGCG-TTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTG--CTGCG-CGCCCCCCCCCGCGCAT  GCGCGGGGCCCCCCCCC—GGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 125
片段1 GCGGCGG 126
片段2 GGGGGCG 127
片段3 GCCGCG 128
片段4 TTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTG 129
片段5 CTGCG 130
片段6 CGCCCCCCCCCGCGCAT 131
片段7 GCGCGGGGCCCCCCCCC 132
片段8 GGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 133
TTV-HD23a 完整序列 CGGCGGCGGCGGCG-CGCGCGCTGCGCGCGCG---CGCCGGGGGGGCGCCAGCG-CCCCCCCCCCCGCGCAT  GCACGGGTCCCCCCCCCCACGGGGGGCTCCG CCCCCCGGCCCCCCCCC 134
片段1 CGGCGGCGGCGGCG 135
片段2 CGCGCGCTGCGCGCGCG 136
片段3 CGCCGGGGGGGCGCCAGCG 137
片段4 CCCCCCCCCCCGCGCAT 138
片段5 GCACGGGTCCCCCCCCCCACGGGGGGCTCCG 139
片段6 CCCCCCGGCCCCCCCCC 140
TTV-JA20 完整序列 CCGTCGGCGGGGGGGCCGCGCGCTGCGCGCGCGGCCC-CCGGGGGAGGCACAGCCTCCCCCCCCCGCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCTCCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCC 141
片段1 CCGTCGGCGGGGGGGCCGCGCGCTGCGCGCGCGGCCC 142
片段2 CCGGGGGAGGCACAGCCTCCCCCCCCCGCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCTCCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCC 143
TTV-TJN02 完整序列 CGGCGGCGGCG-CGCGCGCTACGCGCGCG---CGCCGGGGGG----CTGCCGC-CCCCCCCCCGCGCAT  GCGCGGGGCCCCCCCCC-GCGGGGGGCTCCG  CCCCCCGGCCCCCC 144
片段1 CGGCGGCGGCG 145
片段2 CGCGCGCTACGCGCGCG 146
片段3 CGCCGGGGGG 147
片段4 CTGCCGC 148
片段5 CCCCCCCCCGCGCAT 149
片段6 GCGCGGGGCCCCCCCCC 150
片段7 GCGGGGGGCTCCG  151
片段8 CCCCCCGGCCCCCC 152
TTV-tth8 完整序列 GCCGCCGCGGCGGCGGGGG-GCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCG---CCCCCCCCCGCGCAT  GCGCGGGGCCCCCCCCC-GCGGGGGGCTCCG CCCCCCGGCCCCCCCCG 153
片段1 GCCGCCGCGGCGGCGGGGG 154
片段2 GCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCG 155
片段3 CCCCCCCCCGCGCAT 156
片段4 GCGCGGGGCCCCCCCCC 157
片段5 GCGGGGGGCTCCG 158
片段6 CCCCCCGGCCCCCCCCG 159
片段7 CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC 160
片段8 CCGCCATCTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGG 161
片段9 CTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGGACAATTTCTTCCGGGTCAAAGGTTACAGCCGCCATGTTAAAACACGTGACGTATGACGTCACGGCCGCCATTTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCC 162
額外富含GC之序列(如圖32中所示) 36個核苷酸之共有富含GC之區序列1 CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC 163
36個核苷酸之區共有序列2 GCGCTX 1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC，其中X 1選自T、G或A 164
TTV分枝系1 36個核苷酸之區 GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG 165
TTV進化枝3 36個核苷酸之區域 GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG 166
 TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區 GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT 167
 TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區 GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC 168
 TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區 GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC 169
TTV分枝系5 36個核苷酸之區 GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC 170
TTV分枝系6 36個核苷酸之區 GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC 171
TTV分枝系7 36個核苷酸之區 GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC 172
額外甲型細環病毒屬富含GC之區序列 TTV-CT30F GCGGCGGGGGGGCGGCCGCGTTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTGCTGCGCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 801
TTV-P13-1 CCGAGCGTTAGCGAGGAGTGCGACCCTACCCCCTGGGCCCACTTCTTCGGAGCCGCGCGCTACGCCTTCGGCTGCGCGCGGCACCTCAGACCCCCGCTCGTGCTGACACGCTTGCGCGTGTCAGACCACTTCGGGCTCGCGGGGGTCGGG 802
TTV-tth8 GCCGCCGCGGCGGCGGGGGGCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCG 803
TTV-HD20a CGGCCCAGCGGCGGCGCGCGCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGTCCCCCCCCG 804
TTV-16 CGGCCGTGCGGCGGCGCGCGCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGCTGCCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCCCCG 805
TTV-TJN02 CGGCGGCGGCGCGCGCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCCGCCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCC 806
TTV-HD16d GGCGGCGGCGCGCGCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGAGCTCTGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGTCCCCCCCCCG 807
在一些實施例中，遺傳元件包含與表N1-N4中之任一者之指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)富含GC之核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
效應子 在一些實施例中，遺傳元件可包括一或多個編碼效應子，例如功能性效應子，例如內源性效應子或外源性效應子，例如治療多肽或核酸，例如細胞毒性或細胞溶解RNA或蛋白質的序列。在一些實施例中，功能性核酸為非編碼RNA。在一些實施例中，功能性核酸為編碼RNA。效應子可調節生物活性，例如增加或減少酶活性、基因表現、細胞傳訊及細胞或器官功能。效應子活性亦可包括結合調節蛋白以調節調節子之活性，諸如轉錄或轉譯。效應子活性亦可包括活化子或抑制子功能。舉例而言，效應子可藉由觸發酶中受質親和力的增加來誘導酶活性，例如果糖2,6-雙磷酸活化磷酸果糖激酶1且增加回應於胰島素之糖酵解速率。在另一實例中，效應子可抑制受質與受體結合且抑制其活化，例如納曲酮(naltrexone)及納洛酮(naloxone)在不活化類鴉片受體之情況下結合類鴉片受體且阻斷受體結合類鴉片之能力。效應子活性亦可包括調節蛋白質穩定性/降解及/或轉錄物穩定性/降解。舉例而言，蛋白質可經靶向以藉由多肽輔因子泛素降解至蛋白質上，以標記蛋白質用於降解。在另一實例中，效應子藉由阻斷酶活性位點來抑制酶活性，例如甲胺喋呤為四氫葉酸之結構類似物，該四氫葉酸為酶二氫葉酸還原酶之輔酶，與二氫葉酸還原酶之結合比天然受質更緊密1000倍，且抑制核苷酸鹼基合成。
在一些實施例中，編碼效應子之序列為遺傳元件之一部分，例如其可插入如實例10、12或22中所描述之插入位點。在一些實施例中，編碼效應子之序列在非編碼區處插入至遺傳元件中，例如安置於遺傳元件之開讀框之3'及富含GC之區之5'的非編碼區、在TATA盒上游之5'非編碼區中、在5' UTR中、在聚A訊號下游之3'非編碼區中或在富含GC之區上游。在一些實施例中，編碼效應子之序列在例如如本文所描述之TTV-tth8質體之約核苷酸3588處，或在例如如本文所描述之TTMV-LY2質體之約核苷酸2843處插入至遺傳元件中。在一些實施例中，編碼效應子之序列在例如如本文所描述之TTV-tth8質體之核苷酸336-3015處或其內，或在例如如本文所描述之TTMV-LY2質體之核苷酸242-2812處或其內插入至遺傳元件中。在一些實施例中，編碼效應子之序列替代開讀框之部分或全部(例如，如本文所描述之ORF或VP1，例如如表A1-A3或N1-N4中所示之ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)。
在一些實施例中，編碼效應子之序列包含100-2000、100-1000、100-500、100-200、200-2000、200-1000、200-500、500-1000、500-2000或1000-2000個核苷酸。在一些實施例中，效應子係例如如實例11中所描述之核酸或蛋白質有效負載。
調節核酸在一些實施例中，效應子為調節核酸。調節核酸修飾內源基因及/或外源基因之表現。在一個實施例中，調節核酸靶向宿主基因。調節核酸可包括(但不限於)與內源性基因雜交之核酸(例如本文其他地方所描述之miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA、gRNA)、與諸如病毒DNA或RNA之外源性核酸雜交之核酸、與RNA雜交之核酸、干擾基因轉錄之核酸、干擾RNA轉譯之核酸、使RNA穩定或使RNA不穩定諸如經由靶向降解之核酸及調節DNA或RNA結合因子之核酸。在一些實施例中，調節核酸編碼miRNA。
在一些實施例中，調節核酸包含通常含有5-500個鹼基對之RNA或RNA樣結構(視特定RNA結構而定，例如miRNA 5-30 bp、lncRNA 200-500 bp)，且可具有與細胞內表現之目標基因中之編碼序列或編碼細胞內表現之目標基因之序列一致(或互補)或幾乎一致(或實質上互補)的核鹼基序列。
在一些實施例中，調節核酸包含核酸序列，例如嚮導RNA (gRNA)。在一些實施例中，DNA靶向部分包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA之核酸。gRNA短合成RNA由與不完全效應部分結合所必需的「骨架」序列及使用者定義之基因體目標之約20個核苷酸靶向序列構成。實際上，嚮導RNA序列通常經設計以具有17-24個核苷酸(例如19、20或21個核苷酸)之間的長度且與靶向核酸序列互補。用於設計有效嚮導RNA的定製gRNA產生器及算法可市購。亦已使用嵌合「單嚮導RNA」(「sgRNA」)實現基因編輯，該單嚮導RNA為模擬天然存在之crRNA-tracrRNA複合物且含有tracrRNA (用於結合核酸酶)與至少一種crRNA (以將核酸酶導引至用於編輯的標靶序列)的經工程化(合成)之單一RNA分子。亦已證明經化學修飾之sgRNA在基因體編輯中有效；參見例如Hendel等人(2015) Nature Biotechnol., 985-991。
調控性核酸包含gRNA，其識別特異性DNA序列(例如鄰近於基因之啟動子、強化子、沉默子或抑制子或在基因之啟動子、強化子、沉默子或抑制子內之序列)。
某些調節核酸可經由RNA干擾(RNAi)之生物過程抑制基因表現。RNAi分子包含RNA或RNA樣結構，該等結構通常含有15-50個鹼基對(諸如約18-25個鹼基對)且具有與細胞內所表現之目標基因中之編碼序列一致(互補)或幾乎一致(大體上互補)的核鹼基序列。RNAi分子包括(但不限於)：短干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、部分雙螺旋體(meroduplex)及切丁酶(dicer)受質(美國專利第8,084,599號、第8,349,809號及第8,513,207號)。
長非編碼RNA (lncRNA)被定義為長於100個核苷酸之非蛋白質編碼轉錄物。此略微任意之限制將lncRNA與小調節RNA (諸如微小RNA (miRNA)、短干擾RNA (siRNA)及其他短RNA)區分開來。一般而言，大部分(約78%)之lncRNA表徵為組織特異性的。在與附近蛋白質編碼基因相反之方向上轉錄之發散lncRNA (佔哺乳動物基因體中總lncRNA之顯著比例約20%)可能調節附近基因之轉錄。
遺傳元件可編碼具有與內源基因或基因產物(例如mRNA)之全部或片段大體上互補或完全互補之序列的調節核酸。調節核酸可與內含子與外顯子之間的邊界處之序列互補，以防止特定基因之新產生的細胞核RNA轉錄物成熟為mRNA以便轉錄。與特定基因互補之調節核酸可與該基因之mRNA雜交且防止其轉譯。反義調節核酸可為DNA、RNA或其衍生物或混成物。
雜交至所關注轉錄物之調控性核酸之長度可為5至30個核苷酸、約10至30個核苷酸或約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個核苷酸。調節核酸與所靶向轉錄本之一致性程度應為至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
遺傳元件可編碼調控性核酸，例如與目標基因之約5至約25個連續核苷酸一致的微小RNA (miRNA)分子。在一些實施例中，miRNA序列靶向mRNA且以二核苷酸AA開始，包含約30-70% (約30-60%、約40-60%或約45-55%)之GC含量，且與欲引入之哺乳動物基因體中除目標以外之任何核苷酸序列不具有高比例一致性，例如以藉由標準BLAST搜尋所確定。
在一些實施例中，調節核酸為至少一個miRNA，例如2、3、4、5、6或更多個。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼與該核苷酸序列中之任一者至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序列一致性的miRNA的序列或與本文所描述之序列互補的序列。
siRNA及shRNA類似內源性微小RNA (miRNA)基因之加工路徑中之中間物(Bartel, Cell 116:281-297, 2004)。在一些實施例中，siRNA可充當miRNA且反之亦然(Zeng等人, Mol Cell 9:1327-1333, 2002；Doench等人, Genes Dev 17:438-442, 2003)。微小RNA，如siRNA一般，使用RISC下調目標基因，但不同於siRNA，大部分動物miRNA不使mRNA裂解。實際上，miRNA經由轉譯遏制或多聚A移除及mRNA降解來減少蛋白質輸出(Wu等人, Proc Natl Acad Sci USA 103:4034-4039, 2006)。已知miRNA結合位點在mRNA 3' UTR內；miRNA似乎靶向與來自miRNA 5'端之核苷酸2-8具有接近完美的互補性之位點(Rajewsky, Nat Genet 38 Suppl:S8-13, 2006; Lim等人., Nature 433:769-773, 2005)。此區稱為種子區。由於siRNA及miRNA為可互換的，因此外源性siRNA下調與siRNA具有種子互補性之mRNA(Birmingham等人, Nat Methods 3:199-204, 2006。3' UTR內之多個目標位點提供較強下調(Doench等人, Genes Dev 17:438-442, 2003)。
已知miRNA序列清單可見於研究組織所維護之資料庫中，尤其諸如Wellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center，及European Molecule Biology Laboratory。已知的有效siRNA序列及同源結合位點亦充分呈現於相關文獻中。RNAi分子容易藉由此項技術中已知之技術設計及產生。此外，存在增加發現有效及特定序列模體之機率的計算工具(Lagana等人, Methods Mol. Bio., 2015, 1269:393-412)。
調節核酸可調節由基因編碼之RNA的表現。因為多個基因可彼此共有一定程度之序列同源性，所以在一些實施例中，調節核酸可經設計以靶向具有足夠序列同源性之一類基因。在一些實施例中，調節核酸可含有與在不同基因目標中共有或特定基因目標所獨有之序列互補的序列。在一些實施例中，調節核酸可經設計以靶向在若干基因之間具有同源性之RNA序列的保守區，藉此靶向基因家族中之若干基因(例如不同基因同功型、剪接變異體、突變基因等)。在一些實施例中，調節核酸可經設計以靶向為單個基因之特定RNA序列所獨有的序列。
在一些實施例中，遺傳元件可包括一或多個編碼調節一或多個基因之表現之調節核酸的序列。
在一個實施例中，本文他處所描述之gRNA用作用於基因編輯之CRISPR系統的一部分。出於基因編輯之目的，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可經設計以包括與所需目標DNA序列對應之一或多個嚮導RNA序列；參見例如，Cong等人. (2013) Science, 339:819-823; Ran等人. (2013) Nature Protocols, 8:2281 – 2308。gRNA序列之至少約16或17個核苷酸通常允許發生Cas9介導之DNA裂解；對於Cpf1，需要gRNA序列之至少約16個核苷酸來實現可偵測DNA裂解。
治療效應子 ( 例如肽或多肽 )在一些實施例中，遺傳元件包含治療性表現序列，例如編碼治療性肽或多肽之序列，例如胞內肽或胞內多肽、分泌型多肽或蛋白質替代療法。在一些實施例中，遺傳元件包括編碼蛋白質(例如治療性蛋白質)之序列。治療性蛋白質之一些實例可包括(但不限於)激素、細胞介素、酶、抗體(例如編碼至少重鏈或輕鏈之一種或複數種多肽)、轉錄因子、受體(例如膜受體)、配位體、膜轉運體、分泌型蛋白質、肽、載體蛋白、結構蛋白、核酸酶或其組分。
在一些實施例中，遺傳元件包括編碼肽(例如治療性肽)之序列。肽可為線性的或分支的。肽之長度為約5至約500個胺基酸、約15至約400個胺基酸、約20至約325個胺基酸、約25至約250個胺基酸、約50至約200個胺基酸或其間的任何範圍。
在一些實施例中，由治療性表現序列編碼之多肽可為以上中之任一者之功能性變異體或其片段，例如與參照其UniProt ID揭露於本文之表中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%之一致性的蛋白質。
在一些實施例中，治療性表現序列可編碼結合以上中之任一者之抗體或抗體片段，例如針對與參照其UniProt ID揭露於本文之表中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%之一致性的蛋白質的抗體。術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。「抗體片段」係指包括至少一個重鏈或輕鏈且結合抗原之分子。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
例示性胞內多肽效應子  在一些實施例中，效應子包含細胞溶質多肽或細胞溶質肽。在一些實施例中，效應子包含細胞溶質肽，其為DPP-4抑制劑、GLP-1傳訊之活化劑或嗜中性球彈性蛋白酶之抑制劑。在一些實施例中，效應子增加生長因子或其受體(例如FGF受體，例如FGFR3)之含量或活性。在一些實施例中，效應子包含n-myc相互作用蛋白質活性之抑制劑(例如，n-myc相互作用蛋白質抑制劑)；EGFR活性之抑制劑(例如，EGFR抑制劑)；IDH1及/或IDH2活性之抑制劑(例如，IDH1抑制劑及/或IDH2抑制劑)；LRP5及/或DKK2活性之抑制劑(例如，LRP5及/或DKK2抑制劑)；KRAS活性之抑制劑；HTT活性之活化劑；或DPP-4活性之抑制劑(例如，DPP-4抑制劑)。
在一些實施例中，效應子包含調控性胞內多肽。在一些實施例中，調控性胞內多肽結合對於目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)。在一些實施例中，調節性胞內多肽增加對目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)之含量或活性。在一些實施例中，調節性胞內多肽減少對目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)之含量或活性。
在一些實施例中，效應子為抗細胞凋亡劑。在一些實施例中，效應子降低與指環病毒科家族載體接觸之細胞，例如癌細胞的細胞凋亡，例如藉由降低凋亡蛋白酶-3活性，例如降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。在一些實施例中，效應子降低與指環病毒科家族載體接觸之細胞，例如癌細胞的細胞凋亡，例如藉由降低凋亡蛋白酶-3活性，例如降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。在某些實施例中，效應子為miRNA，例如miR-625。
示例性分泌型多肽效應子  例示性分泌型治療劑描述於本文中，例如下表中。 表 50. 例示性細胞介素及細胞介素受體
細胞介素 細胞介素受體 Entrez 基因ID UniProt ID
IL-1α、IL-1β或其雜二聚體 IL-1 1型受體、IL-1 2型受體 3552、3553 P01583、P01584
IL-1Ra IL-1 1型受體、IL-1 2型受體 3454、3455 P17181、P48551
IL-2 IL-2R 3558 P60568
IL-3 IL-3受體α + β c (CD131) 3562 P08700
IL-4 IL-4R I型、IL-4R II型 3565 P05112
IL-5 IL-5R 3567 P05113
IL-6 IL-6R (sIL-6R) gp130 3569 P05231
IL-7 IL-7R及sIL-7R 3574 P13232
IL-8 CXCR1及CXCR2 3576 P10145
IL-9 IL-9R 3578 P15248
IL-10 IL-10R1/IL-10R2複合物 3586 P22301
IL-11 IL-11Rα 1 gp130 3589 P20809
IL-12 (例如p35、p40或其雜二聚體) IL-12Rβ1及IL-12Rβ2 3593、3592 P29459、P29460
IL-13 IL-13R1α1及IL-13R1α2 3596 P35225
IL-14 IL-14R 30685 P40222
IL-15 IL-15R 3600 P40933
IL-16 CD4 3603 Q14005
IL-17A IL-17RA 3605 Q16552
IL-17B IL-17RB 27190 Q9UHF5
IL-17C IL-17RA至IL-17RE 27189 Q9P0M4
IL-17E SEF 53342 Q8TAD2
IL-17F IL-17RA、IL-17RC 112744 Q96PD4
IL-18 IL-18受體 3606 Q14116
IL-19 IL-20R1/IL-20R2 29949 Q9UHD0
IL-20 L-20R1/IL-20R2及IL-22R1/ IL-20R2 50604 Q9NYY1
IL-21 IL-21R 59067 Q9HBE4
IL-22 IL-22R 50616 Q9GZX6
IL-23 (例如p19、p40或其雜二聚體) IL-23R 51561 Q9NPF7
IL-24 IL-20R1/IL-20R2及IL-22R1/ IL-20R2 11009 Q13007
IL-25 IL-17RA及IL-17RB 64806 Q9H293
IL-26 IL-10R2鏈及IL-20R1鏈 55801 Q9NPH9
IL-27 (例如，p28、EBI3或其雜二聚體) WSX-1及gp130 246778 Q8NEV9
IL-28A、IL-28B及IL29 IL-28R1/IL-10R2 282617、282618 Q8IZI9、Q8IU54
IL-30 IL6R/gp130 246778 Q8NEV9
IL-31 IL-31RA/OSMRβ 386653 Q6EBC2
IL-32    9235 P24001
IL-33 ST2 90865 O95760
IL-34 群落刺激因子1受體 146433 Q6ZMJ4
IL-35 (例如p35、EBI3或其雜二聚體) IL-12Rβ2/gp130；IL-12Rβ2/IL-12Rβ2；gp130/gp130 10148 Q14213
IL-36 IL-36Ra 27179 Q9UHA7
IL-37 IL-18Rα及IL-18BP 27178 Q9NZH6
IL-38 IL-1R1、IL-36R 84639 Q8WWZ1
IFN-α IFNAR 3454 P17181
IFN-β IFNAR 3454 P17181
IFN-γ IFNGR1/IFNGR2 3459 P15260
TGF-β TβR-I及TβR-II 7046、7048 P36897、P37173
TNF-α TNFR1、TNFR2 7132、7133 P19438、P20333
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含表50之細胞介素或其功能變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含與參考其UniProt ID在表50中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能性變異體以比在相同條件下相應野生型細胞介素對相同受體之Kd高或低不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至相應細胞介素受體。在一些實施例中，效應子包含融合蛋白質，其包含第一區域(例如表50之細胞介素多肽或其功能變異體或片段)及第二異源區域。在一些實施例中，第一區為表50之第一細胞介素多肽。在一些實施例中，第二區為表50之第二細胞介素多肽，其中第一及第二細胞介素多肽在野生型細胞中彼此形成細胞介素雜二聚體。在一些實施例中，表50之多肽或其功能變異體包含訊號序列，例如對效應子而言為內源性之訊號序列，或異源訊號序列。在一些實施例中，編碼表50之細胞介素的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其功能變異體用於治療本文所描述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含結合表50之細胞介素的抗體分子(例如，scFv)。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含結合表50之細胞介素受體的抗體分子(例如，scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含訊號序列。
例示性細胞介素及細胞介素受體描述於例如Akdis等人, 「Interleukins (from IL-1 to IL-38), interferons, transforming growth factor β, and TNF-α: Receptors, functions, and roles in diseases」 October 2016 第138卷, 第4期, 第984-1010頁中，其以全文引用之方式併入本文中，包括其中之表I。 表 51. 例示性多肽激素及受體
激素 受體 Entrez 基因ID UniProt ID
利尿鈉肽，例如心房利尿鈉肽(ANP) NPRA、NPRB、NPRC 4878 P01160
腦利尿鈉肽(BNP) NPRA、NPRB 4879 P16860
C型利尿鈉肽(CNP) NPRB 4880 P23582
生長激素(GH) GHR 2690 P10912
人類生長激素(hGH) hGH受體(人類GHR) 2690 P10912
促乳素(PRL) PRLR 5617 P01236
甲狀腺刺激激素(TSH) TSH受體 7253 P16473
促腎上腺皮質激素(ACTH) ACTH受體 5443 P01189
卵泡刺激激素(FSH) FSHR 2492 P23945
促黃體生成激素(LH) LHR 3973 P22888
抗利尿激素(ADH) 血管加壓素受體，例如V2；AVPR1A；AVPR1B；AVPR3；AVPR2 554 P30518
催產素 OXTR 5020 P01178
降鈣素 降鈣素受體(CT) 796 P01258
副甲狀腺激素(PTH) PTH1R及PTH2R 5741 P01270
胰島素 胰島素受體(IR) 3630 P01308
升糖素 升糖素受體 2641 P01275
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含表51之激素或其功能變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含與參考其UniProt ID在表51中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體以比在相同條件下相應野生型激素對相同受體之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至相應受體。在一些實施例中，表51之多肽或其功能變異體包含訊號序列，例如對效應子而言為內源性之訊號序列，或異源訊號序列。在一些實施例中，編碼表51之激素的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其功能變異體用於治療本文所描述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含結合表51之激素的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含結合表51之激素受體的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含訊號序列。 表 52 . 例示性生長因子
生長因子 Entrez 基因ID UniProt ID
PDGF家族
PDGF (例如，PDGF-1、PDGF-2或其雜二聚體) PDGF受體，例如PDGFRα、PDGFRβ 5156 P16234
CSF-1 CSF1R 1435 P09603
SCF CD117 3815 P10721
VEGF家族      
VEGF (例如同功型VEGF 121、VEGF 165、VEGF 189及VEGF 206) VEGFR-1、VEGFR-2 2321 P17948
VEGF-B VEGFR-1 2321 P17949
VEGF-C VEGFR-2及VEGFR -3 2324 P35916
PlGF VEGFR-1 5281 Q07326
EGF家族      
EGF EGFR 1950 P01133
TGF-α EGFR 7039 P01135
雙調蛋白 EGFR 374 P15514
HB-EGF EGFR 1839 Q99075
β細胞調節素 EGFR、ErbB-4 685 P35070
表皮調節素 EGFR、ErbB-4 2069 O14944
調蛋白 EGFR、ErbB-4 3084 Q02297
FGF家族      
FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9 FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4 2246、2247、2248、2249、2250、2251、2252、2253、2254 P05230、P09038、P11487、P08620、P12034、P10767、P21781、P55075、P31371
胰島素家族      
胰島素 IR 3630 P01308
IGF-I IGF-I受體、IGF-II受體 3479 P05019
IGF-II IGF-II受體 3481 P01344
HGF家族      
HGF MET受體 3082 P14210
MSP RON 4485 P26927
神經營養因子家族      
NGF LNGFR、trkA 4803 P01138
BDNF trkB 627 P23560
NT-3 trkA、trkB、trkC 4908 P20783
NT-4 trkA、trkB 4909 P34130
NT-5 trkA、trkB 4909 P34130
血管生成素家族      
ANGPT1 HPK-6/TEK 284 Q15389
ANGPT2 HPK-6/TEK 285 O15123
ANGPT3 HPK-6/TEK 9068 O95841
ANGPT4 HPK-6/TEK 51378 Q9Y264
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含表52之生長因子或其功能變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含與參考其UniProt ID在表52中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體以比在相同條件下相應野生型生長因子對相同受體之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至相應受體。在一些實施例中，表52之多肽或其功能變異體包含訊號序列，例如對效應子而言為內源性之訊號序列，或異源訊號序列。在一些實施例中，編碼表52之激素的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其功能變異體用於治療本文所描述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含結合表52之生長因子的抗體分子(例如，scFv)。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含結合表52之生長因子受體的抗體分子(例如，scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含訊號序列。
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含特異性結合至VEGF (例如，VEGF 121、VEGF 165、VEGF 189及/或VEGF 206)之多肽。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含抗VEGF抗體分子，例如特異性結合至一或多個(例如，1、2、3或所有4) VEGF 121、VEGF 165、VEGF 189及VEGF 206或其功能片段、變異體或衍生物之抗體分子。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含貝伐單抗或其功能片段、變異體或衍生物，或包含與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含蘭比珠單抗(ranibizumab)或其功能片段、變異體或衍生物，或包含與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含法瑞昔單抗(faricimab-svoa)或其功能片段、變異體或衍生物，或包含與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽(例如，用於治療黃斑變性，例如濕性AMD；及/或糖尿病黃斑水腫)。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含阿柏西普或其功能片段、變異體或衍生物，或包含與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含抗VEGF受體抗體分子。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含抗VEGFR1抗體分子。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含抗VEGFR2抗體分子。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含抗VEGFR3抗體分子。
例示性生長因子及生長因子受體描述於例如Bafico等人, 「Classification of Growth Factors and Their Receptors」 Holland-Frei Cancer Medicine. 第6版中，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，如本文所描述之效應子包含抗C4抗體分子或其功能片段、變異體或衍生物，或包含與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，如本文所描述之效應子包含抗C5抗體分子或其功能片段、變異體或衍生物，或包含與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。
在一些實施例中，如本文所描述之效應子包含ABCA4蛋白質(例如，人類ABCA4蛋白質)，或包含與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。在某些實施例中，效應子用於治療斯特格氏病。
在一些實施例中，如本文所描述之效應子包含RPGR蛋白質(例如，人類RPGR蛋白質)，或包含與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。在某些實施例中，效應子用於治療X性聯色素性視網膜炎(XLRP)。 表 53. 凝結 相關因子
效應子 適應症 Entrez 基因ID UniProt ID
因子I (血纖維蛋白原) 無纖維蛋白原血症 2243、2266、2244 P02671、P02679、P02675
因子II 因子II缺乏症 2147 P00734
因子IX B型血友病 2158 P00740
因子V 奧倫氏病(Owren's disease) 2153 P12259
因子VIII A型血友病 2157 P00451
因子X 斯圖亞特因子缺乏症 2159 P00742
凝血因子XI C型血友病 2160 P03951
因子XIII 纖維蛋白穩定因子缺乏症 2162、2165 P00488、P05160
vWF 馮威里氏病 7450 P04275
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含表53之多肽或其功能變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含與參考其UniProt ID在表53中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體催化與對應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，表53之多肽或其功能變異體包含訊號序列，例如對效應子而言為內源性之訊號序列，或異源訊號序列。在一些實施例中，編碼表53之多肽或其功能變異體的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於治療表53之疾病或病症。
例示性蛋白質置換治療劑  例示性蛋白質替代治療劑描述於本文中，例如下表中。 表 54. 例示性酶效應子及對應適應症
效應子 缺乏症 Entrez 基因ID UniProt ID
3-甲基巴豆醯-CoA羧化酶 3-甲基巴豆醯基-CoA羧化酶缺乏症 56922、64087 Q96RQ3、Q9HCC0
乙醯基-CoA-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo's syndrome)) III-C型 138050 Q68CP4
ADAMTS13 血栓性血小板減少性紫癲 11093 Q76LX8
腺嘌呤磷酸核糖轉移酶 腺嘌呤磷酸核糖轉移酶缺乏症 353 P07741
腺苷去胺酶 腺苷去胺酶缺乏症 100 P00813
ADP-核糖蛋白質水解酶 麩胺醯基核糖-5-磷酸貯積病 26119、54936 Q5SW96、Q9NX46
α葡糖苷酶 2型肝糖貯積病(龐貝氏病(Pompe's disease)) 2548 P10253
精胺酸酶 家族性高精胺酸血症 383、384 P05089、P78540
芳基硫酸酯酶A 異染性腦白質營養不良 410 P15289
組織蛋白酶K 密骨發育障礙 1513 P43235
神經醯胺酶 法伯氏病(Farber's disease) (脂肪肉芽腫病) 125981、340485、55331 Q8TDN7、Q5QJU3、Q9NUN7
胱硫醚B合成酶 高胱胺酸尿 875 P35520
多萜醇-P-甘露糖合成酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ie 8813、54344 O60762、Q9P2X0
多萜醇-P-Glc:Man9GlcNAc2-PP-多萜醇葡萄糖基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG Ic 84920 Q5BKT4
多萜醇-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-多萜醇甘露糖基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG Id 10195 Q92685
多萜醇基-P-葡萄糖:Glc-1-Man-9-GlcNAc-2-PP-多萜醇基-α-3-葡萄糖基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG Ih 79053 Q9BVK2
多萜醇基-P-甘露糖:Man-7-GlcNAc-2-PP-多萜醇基-α-6-甘露糖基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG Ig 79087 Q9BV10
因子II 因子II缺乏症 2147 P00734
因子IX B型血友病 2158 P00740
因子V 奧倫氏病 2153 P12259
因子VIII A型血友病 2157 P00451
因子X 斯圖亞特因子缺乏症 2159 P00742
凝血因子XI C型血友病 2160 P03951
因子XIII 纖維蛋白穩定因子缺乏症 2162、2165 P00488、P05160
半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶 黏多糖病MPS IV (莫奎歐氏症候群(Morquio's syndrome)) IV-A型 2588 P34059
半乳糖苷基神經醯胺β-半乳糖苷酶 克拉伯氏病(Krabbe's disease) 2581 P54803
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 全身性GM1神經節苷脂貯積病 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 GM2神經節苷脂貯積病 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 I型神經鞘脂貯積症 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 II型神經鞘脂貯積病(幼年型) 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 III型神經鞘脂貯積病(成人型) 2720 P16278
葡糖苷酶I 先天性N-醣基化障礙CDG IIb 2548 P10253
葡糖神經醯胺β-葡糖苷酶 高歇氏病(Gaucher's disease) 2629 P04062
乙醯肝素-S-硫酸酯硫酸醯胺酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群) III-A型 6448 P51688
尿黑酸氧化酶 黑尿症 3081 Q93099
玻尿酸酶 黏多糖病MPS IX (玻尿酸酶缺乏症) 3373、8692、8372、23553 Q12794、Q12891、O43820、Q2M3T9
艾杜糖醛硫酸酯硫酸酯酶 黏多糖病MPS II (亨特氏症候群(Hunter's syndrome)) 3423 P22304
卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(LCAT) 完全LCAT缺乏症、魚眼病、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症 3931 606967
離胺酸氧化酶 戊二酸血症第I型 4015 P28300
溶酶體酸性脂肪酶 膽甾醇酯貯積病(CESD) 3988 P38571
溶酶體酸性脂肪酶 溶酶體酸性脂肪酶缺乏症 3988 P38571
溶酶體酸性脂肪酶 沃爾曼氏病(Wolman's disease) 3988 P38571
溶酶體胃酶抑素不敏感性肽酶 幼兒型蠟樣脂褐質沈積症(CLN2，詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)) 1200 O14773
甘露糖(Man)磷酸酯(P)異構酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ib 4351 P34949
甘露糖基-α-1,6-醣蛋白-β-1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG IIa 4247 Q10469
金屬蛋白酶-2 溫徹斯特症候群(Winchester syndrome) 4313 P08253
甲基丙二醯基-CoA變位酶 甲基丙二酸血症(維生素b12無反應型) 4594 P22033
N-乙醯基半乳糖胺α-4-硫酸酯硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶B) 黏多糖病MPS VI (馬洛特-拉米症候群(Maroteaux-Lamy syndrome)) 411 P15848
N-乙醯基-D-胺基葡糖苷酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo's syndrome)) III-B型 4669 P54802
N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶 I型辛德勒氏病(Schindler's disease) (嬰兒嚴重型) 4668 P17050
N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶 II型辛德勒氏病(神琦病(Kanzaki disease)，成年發作型) 4668 P17050
N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶 III型辛德勒氏病(中間型) 4668 P17050
N-乙醯基-葡萄糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群) III-D型 2799 P15586
N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶 黏脂貯積症ML III (假賀勒氏多種營養不良(pseudo-Hurler's polydystrophy)) 79158 Q3T906
N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶催化次單元 黏脂貯積病ML II (I細胞病) 79158 Q3T906
N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶，受質識別次單元 黏脂貯積症ML III (假賀勒氏多種營養不良) III-C型 84572 Q9UJJ9
N-天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶 天冬胺醯葡萄糖胺尿症 175 P20933
神經胺糖酸苷酶1 (唾液酸酶) 唾液腺病 4758 Q99519
軟脂醯基-蛋白質硫酯酶-1 成人型蠟樣脂褐質沈積症(CLN4、庫夫斯病(Kufs'disease)) 5538 P50897
軟脂醯基-蛋白質硫酯酶-1 嬰兒型蠟樣脂褐質沈積症(CLN1，桑塔沃里-哈爾蒂亞病(Santavuori-Haltia disease)) 5538 P50897
苯丙胺酸羥化酶 苯酮尿症 5053 P00439
磷酸甘露糖酶-2 先天性N-糖基化障礙CDG Ia (僅神經及神經-多內臟型) 5373 O15305
膽色素原去胺酶 急性間歇卟啉症 3145 P08397
嘌呤核苷磷酸化酶 嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症 4860 P00491
嘧啶5'核苷酸酶 溶血性貧血及/或嘧啶5'核苷酸酶缺乏症 51251 Q9H0P0
神經磷脂酶 A型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease) 6609 P17405
神經磷脂酶 B型尼曼-匹克病 6609 P17405
固醇27-羥化酶 腦腱黃瘤病(膽甾醇脂沈積症) 1593 Q02318
胸苷磷酸化酶 粒線體神經胃腸道腦肌病(MNGIE) 1890 P19971
三己糖神經醯胺α-半乳糖苷酶 法布立氏病(Fabry's disease) 2717 P06280
酪胺酸酶，例如OCA1 白化病，例如眼白化病 7299 P14679
UDP-GlcNAc:多萜醇基-P NAcGlc磷酸轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ij 1798 Q9H3H5
UDP-N-乙醯基葡糖胺-2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶，唾液酸轉運蛋白(sialin) 法國型涎尿(Sialuria French type) 10020 Q9Y223
尿酸酶 萊尼症候群(Lesch-Nyhan syndrome)、痛風 391051 No protein
二磷酸尿苷葡萄糖醛酸轉移酶(例如UGT1A1) 克果-納傑氏症候群(Crigler-Najjar syndrome) 54658 P22309
α-1,2-甘露糖基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG Il (608776) 79796 Q9H6U8
α-1,2-甘露糖基轉移酶 I型先天性N-糖基化障礙(前高基體糖基化缺陷) 79796 Q9H6U8
α-1,3-甘露糖基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG Ii 440138 Q2TAA5
α-D-甘露糖苷酶 I型(重度)或II型(輕度) α-甘露糖苷貯積病 10195 Q92685
α-L-海藻糖苷酶 岩藻糖苷貯積症 4123 Q9NTJ4
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPS I H/S (賀勒-沙伊侯症群(Hurler-Scheie syndrome)) 2517 P04066
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPS I-H (賀勒氏症候群) 3425 P35475
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPS I-S (施艾氏症候群(Scheie's syndrome)) 3425 P35475
β-1,4-半乳糖苷基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG IId 3425 P35475
β-1,4-甘露糖基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG Ik 2683 P15291
β-D-甘露糖苷酶 β-甘露糖苷貯積症 56052 Q9BT22
β-半乳糖苷酶 黏多糖病MPS IV (莫奎歐氏症候群) IV-B型 4126 O00462
β-葡糖苷酸酶 黏多糖病MPS VII (斯利症候群(Sly's syndrome)) 2720 P16278
β-己醣胺酶A 泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease) 2990 P08236
β-己醣胺酶B 桑德霍夫氏病(Sandhoff's disease) 3073 P06865
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含表54之酶或其功能變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含與參考其UniProt ID在表54中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能變異體催化與對應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，編碼表54之酶或其功能變異體的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於治療表54之疾病或病症。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於將二磷酸尿苷葡萄糖醛酸苷轉移酶或其功能變異體遞送至目標細胞，例如肝細胞。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於將OCA1或其功能變異體遞送至目標細胞，例如視網膜細胞。 表 55. 例示性非酶效應子及相應適應症
效應子 適應症 Entrez 基因ID UniProt ID
存活運動神經元蛋白質(SMN) 脊髓性肌萎縮 6606 Q16637
肌縮蛋白或微肌縮蛋白 肌肉萎縮症(例如杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)或貝氏肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy)) 1756 P11532
補體蛋白，例如補體因子C1 補體因子I缺乏症 3426 P05156
補體因子H 非典型性溶血性尿毒症症候群 3075 P08603
胱胺酸素(溶酶體胱胺酸轉運體) 胱胺酸症 1497 O60931
附睾分泌蛋白質1 (HE1；NPC2蛋白質) C2型尼曼-匹克病 10577 P61916
GDP-岩藻糖轉運體-1 先天性N-糖基化障礙CDG IIc (拉瑪-哈薩隆症候群(Rambam-Hasharon syndrome)) 55343 Q96A29
GM2活化蛋白質 GM2活化蛋白質缺乏症(泰-薩克斯病AB變異體，GM2A) 2760 Q17900
溶酶體跨膜CLN3蛋白質 幼年型蠟樣脂褐質沈積症(CLN3、巴氏病(Batten disease)、沃格特-施皮耳麥耶病(Vogt-Spielmeyer disease)) 1207 Q13286
溶酶體跨膜CLN5蛋白質 嬰兒型蠟樣脂褐質沈積症變異體，芬蘭型(CLN5) 1203 O75503
磷酸鈉協同轉運蛋白，唾液酸轉運蛋白 嬰兒唾液酸貯積病 26503 Q9NRA2
磷酸鈉協同轉運蛋白，唾液酸轉運蛋白 芬蘭型涎尿(薩拉病(Salla disease)) 26503 Q9NRA2
NPC1蛋白質 C1型/D型尼曼-匹克病 4864 O15118
寡聚高基體複合物-7 先天性N-糖基化障礙CDG IIe 91949 P83436
鞘脂激活蛋白原 鞘脂激活蛋白原缺乏症 5660 P07602
保護性蛋白質/組織蛋白酶A (PPCA) 半乳糖唾液酸貯積症(戈德堡症候群(Goldberg's syndrome)、神經胺糖酸苷酶與β-半乳糖苷酶組合缺乏症) 5476 P10619
與甘露糖-P-多萜醇利用有關之蛋白質 先天性N-糖基化障礙CDG If 9526 O75352
鞘脂激活蛋白B 鞘脂激活蛋白B缺乏症(硫苷脂活化子缺乏症) 5660 P07602
鞘脂激活蛋白C 鞘脂激活蛋白C缺乏症(高歇氏活化子缺乏症(Gaucher's activator deficiency)) 5660 P07602
硫酸酯酶修飾因子-1 黏硫脂病(多硫酸酯酶缺乏症) 285362 Q8NBK3
跨膜CLN6蛋白質 嬰兒型蠟樣脂褐質沈積症變異體(CLN6) 54982 Q9NWW5
跨膜CLN8蛋白質 蠟樣脂褐質沈積症進展性癲癇症伴智力障礙 2055 Q9UBY8
vWF 馮威里氏病 7450 P04275
因子I (血纖維蛋白原) 無纖維蛋白原血症 2243、2244、2266 P02671、P02675、P02679
紅血球生成素(hEPO)         
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含紅血球生成素(EPO)，例如人類紅血球生成素(hEPO)或其功能變異體。在一些實施例中，編碼紅血球生成素或其功能變異體之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於刺激紅血球生成。在一些實施例中，編碼紅血球生成素或其功能變異體之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於治療疾病或病症，例如貧血。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於將EPO或其功能變異體遞送至目標細胞，例如紅血球。
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含表55之多肽或其功能變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含與參考其UniProt ID在表55中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，編碼表55之多肽或其功能變異體的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於治療表55之疾病或病症。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於將SMN或其功能變異體遞送至目標細胞，例如脊髓及/或運動神經元之細胞。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)用於將微肌縮蛋白遞送至目標細胞，例如肌細胞。
例示性微肌縮蛋白描述於Duan, 「Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.」 Mol Ther. 2018 Oct 3;26(10):2337-2356. doi: 10.1016/j.ymthe.2018.07.011. Epub 2018 Jul 17中。
在一些實施例中，本文所描述之效應子包含凝血因子，例如本文之表54或表55中所列之凝血因子。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含當突變時引起溶酶體貯積病之蛋白質，例如本文之表54或表55中所列之蛋白質。在一些實施例中，本文所描述之效應子包含轉運蛋白，例如本文之表55中所列之轉運蛋白。
在一些實施例中，野生型蛋白質之功能性變異體包含具有野生型蛋白質之一或多種活性的蛋白質，例如功能性變異體催化與相應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，功能性變異體以比在相同條件下相應野生型蛋白質對相同結合搭配物之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至由野生型蛋白質結合之相同結合搭配物。在一些實施例中，功能性變異體之多肽序列與野生型多肽至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，功能變異體包含對應野生型蛋白質之同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)。在一些實施例中，功能變異體為融合蛋白。在一些實施例中，融合包含與相應野生型蛋白質具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性的第一區及第二異源區。在一些實施例中，功能變異體包含對應野生型蛋白質之片段或由其組成。
再生、修復及纖維化因子本文所描述之治療性多肽包括例如如表56中所揭示之生長因子，或其功能變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表56中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%一致性的蛋白質。亦包括針對此類生長因子之抗體或其片段，或促進再生及修復之miRNA。
表 56. 例示性再生、修復及纖維化因子
目標 基因登錄號 蛋白質登錄號
VEGF-A NG_008732    NP_001165094   
NRG-1 NG_012005    NP_001153471   
FGF2 NG_029067    NP_001348594   
FGF1 Gene ID：2246    NP_001341882
miR-199-3p MIMAT0000232      
miR-590-3p MIMAT0004801   
mi-17-92 MI0000071    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2732113/figure/F1/
miR-222 MI0000299      
miR-302-367 MIR302A及MIR367    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4400607/
轉型因子本文所描述之治療性多肽亦包括轉型因子，例如將纖維母細胞轉型成分化細胞之蛋白質因子，例如如表57中所揭示之因子，或其功能變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表57中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%一致性的蛋白質。 表 57. 例示性轉型因子
目標 適應症 基因登錄號 蛋白質登錄號
MESP1 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 Gene ID：55897    EAX02066   
ETS2 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 GeneID：2114    NP_005230   
HAND2 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 GeneID：9464    NP_068808   
MYOCARDIN 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 GeneID：93649 NP_001139784   
ESRRA 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 Gene ID：2101    AAH92470
miR-1 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 MI0000651    n/a
miR-133 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 MI0000450 n/a
TGFb 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 GeneID：7040    NP_000651.3   
WNT 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 Gene ID：7471    NP_005421   
JAK 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 Gene ID：3716    NP_001308784   
NOTCH 藉由轉化纖維母細胞進行器官修復 GeneID：4851    XP_011517019   
刺激細胞再生之蛋白質  本文所描述之治療性多肽亦包括刺激細胞再生之蛋白質，例如如表58中所揭示之蛋白質，或其功能變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表58中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%一致性的蛋白質。 表 58. 刺激細胞再生之例示性蛋白質
目標 基因登錄號 蛋白質登錄號
MST1 NG_016454 NP_066278
STK30 基因ID：26448 NP_036103  
MST2 基因ID：6788 NP_006272
SAV1 基因ID：60485 NP_068590
LATS1 基因ID：9113 NP_004681
LATS2 基因ID：26524 NP_055387
YAP1 NG_029530 NP_001123617
CDKN2b NG_023297 NP_004927
CDKN2a NG_007485 NP_478102
STING 調節物效應子在一些實施例中，本文所描述之分泌效應子調節STING/cGAS傳訊。在一些實施例中，STING調節物為多肽，例如病毒多肽或其功能變異體。舉例而言，效應子可包含描述於Maringer等人. 「Message in a bottle: lessons learned from antagonism of STING signalling during RNA virus infection」 Cytokine & Growth Factor Reviews 第25卷, 第6期, December 2014, 第669-679頁中之STING調節物(例如抑制劑)，該等內容以全文引用的方式併入本文中。額外STING調節物(例如活化劑)描述於例如Wang等人. 「STING activator c-di-GMP enhances the anti-tumor effects of peptide vaccines in melanoma-bearing mice.」  Cancer Immunol Immunother. 2015 Aug;64(8):1057-66. doi: 10.1007/s00262-015-1713-5. Epub 2015 May 19; Bose ''cGAS/STING Pathway in Cancer: Jekyll and Hyde Story of Cancer Immune Response'' Int J Mol Sci. 2017 Nov; 18(11): 2456；及Fu等人. 「STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumors resistant to PD-1 blockade」 Sci Transl Med. 2015 Apr 15; 7(283): 283ra52中，其各自以全文引用的方式併入本文中。
肽之一些實例包括但不限於螢光標籤或標記物、抗原、治療性肽、來自天然生物活性肽之合成或模擬肽、促效性或拮抗性肽、抗微生物肽、靶向或細胞毒性肽、一種降解或自毀肽及多種降解或自毀肽。本文所描述之適用於本發明之肽亦包括抗原結合肽，例如抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體(參見例如Steeland等人. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113)。此類抗原結合肽可結合細胞溶質抗原、細胞核抗原或細胞器內抗原。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼小肽、肽模擬物(例如，類肽)、胺基酸及胺基酸類似物之序列。此類治療劑通常具有每莫耳低於約5,000公克之分子量、每莫耳低於約2,000公克之分子量、每莫耳低於約1,000公克之分子量、每莫耳低於約500公克之分子量及此類化合物之鹽、酯及其他醫藥學上可接受之形式。此類治療劑可包括但不限於神經傳遞質、激素、藥物、毒素、病毒或微生物粒子、合成分子及其促效劑或拮抗劑。
在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括連接至能夠靶向特定位置、組織或細胞之配位體的多肽。
基因編輯組分指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件可包括編碼基因編輯系統之組分的一或多個基因。例示性基因編輯系統包括成簇規律間隔短回文重複序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR)系統、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFN)及基於類轉錄活化因子效應子之核酸酶(Transcription Activator-Like Effector-based Nucleases，TALEN)。基於ZFN、TALEN及CRISPR之方法描述於例如Gaj等人. Trends Biotechnol. 31.7(2013):397-405中；基因編輯之CRISPR方法描述於例如Guan等人., Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair 2016 Oct;46:1-8. doi: 10.1016/j.dnarep.2016.07.004; Zheng等人., Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques, 第57卷, 第3號, September 2014, 第115-124頁中。
CRISPR系統為最初在細菌及古菌中發現的適應性防禦系統。CRISPR系統使用稱為CRISPR相關性或「Cas」核酸內切酶(例如，Cas9或Cpf1)之RNA引導之核酸酶以分解外來DNA。在典型CRISPR/Cas系統中，核酸內切酶係藉由靶向單股或雙股DNA序列之序列特定性非編碼「導引RNA」指向目標核苷酸序列(例如，待進行序列編輯之基因體中的位點)。已鑑定出三類(I-III) CRISPR系統。II類CRISPR系統使用單一Cas核酸內切酶(而非多種Cas蛋白)。一個II類CRISPR系統包括II型Cas核酸內切酶，諸如Cas9、CRISPR RNA (「crRNA」)及反式活化crRNA (「tracrRNA」)。crRNA含有「嚮導RNA」，典型地為對應於標靶DNA序列的約20個核苷酸RNA序列。crRNA亦含有結合至tracrRNA以形成由RNase III裂解之部分雙股結構之區域，產生crRNA/tracrRNA雜合物。crRNA/tracrRNA雜合物隨後引導Cas9核酸內切酶識別及裂解目標DNA序列。目標DNA序列通常必須鄰近於對指定Cas核酸內切酶具有特異性之「原間隔序列相鄰模體」(「PAM」)；然而，PAM序列出現在整個給定基因體中。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括用於CRISPR核酸內切酶之基因。舉例而言，自多種原核物種鑑別之一些CRISPR核酸內切酶具有不同PAM序列要求；PAM序列之實例包括5'-NGG (化膿性鏈球菌)、5'-NNAGAA (嗜熱鏈球菌CRISPR1)、5'-NGGNG (嗜熱鏈球菌CRISPR3)及5'-NNNGATT (腦膜炎雙球菌)。一些核酸內切酶，例如Cas9核酸內切酶係與富含G之PAM位點，例如5'-NGG相關，且在PAM位點上游(5')之位置3核苷酸處執行目標DNA之平端裂解。另一II類CRISPR系統包括V型核酸內切酶Cpf1，其小於Cas9；實例包括AsCpf1 (來自胺基酸球菌屬物種)及LbCpf1 (來自毛螺菌科物種)。Cpf1核酸內切酶係與富含之PAM位點，例如5'-TTN相關。Cpf1亦可識別5'-CTA PAM模體。Cpf1藉由以下裂解目標DNA：引入具有4-或5-核苷酸5'突出物之偏移或交錯雙股斷裂，例如使用位於編碼股上之PAM位點下游(3') 18個核苷酸及互補股上之PAM位點下游23個核苷酸的5-核苷酸偏移或交錯切口裂解目標DNA；由此類偏移裂解產生之5-核苷酸突出物使得藉由同源重組之DNA插入與藉由插入平端裂解的DNA相比更精確的基因體編輯。參見例如Zetsche等人. (2015) Cell, 163:759 - 771。
多種CRISPR相關(Cas)基因可包括於指環病毒科家族載體(例如，指環載體)中。基因之特定實例為編碼來自包括Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、C2C1或C2C3之II類系統之Cas蛋白質的彼等基因。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼Cas蛋白質，例如Cas9蛋白質之基因，可來自多種原核物種中之任一者。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼特定Cas蛋白質，例如Cas9蛋白質之基因，經選擇以鑑別特定前間隔子-相鄰模體(PAM)序列。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼兩個或更多個不同Cas蛋白質或兩個或更多個Cas蛋白質之核酸，可引入至細胞、受精卵、胚胎或動物中，例如以允許鑑別及修飾包含相同、類似或不同PAM模體之位點。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼具有去活化核酸酶，例如核酸酶缺失型Cas9之經修飾Cas蛋白質的基因。
儘管野生型Cas9蛋白在由gRNA靶向之特定DNA序列處產生雙股斷裂(DSB)，但已知具有經修飾功能之多種CRISPR核酸內切酶，例如：Cas核酸內切酶之「切口酶」型式(例如Cas9)僅產生單股斷裂；無催化活性Cas核酸內切酶，例如Cas9 (「dCas9」)不切割目標DNA。編碼dCas9之基因可與編碼效應子域之基因融合以抑制(CRISPRi)或活化(CRISPRa)目標基因之表現。舉例而言，基因可編碼Cas9與轉錄沉默子(例如KRAB域)之融合物或與轉錄活化子之融合物(例如dCas9-VP64融合物)。可包括編碼融合至FokI核酸酶之無催化活性Cas9 (dCas9)之基因(「dCas9-FokI」)，以在與兩個gRNA同源之目標序列處產生DSB。參見例如揭露於Addgene repository (Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/)且公開可購自其中之許多CRISPR/Cas9質體。引入兩個單獨雙股斷裂(各自藉由單獨嚮導RNA引導)之「雙切口酶」Cas9描述為藉由Ran等人. (2013) Cell, 154:1380 - 1389達成之更精確的基因體編輯。
用於編輯真核生物之基因的CRISPR技術揭露於美國專利申請案公開案2016/0138008A1及US2015/0344912A1中，及美國專利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965及8,906,616中。Cpf1核酸內切酶及相應導引RNA及PAM位點揭露於美國專利申請公開案2016/0208243 A1中。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含編碼本文所描述之多肽，例如經靶向核酸酶，例如Cas9，例如野生型Cas9、切口酶Cas9 (例如，Cas9 D10A)、死亡Cas9 (dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1或C2C3及gRNA的基因。編碼核酸酶及gRNA之基因的選擇係藉由靶向突變是否為核苷酸缺失、取代或添加，例如靶向序列之核苷酸缺失、取代或添加來確定。編碼無催化活性核酸內切酶之基因，例如與(一或多個)效應子域(例如VP64)之全部或一部分(例如，生物活性部分)繫留之死亡Cas9 (dCas9，例如D10A；H840A)產生可調節一或多個目標核酸序列之活性及/或表現的嵌合蛋白質。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼具有一或多個效應子域(例如，全長野生型效應子域，或其片段或變異體，例如其生物活性部分)之所有或一部分的dCas9之融合物的基因，以產生適用於本文所描述之方法的嵌合蛋白。因此，在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼dCas9-甲基化酶融合物的基因。在其他一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼具有位點特異性gRNA之dCas9-酶融合物的基因，以靶向內源性基因。
在其他態樣中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括與dCas9融合之編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個效應子域之基因(所有或生物活性部分)。
調節序列在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接至編碼效應子之序列的調節序列，例如啟動子或強化子。
在一些實施例中，啟動子包括與編碼表現產物之DNA序列相鄰定位的DNA序列。啟動子可以操作方式連接於相鄰DNA序列。相比於不存在啟動子時表現產物之量，啟動子通常增加自DNA序列表現之產物的量。來自一個生物體之啟動子可用於增強來自來源於另一生物體之DNA序列的產物表現。舉例而言，脊椎動物啟動子可用於在脊椎動物中表現水母GFP。另外，一個啟動子元件可增加以串聯方式附接之多個DNA序列所表現之產物的量。因此，一個啟動子元件可增強一或多種產物之表現。多個啟動子元件為一般熟習此項技術者熟知的。
在一個實施例中，需要高水準組成性表現。此類啟動子之實例包括(但不限於)反轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)長末端重複序列(LTR)啟動子/強化子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期啟動子/強化子(參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985))、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、細胞質.β.-肌動蛋白啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
在另一實施例中，可能需要誘導性啟動子。誘導性啟動子為由外源提供之化合物調節之彼等啟動子，例如以順式或反式，包括但不限於鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子；地塞米松(Dex)誘導性小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子；T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；四環素抑制性系統(Gossen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992))；四環素誘導性系統(Gossen等人, Science, 268:1766-1769 (1995)；亦參見Harvey等人, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998))；RU486誘導性系統(Wang等人, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)及Wang等人, Gene Ther., 4:432-441 (1997)]；及雷帕黴素誘導性系統(Magari等人, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)；Rivera等人, Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))。在此情形下可適用之其他類型之誘導性啟動子為藉由特定生理狀態，例如溫度、急性期或僅在複製細胞中調控之啟動子。
在一些實施例中，使用所關注之基因或核酸序列之天然啟動子。當期望基因或核酸序列之表現應模擬天然表現時，可使用天然啟動子。當基因或其他核酸序列之表現必須在時間上或發育上，或以組織特異性方式，或回應於特定轉錄刺激進行調節時，可使用天然啟動子。在另一實施例中，其他天然表現控制元件，諸如強化子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列，亦可用於模擬天然表現。
在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接至組織特異性啟動子的基因。例如，若期望骨胳肌肉中之表現，則可使用在肌肉中有活性之啟動子。此等啟動子包括來自編碼骨骼α-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌縮蛋白、肌肉肌酸激酶之基因的啟動子，以及具有高於天然存在之啟動子之活性的合成肌肉啟動子。參見Li等人., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)。組織特異性啟動子之實例為吾人所知：肝白蛋白，Miyatake等人J. Virol., 71:5124-32 (1997)；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig等人, Gene Ther. 3:1002-9 (1996)；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人, Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)]；骨(骨鈣化素，Stein等人, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)；骨唾液蛋白，Chen等人, J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996))；淋巴細胞(CD2，Hansal等人, J. Immunol., 161:1063-8 (1998)；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體a鏈)；神經元(神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子，Andersen等人Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)；神經絲輕鏈基因，Piccioli等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)；神經元特異性vgf基因，Piccioli等人, Neuron, 15:373-84 (1995)]；以及其他。
遺傳元件可包括強化子，例如與編碼基因之DNA序列相鄰定位的DNA序列。強化子元件通常位於啟動子元件上游或可位於編碼DNA序列(例如，轉錄或轉譯成一或多種產物之DNA序列)下游或其內。因此，強化子元件可位於編碼產物之DNA序列上游或下游100個鹼基對、200個鹼基對或300個或更多個鹼基對處。增強子元件可將自DNA序列表現之重組產物的量增加至高於由啟動子元件提供之增加的表現。多個增強子元件可易於供一般熟習此項技術者使用。
在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個側接編碼本文所描述之表現產物之序列的反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個側接編碼本文所描述之表現產物之序列的長末端重複序列(LTR)。可使用之啟動子序列之實例包括但不限於猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子及勞氏肉瘤病毒啟動子。
複製蛋白質在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件可包括編碼一或多個複製蛋白質之序列。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可藉由滾環複製方法複製，例如前導股及滯後股之合成為非偶聯的。在此類實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含三個元件額外元件：i)編碼起始蛋白之基因，ii)雙股起點，及iii)單股起點。包含複製蛋白之滾環複製(RCR)蛋白複合物結合至前導股且使複製起點不穩定。RCR複合物裂解基因體以產生游離3'OH末端。細胞DNA聚合酶自游離3'OH末端起始病毒DNA複製。在基因體已複製後，RCR複合物共價閉合環。此引起正環狀單股親體DNA分子及由負親體股及新合成之正股構成之環狀雙股DNA分子的釋放。單股DNA分子可經衣殼化或參與第二輪複製。參見例如Virology Journal 2009, 6:60 doi:10.1186/1743-422X-6-60。
遺傳元件可包含編碼聚合酶，例如RNA聚合酶或DNA聚合酶之序列。
其他序列在一些實施例中，遺傳元件進一步包括編碼產物(例如核糖核酸酶、編碼蛋白質之治療mRNA、外源基因)之核酸。
在一些實施例中，遺傳元件包括一或多個影響以下之序列：物種及/或組織及/或細胞向性(例如衣殼蛋白序列)、感染性(例如衣殼蛋白序列)、免疫抑制/活化(例如調節核酸)、病毒基因體結合及/或封裝、免疫逃避(非免疫原性及/或耐受性)、藥物動力學、內吞作用及/或細胞附著、核進入、細胞內調節及定位、胞外分泌調節、繁殖及宿主或宿主細胞中指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之核酸保護。
在一些實施例中，遺傳元件可包含包括DNA、RNA或人工核酸之其他序列。其他序列可包括(但不限於)基因體DNA、cDNA或編碼tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子之序列。在一個實施例中，遺傳元件包括編碼siRNA以靶向與調節核酸相同之基因表現產物之不同基因座的序列。在一個實施例中，遺傳元件包括編碼siRNA以靶向與調節核酸不同之基因表現產物的序列。
在一些實施例中，遺傳元件進一步包含以下序列中之一或多者：編碼一或多種miRNA之序列、編碼一或多種複製蛋白之序列、編碼外源性基因之序列、編碼治療劑之序列、調控性序列(例如啟動子、強化子)、編碼一或多個靶向內源性基因(siRNA、lncRNA、shRNA)之調控性序列的序列以及編碼治療性mRNA或蛋白質之序列。
其他序列之長度可為約2至約5000 nts、約10至約100 nts、約50至約150 nts、約100至約200 nts、約150至約250 nts、約200至約300 nts、約250至約350 nts、約300至約500 nts、約10至約1000 nts、約50至約1000 nts、約100至約1000 nts、約1000至約2000 nts、約2000至約3000 nts、約3000至約4000 nts、約4000至約5000 nts，或其間任何範圍。
經編碼基因  舉例而言，遺傳元件可包括與傳訊生化途徑相關之基因，例如傳訊生化途徑相關基因或聚核苷酸。實例包括疾病相關基因或聚核苷酸。「疾病相關」基因或聚核苷酸係指相比於非疾病對照之組織或細胞，在衍生自受疾病影響之組織的細胞中以異常含量或以異常形式產生轉錄或轉譯產物的任何基因或聚核苷酸。其可為以異常高含量表現之基因；其可為以異常低含量表現之基因，其中改變之表現與疾病之出現及/或進展相關。疾病相關基因亦指具有直接負責或與負責疾病病因之基因處於連鎖不平衡之突變或遺傳變異的基因。
疾病相關基因及聚核苷酸之實例係購自McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)及National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.)。疾病相關基因及聚核苷酸之實例列於美國專利第8,697,359號之表A及B中，該專利以全文引用之方式併入本文中。疾病特定資訊可獲自McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)及National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.)。傳訊生化途徑相關基因及聚核苷酸之實例列於美國專利第8,697,359號之表A-C中，該專利以全文引用之方式併入本文中。
此外，遺傳元件可編碼靶向部分，如本文他處所描述。此可例如藉由插入編碼糖、醣脂或蛋白質，諸如抗體之聚核苷酸來達成。熟習此項技術者已知用於產生靶向部分之額外方法。
病毒序列  在一些實施例中，遺傳元件包含至少一個病毒序列。在一些實施例中，序列與來自單股DNA病毒，例如指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)、雙DNA病毒(Bidnavirus)、環狀病毒(Circovirus)、雙生病毒(Geminivirus)、基因體病毒(Genomovirus)、絲狀病毒(Inovirus)、微小病毒(Microvirus)、矮化病毒(Nanovirus)、小病毒(Parvovirus)及螺旋病毒(Spiravirus)的一或多個序列具有同源性或一致性。在一些實施例中，序列與一或多個來自雙股DNA病毒，例如腺病毒(Adenovirus)、壺腹病毒(Ampullavirus)、囊泡病毒(Ascovirus)、非洲豬瘟病毒(Asfarvirus)、桿狀病毒(Baculovirus)、微小紡錘形噬菌體屬(Fusellovirus)、球狀病毒(Globulovirus)、滴狀病毒(Guttavirus)、肥大唾腺炎病毒(Hytrosavirus)、疱疹病毒(Herpesvirus)、虹彩病毒(Iridovirus)、脂毛病毒(Lipothrixvirus)、線極病毒(Nimavirus)及痘病毒(Poxvirus)的序列具有同源性或一致性。在一些實施例中，序列與一或多個來自RNA病毒，例如α病毒(Alphavirus)、真菌傳棒狀病毒(Furovirus)、肝炎病毒(Hepatitis virus)、大麥病毒(Hordeivirus)、菸草花葉病毒(Tobamovirus)、菸草脆裂病毒(Tobravirus)、三角病毒(Tricornavirus)、風疹病毒(Rubivirus)、雙RNA病毒(Birnavirus)、囊狀病毒(Cystovirus)、分病毒(Partitivirus)及里奧病毒(Reovirus)的序列具有同源性或一致性。
在一些實施例中，遺傳元件可包含一或多個來自非致病性病毒，例如共生病毒，例如共生的病毒，例如原生病毒，例如指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)之序列。命名法之近期變化將能夠感染人類細胞之三種指環病毒分類為病毒之指環病毒科的甲型細環病毒(TT)、乙型細環病毒(TTM)及丙型細環病毒(TTMD)屬。迄今，指環病毒尚未與任何人類疾病相關聯。在一些實施例中，遺傳元件可包含與細環病毒(Torque Teno Virus，TT)，一種具有環狀、反義基因體之無包膜、單股DNA病毒具有同源性或一致性的序列。在一些實施例中，遺傳元件可包含與SEN病毒、哨兵病毒(Sentinel virus)、TTV樣微型病毒及TT病毒具有同源性或一致性之序列。已描述不同類型之TT病毒，包括TT病毒基因型6、TT病毒組、TTV樣病毒DXL1及TTV樣病毒DXL2。在一些實施例中，遺傳元件可包含與以下具有同源性或一致性之序列：較小病毒細環樣微型病毒(TTM)，或基因體大小介於TTV與TTMV之間的第三病毒，稱為細環樣中型病毒(TTMD)。在一些實施例中，遺傳元件可包含一或多個來自與本文所描述之核苷酸序列中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的非致病性病毒之序列或序列片段。
在一些實施例中，遺傳元件包含與來自以下之一或多個序列具有同源性或一致性的一或多個序列：一或多個非指環病毒科家族病毒(例如，非指環病毒)，例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、痘瘡病毒、SV40、乳頭狀瘤病毒；RNA病毒，諸如反轉錄病毒，例如慢病毒；單股RNA病毒，例如肝炎病毒；或雙股RNA病毒，例如輪狀病毒。在一些實施例中，由於缺乏重組反轉錄病毒，因此可提供輔助以產生感染性粒子。此類輔助可例如藉由使用輔助細胞株來提供，該等輔助細胞株含有在LTR內之調節序列控制下編碼反轉錄病毒之所有結構基因的質體。適合於複製本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的細胞株包括此項技術中已知之細胞株，例如A549細胞，其可如本文所描述地修飾。該遺傳元件可另外含有編碼可選標記物之基因，以使得可鑑定所需遺傳元件。
在一些實施例中，遺傳元件包括非靜默突變，例如在編碼多肽中產生胺基酸差異之鹼基取代、缺失或添加，只要序列保持與由第一核苷酸序列編碼之多肽至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或以其他方式適用於實踐本發明。就此而言，可進行通常認為不使總體蛋白質功能不活化的某些保守胺基酸取代，諸如關於帶正電胺基酸(且反之亦然)：離胺酸、精胺酸及組胺酸；關於帶負電胺基酸(且反之亦然)：天冬胺酸及麩胺酸；以及關於帶中性電荷之某些胺基酸群組(且在所有情況下，亦反之亦然)：(1)丙胺酸及絲胺酸，(2)天冬醯胺、麩醯胺酸及組胺酸，(3)半胱胺酸及絲胺酸，(4)甘胺酸及脯胺酸，(5)異白胺酸、白胺酸及纈胺酸，(6)甲硫胺酸、白胺酸及異白胺酸，(7)苯丙胺酸、甲硫胺酸、白胺酸及酪胺酸，(8)絲胺酸及蘇胺酸，(9)色胺酸及酪胺酸，以及(10)例如酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸。可根據物理特性及對二級與三級蛋白質結構的影響來對胺基酸進行分類。保守取代在此項技術中公認為一個胺基酸取代具有類似特性之另一胺基酸。
具有相同或指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基的兩個或更多個核酸或多肽序列之一致性(例如在指定區域上之約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性，當在比較窗或指示區域上比較及比對最大一致性時)可使用BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法在下文所描述之預設參數下，或藉由手動比對及目視檢查來量測(參見例如NCBI網站www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或其類似者)。一致性亦可指或可應用於測試序列之互補序列。一致性亦包括具有缺失及/或添加之序列以及具有取代之彼等者。如本文所描述，演算法考慮空隙及其類似物。一致性可存在於以下區內：長度為至少約10個胺基酸或核苷酸、長度為約15個胺基酸或核苷酸、長度為約20個胺基酸或核苷酸、長度為約25個胺基酸或核苷酸、長度為約30個胺基酸或核苷酸、長度為約35個胺基酸或核苷酸、長度為約40個胺基酸或核苷酸、長度為約45個胺基酸或核苷酸、長度為約50個胺基酸或核苷酸或更多個胺基酸或核苷酸之區。
在一些實施例中，遺傳元件包含與本文所描述，例如如表N1-N4中之任一者所列出之核苷酸序列中之任一者具有至少約75%核苷酸序列一致性，至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%99%或100%核苷酸序列一致性的核苷酸序列。由於遺傳密碼簡併，因此同源核苷酸序列可包括任意數目個靜默鹼基變化，亦即仍然編碼相同胺基酸的核苷酸取代。
基因編輯組分  指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件可包括編碼基因編輯系統之組分的一或多個基因。例示性基因編輯系統包括成簇規律間隔短回文重複序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR)系統、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFN)及基於類轉錄活化因子效應子之核酸酶(Transcription Activator-Like Effector-based Nucleases，TALEN)。基於ZFN、TALEN及CRISPR之方法描述於例如Gaj等人. Trends Biotechnol. 31.7(2013):397-405中；基因編輯之CRISPR方法描述於例如Guan等人., Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair 2016 Oct;46:1-8. doi: 10.1016/j.dnarep.2016.07.004; Zheng等人., Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques, 第57卷, 第3號, September 2014, 第115-124頁中。
CRISPR系統為最初在細菌及古菌中發現的適應性防禦系統。CRISPR系統使用稱為CRISPR相關性或「Cas」核酸內切酶(例如，Cas9或Cpf1)之RNA引導之核酸酶以分解外來DNA。在典型CRISPR/Cas系統中，核酸內切酶係藉由靶向單股或雙股DNA序列之序列特定性非編碼「導引RNA」指向目標核苷酸序列(例如，待進行序列編輯之基因體中的位點)。已鑑定出三類(I-III) CRISPR系統。II類CRISPR系統使用單一Cas核酸內切酶(而非多種Cas蛋白)。一個II類CRISPR系統包括II型Cas核酸內切酶，諸如Cas9、CRISPR RNA (「crRNA」)及反式活化crRNA (「tracrRNA」)。crRNA含有「嚮導RNA」，典型地為對應於標靶DNA序列的約20個核苷酸RNA序列。crRNA亦含有結合至tracrRNA以形成由RNase III裂解之部分雙股結構之區域，產生crRNA/tracrRNA雜合物。crRNA/tracrRNA雜合物隨後引導Cas9核酸內切酶識別及裂解目標DNA序列。目標DNA序列通常必須鄰近於對指定Cas核酸內切酶具有特異性之「原間隔序列相鄰模體」(「PAM」)；然而，PAM序列出現在整個給定基因體中。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括用於CRISPR核酸內切酶之基因。舉例而言，自多種原核物種鑑別之一些CRISPR核酸內切酶具有不同PAM序列要求；PAM序列之實例包括5'-NGG (化膿性鏈球菌)、5'-NNAGAA (嗜熱鏈球菌CRISPR1)、5'-NGGNG (嗜熱鏈球菌CRISPR3)及5'-NNNGATT (腦膜炎雙球菌)。一些核酸內切酶，例如Cas9核酸內切酶係與富含G之PAM位點，例如5'-NGG相關，且在PAM位點上游(5')之位置3核苷酸處執行目標DNA之平端裂解。另一II類CRISPR系統包括V型核酸內切酶Cpf1，其小於Cas9；實例包括AsCpf1 (來自胺基酸球菌屬物種)及LbCpf1 (來自毛螺菌科物種)。Cpf1核酸內切酶係與富含之PAM位點，例如5'-TTN相關。Cpf1亦可識別5'-CTA PAM模體。Cpf1藉由以下裂解目標DNA：引入具有4-或5-核苷酸5'突出物之偏移或交錯雙股斷裂，例如使用位於編碼股上之PAM位點下游(3') 18個核苷酸及互補股上之PAM位點下游23個核苷酸的5-核苷酸偏移或交錯切口裂解目標DNA；由此類偏移裂解產生之5-核苷酸突出物使得藉由同源重組之DNA插入與藉由插入平端裂解的DNA相比更精確的基因體編輯。參見例如Zetsche等人. (2015) Cell, 163:759 - 771。
多種CRISPR相關(Cas)基因可包括於指環病毒科家族載體(例如，指環載體)中。基因之特定實例為編碼來自包括Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、C2C1或C2C3之II類系統之Cas蛋白質的彼等基因。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼Cas蛋白質，例如Cas9蛋白質之基因，可來自多種原核物種中之任一者。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼特定Cas蛋白質，例如Cas9蛋白質之基因，經選擇以鑑別特定前間隔子-相鄰模體(PAM)序列。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼兩個或更多個不同Cas蛋白質或兩個或更多個Cas蛋白質之核酸，可引入至細胞、受精卵、胚胎或動物中，例如以允許鑑別及修飾包含相同、類似或不同PAM模體之位點。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼具有去活化核酸酶，例如核酸酶缺失型Cas9之經修飾Cas蛋白質的基因。
儘管野生型Cas9蛋白質在由gRNA靶向之特定DNA序列處產生雙股斷裂(DSB)，但已知具有經修飾功能之多種CRISPR核酸內切酶，例如：Cas9之「切口酶」版本產生僅單股斷裂；無催化活性Cas9 (「dCas9」)不切割目標DNA。編碼dCas9之基因可與編碼效應子域之基因融合以抑制(CRISPRi)或活化(CRISPRa)目標基因之表現。舉例而言，基因可編碼Cas9與轉錄沉默子(例如KRAB域)之融合物或與轉錄活化子之融合物(例如dCas9-VP64融合物)。可包括編碼融合至FokI核酸酶之無催化活性Cas9 (dCas9)之基因(「dCas9-FokI」)，以在與兩個gRNA同源之目標序列處產生DSB。參見例如揭露於Addgene repository (Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/)且公開可購自其中之許多CRISPR/Cas9質體。引入兩個單獨雙股斷裂(各自藉由單獨嚮導RNA引導)之「雙切口酶」Cas9描述為藉由Ran等人. (2013) Cell, 154:1380 - 1389達成之更精確的基因體編輯。
用於編輯真核生物之基因的CRISPR技術揭露於美國專利申請案公開案2016/0138008A1及US2015/0344912A1中，及美國專利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965及8,906,616中。Cpf1核酸內切酶及相應導引RNA及PAM位點揭露於美國專利申請公開案2016/0208243 A1中。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含編碼本文所描述之多肽，例如經靶向核酸酶，例如Cas9，例如野生型Cas9、切口酶Cas9 (例如，Cas9 D10A)、死亡Cas9 (dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1或C2C3及gRNA的基因。編碼核酸酶及gRNA之基因的選擇係藉由靶向突變是否為核苷酸缺失、取代或添加，例如靶向序列之核苷酸缺失、取代或添加來確定。編碼無催化活性核酸內切酶之基因，例如與(一或多個)效應子域(例如VP64)之全部或一部分(例如，生物活性部分)繫留之死亡Cas9 (dCas9，例如D10A；H840A)產生可調節一或多個目標核酸序列之活性及/或表現的嵌合蛋白質。
如本文所用，「效應子域之生物活性部分」為維持效應子域(例如，「最小」或「核心」域)之功能(例如完全地、部分地、最低程度地維持該功能)的部分。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼具有一或多個效應子域之所有或一部分的dCas9之融合物的基因，以產生適用於本文所描述之方法之嵌合蛋白。因此，在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼dCas9-甲基化酶融合物的基因。在其他一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括編碼具有位點特異性gRNA之dCas9-酶融合物的基因，以靶向內源性基因。
在其他態樣中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括與dCas9融合之編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個效應子域之基因(所有或生物活性部分)。
蛋白質外部在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如指環載體，例如合成性指環載體)包含包封遺傳元件之蛋白質外部。蛋白質外部可包含未能在哺乳動物中引發非所需免疫反應之基本上非致病性外部蛋白質。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之蛋白質外部通常包含可自裝配成構成蛋白質外部之二十面體結構的實質上非致病性蛋白質。
在一些實施例中，蛋白質外部蛋白質由指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件之序列(例如，與遺傳元件呈順式)編碼。在一些實施例中，蛋白質外部蛋白質由與分離指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件的核酸(例如，與遺傳元件呈反式)編碼。
在一些實施例中，蛋白質，例如基本上非致病性蛋白質及/或蛋白質外部蛋白質，包含一或多個醣基化胺基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個。
在一些實施例中，蛋白質，例如基本上非致病性蛋白質及/或蛋白質外部蛋白質，包含至少一個親水性DNA結合區、富含精胺酸之區域、富含蘇胺酸之區域、富含麩醯胺酸之區域、N端聚精胺酸序列、可變區、C端聚麩醯胺酸/麩胺酸序列及一或多個二硫橋鍵。
在一些實施例中，蛋白質為衣殼蛋白，例如具有與由編碼本文所描述之衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1序列或CAV VP1序列或如表A1-A3中之任一者中所列出之衣殼蛋白序列的核苷酸序列中之任一者編碼的蛋白質具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，蛋白質或衣殼蛋白之功能片段由與本文所描述之核苷酸序列中之任一者，例如指環病毒科家族病毒衣殼序列或如表A1-A3中之任一者中所列出之衣殼蛋白序列具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列編碼。在一些實施例中，蛋白質包含由衣殼核苷酸序列或與本文所描述之核苷酸序列，例如指環病毒科家族病毒衣殼序列或如表N1-N4中之任一者中所列出之衣殼蛋白序列中之任一者具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序列一致性之序列編碼的衣殼蛋白或衣殼蛋白之功能片段。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含編碼衣殼蛋白或衣殼蛋白之功能片段的核苷酸序列或與本文所描述之胺基酸序列中之任一者，例如衣殼序列或表A1-A3中之任一者中之衣殼蛋白序列具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含編碼衣殼蛋白或衣殼蛋白之功能片段的核苷酸序列或與本文所描述之胺基酸序列中之任一者，例如指環病毒衣殼序列或表A1-A3中之任一者中之衣殼蛋白序列具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含編碼胺基酸序列的核苷酸序列，該胺基酸序列具有本文所描述之胺基酸序列，指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)胺基酸序列，例如如表A1-A3中所列出或圖1所展示的約位置1至約位置150 (例如，各範圍內之胺基酸之任何子集，例如約位置20至約位置35、約位置25至約位置30、約位置26至約30)、約位置150至約位置390 (例如，各範圍內之胺基酸之任何子集，例如約位置200至約位置380、約位置205至約位置375、約位置205至約371)、約390至約位置525、約位置525至約位置850 (例如，各範圍內之胺基酸之任何子集，例如約位置530至約位置840、約位置545至約位置830、約位置550至約820)、約850至約位置950 (例如，各範圍內之胺基酸之任何子集，例如約位置860至約位置940、約位置870至約位置930、約位置880至約923)，或其功能片段。在一些實施例中，蛋白質包含胺基酸序列或其功能片段或與本文所描述之胺基酸序列，指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)胺基酸序列，例如如表A1-A3中所列出或圖1所展示的約位置1至約位置150 (例如，或如本文所描述之各範圍內之胺基酸的任何子集)、約位置150至約位置390、約位置390至約位置525、約位置525至約位置850、約位置850至約位置950具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，蛋白質包含胺基酸序列或其功能片段或與胺基酸序列中之任一者或本文所描述之胺基酸範圍，指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)胺基酸序列，例如如表A1-A3中所列出或圖1所展示的具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，具有較低序列一致性之胺基酸的範圍可提供本文所描述之特性及細胞/組織/物種特定性(例如，趨向性)之差異中之一或多者。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)缺乏蛋白質外部中之脂質。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)缺乏脂質雙層，例如病毒包膜。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之內部完全由蛋白質外部覆蓋(例如，100%覆蓋)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之內部低於100%由蛋白質外部覆蓋，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更低覆蓋。在一些實施例中，蛋白質外部包含間隔或不連續處，例如允許對水、離子、肽或小分子之滲透性，只要遺傳元件保留於指環病毒科家族載體(例如，指環載體)中。
在一些實施例中，蛋白質外部包含一或多種蛋白質或多肽，其特異性識別及/或結合宿主細胞，例如互補蛋白質或多肽，以介導遺傳元件進入宿主細胞中。
在一些實施例中，蛋白質外部包含以下中之一或多者：一或多種糖基化蛋白質、親水性DNA結合區、富含精胺酸區、富含蘇胺酸區、富含麩醯胺酸區、N端聚精胺酸序列、可變區、C端聚麩醯胺酸/麩胺酸序列及一或多個二硫橋鍵。舉例而言，蛋白質外部包含由本文所描述之指環病毒ORF1或CAV VP1基因編碼之蛋白質。
在一些實施例中，蛋白質外部包含以下特徵中之一或多者：二十面體對稱性，識別及/或結合與一或多個宿主細胞分子相互作用以介導進入宿主細胞中之分子，缺乏脂質分子，缺乏碳水化合物，pH及溫度穩定性、耐清潔劑，及在宿主中為基本上非免疫原性或非致病性的。
II.用於產生指環病毒科家族載體之組合物及方法  在一些態樣中，本發明提供指環病毒科家族載體(例如，指環載體)及其遞送效應子之方法。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組分可如下文所描述產生。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生遺傳元件或遺傳元件構築體。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生一或多個指環病毒科家族病毒衣殼蛋白質(例如，指環病毒ORF或CAV VP1)分子(例如，ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、ORF1/2或VP1分子或其功能片段或剪接變異體)。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生蛋白質外部或其組分(例如，ORF1或VP1分子)，例如在宿主細胞中。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組分可使用串聯構築體產生，例如如PCT公開案第WO 2021252955號中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組分可使用穿梭載體/昆蟲細胞系統產生，例如如PCT公開案第WO 2021/252943號中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。
不希望受理論所束縛，滾環擴增可經由Rep蛋白與Rep結合位點(例如包含5' UTR，例如包含髮夾環及/或複製起點，例如如本文所描述)結合而發生，該結合位點位於相對於遺傳元件區之5'處(或在5'區內)。Rep蛋白可接著繼續通過遺傳元件區域，引起遺傳元件之合成。遺傳元件可隨後環化且隨後包封於蛋白質外部內以形成指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
指環病毒科家族載體之組分及組裝本文中之組合物及方法可用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。如本文所描述，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)一般包含圍封於蛋白質外部內之遺傳元件(例如，單股、環狀DNA分子，例如包含如本文所描述之5'UTR區域) (例如，包含由指環病毒科家族病毒衣殼蛋白(例如，指環病毒ORF1或CAV VP1核酸，例如如本文所描述之核酸編碼的多肽)。在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個編碼指環病毒ORF (例如，指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2中之一或多者)或CAV VP1之序列。在一些實施例中，指環病毒ORF或ORF分子(例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2)包括多肽，該多肽包含與對應指環病毒ORF序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，例如如PCT/US2018/037379或PCT/US19/65995中所描述(其各自以全文引用之方式併入本文中)。在實施例中，遺傳元件包含編碼指環病毒ORF1或CAV VP1或其剪接變異體或功能片段(例如，果凍卷區域，例如如本文所描述)的序列。在一些實施例中，蛋白質外部包含由指環病毒ORF1或CAV VP1核酸(例如，指環病毒ORF1或CAV VP1分子或其剪接變異體或功能片段)編碼之多肽。
在一些實施例中，藉由在蛋白質外部(例如如本文所描述)內圍封遺傳元件(例如如本文所描述)來組裝指環載體。在一些實施例中，遺傳元件包封於宿主細胞中之蛋白質外部內(例如如本文所描述)。在一些實施例中，宿主細胞表現一或多個包含於蛋白質外部中之多肽(例如，由指環病毒ORF1或CAV VP1核酸編碼之多肽，例如ORF1分子或VP1分子)。例如，在一些實施例中，宿主細胞包含編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子之核酸序列，例如指環病毒ORF1或CAV VP1多肽之剪接變異體或功能片段(例如，野生型指環病毒ORF1或CAV VP1蛋白質或由野生型指環病毒ORF1或CAV VP1核酸編碼之多肽，例如如本文所描述)。在實施例中，編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子之核酸序列包含於宿主細胞中所包含之核酸構築體(例如，質體、病毒載體、病毒、微型環、穿梭載體或人工染色體)中。在實施例中，編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子之核酸序列整合至宿主細胞之基因體中。
在一些實施例中，宿主細胞包含遺傳元件及/或包含遺傳元件之序列的核酸構築體。在一些實施例中，核酸構築體係選自質體、病毒核酸、微型環、穿梭載體或人工染色體。在一些實施例中，遺傳元件自核酸構築體切除，且視情況自雙股形式轉化成單股形式(例如藉由變性)。在一些實施例中，遺傳元件由基於核酸構築體中之模板序列之聚合酶產生。在一些實施例中，聚合酶產生遺傳元件序列之單股複本，其可視情況環化以形成如本文所描述之遺傳元件。在其他實施例中，核酸構築體為藉由活體外環化遺傳元件之核酸序列產生之雙股微型環。在實施例中，將經活體外環化(IVC)之微型環引入至宿主細胞中，在宿主細胞中其轉化為適用於包封於蛋白質外部中之單股遺傳元件，如本文所描述。
例如用於組裝指環病毒科家族載體 ( 例如， 指環載體 ) 之 ORF1 或 VP1 分子 指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可例如藉由包覆蛋白質外部內之遺傳元件產生。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之蛋白質外部一般包含由指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒ORF1或CAV VP1)核酸(例如，指環病毒ORF1或CAV VP1分子或其剪接變異體或功能片段，例如如本文所描述)編碼之多肽。在一些實施例中，ORF1分子或VP1分子可包含以下中之一或多者：包含富含精胺酸之區之第一區域，例如具有至少60%鹼性殘基(例如，至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%鹼性殘基；例如在60%-90%、60%-80%、70%-90%或70-80%鹼性殘基之間)之區域，及包含果凍卷域之第二區域，例如至少六個β股(例如，4、5、6、7、8、9、10、11或12個β股)。在實施例中，蛋白質外部包含一或多個(例如，1、2、3、4或所有5)指環病毒ORF1或CAV VP1富含精胺酸之區、果凍卷區域、N22域、高變區及/或C端域。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1或CAV VP1果凍卷區(例如，如本文所描述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1或CAV VP1富含精胺酸區(例如，如本文所描述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1 N22域(例如如本文所描述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒高變區(例如如本文所描述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1 C端域(例如如本文所描述)。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含ORF1分子及/或編碼ORF1分子之核酸；或VP1分子及/或編碼VP1分子之核酸。通常，ORF1或VP1分子包含具有指環病毒ORF1或CAV VP1蛋白質(例如，指環病毒ORF1或CAV VP1蛋白質，如本文所描述)或其功能片段之結構特點及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF1或VP1分子包含相對於指環病毒ORF1或CAV VP1蛋白質(例如，指環病毒ORF1或CAV VP1蛋白質，如本文所描述)之截斷。在一些實施例中，ORF1或VP1分子被截短至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700胺基酸之指環病毒ORF1或CAV VP1蛋白質。在一些實施例中，ORF1分子包含與例如如本文所描述之乙型細環病毒ORF1蛋白質具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。ORF1分子通常可結合至核酸分子，諸如DNA (例如遺傳元件，例如如本文所描述)。在一些實施例中，ORF1分子定位至細胞核。在某些實施例中，ORF1分子定位至細胞之細胞核。
不希望受理論所束縛，ORF1分子或VP1分子可能能夠結合至其他ORF1分子或VP1分子，例如以形成蛋白質外部(例如，如本文所描述)。此類ORF1分子或VP1分子可描述為能夠形成衣殼。在一些實施例中，蛋白質外部可包封核酸分子(例如如本文所描述之遺傳元件，例如使用如本文所描述之組合物或構築體產生)。在一些實施例中，複數個ORF1分子或VP1分子可形成多聚體，例如以產生蛋白質外部。在一些實施例中，多聚體可為均多聚體。在其他實施例中，多聚體可為雜多聚體。
在一些實施例中，包含如本文所描述之ORF1或VP1分子的第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)向個體投與。在一些實施例中，包含如本文所描述之ORF1或VP1分子的第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)隨後在投與第一複數個之後向該個體投與。在一些實施例中，第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含具有與第一複數個之指環載體所包含之ORF1或VP1分子相同的胺基酸序列ORF1或VP1分子。在一些實施例中，第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含與第一複數個之指環載體中所包含之ORF1或VP1分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的ORF1或VP1分子。
例如用於組裝指環病毒科家族載體 ( 例如， 指環載體 ) 之 ORF2 或 VP2 分子 使用本文所描述之組合物或方法產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可包括指環病毒ORF2或VP2分子(例如，如本文所描述)或其剪接變異體或功能片段之表現。在一些實施例中，指環病毒科家族載體包含ORF2或VP2分子或其剪接變異體或功能片段，及/或編碼ORF2或VP2分子之核酸或其剪接變異體或功能片段。在一些實施例中，指環載體不包含ORF2或VP2分子或其剪接變異體或功能片段，及/或編碼ORF2或VP2分子或其剪接變異體或功能片段之核酸。在一些實施例中，產生指環載體包含表現ORF2或VP2分子或其剪接變異體或功能片段，但ORF2或VP2分子不併入至指環病毒科家族載體中。
蛋白質組分之產生 指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之蛋白質組分，例如ORF1或VP1分子可以多種方式產生，例如如本文所描述。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之蛋白質組分，包括例如蛋白質外部，在包裹遺傳元件至蛋白質外部中之相同宿主細胞中產生，從而產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之蛋白質組分，包括例如蛋白質外部，在不包含遺傳元件及/或遺傳元件構築體(例如，如本文所描述)的細胞中產生。
桿狀病毒表現系統病毒表現系統，例如桿狀病毒表現系統，可用於表現蛋白質(例如，用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體))，例如如本文所描述。桿狀病毒為桿形病毒，具有環狀、超螺旋雙股DNA基因體。桿狀病毒屬包括：α桿狀病毒(自鱗翅目昆蟲分離之核型多角體病毒(NPV))、β桿狀病毒(自鱗翅目昆蟲分離之顆粒體病毒(GV))、γ桿狀病毒(自膜翅目昆蟲分離之NPV)及λ桿狀病毒(自雙翅目昆蟲分離之NPV)。雖然GV通常每個包膜僅含有一個核衣殼，但NPV通常每個包膜含有單個(SNPV)或多個(MNPV)核衣殼。包膜病毒粒子在GV中進一步封閉於顆粒體蛋白基質中且在NPV中進一步封閉於多角體蛋白中。桿狀病毒通常具有溶解及封閉的生命週期。在一些實施例中，溶解及包涵的生命週期貫穿三個病毒複製階段獨立地表現：早期、晚期及極晚期。在一些實施例中，在早期階段內，病毒DNA複製發生在病毒進入宿主細胞、早期病毒基因表現及宿主基因表現機制關閉之後。在一些實施例中，在表現編碼病毒DNA複製之晚期基因的晚期階段內，病毒粒子經組裝，且由宿主細胞產生細胞外病毒(EV)。在一些實施例中，在表現多角體蛋白及p10基因之極晚期內，包涵體病毒(OV)由宿主細胞產生，且宿主細胞經溶解。由於桿狀病毒感染昆蟲物種，因此其可用作生物製劑以在桿狀病毒容許之昆蟲細胞或幼蟲中產生外源性蛋白質。不同桿狀病毒分離株，諸如加洲苜蓿夜蛾(Autographa californica)多核多角體病毒(AcMNPV)及家蠶(蠶)核多角體病毒(BmNPV)可用於外源性蛋白質表現。各種桿狀病毒表現系統為市售的，例如獲自ThermoFisher。
在一些實施例中，本文所描述之蛋白質(例如，指環病毒ORF或CAV VP1分子，例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、ORF1/2或VP1或其功能片段或剪接變異體)可使用包含一或多種本文所描述之組分的桿狀病毒表現載體(例如，穿梭載體)表現。舉例而言，桿狀病毒表現載體可包括以下中之一或多者(例如全部)：可選標記物(例如kanR)、複製起點(例如細菌複製起點及昆蟲細胞複製起點中之一或兩者)、重組酶識別位點(例如att位點)及啟動子。在一些實施例中，桿狀病毒表現載體(例如如本文所描述之穿梭載體)可藉由用編碼本文所描述之蛋白質的基因替換編碼桿狀病毒包涵體的天然存在之野生型多角體蛋白基因產生。在一些實施例中，將編碼本文所描述之蛋白質的基因選殖至含有桿狀病毒啟動子之桿狀病毒表現載體(例如如本文所描述之穿梭載體)中。在一些實施例中，桿狀病毒載體包含一或多個非桿狀病毒啟動子，例如哺乳動物啟動子或指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)啟動子。在一些實施例中，將編碼本文所描述之蛋白質的基因選殖至供體載體(例如如本文所描述)中，接著使該供體載體與空桿狀病毒表現載體(例如空穿梭載體)接觸，使得編碼本文所描述之蛋白質的基因自供體載體轉移(例如藉由同源重組或轉座酶活性)至桿狀病毒表現載體(例如穿梭載體)中。在一些實施例中，桿狀病毒啟動子由來自非必需多角體蛋白基因座之桿狀病毒DNA側接。在一些實施例中，本文所描述之蛋白質在處於病毒複製極後期之AcNPV多角體蛋白啟動子的轉錄控制下。在一些實施例中，適用於昆蟲細胞中之桿狀病毒表現之強啟動子包括但不限於桿狀病毒p10啟動子、多角體蛋白(polh)啟動子、p6.9啟動子及衣殼蛋白啟動子。適用於昆蟲細胞中之桿狀病毒表現的弱啟動子包括桿狀病毒之ie1、ie2、ie0、et1、39K (亦稱為pp31)及gp64啟動子。
在一些實施例中，重組桿狀病毒由桿狀病毒基因體(例如，野生型或突變型桿狀病毒基因體)與轉移載體之間的同源重組產生。在一些實施例中，將一或多個編碼本文所描述之蛋白質的基因選殖至轉移載體中。在一些實施例中，轉移載體進一步含有由來自非必需基因座(例如多角體蛋白基因)之DNA側接的桿狀病毒啟動子。在一些實施例中，藉由桿狀病毒基因體與轉移載體之間的同源重組將一或多個編碼本文所描述之蛋白質的基因插入桿狀病毒基因體中。在一些實施例中，桿狀病毒基因體在一或多個獨特位點經線性化。在一些實施例中，線性化位點位於用於將編碼本文所描述之蛋白質的基因插入至桿狀病毒基因體中的目標位點附近。在一些實施例中，在基因(例如多角體蛋白基因)下游缺失桿狀病毒基因體之片段的線性化桿狀病毒基因體可用於同源重組。在一些實施例中，桿狀病毒基因體及轉移載體共轉染至昆蟲細胞中。在一些實施例中，產生重組桿狀病毒之方法包含以下步驟：製備桿狀病毒基因體，以與含有編碼一或多種本文所描述之蛋白質之基因的轉移載體進行同源重組，且將轉移載體及桿狀病毒基因體DNA共轉染至昆蟲細胞中。在一些實施例中，桿狀病毒基因體包含與轉移載體之區域同源的區域。此等同源區域可增強桿狀病毒基因體與轉移載體之間的重組機率。在一些實施例中，轉移載體中之同源區域位於啟動子上游或下游。在一些實施例中，為誘導同源重組，將桿狀病毒基因體及轉移載體以約1:1至10:1之重量比混合。
在一些實施例中，重組桿狀病毒由包含藉由Tn7進行位點特異性轉座的方法產生，例如藉此將編碼本文所描述之蛋白質的基因插入至穿梭載體DNA中，例如在細菌，例如大腸桿菌(例如DH 10Bac細胞)中繁殖。在一些實施例中，將編碼本文所描述之蛋白質的基因選殖至pFASTBAC®載體中且轉型至含有具有微型attTn7目標位點之穿梭載體DNA的勝任細胞，例如DH10BAC®勝任細胞中。在一些實施例中，桿狀病毒表現載體，例如pFASTBAC®載體可具有啟動子，例如雙啟動子(例如多角體蛋白啟動子、p10啟動子)。市售之pFASTBAC®供體質體包括：pFASTBAC 1、pFASTBAC HT及pFASTBAC DUAL。在一些實施例中，鑑定含有重組穿梭載體DNA之菌落且分離穿梭載體DNA以轉染昆蟲細胞。
在一些實施例中，桿狀病毒載體連同輔助核酸一起引入至昆蟲細胞中。引入可為同時的或依序的。在一些實施例中，輔助核酸提供一或多種桿狀病毒蛋白質，例如以促進桿狀病毒載體之封裝。
在一些實施例中，昆蟲細胞中產生之重組桿狀病毒(例如藉由同源重組)經擴增且用於感染用於重組蛋白表現的昆蟲細胞(例如在對數生長中期內)。在一些實施例中，藉由細菌(例如大腸桿菌)中之位點特異性轉座產生的重組穿梭載體DNA用於使用轉染劑(例如Cellfectin® II)轉染昆蟲細胞。關於桿狀病毒表現系統之額外資訊論述於美國專利申請案第14/447,341號、第14/277,892號及第12/278,916號中，該等申請案以引用之方式併入本文中。
昆蟲細胞系統本文所描述之蛋白質可在經重組桿狀病毒或穿梭載體DNA感染或轉染之昆蟲細胞中表現，例如如上文所描述。在一些實施例中，昆蟲細胞包括：衍生自草地黏蟲之Sf9及Sf21細胞以及衍生自粉紋夜蛾之Tn-368及High Five™ BTI-TN-5B1-4細胞(亦稱為Hi5細胞)。在一些實施例中，衍生自草地黏蟲蛹秋黏蟲之卵巢的昆蟲細胞株Sf21及Sf9可用於使用桿狀病毒表現系統來表現重組蛋白。在一些實施例中，Sf21及Sf9昆蟲細胞可在市售補充血清或無血清培養基中培養。適用於培養昆蟲細胞之培養基包括：格里斯氏補充(Grace's Supplemented) (TNM-FH)、IPL-41、TC-100、施奈德果蠅(Schneider's Drosophila)、SF-900 II SFM或及EXPRESS-FIVE™ SFM。在一些實施例中，一些無血清培養基調配物利用磷酸鹽緩衝液系統將培養物pH維持在6.0-6.4範圍內(Licari等人Insect cell hosts for baculovirus expression vectors contain endogenous exoglycosidase activity. Biotechnology Progress 9: 146-152 (1993)及Drugmand等人Insect cells as factories for biomanufacturing. Biotechnology Advances 30:1140-1157 (2012))，以用於培養及重組蛋白生產。在一些實施例中，可使用6.0-6.8之pH培養各種昆蟲細胞株。在一些實施例中，昆蟲細胞在25℃至30℃之間的溫度下、在充氣下懸浮培養或以單層形式培養。關於昆蟲細胞之額外資訊論述於例如美國專利申請案第14/564,512號及第14/775,154號中，其各自以引用的方式併入本文中。
哺乳動物細胞系統在一些實施例中，本文所描述之蛋白質可在用例如如本文所描述之編碼蛋白質之載體感染或轉染的動物細胞株中活體外表現。在本發明之上下文中設想之動物細胞株包括豬細胞株，例如永生化豬細胞株，諸如(但不限於)豬腎上皮細胞株PK-15及SK、單骨髓細胞株3D4/31及睪丸細胞株ST。另外，包括其他哺乳動物細胞株，諸如CHO細胞(中國倉鼠卵巢)、MARC-145、MDBK、RK-13、EEL。另外或替代地，本發明之方法之特定實施例利用作為上皮細胞株，亦即上皮譜系細胞之細胞株的動物細胞株。適用於表現本文所描述之蛋白質的細胞株包括但不限於人類或靈長類動物來源之細胞株，諸如人類或靈長類動物腎臟癌細胞株。
例如用於組裝指環病毒科家族載體之遺傳元件構築體如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的遺傳元件可由包含遺傳元件區及視情況其他序列(諸如載體主鏈)之遺傳元件構築體產生。通常，遺傳元件構築體包含指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒) 5' UTR (例如，如本文所描述)。遺傳元件構築體可為適用於將遺傳元件之序列遞送至宿主細胞中之任何核酸構築體，其中遺傳元件可包封於蛋白質外部內。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含啟動子。在一些實施例中，遺傳元件構築體為線性核酸分子。在一些實施例中，遺傳元件構築體為環形核酸分子(例如質體、桿狀病毒質體或微型環，例如如本文所描述)。在一些實施例中，遺傳元件構築體可為雙股的。在其他實施例中，遺傳元件為單股的。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含DNA。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含RNA。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含一或多個經修飾之核苷酸。
在一些態樣中，本發明提供一種用於複製及傳播如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)(例如，在細胞培養物系統中)之方法，其可包含以下步驟中之一或多者：(a)將遺傳元件(例如，線性化)引入(例如，轉染)至對指環病毒科家族載體(例如，指環載體)感染敏感之細胞株中；(b)收穫細胞且視情況分離展現出遺傳元件之存在的細胞；(c)視實驗條件及基因表現而培養在步驟(b)中獲得之細胞(例如，持續至少三天，諸如至少一週或更久)；及(d)收穫步驟(c)之細胞，例如如本文所描述。
質體在一些實施例中，遺傳元件構築體為質體。質體將一般包含如本文所描述之遺傳元件之序列以及適用於在宿主細胞中複製之複製起點(例如細菌細胞中複製之細菌複製起點)及可選標記物(例如抗生素抗性基因)。在一些實施例中，遺傳元件之序列可自質體切除。在一些實施例中，質體能夠在細菌細胞中複製。在一些實施例中，質體能夠在哺乳動物細胞(例如人類細胞)中複製。在一些實施例中，質體之長度為至少300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000 bp。在一些實施例中，質體之長度為小於600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000 bp。在一些實施例中，質體之長度在300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-4000或4000-5000 bp之間。在一些實施例中，遺傳元件可自質體切除(例如藉由活體外環化)，例如以形成微型環，例如如本文所描述。在實施例中，遺傳元件之切除將遺傳元件序列與質體主鏈分開(例如將遺傳元件與細菌主鏈分開)。
小環形核酸構築體在一些實施例中，遺傳元件構築體為環形核酸構築體，例如缺乏主鏈(例如缺乏細菌複製起點及/或可選標記物)。在實施例中，遺傳元件為雙股環形核酸構築體。在實施例中，雙股環形核酸構築體係藉由活體外環化(IVC)產生，例如如本文所描述。在實施例中，雙股環形核酸構築體可引入至宿主細胞中，在其中其可轉化為或用作用於產生單股環形遺傳元件之模板，例如如本文所描述。在一些實施例中，環狀核酸構築體不包含質體主鏈或其功能片段。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度為至少2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400或4500 bp。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度小於2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5500或6000 bp。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度在2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、2900-3000、3000-3100、3100-3200、3200-3300、3300-3400、3400-3500、3500-3600、3600-3700、3700-3800、3800-3900、3900-4000、4000-4100、4100-4200、4200-4300、4300-4400或4400-4500之間。在一些實施例中，環形核酸構築體為微型環。
活體外環化在一些情況下，待封裝至蛋白質外部中之遺傳元件為單股環形DNA。在一些情況下，遺傳元件可經由具有除單股環形DNA以外之形式的遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。例如，遺傳元件構築體可為雙股環形DNA。雙股環狀DNA隨後可在宿主細胞(例如包含適用於滾環複製之酶的宿主細胞，例如指環病毒Rep蛋白，例如Rep68/78、Rep60、RepA、RepB、Pre、MobM、TraX、TrwC、Mob02281、Mob02282、NikB、ORF50240、NikK、TecH、OrfJ或TraI，例如如Wawrzyniak等人2017, Front. Microbiol. 8: 2353中所描述；其就所列酶而言以引用的方式併入本文中)中轉化為單股環狀DNA。在一些實施例中，雙股環狀DNA係藉由活體外環化(IVC)產生，例如如實例15中所描述。
一般而言，活體外環化DNA構築體可藉由消化待封裝之遺傳元件構築體(例如包含遺傳元件之序列的質體)產生，使得該遺傳元件序列作為線性DNA分子切除。所得線性DNA可接著例如使用DNA連接酶連接，以形成雙股環形DNA。在一些情況下，藉由活體外環化產生之雙股環狀DNA可經歷例如如本文所描述之滾環複製。不希望受理論所束縛，經考慮活體外環化產生可在無進一步修飾之情況下進行滾環複製之雙股DNA構築體，由此能夠產生具有適合待封裝於指環病毒科家族載體(例如，指環載體)中之尺寸的單股環形DNA，例如如本文所描述。在一些實施例中，雙股DNA構築體小於質體(例如細菌質體)。在一些實施例中，雙股DNA構築體自質體(例如細菌質體)切除且接著例如藉由活體外環化而進行環化。
串聯構築體在一些實施例中，遺傳元件構築體包含以串聯方式佈置之遺傳元件序列(例如，遺傳元件之核酸序列，例如如本文所描述)之第一複本及遺傳元件序列(例如，相同遺傳元件之核酸序列，或不同遺傳元件之核酸序列)之第二複本的至少一部分。具有此類結構之遺傳元件構築體在本文中一般稱為串聯構築體。此類串聯構築體用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件。在一些情況下，遺傳元件序列之第一複本及遺傳元件序列之第二複本在遺傳酸構築體上可彼此緊鄰。在其他情況下，遺傳元件序列之第一複本及遺傳元件序列之第二複本可例如藉由間隔序列分開。在一些實施例中，遺傳元件序列之第二複本或其部分包含上游複製促進序列(uRFS)，例如如本文所描述。在一些實施例中，遺傳元件序列之第二複本或其部分包含下游複製促進序列(dRFS)，例如如本文所描述。在一些實施例中，uRFS及/或dRFS包含複製起點(例如，哺乳動物複製起點、昆蟲複製起點或病毒複製起點，例如非指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒)複製起點，例如如本文所描述)或其部分。在一些實施例中，uRFS及/或dRFS不包含複製起點。在一些實施例中，uRFS及/或dRFS包含髮夾環(例如在5' UTR中)。在一些實施例中，串聯構築體產生的遺傳元件水準高於不具有遺傳元件之第二複本或其部分的其他類似構築體。不受理論束縛，在一些實施例中，本文所描述之串聯構築體可藉由滾環複製進行複製。在一些實施例中，串聯構築體為質體。在一些實施例中，串聯構築體為環狀。在一些實施例中，串聯構築體為直鏈。在一些實施例中，串聯構築體為單股。在一些實施例中，串聯構築體為雙股。在一些實施例中，串聯構築體為DNA。
在一些情況下，串聯構築體可包括遺傳元件之序列之第一複本及遺傳元件之序列之第二複本或其一部分。應理解，第二複本可為第一複本之相同複本或其部分，或可包含一或多個序列差異，例如取代、添加或缺失。在一些情況下，遺傳元件序列之第二複本或其部分相對於遺傳元件序列之第一複本定位於5'。在一些情況下，遺傳元件序列之第二複本或其部分相對於遺傳元件序列之第一複本定位於3'。在一些情況下，遺傳元件序列之第二複本或其部分及遺傳元件序列之第一複本彼此緊鄰於串聯構築體上。在一些情況下，遺傳元件序列之第二複本或其部分及遺傳元件序列之第一複本可例如藉由間隔序列分開。
在一些實施例中，本文所描述之串聯構築體可用於產生包含囊封包含結合至衣殼之蛋白質結合序列及編碼治療性效應子之異源(例如，相對於自其中衍生出ORF1分子之指環病毒或自其中衍生出VP1分子之CAV)序列之遺傳元件的衣殼(例如，包含指環病毒ORF，例如ORF1分子，例如如本文所描述之分子的衣殼；或包含CAV VP1，例如VP1分子，例如如本文所描述之分子的衣殼)之載體(例如，如本文所描述之指環病毒科家族載體)、媒劑或粒子(例如，病毒粒子)之遺傳元件。在實施例中，載體能夠將遺傳元件遞送至哺乳動物(例如，人類)細胞中。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體序列具有低於約50% (例如，低於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5.5%、5%、4.5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%或更低)一致性。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體序列具有不超過1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%或80%一致性。在一些實施例中，遺傳元件具有大於約2000、3000、4000、4500或5000個連續核苷酸之非家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體序列。在一些實施例中，遺傳元件具有大於約2000至5000、2500至4500、3000至4500、2500至4500、3500或4000、4500 (例如，在約3000至4500之間)個連續核苷酸之非指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)基因體序列。
在本文之系統及方法的一些實施例中，載體(例如，指環病毒科家族載體，例如如本文所描述)藉由將作為遺傳元件或遺傳元件構築體，例如串聯構築體的第一核酸分子及編碼一或多個額外蛋白質(例如，Rep分子及/或衣殼蛋白)，例如如本文所描述之蛋白質的第二核酸分子引入細胞中產生。在一些實施例中，第一核酸分子與第二核酸分子彼此連接(例如在本文所描述之遺傳元件構築體中，例如以順式連接)。在一些實施例中，第一核酸分子與第二核酸分子為分離的(例如以反式)。在一些實施例中，第一核酸分子為質體、黏質體、桿狀病毒質體(bacmid)、微型環或人工染色體。在一些實施例中，第二核酸分子為質體、黏質體、桿狀病毒質體、微型環或人造染色體。在一些實施例中，第二核酸分子整合至宿主細胞之基因體中。
在一些實施例中，該方法進一步包括將第一核酸分子及/或第二核酸分子引入宿主細胞中。在一些實施例中，第二核酸分子係在第一核酸分子之前、與其同時或在其之後引入宿主細胞中。在其他實施例中，第二核酸分子整合至宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，第二核酸分子為例如如本文所描述之輔助構築體、輔助病毒或其他輔助載體或包含輔助構築體、輔助病毒或其他輔助載體或為輔助構築體、輔助病毒或其他輔助載體之一部分。
可用於本發明中之串聯構築體的額外描述描述於例如PCT公開案第WO 2021252955號中，其以全文引用的方式併入本文中。
順式 / 反式構築體 在一些實施例中，如本文所描述之遺傳元件構築體一或多個編碼一或多個指環病毒科家族病毒ORF，例如蛋白質外部組分(例如，由指環病毒ORF1或CAV VP1核酸編碼之多肽，例如如本文所描述)的序列。舉例而言，遺傳元件構築體可包含編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子之核酸序列。此類遺傳元件構築體可適於以順式將遺傳元件及指環病毒科家族病毒ORF引入至宿主細胞中。在其他實施例中，如本文所描述之遺傳元件構築體不包含編碼一或多個指環病毒科家族病毒ORF，例如蛋白質外部組分(例如，由指環病毒ORF1或CAV VP1核酸編碼之多肽，例如如本文所描述)的序列。舉例而言，遺傳元件構築體可包含編碼指環病毒ORF1分子或CAV VP1分子之核酸序列。此類遺傳元件構築體可適用於將遺傳元件引入至宿主細胞中，其中該一或多種指環病毒科家族病毒ORF以反式提供(例如，經由引入編碼指環病毒科家族病毒ORF中之一或多者的第二核酸構築體，或經由整合至宿主細胞基因體中之指環病毒科家族病毒ORF卡匣)。在一些實施例中，ORF1分子以反式提供，例如如本文所描述。在一些實施例中，ORF2分子以反式提供，例如如本文所描述。在一些實施例中，ORF1分子及ORF2分子均以反式提供，例如如本文所描述。在一些實施例中，VP1分子以反式提供，例如如本文所描述。
在一些實施例中，遺傳元件構築體包含編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子，或其剪接變異體或功能片段(例如，果凍卷區域，例如如本文所描述)的序列。在實施例中，不包含遺傳元件之序列的遺傳元件之部分包含編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子或其剪接變異體或功能性片段之序列(例如，在包含啟動子及編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子或其剪接變異體或功能性片段之序列的卡匣中)。在其他實施例中，包含遺傳元件之序列的構築體之部分包含編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子，或其剪接變異體或功能性片段(例如，果凍卷區域，例如如本文所描述)的序列。在實施例中，蛋白質外部(例如，如本文所描述)中之此類遺傳元件的包殼產生複製組分指環病毒科家族載體(例如，指環載體) (例如，指環病毒科家族載體，其在感染細胞之後使得細胞產生指環載體之額外複本而不將其他核酸構築體，例如編碼如本文所描述之一或多個指環病毒科家族病毒ORF引入至細胞中)。
在其他實施例中，遺傳元件不包含編碼指環病毒ORF1分子或CAV VP1分子，或其剪接變異體或功能性片段(例如，果凍卷區域，例如如本文所描述)的序列。在實施例中，蛋白質外部(例如，如本文所描述)中之此類遺傳元件的包殼產生複製缺陷型指環病毒科家族載體(例如，指環載體) (例如，指環病毒科家族載體，其在感染細胞之後使得感染細胞無法產生額外指環病毒科家族載體，例如在不存在一或多個額外構築體之情況下，例如編碼一或多個如本文所描述之指環病毒或CAV ORF)。
表現卡匣在一些實施例中，遺傳元件構築體包含一或多個用於表現多肽或非編碼RNA (例如miRNA或siRNA)的卡匣。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含用於表現效應子(例如外源性或內源性效應子)，例如如本文所描述之多肽或非編碼RNA的卡匣。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含用於表現指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)蛋白質(例如，指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或CAV VP1，或其功能片段)之卡匣。在一些實施例中，表現卡匣可位於遺傳元件序列內。在實施例中，效應子之表現卡匣位於遺傳元件序列內。在實施例中，用於指環病毒科家族病毒蛋白質之表現卡匣定位於遺傳元件序列內。在其他實施例中，表現卡匣位於遺傳元件構築體內遺傳元件序列之外的位置處(例如主鏈中)。在實施例中，用於指環病毒科家族病毒蛋白質之表現卡匣位於遺傳元件序列之外的遺傳元件構築體內的位置(例如主鏈中)。
多肽表現卡匣一般包含啟動子及編碼多肽之編碼序列，該多肽例如效應子(例如如本文所描述之外源性或內源性效應子)或指環病毒科家族病毒蛋白質(例如，編碼指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或CAV VP1，或其功能片段的序列)。可包括於多肽表現卡匣中(例如以驅動多肽表現)之例示性啟動子包括但不限於組成性啟動子(例如CMV、RSV、PGK、EF1a或SV40)、細胞或組織特異性啟動子(例如骨骼α-肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白輕鏈2A啟動子、肌縮蛋白啟動子、肌肉肌酸激酶啟動子、肝白蛋白啟動子、B型肝炎病毒核心啟動子、骨鈣化素啟動子、骨唾液蛋白啟動子、CD2啟動子、免疫球蛋白重鏈啟動子、T細胞受體a鏈啟動子、神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子或神經絲輕鏈啟動子)及誘導性啟動子(例如鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子；地塞米松(Dex)誘導性小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子；T7聚合酶啟動子系統、四環素抑制性系統、四環素誘導性系統、RU486誘導性系統、雷帕黴素誘導性系統)，例如如本文所描述。在一些實施例中，表現卡匣進一步包含強化子，例如如本文所描述。
遺傳元件構築體之設計及產生各種方法可用於合成遺傳元件構築體。例如，遺傳元件構築體序列可分成更易於合成之較小重疊片段(例如在約100 bp至約10 kb區段或個別ORF範圍內)。此等DNA區段由一組重疊單股寡核苷酸合成。接著將所得重疊合成子組裝成較大DNA片段，例如遺傳元件構築體。區段或ORF可例如藉由活體外再結合或5'及3'末端處之獨特限制位點組裝成遺傳元件構築體，以實現連接。
遺傳元件構築體可由設計演算法合成，該演算法將構築體序列解析為寡核苷酸長度的片段，產生適用於合成之設計條件，其考慮序列空間之複雜性。隨後在基於半導體之高密度晶片上化學合成寡核苷酸，其中每個晶片合成超過200,000個個別寡核苷酸。用諸如BioFab®之組裝技術組裝寡核苷酸，以自較小寡核苷酸建構較長DNA區段。此係以並行方式進行，因此一次性建構數百至數千個合成DNA區段。
各遺傳元件構築體或遺傳元件構築體區段可經序列驗證。在一些實施例中，RNA或DNA之高通量定序可使用允許監測生物過程(例如miRNA表現)或對偶基因變異性(SNP偵測)之AnyDot.chip (Genovoxx, Germany)進行。其他高產量定序系統包括Venter, J., 等人Science 2001年2月16日；Adams, M.等人, Science 2000年3月24日；及M. J, Levene等人Science 299:682-686, 2003年1月以及美國公開申請案第20030044781號及第2006/0078937號中所揭示之彼等定序系統。總體而言，此類系統涉及經由在核酸分子上量測之聚合反應藉由暫時添加鹼基來定序具有複數個鹼基之目標核酸分子，亦即，即時追蹤核酸聚合酶在待定序之模板核酸分子上的活性。在一些實施例中，進行霰彈槍定序(shotgun sequencing)。
遺傳元件構築體可經設計以使得用於複製或封裝之因子可相對於遺傳元件以順式或反式提供。舉例而言，當以順式提供時，遺傳元件可包含編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3或CAV VP1之一或多個基因，例如如本文所描述。在一些實施例中，複製及/或封裝信號可併入至遺傳元件中，例如以誘導擴增及/或囊封。在一些實施例中，將效應子插入至基因體中之特定位點中。在一些實施例中，一或多個病毒ORF經效應子置換。
在另一實例中，當複製或封裝因子以反式提供時，遺傳元件可缺乏編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3或CAV VP1中之一或多者的基因，例如如本文所描述；此一或多種蛋白質可例如由另一核酸，例如輔助核酸供應。在一些實施例中，最小順式訊號(例如，5'UTR及/或富含GC之區)存在於遺傳元件中。在一些實施例中，遺傳元件不編碼複製或封裝因子(例如，複製酶及/或衣殼蛋白)。在一些實施例中，此類因子可由一或多種輔助核酸(例如輔助病毒核酸、輔助質體或整合至宿主細胞基因體中之輔助核酸)供應。在一些實施例中，輔助核酸表現足以誘導擴增及/或封裝之蛋白質及/或RNA，但可能缺乏其自身的封裝信號。在一些實施例中，將遺傳元件及輔助核酸引入至宿主細胞中(例如同時或分開)，引起遺傳元件之擴增及/或封裝，但不引起輔助核酸之擴增及/或封裝。
在一些實施例中，可使用電腦輔助設計工具設計遺傳元件構築體。
產生構築體之一般方法描述於例如Khudyakov及Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)；Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (第一版), Academic Press (2013)；及Egli及Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (第一版), Wiley-VCH (2012)中。
效應子本文所描述之組合物及方法可用於產生包含編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)，例如如本文所描述之效應子之序列的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件。在一些情況下，效應子可為內源性效應子或外源性效應子。在一些實施例中，效應子係治療性效應子。在一些實施例中，效應子包含多肽(例如治療性多肽或肽，例如如本文所描述)。在一些實施例中，效應子包含非編碼RNA (例如miRNA、siRNA、shRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA或gRNA)。在一些實施例中，效應子包含例如如本文所描述之調節核酸。
在一些實施例中，效應子編碼序列可例如在非編碼區處插入遺傳元件中，該非編碼區例如安置於遺傳元件之開讀框之3'及富含GC區之5'的非編碼區、在TATA盒上游之5'非編碼區中、在5' UTR中、在poly-A信號下游之3'非編碼區中或在富含GC區上游。在一些實施例中，效應子編碼序列可插入至遺傳元件中，例如編碼序列中(例如，編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3或CAV VP1之序列中，例如如本文所描述)。在一些實施例中，效應子編碼序列替代開讀框之全部或一部分。在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接於效應子編碼序列之調控序列(例如啟動子或強化子，例如如本文所描述)。
宿主細胞本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可例如在宿主細胞中產生。通常，提供一種宿主細胞，其包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件及指環病毒科家族載體(例如，指環載體)蛋白質外部(例如，由指環病毒ORF1核酸或CAV VP1核酸或指環病毒ORF1或CAV VP1分子編碼之多肽)之組分。接著在適用於將遺傳元件包封於蛋白質外部內之條件(例如如本文所描述之培養條件)下培育宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞在適用於將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)自宿主細胞中釋放至例如周圍上清液中之條件下進一步培育。在一些實施例中，溶解宿主細胞以自細胞溶解物中收穫指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可引入至生長至較高細胞密度之宿主細胞株中。在一些實施例中，宿主細胞為Expi-293細胞。
將遺傳元件引入至宿主細胞中可將包含遺傳元件之序列的遺傳元件或核酸構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，將遺傳元件本身引入至宿主細胞中。在一些實施例中，將包含遺傳元件(例如如本文所描述)之序列的遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。遺傳元件或遺傳元件構築體可例如使用此項技術中已知之方法引入至宿主細胞中。例如，可藉由轉染(例如穩定轉染或短暫轉染)將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在實施例中，藉由脂染胺(lipofectamine)轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在實施例中，藉由磷酸鈣轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，遺傳元件或遺傳元件構築體藉由電穿孔引入至宿主細胞中。在一些實施例中，使用基因槍將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，遺傳元件或遺傳元件構築體藉由核轉染引入至宿主細胞中。在一些實施例中，藉由PEI轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，遺傳元件藉由使宿主細胞與包含遺傳元件之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸而引入至宿主細胞中。在一些實施例中，將細胞懸浮於2S Chica緩衝液(例如，如本文所描述，例如實例20中)。
在實施例中，一旦引入至宿主細胞中遺傳元件構築體便能夠複製。在實施例中，一旦引入至宿主細胞中遺傳元件可自遺傳元件構築體中產生。在一些實施例中，遺傳元件藉由聚合酶，例如使用遺傳元件構築體作為模板在宿主細胞中產生。
在一些實施例中，將遺傳元件或包含遺傳元件之載體引入(例如，轉染)至表現病毒聚合酶蛋白質之細胞株中，以便達成指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之表現。為此目的，表現指環病毒科家族載體(例如，指環載體)聚合酶蛋白質之細胞株可用作適當宿主細胞。宿主細胞可類似地經工程化以提供其他病毒功能或額外功能。
為了製備本文所揭示之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，遺傳元件構築體可用於轉染提供指環病毒科家族載體(例如，指環載體)蛋白質及複製及產生所需功能的細胞。或者，細胞可經第二構築體(例如，病毒)轉染，從而在本文所揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體轉染之前、期間或之後提供指環病毒科家族載體(例如，指環載體)蛋白質及功能。在一些實施例中，第二構築體可適用於補充不完全病毒粒子之產生。第二構築體(例如病毒)可具有條件性生長缺陷，諸如宿主範圍限制或溫度靈敏度，例如其允許轉染子病毒之後續選擇。在一些實施例中，第二構築體可提供宿主細胞所用之一或多個複製蛋白質以實現指環病毒科家族載體(例如，指環載體)表現。在一些實施例中，宿主細胞可經編碼病毒蛋白質，諸如一或多種複製蛋白質之載體轉染。在一些實施例中，第二構築體包含抗病毒靈敏度。
在一些情況下，使用此項技術中已知之技術，本文所揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體可複製且產生至指環病毒科家族載體(例如，指環載體)中。例如，各種病毒培養方法描述於例如美國專利第4,650,764號；美國專利第5,166,057號；美國專利第5,854,037號；歐洲專利公開案EP 0702085A1；美國專利申請案序列號09/152,845；國際專利公開案PCT WO97/12032；WO96/34625；歐洲專利公開案EP-A780475；WO 99/02657；WO 98/53078；WO 98/02530；WO 99/15672；WO 98/13501；WO 97/06270；及EPO 780 47SA1中，其各自以全文引用之方式併入本文中。
提供呈順式或反式之蛋白質的方法 在一些實施例(例如本文所描述之順式實施例)中，遺傳元件構築體進一步包含一或多個表現卡匣，該表現卡匣包含指環病毒ORF (例如，指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或CAV VP1，或其功能片段)之編碼序列。在實施例中，遺傳元件構築體包含包括指環病毒ORF1或CAV VP1或其剪接變異體或功能性片段之編碼序列的表現卡匣。包含效應子以及一或多個指環病毒科家族病毒ORF之表現卡匣的此類遺傳元件構築體可引入至宿主細胞中。在一些情況下，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞能夠產生用於蛋白質外部之遺傳元件及組分，且能夠在蛋白質外部內包封遺傳元件，而無需額外核酸構築體或將表現卡匣整合至宿主細胞基因體中。換言之，此類遺傳元件構築體可用於例如如本文所描述之宿主細胞中之順式指環病毒科家族載體(例如，指環載體)產生方法。
在一些實施例中(例如，本文所描述之反式實施例)，遺傳元件不包含含有一或多個指環病毒科家族病毒ORF (例如，指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或CAV VP1或其功能片段)之編碼序列的表現卡匣。在實施例中，遺傳元件構築體不包含含有指環病毒ORF1或CAV VP1或其剪接變異體或功能性片段之編碼序列的表現卡匣。可將此類遺傳元件構築體引入至宿主細胞中，該等構築體包含用於效應子之表現卡匣但缺乏用於一或多個指環病毒科家族病毒ORF (例如，指環病毒ORF1、CAV VP1或其剪接變異體或功能片段)之表現卡匣。在一些情況下，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞可能需要額外核酸構築體或將表現卡匣整合至宿主細胞基因體中以用於產生指環載體之一或多種組分(例如蛋白質外部蛋白質)。在一些實施例中，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞不能在缺乏編碼指環病毒ORF1或CAV VP1分子之額外核酸構築體之情況下在蛋白質外部內包封遺傳元件。換言之，例如如本文所描述，此類遺傳元件構築體可用於宿主細胞中之反式指環載體產生方法。
在一些實施例中(例如，本文所描述之順式實施例)，遺傳元件構築體進一步包含一或多個表現卡匣，其包含用於一或多個非指環病毒科家族病毒ORF (例如，非指環病毒或非CAV Rep分子，例如AAV Rep分子，例如AAV Rep蛋白質，例如AAV Rep2蛋白質)之編碼序列。包含效應子以及一或多個非指環病毒科家族病毒ORF之表現卡匣的此類遺傳元件構築體可引入至宿主細胞中。在一些情況下，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞能夠產生用於蛋白質外部之遺傳元件及組分，且能夠在蛋白質外部內包封遺傳元件，而無需額外核酸構築體或將表現卡匣整合至宿主細胞基因體中。換言之，此類遺傳元件構築體可用於例如如本文所描述之宿主細胞中之順式指環病毒科家族載體(例如，指環載體)產生方法。
在一些實施例中(例如，本文所描述之反式實施例)，遺傳元件不包含表現卡匣，其包含用於一或多個非指環病毒科家族病毒ORF (例如，非指環病毒或非CAV Rep分子，例如AAV Rep分子，例如AAV Rep蛋白質，例如AAV Rep2蛋白質)之編碼序列。可將此類遺傳元件構築體引入至宿主細胞中，該等構築體包含用於效應子之表現卡匣但缺乏用於一或多個非指環病毒科家族病毒ORF (例如，非指環病毒或非CAV Rep分子，例如AAV Rep分子，例如AAV Rep蛋白質，例如AAV Rep2蛋白質)之表現卡匣。在一些情況下，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞可能需要額外核酸構築體或表現卡匣整合至宿主細胞基因體中以用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之一或多種組分(例如，用於遺傳元件之複製)。在一些實施例中，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞無法在不存在額外核酸構築體，例如編碼非指環病毒或非CAV Rep分子，例如AAV Rep分子，例如AAV Rep蛋白質，例如AAV Rep2蛋白質之情況下複製遺傳元件。換言之此類遺傳元件構築體可用於例如如本文所描述之宿主細胞中之反式指環病毒科家族載體(例如，指環載體)產生方法中。
例示性細胞類型適用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之例示性宿主細胞包括(但不限於)哺乳動物細胞，例如人類細胞及昆蟲細胞。在一些實施例中，宿主細胞為人類細胞或細胞株。在一些實施例中，細胞為免疫細胞或細胞株，例如T細胞或細胞株、癌細胞株、肝細胞或細胞株、神經元、膠質細胞、皮膚細胞、上皮細胞、間葉細胞、血細胞、內皮細胞、眼睛細胞(例如，感光細胞、視網膜細胞、後眼杯(PEC)細胞、視網膜神經節細胞、視神經細胞、視神經頭細胞或視網膜色素上皮(RPE)細胞)、胃腸道細胞、祖細胞、前驅體細胞、幹細胞、肺細胞、心臟細胞或肌肉細胞。在一些實施例中，宿主細胞為動物細胞(例如小鼠細胞、大鼠細胞、兔細胞、倉鼠細胞或昆蟲細胞)。
在一些實施例中，宿主細胞為淋巴細胞。在一些實施例中，宿主細胞為T細胞或永生化T細胞。在實施例中，宿主細胞為Jurkat細胞。在實施例中，宿主細胞為MOLT細胞(例如MOLT-4或MOLT-3細胞)。在實施例中，宿主細胞為MOLT-4細胞。在實施例中，宿主細胞為MOLT-3細胞。在一些實施例中，宿主細胞為急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)細胞，例如MOLT細胞，例如MOLT-4或MOLT-3細胞。在一些實施例中，宿主細胞為B細胞或永生化B細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含遺傳元件構築體(例如如本文所描述)。
在一些實施例中，宿主細胞為MOLT細胞(例如MOLT-4或MOLT-3細胞)。
在一些實施例中，宿主細胞為急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)細胞，例如MOLT細胞，例如MOLT-4或MOLT-3細胞。
在一些實施例中，宿主細胞為Expi-293細胞。在一些實施例中，宿主細胞為Expi-293F細胞。
在一態樣中，本發明提供一種製備包含包覆於蛋白質外部中之遺傳元件之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的方法，該方法包含提供包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件之MOLT-4細胞且在允許指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件包覆於MOLT-4細胞中之蛋白質外部中的條件下培育MOLT-4細胞。在一些實施例中，MOLT-4細胞進一步包含一或多種形成蛋白質外部之部分或全部之指環病毒蛋白質(例如指環病毒ORF1分子)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件在例如來自遺傳元件構築體(例如，如本文所描述)之MOLT-4細胞中產生。在一些實施例中，該方法進一步包含將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件構築體引入至MOLT-4細胞中。
在一態樣中，本發明提供一種製備包含包覆於蛋白質外部中之遺傳元件之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的方法，該方法包含提供包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件之MOLT-3細胞且在允許指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件包覆於MOLT-3細胞中之蛋白質外部中的條件下培育MOLT-3細胞。在一些實施例中，MOLT-3細胞進一步包含一或多種形成蛋白質外部之部分或全部之指環病毒蛋白質(例如指環病毒ORF1分子)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件在例如來自遺傳元件構築體(例如，如本文所描述)之MOLT-3細胞中產生。在一些實施例中，該方法進一步包含將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遺傳元件構築體引入至MOLT-3細胞中。
在一些實施例中，宿主細胞為人類細胞。在實施例中，宿主細胞為HEK293T細胞、HEK293F細胞、A549細胞、Jurkat細胞、Raji氏細胞、Chang氏細胞、希拉細胞、Phoenix細胞、MRC-5細胞、NCI-H292細胞或Wi38細胞。在一些實施例中，宿主細胞為非人類靈長類細胞(例如Vero細胞、CV-1細胞或LLCMK2細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為鼠類細胞(例如McCoy細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為倉鼠細胞(例如CHO細胞或BHK 21細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為MARC-145、MDBK、RK-13或EEL細胞。在一些實施例中，宿主細胞為上皮細胞(例如上皮譜系之細胞株)。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在連續動物細胞株(例如，可連續繁殖之永生化細胞株)中培養。根據本發明之一個實施例，細胞株可包括豬細胞株。在本發明之上下文中設想之細胞株包括永生化豬細胞株，諸如(但不限於)豬腎上皮細胞株PK-15及SK、單骨髓細胞株3D4/31及睪丸細胞株ST。
培養條件包含遺傳元件及蛋白質外部組分之宿主細胞可在適用於遺傳元件包封在蛋白質外部內之條件下培育，藉此產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。適合的培養條件包括例如實例4、5、7、8、9、10、11或15中之任一者中所描述的彼等培養條件。在一些實施例中，宿主細胞在液體培養基(例如，格里斯氏補充(Grace's Supplemented) (TNM-FH)、IPL-41、TC-100、施奈德果蠅(Schneider's Drosophila)、SF-900 II SFM或及EXPRESS-FIVE™ SFM)中培育。在一些實施例中，宿主細胞在黏附培養物中培育。在一些實施例中，宿主細胞在懸浮培養物中培育。在一些實施例中，宿主細胞在管、瓶、微載體或燒瓶中培育。在一些實施例中，宿主細胞在培養皿或孔(例如盤上之孔)中培育。在一些實施例中，宿主細胞在適合於宿主細胞增殖之條件下培育。在一些實施例中，在適合於宿主細胞之條件下培育宿主細胞以將其中產生之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)釋放至周圍上清液中。
根據本發明之含有指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之細胞培養物的產生可以不同規模(例如，在燒瓶、滾瓶或生物反應器中)進行。用於培養待感染細胞之培養基一般包含細胞活力所需之標準營養物，但亦可包含視細胞類型而定之額外營養物。視情況，培養基可不含蛋白質及/或不含血清。視細胞類型而定，細胞可在懸浮液中或在受質上培養。在一些實施例中，不同培養基用於生長宿主細胞且用於產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
收穫可例如根據此項技術中已知之方法收穫由宿主細胞產生之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。舉例而言，培養物中宿主細胞釋放至周圍上清液中的指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可自上清液收穫(例如，如實例4中所描述)。在一些實施例中，上清液與宿主細胞分離，以獲得指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，在收穫之前或期間溶解宿主細胞。在一些實施例中，自宿主細胞溶解物中收穫指環病毒科家族載體(例如，指環載體) (例如，如實例10中所描述)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)自宿主細胞溶解物及上清液兩者中收穫。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之純化及分離係根據病毒生產中已知之方法進行，例如如以全文引用之方式併入本文中的Rinaldi等人, DNA Vaccines: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), 第3版. 2014, Humana Press中所描述)。在一些實施例中，在用醫藥賦形劑調配之前，可基於生物物理學特性，例如離子交換層析或切向流過濾，藉由分離溶質來收穫及/或純化指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
活體外組裝方法 可例如藉由活體外組裝，例如在不含細胞之懸浮液中或在上清液中產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，遺傳元件例如在允許組裝之條件下活體外與ORF1分子接觸。
在一些實施例中，桿狀病毒構築體用於產生指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)蛋白質。此等蛋白質接著可用於例如活體外組裝以衣殼化遺傳元件，例如包含RNA之遺傳元件。在一些實施例中，編碼一或多種指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)蛋白質之聚核苷酸與啟動子融合，以便在宿主細胞(例如，昆蟲或動物細胞)中表現。在一些實施例中，將聚核苷酸選殖至桿狀病毒表現系統中。在一些實施例中，宿主細胞，例如昆蟲細胞經桿狀病毒表現系統感染且培育一段時間。在一些實施例中，將經感染細胞培育約1、2、3、4、5、10、15或20天。在一些實施例中，將經感染細胞溶解以回收指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)蛋白質。
在一些實施例中，經分離指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)蛋白質被純化。在一些實施例中，指環病毒蛋白質使用純化技術純化，包括但不限於螯合純化、肝素純化、梯度沈降純化及/或SEC純化。在一些實施例中，經純化指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒或CAV)蛋白質與遺傳元件混合以用衣殼包裹遺傳元件，例如包含RNA之遺傳元件。在一些實施例中，使用ORF1蛋白、ORF2蛋白或其經修飾形式來衣殼化遺傳元件。在一些實施例中，兩個核酸經衣殼化。舉例而言，第一核酸可為mRNA，例如經化學修飾之mRNA，且第二核酸可為DNA。
在一些實施例中，編碼指環病毒(AV) ORF1之DNA (例如野生型ORF1蛋白、含有突變例如以改良組裝效率、產量或穩定性之ORF1蛋白、嵌合ORF1蛋白或其片段)或CAV VP1表現於昆蟲細胞株(例如Sf9及/或HighFive)、動物細胞株(例如雞細胞株(MDCC))、細菌細胞(例如大腸桿菌)及/或哺乳動物細胞株(例如293expi及/或MOLT4)中。在一些實施例中，編碼AV ORF1或CAV VP1之DNA可不經標記。在一些實施例中，編碼AV ORF1或CAV VP1之DNA可含有N端及/或C端融合之標籤。在一些實施例中，編碼AV ORF1或CAV VP1之DNA可在ORF1或VP1蛋白質內具有突變、插入或缺失以引入標籤，例如以例如經由免疫染色分析(包括但不限於ELISA或西方墨點法)來輔助純化及/或鑑別確定。在一些實施例中，編碼AV ORF1或CAV VP1之DNA可單獨或與任何數目之輔助蛋白質組合表現。在一些實施例中，編碼AV ORF1之DNA與AV ORF2及/或ORF3蛋白組合表現。
在一些實施例中，具有改進組裝效率之突變的ORF1或VP1蛋白質可包括(但不限於) ORF1或VP1蛋白，其具有引入N端精胺酸臂(ARG臂)中之突變以改變ARG臂之pI，從而允許pH敏感性核酸結合以觸發粒子總成(SEQ ID 3-5)。在一些實施例中，具有改良穩定性之突變的ORF1或VP1蛋白可包括接觸典型果醬卷β桶形之β股F及G的內原聚體之突變，以改變原聚體表面之疏水性狀態且提高衣殼形成之熱力學有利性。
在一些實施例中，嵌合ORF1或VP1蛋白可包括但不限於ORF1或VP1蛋白，其序列的一或多個部分經另一衣殼蛋白的相當部分置換，該衣殼蛋白為例如喙羽病病毒(BFDV)衣殼蛋白，或E型肝炎衣殼蛋白，例如Ring 9 ORF1的ARG臂或F及G β股經來自BFDV衣殼蛋白的相當組分置換。在一些實施例中，嵌合ORF1或VP1蛋白亦可包括其序列之一或多個部分經另一AV ORF1或CAV VP1蛋白之相當部分置換(例如Ring 2 ORF1之果醬卷片段或C端部分經Ring 9 ORF1之相當部分置換)的ORF1或VP1蛋白。
在一些實施例中，本發明描述產生指環載體之方法，該方法包含：(a)提供包含以下之混合物：(i)包含RNA之遺傳元件，及(ii) ORF1分子或VP1分子；及(b)在適用於將遺傳元件包裹於包含ORF1分子或VP1分子之蛋白質外部內的條件下培育該混合物，由此產生指環載體；視情況其中該混合物不包含於細胞中。在一些實施例中，該方法在提供(a)之前進一步包含例如在宿主細胞(例如，昆蟲細胞或哺乳動物細胞)中表現ORF1分子或VP1分子。在一些實施例中，表現包含在適用於產生ORF1分子或VP1分子之條件下培育包含編碼ORF1分子或VP1分子之核酸分子(例如，桿狀病毒表現載體)的宿主細胞(例如，昆蟲細胞或哺乳動物細胞)。在一些實施例中，該方法進一步包含在提供(a)之前純化由宿主細胞表現之ORF1分子或VP1分子。在一些實施例中，該方法在無細胞系統中進行。在一些實施例中，本發明描述一種製備指環載體組合物之方法，其包含：(a)提供複數個如前述實施例中任一項之指環載體或組合物；(b)視情況評估該複數個以下中之一或多者：本文所描述之污染物、光學密度量測(例如，OD 260)、粒子數目(例如，藉由HPLC)、感染性(例如，粒子:感染性單位比率，例如，以藉由螢光及/或ELISA所測定)；及(c)例如若(b)之參數中之一或多者符合指定臨限值時，調配該複數個指環載體，例如作為適用於向個體投與之醫藥組合物。
富集及純化可純化及/或富集收穫之指環病毒科家族載體，例如以產生指環載體製劑。在一些實施例中，所收穫之指環載體與存在於收穫溶液中之其他成分或污染物分離，例如使用此項技術中已知用於純化病毒粒子之方法(例如藉由沈降、層析及/或超濾進行純化)。在一些實施例中，純化步驟包含自製劑中移除血清、宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、缺乏遺傳元件之粒子及/或酚紅中之一或多者。在一些實施例中，所收穫之指環病毒科家族載體相對於收穫溶液中存在之其他組分或污染物富集，例如使用此項技術中已知的富集病毒粒子之方法富集。
在一些實施例中，所得製備或包含製劑之醫藥組合物在可接受之時段及溫度內將為穩定的，及/或與所需投與途徑及/或此投與途徑將需要之任何裝置，例如針或注射器相容。
III.載體  本文所描述之遺傳元件可包括於載體中。適合之載體以及其製備方法及其用途為先前技術中所熟知。
在一個態樣中，本發明包括一種載體，其包含遺傳元件，該遺傳元件包含(i)編碼非致病性外部蛋白質之序列，(ii)使遺傳元件結合至非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列，及(iii)編碼調節性核酸之序列。
遺傳元件或遺傳元件內之序列中之任一者可使用任何適合之方法獲得。各種重組方法為此項技術中已知的，諸如自具有病毒序列之細胞中篩選庫、自已知包括其之載體中衍生該序列或使用標準技術自含有其之細胞及組織中直接分離。替代地或組合地，遺傳元件之一部分或所有可以合成方式產生，而非選殖。
在一些實施例中，載體包括調節元件、與目標基因同源之核酸序列及用於引起活細胞內之報導分子之表現的各種報導構築體及/或當胞內分子存在於目標細胞內時。
報導基因用於識別潛在經轉染細胞及評估調節序列功能。一般而言，報導基因為不存在於接受者生物體或組織中或由接受者生物體或組織表現的基因，且該基因編碼表現藉由一些容易偵測之特性(例如酶活性)顯現之多肽。在DNA已引入接受者細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、β-內醯胺酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶之基因，或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tei等人, 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適合的表現系統已熟知且可使用已知技術製備或商業購買。一般而言，具有展示報導基因之最高表現量之最小5'側接區的構築體識別為啟動子。此類啟動子區可連接至報導基因且用於評估調節啟動子驅動之轉錄能力的試劑。
在一些實施例中，載體在宿主細胞中為實質上非致病性及/或實質上非整合的，或在宿主中為實質上非免疫原性的。
在一些實施例中，載體呈足以調節表現型、病毒含量、基因表現、與其他病毒競爭、疾病病況等中之一或多者的量，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
IV.組合物  本文所描述之指環病毒科家族載體、指環載體或其他載體亦可包括於具有例如如本文所描述之醫藥賦形劑的醫藥組合物中。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14或10 15個指環病毒科家族載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含約10 5-10 15、10 5-10 10或10 10-10 15個指環病毒科家族載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含約10 8(例如，約10 5、10 6、10 7、10 8、10 9或10 10)個基因體當量/mL的指環病毒科家族載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含10 5-10 10、10 6-10 10、10 7-10 10、10 8-10 10、10 9-10 10、10 5-10 6、10 5-10 7、10 5-10 8、10 5-10 9、10 5-10 11、10 5-10 12、10 5-10 13、10 5-10 14、10 5-10 15或10 10-10 15個基因體當量/mL的指環病毒科家族載體，例如如根據實例18之方法所確定。在一些實施例中，醫藥組合物包含將足夠的指環病毒科家族載體，以將包含於指環病毒科家族載體中之每細胞至少1、2、5或10、100、500、1000、2000、5000、8,000、1 x 10 4、1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7或更多個複本的遺傳元件遞送至真核細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含將足夠的指環病毒科家族載體，以將包含於指環病毒科家族載體中之每細胞至少約1 x 10 4、1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7或約1 x 10 4-1 x 10 5、1 x 10 4-1 x 10 6、1 x 10 4-1 x 10 7、1 x 10 5-1 x 10 6、1 x 10 5-1 x 10 7或1 x 10 6-1 x 10 7個複本的遺傳元件遞送至真核細胞群體。應理解，本文所描述關於指環載體之適用的實施例亦可應用於指環病毒科家族載體(例如，基於或源自雞貧血病毒(CAV)之載體，例如如本文所描述)。
在一些實施例中，醫藥組合物具有以下特徵中之一或多者：醫藥組合物符合醫藥或良好作業規範(GMP)標準；醫藥組合物根據良好作業規範(GMP)製得；醫藥組合物具有低於預定參考值之病原體含量，例如實質上不含病原體；醫藥組合物具有低於之污染物含量，例如實質上不含污染物；或醫藥組合物具有較低免疫原性或實質上無免疫原性，例如如本文所描述。
在一些實施例中，醫藥組合物包含低於臨限量之一或多種污染物。醫藥組合物中宜排除或降至最低之例示性污染物包括(但不限於)宿主細胞核酸(例如，宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、宿主細胞蛋白質、動物衍生之組分(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型病毒、無感染性粒子、游離病毒衣殼蛋白、偶然性物質及聚集體。在實施例中，污染物為宿主細胞DNA。在實施例中，組合物包含每劑量小於約10 ng之宿主細胞DNA。在實施例中，組合物中之宿主細胞DNA之含量藉由過濾及/或酶降解宿主細胞DNA而降低。在實施例中，醫藥組合物由低於10重量% (例如，低於約10重量%、5重量%、4重量%、3重量%、2重量%、1重量%、0.5重量%、或0.1重量%)之污染物組成。
在一個態樣中，本文所描述之本發明包括一種醫藥組合物，其包含： a)指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含遺傳元件，該遺傳元件包含(i)編碼非致病性外部蛋白質之序列、(ii)將該遺傳元件結合至非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列及(iii)編碼調節核酸之序列；及與遺傳元件相關，例如圍封或包封遺傳元件之蛋白質外部；及 b)醫藥賦形劑。
囊泡  在一些實施例中，組合物進一步包含載體組分，例如微粒、脂質體、囊泡或胞外體。在一些實施例中，脂質體包含由圍繞內部水性隔室之單層或多層脂質雙層及相對不可滲透之外部親脂性磷脂雙層構成的球狀囊泡結構。脂質體可為陰離子型、中性或陽離子型的。脂質體具有生物相容性，無毒性，可遞送親水性及親脂性藥物分子，保護其負荷不被血漿酶降解，且將其負載轉運穿過生物膜(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. 數位物件識別碼:10.1155/2011/469679)。
囊泡可由數種不同類型之脂質製成；然而，磷脂最常用於產生脂質體作為藥物載劑。囊泡可包含但不限於DOTMA、DOTAP、DOTIM、DDAB，其單獨或連同膽固醇一起產生DOTMA及膽固醇、DOTAP及膽固醇、DOTIM及膽固醇以及DDAB及膽固醇。用於製備多層囊泡脂質之方法為此項技術中已知的(參見例如美國專利第6,693,086號，其關於多層囊泡脂質製備之教示內容以引用的方式併入本文中)。雖然當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可為自發的，但其亦可藉由使用均質機、音波處理器或擠出設備以震盪形式施加力來加快(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。擠壓脂質可藉由經由尺寸減小之過濾器擠壓來製備，如Templeton等人, Nature Biotech, 15:647-652, 1997 (其關於擠壓脂質製備之教示內容以引用的方式併入本文中)中所描述。
如本文所描述，可將添加劑添加至囊泡中以修改其結構及/或特性。舉例而言，可將膽固醇或神經鞘磷脂中之任一者添加至混合物中以幫助使結構穩定及防止內部負荷洩漏。此外，囊泡可由氫化卵磷脂醯膽鹼或卵磷脂醯膽鹼、膽固醇及磷酸二鯨蠟酯製備。(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. 數位物件識別碼:10.1155/2011/469679)。此外，囊泡可在合成期間或之後經表面修飾以包括與受體細胞上之反應性基團互補的反應性基團。此類反應性基團包括但不限於順丁烯二醯亞胺基。舉例而言，可合成囊泡以包括順丁烯二醯亞胺結合磷脂，諸如但不限於DSPE-MaL-PEG2000。
囊泡調配物可主要包含天然磷脂及脂質，諸如1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DSPC)、神經鞘磷脂、卵磷脂醯膽鹼及單唾液酸神經節苷脂。由磷脂構成之調配物僅在血漿中較不穩定。然而，用膽固醇操縱脂質膜減少經囊封負荷之快速釋放或1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)增加穩定性(關於綜述，參見例如Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。
在實施例中，脂質可用於形成脂質微粒。脂質包括但不限於DLin-KC2-DMA4、C12-200及共脂質二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(disteroylphosphatidyl choline)、膽固醇及PEG-DMG可使用自發性囊泡形成程序調配(參見例如Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3)。組分莫耳比可為約50/10/38.5/1.5 (DLin-KC2-DMA或C12-200/二硬脂醯基磷脂醯膽鹼/膽固醇/PEG-DMG)。Tekmira在美國及海外具有約95個專利系列，涉及脂質微粒及脂質微粒調配物之各種態樣(參見例如美國專利第7,982,027；7,799,565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,915,399；8,236,943及7,838,658號，及歐洲專利第1766035；1519714；1781593及1664316號)，其皆可用於及/或適用於本發明。
在一些實施例中，微粒包含以隨機方式配置之一或多種固化聚合物。微粒可為可生物降解的。可使用例如此項技術中已知之方法合成可生物降解之微粒，包括但不限於溶劑蒸發、熱熔微囊封裝、溶劑移除及噴霧乾燥。用於合成微粒之例示性方法係由Bershteyn等人, Soft Matter 4:1787-1787, 2008及在US 2008/0014144 A1中描述，其與微粒合成相關之特定教示內容以引用的方式併入本文中。
可用以形成可生物降解微粒之例示性合成聚合物包括但不限於脂族聚酯、聚(乳酸) (PLA)、聚(乙醇酸) (PGA)、乳酸與乙醇酸之共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)、聚酸酐、聚(鄰)酯、聚胺基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)及聚(丙交酯-共-己內酯)、及天然聚合物，諸如白蛋白、海藻酸鹽及其他多醣，包括聚葡萄糖及纖維素、膠原蛋白、其化學衍生物，包括化學基團之取代、添加，諸如烷基、伸烷基、羥基化、氧化、及藉由熟習此項技術者常規進行之其他改質)、白蛋白及其他親水性蛋白質、玉米蛋白及其他醇溶蛋白及疏水性蛋白，其共聚物及混合物。一般而言，此等材料藉由酶水解或暴露於水、藉由表面或整體侵蝕而降解。
微粒之直徑範圍介於0.1-1000微米(µm)。在一些實施例中，其直徑之大小範圍為1-750 µm，或50-500 µm，或100-250 µm。在一些實施例中，其直徑之大小範圍為50-1000 µm、50-750 µm、50-500 µm或50-250 µm。在一些實施例中，其直徑之大小範圍為05-1000 µm、10-1000 µm、100-1000 µm或500-1000 µm。在一些實施例中，其直徑為約0.5 µm、約10 µm、約50 µm、約100 µm、約200 µm、約300 µm、約350 µm、約400 µm、約450 µm、約500 µm、約550 µm、約600 µm、約650 µm、約700 µm、約750 µm、約800 µm、約850 µm、約900 µm、約950 µm或約1000 µm。如在微粒直徑之情形下所用，術語「約」意謂所陳述之絕對值+/-5%。
在一些實施例中，配位體經由存在於粒子表面上且存在於待連接之配位體上的官能性化學基團(羧酸、醛類、胺硫氫基及羥基)與微粒之表面結合。可藉由例如在微粒之乳液製備期間將穩定劑與官能性化學基團合併而將官能基引入至微粒中。
將官能基引入至微粒之另一實例為在粒子製備後期間藉由使粒子及配位體與同型或異型雙官能交聯劑直接交聯來進行。此程序可使用適合之化學及一類交聯劑(如下文更詳細地論述之CDI、EDAC、戊二醛等)或在製備之後經由粒子表面之化學改質將配位體耦接至粒子表面的任何其他交聯劑。此亦包括兩親媒性分子，諸如脂肪酸、脂質或功能性穩定劑藉此可被動地吸附且黏附至粒子表面，藉此引入用於繫留至配位體之功能性端基的方法。
在一些實施例中，微粒可經合成以在其外部表面上包含一或多個目標基團以靶向特定細胞或組織類型(例如心肌細胞)。此等靶向基團包括但不限於受體、配位體、抗體及其類似基團。此等靶向基團結合細胞表面上之其搭配物。在一些實施例中，微粒將整合至包含細胞表面之脂質雙層中且將粒線體遞送至細胞。
微粒亦可在其最外表面上包含脂質雙層。此雙層可由一或多種相同或不同類型之脂質組成。實例包括但不限於磷脂，諸如磷酸膽鹼及磷酸肌醇。特定實例包括(但不限於)DMPC、DOPC、DSPC及各種其他脂質，諸如本文針對脂質體所描述之脂質。
在一些實施例中，載劑包含奈米粒子，例如如本文所描述。
在一些實施例中，本文所描述之囊泡或微粒係用診斷劑功能化。診斷劑之實例包括(但不限於)用於正電子發射斷層攝影術(PET)、電腦輔助斷層攝影術(CAT)、單光子發射電腦斷層攝影術、x射線、螢光檢查及磁共振成像(MRI)之可商購的成像劑；及造影劑。適用作MRI中之造影劑之適合的材料之實例包括釓螯合物，以及鐵、鎂、錳、銅及鉻。
載體本文所描述之組合物(例如，醫藥組合物)可包含用載劑調配及/或在載劑中遞送。在一個態樣中，本發明包括一種包含含有(例如，囊封)本文所描述之組合物(例如，本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、指環病毒、CAV或遺傳元件)之載劑(例如，囊泡、脂質體、脂質奈米粒子、外泌體、紅血球、外泌體(例如，哺乳動物或植物外泌體)、融質體)的組合物，例如醫藥組合物。
在一些實施例中，本文所描述之組合物及系統可在脂質體或其他類似囊泡中調配。通常，脂質體為由圍繞內部水性區室之單層或多層脂質雙層及相對不可滲透之外部親脂性磷脂雙層構成的球狀囊泡結構。脂質體可為陰離子型、中性或陽離子型的。脂質體通常具有以下特徵中之一或多個(例如全部)：生物相容性、無毒性、可遞送親水性及親油性藥物分子二者、可保護其負荷免於受血漿酶降解，且可將其負載轉運穿過生物膜及血腦障壁(BBB) (參見例如Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679; and Zylberberg & Matosevic. 2016. Drug Delivery, 23:9, 3319-3329, doi: 10.1080/10717544.2016.1177136)。
囊泡可由數種不同類型之脂質製成；然而，磷脂最常用於產生脂質體作為藥物載劑。用於製備多層囊泡脂質之方法為已知的(參見例如美國專利第6,693,086號，其關於多層囊泡脂質製備之教示內容以引用的方式併入本文中)。雖然當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可為自發的，但其亦可藉由使用均質機、音波處理器或擠出設備以震盪形式施加力來加速(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。擠壓脂質可藉由擠壓穿過尺寸減小之過濾器來製備，如Templeton等人, Nature Biotech, 15:647-652, 1997中所描述。
脂質奈米粒子(LNP)為載劑的另一實例，其可提供本文所描述之醫藥組合物生物相容及可生物降解遞送系統。參見例如Gordillo-Galeano等人. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 第133卷, December 2018, 第285-308頁。奈米結構脂質載劑(NLC)為保留SLN特徵、改善藥物穩定性及負載能力且防止藥物滲漏之經修飾固體脂質奈米粒子(SLN)。聚合物奈米粒子(PNP)為藥物遞送之重要組成部分。此等奈米粒子可有效地將藥物遞送引導至特定目標，且改良藥物穩定性及受控藥物釋放。亦可採用脂質-聚合物奈米粒子(PLN)，其為組合脂質體及聚合物之一種新類型載劑。此等奈米粒子具有PNP及脂質體之互補優點。PLN由核-殼結構構成；聚合物核提供穩定結構，且磷脂殼提供良好生物相容性。因此，兩種組分增加藥物囊封效率，促進表面修飾，且防止水溶性藥物滲漏。關於綜述，參見例如Li等人2017, Nanomaterials 7, 122; 數位物件識別碼:10.3390/nano7060122。
胞外體亦可用作本文所描述之組合物及系統的藥物遞送媒劑。關於評述，參見Ha等人2016年七月. Acta Pharmaceutica Sinica B. 第6卷, 第4期, 第287-296頁；doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
活體外分化之紅血球亦可用作本文所描述之組合物的載劑。參見例如WO2015073587；WO2017123646；WO2017123644；WO2018102740；wO2016183482；WO2015153102；WO2018151829；WO2018009838；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136；美國專利9,644,180；Huang等人2017. Nature Communications 8: 423；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136。
例如如WO2018208728中所描述之融質體組合物亦可用作載劑以遞送本文所描述之組合物。
膜滲透多肽  在一些實施例中，組合物進一步包含膜滲透多肽(MPP)，以攜帶組分進入細胞中或穿過膜，例如細胞或細胞核膜。能夠促進將物質轉運穿過膜之膜滲透多肽包括(但不限於)細胞穿透肽(CPP)(參見例如美國專利第8,603,966號)、用於植物胞內遞送之融合肽(參見例如Ng等人., PLoS One, 2016, 11:e0154081)、蛋白質轉導域、Trojan肽及膜移位訊號(MTS) (參見例如Tung等人., Advanced Drug Delivery Reviews 55:281-294 (2003))。一些MPP富含具有帶正電側鏈之胺基酸，諸如精胺酸。
膜滲透多肽具有誘導組分之膜滲透及允許在全身性投與時在多個組織之細胞內大分子活體內易位的能力。膜滲透多肽亦可指當在適當條件下與細胞接觸時以遠大於被動擴散所能達到的量自外部環境進入胞內環境，包括細胞質、細胞器(諸如粒線體)或細胞核的肽。
轉運穿過膜之組分可以可逆或不可逆方式連接至膜滲透多肽。連接子可為化學鍵，例如一或多個共價鍵或非共價鍵。在一些實施例中，連接子為肽連接子。此類連接子可介於2-30個胺基酸之間或更長。連接子包括可撓性、剛性或可裂解連接子。
組合  在一個態樣中，本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之組合物亦可包括一或多個異源部分。在一個態樣中，本文所描述之指環載體或包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的組合物亦可包括一或多個融合物中之異源部分。在一些實施例中，異源部分可與遺傳元件連接。在一些實施例中，異源部分可包覆於作為指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之部分的蛋白質外部中。在一些實施例中，異源部分可與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)一起投與。
在一個態樣中，本發明包括一種細胞或組織，其包含本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)及異源部分中之任一者。
在另一態樣中，本發明包括一種包含本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)及異源部分的醫藥組合物。
在一些實施例中，異源部分可為病毒(例如效應子(例如藥物、小分子)、靶向劑(例如DNA靶向劑、抗體、受體配位體)、標籤(例如螢光團、感光劑，諸如KillerRed)或本文所描述之編輯或靶向部分。在一些實施例中，本文所描述之膜易位多肽連接至一或多個異源部分。在一個實施例中，異源部分為小分子(例如，肽模擬物或分子量低於2000道爾頓之小有機分子)、肽或多肽(例如，抗體或其抗原結合片段)、奈米粒子、適體或藥劑。
病毒在一些實施例中，組合物可進一步包含作為異源部分之病毒，例如單股DNA病毒，例如指環病毒科家族病毒(例如，指環病毒)、雙DNA病毒、環病毒、雙生病毒、基因體病毒、絲狀病毒、微小病毒、矮化病毒、小病毒及螺旋病毒。在一些實施例中，該組合物可進一步包含雙股DNA病毒，例如腺病毒、壺腹病毒、囊泡病毒、非洲豬瘟病毒、桿狀病毒、微小紡錘形噬菌體屬、球狀病毒、滴狀病毒、肥大唾腺炎病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、脂毛病毒、線極病毒及痘病毒。在一些實施例中，該組合物可進一步包含RNA病毒，例如α病毒、真菌傳棒狀病毒、肝炎病毒、大麥病毒、菸草花葉病毒、菸草脆裂病毒、三角病毒、風疹病毒、雙RNA病毒、囊狀病毒、分病毒及里奧病毒。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)與病毒一起作為異源部分投與。
在一些實施例中，異源部分可包含非致病性，例如共生性、共生、天然病毒。在一些實施例中，非致病性病毒為一或多個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如甲型細環病毒(TT)、乙型細環病毒(TTM)及丙型細環病毒(TTMD)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可包括細環病毒(TT)、SEN病毒、哨兵病毒、TTV樣微型病毒、TT病毒、TT病毒基因型6、TT病毒組、TTV樣病毒DXL1、TTV樣病毒DXL2、細環樣微型病毒(TTM)或細環樣中型病毒(TTMD)。在一些實施例中，非致病性病毒包含一或多個與本文所描述，例如如表N1-N4中所列之核苷酸序列中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。
在一些實施例中，異源部分可包含鑑定為在個體中缺乏之一或多個病毒。舉例而言，鑑別為具有疾病(dyvirosis)之個體可投與包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)及在該個體中不平衡或具有不同於參考值之比率的一或多個病毒組分或病毒之組合物，例如健康個體。
在一些實施例中，異源部分可包含一或多個非指環病毒科家族病毒(例如，非指環病毒)，例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、痘瘡病毒、SV40、乳頭狀瘤病毒；RNA病毒，諸如反轉錄病毒，例如慢病毒；單股RNA病毒，例如肝炎病毒；或雙股RNA病毒，例如輪狀病毒。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或病毒為缺陷性，或需要幫助以產生感染性粒子。此類輔助可例如藉由使用含有核酸(例如，整合至基因體中之質體或DNA)之輔助細胞株提供，該核酸在LTR內調節序列控制下編碼複製缺陷型指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或病毒之一或多種(例如，全部)結構基因。適合於複製本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的細胞株包括此項技術中已知之細胞株，例如A549細胞，其可如本文所描述地修飾。
靶向部分在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可進一步包含靶向部分，例如特異性結合至存在於目標細胞上之所關注分子的靶向部分。靶向部分可調節所關注分子或細胞之特異性功能，調節特異性分子(例如，酶、蛋白質或核酸)，例如路徑中所關注分子下游的特異性分子，或特異性結合至目標以定位指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或遺傳元件。舉例而言，靶向部分可包括與所關注特定分子相互作用以增加、降低或以其他方式調節其功能的治療劑。
標記或監測部分在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可進一步包含標記或監測本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或遺傳元件的標籤。標記或監測部分可藉由化學藥劑或酶裂解，諸如蛋白分解或內含肽剪接移除。親和標籤可適用於使用親和技術純化經標記多肽。一些實例包括幾丁質結合蛋白質(CBP)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)及聚(His)標籤。溶解標籤可適用於輔助在伴隨蛋白缺失型物種，諸如大腸桿菌，中表現之重組蛋白質以幫助蛋白質之恰當摺疊且阻止其沈澱。一些實例包括硫化還原蛋白(TRX)及聚(NANP)。標記或監測部分可包括光敏標籤，例如螢光。螢光標記可用於觀測。GFP及其變異體為常用作螢光標籤之一些實例。蛋白質標籤可允許發生特異性酶修飾(諸如藉由生物素接合酶進行之生物素標記)或化學修飾(諸如與FlAsH-EDT2反應以便螢光成像)。通常合併標記或監測部分，以便將蛋白質連接至多個其他組分。標記或監測部分亦可藉由特異性蛋白分解或酶裂解(例如，藉由TEV蛋白酶、凝血酶、Xa因子或腸肽酶)移除。
奈米粒子在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可進一步包含奈米粒子。奈米粒子包括尺寸在約1與約1000奈米之間、尺寸在約1與約500奈米之間、尺寸在約1與約100 nm之間、尺寸在約50 nm與約300 nm之間、尺寸在約75 nm與約200 nm之間、尺寸在約100 nm與約200 nm之間及其間任何範圍的無機材料。奈米粒子通常具有奈米尺度尺寸之複合結構。在一些實施例中，奈米粒子通常為球形的，但取決於奈米粒子組合物，不同形態為可能的。奈米粒子之與奈米粒子外部環境接觸的部分通常鑑別為奈米粒子之表面。在本文所描述之奈米粒子中，尺寸限制可限於二維，且因此，奈米粒子包括直徑為約1至約1000 nm之複合結構，其中特定直徑取決於金屬奈米粒子組合物及根據實驗設計之奈米粒子的預期用途。舉例而言，用於治療性應用之奈米粒子通常具有約200 nm或更低之尺寸。
奈米粒子之額外所需特性，諸如表面電荷及空間穩定性，亦可鑒於所關注之特定應用而變化。諸如癌症治療之臨床應用中可能需要的例示性特性描述於Davis等人, Nature 2008 第7卷, 第771-782頁; Duncan, Nature 2006 第6卷, 第688-701頁; and Allen, Nature 2002 第2卷，第750-763頁中，其各自以全文引用的方式併入本文中。在閱讀本發明時，熟習此項技術者可鑑定額外特性。奈米粒子尺寸及特性可藉由此項技術中已知之技術來偵測。用以偵測粒子尺寸之例示性技術包括但不限於動態光散射(DLS)及多種顯微法，諸如穿透式電子顯微法(TEM)及原子力顯微法(AFM)。用於偵測粒子形態之例示性技術包括但不限於TEM及AFM。用於偵測奈米粒子之表面電荷的例示性技術包括但不限於ζ電位方法。適合於偵測其他化學特性之額外技術包含 1H、 11B及 13C及 19F NMR、UV/Vis及紅外線/拉曼光譜及螢光光譜(在奈米粒子與螢光標記組合使用時)及可藉由熟習此項技術者鑑別之額外技術。
小分子 在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可進一步包含小分子。小分子部分包括但不限於小肽、肽模擬物(例如類肽)、胺基酸、胺基酸類似物、合成聚核苷酸、聚核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、通常具有低於約5,000公克/莫耳之分子量的有機及無機化合物(包括異質性及/或有機金屬化合物)，例如具有低於約2,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，例如具有低於約1,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，例如具有低於約500公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，及此類化合物之鹽、酯及其他醫藥學上可接受之形式。小分子可包括但不限於神經傳遞質、激素、藥物、毒素、病毒或微生物粒子、合成分子及促效劑或拮抗劑。
適合之小分子的實例包括描述於「The Pharmacological Basis of Therapeutics」Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition, under the sections: Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Drugs Acting on the Central Nervous System; Autacoids: Drug Therapy of Inflammation; Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Cardiovascular Drugs; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Drugs Affecting Uterine Motility; Chemotherapy of Parasitic Infections; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Used for Immunosuppression; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; and Toxicology中之彼等小分子，所有以引用的方式併入本文中。小分子之一些實例包括但不限於朊病毒藥物，諸如他克莫司(tacrolimus)、泛蛋白連接酶或HECT接合酶抑制劑，諸如heclin；組蛋白修飾藥物，諸如丁酸鈉；酶抑制劑，諸如5-氮雜-胞苷；蒽環黴素，諸如小紅莓；β-內醯胺，諸如青黴素；抗菌劑；化學治療劑；抗病毒劑；來自其他生物體之調節劑，諸如VP64；及具有不充分生物可用性之藥物，諸如具有缺陷型藥物動力學之化學治療劑。
在一些實施例中，小分子為表觀遺傳調節劑，例如de Groote等人. Nuc. Acids Res. (2012):1-18中所描述之彼等。例示性小分子表觀遺傳調節劑描述於例如Lu等人. J. Biomolecular Screening 17.5(2012):555-71中，例如表1或2中，以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含伏立諾他(vorinostat)或羅米地辛(romidepsin)。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含I、II、III及/或IV類組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含SirTI之活化劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含山竹醇(Garcinol)、Lys-CoA、C646、(+)-JQI、I-BET、BICI、MS120、DZNep、UNC0321、EPZ004777、AZ505、AMI-I、吡唑醯胺7b、苯并[d]咪唑17b、醯基化二胺苯碸衍生物(例如PRMTI)、甲基司他(methylstat)、4,4'-二羧基-2,2'-聯吡啶、SID 85736331、氧肟酸鹽類似物8、丹尼賽普羅米(tanylcypromie)、雙胍及二胍多元胺類似物、UNC669、維達紮(Vidaza)、地西他濱(decitabine)、苯丁酸鈉(SDB)、類脂酸(LA)、槲皮素、丙戊酸、肼呔𠯤(hydralazine)、複方新諾明(bactrim)、綠茶提取物(例如，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG))、薑黃素(curcumin)、蘿蔔硫素(sulforphane)及/或大蒜素/二烯丙基二硫化物。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑抑制DNA甲基化，例如為DNA甲基轉移酶之抑制劑(例如為5-氮胞苷及/或地西他濱(decitabine))。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑調節組蛋白修飾，例如組蛋白乙醯化、組蛋白甲基化、組蛋白類泛素化及/或組蛋白磷酸化。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑為組蛋白脫乙醯基酶之抑制劑(例如，為伏立諾他(vorinostat)及/或曲古黴素A(trichostatin A))。
在一些實施例中，小分子為醫藥活性劑。在一個實施例中，小分子為代謝活性或組分之抑制劑。適用類別之醫藥活性劑包括但不限於抗生素、消炎藥、血管生成或血管活性劑、生長因子及化學治療(抗贅生)劑(例如腫瘤抑制劑)。可使用來自本文所描述之類別及實例或來自(Orme-Johnson 2007, Methods Cell Biol. 2007;80:813-26)之一個分子或分子之組合。在一個實施例中，本發明包括包含抗生素、消炎藥、血管生成或血管活性劑、生長因子或化學治療劑之組合物。
肽或蛋白質在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可進一步包含肽或蛋白質。肽部分可包括但不限於肽配位體或抗體片段(例如結合受體，諸如胞外受體之抗體片段)、神經肽、激素肽、肽藥物、毒性肽、病毒或微生物肽、合成肽及促效性或拮抗性肽。
肽部分可為線性的或分支的。肽之長度為約5至約200個胺基酸、約15至約150個胺基酸、約20至約125個胺基酸、約25至約100個胺基酸或其間任何範圍。
肽之一些實例包括但不限於螢光標籤或標記物、抗原、抗體、抗體片段(諸如單域抗體)、配位體及受體(諸如類升糖素肽-1 (GLP-1)、GLP-2受體2、膽囊收縮素B (CCKB)及生長抑素受體)、肽治療劑(諸如結合至特定細胞表面受體，諸如G蛋白偶聯受體(GPCR)或離子通道之彼等)、合成肽或來自天然生物活性肽之類似物肽、抗微生物肽、成孔肽、靶向腫瘤或細胞毒性肽及降解或自毀肽(諸如誘導細胞凋亡之肽信號或感光劑肽)。
本文所描述之適用於本發明之肽亦包括小抗原結合肽，例如抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體(參見例如Steeland等人. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113)。此類小抗原結合肽可結合細胞溶質抗原、細胞核抗原或細胞器內抗原。
在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包括連接至能夠靶向特定位置、組織或細胞之配位體的多肽。
寡核苷酸適體在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可進一步包含寡核苷酸適體。適體部分為寡核苷酸或肽適體。寡核苷酸適體為單股DNA或RNA (ssDNA或ssRNA)分子，其可以高親和力及特異性結合至預先選擇的標靶，包括蛋白質及肽。
寡核苷酸適體為可經由重複數輪之活體外選擇或同等方法，SELEX (指數富集的配位體系統進化)工程化以便結合於諸如小分子、蛋白質、核酸及甚至細胞、組織及生物體之多種分子目標的核酸物種。適體提供辨別性分子識別，且可由化學合成產生。另外，適體可具有所需儲存特性，且在治療性應用中引發極少免疫原性或無免疫原性。
DNA及RNA適體兩者可對各種目標展現出穩固的結合親和力。舉例而言，已選擇DNA及RNA適體用於t溶菌酶、凝血酶、人類免疫不全病毒反式作用反應元件(HIV TAR) (參見en.wikipedia.org/wiki/Aptamer - cite_note-10)、氯化血紅素、干擾素γ、血管內皮生長因子(VEGF)、前列腺特異性抗原(PSA)、多巴胺及非典型致癌基因、熱休克因子1 (HSF1)。
肽適體在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可進一步包含肽適體。肽適體具有一個(或多個)短不同肽域，包括具有較低分子量12-14 kDa之肽。肽適體可經設計以特異性結合且干擾細胞內之蛋白質-蛋白質相互作用。
肽適體為經選擇或工程化以結合特定目標分子之人工蛋白質。此等蛋白質包括可變序列之一或多個肽環。其通常自組合庫分離，且通常隨後藉由定向突變或數輪可變區突變誘發及選擇來改進。肽適體可活體內結合細胞蛋白質目標且發揮生物效應，包括干擾其經靶向分子與其他蛋白質之正常蛋白質相互作用。特定言之，針對連接至轉錄因子活化域之目標蛋白質篩選連接至轉錄因子結合域之不同肽適體環。經由此選擇策略將肽適體活體內結合至其目標係偵測為下游酵母標記物基因之表現。此類實驗鑑別由適體結合之特定蛋白質及因適體破壞引起之蛋白質相互作用，以產生表現型。另外，用適當功能性部分衍生之肽適體可引起其目標蛋白質之特異性轉譯後修飾，或改變目標之亞細胞定位。
肽適體亦可活體外識別目標。其已發現代替生物感測器中之抗體使用且用於偵測來自含有無活性及活性蛋白質形式兩者之群體的蛋白質之活性同功型。稱為蝌蚪之衍生物，其中肽適體「頭部」經共價連接至特異性序列雙股DNA「尾部」，允許藉由其DNA尾部之PCR (使用例如定量即時聚合酶鏈反應)在混合物中定量稀有的目標分子。
可使用不同系統選擇肽適體，但當前酵母雙雜交系統使用最多。肽適體亦可選自藉由噬菌體呈現及其他表面呈現技術，諸如mRNA呈現、核糖體呈現、細菌呈現及酵母呈現構築之組合肽庫。此等實驗程序亦稱為生物淘洗(biopannings)。在自生物淘洗獲得之肽中，可將模擬表位(mimotope)視為一種肽適體。自組合肽庫淘洗之所有肽已儲存於名為MimoDB之特殊資料庫中。
額外治療劑在一些實施例中，本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可與其他方法或治療性方案組合投與，包括(例如)與抗血管生成藥物、光動力療法(例如，用於濕性AMD)、雷射光凝(例如，用於糖尿病性視網膜病變及濕性AMD)及眼內壓降低藥物(例如，用於青光眼)組合。
在一些實施例中，如本文所描述之指環病毒科家族載體與第二治療劑(例如，在第二治療劑之前、與第二治療劑同時或在第二治療劑之後)一起投與。在一些實施例中，第二治療劑包含例如用於治療病症、疾病或病狀之如本文所描述之抗VEGF抗體分子(例如，貝伐單抗、蘭比珠單抗或法瑞昔單抗)或其功能片段、變異體或衍生物。在一些實施例中，第二治療劑包含阿柏西普或其功能片段、變異體或衍生物。在一些實施例中，第二治療劑包含例如用於治療病症、疾病或病狀之如本文所描述之抗C4抗體分子、抗C5抗體分子、ABCA4蛋白質或RPGR蛋白質。
V. 宿主細胞本發明進一步關於包含本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的宿主或宿主細胞。在一些實施例中，宿主或宿主細胞為植物、昆蟲、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物(例如人類)或其他生物體或細胞。在某些實施例中，如本文所證實，提供指環病毒科家族載體(例如，指環載體)感染一系列不同宿主細胞。目標宿主細胞包括中胚層、內胚層或外胚層來源之細胞。目標宿主細胞包括例如上皮細胞、肌肉細胞、白血球(例如淋巴細胞)、腎臟組織細胞、肺組織細胞。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在宿主中為實質上非免疫原性的。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或遺傳元件未能藉由宿主之免疫系統產生非所需實質性反應。一些免疫反應包括但不限於體液免疫反應(例如抗原特異性抗體之產生)及細胞介導之免疫反應(例如淋巴細胞增殖)。
在一些實施例中，宿主或宿主細胞與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸(例如，經載體感染)。在一些實施例中，宿主為哺乳動物，諸如人類。宿主中之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之量可在投與之後任何時間量測。在某些實施例中，確定生長於培養物中之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的時程。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)為可遺傳的。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在流體及/或細胞中自母親至兒童以線性方式傳輸。在一些實施例中，來自原始宿主細胞之子細胞包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，母親以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之效率，或自宿主細胞至子細胞之至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)傳輸至孩童。在一些實施例中，宿主細胞中之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在減數分裂期間具有25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率。在一些實施例中，宿主細胞中之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在有絲分裂期間具有至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率。在一些實施例中，細胞中之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之傳輸效率在以下之間：約10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-99%或其間之任何百分比。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在宿主細胞內複製。在一個實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)能夠在哺乳動物細胞中，例如人類細胞複製。在其他實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)為複製缺陷型或複製不勝任型。
儘管在一些實施例中指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在宿主細胞內複製，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)未整合至例如具有宿主之染色體的宿主基因體中。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)例如與宿主之染色體的重組頻率可忽略。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)例如與宿主之染色體的重組頻率例如低於約1.0 cM/Mb、0.9 cM/Mb、0.8 cM/Mb、0.7 cM/Mb、0.6 cM/Mb、0.5 cM/Mb、0.4 cM/Mb、0.3 cM/Mb、0.2 cM/Mb、0.1 cM/Mb或更低。
VI.使用方法  本文所描述之指環病毒科家族載體，例如指環載體及包含指環病毒科家族載體，例如指環載體的組合物可用於治療例如有需要之個體(例如，哺乳動物個體，例如人類個體)之病症、疾病或病狀中。投與本文所描述之醫藥組合物可例如藉助於非經腸(包括靜脈內、瘤內、腹膜內、肌肉內、腔內及皮下)投與。在一些實施例中，如本文所描述之指環病毒科家族載體，例如指環載體，或醫藥組合物視網膜下投與。在一些實施例中，如本文所描述之指環病毒科家族載體，例如指環載體，或醫藥組合物玻璃體內投與。在一些實施例中，如本文所描述之指環病毒科家族載體，例如指環載體，或醫藥組合物脈絡膜上投與。指環載體可單獨投與或調配為醫藥組合物。
應理解，本文所描述關於指環載體之適用的實施例亦可應用於指環病毒科家族載體(例如，基於或源自雞貧血病毒(CAV)之載體，例如如本文所描述)。
指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可呈單位劑量組合物形式投與，諸如單位劑量非經腸組合物。此類組合物通常藉由摻合來製備，且可適合地經調適用於非經腸投與。此類組合物可例如呈可注射及可輸注溶液或懸浮液或栓劑或氣溶膠形式。
在一些實施例中，投與例如如本文所描述指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含其之組合物可引起指環病毒科家族載體(例如，指環載體)所包含之遺傳元件遞送至例如個體中之目標細胞。
本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組合物，例如包含效應子(例如，內源性或外源性效應子)，可用於將效應子遞送至細胞、組織或個體。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組合物用於將效應子遞送至個體，例如哺乳動物個體，例如人類個體之眼睛。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組合物用於將效應子遞送至個體，例如哺乳動物個體，例如人類個體之眼睛細胞。在某些實施例中，眼睛之細胞為感光細胞、視網膜細胞、後眼杯(PEC)細胞、視網膜神經節細胞、視神經細胞、視神經頭細胞或視網膜色素上皮(RPE)細胞。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組合物用於將效應子遞送至骨髓、血液、心臟GI或皮膚。藉由投與本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)組合物遞送效應子可調節(例如增加或降低)細胞、組織或個體之非編碼RNA或多肽的表現量。以此方式調節表現量可引起效應子遞送至之細胞中的功能活性改變。在一些實施例中，經調節功能活性在本質上可為酶、結構或調控性的。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其複本在遞送至細胞中之後24小時(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、30天或1個月)在細胞中可偵測。在實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組合物介導對目標細胞之作用，且該作用持續至少1、2、3、4、5、6或7天、2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。在一些實施例中(例如，其中該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其組合物包含編碼外源蛋白質之遺傳元件，該作用持續少於1、2、3、4、5、6或7天、2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之組合物治療的疾病、病症或病況為眼睛之疾病。
在一些實施例中，眼睛之疾病係選自由以下組成之群：新生血管性老年性黃斑變性(nAMD) (亦稱為濕性AMD或WAMD)、乾性AMD、視網膜靜脈栓塞(RVO)、糖尿病黃斑水腫(DME)或糖尿病性視網膜病變(DR) (特定而言，濕性AMD)，其包含將治療有效量之抗hVEGF抗原結合片段遞送至該人類個體之視網膜或遞送至後眼杯(PEC)。在一特定態樣中，本文描述治療經診斷患有nAMD、乾性AMD、視網膜靜脈栓塞(RVO)、糖尿病黃斑水腫(DME)或糖尿病性視網膜病變(DR) (特定而言，濕性AMD)之人類個體的方法，其包含將治療有效量之抗hVEGF抗原結合片段遞送至該人類個體之視網膜或後眼杯(PEC)，藉由向該人類個體之眼睛中玻璃體內空間、脈絡膜上腔、視網膜下腔或鞏膜外表面投與(例如，藉由脈絡膜上腔注射(例如，經由脈絡膜上腔藥物遞送裝置，諸如具有微針之微注射器)、經由經玻璃體方法(手術程序)視網膜下注射、經由脈絡膜上腔(例如，經由包含導管之視網膜下藥物遞送裝置之手術程序，該導管可朝向後極插入及穿過脈絡膜上腔空間，其中小針噴射至視網膜下腔中)視網膜下投與或後近鞏膜儲存程序(例如，經由包含插管之近鞏膜藥物遞送裝置，該插管之尖端可插入且保持在鞏膜表面直接並置))編碼抗hVEGF抗原結合片段之表現載體。在一特定態樣中，本文描述治療經診斷患有nAMD、乾性AMD、視網膜靜脈栓塞(RVO)、糖尿病黃斑水腫(DME)或糖尿病性視網膜病變(DR) (特定而言，濕性AMD)之人類個體的方法，其包含將治療有效量之抗hVEGF抗原結合片段遞送至該人類個體之視網膜或後眼杯(PEC)，藉由使用脈絡膜上腔藥物遞送裝置，諸如微小注射器。在一特定態樣中，本文描述治療經診斷患有新生血管性老年性黃斑變性(nAMD)、乾性AMD、視網膜靜脈栓塞(RVO)、糖尿病黃斑水腫(DME)或糖尿病性視網膜病變(DR) (特定而言，濕性AMD)之人類個體的方法，其包含將治療有效量之抗hVEGF抗原結合片段遞送至該人類個體之視網膜或後眼杯(PEC)，其中該人類個體具有≤20/20及≥20/400之最佳矯正視力(BCVA)。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為單基因性疾病。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為多基因性疾病(例如，青光眼)。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為黃斑變性(例如，老年性黃斑變性(AMD)、斯特格氏病或近視性黃斑變性)。在某些實施例中，黃斑變性為濕性AMD。在某些實施例中，黃斑變性為乾性AMD (例如，具有地圖狀萎縮之AMD)。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為視網膜疾病。在某些實施例中，視網膜疾病為遺傳性視網膜疾病(IRD)，例如如Stone等人. (2017, Ophthalmology；關於其中所描述之疾病及病症以引用的方式併入本文中)中所描述。在某些實施例中，視網膜疾病為色素性視網膜炎(例如，X性聯色素性視網膜炎(XLRP))。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為VEGF相關病症(例如，癌症，例如如本文所描述；黃斑部水腫；或增殖性視網膜病)。
在一些實施例中，該疾病或病症係選自由以下組成之群：視網膜洩漏、萊伯氏先天性黑朦症(LCA) (例如，其中該遺傳元件包含人類RPE65序列，例如編碼人類RPE65蛋白質之序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列)、先天性黑朦症、視錐視桿細胞營養不良、無脈絡膜症、卵黃狀黃斑變性、高鐵蛋白血症-白內障症候群、光學萎縮症、XLR視網膜劈裂症、巨細胞病毒視網膜炎、色盲、雷伯氏遺傳性光學神經病變、角膜炎、葡萄膜炎、葛瑞夫茲氏眼病變、糖尿病性視網膜病變或糖尿病黃斑水腫。
在一些實施例中，病症、疾病或病狀(例如，如本文所描述)藉由玻璃體內投與如本文所描述之指環病毒科家族載體來治療。在一些實施例中，病症、疾病或病狀(例如，如本文所描述)藉由視網膜下投與如本文所描述之指環病毒科家族載體來治療。在一些實施例中，病症、疾病或病狀(例如，如本文所描述)藉由脈絡膜上腔投與如本文所描述之指環病毒科家族載體來治療。
可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之組合物治療的疾病、病症及病況的實例包括(但不限於)：免疫病症、干擾素病變(例如，I型干擾素病變)、感染性疾病、發炎性病症、自體免疫性病況、癌症(例如，實體腫瘤，例如肺癌，非小細胞肺癌，例如表現回應於mIR-625，例如凋亡蛋白酶-3之基因的腫瘤)及腸胃疾病。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)調節(例如增加或降低)與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸之細胞中之活性或功能。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)調節(例如，增加或降低)指環病毒科家族載體(例如，指環載體)所接觸之細胞中之分子(例如，核酸或蛋白質)的含量或活性。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)降低與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸之細胞(例如癌細胞)的存活率，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含降低與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸之細胞(例如，癌細胞)之存活率，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的效應子(例如miRNA，例如miR-625)。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)增加藉由增加指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸之細胞，例如癌細胞之細胞凋亡，例如凋亡蛋白酶-3活性，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含增加與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸之細胞(例如，癌細胞)之存活率，例如藉由增加凋亡蛋白酶-3活性，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的效應子(例如miRNA，例如miR-625)。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)降低與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸之細胞，例如癌細胞的細胞凋亡，例如藉由降低凋亡蛋白酶-3活性，例如降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含降低與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)接觸之細胞(例如，癌細胞)之細胞凋亡，例如降低凋亡蛋白酶-3活性，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的效應子(例如miRNA，例如miR-625)。
VII.產生方法  產生遺傳元件  產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件的方法描述於例如Khudyakov及Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)；Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (第一版), Academic Press (2013)；及Egli及Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (第一版), Wiley-VCH (2012)中。
在一些實施例中，可使用電腦輔助設計工具設計遺傳元件。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可劃分成更易於合成之較小重疊片(例如，在約100 bp至約10 kb片段或個別ORF範圍內)。此等DNA區段由一組重疊單股寡核苷酸合成。接著將所得重疊合成子組裝成較大DNA片段，例如指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。區段或ORF可例如活體外重組或5'及3'末端處之獨特限制位點組裝成指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，以實現接合。
遺傳元件構築體可由設計演算法合成，該演算法將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)解析為寡核苷酸長度的片段，產生適用於合成之設計條件，其考慮序列空間之複雜性。隨後在基於半導體之高密度晶片上化學合成寡核苷酸，其中每個晶片合成超過200,000個個別寡核苷酸。用諸如BioFab®之組裝技術組裝寡核苷酸，以自較小寡核苷酸建構較長DNA區段。此係以並行方式進行，因此一次性建構數百至數千個合成DNA區段。
各遺傳元件或遺傳元件之區段可經序列驗證。在一些實施例中，RNA或DNA之高通量定序可使用允許監測生物過程(例如miRNA表現)或對偶基因變異性(SNP偵測)之AnyDot.chip (Genovoxx, Germany)進行。特定而言，AnyDot-碎片允許核苷酸螢光訊號偵測之10x-50x增強。AnyDot.碎片及使用其之方法部分地描述於以下中：國際公開應用第WO 02088382號、第WO 03020968號、第WO 0303 1947號、第WO 2005044836號、第PCTEP 05105657號、第PCMEP 05105655號；及德國專利申請案第DE 101 49 786號、第DE 102 14 395號、第DE 103 56 837號、第DE 10 2004 009 704號、第DE 10 2004 025 696號、第DE 10 2004 025 746號、第DE 10 2004 025 694號、第DE 10 2004 025 695號、第DE 10 2004 025 744號、第DE 10 2004 025 745號及第DE 10 2005 012 301號。
其他高產量定序系統包括Venter, J., 等人Science 2001年2月16日；Adams, M.等人, Science 2000年3月24日；及M. J, Levene等人Science 299:682-686, 2003年1月以及美國公開申請案第20030044781號及第2006/0078937號中所揭示之彼等定序系統。總體而言，此類系統涉及經由在核酸分子上量測之聚合反應藉由暫時添加鹼基來定序具有複數個鹼基之目標核酸分子，亦即，即時追蹤核酸聚合酶在待定序之模板核酸分子上的活性。序列可隨後藉由鑑定在鹼基添加物定序之每一步驟藉由核酸聚合酶之催化活性併入目標核酸之生長互補股中的鹼基來推導。在目標核酸分子複合物上之聚合酶提供在適合於沿著目標核酸分子移動且在活性位點延伸寡核苷酸引子之位置。在活性位點附近提供複數個標記類型之核苷酸類似物，每一可辨識類型之核苷酸類似物與目標核酸序列之不同核苷酸互補。生長核酸股藉由使用聚合酶在活性位點添加核苷酸類似物至核酸股來延伸，其中所添加之核苷酸類似物在活性位點與目標核酸之核苷酸互補。鑑別出由於聚合步驟添加至寡核苷酸引子之核苷酸類似物。重複提供經標記之核苷酸類似物、使生長核酸股聚合且鑑別所添加之核苷酸類似物的步驟，以使得核酸股進一步延伸且確定目標核酸之序列。
在一些實施例中，進行霰彈槍定序(shotgun sequencing)。在鳥槍定序中，DNA隨機分解成許多小片段，該等片段使用鏈終止方法定序以獲得讀段。藉由進行若干輪此片段化及定序來獲得目標DNA的多個重疊讀段。電腦程式隨後使用不同讀段之重疊末端將其組裝成連續序列。
在一些實施例中，用於複製或封裝之因子可以相對於遺傳元件之順式或反式供應。舉例而言，當以順式提供時，遺傳元件可包含編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3或CAV VP1之一或多個基因，例如如本文所描述。在一些實施例中，複製及/或封裝信號可併入至遺傳元件中，例如以誘導擴增及/或囊封。在一些實施例中，此在指環病毒科家族載體(例如，指環載體)基因體之較大區域的情況下進行(例如，將效應子插入基因體中之特定位點中或用效應子置換病毒ORF)。
在另一實例中，當以反式提供時，遺傳元件可缺乏編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3或CAV VP1中之一或多者的基因，例如如本文所描述；此一或多種蛋白質可例如由另一核酸，例如輔助核酸供應。在一些實施例中，最小順式訊號(例如，5'UTR及/或富含GC之區)存在於遺傳元件中。在一些實施例中，遺傳元件不編碼複製或封裝因子(例如，複製酶及/或衣殼蛋白)。在一些實施例中，此類因子可由一或多種輔助核酸(例如輔助病毒核酸、輔助質體或整合至宿主細胞基因體中之輔助核酸)供應。在一些實施例中，輔助核酸表現足以誘導擴增及/或封裝之蛋白質及/或RNA，但可能缺乏其自身的封裝信號。在一些實施例中，將遺傳元件及輔助核酸引入至宿主細胞中(例如同時或分開)，引起遺傳元件之擴增及/或封裝，但不引起輔助核酸之擴增及/或封裝。
活體外環化在一些情況下，待封裝至蛋白質外部中之遺傳元件為單股環形DNA。在一些情況下，遺傳元件可以除單股環狀DNA之外的形式引入宿主細胞中。舉例而言，可將遺傳元件引入宿主細胞中作為雙股環狀DNA。雙股環狀DNA隨後可在宿主細胞(例如包含適用於滾環複製之酶的宿主細胞，例如指環病毒Rep蛋白，例如Rep68/78、Rep60、RepA、RepB、Pre、MobM、TraX、TrwC、Mob02281、Mob02282、NikB、ORF50240、NikK、TecH、OrfJ或TraI，例如如Wawrzyniak等人2017, Front. Microbiol. 8: 2353中所描述；其就所列酶而言以引用的方式併入本文中)中轉化為單股環狀DNA。在一些實施例中，雙股環形DNA係藉由活體外環化產生，例如如實例35中所描述。一般而言，活體外環化DNA構築體可藉由消化包含待封裝之遺傳元件之序列的質體產生，使得遺傳元件序列作為線性DNA分子切除。所得線性DNA可接著例如使用DNA連接酶連接，以形成雙股環形DNA。在一些情況下，藉由活體外環化產生之雙股環狀DNA可經歷例如如本文所描述之滾環複製。不希望受理論所束縛，經考慮活體外環化產生可在無進一步修飾之情況下進行滾環複製之雙股DNA構築體，由此能夠產生具有適合待封裝於指環病毒科家族載體(例如，指環載體)中之尺寸的單股環形DNA，例如如本文所描述。在一些實施例中，雙股DNA構築體小於質體(例如細菌質體)。在一些實施例中，雙股DNA構築體自質體(例如細菌質體)切除且接著例如藉由活體外環化而進行環化。
產生指環病毒科家族載體(例如，指環載體)  如本文所描述製備之遺傳元件及包含遺傳元件的載體可以多種方式用於在適當宿主細胞中表現指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，遺傳元件及包含遺傳元件之載體轉染於適當宿主細胞中，且所得RNA可以高含量引導指環病毒科家族載體(例如，指環載體)基因產物，例如非致病性蛋白質及蛋白質結合序列之表現。提供高表現量之宿主細胞系統包括提供病毒功能之連續細胞株，諸如分別感染有APV或MPV之細胞株、經工程化以補充APV或MPV功能之細胞株等。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)如實例1、2、5、6或15至17中之任一者中所描述來產生。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在活體外連續動物細胞株中培養。根據本發明之一個實施例，細胞株可包括豬細胞株。在本發明之上下文中設想之細胞株包括永生化豬細胞株，諸如(但不限於)豬腎上皮細胞株PK-15及SK、單骨髓細胞株3D4/31及睪丸細胞株ST。另外，包括其他哺乳動物細胞株，諸如CHO細胞(中國倉鼠卵巢)、MARC-145、MDBK、RK-13、EEL。另外或替代地，本發明之方法之特定實施例利用作為上皮細胞株，亦即上皮譜系細胞之細胞株的動物細胞株。易感染指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之細胞株包括(但不限於)人類或靈長類動物來源之細胞株，諸如人類或靈長類動物腎臟癌細胞株。
在一些實施例中，將遺傳元件或包含遺傳元件之載體轉染至表現病毒聚合酶蛋白質之細胞株中，以實現指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之表現。為此目的，表現指環病毒科家族載體(例如，指環載體)聚合酶蛋白質之經轉型細胞株可用作適合之宿主細胞。宿主細胞可類似地經工程化以提供其他病毒功能或額外功能。
為製備本文所揭示之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)、遺傳元件或包含本文所揭示之遺傳元件的載體可用於轉染提供複製及產生所需之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)蛋白質及功能的細胞。或者，細胞可在藉由本文所揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體轉染之前、期間或之後經輔助病毒轉染。在一些實施例中，輔助病毒可適用於補充不完全病毒粒子之產生。輔助病毒可具有條件性生長缺陷，諸如宿主範圍限制或溫度靈敏度，其允許轉染子病毒之後續選擇。在一些實施例中，輔助病毒可提供宿主細胞所利用之一或多種複製蛋白質以實現指環病毒科家族載體(例如，指環載體)表現。在一些實施例中，宿主細胞可經編碼病毒蛋白質，諸如一或多種複製蛋白質之載體轉染。在一些實施例中，輔助病毒包含抗病毒敏感性。
本文所揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體可藉由如例如以下所描述之此項技術中已知的任何數目之技術複製且產生為指環病毒科家族載體(例如，指環載體)粒子：美國專利第4,650,764號；美國專利第5,166,057號；美國專利第5,854,037號；歐洲專利公開案EP 0702085A1；美國專利申請案第09/152,845號；國際專利公開案PCT WO97/12032；WO96/34625；歐洲專利公開案EP-A780475；WO 99/02657；WO 98/53078；WO 98/02530；WO 99/15672；WO 98/13501；WO 97/06270及EPO 780 47SA1，其各自以全文引用之方式併入本文中。
根據本發明之含有指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之細胞培養物的產生可以不同規模(例如在燒瓶、滾瓶或生物反應器中)進行。用於培養待感染細胞之培養基為熟習此項技術者已知且可一般包含細胞存活率所需之標準營養物，但亦可包含視細胞類型而定之額外營養物。視情況，培養基可不含蛋白質及/或不含血清。視細胞類型而定，細胞可在懸浮液中或在受質上培養。在一些實施例中，不同培養基用於宿主細胞之生長及用於指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之產生。
指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之純化及分離可根據熟習此項技術者在病毒產生中已知之方法進行且例如藉由以下所描述：Rinaldi,等人., DNA Vaccines: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), 第3版. 2014, Humana Press。
在一個態樣中，本發明包括用於如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之活體外複製及繁殖的方法，其可包含以下步驟：(a)將線性化遺傳元件轉染至對指環病毒科家族載體(例如，指環載體)感染敏感之細胞株中；(b)收穫該等細胞且分離出細胞，展現出該遺傳元件之存在；(c)視實驗條件及基因表現而定，培養在步驟(b)中獲得之細胞持續至少三天，諸如至少一週或更久；及(d)收穫步驟(c)之細胞。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可引入至生長至較高細胞密度之宿主細胞株中。在一些實施例中，在用醫藥賦形劑調配之前，可基於生物物理學特性，例如離子交換層析或切向流過濾，藉由分離溶質來收穫及/或純化指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
VIII.投與/遞送  組合物(例如，包含如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的醫藥組合物)可經調配以包括醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥組合物可視情況包含一或多個額外活性物質，例如治療性及/或預防性活性物質。本發明之醫藥組合物可無菌及/或不含熱原質。在調配及/或製造藥劑中之一般考慮因素可見於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (以引用之方式併入本文中)中。
儘管本文中所提供之醫藥組合物之說明主要針對適用於向人類投與之醫藥組合物，但熟習此項技術者應理解，此類組合物通常適用於向任何其他動物投與，例如向非人類動物，例如非人類哺乳動物投與。應充分理解，為使組合物適用於向各種動物投與，對適用於向人類投與之醫藥組合物進行修改，且一般熟練的獸醫藥理學家可僅用一般實驗(若存在)設計及/或進行此類修改。考慮投與醫藥組合物之個體包括(但不限於)人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、羊、貓、狗、小鼠及/或大鼠；及/或鳥類，包括商業相關之鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。
本文所描述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後研發之任何方法來進行製備。一般而言，此類製備方法包括使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分結合，且隨後必要時及/或需要時將產物分割、成型及/或封裝之步驟。
在一個態樣中，本發明提供一種向個體，例如向個體之眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間或視網膜色素上皮(RPE))的方法遞送指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。該方法包括向該個體，例如向個體之眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視網膜神經節、視神經、視神經頭、視網膜下腔、玻璃體內空間或視網膜色素上皮(RPE))的方法投與包含如本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的醫藥組合物。在一些實施例中，所投與之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在個體中複製(例如，成為個體之病毒組的一部分)。
在一些實施例中，向個體遞送指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之方法包含使指環病毒科家族載體(例如，指環載體)與任何適合之眼細胞接觸。與老年性黃斑變性相關之眼細胞包括(但不限於)神經來源細胞、視網膜之所有層的細胞，尤其視網膜色素上皮細胞、膠細胞及外被細胞。可作為本發明方法之結果接觸的其他眼細胞包括例如內皮細胞、虹膜上皮細胞、角膜細胞、睫狀上皮細胞、米勒細胞、星形膠質細胞、眼睛周圍及附接的肌肉細胞(例如，外直肌細胞)、纖維母細胞(例如，與鞏膜外層相關之纖維母細胞)、眼眶脂肪細胞、鞏膜及鞏膜外層細胞、結締組織細胞、肌肉細胞及小樑網狀結構之細胞。其他與各種眼相關疾病有關之細胞包括例如纖維母細胞及血管內皮細胞。
一般而言，載體可在直接觀測下使用操作顯微鏡以經眼(視網膜下)注射之懸浮液形式遞送。此程序可涉及玻璃體切除術，接著使用精細插管經由一或多個小視網膜切開處注射載體懸浮液至視網膜下腔中。
簡言之，可縫合輸注插管以在整個操作中藉由輸注(例如，生理食鹽水)維持正常球狀體積。使用具有適合的孔洞尺寸(例如20號規格至27號規格)之插管進行玻璃體切除術，其中藉由自輸注插管輸注生理鹽水或其他等滲溶液來置換所移除之體積的玻璃體凝膠。有利地進行玻璃體切除術，因為(1)移除其皮質(後玻璃體牽拉膜)促進藉由插管穿透視網膜；(2)其移除及用流體(例如，鹽水)置換產生空間以容納載體之眼內注射，及(3)其控制移除降低視網膜撕裂及計劃外的視網膜剝離之可能性。
在一些實施例中，藉由使用適當孔洞尺寸(例如27號規格至45號規格)之插管，將載體直接注射至中央視網膜外的視網膜下腔，從而在視網膜下腔產生氣泡。在其他實施例中，視網膜下注射載體懸浮液之前為將小體積(例如，約0.1至約0.5 ml)之適當流體(諸如，生理食鹽水或林格氏溶液)視網膜下注射至中心視網膜外部的視網膜下腔中。此初始注射至視網膜下腔中會在視網膜下腔內建立初始流體氣泡，引起初始氣泡位置處之局部視網膜脫落。此初始流體氣泡可促進載體懸浮液至視網膜下腔之靶向遞送(藉由在載體遞送之前定義注射平面)，且最小化向脈絡膜中之可能的載體投與及向玻璃腔中進行載體注射或回流之可能性。在一些實施例中，此初始流體氣泡可進一步注射包含一或多種載體懸浮液及/或一或多種額外治療劑之流體，其藉由將此等流體直接投與至具有相同或額外精細孔插管之初始流體氣泡。
載體懸浮液及/或初始小體積流體之眼內投與可使用附接至注射器之精細孔插管(例如21-A5號規格)進行。在一些實施例中，該注射器的柱塞可由機械化裝置驅動，例如藉由踩下腳踏板。細孔插管通過鞏膜切開術前進，穿過玻璃體腔，且根據所靶向視網膜區域(但在中央視網膜之外)在各個體中預先確定的位置進入視網膜。在直接觀察下，將載體懸浮液以機械方式注射在神經感覺視網膜下，引起局部視網膜剝離，伴隨自密封非擴增視網膜切除。如上所述，可以將載體直接注射至視網膜下腔中，在中心視網膜外部產生氣泡，或可將載體注射至中心視網膜外部之初始氣泡中，使其擴大(及擴大視網膜剝離之區域)。在一些實施例中，注射載體懸浮液之後為注射另一種流體至氣泡中。
不希望受理論所束縛，視網膜下注射之速率及位置可產生局部剪切力，其可破壞黃斑、中央窩及/或下面的RPE細胞。視網膜下注射可以最小化或避免剪切力之速率進行。在一些實施例中，載體經約15至17分鐘注射。在一些實施例中，載體經約17至20分鐘注射。在一些實施例中，載體經約20-22分鐘注射。在一些實施例中，載體以約35至約65 μl/ml之速率注射。在一些實施例中，載體以約35 μl/ml之速率注射。在一些實施例中，載體以約40 μl/ml之速率注射。在一些實施例中，載體以約45 μl/ml之速率注射。在一些實施例中，載體以約50 μl/ml之速率注射。在一些實施例中，載體以約55 μl/ml之速率注射。在一些實施例中，載體以約60 μl/ml之速率注射。在一些實施例中，載體以約65 μl/ml之速率注射。一般熟習此項技術者將認識到，氣泡注射速率及時間可藉由例如產生足夠視網膜脫離以接近中心視網膜之細胞所需的載體體積或氣泡尺寸、用於遞送載體之插管尺寸以及安全地維持本發明之插管位置的能力來導向。
可產生一或多個(例如，2個、3個或更多個)氣泡。一般而言，由本發明之方法及系統產生之一或多種氣泡的總體積可不超過眼睛之流體體積，例如典型人類個體中約4 ml。各個別氣泡之總體積較佳為至少約0.3 ml，且更佳為至少約0.5 ml，以便於視網膜脫落尺寸足以暴露中心視網膜之細胞類型且產生對於最佳操作具有足夠依賴性之濾泡。一般熟習此項技術者應瞭解，在根據本發明之方法及系統產生氣泡時，必須維持適當的眼內壓以便避免損傷眼結構。各個別氣泡之尺寸可為例如約0.5至約1.2 ml、約0.8至約1.2 ml、約0.9至約1.2 ml、約0.9至約1.0 ml、約1.0至約2.0 ml、約1.0至約3.0 ml。因此，在一個實例中，為了注射總共3 ml的載體懸浮液，可以建立3個氣泡，每個約1 ml。組合中之所有氣泡的總體積可為例如約0.5至約3.0 ml、約0.8至約3.0 ml、約0.9至約3.0 ml、約1.0至約3.0 ml、約0.5至約1.5 ml、約0.5至約1.2 ml、約0.9至約3.0 ml、約0.9至約2.0 ml、約0.9至約1.0 ml。
為了安全且高效地轉導在氣泡之原始位置之邊緣外部的目標視網膜(例如，中心視網膜)之區域，可操控氣泡以將氣泡再定位至目標區域以用於轉導。氣泡之操縱可藉由氣泡體積產生之氣泡的依賴性、含有氣泡之眼睛的再定位、用含有一或多個氣泡之眼睛再定位人類頭部，及/或藉助於流體空氣交換。此與中心視網膜特別相關，因為此區域典型地藉由視網膜下注射來阻擋脫落。在一些實施例中，利用流體-空氣交換以重新定位氣泡；來自輸注插管之流體暫時由空氣置換，例如自吹入空氣至視網膜表面上。隨著空氣之體積使玻璃體腔流體自視網膜表面移位，玻璃體空腔中之流體可自插管中流出。暫時缺乏來自玻璃體腔流體之壓力使得氣泡移動且懸浮至眼部之下垂部分。藉由恰當地定位眼球，操控視網膜下載體之氣泡以涉及鄰近區域(例如，黃斑及/或中央窩)。在一些情況下，氣泡之質量足以使其產生重力，即使不使用流體-空氣交換。氣泡移動至所需位置可藉由改變個體頭部之位置來進一步促進，以便允許氣泡被懸浮至眼睛的所需位置。一旦獲得氣泡之所需組態，則流體返回至玻璃體腔。流體為適當的流體，例如，新鮮鹽水。通常，視網膜下載體可留在原位，沒有視網膜切開術的視網膜固定術，且無眼內填塞，且視網膜將在約48小時內自發地重新附著。
組合物直接投與哺乳動物之眼睛，諸如小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。任何投與途徑均為適當的，只要組合物接觸適當眼細胞即可。組合物可適當調配且以注射劑、眼洗劑、軟膏、插入物及其類似物形式投與。組合物可例如局部、前房內、結膜下、眼內、眼球後、眼周(例如，結膜下遞送)、視網膜下或脈絡膜上投與。局部調配物為此項技術中所熟知。貼片、角膜障壁(參見例如，美國專利第5,185,152號)、眼用溶液(參見例如，美國專利第5,710,182號)及軟膏亦為此項技術中已知的且可用於本發明方法之上下文中。組合物亦可使用無針注射裝置，諸如可購自Bioject Medical Technologies公司(Tigard, Oreg.)之Biojector 2000 Needle-Free Injection Management System™非侵入性地投與。
或者，組合物可使用侵襲性程序投與，諸如玻璃體內注射或視網膜下注射，視情況接著玻璃體切除術或眼周(例如，肌腱下)遞送。組合物可注射至眼睛之不同區室中，例如玻璃體腔或前房。較佳地，該組合物玻璃體內投與，最佳藉由玻璃體內注射投與。
在一些實施例中，組合物可使用包含使用微針之眼部遞送系統投與(USPN 8,808，225，其全文併入本文中)。
醫藥組合物可包括野生型或天然病毒元件及/或經修飾病毒元件。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可包括以下中之一或多者：表N1-N4中之任一者的序列(例如，核酸序列或編碼其胺基酸序列的核酸序列)，或與核苷酸序列或與表N1-N4中之任一者之序列互補的序列中之任一者具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可包含核酸分子，其包含與表N1-N4中之一或多個序列具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性的核酸序列。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可包含核酸分子，其編碼與表A1或A2中之胺基酸序列中之任一者具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性的胺基酸序列指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可包含多肽，其包含與表A1或A2中之胺基酸序列中之任一者具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性的胺基酸序列。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可包括以下中之一或多者：表A1或A2或N1-N4中之序列或與核苷酸序列或與表N1-N4中之任一者之序列互補的序列中之任一者具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性之序列。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)足以使內源基因及蛋白質表現與參考，例如健康對照相比增加(刺激)例如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在某些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)足以使內源基因及蛋白質表現與參考，例如健康對照相比降低(抑制)例如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)與參考，例如健康對照相比抑制/增強宿主或宿主細胞中之一或多種病毒特性，例如趨向性、感染性、免疫抑制活化，例如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
在一些實施例中，向個體投與進一步包含未在病毒遺傳資訊中表示之一或多個病毒株的醫藥組合物。
在一些實施例中，包含本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的醫藥組合物以足以調節病毒感染之劑量及時間投與。病毒感染之一些非限制性實例包括腺相關病毒、愛知病毒(Aichi virus)、澳大利亞蝙蝠狂犬病毒、BK多瘤病毒、班納病毒(Banna virus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest virus)、布尼安維拉病毒(Bunyamwera virus)、拉克羅斯布尼亞病毒(Bunyavirus La Crosse)、雪足野兔布尼亞病毒(Bunyavirus snowshoe hare)、獼猴疱疹病毒、金迪普拉病毒(Chandipura virus)、屈公病毒、科薩奇病毒A、牛痘病毒、柯薩奇病毒、克里米亞-岡果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、登革熱病毒、多理病毒(Dhori virus)、達格畢病毒(Dugbe virus)、杜文海格病毒(Duvenhage virus)、東部馬腦炎病毒、埃博拉病毒、埃可病毒、腦心肌炎病毒、埃-巴二氏病毒、歐洲蝙蝠狂犬病毒、GB病毒C/G型肝炎病毒、漢坦病毒(Hantaan virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、E型肝炎病毒、D型肝炎病毒、馬痘病毒、人類腺病毒、人類星狀病毒、人類冠狀病毒、人類巨細胞病毒、人類腸病毒68、人類腸病毒70、人類疱疹病毒1、人類疱疹病毒2、人類疱疹病毒6、人類疱疹病毒7、人類疱疹病毒8、人類免疫不全病毒、人類乳頭狀瘤病毒1、人類乳頭狀瘤病毒2、人類乳頭狀瘤病毒16、人類乳頭狀瘤病毒18、人類副流感、人類小病毒B19、人類呼吸道融合病毒、人類鼻病毒、人類SARS冠狀病毒、人類泡沫病毒、人類T-嗜淋巴細胞病毒、人類環曲病毒屬、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、JC多瘤病毒、日本腦炎病毒、胡甯沙狀病毒(Junin arenavirus)、KI多瘤病毒、庫京病毒(Kunjin virus)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus)、維多利亞湖馬堡病毒(Lake Victoria marburgvirus)、蘭加特病毒(Langat virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、洛茲達雷病毒(Lordsdale virus)、跳躍病(Louping ill)病毒、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、馬丘波病毒(Machupo virus)、馬雅羅病毒(Mayaro virus)、MERS冠狀病毒、麻疹病毒、門戈腦心肌炎病毒(Mengo encephalomyocarditis virus)、梅克爾細胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus)、莫科拉病毒(Mokola virus)、傳染性軟疣病毒、猴痘病毒、腮腺炎病毒、莫雷穀腦炎病毒(Murray valley encephalitis virus)、紐約病毒(New York virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、諾沃克病毒(Norwalk virus)、奧尼永-尼永病毒(O'nyong-nyong virus)、口瘡病毒(Orf virus)、奧羅普切病毒(Oropouche virus)、皮欽德病毒(Pichinde virus)、脊髓灰白質炎病毒、龐塔托魯靜脈病毒(Punta toro phlebovirus)、撲嗎拉病毒(Puumala virus)、狂犬病病毒、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒(Rift valley fever virus)、羅沙病毒(Rosavirus) A、羅斯河病毒(Ross river virus)、輪狀病毒A、輪狀病毒B、輪狀病毒C、風疹病毒、鷺山病毒(Sagiyama virus)、薩利病毒(Salivirus) A、西西里白蛉熱病毒(Sandfly fever sicilian virus)、劄幌病毒(Sapporo virus)、勝利基森林病毒(Semliki forest virus)、首爾病毒(Seoul virus)、猴泡沫病毒、猴病毒5、辛得比斯病毒(Sindbis virus)、南安普頓病毒(Southampton virus)、聖路易腦炎病毒(St. louis encephalitis virus)、蜱傳波瓦生病毒(Tick-borne powassan virus)、細環病毒、托斯卡納病毒(Toscana virus)、尤尤庫尼米病毒(Uukuniemi)、痘瘡病毒、水痘-帶狀疱疹病毒、天花病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、水泡性口炎病毒、西部馬腦炎病毒、WU多瘤病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、亞巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)、亞巴樣疾病病毒、黃熱病病毒及茲卡病毒(Zika Virus)。在某些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)足以勝過及/或取代已存在於個體中之病毒，例如與參考相比至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在某些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)足以與慢性或急性病毒感染競爭。在某些實施例中，可預防性投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)以保護免於病毒感染(例如前病毒)。在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)呈足以調節(例如表型、病毒含量、基因表現、與其他病毒競爭、疾病病況等之量，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多)。
適合於內部使用之醫藥組合物包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。對於靜脈內投與，適合之載劑包括生理鹽水、抑菌水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物必須為無菌的且流動性應至存在易於注射性之程度。其在製造及儲存條件下必須穩定，且必須保護其免遭諸如細菌及真菌之微生物之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇以及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散介質。可例如在分散液之情況下藉由使用包衣(諸如卵磷脂)保持所需粒度及藉由使用界面活性劑(諸如聚山梨醇酯(例如Tween™)、十二烷基硫酸鈉(月桂基硫酸鈉)、月桂基二甲基氧化胺、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇、辛苯聚醇(Triton X100™)、N,N-二甲基十二胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化銨(HTAB)、聚乙二醇10月桂基醚、Brij 721™、膽汁鹽(去氧膽酸鈉、膽酸鈉)、普洛尼克酸(pluronic acid)(F-68、F-127)、聚乙二醇蓖麻油(Cremophor™)、乙氧基化壬基酚(Tergitol™)、環糊精及苄索氯銨(ethylbenzethonium chloride)(Hyamine™))來保持適當的流動性。微生物作用之預防可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑來達成，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，在組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠，來實現內部組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由如下方法製備：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，視需要隨後進行過濾滅菌。通常，藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及來自上文所列舉之成分之其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，其自其先前此前經無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何其他所需成分之散劑。
在一個態樣中，活性化合物係用將防止化合物自體內快速排除的載劑製備，諸如控制釋放型調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法為熟習此項技術者顯而易見的。物質亦可在商業上獲得。脂質體懸浮液(包括靶向具有針對病毒抗原之單株抗體的經感染細胞的脂質體)亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等物質可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如以引用之方式併入本文中之美國專利第4,522,811號。
眼部遞送系統在一些實施例中，本文所描述之組合物(例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物)或方法涉及眼部遞送系統，諸如眶視網膜下遞送系統。簡言之，此類遞送系統可包含待插入至眼睛中以用於將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遞送至眼睛中之插管、用於將生理食鹽水溶液或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遞送至插管之裝置主體、用於將生理食鹽水溶液遞送至裝置主體之第一線及用於將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遞送至裝置主體之第二線。更特定言之，在一些實施例中，遞送系統提供為三「套」。第一套為視網膜下注射裝置套，自帶視網膜下注射裝置，其包含插管尖端/針、針推進旋鈕、視網膜下注射裝置主體(帶磁鐵)、劑量線魯爾及BSS線魯爾。該系統亦可包含磁性襯墊及眼用標記物。磁體在注入期間提供穩定性。第二套(可稱為管路套)包括管路組件、BSS注射器、兩個注射器按扣環及CPC轉接器。第三套(可稱為劑量套)包含劑量注射器及導管夾具。
對於視網膜下注射裝置，內部針連接至針推進旋鈕，針推進旋鈕連接至視網膜下注射裝置主體。此有兩條線，各線連接至BSS線魯爾或劑量線魯爾。
因此，在一些實施例中，本文所描述之組合物(例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物)位於眼部遞送系統中。眼部遞送系統可包含例如： a)插管，其包含第一端及第二端，其中該插管之該第一端視情況包含針， b)視情況包含磁體之裝置主體，其中該插管之該第二端以可操作方式連接至該裝置主體， c)針推進旋鈕，定位於裝置主體上，其中針推進旋鈕可藉由使用者調節以使針伸出插管之第一端，例如延伸至視網膜下腔中； d)第一線，其可操作地附接至該連接的裝置主體(例如，與魯爾連接)，其中該第一線可用於遞送洗滌溶液，例如鹽水溶液，例如BSS，其中視情況該第一線可操作地連接至第一注射器(例如，使用注射器按扣環連接)； e)第二線，其可操作地附接至該連接的裝置主體(例如，與魯爾連接)，其中該第二線可用於遞送本文所描述之組合物(例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物)，其中視情況第二線可操作地連接至第二注射器(例如，使用注射器按扣環連接)。
在一些實施例中，眼部遞送系統為套組之一部分。套組可進一步包含磁性墊及眼用標記物中之一者或兩者。
在一些實施例中，本文所描述之方法包含使用眼部遞送系統(例如，上文所描述之眼部遞送系統)投與本文所描述之組合物(例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物)。在一些實施例中，該方法包含以手術方式製備眼睛以用於投與組合物，例如藉由暴露鞏膜(例如，藉由結膜腹膜切除術)，視情況轉移油墨至鞏膜以形成縫合模板，形成縫線環，且產生鞏膜切開術。插管可插入至虹膜切開術中。可置放眼部遞送系統。舉例而言，磁性襯墊可置放於個體之前額上，且裝置主體可置放於磁性襯墊上，例如與鞏膜切開術呈相同經線。插管之第一端可安置於角膜之相對邊緣正上方。可進行套管插入法。例如，可以被提起縫線環且可以使插管穿過縫線環。裝置主體可朝向眼睛滑動。插管可插入至虹膜切開術中。針可使用針推進旋鈕推進至視網膜下腔中。可例如使用連接至第一線之注射器投與生理食鹽水溶液(例如，BSS)。鹽水溶液可形成可見氣泡。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物可例如使用連接至第二線之注射器投與。指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物可釋放至氣泡中。可隨後縮回針。可將眼部遞送系統自眼睛移除。
遞送方法亦可包含以下步驟中之一或多者。
管路套之BSS注射器經由視網膜下注射裝置之BSS線附接至注射裝置。將柱塞插入至劑量注射器中，接著使無菌針附接至劑量注射器。
亦將柱塞插入至劑量注射器中，且將無菌針附接至劑量注射器。隨後將此針插入小瓶中，且用於將視網膜下輸液抽吸至注射器中。隨後移除針。
隨後將鎖片旋轉到閂鎖位置以準備劑量線。將劑量注射器連接至視網膜下注射裝置之劑量線。隨後使劑量注射器柱塞緩慢推進，直至達到硬擋板且達到觸覺點。此啟動劑量線及劑量注射器，以確保正確的視網膜下劑量體積已準備好注射到視網膜下區域。
若使用氣動噴射，則柱塞將逆時針旋轉以自BSS注射器移除螺紋桿且在BSS注射器中留下密封。導管待插入於BSS注射器之開口筒中且藉由在兩個組件上滑動注射器按扣環而固定在適當位置。在必要時，管總成隨後使用CPC轉接器附接至所選氣動源(例如，玻璃體切除術機器)。黏稠流體控制注射壓力應設定成36 psi。
供應給視網膜下遞送系統之所提供管技術方案僅與證實與眶SDS一起使用之替代劑量注射器(未在該套中供應)一起使用。替代注射器標記必須指示證實其與眶SDS一起使用且包括與眶SDS一起使用之說明書。若使用替代劑量注射器，則在啟動之後將套管夾置放於劑量管線上，以防止在BSS注射器使用期間潛在回流至替代劑量注射器中。在注射輸注之前即刻移除套管夾。
例示性手術步驟： 其藉由插入蓋窺鏡且為枝形吊燈插入閥調式孔口而製備該站點。下方鼻側旋轉眼睛以暴露顳上象限，且進行結膜環狀切開術(conjunctival peritomy)以暴露鞏膜。選擇不干擾所鑑別之渦流靜脈或長後睫狀神經血管束之插管路徑。用角膜緣將墨水塗在眼用標記物的尖端，且輕輕地將其壓在鞏膜上以轉移墨水。在乾燥鞏膜表面之後，標記物與角膜緣比對，且輕輕地壓抵鞏膜以轉移油墨，且藉此產生縫合模板(約10個油墨點)。產生縫線環。進行鞏膜切開術。
例示性裝置置放： 自磁性墊移除黏著襯底，且將墊置放在患者前額上方的無菌開窗手術巾上。磁墊頂部的已準備好的視網膜下注射裝置主體置放在與虹膜切開術相同的經線中。視網膜下注射套管的遠端尖端直接位於角膜相對邊緣的上方，以確保足夠的鬆弛度以進行推進。針推進且檢查BSS或BSS PLUS之流動。針經完全回縮。
例示性套管插入法： 使用光滑的鑷子，在距遠端尖端約10 mm的地方抓住柔性插管。在眼睛上使用帶齒的鑷子幫助插入，提起縫合環，且隨後抓住鞏膜切開術之後唇。插管穿過縫合環。在插入之前，視網膜下注射裝置主體向眼睛滑動以提供額外鬆弛且維持與眼睛曲率的切線路徑。在抓住鞏膜切開術後唇的中心且從眼睛拉開的同時，將柔性插管插入鞏膜切開術中。將眼旋轉回至中性軸。
使用Clearside Biomedical SCS微注入器之例示性方法： 在一些實施例中，本文所描述之組合物(例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物)或方法涉及眼部遞送系統，諸如SCS微小注射器。簡言之，此類遞送系統可包含針，其經適當尺寸設定以將指環病毒科家族載體(例如，指環載體)遞送至脈絡膜上腔；含有指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之腔室；及投與該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之柱塞。在一些實施例中，微小注射器由具有各種長度之針組成(針長印刷在針上-900 um或1100 um)。針為30規格針。針頭連接到一個結膜壓縮中心，該中心連接到一個腔室(例如，一個筒)，該腔室具有100 uL容量且具有以25 uL為增量的指示器。筒連接至柱塞及柱塞手柄以注射藥物。顯微注射器還配有一個針頭安全帽，帶有4.5 mm整合固定長度卡尺。
Clearside SCS微小注射器經設計用於脈絡膜上腔藥物遞送。
因此，在一些實施例中，本文所描述之組合物(例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物)位於眼部遞送系統中。眼部遞送系統可包含： a)針，例如30規格針，其中視情況地，針為800-1200 um (例如，長度約900 um或1100 um)； b)視情況連接到針頭的結膜壓縮中心； c)連接至結膜壓縮中心及針中之一者或兩者的腔室；及 d)視情況，柱塞連接至該腔室。
在一些實施例中，眼部遞送系統為套組之一部分。套組可進一步包含針安全帽及測徑規中之一者或兩者。
在一些實施例中，本文所描述之方法包含使用眼部遞送系統(例如，上文所描述之眼部遞送系統)投與本文所描述之組合物(例如，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物)。在一些實施例中，該方法包含將針插入脈絡膜上腔中且向脈絡膜上腔投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物。
給藥可利用多種分析以便確定用於投與之適當劑量，或評估基因遞送載體治療或預防特定疾病之能力。下文更詳細地論述此等分析中之某些。
應以在≥0.1 mL至≤ 0.5 mL範圍內之體積，較佳地以0.1至0.30 mL (100-300 µl)之體積，且最佳地以0.25 mL (250 µl)之體積，視網膜下及/或視網膜內投與(例如藉由經由經玻璃體途徑之視網膜下注射(手術程序)或經由脈絡膜上腔之視網膜下投與)治療有效量之如本文所描述之組合物或指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。應以100 μl或更小之體積，例如以50-100 μl之體積脈絡膜上腔投與治療有效劑量之重組載體。應以500 μl或更小之體積，例如以10-20 μl、20-50 μl、50-100 μl、100-200 μl、200-300 μl、300-400 μl或400-500 μl之體積，向鞏膜外表面投與(例如藉由後近鞏膜儲槽程序)治療有效量之重組載體。經由玻璃體切除術進行視網膜下投藥為由經過訓練之視網膜醫師執行的外科手術，其涉及在局部麻醉下對個體進行玻璃體切除術，且將基因療法視網膜下注射至視網膜中(參見例如Campochiaro等人, 2017, Hum Gen Ther 28(1):99-111，其以全文引用的方式併入本文中)。在一具體實施例中，無視網膜下投與係使用將藥物注射至視網膜下腔中之脈絡膜上導管經由脈絡膜上腔來進行，諸如包含導管之視網膜下藥物遞送裝置，該導管可插入且遂穿脈絡膜上腔接近後極，在該後極處小針注入至視網膜下腔中(參見例如Baldassarre等人, 2017, Subretinal Delivery of Cells via the Suprachoroidal Space: Janssen Trial. 在Schwartz等人(編) Cellular Therapies for Retinal Disease, Springer, Cham中；國際專利申請公開案第WO 2016/040635 A1號；其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。脈絡膜上投與程序涉及將藥物投與至眼睛之脈絡膜上腔，且通常使用脈絡膜上藥物遞送裝置來進行，諸如具有微針之微小注射器(參見例如Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23；Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87；其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。根據本文所描述之本發明，可用於將表現載體沈積於脈絡膜上腔中之脈絡膜上藥物遞送裝置包括但不限於由Clearside ®Biomedical, Inc.製造之脈絡膜上藥物遞送裝置(參見例如Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23)及MedOne脈絡膜上導管。根據本文所描述之本發明，可用於經由脈絡膜上腔將表現載體沈積於視網膜下腔中之視網膜下藥物遞送裝置包括但不限於由Janssen Pharmaceuticals, Inc.製造之視網膜下藥物遞送裝置(參見例如國際專利申請公開案第WO 2016/040635 A1號)。在一具體實施例中，向鞏膜外表面投與係藉由近鞏膜藥物遞送裝置來進行，該裝置包含尖端可插入且保持直接並置於鞏膜表面之插管。關於不同投與模式之更多細節，參見章節5.3.2。脈絡膜上、視網膜下、近鞏膜及/或視網膜內投與應致使將可溶性轉殖基因產物遞送至視網膜、玻璃體液及/或水狀液。由視網膜細胞，例如視桿細胞、視錐細胞、視網膜色素上皮細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、神經節細胞及/或穆勒細胞(Müller cell)表現轉殖基因產物(例如所編碼之抗VEGF抗體)致使將轉殖基因產物遞送於視網膜、玻璃體液及/或水狀液中且維持於其中。維持轉殖基因產物在玻璃體液中至少0.330 μg/mL或在水狀液(眼前房)中0.110 μg/mL之Cmin濃度持續三個月的劑量為所需的；其後，應維持轉殖基因產物之玻璃體Cmin濃度在1.70至6.60 μg/mL範圍內，及/或水狀液Cmin濃度在0.567至2.20 μg/mL範圍內。然而，因為轉殖基因產物持續產生，所以維持低濃度可為有效的。可在來自經治療之眼睛之前房的玻璃體液及/或水狀液的患者樣品中量測轉殖基因產物之濃度。替代地，可藉由量測患者之轉殖基因產物之血清濃度來估計及/或監測玻璃體液濃度--全身與玻璃體暴露於轉殖基因產物之比率為約1:90,000。(例如參見Xu L等人, 2013, Invest. Opthal. Vis. Sci. 54: 1616-1624, 第1621頁及第1623頁之表5中報導之蘭比珠單抗的玻璃體液及血清濃度，其以全文引用之方式併入本文中)。
可藉由眼內注射至玻璃體中將指環病毒科家族載體遞送至眼睛。在本申請案中，基因遞送載體之注射體積可實質上較大，因為體積不受視網膜下腔之解剖結構約束。在此實例中之可接受劑量之範圍介於25 ul至1000 ul。在本申請案中，待轉導之目標細胞包括視網膜神經節細胞，其為主要受青光眼影響之視網膜細胞。
在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以介於3x10 7、3x10 8、3x10 9或3x10 10個基因體複本至2.5x10 11、2.5x10 12或2.5x10 13個基因體複本範圍內之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以介於3x10 9個基因體複本至2.5x10 10個基因體複本範圍內之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以介於3x10 9個基因體複本至2.5x10 11個基因體複本範圍內之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以介於3x10 9個基因體複本至2.5x10 12個基因體複本範圍內之劑量投與。在一些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以介於3x10 9個基因體複本至2.5x10 13個基因體複本範圍內之劑量投與。
在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以約3x10 7、4 x10 7、5 x10 7、6 x10 7、7 x10 7、8x10 7或9 x10 7個基因體複本之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以約1x10 8、2 x10 8、3 x10 8、4 x10 8、5 x10 8、6 x10 8、7 x10 8、8 x10 8或9 x10 8個基因體複本之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以約1x10 9、2 x10 9、3x10 9、4 x10 9、5 x10 9、6 x10 9、7 x10 9、8 x10 9或9 x10 9個基因體複本之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以約1x10 10、2 x10 10、3 x10 10、4 x10 10、5 x10 10、6 x10 10、7 x10 10、8 x10 10或9 x10 10個基因體複本之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以約1x10 11、2x10 11、3 x10 11、4 x10 11、5 x10 11、6 x10 11、7 x10 11、8 x10 11或9 x10 11個基因體複本之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以約1x10 12、2 x10 12、3x10 12、4 x10 12、5 x10 12、6 x10 12、7 x10 12、8 x10 12或9 x10 12個基因體複本之劑量投與。在某些實施例中，該組合物或編碼轉殖基因之指環病毒科家族載體係以約1x10 13、2 x10 13、3 x10 13、4 x10 13、5 x10 13、6 x10 13、7 x10 13、8 x10 13或9 x10 13個基因體複本之劑量投與。
再投藥在一些情況下，本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)可用作遞送媒劑，其可以多次劑量(例如分開投與之劑量)投與。雖然不希望受理論束縛，但在一些實施例中，指環病毒科家族載體(例如，指環載體)(例如，如本文所描述)誘導相對較低的免疫反應(如所量測，例如50% GMT值，例如如實例12中所觀測到)，例如允許個體重複給藥一或多個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)(例如，多個劑量的相同指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或不同指環病毒科家族載體(例如，指環載體))。在一態樣中，本發明提供一種遞送效應子之方法，其包含向個體投與第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)且隨後投與第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含與第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)相同的蛋白質外部。在另一態樣中，本發明提供一種選擇個體(例如，人類個體)接受效應子之方法，其中該個體先前接受或鑑別為已接受第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其包含編碼效應子之遺傳元件，其中該方法涉及選擇該個體接受包含編碼效應子之遺傳元件的第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)(例如與由第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件編碼之效應子相同的效應子，或與由第一複數多個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之遺傳元件編碼之效應子不同的效應子)。在另一態樣中，本發明提供一種鑑別個體(例如，人類個體)適於接受第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)的方法，該方法包含鑑別個體先前已接受包含編碼效應子之遺傳元件的第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，其中該個體鑑別為接受該第一複數個指環病毒科家族載體(例如指環載體)指示該個體適於接受該第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
在一些實施例中，第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)包含與第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)中之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基之蛋白質外部。在一些實施例中，第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)及第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)攜帶編碼相同效應子之遺傳元件。在一些實施例中，第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)及第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)攜帶編碼不同效應子之遺傳元件。
在一些實施例中，第二複數個包含與第一複數個約相同的數量及/或濃度之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)(例如，當在投與時標準化為個體之身體質量時)，例如，當在投與時相對於個體之身體質量標準化時，第二複數個佔第一複數個中之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)數目的90-110%，例如95-105%。在一些實施例中，其中第一複數個包含比第二複數個更大劑量之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如其中第一複數個包含相對於第二複數個更大數量及/或濃度之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，其中第一複數個包含比第二複數個更低劑量之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如其中第一複數個包含相對於第二複數個更低數量及/或濃度之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
在一些實施例中，評估個體投與第一及第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)，例如來自第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其子代之存在(例如，持久性)。在一些實施例中，若未偵測到來自第一複數個中之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或其子代之存在，則向個體投與第二複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
在一些實施例中，在向個體投與第一複數個之後至少1、2、3或4週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月，或1、2、3、4、5、10或20年向個體投與第二複數個。在一些實施例中，在向個體投與第一複數個之後1-2週、2-3週、3-4週、1-2個月、3-4個月、4-5個月、5-6個月、6-7個月、7-8個月、8-9個月、9-10個月、10-11個月、11-12個月、1-2年、2-3年、3-4年、4-5年、5-10年或10-20年向個體投與第二複數個。在一些實施例中，該方法包含在至少1、2、3、4或5年之時程內投與重複劑量之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一複數個之後且在投與第二複數個之前評定以下中之一或多者： 該個體中之該效應子之水準或活性(例如藉由例如由ELISA偵測蛋白質效應子；藉由例如由RT-PCR偵測核酸效應子；或藉由偵測效應子之下游效應，例如受效應子影響之內源性基因之水準)； b)該第一複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)在該個體中之含量或活性(例如，藉由偵測該指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之VP1含量)； c)投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)以進行治療之個體中之疾病之存在、嚴重程度、進展或病徵或症狀；及/或 d)針對指環病毒科家族載體(例如，指環載體)之免疫反應(例如中和抗體)之存在或含量。
在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與例如如本文所描述之第三、第四、第五及/或其他複數個指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
在一些實施例中，第一複數個及第二複數個經由相同投與途徑投與，例如靜脈內投與。在一些實施例中，第一複數個及第二複數個經由不同投與途徑投與。在一些實施例中，第一及第二複數個藉由同一實體(例如同一健康照護提供者)投與。在一些實施例中，第一及第二複數個藉由不同實體(例如不同健康照護提供者)投與。在一些實施例中，第一及第二複數個中之一者或兩者均視網膜下、玻璃體內或脈絡膜上投與。
治療方法在一個態樣中，本發明提供一種用於治療疾病、病症或病狀(例如，眼睛疾病)之方法，該方法包含向需要此類治療之個體(例如，人類個體)投與醫藥學上有效量之本文所提供之指環病毒科家族載體或包含指環病毒科家族載體的醫藥組合物。在一些態樣中，疾病選自由以下組成之眼部新生血管疾病之群：老年性黃斑變性(AMD)、濕性AMD、乾性AMD、視網膜新血管生成、脈絡膜新生血管、糖尿病性視網膜病變、增生性糖尿病性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、視網膜中央靜脈阻塞、視網膜分枝靜脈阻塞、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變及糖尿病性視網膜水腫。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為單基因性疾病。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為多基因性疾病(例如，青光眼)。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為黃斑變性(例如，老年性黃斑變性(AMD)、斯特格氏病或近視性黃斑變性)。在某些實施例中，黃斑變性為濕性AMD。在某些實施例中，黃斑變性為乾性AMD (例如，具有地圖狀萎縮之AMD)。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為視網膜疾病。在某些實施例中，視網膜疾病為遺傳性視網膜疾病(IRD)，例如如Stone等人. (2017, Ophthalmology；關於其中所描述之疾病及病症以引用的方式併入本文中)中所描述。在某些實施例中，視網膜疾病為色素性視網膜炎(例如，X性聯色素性視網膜炎(XLRP))。
在一些實施例中，可經本文所描述之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或包含此類指環病毒科家族載體之組合物治療的疾病、病症或病況為VEGF相關病症(例如，癌症，例如如本文所描述；黃斑部水腫；或增殖性視網膜病)。
在一些實施例中，該疾病、病症或病狀係選自由以下組成之群：視網膜洩漏、萊伯氏先天性黑朦症(LCA) (例如，其中該遺傳元件包含人類RPE65序列，例如編碼人類RPE65蛋白質之序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列)、先天性黑朦症、視錐視桿細胞營養不良、無脈絡膜症、卵黃狀黃斑變性、高鐵蛋白血症-白內障症候群、光學萎縮症、XLR視網膜劈裂症、巨細胞病毒視網膜炎、色盲、雷伯氏遺傳性光學神經病變、角膜炎、葡萄膜炎、葛瑞夫茲氏眼病變、糖尿病性視網膜病變或糖尿病黃斑水腫。
在一些情況下，可治療乾性AMD。在一些情況下，乾性AMD可被稱為中心地圖狀萎縮，其特徵為視網膜下方的視網膜色素上皮萎縮，且隨後眼睛中央部分的光感受器喪失。本發明之組合物及方法提供對任何及所有形式之AMD的治療。
在另一態樣中，本發明提供如本文所描述之AMD或眼部新生血管性疾病之預防性治療的方法，其包含向需要此類治療之人類個體投與醫藥學上有效量的本文所提供之醫藥組合物。本發明可用於治療處於罹患AMD之風險下的患者，或呈現該疾病之早期症狀的患者。此可包括同時或依序治療眼睛。同時治療可意謂同時向各眼睛投與治療或在相同訪視期間向治療醫師或其他保健提供者治療兩隻眼睛。據記載，患者在出現AMD症狀眼的健康對側眼中或在具有發展為AMD的遺傳易感性的患者中患AMD的風險更高。本發明可用作預防老年人中之AMD的預防性治療。
儘管患有眼部新生血管疾病進展之風險增加的基礎機制為未知的，但在詳述此高風險之領域中存在多個研究。舉例而言，在一個此類大規模研究中，觀測到進展至晚期AMD的110隻對側眼中，98隻眼睛中患上脈絡膜新生血管(CNV)及15隻眼睛中視窩地圖狀萎縮(GA)。Ophthalmologica 2011; 226(3):110-8. doi: 10.1159/000329473. Curr Opin Ophthalmol. 1998 June; 9(3):38-46。基線時研究眼的非眼部特徵(年齡、性別、高血壓或吸菸史)或眼部特徵(病變成分、病變大小或視力)均無法預測該組中晚期AMD的進展。統計分析表明，第一隻眼的AMD症狀，包括玻璃膜疣大小、局灶性色素過多及非中心凹地理萎縮，在評估對側眼發生AMD的風險時具有顯著的獨立關係。近期研究已指示，眼部特徵、遺傳因素及某些環境因素可在對側眼罹患AMD的風險增加中起一定作用。JAMA Ophthalmol. 2013 Apr. 1; 131(4):448-55. doi: 10.1001/jamaophthalmol.2013.2578。鑒於在未治療的對側眼中已充分表徵的AMD發展風險升高，此項技術中需要預防該疾病引起的發作及隨後的視力喪失的方法。
在一些態樣中，在投與該醫藥組合物之後7、14、21或30天，未在人類個體淚液、血液、唾液或尿液樣品中偵測到載體。在一些態樣中，如此項技術中已知，藉由qPCR或ELISA偵測病毒載體之存在。
在一些態樣中，如在至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月週期內藉由連續眼科檢查所評估，人類個體未顯示出臨床上顯著之視網膜毒性。在一些態樣中，如在至多約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月週期內藉由連續眼科檢查所評估，人類個體未顯示出臨床上顯著之視網膜毒性。
在一些態樣中，在至少兩個月期間人類個體中不存在淺表、前段或玻璃體發炎性症狀。在一些情況下，在投與醫藥組合物之後1週或3、6、9或12個月時人類個體中不存在淺表、前段或玻璃體發炎性症狀。
在一些態樣中，在投與後至少120天，該人類個體中無視力喪失、TOP升高、視網膜剝離或任何眼內或全身免疫反應之證據。
本文中引用之所有參考文獻及公開案均以引用之方式併入本文中。
提供以下實例以進一步說明本發明之一些實施例，但不意欲限制本發明之範疇；藉由其例示性性質，應瞭解，可替代地使用熟習此項技術者已知之其他程序、方法或技術。
實例目錄  實例1：指環載體(指環載體A)之免疫效應：在投與之後指環載體的活體內效應功能，例如miRNA之表現  實例2：蛋白質結合序列之鑑別及使用：指環病毒基因體中之假定蛋白質結合位點 實例3：複製缺陷型指環載體及輔助病毒 實例4：複製勝任型指環載體之產生方法 實例5：複製缺陷型指環載體之產生方法：複製缺陷型指環載體之回收及按比例擴大產生 實例6：使用懸浮液細胞之指環載體的產生：懸浮液中之細胞中的指環載體之產生. 實例7：qPCR對指環載體基因體當量的定量：開發基於水解探針之定量PCR分析以定量指環載體 實例8：表現外源性微小RNA序列之指環載體的功能效應：使用指環載體以表現功能性核酸效應子 實例9：指環載體產生所需的區域之表徵 實例10：外源性蛋白質之活體內指環載體遞送：此實例表明在投與之後指環載體的活體內效應功能(例如，蛋白質之表現) 實例11：指環病毒基因體之串聯複本 實例12：活體外環化指環病毒基因體：包含具有最低非病毒DNA之環狀、雙股指環病毒基因體DNA的構築體 實例13：產生含有具有來自不同細環病毒株之高變域的嵌合ORF1的指環載體 實例14：攜帶DNA有效負載之指環載體的設計 實例15：編碼指環載體之抗體轉殖基因的轉導 實例16：基於tth8及LY2之指環載體各自成功地將EPO基因轉導至肺癌細胞中 實例17：在靜脈內(i.v.)投與之後可活體內偵測到具有治療性轉殖基因之指環載體 實例18：活體外環化基因體作為用於活體外產生指環載體之輸入材料 實例19：重組Ring 19人類指環病毒之拯救 實例20：使用MOLT-4細胞之指環病毒的產生及純化 實例21：Ring19粒子展現出活體內感染性 實例22.視網膜及PEC在視網膜下及玻璃體內注射後的Ring 2感染性 實例23.視網膜及PEC在視網膜下及玻璃體內注射後的CAV感染性及轉導
實例1：指環載體(指環載體A)之免疫效應  此實例描述投與之後的指環載體之活體內效應功能，例如miRNA之表現。
使用百倍稀釋，以每公斤10 14個基因體當量開始，降至每公斤0個基因體當量，以各種劑量向健康豬靜脈內投與如本文所描述製備之經純化指環載體。為了評估對免疫耐受性之影響，用指環載體或媒劑對照PBS每天注射豬持續3天，且在3天之後處死。
收穫脾臟、骨髓及淋巴結。由組織中之各者製備單細胞懸浮液，且經MHC-II、CD11c及胞內IFN之胞外標記物染色。經由流動式細胞測量術對來自各組織的MHC+、CD11c+、IFN+抗原呈現細胞進行分析，例如其中對上述標記物中之給定標記物呈陽性之細胞為如下細胞：其展現出的螢光高於缺乏該標記物之表現的陰性對照群體中99%之細胞但在相同條件下在其他方面類似於細胞分析群體。
在一實施例中，與對照相比，指環載體處理組中之IFN+細胞數目降低將表明指環載體在投與之後使細胞中之IFN產生降低。
實例 2： 蛋白質結合序列之鑑別及使用此實例描述指環病毒基因體中之假定蛋白質結合位點，其可用於例如在如本文所描述之指環載體中擴增及封裝效應子。在一些情況下，蛋白質結合位點可能能夠結合至外部蛋白質，諸如衣殼蛋白質。
指環病毒基因體內之兩個保守域為假定複製起點：5' UTR保守域(5CD)及富含GC之域(GCR) (de Villiers等人., Journal of Virology 2011; Okamoto等人., Virology 1999)。在一個實例中，為了證實此等序列是否充當DNA複製位點或充當衣殼封裝訊號，在攜帶指環病毒序列之質體中產生各區域之缺失。A539細胞經缺失構築體轉染。將經轉染細胞培育四天，且隨後自上清液及細胞集結粒中分離出病毒。將A549細胞用病毒感染，且在四天之後，自上清液及感染之細胞集結粒中分離出病毒。進行qPCR以定量來自樣品之病毒基因體。複製起點之破壞防止了病毒複製酶擴增病毒DNA且使得與野生型病毒相比，自經轉染的細胞集結粒中分離之病毒基因體減少。少量病毒仍被封裝且可見於經轉染上清液及經感染細胞集結粒中。在一些實施例中，封裝訊號之中斷將防止病毒DNA被衣殼蛋白質囊封。因此，在實施例中，在經轉染細胞中將仍存在病毒基因體之擴增，但在上清液或經感染細胞集結粒中未發現病毒基因體。
在另一實例中，為了表徵DNA中之額外複製或封裝訊號，使用跨越整個TTMV-LY2基因體之一系列缺失。100bp之缺失在整個序列之長度中逐步發生。攜帶指環病毒基因體缺失之質體經轉染至A549中，且如上文所描述進行測試。在一些實施例中，破壞病毒擴增或封裝之缺失將含有潛在順式調節域。
複製及封裝訊號可併入至編碼效應子之DNA序列中(例如，在指環載體中之遺傳元件中)以誘導擴增及封裝。此在指環載體基因體之較大區域之情況下(亦即，將效應子插入基因體中之特定位點中，或用效應子替換病毒ORF等)或藉由將最小順式訊號併入效應子DNA中來進行。在指環載體缺乏反式複製或封裝因子(例如，複製酶及衣殼蛋白質等)的情況下，反式因子由輔助基因提供。輔助基因表現足以誘導擴增及封裝之所有蛋白質及RNA，但缺乏其自身封裝訊號。指環載體DNA與輔助基因共轉染，引起效應子之擴增及封裝，但不引起輔助基因之擴增及封裝。
實例 3： 複製缺陷型指環載體及輔助病毒為了複製及封裝指環載體，一些元件(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3分子或編碼其之核酸序列)可以反式形式提供。此等包括導引或支援DNA複製或封裝之蛋白質或非編碼RNA。在一些情況下，反式元件可自指環載體之替代來源(諸如輔助病毒、質體)或自細胞基因體提供。
其他元件通常以順式形式提供(例如，TATA盒、加帽位點、起始子元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、三個開讀框區域、聚(A)訊號或富含GC之區)。此等元件可為例如充當複製起點(例如以允許擴增指環載體DNA)或封裝信號(例如以結合至蛋白質以將基因體負載至衣殼中)之指環載體DNA中之序列或結構。通常，複製缺陷型病毒或指環載體將缺失此等元件中之一或多者，使得即使以反式形式提供其他元件，DNA仍無法封裝至感染性病毒粒子或指環載體中。
複製缺陷型病毒可適用於控制相同細胞中之指環載體(例如，複製缺陷型或封裝缺陷型指環載體)的複製。在某些情況下，輔助病毒將缺乏順式複製或封裝元件，但表現反式元件，諸如蛋白質及非編碼RNA。通常，治療性指環載體將缺乏此等反式元件中之一些或全部，且因此將無法自行複製，但將保留順式元件。在共轉染/感染至細胞中時，複製缺陷型病毒將驅動指環載體之擴增及封裝。因此，所收集之封裝粒子將僅由治療性指環載體構成，而不受複製缺陷型病毒污染。
為產生複製缺陷型指環載體，將移除指環病毒之非編碼區中之保守元件。詳言之，將分別及一起測試保守5' UTR域及富含GC之域的缺失。兩種元件經考慮對於病毒複製或封裝均為重要的。另外，將在整個非編碼區上進行系列缺失以鑑別先前未知的所關注區。
複製元件之成功缺失將引起細胞內之指環載體DNA擴增降低，例如以藉由qPCR所量測，但將支援一些感染性指環載體產生，例如以藉由經感染細胞上之分析所監測，該等分析可包括qPCR、西方墨點、螢光分析或發光分析中之任一者或全部。封裝元件之成功缺失將不破壞指環載體DNA擴增，因此藉由qPCR在經轉染細胞中將觀測到指環載體DNA之增加。然而，指環載體基因體將未囊封，因此不會觀測到感染性指環載體產生。
實例 4： 複製勝任型指環載體之製造方法此實例描述一種用於回收且按比例擴大複製勝任型指環載體之生產的方法。當指環載體在其基因體中編碼所有所需核酸元件及在細胞中複製所需的ORF時，指環載體為複製勝任型。由於此等指環載體在其複製中無缺陷，所以其不需要以反式提供的補充活性。然而，其可能需要輔助活性，諸如轉錄增強子(例如，丁酸鈉)或病毒轉錄因子(例如，腺病毒E1、E2、E4、VA；HSV Vp16及即刻早期蛋白質)。
在此實例中，將編碼呈線性或環狀形式之合成指環載體的完整序列的雙股DNA藉由化學轉染引入至T75燒瓶中之5E+05黏附哺乳動物細胞中，或藉由電穿孔引入至懸浮液中之5E+05細胞中。在最佳時段(例如，轉染後3-7天)之後，藉由將細胞刮至上清液培養基中來收穫細胞及上清液。將諸如膽鹽之溫和清潔劑添加至最終濃度為0.5%，且在37℃下培育30分鐘。將氯化鈣及氯化鎂添加至最終濃度分別為0.5mM及2.5mM。添加核酸內切酶(例如，DNA酶I，Benzonase)，且在25-37℃下培育0.5-4小時。使指環載體懸浮液在1000×g下在4℃下離心10分鐘。將澄清上清液轉移至新管中，且用低溫保護緩衝液(亦稱為穩定緩衝液) 1:1稀釋，且必要時儲存於-80℃下。此產生0代指環載體(P0)。為了使洗滌劑濃度低於待在經培養細胞上使用之安全限值，視指環載體效價而定，將此接種物在無血清培養基(SFM)中稀釋至少100倍或更多倍。
使T225燒瓶中之新鮮哺乳動物細胞單層與足以覆蓋培養物表面之最小體積重疊，且在37℃及5%二氧化碳下在平緩擺動下培育90分鐘。用於此步驟之哺乳動物細胞可或可不與P0回收所用之細胞類型相同。在此培育之後，接種物經40 ml無血清、無動物來源之培養基置換。使細胞在37℃及5%二氧化碳下培育3-7天。添加先前使用之相同溫和清潔劑的4 mL 10×溶液以達成0.5%之最終清潔劑濃度，且隨後在輕微攪拌下在37℃下培育混合物30分鐘。添加核酸內切酶，且在25-37℃下培育0.5-4小時。隨後收集培養基，且在4℃下在1000×g下離心10分鐘。使澄清上清液與40 mL穩定緩衝劑混合，且儲存於-80℃下。此產生種子儲備液或1代指環載體(P1)。
取決於儲備液之效價，其在SFM中稀釋不少於100倍，且添加至在所需尺寸之多層燒瓶上生長的細胞。感染倍率(MOI)及培育時間以較小標度最佳化以確保最大指環載體產生。收穫後，可接著純化指環載體且視需要濃縮。展示工作流(例如，此實例如中所描述)之示意圖提供於圖12中。
實例 5： 複製缺陷型指環載體之製造方法此實例描述一種用於回收且按比例擴大複製缺陷型指環載體之生產的方法。
指環載體可藉由參與複製之一或多個ORF (例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)的缺失而呈現複製缺陷型。複製缺陷型指環載體可生長於補充細胞株中。此類細胞株構成性地表現促進指環載體生長但在指環載體之基因體中為缺失的或無功能性的組分。
在一個實例中，將參與指環載體傳播之任何ORF的序列選殖至適用於產生編碼選擇標記物之穩定細胞株的慢病毒表現系統中，且如本文所描述產生慢病毒載體。能夠支援指環載體繁殖之哺乳動物細胞株經此慢病毒載體感染，且藉由選擇標記物(例如嘌呤黴素或任何其他抗生素)經受選擇性壓力以選擇已穩定整合經選殖ORF的細胞群體。一旦此細胞株經表徵及認證以補充經工程化指環載體中之缺陷，且因此支援此類指環載體之生長及傳播，則該細胞株經擴增且儲備於低溫儲存器中。在此等細胞之擴增及維持期間，將選擇抗生素添加至培養基中以維持選擇性壓力。一旦將指環載體引入至此等細胞中，便可停止選擇抗生素。
當建立此細胞株時，進行複製缺陷型指環載體之生長及產生，例如實例15如中所描述。
實例 6： 使用懸浮液細胞產生指環載體此實例描述在懸浮液中之細胞中產生指環載體。
在此實例中，使經調適以在懸浮液條件中生長之A549或293T生產細胞株在37℃及5%二氧化碳下在WAVE生物反應袋中在無動物組分及無抗生素懸浮液培養基(Thermo Fisher Scientific)中生長。以1×10 6個活細胞/毫升接種之此等細胞在當前良好作業規範(cGMP)下使用脂染胺2000 (Thermo Fisher Scientific)用包含指環載體序列之質體以及適合封裝指環載體(例如，在複製缺陷型指環載體之情況下，例如如實例16中所描述)或封裝指環載體所需的任何補充質體轉染。補充質體可在一些情況下編碼已自指環載體基因體(例如基於病毒基因體(例如指環病毒基因體，例如如本文所描述)之指環載體基因體)缺失，但適合複製及封裝指環載體或其所需的病毒蛋白。使經轉染細胞在WAVE生物反應袋中生長且在以下時間點收穫上清液：轉染後48、72及96小時。使用離心自各樣品之細胞集結粒分離上清液。接著使用離子交換層析自收穫之上清液及裂解之細胞集結粒純化封裝之指環載體粒子。
可例如如下地確定指環載體之純化製備物中之基因體當量：藉由使用純化製備物之小等分試樣以使用病毒基因體提取套組(Qiagen)收穫指環載體基因體，接著使用靶向指環載體DNA序列之引子及探針進行qPCR，例如如實例18中所描述。
可藉由製備純化製備物之連續稀釋液以感染新A549細胞來定量純化製備物中之指環載體的感染性。轉染後72小時收穫此等細胞，之後使用對指環載體DNA序列具有特異性之引子及探針對基因體DNA進行qPCR分析。
實例 7： qPCR 對 指環載體基因體 當量之 定量此實例表明開發基於水解探針之定量PCR分析以定量指環載體。基於指環病毒基因體序列，使用具有最終使用者最佳化之軟體Geneious設計引子及探針集合。TTV (登錄號AJ620231.1)及TTMV (登錄號JX134045.1)之例示性引子序列展示於下表44中。
表 44 ： 用於藉由定量 PCR 定量 TTMV 及 TTV 基因體當量之正向及反向引子及水解探針之序列 .
TTMV    SEQ ID NO:
正向引子 5'-GAAGCCCACCAAAAGCAATT-3' 697
反向引子 5'-AGTTCCCGTGTCTATAGTCGA-3' 698
探針 5'-ACTTCGTTACAGAGTCCAGGGG-3' 699
        
TTV      
正向引子 5'-AGCAACAGGTAATGGAGGAC-3' 700
反向引子 5'-TGGAAGCTGGGGTCTTTAAC-3' 701
探針 5'-TCTACCTTAGGTGCAAAGGGCC-3' 702
作為產生方法中之第一步驟，使用具有SYBR-綠色化學之指環病毒引子進行qPCR以檢查引子特異性。圖13展示各引子對之一個不同擴增峰。
水解探針經螢光團6FAM在5'端處及經小凹槽結合、非螢光驟冷劑(MGBNFQ)在3'端處有序地標記。使用兩種不同商業主混合物，使用經純化質體DNA作為標準曲線之組分及增加之引子濃度來評估新穎引子及探針之PCR效率。藉由使用含有針對不同組之引子-探針之目標序列的經純化質體來設定標準曲線。進行七十倍連續稀釋以達成超過7 log之線性範圍及每20 ul反應物15個複本之定量的下限。用於qPCR之所有引子自商業供應商(諸如，IDT)定序。與螢光團6FAM及小凹槽結合、非螢光驟冷劑(MGBNFQ)共軛之水解探針以及所有qPCR主混合物自Thermo Fisher中獲得。例示性擴增曲線展示於圖15中。
使用此等引子-探針組及試劑，定量指環載體儲備液中之基因體當量(GEq)/ml。隨後使用線性範圍來計算GEq/ml。可按需要稀釋具有比線性範圍更高濃度之樣品。
實例 8： 表現外源性微小 RNA 序列之指環載體的功能性作用此實例表明使用天然啟動子自指環載體基因體成功表現外源性miRNA (miR-625)。
在24孔盤中將500 ng以下質體DNA轉染至HEK293T細胞之60%匯合的孔中： i)空質體主鏈 ii)含有指環病毒基因體之質體，其中基因剔除(KO)內源性miRNA iii)指環病毒基因體，其中內源性miRNA經非靶向加擾miRNA置換 iv)指環病毒基因體，其中內源性miRNA序列經編碼miR-625之miRNA置換
轉染後72小時，使用Qiagen miRNeasy套組自經轉染細胞中收穫總miRNA，之後使用miRNA Script RT II套組進行反轉錄。使用應特異性地偵測miRNA-625或RNU6小RNA之引子在反轉錄DNA上進行定量PCR。RNU6小RNA用作管家基因，且資料繪製為相對於空載體之倍數變化。
實例 9： 指環載體產生所需的區域之表徵此實例描述指環病毒基因體中之缺失以幫助表徵足以用於複製病毒及指環載體產生之基因體部分。在ORF之TTV-tth8下游的非編碼區域(NCR)中產生一系列缺失(nts 3016至3753)。自GC區域(經標記Δ36nt (GC))中缺失36-核苷酸(nt)序列(CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160))。另外，自3'NCR (經標記Δ36nt (GC) ΔmiR)中缺失78-nt 前-微小RNA序列(CCGCCATCTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGG (SEQ ID NO: 161))。且最後，Δ36nt (GC)之額外3'NCR中缺失171 nts (CTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGGACAATTTCTTCCGGGTCAAAGGTTACAGCCGCCATGTTAAAACACGTGACGTATGACGTCACGGCCGCCATTTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCC (SEQ ID NO: 162))及標記Δ3'NCR (圖26)。2 μg分別具有上文所描述之經改變3'NCR TTV-tth8的環狀pTTV-tth8 (WT)、pTTV-tth8(Δ36nt (GC))、pTTV-tth8(Δ36nt (GC) ΔmiR)、pTTV-tth8(Δ3'NCR) DNA質體一式三份地使用脂染胺2000在12孔培養盤中以60%匯合轉染至HEK293中。在轉染之後48小時，收穫細胞集結粒且溶解以分離mRNA轉錄物(RNeasy，Qiagen目錄號74104)且轉化成cDNA (高容量cDNA反轉錄套組，ThermoFisher，目錄號4368814)。對所有樣品進行qPCR，量測每次缺失時之病毒轉錄物表現，且相對於GAPDH之內部對照mRNA進行標準化。
如圖27A-27D中所示，所有三種缺失突變體均顯著抑制活體外病毒轉錄物表現。因此，TTV-tth8之3' NCR為用於表現轉殖基因之指環載體產生所需。
TTV病毒株tth8，GeneBank登錄號AJ620231.1，寄存為全基因體序列。然而，在富含GC之區中，存在36個核苷酸之片段，標註為通用Ns。此區域在TTV病毒株中高度保守，且因此對於此等病毒之生物學可能為重要的。將數百個TTV病毒株之DNA序列在計算上對齊且用於產生彼等36個核苷酸之較強共有序列(CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160))。在本文中稱為「野生型序列」之TTV-tth8基因體序列因此使得此共有序列插入以替代公開可獲得的TTV-tth8序列中所列之36個Ns之片段。
實例 10 ： 活體內外源性蛋白質之指環載體遞送此實例表明在投與之後指環載體之活體內效應功能(例如，蛋白質之表現)。
製備包含編碼奈米-螢光素酶(nLuc)之轉殖基因的指環載體(圖28A-28B)。簡言之，經攜帶指環病毒非編碼區及nLuc表現匣之雙股DNA質體轉染至HEK293T細胞以及編碼完整指環病毒基因體之雙股DNA質體中以充當反式複製及封裝因子。在轉染之後，培育細胞以允許指環載體產生，且收穫指環載體物質且經由核酸酶處理、超過濾/透濾及無菌過濾進行富集。額外HEK293T細胞經攜帶nLuc表現匣及指環病毒ORF轉染匣但缺乏複製及封裝必需之非編碼域的非複製DNA質體轉染，以充當「非病毒」陰性對照。根據與指環載體物質相同的方案製備非病毒樣品。
向三個健康小鼠組肌肉內投與指環載體製劑，且藉由IVIS Lumina成像(Bruker)歷經九天進行監測。作為非病毒對照，向三隻額外小鼠投與非複製製劑。在第0天向左後腿投與25µL指環載體或非病毒製劑之注射液，且在第4天向右後腿再投與。與非病毒製劑相比，用指環載體製劑注射之小鼠中觀測到nLuc發光訊號之出現量更多，將與活體內指環載體轉導後之反式基因表現一致。
實例 11： 指環病毒基因體之串聯複本此實例描述攜帶單一指環病毒基因體之兩個複本的基於質體之表現載體，該等複本以串聯配置使得上游基因體之富含GC區接近下游基因體之5'區(圖31A)。
指環病毒經由滾環複製，其中複製酶(Rep)蛋白質在複製起點處結合至基因體，且起始環周圍之DNA合成。對於質體主鏈中所含之指環病毒基因體，此需要比原生病毒基因體更長的完整質體長度的複製，或產生包含具有最小主鏈之基因體之較小環之質體的重組。因此，脫離質體之病毒複製可能為低效的。為了改進病毒基因體複製效率，質體經TTV-tth8及TTMV-LY2之串聯複本工程化。此等質體呈現指環病毒基因體之每個可能的環狀排列：不管Rep蛋白質結合之情況，其將能夠驅動病毒基因體自上游複製起點至下游起點之複製。類似策略已用於產生豬指環病毒(Huang等人., 2012, Journal of Virology 86 (11) 6042-6054)。
串聯指環載體可例如藉由將基因體之複本依序選殖至質體主鏈中而組裝，從而在兩個序列之間留下12bp之非病毒DNA。或者，串聯指環載體可經由金-門控組裝(Golden-gate assembly)來組裝，同時將基因體之兩個複本併入主鏈中且在基因體之間不留額外核苷酸。
將攜帶指環載體遺傳元件序列之串聯複本的質體轉染至HEK239T細胞中。將細胞培育五天，隨後使用0.1% Triton X-100溶解且經核酸酶處理以消化不受病毒衣殼保護之DNA。隨後使用Taqman探針針對TTV-tth8基因體序列及質體主鏈進行qPCR。TTV-tth8基因體複本相對於主鏈複本標準化。
實例 12： 活體外環化指環病毒基因體此實例描述包含具有最小非病毒DNA之環狀雙股指環病毒基因體DNA的構築體。此等環狀病毒基因體更密切地匹配在野生型指環病毒複製期間發現的雙股DNA中間物。當引入至細胞中時，具有最小非病毒DNA之此類環狀雙股指環病毒基因體DNA可經歷滾環複製以產生例如如本文所描述之遺傳元件。
在一個實例中，攜帶指環病毒基因體序列之質體係用識別側接基因體DNA之位點的限制性核酸內切酶消化。隨後使所得經線性化基因體接合，以形成環狀DNA。此等接合反應在變化的DNA濃度下進行，以使分子內接合最佳化。將接合之環直接轉染至哺乳動物細胞中，或藉由用限制性核酸內切酶消化以裂解質體主鏈且用核酸外切酶消化以降解線性DNA來進一步處理，以移除非環狀基因體DNA。為了展現出指環病毒產生之改進，將環化指環病毒基因體構築體轉染至HEK293T細胞中。在培育7天之後，溶解細胞，且進行qPCR以比較環化與基於質體之指環病毒基因體之間的指環病毒基因體之含量。增加含量之指環病毒基因體顯示，病毒DNA之環化為適用於增加指環病毒產生之策略。
在電溶離或Qiagen管柱純化且用T4 DNA接合酶接合之前，在1%瓊脂糖凝膠上純化經消化質體。在轉染之前在100 kDa UF/DF膜上濃縮經環化DNA。藉由凝膠電泳確認環化。在用脂染胺2000進行脂質體轉染之前，以3×10 4個細胞/cm 2用HEK293T接種T-225燒瓶。在燒瓶接種後一天，共轉染九微克經環化指環病毒DNA及50 μg經環化指環病毒-nLuc。作為比較，額外T-225燒瓶經50 μg線性化指環病毒及50 μg之線性化指環病毒-nLuc共轉染。
在Triton X-100收穫緩衝劑中收穫細胞之前，進行指環載體產生持續八天。通常，指環載體可例如藉由宿主細胞之裂解、裂解物之澄清、過濾及層析進行富集。在此實例中，所收穫之細胞在氯化鈉調節及1.2 μm/0.45 μm正常流動過濾之前經核酸酶處理。濃縮澄清的收穫物，且在750 kDa MWCO mPES中空纖維膜上緩衝交換至PBS中。TFF保留物在負載於PBS中之預先平衡的Sephacryl S-500 HR SEC管柱上之前使用0.45 μm過濾器進行過濾。指環載體在30 cm/hr下在SEC管柱中處理。收集個別溶離份，且藉由qPCR分析病毒基因體複本數及轉殖基因複本數。在SEC層析圖之空隙體積(部分7)開始觀測到病毒基因體及轉殖基因複本。指環病毒基因體及指環病毒-nLuc轉殖基因之複本數與使用在溶離份7-溶離份10處之環化輸入DNA產生的指環載體良好一致，表明含有nLuc轉殖基因之封裝的指環載體。合併SEC溶離份且使用100 kDa MWCO PVDF膜濃縮，且隨後在活體內投與之前0.2 μm過濾。
實例 13： 產生含有具有來自不同細環病毒株之高變域的嵌合 ORF1 的 指環載體此實例描述ORF1之高變區的域交換以產生含有以下之嵌合指環載體：ORF1富含精胺酸之區、果凍卷域、N22及一個TTV病毒株之C端域，及來自不同TTV病毒株之ORF1蛋白質的高變域。
將第一指環病毒之全長基因體選殖入表現載體中，以便在哺乳動物細胞中表現。此基因體經突變以移除ORF1編碼序列之高變域，且用來自第二指環病毒基因體之ORF1編碼序列的高變域置換(圖36)。含有具有經交換高變域之第一指環病毒基因體的質體隨後如本文所描述經線性化及環化。使HEK293T細胞經環化基因體轉染，且培育5-7天以允許指環載體產生。在培育期之後，藉由梯度超速離心自經轉染細胞之上清液及細胞集結粒純化指環載體。
為了確定嵌合指環載體是否仍具有感染性，將分離的病毒粒子添加至未感染細胞中。培育細胞5-7天以允許病毒複製。在培育之後，嵌合指環載體建立感染之能力將藉由免疫螢光法、西方墨點及qPCR監測。嵌合病毒之結構完整性藉由陰性染色及低溫電子顯微法評定。可進一步測試嵌合指環載體活體內感染細胞之能力。建立經由高變域交換實現產生功能性嵌合指環載體之能力可允許病毒之工程化以改變趨向性且潛在地避開免疫偵測。
實例 14： 攜帶有效負載之指環載體的設計此實例描述攜帶反式基因之例示性指環載體遺傳元件的設計。遺傳元件由來自指環病毒基因體(例如，如本文所描述)之必需順式複製及封裝域以及非指環病毒有效負載組成，其可包括例如蛋白質或表現非編碼RNA之基因。指環載體缺乏用於複製及封裝之必需反式蛋白質元件，且需要由用於滾環複製及衣殼化之其他來源(例如，輔助，例如複製病毒、表現質體或基因體整合)提供之蛋白質。
在一組實例中，編碼整個蛋白質之DNA序列自第一起始密碼子缺失至最後終止密碼子(圖38)。所得DNA保留病毒非編碼區域(NCR)，包括病毒啟動子、5' UTR保守域、3' UTR (其編碼一些指環病毒株中之miRNA)及富含GC之區。指環載體NCR攜帶必需順式域，包括病毒複製起點及衣殼結合域。然而，因為缺乏編碼指環病毒蛋白質之開讀框，指環載體不能表現DNA複製及衣殼化所需之必需蛋白質因子，且因此不能擴增或封裝，除非此等元件以反式提供。
有效負載DNA，包括(但不限於)編碼蛋白質之序列、完全反式基因(包括非指環病毒啟動子序列)及非編碼RNA基因藉由插入缺失之指環病毒開讀框之位點中而併入至指環載體遺傳元件中(圖38)。來自編碼蛋白質之序列的表現可例如藉由以反式基因形式併入之原生病毒啟動子或合成啟動子驅動。
複製缺陷型或非勝任指環載體遺傳元件(例如，如本文所描述)可缺乏用於病毒複製及/或衣殼因子之編碼蛋白質的序列。因此，經封裝指環載體藉由用此實例中所描述之指環載體DNA及編碼病毒蛋白質之DNA共有轉染細胞產生。病毒蛋白質表現為複製勝任型野生型病毒基因體、在病毒啟動子控制下攜帶病毒蛋白質之非複製質體或在強組成型啟動子控制下攜帶病毒蛋白質之質體。
實例 15： 編碼轉殖基因之指環載體的轉導在此實例中，使用指環病毒基因體(例如，如本文所描述)產生攜帶有效負載免疫黏附素(IA)之指環載體，且隨後經工程化以遞送人類免疫黏附素。雙股環狀IA指環載體DNA，其包括指環病毒非編碼區域(5' UTR，富含GC之區)及IA-編碼卡匣，但未包括指環病毒ORF，經設計(例如，如本文所描述)且隨後由如本文所描述活體外環化產生。指環病毒ORF以反式形式提供於單獨活體外環化DNA中。兩種DNA在兩個生物複本中經共轉染至HEK293T細胞中。亦測試陰性對照(模擬轉染)及陽性對照(質體中之IA表現卡匣)中之各者的兩個生物複本。預期將指環載體製劑轉導為來源於肺的人類細胞株EKVX及A549以藉由ELISA偵測所分泌之免疫黏附素。此外，預期對IA指環載體轉導之EKVX細胞的免疫螢光分析揭示對於免疫黏附素之表現呈陽性的細胞。
實例 16： 攜帶 EPO 基因至肺癌細胞中之指環載體在此實例中，使用攜載紅血球生成素基因(EPO)之指環載體轉導非小細胞肺癌株(EKVX)。指環載體係藉由如本文所描述之活體外環化產生。指環載體中之各者包括遺傳元件，其分別包括編碼EPO之卡匣及指環病毒基因體之非編碼區(5' UTR，富含GC之區)，但未包括指環病毒ORF，例如如本文所描述。使細胞接種經純化指環載體或陽性對照(在較高劑量或與指環載體相同之劑量下的AAV2-EPO)，且培育7天。指環病毒ORF以反式形式提供於單獨活體外環化DNA中。接種後3、5.5及7天對培養物上清液取樣，且使用商業ELISA套組進行分析以偵測EPO。成功轉導細胞預期與未處理(陰性)對照細胞相比引起顯著更高的EPO效價(在所有時間點P ＜ 0.013)。
實例 17： 在靜脈內 (i.v.) 投與之後可活體內偵測到具有治療性轉殖基因之指環載體在此實例中，在靜脈內(i.v.)投與之後活體內偵測到編碼人類生長激素(hGH)之指環載體。編碼外源性hGH之複製缺陷型指環載體係藉由如本文所描述之活體外環化產生。hGH指環載體之遺傳元件包括指環病毒非編碼區(5' UTR，富含GC之區)及編碼hGH之卡匣，但不包括指環病毒ORF。向小鼠靜脈內投與hGH指環載體。指環病毒ORF以反式形式提供於單獨活體外環化DNA中。簡言之，在第0天靜脈內注射指環載體或PBS (n=4隻小鼠/組)。以每隻小鼠4.66E+07指環載體基因體向獨立動物組投與指環載體。
在第一實例中，偵測到指環載體病毒基因體DNA複本。在第7天，收集血液及血漿，且藉由qPCR分析hGH DNA擴增子。在活體內感染後7天之後，全血中之細胞部分中存在hGH指環載體且血漿中不存在指環載體將證實此類指環載體不能在活體內複製。
在第二實例中，在活體內轉導之後偵測到hGH mRNA轉錄物。在第7天，收集血液且藉由qRT-PCR分析hGH mRNA轉錄物擴增子。GAPDH用作對照管家基因。在全血之細胞溶離份中量測hGH mRNA轉錄物。
實例 18： 活體外環化基因體作為用於活體外產生指環載體之輸入材料此實例表明，作為如本文所描述之指環載體遺傳元件的活體外環化(IVC)雙股指環病毒DNA在質體中是否比指環病毒基因體DNA更穩固，得到預期密度之經封裝指環載體基因體。
T75燒瓶中之1.2E+07 HEK293T細胞(人類胚胎腎細胞株)經11.25 ug以下物質轉染：(i)活體外環化雙股指環病毒基因體(IVC指環病毒)，(ii)質體主鏈中之指環病毒基因體，或(iii)僅含有指環病毒(非複製指環病毒)之ORF1序列的質體。轉染後7天收穫細胞，用0.1% Triton溶解，且用100單位/mL Benzonase處理。溶解物用於氯化銫密度分析；量測密度且對各溶離份之氯化銫線性梯度進行TTV-tth8複本定量。
1E+07 Jurkat細胞(人類T淋巴球細胞株)經活體外環化指環病毒基因體(IVC指環病毒)或質體中之指環病毒基因體核轉染。轉染後4天收穫細胞且使用含有0.5%曲拉通及300 mM氯化鈉之緩衝劑溶解，接著進行兩輪瞬時冷凍複溫。溶解物用100單位/ml核酸酶處理，接著進行氯化銫密度分析。對各溶離份之氯化銫線性梯度進行密度量測及LY2基因體定量。
實例 19： 重組 Ring 19 人類指環病毒之拯救使用如本文所描述之方法自人眼組織鑑別人類指環病毒且指定為Ring 19 (圖49)。Ring19核苷酸及胺基酸序列在本文中分別提供於表N1及表A1中。Ring 19基因體隨後如本文所描述合成且經轉染至人類細胞株中。在培育、細胞溶解、等密度離心及所得溶離份之qPCR定量之後，以與病毒粒子一致之密度鑑別峰值溶離份。穿透電子顯微術(TEM)將用於表徵來自如本文所描述之純化的溶離份。Ring 19粒子經考慮為直徑為約30 nm。
實例 20： 使用 MOLT-4 細胞之指環病毒的產生及純化此實例描述使用人類淋巴母細胞細胞株MOLT-4產生指環病毒。
方法與材料 質體構築構築稱為RING2及RING19，含有屬於乙型細環病毒屬之兩種不同指環病毒之基因體之一或兩個複本的質體。
為了構築含有Ring 2之單一複本的質體，RING2 (GenBank登錄號：JX134045.1)之序列藉由整合式DNA技術合成至pUCIDT-Kan質體(pUCIDT-RING2)中。在此質體中，在基因體之各側添加SapI及Esp3I限制切割位點以允許次選殖、無疤痕限制消化且接合基因體之兩端以製備雙股環狀基因體。模板質體用以下引子擴增：正向5'-ACAGCTCTTCAAGGCGTCTCACCTAATAAATATTCAACAGGAAAACCACCTAATTTAAATTGCC-3'及逆向5'-ACAGCTCTTCAGTGCGTCTCATAGGGGGTGTAAGGGGGCGTAG-3'。PCR反應物(50µl)含有1.0單位Phusion DNA聚合酶、1X Phusion HF緩衝液、200µM dNTPs、0.5µM各引子、3% DMSO及1ng模板DNA (New England Biolabs)。所有PCR反應用以下參數進行：在98C下初始變性30秒，接著在98C下變性15秒進行40次，在60C下退火30秒，在72C下延伸3分鐘，且最終72C延伸10分鐘。
經純化PCR產物在含有50ng目的載體、30ng之PCR產物、1X BSA、1X T4 DNA接合酶緩衝液、10單位之BspQI及400單位之T4 DNA接合酶之一鍋反應中經選殖至pcDNA 6.2/V5-PL-DEST (Thermo Fisher Scientific)目的質體中。選殖反應在50C下培育一小時，接著在16C下培育15分鐘。
為構築含有串聯RING2之兩個複本的質體，使用金門控選殖方法組裝攜帶以串聯組態配置之RING2基因體的兩個複本的質體。用含有不同Esp3I懸垂物之PCR引子將RING2基因體次選殖至作為基因體1 (G1)及基因體2 (G2)之1級質體中以用於後續組裝。質體藉由PCR，使用正向G1-F 5'-ACAGCTCTTCAAGGCGTCTCAATGGTAATAAATATTCAACAGGAAAACCACCTAATTTAAATTGCC-3'及逆向G1-R 5'-ACAGCTCTTCAGTGCGTCTCATAGGGGGTGTAAGGGGGCGTAG-3'(對於G1)；及正向G2-F 5'-ACAGCTCTTCAAGGCGTCTCACCTAATAAATATTCAACAGGAAAACCACCTAATTTAAATTGCC-3'及逆向G2-R 5'-ACAGCTCTTCAGTGCGTCTCATTCAGGGGGTGTAAGGGGGCGTAG-3'(對於G2)擴增。PCR反應物(50µl)含有1.0單位Phusion DNA聚合酶、1X Phusion HF緩衝液、200µM dNTPs、0.5µM各引子、3% DMSO及1ng模板DNA (New England Biolabs)。所有PCR反應用以下參數進行：在98℃下初始變性30秒，接著在98℃下變性15秒進行40次，在60℃下退火30秒，在72℃下延伸3分鐘，且最終72℃延伸10分鐘。為了組裝串聯基因體質體，將目的質體、G1次純系及G2次純系選殖於含有50 ng目的質體、30 ng各基因體次純系、1x BSA、1x T4 DNA接合酶緩衝液、10單位之Esp3I及400單位之T4 DNA接合酶之一鍋式金門控反應中。選殖反應在37℃下進行15分鐘，在37℃下持續2分鐘進行20次，接著在15℃下進行5分鐘，在37℃下進行15分鐘，在50℃下進行5分鐘，且在80℃下進行5分鐘。
構築含有兩個串聯RING19複本之另一質體。為了構築此質體，藉由BsaI切割位點側接之RING19基因體的單一複本藉由GenScript合成至pUC57-Kan載體中。切除RING19基因體且使用BsaI-HFv2及PvuI-HF限制酶(New England Biolabs)與其質體主鏈分離；經切除帶被純化且接合至自身以形成活體外環化(IVC)基因體。含有RING19之串聯複本的質體藉由使用NheI-HF限制酶線性化IVC基因體及含有Ring19 (上文所描述)之單一複本的質體二者及用T4 DNA接合酶(New England Biolabs)接合選殖。
所有純系在Genewiz經由桑格定序檢驗。
細胞培養MOLT-4細胞獲自國家癌症研究所。使細胞按比例擴大且在37℃下使用5% CO 2維持於完全生長介質(具有10%胎牛血清[FBS]之Gibco's RPMI 1640，補充有1 mM丙酮酸鈉、Pluronic F-68 [0.1%]及2 mM L-麩醯胺酸)中之懸浮培養物中。使細胞以0.1E+06個活細胞/mL之密度接種至各自具有800 mL工作體積之搖瓶(2-L，平底，錐形瓶)中，且在37℃下及100 rpm以及＞85%相對濕度(RH)培養於回轉式震盪器(New Brunswick Innova 2100，19-mm圓形軌道)中持續4天。
MOLT-4 細胞之轉染MOLT-4細胞藉由核轉染或電穿孔經指定質體轉染。
對於25 mL規模之核轉染，使用BioProfile FLEX2分析儀(Nova Biomedical)統計細胞數，且藉由在200 × g下旋轉10分鐘使1E7細胞粒化。使粒化細胞再懸浮於具有添加之補充劑(Lonza)之SF細胞株核轉染溶液中。將25 µg待轉染之質體(Aldevron)添加至再懸浮之細胞中，且使用在4D-核轉染X單元(Lonza)上之CM-150程式進行核轉染。使核轉染之細胞在37℃培育箱中在5% CO 2下回收20分鐘，其後將其添加至含有預溫熱之完全生長培養基的燒瓶中。
對於25 mL規模之電穿孔，使1E7粒化之細胞再懸浮於自製的2S Chica緩衝液(5 mM KCl，15 mM MgCl 2，15 mM HEPES緩衝液，150 mM Na 2HPO 4pH 7.2，50 mM丁二酸鈉)中。將待轉染之100 µg質體(Aldevron)添加至經再懸浮細胞中，且使用NEPA21電穿孔器(Bulldog Bio)電穿孔。穿孔脈衝參數為在150 V下2個脈衝，持續5毫秒，時間間隔為50毫秒。轉移脈衝參數為在20 V下5個脈衝，持續50毫秒，時間間隔為50毫秒。隨後將電穿孔之細胞轉移至含有預升溫之完全生長培養基的燒瓶中。
使經轉染細胞在37℃及5% CO 2下培育且在指定時間收穫。
西方墨點法使細胞集結粒再懸浮於含有50 mM Tris pH 8.0、0.5% Triton-X100、100 mM NaCl及1 × Halt蛋白酶抑制劑混合物(ThermoFisher Scientific)之溶解緩衝液中，接著進行兩輪冷凍-解凍。細胞溶解物藉由在4℃下以10,000 × g離心30分鐘來澄清，且蛋白質濃度根據製造商的方案使用Pierce BCA蛋白質分析套組(ThermoFisher Scientific)定量。將等量細胞溶解物與負載染料及Bolt樣品還原劑(ThermoFisher Scientific)混合，接著在95℃下沸騰5分鐘。
對於ORF2及GAPDH，將蛋白質在1X Bolt MOPS SDS操作緩衝液(ThermoFisher Scientific)中在Bolt 4-12% Bis-Tris凝膠上分離。使用Trans-Blot Turbo轉移系統(Bio-Rad)使經分離蛋白質電轉移至硝化纖維素膜。對於ORF1，使蛋白質在Bolt 12% Bis-Tris凝膠上分離且使用補充有20%甲醇之冷1X Bolt轉移緩衝液(ThermoFisher Scientific)藉由濕轉移方法在100伏下轉移至硝化纖維素膜1.5小時。
在轉移之後，使膜在Odyssey阻斷緩衝液(LI-COR)中阻斷1小時且隨後與相關一級抗體一起培育隔夜。藉由用大腸桿菌中表現之經純化全長ORF2蛋白質對兔進行免疫來產生抗ORF2抗體。在小鼠中針對ORF1蛋白質之果凍卷域產生抗ORF1抗體。以1:500之濃度使用抗ORF2及ORF1抗體。以1:1000之濃度使用抗GAPDH抗體(Cell Signaling Technologies，目錄號#97166)，以偵測GAPDH作為內參考物。
藉由在參緩衝生理鹽水(TBS)及聚山梨醇酯20之混合物中分別搖盪10分鐘來洗滌膜三次。膜隨後在與螢光染料共軛之相關二級抗體中培育。所用之二級抗體為山羊抗小鼠IgG副蛋白質(IRDye 680RD，LI-COR，目錄號926-68070，1:5000稀釋度)及山羊抗兔IgG IRDye® 680RD，LI-COR，目錄號926-68071，1:5000稀釋度)。
使用Odyssey DLx成像系統(LI-COR)偵測特異性免疫反應性蛋白質。
逆轉錄酶定量 PCR (RT-qPCR)經轉染之MOLT-4細胞藉由以500 × g離心5分鐘來收穫。粒化之細胞使用700 µl QIAzol溶解劑(Qiagen)溶解，接著根據製造商的方案使用miRNeasy Mini套組(Qiagen，目錄號217004)進行RNA提取。根據製造商的方案亦在所收穫之RNA上使用RQ1 RNase-Free DNA酶(Promega，目錄號M6101)進行額外DNA酶處理以移除任何殘留之雙股或單股DNA。使用SuperScript III第一股合成系統(Invitrogen，18080-051)自具有低聚(dT)引子之DNA酶處理的RNA進行cDNA合成。使用在QuantStudio 5即時PCR機器(Applied Biosystems)中具有SYBR綠色PCR主混合物(ThermoFisher Scientific)的基因特異性引子一式三份地進行qPCR。使用人類GAPDH作為內參考物計算相對量。
南方墨點法使用DNeasy血液&組織套組(Qiagen)進行自總共1E7個經轉染MOLT-4細胞中分離總DNA。將細胞負載至兩個管柱中，每管柱5E6個細胞，且彙集來自兩個管柱之經溶離DNA。經分離之DNA用NcoI-HF或NcoI-HF/DpnI限制酶(New England Biolabs)在37℃下消化隔夜。NcoI-HF切割RING2基因體一次。藉由凝膠電泳分離經消化樣品且隨後隔夜轉移至Hybond-N+膜上。膜在ULTRAhyb混成化緩衝液(ThermoFisher Scientific)中雜交隔夜，且使用內部產生之生物素標記的寡核苷酸探測，以偵測RING2基因體。此等RING2特異性探針藉由隨機預塗產生，且使用BioPrime Array CGH Genomic標記系統(Invitrogen)經生物素標記。膜與IRDye800一起培育且使用Odyssey DLx成像系統(LI-COR)成像。
RING2 基因體之活體外環化 (IVC) 氯化銫 (CsCl) 線性梯度在轉染之後四天，MOLT-4細胞藉由以500 × g離心10分鐘來收穫。使粒化細胞再懸浮於含有50 mM Tris pH 8.0、0.5% Triton-X100、100 mM NaCl及1 × Halt蛋白酶抑制劑混合物(ThermoFisher Scientific)之溶解緩衝液中，接著兩輪冷凍-解凍且添加等體積之含有50 mM Tris pH 8.0及2 mM MgCl2之緩衝液。使細胞溶解物用100 U/mL Benzonase核酸內切酶(Sigma-Aldrich)處理且在室溫下(RT)章動90分鐘。經Benzonase處理之細胞溶解物在4℃下以10,000 × g澄清30分鐘以粒化任何細胞碎片。
CsCl線性梯度藉由將8.5 mL之1.46 g/cm3 CsCl溶液用8.5 mL之1.2 g/cm3 CsCl溶液在17 mL超透明試管(Beckman Coulter)中覆蓋製備，隨後使用Gradient Master (BioComp)使該等試管在45-度角度下以20 rpm之速度旋轉13.5分鐘。
2 mL來自管頂部之CsCl溶液經2 mL處理MOLT 4細胞溶解物置換。使用SW 32.1轉子(Beckman Coulter)在31,000 × g下旋轉含有樣品之試管18小時。自管底部收集1-mL溶離份。使用Refracto手持型折射計(Mettler Toledo)量測各溶離份之折射率以計算密度。使用去鹽套組(ThermoFisher Scientific)使各溶離份去鹽，且隨後經受如下文所描述之DNA酶保護之qPCR分析。
碘克沙醇線性梯度收穫MOLT-4細胞且如上文所描述處理以用於CsCl線性梯度。
為了製備碘克沙醇線性梯度，13 mL之60% OptiPrep (Sigma-Aldrich)覆蓋有13 mL之20% OptiPrep於26.3-mL聚碳酸酯管中，隨後使用Gradient Master (BioComp)以46度角度及20 rpm之速度旋轉16分鐘。
使用70型轉子(Beckman Coulter)在347,000 × g下及20℃下旋轉含有樣品之管持續4小時。自管頂部收集1-mL溶離份。使用Refracto手持型折射計(Mettler Toledo)量測各溶離份之折射率以計算密度。隨後對各溶離份進行如下文所描述之經DNA酶保護之qPCR分析。
DNA 酶保護之 qPCR 分析將5 µl待滴定樣品與200 U之DNA酶I核酸內切酶(New England Biolabs)一起在20-µl反應物中培育。在37℃下培育反應物2小時，隨後在95℃下使DNA酶I失活10分鐘。
根據製造商的方案，使4 µl之1:10稀釋之DNA酶反應物在20-µl反應物中使用TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)進行qPCR分析。引子及探針序列列於表1中。
RING2 按比例擴大產生 核轉染使用BioProfile FLEX2分析儀(Nova Biomedical)統計細胞數，且2.0E+9活細胞使用Sorvall BIOS A底模型離心機(ThermoFisher Scientific)在1-L瓶中以500相對離心力(RCF)粒化30分鐘。丟棄上清液，使集結粒再懸浮於具有添加之補充劑(Lonza)的20 mL之P3溶液中，且添加2 mg編碼RING2基因體之串聯複本的質體(Aldevron)。使用4D核轉染LV單元(Lonza)核轉染細胞且收集於5 mL完全生長培養基中。隨後將核轉染細胞轉移至震盪燒瓶中之600 mL預溫熱完全生長培養基，且在震盪器中在37℃及100 rpm以及5% CO 2及＞85% RH下培育1小時。
培育之後，使用BioProfile FLEX2分析儀(Nova Biomedical)對細胞進行計數。其隨後在震盪燒瓶中在預溫熱之完全生長培養基(800 mL最大工作體積)中稀釋至0.4E+6個活細胞/毫升，且在震盪器中在37℃及100 rpm以及5% CO 2及＞85% RH下培育4天。
收穫及細胞溶解在核轉染之後四天，使用BioProfile FLEX2分析儀(Nova Biomedical)統計細胞數。隨後藉由使用Sorvall BIOS A底模型離心機(ThermoFisher Scientific)在1000 RCF下粒化30分鐘來收穫細胞，且丟棄上清液。使細胞集結粒再懸浮於30 mL之20 mM Tris pH 8，100 mM NaCl及2 mM MgCl2緩衝液中，使用LM10微流化床(Microfluidics)在10,000 psi下溶解，且用30 mL相同緩衝液洗滌，以產生60 mL之最終細胞溶解物體積。隨後使細胞溶解物經1 × Halt蛋白酶抑制劑混合物(ThermoFisher Scientific)及100 U/mL Benzonase核酸內切酶(Sigma-Aldrich)處理且在室溫下在攪動盤上培育1.5小時。隨後，將0.5% Triton X-100清潔劑添加至細胞溶解物中且在室溫下在攪拌盤上返回培育45分鐘。隨後使用5810 R台式離心機(Eppendorf)以10,000 RCF使經處理細胞溶解物離心30分鐘以粒化任何細胞碎片。丟棄細胞碎片，且使用密度梯度純化上清液(溶解物)。
CsCl階段梯度- CsCl階段梯度藉由將38.6 mL Ultra-Clear超離心機管(Beckman Coulter)中產生於30 mM Tris及100 mM NaCl (TN)緩衝液中之30 mL R2上清液用3 mL 1.2 g/L CsCl溶液及3 mL 1.4 g/L CsCl溶液覆蓋製備。隨後，使用Optima XE (Beckman Coulter)在31,000rpm及10℃下使管超速離心持續3小時。在旋轉之後，使帶以1.2 g/L及1.4 g/L CsCl之接合點提取且轉移至3-12 mL Slide-A-Lyzer透析卡匣，其中分子量截斷(MWCO)為10K (ThermoFisher Scientific)。在攪拌盤上在4℃下使膜置於具有Mg及Ca鹽(Gibco)、0.001% Pluronic F-68 (Gibco)及100 mM NaCl作為透析緩衝液的1 ×達爾伯克磷酸鹽緩衝生理鹽水(DPBS)中隔夜(O/N)。
CsCl線性梯度及濃度- CsCl線性梯度藉由在30 mL OptiSeal超離心管(Backman Coulter)中將15 mL 1.2 g/L CsCl溶液與15 mL 1.4 g/L CsCl溶液覆蓋且使用Gradient Master 108 (BioComp)以45度角度及20 RPM之速度旋轉13.5分鐘製備。接著，3 mL最高CsCl溶液經3 mL透析之R2溶解物置換。隨後，該等管在25,000 rpm及10℃下超速離心18小時。O/N旋轉之後，將1 mL溶離份自管底部收集於96 mL深孔盤中。使用Refracto手持型折射計(Mettler Toledo)量測各溶離份之折射率以計算密度。使用Zeba 96孔旋轉去鹽培養盤(ThermoFisher Scientific)使各溶離份之等分試樣去鹽，以移除任何CsCl且使用DNA酶qPCR分析RING2效價。所關注之溶離份係基於qPCR效價及密度測定。隨後將其彙集且轉移至3-12 mL Slide-A-Lyzer透析卡匣，其中MWCO為10K (ThermoFisher Scientific)。在攪拌盤上在4℃下使膜置於具有Mg及Ca鹽(Gibco)、0.001% Pluronic F-68 (Gibco)及100 mM NaCl作為透析緩衝液的1 ×DPBS中O/N。使用Amicon超離心過濾單元(Sigma-Aldrich，目錄號Z648043)使滲析樣品濃縮十倍，其中MWCO為100 kD。
人類樣品之解剖人類眼部經由國家疾病研究學會(NDRI)獲得且在獲取24-48小時內解剖。置放於解剖板上之各個別眼廢物及鞏膜使用剃刀片在角膜與視神經之間的位置處切開。自彼點，將鞏膜全部以環繞方式切割。分別分離房水及玻璃體液。隨後移除脈絡膜層且緩慢剝離視網膜且加以處理。經分離及分析之眼睛中之其他區室為鞏膜、虹膜、角膜、結膜及視神經。許多供體已經歷白內障手術；然而若天然晶狀體為可用的，則其亦經處理以用於進一步分析。
DNA 提取及處理 在含有1.4 mm陶瓷球體之均勻化試管中使用珠打研磨器(MP Biomedicals)用DNA溶解緩衝液(PureLink)使所解剖之組織切片均勻化。以10 m/秒、以15秒之4次間隔將該等部分均質化。將試管置於冰上5分鐘，隨後以13,000 × g離心3分鐘。上清液轉移至新試管中。添加10%脫氧酸鈉且在37℃下培育1小時。將Benzonase及Benzonase緩衝液添加至上清液中且在37℃下培育1小時。DNA用來自Invitrogen之PureLink病毒DNA/RNA套組提取。將樣品根據製造商方案進行處理，其中對於蛋白酶K培育則增加至60 min。將樣品溶離在50 μL無核酸酶水中。隨後根據藉由Arze等人所概述之程序對所提取DNA進行滾環擴增(RCA)擴增。藉由用藉由Ninomiya等人產生之泛-指環病毒引子的PCR測試樣品中指環病毒科之存在。將2 µL樣品添加至1×PCR Master Mix (Sigma-Aldrich)中且4個簡併引子之最終濃度各自為1 μM，最終體積為25 μL。根據在2%瓊脂糖凝膠中存在128個鹼基對帶鑑別陽性樣品。
伊路米那庫製備及定序 將RCA後DNA稀釋至50 µL之體積以降低樣品之黏度且隨後藉由Qubit評估DNA之濃度。RCA後DNA係使用Nextera DNA套組(Illumina)庫製備。遵循製造商之方案製備樣品用於100-500 ng輸入。亦使用SureSelect XT HS2 DNA試劑Kit(Agilent)與針對指環病毒科專門設計之目標富集探針庫製備RCA後DNA。用D5000 ScreenTape在a4200 TapeStation (Agilent)上進行庫品質對照。隨後所有庫在iSeq 100或NextSeq 550 (Illumina)上定序。
奈米孔庫製備及定序 遵循NanoAmpli-Seq (Calus等人., 2018)方案，RCA後DNA經脫支且片段化成20 kb-大小的片段。將4.5 μg RCA物質稀釋於65 μL無核酸酶水且在室溫下經2 μL T7核酸內切酶I (New England Biolabs)處理5分鐘。隨後將反應物負載於g-TUBE (Covaris)中且在1800 rpm下離心4分鐘。隨後逆轉g-TUBE，且重複離心過程。在混合物隨後用SPRI珠粒以1.8 ×之比率清潔之前，在20 μL無核酸酶水中最終溶離，進行另一輪T7核酸內切酶I及g-TUBE。藉由Qubit評定DNA之濃度。隨後遵循製造商之方案使用SQK-LSK109套組(Oxford Nanopore Technologies)庫製備片段化樣品。另外，遵循製造商之方案，使用SureSelect XT HS2 DNA試劑套組(Agilent)製備樣品，其中在擴增步驟中延長至6分鐘。遵循製造商之方案，樣品隨後使用SQK-LSK109 kit (Oxford Nanopore Technologies)庫製備。將庫負載至R9.5 (FLO-MIN107)流動槽上且置放於MinION Mk1B (Oxford Nanopore Technologies)上且運行48小時。僅使用通過製造商的流動槽鑑定試驗之流量槽。
序列品質控制 使伊路米那及奈米孔原始定序讀段二者在來源於各儀器之序列資料集上利用FastQC (Andrews，2019)進行品質控制。隨後使用MultiQC (Ewels等人., 2016)公用程式將由各個別樣品之FastQC產生的報導子聚集至單一報導子中。來自此等報告之量度影響分析期間進一步下游的品質控制步驟之參數選擇。
伊路米那序列資料經過濾以使用具有以下參數之bbduk (Bushnell, 2014)移除低品質序列及共有銜接子： ktrim=r 、 k=23 、 mink=11 、 tpe=t 、 tbo=t 、 qtrim=rl 、 trimq=20 、 minlength=50 、 maxns=2。藉由自覆蓋若干細菌之NCBI GenBank拉取污染物序列、待移除之人類遺傳元件及常見實驗室合成序列來組裝所用之目標污染物檔案。
奈米孔序列資料使用預設參數經過濾以移除具有porechop (Wick，2018a)之轉接子序列，接著使用具有參數 --min_length 2000 --keep_percent 90(Wick，2018b)之filtlong進行品質及長度過濾。通過品質控制之讀段映射至具有以下參數：-cx map-ont之指環病毒重疊序列(Li, 2018)。所得PAF檔案均以Alvis (Martin, 2021)觀測到且經解析以鑑別參考重疊序列之最佳成功結果，且此等讀段在G-INS-i算法下進一步使用具有MAFFT比對插件之Geneious (Biomatters，2021)中的成對比對分析。此等長讀段用於驗證組裝之短讀段，且用於驗證此等重疊並非嵌合體。
接下來，使用NextGenMap (Sedlazeck等人., 2013)及BWA (Li, 2013; Li and Durbin, 2009)兩者針對人類參考基因體之GRCh37/hg19建構以兩次移除人類序列。以參數-- affine、 -s0.7及 -p運行NextGenMap且以預設參數運行BWA。使用SAMtools (Li等人., 2009)及Picard's (Broad Institute, 2018)之經組配有參數VALIDATION_STRINGENCY=「 silent」的SamToFastq公用程式，將以SAM檔案格式輸出之映射讀段轉換為成對端FASTQ格式。
使用具有以下參數之bbmap (Bushnell，2014)移除rRNA污染物及常見實驗室細菌污染物： minid=0.95 ， bwr=0.16 ， bw=12 ， quickmatch=t ， fast=t ， minhits=2。所篩選之所有參考序列之解釋可見於所提供之補充資料中。
最後，吾等使用經組配有參數 dedupe=t之clumpify (Bushnell, 2014)對通過所有QC及去污步驟之短讀段資料進行去重以加速基因體組裝且幫助提高基因體組裝品質。
基因體組裝 使用metaSPAdes (Nurk等人., 2017)經由使用 --only-assembler參數停用之誤差校正模組來對較短、微調、去污及去重定序讀段進行組裝。使用參數out_format 1、-lc_method dust及lc_threshold 20之PRINSEQ精簡版(Schmieder及Edwards, 2011)過濾所得片段重疊組。通過此過濾步驟之片段重疊組隨後以99.5%相似性群集，以使用預設參數經由VSEARCH軟體之cluster_fast算法(Rognes等人., 2016)移除任何重複序列。使用ccfind (Nishimura等人., 2017)自片段重疊組回收任何假定完全環狀基因體，所有參數設定為預設。
長讀段誤差校正 使用成對較短讀段資料利用racon (Vaser R等人., 2017)誤差校正歸類為指環病毒序列之奈米孔讀段。首先，使用具有預設參數之BWA's (Li, 2013) mem演算法將分類為指環病毒之較短讀段映射至長指環病毒讀段。所得SAM比對及用於產生比對之較短讀段及長讀段供應至racon進行錯誤校正。使用預設參數對多輪誤差校正進行racon之執行，直至經拋光產物展現出與先前迭代無差異。
指環病毒重疊鑑別 使用具有預設參數之NCBI's blastn軟體(citation)篩選所組裝片段重疊組，以使用由728種精選的指環病毒序列組成的定製內部指環病毒資料庫鑑別假定指環病毒序列。
指環病毒基因體標註使用OrfM (Woodcroft等人., 2016)軟體自經組裝之指環病毒片段重疊組鑑別及提取ORF序列，其中參數經組態以列印終止密碼子( -p)及在與終止密碼子相同之框架中列印ORF ( -s)，且限定ORF序列不短於50個胺基酸( -m150)。
經預測之ORF序列係使用序列seqkit之 seq及 grep公用程式(Shen等人, 2016)進一步篩選以將ORF序列細分為ORF1、ORF2及ORF3。ORF1序列係藉由使用seqkit seq篩選不短於600個胺基酸之ORF序列(-m 600)，且使用seqkit grep以僅搜尋ORF序列資料( -s)，針對基於之模式(-p 「 YNP.{2}D.G.{2}」)之常規表示式下的保守模體YNP X 2 D XG X 2 N來鑑別。類似地，ORF2序列係使用先前在文獻(Takahashi等人, 2000)中所鑑別之保守模體W X 7 H X 3 C XC X 5 H經由seqkit之 grep公用程式 (-p 「 W.{7}H.{3}C.C.{5}H 」 )來回收。
藉由利用相同片段重疊組上之預測ORF1及ORF2序列的存在及座標位置來預測ORF3序列。預測ORF3使用ORF1所使用之終止密碼子下游的終止密碼子且其閱讀框架與ORF1及ORF2之終止密碼子不同。另外，經由MEME對來自內部資料集之ORF3序列(中值長度：68aa，最小長度：50aa，最大長度：159aa)至MEME (Bailey等人，2009)進行解析揭示兩個先前未知的且高度保守的模體位於ORF3之3'端附近的存在。亦利用兩種新穎模體使用seqkit之 grep命令鑑別ORF3序列。
所鑑別之ORF序列需要額外修整步驟，因為OrfM產生ORF調用典型起始密碼子上游的肽。經由使用富含精胺酸之區域的存在之內部書面python指令碼對ORF1序列定時為恰當起始密碼子，以識別在5'端之方向上位於其上游的第一甲硫胺酸。在一些情況下，藉由僅在富含精胺酸區上游搜尋胺基酸亦即蘇胺酸-脯胺酸-色胺酸或蘇胺酸-丙胺酸-色胺酸來預測非典型起始密碼子作為ORF1起始密碼子。修整ORF2及ORF3序列至最接近序列之5'端鑑別的第一起始密碼子。
指環病毒屬分類 藉由使用tblastx軟體(引文)對由720個精選及分類之指環病毒序列組成的定製內部資料庫進行同源檢索，將指環病毒重疊序列鑑定為三個已知屬之一。含有跨越大多數重疊序列之適合覆蓋度的前成功結果隨後用於屬分類。
引子行走及基因體回收 圍繞長讀段與短讀段定序資料之間的不一致區域設計引子。使用具有Q5 Hot Start polymerase (New England Biolabs)之此等引子擴增RCA後DNA。在2%凝膠上進行產物以確認特異性結合，隨後將PCR產物傳送至GeneWiz用於桑格定序。使用Geneious bioinformatics軟體(Biomatters)分析桑格定序結果。
RING19 按比例擴大產生 除了經轉染之質體串聯編碼RING19基因體之兩個複本以外，如上文關於RING2所描述進行核轉染、細胞收穫及溶解。
碘克沙醇線性梯度及濃度碘克沙醇線性梯度藉由將在TN緩衝液中之19 mL的20%碘克沙醇溶液用19 mL OptiPrep 60%碘克沙醇溶液(Sigma-Aldrich)在38.6 mL超透明試管(Beckman Coulter)中覆蓋製備，且在45-度角度下及以20 rpm之速度在Gradient Master (BioComp)上旋轉16分鐘。隨後前5 mL碘克沙醇溶液經5 mL R19溶解物置換，且以32,000rpm及20℃超速離心管18小時。O/N旋轉之後，將1 mL溶離份自管頂部收集於96 mL深孔盤中。使用Refracto手持型折射器(Mettler Toledo)以及RING19效價，根據上文關於經DNA酶保護之qPCR所描述之方案，使用各部分之等分試樣量測折射率。所關注之溶離份係基於病毒效價及密度量測來確定。隨後使其彙集且使用Amicon超離心過濾單元(Sigma-Aldrich，目錄號Z648043)濃縮十倍，其中MWCO為100 kD。
尺寸排阻層析法 (SEC) ：在SEC之前，樣品在12000 rpm下離心1分鐘。將上清液在緩衝液條件下在50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl及0.01%泊洛沙姆下負載至HiPrep 16/60 Sephacryl S-500 HR管柱(Cytiva)上。在4℃下以1 mL/min流速進行整個純化。彙集具有顯著qPCR數量的溶離份且使用Vivaspin 2, 10,000 MWCO PES濃縮器(Sartorius，目錄號VS0201)及Nanosep離心式裝置濃縮，其中ω膜之MWCO為30K (Pall，目錄號OD030C34)。
電子顯微鏡 為了觀測病毒粒子，使用配備有AMT 2k CCD攝影機之Jeol 1200 EX在Harvard Medical School進行陰性染色穿透電子顯微術。使10 µl樣品在400網狀碳載體膜(EMS CF400-Cu)上進行墨點法30秒。在用雙蒸餾水洗滌30秒之後，在成像之前，將柵格用1%乙酸鈾染色10秒。
活體內 RING19 感染性研究 動物之照護及使用所有小鼠研究均由Laronde機構動物護理及使用委員會批准及管理。8至12週齡雌性C57BL/6J小鼠獲自此等眼部研究之Jackson Laboratories。
視網膜下注射首先用一至二滴1%托品醯胺/2.5%苯腎上腺素HCl (Tropi-Phen，Pine Pharmaceuticals)擴張瞳孔。小鼠隨後使用氯胺酮/甲苯噻𠯤混合物(100/10 mg/kg)之腹膜內注射液麻醉。將一或兩滴0.5%丙美卡因(McKesson Corp.)投與至眼睛。在鼻緣後方1 mm處用微型刮刀切開約0.5 mm長的切口。將裝有5 μl Hamilton注射器的33g鈍頭針通過鞏膜切口插入，在晶狀體後方，朝向顳半側視網膜，直至感覺到阻力。然後將一微升含有0.1%螢光素鈉(AK-Fluor 10%，Akorn)之PBS、病毒或載體緩慢注入視網膜下腔。檢查眼睛且藉由使用Leica M620 TTS眼用手術顯微鏡(Leica Microsystems, Inc)經由擴張的瞳孔觀察含螢光素的泡來確認視網膜下注射的成功。有顯著出血或載體溶液自視網膜下腔滲漏到玻璃體中的眼睛被排除在研究之外。手術後，將0.3%托普黴素眼用軟膏0.3% (Tobrex，Alcon)投與至各隻處理過的眼睛，且允許小鼠從麻醉中恢復，之後返回到飼養室內的籠子中。
玻璃體內注射首先用一至二滴1%托品醯胺/2.5%苯腎上腺素HCl (Tropi-Phen，Pine Pharmaceuticals)擴張瞳孔。小鼠隨後使用氯胺酮/甲苯噻𠯤混合物(100/10 mg/kg)之腹膜內注射液麻醉。將一或兩滴0.5%丙美卡因(McKesson Corp.)投與至眼睛。將5 μl Hamilton注射器上的34g斜針插入鼻緣後方1 mm處，注意不要損壞晶狀體。然後將一微升含有0.1%螢光素鈉(AK-Fluor 10%，Akorn)之PBS、病毒或載體緩慢注入視網膜下腔。檢查眼睛且藉由使用Leica M620 TTS眼用手術顯微鏡(Leica Microsystems, Inc)經由擴張的瞳孔觀察含螢光素的玻璃體來確認玻璃體內注射的成功。有顯著出血、晶狀體損傷或眼外載體溶液洩漏的眼睛被排除在研究之外。手術後，將0.3%托普黴素眼用軟膏0.3% (Tobrex，Alcon)投與至各隻處理過的眼睛，且允許小鼠從麻醉中恢復，之後返回到飼養室內的籠子中。
收穫及處理組織樣品用於 DNA 提取在SR或IVT注射後指定時間點解剖小鼠眼睛(各時間點，n=5)。摘出後，視網膜及後眼杯(PEC)經分離且單獨處理。此等組織收集於含有不鏽鋼珠粒之管中且立即速凍。將其儲存在-80℃下直至準備均質化。冷凍組織使用Geno/Grinder 2010 (SPEX SamplePrep，LLC)在1,250 rpm下均質化30秒。根據製造商說明書使用DNEasy血液及組織套組(Qiagen)自均質化組織中分離基因體DNA且使用Qubit DNA廣範圍分析套組(Thermo Fisher)在Qubit螢光計上定量。
定量 PCR 分析藉由qPCR在QuantStudio 5 - Real-Time PCR系統(Thermo Fisher)上使用TaqMan Universal PCR Mastermix (Thermo Fisher)分析基因體DNA。此研究中所用之序列偵測引子及定製Taqman探針係藉由IDT合成(表Z1)。包括DNA樣品及已知數量之線性化mCherry或Ring19質體標準物之不同稀釋液的所有反應物一式三份地在同一培養盤上運作。標準曲線方法用於計算病毒/載體DNA之量且用各樣品之基因體DNA之總量標準化(使用如上文所描述之Qubit定量)。
表 Z1. 經設計以定量 AAV2.mCherry 及 WT Ring19 之引子及探針
目標 標記 序列 (5 '       3 ')
mCherry 正向引子 CCGACTACTTGAAGCTGTCC
   反向引子 CGCAGCTTCACCTTGTAGAT
   TaqMan探針(FAM) TGATGAACTTCGAGGACGGC
WT Ring19 正向引子 反向引子 TaqMan探針(FAM) GGATTTTGGGAGGGTCACTC TACAGTTCCTGGACCTGTGT ACACTGGTACCCTAAAAATAGATTTCA   
結果 RING2 啟動子在 MOLT-4 細胞中具有活性已報導人類血漿中之指環病毒的病毒負荷比全血低百分之一[Tyschik等人., 2017]，表明攜帶指環病毒感染之血液的細胞組分。除被感染之外，淋巴細胞先前已報導為指環病毒複製之主要部位[Mariscal等人, 2001; Maggi等人, 2001; Focosi等人, 2015; Maggi等人, 2001]。因此，吾等檢驗指環病毒基因是否可在MOLT-4中表現，MOLT-4為一種源自急性淋巴母細胞白血病患者的T細胞株。吾等合成以如上文所描述之串聯排列編碼LY2 (下文稱為RING2)之基因體之兩個複本的質體。RING2為一種屬於乙型細環病毒屬之人類指環病毒，先前自法國住院的患有副肺炎膿胸(parapneumonic empyema)之兒童的胸腔積液中進行了定序[Galmès 2013]。轉染後第1天、第2天、第3天及第4天收穫經此質體電穿孔之MOLT-4細胞且分析其藉由逆轉錄酶定量PCR (RT-qPCR)偵測RING2轉錄物。
先前指環病毒基因表現研究已描述由於替代性剪接產生之三種主要mRNA同功型(圖50A)。對於吾等分析，吾等使用將偵測RING2轉錄物之所有3種同功型的引子對。GAPDH轉錄物之表現用於標準化。吾人能夠在電穿孔後第1天開始偵測RING2轉錄物。表現在轉染後第3天達到峰值且在第4天降溫(圖1B)。如所預期，吾人未偵測到未經轉染之MOLT-4細胞中之任何RING2轉錄物。(圖50B)。偵測到RING2轉錄物之後，接下來吾等進行類似時間過程實驗以確定RING2蛋白質表現。產生偵測假定核衣殼蛋白，ORF1以及ORF2及其變異體之抗體。如圖50C中所示，ORF1在轉染後第2天開始可偵測，第3天達到峰值且第3天後達到平穩狀態。由於用於產生抗ORF1抗體之抗原決定基對ORF1之果凍卷域具有特異性，因此其無法偵測諸如ORF1/1及ORF1/2之同功型。
吾等產生之抗ORF2抗體可偵測ORF2之所有三種同功型，包括ORF2、ORF2/2及ORF2/3。ORF2、ORF2/2及ORF2/3之預測分子量分別為17、31及30 kDa。由於ORF2/2及ORF2/3分子量幾乎相等，因此基於變性狀態下SDS-PAGE凝膠上之遷移區分具有挑戰性。類似於ORF1，ORF2及其同功型之表現亦在轉染後第3天達至峰值且此後達到平穩(圖50C)。
總體而言，此等結果表明RING2啟動子在MOLT-4細胞中具有活性，使得能夠在此人類細胞株中轉錄及轉譯指環病毒基因。
MOLT-4 容許 RING 2 指環病毒之複製在已偵測到MOLT-4細胞中之RING2基因表現之後，接下來吾等測試細胞株是否允許游離指環病毒複製。
編碼RING2基因體之單個複本或串聯RING2基因體之兩個複本的質體用於核轉染細胞。在核轉染後四天收穫細胞，接著進行DNA提取。將經提取DNA保持未經處理或經一次消化質體主鏈之限制酶、一次消化RING2基因體之限制酶或DpnI處理。細菌細胞中複製之DNA含有甲基化腺嘌呤且因此對DpnI消化敏感。另一方面，在真核細胞中複製之DNA缺乏甲基化腺嘌呤，且因此對DpnI消化具有抗性。因此，DpnI消化可用於區分經轉染之基因體與在MOLT-4細胞中複製之基因體。未處理及經處理之DNA樣品使用經設計以特異性偵測RING2基因體的探針進行南方墨點分析。
對於自經串聯含RING2基因體質體轉染之樣品提取的DNA (圖51，樣品5號)，吾人偵測到具有與關於單位長度雙股RING2基因體所預期相同大小之條帶。此帶對用切割質體主鏈之酶消化不敏感，但在用切割RING2基因體一次之酶處理時變得線性。此等觀察結果表明此帶表示RING2基因體而非質體主鏈。此外，此條帶對用DpnI處理具有抗性，指示基因體RING2在經轉染之MOLT-4細胞中複製。總體而言，基於對樣品及對照觀測到的條帶模式，吾人得出結論，用含有串聯RING2基因體之質體轉染的MOLT-4細胞允許指環病毒複製，且產生單位長度的複製指環病毒基因體。
亦偵測到針對經含單個RING2基因體質體轉染之樣品的DpnI抗性帶(圖51，樣品4號)。當此樣品用消化質體主鏈一次或RING2基因體一次之限制酶處理時，吾人偵測到具有與含有整個RING2基因體之線性質體所預期相同尺寸之條帶。此結果表明含單一RING2基因體之質體亦可在MOLT4細胞中複製，但不產生可偵測之單位長度之指環病毒基因體。
對於吾人之知識，此為用以證實使用重組DNA作為輸入材料在人類細胞株中之單位長度人類指環病毒基因體之複製的第一研究。
MOLT-4 細胞允許 RING2 封裝因為吾人證實MOLT-4細胞允許RING2複製，所以接下來測試RING2粒子是否可在此人類細胞株中產生。吾人用含有RING2之qPCR擴增子(RING2非複製)或活體外環化雙股RING2基因體(RING2 IVC)的質體核轉染MOLT-4細胞。核轉染後四天，收穫細胞，藉由兩輪冷凍-解凍溶解，用Benzonase處理，澄清，且使用CsCl線性梯度進行等密度超速離心。自管底部收集1-mL CsCl線性梯度部分。使用經DNA酶保護之qPCR分析來分析各溶離份之密度以及RING2效價之效價。
如圖52中所示，經RING2 IVC轉染之樣品顯示密度為約1.32 g/cm 3之溶離份中的峰值病毒效價。此密度與先前所描述之指環病毒在CsCl中之密度一致。相比之下，經陰性對照轉染之樣品在任何部分中不具有可偵測之病毒效價。此等結果表明，MOLT-4細胞株不僅允許RING2基因表現及複製，且亦允許產生RING2粒子。
MOLT-4 細胞中 RING2 之產生視病毒蛋白質表現而定為了評估RING2粒子之產生是否視病毒蛋白質表現而定，吾等產生RING2突變基因體，其中包括ORF1、ORF1/1及ORF1/2之所有3 ORF1變異體經基因剔除(ORF1 KO)或包括ORF2、ORF2/2及ORF2/3之所有3 ORF2變異體經基因剔除(ORF2 KO)。此等突變基因體係藉由如方法部分中所指定，將過早終止密碼子插入開讀框中來產生。
為證實目標蛋白質成功基因剔除，將編碼野生型RING2基因體、ORF1 KO基因體或ORF2 KO基因體之單複本的質體轉染至MOLT-4細胞中。在轉染後2天進行西方墨點分析。如所預期，ORF1 KO突變體未表現任何可偵測之ORF1蛋白質。類似地，ORF2 KO突變體不表現任何可偵測之ORF2蛋白質或其同功型含量。
為了測試此等突變體可是否產生RING2病毒粒子，MOLT-4細胞經編碼串聯野生型RING2基因體之兩個複本(WT RING2串聯)、活體外環化ORF1基因剔除基因體(ORF1 KO IVC)或活體外環化ORF2基因剔除基因體(ORF2 KO IVC)之質體轉染或經ORF1 KO IVC及ORF2 KO IVC共轉染。使用等密度CsCl步驟梯度分析樣品之RING2生產。
正如所料，WT RING2串聯生產RING2粒子(圖53)。基因剔除ORF1及其變異體或ORF2及其變異體之表現顯著破壞在MOLT-4細胞中產生病毒之能力。引起關注地，突變基因體能夠彼此反補充，此預期假設相同細胞之共轉染，鑒於ORF1 KO IVC可產生ORF2及其變異體，而ORF2 KO IVC可產生ORF1及其變異體。總體而言，此等發現表明經轉染之MOLT-4細胞中RING2粒子之產生視病毒蛋白質表現而定。
RING2 指環病毒之穿透電子顯微術 (TEM) 分析先前僅對雞貧血病毒(指環病毒科家族中之禽類病毒)進行重組指環病毒粒子之觀測。為進一步理解人類指環病毒之結構生物學，吾人藉由TEM分析RING2。
RING2之產生及純化方法的示意圖描繪於圖54A中。簡言之，MOLT-4細胞經含有串聯兩個RING2基因體複本之質體轉染且轉染後四天收穫。溶解所收穫之細胞且用Benzonase及清潔劑處理。使細胞溶解物澄清以移除任何細胞碎片且進行CsCl步驟梯度以濃縮病毒粒子，接著透析隔夜以移除任何CsCl。使滲析物質經受CsCl線性梯度，接著分餾。分析各溶離份之密度及病毒效價。
正如所料，所有線性梯度管在1.32 g/cm 3之預期密度下具有針對DNA酶保護之RING2效價的峰值。線性梯度之各級分中針對病毒效價之密度的代表性概況展示於圖54B中。
接著，吾人彙集所有12個線性梯度之管的峰中之溶離份，將其透析隔夜以移除任何CsCl，且使用透濾濃縮體積十倍。當吾人使用100 kD截止透濾單元時，吾人能夠濃縮RING2粒子之效價(圖54C)。同時，觀測到以藉由西方墨點法評估之衣殼蛋白ORF1之效價升高(圖54D)。
此純化病毒製劑的陰性染色TEM顯示多個RING2粒子(圖54E)。吾等偵測到之指環病毒粒子的結構與先前針對雞貧血病毒所描述之結構一致，亦即具有喇叭形衣殼的二十面體衣殼。
在人類視網膜色素上皮細胞中探索指環病毒已自許多人類非血液組織(諸如骨髓、肝臟及眼表面及眼睛之玻璃體流體兩者)分離指環病毒。此類組織中之指環病毒的豐度較低先前已使得量測多樣性程度及分離完全基因體困難。吾等使用吾等AnelloScope平台研究存在於來自同一個體之四個眼睛子切片組織中的特異性指環病毒譜系。吾人自一半所研究之眼睛子切片組織回收若干指環病毒基因體，跨越全部三種屬，且成功地分離指定為RING19之假定全長環化基因體。
為了探索四種眼睛子切片組織(角膜、黃斑、鞏膜及視網膜色素上皮細胞)之多樣性，吾人進行了兩次深度較短讀段定序(存在及不存在珠粒誘餌目標富集)及一次淺長讀段定序運行以恢復適量之基因體指環病毒資料。在所有定序運行中產生28.71Gbp之短讀段序列資料及1.41Gbp之長讀段序列數據的集合，其中3.71Gbp及269.3Mbp的序列資料分類為來自短讀段序列及長讀段序列的指環病毒。引人注目地，當檢查兩個短讀段定序運作時，利用吾等珠粒誘餌目標富集方案之運作提供99.9%鑑別為指環病毒之彼等讀段。此等發現突出顯示自非血液組織樣品分離指環病毒基因體資料的困難及對靶向方法之需求，該等靶向方法擴增樣品中之指環病毒的量且降低所定序之宿主背景的量。
為了定量各眼睛子切片組織中之指環病毒譜系之數目，吾人分別利用各組短讀段定序資料組裝假定指環病毒基因體。吾人發現產生自黃斑及RPE組織回收之有效ORF1衣殼蛋白質的十一個假定基因體。吾人聚集來自此等十一個基因體之ORF1衣殼蛋白序列以產生尺寸在2,762bp至3,881bp範圍內的八種不同基因體。在已知經確認完全基因體附近之長度處的假定基因體之回收率指示，吾等方法可回收可使用載體構築及合成之候選基因體。
隨後吾等將此等八個代表性基因體中之每一者歸類為三種已知人類指環病毒屬之一。吾人在此等屬中之各者中觀測到至少一個基因體，其中甲型細環病毒最多有四個，接著乙型細環病毒有2個，及最終丙型細環病毒有一個。此等發現表明，指環病毒趨向性可能並不侷限於特定的屬。
吾人進一步評估吾人是否能夠通過利用成對RPE衍生之長讀段定序資料來解決富含GC及重複區域附近有問題的基因體區，從而恢復全長、環化指環病毒基因體。吾人首先將長讀段資料映射至此等基因體且在所有經查詢基因體中觀測到289,631個命中。吾等評價此等命中中之各者與短讀段衍生之基因體的相似性且選擇具有最高相似性的長讀段進行錯誤校正以解決遇到之高錯誤率。吾人使用短讀段序列資料使用此等位點中之各者處發現之共有序列校正任何可變位置。一旦經拋光，吾等嘗試藉由觀察在此等正確長讀段之任意末端中之各者處重疊來環化各序列。此等RPE衍生之假定基因體中僅一個環化且命名為RING19 (圖55A)。
活體外產生 RING19 病毒粒子然而RING2先前已自人類肋膜積液樣品定序且報導於文獻[Galmès 2013]中，RING19為自如上文所描述之人類視網膜色素上皮細胞分離之指環病毒。因為RING2及RING19均屬於人類指環病毒之乙型細環病毒屬，所以吾人假設MOLT-4細胞株將類似地容許產生RING19。吾人產生含有RING19基因體之單一複本或串聯複本的質體。質體電穿孔至MOLT-4細胞中，培育4天且使用碘克沙醇線性梯度處理以用於分析。吾人偵測經串聯含RING19基因體質體轉染之樣品在具有1.25 g/cm 3之密度的溶離份中RING19效價之明顯峰值。此等樣品中之此峰值顯著高於經單一含RING19基因體質體轉染之樣品，指示MOLT-4細胞實際上允許產生RING19以及RING2。
接著，吾人在MOLT-4細胞中以較大規模重複產生RING19以純化病毒粒子以便藉由TEM觀測。簡言之，對經轉染細胞之經處理溶解物進行二步驟純化，包括使用碘克沙醇線性梯度進行等密度離心，接著進行尺寸排阻層析法(SEC)(圖55B)。在預期指環病毒粒子遷移之SEC部分中偵測到RING19效價之明顯峰值(圖55C)。當彙集此等溶離份且濃縮用於TEM分析時，吾人如圖55D及55E中所示偵測到多個RING19粒子。此等RING19粒子之形態與RING2粒子之形態一致(圖54E)。
實例 21. Ring19 粒子展現出活體內感染性因為RING19基因體自人類視網膜上皮細胞分離，所以吾人檢驗其藉由活體內測試眼睛中之RING19感染性及向性而對眼睛組織具有向性。如所示，向小鼠視網膜下(SR)或玻璃體內(IVT)注射PBS、純化WT RING19或劑量匹配之AAV2.mCherry (圖56A)。收穫眼睛且將其分成神經視網膜(其含有感光體、雙極性及神經節細胞)及後眼杯(PEC，其含有視網膜色素上皮、脈絡膜及鞏膜)。自此等組織收穫DNA，接著進行qPCR分析以偵測RING19及AAV2.mCherry基因體，如以上材料及方法中所描述。RING19顯示在視網膜下或玻璃體內注射之後第7天及第21天神經視網膜與PEC之感染性(圖56B)。RING19證明在視網膜下注射之後神經視網膜及PEC之靶向優於AAV2.mCherry。在第7天及第21天觀測到此感染性增加。對於玻璃體內注射，與AAV2.mCherry相比，RING19亦在第7天及第21天PEC中展現出優異感染性。另外，吾人亦在玻璃體內遞送之後在第7天及第21天偵測到神經視網膜中之RING19感染性。此等資料顯示與人類供體之RPE分離的RING19證實PEC之靶向優於AAV2。
實例 22. 視網膜及 PEC 在 視網膜下及玻璃體內注射後的 Ring 2 感染性在一個實例中，在小鼠中活體內測試Ring2指環病毒對眼睛之感染性及向性。簡言之，給小鼠視網膜下或玻璃體內注射PBS、Ring 2或劑量匹配之AAV2.mCherry。收穫眼睛且將其分成神經視網膜(其含有感光體、雙極性及神經節細胞)及後眼杯(PEC，其含有視網膜色素上皮、脈絡膜及鞏膜)。如圖57中所示，在視網膜下或玻璃體內注射之後第7天及第21天，Ring 2展現出神經視網膜及PEC兩者之感染性。第2組顯示在視網膜下注射至AAV2.mCherry之後類似地靶向神經視網膜及PEC。此等資料顯示與人類供體之肋膜積液分離之Ring 2可以與AAV2類似之含量靶向眼組織。
實例 23. 視網膜及 PEC 在 視網膜下及玻璃體內注射後的 CAV 感染性及轉導在一實例中，在小鼠中活體內測試雞貧血病毒(CAV)對感染性、向性及眼睛轉導之能力。簡言之，向小鼠視網膜下注射PBS，攜帶奈米螢光素酶有效負載之CAV(Ring46.nLuc)、劑量匹配之AAV2.nLuc或低劑量AAV2.nLuc。收穫眼睛且將其分成神經視網膜(其含有感光體、雙極性及神經節細胞)及後眼杯(PEC，其含有視網膜色素上皮、脈絡膜及鞏膜)。
如圖58中所示，在視網膜下注射之後，CAV展現出PEC在第14天之感染性。攜載nLuc有效負載之CAV載體展現出在視網膜下注射之後，PEC之靶向優於劑量匹配之AAV2.nLuc。另外，在用攜載nLuc有效負載之CAV載體視網膜下遞送之後，在PEC中偵測到nLuc mRNA，而在AAV2.nLuc之高劑量組中僅可偵測到nLuc mRNA。此等資料顯示，CAV表明PEC之靶向及轉導比AAV2大。
實例 24. 攜載外源性 nLuc 有效負載之 Ring19 之 載體化及 Ring19 指環載體之救援在此實例中，將Ring19載體化且封裝。選擇Ring19指環載體粒子展示為攜有編碼外源性有效負載之遺傳元件。簡言之，產生一組例示性串聯指環載體基因體構築體，其中Ring19基因體之第一複本為野生型且Ring19基因體之第二複本包含插入Ring19基因體之各個位置的CMV_nLuc卡匣。如圖59A中所示，在串聯構築體之Ring19基因體之第二複本中，nLuc卡匣替換Ring19基因體序列之對應部分。在第一例示性Ring19指環載體構築體(在本文中稱為CMV_nLuc3構築體或pTandem R19_nLuc3)中，CMV_nLuc卡匣代替ORF2基因之C端部分以及ORF1基因之N端部分。在第二例示性Ring19指環載體構築體(在本文中稱為CMV_nLuc4構築體或pTandem R19_nLuc4)中，CMV_nLuc卡匣替換ORF1基因之內部部分。在第三例示性Ring19指環載體構築體(在本文中稱為CMV_nLuc5構築體或pTandem R19_nLuc5)中，CMV_nLuc卡匣替換ORF1基因之內部部分，該部分相對於CMV_nLuc4構築體中替換之位置更靠近C端。
詳言之，使用滑動窗方法測定Ring19基因體內之容許缺失限制。nLuc3缺失自ORF2、2/2及2/3之胺基酸56移除至ORF1之胺基酸324。自ORF1之胺基酸96至胺基酸424移除nLuc4缺失。自ORF1之胺基酸196至胺基酸524移除nLuc5缺失。ORF1及ORF2、2/2、2/3之甲硫胺酸藉由奈米-螢光素酶卡匣插入而經改變以編碼Ring19基因體之第二複本中的離胺酸(ATG至AAA)，以剔除此等ORF之基因表現，使得僅Ring19基因體之第一野生型複本能夠進行ORF1及ORF2基因表現。
本文所用之奈米-螢光素酶(nLuc)序列包含胺基酸序列：
表D1為包含兩個串聯野生型Ring19基因體序列之親本構築體提供序列。表D2至D4提供Ring19 nLuc指環載體串聯構築體之序列。引入所選靜默突變以移除內部BsaI限制位點且促進選殖。
表 D1. 例示性 Ring19 指環病毒串聯構築體序列
名稱  RING 19 WT-WT串聯構築體
屬/ 分支 乙型細環病毒
登錄號 N/A
全序列：5752 bp
註釋：   
假定域 鹼基範圍
ORF1 524 - 2491
ORF2 342 - 632
ORF2/2 342 – 628；2201 - 2474
ORF2/3 342 – 628；2328 - 2703
富含GC之區或其一部分 2767 - 2876
5'UTR保守域或其一部分 242 - 312
ORF1 3400 - 5367
ORF2 3218 - 3508
ORF2/2 3218 – 3504；5077 - 5350
ORF2/3 3218 – 3504；5204 - 5579
ORF3 5394 - 5579
富含GC之區或其一部分 5643 - 5752
5'UTR保守域或其一部分 3118 - 3188
表 D2. 例示性 Ring19 CMV_nLuc3 串聯構築體序列
名稱 RING 19 WT-CMV_nLuc3串聯構築體
屬/ 分支 乙型細環病毒
登錄號 N/A
全序列：5743 bp
註釋：   
假定域 鹼基範圍
全長ORF1 524 - 2491
全長ORF2 342 - 632
ORF2/2 342 – 628；2201 - 2474
ORF2/3 342 – 628；2328 - 2703
富含GC之區或其一部分 2767 - 2876
5'UTR保守域或其一部分 242 - 312
截短ORF1 4367 - 5358
截短ORF2 3218 - 3385
ORF2/2 3218 – 3385；5068 - 5341
ORF2/3 3218 – 3385；5195 - 5570
ORF3 5385 - 5570
CMV啟動子 3525 - 3728
奈米-螢光素酶(nLuc) 3776 - 4291
SV40聚A 4301 - 4349
富含GC之區或其一部分 5634 - 5743
5'UTR保守域或其一部分 3118 - 3188
表 D3. 例示性 Ring19 CMV_nLuc4 串聯構築體序列
名稱 RING 19 WT-CMV_nLuc4串聯構築體
屬/ 分支 乙型細環病毒
登錄號 N/A
全序列：5743 bp
註釋：   
假定域 鹼基範圍
全長ORF1 524 - 2491
全長ORF2 342 - 632
ORF2/2 342 – 628；2201 - 2474
ORF2/3 342 – 628；2328 - 2703
富含GC之區或其一部分 2767 - 2876
5'UTR保守域或其一部分 242 - 312
具有缺失之ORF1 3400 – 3684；4663 - 5358
全長ORF2 3218 - 3508
ORF2/2 3218 – 3504；5068 - 5341
ORF2/3 3218 – 3504；5195 - 5570
ORF3 5385 - 5570
CMV啟動子 3824 - 4027
奈米-螢光素酶(nLuc) 4075 - 4590
SV40聚A 4600 - 4648
富含GC之區或其一部分 5634 - 5743
5'UTR保守域或其一部分 3118 - 3188
表 D4. 例示性 Ring19 CMV_nLuc5 串聯構築體序列
名稱 RING 19 WT-CMV_nLuc5串聯構築體
屬/ 分支 乙型細環病毒
登錄號 N/A
全序列：5743 bp
註釋：   
假定域 鹼基範圍
全長ORF1 524 - 2491
全長ORF2 342 - 632
ORF2/2 342 – 628；2201 - 2474
ORF2/3 342 – 628；2328 - 2703
富含GC之區或其一部分 2767 - 2876
5'UTR保守域或其一部分 242 - 312
具有缺失之ORF1 3400 – 3984；4964 - 5358
全長ORF2 3218 - 3508
ORF2/2 3218 – 3504；5068 - 5341
ORF2/3 3218 – 3504；5195 - 5570
ORF3 5385 - 5570
CMV啟動子 4124 - 4327
奈米-螢光素酶(nLuc) 4375 - 4890
SV40聚A 4900 - 4948
富含GC之區或其一部分 5634 - 5743
5'UTR保守域或其一部分 3118 - 3188
包含野生型Ring19基因體序列之兩個複本的串聯質體用作陰性對照。如圖59B中所示，1e7個MOLT-4細胞用100 ug串聯質體中之一者電穿孔。四天後，收穫細胞。將細胞溶解於0.5% Triton X-100、50 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl中，接著兩輪凍融，且隨後在室溫下用100 U/ml核酸酶處理90分鐘。所得溶液穿過碘克沙醇線性梯度，且使用DNA酶qPCR定量包含nLuc序列之DNA酶保護之基因體，藉此確定所封裝之Ring19指環載體粒子之含量救援。
如圖60中所示，例示性R19_nLuc指環載體中之各者成功地救援，展現出DNA酶保護之nLuc訊號，而包含野生型Ring19基因體之兩個串聯複本的陰性對照構築體未展現出任何可偵測到的DNA酶保護之nLuc訊號。
實例 25. 編碼多種外源性效應子之 Ring19 指環載體在此實例中，實例24中所描述之載體化及救援方法用以產生攜載多個不同轉殖基因卡匣之一系列基於Ring19的指環載體，該等卡匣包含啟動子及編碼外源性效應子之序列。如圖61中所示，用於此等實驗之串聯核酸構築體在實例24中所描述之R19_nLuc3、nLuc4及nLuc5構築體之後模型化，其中轉殖基因卡匣序列置換延伸跨越Ring19基因體之區域，該基因體經R19_nLuc3、nLuc4及nLuc5卡匣置換。所測試之啟動子包括SV40、min-hEF1a、泛蛋白C、MSCV、SFFV、hPGK、INS84-eGFP、U1a-eGFP、CMV。所測試之例示性外源性效應子包括eGFP、mCherry、hGH、iCre、gLuc及hEpo。
如下產生串聯指環載體構築體。簡言之，根據自nLuc3構築體(ORF2、2/2、2/3之胺基酸56之後的缺失)及nLuc5構築體(終止於ORF1之胺基酸525之缺失)鑑別之界限，串聯構築體之第二複本中的Ring19基因體之一部分截止。移除1588 bp基因體序列且經攜有SV40啟動子、eGFP編碼序列及SV40聚A之表現卡匣置換。ORF1及ORF2、2/2、2/3之甲硫胺酸改變以編碼離胺酸(ATG至AAA)以剔除此等ORF之基因表現，使得僅Ring19基因體之第一野生型複本能夠進行ORF1及ORF2基因表現。表現卡匣側接有兩個BsaI位點。此等位點用於有效交換有效負載及用於插入公開可用之啟動子及報導序列之庫。如上所指出，測試以下啟動子序列：SV40、最小hEF1a、UbC、MSCV、SFFV、hPGK、最小CMV、INS84及U1a。測試以下報導序列：eGFP、mCherry、Epo、hGH、hGluc及iCRE。在攜帶康微素抗性標記物之pUC57標準主鏈中選殖及繁殖所有串聯構築體。
用於產生包含SV40-eGFP卡匣之Ring19指環載體的例示性串聯構築體之序列提供於下表D5中。引入所選靜默突變以移除內部BsaI限制位點且促進選殖。
表 D5. 例示性 Ring19 SV40-eGFP 串聯構築體序列
名稱 RING 19 WT-SV40-eGFP串聯構築體
屬/ 分支 乙型細環病毒
登錄號 N/A
全序列：5669 bp
註釋：   
假定域 鹼基範圍
全長ORF1 524 - 2491
全長ORF2 342 - 632
ORF2/2 342 – 628；2201 - 2474
ORF2/3 342 – 628；2328 - 2703
富含GC之區或其一部分 2767 - 2876
5'UTR保守域或其一部分 242 - 312
截短ORF1 4890 - 5284
截短ORF2 3218 - 3385
ORF2/2 3218 – 3385；4994 - 5267
ORF2/3 3218 – 3385；5121 - 5496
ORF3 5311 - 5496
SV40啟動子 3417 - 3613
SV40 ori 3464 - 3599
eGFP 3670 - 4389
SV40聚A 4448 - 4569
富含GC之區或其一部分 5560 - 5669
5'UTR保守域或其一部分 3118 - 3188
由以上構築體編碼之eGFP多肽包含如下胺基酸序列： 。
為了轉染各載體串聯質體，將1e7個MOLT-4細胞粒化且再懸浮於500uL電穿孔緩衝液(5mM KCl、15mM MgCl2、15mM HEPES、150mM Na2HPO4 pH7.2、50mM丁二酸鈉)中，且將50ug載體-質體添加至1e7個細胞之各懸浮液中。將質體+細胞懸浮液分佈於五個2mm電穿孔比色管(每個比色管110uL懸浮液混合物)中。使用NEPA21轉染儀器使含有質體+細胞懸浮液之比色管經受以下電穿孔條件：
      穿孔脈衝                轉移脈衝         
V 長度(ms) 間隔(ms) No. D.速率 (%) 極性 V 長度(ms) 間隔(ms) No. D.速率(%) 極性
150 5 50 2 10 + 20 50 50 5 40 +/-
將預溫熱培養基(300uL)添加至各比色管。將懸浮液轉移至含有25 mL預溫熱完全培養基(RPMI+10% FBS+1mM丙酮酸鈉)之150 mL燒瓶中且在37℃及5% CO 2下培育4天。將第4天培養物之細胞粒化且再懸浮於1×溶解緩衝液(0.5% Triton，50 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl)中且經歷3×冷凍-解凍循環。在冷凍-解凍後，將1 ml核酸酶緩衝液(2 mM MgCl2，50 mM Tris pH 8.0，200U苯甲酶)添加至裂解物且在室溫下培育90 min。藉由在10K RCF下離心30分鐘使溶解物澄清。溶解物裝載至線性碘克沙醇梯度上且在70Ti轉子中在60000RPM下超速離心1小時。分餾梯度且藉由DNA酶保護之qPCR效價分析確定病毒粒子含量。
為確定DNA酶保護之載體基因體複本，在37℃下將5uL各部分與20U之DNA酶I (20uL最終反應體積)一起培育30分鐘。隨後使反應物在55C下經歷蛋白酶K消化(40uL最終體積)30分鐘，接著在95C下經歷去活化步驟15分鐘。隨後將樣品在0.05%普朗尼克緩衝液中1:10稀釋。隨後使用基於探針之qPCR反應使用由已知濃度之質體之連續稀釋構成的標準曲線來確定DNA含量。
如圖62A及62B中所示，在x軸上所指示之啟動子控制下攜帶eGFP卡匣(圖62A)或mCherry卡匣(圖62B)之Ring19指環載體構築體展現出可偵測含量之DNA酶保護之基因體，指示經封裝指環載體粒子之成功救援。亦測試在CMV、泛蛋白C或SFFV啟動子控制下攜載hGH轉殖基因、gLuc轉殖基因、iCre轉殖基因或hEpo轉殖基因的Ring19指環載體構築體。如圖63A至63D中所示，針對此等構築體中之各者回收封裝Ring19指環載體粒子。圖64A-64B及65A-65B顯示串聯質體上之野生型基因體亦產生Ring19指環病毒粒子。綜合而言，此等資料證明攜帶編碼外源性效應子之遺傳元件的Ring19指環載體粒子之成功載體化及救援。
當結合附圖閱讀時，將更好地理解本發明之實施例的以下詳細描述。出於說明本發明之目的，在圖式中展示本發明例示之實施例。然而應瞭解，本發明不限於圖式中所展示之實施例之確切配置及手段。
圖1A為展示衣殼蛋白序列之胺基酸區域之序列相似性百分比的圖示。 圖1B為展示衣殼蛋白序列之序列相似性百分比的圖示。 圖2為展示指環載體之一個實施例的圖示。 圖3描繪編碼TTMiniV之LY1病毒株的康黴素載體(「指環載體1」)之示意圖。 圖4描繪編碼TTMiniV之LY2病毒株的康黴素載體(「指環載體2」)之示意圖。 圖5描繪293T及A549細胞中之合成性指環載體的轉染效率。 圖6A及圖6B描繪用以繪示合成性指環載體對293T細胞之成功感染的定量PCR結果。 圖7A及圖7B描繪用以繪示合成性指環載體對A549細胞之成功感染的定量PCR結果。 圖8A及圖8B描繪用以繪示合成性指環載體對Raji細胞之成功感染的定量PCR結果。 圖9A及圖9B描繪用以繪示合成性指環載體對Jurkat細胞之成功感染的定量PCR結果。 圖10A及圖10B描繪用以繪示合成性指環載體對Chang細胞之成功感染的定量PCR結果。 圖11A-11B為展示來自經TTMV-LY2∆574-1371、∆1432-2210、2610::nLuc轉染或感染之細胞之螢光素酶表現的一系列圖式。在感染細胞中觀測到發光，指示成功複製及封裝。 圖11C為描繪甲型細環病毒(細環病毒；TTV)之系統發生樹的圖式，其中分枝系被突出顯示。表示至少100個指環病毒株。本文提供來自若干分枝系之例示性序列。 圖12為展示用於產生指環載體(例如，如本文所描述之複製勝任型或複製缺陷型指環載體)之例示性工作流的示意圖。 圖13為展示針對TTV及TTMV基因體當量之定量設計的引子組之引子特異性的圖式。基於SYBR綠色化學之定量PCR顯示，如圖所示，在編碼對應基因體之質體上，使用TTMV或TTV特異性引子組的擴增產物中之各者均有一個不同的峰。 圖14為展示qPCR定量TTV基因體當量之PCR效率的一系列圖式。在兩種不同商業qPCR主混合物下使用增加濃度之引子及固定濃度之水解探針(250 nM)。90-110%之效率在定量期間引起最小誤差傳播。 圖15為展示TTMV (目標1)或TTV (目標2)在7 log10基因體等效濃度下線性擴增的例示性擴增曲線的圖。基因體當量在7個10倍稀釋液中進行定量，具有較高PCR效率及線性(R 2TTMV：0.996；R 2TTV：0.997)。 圖16A至16B為展示指環載體儲備液中之TTMV基因體當量之定量的一系列圖式。(A)兩種儲備液之擴增曲線圖，各儲備液1:10稀釋且一式兩份地操作。(B)如圖A中所示之相同兩個樣品，此處顯示於線性範圍之上下文中。展示兩個代表性樣品中之上限及下限。PCR效率：99.58%，R 2：0988。 圖17為展示在經指定質體轉染之HEK293T細胞中miR-625表現之倍數變化的圖式。 圖18為展示來自各甲型細環病毒分枝系之代表性序列比對之成對一致性的圖式。將針對TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02及TTV-HD16d之DNA序列比對。沿比對長度顯示跨50-bp滑動窗之成對同一性百分比。以上括號表示具有成對標識之非編碼及編碼區域。以下括號表示具有高或低序列保守性之區域。 圖19為展示七個甲型細環病毒分枝系之假定蛋白質的胺基酸比對的成對一致性的圖。將來自TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02及TTV-HD16d之假定蛋白質的胺基酸序列比對。沿各比對長度顯示跨15-aa滑動窗之成對同一性百分比。指示開讀框DNA序列與蛋白質胺基酸序列之逐對一致性。(*)比對TTV-CT30F、TTV-tth8、TTV-16及TTV-TJN02之假定ORF2t/3胺基酸序列。 圖20為展示5'UTR內之域在七個甲型細環病毒分枝系(按出現之次序分別為SEQ ID NOS 810-817)之間具有高度保守性的圖式。將各代表性甲型細環病毒之71-bp 5'UTR保守域序列進行比對。該序列在七個分枝系之間具有95.2%成對一致性。 圖21為展示來自七個甲型細環病毒分枝系之富含GC域之比對的圖式。各指環病毒具有ORF下游的區域，其GC含量大於70%。展示來自TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02及TTV-HD16d之富含GC之區的比對。該等區域之長度不同，但在其比對處具有75.4%成對一致性。 圖22為展示用編碼靶向n-myc相互作用蛋白質(NMI)之miRNA的指環載體感染Raji B細胞之圖式。顯示在用編碼NMI miRNA之指環載體感染Raji B細胞(箭頭)或對照細胞之後偵測到的指環載體之基因體當量的定量。 圖23為展示用編碼靶向n-myc相互作用蛋白質(NMI)之miRNA的指環載體感染Raji B細胞之圖式。西方墨點顯示編碼針對NMI之miRNA的指環載體降低Raji B細胞中之NMI蛋白質表現，而經缺乏miRNA之指環載體感染的Raji B細胞顯示出與對照相當的NMI蛋白質表現。 圖24為展示在用包含編碼內源性miRNA之序列的指環載體及其中缺失編碼內源性miRNA之序列的對應指環載體感染之後在宿主細胞中產生的指環載體粒子之定量的一系列圖式。 圖25A至圖25C為展示來自融合至奈米-螢光素酶之TTMV-LY2之ORF的胞內定位的一系列圖式。(A) Vero細胞中，ORF2 (頂部列)似乎定位至細胞質，而ORF1/1 (底部列)似乎定位至細胞核。(B)在HEK293細胞中，ORF2 (頂部列)似乎定位至細胞質，而ORF1/1 (底部列)似乎定位至細胞核。(C)細胞中ORF1/2及ORF2/2之定位圖案。 圖26為展示TTV-tth8之3'非編碼區域(NCR)中之順序缺失控制的一系列圖式。頂部列顯示野生型TTV-tth8指環病毒的結構。第二列顯示TTV-tth8，其中在3' NCR (Δ36nt (GC))之富含GC之區中缺失36個核苷酸。第三列展示具有36個核苷酸缺失及miRNA序列之額外缺失的TTV-tth8，從而引起78個核苷酸之全部缺失(Δ36nt (GC) ΔmiR)。第四列展示TTV-tth8，其具有來自3' NCR之171個核苷酸缺失，其包括36個核苷酸缺失區域及miRNA序列(Δ3' NCR)兩者。 圖27A至圖27D為展示TTV-tth8之3' NCR中之連續缺失對指環病毒ORF轉錄物含量具有顯著作用的一系列圖式。展示ORF1及ORF2在第2天(A)、ORF1/1及ORF2/2在第2天(B)、ORF1/2及ORF2/3在第2天(C)及ORF2t3在第2天(D)之表現。 圖28A至圖28B為展示用於產生表現奈米-螢光素酶之指環載體(A)及用於轉染細胞之一系列指環載體/質體組合(B)的構築體之一系列圖式。 圖29A至圖29C為展示在注射指環載體之小鼠中之奈米-螢光素酶表現的一系列圖式。(A)在注射之後第0-9天時小鼠中之奈米-螢光素酶表現。(B)注射如所指示之各種指環載體/質體構築體組合的小鼠中之奈米-螢光素酶表現。(C)在注射後小鼠中偵測到的奈米-螢光素酶發光之定量。A組接受TTMV-LY2載體+奈米-螢光素酶。B組接受奈米-螢光素酶蛋白質及TTMV-LY2 ORF。 圖29D-1至圖29D-2為來自七個不同甲型細環病毒分枝系之代表性指環之基因體組織的示意圖。將針對TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02及TTV-HD16d之序列比對，其關鍵區域被標註。假定開讀框(ORF)係以淺灰色表示，TATA盒係以深灰色表示，且關鍵假定調節區以中等灰色表示，包括起始子元件、5'UTR保守域及富含GC之區(例如，如所指示)。 圖30為展示用於確定指環病毒miRNA前體之內源性目標之例示性工作流程的示意圖。 圖31A至圖31B為一系列顯示串聯指環病毒質體可增加指環病毒或指環載體產生之圖式。(A)例示性串聯指環病毒質體之質體圖。(B)用串聯指環病毒質體轉染HEK293T細胞引起病毒基因體數目之四倍產生(相較於攜帶單複本之質體)。 圖31C為展示TTMV-LY2質體pVL46-063及pVL46-240之環化的凝膠電泳成像。 圖31D為展示如由尺寸排阻層析法(SEC)確定之線性及環形TTMV-LY2構築體之複本數的層析圖。 圖32為顯示來自九個指環病毒基因體序列之36個核苷酸富含GC之區及基於其之共有序列(按出現之次序分別為SEQ ID NOS 818-827)的比對之圖。 圖33為展示來自指環病毒株LY2及CBD203之ORF1結構的一系列圖。標記假定域：富含精胺酸之區(富含arg)、包含果凍卷域之核心區域、高變區(HVR)、N22區域及C端域(CTD)，如所指示。 圖34為展示來自乙型細環病毒株CBS203之ORF1結構的圖。指示展示一組110個乙型細環病毒之間的高相似性之殘基。指示在所評估之所有病毒株中具有60-79.9%相似性之殘基、80-99.9%相似性之殘基及100%相似性之殘基。 圖35為展示來自甲型細環病毒之258個序列的比對的共有序列(SEQ ID NO: 828)的圖表，具有較高相似性分數之殘基突出顯示深灰色(100%)，中灰色(80-99.9%)，淺灰色(60-80%)。假定域以方框指示。一致性百分比亦藉由共有序列下方之盒狀圖指示，其中中灰色盒指示100%一致性，淺灰色盒指示30-99%一致性，且深灰色盒指示低於30%一致性。 圖36為展示指環病毒ORF1分子之域及待用來自不同指環病毒之高變域置換之高變區的示意圖。 圖37為展示ORF1之域及將用來自非指環病毒源之所關注之蛋白質或肽(POI)置換的高變區的示意圖。 圖38為展示基於指環病毒基因體之例示性指環載體遺傳元件之設計的一系列圖。在指環病毒基因體中缺失了編碼蛋白質區(左)，留下指環病毒非編碼區(NCR)，包括病毒啟動子、5'UTR保守域(5CD)及富含GC之區。將有效負載DNA插入至編碼蛋白質之基因座處之非編碼區中(右側)。所得指環載體具有有效負載DNA (包括開讀框、基因、非編碼RNA等)及必需的指環病毒順式複製及封裝元件，但缺乏用於複製及封裝之必需蛋白質元件。 圖39為展示包含編碼外源性人類免疫黏附素之遺傳元件的指環載體成功地轉導人類肺衍生之細胞株EKVX的條形圖。 圖40為展示經工程化以含有編碼人類紅血球生成素(hEpo)之序列的基於tth8或LY2之指環載體可將功能性轉殖基因遞送至哺乳動物細胞的圖式。 圖41A及41B為展示在靜脈內注射之後七天向小鼠投與之工程化指環載體為可偵測的一系列圖式。 圖42為展示在靜脈內投與編碼hGH之工程化指環載體之後七天在全血之細胞級分中偵測到hGH mRNA的圖式。 圖43A-43D為繪示指環病毒ORF2中高度保守模體之一系列圖式。圖43揭示SEQ ID NO: 949。 圖44A及44B為展示人類組織中之全長ORF1 mRNA表現之跡象的一系列圖式。 圖45為展示活體外環化(IVC) TTV-tth8基因體(IVC TTV-tth8)與質體中之TTV-tth8基因體相比在HEK293T細胞中之預期密度下產生TTV-tth8基因體複本之能力的圖式。 圖46為展示活體外環化(IVC) LY2基因體(WT LY2 IVC)及質體中之野生型LY2基因體(WT LY2質體)在Jurkat細胞中之預期密度下產生LY2基因體複本之能力的一系列圖式。 圖47為顯示來自甲型細環病毒(Alphatorquevirus)、乙型細環病毒(Betatorquevirus)及丙型細環病毒(Gammatorquevirus)之指環病毒ORF1蛋白質之果凍卷域(SEQ ID NO: 950-975)之二級結構的比對的圖式。此等二級結構元件高度保守。 圖48為展示位於N22域中之ORF1模體的保守序列及二級結構的圖(按出現之次序分別為SEQ ID NOS 976-1000及851)。人類TTV ORF1之保守性YNPXXDXGXXN (SEQ ID NO: 829)模體具有保守二級結構。特定言之，模體中之酪胺酸斷裂β股，且第二β股開始於模體之末端天冬醯胺上。 圖49為展示人類細胞中環形19指環載體之產生的圖式。 圖50A為指環病毒之單股環形DNA基因體之示意圖，或者剪接以產生編碼七個具有不同分子量之假定蛋白質之三種不同mRNA。 圖50B描繪來自經編碼以串聯方式之兩個RING2基因體複本之質體轉染的MOLT-4細胞之RT-qPCR資料。未經轉染之MOLT4細胞(對照)用作陰性對照，且GAPDH mRNA用作管家基因用於標準化。 圖50C描繪西方墨點法資料，其在編碼以串聯方式之RING2基因體之兩個複本之質體轉染後指示時間點時進行，以研究指環病毒蛋白質ORF1及ORF2隨時間推移之動力學。使用GAPDH蛋白質作為內參考物。 圖51為經編碼RING2基因體之單一複本的質體(4號樣品)或編碼以串聯方式之RING2基因體之兩個複本的質體(5號樣品)轉染之MOLT-4細胞的經消化樣品的南方墨點。樣品1、2及3號分別為充當對照之活體外環化RING2基因體、含有RING2基因體之單一複本的質體及含有以串聯方式之RING2基因體之兩個複本的質體。 圖52為繪製經受使用CsCl線性梯度之等密度離心的澄清裂解物之密度(以灰色標繪)及病毒效價(以黑色標繪)之圖。 圖53為描繪來自經編碼以串聯方式之RING2基因體之兩個複本(WT RING2串聯)、其中所有ORF1變異體之表現已基因剔除(ORF1 KO IVC)的RING2之活體外環化基因體、其中所有ORF2變異體之表現已經基因敲除(ORF2 KO IVC)或經ORF1 KO IVC及ORF2 KO IVC兩者共轉染的RING2之活體外環化基因體的質體轉染的MOLT-4細胞樣品之DNA酶保護之qPCR之結果的圖。 圖54A為來自MOLT-4細胞之RING2粒子之產生及純化的示意圖。 圖54B為描繪在CsCl梯度之後各部分之密度及病毒效價的一組圖。 圖54C為描繪合併材料(輸入)、濃縮物質及流通(FT)中之病毒效價的曲線圖。 圖54D為西方墨點法分析以偵測合併材料(輸入)、濃縮物質及流通(FT)中之衣殼蛋白ORF1。 圖54E為濃縮RING2粒子之一組代表性穿透式電子顯微鏡影像。 圖55A為自剝離之RPE組織回收之完全標註、環化基因體RING19的示意圖。ORF1及ORF2均為計算標註的，而ORF2/2及ORF2/3及手動管理的。 圖55B為來自MOLT-4細胞之RING19粒子之產生及純化的示意圖。 圖55C為描繪來自經純化RING19之SEC之部分的DNA酶保護之qPCR分析之圖。 圖55D-55E為經濃縮RING19粒子之代表性穿透電子顯微影像。 圖56A-56B為展示鼠類視網膜及後眼杯之RING19感染性的一系列圖式。(A)表描述用於活體內研究之各組、治療、病毒/載體劑量、投與途徑、每組動物數目及時間點。下圖展示小鼠眼之解剖結構以及研究設計之示意圖。(B)存在於神經視網膜或後眼杯(PEC)中之載體/病毒基因體複本，以藉由qPCR在玻璃體內(IVT)或視網膜下(SR)注射PBS、Ring 19之6.6E+5 vg或劑量匹配AAV2.mCherry一次之小鼠眼睛的收穫DNA中所評定。N=5至6隻眼睛/組。縮寫：AAV=腺相關病毒，DNA=去氧核糖核酸，IVT=玻璃體內，PBS=磷酸鹽緩衝鹽水，PEC=後眼杯，SR=視網膜下。 圖57為顯示視網膜下及玻璃體內注射指環病毒後小鼠之視網膜及PEC中之Ring2感染性的一系列圖。載體基因體(vg)複本存在於玻璃體內或視網膜下注射PBS、1.6E6 vg之Ring 2或劑量匹配的AAV2.mCherry一次之小鼠眼睛中。在第7天或第21天，收穫各組中的三隻眼睛且藉由qPCR分析使用靶向Ring 2基因體或mCherry轉殖基因之探針單獨地分析視網膜及PEC。縮寫：AAV=腺相關病毒，DNA=去氧核糖核酸，IVT=玻璃體內，PBS=磷酸鹽緩衝鹽水，PEC=後眼杯，SR=視網膜下，VG=載體基因體。 圖58為展示視網膜下及玻璃體內注射後小鼠之視網膜及PEC中之CAV感染性的一系列圖。在視網膜下注射PBS、9.4E5 vg 之CAV、劑量匹配之AAV2.nLuc或1E+9 vg AAV2.nLuc一次之小鼠眼睛中偵測到的DNA載體基因體複本或mRNA轉殖基因複本。在第14天，收穫各組之5至6隻眼睛且分別藉由qPCR (DNA)或RT-qPCR (mRNA)使用nLuc轉殖基因之探針分析視網膜及PEC。縮寫：AAV=腺相關病毒，DNA=去氧核糖核酸，IVT=玻璃體內，PBS=磷酸鹽緩衝鹽水，PEC=後眼杯，SR=視網膜下，nLuc=奈米螢光素酶，mRNA=信使核糖核酸。 圖59A為展示三個例示性Ring19串聯載體構築體之示意圖。在各構築體中，CMV_nLuc卡匣在指定位置插入串聯構築體中之Ring19基因體之第二複本中，替代Ring19基因體序列之對應核苷酸。在第一例示性構築體(在本文中稱為CMV_nLuc3構築體)中，CMV_nLuc卡匣代替ORF2基因之C端部分以及ORF1基因之N端部分。在第二例示性構築體(在本文中稱為CMV_nLuc4構築體)中，CMV_nLuc卡匣替換ORF1基因之內部部分。在第三例示性構築體(在本文中稱為CMV_nLuc5構築體)中，CMV_nLuc卡匣替換ORF1基因之內部部分，該部分相對於CMV_nLuc4構築體中替換之位置更靠近C端。 圖59B為展示用於產生Ring19指環載體粒子之例示性工作流程之圖。 圖60為展示使用圖59B中所示之基於串聯載體之工作流的指定Ring19指環載體之恢復的圖式。展示在產生指定指環載體之後的含DNA酶保護之nLuc的病毒基因體之含量。 圖61為展示用於產生Ring19指環載體之例示性串聯核酸構築體之圖。串聯構築體包含第一區域(或第一複本)，其包含Ring19指環病毒基因體(包括5' UTR、ORF2編碼序列、ORF1編碼序列、ORF3編碼序列及Ring19之富含GC之區，如本文所描述)及第二區域(或第二複本)，其包含基於Ring19之指環載體基因體(包括5' UTR、ORF2核酸序列之至少一部分、編碼所關注之有效負載多肽的轉殖基因序列、ORF1核酸序列之C端部分、ORF3核酸序列之至少一部分及富含GC之區)。 圖62A-62B為顯示在產生攜載指定轉殖基因之Ring19指環載體之後在各種啟動子控制下eGFP或mCherry擴增子之qPCR效價的一系列圖式(如x軸中所列)。 圖63A-63D為展示在產生攜載指定轉殖基因之Ring19指環載體之後在各種啟動子控制下hGH、gLuc、iCre或hEpo擴增子之qPCR效價的一系列圖(如x軸中所列)。 圖64A-64B為顯示在各種啟動子控制下產生Ring19指環載體擴增子之後野生型Ring19擴增子之qPCR效價的一系列圖(如x軸中所列)。 圖65A-65D為顯示在各種啟動子控制下產生Ring19指環載體擴增子之後野生型Ring19擴增子之qPCR效價的一系列圖(如x軸中所列)。
TW202334431A_111138702_SEQL.xml

Claims (28)

  1. 一種指環載體，其包含： (i) 蛋白質外部，該蛋白質外部包含如表A1中所列出之指環病毒ORF1蛋白質，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之多肽，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。
  2. 一種指環載體，其包含： (i) 蛋白質外部，該蛋白質外部包含如表A1中所列出之指環病毒ORF1蛋白質，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之多肽，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件； 其中該蛋白質外部及/或該遺傳元件相對於野生型指環病毒ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒基因體(例如，如本文所描述) 分別包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域之缺失，該域例如為富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述，或基因體區之缺失，該基因體區例如為TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者，例如如本文所描述。
  3. 一種指環載體，其包含： (i) 蛋白質外部，該蛋白質外部包含由表N1中所列出之指環病毒ORF1核酸序列編碼的多肽，或由與該指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼的多肽，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。
  4. 一種指環載體，其包含： (i) 蛋白質外部，該蛋白質外部包含由表N1中所列出之指環病毒ORF1核酸序列編碼的多肽，或由與該指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼的多肽，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件； 其中該蛋白質外部及/或該遺傳元件相對於野生型指環病毒ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒基因體(例如，如本文所描述) 分別包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域之缺失，該域例如為富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述，或基因體區之缺失，該基因體區例如為TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者，例如如本文所描述。
  5. 一種指環載體，其包含： (i)蛋白質外部(例如，其包含指環病毒ORF1分子，例如如本文所描述，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含：(a)如表N1中所列出之5' UTR保守域，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列，及(b)可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。
  6. 一種指環載體，其包含： (i)蛋白質外部(例如，其包含指環病毒ORF1分子，例如如本文所描述，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含：(a)如表N1中所列出之5' UTR保守域，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列，及(b)可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件； 其中該蛋白質外部及/或該遺傳元件相對於野生型指環病毒ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒基因體(例如，如本文所描述) 分別包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域之缺失，該域例如為富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述，或基因體區之缺失，該基因體區例如為TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者，例如如本文所描述。
  7. 一種指環載體，其包含： (i)蛋白質外部(例如，其包含指環病毒ORF1分子，例如如本文所描述，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件，且其中該遺傳元件與如表N1中所列出之指環病毒基因體序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
  8. 一種指環載體，其包含： (i)蛋白質外部(例如，其包含指環病毒ORF1分子，例如如本文所描述，或包含與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽)，及 (ii)被該蛋白質外部包覆之遺傳元件，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件，且其中該遺傳元件與如表N1中所列出之指環病毒基因體序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性； 其中該蛋白質外部及/或該遺傳元件相對於野生型指環病毒ORF1蛋白質及/或野生型指環病毒基因體(例如，如本文所描述)分別包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域之缺失，該域例如為富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述，或基因體區之缺失，該基因體區例如為TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開讀框(ORF)、聚(A)訊號或富含GC之區中之一或多者，例如如本文所描述。
  9. 一種經分離ORF1分子，其包含如表A1中所列之ORF1的胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列； 其中該ORF1分子相對於野生型ORF1蛋白質(例如，如本文所描述)包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域之缺失，該域例如為富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述。
  10. 一種經分離ORF1分子，其包含如表A1中所列之ORF1之果凍卷域的胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列； 其中該ORF1分子相對於野生型ORF1蛋白質(例如，如本文所描述)包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域之缺失，該域例如為富含精胺酸之區、果凍卷域、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如如本文所描述。
  11. 一種經分離ORF2分子，其包含如表A1中所列之ORF2的胺基酸序列，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列； 其中該ORF2分子相對於野生型ORF2蛋白質(例如，如本文所描述)包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如插入、取代、化學或酶修飾及/或缺失，例如，域之缺失。
  12. 一種經分離核酸分子(例如，遺傳元件構築體或遺傳元件)，其包含如表N1中所列出之5' UTR保守域的核酸序列，或與其具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。
  13. 一種經分離核酸分子(例如，遺傳元件構築體或用於提供呈反式形式之ORF1分子的構築體，例如如本文所描述)，其包含如表N1中所列出之ORF1基因的核酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。
  14. 一種經分離核酸分子(例如，遺傳元件構築體或用於提供呈反式形式之ORF2分子的構築體，例如如本文所描述者)，其包含如表N1中所列出之ORF2基因的核酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。
  15. 一種經分離核酸分子(例如，遺傳元件構築體、遺傳元件或用於提供呈反式形式之ORF1或ORF2分子的構築體，例如如本文所描述者)，其包含如表N1中所列出之指環病毒基因體序列，或與其具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。
  16. 一種遺傳元件，其包含： (a)如表N1中所列出之5' UTR保守域，或與其具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列，及 (b)可操作地連接至編碼外源性效應子之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。
  17. 一種製備指環載體組合物之方法，該方法包含： (a)提供細胞，例如如本文所描述之宿主細胞； (b)將編碼如表A1中所列出之ORF1多肽(或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)的核酸分子引入至該細胞中； (c)將遺傳元件構築體引入至該細胞中(例如，在(b)之前、之後或同時)， (d)在允許該細胞產生指環載體之條件下培育該細胞；及 (e)將該等指環載體調配成例如適合於向個體投與之醫藥組合物， 從而產生該指環載體組合物。
  18. 一種製備指環載體組合物之方法，該方法包含： (a)提供細胞，例如如本文所描述之宿主細胞； (b)將編碼ORF1多肽之核酸分子引入至該細胞中； (c)將遺傳元件構築體引入至如表N1中所列出之該細胞中(或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列)(例如，在(b)之前、之後或同時)， (d)在允許該細胞產生指環載體之條件下培育該細胞；及 (e)將該等指環載體調配成例如適合於向個體投與之醫藥組合物， 從而產生該指環載體組合物。
  19. 一種產生指環載體，例如合成性指環載體之方法，其包含： (a)提供宿主細胞，其包含： (i)包含如表N1中所列出之指環病毒基因體的核酸序列(或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列)的核酸分子，例如第一核酸分子，及 (ii)編碼選自例如如表A1中所列出之ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2之胺基酸序列中之一或多者，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的核酸分子，例如第二核酸分子；及 (b)在適合於產生該指環載體之條件下培養該宿主細胞。
  20. 一種將效應子遞送至個體眼睛之方法，該方法包含向該個體之該眼睛投與如請求項1至8中任一項之指環載體。
  21. 一種調節個體眼睛之生物功能的方法，該方法包含向該個體投與如請求項1至8中任一項之指環載體。
  22. 一種治療有需要個體之眼睛疾病或病症的方法，該方法包含向該個體投與如請求項1至8中任一項之指環載體。
  23. 一種向該個體眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(posterior eye cup；PEC)、視神經、視神經頭、玻璃體內空間、視網膜下腔、視網膜神經節或視網膜色素上皮(retinal pigmented epithelium；RPE))遞送效應子(例如，外源性效應子或內源性效應子，例如過度表現內源性效應子)之方法，該方法包含向該個體之該眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視神經、視神經頭、玻璃體內空間、視網膜下腔、視網膜神經節或視網膜色素上皮(RPE))投與指環病毒科家族載體(例如，指環載體)。
  24. 一種調節，例如增強或抑制該個體眼睛的(例如，該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視神經、視神經頭、玻璃體內空間、視網膜下腔、視網膜神經節或視網膜色素上皮(RPE)的)生物功能(例如，如本文所描述)之方法，該方法包含向該個體之該眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視神經、視神經頭、玻璃體內空間、視網膜下腔、視網膜神經節或視網膜色素上皮(RPE))投與如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物。
  25. 一種治療有需要個體之疾病或病症(例如，眼睛疾病或病症)的方法，該方法包含向該個體之眼睛(例如，向該個體之感光體、視網膜、後眼杯(PEC)、視神經、視神經頭、玻璃體內空間、視網膜下腔、視網膜神經節或視網膜色素上皮(RPE))投與如前述實施例中任一項之指環病毒科家族載體(例如，指環載體)或醫藥組合物。
  26. 一種經眼遞送系統，其包含指環病毒科家族載體(例如，指環載體，例如如本文所描述)。
  27. 一種遺傳元件，其包含(例如，呈5'至3'順序)： (i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1至71，或與其具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列； (ii) ORF2核酸序列之5'部分； (iii)啟動子元件； (iv)編碼外源性效應子(例如，治療性外源性效應子)之核酸序列；及 (v) ORF1核酸序列之3'部分； 或(i)至(v)之互補序列； 其中該遺傳元件未編碼全長ORF1多肽或全長ORF2多肽。
  28. 一種遺傳元件，其包含(例如，呈5'至3'順序)： (i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1至71，或與其具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列； (ii) ORF1核酸序列之5'部分； (iii)啟動子元件； (iv)編碼外源性效應子(例如，治療性外源性效應子)之核酸序列；及 (v) ORF1核酸序列之3'部分； 或(i)至(v)之互補序列； 其中該遺傳元件未編碼全長ORF1多肽。
TW111138702A 2021-10-12 2022-10-12 新穎指環載體(anellovector)組合物及方法 TW202334431A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163254854P 2021-10-12 2021-10-12
US63/254,854 2021-10-12
US202263320515P 2022-03-16 2022-03-16
US63/320,515 2022-03-16
PCT/US2022/077923 WO2023064781A1 (en) 2021-10-12 2022-10-11 Novel anellovector compositions and methods
WOPCT/US22/77923 2022-10-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202334431A true TW202334431A (zh) 2023-09-01

Family

ID=85988034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111138702A TW202334431A (zh) 2021-10-12 2022-10-12 新穎指環載體(anellovector)組合物及方法

Country Status (4)

Country Link
AU (1) AU2022366936A1 (zh)
CA (1) CA3235445A1 (zh)
TW (1) TW202334431A (zh)
WO (1) WO2023064781A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2653562A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-23 Institut Pasteur Anellovirus genome quantification as a biomarker of immune suppression
CN106867972A (zh) * 2015-12-11 2017-06-20 上海交通大学医学院附属第九人民医院 小细环病毒及其获得方法和应用
BR112021010925A2 (pt) * 2018-12-12 2021-08-31 Flagship Pioneering Innovations V, Inc Anelossomos para entrega de modalidades terapêuticas de substituição de proteína
US11166996B2 (en) * 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022366936A1 (en) 2024-05-02
WO2023064781A1 (en) 2023-04-20
CA3235445A1 (en) 2023-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111108208A (zh) 包含愈合子的组合物及其用途
US20220073950A1 (en) Anellosomes for delivering protein replacement therapeutic modalities
JP2021530227A (ja) 非症候性感音性聴力喪失の治療方法
US20230048858A1 (en) Anellosomes for delivering secreted therapeutic modalities
JP2023153320A (ja) Ｃｌｒｎ１に関連する聴力喪失及び／または視力喪失を治療する方法
US20220372519A1 (en) In vitro assembly of anellovirus capsids enclosing rna
US20240000914A1 (en) Chicken anemia virus (cav)-based vectors
US20230340527A1 (en) Baculovirus expression systems
TW202334431A (zh) 新穎指環載體(anellovector)組合物及方法
TW202417632A (zh) 新穎指環病毒科(anelloviridae)載體組合物及方法
US20230227849A1 (en) Methods of identifying and characterizing anelloviruses and uses thereof
US20240123083A1 (en) Hybrid aav-anellovectors
US20230348933A1 (en) Tandem anellovirus constructs
WO2023178177A2 (en) Novel anelloviridae family vector compositions and methods
TW202403047A (zh) 包含經修飾之指環病毒衣殼蛋白之組合物及其用途
CN116829723A (zh) 基于鸡贫血病毒（cav）的载体