TW202234064A - 含抗cd3分子的擴散梯度測定 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了鑒定、選擇和表徵表現和分泌不含Fc的生物分子的細胞之材料和方法。

Description

含抗CD3分子的擴散梯度測定
目前處於開發中的候選治療性生物製劑的數量的日益增加提高了從製程開發操作到遞送該等藥物的創新解決方案的需求。使用活細胞系統製造了大量生物製劑，其中哺乳動物中國倉鼠卵巢（CHO）細胞主要用於生產重組蛋白治療劑，例如單株抗體或其他抗體形式（Wurm, F. M., Nat Biotechnol [自然生物技術] 2004, 22 (11), 1393-8）。典型的哺乳動物細胞系開發（CLD）過程始於用編碼目的轉基因的DNA構建體轉染宿主細胞，然後進行選擇和擴增（如果需要）以遞送表現所需治療性蛋白質的穩定細胞庫。為了滿足監管要求並確保治療性蛋白質生產的安全和穩健過程，過程細胞系必須衍生自單細胞（single cell）（Frye, C. 等人, Biologicals [生物製劑] 2016, 44 (2), 117-22；以及Le K, Tan C, Le H等人Assuring Clonality on the Beacon Digital Cell Line Development Platform. [確保信標數位細胞系開發平臺上的選殖性] Biotechnol J. [生物技術雜誌] 2020; 15 (1): e1900247）。用於單細胞殖株的細胞庫群體係高度異質的，就此而言生產具有令人滿意的產品品質特徵的大量蛋白質的細胞表現不佳。因此，需要進行經驗篩選工作來鑒定和分離具有所需產品品質屬性的高品質選殖細胞系。通常，殖株篩選研究相當具有挑戰性且係資源密集型，因為需要評價成百上千個殖株以鑒定適合於臨床和商業製造的高品質候選細胞系（Wurm, F. M., Nat Biotechnol. [自然生物技術]）。
Berkeley Light公司的最近開發的Beacon®技術平臺適用於細胞系開發操作，並能夠在單細胞水平上評估細胞生長和期望的分泌特徵。Beacon®儀器係完全集成的奈米流體細胞培養系統，其允許在單個奈米流體晶片上分離多達1758個選殖細胞系。BLI平臺配備有內置螢光顯微鏡功能，使得能夠開發奈米級的螢光測定以表徵晶片上生長的細胞群。裝載到奈米流體晶片中的細胞在單個圍欄（pen）中分離，並且可以同時培養和測定重組蛋白分泌。基於期望的生長和分泌特徵選擇候選殖株，從晶片匯出並進行放大。Beacon®平臺最近被用於富集適於臨床和商業生產、同時具有高選殖性保證的高品質殖株（Le K等人, Biotechnol Prog. [生物技術進展] 2018; 34 (6): 1438-1446；以及Le K等人, Biotechnol J. [生物技術雜誌] 2020; 15 (1): e1900247）。
利用BLI平臺的標準CLD工作流程允許選擇高產細胞系，該細胞系表現治療性生物製劑（其蛋白質序列中存在人Fc或人κ輕鏈結構域）。通過BLI的基於擴散的Spotlight™ Hu3或SpotLight人κ測定，可以促進對表現出所需分泌表型的細胞系的篩選，該等測定允許在奈米流體晶片上檢測蛋白質並評估單個殖株的分泌能力。Berkeley Light公司的擴散測定試劑含有螢光標記的探針，該探針與存在於治療模式子集如單株抗體中的人Fc或人κ輕鏈結構域結合。該測定依賴於圍欄中螢光試劑的差異保留，其可以藉由螢光顯微鏡檢測並提供重組蛋白分泌的定量測量。螢光探針的小分子量允許其快速擴散和有效的晶片上平衡。將測定試劑在培養基中稀釋並灌注到晶片上，在晶片上其擴散到每個圍欄中並與分泌的蛋白產物中存在的靶結構域結合。結果，形成由靶蛋白和擴散測定試劑組成的高分子量複合物。當達到平衡時用培養基沖洗晶片，並且在該過程中未結合的測定試劑快速地從圍欄中擴散出去。相反，與分泌的蛋白複合的擴散試劑由於較大的分子量導致擴散速率較慢，被保留在圍欄中。對應於Spotlight™ Hu3-Fc結構域或SpotLight人κ-κ輕鏈複合物的螢光強度在圍欄中進行檢測並可測量重組蛋白分泌水平。
使用Berkeley Lights擴散測定進行細胞系篩選的一個重大限制係該等測定只能應用於表現重組蛋白（如抗體或其他含有人Fc或人κ輕鏈的抗體形式）子集的細胞。然而，由於分子形式或蛋白質序列工程化，存在大量的可能與Berkeley Lights公司提供的市售試劑不相容的重組蛋白質治療劑。雙特異性T細胞接合物（BiTE ®）分子係由兩種抗體的單鏈可變片段（scFv）組成的重組融合蛋白，並且被工程化以特異性識別兩種抗原：一種抗原通過與CD3受體的親和力而存在於T細胞表面，另一種抗原被發現存在於靶腫瘤細胞上（Baeuerle PA等人, Curr Opin Mol Ther. [分子治療當代觀點] 2009; 11 (1): 22-30；Frankel SR和Baeuerle PA. Curr Opin Chem Biol. [生物化學當代觀點] 2013; 17 (3): 385-392；以及Yuraszeck T等人, Clin Pharmacol Ther. [臨床藥理學與治療學] 2017; 101 (5): 634-645）。BiTE ®療法係一種抗癌治療，其被設計為使患者自身的免疫系統工作以對抗疾病。投與BiTE ®後，患者自身的T細胞被栓系於表現選定的腫瘤相關抗原的癌細胞，並因此誘導針對腫瘤的免疫反應。BiTE ®技術為開發針對實性惡性腫瘤和血液系統惡性腫瘤的治療提供了一種有前景的解決方案（Baeuerle PA等人, Curr Opin Mol Ther. [分子治療當代觀點] 2009; 11 (1): 22-30）。
因此，本領域需要開發表徵表現和分泌不含Fc的生物分子如經典BiTE ®分子的細胞之方法。
如本文所述，在各種實施方式中，本揭露提供用於從細胞群體中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞之方法。在一個實施方式中，本揭露提供了用於從細胞群體中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞之方法，該方法包括以下步驟：(a) 在奈米流體晶片的奈米流體室中從細胞群體中收集單細胞，其中所述細胞包含能夠表現所述生物分子的表現構建體；(b) 在允許所述生物分子的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養該單細胞，從而由單細胞殖株產生多個細胞；(c) 在允許CD3肽接觸由單細胞殖株的所述多個細胞分泌的所述生物分子的條件下，向所述奈米流體晶片投與包含所述CD3肽的組成物；(d) 檢測CD3肽與所述生物分子的結合；以及 (e) 從步驟 (b) 的多個細胞中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞。
在一個實施方式中，細胞群體係細胞系。在另一個實施方式中，細胞群體係兩種或更多種細胞系的混合物。在又另一個實施方式中，提供了上述方法，其還包括定量由單細胞系之所述多個細胞分泌的所述生物分子之量的步驟。
在又另一個實施方式中，本揭露提供上述方法，其中該細胞選自由哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、酵母細胞和真菌細胞組成之群組。在一些實施方式中，細胞選自由中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人胚腎（HEK）細胞、鼠骨髓瘤（NS0、Sp2/0）細胞、幼倉鼠腎（BHK）細胞、人胚腎（293）細胞、纖維肉瘤（HT-1080）細胞、人胚視網膜（PER.C6）細胞、雜交腎和B細胞（HKB-11）、CEVEC羊水細胞生產（CAP）細胞和人肝（HuH-7）細胞組成之群組。
在另一個實施方式中，本揭露提供上述方法，其中所述生物分子包含多肽。在一個實施方式中，多肽係重組的。在一些實施方式中，多肽選自由抗體、肽體、多特異性蛋白、雙特異性蛋白、雙特異性T細胞接合物、半衰期延長的雙特異性T細胞接合物及其生物活性片段、類似物和衍生物組成之群組。
在又另一個實施方式中，本揭露提供了上述方法，其中該生物分子係BiTE並且還能夠結合選自由CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、CD19、FLT3、CDH3、BCMA、PSMA、MUC17、CLDN18.2、EpCAM、CEA、Her2、CD20和CD70組成之群組的靶分子。
在又另一個實施方式中，本揭露提供上述方法，其中所述CD3肽包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。在一個實施方式中，CD3肽包含10個胺基酸。在另一個實施方式中，CD3肽包含胺基酸序列焦麩胺酸-DGNEEMGGC（SEQ ID NO: 1）。
在又另一個實施方式中，本揭露提供上述方法，其中所述CD3肽係包含至少一個修飾的CD3肽軛合物。在一個實施方式中，修飾包括連接所選擇的檢測部分，其中所述檢測部分係螢光團。在一個實施方式中，螢光團選自由AF594和AF488組成之群組。在又另一個實施方式中，使用馬來醯亞胺連接子將AF594連接到序列焦麩胺酸-DGNEEMGGC（SEQ ID NO: 1）的C末端半胱胺酸。
在又另一個實施方式中，本揭露提供上述方法，其中所述表現構建體選自由載體、質體和線性化DNA表現序列組成之群組。在又其他實施方式中，上述方法在14天或更短時間內完成。
在另一個實施方式中，本揭露提供上述方法，其中所述奈米流體晶片包含1,000至2,000個奈米流體室。在一個實施方式中，奈米流體晶片包括1758個奈米流體室。
在又另一個實施方式中，本揭露提供用於從細胞群體中分離分泌能夠結合CD3肽的雙特異性T細胞接合物的至少一個細胞之方法，該方法包括以下步驟：(a) 在奈米流體晶片的奈米流體室中收集單細胞，其中所述細胞包含能夠表現所述雙特異性T細胞接合物的表現構建體；(b) 在允許所述雙特異性T細胞接合物的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養該單細胞，從而由單細胞殖株產生多個細胞；(c) 在允許CD3肽接觸由單細胞系的所述多個細胞分泌的所述雙特異性T細胞接合物的條件下，向所述奈米流體晶片投與包含所述CD3肽的組成物；(d) 檢測CD3肽與所述雙特異性T細胞接合物的結合；以及 (e) 從步驟 (b) 的多個細胞中分離分泌能夠結合CD3肽的雙特異性T細胞接合物的至少一個細胞；其中所述CD3肽係CD3肽軛合物並且包含胺基酸序列焦麩胺酸-DGNEEMGGC（SEQ ID NO: 1），其中AF594連接至所述序列的C末端半胱胺酸。
在又另一個實施方式中，本揭露提供了產生能夠結合CD3肽的生物分子之方法，該方法包括以下步驟：(a) 在奈米流體晶片的奈米流體室中從細胞群體中收集單細胞，其中所述細胞包含能夠表現所述生物分子的表現構建體；(b) 在允許所述生物分子的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養該單細胞，從而由單細胞殖株產生多個細胞；(c) 在允許CD3肽接觸由單細胞系的所述多個細胞分泌的所述生物分子的條件下，向所述奈米流體晶片投與包含所述CD3肽的組成物；(d) 檢測CD3肽與所述生物分子的結合；(e) 從步驟 (b) 的多個細胞中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞；以及 (f) 將所述至少一個細胞從細胞系轉移到容器中，並在允許所述生物分子產生的條件下培養所述細胞。
在又另一個實施方式中，本揭露提供了用於從細胞群體中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞之方法，該方法包括以下步驟：(a) 在奈米流體晶片的奈米流體室中從細胞群體中收集單細胞，其中所述細胞包含能夠表現所述生物分子的表現構建體；(b) 在允許所述生物分子的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養該單細胞，從而由單細胞殖株產生多個細胞；(c) 在允許CD3肽接觸由單細胞系的所述多個細胞分泌的所述生物分子的條件下，向所述奈米流體晶片投與包含所述CD3肽的第一組成物和包含生物分子結合劑的第二組成物；(d) 檢測該CD3肽和生物分子結合劑與所述生物分子的結合；以及 (e) 從步驟 (b) 的多個細胞中分離分泌能夠結合CD3肽及視需要生物分子結合劑的生物分子的至少一個細胞。在一些實施方式中，上述方法允許從細胞或細胞系的混合物或細胞或細胞系的混合群體中分離至少一個細胞。在一些實施方式中，細胞群體來自一種細胞系。
本揭露藉由提供可用於表徵表現和分泌不含Fc的生物分子的細胞之方法和材料來解決本領域中的上述需要。進一步增強這種需要，經典和半衰期延長的Fc軛合的BiTE ®分子在CHO細胞中都以低於單株抗體的水平表現。鑒定表現高水平BiTE ®分子的殖株的篩選方法可能繞過了低表現庫的障礙。
在一個實施方式中，本揭露提供了對CD3結合模式具有特異性的測定，其與使用Beacon®平臺的細胞系開發工作流程相容。對於該實施方式，製備CD3-肽軛合物並進行優化的晶片上擴散梯度測定以在奈米流體晶片上鑒定分泌CD3結合治療性生物製劑的殖株。該策略允許在奈米流體晶片上將分泌高水平CD3結合劑的殖株與低產量殖株，以及與分泌其他模式的細胞系區分。此外，當與通過標準工作流程衍生的殖株相比時，使用該測定法選擇的細胞系顯示相似的生長和分泌特徵。因此，本文提供的CD3擴散測定允許在奈米流體晶片上鑒定高分泌細胞系，並支持在一個實施方式中使用BLI平臺進行早期殖株選擇。在其他實施方式中，本揭露提供了可用於其他微流體裝置、基於細胞的微陣列、基於微量滴定板的篩選測定（例如ELISA）和使用珠封裝技術的基於液滴的篩選（包括基於光刻的微陣列和奈米孔輔助的細胞圖案化平臺）之方法和試劑（Love等人, Nat. Biotechnol. [自然生物技術], 24 (6) 703 (2006)；和Ozkumur等人, Materials Views [材料視圖], 11 (36), 4643-4650 (2015)）。
細胞系開發活動涉及數千個單個前驅細胞系，將其擴增並評價其對期望的治療性生物製劑的分泌。Berkeley Light Beacon®平臺係完全集成的奈米流體細胞培養系統，其使得使用者能夠在單個奈米流體晶片上同時培養、測定和生長多達1758個選殖細胞系。如本文所述，在一個實施方式中，Beacon®平臺推進細胞系開發（CLD）操作，並能夠在單細胞水平上評估生長和期望的分泌特徵。這允許選擇高品質的殖株，而不需要將數千個候選物擴大到生產規模，並使用標準測定進行篩選。對於晶片上分泌評估，Berkeley Lights公司開發了分別結合人Fc或人κ輕鏈結構域的Spotlight™ Hu3和Spotlight人κ測定試劑，然而，該方法僅適用於重組蛋白治療劑子集。因此，在一個實施方式中，本揭露提供了基於晶片上擴散的測定，其利用由CD3結合劑（例如經典雙特異性T細胞接合物）特異性識別的螢光團軛合肽，使得能夠在奈米流體晶片上鑒定高度分泌性殖株。如本文所揭露的，該測定提供了用於檢測各種CD3結合劑的特異性。此外，在另一個實施方式中，本揭露提供了一種雙靶向測定策略，其使用兩種螢光探針來檢測重組蛋白分泌並且能夠提高標準擴散梯度測定的靈敏度。
在一個實施方式中，本揭露提供了用於從細胞群體中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞之方法。如本文所用的短語「至少1個」可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個。在一些實施方式中，分離並測定數千個單個細胞。例如，在一些實施方式中，分離大約10、100、1,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000或11,000個或更多個細胞。在一些實施方式中，奈米流體晶片可容納更多數量的待分離的單個細胞，至多並包括例如85,000或250,0000個單個細胞。在一個實施方式中，在奈米流體晶片上分離1758個細胞。在一個實施方式中，「細胞群體」係單細胞系的細胞群體。在本揭露之一個實施方式中，可以選殖單細胞系。在其他實施方式中，細胞群體來自細胞系的混合物（例如，2種或更多種）（例如，混合的細胞群體）。
本文提供的生物分子能夠結合CD3蛋白或CD3肽。在一個實施方式中，本文所述之CD3蛋白和CD3肽對應於UniProt編號P07766。（關於本文考慮的CD3的額外資訊和序列還參見Clevers等人, Proc. Natl. Acad. Sci. [美國科學院院報], 85, 8156-8160 (1988) 和Borroto等人, J. Immunol. [免疫學雜誌], 163, (1), 25-31 (1999)）。CD3肽可包含足以促進本文所述方法中之結合的內源性人CD3ε蛋白的一部分。在一些實施方式中，CD3肽係全長CD3胺基酸序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個或更多個連續胺基酸。在一些實施方式中，CD3肽係全長CD3胺基酸序列的59、10、11、12、13或14個連續胺基酸。在一些實施方式中，可以修飾CD3肽胺基酸序列（例如，包括置換、缺失和/或插入突變和/或包括化學修飾）。在一些實施方式中，可以修飾CD3肽胺基酸序列以在一個或兩個末端包含載體蛋白。如本文所述，肽可視需要以合成方式軛合至焦麩胺酸。在另一個實施方式中，可以在內部或在一或多個肽末端添加一或多個半胱胺酸（C）殘基以促進化學修飾。例如，CD3肽包含序列DGNEEMGGC（SEQ ID NO: 1）。在一些實施方式中，添加C末端半胱胺酸和/或螢光團部分改善肽的溶解度。例如，雖然單獨的未修飾肽可為不溶性的，但添加半胱胺酸可允許螢光團軛合並增加溶解度。
因此，如本文所述，CD3肽可包含對以下序列或以下序列的部分（CD3ε的前27個N末端胺基酸）的修飾，包括但不限於一或多個置換、缺失和/或插入突變和/或包含標籤或化學修飾：QDGNE EMGGI TQTPY KVSIS GTTVI LT（SEQ ID NO: 2）。
本揭露還考慮了報告分子如螢光團與CD3肽的軛合。在一些實施方式中，螢光團帶電或高度帶電以使軛合肽具有溶解性。在一些實施方式中，螢光團具有與硫酸基團交換的羧基基團，因此在甚至低pH下具有較高溶解度。在一些實施方式中，在本文所述之方法中使用Alexa Fluor ®染料或Amersham™ CyDye™螢光染料或VivoTag ®螢光染料（Perkin Elmer）或DyLight ®螢光染料。例如，肽可以與ALEXA-FLUOR ®染料（賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific））（例如ALEXA-FLUOR ®488、ALEXA-FLUOR ®594、ALEXA-FLUOR ®555、ALEXA-FLUOR ®647）軛合。在一些實施方式中，本文考慮了ALEXA-FLUOR ®350、ALEXA-FLUOR ®405、ALEXA-FLUOR ®532、ALEXA-FLUOR ®546、ALEXA-FLUOR ®568、ALEXA-FLUOR ®、ALEXA-FLUOR ®700、ALEXA-FLUOR ®750、BODIPY FL、香豆素、Cy3、Cy5、Cy2、Cy3.5、Cy5.5、Cy7、螢光素（FITC）、俄勒岡綠（Oregon Green）、太平洋藍（Pacific Blue）、太平洋綠（Pacific Green）、太平洋橙（Pacific Orange）、PE-菁7（PE-Cyanine7）、PerCP-菁5.5（PerCP-Cyanine5.5）、四甲基玫瑰紅（TRITC）和/或德克薩斯紅（Texas Red），每個均可從賽默飛世爾科技公司獲得。
在一些實施方式中，ALEXA-FLUOR ®488或ALEXA-FLUOR ®594通過馬來醯亞胺介導的化學過程軛合至肽。
在其他實施方式中，可以使用以下示例性技術中的一或多種來修飾根據本揭露的肽：點擊化學、通過在肽合成期間包含以化學方式活化的螢光團進行直接軛合、螢光團與肽合成期間使用的人工胺基酸的共價偶合、和/或添加N末端離胺酸。
如本文所述，在一個實施方式中，本揭露提供的組成物和方法能夠鑒定能夠結合CD3蛋白或CD3肽的生物分子。在相關的實施方式中，生物分子係能夠結合CD3蛋白或CD3肽和本文所述之抗原靶標的雙特異性生物分子。
本文所用的術語「生物分子」係指由細胞產生的能夠與結合劑如本文所述之CD3肽結合的分子。根據本揭露之各種實施方式，生物分子包括但不限於抗體、肽體、融合蛋白、突變蛋白、多特異性蛋白、雙特異性蛋白、以及其生物活性片段、類似物、衍生物和變體、以及生物仿製藥。
「多特異性蛋白質」和「多特異性抗體」在本文中用於指重組工程化以同時與至少兩種不同抗原或同一抗原上的至少兩種不同表位特異性結合、中和和/或相互作用的蛋白質。例如，多特異性蛋白可以被工程化以與針對腫瘤的靶向細胞毒性劑或感染劑組合靶向免疫效應子。結合兩種抗原的多特異性蛋白質，在本文中稱為「雙特異性蛋白質」和「雙特異性抗體」，係最常見和多樣的多特異性蛋白質組。包括雙特異性抗體的雙特異性蛋白的形式包括但不限於四源融合瘤（quadromas）、杵臼結構（knobs-in-holes）、交叉單株抗體（cross-Mabs）、雙可變結構域IgG（DVD-IgG）、IgG-單鏈Fv（scFv）、scFv-CH3 KIH、雙功能Fab（DAF）、半-分子交換、κλ-體、串聯scFv、scFv-Fc、雙抗體、單鏈雙抗體（sc雙抗體）、sc雙抗體-CH3、三抗體、微型抗體、微型體、TriBi微型體、串聯雙抗體、sc雙抗體-HAS、串聯scFv-毒素、雙親和重定向分子（dual-affinity retargeting molecules，DARTs）、奈米抗體、奈米抗體-HSA、對接和鎖定（DNL）、股交換工程化結構域SEED體（SEEDbody）、三功能抗體（Triomab）、白胺酸拉鍊（LUZ-Y）、Fab-臂交換、DutaMab、DT-IgG、電荷對（charged pair）、Fcab、正交Fab、IgG(H)-scFv、scFV-(H)IgG、IgG(L)-scFV、IgG(L1H1)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFV-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zy體、DVI-Ig4（四位一體）、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFV、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙抗體-Fc、雙抗體-Fc、胞內抗體、ImmTAC、HSA體（HSABody）、IgG-IgG、Cov-X-體、scFv1-PEG-scFv2、使用XmAb ®技術製造的分子、雙特異性T細胞接合物（BiTE ®）和半衰期延長的雙特異性T細胞接合物（HLE BiTE ®）（Fan, 同上；Spiess, 同上；Sedykh, 同上；Seimetz等人, Cancer Treat Rev [癌症治療評論] 36 (6) 458-67, 2010；Shulka和Norman, 第26章Downstream Processing of Fc Fusion Proteins, Bispecific Antibodies, and Antibody-Drug Conjugates [Fc融合蛋白、雙特異性抗體和抗體藥物軛合物的下游處理], 在第二版Process Scale Purification of Antibodies [抗體的生產規模純化] 中, Uwe Gottswchalk編輯, p559-594, John Wiley & Sons [約翰威立父子公司], 2017；Moore等人, MAbs 3: 6，546-557，2011）。
雙特異性蛋白還包括三特異性抗體、四價雙特異性抗體、不含抗體組分多特異性蛋白（如雙抗體、三抗體或四抗體、微型體）、和能夠結合多個靶標的單鏈蛋白等。Coloma, M.J. 等人, Nature Biotech [自然生物技術]. 15 (1997) 159-163。
在一些實施方式中，雙特異性蛋白可以包括博納吐單抗、卡妥索單抗、厄妥索單抗、索利托單抗、targomiRs、魯吉珠單抗（ABT981）、伐努賽珠單抗（RG7221）、壬托魯單抗（ABT122）、ozoralixumab（ATN103）、floteuzmab（MGD006）、帕妥昔珠單抗（AMG112、MT112）、lymphomun（FBTA05）、（ATN-103）、AMG211（MT111、Medi-1565）、AMG330、AMG420（B1836909）、AMG-110（MT110）、MDX-447、TF2、rM28、HER2Bi-aATC、GD2Bi-aATC、MGD006、MGD007、MGD009、MGD010、MGD011（JNJ64052781）、IMCgp100、銦標記的IMP-205、xm734、LY3164530、OMP-305BB3、REGN1979、COV322、ABT112、ABT165、RG-6013（ACE910）、RG7597（MEDH7945A）、RG7802、RG7813（RO6895882）、RG7386、BITS7201A（RG7990）、RG7716、BFKF8488A（RG7992）、MCLA-128、MM-111、MM141、MOR209/ES414、MSB0010841、ALX-0061、ALX0761、ALX0141；BII034020、AFM13、AFM11、SAR156597、FBTA05、PF06671008、GSK2434735、MEDI3902、MEDI0700、MEDI7352、以及其分子或變體或類似物，和上述任何一種的生物仿製藥。
本文所用的「生物活性衍生物」或「生物活性變體」包括具有與所述分子基本相同的功能和/或生物學性質（例如結合性質）和/或相同的結構基礎（例如肽主鏈或基本聚合單元）的分子的任何衍生物或變體。
「類似物」，例如「變體」或「衍生物」，係與天然存在的分子在結構上基本相似並且具有相同生物活性（儘管在某些情況下程度不同）的化合物。例如，多肽變體係指與參考多肽共用基本相似的結構並具有相同生物活性的多肽。基於一或多個突變，與衍生該類似物的天然存在的多肽相比，變體或類似物在其胺基酸序列組成上不同，該等突變包括 (i) 在多肽的一或多個末端和/或天然存在的多肽序列的一或多個內部區域（例如片段）缺失一或多個胺基酸殘基，(ii) 在多肽的一或多個末端（典型地「添加」或「融合」）和/或天然存在的多肽序列的一或多個內部區域（典型地「插入」）插入或添加一或多個胺基酸或 (iii) 在天然存在的多肽序列中用一或多個胺基酸置換其他胺基酸。例如，「衍生物」係一種類似物，係指與參考多肽具有相同或基本相似結構的已被修飾（例如化學修飾）的多肽。
變體多肽係一種類似物多肽並且包括插入變體，其中一或多個胺基酸殘基被添加到本發明之生物分子胺基酸序列中。插入可以位於蛋白質的一個或兩個末端，和/或可以位於治療性蛋白質胺基酸序列的內部區域。在任一個或兩個末端具有額外殘基的插入變體包括例如融合蛋白和包括胺基酸標籤或其他胺基酸標記的蛋白。在一個方面，生物分子視需要含有N末端Met，特別是當分子在細菌細胞如大腸桿菌中重組表現時。在另一個方面，生物分子包含組胺酸標籤（His-tag）。
在缺失變體中，如本文所述之生物分子多肽中的一或多個胺基酸殘基被去除。可以在治療性蛋白質多肽的一個或兩個末端進行缺失，和/或去除治療性蛋白質胺基酸序列內的一或多個殘基。因此，缺失變體包括治療性蛋白質多肽序列的片段。
在置換變體中，生物分子的一或多個胺基酸殘基被去除並用替代殘基替換。在一個方面，置換本質上是保守的，並且這種類型的保守置換係本領域公知的。或者，本發明包括也是非保守的置換。示例性保守置換描述於Lehninger, [Biochemistry [生物化學], 第二版；Worth Publishers公司, 紐約 (1975), 第71-77頁] 中並在下面陳述。
如本文所用，「特異性結合」的生物分子為「抗原特異性的」、「對抗原靶標具有特異性」或與抗原「免疫反應」係指生物分子以比相似序列的其他抗原更大的親和力結合抗原。在一方面，生物分子或其片段、變體、或衍生物，與其對其他（即非人類）物種的類似抗原的結合親和力相比，將以更大的親和力與人抗原結合，但識別和結合靶標的同源物的多肽結合劑也在本發明之範圍內。
術語「表位」係指任何分子中能夠被生物分子識別和結合的部分。表位通常由以下組成：分子例如胺基酸或碳水化合物側鏈的化學活性表面分組，並且具有特定的三維結構特徵、以及特定的電荷特徵。如本文所用的表位可為連續的或不連續的。
本文考慮的生物分子包括全長蛋白質、全長蛋白質的先質、全長蛋白質的生物活性亞基或片段、以及該等形式的治療性蛋白質中任一種的生物活性衍生物和變體。因此，生物分子包括（1）其胺基酸序列在至少約25個、約50個、約100個、約200個、約300個、約400個或更多個胺基酸的區域上與由本文所述之參考核酸或胺基酸序列編碼的多肽具有大於約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%或更大的胺基酸序列同一性的那些。根據本揭露，術語「重組生物分子」包括通過重組DNA技術獲得的任何生物分子。在某些實施方式中，該術語包括本文所述之蛋白質。
在一些實施方式中，目的生物分子與CD3蛋白或肽和一或多種其他蛋白特異性結合、中和和/或相互作用，該等其他蛋白為例如HER受體家族蛋白、CD蛋白、細胞黏附分子、生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子（TGF）、胰島素樣生長因子、骨誘導因子、胰島素和胰島素相關蛋白、凝血和凝血相關蛋白、集落刺激因子（CSF）、其他血液和血清蛋白血型抗原；受體、受體相關蛋白、生長激素、生長激素受體、T細胞受體；神經營養因子、神經營養蛋白、鬆弛素（relaxin）、干擾素、介白素、病毒抗原、脂蛋白、整聯蛋白、類風濕因子、免疫毒素、表面膜蛋白、運輸蛋白、歸巢受體、位址素、調節蛋白和免疫黏附素。
在一些實施方式中，目的生物分子單獨或以任何組合與CD3蛋白和以下一或多種結合、中和和/或相互作用：CD蛋白（包括但不限於CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171和CD174）、HER受體家族蛋白（包括例如HER2、HER3、HER4和EGF受體）、EGFRvIII、細胞黏附分子（例如LFA-1、Mol、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和α v/β 3整聯蛋白）、生長因子（包括但不限於例如血管內皮生長因子（「VEGF」））；VEGFR2、生長激素、促甲狀腺激素、卵泡刺激素、黃體生成素、生長激素釋放因子、甲狀旁腺激素、米勒管抑制物質（mullerian-inhibiting substance）、人巨噬細胞炎性蛋白（MIP-1-α）、促紅血球生成素（EPO）、神經生長因子（如NGF-β）、血小板源性生長因子（PDGF）、成纖維細胞生長因子（包括例如aFGF和bFGF）、表皮生長因子（EGF）、Cripto、轉化生長因子（TGF）（尤其包括TGF-α和TGF-β（包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5））、胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-II（IGF-I和IGF-II）、des(1-3)-IGF-I（腦IGF-I）和骨誘導因子、胰島素和胰島素相關蛋白（包括但不限於胰島素、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素原和胰島素樣生長因子結合蛋白）；（凝血蛋白和凝血相關蛋白，尤其如，VIII因子、組織因子、馮威里氏（von Willebrand）因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶原激活劑（如尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑（「t-PA」））、邦巴辛（bombazine）、凝血酶、血小板生成素和血小板生成素受體、集落刺激因子（CSF）（尤其包括以下物質：M-CSF、GM-CSF和G-CSF）、其他血液和血清蛋白（包括但不限於白蛋白、IgE和血型抗原）、受體和受體相關蛋白（包括例如flk2/flt3受體、肥胖（OB）受體、生長激素受體和T細胞受體）；神經營養因子，包括但不限於骨源性神經營養因子（BDNF）和神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5或神經營養蛋白-6（NT-3、NT-4、NT-5或NT-6）；鬆弛素A鏈、鬆弛素B鏈和鬆弛素原、干擾素（包括例如干擾素α、干擾素β和干擾素γ）、介白素（IL）（例如IL-1至IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23、IL-12/IL-23、IL-2Ra、IL1-R1、IL-6受體、IL-4受體和/或IL-13受體、IL-13RA2或IL-17受體、IL-1RAP；病毒抗原，包括但不限於AIDS有包膜病毒抗原、脂蛋白、降鈣素、升糖素、心房利尿鈉因子、肺界面活性劑、腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子-β、腦啡肽酶、BCMA、STEAP1、IgKappa、ROR-1、ERBB2、間皮素、RANTES（受激活調節的正常T細胞表現與分泌因子）、小鼠促性腺激素相關肽、DNA酶、FR-α、抑制素和激活素、整合素、蛋白A或D、類風濕因子、免疫毒素、骨成形性蛋白質（BMP）、超氧化物歧化酶、表面膜蛋白、衰變加速因子（DAF）、AIDS包膜、運輸蛋白、歸巢受體、MIC（MIC-a、MIC-B）、ULBP 1-6、EPCAM、位址素、調節蛋白、免疫黏附素、抗原結合蛋白、生長激素、CTGF、CTLA4、嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin）-1、MUC1、CEA、c-MET、密蛋白（Claudin）-18、GPC-3、EPHA2、FPA、LMP1、MG7、NY-ESO-1、PSCA、神經節苷脂GD2、神經節苷脂GM2、BAFF、OPGL（RANKL）、肌生成抑制素、Dickkopf-1（DKK-1）、Ang2、NGF、IGF-1受體、肝細胞生長因子（HGF）、TRAIL-R2、c-Kit、B7RP-1、PSMA、NKG2D-1、計畫性細胞死亡蛋白1和配體、PD1和PDL1、甘露糖受體/hCGβ、TNF、TL1A、C型肝炎病毒、間皮素dsFv[PE38軛合物、嗜肺軍團菌（lly）、IFN γ、γ干擾素誘導蛋白10（IP10）、IFNAR、TALL-1、胸腺基質淋巴球生成素（TSLP）、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型（PCSK9）、幹細胞介素、Flt-3、降鈣素基因相關肽（CGRP）、OX40L、α4β7、血小板特異性（血小板糖蛋白Iib/IIIb（PAC-1）、轉化生長因子β（TFGβ）、透明帶精子結合蛋白3（ZP-3）、TWEAK、血小板衍生的生長因子受體α（PDGFRα）、硬化蛋白（sclerostin）、以及任何前述內容的生物活性片段或變體。
在一些實施方式中，生物分子包括雙特異性蛋白質，特別是特異性結合CD3與CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、FLT3、CDH3、PSMA、MUC1、CLDN18.2、CD70、EpCAM、CEA、BCMA、Her2和CD20組合的BiTE ®分子和HLE BiTE ®分子。
本揭露還考慮組成物和使用各自包含如本文所述之不同結合劑的兩種或更多種組成物之方法。在一些實施方式中，包含CD3肽的第一組成物與包含結合目的生物分子的不同部分或表位的結合劑的一或多種組成物組合使用。在此，結合劑可以軛合至（不同的）螢光團或如本文描述以其他方式修飾。在各種實施方式中，除CD3肽外，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種或更多種結合劑用於本文所述之方法中。
如本文所用，在各種實施方式中，「細胞」可為真核細胞、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、單核細胞、周邊血單核細胞、骨髓來源的單核細胞、臍帶血來源的單核細胞、淋巴球、單核細胞、樹突細胞、巨噬細胞、T細胞、初始T細胞、記憶T細胞、CD28 +細胞、CD4 +細胞、CD8 +細胞、CD45RA +細胞、CD45RO +細胞、自然殺手細胞、造血幹細胞、多能胚胎幹細胞、誘導型多能幹細胞或植物細胞。其他示例性細胞系包括由SV40（COS-7，ATCC CRL 1651）轉化的猴腎CVl系；人胚胎腎系（293細胞或亞選殖用於在懸浮培養中生長的293細胞，Graham等人, J. Gen Virol. [普通病毒學雜誌] 36: 59, 1977)；幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；小鼠塞托利細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod. [生殖生物學] 23: 243-251, 1980）；猴腎細胞（CVl ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝癌細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TRI細胞（Mather等人, Annals N.Y Acad. Sci. [紐約科學院年報] 383: 44-68, 1982）；MRC 5細胞或FS4細胞；哺乳動物骨髓瘤細胞、人肝（HuH-7）細胞、CEVEC的羊水細胞生產（CAP）細胞、雜交腎和B細胞（HKB-11）、纖維肉瘤（HT-1080）細胞、人胚胎腎（HEK）細胞、人胚胎視網膜（PER.C6）細胞和中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、以及用於臨床和/或商業製造的任何其他細胞。在一個實施方式中，細胞或細胞系可為畢赤酵母。
如本文所用，「奈米流體晶片的奈米流體室」係指能夠分離單細胞的奈米流體裝置的一部分或區段。例如，奈米流體室可為與如本文所述之Berkeley Light公司的Beacon®技術平臺相關聯的圍欄。在一些實施方式中，奈米流體晶片或裝置包含成百上千個單獨的圍欄或室，每個圍欄或室能夠分離單細胞。在一些實施方式中，奈米流體裝置或晶片包含1758個室（或圍欄或孔）、3,500個室或11,000個室。
另外的單細胞分選和分析平臺也預期與本揭露之試劑和材料一起使用。在一個實施方式中，考慮基於光刻的微陣列或奈米孔輔助的細胞圖案化平臺（Love等人, Nat. Biotechnol. [自然生物技術], 24 (6) 703 (2006)；以及Ozkumur等人, Materials Views [材料視圖], 11 (36), 4643-4650 (2015)）。因此，在一些實施方式中，奈米流體裝置或晶片包含1758個室，本文考慮85,000或250,000個室。
本文所用的術語「表現構建體」係指本領域常規用於蛋白質重組表現的載體、質體或線性化DNA表現序列。
本揭露還考慮了用於產生生物分子之方法。例如，在一個實施方式中，能夠結合CD3肽的生物分子藉由在奈米流體晶片的奈米流體室中從細胞群體中收集單細胞來產生，其中該細胞包含能夠表現該生物分子的表現構建體。在允許生物分子的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養單細胞後，在允許CD3肽接觸分泌的生物分子的條件下將包含如本文所述之CD3肽的組成物投與至奈米流體晶片。接著，分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞，並轉移到容器中以在允許產生生物分子的條件下培養。在各種實施方式中，「容器」可包括適於細胞培養的容器，包括多孔板、搖瓶、旋轉管、滾瓶、透氣培養袋、透氣生物反應器、不透氣生物反應器、流化床生物反應器、中空纖維生物反應器和用於所需生產水平的合適規模的攪拌罐生物反應器。
在進一步描述本發明之前，應當理解，本發明不限於所描述的特定實施方式，因此當然可以變化。還應當理解，文中使用的術語僅用於描述特定實施方式的目的，而不旨在是限制性的，因為本發明之範圍將僅由所附請求項限制。
在提供值範圍的情況下，應當理解，在該範圍的上限和下限之間的每個中間值（除非上下文另有明確說明，至下限單位的十分之一），以及在所述範圍內的任何其他所述或中間值都包括在本發明內。該等較小範圍的上限和下限可以獨立地包括在較小範圍內，並且也包括在本發明內，受制於所述範圍內任何特別排除的限制。在所述範圍包括一個或兩個限制的情況下，排除那些包括的限制中的任一個或兩個的範圍也包括在本發明中。
除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的普通技術者通常所瞭解的含義相同的含義。儘管在本發明之實踐或測試中也可以使用與本文所述之那些類似或等效的任何方法和材料，但現在描述較佳的方法和材料。本文提及的所有出版物藉由引用併入本文以揭露和描述與所引用的出版物相關的方法和/或材料。
必須注意的是，如本文和所附請求項中所使用的，單數形式「一種/個（a/an）」和「該」包括複數指示物，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「構象轉換探針」包括多個這種構象轉換探針，提及「微流體裝置」包括提及一或多個微流體裝置及其熟悉該項技術者已知的等效物，等等。進一步要注意的是，可以將申請專利範圍撰寫為排除任何要素，例如任何可選的要素。因此，此陳述旨在作為與請求項要素的敘述有關的如「只」，「僅」等排他性術語的使用或「否定型」限制的使用的前提基礎。
如在閱讀本揭露內容時對熟悉該項技術者顯而易見的，本文所述和說明的單個實施方式中的每一個具有離散組分和特徵，其可以易於與其他若干實施方式中的任一個的特徵分離或組合而不脫離本發明之範圍或精神。任何所述方法可以按敘述事件的順序或邏輯上可能的任何其他順序進行。這旨在為所有該等組合提供支持。 實例
以下材料和方法與以下實例1聯合使用。 CD3肽螢光染料軛合物的設計和合成
使用天然人CD3e肽胺基酸序列的前9個n末端胺基酸（使用的CD3肽序列：QDGNEEMGG（SEQ ID NO: 1））。肽在德國麥德堡公司（Metabion GmbH, 普拉內格, 德國）合成，包括以下修飾：N末端麩醯胺酸（Q）轉化為焦麩胺酸，將半胱胺酸添加到肽的C末端，並將C末端醯胺化。將合成的肽溶解在85%水、10%二甲基甲醯胺DMF、5%乙腈的混合物中。將Alexa Fluor C5 488馬來醯亞胺溶解在DMF中。以兩份螢光染料與一份肽的莫耳比加入溶解的Alexa Fluor C5 488馬來醯亞胺螢光染料。藉由將反應容器在室溫下在黑暗中混合1小時進行孵育。將Superdex Peptide 10/300 GL柱（GE醫療公司, 弗萊堡, 德國）連接到Äkta Explorer FPLC系統（GE醫療公司, 弗萊堡, 德國），並用由含有5% DMSO的磷酸鹽緩衝鹽水PBS組成的緩衝液以0.5 ml/min的流速平衡。將檢測設定為280和490 nm波長的線上光吸收。將1 ml反應混合物注入連接的樣本環並施加到柱上，隨後使用0.5 ml/min的流速進行等度洗脫。使用連接的級分收集器以0.5 ml大小的級分收集洗脫體積。將含有肽-螢光染料軛合物的第一洗脫峰合並且等分。 細胞培養上清液中經典BiTE ®的檢測
將100 μl含有以人CD3e結合結合劑為特徵的表現的BiTE ®構建體的0.2 μm過濾的哺乳動物細胞培養樣本與2.5 μl肽-螢光染料軛合物混合，並轉移到自動進樣器小瓶中。將小瓶置於與以螢光檢測器為特徵的超高效液相層析ACQUITY UPLC裝置（沃特斯公司（Waters）, 埃施波恩, 德國）連接的自動進樣器上。將分析型粒徑排阻層析BEH200 SEC 1.7 µm柱（沃特斯公司, 埃施波恩, 德國）連接至UHPLC並且用含有10 mM檸檬酸、75 mM離胺酸HCl（調節至pH 7.0）的水基緩衝系統平衡。將10 μl每個製備的樣本施加到柱上並使用等度洗脫進行洗脫。藉由使用490 nm激發波長和520 nm發射波長下的螢光檢測進行檢測。藉由比較由注射純化的單體和二聚體經典BiTE ®構建體產生的層析圖中的洗脫時間作為不同經典BiTE ®種類的洗脫時間的參考來進行評價。 使用Berkeley Lights Beacon®儀器進行細胞選殖
根據前述程序實施單細胞選殖方法。（Le K等人, Biotechnol Prog. [生物技術進展] 2018; 34 (6): 1438-1446；以及Le K等人, Biotechnol J. [生物技術雜誌] 2020; 15 (1): e1900247。）簡單地說，使用Beacon®儀器並利用加利福尼亞州埃默里維爾Berkeley Lights公司提供的標準細胞系開發工作流程，將穩定細胞系單細胞載入到OptoSelect晶片（設計1758, Berkeley Lights, 埃默里維爾, 加利福尼亞州）上。使用Beacon®平臺內置的集成4X物鏡和相機對細胞進行成像以監測細胞生長。使用專有生長培養基和製造商推薦的設置對細胞進行灌注培養。 Spotlight®Hu3測定
使用Berkeley Lights公司提供並以製造商推薦的濃度使用的Spotlight®Hu3測定試劑進行Spotlight®Hu3分泌測定。根據Berkeley Lights公司建立的建議執行測定工作流程。在圖4B中，將測定數據手動歸一化為平均Au得分，該平均Au得分藉由集成到Beacon®平臺中的Berkeley Lights CAS軟體對空圍欄計算得出。 CD3擴散測定
將CD3擴散測定肽試劑以1 mg/ml重懸於DMSO中並避光儲存在-20°C下以長期儲存。對於短期儲存，將測定試劑在PBS中進一步稀釋至4 μg/ml並儲存在4°C下。在執行擴散梯度測定以檢測奈米流體晶片上的BiTE ®分泌之前，將CD3擴散測定試劑在細胞培養基中稀釋至0.2 μg/ml濃度，通過22 μm過濾器過濾，轉移至96孔板並加入晶片上。以0.014 μl/秒流速將測定試劑灌注到晶片上，持續45分鐘。在圖4中，一旦平衡步驟完成，用250 μl細胞培養基以2 μl/秒的流速沖洗測定試劑，然後用細胞培養基以0.1667 μl/秒的流速再沖洗持續20分鐘。然後使用900 ms曝光時間和100%照明設置通過TRED過濾立方體（filter cube）對晶片成像。
在圖2中，CD3擴散測定試劑以0.125 μg/ml的最終濃度使用。圖2和3，一旦平衡步驟完成，用500 μl細胞培養基以2 μl/秒的流速沖洗測定試劑，然後用細胞培養基以0.1667 μl/秒的流速再沖洗持續24分鐘。然後使用1000 ms曝光時間（圖2）或750 ms（圖3）和100%照明設置通過TRED過濾立方體對晶片成像。 擴散梯度分析和Au得分歸一化
對於圖3和4中所示的CD3擴散測定，參考測定在空晶片上運行，以產生用於相對於晶片位置效應和背景螢光信號歸一化CD3擴散測定得分的參考圖像。在將細胞載入在奈米流體晶片上之前，使用TRED過濾立方體在900 ms曝光時間和100%照明設置（圖4）或750 ms曝光時間和100%照明設置（圖3）下產生參考數據集。「背景」圖像序列係在奈米流體晶片上併入CD3擴散測定試劑之前產生的。「螢光參考（Fluoref）」圖像序列係在將試劑併入晶片上並且擴散梯度分析的平衡步驟完成之後產生的。對於圖4中的數據，「擴散參考」圖像序列係在擴散梯度測定的沖洗步驟完成之後產生的。CAS軟體使用參考圖像以相對於背景和晶片位置效應歸一化每個單獨圍欄的CD3擴散測定得分。 雙靶向測定
將CD3擴散測定試劑以1 mg/ml重懸於DMSO中並避光儲存在-20°C下以長期儲存。對於短期儲存，將測定試劑在PBS中進一步稀釋至4 μg/ml並儲存在4°C下。在執行擴散梯度測定之前，將CD3擴散測定和Spotlight®Hu3測定試劑在細胞培養基中分別稀釋至0.2 μg/ml和Berkeley Lights推薦的1x濃度。然後將測定試劑通過22 μm過濾器過濾，轉移至96孔板且併入晶片上。以0.014 μl/秒流速將測定試劑灌注到晶片上，持續45分鐘。一旦平衡步驟完成，用250 μl細胞培養基以2 μl/秒的流速沖洗測定試劑，然後用細胞培養基以0.1667 μl/秒的流速再沖洗持續20分鐘。然後使用900 ms曝光時間和100%照明設置通過TRED過濾立方體對晶片成像。 擴散梯度分析和Au得分歸一化
參考測定在空晶片上運行，以產生用於相對於晶片位置效應和背景螢光信號歸一化雙靶向測定得分的參考圖像。包括「背景」、「螢光參考」和「擴散參考」的參考數據集係在將細胞載入到奈米流體晶片上之前並且使用TRED過濾立方體在900 ms曝光時間和100%照明設置下生成的。在目視檢查測定圖像時，圍欄（其中明亮螢光物體位於測量區域中）被鑒定為偽影。 10天分批補料生產
以每孔3.5 mL的工作體積在24深孔板中進行分批補料實驗，並將細胞懸浮培養物在36°C、5% CO2、85%相對濕度下孵育。以8 × 10 5個細胞/mL靶細胞密度接種生產培養物，培養為期10天，在第3、6和8天大劑量補料。在第0、3、6-10天收集過程中樣本用於分析。使用Vi-CellBlu細胞計數器（貝克曼庫爾特公司（Beckman Coulter），貝瑞阿，加利福尼亞州）測定細胞計數和活力。藉由親和蛋白A高效液相層析（HPLC）（Protein A，沃特斯公司，米爾福德（Milford），麻塞諸塞州）測量蛋白力價。藉由VCD對培養時間的梯形規則計算綜合活細胞密度（IVCD）。比生產率（Qp）藉由力價除以IVCD計算確定。 實例 1 專用於 CD3 擴散模式的擴散梯度測定 A. 模擬 CD3 結合的 CD3 結合劑分泌測定試劑的設計和開發
本實例提供了被設計為易於檢測CD3結合劑的測定，該測定可利用先前技術，在一些實施方式中，該等先前技術包括Berkeley Lights儀器。試劑被設計為由與螢光團軛合的CD3肽組成，其可被CD3結合重組蛋白特異性識別（圖1A）。該試劑的特異性結合係由內源性人CD3ε蛋白的前9個胺基酸序列的存在賦予的。這一短肽由於不溶性而被證明難以合成。為了提高肽溶解性，將半胱胺酸殘基添加到C末端，這允許CD3肽通過馬來醯亞胺介導的化學過程共價軛合到ALEXA-FLUOR ®488或ALEXA-FLUOR ®594螢光團（圖1A）。將該肽以合成方式軛合到該胺基酸衍生物。該等修飾產生具有以下序列（SEQ ID NO: 1）的大約2 kDa大小的最終肽軛合物：焦麩胺酸-DGNEEMGGC-AF594（或AF488）（圖1A）。
測試CD3肽與CD3結合劑的結合，CD3結合劑係分泌到細胞培養基中的重組經典BiTE ®蛋白。收集從表現基於scFv的BiTE ®重組蛋白的細胞系收集的分泌培養基，與CD3-AF488試劑混合，並進行捕獲層析。未純化的分泌培養基和純化物質隨後均藉由配備有螢光檢測器的粒徑排阻層析進行分析（圖1B、1C）。該設置允許在分析樣本中存在的全蛋白質含量的背景下監測CD3-AF488肽及其結合的蛋白質複合物的洗脫曲線。純化材料的UV吸光度（A280 nm）洗脫曲線允許鑒定BiTE®單體、二聚體和HMW物質（圖1B）。螢光CD3-AF488肽（254 nm）的洗脫曲線與BiTE ®洗脫曲線重疊，表明CD3-肽與BiTE ®重組蛋白形成複合物，並允許檢測BiTE®單體、二聚體和聚集物質（圖1B）。在未純化樣本中檢測到的螢光洗脫曲線類似於在純化材料中檢測到的SEC曲線，表明CD3肽軛合物試劑可用於檢測細胞培養基中的CD3結合劑分泌（圖1C）。
為了確定測定試劑是否引入細胞毒性，將表現BiTE ®-Fc融合分子的CHO細胞暴露於補充有濃度為0 μg/mL至1 μg/mL的CD3-AF594軛合物的培養基。將細胞與試劑一起孵育24小時，用培養基洗滌並分析細胞活力。沒有觀察到回應於CD3測定試劑處理的細胞活力缺陷。基於該等數據，可以得出，CD3肽軛合物適於檢測細胞培養基中的CD3結合劑分泌，且不誘導細胞毒性（圖1A-1D）。 B. 奈米流體晶片上 CD3 結合劑分泌的擴散梯度測定的優化
接下來評估CD3-AF594肽軛合物用於擴散梯度測定以檢測Berkeley Light奈米流體晶片上重組CD3結合劑分泌的能力（圖2A）。使用標準細胞系開發工作流程將表現BiTE ®模式的細胞載入到BLI平臺上。單細胞放置於Nanopens™中，隨後灌注培養為期6天。使用本文所述之優化設置將CD3試劑用於擴散梯度測定。該測定允許基於收集的螢光圖像的目視檢查鑒定分泌高水平BiTE ®重組蛋白的細胞系（圖2B）。在填充有表現BiTE®重組蛋白的細胞的圍欄中檢測到高螢光信號，這與用作陰性對照的空圍欄相反（圖2B）。該等數據表明CD3測定試劑適於利用BLI平臺檢測BiTE®分泌。
接下來，評估BiTE®擴散梯度測定的特異性。在BLI平臺上的單細胞載入工作流程中使用表現BiTE®、BiTE®-Fc融合體或IgG融合蛋白的三種不同細胞系（圖3A）。使細胞生長5天並使用Spotlight™ Hu3和CD3擴散測定法測定重組蛋白分泌。BiTE ®-Fc融合體在該研究中用作陽性對照，因為它具有結合CD3蛋白的能力以及由於CD3和Fc結構域的存在而對Spotlight™ Hu3試劑具有親和力。如所預期的，藉由Spotlight™ Hu3和CD3擴散測定檢測BiTE ®-Fc蛋白產物的分泌（圖3A、3B）。使針對兩種測定測量的分泌得分（Au得分）相關聯，R 2值達到0.96，表明CD3擴散測定能夠如市售Spotlight™ Hu3測定一樣有效地檢測BiTE ®-Fc分子（圖3C）。CD3擴散測定不能檢測IgG融合蛋白的分泌，這與Spotlight™ Hu3測定相反，表明了CD3肽試劑的高特異性（圖3A-3C）。在表現IgG的細胞系的情況下，對CD3擴散測定和Spotlight™ Hu3測定測量的分泌得分（Au得分）顯示較差的相關性（圖3C）。CD3擴散試劑有效地檢測表現BiTE ®的細胞系的分泌（圖3A-3C）。該等數據證明，本文開發的CD3擴散測定可用於檢測各種BiTE ®形式，並表明對CD3結合劑具有高特異性。 C. 與通過標準方法得到的殖株相比，基於 CD3 結合測定選擇的選殖性能出相似的性能。
接下來，評價在匯出程序（即，將選擇的候選殖株從奈米流體晶片轉移到96孔板用於隨後的擴增和放大）後暴露於CD3結合劑測定的殖株的性能。選擇來自表現BiTE ®-Fc融合分子的選殖親本細胞系的殖株（圖3）並匯出。放大19個殖株並藉由在深孔板中進行的10天小規模分批補料實驗進行評價。監測培養物的生長、活力和最終力價以及比生產率（qp），並與用於在BLI晶片上亞選殖細胞的親本細胞系進行比較（圖3）。除了一個例外，所有的殖株均顯示出相似的生長和活力特徵（圖4C、4D）。與用於亞選殖的親本細胞系獲得的值相比時，匯出的選殖獲得的力價和比生產率分別在110%-47%和155%-50%的範圍內。所有該等數據表明，與通過標準方法獲得的細胞系相比時，在選殖過程中暴露於CD3擴散測定試劑的細胞系性能出相當的性能。此外，CD3擴散測定可用於鑒定和富集性能出與通過標準CLD工作流程選擇的細胞系相當的性能的殖株。 D. 用於低水平表現的 CD3 結合模式的雙靶向擴散梯度測定的開發
然而，晶片上擴散梯度測定係用於檢測奈米級蛋白質分泌的有前景的工具；這種測定的檢測限對低水平表現治療性生物製劑的細胞系提出了挑戰。利用其中兩種螢光探針同時靶向非重疊蛋白質結構域的測定，可以觀察到保留在圍欄中的螢光信號的增加。
為了測試這一點，優化擴散梯度測定以檢測低水平表現的BiTE ®-Fc融合蛋白。由於BiTE ®-Fc融合蛋白的CD3結合能力和Fc結構域的存在，BiTE ®-Fc融合蛋白可分別被CD3擴散測定和Spotlight™ Hu3測定識別。在該實施方式中，使用兩種測定試劑。CD3肽和Fc測定試劑與重疊光譜的AF594或TRED（德克薩斯紅）螢光團軛合，因此可以使用相同的螢光立方體同時退出和檢測。
將表現BiTE ®-Fc蛋白的細胞載入到BLI平臺上。單細胞存放在Nanopens™中，隨後在灌注下培養為期4天。然後單獨進行雙靶向測定（其中使用兩種螢光探針的組合）或CD3擴散測定和Spotlight®Hu3測定（圖5A、5B）。為了去除存在於圍欄中的任何殘留螢光信號，在每次測定之間用5 ml細胞培養基（其對應於大約1000x晶片體積）沖洗晶片。由於Spotlight®Hu3與CD3擴散測定和雙靶向測定之間用於圖像捕獲的曝光時間不同，將由BLI軟體對各測定計算的分泌得分（Au得分）歸一化為對每個數據集內的空圍欄檢測的平均Au得分（圖5A）。該歸一化步驟允許與在晶片上進行的每個測定的分泌得分進行直接比較。在CD3擴散測定和Spotlight®Hu3測定的情況下，其中每個螢光探針以1 : 1的比例結合靶分子，在圍欄中檢測到的螢光信號低。這與雙靶向測定相反，在雙靶向測定中兩種螢光探針同時結合靶蛋白產物，產生2 : 1的螢光團：靶蛋白比率。這種對晶片上分泌的重組蛋白的雙重識別導致在單個圍欄中檢測到的螢光強度增加（圖5A、5B）。
為了確定進行測定的順序和其間進行的大量沖洗是否可能影響在圍欄中檢測到的蛋白質水平，將圖4中使用的表現相同BiTE ®-Fc融合蛋白的細胞系載入到奈米流體晶片上，並且在培養的第4天進行Spotlight®Hu3測定，隨後用5 ml培養基沖洗。進行雙靶向測定並分析在晶片上檢測的分泌特徵。與單獨的Spotlight®Hu3試劑相比，在進行雙靶向測定時檢測到螢光信號的增加，並且容易鑒定高度分泌的殖株。
基於該等觀察，可以得出結論，組合兩種測定試劑產生更高的靈敏度和螢光信號放大，使得能夠更有效地檢測低水平分泌的BiTE ®-Fc融合蛋白。此外，藉由使用Spotlight®Hu3和CD3擴散測定試劑檢測的分泌表型顯示更多的多樣性，允許選擇具有所需生產力特徵的殖株。 E. 討論
表現重組蛋白治療劑的細胞系的開發係資源和時間密集型過程。Berkeley lights技術平臺提供了使細胞系開發活動小型化的有前景的解決方案，並且顯著減少了為了鑒定適合商業製造的殖株衍生的候選細胞系而需要篩選的殖株數。Beacon®平臺還實現了遞送具有詳細選殖數據包的高品質選殖細胞系所需資源的顯著減少（Le K等人, Biotechnol Prog. [生物技術進展] 2018; 34 (6): 1438-1446；以及Le K等人, Biotechnol J. [生物技術雜誌] 2020; 15 (1): e1900247）。Beacon®平臺上的細胞系開發工作流程允許實施螢光測定以幫助選擇具有所需生產力特徵的殖株。市售試劑允許檢測含Fc的分子，這限制了對非Fc模式實施晶片上分泌測定的能力。
本文提供的CD3擴散梯度測定可通過螢光標記的CD3肽檢測CD3結合模式的分泌。當與來源於單個前驅細胞的親本細胞比較時，基於用CD3擴散測定評估的分泌特徵亞選殖的細胞系顯示相似的性能。此外，在本揭露之當前實施方式中提供的測定試劑係完全合成衍生的，不誘導細胞毒性，並且表明對CD3結合模式形式的高特異性，使其適於開發與臨床和商業製造相容的細胞系。
重組蛋白形式的子集被證明難以表現，並且其分泌水平低。在這種情況下，對以單細胞或少數細胞水平檢測分泌的重組蛋白產物提出了挑戰。如本文所示，組合多種測定試劑可改善在Beacon®平臺上的CLD工作流程的上下文中使用的擴散梯度測定的靈敏度並導致信號放大。
上述各種實施方式可以組合以提供另外的實施方式。本說明書中提及的和/或在申請數據表中列出的所有美國專利、美國專利申請出版物、美國專利申請、外國專利、外國專利申請和非專利出版物藉由引用整體併入本文。如果需要，可以修改實施方式的各方面以採用各種專利、申請和出版物的概念來提供另外的實施方式。
根據上述詳細描述，可以對實施方式進行該等和其他改變。通常，在以下請求項中，所使用的術語不應該被解釋為將請求項限於說明書和請求項中揭露的特定實施方式，而是應該被解釋為包括所有可能的實施方式以及該等請求項被授權的等效物的全部範圍。因此，請求項不受本揭露的限制。
無
[ 圖 1]顯示模擬CD3結合的測定試劑之設計和開發。 圖 1A.用於擴散梯度測定的BiTE ®特異性試劑設計之示意圖。 圖 1B.對應於從補充有CD3-AF488肽軛合物的培養基中純化的重組BiTE ®蛋白的SEC圖譜。檢測到的重組BiTE ®蛋白種類如箭頭所示。 圖 1C.對應於來自補充有CD3-AF488肽軛合物的分泌培養基的樣本的SEC圖譜。檢測到的重組BiTE ®蛋白種類和未結合的CD3-AF488試劑如箭頭所示。 圖 1D.圖顯示了與指定濃度的CD3擴散測定試劑一起孵育24小時後測量的CHO細胞之活力。
[ 圖 2]顯示了在Berkeley Lights奈米流體晶片上CD3結合劑分泌的擴散梯度測定的優化。 圖 2A.用於檢測CD3結合蛋白（一種典型的BiTE ®蛋白產物）分泌的晶片上CD3擴散梯度測定之示意圖。 圖 2B.在BLI平臺上獲得的圖像表明，CD3擴散測定允許基於螢光探針在圍欄中的差異保留來鑒定分泌典型BiTE ®模式的殖株。
[ 圖 3]顯示CD3擴散分析對Berkeley Lights奈米流體晶片上的兩種BiTE®形式表現出高度特異性。 圖 3A.在BLI平臺上獲得的代表性圖像表明CD3結合劑擴散測定的特異性和效率。從BLI平臺中構建的測定分析儀工具提取圖像。由於測定參數不同，CD3結合劑和Spotlight®Hu3測定圖像採集所用的曝光時間不同。將表現經典BiTE ®、BiTE®-Fc融合體或IgG融合蛋白的三種獨立生成的細胞系載入到一個晶片上的交替部分中，並培養為期5天。在第5天進行CD3結合劑和Spotlight®Hu3測定。 圖 3B.圖顯示了A中所示的分泌得分和測定結果的定量。 圖 3C.由A和B中所示的細胞系表現的三種模式的CD3擴散測定與Spotlight®Hu3測定得分的相關性。顯示的R 2值表明了CD3擴散測定和Spotlight®Hu3測定結果之間的相關程度。
[ 圖 4]顯示基於CD3擴散測定選擇的殖株與用於亞選殖的親本細胞系相比性能出相似的性能。 圖 4A ，圖 4B.圖顯示歸一化力價測量（A）和比生產率（B），其藉由圖3所示基於CD3擴散測定選擇並從晶片匯出的表現BiTE®-Fc融合體的殖株的10天分批補料實驗評估。本研究中生成的BLI匯出殖株用圓圈顯示，用於亞選殖的親本細胞系用三角形顯示。將A和B中所示的細胞系獲得的力價和Qp歸一化為親本細胞系測量的值。 圖 4B.圖顯示了A和B中所示的10天分批補料實驗期間的活細胞密度和活力。
[ 圖 5]顯示了用於以低水平分泌的BiTE ®模式的雙靶向擴散梯度測定的發展。 圖 5A.B和C所示實驗設計之示意圖。 圖 5B.圖顯示CD3擴散測定、Spotlight ®Hu3和雙靶向測定結果的定量。表現BiTE®-Fc的細胞系以深灰色圓圈顯示，空圍欄以淺灰色圓圈顯示。將分泌得分（Au得分）歸一化為對每個數據集內的空圍欄計算的平均Au得分。 圖 5C.在BLI平臺上獲得的代表性圖像表明雙靶向擴散梯度測定的效率。由於測定參數不同，CD3擴散測定/雙靶向測定和Spotlight®Hu3測定圖像採集所用的曝光時間不同。
無
 

          <![CDATA[<110>  美商安進公司（Amgen Inc.）]]>
          <![CDATA[<120>  含抗CD3分子的擴散梯度測定]]>
          <![CDATA[<130>  01017/55333]]>
          <![CDATA[<140>  TW 110147821]]>
          <![CDATA[<141>  2021-12-21]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/128,959]]>
          <![CDATA[<151>  2020-12-22]]>
          <![CDATA[<160>  2     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  焦麩胺酸]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Cys 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 
          1               5                   10                  15      
          Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 
                      20                  25
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (24)

  1. 一種用於從細胞群體中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞之方法，該方法包括以下步驟： (a) 在奈米流體晶片的奈米流體室中從細胞群體中收集單細胞，其中所述單細胞包含能夠表現所述生物分子的表現構建體； (b) 在允許所述生物分子的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養該單細胞，從而由單細胞殖株產生多個細胞； (c) 在允許CD3肽接觸由所述單細胞殖株的所述多個細胞分泌的所述生物分子的條件下，向所述奈米流體晶片投與包含所述CD3肽的組成物； (d) 檢測CD3肽與所述生物分子的結合；以及 (e) 從步驟 (b) 的多個細胞中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該細胞群體係細胞系。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該細胞群體係兩種或更多種細胞系的混合物。
  4. 如請求項1所述之方法，其還包括定量由單細胞系之所述多個細胞分泌的所述生物分子之量的步驟。
  5. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞選自由哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、酵母細胞和真菌細胞組成之群組。
  6. 如請求項5所述之方法，其中該細胞選自由中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人胚腎（HEK）細胞、鼠骨髓瘤（NS0、Sp2/0）細胞、幼倉鼠腎（BHK）細胞、人胚腎（293）細胞、纖維肉瘤（HT-1080）細胞、人胚視網膜（PER.C6）細胞、雜交腎和B細胞（HKB-11）、CEVEC羊水細胞生產（CAP）細胞和人肝（HuH-7）細胞組成之群組。
  7. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中所述生物分子包含多肽。
  8. 如請求項7所述之方法，其中所述多肽係重組的。
  9. 如請求項7-8中任一項所述之方法，其中所述多肽選自由抗體、肽體、多特異性蛋白、雙特異性蛋白、雙特異性T細胞接合物、半衰期延長的雙特異性T細胞接合物及其生物活性片段、類似物和衍生物組成之群組。
  10. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該生物分子係BiTE並且還能夠結合選自由CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、CD19、FLT3、CDH3、BCMA、PSMA、MUC17、CLDN18.2、EpCAM、CEA、Her2、CD20和CD70組成之群組的靶分子。
  11. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中所述CD3肽包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。
  12. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中所述CD3肽包含10個胺基酸。
  13. 如請求項12所述之方法，其中所述CD3肽包含胺基酸序列焦麩胺酸-DGNEEMGGC（SEQ ID NO: 1）。
  14. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中所述CD3肽係包含至少一個修飾的CD3肽軛合物。
  15. 如請求項14所述之方法，其中所述修飾包括連接所選擇的檢測部分，其中所述檢測部分係螢光團。
  16. 如請求項15所述之方法，其中所述螢光團選自由AF594和AF488組成之群組。
  17. 如請求項16所述之方法，其中使用馬來醯亞胺連接子將所述AF594連接到序列焦麩胺酸-DGNEEMGGC（SEQ ID NO: 1）的C末端半胱胺酸。
  18. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中所述表現構建體選自由載體、質體和線性化DNA表現序列組成之群組。
  19. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中所述方法在14天或更短時間內完成。
  20. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中所述奈米流體晶片包含1,000至2,000個奈米流體室。
  21. 如請求項20所述之方法，其中所述奈米流體晶片包含1758個奈米流體室。
  22. 一種用於從細胞群體中分離分泌能夠結合CD3肽的雙特異性T細胞接合物的至少一個細胞之方法，該方法包括以下步驟： (a) 在奈米流體晶片的奈米流體室中收集單細胞，其中所述單細胞包含能夠表現所述雙特異性T細胞接合物的表現構建體； (b) 在允許所述雙特異性T細胞接合物的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養該單細胞，從而由單細胞殖株產生多個細胞； (c) 在允許CD3肽接觸由單細胞系的所述多個細胞分泌的所述雙特異性T細胞接合物的條件下，向所述奈米流體晶片投與包含所述CD3肽的組成物； (d) 檢測CD3肽與所述雙特異性T細胞接合物的結合；以及 (e) 從步驟 (b) 的多個細胞中分離分泌能夠結合CD3肽的雙特異性T細胞接合物的至少一個細胞； 其中所述CD3肽係CD3肽軛合物並且包含胺基酸序列焦麩胺酸-DGNEEMGGC（SEQ ID NO: 1），其中AF594連接至所述序列的C末端半胱胺酸。
  23. 一種產生能夠結合CD3肽的生物分子之方法，該方法包括以下步驟： (a) 在奈米流體晶片的奈米流體室中從細胞群體中收集單細胞，其中所述細胞包含能夠表現所述生物分子的表現構建體； (b) 在允許所述生物分子的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養該單細胞，從而由單細胞殖株產生多個細胞； (c) 在允許CD3肽接觸由單細胞系的所述多個細胞分泌的所述生物分子的條件下，向所述奈米流體晶片投與包含所述CD3肽的組成物； (d) 檢測CD3肽與所述生物分子的結合； (e) 從步驟 (b) 的多個細胞中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞；以及 (f) 將所述至少一個細胞從細胞系轉移到容器中，並在允許所述生物分子產生的條件下培養所述細胞。
  24. 一種用於從細胞群體中分離分泌能夠結合CD3肽的生物分子的至少一個細胞之方法，該方法包括以下步驟： (a) 在奈米流體晶片的奈米流體室中從細胞群體中收集單細胞，其中所述細胞包含能夠表現所述生物分子的表現構建體； (b) 在允許所述生物分子的選殖擴增和表現及分泌的條件下培養該單細胞，從而由單細胞殖株產生多個細胞； (c) 在允許CD3肽接觸由單細胞系的所述多個細胞分泌的所述生物分子的條件下，向所述奈米流體晶片投與包含所述CD3肽的第一組成物和包含生物分子結合劑的第二組成物； (d) 檢測該CD3肽和生物分子結合劑與所述生物分子的結合；以及 (e) 從步驟 (b) 的多個細胞中分離分泌能夠結合CD3肽及視需要生物分子結合劑的生物分子的至少一個細胞。
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