TW202227618A - 細胞製劑、蛋白在表徵造血幹細胞中的用途及判定造血幹細胞的方法 - Google Patents

細胞製劑、蛋白在表徵造血幹細胞中的用途及判定造血幹細胞的方法 Download PDF

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Abstract

本發明公開了一種細胞製劑、蛋白在表徵造血幹細胞中的用途及判定造血幹細胞的方法，所述細胞製劑是待分選的細胞中分選得到的CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的造血幹細胞，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。通過使用本發明所述的蛋白對造血幹細胞進行表徵，不僅在體外能更準確的標定和評價目的細胞，還能提高患者在接受造血幹細胞移植後，能維持長效重建造血系統的能力，達到更好的治療效果。

Description

細胞製劑、蛋白在表徵造血幹細胞中的用途及判定造血幹細胞的方法
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種細胞製劑、蛋白在表徵造血幹細胞中的用途及判定造血幹細胞的方法。
造血幹細胞（Hematopoietic stem cells, HSCs）是存在於骨髓和血液中具有自我更新能力，多向分化為所有類型血細胞的一類幹細胞。在造血系統中，造血幹細胞是所有細胞分化由來的源泉，具有多能性及自我更新的潛能。造血幹細胞包含了長期（Long-term, LT）及短期(Short-term, ST)兩種,其中LT-HSC數量較少，主要維持靜息狀態，主要負責造血系統的長期重建能力。而ST-HSC具有較強的增殖能力，可進一步分化為造血前驅細胞（hematopoietic progenitor cells, HPCs）。這些前驅細胞保留了部分造血系統譜系分化能力，可以進一步定向分化為成熟的淋巴細胞、髓系細胞、紅血球等。
近四十年來，隨著人們對造血系統逐漸深入瞭解，造血幹細胞被越來越多的應用到了臨床，針對血液疾病及免疫缺陷病等進行細胞治療和基因治療。根據細胞來源，HSC可分為臍血（臍帶血）（Cord blood, CB）、募集外周血（Mobilized peripheral blood, mPB）和骨髓（Bone marrow, BM）HSC。目前造血幹細胞移植的適應症包括：
（1）血液系統惡性腫瘤，例如慢性粒細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓纖維化及骨髓增生異常綜合征、伯基特淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、原發性巨球蛋白血症、漿細胞白血病、漿母細胞性淋巴瘤、毛細胞白血病、系統性肥大細胞增多症、成胚漿樣樹突狀細胞瘤及其它血液系統惡性腫瘤。
（2）血液系統非惡性腫瘤，例如再生障礙性貧血、範可尼貧血、地中海貧血、鐮狀細胞貧血、骨髓纖維化、重型陣發性睡眠性血紅蛋白尿症、無巨核細胞性血小板減少症及其它血液系統非惡性腫瘤。
（3）實體瘤，例如乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、神經母細胞瘤、小細胞肺癌、生殖細胞瘤、尤因氏肉瘤、軟組織肉瘤、維爾姆斯瘤、骨肉瘤、成神經管細胞瘤、惡性腦瘤及其它實體瘤。
（4）免疫系統疾病，例如重症聯合免疫缺陷症、嚴重自身免疫性疾病、原發性中樞神經系統淋巴瘤、濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征、慢性肉芽腫，IPEX（免疫失調、多內分泌病、腸病x連鎖）綜合征，AL澱粉變性、POEMS綜合征、嗜血細胞綜合征、類風濕性關節炎、多發性硬化、系統性硬化、系統性紅斑狼瘡、克羅恩病、多肌炎和皮肌炎及其它自身免疫、免疫失調及免疫缺陷疾病；
（5）其它遺傳或代謝類疾病，例如黏多糖病、先天性角化不良、溶酶體代謝病、球形細胞樣腦白質病、異染性腦白質營養不良、X連鎖的腎上腺腦白質營養不良及其它遺傳病或代謝類疾病。
由於倫理及研究模型的限制，我們對於人造血幹細胞的瞭解僅限於參考小鼠HSC的機制研究，以及人HSC在免疫缺陷小鼠模型上的移植研究。然而小鼠的發育機制與人有很多不同。因而，對於人成體造血幹細胞表型及功能的瞭解仍較為局限，至今仍沒有一項最權威的研究，來定義人成體造血幹細胞真正的免疫表型。
CD34廣泛的在未成熟造血細胞中表達,目前在臨床上最為廣泛地應用於鑒定及分選人HSC用於移植。然而CD34陽性細胞仍存在異質性，其既包含了HSC，也包含著隻能分化為特定譜系的HPCs，如巨核細胞-紅血球前驅細胞(MEP)，淋巴-髓系前驅細胞（LMP），多能前驅細胞（MPP），多能淋系前驅細胞(MLP)，定向髓系前驅細胞（CMP），粒細胞-單核細胞前驅細胞(GMP)，定向淋系前驅細胞（CLP）等。這些造血幹細胞/前驅細胞在表型、幹性（幹細胞特性，stemness）及分化能力等方面均存在很多異同。其中在機體內，既能夠保持長期自我更新、又能夠重塑所有血液系統譜系的僅有長期造血幹細胞（Long-term HSCs, LT-HSCs）。為了維持受試者在移植後造血系統的長期重建能力，達到更好更安全的治療效果，我們亟待尋求更好的通過表面標記蛋白定義人HSCs的方法。
目前有數項研究用不同方法挖掘出能定義人HSCs的標記蛋白。如最經典的CD90(Thy1）最早在人胎兒骨髓中發現，被沿用至今。儘管HSC被認為是CD90陽性，但是有報導指出CD90陰性的細胞中仍包含有自我更新和多向分化潛能的HSCs。
CD38是一種表達於多種免疫細胞表面的糖蛋白，如T細胞、B細胞、NK細胞等。因其被報導表達於非HSCs上，因而CD34+CD38-被多項研究應用於HSC的定義。然而在我們及其他多個項目組研究發現，HSC經過體外培養後，CD38的表達量急劇減少，因此CD38並不是一個能很好定義HSC的表面標記蛋白。
而後，有研究組在CD34+CD38-CD90+基礎上，進一步研究發現CD45RA同樣可以用以區分HSCs和HPCs。無論在mPB還是CB來源的細胞中Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 都富集了更多的人HSCs。
通過篩選HSPCs上不同黏附蛋白，CD49f（integrinα6, ITGA6）被發現可用作HSCs的特異性標記。將Lin-CD34+CD38-CD45RA-細胞進一步分為CD90+CD49f+ 和CD90+CD49f-用於體內功能驗證，CD90+CD49f+表現出比CD90+CD49-細胞的移植效率高6倍以上，並且僅CD90+CD49f+能夠在連續移植過程中，表現出長效造血重建效果。
另外一項報導發現CD166在小鼠和人的HSC上都是一個功能性標記蛋白。人CB CD34+ HSPCs多數為CD166陽性。除此之外，在造血微環境中影響HSC非常重要的成骨細胞（osteoblasts, OB）也同樣有CD166的表達。Lin-CD34+CD38-細胞中，CD166+亞群相比於CD166-亞群表現出更高的移植效率，這一移植優勢可能是通過HSC和OB上CD166的同型互作實現的。
CD105（endoglin）被廣泛認為是內皮細胞的標記蛋白，但其在30-80%的人CD34+ HSPCs中也有高表達。其與CD34均在造血細胞上正向調控TGF-beta1，起到抑制細胞週期，維持幹/前驅細胞更原始狀態的作用。CD34+CD105+標記了發育初期，更具有幹性的人造血幹細胞。
另一項研究中用CD201(endothelial protein C receptor, EPCR) 配合CD34和CD45RA來定義經過培養後的人HSC。EPCR/PAR1通路曾被報導通過限制一氧化氮的產生及調控Cdc42活性，而促進LT-HSC在骨髓中的存留。並且，在小鼠骨髓中EPCR也同樣被用作定義小鼠HSC。
此外，這個研究組進一步發現經培養的CB中，CD34+CD45RA-EPCR+細胞仍然存在兩個功能亞群，其中LT-HSCs主要集中在Integrin-a3 (ITGA)+亞群。ITGA3+細胞表現出更強的多譜系分化潛能，在免疫缺陷小鼠模型中連續移植重建能力以及HSC的特異性基因表達。因而認為EPCR+CD90+CD133+CD34+CD45RA-ITGA3+細胞更接近HSC的真正定義。
另一項研究中，通過對人骨髓樣本進行基因表達分析，鑒定出糖蛋白(endomucin,EMCN)可作為人HSC的另一個潛在的標記分子。其在人HSC中高表達，而在分化為前驅細胞的過程中表達量下降。在此之前，EMCN同樣被發現在胚胎發育過程中，特異性地表達在小鼠HSC，而在紅血球前驅細胞中沒有表達，進一步證明了EMCN可以作為HSC潛在的表面標記。
隨著單細胞測序的發展，一些研究組將人HSPCs各個階段的幹細胞和前驅細胞進一步分群,分析其基因譜系。經研究發現CD164表達於造血系統最早的譜系，能夠明顯地區分早期與晚期幹/前驅細胞。CD34+CD164hi亞群，相比於CD34+CD164low亞群有更強的克隆形成能力、體外分化能力、擴增能力及體內的全譜系分化能力。並且CD164相比於傳統定義LT-HSC的CD90+或CD38-，有更強的辨識性。
此外，還有報導一些表面蛋白，如HLA-DR，c-Kit, Tie2, IL-3R也在HSPCs上高表達，但並非能夠用來在Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+細胞中定義一個幹性更好的亞群。
以上的研究，用不同方法發現了人HSCs的標記蛋白，然而對於HSCs免疫表型的真正定義仍是百家爭鳴，莫衷一是，這也大大影響了造血幹細胞移植的臨床開發以及對其治療功效和安全性的評價。
針對上述問題，本發明提供了一種通過蛋白表徵造血幹細胞的方法，所述蛋白包括CD34、CD90和CD45RA；和
選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。使用蛋白對造血幹細胞進行表徵後，不僅在體外能更準確的標定和評價目的細胞，還能著重提高患者在接受造血幹細胞移植後，能維持長效重建造血系統的能力，達到更好的治療效果。
採用上述蛋白定義造血幹細胞的意義在於： （1）在體外，可以更有效的評價和控制各種來源HSC的細胞純度和品質。 （2）由於人體內能夠獲得的造血幹細胞數量有限，往往不能達到臨床移植的最低數量標準，因此需要體外擴增培養。然而多數培養系統不能很好的維持幹性，導致培養後HSC比例降低。通過標記蛋白更準確地標定HSC，也可以更好地評價及優化體外培養系統。 （3）基於重建整個造血系統的能力，HSC被用於基因編輯治療多種血液及免疫疾病。在基因修飾過程中，通過標記蛋白更準確地標定HSC能更準確地確定所靶向的目的細胞，有針對性地對HSC進行基因修飾。 （4）HSC標記蛋白不僅對於瞭解造血系統的生理發育至關重要，並且由於很多難治性惡性血液腫瘤是在HSC上發生癌變，導致很難靶向和根治。通過標記蛋白更準確地標定HSC 有助於更好地瞭解這些腫瘤疾病的發病機理，拓展治療靶點。 （5）針對HSC標記蛋白，可開發相應的檢測產品如抗體，檢測磁珠，檢測試劑盒等，用於富集HSCs，為科學研究和臨床應用提供更多有效的HSC。
因此，本發明具體技術方案如下：
1. 蛋白在表徵造血幹細胞中的用途，其中，所述蛋白包括 （1）CD34、CD90和CD45RA；和 （2）選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
2. 根據項1所述的用途，其中，所述蛋白包括 （1）CD34、CD90和CD45RA；和 （2）CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
3. 一種用於判定造血幹細胞的方法，其包括： 檢測待測細胞是否為CD34陽性； 檢測待測細胞是否為CD90陽性； 檢測待測細胞是否為CD45RA陰性；和 檢測待測細胞是否為下述蛋白陽性， 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上， 當待測細胞為CD34陽性、CD90陽性、CD45RA陰性和選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中一種、兩種、三種、四種或四種以上的蛋白陽性時，判定其為造血幹細胞。
上述檢測步驟旨在描述需要檢測的專案，不旨在限定檢測實施的順序，也就是說，本申請的實施方案涵蓋了上述檢測步驟按先後的順序進行、不按先後的順序進行和同時進行的所有技術方案。
4. 根據項3所述的方法，其中，所述待測細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
5. 根據項3或4所述的方法，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
6. 一種篩選造血幹細胞的方法，其包括： 從待分離細胞中篩選出CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的造血幹細胞； 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
7. 根據項6所述的方法，其中，所述待分離細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
8. 根據項6或7所述的方法，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
9. 一種細胞製劑，其包括從待分選的細胞中分選得到的CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的造血幹細胞，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
10. 根據項9所述的細胞製劑，其中，所述待分選的細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
11. 根據項9或10所述的細胞製劑，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
12. 一種製備細胞製劑的方法，其包括： 從待分選細胞中篩選出CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的造血幹細胞； 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
13. 根據項12所述的方法，其中，所述待分選細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
14. 根據項12或13所述的方法，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
15. 一種用於提高造血系統的重建能力的藥物，其包括項9-11中任一項所述的細胞製劑或者項12-14中任一項所述的方法製備得到的細胞製劑。
16. 一種重建受試者造血系統方法，包括給予受試者項9-11中任一項所述的細胞製劑或者項12-14中任一項所述的方法製備得到的細胞製劑。
在一個實施方案中，本申請還涉及項9-11中任一項所述的細胞製劑或者項12-14中任一項所述的方法製備得到的細胞製劑在製備重建受試者造血系統的藥物中的用途。
17. 一種檢測造血幹細胞的試劑盒或產品，包括用於檢測如下各項的化合物： 檢測待測細胞是否為CD34陽性； 檢測待測細胞是否為CD90陽性； 檢測待測細胞是否為CD45RA陰性；和 檢測待測細胞是否為下述蛋白陽性， 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
18. 項17的試劑盒或產品，其中所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
19. 項17或18的試劑盒或產品，其中，所述待分離細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
20. 項17-19任一項的試劑盒或產品，其中所述化合物為抗體。
21. 項20的試劑盒或產品，其中所述抗體為化學標記的抗體，例如發光化合物標記的抗體，例如螢光標記的抗體。
22. 項20的試劑盒或產品，其中所述抗體為附著於磁珠的抗體。
23. 一種分選或富集造血幹細胞的試劑盒或產品，包括用於從待分選或富集的細胞中分選CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的造血幹細胞的化合物，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
24. 項23的試劑盒或產品，其中所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
25. 項23或24的試劑盒或產品，其中，所述待分離細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
26. 項23-25任一項的試劑盒或產品，其中所述化合物為抗體。
27. 項26的試劑盒或產品，其中所述抗體為化學標記的抗體，例如發光化合物標記的抗體，例如螢光標記的抗體。
28. 項26的試劑盒或產品，其中所述抗體為附著於磁珠的抗體。
29. 一種篩選造血幹細胞培養基的方法，包括使用待篩選培養基培養造血幹細胞後檢測如下表徵的造血幹細胞的比例的維持或升降，所述造血幹細胞CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上，其中上述表徵的造血幹細胞經過培養後的比例得以維持或上升表示待篩選培養基為適宜的造血幹細胞培養基。
30. 項29的方法，其中所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
31. 經過項29或30的方法篩選的造血幹細胞培養基。
32. 一種治療受試者疾病的方法，包括給予受試者有效量的項9-11中任一項所述的細胞製劑或者項12-14中任一項所述的方法製備得到的細胞製劑。
33. 項32的方法，其中所述疾病為需要造血幹細胞治療重建受試者造血系統的疾病。
34. 項33的方法，其中所述疾病為惡性腫瘤、血液系統疾病或免疫系統疾病。
35. 項34的方法，其中所述疾病包括：（1）慢性粒細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓纖維化及骨髓增生異常綜合征、伯基特淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、原發性巨球蛋白血症、漿細胞白血病、漿母細胞性淋巴瘤、毛細胞白血病、系統性肥大細胞增多症、成胚漿樣樹突狀細胞瘤及其它血液系統惡性腫瘤； （2）再生障礙性貧血、範可尼貧血、地中海貧血、鐮狀細胞貧血、骨髓纖維化、重型陣發性睡眠性血紅蛋白尿症、無巨核細胞性血小板減少症及其它血液系統非惡性腫瘤； （3）乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、神經母細胞瘤、小細胞肺癌、生殖細胞瘤、尤因氏肉瘤、軟組織肉瘤、維爾姆斯瘤、骨肉瘤、成神經管細胞瘤、惡性腦瘤及其它實體瘤； （4）重症聯合免疫缺陷症、嚴重自身免疫性疾病、原發性中樞神經系統淋巴瘤、濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征、慢性肉芽腫，IPEX（免疫失調、多內分泌病、腸病x連鎖）綜合征，AL澱粉變性、POEMS綜合征、嗜血細胞綜合征、類風濕性關節炎、多發性硬化、系統性硬化、系統性紅斑狼瘡、克羅恩病、多肌炎和皮肌炎及其它自身免疫、免疫失調及免疫缺陷疾病；或 （5） 黏多糖病、先天性角化不良、溶酶體代謝病、球形細胞樣腦白質病、異染性腦白質營養不良、X連鎖的腎上腺腦白質營養不良及其它遺傳病或代謝類疾病。
36. 本申請還涉及項9-11中任一項所述的細胞製劑或者項12-14中任一項所述的方法製備得到的細胞製劑在製備治療上述疾病的藥物中的用途。 發明的效果
本發明所提供的蛋白對造血幹細胞進行表徵，不僅在體外能更準確地標定和評價目的細胞，還能著重提高患者在接受造血幹細胞移植後，維持長效重建造血系統的能力，達到更好的治療效果。
下面結合附圖所描述的實施方式對本發明做以詳細說明，其中所有附圖中相同的數位表示相同的特徵。雖然附圖中顯示了本發明的具體實施例，然而應當理解，可以以各種形式實現本發明而不應被這裡闡述的實施例所限制。相反，提供這些實施例是為了能夠更透徹地理解本發明，並且能夠將本發明的範圍完整的傳達給本領域的技術人員。
需要說明的是，在說明書及申請專利範圍當中使用了某些詞彙來指稱特定元件。本領域技術人員應可以理解，技術人員可能會用不同名詞來稱呼同一個元件。本說明書及申請專利範圍並不以名詞的差異作為區分元件的方式，而是以元件在功能上的差異作為區分的準則。如在通篇說明書及申請專利範圍當中所提及的「包含」或「包括」為開放式用語，故應解釋成「包含但不限定於」。說明書後續描述為實施本發明的較佳實施方式，然而所述描述乃以說明書的一般原則為目的，並非用以限定本發明的範圍。本發明的保護範圍當視所附申請專利範圍所界定者為准。
本發明提供了一種蛋白在表徵造血幹細胞中的用途，其中，所述蛋白包括CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。
在一些實施方案中，本發明涉及蛋白在表徵造血幹細胞中的用途，其中，所述蛋白包括（1）CD34、CD90和CD45RA；和 （2）選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
CD48是一種免疫球蛋白家族CD2亞族蛋白。其並非跨膜蛋白，但能夠通過GPI錨定在細胞膜上，其C端結構域可被剪切而形成可溶性蛋白。 CD48表達於多種免疫細胞及內皮細胞等，其與NK細胞上2B4受體高親和力連接，與CD2低親和力連接。CD48可能對活化的淋巴細胞間互作起促進作用，參與T細胞啟動。
CEA家族包含兩個亞族，CEA細胞黏附因數和孕特異性多糖。其位於19號染色體長臂上。CEACAM蛋白的特點是其能夠錨定在細胞膜上，且在Ig結構域含有34個氨基酸組成的信號肽。其包含12個成員蛋白（CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM16、CEACAM18、CEACAM19、CEACAM20、CEACAM21）。
CD66a（CEACAM1），是CEACAM家族中最廣泛分佈的成員，包含了分泌型及跨膜型兩種形式，其功能的實現主要依賴於N端結構域。CD66a最初作為膽汁糖蛋白，被發現於肝臟膽管中。後經研究報導，其同樣表達於淋巴細胞、上皮細胞、內皮細胞等。作為一種細胞間黏連蛋白，通過嗜同或嗜異性連接實現細胞功能調控，參與細胞分化、組織結構形成、血管生成、凋亡、腫瘤抑制、代謝、固有免疫和獲得性免疫。
CD66c（CEACAM6）屬於CEA家族成員，其通過糖基磷脂醯肌醇(GPI)結合在細胞膜上。生理情況下，CD66c在一系列上皮細胞、中性粒細胞及單核細胞中顯著高表達。同時，CD66c也普遍用於針對惡性腫瘤的血清檢測。
CD66d(CEACAM3)屬於CEA家族成員，位於人染色體19q13.2。多種細菌性病原體通過此蛋白結合及入侵宿主細胞。因此CD66d在調控人固有免疫抵抗病原體感染方面起到重要作用。
CD66e（CEACAM5）屬於CEA家族成員，其通過糖基磷脂醯肌醇(GPI)結合在細胞膜上。CD66e的表達起始於人胚胎及胎兒發育早期階段（9-14周），並且在特定細胞中終身維持表達。在成人組織中，CD66e在腸道、胃、舌、食道、宮頸、汗腺、前列腺中均有表達。CD66e同樣被作為一個常用的腫瘤識別標記，但是其機理和功能並不明瞭。
CD200分子是一種I-型膜糖蛋白，分子品質為（41-47）kDa，具有典型的V/C2結構，由胞外信號肽、二羥基脫氫酶區、V區、C2區、跨膜區和胞內區構成，屬於免疫球蛋白超家族（IgSF）成員。在人類其位於染色體3q12-q13上，由6個外顯子和5個內含子組成，轉錄後mRNA全長為2.14kb，可編碼269個氨基酸的多肽鏈，CD200在小鼠上位於16號染色體B5區上，全長2.20kb，可編碼278個氨基酸的多肽鏈。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
本發明提供了一種用於判定造血幹細胞的方法，其包括下述步驟： 檢測待測細胞是否為CD34陽性； 檢測待測細胞是否為CD90陽性； 檢測待測細胞是否為CD45RA陰性；和 檢測待測細胞是否為下述蛋白陽性， 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上， 當待測細胞為CD34陽性、CD90陽性、CD45RA陰性和上述蛋白陽性時，判定其為造血幹細胞。
上述檢測步驟旨在描述需要檢測的專案，無意限定檢測實施的順序。
對於待測細胞的來源，本發明不作限制，例如可以來源於臍血、募集外周血或骨髓。
所述待測細胞指的是將來源於臍血、募集外周血或骨髓的造血幹細胞進行分選所得到的細胞。
對於其操作方法，本發明不作限制，其可以根據本領域技術人員公知的方法進行分選，例如依託於特異性抗體染色後進行流式細胞分選，磁珠分選等。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
本發明通過採用上述所述的蛋白對造血幹細胞進行表徵，不僅在體外能更準確的標定和評價目的細胞，還能著重提高患者在接受造血幹細胞移植後，能維持長效重建造血系統的能力，達到更好的治療效果。
本發明提供了一種篩選造血幹細胞的方法，其包括下述步驟：
從待分離的細胞中篩選出CD34+、CD90+、CD45RA-以及蛋白為陽性的造血幹細胞；
其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。
所述的造血幹細胞指的是CD34呈陽性、CD90呈陽性、CD45RA呈陰性以及選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上的蛋白呈陽性的造血幹細胞。
對於上述篩選的方法，本發明不作限制，其可以根據需要按本領域技術人員公知的方法進行，例如，可以使用流式細胞篩選法、磁珠分選等進行篩選。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述待分離的細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
在本發明優選的一種具體實施方式中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
本發明提供了一種細胞製劑，其包括待分離的細胞中分選得到的CD34+、CD90+、CD45RA-以及蛋白為陽性的造血幹細胞，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述待分選的細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
本發明提供了一種製備細胞製劑的方法，其包括下述步驟： 從待分選的細胞中篩選出CD34+、CD90+、CD45RA-以及蛋白為陽性的細胞製劑； 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。 所述細胞製劑指的是CD34呈陽性、CD90呈陽性、CD45RA呈陰性以及選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上的蛋白呈陽性的造血幹細胞。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述待分選的細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
本發明提供了一種用於提高造血系統的重建能力的藥物，其包括上述所述的細胞製劑或者上述所述的方法製備得到的細胞製劑。
本發明提供了一種造血幹細胞的分選方法，其包括下述步驟： 使用CD34抗體、CD90抗體、CD45RA抗體以及蛋白抗體從待分離的細胞中分選出CD34+、CD90+、CD45RA-以及蛋白為陽性的造血幹細胞； 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。
在本發明優選的一種具體實施方式中，所述待分離的細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
本申請還涉及一種重建受試者造血系統方法，包括給予受試者上述細胞製劑或者上述方法製備得到的細胞製劑。
本申請還涉及一種檢測造血幹細胞的試劑盒或產品，包括用於檢測如下各項的化合物： 檢測待測細胞是否為CD34陽性； 檢測待測細胞是否為CD90陽性； 檢測待測細胞是否為CD45RA陰性；和 檢測待測細胞是否為下述蛋白陽性， 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
在一些實施方案中，所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。對於所述待分離細胞，本申請不做具體限制，其可以來源於臍血、募集外周血或骨髓或培養的細胞。對於上述檢測方法，本發明不作限制，可以根據本領域技術人員公知的方法進行檢測，例如依託於特異性抗體的檢測，流式細胞術檢測等。
本申請還涉及一種分選或富集造血幹細胞的試劑盒或產品，包括用於從待分選或富集的細胞中分選CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的造血幹細胞的化合物，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
對於所述待分選或富集的細胞，本申請不做具體限制，其可以來源於臍血、募集外周血或骨髓或培養的細胞。對於上述分選方法，本發明不作限制，可以根據本領域技術人員公知的方法進行分選，例如依託於特異性抗體的分選，例如流式細胞術或磁珠分選等。
本申請還涉及一種篩選造血幹細胞培養基的方法，包括使用待篩選培養基培養造血幹細胞後檢測如下表徵的造血幹細胞的比例的維持或升降，所述造血幹細胞CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上，其中上述表徵的造血幹細胞經過培養後的比例得以維持或上升表示待篩選培養基為適宜的造血幹細胞培養基。本申請還涉及通過該方法篩選的造血幹細胞培養基。
本申請還涉及一種治療受試者疾病的方法，包括給予受試者有效量的上述細胞製劑或者上述方法製備得到的細胞製劑。在一些實施方案中，所述疾病為需要給予造血幹細胞重建受試者造血系統的疾病。 實施例
本發明對試驗中所用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述，在下面的實施例中，如果無其他特別的說明，％表示wt％，即重量百分數。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規試劑產品。
實施例1：造血幹細胞的分離
所使用的人造血幹細胞主要來源於臍血，臍血樣本從醫院取回後，放室溫複溫0.5-1小時，將血液樣本從采血袋中轉移至50mL離心管中，輕輕混勻。用移液槍分別取100μL樣品用於白細胞計數及流失細胞檢測CD34陽性比例。剩餘血液樣本用含1% HAS的生理食鹽水1:1稀釋，移液管輕輕混勻。將混合液置於新的50mL離心管，添加適量淋巴細胞分離液至管底，400g升3降0離心30分鐘。離心後將離心管緩慢取出，保持液面水準。用移液器小心吸取白膜層細胞，移至新的離心管中，用1% HAS的生理食鹽水清洗細胞，500g升9降5離心10分鐘。
離心後重懸細胞，進行CD34陽性細胞的分選（CD34+細胞磁珠分選試劑盒，美天旎，130-046-703)。首先每1x10 6總細胞，加入100μL FcR Blocking Antibody和100μL CD34-Beads，置於4℃，培養30分鐘。培養後用40mL 1% HAS的生理食鹽水清洗，400g離心8分鐘，按照每3mL 1x10 9細胞重懸。
將CD34+細胞分選柱置於MACS磁力分離架上，並在分選柱上放置一個40μm細胞篩，分選柱下方放置15mL離心管。用3mL 1%HAS的生理食鹽水潤洗過濾篩，然後加入細胞懸液，滴落完成後，用3mL 1% HAS的生理食鹽水清洗3次。將吸附柱去除磁場，加入1% HAS的生理食鹽水將細胞收集至離心管中，重複一次。細胞混勻計數，進行培養或凍存。收集一部分細胞進行流式細胞檢測，檢測CD34表達，確認其純度。
實施例2：造血幹細胞的培養
首先配製造血幹細胞完全培養基，其組分及用量如下：
表1：造血幹細胞完全培養基各成分具體資訊
成分 品牌 貨號 使用濃度
StemSpan SFMEII Stem cell 09655  
IL6 PeproTech 200-06 20ng/mL
TPO PeproTech 300-18-100 100ng/mL
FLT3L PeproTech AF-300-19-100 100ng/mL
SCF PeproTech 300-07-100 100ng/mL
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122 1:100 (P:100單元/mL,S:100μg/mL)
根據實施例1的計數結果，分別將5x10 4的CD34+細胞加入24孔板的每孔，以1mL完全培養基培養細胞。培養三天後，收集細胞用於流式細胞檢測。
實施例3：表面蛋白表達初篩
本檢測使用人表面蛋白檢測板（BD Lyoplate-Human cell surface marker screening panel, BD Biosciences,貨號560747）。此檢測板分別在96孔板每孔中包被了242個人表面標記蛋白和9個同型對照抗體。
配製流式染色液：PBS+0.5% BSA+5mM EDTA。用流式染色液重懸新鮮/培養的人HSCs，分別加入檢測板中，每孔50000細胞/50μL，4℃染色30分鐘後，每孔加入100μL流式染色液，400g離心去上清。根據板中一抗類型為小鼠抗體或大鼠抗體，分別用Alexa Fluor® 647–conjugated goat anti-mouse Ig 或goat anti-rat Ig（使用濃度均為1:200倍稀釋）避光4℃染色30分鐘，每孔加入100μL流式染色液，清洗離心2次。
然後用Brilliant Violet 510 anti-human CD34 Antibody （Biolegend, 貨號：343528）和FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody（Biolegend貨號：328108）均以5μL每100μL細胞的使用濃度，避光4℃染色15分鐘。每孔加入100μL流式染色液，400g離心去上清。用100μL流式染色液重懸細胞，在高通量流式細胞儀上進行檢測（BD LSRFortessa Flow Cytometry）。
其流程如圖1所示。
表面蛋白表達的初篩結果如圖2所示。
使用流式細胞法檢測人HSPCs和LT-HSCs上CD66（a,c,d,e）、CD48和CD200表達的示意圖如圖3-1至圖3-3所示。
從圖2可以看出，CD48、CD200和CD66(a、c、d、e)在LT-HSCs(CD34+CD90+CD45RA-)中的表達量明顯高於HSPCs(CD34+)，且差異程度明顯高於其它已測蛋白，說明CD48、CD200、CD66a、CD66c、CD66d和CD66e有望成為LT-HSCs新的表面標記蛋白。
從圖3-1至圖3-3可以看出，CD48、CD200和CD66(a、c、d、e)在LT-HSCs(CD34+CD90+)中的表達量明顯高於HSPCs(CD34+)，說明CD48、CD200、CD66a、CD66c、CD66d和CD66e有望成為LT-HSCs新的表面標記蛋白。
實施例4：表面蛋白表達驗證
針對人HSCs表面蛋白初篩抗體，分別在凍存或新鮮分離的臍血CD34+HSPCs及其對應培養三天後的細胞分別進行進一步複篩鑒定。用下列候選標記蛋白的抗體（表2）分別配合鑒定細胞表型所用抗體（表3），對細胞進行螢光抗體染色，每個條件100000細胞/100μL。避光4℃染色15分鐘後，每孔加入2μL 7AAD（Biolegend，貨號：420404）再避光4℃染色5分鐘，鑒定細胞活率。染色後每管加入1mL流式染色液清洗，400g離心5分鐘後，用100mL流式染色液重懸細胞，在流式細胞分析儀上上樣檢測螢光表達（Beckman Coulter CytoFLEX），用陽性細胞比率和平均螢光強度（MFI）分別表示各表面蛋白的表達。
表2：候選標記蛋白的抗體具體資訊
蛋白名稱 螢光標記 品牌 貨號 使用濃度（每100μL）
CD48 PE 義翹神州 10797-R248-P 5μL
CD66a PE 義翹神州 10822-MM02-P 5μL
CD66c PE 義翹神州 10823-MM12-P 5μL
CD66d PE 義翹神州 11933-MM06-P 10μL
CD66e PE 義翹神州 11077-MM02-P 2μL
CD200 PE 義翹神州 10886-MM17-P 5μL
表3：鑒定細胞表型所用抗體的具體資訊
蛋白名稱 螢光標記 品牌 貨號 使用濃度（每100μL）
CD34 BV510 Biolegend 343528 5μL
CD90 APC Biolegend 328114 5μL
CD45RA FITC Biolegend 304106 5μL
其中，圖4是人造血幹細胞/前驅細胞在體外培養以及未經培養中所含的LT-HSCs差異示意圖。
圖5是對不同來源的HSPCs上表面標記蛋白進行複篩的示意圖。
圖6是用目的蛋白區分HSPCs不同亞群，分析其包含LT-HSCs比例的示意圖。
圖7是對比CD200、CD66e、CD66a亞群所包含LT-HSCs的比例隨培養時間變化的示意圖。
從圖4中可以看出，雖然HSPCs在體外培養體系中可維繫生長，但不能很好的維繫幹性，因而在培養3天後LT-HSCs的比例會下降。
從圖5中可以看出，凍存及新鮮來源的臍血細胞經體外三天培養前後目的蛋白的表達變化，發現LT-HSCs中CD66e和CD66a的比例隨著體外培養而下降，與LT-HSCs的下降趨勢相似；CD200同樣有非常輕微的下降。
從圖6可以看出，凍存及新鮮來源的臍血細胞CD66a、CD66e和CD200表達量越高的亞群富集有更多的LT-HSC（CD34+CD90+CD45RA-）。
從圖7可以看出，未經體外培養的CD34+HSPCs包含10-25%的LT-HSCs，在CD34+CD200+和CD34+CD66a+細胞中LT-HSCs比例相似或略有升高；而在CD34+CD66e+中的LT-HSCs比例明顯更高，新鮮臍血細胞中甚至可大於40%。
實施例5：HSC相關基因表達驗證
首先，通過流式細胞分選得到特定細胞亞群。將臍帶血CD34+細胞進行螢光抗體染色（表4），避光4℃染色15分鐘後，每孔加入2μL 7AAD（Biolegend，貨號：420404）再避光4℃染色5分鐘，鑒定細胞活率。染色後每管加入1mL流式染色液清洗，400g離心5分鐘後，用100μL流式染色液重懸細胞，在流式細胞分選儀上（BD，Aria III）分選出CD34+CD90+CD45RA-CD66e-和CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi兩群細胞（CD66e hi指的是CD66e高表達細胞）。
然後將分選所得細胞在流式細胞分析儀（Beckman Coulter CytoFLEX）上進行細胞表型純度鑒定。
將所得細胞進行RNA提取，而後將其反轉錄為cDNA (全式金一步法cDNA反轉錄試劑盒，AT311-03)，按照表5反應體系（表5）和反應程式（表6）進行qRT-PCT反應 (羅氏6402712001)，結果以GAPDH為參考基因，用2^-△△CT表示各基因表達情況。
表4：流式細胞分選所用抗體的具體資訊
蛋白名稱 螢光標記 品牌 貨號 使用濃度（每100μL）
CD34 BV510 Biolegend 343528 5μL
CD90 APC Biolegend 328114 5μL
CD45RA FITC Biolegend 304106 5μL
CD66e PE 義翹神州 11077-MM02-P 2μL
表5：qRT-PCR反應體系
成分 用量
F primer 1μL
R primer 1μL
MIX 10μL
cDNA 2μL
H2O 6μL
表6：qRT-PCR反應程式
溫度 時間 迴圈數
95℃ 10分 1迴圈
95℃ 30秒 40迴圈
63℃ 30秒
72℃ 15秒
95℃ 10秒 1迴圈
65℃ 1分 升溫斜率2.2℃/S
95℃ 1秒
圖8是流式分選CD34+CD90+CD45RA -CD66e-或CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi細胞以及分選後流式細胞儀分析細胞純度示意圖。
圖9是利用qRT-PCR分別對CD34+，CD34+CD90+CD45RA-CD66e-，CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi三種細胞進行HSC相關基因表達量檢測示意圖。
從圖8中看出經流式細胞分選後CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi純度可達97.5%。
由圖9可以看出，所測的HSC相關基因均在CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi細胞中表達量最高，由此得知CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi富集有更多的HSC。
實施例6
復甦人類CD34+HSPC，在造血幹細胞完全培養基中培養過夜後收集細胞，經過抗人CD34、CD90、CD45RA和CD66e的螢光抗體染色後，用流式細胞儀分選出兩群細胞：CD66e+組:CD34+CD90+CD45RA-CD66e+和CD66e-組:CD34+CD90+CD45RA-CD66e-。將兩群細胞分別移植到經1.0Gy輻射的NPG（NOD-scid Il2rg-/-）免疫缺陷小鼠，每隻小鼠分別移植300、1000或3000個細胞，每組8隻小鼠。在移植後第4周，12周和16周分別檢測小鼠外周血中細胞移植效率，在第16周同時檢測小鼠骨髓和脾臟中的移植效率。移植效率=hCD45 +比例/(hCD45 +比例+mCD45 +比例) x100%，有限稀釋法是利用ELDA線上工具http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/，計算出各細胞亞群所包含有重建能力的HSC比例。
圖10為細胞移植小鼠後，分別於4周、12周和16周檢測外周血中細胞移植效率統計圖。
圖11是通過有限稀釋法計算兩群細胞中含有重建能力的HSC的示意圖。
圖12是移植後第16周時骨髓和脾臟中的移植情況示意圖。
圖10的結果表明，CD34+CD90+CD45RA-CD66e+細胞的移植效率顯著高於CD34+CD90+CD45RA-CD66e-細胞，且移植效率隨著移植細胞數增多而提高。
圖11結果表明，通過有限稀釋法計算出CD34+CD90+CD45RA-CD66e+細胞包含1/529個有重建能力的HSC，比CD34+CD90+CD45RA-CD66e-細胞高60倍。
圖12結果表明，在移植後16周的骨髓和脾臟中，CD34+CD90+CD45RA-CD66e+移植效率同樣遠遠高於CD34+CD90+CD45RA-CD66e-細胞。
實施例7
收集實施例6中移植16周後的小鼠骨髓，二次移植到經1.0Gy輻射的NPG免疫缺陷小鼠。在移植後第16周檢測小鼠骨髓、外周血和脾臟中的移植情況。其中，移植效率=hCD45 +比例/(hCD45 +比例+mCD45 +比例)x100%
圖13是小鼠外周血、骨髓和脾臟中二次移植第16周的移植情況示意圖。
圖13結果表明，CD34+CD90+CD45RA-CD66e+細胞經過二次移植以後表現出長期重建造血系統的功能，且移植效率顯著高於CD34+CD90+CD45RA-CD66e-細胞。
綜上所述，本發明發現上述所述的蛋白均有表徵造血幹細胞例如LT-HSCs的可能性，尤其是CD66e，CD66a和CD200，此外，CD66e可作為人LT-HSCs新的表面標記蛋白。
以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。
無。
圖1是實施例3中進行表面蛋白表達驗證的流程圖。 圖2是實施例3中使用流式細胞法初篩不同表面蛋白在LT-HSCs和HSPCs上表達量差異的示意圖。 圖3-1至圖3-3是實施例3中使用流式細胞法檢測人HSPCs和LT-HSCs上CD66（a,c,d,e）、CD48和CD200表達的示意圖。 圖4是實施例4中對比體外培養或未經培養的HSPCs所含LT-HSCs差異的示意圖。 圖5是實施例4中對不同來源的HSPCs上表面標記蛋白進行複篩的示意圖。 圖6是實施例4中用目的蛋白區分HSPCs不同亞群，分析其包含LT-HSCs比例的示意圖。 圖7是實施例4中對比CD200、CD66a和CD66e亞群所包含LT-HSCs的比例隨培養時間變化的示意圖。 圖8是實施例5中流式分選CD34+CD90+CD45RA-CD66e-或CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi細胞（CD66e hi指的是CD66e高表達）以及分選後流式細胞儀分析細胞純度示意圖，其中，圖8的A為流式分選CD34+CD90+CD45RA -CD66e-或CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi細胞示意圖，圖8的B為流式分選後細胞純度檢測示意圖。 圖9是實施例5中利用qRT-PCR分別對CD34+，CD34+CD90+CD45RA-CD66e-，CD34+CD90+CD45RA-CD66e hi三種細胞進行HSC相關基因表達量檢測示意圖。 圖10是實施例6中細胞移植小鼠後，分別於4周、12周和16周檢測外周血中細胞移植效率統計圖。 圖11是實施例6中通過有限稀釋法計算兩群細胞中含有重建能力的HSC的示意圖。 圖12是實施例6中移植後第16周時骨髓和脾臟中的移植情況示意圖。 圖13是實施例7中小鼠外周血、骨髓和脾臟中的移植情況示意圖。

Claims (31)

  1. 一種蛋白在表徵造血幹細胞中的用途，其中，所述蛋白包括 （1）CD34、CD90和CD45RA；和 （2）選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。
  2. 如請求項1所述的用途，其中，所述蛋白包括 （1）CD34、CD90和CD45RA；和 （2）CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
  3. 一種用於判定造血幹細胞的方法，其包括： 檢測待測細胞是否為CD34陽性； 檢測所述待測細胞是否為CD90陽性； 檢測所述待測細胞是否為CD45RA陰性；和 檢測所述待測細胞是否為下述蛋白陽性， 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上， 當所述待測細胞為CD34陽性、CD90陽性、CD45RA陰性和選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中一種或兩種以上的蛋白陽性時，判定其為所述造血幹細胞。
  4. 如請求項3所述的方法，其中，所述待測細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
  5. 如請求項3或4所述的方法，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
  6. 一種篩選造血幹細胞的方法，其包括： 從待分離細胞中篩選出CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的所述造血幹細胞； 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。
  7. 如請求項6所述的方法，其中，所述待分離細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
  8. 如請求項6或7所述的方法，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
  9. 一種細胞製劑，其包括從待分選的細胞中分選得到的CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的造血幹細胞，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。
  10. 如請求項9所述的細胞製劑，其中，所述待分選的細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
  11. 如請求項9或10所述的細胞製劑，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
  12. 一種製備細胞製劑的方法，其包括： 從待分選細胞中篩選出CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的造血幹細胞； 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種或兩種以上。
  13. 如請求項12所述的方法，其中，所述待分選細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
  14. 如請求項12或13所述的方法，其中，所述蛋白為CD66a、CD66e和/或CD200，優選為CD66e。
  15. 一種用於提高造血系統的重建能力的藥物，其包括如請求項9至11中任一項所述的細胞製劑或者如請求項12至14中任一項所述的方法製備得到的細胞製劑。
  16. 一種重建受試者造血系統方法，包括給予受試者如請求項9至11中任一項所述的細胞製劑或者如請求項12至14中任一項所述的方法製備得到的細胞製劑。
  17. 一種檢測造血幹細胞的試劑盒或產品，包括用於檢測如下各項的化合物： 檢測待測細胞是否為CD34陽性； 檢測所述待測細胞是否為CD90陽性； 檢測所述待測細胞是否為CD45RA陰性；和 檢測所述待測細胞是否為下述蛋白陽性， 其中，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
  18. 如請求項17所述的試劑盒或產品，其中所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
  19. 如請求項17或18所述的試劑盒或產品，其中，所述待測細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
  20. 如請求項17至19中任一項所述的試劑盒或產品，其中所述化合物為抗體。
  21. 如請求項20所述的試劑盒或產品，其中所述抗體為化學標記的抗體，例如發光化合物標記的抗體，例如螢光標記的抗體。
  22. 如請求項20所述的試劑盒或產品，其中所述抗體為附著於磁珠的抗體。
  23. 一種分選或富集造血幹細胞的試劑盒或產品，包括用於從待分選或富集的細胞中分選CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性的所述造血幹細胞的化合物，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上。
  24. 如請求項23所述的試劑盒或產品，其中所述蛋白為CD66a、CD66e和CD200中的一種、二種或三種，優選為CD66e。
  25. 如請求項23或24所述的試劑盒或產品，其中，所述待分選或富集的細胞來源於臍血、募集外周血或骨髓。
  26. 如請求項23至25中任一項所述的試劑盒或產品，其中所述化合物為抗體。
  27. 如請求項26所述的試劑盒或產品，其中所述抗體為化學標記的抗體，例如發光化合物標記的抗體，例如螢光標記的抗體。
  28. 如請求項26所述的試劑盒或產品，其中所述抗體為附著於磁珠的抗體。
  29. 一種篩選造血幹細胞培養基的方法，包括使用待篩選培養基培養造血幹細胞後檢測如下表徵的造血幹細胞的比例的維持或升降，所述造血幹細胞CD34+、CD90+、CD45RA-以及下述蛋白為陽性，所述蛋白選自CD48、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e和CD200中的一種、兩種、三種、四種或四種以上，其中上述表徵的造血幹細胞經過培養後的比例得以維持或上升表示待篩選培養基為適宜的所述造血幹細胞培養基。
  30. 一種經過如請求項29所述的方法篩選的所述造血幹細胞培養基。
  31. 一種治療受試者疾病的方法，包括給予所述受試者有效量的如請求項9至11中任一項所述的細胞製劑或者如請求項12至14中任一項所述的方法製備得到的細胞製劑。
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