TW202227084A

TW202227084A - 用於sars-cov-2突變株治療之niran干擾藥物

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Publication number: TW202227084A
Application number: TW110137819A
Authority: TW
Inventors: 珍皮爾索馬多希; 艾戴爾摩薩; 林凱; 布魯諾坎納德; 亞希利雪儂
Original assignee: 美商亞堤製藥公司
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2022-07-16
Also published as: WO2022076903A1; US20230364121A1; JP2023546030A; EP4225282A1; CA3173701A1

Abstract

本發明提供治療及預防嚴重急性呼吸道症候群(severe acute respiratory syndrome；SARS)相關冠狀病毒(SARS-CoV)(諸如SARS-CoV-2)之感染的方法及選擇用於治療或預防該感染之最佳化合物的分析，該等化合物干擾非結構蛋白12 (non-structural protein 12；nsp12)之套病毒RdRp相關核苷酸轉移酶(NiRAN)域的活性。本發明首次在本文中建立該NiRAN域之作用機制的基礎發現及其如何用於針對SARS-CoV感染(包括SARS-CoV-2感染或暴露)之醫藥療法中。

Description

用於SARS-COV-2突變株治療之NIRAN干擾藥物

本發明提供用非結構蛋白12 (nsp12)之套病毒RdRp相關核苷酸轉移酶(NiRAN)域干擾藥物來治療或預防嚴重急性呼吸道症候群(SARS)相關冠狀病毒(SARS-CoV)，包括SARS-CoV-2突變株或抗性病毒株感染的化合物、方法及組合物。本發明亦提供選擇藉由干擾非結構蛋白12 (nsp12)之NiRAN域之活性來治療或預防SARS-CoV，包括SARS-CoV-2之突變株形式之感染的最佳化合物的分析及方法。

自嚴重急性呼吸道症候群新冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)在2019年12月出現起，其已感染全世界幾乎1.2億人且數百萬人死於所得疾病COVID-19。SARS-CoV-2為冠狀病毒(CoV) (病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒亞科)，其為以其大致26至32千鹼基之單股正義大RNA基因體著稱的有套膜病毒。相關冠狀病毒包括嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV-1)及中東呼吸症候群冠狀病毒(MERS-CoV)。然而，相較於SARS-CoV-1及MERS-CoV，SARS-CoV-2呈現更快的人傳人速率(Huang等人, (2020) Lancet 395, 497-506)，使得其尤其具有挑戰性。

SARS-CoV-2病毒之全基因體首先在2020年1月23日報導(GenBank：MN988668.1 -嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2分離株2019-nCoV WHU01，全基因體；亦參見Chen等人, RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak. Emerg Microbes Infect. 2020年2月5日;9(1):313-319；本文中視為野生型病毒)。

SARS-CoV之複製受一組由其基因體中之開讀框(ORF) 1a及ORF1ab編碼之非結構蛋白質(nsp)控制，其初始地轉譯為多聚蛋白質，隨後蛋白分解裂解以成熟化(Ziebuhr, (2005) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 287, 57-94)。此等蛋白質組裝成多次單元聚合酶複合物以介導病毒基因體之轉錄及複製。此不僅需要新基因體自全長負股模板合成，且亦需要不連續的RNA合成過程以產生次基因體長度負股RNA。後者充當模板以產生自無法進入轉譯病毒基因體RNA之核糖體之基因表現病毒結構性及輔助蛋白所需的次基因體mRNA巢式集合(Sawicki等人, (1995) Adv Exp Med Biol 380:499-506)。

已在SARS-CoV中鑑別出作為具有RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)活性之主要催化次單元的Nsp12 (Ahn等人, (2012) Arch. Virol. 157, 2095-2104)。然而，Nsp12本身能夠具有低效率之聚合酶活性，nsp7及nsp8輔因子之存在顯著提高其聚合酶活性(Subissi等人, (2014) PNAS USA 111, E3900-E3909)。因此，認為nsp12-nsp7-nsp8次複合物為用於實現冠狀病毒RNA合成之實用核心組分。亦觀測到，nsp12-nsp7-nsp8複合物可與nsp14結合，該nsp14為一種攜帶分別涉及複製保真度及5'-RNA加帽之3'-5'核糖核酸外切酶及RNA帽N7-鳥嘌呤甲基轉移酶活性的雙功能酶(Subissi等人, (2014) PNAS USA E3900-E3909)。

為了達成病毒基因體之完全轉錄及複製，需要若干其他nsp次單元組裝成全酶複合物，包括nsp10 (nsp16及Nsp14之輔因子)、nsp13 (解旋酶，5'-三磷酸酶)、nsp15 (NendoU，尿苷酸特異性內切核糖核酸酶)及nsp16 (2'-O-核糖甲基轉移酶) (Romano等人, (2020) Cells 9,1267)。

最近，因為SARS-CoV-2已在全世界擴散，所以其已呈現高突變率。存在對早期病毒株具有活性之醫藥或生物療法將失去針對突變株之功效，或更糟，具有多個突變之病毒株將發展完全抗性的問題。

正在研發多種疫苗以降低或預防SARS-CoV-2感染，且若干種已自美國食品藥物管理局(FDA)獲得緊急使用授權(EUA)。在2020年12月11日，FDA頒予Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗BNT162b2在年齡為16歲及更大之人員中用於預防COVID-19的EUA。在2020年12月18日，FDA頒予ModernaTX, Inc. COVID-19疫苗mRNA-1272用於在18歲及更大之人員中預防COVID-19的EUA。Pfizer疫苗及Moderna疫苗兩者均為編碼SARS-CoV-2刺突蛋白之mRNA疫苗。在2021年2月27日，FDA頒予Johnson & Johnson's COVID-19疫苗(JNJ-78436735)在18歲及更大之人員中用於預防COVID-19的第三個EUA。J&J疫苗為單價疫苗，其由經構築用於編碼SARS-CoV-2刺突(S)蛋白之重組複製缺陷型第26型腺病毒(Ad26)載體構成。

SARS-CoV-2變體中之刺突蛋白之近期突變已引起了大量關於當前疫苗之效用的擔憂。此等所關注/擔憂變體包括α (B.1.1.7；英國)、β (B.1.351、B.1.351.2及B1.351.3；南非)、γ (P.1、P.1.1、P.1.2；巴西)、δ (B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3；印度)、λ (C.37；秘魯)及μ (B.1.621；哥倫比亞)。舉例而言，在小型臨床試驗中，歸因於β變體之刺突蛋白中之E484K突變，顯示Oxford-AstraZeneca疫苗針對β變體的效用降低，此可使得疫苗不太有效，從而導致潛在逃逸突變株。最近，已顯示增加數目之接種個體易受δ變體「爆發性」感染影響，且可能能夠傳播該病毒。參見例如Riemersma等人, Vaccinated and unvaccinated individuals have similar viral loads in communities with a high prevalence of the SARS-CoV-2 delta variant, 2021年7月31日；https://doi.org/10.1101/2021.07.31.21261387。

儘管歸因於由當前疫苗提供之免疫保護機制而更多聚焦於刺突蛋白突變，但已在SARS-CoV-2之其他蛋白質中顯示高遺傳變異率及突變率。參見例如Mohammadi等人, Novel and emerging mutations of SARS-CoV-2: Biomedical implications. Biomed Pharmacother. 2021年7月; 139: 111599。此類額外突變，包括抗病毒藥靶向之突變，引起關於短暫功效的其他擔憂。鑒於最新出現的SARS-CoV-2及其快速突變，用於判定哪些藥物將在病毒顯著突變之後仍有效之資訊不足。用於設計抑制或預防病毒感染之新藥物之資訊不足。實際上，某些針對其他含有正義RNA依賴性-RNA-聚合酶之病毒具有活性之抗病毒化合物針對SARS-CoV-2之活性不足以進行研發。需要新方法及分析來鑑別最佳用於治療或預防SARS-CoV-2，最值得注意地，新出現之突變株的藥物，且基於治療性及防治性治療之新標準，需要新的治療方法。

因此，本發明之目標為提供治療或預防SARS-CoV-2之突變株或抗性病毒株感染之化合物、組合物及方法。

本發明之另一目標為提供用於鑑別及研發有效SARS-CoV-2靶向療法之方法。

已出乎意料地發現，嚴重急性呼吸道症候群(SARS)相關冠狀病毒(SARS-CoV)，諸如SARS-CoV-2之nsp12之NiRAN域在病毒RNA合成中起獨特且基本的作用，其不與大部分其他病毒共用。本發明係基於以下基礎發現：SARS-CoV-2 NiRAN域在經由NiRAN依賴性蛋白質引動的路徑之蛋白質引動的RNA合成中具有重要作用，其中nsp8之酪胺酸羥基首先藉由UTP轉移至nsp8而用尿苷單磷酸共價標記(稱為「UMP化」)，得到UMP-nsp8，接著進一步置於poly(A) 3'端以引動(-)ssRNA股合成(參見圖7H)。此活性已經由實驗證據確認，如下文實例8至20中所例示(亦參見圖5A、圖5B、圖6A、圖13A、圖13C及圖13E)。nsp8之UMP化及所得蛋白質引動的基因體RNA合成路徑表示NiRAN域之先前未知的作用。重要的是，藉由靶向NiRAN依賴性路徑，繞過nsp14之核酸外切酶活性，其已呈現RNA合成鏈終止無效之靶向策略。藉由用NiRAN活性干擾藥劑靶向此NiRAN介導之SARS相關冠狀病毒之活性，可實現用於治療SARS-CoV-2突變株及突變株對治療具有抗性之機會降低的強大工具。

NiRAN 機制之發現重要的是，已發現，NiRAN域(其功能至今未知)涉及RNA合成，與nsp8協作進行蛋白質引動。如本文首次所示，nsp12能夠特異性地使RdRp輔因子nsp8尿苷酸化，形成引動自poly(A)模板進行RNA合成之UMP-nsp8共價中間物，其隨後經由nsp12-nsp8-nsp7最小複製-轉譯複合物(replication-transcription complex；RTC)延伸(參見圖7H；路徑1)。此反應依賴於位於nsp12之N端上之CoV獨特的套病毒RdRp相關核苷酸化(NiRAN)域，且因此表示此域之先前未知的活性。

重要的是，已發現，使用能夠干擾nsp8之NiRAN之UMP化的化合物干擾此NiRAN域活性顯著抑制病毒複製，且提供用於治療SARS相關冠狀病毒感染的強大抗冠狀病毒方法。藉由靶向NiRAN功能，本發明確立可永久地抑制基因體RNA合成。在此發現之前，多種SARS-CoV-2蛋白之未證實功能及/或成藥性使得其尤其難以判定如何治療病毒之突變株形式—且該區域為治療劑之最佳目標—其阻礙潛在有效藥物之鑑別及/或研發。

關鍵地，此發現確認，具有對於SARS-CoV之干擾NiRAN活性之主要機制之化合物提供治療或預防由病毒之突變株形式引起的感染，其中突變不為失能性NiRAN突變。

具有干擾此重要NiRAN活性之化合物優於僅經由在RNA複製期間之RNA鏈終止作用之化合物，此係因為病毒另外可藉由利用其3',5'-核酸外切酶(nsp14)自生長的聚合酶切除併入藥物而逃逸藥物治療。

SARS-CoV-2 nsp12蛋白之序列之長度為932個胺基酸。類似於SARS-CoV-1，SARS-CoV-2之nsp12含有右側C端RdRp域(殘基366至920)及採用套病毒RdRp相關核苷酸轉移酶(NiRAN)架構之套病毒特異性N端延伸域(殘基1至250) (參見圖1) (Gao等人. Science 10.1126/science.abb7498 (2020))。RdRp聚合酶域及NiRAN域由界面域(殘基A250至R365)連接。相較於其他正義RNA病毒，諸如黃病毒之聚合酶次單元，NiRAN及界面域代表冠狀病毒RdRp之額外及獨特特徵(Duan等人, (2017) EMBO J. 36, 919-933；Godoy等人, (2017) Nat. Commun. 8, 14764；Zhao等人, (2017) Nat. Commun. 8, 14762)。在本發明之前，SARS-CoV-2中之nsp12之獨特NiRAN域之作用為未知的，由於NiRAN域之先前提議的功能因冠狀病毒複製的複雜性、NiRAN域對於冠狀病毒的獨特性及來自具有SARS NiRAN域之提議功能之其他病毒的域的矛盾及不同進化、結構及功能特性而複雜化(參見Lehmann (2015) Nucleic Acids Research, 第43卷, 第17期, 第8416-8434頁)。nsp12藉以起始RNA複製之準確機制以及其複製產物之性質迄今為止仍未表徵。

本發明係基於基於SARS-CoV-2病毒NIRAN域之蛋白質引動之起始之重要性的發現。傳統上，病毒RdRp一般分類為兩個大類：重新(引子非依賴性)起始及寡核苷酸引子依賴性起始(Kao等人. 2001. Virology 287:251-260)。然而，用於此等廣泛定義群組內之特定機制可顯著變化。在一些病毒，諸如小核糖核酸病毒科( Picornaviridae)之成員(例如脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)及口蹄疫病毒)中，稱為「蛋白質引動的」RNA合成之RNA合成的額外機制在不存在RNA引子下發生(參見Rohayem等人, (2006) J Virol. 2006年7月; 80(14): 7060-7069)。在此等病毒中，基因體RNA之RNA合成之起始依賴於稱為VPg之病毒蛋白(病毒粒子蛋白質，基因體相關)在聚腺苷酸化基因體RNA存在下的尿苷化及後續伸長。此「蛋白質引動的」起始發生於伸長的VPg-poly(U)退火為病毒基因體之poly(A)尾之後的小核糖核酸病毒科中。在小核糖核酸病毒科，諸如脊髓灰白質炎病毒中，VPg必須在其可充當複製之引子之前經受轉譯後尿苷化。3Dpol (脊髓灰白質炎病毒之RdRp)能夠藉由使用2C-ATP酶之莖環結構(順式作用複製元件)內之polyA序列作為模板來合成Vpg-pUpU-OH (參見例如Goodfellow等人, J Virol. 2000; 74:4590-4600；Paul等人, J Virol. 2000;74:10359-10370；Rieder等人, J Virol. 2000; 74:10371-10380)。此外，需要順式5'端三葉草結構(cloverleaf)以形成涉及將VPg尿苷化之3Dpol預起始RNA複製複合物。

在此發現之前，尚未知曉SARS-CoV-2使用哪種機制來實現基因體RNA之合成。本文現揭示，SARS-CoV RNA蛋白質引動的RNA複製之機制係經由NiRAN介導之蛋白質引動結合nsp8來實現，其中nsp8可以Vpg樣方式起作用，且其中合成的RNA與蛋白質共價結合。如本文所示，NiRAN域將尿苷鹼基轉移至nsp8。後續UMP-nsp8複合物在不存在引子下，經由共價結合的UMP與(+) RNA polyA模板之3'端處之互補鹼基之鹼基配對而促進RNA合成。依次將核苷酸添加至產物股中。所得最終產物為共價連接有nsp8之(-) RNA股。此nsp-UMP蛋白引動策略對自poly(A)尾模板化之負股合成(minus strand synthesis)具特異性。干擾此路徑加強本發明。

已顯示Nsp14自雙股(ds) RNA受質切除3′端錯配核苷酸，且提供用以促進CoV RNA合成之保真度之複製錯配修復機制(Bouvet等人. (2010). PLoS Pathog. 6: e1000863. 數位物件識別碼：10.1371/journal.ppat.1000863)。如上文所描述，藉由靶向NiRAN域及干擾NiRAN依賴性蛋白質引動的合成，避免由nsp14提供之外顯子校正功能，其為在複製期間保持冠狀病毒基因體之天然保真度所必需的。舉例而言，已顯示，nsp14可有效切除利巴韋林(ribavirin) 5′-單磷酸，從而可能解釋為何此廣譜抗病毒藥針對CoV之活性不佳(參見Snijder等人. (2003). J. Mol. Biol. 331, 991-1004. 數位物件識別碼：10.1016/s0022-2836(03)00865-9；Ferron等人. (2018) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E162-E171. 數位物件識別碼：10.1073/pnas.1718806115)。因為由nsp14提供之外顯子校正功能能夠逆轉多個抑制性機制，從而經由抑制NiRAN域活性來靶向RNA合成為一種優良方法。

本文中亦顯示，平行的NiRAN非依賴性重新合成亦在CoV複製期間發生，其中SARS-CoV RTC合成5'-三磷酸二核苷酸引子起始RNA合成。如實例13至15及圖8A至圖8B及圖9A至圖9B中所示，nsp12之RdRp活性位點結合nsp7及nsp8驅動pppNpN二核苷酸引子，較佳地pppGpU二核苷酸引子以NiRAN非依賴性方式合成，該引子用於引動自基因體5'端在基因體-poly(A)尾接合處開始的(-) ssRNA合成(參見圖7H；路徑2)。其與poly(A)尾接合處之保守基因體RNA髮夾序列在nsp12 RdRp活性位點附近結合，以合成能夠引動互補股之RNA合成的pppGpU二核苷酸引子。

由 SARS-CoV 突變株引起之感染之治療或預防由於此基礎發現，現已判定，某些核苷酸藥物，包括式I之彼等藥物，包括但不限於化合物1、2、1A、1B、2A及2B，在SARS相關冠狀病毒之NiRAN域處獨特地起作用，此允許藉由投與有效量之化合物或此化合物之醫藥學上可接受之鹽(視情況在醫藥學上可接受之載劑中)而治療感染或可能已暴露於或可能暴露於SARS-CoV (包括SARS-CoV-2)之突變株形式的宿主(包括人類)，該突變形式在NiRAN域中不具有失能性突變。在另一態樣中，式II至VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於藉由投與有效量之式II至VIII之化合物或式II至VIII之化合物或其鹽之醫藥學上可接受之鹽(視情況在醫藥學上可接受之載劑中)來治療感染或可能已暴露於或可能暴露於SARS-CoV之突變株形式的宿主(包括人類)，該突變形式在NiRAN域中不具有失能性突變。

先前已顯示馬動脈炎病毒之NiRAN域在核苷酸化期間相對於GTP優先併入UTP (參見Lehmann等人, Nucleic Acids Res. 2015年9月30日; 43(17): 8416-8434)。然而，出人意料地發現，某些基於鳥苷之核苷酸(例如AT-9010，其為AT-511 (化合物1A)及AT-527 (化合物2A)之活性2'-氟-2'-C-甲基鳥苷-5'-三磷酸，如Good等人, (2020) PLoS ONE 15(1): e0227104中所描述，且進一步描述於例如美國專利第9,828,410號及第10,519,186號中，其以引用之方式併入本文中)，相對於尿苷-5'-三磷酸(UTP)及鳥苷-5'-三磷酸(GTP)兩者，優先經NiRAN域併入，仍與NiRAN域之活性位點結合，且能夠抑制UTP及GTP自nsp12之NiRAN域轉移至nsp8 (參見例如實例19；圖13A至圖13C及圖14A至圖14C)。舉例而言，當與在等莫耳濃度下之UTP及GTP競爭時，AT-9010分別抑制UTP及GTP自nsp12轉移至nsp8 75%及64% (參見例如實例8)。

在MgCl ₂存在下nsp12之熱位移分析確認，AT-9010比任何其他天然核苷酸提供更大的熱力學穩定性(實例20；圖13F至圖13H)。在MnCl ₂存在下nsp12之熱位移分析確認，AT-9010比任何其他天然核苷酸提供更大的熱力學穩定性(圖13F至圖13H)。NiRAN及RdRp活性位點突變體(分別為K73A及SAA)之比較顯示，此穩定性增加係由AT-9010優先結合於NiRAN活性位點而非RdRp活性位點中提供。GTP-及AT-9010-nsp12複合物兩者相較於UTP結合的複合物均顯示穩定性增加，且此外能夠在MgCl ₂以及MnCl ₂存在下結合於NiRAN活性位點中(實例19至20；圖13A至圖13C)。與抑制結果一致，此等結果指示，鳥苷為NiRAN活性位點之較佳鹼基，且AT-9010之2'-氟-2'-C-甲基核糖修飾提供額外穩定性。相對較地，腺苷核苷酸瑞德西韋(Remdesivir)及 ^m7GTP不佳地抑制藉由nsp12將UTP轉移至nsp8 (參見實例19，圖13A至圖13C)，且指示，基於鳥苷之核苷酸可能為基於NiRAN之抑制的最佳候選者。

相比較地，尿嘧啶核苷酸索非布韋(sofosbuvir)相較於AT-9010在阻斷藉由nsp12進行nsp8 UMP化方面之效率低約5倍，使得此類尿嘧啶核苷酸在一般抑制冠狀病毒病毒複製方面之效率顯著較低(參見例如實例2、表2A、表2B、表3A、表3B；實例19)。此外，鑒於NiRAN域併入UTP及GTP以便於RNA合成之偏好，瑞德西韋，其被稱為腺苷核苷酸但實際上為不代謝成腺苷(或鳥嘌呤)之吡咯并[2,1-f] [1,2,4]三𠯤-4-胺，可能不具有NiRAN抑制劑活性。假定缺乏NiRAN抑制活性之瑞德西韋可對以下做出解釋：其限制功效，以及歸因於其在鹼基上之不常見的氰基1'-取代或不常見的吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-4-胺鹼基而與RdRp的結合可能降低。

SARS-CoV-2不斷突變，此可增加毒力及傳染速率。某些抗病毒藥之使用已顯示在延長治療之後導致病毒之抗藥性變體，此係歸因於不足功效及編碼抗病毒藥所靶向之病毒組分之基因出現突變。舉例而言，使用取決於將突變引入病毒基因體中以進行抑制之誘變藥劑可導致引入藥物誘發之突變，該等突變最初對於病毒而言可能不致命，從而允許病毒繼續複製同時進一步積累額外突變。替代地，在SARS相關冠狀病毒之情況下，使用依賴於RNA複製鏈終止之藥物可允許經由nsp14之核酸外切酶活性而切除終止核苷酸，此可在置換期間經不完美的鹼基對匹配置換，從而導致在基因體病毒序列中積累其他突變。重要的是，本文所描述之化合物可提供針對SARS-CoV-2之強效抗病毒活性而無需在病毒中誘導或驅動額外突變。舉例而言，如實例27中所示，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，AT-511 (化合物1A)不會驅動或誘導病毒進一步突變。相對較地，如實例27中所示，其他靶向SARS-CoV-2之抗病毒藥(諸如莫努拉韋(molnupiravir))可導致突變誘發增加。

已經鑑別之不在NiRAN域中之SARS-CoV-2突變之非限制性實例提供於具體實施方式中。視情況在醫藥學上可接受之載劑中之式I以及式II-VII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可用於醫學療法中，以治療或預防攜帶一或多個此等突變之SARS-CoV-2感染，其中突變單獨或與其他突變組合出現。一般而言，已發現SARS-CoV-2傾於隨著時間推移突變，使得本發明對於健康照護解決方案而言極其重要。

在非限制性實例中，視情況在醫藥學上可接受之載劑中之式I以及式II-VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可用於醫學療法中，以治療或預防SARS-CoV-2變體，包括但不限於(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)所定義) α (Pango譜系：B.1.1.7)、β (Pango譜系：B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)、γ (Pango譜系：P.1、P.1.1、P.1.2)、δ (Pango譜系：B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3)、μ (Pango譜系：B.1.621、B.1.621.1)、η (Pango譜系：B.1.525)、ι (Pango譜系：B.1.526)、κ (Pango譜系：B.1.617.1)、λ (Pango譜系：C.37)、ε (Pango譜系：B.1.427、B.1.429)、ζ (Pango譜系：P.2)及θ (Pango譜系：P.3)。由本文所描述之化合物及方法所靶向之額外SARS-CoV-2變體包括Pango譜系P.2、P.3、R.1、R.2、B.1.466.2、B.1.621、B.1.1.318、B.1.1.519、C.36.3、C.36.3.1、B.1.214.2、B.1.1.523、B.1.619、B.1.620、B.1.621、B.1.617.3。

在某些態樣中，用式I-VIII之化合物治療具有SARS-CoV-2之突變株形式之人類或宿主可在與野生型病毒(在2020年1月23日標識為GenBank：MN988668.1)實質上相同的劑量下及治療方案來實現。在替代實施例中，在治療或預防方案中或如認可的活體外分析中所量測，所選擇之如本文所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽維持針對突變或抗性SARS-CoV-2病毒之活性的至少95%、至少93%、至少90%或至少80%或85%。

在某些態樣中，視情況在醫藥學上可接受之載劑中之式I以及式II-VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可與一或多種額外活性劑組合或交替用於醫學療法中，以治療或預防SARS-CoV-2變體或突變株。在一些實施例中，額外活性劑選自但不限於以下中之一或多者：額外抗病毒劑、抗炎劑、或免疫抑制劑或免疫調節劑。在一些實施例中，額外活性劑選自但不限於以下：瑞德西韋、瑪瑞路單抗(mavrilumab)、莫努拉韋(molnupiravir)、巴瑞替尼(baricitinib)、托西利單抗(tocilizumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、賽瑞單抗(sarilimab)、卡瑞單抗(asirivimab)、依德單抗(imdevimab)、地塞米松(dexamethasone)、普賴松(prednisone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、皮質醇(hydrocortisone)、巴尼單抗(bamlanivimab)、艾特森韋單抗(etesevimab)；莫努拉韋(molnupiravir)、索非布韋(sofosbuvir)、GC376、PF-07304814、PF-07321332、EDP-235、PBI-0451、ALG-097111、索曲韋單抗(sotrovimab) (VIR-7831)、VIR-7832、BRII-196、BRII-198、ADG20、ADG10或其組合。在一些實施例中，額外活性劑為莫努拉韋。在一些實施例中，額外活性劑為瑞德西韋。在一些實施例中，額外活性劑為索非布韋。在一些實施例中，額外活性劑為PF-07321332。在一些實施例中，額外活性劑為EDP-235。

在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以500 mg至1200 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少500 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少550 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少600 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少650 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少700 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少750 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少800 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少850 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少900 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少950 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少1000 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少1050 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少1100 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以至少1150 mg之劑量投與，一天兩次。在一些實施例中，化合物為化合物2A，其以約550 mg之劑量投與，一天兩次。

用於鑑別干擾 SARS-CoV NiRAN 域之化合物之分析及方法 .NiRAN域之此功能作用之基本發現允許藉由以下二者中之一者篩選及鑑別能夠抑制由NiRAN域介導之RNA合成的化合物：i)直接抑制NiRAN功能；或2)使用當轉移至NiRAN之專性RNA合成搭配物nsp8時，由NiRAN併入且能夠干擾NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成的化合物，及後續使用此等NiRAN介導之活性干擾化合物(NiRAN干擾化合物)來治療性治療及預防COVID-19及/或SARS-CoV感染，包括但不限於SARS-CoV-2感染。如本文所描述之化合物抑制NiRAN介導之活性的能力可使用如本文中之實例中所描述之活體外分析，或此項技術中已知之類似活體外分析來測定，且將其與其中在相同分析中不存在該化合物的對照比較。

因此，基於NiRAN域在病毒複製中之重要作用之發現之本發明的另一實施例為鑑別及使用化合物，例如核苷酸，包括穩定的磷酸酯前藥，諸如穩定的三磷酸酯(例如提供核苷之5'-單磷酸之胺基磷酸酯、硫代胺基磷酸酯或硫代磷酸酯)，該化合物有效干擾NiRAN介導之RNA合成活性且因此能夠治療SARS-CoV病毒(包括例如SARS-CoV-2)的野生型形式、在NiRAN域中不攜帶失能性突變的突變形式或抗藥形式。此代表一種相對於不能夠進行NiRAN抑制但依賴於其他非排他性抑制機制(諸如錯併入及錯配)之化合物(其經受抵抗冠狀病毒nsp14之校正核酸外切酶活性)顯著改良的抗病毒策略。

使用本文中之教示，選擇對於人類治療具有有利特性之藥物來治療COVID-19及/或SARS相關冠狀病毒感染，包括SARS-CoV-2。選擇能夠經由NiRAN活性干擾而抑制RNA合成之化合物提供在目前SARS-CoV治療性治療最佳技術方面之關鍵改良，且克服某些當前SARS-CoV-2治療策略固有的挑戰。

藉由設計已發現作為本發明之一部分之干擾NiRAN介導之RNA合成功能的化合物，可選擇對於病毒而言致命的化合物來用於COVID-19療法及/或SARS-CoV感染，此係因為當破壞NiRAN RNA合成作用時，病毒不具有編輯或設計能力。此產生一種藉由靶向不具有已知同源物之獨特區域而控制SARS-CoV-2及其他SARS相關病毒感染的根本上新的且強大的手段，且大大有助於鑑別對於SARS相關病毒，包括SARS-CoV-2具有特異性且具選擇性的藥物。

因此，在一些實施例中，提供一種用於治療或預防有需要之宿主(通常人類)之COVID-19或SARS相關冠狀病毒感染之方法，其包括：(i)選擇相對於RNA依賴性-RNA-聚合酶(RdRp)之鏈終止抑制功能或錯配併入功能或除其以外，其主要機制為干擾NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成的化合物；及(ii)向宿主投與有效量的藥物以治療或預防感染。在某些實施例中，藥物為非天然存在之核苷酸，且在一具體實施例中，其為或經代謝成鳥嘌呤三磷酸及/或單磷酸或尿苷三磷酸及/或單磷酸衍生物，其中糖部分為非天然存在的，例如呈式I-VIII中之任一者中獨立描繪的糖部分物種形式。在一些實施例中，核苷酸在糖之2'-位置中具有烷基及/或鹵基(諸如氟或氯)部分。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，核苷酸不會驅動或誘導所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)進一步突變。

當在下文使用術語鳥嘌呤三磷酸時，意欲包括含有式I-VIII中之任一者中獨立描繪的糖部分物種的任何鳥苷部分。

因此，鑑別及使用化合物，例如有效干擾NiRAN介導之RNA合成活性之所選擇核苷酸，相對於不能夠進行NiRAN抑制但依賴於其他非排他性抑制性機制(諸如錯併入及錯配)之化合物(其經受抵抗冠狀病毒nsp14之校正核酸外切酶活性)提供顯著改良的抗病毒策略。

根據本文中之基本發現，能夠抑制NiRAN介導之RNA合成活性之化合物可經由篩選來鑑別或經設計及因其可能用途而選擇用於治療或預防由SARS-CoV-2引起的COVID-19，或治療或預防SARS相關冠狀病毒感染，包括SARS-CoV-2之突變及變異形式。

因此，在本發明之一態樣中，提供一種用於治療或預防有需要之宿主(通常人類)之COVID-19或SARS相關冠狀病毒感染之方法，其包括：(i)選擇呈現干擾NiRAN介導之RNA合成之作用機制的核苷酸藥物；及(ii)向宿主投與有效量的藥物以治療或預防感染。在一些態樣中，相對於活體外無化合物之正常水準，在等莫耳濃度之UTP及/或GTP以及測試化合物中，所選擇核苷酸抑制天然UTP及/或GTP自nsp12轉移至nsp8至少約50%。在一些實施例中，UTP及GTP兩者之轉移受抑制至少約50%。在另一實施例中，UTP及/或GTP之轉移受抑制至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，UTP之轉移受抑制至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，GTP之轉移受抑制至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，使用例如如實例8中所描述之活體外分析或與其類似之分析來量測抑制。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制或減少藉由nsp12進行之nsp8之NiRAN介導的UMP化。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制UMP化至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，使用例如如實例8-10、17及19-20中所描述之活體外分析或與其類似之分析來量測抑制。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制蛋白質引動的RNA合成。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制蛋白質引動的RNA合成至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，使用例如如實例12、19及20中所描述之活體外分析或與其類似之分析來量測蛋白質引動的RNA合成之抑制。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制或減少NiRAN介導之引子非依賴性RNA合成。在一替代實施例中，所選擇核苷酸抑制nsp8引子酶活性。在一替代實施例中，所選擇核苷酸抑制nsp8腺苷化酶活性。在替代實施例中，所選擇核苷酸仍與NiRAN活性位點結合且不轉移至nsp8。在一些實施例中，所選擇核苷酸亦抑制或阻止經nsp9之NiRAN域進行UMP化。在一些實施例中，宿主之COVID-19或SARS-CoV相關冠狀病毒感染係由SARS-CoV-2之突變/變異形式引起。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，核苷酸不會驅動或誘導所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)進一步突變。

因此，在本發明之另一態樣中，提供一種用於治療或預防有需要之宿主(通常人類)之COVID-19及/或SARS相關冠狀病毒感染之方法，其包括：(i)選擇相對於其RdRp鏈終止功能呈現干擾NiRAN介導之RNA合成之主要作用機制的核苷酸藥物；及(ii)向宿主投與有效量的藥物以治療或預防感染。在一些態樣中，相對於活體外無化合物之正常水準，在等莫耳濃度之UTP及/或GTP以及測試化合物中，所選擇核苷酸抑制天然UTP及/或GTP自nsp12轉移至nsp8至少約50%。在一些實施例中，UTP及GTP兩者之轉移受抑制至少約50%。在另一實施例中，UTP及/或GTP之轉移受抑制至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，UTP之轉移受抑制至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，GTP之轉移受抑制至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，使用例如如實例8-12、17、19或20中所描述之活體外分析或與其類似之分析來量測抑制。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制或減少藉由nsp12進行之nsp8之NiRAN介導之UMP化至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制或減少NiRAN依賴性蛋白質引動的RNA合成起始至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制或減少NiRAN介導之引子非依賴性RNA合成至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一替代實施例中，所選擇核苷酸抑制nsp8引子酶活性。在另一替代實施例中，所選擇核苷酸抑制nsp8腺苷化酶活性。在替代實施例中，所選擇核苷酸仍與NiRAN活性位點結合且不轉移至nsp8。在一些實施例中，所選擇核苷酸亦抑制或阻止經nsp9之NiRAN域進行UMP化。在一些實施例中，宿主之COVID-19或SARS相關冠狀病毒感染係由SARS-CoV-2之突變/變異形式引起。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，核苷酸不會驅動或誘導所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)進一步突變。

在本發明之又一態樣中，提供一種用於治療或預防有需要之宿主(通常人類)之COVID-19或SARS相關冠狀病毒感染之方法，其包括：(a)藉由分析化合物之以下能力來鑑別及選擇能夠抑制NiRAN介導之活性的核苷酸：(i)預防或降低天然UTP及/或GTP與NiRAN之活性區域的結合至少25%或更多；(ii)預防或降低天然UTP與NiRAN之活性UMP化位點的結合(參見例如實例8-10、12、17、19-20)至少25%或更多；(iii)預防或降低天然NTP與NiRAN之活性NMP化位點的結合至少25%或更多；(iv)預防或降低天然UTP及/或GTP與NiRAN域中之不變的離胺酸殘基K73的結合至少25%或更多；(v)預防或降低天然UTP及/或GTP進入NiRAN域之活性位點至少25%或更多；(vi)預防或降低天然UTP及/或GTP進入NiRAN域之活性位點至少25%或更多，其中活性位點為襯有以下殘基的袋：K73、R74、H75、N79、E83、R116、N209、G214、D218、F219及F222 (參見例如Chen等人，2020, Cell182, 1-14)；(vii)預防或降低天然UTP及/或GTP進入NiRAN域之活性位點至少25%或更多，其中活性位點為襯有以下殘基的袋：K50、R55、T120、N209、Y217；(viii)與不變的離胺酸殘基K73結合；(ix)與NiRAN域的活性位點袋結合；(x)與NiRAN域的活性位點袋結合，其中活性位點袋襯有以下殘基：K73、R74、H75、N79、E83、R116、N209、G214、D218、F219及F222；(xi)與NiRAN域的活性位點袋結合，其中活性位點袋襯有以下殘基：K50、R55、T120、N209、Y217；(xii)預防藉由NiRAN域將天然UTP及/或GTP轉移至少25%或更多；(xiii)預防天然GTP及/或UTP轉移至nsp8至少25%或更多；或(xiv)預防蛋白質引動的RNA合成之起始或完成至少25%或更多；或其組合，其中量測係相較於其中不存在化合物的對照；及接著(b)若核苷酸能夠抑制NiRAN介導的活性，則向有需要之宿主投與有效量的所選擇核苷酸。在一些實施例中，宿主之COVID-19或感染係由SARS-CoV-2之突變/變異形式引起。在一些實施例中，相較於其中不存在化合物之對照，所選擇核苷酸抑制NiRAN介導之活性至少50%或更多，例如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更多。在替代實施例中，所選擇核苷酸仍與NiRAN活性位點結合且不轉移至nsp8。在一些實施例中，所選擇核苷酸亦抑制或阻止經nsp9之NiRAN域進行UMP化。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，核苷酸不會驅動或誘導所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)中進一步突變。在一些實施例中，NiRAN介導之活性經化合物之抑制使用如本文中，例如實例8-12、17或19-20中所描述之活體外分析或與其類似之分析測定。

在本發明之另一態樣中，提供一種用於鑑別能夠抑制SARS-CoV中之NiRAN介導之活性之化合物的方法，其包含： i. 使化合物在UTP及/或GTP存在下與SARS-CoV之nsp12蛋白接觸；及 ii. 量測化合物、GTP及/或UTP與NiRAN域之結合；其中相較於GTP及/或UTP，由化合物結合之高水準指示化合物能夠抑制NiRAN介導之活性。在一些實施例中，該方法提供在UTP存在下使化合物及nsp12接觸。在一些實施例中，該方法提供在GTP存在下使化合物及nsp12接觸。在一些實施例中，該方法提供在UTP及GTP存在下使化合物及nsp12接觸。在一些實施例中，該方法提供在GTP及/或UTP存在下使化合物及nsp12接觸，其中GTP及/或UTP以比化合物更大之濃度存在。在一些實施例中，該方法提供在GTP及/或UTP存在下使化合物及nsp12接觸，其中GTP及/或UTP與化合物呈等莫耳濃度。在一些實施例中，若相較於其中不存在化合物之對照，化合物以相對於UTP及/或GTP約1.25X、1.5X、1.75X、2.0X、2.25X、2.5X、2.75X、3.0X、3.25X、3.5X或更大結合NiRAN域，則該化合物係鑑別為能夠抑制NiRAN介導之活性的化合物。在一些實施例中，若相較於當不存在化合物時，化合物以相對於GTP 1.5X或更大結合NiRAN域，則該化合物係鑑別為能夠抑制NiRAN域之化合物。在一些實施例中，若相較於當不存在化合物時，化合物以相對於UTP 3.0X或更大結合NiRAN域，則該化合物係鑑別為能夠抑制NiRAN域之化合物。在一些實施例中，使用例如如實例8-10、17、19或20中所描述之活體外分析或與其類似之分析，來測定化合物之結合。在一些實施例中，向個體投與如本文所提供之所鑑別NiRAN干擾化合物以預防或治療SARS-CoV感染。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。在一些實施例中，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2之突變/變異形式。在一些實施例中，向個體投與如本文所提供之所鑑別NiRAN干擾化合物以預防或治療COVID-19。在一些實施例中，向個體投與以預防或治療SARS-CoV感染之NiRAN抑制性化合物為或經代謝成基於鳥苷之核苷酸類似物。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，化合物不會驅動或誘導在所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)進一步突變。

在本發明之另一態樣中，用於治療或預防宿主(諸如人類)之SARS-CoV感染之方法包含：(a)鑑別能夠抑制NiRAN介導之活性的化合物，其包含： i. 使化合物在UTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12蛋白及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定化合物是否抑制nsp8之UMP化；及(b)若化合物能夠抑制NiRAN介導之活性，則向有需要之宿主投與有效量之化合物；其中相較於其中不存在化合物之對照，藉由NiRAN域進行之nsp8之UMP化經抑制至少25%或更多指示化合物能夠抑制NiRAN介導的活性。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制UMP化至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，使用例如如實例8-10、17及19-20中所描述之活體外分析或與其類似之分析來量測抑制。在一些實施例中，向個體投與經鑑別之NiRAN抑制性化合物以預防或治療SARS-CoV感染。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。在一些實施例中，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2之突變/變異形式。在一些實施例中，向個體投與以預防或治療SARS-CoV感染之NiRAN抑制性化合物為或經代謝成鳥苷核苷酸。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，化合物不會驅動或誘導所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)進一步突變。

在本發明之另一態樣中，用於治療或預防宿主(諸如人類)之SARS-CoV感染之方法包含：(a)鑑別能夠抑制NiRAN介導之活性的化合物，其包含： i. 使化合物在UTP及/或GTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12蛋白及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定化合物是否抑制nsp8之核苷酸化；及(b)若化合物能夠抑制NiRAN介導之活性，則向有需要之宿主投與有效量之化合物；其中相較於其中不存在化合物之對照，藉由NiRAN域進行之核苷酸化經抑制至少25%指示化合物能夠抑制NiRAN介導的活性。在一些實施例中，所選擇核苷酸抑制核苷酸化至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更大。在一些實施例中，使用例如如實例8-10及19-20中所描述之活體外分析或與其類似之分析來量測抑制。在一些實施例中，該方法提供在UTP存在下使化合物、nsp12及nsp8接觸。在一些實施例中，該方法提供在GTP存在下使化合物、nsp12及nsp8接觸。在一些實施例中，該方法提供在UTP及GTP存在下使化合物、nsp12、nsp8接觸。在一些實施例中，該方法提供在GTP及/或UTP存在下使化合物、nsp12及nsp8接觸，其中GTP及/或UTP以比化合物更大之濃度存在。在一些實施例中，該方法提供在GTP及/或UTP存在下使化合物、nsp12及nsp8接觸，其中GTP及/或UTP與化合物呈等莫耳濃度。在一些實施例中，相較於其中不存在化合物之對照，化合物降低nsp8之核苷酸化至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多。在一些實施例中，向個體投與經鑑別之NiRAN抑制性化合物以預防或治療SARS-CoV感染。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。在一些實施例中，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2之突變/變異形式。在一些實施例中，向個體投與以預防或治療SARS-CoV感染之NiRAN抑制性化合物為或經代謝成鳥苷核苷酸。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，化合物不會驅動或誘導所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)進一步突變。

在本發明之又一態樣中，提供一種用於治療或預防COVID 19及/或SARS-CoV感染之方法，其包含：(a)鑑別能夠抑制SARS相關冠狀病毒中之NiRAN介導之活性的化合物，其包含： i. 使化合物在UTP及/或GTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定化合物是否抑制UTP及/或GTP自nsp12轉移至nsp8；及(b)若化合物能夠抑制NiRAN介導之活性，則向有需要之宿主投與有效量之化合物；其中相較於其中不存在化合物之對照，藉由NiRAN域進行之UTP及/或GTP之轉移經抑制至少25%或更多指示化合物能夠抑制NiRAN介導之活性。在一些實施例中，該方法提供在UTP存在下使化合物及nsp12與nsp8接觸。在一些實施例中，該方法提供在GTP存在下使化合物及nsp12與nsp8接觸。在一些實施例中，該方法提供在UTP及GTP存在下使化合物及nsp12與nsp8接觸。在一些實施例中，該方法提供使化合物在GTP及/或UTP存在下與nsp12及nsp8接觸，其中GTP及/或UTP以比化合物更大之濃度存在。在一些實施例中，該方法提供使化合物在GTP及/或UTP存在下與nsp12及nsp8接觸，其中GTP及/或UTP與化合物呈等莫耳濃度。在一些實施例中，若相較於其中不存在化合物之對照，化合物降低GTP及/或UTP自nsp12轉移至nsp8至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、95%、97%、98%、99%或更多，則該化合物係鑑別為能夠抑制NiRAN域活性。在一些實施例中，使用例如如實例8-10、17及19-20中所描述之活體外分析或與其類似之分析來量測抑制。在一些實施例中，向個體投與經鑑別之NiRAN抑制性化合物以預防或治療SARS-CoV感染。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。在一些實施例中，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2之突變/變異形式。在一些實施例中，向個體投與以預防或治療SARS-CoV感染之NiRAN抑制性化合物為或經代謝成鳥苷核苷酸。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，化合物不會驅動或誘導所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)進一步突變。

在本發明之另一態樣中，提供一種用於治療或預防SARS-CoV感染之方法，其包括：(a)鑑別能夠抑制SARS相關冠狀病毒中之蛋白質引動的RNA合成的化合物，其包含： i. 使該化合物在UTP及poly(A) RNA模板存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12、nsp7及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定該化合物是否在UTP存在下抑制poly(A) RNA模板上之引子非依賴性RNA合成；及(b)若該化合物能夠抑制蛋白質引動的RNA合成，則向有需要之宿主投與有效量之化合物；其中相較於其中不存在化合物之對照，在UTP存在下抑制poly(A) RNA模板上之引子非依賴性RNA合成至少25%或更多指示化合物能夠抑制引子非依賴性RNA合成。在一些實施例中，該方法提供呈nsp12:nsp7-nsp8複合物形式之nsp12、nsp7及nsp8。在一些實施例中，該方法提供呈nsp12:7L8:8聚合酶複合物形式之nsp12、nsp7及nsp8。在一些實施例中，該方法提供呈1:3:3莫耳比之nsp12:7L8:8聚合酶複合物。在一些實施例中，nsp12、nsp7及nsp8聚合酶複合物呈1:3:6莫耳比。在一些實施例中，nsp12:7L8:8聚合酶複合物呈1:3:6莫耳比。在一些實施例中，若相較於其中不存在化合物之對照，化合物降低poly(A) RNA模板之引子非依賴性RNA合成至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，則該化合物係鑑別為能夠抑制引子非依賴性RNA合成。在一些實施例中，向個體投與經鑑別之NiRAN抑制性化合物以預防或治療SARS-CoV感染。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。在一些實施例中，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2之突變/變異形式。在一些實施例中，向個體投與以預防或治療SARS-CoV感染之NiRAN抑制性化合物為或經代謝成鳥苷核苷酸。

在以下態樣中，提供一種治療或預防宿主之SARS-CoV感染之方法，其包含：(a)鑑別能夠在個體中提供抑制SARS-CoV複製之化合物，其包含： i. 選擇核苷酸； ii. 篩選核苷酸以判定該化合物是否抑制病毒之NiRAN介導之活性；及 (b)若化合物抑制病毒之NiRAN介導之活性，則向有需要之宿主投與有效量之化合物；其中若相較於其中不存在化合物之對照，化合物抑制以下中之一或多者：至少25%或更多，則判定該化合物抑制NiRAN介導之活性：a)NiRAN介導之nsp8 UMP化；b)NiRAN介導之nsp8的核苷酸化；c)抑制UMP自nsp12之NiRAN域轉移至nsp8；d)抑制核苷酸自nsp12之NiRAN域轉移至nsp8；e) NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成；f)相對於天然UTP及GTP優先與nsp12之NiRAN域結合；g)當以1:1比率分析時，相對於天然UTP之至少約3倍優先與NiRAN域結合；h)當以1:1比率分析時，相對於天然GTP之至少約1.5倍優先與NiRAN域結合；i)結合NiRAN域中之不變的離胺酸殘基K73；或其組合。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物為所選擇之鳥苷核苷酸。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物為穩定的磷酸酯前藥。在一些實施例中，向個體投與經鑑別之NiRAN抑制性化合物以預防或治療SARS-CoV感染。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。在一些實施例中，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2之突變/變異形式。在替代實施例中，化合物仍與NiRAN活性位點結合且不轉移至nsp8。在一些實施例中，化合物亦抑制或阻止經nsp9之NiRAN域進行UMP化。在一些實施例中，向個體投與以預防或治療SARS-CoV感染之NiRAN抑制性化合物為或經代謝成所選擇之鳥苷核苷酸。在一些實施例中，相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，化合物不會驅動或誘導所靶向之SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)進一步突變。在一些實施例中，若相較於其中不存在化合物之對照，化合物抑制NiRAN介導之活性至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、95%、97%、98%、99%或更多，則該化合物係鑑別為能夠抑制NiRAN介導之活性。

在以下態樣中，提供一種治療或預防宿主之SARS-CoV感染之方法，其包含：(a)鑑別能夠在個體中提供抑制SARS-CoV感染之化合物，其包含： i. 選擇核苷酸； ii. 篩選核苷酸以判定化合物是否抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成；及 (b)若化合物抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成，則向有需要之宿主投與有效量之化合物；其中若相較於其中不存在化合物之對照，化合物抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成至少25%或更多，則判定該化合物抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成，且因此能夠抑制SARS-CoV感染。在一些實施例中，若相較於其中不存在化合物之對照，化合物抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、95%、97%、98%、99%或更多，則該化合物係鑑別為能夠抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。在一些實施例中，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2之突變/變異形式。在一些實施例中，向個體投與以預防或治療SARS-CoV感染之化合物為所選擇之鳥苷核苷酸。

在另一態樣中，提供一種用於治療或預防個體之SARS-CoV感染之方法，其包含： i) 判定個體是否已感染了SARS-CoV； ii) 鑑別具有NiRAN抑制活性之化合物，其中相較於其中不存在化合物之對照，化合物抑制NiRAN介導之活性至少25%或更多指示化合物具有NiRAN抑制活性；及 iii) 向個體投與有效量之NiRAN抑制性化合物。

在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物抑制NiRAN介導之活性nsp8 UMP化。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物抑制NiRAN介導之活性nsp8核苷酸化。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物抑制核苷酸自nsp12之NiRAN域轉移至nsp8。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物抑制蛋白質引動的RNA合成及RdRP介導之引子非依賴性重新RNA合成。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物抑制蛋白質引動的RNA合成及引子依賴性RNA鏈延伸。在一些實施例中，相對於天然UTP及GTP，NiRAN抑制性化合物優先與nsp12之NiRAN域結合。在一些實施例中，當以1:1比率分析時，相對於天然UTP之至少約3倍，NiRAN抑制性化合物優先與NiRAN域結合。在一些實施例中，當以1:1比率分析時，相對於天然GTP之至少約1.5倍，NiRAN抑制性化合物優先與NiRAN域結合。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物結合NiRAN域中之不變的離胺酸殘基K73。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物為所選擇之核苷酸。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物為所選擇之鳥苷核苷酸。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物為穩定的磷酸酯前藥。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。在一些實施例中，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2之突變/變異形式。在一些實施例中，向個體投與以預防或治療SARS-CoV感染之NiRAN抑制性化合物為所選擇之鳥苷核苷酸。

本文亦提供一種抑制SARS-CoV中之NiRAN域活性之方法，其包含使冠狀病毒與NiRAN干擾化合物接觸，其中NiRAN干擾化合物藉由以下起作用：a)抑制NiRAN介導之nsp8 UMP化；b)抑制NiRAN介導之nsp8核苷酸化；c)抑制核苷酸自nsp12之NiRAN域轉移至nsp8；d)抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成；e)相對於天然UTP及GTP，優先與nsp12的NiRAN域結合；f)當以1:1比率分析時，相對於天然UTP之至少約3倍優先與NiRAN域結合；g)以1:1比率分析時，相對於天然GTP之至少約1.5倍優先與NiRAN域結合；或h)結合NiRAN域中之不變的離胺酸殘基K73；或其組合。

在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物亦能夠抑制NiRAN非依賴性重新二核苷酸合成。在一些實施例中，化合物能夠抑制SARS-CoV病毒RTC (nsp12:nsp7L8:nsp8)合成5'三磷酸二核苷酸引子。在一些實施例中，二核苷酸引子為pppGpU。在一些實施例中，NiRAN抑制性化合物能夠抑制在poly(A)尾模板及pppNpN二核苷酸(例如pppGpU二核苷酸)存在下，自對應於SARS-CoV基因體3'端之最後20個核苷酸(ST20)之雜聚RNA進行的poly(U)合成。

本文所描述或藉由本文所描述之方法鑑別之NiRAN干擾化合物可用於治療或預防人類中SARS-CoV感染(包括SARS-CoV-2感染)及由此引起之病症，包括但不限於病毒的抗藥性及多重抗性形式及病毒感染的相關疾病病況、病狀或併發症，包括肺炎，諸如2019新冠狀病毒感染的肺炎(novel coronavirus-infected pneumonia；NCIP)、急性肺損傷(acute lung injury；ALI)及急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome；ARDS)。可使用本文所描述之NiRAN干擾化合物治療或預防之由SARS-CoV-2引起之額外非限制性併發症包括低氧血症型呼吸衰竭、急性呼吸衰竭(acute respiratory failure；ARF)、急性肝損傷、急性心臟損傷、急性腎損傷、敗血性休克、彌散性血管內凝血、血凝塊、多系統發炎性症候群、慢性疲勞、橫紋肌溶解症及細胞介素風暴。

除當前對於罹患SARS-CoV之患者，例如COVID-19患者之標準照護以外，可與健康照護提供者視為有益於患者之任何其他化合物或療法組合或交替投與如本文所描述之NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽，如下文更詳細地描述。組合及/或交替療法可為防治性、治療性、輔助性或姑息性的。

相關申請案之聲明本申請案係關於且主張以下之優先權：2020年10月9日提交之美國臨時申請案第63/090,090號、2021年1月8日提交之美國臨時申請案第63/135,494號、2021年3月12日提交之美國臨時申請案第63/160,618號及2021年8月23日提交之美國臨時申請案第63/236,151號。此等申請案中之每一者之全文以引用之方式併入本文中。

2型嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV-2)為冠狀病毒科(CoV)病毒目之人類病原體，其正在造成流行性，至今導致超過250萬死亡(https://covid19.who.int/)。此已引起大規模的全球研究成果。關於導引CoV複製及病毒RNA之轉錄的特異性機制的許多機制仍需要學習很多，對於適當抗病毒策略而言具有直接重要性。

具有約30,000個核苷酸，CoV正義RNA (+RNA)基因體比大量人類病原性+RNA病毒(諸如登革熱(dengue)、茲卡(zika)及脊髓灰白質炎病毒)之基因體大致大三倍。此大小差異反映獲取新域，儘管為CoV特異性藥物目標之潛在候選者，但許多仍不佳地表徵。病毒基因體主要由兩個大開讀框Orf1a及Orf1ab構成，其經轉譯，得到16種負責病毒複製及基因體維持之非結構蛋白(nsp1-nsp16) (Hartenian等人. J Biol Chem. 2020年9月11日; 295(37): 12910-12934)。在此等中為病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp，nsp12)，其與兩種小輔因子蛋白質nsp7及nsp8結合，形成能夠進行RNA合成之最小複製轉譯複合物(replication-transcription complex；RTC) (Subissi等人Proc Natl Acad Sci U S A. 2014年9月16日; 111(37): E3900-E3909；Kirchdoerfer等人, (2019) Nat Commun. 5月28日;10(1):2342)。CoV基因體之3'端指定次基因體mRNA巢式集合，其經轉譯，得到結構及輔助蛋白。

一旦在目標細胞中表現，病毒RdRp及相關蛋白質必須在精確末端處勤奮地起始病毒RNA合成以確保複製所有遺傳資訊。RNA病毒已進化出各種各樣的起始策略，通常係由RdRp中細微結構變化支配。起始通常分成兩個主要類別：重新(引子非依賴性)及引子依賴性。然而，此等廣泛定義群組內之特定機制可顯著變化。在CoV之情況下，起始RNA合成之機制尚未充分瞭解且有爭論。在此過程中已考慮病毒蛋白nsp8，此係由於據報導其合成短引動性寡核苷酸(Imbert等人, A second, non-canonical RNA-dependent RNA polymerase in SARS coronavirus. EMBO J. 2006年10月18日;25(20):4933-42)以及執行性腺苷特異性末端轉移酶(Tvarogova等人J Virol. 2019年5月29日;93(12): e00291-19)、及引子延伸活性(Te Velthuis等人Nucleic Acids Res. 2012年2月; 40(4): 1737-47)。在結構層級上，CoV RdRp與「小拇指」RNA聚合酶，諸如小核糖核酸病毒科之彼等RNA聚合酶有關(Peersen. Virus Res. 2017年4月15日; 234: 4-20)。此等聚合酶經由『蛋白質引動』機制引動RNA合成(Paul等人Virus Res. 2015年8月3日; 206: 12-26)，從而稱為VPg (病毒蛋白基因體連接的)之小病毒肽的酪胺酸羥基首先經尿苷單磷酸共價標記(稱為UMP化)。接著，VPg-pU延伸至二核苷酸且用於引動RNA合成，得到仍與病毒VPg共價連接之基因體RNA。值得注意的是，CoV nsp12 (僅RdRp之上游)之N端含有稱為NiRAN之套病毒特異性域，已顯示該域介導核苷酸單磷酸(nucleotide monophosphate；NMP)共價轉移至各種病毒輔因子蛋白質(Lehmann等人, Nucleic Acids Research,第43卷,第17期, 2015年9月30日, 第8416-8434頁；Slanina等人, PNAS 2021年2月9日118 (6) e2022310118；Conti等人, (2020) 數位物件識別碼：https://doi.org/10.1101/2020.10.07.330324)。

某些核苷酸被細胞激酶代謝成活性5'-三磷酸形式，其會與天然核苷酸三磷酸(nucleotide triphosphate；NTP)競爭被RdRp併入至病毒RNA中。一旦併入後，此等核苷酸不是造成RNA合成之鏈終止，就是充當致死地改變病毒之基因構成的誘變核苷酸。然而，CoV在RNA病毒中脫穎而出，因為它具有能夠切除錯配鹼基及鏈終止核苷酸之RNA修復性3'-至-5'核酸外切酶(ExoN，nsp14)(Minskaia等人, PNAS 2006年3月28日;103(13):5108-13；Eckerle等人, J Virol 81: 12135-12144；Eckerle等人, (2010) PLOS Pathogens 6(5): e1000896；Bouvet等人, PNAS 2012年6月12日109 (24) 9372-9377；Ferron PNAS. 2018年1月9日;115(2): E162-E171)，通常錯配鹼基及鏈終止核苷酸會損害此等藥物之功效。

本發明係基於以下的基本發現：SARS-CoV之NiRAN域在病毒RNA合成之起始作用的角色及此域被某些核苷酸靶向以抑制病毒複製的能力。現發現且確立CoV nsp7-(nsp8)2-nsp12最小RTC可經由兩個獨特路徑起始RNA合成：一者為蛋白質引動且經由nsp8之UMP化由NiRAN域介導；且另一者為經由以NiRAN非依賴性方式重新合成二核苷酸引子。NiRAN轉移酶活性及重新合成之抑制藉由前藥AT-527 (化合物2A)之活性三磷酸AT-9010以及以類似方式對NiRAN起作用之其他核苷酸實現。該等發現允許研發用於鑑別適用於治療SARS-CoV-2感染(包括對當前治療具有抗性或易發展抗性之SARS-CoV-2突變株)之化合物的方法。

定義除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同的含義。儘管類似或等效於本文所描述之方法及材料可用於本發明的實踐或測試中，但下文描述適合的方法及材料。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。倘若有衝突，本說明書(包括定義)將占主導。另外，該等材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。

「烷基」為直鏈或分支鏈飽和脂族烴基。在某些實施例中，烷基為C ₁-C ₂、C ₁-C ₃、C ₁-C ₄、C ₁-C ₅或C ₁-C ₆(亦即，烷基鏈之長度可為1、2、3、4、5或6個碳)。如本文所用之指定範圍指示描述為獨立物種之具有該範圍之各成員之長度的烷基。舉例而言，如本文所用之C ₁-C ₆烷基指示烷基具有1、2、3、4、5或6個碳原子且欲意謂此等烷基中之每一者經描述為獨立物種，且如本文所用之C ₁-C ₄烷基指示烷基具有1、2、3或4個碳原子且欲意謂此等烷基中之每一者經描述為獨立物種。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、三級戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、及2,3-二甲基丁烷。

「環烷基」為飽和單環烴環系統。環烷基之非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基及環己基。

「鹵烷基」為其中一或多個氫原子經鹵素置換之烷基(例如單鹵烷基、二鹵烷基及三鹵烷基)。非限制性實例包括氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氯-2-氟甲基及2-氟異丁基。鹵烷基可進一步經取代。

「芳基」指示一或多個芳族環中僅含有碳的芳族基。在一些實施例中，芳基含有1至3個分開的環或稠合環且具有6至約14或18個環原子，但無雜原子作為環成員。芳基包括例如苯基及萘基，包括1-萘基及2-萘基。在一些實施例中，芳基為側基。側接環之實例為經苯基取代之苯基。在一些實施例中，芳基視情況如上文所描述經取代。在一些實施例中，芳基包括例如二氫吲哚、二氫苯并呋喃、異吲哚啉-1-酮及吲哚啉-2-酮。

「芳基(烷基)-」為經如本文所描述之芳基取代的如本文所描述之烷基。實例包括苯甲基、2-苯基(烷基)、3-苯基(烷基)及萘基(烷基)。

「雜芳基」係指含有1至3個或在一些實施例中含有1、2或3個選自N、O、S、B或P (且通常選自N、O及S)之雜原子且其餘環原子為碳的穩定單環、雙環或多環芳環，或含有至少一個5、6或7員芳環，該芳環含有1至3個或在一些實施例中1至2個選自N、O、S、B或P之雜原子且其餘環原子為碳的穩定雙環或三環系統。在一些實施例中，唯一雜原子為氮。在一些實施例中，唯一雜原子為氧。在一些實施例中，唯一雜原子為硫。單環雜芳基通常具有5或6個環原子。當雜芳基中S及O原子之總數超過1時，此等雜原子彼此不相鄰。雜芳基之實例包括但不限於吡啶基(包括例如2-羥基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如4-羥基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡𠯤基、呋喃基、噻吩基、異㗁唑基、噻唑基、㗁二唑基、㗁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、四氫異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、㖕啉基、吲唑基、吲吊基、呔𠯤基、嗒𠯤基、三𠯤基、異吲哚基、喋啶基、嘌呤基、㗁二唑基、三唑基、噻二唑基、呋呫基、苯并呋呫基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并㗁唑基、喹唑啉基、喹㗁啉基、㖠啶基、四氫呋喃基及呋喃并吡啶基。

術語「雜烷基」係指如本文所定義之烷基或鹵烷基部分，其中CH ₂基團經一或多個雜原子置換，或碳原子經一或多個雜原子取代，該等雜原子例如胺、羰基、羧基、側氧基、硫基、磷酸酯基、膦酸酯基、氮、磷、矽或硼(boron)。在一些實施例中，唯一雜原子為氮。在一些實施例中，唯一雜原子為氧。在一些實施例中，唯一雜原子為硫。在一些實施例中，「雜烷基」用於指示具有1至6個碳原子之雜脂族基(環狀、非環狀、經取代、未經取代、分支鏈或未分支鏈)。

除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另外陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)之使用不具限制性。

「患者」或「宿主」或「個體」為需要治療或預防SARS-CoV感染之人類或非人類動物。通常，宿主為人類。「患者」或「宿主」或「個體」亦指例如哺乳動物、靈長類動物(例如人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、鳥類及其類似動物。

術語「防治性」或「預防性」當使用時係指投與活性NiRAN抑制性化合物以預防、降低SARS-CoV感染，諸如SARS-CoV-1或SARS-CoV-2出現或復發之可能性，或相對於將在無此類治療之情況下出現之感染將新感染降至最低。本發明包括治療及防治性或預防性療法。在一些實施例中，向已暴露於SARS-CoV感染(諸如SARS-CoV-1或SARS-CoV-2)且因此處於感染SARS-CoV感染風險下之宿主投與活性NiRAN抑制性化合物。在另一替代實施例中，提供一種預防傳染之方法，其包括在暴露於可經感染之人群之前，包括在旅行或公共事件或會議期間，包括例如在傳染情況之前至多3、5、7、10、12、14天或更多天，持續足夠時長向人類投與有效量的本文所描述之化合物中之一者。

術語「共同投與(coadminister/coadministration)」或「組合地」用於描述與至少一種其他抗病毒活性劑組合投與NiRAN干擾化合物。共同投與之時序最好由治療患者之醫學專家來判定。有時需要同時投與藥劑。替代地，選擇用於組合療法之藥物在不同時間向患者投與。當然，在超過一種病毒或其他感染或其他病狀存在時，本發明化合物可視需要與其他藥劑組合以治療該其他感染或病狀。

可向個體投與呈其醫藥學上可接受之鹽形式之經由本文所描述之方法鑑別的NiRAN干擾化合物。「醫藥學上可接受之鹽」為本發明化合物之離子形式，其中母體化合物經改質為無異常毒性之其無機及有機的酸或鹼加成鹽。本發明化合物之鹽可藉由已知化學方法自具有鹼性或酸性部分之母體化合物合成。一般而言，此類鹽可藉由使此等化合物之游離酸形式與化學計算量之適當鹼(諸如Na、Ca、Mg或K之氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或其類似物)反應，或藉由使此等化合物之游離鹼形式與化學計算量之適當酸反應來製備。此類反應通常在水中或有機溶劑中，或在兩者之混合物中進行。一般而言，在可行之情況下，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈之非水性介質為典型的。本發明化合物之鹽可視情況以溶劑合物形式提供。

醫藥學上可接受之鹽之實例包括但不限於鹼性殘基，諸如胺之無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基，諸如羧酸之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似者。醫藥學上可接受之鹽包括由例如不過度有毒之無機酸或有機酸形成之母體化合物的鹽及四級銨鹽。舉例而言，酸鹽包括自無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、胺基磺酸、磷酸、硝酸及其類似酸)衍生的鹽；及自有機酸(諸如乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、撲酸、順丁烯二酸、羥基順丁烯二酸、苯乙酸、麩胺酸、苯甲酸、水楊酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對胺基苯磺酸、2-乙醯氧基苯甲酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙基磺酸、HOOC-(CH ₂)n-COOH，其中n為0-4，及其類似酸)製備的鹽，或使用產生相同相對離子的不同酸製備的鹽。其他適合鹽之清單可見於例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa.,第1418頁(1985)。

化合物可以遞送所需結果之鹽的任何莫耳比遞送。舉例而言，化合物可具有小於莫耳當量之相對離子，諸如呈半硫酸鹽形式。替代地，化合物可具有超過莫耳當量之相對離子，諸如呈二硫酸鹽形式。化合物與相對離子之莫耳比之非限制性實例包括1:0.25、1:0.5、1:1及1:2。

用於治療或預防 SARS 相關冠狀病毒 ，包括 SARS-CoV-2 突變株或抗性形式之感染的化合物在一個態樣中，本文揭示之本發明包括一種破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或用於治療或預防有需要之宿主(例如人類)之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式的方法，其包含投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

式 I其中 R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基。

在某些實施例中，R ¹不為C ₁-C ₆烷基。在某些實施例中，R ¹不為甲基。在某些實施例中，R ²不為芳基。在某些實施例中，R ²不為苯基。在某些實施例中，R ³不為氫。在某些實施例中，R ^4a及R ^4b不係選自氫及C _1-6烷基。在某些實施例中，R ^4a及R ^4b不係選自氫及甲基。在某些實施例中，R ⁵不為C _1-6烷基。在某些實施例中，R ⁵不為異丙基。

式I化合物之非限制性實例包括化合物 1及化合物 2。在一些實施例中，化合物以S-鏡像異構物，諸如化合物 1A之形式投與。在一些實施例中，化合物以R-鏡像異構物，諸如化合物 1B之形式投與。在一些實施例中，式I化合物為化合物 2、化合物 2A或化合物 2B。

化合物 1

化合物 2

化合物 1A

化合物 1B

化合物 2A

化合物 2B

可使用之化合物 1或其醫藥學上可接受之鹽的替代組態包括：

可使用之化合物 2之替代組態包括：

式I化合物之非限制性實例包括：

或其醫藥學上可接受之鹽。

式I化合物之額外非限制性實例包括：

或其醫藥學上可接受之鹽。

式I化合物之額外非限制性實例包括：

或其醫藥學上可接受之鹽。

本發明亦包括一種有效量之式II化合物之用途，其用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒的突變或抗性形式：

式II 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基。

式II化合物之非限制性實例包括化合物 3及化合物 4。在一些實施例中，化合物以S-鏡像異構物，諸如化合物 3A及化合物 4A之形式投與。在一些實施例中，化合物以R-鏡像異構物，諸如化合物 3B或化合物 4B之形式投與。

化合物 3

化合物 4

化合物 3A

化合物 3B

化合物 4A

化合物 4B

化合物 3或其醫藥學上可接受之鹽的替代組態包括：

化合物 4之額外替代組態包括：

式II化合物之非限制性實例包括：

或其醫藥學上可接受之鹽。

式II化合物之額外非限制性實例包括：

或其醫藥學上可接受之鹽。

式II化合物之額外非限制性實例包括：

或其醫藥學上可接受之鹽。

本發明亦包括一種有效量之式III化合物之用途，其用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式：

式 III或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基； X選自F、Cl、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基及C ₁-C ₃羥基烷基；及 Y為Cl或F。

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIa化合物：

式IIIa 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIa之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIa之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIa之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIa之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIa之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIa之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIa之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIa之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIa之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIa化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIb化合物：

式IIIb 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIb之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIb之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIb之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIb之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIb之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIb之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIb之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIb之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIb之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIb化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIc化合物：

式IIIc 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIc之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIc之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIc之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIc之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIc之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIc之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIc之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIc之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIc之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIc化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIId化合物：

式IIId 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIId之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIId之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIId之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIId之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIId之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIId之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIId之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIId之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIId之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIId化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIe化合物：

式IIIe 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIe之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIe之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIe之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIe之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIe之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIe之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIe之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIe之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIe之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIe化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIf化合物：

式IIIf 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIf之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIf之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIf之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIf之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIf之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIf之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIf之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIf之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIf之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIf化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIg化合物：

式IIIg 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIg之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIg之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIg之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIg之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIg之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIg之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIg之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIg之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

式IIIg化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIh化合物：

式IIIh 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIh之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIh之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIh之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIh之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIh之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIh之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIh之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIh之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

式IIIh化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIi化合物：

式IIIi 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIi之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIi之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIi之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIi之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIi之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIi之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIi之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIi之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIi之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIi化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIj化合物：

式IIIj 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIj之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIj之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIj之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIj之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIj之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIj之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIj之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIj之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIj之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIj化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防SARS-CoV-2突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIk化合物：

式IIIk 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIk之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIk之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIk之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIk之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIk之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIk之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIk之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIk之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIk之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIk化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIl化合物：

式IIIl 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIl之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIl之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIl之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIl之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIl之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIl之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIl之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIl之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIl之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

式IIIl化合物之非限制性實例包括：

在一些實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式III化合物為式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之化合物：

式IIIm

式IIIn

式IIIo

式IIIp 或其醫藥學上可接受之鹽。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，R ¹為甲基。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，R ¹為環丙基。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，R ²為苯基。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，R ²為萘基。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，R ^4a為氫且R ^4b為甲基。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，R ⁵為異丙基。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，化合物為S _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，化合物為R _p-異構物且胺基磷酸酯呈L-組態。

在式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽為半硫酸鹽。

在式IIIp之一些實施例中，X為F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIp之一些實施例中，X為F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIp之一些實施例中，X為F，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIp之一些實施例中，X為F，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIo之一些實施例中，X為Cl，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIo之一些實施例中，X為Cl，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIo之一些實施例中，X為Cl，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIo之一些實施例中，X為Cl，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIn之一些實施例中，X為Cl，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIn之一些實施例中，X為Cl，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIn之一些實施例中，X為Cl，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIn之一些實施例中，X為Cl，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIm之一些實施例中，X為F，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIm之一些實施例中，X為F，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIm之一些實施例中，X為F，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IIIm之一些實施例中，X為F，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

式IIIm、式IIIn、式IIIo或式IIIp之化合物之非限制性實例包括

本發明亦包括一種式IV化合物之用途，其用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防如本文所描述之有需要之宿主之SARS-CoV-2的突變或抗性形式：

式IV 或其醫藥學上可接受之鹽其中 R ⁶選自氫、-C(O)R ^6A、-C(O)OR ^6A、C _1-6烷基、-CH ₂-O-R ^6A； R ^6A選自氫、C _1-6烷基、C ₁-C ₆鹵烷基(例如-CHCl ₂、-CCl ₃、-CH ₂Cl、-CF ₃、-CHF ₂、-CH ₂F)、芳基、芳基(C _1-6烷基)-，其中芳基視情況經選自以下一個取代基取代：烷氧基、羥基、硝基、溴、氯、氟、疊氮基及鹵烷基； R ⁷為NH ₂、H或-NR ⁸R ⁹； R ⁸及R ⁹獨立地選自氫、C _1-6烷基、-C(O)R ^6A及-C(O)OR ^6A； Y選自F及Cl； Z選自甲基、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基、C ₁-C ₃羥基烷基及鹵素(包括Cl及F)，或在一替代實施例中，Z為C _1-6烷基；及 R ¹、R ²、R ³、R ^4a、R ^4b及R ⁵如本文所定義。

R ⁶之非限制性實例包括

。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CHCH ₂，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂CH ₂，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂CH ₂，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂CH ₂，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂CH ₂，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CHCH ₂，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CHCH ₂，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CHCH ₂，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為F，Y為F，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為F，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為F，Y為F，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₃，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CF ₃，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為Cl，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂F，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CHCH ₂，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂CH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂CH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂CH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CH ₂CH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CHCH ₂，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CHCH ₂，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CHCH ₂，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NH ₂。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為H。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NR ⁸R ⁹。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)R ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，R ⁵為C ₁-C ₆烷基，及R ⁷為NHC(O)OR ^6A。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為Cl，R ¹為甲基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為C ₁-C ₄烷基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

在式IV之一些實施例中，Z為CCH，Y為Cl，R ¹為環丙基，R ²為芳基，R ³為氫，R ^4a為氫，R ^4a為甲基，及R ⁵為C ₁-C ₆烷基。

式IV化合物之非限制性實例包括

式IV化合物之額外非限制性實例包括：

本發明亦包括一種之式V、式VI或式VI之化合物之用途，其中R ¹⁰為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或R ^10A，其中R ^10A為活體內代謝成單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯之穩定的磷酸酯前藥，其用於破壞冠狀病毒中的NiRAN功能或治療或預防如本文所描述之有需要之宿主之SARS-CoV-2疾病的突變或抗性形式：


式 V	式 VI

式 VII

其中R ¹⁰選自

及R ^10A； R ^10A為活體內代謝成單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯之穩定的磷酸酯前藥； R ¹¹選自氫及R ¹；及 R ¹選自C ₁-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基。

本發明亦包括一種式VIII化合物之用途，其用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防如本文所描述之有需要之宿主中之SARS-CoV-2的突變或抗性形式：

式VIII 或其醫藥學上可接受之鹽：其中 R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基； R ⁶選自氫、-C(O)R ^6A、-C(O)OR ^6A、C _1-6烷基、-CH ₂-O-R ^6A； R ^6A選自氫、C _1-6烷基、C ₁-C ₆鹵烷基(例如-CHCl ₂、-CCl ₃、-CH ₂Cl、-CF ₃、-CHF ₂、-CH ₂F)、芳基、芳基(C _1-6烷基)-，其中芳基視情況經選自以下一個取代基取代：烷氧基、羥基、硝基、溴、氯、氟、疊氮基及鹵烷基； R ⁷為NH ₂、H或-NR ⁸R ⁹； R ⁸及R ⁹獨立地選自氫、C _1-6烷基、-C(O)R ^6A及-C(O)OR ^6A； Y選自F及Cl；及 Z選自C _1-4烷基(包括甲基)、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基、C ₁-C ₃羥基烷基及鹵素(包括Cl及F)。

式VIII化合物之非限制性實例包括：

在一個實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式VIII化合物為式VIIIa化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

式VIIIa。

式VIII化合物之非限制性實例包括但不限於：

。

式VIII化合物之額外非限制性實例包括但不限於：

。

在一個實施例中，用於破壞冠狀病毒中之NiRAN功能或治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式VIII化合物為式VIIIb化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

式VIIIb。

在一個實施例中，用於治療或預防有需要之宿主中之SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之式VIII化合物為式VIIIc化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

式VIIIc。

式VIIIc化合物之非限制性實例包括：

式VIII化合物可根據歸屬於Alios Biopharma之US 8,895,723及8,871,737中描述之程序合成。舉例而言，使用本發明之代表性化合物之通用合成顯示於下文：

其中R'選自Cl、Br、I、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟乙酸酯或經至少一個拉電子基團取代之芳基氧化物，該拉電子基團包括但不限於2-硝基苯氧化物、4-硝基苯氧化物、2,4-二硝基苯氧化物、五氟苯氧化物、2-氯-4-硝基苯氧化物；2,4-二氯苯氧化物；及2,4,6-三氯苯氧化物。

多種方法可用於式(A)化合物與式(B)化合物之間的反應中。在一些實施例中，使用鹼、酸或格林納試劑(Grignard reagent)，式(A)化合物可與式(B)化合物偶合。在一些實施例中，為了促進偶合，可使用格林納試劑。適合格林納試劑已為熟習此項技術者所知且包括但不限於氯化烷基鎂及溴化烷基鎂。在一些實施例中，格林納試劑可具有R ^X-MgBr或R ^X-MgCl之通式，其中R ^X可為視情況經取代之烷基或視情況經取代之芳基。在一些實施例中，式(A)化合物與式(B)化合物之間的反應可在鹼存在下進行。舉例而言，可向式(A)化合物與鹼之混合物中添加式(B)化合物。

鹼之實例包括但不限於視情況經取代之胺鹼，諸如烷基胺(包括單烷基胺、二烷基胺及三烷基胺(例如單乙胺、二乙胺及三乙胺))、視情況經取代之吡啶(諸如三甲基吡啶)及視情況經取代之咪唑(例如N-甲基咪唑))。在一些實施例中，式(A)化合物與式(B)化合物之間的反應可在N-甲基咪唑存在下進行。在一些實施例中，式(A)化合物與式(B)化合物之間的反應可在酸存在下進行。適合酸之實例為三氟甲磺酸。

在一些實施例中，鹼，諸如N-甲基咪唑(NMI)可置換式(B)化合物之氯，形成中間物。此中間物可與式(A)化合物反應，形成本發明之式VIII化合物。當鹼為NMI時，可形成式(C)化合物，其中相對離子為氯離子。

在一些實施例中，式(B)化合物與鹼(諸如NMI)之間的反應可得到式Sp-C化合物及式Rp-C化合物之非鏡像異構混合物：

在一些實施例中，式(B)化合物與鹼之間的反應可得到可富集一種關於磷之非鏡像異構物，例如(S)-非鏡像異構物的式(C)化合物(化合物Sp-C)。在一些實施例中，式(B)化合物與如本文所描述之鹼(諸如NMI)之間的反應可得到關於磷之(S)-非鏡像異構物可富集≧60%、≧75%、≧90%之式(C)化合物。在一些實施例中，式(B)化合物與如本文所描述之鹼(諸如NMI)之間的反應可得到非鏡像異構混合物，其中式Sp-C化合物與式Rp-C化合物之非鏡像異構比率為2或更多:1。在其他實施例中，式(B)化合物與鹼之間的反應可得到可富集關於磷之(R)-非鏡像異構物的式(C)化合物(化合物Rp-C)。在其他實施例中，式(B)化合物與如本文所描述之鹼(諸如NMI)之間的反應可得到關於磷之(R)-非鏡像異構物可富集≧60%、≧75%、≧90%之式(C)化合物。在其他實施例中，式(B)化合物與如本文所描述之鹼(諸如NMI)之間的反應可得到非鏡像異構混合物，其中式Rp-C化合物與式Sp-C化合物之非鏡像異構比率為2或更多:1。

在一個實施例中，式(B)化合物與如本文所描述之鹼(諸如NMI)之間的反應可得到關於磷之(R)-非鏡像異構物可富集≧90%之式(C)化合物。在此實施例中，Rp-C將與化合物A反應，得到Sp-立體化學富集之式VIII化合物。舉例而言，使用本發明之代表性化合物之通用反應顯示於下文：

。

替代地，在磷處無立體化學之式VIII化合物可使用習知方法，諸如製備型HPLC分離，得到Rp-異構物及Sp-異構物：

SARS-CoV-2 突變株或抗性形式之治療或預防SARS-CoV-2病毒之全基因體首先在2020年1月23日報導(GenBank：MN988668.1 -嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2分離株2019-nCoV WHU01，全基因體；亦參見Chen等人, RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak. Emerg Microbes Infect. 2020年2月5日;9(1):313-319)，且大體上形成用於鑑別SARS-CoV-2之突變率的基礎。SARS-CoV-2，如其他SARS相關冠狀病毒，已顯示高突變率，且此突變率驅動SARS相關冠狀病毒進化及基因體變異，從而潛在地使得SARS相關冠狀病毒(諸如SARS-CoV-2)能夠逃逸宿主免疫性且產生抗藥性。

重要的是，許多靶向SARS-CoV-2之初始治療係基於初始報導的基因序列衍生，包括經批准的疫苗BNT162b2 (Pfizer, Inc.及BioNTech)、mRNA-1273 (ModernaTX, Inc.)、Regeneron抗體及恢復期血漿，且許多早期抗病毒藥物候選者經由藥物靶向位點模型化及/或使用初始報導的蛋白質胺基酸序列研發之生物分析來分析。自初始報導SARS-CoV-2基因體序列開始，已鑑別出大量SARS-CoV-2變體，其可潛在地影響各種治療之治療功效。舉例而言，最近在結構性刺突蛋白中鑑別出之大量突變已提高了疫苗策略可能歸因於突變逃避而呈現為不太有效的問題。

SARS相關冠狀病毒(諸如SARS-CoV-2)中之突變積累可為若干倍。如同其他RNA病毒，SARS相關冠狀病毒中之突變率實質上比DNA病毒高，且RNA病毒中之突變積累速率可以高於宿主細胞之突變速率六個數量級出現。另外，暴露某些抗病毒藥物可導致歸因於由藥物自身引起之突變誘導而進一步增強病毒突變積累。舉例而言，使用取決於將突變引入病毒基因體中以進行抑制之誘變藥劑可導致引入藥物誘發之突變，該等突變最初對於病毒而言可能不致命，從而允許病毒繼續複製同時進一步積累額外突變。替代地，在SARS相關冠狀病毒之情況下，使用依賴於RNA複製鏈終止之藥物可允許經由nsp14之核酸外切酶活性而切除終止核苷酸，此可在置換期間經不完美的鹼基對匹配置換，從而導致在基因體病毒序列中積累其他突變。

發展天然或藥物誘發之突變可引起抗病毒療法之主要障礙。造成藥物目標區域變化之誘變事件為對於先前有效藥物產生抗藥性之常見機制(參見Pucci等人, 5.17 - Recent Epidemiological Changes in Infectious Diseases, 編者：Samuel Chackalamannil, David Rotella, Simon E. Ward, Comprehensive Medicinal Chemistry III, Elsevier, 2017, 第511-552頁)。

難以預測對於非目標區域中或其他病毒蛋白中之藥物效用的突變效果，其可影響藥物與其正構靶向位點之間的相互作用。舉例而言，蛋白質之非靶向域中之突變可誘導靶向位點之輕微結構變化，原因在於儘管未不利影響病毒中之蛋白質之活性的相同蛋白質可能降低靶向正構結合區之藥物的效用。此外，不同蛋白質中之突變可能歸因於在複合物形成期間之異位蛋白質-蛋白質相互作用而影響靶向正構結合區之藥物，其已顯示能夠經由異位波傳播，經由蛋白質結構自異位至正構位點之相互作用而產生異位擾動，從而導致微調正構位點之構形動力學(參見例如Lu等人, Emergence of allosteric drug-resistance mutations: new challenges for allosteric drug discovery, Drug Discovery Today,第25卷,第1期, 2020,第177-184頁)。在所靶向域在主動與多種蛋白質相互作用之蛋白質(當在nsp12蛋白之情況下發生時，其在病毒複製期間在複合物形成中與nsp7、nsp8及多種其他非結構及結構蛋白相互作用)內之情況下尤其如此。關於SARS相關冠狀病毒(諸如SARS-CoV-2)及其空間相互作用之資訊不足以能夠預測針對突變株之藥物功效是否將損失，此係由於其在基因體上之多個位置中突變。

藉由靶向nsp12之NiRAN域之高度保守區，天然進化的突變株在獲取對於NiRAN靶向劑之抗性方面的影響顯著降低，且可維持治療功效。此外，藉由靶向NiRAN域以進行複製抑制，不依賴於或牽涉與藥物誘發之誘變相關之機制，因此降低產生藥物誘發之病毒突變株的可能。

在一些態樣中，提供一種藉由向宿主投與有效量之呈現干擾NiRAN介導之RNA合成之作用機制之所選擇核苷酸藥物來治療或預防有需要之宿主(通常人類)的SARS相關冠狀病毒感染的方法，其中SARS相關冠狀病毒感染係由產生天然或藥物誘發之突變的病毒變體引起。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒為SARS-CoV-2。在一些實施例中，病毒變體對於不依賴於干擾NiRAN介導之RNA合成之作用機制的抗病毒藥物已產生後天抗性。

在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒病毒變體在選自以下之病毒蛋白中具有天然突變或藥物誘發之突變：套膜(E)蛋白、膜(M)蛋白、刺突(S)蛋白、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5、nsp 6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp12、nsp13、nsp14、nsp15、nsp16、ORF1ab、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8及ORF10。在一些實施例中，病毒變體具有對於一或多種抗病毒藥物產生後天抗性的突變。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸H69及V70之缺失之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代D614G之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸Y144之缺失之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代N501Y之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代A570D之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代P681H之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代T716I之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代S982A之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代D1118H之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為在ORF8之蛋白質產物中具有過早終止密碼子突變Q27stop之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代K417N之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代E484K之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代D215G之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代A701V之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代L18F之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代R246I之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為在胺基酸242-244處具有刺突蛋白缺失之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代Y453F之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代I692V之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代M1229I之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代N439K之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代A222V之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代S477N之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有刺突蛋白胺基酸取代A376T之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有nsp12蛋白胺基酸取代P323L之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有nsp12蛋白胺基酸取代Y455I之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有Orf8蛋白胺基酸取代R52I之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有ORF8蛋白胺基酸取代Y73C之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有核鞘(N)蛋白胺基酸取代D3L之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有核鞘(N)蛋白胺基酸取代S235F之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代T1001I之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代A1708D之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代I2230T之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有ORF1ab蛋白胺基酸SGF 3675-3677缺失之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有nsp12蛋白胺基酸取代S861X之SARS-CoV-2病毒，其中X為任何胺基酸。

在一些實施例中，變異株為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480V之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557L之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484Y之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有nsp12蛋白胺基酸取代E802D之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，變異株為具有nsp12蛋白胺基酸取代E802A之SARS-CoV-2病毒。

在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代F480X，其中X=任何胺基酸。

在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代V557X，其中X=任何胺基酸。

在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代D484X，其中X=任何胺基酸。

在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代P323L及刺突蛋白胺基酸取代D614G。

在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp2蛋白胺基酸取代T85I及ORF3a胺基酸取代Q57H。

在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp13蛋白胺基酸取代P504L及Y541C。

在一些實施例中，SARS-CoV-2在刺突蛋白中具有K417T、E484K及N501Y突變。

在一些實施例中，變異株為包括以下之SARS-CoV-2病毒：刺突蛋白胺基酸69-70之缺失、刺突蛋白胺基酸Y144之缺失、刺突蛋白胺基酸取代N501Y、刺突蛋白胺基酸取代A570D、刺突蛋白胺基酸取代D614G、刺突蛋白胺基酸取代P681H、刺突蛋白胺基酸取代T716I、刺突蛋白胺基酸取代S982A、刺突蛋白胺基酸取代D1118H及ORF8之蛋白產物中之過早終止密碼子突變(Q27stop)。

在一些實施例中，變異株為包括以下之SARS-CoV-2病毒：刺突蛋白中之N501Y、K417N、E484K、D80A、D215G、L18F及R246I之刺突蛋白胺基酸取代，及刺突蛋白之胺基酸242-244處之胺基酸缺失。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變體且選自SARS-CoV-2進化枝O、S、L、V、G、GH或GR，如由Alm等人, 「Geographical and temporal distribution of SARS-CoV-2 clades in the WHO European Region, January to June 2020」. Euro Surveillance: Bulletin European Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 25 (32)所描述。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且選自SARS-CoV-2進化枝G614、S84、V251、I378或D392，如由Guan等人, A genetic barcode of SARS-CoV-2 for monitoring global distribution of different clades during the COVID-19 pandemic. Int J Infect Dis. 2020年11月; 100: 216-223所描述。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且選自SARS-CoV-2進化枝19A、19B、20A或20C，如由Nextstrain: Genomic epidemiology of novel coronavirus - Global sub-sampling所描述。可獲自：https://nextstrain.org/ncov。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且選自SARS-CoV-2譜系A、B、B.1、B.1.1或B.1.177，如Rambaut等人, Phylogenetic Assignment of Named Global Outbreak LINeages (pangolin). San Francisco: GitHub所描述。可獲自：https://github.com/cov-lineages/pangolin；Rambaut等人A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2 lineages to assist genomic epidemiology. Nat Microbiol. 2020年11月;5(11):1403-1407；Rambaut等人SARS-CoV-2 lineages。可獲自：https://cov-lineages.org/。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2且為「集群5 (Cluster 5)」變體，其包括刺突蛋白胺基酸取代D614G。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為α變體(Pango譜系：B.1.1.7)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為β變體(Pango譜系：B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為γ變體(Pango譜系：P.1、P.1.1、P.1.2)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為δ變體(Pango譜系：B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為η變體(Pango譜系：B.1.525)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為ι變體(Pango譜系：B.1.526)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為κ變體(Pango譜系：B.1.617.1)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為λ變體(Pango譜系：C.37)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為ε變體(Pango譜系：B.1.427、B.1.429)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為ζ變體(Pango譜系：P.2)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為θ變體(Pango譜系：P.3)。

在一些實施例中，變異株(如世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由所定義)為μ變體(Pango譜系：B.1.621)。

由本文所描述之化合物及方法靶向之額外SARS-CoV-2變體包括Pango譜系P.2、P.3、R.1、R.2、B.1.466.2、B.1.1.318、B.1.1.519、C.36.3、C.36.3.1、B.1.214.2、B.1.1.523、B.1.617.3、B.1.619、B.1.620、B.1.621、A.23.1 (+E484K)、A.27、A.28、C.16、B.1.351 (+P384L)、B.1351 (+E516Q)、B.1.1.7 (+L452R)、B.1.1.7 (+S494P)、C.36 (+L452R)、AT.1、B.1.526.1、B.1.526.2、B.1.1.318、B.1.1.519、AV.1、P.1 (+P681H)、B.1.671.2 (+K417N)及C.1.2。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為VUI 202012/01 (調查中之變體，2020年，12月，變體01) (亦稱為B.1.1.7譜系及20B/501Y.V1)，其已由多種刺突蛋白變化定義，包括刺突蛋白胺基酸69-70之缺失、刺突蛋白胺基酸Y144之缺失、刺突蛋白胺基酸取代N501Y、刺突蛋白胺基酸取代A570D、刺突蛋白胺基酸取代D614G、刺突蛋白胺基酸取代P681H、刺突蛋白胺基酸取代T716I、刺突蛋白胺基酸取代S982A、刺突蛋白胺基酸取代D1118H及ORF8之蛋白產物中之過早終止密碼子突變(Q27stop)。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為B.1.351譜系變體(亦稱為501.V2, 20C/501Y.V2)，其包括刺突蛋白之受體結合域(receptor-binding domain；RBD)中之若干突變：N501Y、K417N及E484K，該等突變允許病毒更易於附著至人類細胞，以及刺突蛋白中之胺基酸取代D80A、刺突蛋白中之胺基酸取代D215G、刺突蛋白中之胺基酸取代A701V、刺突蛋白中之胺基酸取代L18F、刺突蛋白中之胺基酸取代R246I及刺突蛋白之胺基酸242-244處之胺基酸缺失。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為B.1.1.207譜系變體，其在刺突蛋白中包括P681H突變。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為P.1譜系變體，其在刺突蛋白中包括K417T、E484K及N501Y突變。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為B.1.427/B.1.428變體，其在刺突蛋白中包括L452R突變。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為丹麥貂變體，其包括刺突蛋白中H69及V70之胺基酸缺失，及刺突蛋白中之胺基酸取代Y453F。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為丹麥貂集群5變體，其包括刺突蛋白中H69及V70之胺基酸缺失、刺突蛋白中之胺基酸取代Y453F、刺突蛋白中之胺基酸取代I692V及刺突蛋白中之胺基酸取代M1229I。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且包括刺突蛋白中H69及V70之胺基酸缺失，及刺突蛋白中之胺基酸取代N439K。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為集群20A.EU1變體，其在刺突蛋白中包括胺基酸取代A222V。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且為Nexstrain集群20A.EU2變異體，其包括刺突蛋白中之胺基酸取代S477N，及核鞘蛋白中之胺基酸取代A376T。

在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株且具有選自以下之以下突變中之一或多者：ORF1ab之蛋白質產物中之胺基酸取代T1001I；ORF1a之蛋白質產物中之胺基酸取代A1708D；ORF1ab之蛋白質產物中之胺基酸取代I2230T；ORF1ab之蛋白質產物中3675-3677處之胺基酸SGF的缺失；ORF3a之蛋白質產物中之胺基酸取代G251V；ORF8之蛋白質產物中之胺基酸取代S24L；ORF8之蛋白質產物中之胺基酸取代R52I；ORF8之蛋白質產物中之胺基酸取代Y73C；ORF8之蛋白質產物中之胺基酸取代L84S；nsp12域中之胺基酸取代P323L；nsp12域中之胺基酸取代Y455I；ORF3a之蛋白質產物中之胺基酸取代Q57H；nsp2中之胺基酸取代R27C；nsp2中之胺基酸取代V198I；nsp2中之胺基酸取代T85I；nsp2中之胺基酸取代P585S；nsp2中之胺基酸取代I559V；nsp4中之胺基酸取代M33I；nsp5中之胺基酸取代G15S；nsp6中之胺基酸取代L37F；nsp13中之胺基酸取代Y541C；nsp13中之胺基酸取代P504L；刺突蛋白中之胺基酸取代S477N；刺突蛋白中之胺基酸取代N439K；刺突蛋白中之胺基酸取代N501Y；刺突蛋白中之胺基酸取代Y453F；刺突蛋白中之胺基酸取代K417N；刺突蛋白中之胺基酸取代E484K；刺突蛋白中之胺基酸取代A222V；刺突蛋白中之胺基酸取代S98F；刺突蛋白中之胺基酸取代D80Y；刺突蛋白中之胺基酸取代A626S；刺突蛋白中之胺基酸取代V1122L；刺突蛋白中之胺基酸取代A570D；刺突蛋白中之胺基酸取代P681H；刺突蛋白中之胺基酸取代V1122L；刺突蛋白中之胺基酸取代T716I；刺突蛋白中之胺基酸取代S982A；刺突蛋白中之胺基酸取代D1118H；刺突蛋白中之胺基酸取代E583D；刺突蛋白中之胺基酸取代V483A；刺突蛋白中之胺基酸取代Q675R；刺突蛋白中之胺基酸取代A344S；刺突蛋白中之胺基酸取代T345S；刺突蛋白中之胺基酸取代R346K；刺突蛋白中之胺基酸取代A348S；刺突蛋白中之胺基酸取代A348T；刺突蛋白中之胺基酸取代N354K；刺突蛋白中之胺基酸取代S359N；刺突蛋白中之胺基酸取代V367F；刺突蛋白中之胺基酸取代V382L；刺突蛋白中之胺基酸取代P384L；刺突蛋白中之胺基酸取代P384S；刺突蛋白中之胺基酸取代T385S；刺突蛋白中之胺基酸取代V395I；刺突蛋白中之胺基酸取代R403K；刺突蛋白中之胺基酸取代D405V；刺突蛋白中之胺基酸取代Q414P；刺突蛋白中之胺基酸取代Q414E；刺突蛋白中之胺基酸取代I418V；刺突蛋白中之胺基酸取代L441I；刺突蛋白中之胺基酸取代R457K；刺突蛋白中之胺基酸取代K458Q；刺突蛋白中之胺基酸取代P463S；刺突蛋白中之胺基酸取代A475V；刺突蛋白中之胺基酸取代G476S；刺突蛋白中之胺基酸取代T478A；刺突蛋白中之胺基酸取代P479L；刺突蛋白中之胺基酸取代V483A；刺突蛋白中之胺基酸取代F490L；刺突蛋白中之胺基酸取代Q493L；刺突蛋白中之胺基酸取代A520S；刺突蛋白中之胺基酸取代L5F；刺突蛋白中之胺基酸取代P521R；刺突蛋白中之胺基酸取代A522S；刺突蛋白中之胺基酸取代A831V；刺突蛋白中之胺基酸取代D839Y；刺突蛋白中之胺基酸取代D839N；刺突蛋白中之胺基酸取代D839E；刺突蛋白中之胺基酸取代L8V；刺突蛋白中之胺基酸取代L8W；刺突蛋白中之胺基酸取代H49Y；刺突蛋白中之胺基酸H69的缺失；刺突蛋白中之胺基酸V70的缺失；刺突蛋白中之胺基酸Y144的缺失；核鞘蛋白中之胺基酸取代D3L；核鞘蛋白中之胺基酸取代S253F；核鞘蛋白中之胺基酸取代RG203KR；核鞘蛋白中之胺基酸取代G214C；核鞘蛋白中之胺基酸取代S194L；nsp14蛋白中之胺基酸取代F377L；nsp3中之胺基酸取代K1186R；或nsp3中之胺基酸取代A58T。

在一些實施例中，SARS-CoV-2變體在刺突蛋白中含有L452R突變。

在一些實施例中，SARS-CoV-2變體在套膜(E)蛋白中含有以下突變中之一或多者：S68F；L73F；P71L；S55F；R69I；T9I；V24M；D72H；T30I；S68C；V75L；V58F；V75F；或L21F；及其組合。

在一些實施例中，SARS-CoV-2變體在膜(M)蛋白中含有以下突變中之一或多者：T175M；D3G；V23L；W31C；A2V；V70F；W75L；M109I；I52T；L46F；V70I；D3Y；K162N；H125Y；K15R；D209Y；R146H；R158C；L87F；A2S；A69S；S214I；T208I；L124F；或S4F；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在核鞘(N)蛋白中含有以下突變中之一或多者：RG203KR；S194L；S197L；P13L；D103Y；S193I；S188L；I292T；S202N；D401Y；S190I；D22G；A208G；T205I；S183Y；S33I；D81Y；T393I；A119S；D377Y；S37P；T247I；A156S；D128Y；P199L；R195I；P207L；E62V；R209T；T362I；G18C；T24N；R185C；S180I；M234I；Q9H；P383L；A35S；P383S；D348H；K374N；R32H；S327L；G179C；G238C；A55S；S190G；H300Y；A119V；D144Y；L139F；P199S；P344S；P6L；R203K；P364L；R209I；S188P；A35V；K387N；P122L；R191C；R195K；T391I；A252S；Q418L；T271I；T325I；G18V；L161F；Q289H；R203S；P162L；D340N；K373N；P168Q；A211V；D3L；G212V；K370N；P151L；T334I；A359S；G34W；P67T；R203M；D144N；R191L；S232I；D402Y；P168S；S187L；T366I；A152S；A381T；N140T；T198I；A251V；A398V；A90S；D348Y；D377G；G204R；G243C；G34E；Q229H；R185L；T24I；T379I；A134V；N196I；P365S；Q384H；R276I；S235F；D216A；M210I；M322I；P20S；Q389H；R209缺失；或V246I；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp1蛋白中含有以下突變中之一或多者：M85；D75E；G82缺失；V84缺失；P80缺失；H83缺失；V86缺失；H81缺失；E87缺失；L88缺失；K141缺失;A79缺失;V89缺失；V56I；R124C；D75G；A90缺失；Y118C；D139N；Y136缺失；G30D；R24C；D139Y；E37K；H45Y；H110Y；G52S；I71V；D156缺失；A76T；E37D；S135缺失；S166G；A138T；F157缺失；G49C；M85I；或D144A；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp10蛋白中含有以下突變中之一或多者：D64E；P136S；A104V；A32V；T12I；T111I；P84S；T51I；I55V；T102I；或T51A；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp12蛋白中含有以下突變中之一或多者：P323L；T141I；A449V；S434F；M666I；H613Y；S647I；M380I；E922D；M629I；G774S；M601I；E436G；N491S；Q822H；A443V；T85I；A423V；M463I；T26I；A656T；M668I；T806I；T276M；T801N；V588L；K267N；V880I；K718R；L514F；F415S；T252N；Y38H；E744D；H752Q；I171V；S913L；A526V；A382V；G228C；P94L；E84K；K59N；P830S；T908I；P21S；D879Y；G108D；K780N；R279S；D258Y；T259I；K263N；D284Y；Q292H；T293I；N297S；V299F；D304Y；T319I；F321L；P328S；V330E；I333T；G337C；T344I；Y346H；L351P；V354L；Q357H；E370G；L372F；A400S；T402I；V405F；V410I；D418N；K426N；K430N；V435F；Q444H；D445G；A448V；R457C；P461T；C464F；I466V；V473F；K478N；D481G；D517G；D523N；A529V；P537S；S549N；A555V；C563F；M566I；A581T；G584V；A585T；G596S；T604I；S607I；D608G；V609I；M615V；W617L；M629V；I632V；L636F；L638F；A639V；T643I；T644M；L648F；V667I；A699S；N713S；H725；N734T；D736N；V737F；T739I；V742M；N743S；M756I；L758I；A771V；L775V；A777T；K780T；F793L；T801I；T803A；H810Y；G823C；D825Y；V827A；Y828H；V848L；T870I；K871R；N874D；Q875R；E876D；H882Y；H892Y；D901Y；M906I；N909D；T912N；P918S；E919D；A923T；F480V；V557L；D484Y；E802D, E802A；或S433G；及其組合。

在一些實施例中，SARS-CoV-2變體在nsp13蛋白中含有以下突變中之一或多者：Y541C；P504L；A18V；R392C；P47L；S485L；L297P；H290Y；T127I；L176F；V193I；V570L；D260Y；V49I；Q518H；S468L；A598V；D204Y；S74L；T588I；G206C；V226L；V348L；M576I；A302D；P53S；T481M；K524N；A338V；P419S；V479F；P77L；V169F；N124S；P78S；S80G；V496L；A4V；T413I；A296S；A368S；K460R；L297F；P172S；A302S；P402S；T530I；L428F；P504S；A368V；D458Y；P364S；S74P；T416A；A568V；M474I；S166L；S350L；D344N；E341D；I432T；L581F；S38L；T250I；Y253H；A509V；E244D；H164Y；S74A；T141I；V356F；E319D；E365D；G170S；L526F；R155C；或Y396C；及其組合。

在一些實施例中，SARS-CoV-2變體在nsp14蛋白中含有以下突變中之一或多者：A320V；F233L；T250I；V182L；A225V；R289C；A274S；P24L；I150T；S374A；H26Y；L177F；L157F；T16I；A482V；P297S；V120A；S255I；P203L；A23缺失；K311N；M72I；V290F；F431L；K349N；M58I；P140S；R205C；T193A；L409F；P443S；Y260C；D345G；E204D；R163C；R81K；T524I；T113I；T31I；L493F；A119V；D345Y；M501I；A360V；A371V；T206I；V287F；A360S；I74T；M315I；P142L；或Q343K；及其組合。

在一些實施例中，SARS-CoV-2變體在nsp15蛋白中含有以下突變中之一或多者：V320L；A217V；V22L；V172L；D219N；P205S；V127F；Q19H；M218缺失；A92V；D282G；I252V；T33I；G129S；L331F；A81V；V69L；S312F；T325I；A171V；R206S；D272Y；D87N；S288F；K109R；P270S；P65S；D267Y；D128Y；E215I；T144I；S261L；S287L；T112I；E260K；P205L；S161I；V66L；D39Y；或T114A；或其組合。

在一些實施例中，SARS-CoV-2變體在nsp16蛋白中含有以下突變中之一或多者：S33R；K160R；P134S；Q28K；T195I；V78G；T35I；G265V；K249N；A204S；K182N；R287I；A188S；A116V；T140I；L111F；M270T；R216N；A188V；A34V；D108N；L163F；L163H；M17I；T91M；A226S；G77R；L126F；N298L；R216S；T48I；Q238H；或R279K；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp2蛋白中含有以下突變中之一或多者：T85I；P585S；I559V；D268；G212D；V198I；H237R；F10L；G339S；T166I；R27C；L271F；S211F；P91S；G199E；T371I；A336V；I120F；S122F；A476V；S138L；V480A；T388I；T634I；P129S；R218C；I188T；T170I；P568L；E574A；I367V；H208Y；S99F；T429I；A306V；M405V；P129L；R222C；T44I；Q275H；R380C；A360V；A361V；G115C；L353F；H237Y；L462F；E261G；R4C；S263F；T573I；A318V；G262V；P624L；S430L；T422I；A357S；I100V；E272G；L400F；A192V；D464A；E172D；G262S；L501F；S369F；E172K；G465S；K219R；A411V；A522V；H194Y；S32L；F437L；P181S；P446L；G115V；H532Y；N92H；P13S；A159V；A184S；A306S；I273T；L274F；P13L；R370H；T223I；T590I；E453D；H145Y；K618N；S301F；T153M；V244I；V530I；A127V；L24F；P191L；Q182L；S196L；S248G；S378F；T139I；T434I；A205V；A375V；A411S；C51Y；F300L；M135T；P568S；Q496H；S348P；T412I；T528I；T547I；V447F；或V577I；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp3蛋白中含有以下突變中之一或多者：A58T；T1198K；T428I；P153L；S1197R；D218E；S1424F；A1431V；S1285F；P74L；Q1884H；P1326L；L1221F；P141S；P1103S；S126L；Y916H；L557F；E391D；A1311V；S650F；P1103L；Y952H；P340S；A534V；P1787S；L1791F；N1587S；S371N；K1693N；G282V；P278S；T1335I；A1711V；K19R；A994D；K1325R；P822L；K412N；A465V；T1004I；T808I；G489D；S1699F；M1436V；S1265R；V1768G；A231V；M951I；K384N；T1288I；Q966H；R1614K；T1036I；T1306I；A1179V；P395L；N1785D；P679L；S166G；A1769V；T181I；L1718F；P822S；T1022I；A1381V；A602T；I1720V；K837N；T73I；A1033V；S1204；C1223Y；P389L；T398A；M1441I；M494I；T1303I；T181A；P1228L；R1135K；V267F；A1883V；A655V；S1296F；T686I；L198I；P1403S；L781F；T1046A；A1215V；E374D；I205缺失；V477F；E324K；I707V；P109L；P1558L；P74S；S1212L；S1807F；T819I；T864I；H1000Y；P340L；S697F；T1189I；A480V；D729Y；K1771R；S1717L；T749I；M829I；Q172R；T1482I；A1395V；I385T；M560I；S1206L；S1699P；T1269I；T779I；V1315I；V1795F；V325F；A1892V；A579V；E493G；H1274Y；S1467F；T1063I；T350I；V61F；A1736V；K1804N；R646W；T583I；T611I；V1243I；V190I；A41V；H290Y；H295Y；H342Y；L1244F；Q128H；V1673I；A1305V；A1526S；E948K；L72F；P125S；P402T；A1766V；D1214N；E1271D；G1440D；G283D；K1211N；K902N；K945N；L1839S；L312F；N1263S；P1292S；S1670F；S743A；T771I；V1936I；A1262V；A1321V；A358V；A41T；C55Y；G1273S；K463E；K497Q；P1044S；R30K；S1375F；S1682F；T133I；T1348I；465I；T1830I；T237I；V1248L；A225V；A496V；G1217R；I1816T；L956I；N1369T；N506S；P153S；P2L；T1275I；T1459I；V1234M；E595D；F90L；G1585S；H1307Y；I1409V；L1034V；L1328F；L292F；N1264；P1326T；S1197G；T1456I；T64I；T703I；T720I；T820I；V1229F；V234I；A1279V；A333V；A54S；D1121G；D1761N；E731D；I1672T；I789V；K1037R；K487N；L142F；N1177H；P1228S；P723S；Q180H；Q474R；Q940L；S370L；T1180I；T275I；T422I；T526I；T724I；V1434G；或V207L；或其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp4蛋白中含有以下突變中之一或多者：F308Y；T295I；M33I；A307V；A457V；G309C；L360F；A231V；H313Y；K399E；V20F；S137L；S34F；A380V；H470Y；T204I；S336L；L264F；L438F；M33L；S209F；C296S；L475I；G79V；T327N；T350I；L206F；M324I；E230G；L436缺失；T237I；T492I；A260V；A446V；M458I；S395G；S481L；H36Y；T73I；L323F；L349F；S59F；T214I；或T60I；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp5蛋白中含有以下突變中之一或多者：G15S；D248E；K90R；L89F；A266V；P108S；A70T；A129V；T45I；G71S；L75F；A191V；L220F；N274D；L67F；P241L；K236R；V157L；K61R；P184S；S62Y；T21I；L50F；P108L；S254F；T93I；A255V；A94V；P132S；A234V；A260V；R60C；P96L；V247F；或T199I；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp6蛋白中含有以下突變中之一或多者：L37F；G277S；A46V；L75F；F37缺失；T10I；V149F；L260F；Q208H；M83I；A136V；V145I；N156D；M86I；Y153C；G188V；L230I；F34缺失；I189V；R233H；V114A；L33F；A287V；H11Y；A287T；A51V；G188S；I162T；M126V；M183I；N40Y；S104；F35L；M58L；或V84F；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp7蛋白中含有以下突變中之一或多者：S25L；S26F；L71F；S15T；M75I；或N78S；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp8蛋白中含有以下突變中之一或多者：M129I；I156V；T145I；R51C；T123I；L95F；T89I；P133S；S41F；K37N；T141M；V34F；R51L；A14T；A74V；I107V；A16V；P10S；A194V；D30G；A152V；或T187I；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在nsp9蛋白中含有以下突變中之一或多者：T77I；T109I；L42F；T34I；T19I；M101V；T62I；或T19K；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在ORF10之蛋白質產物中含有以下突變中之一或多者：L17P；A28V；P10S；I4L；S23F；R24C；*39Q；Q29 stop；Y14C；R20I；或A8V；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在ORF3a之蛋白質產物中含有以下突變中之一或多者：Q57H；G251V；V13L；G196V；A54S；A99V；H93Y；T14I；L46F；Q185H；T175I；Q213K；L108F；K61N；Y264C；A72S；T151I；A23S；G224C；K67N；S171L；W69L；H78Y；K136E；L86F；W131C；L147F；S58N；Y91H；I63T；D155Y；G172C；P240L；Y189C；W131R；KN136NY；T223I；G100C；S195Y；V112F；W131L；G44V；D27H；G174C；K21N；S165F；L65F；T229I；T89I；S74F；A99S；G254R；H204N；K75N；F43L；L53F；Q38P；S26L；S40L；M260I；V256缺失；K16N；Q218R；S253P；V163L；W69C；A23V；L41F；L106F；V55F；V88A；A99D；E239D；L52F；T24I；A31T；D27Y；I186V；L73F；P104L；D22Y；F114V；L95F；P240S；P42L；T268M；或T32I；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在ORF6之蛋白質產物中含有以下突變中之一或多者：I33T；W27L；D53G；F22缺失；P57L；D61Y；D61L；K42N；D53Y；H3Y；I32T；或R20S；或其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在ORF7a之蛋白質產物中含有以下突變中之一或多者：S81L；A8T；L96F；A50V；V104F；Q62 stop；S83L；E16D；T14I；T28I；V93F；G38V；H47Y；T39I；T120S；Q62缺失；Q62L；S37T；V104；P34S；P99L；T120I；V108L；H73Y；V24F；V29L；A13T；或L5F；或其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在ORF7b之蛋白質產物中含有以下突變中之一或多者：C41F；T40I；A43V；L11F；S31L；C41缺失；H42；H42L；S5L；L20F；L32F；E33終止；A15S；或F13缺失；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在ORF8之蛋白質產物中含有以下突變中之一或多者：E110終止；G66缺失；S69L；T11I；F104L；F120L；G8R；P38S；D119E；I10S；或I39V；及其組合。

在一些實施例中，SARS-COV-2變體在刺突蛋白中含有以下突變中之一或多者：D614G；D936Y；P1263L；L5F；N439K；R21I；D839Y；L54F；A879S；L18F；F1121L；R847K；T478I；A829T；Q675H；S477N；H49Y；T29I；G769V；G1124V；V1176F；K1073N；P479S；S1252P；Y145缺失；E583D；R214L；A1020V；Q1208H；D215G；H146Y；S98F；T95I；G1219C；A846V；I197V；R102I；V367F；T572I；A1078S；A831V；P1162L；T73I；A845S；G1219V；H245Y；L8V；Q675R；S254F；V483A；Q677H；D138H；D80Y；M1237T；D1146H；E654D；H655Y；S50L；S939F；S943P；G485R；Q613H；T76I；V341I；M153I；S221L；T859I；W258L；L242F；P681L；V289I；A520S；V1104L；V1228L；L176F；M1237I；T307I；T716I；L141；M1229I；A1087S；P26S；P330S；P384L；R765L；S940F；T323I；V826L；E1202Q；L1203F；L611F；V615I；A262S；A522V；A688V；A706V；A892S；E554D；Q836H；T1027I；T22I；A222V；A27S；A626V；C1247F；K1191N；M731I；P26L；S1147L；S1252F；S255F；V1264L；V308L；D80A；I670L；P251L；P631S；*1274Q；A344S；A771S；A879T；D1084Y；D253G；H1101Y；L1200F；Q14H；Q239K；A623V；D215Y；E1150D；G476S；K77M；M177I；P812S；S704L；T51I；T547I；T791I；V1122L；Y145H；D574Y；G142D；G181V；I834T；N370S；P812L；S12F；T791P；V90F；W152L；A292S；A570V；A647S；A845V；D1163Y；G181R；L84I；L938F；P1143L；P809S；R78M；T1160I；V1133F；V213L；V615F；A831V；D839Y；D839N；D839E；S943P；P1263L；或V622F；及其組合。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：N501Y、D614G及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：E484K、N501Y、D614G及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：K417N，E484K，N501Y，D614G及A701V。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：K417T，E484K，N501Y，D614G及H655Y。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：L452R，T478K，D614G及P681R。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：E484K，D614G及Q677H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：E484K，N501Y，D614G及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：L452R，E484Q，D614G及P681R。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：S477N，E484K，D614G及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：R346K，E484K，N501Y，D614G及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：L452Q，F490S及D614G。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：Q414K，N450K，ins214TDR及D614G。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：V367F，E484K及Q613H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：L452R，N501Y，A653V及H655Y。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：E484K，N501T及H655Y。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：L452R及D614G。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：P384L，K417N，E484K，N501Y，D614G及A701V。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：K417N，E484K，N501Y，E516Q，D614G及A701V。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：L452R，N501Y，D614G及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：S494P，N501Y，D614G及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：L452R，D614G及Q677H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：E484K，D614G，N679K及ins679GIAL。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：E484K，D614G及A701V。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：S477N及D614G。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：E484K，D614G,及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：E484K及D614G。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：T478K及D614G。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：N439K，E484K，D614G及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：D614G，E484K，H655Y，K417T，N501Y及P681H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：L452R，T478K，D614G，P681R及K417N。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：D614G，E484K，H655Y，N501Y，N679K及Y449H。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：T19R，T95I，G142D，E156del，F157del，R158G，L452R，T478K，D614G，P681R及D950N。

在一些實施例中，經靶向用於治療之所靶向SARS-CoV-2變體在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變：T19R，V70F，T95I，G142D，E156del，F157del，R158G，A222V，W258L，K417N，L452R，T478K，D614G，P681R及D950N。

抗病毒藥物抗性 SARS-CoV-2 病毒株之治療在一些態樣中，提供一種藉由向有需要之宿主投與有效量之呈現干擾NiRAN介導之RNA合成之作用機制的所選擇核苷酸藥物來治療或預防有需要的宿主(通常人類)中的SARS相關冠狀病毒的方法，其中SARS相關冠狀病毒係由已對於一或多種抗病毒藥物產生後天抗性的SARS相關冠狀病毒的變異株引起。在一些實施例中，SARS相關冠狀病毒為SARS-CoV-2。

在一些實施例中，變異株已對於選自以下之抗病毒藥物產生抗性：瑞德西韋(remdesivir)、莫努拉韋(molnupiravir)、樂沃韋(levovir) (克維啶(clevidine))、加利地韋(galidesivir)、利巴韋林(ribavirin)、利托那韋(ritonavir)、asc09 (Ascletis)、法維拉韋(favilavir)、法匹拉韋(favipiravir)、T-705、咯匹那韋(lopinavir)、馬拉韋羅(maraviroc)、索非布韋(sofosbuvir)、達盧那韋(darunavir)、烏米芬韋(umifenovir)、紐羅西韋(neurosivir)、田諾弗(tenofovir)、安卓西他賓(emtricitabine)、奧司他韋(oseltamivir)、阿紮那韋(atazanavir)、達卡他韋(daclatasvir)、AB001 (Agastiya Biotech)、GC376 (Anivie Lifesciences)、ISR-50 (ISR Immune System Regulation)、slv213 (Selva Therapeutics)或維克馬克斯(vicromax) (Viralclear Pharmaceuticals)。

在一些實施例中，變異株已對於瑞德西韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12胺基酸取代S861X，其中X=任何胺基酸。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代F480X，其中X=任何胺基酸。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代V557X，其中X=任何胺基酸。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代D484X，其中X=任何胺基酸。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代F480V。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代V557L。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代D484Y。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代E802D。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有nsp12蛋白胺基酸取代E802A。瑞德西韋(VEKLURY®；Gilead Sciences)一般稱為腺苷類似物但實際上為並不代謝成腺苷(或鳥苷)之吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-胺，且咸信充當延遲鏈終止劑(Eastman等人(2020年5月). 「Remdesivir: A Review of Its Discovery and Development Leading to Emergency Use Authorization for Treatment of COVID-19」. ACS Central Science. 6 (5): 672-683)。瑞德西韋具有以下結構：

。

瑞德西韋在美國已批准用於治療人類之Covid-19，然而其僅顯示邊緣活性。先前研究指示，nsp12中(例如Ser861處)之突變能夠降低瑞德西韋之活性(Gordon等人(2020). Remdesivir is a direct-acting antiviral that inhibits RNA-dependent RNA polymerase from severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 with high potency. J Biol Chem295, 6785-6797)。

在一些實施例中，變異株已對於莫努拉韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。莫努拉韋(亦稱為MK-4482及EIDD-2801)係由埃默里大學與埃默里藥物創新企業(Emory University and Drug Innovation Ventures at Emory；DRIVE)研發，且目前在由Merck贊助之用於治療SARS-CoV-2感染的臨床試驗中。莫努拉韋為具有以下結構之合成核苷衍生物N4-羥基胞苷之前藥：

。

咸信莫努拉韋經由在病毒RNA複製期間引入病毒誤差失敗而發揮其抗病毒作用，其可能藉由在複製期間併入藥劑之後引起C-至-U及G-至-A轉位突變(參見例如Toots等人(2019年10月). 「Characterization of orally efficacious influenza drug with high resistance barrier in ferrets and human airway epithelia」. Science Translational Medicine. 11 (515): eaax5866)。然而，依據其作用機制，已產生大量關於莫努拉韋在人類中之誘變效果之安全性擔憂，其引起Pharmasset在發現其誘變特性之後原先在2003年放棄了莫努拉韋之活性成分之研發。在2020年5月，生物醫學先進研究及發展局(Biomedical Advanced Research and Development Authority；BARDA)前負責人Rick Bright向美國政府提交了舉報人投訴，增加了關於該藥物使用之安全性擔憂。作為回應，Merck已確認，該藥物為安氏試驗(AMES test)陽性，該試驗為用於評定化合物之誘變潛能的常見生物測定(參見Mortelmans K, Zeiger E (2000年11月). 「The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay」. Mutation Research. 455 (1-2): 29-60)。陽性測試指示，化學品具有誘變性且因此可充當致癌物。

在一些實施例中，變異株已對於核苷類似物樂沃韋(克維啶)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於腺苷類似物加利地韋(BioCryst Pharmaceuticals)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於鳥苷(核糖核酸)類似物利巴韋林產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於蛋白酶抑制劑利托那韋(ritonavir/Norvir)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於蛋白酶抑制劑asc09 (Ascletis)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於法維拉韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於法匹拉韋(favipiravir/Avigan)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於蛋白酶抑制劑咯匹那韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於CCR%受體拮抗劑馬拉韋羅(希爾特利(Selzentry))產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於衍生的尿苷核苷酸索非布韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於蛋白酶抑制劑達盧那韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於病毒膜形成抑制劑烏米芬韋(umifenovir) (阿比朵爾(Arbidol))產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於紐羅西韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於田諾弗產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於安卓西他賓產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於奧司他韋(他米路(Tamiflu))產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於蛋白酶抑制劑阿紮那韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於蛋白酶抑制劑達卡他韋產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於AB001 (Agastiya Biotech)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於GC376 (Anivie Lifesciences)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於ISR-50 (ISR Immune System Regulation)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於slv213 (Selva Therapeutics)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於維克馬克斯(Viralclear Pharmaceuticals)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於波普瑞韋(維克利西(Victrelis))產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於GC-376產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於鈣蛋白酶抑制劑II產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於鈣蛋白酶抑制劑XII產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於PF-07304814產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於PF-07321332產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於EDP-235產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於PBI-0451產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於ALG-097111產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於索曲韋單抗(VIR-7831)產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於VIR-7832產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於BRII-196產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於BRII-198產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於ADG20產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

在一些實施例中，變異株已對於ADG10產生抗性。在一些實施例中，變異株為SARS-CoV-2變異株。

用於測定用於治療或預防 SARS-CoV-2 之其他有利藥物之分析及方法在一些實施例中，本發明提供一種用於鑑別選擇性地結合SARS相關冠狀病毒之nsp12蛋白或抑制其NiRAN介導之活性之有利化合物以用於本文所描述之療法中的方法。如本文所描述之化合物抑制NiRAN介導之活性的能力可使用如本文中之實例中所描述之活體外分析，或此項技術中已知之類似活體外分析來測定，且將其與其中在相同分析中不存在該化合物的對照比較。

在一主要實施例中，化合物為所選擇核苷酸，例如式I-VIII之化合物。如本文所用，所選擇核苷酸或核苷為非天然存在之核苷酸，例如獨立地選自式I-VIII之物種，其可代謝成單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯活性形式。在某些實施例中，核苷酸之糖部分具有2'-甲基。在某些實施例中，核苷酸之糖部分具有2'-甲基以及2'-氟、2'-羥基或2'-氯基團兩者。

本文中，例如實例8、10、11、12、17及19中描述用於偵測化合物與NiRAN、nsp8或nsp12之結合之分析。其他分析為此項技術中已知的，例如如以下中所描述：McFedries等人, Methods for the Elucidation of Protein-Small Molecule Interactions. Chemistry & Biology (2013); 第20卷(5):667-673；Pollard, A Guide to Simple and Informative Binding Assays, Mol. Biol. Cell (2010) 第21卷, 4061- 4067，兩者以全文引用之方式併入本文中。

用於鑑別與nsp12蛋白之NiRAN域結合之化合物之方法可為經標記配體結合分析或無標記配體結合分析。

在競爭性結合分析中，化合物可經標記。將游離化合物與複合物中存在之化合物分離，且無(亦即，未複合)標記之量為所測試之化合物與nsp12之結合的量測。

在一些實施例中，結合分析為經標記配體結合分析。在一些實施例中，經標記配體結合分析為螢光配體結合分析。在一些實施例中，經標記配體結合分析為放射性配體結合分析。在一些實施例中，經標記配體結合分析為使用奈米螢光素酶之生物發光結合分析。篩選化合物以測定其與SARS相關冠狀病毒之nsp12蛋白之NiRAN域相互作用或結合的能力。舉例而言，使經標記之化合物與nsp12蛋白接觸，且接著使用用於偵測其與目標結合之經標記之配體，進行分析以偵測化合物與nsp12蛋白之NiRAN域的結合。將游離化合物與結合複合物中存在之化合物分離，且無(亦即，未複合)標記之量為所測試之化合物與nsp12之結合的量測。

在一些實施例中，結合分析為無標記配體結合分析。無標記配體結合分析之非限制性實例包括表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)、電漿波導共振(plasmon-waveguide resonance；PWR)、用於基於親和力之生物感測器之SPR成像、奈米流體螢光顯微法(nanofluidic fluorescence microscopy；NFM)、耳語廊微共振器(whispering gallery microresonator；WGM)、共振波導光柵(resonant waveguide grating；RWG)及生物層干涉生物感測器(biolayer interferometry biosensor；BIB)。篩選化合物以測定其與SARS相關冠狀病毒之nsp12蛋白之NiRAN域相互作用或結合的能力。舉例而言，使化合物與nsp12蛋白接觸，且接著使用光波或電磁波變化以偵測與目標之結合動力學，進行分析以偵測化合物與nsp12蛋白之NiRAN域的結合。

此外，該分析可量測nsp12之NiRAN域之活性袋與所測試之化合物之間的結合。因此，本發明提供鑑別化合物之方法，其包含使化合物與nsp12蛋白接觸，及分析NiRAN域之活性袋與化合物之結合。在一些實施例中，化合物與活性袋之結合指示化合物能夠抑制NiRAN域活性，其中活性位點袋襯有以下殘基：K73、R74、H75、N79、E83、R116、N209、G214、D218、F219及F222。在一些實施例中，化合物與活性袋之結合指示化合物能夠抑制NiRAN域活性，其中活性位點袋襯有以下殘基：K50、R55、T120、N209、Y217。

在一些實施例中，該分析進一步包含： i. 使化合物在UTP及/或GTP存在下與nsp12蛋白接觸；及 ii. 量測化合物、GTP及/或UTP與NiRAN域之結合；其中相較於GTP及UTP，由化合物結合之高水準指示化合物能夠抑制NiRAN介導之活性。

在一些實施例中，該分析進一步包含： i. 使化合物在UTP及/或GTP存在下與nsp12蛋白接觸；及 ii. 量測化合物、GTP及/或UTP與NiRAN域之結合；其中相較於GTP及UTP，由化合物結合之高水準指示化合物能夠抑制NiRAN介導之活性。在此類競爭性結合分析中，nsp12、UTP或GTP可經標記。將游離nsp12與複合物中存在之nsp12分離，且無(亦即，未複合)標記之量為所測試之化合物與nsp12之結合或其干擾UTP或GTP之結合的量測。在一些實施例中，GTP或UTP經[α-P ³²]放射性標記。在一些實施例中，GTP或UTP經螢光標記。在一些實施例中，化合物在經標記之UTP存在下接觸nsp12。在一些實施例中，化合物在經標記之GTP存在下接觸nsp12。在一些實施例中，化合物在經標記之UTP及GTP兩者存在下接觸nsp12。在一些實施例中，化合物在經標記之GTP及/或UTP存在下接觸nsp12，其中經標記之GTP及/或UTP以比化合物更大之濃度存在。在一些實施例中，化合物在經標記之GTP及/或UTP存在下接觸nsp12，其中GTP及/或UTP與化合物呈等莫耳濃度。在一些實施例中，相較於其中不存在化合物之對照，化合物以相對於UTP及/或GTP約1.25X、1.5X、1.75X、2.0X、2.25X、2.5X、2.75X、3.0X、3.25X、3.5X或更大結合NiRAN域。

在以上方法中，溶液中所含之nsp12及nsp12:化合物之量可使用例如經生物素、放射性同位素、螢光團、發色團或化學發光部分標記之nsp12來量測。舉例而言，生物素標記之nsp12之量可藉由使用蛋白質來量測，該蛋白質能夠以高親和力與生物素結合，諸如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或其變異蛋白(下文稱為)，使得抗生物素蛋白經可容易偵測到之放射性同位素、螢光團、發光體或酶標記，且與生物素標記之化合物結合。放射物質可使用常見輻射量測裝置，諸如閃爍計數器、γ計數器或GM儀來量測。螢光團、發色團及發光體可分別使用螢光量測裝置、吸光計及發光量測裝置來量測。經酶標記之化合物之量可容易地使用利用酶轉化為顯色、螢光或發光化合物之化合物來量測。

在一些實施例中，本發明提供一種用於鑑別能夠抑制SARS相關冠狀病毒中之NiRAN介導之活性之化合物的方法，其包含： i. 使化合物在UTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12蛋白及nsp8接觸；及 ii. 判定化合物是否抑制nsp8之UMP化；其中藉由NiRAN域預防nsp8之UMP化指示化合物能夠抑制NiRAN介導之活性。量測UMP化之方法描述於實例19中。

在一些實施例中，本發明提供一種用於鑑別能夠抑制SARS相關冠狀病毒中之NiRAN介導之活性之化合物的方法，其包含： i. 使化合物在UTP及/或GTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12蛋白及nsp8接觸；及 ii. 判定化合物是否抑制nsp8之核苷酸化；其中藉由NiRAN域預防核苷酸化nsp8指示化合物能夠抑制NiRAN介導之活性。在一些實施例中，化合物在UTP存在下接觸nsp12及nsp8。在一些實施例中，化合物在GTP存在下接觸nsp12及nsp8。在一些實施例中，化合物在UTP及GTP存在下接觸nsp12及nsp8。在一些實施例中，化合物在GTP及/或UTP存在下接觸nsp12及nsp8，其中GTP及/或UTP以比化合物更大之濃度存在。在一些實施例中，化合物在GTP及/或UTP存在下接觸nsp12及nsp8，其中GTP及/或UTP與化合物呈等莫耳濃度。在一些實施例中，相較於其中不存在化合物之對照，化合物降低nsp8之核苷酸化至少50%、60%、70%或更多。

量測核苷酸化之方法描述於Lehmann等人, Nucleic Acids Res. 2015年9月30日; 43(17): 8416-8434中。可鑑別核苷酸化抑制劑之核苷酸化分析之實例描述於例如實例8中。

在一些實施例中，本發明提供一種用於鑑別能夠抑制SARS相關冠狀病毒中之NiRAN介導之活性之化合物的方法，其包含： i. 使化合物在UTP及/或GTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定化合物是否抑制UTP及/或GTP自nsp12轉移至nsp8；其中藉由NiRAN域抑制UTP及/或GTP之轉移指示化合物能夠抑制NiRAN介導之活性。在一些實施例中，化合物在UTP存在下接觸nsp12及nsp8。在一些實施例中，化合物在GTP存在下接觸nsp12及nsp8。在一些實施例中，化合物在UTP及GTP存在下接觸nsp12及nsp8。在一些實施例中，化合物在GTP及/或UTP存在下接觸nsp12及nsp8，其中GTP及/或UTP以比化合物更大之濃度存在。在一些實施例中，化合物在GTP及/或UTP存在下接觸nsp12及nsp8，其中GTP及/或UTP與化合物呈等莫耳濃度。在一些實施例中，相較於其中不存在化合物之對照，化合物降低GTP及/或UTP自nsp12轉移至nsp8至少50%、60%、70%或更多。

在一些實施例中，本發明提供一種鑑別能夠中和nsp12以放射性經標記之GTP或UTP標記nsp8之能力之化合物的方法。舉例而言，該分析可量測在化合物存在下nsp8上經nsp12-NiRAN進行之經標記GTP或NTP之量。經標記nsp8之量降低鑑別能夠與GTP或UTP競爭且中和nsp12標記nsp8之能力的化合物。可鑑別能夠中和nsp12標記nsp8之能力之化合物之分析的實例描述於例如實例19及圖13A至圖13E中。

在一些實施例中，本發明提供一種用於鑑別能夠抑制SARS相關冠狀病毒中之NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成之化合物的方法，其包含： i. 使該化合物在UTP及poly(A) RNA模板存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12、nsp7及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定該化合物是否在UTP存在下抑制poly(A) RNA模板上之引子非依賴性RNA合成；其中在UTP存在下poly(A) RNA模板上之引子非依賴性RNA合成之抑制指示化合物能夠抑制引子非依賴性RNA合成。在一些實施例中，nsp12、nsp7及nsp8係以nsp12:7L8:8聚合酶複合物之形式提供。在一些實施例中，nsp12:7L8:8聚合酶複合物呈1:3:3莫耳比。在一些實施例中，nsp12、nsp7及nsp8聚合酶複合物呈1:3:6莫耳比。在一些實施例中，相較於其中不存在化合物之對照，化合物降低poly(A) RNA模板之引子非依賴性RNA合成至少50%或更多。

在一個非限制性說明性實例中，引子非依賴性RNA合成分析可在具有或不具有該化合物之情況下，在nsp12:7L8:8聚合酶複合物存在下，以固定濃度之poly(A) RNA模板及經標記之UTP進行。在不具有化合物之情況下，nsp12:7L8:8聚合酶複合物將自poly(A) RNA模板合成poly(U)股。合成產物之存在可進行量測且指示功能性nsp12:7L8:8聚合酶複合物。當該分析係以能夠抑制重新RNA合成之化合物進行時，nsp12:7L8:8聚合酶複合物將無法在經標記之UTP存在下自poly(A) RNA模板合成poly(U)股。此結果指示化合物能夠抑制引子非依賴性RNA合成。此類型之分析及結果顯示於實例7及圖4中。

應注意，以上用於鑑別化合物之方法視為說明性而非限制性的。

在一些實施例中，化合物亦能夠抑制複製/轉錄複合物nsp12:nsp7:nsp8二核苷酸引子pppUpU介導之NiRAN非依賴性重新蛋白質合成。因此，進一步篩選能夠抑制藉由nsp12進行之nsp8之NiRAN介導之UMP化及/或能夠抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成的化合物，以判定其抑制RdRp活性位點處的RNA起始的能力。在一些實施例中，化合物進一步能夠抑制RNA合成之重新NiRAN非依賴性起始。在一些實施例中，化合物進一步能夠抑制RNA延伸鏈終止。

在一些實施例中，進一步篩選化合物以判定其是否能夠抑制RNA合成之重新NiRAN非依賴性起始，其包含： i) 使化合物與nsp12、nsp7、nsp8、poly(A)模板及pppGpU接觸； ii) 量測poly(U) RNA之產生；其中poly(U) RNA之產生之抑制或降低指示化合物可抑制重新NiRAN非依賴性RNA合成。適合於測定poly(U) RNA之產生之抑制或降低之分析描述於例如實例6及15中。

V. 治療方法本發明包括一種用於治療患有SARS-CoV-2感染突變株或抗性形式或處於其風險下之宿主(通常人類)之方法，其包括鑑別如本文所描述的最佳化合物及向有需要之宿主投與有效量的化合物。在某些實施例中，治療為防治性或預防性的。在一些實施例中，向已暴露於SARS-CoV (諸如SARS-CoV-2)且因此處於感染SARS-CoV風險下或處於再感染SARS-CoV風險下之宿主投與NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽。

在另一替代實施例中，提供一種預防傳染之方法，其包括在暴露於可能已感染之人群之前，包括在旅行或公共事件或會議期間，持續足夠時長向人類投與有效量的NiRAN干擾化合物，包括例如在傳染情況之前至多3、5、7、10、12、14或更多天，因為人類已感染或預防自傳染情況之已感染者感染。

在一些實施例中，在感染之後，以有效量投與NiRAN干擾化合物至少兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月或更長。

本發明包括NiRAN干擾化合物及治療SARS-CoV感染之方法，其包括抗藥性及多重抗藥性形式之病毒及病毒感染之相關疾病病況、病狀或併發症，包括肺炎，諸如2019年新冠狀病毒感染肺炎(NCIP)、急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。額外非限制性併發症包括低氧血症型呼吸衰竭、急性呼吸衰竭(ARF)、急性肝損傷、急性心臟損傷、急性腎損傷、敗血性休克、彌散性血管內凝血、血結塊、多系統發炎性症候群、慢性疲勞、橫紋肌溶解症及細胞介素風暴。

該方法亦包含向有需要之宿主(通常人類)投與有效量之NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽，視情況與至少一種額外生物活性劑，例如額外抗病毒藥劑組合，進一步視情況與醫藥學上可接受之載劑添加劑及/或賦形劑組合。

在一些實施例中，向有需要之患者投與NiRAN干擾化合物引起進行性呼吸功能不全(progressive respiratory insufficiency；PRI)之發生率降低，如藉由使用下文描述之6層層次級別之呼吸支持方法，維持令人滿意的充氧(SpO ₂≥ 93%)所需之呼吸支持方法增加大於或等於1層或甚至2層或更多所量測。

增加呼吸支持級別之標度包括： 1級：在室內空氣(SpO2 ≥ 93%)中正常充氧，不需要補充O ₂2級：室內空氣(SpO ₂≥ 93)中之持續性低血氧症，需要藉由鼻導管或面罩補充低含量O ₂(至多2 L/min)以維持SpO ₂≥ 93 3級：需要藉由鼻導管或面罩(至多2 L/min)被動補充更高含量之O ₂以維持SpO ₂≥ 93 4級：需要藉由正壓裝置，例如持續氣道正壓(Continuous Positive Airway Pressure；CPAP)或雙位準氣道正壓(Bi-level Positive Airway Pressure；BiPAP)或其他非侵入性正壓呼吸支持方法充氧，以維持令人滿意的充氧及/或通氣 5級：需要侵入性呼吸支持(插管式機械通氣或ECMO) 6級：死亡

在一些實施例中，PRI之降低導致自5級降至3級、自5級降至2級或自5級降至1級。在一些實施例中，PRI之降低導致自4級降至2級或自4級降至1級。在一些實施例中，PRI之降低導致自3級降至1級。

在一些實施例中，投與NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽減少中位數臨床恢復(使用經調適之美國國家過敏及傳染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases；NIAID)臨床狀態順序量表，NIAID臨床狀態量表中之狀態6、7或8)時間至少3、4、5或更多天。在一些實施例中，投與NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽引起改善，如藉由經調適之臨床狀態順序量表所量測。

自最嚴重疾病至逐漸較不嚴重疾病，經調適之總體臨床狀態順序量表之階段定義如下： 1.死亡 2.住院，使用侵入性機械通氣或ECMO 3.住院，使用非侵入性通氣或高流量氧氣裝置 4.住院，需要補充氧氣 5.住院，不需要補充氧氣-需要持續的醫學照護(COVID-19相關或其他) 6.住院，不需要補充氧氣；不再需要COVID-19之密切醫學照護 7.未住院，但活動受限，且需要COVID-19表現之密切門診照護 8.未住院，活動不受限制，無需持續的密切醫療照護

在一些實施例中，投與NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽減少中位數臨床恢復(使用經調適之美國國家過敏及傳染病研究所(NIAID)臨床狀態順序量表，NIAID臨床狀態量表中之狀態6、7或8)時間至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天或至少10天。

在一些實施例中，投與NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽減少感染SARS-CoV感染之患者的住院持續時間。

在一些實施例中，投與NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽減少感染SARS-CoV感染之患者之鼻及/或咽喉中持續不可偵測的SARS-CoV的時間。

在一些實施例中，投與NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽減少呼吸衰竭或死亡。

在一些實施例中，投與NiRAN干擾化合物或其醫藥學上可接受之鹽降低在治療至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天之後醫院群體中呈SARS-CoV陽性之患者的比例。

VI. 醫藥組合物及劑型式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可以有效量投與，以用於治療有需要之宿主(通常人類)中之SARS-CoV-1或SARS-CoV-2病毒的突變或抗性形式。在一些實施例中，化合物為化合物 1A或化合物 3A或其醫藥學上可接受之鹽，例如化合物 2A或化合物 4A。在一些實施例中，化合物為化合物 1B或化合物 3B或其醫藥學上可接受之鹽，例如化合物 2B或化合物 4B。

在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含有效量之式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與至少一種醫藥學上可接受之載劑，以用於治療SARS-CoV-1或SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式。醫藥組合物可含有式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽作為唯一活性劑，或在一替代實施例中，與至少一種額外活性劑組合。

式I (包括但不限於化合物 1、 1A或 1B)、式II (包括但不限於化合物 3、 3A或 3B)、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可與一或多種醫藥學上可接受之載劑一起調配。由於易於投與及預期的良好患者順應性，有時選擇口服劑型。在一些實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係以固體劑型提供，諸如錠劑或丸劑，其在此項技術中已熟知且在下文進一步描述。包覆腸溶包衣之口服錠劑亦可用以增強用於口服投與途徑之化合物的生物可用性。醫藥組合物(調配物)可經由經口、非經腸、靜脈內、吸入、肌肉內、局部、經皮、頰內、皮下、栓劑或其他途徑(包括鼻內噴霧遞送途徑)投與。

在一些實施例中，靜脈內投與式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個非限制性實施例中，本發明化合物以550毫克/天之負載劑量及275毫克/天之維持劑量靜脈內投與。在一些實施例中，負載劑量投與一次且維持劑量一天投與兩次，持續至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。在一個非限制性實施例中，靜脈內負載劑量為550毫克/天之化合物 1(亦即，600毫克/天化合物 1之半硫酸鹽)，且維持劑量為275毫克/天(亦即，300毫克/天之半硫酸鹽))。

有效劑型將視所選特定藥劑之生物可用性/藥物動力學以及患者之疾病之嚴重程度而定。式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可例如以一或多種錠劑、膠囊、注射劑、靜脈內調配物、懸浮液、液體、乳液、植入物、顆粒、球、乳膏、軟膏、栓劑、可吸入形式、經皮形式、頰內、舌下、局部、凝膠、黏膜及其類似者投與。

靜脈內及肌肉內調配物通常以無菌鹽水形式投與。一般熟習此項技術者可修改調配物以使其較可溶於水或另一媒劑中，例如，此可藉由輕微修飾(鹽調配物、酯化等)而容易地實現。

本文中涵蓋之醫藥組合物視情況包括載劑，如下文進一步描述。載劑必須具有足夠高的純度及足夠低的毒性以使其適合於向所治療的患者投與。載劑可呈惰性或其本身可具有醫藥益處。結合化合物使用的載劑之量足以根據單位劑量之化合物提供用於投與的實際量之材料。代表性載劑包括溶劑、稀釋劑、pH調節劑、防腐劑、抗氧化劑、懸浮劑、濕潤劑、黏度劑、張力劑、穩定劑及其組合。在一些實施例中，載劑為水性載劑。

可將一或多種黏度劑添加至醫藥組合物中以視需要增加組合物之黏度。適用黏度劑之實例包括但不限於玻尿酸、玻尿酸鈉、卡波姆(carbomer)、聚丙烯酸、纖維素衍生物、聚卡波非(polycarbophil)、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、糊精、多醣、聚丙烯醯胺、聚乙烯醇(包括部分水解之聚乙酸乙烯酯)、聚乙酸乙烯酯、其衍生物及其混合物。

用於投與之溶液、懸浮液或乳液可用有效量之維持適合於所選投與之pH所需的緩衝液來緩衝。適合緩衝液為熟習此項技術者所熟知。適用緩衝液之一些實例為乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽及磷酸鹽緩衝液。

為了製備根據本發明之醫藥組合物，治療有效量之式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可根據習知醫藥混配技術與醫藥學上可接受之載劑混合以產生劑量。視投與(例如經口或非經腸)所需製劑形式而定，載劑可呈現各種形式。

在以口服劑型製備醫藥組合物方面，可使用常用醫藥介質中之任一者。因此，對於液體口服製劑(諸如懸浮液、酏劑及溶液)而言，可使用適合載劑及添加劑，包括水、二醇、油、醇、調味劑、防腐劑、著色劑及其類似物。對於固體口服製劑，諸如粉劑、錠劑、膠囊而言，且對於諸如栓劑之固體製劑而言，可使用適合載劑及添加劑，包括澱粉、糖載劑(諸如右旋糖、甘露醇、乳糖及相關載劑)、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及其類似物。必要時，錠劑或膠囊可包覆腸溶包衣或藉由標準技術持續釋放。此等劑型之使用可顯著地增強化合物在患者中之生物可用性。

對於非經腸調配物而言，載劑通常會包含無菌水或氯化鈉水溶液，但亦可包括其他成分，包括有助於分散的彼等物。當然，在使用無菌水且維持無菌時，組合物及載劑亦必須經滅菌。亦可製備可注射懸浮液，在此情況下，可採用適當液體載劑、懸浮劑及其類似物。

脂質體懸浮液(包括靶向病毒抗原之脂質體)亦可藉由習知方法製備以產生醫藥學上可接受之載劑。此可適合於遞送根據本發明之核苷化合物之游離核苷、醯基/烷基核苷或磷酸酯前藥形式。

本發明中所提及之量及重量通常係指游離形式(亦即，非鹽、水合物或溶劑合物形式)。本文中所描述之典型值表示游離形式當量，亦即，如同將投與游離形式一般的量。若投與鹽，則需要根據鹽與游離形式之間的分子量比計算量。

根據本發明之醫藥學上可接受之調配物中之式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之量為有效達成以下所需結果之量：治療SARS-CoV-1或SARS-CoV-2病毒的突變或抗性形式，降低獲得SARS-CoV-1或SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式的可能性，或抑制、降低及/或消除SARS-CoV-1或SARS-CoV-2病毒的突變或抗性形式或其繼發作用，包括繼發性病毒出現的疾病病況、病狀及/或併發症。作為非限制性實施例，醫藥劑型中本發明化合物之治療有效量可在例如約每天0.001 mg/kg至約100 mg/kg或更大範圍內。視患者中藥劑之藥物動力學而定，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可例如在非限制性實施例中以每天約0.1 mg/kg至約15 mg/kg患者範圍內之量投與。

除非另外具體指示，否則本文所描述之劑型中之活性化合物之重量係相對於化合物之游離形式或鹽形式。舉例而言，大致600 mg之化合物 2為大致550 mg之化合物 1之當量。

在某些實施例中，醫藥組合物之劑型在單位劑型中含有以下量之式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽：約1 mg至約2000 mg、約10 mg至約1000 mg、約100 mg至約800 mg、約200 mg至約600 mg、約300 mg至約500 mg或約400 mg至約450 mg。

在某些實施例中，醫藥組合物之劑型，例如固體劑型在單位劑型中含有以下量之式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽：至多約10 mg、約50 mg、約100 mg、約125 mg、約150 mg、約175 mg、約200 mg、約225 mg、約250 mg、約275 mg、約300 mg、約325 mg、約350 mg、約375 mg、約400 mg、約425 mg、約450 mg、約475 mg、約500 mg、約525 mg、約550 mg、約575 mg、約600 mg、約625 mg、約650 mg、約675 mg、約700 mg、約725 mg、約750 mg、約775 mg、約800 mg、約825 mg、約850 mg、約875 mg、約900 mg、約925 mg、約950 mg、約975 mg、約1000 mg、約1050 mg、約1100 mg、約1150 mg、約1200 mg、約1250 mg、約1300 mg、約1350 mg、約1400 mg、約1450 mg、約1500 mg、約1550 mg、約1600 mg、約1650 mg、約1700 mg或更多。

在某些實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，例如化合物 1或化合物 2係以初始劑量(或負載劑量)，繼之以至少約300 mg、至少約350 mg、至少約400 mg、至少約450 mg、至少約500 mg、至少約550 mg、至少約650 mg或至少約750 mg之維持劑量投與，且該劑量一天服用一次或兩次。在一些實施例中，負載劑量比維持劑量大約1.5倍、大約2倍、大約2.5倍或大3倍。在一些實施例中，負載劑量在第一維持劑量之前投與一次、兩次、三次、四次或更多次。

在一些實施例中，醫藥組合物之劑型，例如固體劑型在單位劑型中含有以下量之式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽：至少500 mg、至少550 mg、600 mg、至少700 mg、至少800 mg、至少900 mg、至少1000 mg、至少1100 mg、至少1200、至少1300 mg、至少1400 mg或至少1500 mg。

在某些實施例中，醫藥組合物(例如固體劑型)含有至少約450 mg、550 mg、650 mg、750 mg或850 mg化合物 1或化合物 3。在一些實施例中，醫藥組合物含有至少約500 mg、至少約550 mg或至少約600 mg化合物 1或化合物 3，且該組合物一天投與兩次。在一些實施例中，醫藥組合物含有至少約550 mg化合物 1，且醫藥組合物一天投與兩次。在一些實施例中，醫藥組合物以至少約900 mg、1000 mg、1100 mg、1100 mg或1200 mg化合物 1之初始劑量(或負載劑量)投與，隨後以至少約400 mg、至少約450 mg、至少約500 mg、至少約550、至少約600 mg或至少約650 mg化合物 1之劑量一天兩次投與。在一些實施例中，醫藥組合物以至少約1100 mg化合物 1之初始劑量(或負載劑量)投與，隨後以至少約450 mg、550 mg、650 mg、750 mg或850 mg化合物 1之劑量一天兩次投與。在一些實施例中，醫藥組合物以至少約1100 mg化合物 1之初始劑量(或負載劑量)投與，隨後以至少約550 mg化合物 1之劑量一天兩次投與。在一些實施例中，投與維持劑量持續約4、5、6、7、8、9、10或更多天。在一些實施例中，化合物 1為化合物 1A。在一些實施例中，化合物 1為化合物 1B。

在一些實施例中，投與有效量之式I化合物：

或其醫藥學上可接受之鹽，視情況在醫藥學上可接受之載劑中，以用於治療有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式，其中化合物係根據以下時程投與： (i) 一天內1100 mg游離鹼之單次負載劑量；隨後 (ii) 每天550 mg游離鹼之維持劑量。

在一些實施例中，投與有效量之下式化合物：

或其醫藥學上可接受之鹽，視情況在醫藥學上可接受之載劑中，以用於治療有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式，其中化合物係根據以下時程投與： (iii) 一天內1100 mg游離鹼之單次負載劑量；隨後 (iv) 每天550 mg游離鹼之維持劑量。

在一些實施例中，投與有效量之下式化合物：

視情況在醫藥學上可接受之載劑中，以用於治療有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式，其中化合物係根據以下時程投與： (i) 一天內1200 mg鹽之單次負載劑量；隨後 (ii) 每天600 mg鹽之維持劑量。

在某些實施例中，醫藥組合物(例如固體劑型)含有至少約400 mg、至少約500 mg、600 mg、700 mg或800 mg化合物 2或化合物 4。在一些實施例中，醫藥組合物含有至少約500 mg、至少約600 mg或至少約700 mg化合物 2或化合物 4，且組合物一天投與兩次。在一些實施例中，醫藥組合物含有至少約600 mg化合物 2，且醫藥組合物一天投與兩次。在一些實施例中，醫藥組合物以至少約900 mg、1000 mg、1100 mg、1200 mg或1300 mg化合物 2之初始劑量(或負載劑量)投與，隨後以至少約400 mg、500 mg、600 mg、700 mg或800 mg化合物 2之劑量一天一次、兩次或三次投與。在一些實施例中，醫藥組合物以至少約1000 mg、1200 mg或1400 mg化合物 2之初始劑量(或負載劑量)投與，隨後以至少約600 mg化合物 2之劑量一天兩次投與。在一些實施例中，醫藥組合物以至少約1200 mg化合物 2之初始劑量(或負載劑量)投與，隨後以至少約400 mg、500 mg、600 mg、700 mg或800 mg化合物 2之劑量一天兩次投與。在一些實施例中，醫藥組合物以至少約1200 mg化合物 2之初始劑量(或負載劑量)投與，隨後以至少約600 mg化合物 2之劑量一天兩次投與。在一些實施例中，投與維持劑量持續約4、5、6、7、8、9、10或更多天。在一些實施例中，化合物 2為化合物 2A。在一些實施例中，化合物 2為化合物 2B。

在某些實施例中，投與式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽持續至少五天、六天、七天、八天、九天、十天、兩週、三週、一個月、至少兩個月、至少三個月、至少四個月、至少五個月、至少六個月或更久。在一些實施例中，一天投與式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽一次、兩次、三次或更多次。在一些實施例中，其經口投與一天兩次。

出於本發明之目的，根據本發明之組合物之防治或預防有效量一般係屬於上文陳述之範圍內，且可在健康照護提供者之最佳判斷內判定。在一些實施例中，隨著病毒之風險增加而季節性投與本發明化合物以預防感染，或可例如在旅行或暴露之前、期間及/或之後投與。

一般熟習此項技術者將認識到，治療有效量將隨待治療之感染或病狀、其嚴重程度、待採用之治療方案、所用藥劑之藥物動力學以及待治療之患者或個體(動物或人類)而變化，且此類治療量可由主治醫師或專家判定。

固體劑型本發明之一態樣為一種固體劑型，其視情況在醫藥學上可接受之載劑中，包括有效量之式I (包括但不限於化合物 1、 1A、 1B、 2、 2A或 2B)、式II (包括但不限於化合物 3)、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，固體劑型包括式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的噴霧乾燥固體分散體，且組合物適合於經口遞送。在另一實施例中，固體劑型為式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之顆粒分層固體分散體，且組合物適合於經口遞送。

在其他實施例中，固體分散體亦含有至少一種選自共聚維酮(copovidone)、泊洛沙姆(poloxamer)及HPMC-AS之賦形劑。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆407或可包括泊洛沙姆407之泊洛沙姆的混合物。在一些實施例中，HPMC-AS為HPMC-AS-L。

在其他實施例中，由式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽製備之固體劑型亦包含以下賦形劑中之一或多者：磷酸甘油酯；磷脂醯膽鹼；二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)；二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)；二油醯氧基丙基三乙銨(DOTMA)；二油醯基磷脂醯膽鹼；膽固醇；膽固醇酯；二醯甘油；二醯基甘油丁二酸酯；二磷脂醯甘油(DPPG)；十六烷醇；脂肪醇，諸如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-月桂基醚；界面活性脂肪酸，諸如棕櫚酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸單甘油酸酯；脂肪酸二甘油脂；脂肪酸醯胺；山梨糖醇酐三油酸酯(Span®85)甘膽酸酯；山梨糖醇酐單月桂酸酯(Span®20)；聚山梨醇酯20 (Tween®20)；聚山梨醇酯60 (Tween®60)；聚山梨醇酯65 (Tween®65)；聚山梨醇酯80 (Tween®80)；聚山梨醇酯85 (Tween®85)；聚氧乙烯單硬脂酸酯；表面活性素(surfactin)；泊洛沙姆；山梨糖醇酐脂肪酸酯，諸如山梨糖醇酐三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂醯絲胺酸；磷脂醯環己六醇；鞘磷脂；磷脂醯乙醇胺(腦磷脂)；心磷脂；磷脂酸；腦甘脂；二鯨蠟基磷酸酯；二棕櫚醯基磷脂醯甘油；硬脂胺；十二胺；十六胺；乙醯棕櫚酸；甘油蓖麻油酸酯；硬脂酸十六基酯；十四烷酸異丙酯；泰洛沙泊(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000-磷脂醯乙醇胺；聚(乙二醇)400-單硬脂酸酯；磷脂；具有高界面活性劑特性之合成及/或天然清潔劑；去氧膽酸酯；環糊精；離液鹽；離子配對劑；葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺及神經胺酸；普魯蘭(pullulan)、纖維素、微晶纖維素、矽化微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥基纖維素(HC)、甲基纖維素(MC)、聚葡萄糖、環葡聚糖、肝糖、羥乙基澱粉、卡拉膠(carageenan)、糖基(glycon)、直鏈澱粉、聚葡萄胺糖、N,O-羧甲基聚葡萄胺糖、褐藻膠及褐藻酸、澱粉、幾丁質、菊寡糖、蒟蒻、葡甘聚醣、石耳素、肝素、玻尿酸、卡德蘭(curdlan)及黃原膠、甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇及乳糖醇、普洛尼克(pluronic)聚合物、聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1,3-二㗁烷-2-酮))、聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))、聚反丁烯二酸丙酯、聚醯胺(例如聚己內醯胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如聚乳酸交酯、聚乙交酯、聚乳酸交酯-共聚-乙交酯、聚己內酯、聚羥基酸(例如聚((β-羥基烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、及多胺、聚離胺酸、聚離胺酸-PEG共聚物、及聚(伸乙基亞胺)、聚(伸乙基亞胺)-PEG共聚物、甘油單辛癸酸酯、丙二醇、維生素E TPGS (亦稱為d-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯)、明膠、二氧化鈦、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、甲基纖維素(MC)、環氧乙烷與環氧丙烷之嵌段共聚物(PEO/PPO)、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纖維素鈉(NaCMC)或羥丙基甲基纖維素乙酸酯丁二酸酯(HPMCAS)。

在其他實施例中，由式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽製備之固體劑型亦包含以下界面活性劑中之一或多者：聚氧乙二醇、聚氧丙二醇、癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷、辛基葡糖苷、聚氧乙二醇辛基苯酚、Triton X-100、甘油烷基酯、月桂酸甘油酯、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA、十二烷基二甲胺氧化物及泊洛沙姆。泊洛沙姆之實例包括泊洛沙姆188、237、338及407。此等泊洛沙姆可以商標名Pluronic®獲得(可購自BASF, Mount Olive, N.J.)且分別對應於Pluronic® F-68、F-87、F-108及F-127。泊洛沙姆188 (對應於Pluronic® F-68)為具有約7,000至約10,000 Da、或約8,000至約9,000 Da、或約8,400 Da之平均分子量的嵌段共聚物。泊洛沙姆237 (對應於Pluronic® F-87)為具有約6,000至約9,000 Da、或約6,500至約8,000 Da、或約7,700 Da之平均分子量的嵌段共聚物。泊洛沙姆338 (對應於Pluronic® F-108)為具有約12,000至約18,000 Da、或約13,000至約15,000 Da、或約14,600 Da之平均分子量的嵌段共聚物。泊洛沙姆407 (對應於Pluronic® F-127)為比率處於約E101 P56 E101至約E106 P70 E106、或約E101 P56E101、或約E106 P70 E106，且具有約10,000至約15,000 Da、或約12,000至約14,000 Da、或約12,000至約13,000 Da、或約12,600 Da之平均分子量的聚氧乙烯-聚氧丙烯三嵌段共聚物。

在又其他實施例中，由式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽製備之固體劑型亦包含以下界面活性劑中之一或多者：聚乙酸乙烯酯、膽酸鈉鹽、磺基丁二酸二辛酯鈉、溴化六癸基三甲基銨、皂苷、糖酯、Triton X系列、山梨糖醇酐三油酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯、油醇聚氧乙烯(2)醚、硬脂醯聚氧乙烯(2)醚、月桂基聚氧乙烯(4)醚、氧乙烯及氧丙烯之嵌段共聚物、二乙二醇二油酸酯、油酸四氫呋喃酯、油酸乙酯、十四烷酸異丙酯、單油酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單蓖麻油酸甘油酯、鯨蠟醇、硬脂醇、氯化鯨蠟基吡錠、苯紮氯銨、橄欖油、單月桂酸甘油酯、玉米油、棉子油及葵花籽油。

在替代實施例中，由式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽製備之固體劑型係藉由包括溶劑或乾式造粒，視情況隨後壓縮或壓實、噴霧乾燥、奈米懸浮液處理、熱熔擠出、擠出/滾圓、模製、滾圓、分層(例如噴霧分層懸浮液溶液)或其類似方法的方法製備。此類技術之實例包括使用適當衝壓機與沖模直接壓縮，例如其中衝壓機與沖模裝配至適合的壓片機；使用適合的造粒設備(諸如高剪切造粒機)進行濕式造粒以形成待乾燥為顆粒之濕顆粒；造粒，隨後使用適當的衝壓機與沖模進行壓縮，其中衝壓機與沖模裝配至適合的壓片機；擠壓濕塊以形成圓柱形擠出物，在重力及磨損下切割為所需長度或斷裂為所需長度；擠出/滾圓，其中擠出物係磨圓為球形顆粒且藉由滾圓緻密化；使用諸如習知盤或Wurster管柱之技術將懸浮液或溶液噴射分層至惰性芯上；使用安裝至壓縮單元之適合模具進行射出或壓縮成型；及其類似者。

例示性崩解劑包括褐藻酸、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、交聯羧甲基纖維素鈉(交聯羧甲纖維素鈉)、粉末狀纖維素、聚葡萄胺糖、交聯羧甲纖維素鈉、交聯普維酮、瓜爾豆膠(guar gum)、低經取代羥丙基纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、褐藻酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、部分預膠凝化澱粉、預膠凝化澱粉、澱粉、羧甲基澱粉鈉及其類似物或其組合。

例示性潤滑劑包括硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、二十二酸甘油酯、棕櫚基硬脂酸甘油酯、氫化蓖麻油、輕質礦物油、月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂、硬脂醯反丁烯二酸鈉、硬脂酸、硬脂酸鋅、二氧化矽、膠態二氧化矽、經二氧化矽處理之二甲基二氯矽烷、滑石或其組合。

本文所描述之劑型芯可經著衣以產生包衣錠劑。來自芯之劑量可著衣有功能性或非功能性包衣，或功能性與非功能性包衣之組合。「功能性包衣」包括調節總組合物之釋放特性的錠劑包衣，例如持續釋放或延遲釋放包衣。「非功能性包衣」包括非功能性包衣之包衣，例如，裝飾性包衣。非功能性包衣可歸因於初始溶解、水合作用、穿孔包衣等而對活性劑之釋放具有一些影響，但將不認為其為與未包衣組合物的顯著偏差。非功能性包衣亦可掩蓋包括活性醫藥成分之未經著衣之組合物之味道。包衣可包含阻光材料、光吸收材料或阻光材料及光吸收材料。

例示性聚甲基丙烯酸酯包括丙烯酸及甲基丙烯酸酯之共聚物，諸如：a.胺基甲基丙烯酸酯共聚物USP/NF，諸如聚(甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸(2-二甲基胺乙酯)、甲基丙烯酸甲酯) 1:2:1 (例如EUDRAGIT E 100、EUDRAGIT EPO及EUDRAGIT E 12.5；CAS編號24938-16-7)；b.聚(甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯) 1:1 (例如EUDRAGIT L30 D-55、EUDRAGIT L100-55、EASTACRYL 30D、KOLLICOAT MAE 30D及30DP；CAS編號25212-88-8)；c.聚(甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯) 1:1 (例如EUDRAGIT L 100、EUDRAGIT L 12.5及12.5 P；亦稱為甲基丙烯酸共聚物，A型NF；CAS編號25806-15-1)；d.聚(甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯) 1:2 (例如EUDRAGIT S 100、EUDRAGIT S 12.5及12.5P；CAS編號25086-15-1)；e.聚(丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸) 7:3:1 (例如Eudragit FS 30 D；CAS編號26936-24-3)；f.聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸三甲基銨基乙酯氯化物) 1:2:0.2或1:2:0.1 (例如EUDRAGITS RL 100、RL PO、RL 30 D、RL 12.5、RS 100、RS PO、RS 30 D或RS 12.5；CAS編號33434-24-1)；g.聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯) 2:1 (例如EUDRAGIT NE 30 D、Eudragit NE 40D、Eudragit NM 30D；CAS編號9010-88-2)；及其類似物，或其組合。

適合的烷基纖維素包括例如甲基纖維素、乙基纖維素以及其類似物或其組合。例示性基於水之乙基纖維素包衣包括AQUACOAT，進一步含有月桂基硫酸鈉及鯨蠟醇之30%分散液，可獲自FMC, Philadelphia, PA；SURELEASE，進一步含有穩定劑或其他包衣組分(例如油酸銨、癸二酸二丁酯、無水膠狀二氧化矽、中長鏈三酸甘油酯等)之25%分散液，可獲自Colorcon, West Point, PA；乙基纖維素，可獲自Aqualon或Dow Chemical Co (Ethocel), Midland, MI。熟習此項技術者應瞭解，其他纖維素聚合物，包括其他烷基纖維素聚合物，可取代乙基纖維素之一部分或所有。

可用於製備功能性包衣之其他適合的材料包括丁二酸乙酸羥丙基甲基纖維素(HPMCAS)；鄰苯二甲酸乙酸纖維素(CAP)；鄰苯二甲酸聚乙酸乙烯酯；中性或合成蠟、脂肪醇(諸如月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、鯨蠟醇或尤其鯨蠟硬脂醇)、脂肪酸(包括脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯(單、二及三甘油酯)、氫化脂肪、烴、正常蠟、硬脂酸、硬脂醇、具有烴主鏈之疏水性及親水性材料，或其組合。適合的蠟包括蜂蠟、糖蠟、蓖麻蠟、巴西棕櫚蠟、微晶蠟、小燭樹及蠟狀物質，例如在室溫下通常為固體且具有約30℃至約100℃之熔點的材料，或其組合。

在其他實施例中，功能性包衣可包括可消化型、長鏈(例如，C8-C50，特定言之，C12-C40)、經取代或未經取代之烴，諸如脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸之甘油酯、礦物油及植物油、蠟或其組合。可使用具有約25℃與約90℃之間之熔點的烴。具體言之，可使用長鏈烴材料、脂肪(脂族)醇。

包衣可視情況含有額外醫藥學上可接受之賦形劑，諸如塑化劑、穩定劑、水溶性組分(例如成孔劑)、抗黏著劑(例如滑石)、界面活性劑及其類似物或其組合。

功能性包衣可包括釋放調節劑，其影響功能性包衣的釋放特性。釋放調節劑可例如充當成孔劑或基質干擾劑。釋放調節劑可為有機或無機的，且包括可在使用環境中自包衣溶解、萃取或浸出之材料。釋放調節劑可包含一或多種親水性聚合物，其包括纖維素醚及其他纖維素材料，諸如羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素或鄰苯二甲酸乙酸羥丙基甲基纖維素；普維酮；聚乙烯醇；丙烯酸聚合物，諸如胃可溶Eudragit FS 30D，pH敏感的Eudragit L30D 55、L 100、S 100或L 100-55；或其組合。其他例示性釋放調節劑包括普維酮；醣(例如，乳糖及其類似物)；金屬硬脂酸鹽；無機鹽(例如，磷酸氫鈣、氯化鈉及其類似物)；聚乙二醇(例如，聚乙二醇(PEG) 1450及其類似物)；糖醇(例如，山梨醇、甘露醇及其類似物)；鹼金屬烷基硫酸鹽(例如，月桂基硫酸鈉)；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如，聚山梨醇酯)；或其組合。例示性基質干擾劑包括水不溶性有機或無機材料。包括但不限於纖維素、纖維素醚(諸如乙基纖維素)、纖維素酯(諸如乙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素及乙酸丙酸纖維素)；及澱粉之有機聚合物可充當基質干擾劑。實例或無機干擾劑包括許多鈣鹽，諸如磷酸一鈣、磷酸二鈣及磷酸三鈣；二氧化矽及滑石。

包衣可視情況含有塑化劑以改良包衣之物理特性。舉例而言，因為乙基纖維素具有相對較高的玻璃轉移溫度且在正常著衣條件下不形成可撓性膜，所以在使用與包衣材料相同的材料之前向乙基纖維素添加塑化劑可為有利的。一般而言，著衣溶液中所包括之塑化劑之量係基於聚合物之濃度，例如，可視聚合物而定為約1%至約200%，但最通常為聚合物之約1 wt%至約100 wt%。然而，塑化劑之濃度可藉由常規實驗測定。

用於乙基纖維素及其他纖維素之塑化劑的實例包括塑化劑，諸如癸二酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯、檸檬酸三丁酯、三乙酸甘油酯或其組合，但有可能可使用其他不可溶於水的塑化劑(諸如乙醯化單酸甘油酯、鄰苯二甲酸酯、蓖麻油等)。

用於丙烯酸聚合物之塑化劑的實例包括檸檬酸酯，諸如檸檬酸三乙酯NF、檸檬酸三丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、1,2-丙二醇、聚乙二醇、丙二醇、鄰苯二甲酸二乙酯、蓖麻油、三乙酸甘油酯或其組合，但有可能可使用其他塑化劑(諸如乙醯化單酸甘油酯、鄰苯二甲酸酯、蓖麻油等)。

適合方法可用於將包衣材料施加至劑型芯之表面。可使用諸如簡單或複雜凝聚、界面聚合、液體乾燥、熱及離子膠凝、噴霧乾燥、噴霧冷凍、流體化床著衣、盤著衣或靜電沈積之方法。

在某些實施例中，視情況選用之中間包衣用於劑型芯與外部包衣之間。此類中間包衣可用於保護活性劑或芯次單元之其他組分免受外部包衣中使用之材料的影響或提供其他特性。例示性中間包衣典型地包括水溶性成膜聚合物。此類中間包衣可包括成膜聚合物，諸如羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、明膠、羥丙基甲基纖維素、聚乙二醇、聚氧乙烯及其類似物或其組合；及塑化劑。塑化劑可用於降低脆度及增加拉伸強度及彈性。例示性塑化劑包括聚乙二醇丙二醇及甘油。

組合及交替療法如本文所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可在COVID患者之當前標準照護之上投與，或與健康照護提供者認為對患者有益的任何其他化合物或療法組合或交替投與。組合及/或交替療法可為治療性、輔助性或姑息性的。

已觀察到COVID患者可經歷疾病之各個階段，且標準照護可基於患者所呈現或進展到的疾病階段而不同。COVID由於在免疫系統與凝血系統之間產生「串擾」而值得注意。隨著疾病進展，患者之免疫系統可產生過度反應，此可導致多種嚴重影響，包括細胞介素風暴。經由免疫系統與凝血系統之間的串擾，患者可在身體之各個區域開始凝血，包括呼吸系統、腦、心臟及其他器官。已在COVID患者全身觀測到多個凝塊，需要抗凝療法。認為此等凝塊可在未治療及疾病緩解之情況下引起長期或甚至永久性損傷。

更具體言之，已將COVID-19描述為經由三個一般疾病階段進展：階段1 (早期感染)、階段2 (肺部期)及階段3 (高炎症期/細胞介素風暴)。

階段1之特徵在於非特異性且通常輕度的症狀。病毒複製發生，且適合於開始立即用本文所描述之化合物治療且可能與另一抗病毒療法組合或交替。亦可投與干擾素-β以增強針對病毒之先天性免疫反應。因此，在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽以有效量與干擾素-β及/或額外抗病毒藥組合或交替使用。鋅補充劑及/或維生素C有時亦在此階段投與或隨著疾病進展而投與。

COVID-19之階段2為肺部期，其中患者可經歷急性低氧血症型呼吸衰竭。實際上，COVID-19之主要器官衰竭為低氧血症型呼吸衰竭。已顯示，經由類固醇(例如地塞米松)之中度免疫抑制可有益於急性低氧血症型呼吸衰竭患者及/或機械通氣患者。在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物與可為糖皮質素之皮質類固醇組合。非限制性實例為布地奈德(Entocort EC)、倍他米松(Celestone)、普賴松(Prednisone Intensol)、普賴蘇穠(Orapred，Prelone)、曲安西龍(Aristospan Intra-Articular，Aristospan Intralesional，Kenalog)、甲基普賴蘇穠(Medrol，Depo-Medrol，Solu-Medrol)、皮質醇或地塞米松(Dexamethasone Intensol，DexPak 10 Day，DexPak 13 Day，DexPak 6 Day)。

NS5B抑制劑瑞德西韋當向COVID-19患者給與時結果好壞參半。在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與EDP-235組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PBI-0451組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與ALG-097111組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC376組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與艾弗麥克素組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與硝唑尼特組合或交替投與以增大整體抗病毒作用。

在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與抗炎劑巴瑞替尼組合或交替投與。在一些實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與抗炎劑巴瑞替尼及地塞米松組合或交替投與。

階段3 (疾病之最終階段)之特徵在於進行性彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation；DIC)，一種在整個血流中產生小血凝塊之病狀。此階段亦可包括多器官衰竭(例如血管舒張休克、心肌炎)。亦已觀測到許多患者以「細胞介素風暴」對COVID-19感染之此嚴重階段作出反應。DIC與細胞介素風暴之間似乎確實存在雙向、協同關係。為了對抗DIC，通常向患者投與抗凝劑，其可例如為間接凝血酶抑制劑或直接口服抗凝劑(「DOAC」)。非限制性實例為低分子量肝素、華法林(warfarin)、比伐盧定(bivalirudin) (Angiomax)、利伐沙班(rivaroxaban) (Xarelto)、達比加群(dabigatran) (Pradaxa)、阿派沙班(apixaban) (Eliquis)或依度沙班(edoxaban) (Lixiana)。在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與抗凝療法組合或交替投與。在COVID患者凝血之一些嚴重情況下，可投與組織纖維蛋白溶酶原活化因子(tissue plasminogen activator；TPA)。

已觀察到，高含量之細胞介素介白素-6 (IL-6)為COVID-19患者呼吸衰竭及死亡的前兆。為了治療可能構成細胞介素風暴之此免疫反應激增，可向患者投與靶向IL-6之單株抗體、醫藥抑制劑或蛋白質降解劑，諸如與IL-6以及介導降解之蛋白質結合的雙特異性化合物。抗體之實例包括托西利單抗(tocilizumab)、賽瑞單抗(sarilumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、奧諾奇單抗(olokizumab)及克萊贊珠單抗(clazakizumab)。在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之或其醫藥學上可接受之鹽係與托西利單抗或賽瑞單抗組合或交替投與。用於治療過度反應免疫系統之免疫抑制藥物的額外非限制性實例包括Janus激酶抑制劑(托法替尼(tofacitinib) (Xeljanz))；鈣調神經磷酸酶抑制劑(環孢靈(Neoral，Sandimmune，SangCya))、他克莫司(tacrolimus) (Astagraf XL，Envarsus XR，Prograf))；mTOR抑制劑(西羅莫司(sirolimus) (Rapamune)、依維莫司(everolimus) (Afinitor，Zortress))；及IMDH抑制劑(硫唑嘌呤(Azasan，Imuran)、來氟米特(leflunomide) (Arava)、黴酚酸酯(CellCept、Myfortic))。額外抗體及生物製劑包括阿巴西普(abatacept) (Orencia)、阿達木單抗(adalimumab) (Humira)、阿那白滯素(anakinra) (Kineret)、賽妥珠單抗(certolizumab) (Cimzia)、依那西普(etanercept) (Enbrel)、戈利木單抗(golimumab) (Simponi)、英利昔單抗(infliximab) (Remicade)、伊科奇單抗(ixekizumab) (Taltz)、那他珠單抗(natalizumab) (Tysabri)、利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan)、塞庫金單抗(secukinumab) (Cosentyx)、托西利單抗(tocilizumab) (Actemra)、伊科奇單抗(ixekizumab) (Taltz)、那他珠單抗(natalizumab) (Tysabri)、利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan)、托西利單抗(tocilizumab) (Actemra)、烏司奴單抗(ustekinumab) (Stelara)、維多珠單抗(vedolizumab) (Entyvio)、巴利昔單抗(basiliximab) (Simulect)及達利珠單抗(daclizumab) (Zinbryta)。

IL1阻斷IL-6及其他促炎性細胞介素之產生。COVID患者有時亦用抗IL-1療法治療以降低高炎症反應，例如靜脈內投與阿那白滯素。抗IL-1療法一般可為例如靶向單株抗體、醫藥抑制劑或蛋白質降解劑，諸如與IL-1以及介導降解之蛋白質結合的雙特異性化合物。

COVID患者常罹患病毒性肺炎，其可導致細菌性肺炎。重度COVID-19患者亦可受敗血症或「敗血性休克」影響。針對繼發於COVID之細菌性肺炎或敗血症之治療包括投與抗生素，例如巨環內酯抗生素，包括阿奇黴素(azithromycin)、克拉黴素(clarithromycin)、紅黴素(erythromycin)或羅紅黴素(roxithromycin)。額外抗生素包括阿莫西林(amoxicillin)、多西環素(doxycycline)、頭孢力新(cephalexin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、克林達黴素(clindamycin)、甲硝噠唑(metronidazole)、磺胺甲基異㗁唑(sulfamethoxazole)、曲美普林(trimethoprim)、阿莫西林(amoxicillin)、棒酸鹽(clavulanate)或左氧氟沙星(levofloxacin)。因此，在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與抗生素(例如阿奇黴素)組合或交替投與。一些此等抗生素(諸如阿奇黴素)具有獨立的抗炎特性。此類藥物可作為抗炎劑用於COVID患者且對繼發性細菌感染具有治療效果。

若患者需要可持續長達或超過5、10或甚至14天之機械通氣，則治療感染COVID-19之患者的獨特挑戰為相對長期的鎮靜需求。對於此治療期間持續的疼痛，可依序添加鎮痛劑，且對於持續的焦慮，可依序添加鎮靜劑。鎮痛劑之非限制性實例包括乙醯胺苯酚、氯胺酮及PRN類鴉片(氫嗎啡酮、芬太尼(fentanyl)及嗎啡鹼)。鎮靜劑之非限制性實例包括褪黑激素、具有鎮靜為主特性之非典型抗精神病劑(奧氮平(olanzapine)、喹硫平(quetiapine))、異丙酚或右美托咪啶(dexmedetomidine)、氟哌啶醇(haloperidol)及苯巴比妥(phenobarbital)。在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與疼痛舒解劑(諸如乙醯胺苯酚、氯胺酮、氫嗎啡酮、芬太尼或嗎啡鹼)組合或交替投與。在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與鎮靜劑(諸如褪黑激素、奧氮平、喹硫平、異丙酚、右美托咪啶、氟哌啶醇或苯巴比妥)組合或交替投與。

用於COVID-19之研究藥物包括氯奎及羥氯奎。在一個實施例中，式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與氯奎或羥氯奎組合或交替投與。

蛋白酶抑制劑(諸如咯匹那韋或利托那韋，先前批准用於HIV)亦可與式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合投與。

可與式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合使用以治療COVID患者之額外藥物包括但不限於法匹拉韋、芬戈莫德(吉倫亞(Gilenya))、甲基普賴蘇穠、貝伐單抗(阿瓦斯汀(Avastin))、安特美(Actemra) (托西利單抗)、烏米芬韋、氯沙坦及REGN3048與REGN3051或利巴韋林之單株抗體組合。此等藥物或疫苗中之任一者可與本文提供之活性化合物組合或交替使用以治療對此敏感的病毒感染。

在一個實施例中，本發明化合物以有效量與抗冠狀病毒疫苗療法組合使用，該抗冠狀病毒疫苗療法包括但不限於mRNA-1273 (Moderna, Inc.)、AZD-1222 (AstraZeneca及University of Oxford)、BNT162 (Pfizer及BioNTech)、CoronaVac (Sinovac)、NVX-CoV 2372 (NovoVax)、SCB-2019 (Sanofi及GSK)、ZyCoV-D (Zydus Cadila)及CoVaxin (Bharat Biotech)。在另一實施例中，本發明化合物以有效量與被動抗體療法或恢復期血漿療法組合使用。

可與式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合使用之額外藥物包括但不限於：馬瑞利單抗(mavrilimumab)、瑞德西韋、巴瑞替尼(baricitinib)、地塞米松、普賴松、甲基普賴蘇穠、皮質醇、托西利單抗(tocilizumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、賽瑞單抗(sarilumab)、卡瑞單抗(casirivimab)、依德單抗(imdevimab)、卡那單抗(canakinumab)、阿奇黴素(azithromycin)、氯奎(chloroquine)/羥氯奎(hydroxychloroquine)、阿莫地喹(amodiaquine)、青蒿琥酯(artesunate)、咯匹那韋(lopinavir)、利托那韋(ritonavir)、法匹拉韋(favipiravir)、利巴韋林(ribavirin)、EIDD-2801、氯硝柳胺(niclosamide)、硝唑尼特(nitazoxanide)、奧司他韋(oseltamivir)、艾弗麥克素(ivermectin)、莫努拉韋(molnupiravir)、重組ACE-2、索曲韋單抗(sotrovimab)、布地奈德(budesonide)、AZD7442、多西環素(doxycycline)；干擾素、瑞達韋單抗(regdanvimab)、阿那白滯素(anakinra)、盧利替尼(ruxolitinib)、托法替尼(tofacitinib)、阿卡拉布魯替尼(acalabrutinib)、伊馬替尼(imatinib)、博瑞索卡替尼(brensocatib)、拉瓦利單抗(ravulizumab)、奈米路單抗(namilumab)、英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、奧替利單抗(otilimab)、medi3506、巴尼單抗(bamlanivimab)、艾特森韋單抗(etesevimab)、索曲韋單抗(sotrovimab)、樂利單抗(leronlimab)、里森基單抗(Risankizumab)、朗齊魯單抗(lenzilumab)、IMU-838、氟伏沙明(fluvoxamine)、EXO-CD24、樂利單抗、秋水仙鹼(colchicine)、反丁烯二酸二甲酯、血管收縮素轉化酶抑制劑/血管收縮素II受體阻斷劑、士他汀(statin)、克羅匹多(clopidogrel)、抗凝劑、貝西替尼(bemcentinib)、奧美拉唑(omeprazole)、法莫替丁(famotidine)、姿魯克普蘭(zilucoplan)、抗壞血酸/維生素C、維生素D3、阿肽地爾(aviptadi)、特瑞匹坦(tradipitant)、一氧化氮、氟伏沙明(fluvoxamine)、普克魯胺(proxalutamide)、魯克斯特(ruconest)、TRV027、氟伏沙明、異氟醚(isoflurane)、七氟烷(sevoflurane)、索曲韋單抗/VIR-7831 (GSK4182136)、VIR-7832、ADG20、ADG10、LSALT肽、BRII-196/BRII-198、AZD7442 (IV)、SNG001、AZD7442 (IM)、卡莫司他(camostat)、C135-LS + C144-LS、SAB-185、NP-120 (芬普地爾(fenprodil))、氯沙坦(losartan)、奧馬珠單抗(omalizumab)、盧利替尼(ruxolitinib)、同種異體骨髓間葉基質細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell；BM-MSC)、同種異體臍帶間葉基質細胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cell；UC-MSC)、伊科奇單抗(ixekizumab)/阿普司特(apremilast)、CPI-006、坎地沙坦(cadesartan)、纈沙坦(valsartan)、雷米普利(ramipril)、培哚普利(perindopril)、依貝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(losartan)、依那普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、瑞米西爾-L (remestemcel-L)、達格列淨(dapagliflozin)、艾希匹德(alcetrapid)、百慕時(pulmozyme) (去氧核糖酶α)、EB05、全氟戊烷(perflenapent) (NANO2)、呋喃苯胺酸(furosemide)、peg干擾素λ-1A (peginterferon Lambda-1A)、樂複能(novaferon) (嵌合干擾素α)、LAU-7B (非瑞替尼(fenretinide))、牛脂質提取物界面活性劑懸浮液(bovine lipid extract surfactant suspension；BLES)、環索奈德(ciclesonide)、MK-4482、奧紮莫耳(ozanimol)、希托洛(hiltonol) (多核糖肌苷酸(Polyriboinosinic acid)-多核糖胞苷酸(polyribocytidylic acid) (聚ICLC)、茵諾普(innohep) (亭紮肝素鈉(tinzaparin sodium))、洛維諾西(lovenox) (依諾肝素鈉(enoxaparin sodium))、法安明(fragmin) (達肝素鈉(dalteparin sodium))、肝素鈉、二胺苯碸(dapsone)、利伐沙班(rivaroxaban)、膽鈣化醇(cholecalciferol)、方達珀魯(fondaparinux)、茵諾普、法安明(fragmin)、SY-005 (重組人類磷脂結合蛋白(Annexin) A5)、辛伐他汀(simvastatin)、替卡格雷(ticagrelor)、雷米普利(ramipril)、賴諾普利(lisinopril)、培哚普利特丁胺(perindopril erbumine)、依那普利(enalapril)、群多普利(trandolapril)、卡托普利(captopril)、纈沙坦(valsatan)、坎地沙坦酯(candesartan cilexetil)、依貝沙坦(irbesartan)、替米沙坦(telmisartan)、奧美沙坦美度米(olmesartan medoxomil)、RVX000222 (阿帕他隆(Apabetalone))、S-1226 (二氧化碳潘氟隆(Perflubron))、胎盤源性蛻膜基質細胞(decidual stromal cell；DSC)、索馬魯肽(ozempic/semaglutide)、(Vascepa™) (二十碳五烯酸(icosapent))及VIR-7831，或其組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物1或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物1A或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物1B或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物2A組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物2B組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物3A或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物3B或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物4A組合。在一些實施例中，該額外藥劑與化合物4B組合。在一些實施例中，該額外藥劑與式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與式VI化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與式VII化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合。在一些實施例中，該額外藥劑與式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合。

SARS-CoV-2不斷突變，此可增加毒力及傳染速率。可在長期用抗病毒劑治療之後出現抗藥性病毒變體。抗藥性可由編碼用於病毒複製之酶的基因突變產生。在某些情況下，針對RNA病毒感染之藥物的功效可藉由與另一種、且甚至可能兩種或三種其他抗病毒化合物組合或交替投與化合物而延長、增強或恢復，該等抗病毒化合物誘導與原理藥物不同的突變或經由與原理藥物不同的路徑起作用。

替代地，藥物之藥物動力學、生物分佈、半衰期或其他參數可藉由此類組合療法(在視為協同時，其可包括交替療法)變化。因為所揭示之嘌呤核苷酸為聚合酶抑制劑，因此其可適用於與例如以下各者組合向宿主投與化合物： (1) 蛋白酶抑制劑(包括3CLpro/Mpro及PLpro抑制劑兩者)； (2) 另一聚合酶抑制劑； (3) 異位聚合酶抑制劑； (4) 干擾素α-2a，其可經聚乙二醇化或以其他方式經修飾，及/或利巴韋林； (5) 非基於受質之抑制劑； (6) 解螺旋酶抑制劑； (7) 其他病毒非結構蛋白之抑制劑，包括nsp14核糖核酸外切酶/甲基轉移酶、nsp15內切核糖核酸酶、nsp16甲基轉移酶； (8) 病毒結構蛋白，諸如核鞘蛋白之抑制劑； (9) 反義寡去氧核苷酸(S-ODN)； (10) 適體； (11) 核酸酶抗性核糖核酸酶； (12) 小RNA，包括微小RNA及SiRNA； (13) 針對病毒之抗體、部分抗體或域抗體；或 (14) 誘導宿主抗體反應之病毒抗原或部分抗原。

在一些實施例中，化合物1A或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814：

或其醫藥學上可接受之鹽組合或交替向患有SARS-CoV-2變體感染之患者投與。在一些實施例中，化合物1B或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2A係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2B或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3A或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3B或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4A係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4B係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，式VI化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，式VII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07304814組合或交替投與。在一些實施例中，患者具有選自α、β、γ、δ、λ或μ之SARS-CoV-2變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 δ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 λ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 μ變體。

在一些實施例中，化合物1A或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332：

或其醫藥學上可接受之鹽組合或交替向患有SARS-CoV-2變體感染之患者投與。在一些實施例中，化合物1B或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2A係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2B或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3A或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3B或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4A係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4B係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，式VI化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，式VII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與PF-07321332組合或交替投與。在一些實施例中，患者具有選自α、β、γ、δ、λ或μ之SARS-CoV-2變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 δ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 λ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 μ變體。

在一些實施例中，化合物1A或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替向患有SARS-CoV-2變體感染之患者投與：

。在一些實施例中，化合物1B或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2A係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2B或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3A或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3B或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4A係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4B係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，式VI化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，式VII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與GC-376組合或交替投與。在一些實施例中，患者具有選自α、β、γ、δ、λ或μ之SARS-CoV-2變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 δ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 λ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 μ變體。

在一些實施例中，化合物1A或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替向患有SARS-CoV-2變體感染之患者投與。在一些實施例中，化合物1B或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2A係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2B係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3A或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3B或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4A係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4B係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VI化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與莫努拉韋組合或交替投與。在一些實施例中，患者具有選自α、β、γ、δ、λ或μ之SARS-CoV-2變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 δ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 λ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 μ變體。

在一些實施例中，化合物1A或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替向患有SARS-CoV-2變體感染之患者投與。在一些實施例中，化合物1B或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2A係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2B係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3A或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3B或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4A係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4B係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VI化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與索非布韋組合或交替投與。在一些實施例中，患者具有選自α、β、γ、δ、λ或μ之SARS-CoV-2變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 δ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 λ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 μ變體。

在一些實施例中，化合物1A或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替向患有SARS-CoV-2變體感染之患者投與。在一些實施例中，化合物1B或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2A係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物2B係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3A或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物3B或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4A係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，化合物4B係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VI化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與瑞德西韋組合或交替投與。在一些實施例中，患者具有選自α、β、γ、δ、λ或μ之SARS-CoV-2變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 δ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 λ變體。在一些實施例中，患者具有SARS-CoV-2 μ變體。

實施例：至少提供以下實施例：

1. 一種用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之方法，其包含投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

2. 如實施例1之方法，其中該化合物為

(化合物1)，或其醫藥學上可接受之鹽。

3. 如實施例1之方法，其中該化合物為

(化合物2)。

4. 如實施例1之方法，其中該化合物為

(化合物1A)，或其醫藥學上可接受之鹽。

5. 如實施例1之方法，其中該化合物為

(化合物1B)，或其醫藥學上可接受之鹽。

6. 如實施例1之方法，其中該化合物為

(化合物2A)。

7. 如實施例1之方法，其中該化合物為

(化合物2B)。

8. 一種用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之方法，其包含投與有效量之式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

(式II)，其中： R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基。

9. 如實施例8之方法，其中該化合物為：

(化合物3)，或其醫藥學上可接受之鹽。

10. 如實施例8之方法，其中該化合物為：

(化合物4)。

11. 如實施例8之方法，其中該化合物為：

(化合物3A)，或其醫藥學上可接受之鹽。

12. 如實施例8之方法，其中該化合物為：

(化合物3B)，或其醫藥學上可接受之鹽。

13. 如實施例8之方法，其中該化合物為：

(化合物4A)。

14. 如實施例8之方法，其中該化合物為：

(化合物4B)。

15. 一種用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之方法，其包含投與有效量之式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

(式III)，或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基； X選自F、Cl、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基及C ₁-C ₃羥基烷基；及 Y為Cl或F。

16. 一種用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之方法，其包含投與有效量之式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

(式IV)，其中 R ⁶選自氫、-C(O)R ^6A、-C(O)OR ^6A、C _1-6烷基、-CH ₂-O-R ^6A； R ^6A選自氫、C _1-6烷基、C ₁-C ₆鹵烷基(例如-CHCl ₂、-CCl ₃、-CH ₂Cl、-CF ₃、-CHF ₂、-CH ₂F)、芳基、芳基(C _1-6烷基)-，其中芳基視情況經選自以下一個取代基取代：烷氧基、羥基、硝基、溴、氯、氟、疊氮基及鹵烷基； R ⁷為NH ₂、H或-NR ⁸R ⁹； R ⁸及R ⁹獨立地選自氫、C _1-6烷基、-C(O)R ^6A及-C(O)OR ^6A； Y選自F及Cl； Z選自甲基、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基、C ₁-C ₃羥基烷基及鹵素(包括Cl及F)；及 R ¹、R ²、R ³、R ^4a、R ^4b及R ⁵如本文所定義。

17. 一種用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式之方法，其包含投與有效量之式V、式VI或式VII之化合物或其醫藥學上可接受之鹽：

(式V)、

(式VI)、

(式VII)，其中： R ¹⁰選自

18. 一種用於治療或預防有需要之人類之SARS-CoV-2病毒感染之方法，其包含投與有效量之式VIII化合物：

(式VIII)，或其醫藥學上可接受之鹽：其中 R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基； R ⁶選自氫、-C(O)R ^6A、-C(O)OR ^6A、C _1-6烷基、-CH ₂-O-R ^6A； R ^6A選自氫、C _1-6烷基、C ₁-C ₆鹵烷基(例如-CHCl ₂、-CCl ₃、-CH ₂Cl、-CF ₃、-CHF ₂、-CH ₂F)、芳基、芳基(C _1-6烷基)-，其中芳基視情況經選自以下一個取代基取代：烷氧基、羥基、硝基、溴、氯、氟、疊氮基及鹵烷基； R ⁷為NH ₂、H或-NR ⁸R ⁹； R ⁸及R ⁹獨立地選自氫、C _1-6烷基、-C(O)R ^6A及-C(O)OR ^6A； Y選自F及Cl；及 Z選自甲基、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基、C ₁-C ₃羥基烷基及鹵素(包括Cl及F)。

19. 如實施例18之方法，其中該SARS-CoV-2病毒為SARS-CoV-2之突變株。

20. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：B.1.1.207譜系變體、B.1.1.7譜系變體、B.1.427/B.1.428譜系變體及B.1.351譜系變體，或與其相關之病毒變體。

21. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.1.207譜系變體或與其相關之病毒。

22. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.1.7譜系變體或與其相關之病毒。

23. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.427/B.1.428譜系變體或與其相關之病毒。

24. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.351譜系變體或與其相關之病毒。

25. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.177譜系變體或與其相關之病毒。

26. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 P.1譜系變體或與其相關之病毒。

27. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：貂集群5變異株、Nexstrain集群20A.EU1變異株、Nexstrain集群20A.EU2變異株、「集群5」變異株、SARS-CoV-2進化枝19A、19B、20A或20C變異株；SARS-CoV-2進化枝G614、S84、V251、I378或D392變異株；或SARS-CoV-2進化枝O、S、L、V、G、GH或GR變異株。

28. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：α (Pango譜系：B.1.1.7)、β (Pango譜系：B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)、γ (Pango譜系：P.1、P.1.1、P.1.2)、δ (Pango譜系：B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3)、η (Pango譜系：B.1.525)、ι (Pango譜系：B.1.526)、κ (Pango譜系：B.1.617.1)、λ (Pango譜系：C.37)、ε (Pango譜系：B.1.427、B.1.429)、ζ (Pango譜系：P.2)、θ (Pango譜系：P.3)或μ (Pango譜系：B.1.621)。

29. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：Pango譜系P.2、P.3、R.1、R.2、B.1.466.2、B.1.621、B.1.1.318、B.1.1.519、C.36.3、C.36.3.1、B.1.214.2、B.1.1.523、B.1.617.3、B.1.619、B.1.620、B.1.621、A.23.1 (+E484K)、A.27、A.28、C.16、B.1.351 (+P384L)、B.1351 (+E516Q)、B.1.1.7 (+L452R)、B.1.1.7 (+S494P)、C.36 (+L452R)、AT.1、B.1.526.1、B.1.526.2、B.1.1.318、B.1.1.519、AV.1、P.1 (+P681H)、B.1.671.2 (+K417N)或C.1.2。

30. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 α變體(Pango譜系：B.1.1.7)。

31. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 β變體(Pango譜系：B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)。

32. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 γ變體(Pango譜系：P.1、P.1.1、P.1.2)。

33. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 δ變體(Pango譜系：B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3)。

34. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 η變體(Pango譜系：B.1.525)。

35. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 ι變體(Pango譜系：B.1.526)。

36. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 κ變體(Pango譜系：B.1.617.1)。

37. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 λ變體(Pango譜系：C.37)。

38. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 ε變體(Pango譜系：B.1.427、B.1.429)。

39. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 ζ變體(Pango譜系：P.2)。

40. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 θ變體(Pango譜系：P.3)。

41. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 μ變體(Pango譜系：B.1.621)。

42. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：N501Y、D614G及P681H。

43. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、N501Y、D614G及P681H。

44. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V。

45. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：K417T、E484K、N501Y、D614G及H655Y。

46. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、T478K、D614G及P681R。

47. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、D614G及Q677H。

48. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、N501Y、D614G及P681H。

49. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、E484Q、D614G及P681R。

50. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：S477N、E484K、D614G及P681H。

51. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：R346K、E484K、N501Y、D614G及P681H。

52. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452Q、F490S及D614G。

53. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、E484Q、D614G及P681R。

54. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：Q414K、N450K、ins214TDR及D614G。

55. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：V367F、E484K及Q613H。

56. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、N501Y、A653V及H655Y。

57. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、N501T及H655Y。

58. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R及D614G。

59. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：P384L、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V。

60. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：K417N、E484K、N501Y、E516Q、D614G及A701V。

61. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、N501Y、D614G及P681H。

62. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：S494P、N501Y、D614G及P681H。

63. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、D614G及Q677H。

64. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、D614G、N679K及ins679GIAL。

65. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、D614G及A701V。

66. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R及D614G。

67. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：S477N及D614G。

68. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、D614G,及P681H。

69. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K及D614G。

70. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：T478K及D614G。

71. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：N439K、E484K、D614G及P681H。

72. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：D614G、E484K、H655Y、K417T、N501Y及P681H。

73. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、T478K、D614G、P681R及K417N。

74. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：D614G、E484K、H655Y、N501Y、N679K及Y449H。

75. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸H69及V70之缺失的SARS-CoV-2病毒。

76. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代D614G的SARS-CoV-2病毒。

77. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸Y144之缺失的SARS-CoV-2病毒。

78. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代N501Y的SARS-CoV-2病毒。

79. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代A570D的SARS-CoV-2病毒。

80. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代P681H的SARS-CoV-2病毒。

81. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代T716I的SARS-CoV-2病毒。

82. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代S982A的SARS-CoV-2病毒。

83. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代D1118H的SARS-CoV-2病毒。

84. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在ORF8之蛋白質產物中具有過早終止密碼子突變Q27stop的SARS-CoV-2病毒。

85. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代K417N的SARS-CoV-2病毒。

86. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代E484K的SARS-CoV-2病毒。

87. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代K417N的SARS-CoV-2病毒。

88. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代D215G的SARS-CoV-2病毒。

89. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代A701V的SARS-CoV-2病毒。

90. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代L18F的SARS-CoV-2病毒。

91. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代R246I的SARS-CoV-2病毒。

92. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在胺基酸242-244處具有刺突蛋白缺失的SARS-CoV-2病毒。

93. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代Y453F的SARS-CoV-2病毒。

94. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代I692V的SARS-CoV-2病毒。

95. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代M1229I的SARS-CoV-2病毒。

96. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代N439K的SARS-CoV-2病毒。

97. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代A222V的SARS-CoV-2病毒。

98. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代S477N的SARS-CoV-2病毒。

99. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代A376T的SARS-CoV-2病毒。

100. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代P323L的SARS-CoV-2病毒。

101. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代Y455I的SARS-CoV-2病毒。

102. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有Orf8蛋白胺基酸取代R52I的SARS-CoV-2病毒。

103. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有ORF8蛋白胺基酸取代Y73C的SARS-CoV-2病毒。

104. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有核鞘(N)蛋白胺基酸取代D3L的SARS-CoV-2病毒。

105. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有核鞘(N)蛋白胺基酸取代S235F的SARS-CoV-2病毒。

106. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代T1001I的SARS-CoV-2病毒。

107. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代A1708D的SARS-CoV-2病毒。

108. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代I2230T的SARS-CoV-2病毒。

109. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有ORF1ab蛋白胺基酸SGF 3675-3677缺失的SARS-CoV-2病毒。

110. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代S861X的SARS-CoV-2病毒，其中X為任何胺基酸。

111. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480V的SARS-CoV-2病毒。

112. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557L的SARS-CoV-2病毒。

113. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484Y的SARS-CoV-2病毒。

114. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

115. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

116. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

117. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代P323L及刺突蛋白胺基酸取代D614G的SARS-CoV-2病毒。

118. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp2蛋白胺基酸取代T85I及ORF3a胺基酸取代Q57H的SARS-CoV-2病毒。

119. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp13蛋白胺基酸取代P504L及Y541C的SARS-CoV-2病毒。

120. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突蛋白中具有K417T、E484K及N501Y突變的SARS-CoV-2病毒。

121. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有以下之SARS-CoV-2病毒：刺突蛋白胺基酸69-70之缺失、刺突蛋白胺基酸Y144之缺失、刺突蛋白胺基酸取代N501Y、刺突蛋白胺基酸取代A570D、刺突蛋白胺基酸取代D614G、刺突蛋白胺基酸取代P681H、刺突蛋白胺基酸取代T716I、刺突蛋白胺基酸取代S982A、刺突蛋白胺基酸取代D1118H及ORF8之蛋白產物中之過早終止密碼子突變(Q27stop)。

122. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有以下之SARS-CoV-2病毒：刺突蛋白中之N501Y、K417N、E484K、D80A、D215G、L18F及R246I之刺突蛋白胺基酸取代，及刺突蛋白之胺基酸242-244處之胺基酸缺失。

123. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在刺突蛋白之受體結合域中具有突變的SARS-CoV-2病毒。

124. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有突變的SARS-CoV-2病毒。

125. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白之RdRp域之活性位點中具有突變的SARS-CoV-2病毒。

126. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有胺基酸取代P323L的SARS-CoV-2病毒。

127. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有胺基酸取代Y455I的SARS-CoV-2病毒。

128. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代P323L及刺突蛋白胺基酸取代D614G的SARS-CoV-2病毒。

129. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代S861X的SARS-CoV-2病毒，其中X為任何胺基酸。

130. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480V的SARS-CoV-2病毒。

131. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557L的SARS-CoV-2病毒。

132. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484Y的SARS-CoV-2病毒。

133. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

134. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

135. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

136. 如實施例1至19之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有以下突變中之一或多者的SARS-COV-2病毒：P323L；T141I；A449V；S434F；M666I；H613Y；S647I；M380I；E922D；M629I；G774S；M601I；E436G；N491S；Q822H；A443V；T85I；A423V；M463I；T26I；A656T；M668I；T806I；T276M；T801N；V588L；K267N；V880I；K718R；L514F；F415S；T252N；Y38H；E744D；H752Q；I171V；S913L；A526V；A382V；G228C；P94L；E84K；K59N；P830S；T908I；P21S；D879Y；G108D；K780N；R279S；D258Y；T259I；K263N；D284Y；Q292H；T293I；N297S；V299F；D304Y；T319I；F321L；P328S；V330E；I333T；G337C；T344I；Y346H；L351P；V354L；Q357H；E370G；L372F；A400S；T402I；V405F；V410I；D418N；K426N；K430N；V435F；Q444H；D445G；A448V；R457C；P461T；C464F；I466V；V473F；K478N；D481G；D517G；D523N；A529V；P537S；S549N；A555V；C563F；M566I；A581T；G584V；A585T；G596S；T604I；S607I；D608G；V609I；M615V；W617L；M629V；I632V；L636F；L638F；A639V；T643I；T644M；L648F；V667I；A699S；N713S；H725；N734T；D736N；V737F；T739I；V742M；N743S；M756I；L758I；A771V；L775V；A777T；K780T；F793L；T801I；T803A；H810Y；G823C；D825Y；V827A；Y828H；V848L；T870I；K871R；N874D；Q875R；E876D；H882Y；H892Y；D901Y；M906I；N909D；T912N；P918S；E919D；A923T；F480V；V557L；D484Y；E802D；E802A；或S433G；或其組合。

137. 如實施例1至136之方法，其中該方法進一步包含投與有效量之至少一種額外活性劑。

138. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑選自以下：馬瑞利單抗、瑞德西韋、巴瑞替尼、地塞米松、普賴松、甲基普賴蘇穠、皮質醇、托西利單抗、司妥昔單抗、賽瑞單抗、卡瑞單抗、依德單抗、卡那單抗、阿奇黴素、氯奎/羥氯奎、阿莫地喹、青蒿琥酯、咯匹那韋、利托那韋、法匹拉韋、利巴韋林、EIDD-2801、氯硝柳胺、硝唑尼特、奧司他韋、艾弗麥克素、莫努拉韋、重組ACE-2、索曲韋單抗、布地奈德、AZD7442、多西環素；干擾素、瑞達韋單抗、阿那白滯素、盧利替尼、托法替尼、阿卡拉布魯替尼、伊馬替尼、博瑞索卡替尼、拉瓦利單抗、奈米路單抗、英利昔單抗、阿達木單抗、奧替利單抗、medi3506、巴尼單抗、艾特森韋單抗、索曲韋單抗、樂利單抗、里森基單抗、朗齊魯單抗、IMU-838、氟伏沙明、EXO-CD24、樂利單抗、秋水仙鹼、反丁烯二酸二甲酯、血管收縮素轉化酶抑制劑/血管收縮素II受體阻斷劑、士他汀、克羅匹多、抗凝劑、貝西替尼、奧美拉唑、法莫替丁、姿魯克普蘭、抗壞血酸/維生素C、維生素D3、阿肽地爾、特瑞匹坦、一氧化氮、氟伏沙明、普克魯胺、魯克斯特、TRV027、氟伏沙明、異氟醚、七氟烷、VIR-7831 (GSK4182136)、LSALT肽、BRII-196/BRII-198、AZD7442 (IV)、SNG001、AZD7442 (IM)、卡莫司他、C135-LS + C144-LS、SAB-185、NP-120 (芬普地爾)、氯沙坦、奧馬珠單抗、盧利替尼、同種異體骨髓間葉基質細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell；BM-MSC)、同種異體臍帶間葉基質細胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cell；UC-MSC)、伊科奇單抗/阿普司特、CPI-006、坎地沙坦、纈沙坦、雷米普利、培哚普利、依貝沙坦、氯沙坦、依那普利、卡托普利、瑞米西爾-L、達格列淨、艾希匹德、百慕時(去氧核糖酶α)、EB05、全氟戊烷(NANO2)、呋喃苯胺酸、peg干擾素λ-1A、樂複能(嵌合干擾素α)、LAU-7B (非瑞替尼)、牛脂質提取物界面活性劑懸浮液(bovine lipid extract surfactant suspension；BLES)、環索奈德、MK-4482、奧紮莫耳、希托洛(多核糖肌苷酸-多核糖胞苷酸(聚ICLC)、茵諾普(亭紮肝素鈉)、洛維諾西(依諾肝素鈉)、法安明(達肝素鈉)、肝素鈉、二胺苯碸、利伐沙班、膽鈣化醇、方達珀魯、茵諾普、法安明、SY-005 (重組人類磷脂結合蛋白A5)、辛伐他汀、替卡格雷、雷米普利、賴諾普利、培哚普利特丁胺、依那普利、群多普利、卡托普利、纈沙坦、坎地沙坦酯、依貝沙坦、替米沙坦、奧美沙坦美度米、RVX000222 (阿帕他隆)、S-1226 (二氧化碳潘氟隆)、胎盤源性蛻膜基質細胞(decidual stromal cell；DSC)、索馬魯肽(ozempic/semaglutide)、(Vascepa™) (二十碳五烯酸)、PF-07304814、PF-07321332、EDP-235、PBI-0451、ALG-097111、索曲韋單抗(VIR-7831)、VIR-7832、BRII-196、BRII-198、ADG20、ADG10或VIR-7831，或其組合。

139. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為瑞德西韋。

140. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為皮質類固醇。

141. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為地塞米松。

142. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為普賴松、甲基普賴蘇穠或皮質醇。

143. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為巴瑞替尼。

144. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為托西利單抗。

145. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為莫努拉韋。

146. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為索非布韋。

147. 如實施例1至137之方法，其中該額外活性劑為GC376。

148. 一種治療或預防人類中SARS-CoV感染之方法，其包含以下步驟：(a)鑑別能夠抑制套病毒RdRp相關核苷酸轉移酶(NiRAN)域介導之嚴重急性呼吸道症候群(SARS)相關冠狀病毒之非結構蛋白(nsp) 12之活性的化合物，其包含測定該化合物抑制NiRAN域介導的活性的能力，其中該NiRAN域介導的活性選自：(i)用天然尿苷三磷酸(UTP)對非結構蛋白8 (nsp8)進行UMP化；(ii)用天然尿苷三磷酸(UTP)對nsp8進行核苷酸化；(iii)藉由NiRAN域用天然鳥苷-三磷酸(GTP)對nsp8進行核苷酸化；(iv)天然GTP轉移至非結構蛋白(nsp) 8；(v)天然UTP轉移至nsp 8；及(vi)起始或完成蛋白質引動的RNA合成；或其組合；其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，能夠抑制一或多個選自(i)至(vi)之NiRAN域介導的活性至少25%或更多的化合物係鑑別為能夠抑制NiRAN域介導的活性的化合物；及 (b)若該化合物抑制該病毒之該NiRAN域介導的活性，則向有需要之人類投與該化合物。

149. 如實施例148之方法，其中鑑別為能夠抑制NiRAN域介導之活性之該化合物防止蛋白質引動的RNA合成的起始或完成。

150. 如實施例148或149之方法，其中該化合物亦用來抑制NiRAN非依賴性RNA合成中二核苷酸重新合成或RNA依賴性RNA合成之鏈終止。

151. 如實施例148至150中任一項之方法，其中該化合物為核苷酸。

152. 如實施例148至151中任一項之方法，其中該核苷酸為基於鳥苷之核苷酸。

153. 如實施例148至152中任一項之方法，其中向患有SARS-CoV感染之人類投與經鑑別為能夠抑制NiRAN域介導之活性之化合物的該化合物。

154. 如實施例148至153之方法，其中該SARS-CoV為SARS-CoV-2。

155. 一種用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV感染之方法，其包含以下步驟：(a)鑑別能夠抑制SARS相關冠狀病毒之nsp 12之NiRAN域介導的活性的化合物，其包含： i. 使該化合物與SARS相關冠狀病毒之nsp12蛋白接觸；及 ii. 活體外判定該化合物是否與(i)nsp12之NiRAN域中之不變的離胺酸殘基K73或(ii)NiRAN域之活性位點結合；其中化合物與NiRAN域之不變的離胺酸殘基K73或活性位點結合指示化合物能夠抑制NiRAN域介導的活性；及(b)若該化合物抑制病毒之NiRAN域介導的活性，則向該有需要之人類投與有效量的該化合物。

156. 如實施例155之方法，其中該NiRAN域之該活性位點襯有以下殘基：K73、R74、H75、N79、E83、R116、N209、G214、D218、F219及F222。

157. 如實施例155之方法，其中該NiRAN域之該活性位點襯有以下殘基：K50、R55、T120、N209及Y217。

158. 如實施例155至157之方法，其中向患有SARS-CoV-2感染之人類投與經鑑別為能夠抑制NiRAN域介導之活性之化合物的該化合物。

159. 一種治療或預防人類中SARS-CoV感染之方法，其包含：(a)鑑別能夠抑制SARS-CoV之nsp 12之NiRAN域介導之活性的化合物，其包含： i. 於活體外使該化合物在UTP及/或GTP存在下與該nsp12蛋白接觸；及 ii. 量測該化合物、GTP及/或UTP與該NiRAN域之結合；其中由該化合物之結合高於由GTP及/UTP之結合至少約1.5倍指示化合物能夠抑制NiRAN域介導之活性；及(b)若該化合物抑制該病毒之該NiRAN域介導活性，則向該有需要之人類投與有效量之該化合物。

160. 如實施例159之方法，其中該化合物在UTP存在下接觸nsp12。

161. 如實施例159至160之方法，其中該化合物在GTP存在下接觸nsp12。

162. 如實施例159之方法，其中該化合物在UTP及GTP存在下接觸nsp12。

163. 如實施例159至162中任一項之方法，其中GTP及/或UTP以比該化合物更大之濃度存在。

164. 如實施例159至163中任一項之方法，其中GTP及/或UTP與該化合物呈等莫耳濃度。

165. 如實施例159至164中任一項之方法，其中若相較於其中不存在該化合物之對照，該化合物以相對於UTP及/或GTP約2.0倍或更大結合該NiRAN域，則該化合物能夠抑制NiRAN域介導的活性。

166. 如實施例159、161至165中任一項之方法，其中若化合物以相對於GTP高約1.5倍結合該NiRAN域，則該化合物能夠抑制NiRAN域介導之活性。

167. 如實施例159至160、162至165中任一項之方法，其中若化合物以相對於UTP高約2.0倍結合該NiRAN域，則該化合物能夠抑制NiRAN域介導之活性。

168. 如實施例159至167中任一項之方法，其中向患有SARS-CoV感染或處於感染SARS-CoV感染風險下之人類投與經鑑別為能夠抑制NiRAN域介導之活性之化合物的該化合物。

169. 一種鑑別能夠抑制SARS-CoV之nsp 12之NiRAN域介導之活性的化合物的方法，其包含： i. 於活體外使該化合物在UTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定該化合物是否抑制藉由nsp12進行之nsp8之UMP化；其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，藉由該NiRAN域進行之nsp8之UMP化經抑制至少25%或更多指示化合物能夠抑制NiRAN域介導的活性。

170. 一種鑑別能夠抑制SARS-CoV之nsp 12之NiRAN域介導之活性的化合物的方法，其包含： i. 於活體外使該化合物在UTP及/或GTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定化合物是否抑制nsp8之核苷酸化；其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，藉由該NiRAN域進行之nsp8之核苷酸化經抑制至少25%或更多指示化合物能夠抑制NiRAN域介導的活性。

171. 如實施例170之方法，其中該方法提供在UTP存在下接觸nsp12及nsp8。

172. 如實施例170之方法，其中該方法提供在GTP存在下接觸nsp12及nsp8。

173. 如實施例169至170之方法，其中該方法提供在UTP及GTP兩者存在下接觸nsp12及nsp8。

174. 如實施例169至173之方法，其中GTP及/或UTP以比該化合物更大之濃度存在。

175. 如實施例169至173之方法，其中GTP及/或UTP與該化合物呈等莫耳濃度。

176. 如實施例169至175之方法，其中相較於其中不存在能夠抑制NiRAN域介導之活性之化合物之對照，該化合物降低nsp8之核苷酸化至少50%或更多。

177. 如實施例169至175之方法，其中相較於其中不存在能夠抑制NiRAN域介導之活性之化合物之對照，該化合物降低對照，nsp8之核苷酸化至少90%或更多。

178. 如實施例169至177中任一項之方法，其中向患有SARS-CoV感染或處於感染SARS-CoV感染風險下之人類投與經鑑別為能夠抑制NiRAN域介導之活性之化合物的該化合物。

179. 一種鑑別能夠抑制SARS-CoV之nsp 12之NiRAN域介導之活性的化合物的方法，其包含： i. 於活體外使該化合物在UTP及/或GTP存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定化合物是否抑制UTP及/或GTP自nsp12轉移至nsp8；其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，藉由該NiRAN域進行之UTP及/或GTP之轉移經抑制至少25%或更多指示化合物能夠抑制NiRAN域介導的活性。

180. 如實施例179之方法，其中該化合物在UTP存在下接觸nsp12及nsp8。

181. 如實施例179至180之方法，其中該化合物在GTP存在下接觸nsp12及nsp8。

182. 如實施例179至181之方法，其中該化合物在UTP及GTP兩者存在下接觸nsp12及nsp8。

183. 如實施例179至182之方法，其中GTP及/或UTP以比該化合物更大之濃度存在。

184. 如實施例179至182之方法，其中GTP及/或UTP與該化合物呈等莫耳濃度。

185. 如實施例179至184之方法，其中相較於其中不存在能夠抑制NiRAN域介導之活性之化合物之對照，該化合物降低GTP及/或UTP自nsp12轉移至nsp8至少50%或更多。

186. 如實施例179至184之方法，其中相較於其中不存在能夠抑制NiRAN域介導之活性之化合物之對照，該化合物降低GTP及/或UTP自nsp12轉移至nsp8至少90%或更多。

187. 如實施例179至186中任一項之方法，其中向患有SARS-CoV感染或處於感染SARS-CoV感染風險下之人類投與經鑑別為能夠抑制NiRAN域介導活性之化合物的該化合物。

188. 一種用於鑑別能夠抑制SARS相關冠狀病毒中之蛋白質引動的RNA合成之化合物之方法，其包含： i. 於活體外使該化合物在UTP及poly(A) RNA模板存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12、nsp7及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定該化合物是否在UTP存在下抑制poly(A) RNA模板上之重新RNA合成；其中如活體外分析中所量測，相較於無該化合物之相同分析，在UTP存在下該poly(A) RNA模板上之蛋白質引動的RNA合成受到抑制至少25%或更多即指示化合物能夠抑制蛋白質引動的RNA合成。

189. 如實施例188之方法，其中該nsp12、nsp7及nsp8係以nsp12:7L8:8聚合酶複合物形式提供。

190. 如實施例188至189之方法，其中nsp12:7L8:8聚合酶複合物呈1:3:3莫耳比或1:3:6莫耳比。

191. 如實施例188至190之方法，其中若相較於其中不存在該化合物之對照，該化合物降低該poly(A) RNA模板之引子非依賴性RNA合成至少50%或更多，則該化合物係鑑別為能夠抑制蛋白質引動的RNA合成。

192. 如實施例188至190之方法，其中相較於其中不存在該化合物之對照，該化合物降低該poly(A) RNA模板之蛋白質引動的RNA合成至少90%或更多。

193. 如實施例188至192中任一項之方法，其中向患有SARS-CoV-2感染或處於感染SARS-CoV-2感染風險下之人類投與經鑑別為能夠抑制蛋白質引動的RNA合成之化合物的該化合物。

194. 一種治療或預防人類中SARS-CoV感染之方法，其包含鑑別能夠抑制人類中之SARS-CoV複製之化合物，其包含 (a)： i. 選擇核苷酸； ii. 活體外篩選該核苷酸以判定該化合物是否抑制該病毒之NiRAN域介導的活性；其中若該化合物呈現以下，則判定其抑制NiRAN域介導的活性：(i) 如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP及/或GTP與NiRAN之活性區域的結合至少25%或更多；(ii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP與NiRAN之活性UMP化位點的結合至少25%或更多；(iii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然NTP與NiRAN之活性NMP化位點的結合至少25%或更多；(iv)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP及/或GTP與該NiRAN域中之不變的離胺酸殘基K73的結合至少25%或更多；(v)防止或降低天然UTP及/或GTP進入該NiRAN域的該活性位點；(vi)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP及/或GTP進入該NiRAN域的該活性位點至少25%或更多，其中該活性位點為襯有以下殘基的袋：K73、R74、H75、N79、E83、R116、N209、G214、D218、F219及F222；(vii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP及/或GTP進入該NiRAN域之該活性位點至少25%或更多，其中該活性位點為襯有以下殘基的袋：K50、R55、T120、N209、Y217；(viii)與不變的離胺酸殘基K73結合；(ix)與該NiRAN域的該活性位點袋結合；(x)與該NiRAN域的該活性位點袋結合，其中該活性位點袋襯有以下殘基：K73、R74、H75、N79、E83、R116、N209、G214、D218、F219及F222；(xi)與該NiRAN域的該活性位點袋結合，其中該活性位點袋襯有以下殘基：K50、R55、T120、N209、Y217；(xii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，藉由該NiRAN域防止天然UTP及/或GTP轉移至少25%或更多；(xiii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止天然GTP及/或UTP轉移至nsp8至少25%或更多，；或(xiv)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止蛋白質引動的RNA合成之起始或完成至少25%或更多；或其組合；及 (b)若該化合物抑制該病毒之該NiRAN域介導的活性，則向該有需要之人類投與該化合物。

195. 如實施例194之方法，其中該核苷酸為基於鳥苷之核苷酸。

196. 如實施例194至195之方法，其中該核苷酸為穩定的磷酸酯前藥。

197. 如實施例194至196之方法，其中向患有SARS-CoV-2感染或處於感染SARS-CoV-2感染風險下之人類投與經鑑別為能夠抑制SARS-CoV複製之化合物的該化合物。

198. 一種用於治療或預防人類中SARS-CoV感染之方法，其包含： i. 判定該人類是否已感染了SARS-CoV； ii. 鑑別具有NiRAN域介導之抑制活性之化合物；及 iii. 若該化合物具有NiRAN域介導之抑制活性，則向該人類投與有效量之該化合物。

199. 如實施例194至198之方法，其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，該化合物抑制NiRAN域介導之nsp8 UMP化至少25%或更多。

200. 如實施例194至198之方法，其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，該化合物抑制NiRAN域介導之nsp8核苷酸化至少25%或更多。

201. 如實施例194至198之方法，其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，該化合物抑制核苷酸自nsp12之NiRAN域轉移至nsp8至少25%或更多。

202. 如實施例194至198之方法，其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，該化合物抑制蛋白質引動的RNA合成及/或引子非依賴性RNA合成至少25%或更多。

203. 如實施例194至198之方法，其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，該化合物抑制蛋白質引動的RNA合成及/或引子非依賴性RNA合成及RNA依賴性RNA鏈延伸至少25%或更多。

204. 如實施例194至198之方法，其中相對於天然UTP及GTP，該化合物優先與nsp12之NiRAN域結合。

205. 如實施例194至198之方法，其中當以1:1比率分析時，相對於天然UTP之至少約3X，該化合物優先與該NiRAN域結合。

206. 如實施例194至198之方法，其中當以1:1比率分析時，相對於天然GTP之至少約1.5X，該化合物優先與該NiRAN域結合。

207. 如實施例194至198之方法，其中該化合物結合該NiRAN域中之不變的離胺酸殘基K73。

208. 如實施例194至198之方法，其中該化合物為基於鳥嘌呤或基於尿苷之核苷酸。

209. 如實施例194至198之方法，其中該化合物為基於鳥苷之核苷酸。

210. 如實施例194至198之方法，其中該化合物為穩定的磷酸酯前藥。

211. 如實施例148至210中任一項之方法，其中該SARS相關冠狀病毒病毒感染為SARS-CoV-2。

212. 如實施例211之方法，其中該化合物係與一或多種額外活性劑組合或交替投與。

213. 如實施例211之方法，其中該額外活性劑選自以下：馬瑞利單抗、瑞德西韋、巴瑞替尼、地塞米松、普賴松、甲基普賴蘇穠、皮質醇、托西利單抗、司妥昔單抗、賽瑞單抗、卡瑞單抗、依德單抗、卡那單抗、阿奇黴素、氯奎/羥氯奎、阿莫地喹、青蒿琥酯、咯匹那韋、利托那韋、法匹拉韋、利巴韋林、EIDD-2801、氯硝柳胺、硝唑尼特、奧司他韋、艾弗麥克素、莫努拉韋、重組ACE-2、索曲韋單抗、布地奈德、AZD7442、多西環素；干擾素、瑞達韋單抗、阿那白滯素、盧利替尼、托法替尼、阿卡拉布魯替尼、伊馬替尼、博瑞索卡替尼、拉瓦利單抗、奈米路單抗、英利昔單抗、阿達木單抗、奧替利單抗、medi3506、巴尼單抗、艾特森韋單抗、索曲韋單抗、樂利單抗、里森基單抗、朗齊魯單抗、IMU-838、氟伏沙明、EXO-CD24、樂利單抗、秋水仙鹼、反丁烯二酸二甲酯、血管收縮素轉化酶抑制劑/血管收縮素II受體阻斷劑、士他汀、克羅匹多、抗凝劑、貝西替尼、奧美拉唑、法莫替丁、姿魯克普蘭、抗壞血酸/維生素C、維生素D3、阿肽地爾、特瑞匹坦、一氧化氮、氟伏沙明、普克魯胺、魯克斯特、TRV027、氟伏沙明、異氟醚、七氟烷、VIR-7831 (GSK4182136)、LSALT肽、BRII-196/BRII-198、AZD7442 (IV)、SNG001、AZD7442 (IM)、卡莫司他、C135-LS + C144-LS、SAB-185、NP-120 (芬普地爾)、氯沙坦、奧馬珠單抗、盧利替尼、同種異體骨髓間葉基質細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell；BM-MSC)、同種異體臍帶間葉基質細胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cell；UC-MSC)、伊科奇單抗/阿普司特、CPI-006、坎地沙坦、纈沙坦、雷米普利、培哚普利、依貝沙坦、氯沙坦、依那普利、卡托普利、瑞米西爾-L、達格列淨、艾希匹德、百慕時(去氧核糖酶α)、EB05、全氟戊烷(NANO2)、呋喃苯胺酸、peg干擾素λ-1A、樂複能(嵌合干擾素α)、LAU-7B (非瑞替尼)、牛脂質提取物界面活性劑懸浮液(bovine lipid extract surfactant suspension；BLES)、環索奈德、MK-4482、奧紮莫耳、希托洛(多核糖肌苷酸-多核糖胞苷酸(聚ICLC)、茵諾普(亭紮肝素鈉)、洛維諾西(依諾肝素鈉)、法安明(達肝素鈉)、肝素鈉、二胺苯碸、利伐沙班、膽鈣化醇、方達珀魯、茵諾普、法安明、SY-005 (重組人類磷脂結合蛋白A5)、辛伐他汀、替卡格雷、雷米普利、賴諾普利、培哚普利特丁胺、依那普利、群多普利、卡托普利、纈沙坦、坎地沙坦酯、依貝沙坦、替米沙坦、奧美沙坦美度米、RVX000222 (阿帕他隆)、S-1226 (二氧化碳潘氟隆)、胎盤源性蛻膜基質細胞(decidual stromal cell；DSC)、索馬魯肽(ozempic/semaglutide)、(Vascepa™) (二十碳五烯酸)、PF-07304814、PF-07321332、EDP-235、PBI-0451、ALG-097111、或VIR-7832、BRII-196、BRII-198、ADG20、ADG10、VIR-7831，或其組合。

214. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為瑞德西韋。

215. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為皮質類固醇。

216. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為地塞米松。

217. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為普賴松、甲基普賴蘇穠或皮質醇。

218. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為巴瑞替尼。

219. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為托西利單抗。

220. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為莫努拉韋。

221. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為索非布韋。

222. 如實施例212之方法，其中該額外活性劑為GC376。

223. 如實施例148至222中任一項之方法，其中該化合物不為式I化合物。

224. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2之突變株。

225. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：B.1.1.207譜系變體、B.1.1.7譜系變體、B.1.427/B.1.428譜系變體及B.1.351譜系變體，或與其相關之病毒變體。

226. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.1.207譜系變體或與其相關之病毒。

227. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.1.7譜系變體或與其相關之病毒。

228. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.427/B.1.428譜系變體或與其相關之病毒。

229. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.351譜系變體或與其相關之病毒。

230. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 B.1.177譜系變體或與其相關之病毒。

231. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 P.1譜系變體或與其相關之病毒。

232. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：貂集群5變異株、Nexstrain集群20A.EU1變異株、Nexstrain集群20A.EU2變異株、「集群5」變異株、SARS-CoV-2進化枝19A、19B、20A或20C變異株；SARS-CoV-2進化枝G614、S84、V251、I378或D392變異株；或SARS-CoV-2進化枝O、S、L、V、G、GH或GR變異株。

233. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸H69及V70之缺失的SARS-CoV-2病毒。

234. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代D614G的SARS-CoV-2病毒。

235. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸Y144之缺失的SARS-CoV-2病毒。

236. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代N501Y的SARS-CoV-2病毒。

237. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代A570D的SARS-CoV-2病毒。

238. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代P681H的SARS-CoV-2病毒。

239. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代T716I的SARS-CoV-2病毒。

240. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代S982A的SARS-CoV-2病毒。

241. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代D1118H的SARS-CoV-2病毒。

242. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在ORF8之蛋白質產物中具有過早終止密碼子突變Q27stop的SARS-CoV-2病毒。

243. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代K417N的SARS-CoV-2病毒。

244. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代E484K的SARS-CoV-2病毒。

245. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代K417N的SARS-CoV-2病毒。

246. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代D215G的SARS-CoV-2病毒。

247. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代A701V的SARS-CoV-2病毒。

248. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代L18F的SARS-CoV-2病毒。

249. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代R246I的SARS-CoV-2病毒。

250. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在胺基酸242-244處具有刺突蛋白缺失的SARS-CoV-2病毒。

251. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代Y453F的SARS-CoV-2病毒。

252. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代I692V的SARS-CoV-2病毒。

253. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代M1229I的SARS-CoV-2病毒。

254. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代N439K的SARS-CoV-2病毒。

255. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代A222V的SARS-CoV-2病毒。

256. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代S477N的SARS-CoV-2病毒。

257. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有刺突蛋白胺基酸取代A376T的SARS-CoV-2病毒。

258. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代P323L的SARS-CoV-2病毒。

259. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代Y455I的SARS-CoV-2病毒。

260. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有Orf8蛋白胺基酸取代R52I的SARS-CoV-2病毒。

261. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有ORF8蛋白胺基酸取代Y73C的SARS-CoV-2病毒。

262. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有核鞘(N)蛋白胺基酸取代D3L的SARS-CoV-2病毒。

263. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有核鞘(N)蛋白胺基酸取代S235F的SARS-CoV-2病毒。

264. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代T1001I的SARS-CoV-2病毒。

265. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代A1708D的SARS-CoV-2病毒。

266. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有ORF1ab蛋白胺基酸取代I2230T的SARS-CoV-2病毒。

267. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有ORF1ab蛋白胺基酸SGF 3675-3677缺失的SARS-CoV-2病毒。

268 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代S861X的SARS-CoV-2病毒，其中X為任何胺基酸。

269. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480V的SARS-CoV-2病毒。

270. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557L的SARS-CoV-2病毒。

271. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484Y的SARS-CoV-2病毒。

272. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

273. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

274. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

275. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代P323L及刺突蛋白胺基酸取代D614G的SARS-CoV-2病毒。

276. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp2蛋白胺基酸取代T85I及ORF3a胺基酸取代Q57H的SARS-CoV-2病毒。

277. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp13蛋白胺基酸取代P504L及Y541C的SARS-CoV-2病毒。

278. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突蛋白中具有K417T、E484K及N501Y突變的SARS-CoV-2病毒。

279. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有以下之SARS-CoV-2病毒：刺突蛋白胺基酸69-70之缺失、刺突蛋白胺基酸Y144之缺失、刺突蛋白胺基酸取代N501Y、刺突蛋白胺基酸取代A570D、刺突蛋白胺基酸取代D614G、刺突蛋白胺基酸取代P681H、刺突蛋白胺基酸取代T716I、刺突蛋白胺基酸取代S982A、刺突蛋白胺基酸取代D1118H及ORF8之蛋白產物中之過早終止密碼子突變(Q27stop)。

280. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有以下之SARS-CoV-2病毒：刺突蛋白中之N501Y、K417N、E484K、D80A、D215G、L18F及R246I之刺突蛋白胺基酸取代，及刺突蛋白之胺基酸242-244處之胺基酸缺失。

281. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突蛋白之受體結合域中具有突變的SARS-CoV-2病毒。

282. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有突變的SARS-CoV-2病毒。

283. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白之RdRp域之活性位點中具有突變的SARS-CoV-2病毒。

284. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有胺基酸取代P323L的SARS-CoV-2病毒。

285. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有胺基酸取代Y455I的SARS-CoV-2病毒。

286. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代P323L及刺突蛋白胺基酸取代D614G的SARS-CoV-2病毒。

287. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代S861X的SARS-CoV-2病毒，其中X為任何胺基酸。

288. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480V的SARS-CoV-2病毒。

289. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557L的SARS-CoV-2病毒。

290. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484Y的SARS-CoV-2病毒。

291. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代F480X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

292. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代V557X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

293. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為具有nsp12蛋白胺基酸取代D484X的SARS-CoV-2病毒，其中X=任何胺基酸。

294. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有以下突變中之一或多者的SARS-COV-2病毒：P323L；T141I；A449V；S434F；M666I；H613Y；S647I；M380I；E922D；M629I；G774S；M601I；E436G；N491S；Q822H；A443V；T85I；A423V；M463I；T26I；A656T；M668I；T806I；T276M；T801N；V588L；K267N；V880I；K718R；L514F；F415S；T252N；Y38H；E744D；H752Q；I171V；S913L；A526V；A382V；G228C；P94L；E84K；K59N；P830S；T908I；P21S；D879Y；G108D；K780N；R279S；D258Y；T259I；K263N；D284Y；Q292H；T293I；N297S；V299F；D304Y；T319I；F321L；P328S；V330E；I333T；G337C；T344I；Y346H；L351P；V354L；Q357H；E370G；L372F；A400S；T402I；V405F；V410I；D418N；K426N；K430N；V435F；Q444H；D445G；A448V；R457C；P461T；C464F；I466V；V473F；K478N；D481G；D517G；D523N；A529V；P537S；S549N；A555V；C563F；M566I；A581T；G584V；A585T；G596S；T604I；S607I；D608G；V609I；M615V；W617L；M629V；I632V；L636F；L638F；A639V；T643I；T644M；L648F；V667I；A699S；N713S；H725；N734T；D736N；V737F；T739I；V742M；N743S；M756I；L758I；A771V；L775V；A777T；K780T；F793L；T801I；T803A；H810Y；G823C；D825Y；V827A；Y828H；V848L；T870I；K871R；N874D；Q875R；E876D；H882Y；H892Y；D901Y；M906I；N909D；T912N；P918S；E919D；A923T；F480V；V557L；D484Y；E802D；E802A；或S433G；或其組合。

295. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：α (Pango譜系：B.1.1.7)、β (Pango譜系：B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)、γ (Pango譜系：P.1、P.1.1、P.1.2)、δ (Pango譜系：B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3)、η (Pango譜系：B.1.525)、ι (Pango譜系：B.1.526)、κ (Pango譜系：B.1.617.1)、λ (Pango譜系：C.37)、ε (Pango譜系：B.1.427、B.1.429)、ζ (Pango譜系：P.2)、θ (Pango譜系：P.3)或μ (Pango譜系：B.1.621)。

296. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：Pango譜系P.2、P.3、R.1、R.2、B.1.466.2、B.1.621、B.1.1.318、B.1.1.519、C.36.3、C.36.3.1、B.1.214.2、B.1.1.523、B.1.617.3、B.1.619、B.1.620、B.1.621、A.23.1 (+E484K)、A.27、A.28、C.16、B.1.351 (+P384L)、B.1351 (+E516Q)、B.1.1.7 (+L452R)、B.1.1.7 (+S494P)、C.36 (+L452R)、AT.1、B.1.526.1、B.1.526.2、B.1.1.318、B.1.1.519、AV.1、P.1 (+P681H)、B.1.671.2 (+K417N)或C.1.2。

297. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 α變體(Pango譜系：B.1.1.7)。

298. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 β變體(Pango譜系：B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)。

299. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 γ變體(Pango譜系：P.1、P.1.1、P.1.2)。

300. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 δ變體(Pango譜系：B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3)。

301. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 η變體(Pango譜系：B.1.525)。

302. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 ι變體(Pango譜系：B.1.526)。

303. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 κ變體(Pango譜系：B.1.617.1)。

304. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 λ變體(Pango譜系：C.37)。

305. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 ε變體(Pango譜系：B.1.427、B.1.429)。

306. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 ζ變體(Pango譜系：P.2)。

307. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 θ變體(Pango譜系：P.3)。

308. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為SARS-CoV-2 μ變體(Pango譜系：B.1.621)。

309. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：N501Y、D614G及P681H。

310. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、N501Y、D614G及P681H。

311. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V。

312. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：K417T、E484K、N501Y、D614G及H655Y。

313. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、T478K、D614G及P681R。

314. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、D614G及Q677H。

315. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、N501Y、D614G及P681H。

316. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、E484Q、D614G及P681R。

317. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：S477N、E484K、D614G及P681H。

318. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：R346K、E484K、N501Y、D614G及P681H。

319. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452Q、F490S及D614G。

320. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、E484Q、D614G及P681R。

321. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：Q414K、N450K、ins214TDR及D614G。

322. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：V367F、E484K及Q613H。

323. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、N501Y、A653V及H655Y。

324. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、N501T及H655Y。

325. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R及D614G。

326. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：P384L、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V。

327. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：K417N、E484K、N501Y、E516Q、D614G及A701V。

328. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、N501Y、D614G及P681H。

329. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：S494P、N501Y、D614G及P681H。

330. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、D614G及Q677H。

331. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、D614G、N679K及ins679GIAL。

332. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、D614G及A701V。

333. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R及D614G。

334. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：S477N及D614G。

335. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K、D614G,及P681H。

336. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：E484K及D614G。

337. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：T478K及D614G。

338. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：N439K、E484K、D614G及P681H。

339. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：D614G、E484K、H655Y、K417T、N501Y及P681H。

340. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：L452R、T478K、D614G、P681R及K417N。

341. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：D614G、E484K、H655Y、N501Y、N679K及Y449H。

342. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：T19R、T95I、G142D、E156del、F157del、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R及D950N。

343. 如實施例148至223之方法，其中該病毒為在刺突(S)蛋白中至少包含以下突變之SARS-CoV-2：T19R、V70F、T95I、G142D、E156del、F157del、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R及D950N。

344. 如實施例1至147之方法，其中相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，用於該投與之化合物不會驅動或誘導該SARS-CoV病毒進一步突變。

345. 如實施例148至344之方法，其中相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，該投與之經鑑別化合物不會驅動或誘導該SARS-CoV病毒進一步突變。

346. 如實施例1至19或294之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有E802D突變的SARS-CoV-2病毒。

347. 如實施例1至19或294之方法，其中該病毒為在nsp12蛋白中具有E802A突變的SARS-CoV-2病毒。

348. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為PF-07304814。

349. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為PF-07321332。

350. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為EDP-235。

351. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為PBI-0451。

352. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為ALG-097111。

353. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為索曲韋單抗(VIR-7831)。

354. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為VIR-7832。

355. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為BRII-196。

356. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為BRII-198。

357. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為ADG20。

358. 如實施例137或212之方法，其中該額外活性劑為ADG10。

359. 如實施例155至187之方法，其中該NiRAN域介導之活性為蛋白質引動的RNA合成。

360. 如實施例1至359之方法，其中該SARS-CoV病毒已對一或多種抗病毒治療產生抗性。

361. 如實施例360之方法，其中該SARS-CoV病毒對以下各者具有抗性：馬瑞利單抗、瑞德西韋、巴瑞替尼、地塞米松、普賴松、甲基普賴蘇穠、皮質醇、托西利單抗、司妥昔單抗、賽瑞單抗、卡瑞單抗、依德單抗、卡那單抗、阿奇黴素、氯奎/羥氯奎、阿莫地喹、青蒿琥酯、咯匹那韋、利托那韋、法匹拉韋、利巴韋林、EIDD-2801、氯硝柳胺、硝唑尼特、奧司他韋、艾弗麥克素、莫努拉韋、重組ACE-2、索曲韋單抗、布地奈德、AZD7442、多西環素；干擾素、瑞達韋單抗、阿那白滯素、盧利替尼、托法替尼、阿卡拉布魯替尼、伊馬替尼、博瑞索卡替尼、拉瓦利單抗、奈米路單抗、英利昔單抗、阿達木單抗、奧替利單抗、medi3506、巴尼單抗、艾特森韋單抗、索曲韋單抗、樂利單抗、里森基單抗、朗齊魯單抗、IMU-838、氟伏沙明、EXO-CD24、樂利單抗、秋水仙鹼、反丁烯二酸二甲酯、血管收縮素轉化酶抑制劑/血管收縮素II受體阻斷劑、士他汀、克羅匹多、抗凝劑、貝西替尼、奧美拉唑、法莫替丁、姿魯克普蘭、抗壞血酸/維生素C、維生素D3、阿肽地爾、特瑞匹坦、一氧化氮、氟伏沙明、普克魯胺、魯克斯特、TRV027、氟伏沙明、異氟醚、七氟烷、VIR-7831 (GSK4182136)、LSALT肽、BRII-196/BRII-198、AZD7442 (IV)、SNG001、AZD7442 (IM)、卡莫司他、C135-LS + C144-LS、SAB-185、NP-120 (芬普地爾)、氯沙坦、奧馬珠單抗、盧利替尼、同種異體骨髓間葉基質細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell；BM-MSC)、同種異體臍帶間葉基質細胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cell；UC-MSC)、伊科奇單抗/阿普司特、CPI-006、坎地沙坦、纈沙坦、雷米普利、培哚普利、依貝沙坦、氯沙坦、依那普利、卡托普利、瑞米西爾-L、達格列淨、艾希匹德、百慕時(去氧核糖酶α)、EB05、全氟戊烷(NANO2)、呋喃苯胺酸、peg干擾素λ-1A、樂複能(嵌合干擾素α)、LAU-7B (非瑞替尼)、牛脂質提取物界面活性劑懸浮液(bovine lipid extract surfactant suspension；BLES)、環索奈德、MK-4482、奧紮莫耳、希托洛(多核糖肌苷酸-多核糖胞苷酸(聚ICLC)、茵諾普(亭紮肝素鈉)、洛維諾西(依諾肝素鈉)、法安明(達肝素鈉)、肝素鈉、二胺苯碸、利伐沙班、膽鈣化醇、方達珀魯、茵諾普、法安明、SY-005 (重組人類磷脂結合蛋白A5)、辛伐他汀、替卡格雷、雷米普利、賴諾普利、培哚普利特丁胺、依那普利、群多普利、卡托普利、纈沙坦、坎地沙坦酯、依貝沙坦、替米沙坦、奧美沙坦美度米、RVX000222 (阿帕他隆)、S-1226 (二氧化碳潘氟隆)、胎盤源性蛻膜基質細胞(decidual stromal cell；DSC)、索馬魯肽(ozempic/semaglutide)、(Vascepa™) (二十碳五烯酸)、PF-07304814、PF-07321332、EDP-235、PBI-0451、ALG-097111、或VIR-7832、BRII-196、BRII-198、ADG20、ADG10、VIR-7831，或其組合。

362. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為瑞德西韋。

363. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為皮質類固醇。

364. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為地塞米松。

365. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為普賴松、甲基普賴蘇穠或皮質醇。

366. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為巴瑞替尼。

367. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為托西利單抗。

368. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為莫努拉韋。

369. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為索非布韋。

370. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為GC376。

371. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為PF-07304814。

372. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為PF-07321332。

373. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為EDP-235。

374. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為PBI-0451。

375. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為ALG-097111。

376. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為索曲韋單抗(VIR-7831)。

377. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為VIR-7832。

378. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為BRII-196。

379. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為BRII-198。

380. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為ADG20。

381. 如實施例360之方法，其中該額外活性劑為ADG10。

382 一種鑑別能夠抑制或預防SARS-CoV感染之化合物之方法，其包含： i. 於活體外使該化合物在UTP及poly(A) RNA模板存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12、nsp7及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定該化合物是否在UTP存在下抑制poly(A) RNA模板上之重新RNA合成；其中如活體外分析中所量測，相較於無該化合物之相同分析，在UTP存在下該poly(A) RNA模板上之蛋白質引動的RNA合成受到抑制至少25%或更多即指示化合物能夠抑制蛋白質引動的RNA合成。

383. 如實施例382之方法，其中該nsp12、nsp7及nsp8係以nsp12:7L8:8聚合酶複合物形式提供。

384. 如實施例382之方法，其中nsp12:7L8:8聚合酶複合物呈1:3:3莫耳比或1:3:6莫耳比。

385. 如實施例382至384之方法，其中若相較於其中不存在該化合物之對照，該化合物降低該poly(A) RNA模板之引子非依賴性RNA合成至少50%或更多，則該化合物係鑑別為能夠抑制蛋白質引動的RNA合成。

386. 如實施例382至384之方法，其中相較於其中不存在該化合物之對照，該化合物降低該poly(A) RNA模板之蛋白質引動的RNA合成至少90%或更多。

387. 如實施例382至386之方法，其中該SARS-CoV感染為SARS-CoV-2感染。

388. 一種用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV感染之方法，其包含：(i)選擇呈現破壞NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成之作用機制的核苷酸藥物；及(ii)向宿主投與有效量的該藥物以治療或預防該感染。

389. 如實施例388之方法，其中該SARS-CoV感染為SARS-CoV-2感染。

實例

實例 1. 化合物 1A 針對 Huh7 細胞中之冠狀病毒之活性測試了化合物 1A針對Huh7細胞中之人類冠狀病毒α-229E及β-OC43之活性。以在隔夜培育之後在各孔中產生80%-100%匯合單層之濃度，將Huh7細胞接種於96孔盤中。將化合物 1A溶解於DMSO中直至10 mg/mL，且在測試培養基(含有5%胎牛血清及50 µL建它黴素之改良伊格爾氏培養基(Eagle's medium))中製備8個半對數連續稀釋液，其中最高濃度為50 µg/mL。將100 µL之各濃度添加至96孔盤上之5個測試孔，且3個孔用測試培養基中之測試病毒感染(≤100 CCID ₅₀/孔)。將等量之測試培養基添加至其餘測試孔中以評定對未感染細胞之毒性。六個孔經感染以充當未處理之病毒對照。僅將培養基添加至6個孔中以充當細胞對照。將盤在37℃下在潮濕5% CO ₂氛圍中培育，直至用顯微鏡觀測到細胞病變效應(CPE)。

為了獲得CPE終點，將孔用0.011%中性紅染料染色大致2小時。將染料虹吸移出且用磷酸鹽緩衝鹽水沖洗孔一次以移除殘餘未併入之染料。持續＞30分鐘在攪拌下添加200 µL之50:50 Sorensen檸檬酸鹽緩衝液/乙醇，且接著在分光光度計上量測540 nm下之光吸收。

為了獲得病毒產量降低(virus yield reduction；VYR)終點，合併來自各化合物濃度之3個重複孔的上清液流體，且使用標準終點稀釋CCID ₅₀分析來量測病毒效價，且使用Reed Muench (1948)方程式進行效價計算(Reed, LJ及Muench, H. Am. J. Hygiene27:493-497 (1948))。使用回歸分析判定將病毒產量減少1 log ₁₀所需的化合物濃度(EC ₉₀)。

如表1中所示，化合物 1A對α-229E冠狀病毒及β-OC43冠狀病毒均有效。化合物 1A在病毒產量減少分析中針對α-229E呈現0.71 μM的EC ₉₀值，且針對β-OC43呈現0.29 μM的EC ₉₀值。此外，化合物 1A針對α及β冠狀病毒均呈現高CC ₅₀值及選擇性指數(selectivity index；SI)。舉例而言，針對β冠狀病毒，化合物 1A在使用病毒產量減少分析量測時具有大於170之選擇性指數，且當在中性紅分析中量測時具有大於50 μM之CC ₅₀值。表 1. 化合物 1A 針對冠狀病毒 α -229E 及 β -OC43 之活性

	視覺	中性紅	VYR
Huh7細胞中之病毒	EC ₅₀(μM)	CC ₅₀(μM)	SI	EC ₅₀(μM)	CC ₅₀(μM)	SI	EC ₉₀(μM)	SI
α-229E	1	＞50	＞50	1	＞50	＞50	0.71	＞70
β-OC43	NT	＞50	NT	NT	＞50	NT	0.29	＞170

視覺及中性紅SI：CC ₅₀/EC ₅₀VYR S1：CC ₅₀/EC ₉₀NT：未測試

實例 2. 化合物 1A 及 1B 針對 BHK-21 及 MES-21 細胞中之冠狀病毒之活性測試了化合物 1A及化合物 1B針對BHK-21細胞(表2A及表2B)及MES-1細胞(表3A及表3B)中之人類冠狀病毒之活性。測定EC ₅₀及CC ₅₀，且與基於尿嘧啶之核苷酸索非布韋相比較。

化合物針對冠狀病毒之活性係基於抑制以.01之感染倍率(m.o.i.)急性感染的病毒誘導之細胞致病性。在37℃培育3天之後，藉由MTT方法測定細胞活力，如由Pauwels等人所描述(J. Virol. Methods 1988, 20, 309-321)。

為了判定細胞毒性，將細胞以1×10 ⁶個細胞/毫升之初始密度接種於含有最低必需培養基之96孔盤中，該培養基具有厄爾斯鹽(Earles's salt) (MEM-E)、L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及25 mg/L康黴素，補充有10%胎牛血清。接著在37℃在潮濕5% CO ₂氛圍中在不存在或存在測試化合物之連續稀釋液的情況下培育細胞培養物。藉由MTT方法測定細胞活力。表 2A. 所選化合物針對 BHK-21 細胞中之 HCoV 之活性

化合物	CC ₅₀[μM] ^a	EC ₅₀[μM] ^b
	＞100	1.6
	＞100	2.5
	＞100	＞100
2'-CH ₃/OH 腺苷	53	6.1
2'-CH ₃/OH 鳥苷(IDX-184)	65	1.7
瑞德西韋	＞100	7.2
2'-CH ₃/OH 胞苷(IDX-283)	＞100	＞100

^a在3天培育之後，如藉由MTT方法所測定，將模擬感染之BHK細胞之活力降低50%所需的化合物濃度(μM) ^b在3天培育之後，如藉由MTT方法所測定，達成50%保護BHK細胞免受病毒誘導之細胞致病性所需的化合物濃度(μM) 表 2B. 所選化合物針對 BHK-21 細胞中之 HCoV 之活性

化合物	CC ₅₀[μM] ^a	EC ₅₀[μM] ^b
	＞100	2.0
	＞100	2.9
	＞100	＞100
2'-CH ₃/OH 腺苷	53	5.9
2'-CH ₃/OH 鳥苷 (IDX-184)	65	1.9
瑞德西韋	＞100	7.0
2'-CH ₃/OH 胞苷(IDX-283)	＞100	＞100

^a在3天培育之後，如藉由MTT方法所測定，將模擬感染之BHK細胞之活力降低50%所需的化合物濃度(μM) ^b在3天培育之後，如藉由MTT方法所測定，達成50%保護BHK細胞免受病毒誘導之細胞致病性所需的化合物濃度(μM) 表 3A. 所選化合物針對 MES-1 細胞中之 HCoV 之活性

	CC ₅₀[μM] ^c	EC ₅₀[μM] ^d
	＞100	1.6
	＞100	2.0
	＞100	＞100
2'-CH ₃/OH 腺苷	65	5.5
2'-CH ₃/OH 鳥苷 (IDX-184)	82	1.9
瑞德西韋	＞100	6.0
2'-CH ₃/OH 胞苷(IDX-283)	＞100	＞100

^c在3天培育之後，如藉由MTT方法所測定，將模擬感染之MES-1細胞之活力降低50%所需的化合物濃度(μM) ^d在3天培育之後，如藉由MTT方法所測定，達成50%保護MES-1細胞免受病毒誘導之細胞致病性所需的化合物濃度(μM) 表 3B. 所選化合物針對 MES-1 細胞中之 HCoV 之活性

	CC ₅₀[μM] ^c	EC ₅₀[μM] ^d
	＞100	2.0
	＞100	2.2
	＞100	＞100
2'-CH ₃/OH 腺苷	65	5.3
2'-CH ₃/OH 鳥苷 (IDX-184)	82	1.7
瑞德西韋	＞100	5.5
2'-CH ₃/OH 胞苷(IDX-283)	＞100	＞100

^c在3天培育之後，如藉由MTT方法所測定，將模擬感染之MES-1細胞之活力降低50%所需的化合物濃度(μM)。 ^d在3天培育之後，如藉由MTT方法所測定，達成50%保護MES-1細胞免受病毒誘導之細胞致病性所需的化合物濃度(μM)

實例 3. 化合物 1A 針對 SARS-CoV 及 SARS-CoV-2 之活性針對Huh7細胞中之SARS-CoV及分化正常人類支氣管上皮(differentiated normal human bronchial epithelial；dNHBE，亦稱為HAE (人類呼吸道上皮))細胞中之SARS-CoV-2測試了化合物 1A，且結果提供於表4中。使用中性紅分析測定CC ₅₀，且使用病毒產量減少分析測定EC ₉₀及SI。EC ₉₀係以µg/mL及µM為單位提供。化合物 1A針對SARS-CoV呈現0.34 µM之EC ₉₀，且針對SARS-CoV-2呈現0.64 µM之EC ₉₀。表 4. 化合物 1A 針對 SARS-CoV 及 SARS-CoV-2 之活性

HuCoV 病毒(病毒株)	細胞株	中性紅分析	病毒產量減少分析
CC ₅₀(µg/mL)	EC ₉₀(µg/mL)	EC ₉₀(µM)	選擇性指數
SARS-CoV (Urbani)	Huh7	＞50	0.2	0.34	＞250
SARS-CoV-2 (WA1)	dNHBE	＞50 ¹	0.37 ²	0.64	＞135

¹藉由視覺檢查細胞來估計CC ₅₀ ²值表示兩次重複EC ₉₀測定(0.33及0.41 µg/mL)之平均值

在中性紅(neutral red；NR)分析中，在感染SARS-CoV (Urbani)之Huh-7細胞中評估化合物 1A之活性以評定細胞毒性，且接著使用病毒產量減少(virus yield reduction；VYR)分析進行測試以評定抗病毒活性。

中性紅分析：將化合物 1A以10 mg/mL之濃度溶解於100% DMSO中，且在測試培養基(補充有5% FBS及50 μg/mL建它黴素之最低必需培養基)中使用八個半對數稀釋液進行連續稀釋。起始(高)測試濃度為50 μg/mL。將各稀釋液添加至具有80%-100%匯合之Huh7或RD細胞(僅hCoV β OC43)之96孔盤的5個孔中。各稀釋之三個孔經病毒感染，且兩個孔保持未感染作為毒性對照。六個未處理孔經感染作為病毒對照，且六個未處理孔保持未感染以用作細胞對照。將病毒稀釋至每mL特定的50%細胞培養物感染劑量(CCID ₅₀)，以達成將在5-7天內產生＞80%毒性的最低可能感染倍率(multiplicity of infection；MOI)。MOI為0.03 CCID ₅₀/細胞。在37±2℃、5% CO ₂下培育培養盤。

在感染後(post-infection；p.i.)第7天，培養盤用中性紅染料染色大致2小時(±15分鐘)。移除上清液染料，用PBS沖洗孔，且將併入之染料在50:50 Sorensen檸檬酸鹽緩衝液/乙醇中萃取＞30分鐘，且在540 nm下在分光光度計上讀取光密度。將光密度轉化為細胞對照百分比，且計算在不存在病毒下引起50%細胞死亡所需的化合物 1A之濃度(CC ₅₀)。選擇性指數(SI)為CC ₅₀除以EC ₅₀。

病毒產量減少分析：將Vero76細胞接種於96孔盤中且生長隔夜(37℃)至80%匯合度。在感染後第3天收集來自各化合物濃度之上清液流體之樣品(3個孔合併)，且使用標準終點稀釋CCID ₅₀分析測試病毒效價，且使用Reed-Muench (1948)方程式計算效價(Reed, LJ及Muench, H. Am. J. Hygiene27:493-497 (1948))。藉由回歸分析判定將病毒產量減少1 log ₁₀所需的化合物濃度(EC ₉₀)。

接下來，使用由MatTek Corporation(Ashland, MA)訂購之分化正常人類支氣管上皮(dNHBE，亦稱為HAE (人類呼吸道上皮))細胞，評估化合物 1A針對SARS-CoV-2 (WA1)之抗病毒活性。

細胞培養：dNHBE細胞在6 mm網目圓盤上生長且用帶有12孔或24孔半透膜(transwell insert)之套組培養達到細胞數。在運輸期間，將組織穩定在一片瓊脂糖上，在接收後移除該瓊脂糖。估計一個半透膜(insert)由大致1.2×10 ⁶個細胞組成。細胞半透膜之套組(EpiAirway ^TMAIR-100、AIR-112)源自單一供體#9831，一名23歲、健康、不吸菸的高加索男性。細胞在形成層中具有獨特特性，其頂側僅暴露於空氣且產生黏蛋白層。細胞達到後，根據製造商說明書將細胞半透膜立即轉移至6孔盤之個別孔，且將1 mL MatTek專用培養基(AIR-100-MM)添加至底外側，而頂側暴露於潮濕5% CO ₂環境。在開始實驗之前，將細胞在37℃培養一天。在24小時平衡時段之後，藉由用400 µL預溫熱30 mM HEPES緩衝鹽水溶液洗滌3次而移除自細胞頂側分泌之黏蛋白層。在洗滌步驟之後補充培養基。

病毒：在感染之前，將病毒稀釋於AIR-100-MM培養基中，以產生每個細胞大致0.0015 CCID ₅₀之感染倍率(MOI)。

實驗設計：將各化合物處理(120 μL)及病毒(120 μL)應用於頂側。同時，將化合物處理(1 mL)應用於底側進行2 h培育。作為病毒對照，一些細胞用安慰劑(僅細胞培養基)處理。在2 h感染之後，移除頂部培養基，且用新鮮化合物或培養基(1 mL)替換底側。將細胞維持在空氣-液體界面處。在第5天，藉由視覺檢查來估計安慰劑處理之半透膜中的細胞毒性(CC ₅₀值)，且自全部半透膜移除基本培養基且丟棄。藉由添加400 µL在37℃預溫熱之培養基來收集釋放至dNHBE細胞之頂室中的病毒。將內容物培育30分鐘，充分混合，收集，充分渦旋且塗鋪於Vero 76細胞上以進行VYR滴定。重複孔用於病毒對照及細胞對照。

自各經處理之細胞培養物測定病毒效價：將Vero 76細胞接種於96孔盤中且生長隔夜(37℃)至匯合。將含有病毒之樣品以10倍增量稀釋於感染培養基中，且將200 μL之各稀釋液轉移至96孔微量滴定盤之各別孔中。四個微孔用於各稀釋液以測定50%病毒終點。在5天培育之後，若相比於未感染對照觀測到任何細胞病變效應(CPE)，則將各孔評分為病毒陽性，且在第6及7天確認終點計數。能夠感染50%之細胞培養物的病毒劑量(CCID ₅₀/0.1 mL)係藉由Reed-Muench方法(1948) (Reed, LJ及Muench, H. Am. J. Hygiene27:493-497 (1948))計算，且90%有效濃度(EC ₉₀；使病毒產量減少1 log10之濃度)係藉由回歸分析判定。報導第5天值。未處理、未感染細胞係用作細胞對照。

實例 4. 化合物 1A 及其他口服抗病毒藥物針對各種人類冠狀病毒之活體外活性在各種細胞株中針對各種人類冠狀病毒測試化合物 1A及其他口服抗病毒藥物(表5)。資料表明化合物 1A針對若干CoV之強效活體外活性，其中針對HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV-1及SARS-CoV-2，個別EC ₉₀值在0.34至1.2 µM範圍內，且針對MERS-CoV之活性更小(平均EC ₉₀= 36 µM)。表5.化合物1A及其他口服抗病毒藥物針對人類冠狀病毒之活性

病毒 ( 屬)	細胞株	化合物	中性紅分析	病毒產量減少分析 EC ₉₀(µM)	選擇性指數 (CC ₅₀/EC ₉₀)
EC ₅₀(µM)	CC ₅₀(µM)
HCoV-229E (α)	BHK-21	化合物 1A索非布韋	1.8 ^a,b＞100 ^b	＞100 ＞100		＞58 ^cN/A
Huh-7	化合物 1A氯奎羥氯奎	1.7 / 1.6 8.1 7.4	＞86 21 26	1.0 ＜0.050 ＜0.048	＞75 2.6 ^c3.5 ^c
HCoV-OC43 (β)	Huh-7	化合物 1A	ND ^d	＞86	0.5 / ＜0.03	＞170 / ＞3100
RD	化合物 1A	2.8	＞86	2.2	＞39
MERS-CoV (β)	Huh-7	化合物 1A	15 / 36	＞86	17 / 56	＞5 / ＞1.5
SARS-CoV-1 (β)	Huh-7	化合物 1A	ND	＞86	0.34	＞250
SARS-CoV-2 (β)	HAE	化合物 1AN ⁴-hydroxycytidine	ND	＞86 ^e/ ＞8.6 ^e＞19 ^e	0.64 ^f/ 0.47 ^g3.9 ^h	＞130 / ＞18 ＞5.1

^a2個實驗(1.6及2.0 µM)之平均值 ^b藉由染料染色測定之EC ₅₀(病毒產量減少實質上過高估計了細胞毒性化合物之抗病毒效能) ^cCC ₅₀/EC ₅₀ ^d未測定(此病毒在此細胞株中無細胞病變效應) ^e藉由視覺檢查細胞單層評定之細胞毒性 ^f兩個重複(0.57及0.70 µM)之平均值 ^g兩個重複(0.52及0.42 µM)之平均值 ^h兩個重複(4.7及3.1 µM)之平均值 BHK-21，幼倉鼠腎細胞株 Huh-7，人類肝細胞癌細胞株(確認的自化合物 1A形成三磷酸酯之能力) RD，人類橫紋肌肉瘤細胞株(未知的自化合物 1A形成三磷酸酯之能力) HAE，人類呼吸道上皮細胞培養物(確認的自化合物 1A形成三磷酸酯之能力)

在初始篩選中，將急性感染季節性人類α冠狀病毒HCoV-229E之BHK-21細胞暴露於化合物 1A之連續稀釋液。在3天培育之後，自兩個獨立實驗達成病毒誘導之細胞病變效應(CPE)之50%抑制所需的化合物 1A之有效濃度(EC ₅₀)平均為1.8 µM。相比之下，2'-氟-2'-甲基尿苷核苷酸前藥索非布韋在高達100 µM之濃度下不抑制HCoV-229E複製(表5)。自任一藥物未偵測到毒性。

接著在基於Huh-7細胞之分析中評估化合物 1A針對HCoV-229E、HCoV-OC43 (另一季節性人類冠狀病毒菌株)、MERS-CoV及SARS-CoV-1之活體外效能。此人類肝癌細胞株係基於其將化合物 1A細胞內活化為其三磷酸酯代謝物的能力而選擇，不同於MRC-5細胞，其中化合物 1A缺乏針對HCoV-229E之活性(EC ₅₀＞ 100 µM)，如在Good, S.S.等人 PLoS One15(1), e0227104 (2020))中所報導。在將Huh-7細胞暴露於病毒及測試化合物之連續稀釋液之後，抗病毒活性係藉由兩種不同方法評定，其藉由1)在5天(229E及OC43)或7天(MERS及SARS)培育之後，藉由中性紅染料染色測定病毒誘導之CPE的EC ₅₀，及2)使用標準終點稀釋CCID ₅₀分析測定在3天培育之後使感染性病毒向培養基中之分泌減少90%所需的有效濃度(EC ₉₀)，以測定病毒產量減少(VYR)。半最大細胞毒性(CC ₅₀)係藉由化合物處理之重複物在不存在病毒下的中性紅染色來量測。儘管在感染HCoV-OC43或SARS-CoV-1之Huh-7細胞中獲得穩固的VYR終點，但在此等病毒之情況下，未觀測到CPE且使用中性紅染色未獲得EC ₅₀值。化合物 1A針對HCoV-229E、HCoV-OC43及SARS-CoV-1之個別測定EC ₉₀值在0.34至1.2 µM範圍內，而針對MERS-CoV之值平均為37 µM (表5)。直至所測試最高濃度86 µM，在化合物 1A之情況下未偵測到細胞毒性。

基於氯奎及羥氯奎使用VYR量測獲得的＜0.05 µM之EC ₉₀值，其似乎針對HCoV-229E及HCoV-OC43相當強效(表5)。使用中性紅分析獲得的此兩種藥物之各別EC ₅₀值(8.1及7.4 µM)實質上更高且僅比對應CC ₅₀值小2.6至3.6倍，指示相當更低的效能及不佳選擇性指數。此等差異說明僅使用VYR量測評估細胞毒性化合物之抗病毒活性方面的固有誤差。當細胞被有毒藥物毒害且逐漸死亡時，除了自身健康外，其支持病毒複製及繁殖之能力亦可能大大降低。當藉由染色偵測到細胞死亡時，病毒產量減少量測值可能反映了抗病毒活性及細胞毒性之組合，因此高估了抗病毒效能。

與Wang, M.等人( Cell Research2020, 30, 269)中公開之資料相比，Huh-7細胞不容許SARS-CoV-2複製。使用肺之高度相關活體外模型人類呼吸道上皮(HAE)細胞製劑研發分析，該細胞製劑已確立為比SARS-CoV-2複製之細胞株更具代表性的系統(Jomsdottir, H.R., Virol. J.13, 24 (2016))。此等原代細胞形成極化單層，其頂側暴露於空氣且產生黏蛋白層，與人類呼吸道之生理學一致(Jomsdottir, H.R., Virol. J.13, 24 (2016))。來自兩個獨立HAE分析的化合物 1A針對SARS-CoV-2之平均EC ₉₀及CC ₅₀值(分別為0.5及＞86 µM)與針對HCoV-OC43及SARS-CoV-1獲得之彼等值在相同範圍內(表5)。

在第二HAE分析中，與最近報導具有針對SARS-CoV-2之活體外及活體內活性的N ⁴-羥基胞苷平行測試化合物 1A之活性(Sheahan, T.P.等人 Sci. Transl. Med.12, eabb5883 (2020))。在相同實驗中，N ⁴-羥基胞苷針對SARS-CoV-2之效能(EC ₉₀= 3.9 µM)比化合物 1A之該效能小8倍。

在MERS-CoV與其他CoV之間觀測到化合物 1A活性之30倍差異。在CoV RdRp活性位點處達成核苷酸選擇，nsp12基因產物藉由其持續合成能力輔因子nsp7及nsp8活化(Subissi, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA111 (37) 3900-9 (2014))。保守胺基酸模體A及C參與磷酸二酯鍵形成，而模體F及B分別參與核苷酸取道(channeling)及活性位點處之結合。在此等基本模體中，在MERS-CoV與其他CoV之間無顯而易見的顯著結構差異。在化合物 1A與索非布韋之間具有類似核糖修飾之情況下，索非布韋選擇性缺乏活性不太可能歸因於由nsp14攜帶之CoV核酸外切酶進行的切除(Ferron, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA115 (2) 162-171 (2018))。實際上，結果表明，由化合物 1A形成之三磷酸酯很可能靶向另一nsp12域，其抑制將解釋抗病毒效果及MERS-CoV微分靈敏度模式。

細胞、抗病毒劑及病毒BHK-21 (幼倉鼠腎)細胞、Huh-7 (人類肝癌)細胞、RD (人類橫紋肌肉瘤)細胞及季節性人類冠狀病毒(HCoV-229E及HCoV-OC43)係獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection), Manassas, VA。MERS-CoV (EMC)、SARS-CoV-1 (Urbani)及SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020)係由疾病控制與預防中心(The Centers for Disease Control and Prevention), Atlanta, GA供應。HAE細胞製劑(EpiAirway ^TMAIR-100或AIR-112)係購自MatTek Corporation, Ashland, MA。化合物 1A及N4-羥基胞苷分別由Topharman Shanghai Co., Ltd., Shanghai, China及Oxeltis, Montpellier, France為Atea Pharmaceuticals製備。氯奎及羥氯奎係購自Mason-Chem, Palo Alto, CA，且索非布韋係購自Pharma Sys, Inc., Cary, NC。

抗病毒分析 BHK-21 細胞：將測試化合物以100 mM溶解於DMSO中且接著在具有厄爾氏鹽之最低必需培養基(MEM-E)中稀釋至100、20、4及0.8 µM之最終濃度(各有兩個24孔複製盤)，該培養基含有1 mM丙酮酸鈉及25 µg/mL康黴素，補充有10% FBS (生長培養基)。在BHK-21細胞於96孔盤中生長至匯合度之後，生長培養基用新鮮的維持培養基(用1%不活化FBS替代10% FBS的生長培養基)替換，該維持培養基含有連續稀釋之測試化合物及HCoV-229E，感染倍率(MOI)為0.01。在連續稀釋化合物存在下之未感染細胞用於評定化合物之細胞毒性。在37℃於潮濕5% CO ₂氛圍中培育3天之後，藉由MTT方法測定細胞活力(Pauwels, R等人 J. Virol. Methods20(4):309-321 (1988))。藉由回歸分析計算防止50%病毒誘導之細胞病變效應(CPE)所需的測試化合物之有效濃度(EC ₅₀)及在不存在病毒下引起50%細胞死亡所需的測試化合物之有效濃度(CC ₅₀)。

Huh-7 及 RD 細胞：使用中性紅分析評估測試化合物針對人類冠狀病毒α (229E)、β (OC43)、MERS (EMC)及SARS (Urbani)之抗病毒活性，以測定病毒誘導及化合物誘導之CPE的抑制，及使用病毒產量減少(VYR)分析作為病毒誘導之CPE之抑制的第二、獨立測定進行評估。

中性紅分析：將測試化合物以10 mg/mL之濃度溶解於DMSO中且在測試培養基(補充有5% FBS及50 µg/mL建它黴素之最低必需培養基)中使用八個半對數稀釋液進行連續稀釋，以使得最高測試濃度為50 µg/mL。將各稀釋液添加至具有80%-100%匯合之Huh-7或RD細胞(僅OC43)之96孔盤的5個孔中。各稀釋之三個孔經病毒感染，且兩個孔保持未感染作為毒性對照。六個未處理孔經感染作為病毒對照，且六個未處理孔保持未感染以用作病毒對照。病毒經稀釋以分別針對229E、OC43、MERS及SARS達成0.003、0.002、0.001及0.03 CCID ₅₀/細胞之MOI。在37±2℃下在含有5% CO ₂之潮濕氛圍中培育培養盤。

在感染後第5天(229E及OC43)或第7天(MERS及SARS)，當未處理之病毒對照孔達到最大CPE時，培養盤用中性紅染料染色大致2小時(±15分鐘)。移除上清液染料，用PBS沖洗孔，且將併入之染料在50:50 Sorensen檸檬酸鹽緩衝液/乙醇中萃取＞30分鐘，且在540 nm下在分光光度計上讀取光密度。將光密度轉化為對照百分比，且計算預防50%病毒誘導之CPE所需的測試化合物之濃度(EC ₅₀)及在不存在病毒下引起50%細胞死亡所需的測試化合物之濃度(CC ₅₀)。

病毒產量減少分析：將Vero 76細胞接種於96孔盤中且生長隔夜(37℃)至匯合。在感染後第3天收集來自各化合物濃度之上清液流體之樣品(3個孔合併)，且使用標準終點稀釋CCID ₅₀分析測試病毒效價，且使用Reed-Muench方程式(1948)計算效價(Reed, LJ及Muench, H. Am. J. Hygiene27:493-497 (1948))，且藉由回歸分析測定使病毒產量減少90%所需的化合物之濃度(EC ₉₀)。

HAE 細胞製劑使用訂購的人類呼吸道上皮(HAE)細胞評估測試化合物針對SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020)之抗病毒活性。

細胞培養：HAE細胞在6 mm網目圓盤上生長且用帶有12孔或24孔半透膜之套組培養達到細胞數。在運輸期間，將組織穩定在一片瓊脂糖上，在接收後移除該瓊脂糖。估計一個半透膜由大致1.2×10 ⁶個細胞組成。細胞半透膜之套組(EpiAirway ^TMAIR-100或AIR-112)源自單一供體#9831，一名23歲、不吸菸的高加索男性。細胞形成極化單層，其頂側暴露於空氣且產生黏蛋白層。細胞達到後，根據製造商說明書將細胞半透膜立即轉移至6孔盤之個別孔，且將1 mL MatTek專用培養基(AIR-100-MM)添加至底外側，而頂側暴露於潮濕5% CO ₂環境。在實驗開始之前，在37℃在含有5% CO ₂之潮濕氛圍中培養細胞一天。在24 h平衡時段之後，藉由用400 µL預溫熱30 mM HEPES緩衝鹽水溶液洗滌3次而移除自細胞頂側分泌之黏蛋白層。在洗滌步驟之後補充培養基。

病毒：在感染之前將病毒稀釋於AIR-100-MM培養基中，以在添加至培養物時產生每個細胞大約0.0015 CCID ₅₀之MOI。

實驗設計：將各化合物處理(120 μL)及病毒(120 μL)應用於頂側，且將化合物處理(1 mL)應用於底側。作為病毒對照，一些細胞僅用細胞培養基處理。在2 h感染培育之後，移除頂部培養基，且用新鮮化合物或培養基(1 mL)替換基本培養基。將細胞維持在空氣-液體界面處。在第5天，藉由視覺檢查來估計未感染、經化合物處理之半透膜中的細胞毒性(CC ₅₀值)，且自全部半透膜移除基本培養基且丟棄。藉由添加400 µL在37℃預溫熱之培養基來收集釋放至HAE細胞之頂室中的病毒。將內容物培育30 min，充分混合，收集，充分渦旋且塗鋪於Vero 76細胞上以進行VYR滴定。獨立孔用於病毒對照且重複孔用於未處理之細胞對照。如上文所描述測定來自各經處理之培養物的病毒效價。

實例 5 ： SARS CoV1 nsp14 之 N7-Mt 酶 活性經 AT9010 及 2'-Me-GTP 抑制之量測為了測定解釋MERS-CoV與其他CoV之間的化合物 1A活性之30倍差異的機制作用，檢查額外抑制性目標。

首先，檢查代謝物AT-9010及2'-C-甲基-GTP對於nsp14之N7-Mt酶抑制活性。

AT-9010

2'-C- 甲基 -GTP

Nsp14可藉由轉移由[ ³H] S-腺苷-ʟ-甲硫胺酸(SAM)提供之[ ³H]CH ₃部分而將GpppA或GpppAC ₄甲基化。所得放射標記之m7GpppA或m7 GpppAC ₄產物可使用DEAE過濾結合分析，隨後液體閃爍計數來定量。在0.7 μM GpppA或GpppAC ₄合成RNA及純化的SARS-nsp14 (50 nM)存在下，在反應混合物[40 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM DTT、1 mM MgCl ₂、2 μM SAM及0.33 μM ³H-SAM (Perkin Elmer)]中進行抑制劑特異性分析。在添加RNA受質及SAM之前，首先將酶與增加濃度(0-200 µm)之AT9010或2'-C-甲基-GTP混合，且接著在30℃培育。DMSO之最終濃度為5%，且在5% DMSO存在下進行對照反應。在30 min之後，藉由其於冰冷的100 μM S-腺苷-ʟ-升半胱胺酸(SAH)中之10倍稀釋液，終止反應混合物。使用Filtermat收集設備(Packard Instruments)，將樣品轉移至二乙胺基乙基纖維素過濾器(DEAE) (Perkin Elmer)。在對DEAE過濾器進行乾燥之前，藉由用0.01 M甲酸銨(pH 8.0)、H ₂O，接著純乙醇洗滌若干次，自過濾器移除未併入之 ³H SAM。在使用Wallac 1450 MicroBetaTriLux液體閃爍計數器以每分鐘計數(cpm)定量移轉至RNA受質上之 ³H甲基化之前，將過濾器與BetaplateScint (Wallac)閃爍流體一起培育。使用RNA受質GpppA之情況下，AT9010及2'-C-Me-GTP對於SARS-CoV-1 nsp14 (50 nM)之N7-MT酶活性之IC ₅₀顯示於圖2A中，其顯示在AT9010或2'-C-Me-GTP之情況下，對於SARS-CoV1 nsp14 N-7鳥嘌呤MT酶無抑制。使用RNA受質GpppAC ₄之情況下，AT9010及2'-Me-GTP對於SARS nsp14 (50 nM)之N7-MT酶活性之IC ₅₀顯示於圖2B中，其顯示在AT9010或2'-C-Me-GTP之情況下，對於SARS-CoV1 nsp14 N-7鳥嘌呤MT酶無抑制。

基於此實驗，化合物1A之抗病毒效果不大可能係經由nsp14活性之抑制而介導。

實例 6 ： 5' 三磷酸酯 核苷酸、二核苷酸及合成寡核苷酸

5'- 三磷酸酯核苷及二核苷AT-9010、5'-三磷酸酯2'-氟-2'-C-甲基尿苷及瑞德西韋5'-三磷酸酯來自NuBlocks LLC, Oceanside, CA, USA。

其他NTP係購自GE Healthcare。對應於SARS-CoV基因體(具有或不具有poly(A) ₁₅尾)之3'端之Poly(N) ₂₇及寡核苷酸受質係購自Biomers (HPLC級)。

在ABI 394合成器(Applied Biosystems)上，自孔徑為1000 Å，經由丁二醯基連接子衍生之具有5'-O-二甲氧基三苯甲基-2'-O-乙醯基-[尿苷或N2-異丙基苯氧基乙醯基鳥苷] (Link Technologies)之長鏈烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)固體載體，化學合成5'-三磷酸酯(TP)二核苷酸pppUpU、pppUpG、pppGpU及pppApU。使用5'-O-DMTr-2'-O-特戊醯氧甲基-3'-O-(氰基乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷酸酯)-[尿苷或N2-異丙基苯氧基乙醯基鳥苷或N6-苯氧基乙醯基腺苷] (Chemgenes)，以1 µmol規模將二核苷酸組裝於Twist寡核苷酸合成管柱(Glen Research)中。在組裝之後，CPG珠粒在氬氣流下乾燥。用塑料注射器，將1 M亞磷酸二苯酯(0.4 mL)於無水吡啶(1.6 mL)中之溶液(2 mL)人工地穿過Twist管柱，且在40℃靜置30 min。接著，CPG用乙腈洗滌，且將碳酸氫三乙銨(TEAB，pH 7.5)之0.1 M溶液施加於管柱，且使其在40℃反應45 min。在若干次洗滌之後，在氬氣下添加在N,O-雙三甲基矽基乙醯胺(0.4 mL)、乙腈(0.8 mL)、三氯溴甲烷(0.8 mL)及三乙胺(0.1 mL)中含有咪唑(150 mg)之氧化溶液，且使其在40℃反應2 h。在洗滌及乾燥載體之後，將在無水DMF (0.5 mL)中含有焦磷酸雙(三正丁銨)(88 mg，0.15 mmol)之溶液施加於管柱，且使其在40℃反應18 h。移除溶液，且載體用無水乙腈洗滌。藉由將氬氣吹送通過1 min來乾燥CPG珠粒。使用1,8-二氮雜二環-[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU) (0.3 mL)於無水乙腈(1.7 mL)中之1 M溶液對5'-TP二核苷酸進行去保護3 min且自固體載體釋放，接著將CPG珠粒轉移至玻璃瓶中，且在40℃施加30%氨水溶液(2 mL) 3 h。將氨溶液收集於100 mL圓底燒瓶中，且蒸發及在最大30℃浴之情況下與水一起減壓共蒸發。將殘餘物溶解於水(1.8 mL，分成四部分用於燒瓶沖洗：0.6 mL、0.4 mL、0.4 mL、0.4 mL)中，轉移至2 mL Eppendorf小瓶且接著自水中凍乾。

5'-TP二核苷酸藉由半製備型IEX-HPLC，用配備有HPG-3200 BX泵、DAD 3000偵測器、WPS-3000TBRS自動取樣器、級份收集器F之UHPLC Thermoscientific Ultimate 3000系統，使用DNAPac PA200管柱(22 × 250 mm)來純化。用緩衝液A：5% CH ₃CN/25 mM Tris-HCl pH 8，及緩衝液B：5% CH ₃CN + 400 mM LiClO ₄/25 mM Tris-HCl pH 8，以9 mL.min ^-1流速進行溶離。在25℃，使用0%-15%線性梯度之緩衝液B/緩衝液A純化粗二核苷酸25 min。將純級分合併於100 mL圓底燒瓶中且用在最大30℃之浴進行減壓蒸發。使用C18筒柱Sep-Pak® Classic對殘餘物進行去鹽。將殘餘物溶解於1.2 mL水(分3份0.4 mL用於燒瓶沖洗)中，轉移至2 mL Eppendorf小瓶中且自水中凍乾。

用MALDI-TOF質譜，使用配備有337 nm氮雷射(Shimadzu Biotech, UK)之Axima Assurance光譜儀，使用呈飽和溶液之2,4,6-三羥基苯乙酮/檸檬酸銨於乙腈/水(1:1，v/v)中之10:1 (m/m)混合物作為基質，來表徵純5'-TP二核苷酸。以1:1 (v/v)比率將分析樣品與基質混合，在100孔不鏽鋼盤上結晶且分析。

在UV-1600 PC光譜儀(VWR)上，藉由量測在260 nm下之吸光度對5'-TP二核苷酸進行UV定量。

合成寡核苷酸對於引子依賴性併入分析而言，引子模板對以1:1.5於110 mM KCl中之莫耳比在70℃退火10 min，接著歷經數小時緩慢冷卻至室溫。由Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)合成髮夾RNA。

實例 7 ： SARS-CoV 蛋白之表現及純化SARS-CoV輔因子蛋白質nsp7(TEV)6His、6His(TEV)nsp8及nsp7L8(TEV)6His係在pQE30載體中之T5-啟動子控制下，於攜帶有pRARE2LacI (Novagen)質體之大腸桿菌( Escherichia coli； E. coli) NEB Express C2523細胞(New England Biolabs)中表現。蛋白質在安比西林(Ampicillin) (100 µg/mL)及氯黴素(17 µg/mL)存在下在17℃表現隔夜，隨後用100 µM IPTG在OD600 = 0.5-0.6時誘導。藉由在裂解緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 8、300 mM NaCl、10 mM咪唑，補充有20 mM MgSO ₄、0.25 mg/mL溶菌酶、10 μg/mL DNA酶及1 mM PMSF)中進行音波處理來溶解細胞，且經由用TALON® Superflow™基於鈷之IMAC樹脂(Cytiva)之親和層析來純化蛋白質。在溶離之前，用補充有500 mM NaCl之緩衝液進行洗滌步驟。在補充有200 mM咪唑之緩衝液中溶離蛋白質。經由在不含咪唑且補充有1 mM DTT之透析緩衝液中用TEV蛋白酶(1:10 w/w比率之TEV:蛋白質)裂解隔夜來移除親和標籤。

經裂解之蛋白質經由第二鈷管柱再純化以移除組胺酸標記之TEV蛋白酶，且用尺寸排阻層析法(Cytiva Superdex S200)在具有25 mM HEPES pH 8、150 mM NaCl、5 mM MgCl ₂及5 mM TCEP之最終緩衝液中進一步純化。在安比西林(100 µM/mL)及氯黴素(17 µg/mL)存在下，在大腸桿菌菌株BL21/pG-Tf2 (Takara 9124)中自pJ404載體表現SARS-CoV nsp12-8His。在OD ₆₀₀=0.5-0.6時，用250 µM IPTG及5 ng/ml四環素誘導表現，以誘導伴隨蛋白(groES-groEL-tig)，且使其在23℃在220 rpm下保持隔夜。在80℃傳代之後，將細胞再懸浮且在攪拌下在4℃於緩衝液中溶解45-60 min，該緩衝液含有50 mM Tris pH 8、300 mM NaCl、5 mM MgSO ₄、10%甘油、1%CHAPS，補充有5 mM 2-巰基乙醇、0.5 mg/mL溶菌酶、10 μg/mL DNA酶及1 mM PMSF以及0.2 mM苯甲脒。

經由逐漸添加NaCl至1 M之最終濃度進行用於核酸沈澱之第二溶解步驟。此步驟在攪拌下在4℃進行45-60 min。在30000 x g離心30 min之後，稀釋上清液以將NaCl濃度降低至300 mM之最終濃度。使蛋白質與基於鈷之IMAC樹脂TALON® Superflow™ (Cytiva)在4℃結合1小時。在補充有200 mM咪唑之相同緩衝液中溶離之前，樹脂用NaCl濃度(300 mM、1 M、300 mM)不同之洗滌緩衝劑(50 mM Tris pH 8，10%甘油)洗滌3次。經由尺寸排阻層析法(Cytiva Superdex S200)，在具有25 mM HEPES pH 8、150 mM NaCl、5 mM MgCl ₂、10%甘油及5 mM TCEP之最終緩衝液中進一步純化蛋白質。

將nsp12、7、8及7L8之濃縮等分試樣快速冷凍在液氮中且儲存在-80℃。SARS-CoV輔因子蛋白質nsp10在pASK載體中之Tet-啟動子之控制下在攜帶有pRare2LacI (Novagen)質體之大腸桿菌NEB Express C2523細胞(New England Biolabs)中表現。在康黴素(50 µM/mL)及氯黴素(17 µg/mL)存在下在17℃表現蛋白質隔夜，隨後在OD ₆₀₀= 0.6-0.7時用200 µg/L四環素誘導。在平緩搖動下，將細胞在溶解緩衝液(50 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl、10 mM咪唑、5 mM MgSO ₄、1 mM β-巰基乙醇，補充有0.25 mg/mL溶菌酶、10 μg/mL DNA酶、0.1%曲拉通(triton)及1 mM PMSF)中在4℃培育30 min，接著藉由音波處理溶解。蛋白質經由利用HisPur鈷樹脂(Thermo Scientific)之親和層析純化，且在補充有100 mM咪唑之緩衝液中溶離。經由尺寸排阻層析法(GE Superdex S200)，在具有50 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl、5 mM MgCl ₂及1 mM β-巰基乙醇之最終緩衝液中進一步純化蛋白質。在安比西林(100 µM/mL)及氯黴素(17 µg/mL)存在下，在攜帶有pRare2之大腸桿菌菌株NEB Express C2566細胞(New England Biolabs)中自pDEST14載體表現SARS-CoV nsp14。在OD ₆₀₀= 0.8時用2 µM IPTG誘導蛋白質表現，且使其在搖動下在17℃保持隔夜。

在緩衝液中藉由音波處理溶解細胞，該緩衝液含有50 mM HEPES pH 7.5、500 mM NaCl、20 mM咪唑，補充有0.25 mg/mL溶菌酶、10 μg/mL DNA酶及1 mM PMSF。經由利用HisPur鈷樹脂(Thermo Scientific)之親和層析純化蛋白質。在用增加濃度之鹽(1 M NaCl)洗滌之後，在補充有250 mM咪唑之緩衝液中溶離nsp14。藉由尺寸排阻層析法(GE Superdex S200)，在具有10 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl之最終緩衝液中進一步純化蛋白質。SARS-CoV-2蛋白係購自Biortus (en.wuxibiortus.com)或使用實例23中描述之方案經純化以用於冷凍EM。在密碼子最佳化(General Biosystems)之情況下，合成全長SARS-CoV-2 nsp12 (殘基1-932)之基因，且選殖至pFastBac1桿狀病毒表現載體中。將額外肽(HHHHHHHHWSHPQFEKENLYFQG) (SEQ ID NO: 1)添加至nsp12之N端。

在27℃感染後48 h收集表現目標蛋白之草地黏蟲( Spodoptera frugiperda) (Sf21)細胞，且以4,500 rpm離心10 min。將離心塊(Pellet)再懸浮於溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、500 mM NaCl、5%甘油、2mM MgCl ₂、cOmplete蛋白酶抑制劑錠劑)中，且在4℃用高壓均質器均質化。在4℃，以18,000 rpm離心細胞溶解物60 min。融合蛋白首先藉由Strep-Tactin (Strep-Tactin®XT)親和層析純化，且藉由在溶離後在4℃培育TEV蛋白酶隔夜而移除標籤。在緩衝液更換為緩衝液A (50 mM Tris-HCl、pH8.0、150 mM NaCl、5%甘油、2 mM MgCl ₂)之後，將蛋白質再負載至肝素HP管柱上。收集流過物且負載至在10 mM Tris-HCl、pH 8.0、500 mM NaCl、2 mM MgCl ₂中平衡之HiLoad 16/600 Superdex 200 pg管柱(GE healthcare)上。將純化的nsp12濃縮至6.86 mg/ml且儲存在-80℃。將具有C端Avi-6His標籤(GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH) (SEQ ID NO: 2)之SARS-CoV-2 nsp7 (殘基1-83)之基因選殖至經修飾之pET-32a載體中。使含有質體之BL21 (大腸桿菌，T7 Express)在37℃生長至0.6之OD ₆₀₀，且在添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至0.5 mM之最終濃度後16 h，在15℃表現蛋白質。收集細胞，接著再懸浮於緩衝液B (50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、500 mM NaCl、5%甘油、10 mM咪唑)中。在4℃，藉由高壓均質器破壞細胞。藉由在4℃以18,000 rpm離心60 min移除不溶材料。藉由Ni-NTA (Novagen, USA)親和層析，隨後Superdex HiLoad 16/600 Superdex 75 pg管柱(GE Healthcare, USA)在緩衝液C (10mM Tris-HCl (pH 8.0)、150 mM NaCl)中純化融合蛋白。將純化的nsp7濃縮至7.27 mg/ml且儲存在-80℃。

將SARS-CoV-2 nsp8 (殘基1-198)之基因選殖至含有N端His6-旗標-標籤與TEV裂解位點(HHHHHHDYK DDDDKENLYFQG) (SEQ ID NO: 3)之經修飾之pET-28a載體中以用於在大腸桿菌中表現。以與針對nsp7相同之方式，表現Nsp8。收集細胞，接著再懸浮於緩衝液D (50 mM Tris-HCl，pH 8.0，500 mM NaCl，5%甘油)中。在4℃，使用高壓均質器溶解細胞。藉由在4℃以18,000 rpm離心60 min，使細胞溶解物澄清。將上清液施加至Talon親和層析管柱上，且藉由使用TEV蛋白酶進行管柱上裂解隔夜來移除標籤。將混合物緩衝液交換至緩衝液D，且再次再負載至His FF管柱上以移除His標籤及TEV蛋白酶。藉由在緩衝液E (20 mM Tris-HCl pH 8.0、200 mM NaCl、5%甘油)中流經HiLoad 16/600 Superdex 75 pg (GE Healthcare, USA)進一步純化目標蛋白。將靠近最大峰高度之級分合併且藉由Mono Q 10/100 GL管柱(GE Healthcare, USA)進一步純化。緩衝液更換為緩衝液E。純化的nsp8緩衝液交換至緩衝液E，接著濃縮至11.63 mg/ml且儲存在-80℃。

實例 8 ： NiRAN 轉移抑制在此實驗中，在NiRAN競爭分析中測試鳥苷類似物抑制劑之影響，以量測對於在增加濃度之AT9010或2'-C-Me-GTP (在1.2-1280 µM範圍內) (其與天然NTP競爭標記)存在下，藉由具有[α ³²P] GTP或UTP之nsp12-NiRAN標記nsp8之影響。在含有以下之10 µl總體積中進行轉移分析：50 mM Tris pH 8.5、6 mM MnCl ₂、5 mM DTT、至多2.5 µM nsp8及nsp12-NiRan，以及5 µM [α ³²P] UTP (Perkin Elmer，3000 Ci/mmol)或5 µM [α ³²P] GTP (Perkin Elmer，3000 Ci/mmol)及增加濃度之AT9010或2'-C-Me-GTP (在1.2-1280 µM範圍內)。12.5%甘油(v/v)、25 mM NaCl、5 mM HEPES pH 7.5及0.5 mM DTT係自蛋白質儲存緩衝液攜帶。在30℃培育樣品30 min。藉由添加5 µl凝膠負載緩衝液(62.5 mM Tris pH 6.8，100 mM二硫蘇糖醇(DTT)、2.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)、10%甘油、0.005%溴酚藍)終止反應，且藉由在95℃加熱5 min來使蛋白質變性。運行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，用考馬斯(Coomassie) G-250染色，且去染色隔夜。在乾燥之後，將磷光成像儀屏幕暴露於凝膠持續5 h，在可變模式掃描儀上掃描，之後用ImageQuant TL軟體(GE healthcare)分析條帶強度。

使用5 µM UTP加增加濃度之AT9010之分析之影像結果顯示於圖3A中。使用5 µM GTP加增加濃度之AT9010之分析之影像結果顯示於圖3B中。使用5 µM GTP及5 µM UTP加增加濃度之2'-C-Me-GTP之分析之影像結果顯示於圖3C中,及與降低之暴露一起之結果顯示於圖3D中。在此實驗中，將影像強度轉化為百分比以量測抑制水準。在抑制劑濃度為0下，強度為100%。剩餘條帶之相對強度係在抑制劑之各濃度含量下測定，其中結果顯示於表6中。表 6

抑制百分比
抑制劑濃度( μM)	AT9010	2'CH3	抑制劑天然 NTP
GTP	UTP	GTP	UTP
0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
1.3	32.5	44.8	1.4	17.9
5.3	64.2	75.8	22.2	49.2	與天然 NTP 約 1 :1 比率
21.1	86.6	94.4	50.8	73.5
84.2	92.6	98.6	80.2	92.3
336.8	96.3	99.6	91.4	98.4
1347.4	97.8	99.8	100.0	99.9

在約等莫耳比例之天然NTP及AT9010下，當分別與GTP及UTP競爭時，活性降低64%及75%。接著，此等結果以圖形方式顯示於圖3E中，其中生成S形曲線且測定各抑制劑及天然核苷酸之IC ₅₀。此對應於~1.7 AT9010:GTP及~3.2 AT9010:UTP之倍數偏好。此係藉由除以5 µM之NTP濃度/IC ₅₀測定。

實例 9 ： nsp8 之標記要求存在 MnCl ₂ 使用變化濃度(對於個別離子，0-10 mM；對於兩種離子一起，1.25-5 mM )之MnCl ₂、MgCl ₂或兩種離子一起，來評定藉由nsp12之NiRAN域用α ³²P-UTP對nsp8進行之標記。在具有或不具有poly(A) ₂₇RNA之情況下，在緩衝液中，在37℃進行標準核苷酸轉移反應在2-60 min範圍內之反應時間，該緩衝液含有20 mM HEPES pH 7.5、1 mM DTT、(0-10 mM MnCl ₂、MgCl ₂或1.25-5 mM MnCl ₂/MgCl ₂)、1-5 µCi α ³²P-NTP及30 mM NaCl，其中最終蛋白質濃度為1 µM nsp12:8或nsp12:7L8:8 RTC及/或3 µM輔因子。對於僅標記之分析，樣品在2X濃度之SDS負載染料中停止且在95℃加熱5 min，以確保僅共價結合的NMP仍與蛋白質結合。用15% SDS PAGE凝膠分析蛋白質，其用InstantBlue進行總蛋白染色且暴露2小時至隔夜以顯示放射性標記的蛋白質。圖4A顯示在不存在RNA下用nsp12及nsp8進行之反應之結果。圖4B顯示在poly(A) ₂₇RNA存在下用nsp12:7L8:8 RTC進行之反應之結果。圖4C顯示在poly(A) ₂₇RNA存在下用nsp12:7L8:8 RTC進行之反應，但用經暴露隔夜以顯示poly(U)產物之14%丙烯醯胺尿素-PAGE凝膠分析的結果。重要的是，發現poly(U)產物之標記及合成僅在MnCl ₂存在下出現。

實例 10 ： SARS-CoV Nsp12 NiRAN 域介導 NMP 轉移至病毒輔因子 nsp8 。為了闡明SARS-CoV nsp12核苷酸基轉移酶活性背後之特性，將不同組合之SARS-CoV酶nsp12、nsp7及nsp8 (構成RNA合成所需之最小RTC (Subissi))在37℃在緩衝液中培育在2-60分鐘範圍內之反應時間，該緩衝液由20 mM HEPES pH 7.5、1 mM DTT、0.5-2 mM MnCl ₂、30 mM NaCl與1-5 µCi α ³²P-UTP構成，其中最終蛋白質濃度為1 µM nsp12及/或3 µM輔因子。對於僅標記之分析，樣品在2X濃度之SDS負載染料中停止且在95℃加熱5分鐘，以確保僅共價結合的NMP仍與蛋白質結合。

在培育之後，用15% SDS PAGE電泳凝膠分析蛋白質，其用Instant Blue染料進行總蛋白染色且暴露2小時至隔夜，以顯示放射標記的蛋白質。如圖4A至圖4C及圖5A中所示，視nsp12及MnCl ₂而定，UMP在反應中有效且尤其轉移至nsp8及少量雜質蛋白質(*)。此外，nsp7及8之連接型式(nsp7L8)不能藉由NiRAN進行標記，指示可能需要nsp8之真實N端。與相關馬動脈炎病毒相比，在nsp12之情況下不形成共價中間物。

如圖5A至圖5C中所示，各種NiRAN突變體(包括k73A)消除nsp8之標記，從而確認核苷酸轉移活性係由NiRAN域提供而非nsp8自身所提供。如圖5D中所示，對於SAR-CoV-2 RTC，觀測到nsp8標記之相同特異性。

接下來，如上文所描述在相同條件下，但與四種不同放射標記之NTP一起培育nsp12:nsp8之複合物。如圖5E中所示，與不同核苷酸一起培育顯示，UTP為較佳的受質，即使結構可撓性允許以較低程度結合及轉移GTP、CTP及ATP。

為了測定標記位點，在高或低pH下評定UMP-nsp8鍵之穩定性。Nsp8首先在僅含有nsp12蛋白之反應中，或在存在或不存在poly(A) ₂₇寡核糖核苷酸下用由nsp12:nsp7L8:nsp8構成之完全複製/轉錄複合物經標記。在70℃熱滅活反應物10分鐘，接著與0.1M HCl或0.1M NaOH一起在30℃培育1小時。在培育之後，pH用等濃度之酸或鹼中和，且如上文所描述藉由SDS PAGE分析樣品。如圖5F之左圖中所示，UMP-nsp8在0.1M HCL中為穩定的，但在鹼金屬中不穩定，指示大部分UMP與絲胺酸或蘇胺酸殘基之羥基結合。有趣的是，當在poly(A) ₂₇寡核糖核苷酸及nsp7 (亦即，nsp12-nsp7-(nsp8) ₂RTC)存在下進行nsp8標記反應時，UMP-nsp8鍵在高及低pH下均穩定，指示與酪胺酸羥基形成磷酸二酯鍵(圖5F，右圖)。在CoV nsp8中僅兩個絲胺酸(S11及S85)及一個酪胺酸(Y71)為高度保守的(Subissi)。此外，nsp12:nsp8複合物以化學方式(HCl或NaOH)或以酶方式用鹼性磷酸酶(AP)、CapClip酶、核酸酶P1或蛋白酶K (PK)在37℃處理2小時，以規測鍵類型及穩定性，隨後如上文所描述在相同條件下培育(圖5G)。如圖5C中所示，對於丙胺酸之單一及雙重突變體降低但並未完全消除標記，但對於Ser11A，注意到標記效率顯著增加，表明此殘基參與標記位點之選擇性。

在此等兩個實驗之間，因此似乎nsp8之若干殘基能夠藉由NiRAN標記，且此取決於由存在或不存在RNA所決定之RTC的構形。此與最新冷凍EM結構一致，其顯示nsp8形成「分子滑動極」，使自聚合酶活性位點離開之RNA穩定(Hillen, Cramer 2020)。在不存在RNA下，nsp8之此等可撓性N端延伸將可能呈替代構形，從而改變核苷酸化位點之向性且潛在地充當調節NiRAN活性之機制。

實例 11 ： 引子非依賴性 RNA 聚合分析為了執行引子非依賴性RNA聚合分析，藉由首先在室溫培育在等莫耳濃度(100 µM)之nsp7及8 30 min形成活性nsp12:7:8複合物(RTC)。添加Nsp12、額外nsp8及蛋白質凝膠過濾緩衝液，形成由呈1:3:6比率之nsp12:7:8與10 µM nsp12組成之最終複合物。進一步在室溫培育複合物10 min，且在1 µM nsp12之最終濃度下使用。在與核苷酸基轉移酶反應所使用之相同條件，但補充有100-200 µM冷NTP及0.7 µM最終濃度之RNA下進行引子非依賴性分析。在指示時間點，在2X濃度之SDS負載緩衝液中終止反應以進行蛋白質分析，或在2X-4X體積之FBD終止溶液(甲醯胺，10 mM EDTA)中終止反應以用14%丙烯醯胺、7M尿素定序凝膠進行分析。對於蛋白酶K消化，首先藉由在70℃熱滅活10 min來終止反應。在37℃在含有20 mM HEPES pH 7.5及X% SDS之緩衝液中進行消化2小時。按照製造商說明書進行核酸酶P1 (NEB)。藉由添加200 μM [α- ³²P] UTP (0.5 μCi/μL)起始重新分析，該分析使用0.35 µM poly(A) ₂₇RNA作為模板。

對於添加實驗之次序，在37℃在反應緩衝液中將蛋白質與UTP或RNA預培育30 min。在培育之後，添加逆轉試劑以起始反應。在恆定濃度之200 µM冷NTP及變化濃度抑制劑下，測試AT-9010及SOF抑制。將抑制劑NTP及RNA一起在分析緩衝液中培育，經由添加蛋白質複合物起始反應。對於用西方墨點法之與nsp8共價結合之分析，在上文描述之緩衝液中進行聚合酶分析。在添加2 µM poly(A) ₂₇、ST20poly(A) ₁₅或ST20 RNA之前，將Nsp12:7:8複合物與200 µM UTP一起在37℃預培育30 min。緊接地在RNA添加(時間0)之後或在37℃在2X SDS負載緩衝液中培育60 min之後，終止反應。在15% SDS-PAGE凝膠上分離樣品，將其轉移至硝化纖維膜且在含有5%脫脂乳粉之TBS-Tween (0.1%)中阻斷隔夜。Nsp8用來自GeneTex之小鼠單株抗nsp8抗體(5A10) (GTX632696)及HRP結合的兔抗小鼠二級抗體(Agilent Dako)探測，在各抗體之間，於PBS.T中洗滌3次。用Immobilon Crescendo Western HRP受質(Millipore)顯示Nsp8。

實例 12 ： SARS-CoV nsp8-UMP 參與獨特的蛋白質引動的 RNA 合成步驟。使用能夠在不存在引子下自poly(A)模板合成poly(U)之純化的SARS-CoV RTC確立高通量螢光篩選分析(Eydoux)。如實例10中所描述進行RNA聚合分析。為了規測在此等分析中如何起始合成，且是否參與nsp8之UMP化，將各種組合之nsp12、nsp7及nsp8，以及共價連接型式之nsp7及8 (nsp7L8)，與UTP (補充有α- ³²P-UTP)及poly(A) ₂₇RNA一起在37℃培育1小時。用15% SDS PAGE凝膠分離樣品以移除未共價結合的核苷酸/RNA，且進行總蛋白染色(圖6A)及高解析度尿素-PAGE定序凝膠(圖6B)。RTC在MnCl ₂存在下有效合成經標記之RNA (圖4B至圖4C)，其中大部分產物長於預期poly(U) ₂₇大小(圖6B至圖6C)。poly(A) ₂₇模板之5'或3'端之修飾不影響合成，表明此等產物不為nsp8末端轉移酶活性(Tvarogova, 2019)或其他模板修飾(圖6D)之結果。實際上，一旦合成全長poly(U) ₂₇產物，則複合物能夠切換至新的poly(A) ₂₇受體模板且繼續合成，從而產生長度上對於輸入poly(A) ₂₇模板而言為多聚的產物。

類似的模板交換活動性先前已對於其他病毒RdRps進行描述(Woodman; Menendez-Arias)。儘管先前報導了nsp8之引子酶(Imbert, 2006)、poly(A)聚合酶(Tvarogova)及引子延伸(Te Velthuis)活性，但在此情形下未觀測到單獨nsp8或其與nsp7組合之活性(圖6A及圖6C)。重要的是，亦發現大量放射性標記之產物保留在孔中或沿凝膠往下遷移極其有限(圖6B，箭頭)。聚合酶複合物之蛋白酶K (PK)水解導致此等產物之消化且導致進一步釋放poly(U)合成的RNA，與nsp8引動的合成事件一致。在抗nsp8之情況下之西方墨點分析確認，較高產物(在SDS PAGE上＞40 kDa)與nsp8共價連接且不與另一蛋白質共價連接(圖6E，泳道1至2)。此外，在NiRAN K73A突變體之情況下未發現此等產物，顯示此反應為NiRAN依賴性的(圖6E，泳道11)。

有趣的是，分別經由添加ATP及GTP，亦可在poly(U)及poly(C)模板上起始聚合(圖6F至圖6G)。然而，與poly(U)合成相比，poly(A)及poly(G)產物不保留在孔中，且此外對蛋白酶K消化不敏感。因此，蛋白質引動的RNA合成為UTP特異性的，與藉由NiRAN域進行UMP-nsp8標記之偏好一致。因此，RTC複合物將UMP轉移至其可能結合之nsp8中之一者，其充當尿苷酸化引子以起始poly(U) _n合成。

實例 13 ： SARS-CoV 中共存的起始 RNA 合成之兩個非依賴性引子合成路徑對於小核糖核酸病毒科( Picornaviridaefamily)，VPg蛋白用於引動正及負股合成。此外，其與RNA之5'端共價連接取代RNA-帽，從而保護病毒RNA免於宿主細胞降解。相比之下，CoV基因體可能含有習知m7GpppA _2'OmRNA帽(Bouvet)。此差異表明，對於CoV而言，nsp8-UMP蛋白質引動的策略對自poly(A)尾模板化之負股合成具特異性。

應注意，完全消除用UMP進行nsp8標記之NiRAN突變體仍能夠合成poly(U) RNA，但值得注意的是高分子量產物之損失(圖7A)。為了解決此，設定添加次序實驗。在添加逆轉/互補試劑之前，首先將nsp12:7:8複合物(RTC)與UTP或poly(A) ₂₇RNA一起在37℃培育30分鐘。在培育之後，添加逆轉試劑以起始反應，且在0.5與60分鐘之間的指示時間點終止反應。此外，進行60分鐘之反應物用蛋白酶K (PK)或核酸酶P1 (P1)處理以分別進行蛋白質及RNA消化。根據製造商說明書進行核酸酶P1 (NEB)。

與UTP一起預培育，促進NiRAN介導之nsp8-UMP標記，排他性地產生與Nsp8共價結合之高分子量poly(U) _n產物(圖7B，箭頭，圖7C)。相比之下，RTC與poly(A) ₂₇一起預培育導致產生蛋白質結合的RNA (藉由PK消化釋放)及未與Nsp8結合之長鏈poly(U) _n產物(圖7B)。消除nsp8-UMP標記之NiRAN突變體亦消除較高分子量蛋白質引動的產物，但並不消除polyU產物之合成(圖7D至圖7G)。此指示兩個不同的引動機制共存：一個由Nsp8-UMP促進之NiRAN依賴性的(路徑1；圖7H，上圖)及另一個NiRAN非依賴性的(路徑2；圖7H，下圖)。

實例 14 ： SARS-CoV RTC 以 NiRAN 非依賴性方式合成 5'- 三磷酸酯二核苷酸引子應注意，對於NiRAN突變型RTC而言，經由NiRAN非依賴性路徑(路徑2)之聚合實際上增加，指示兩個起始機制同時出現且競爭(圖7D)。NiRAN突變型RTC亦產生較高量之含有UMP之小分子重量產物，表明其在第二引動路徑中起作用。基於此產物對於Calf鹼性磷酸酶及核酸酶P1之敏感性以及與化學合成之pppUpU共遷移，該產物係鑑別為pppUpU。添加游離pppUpU至RTC增加非結合poly(U) _nRNA產物之合成，且以濃度依賴性方式減少反應之滯後時間，從而顯示二核苷酸pppUpU之合成為路徑2之先決條件(圖8A至圖8B)。為了顯示此，評定在變化濃度之pppUpU (0-100 µM)存在下隨著時間推移(0-50 min)，藉由nsp12:7:8複合物自poly(A) ₂₇模板進行之poly(U) _nRNA的合成。

如所預期，nsp12之RdRp活性位點突變體(SDD → SAA)破壞poly(U)合成，且此外消除pppUpU之合成(圖7D)。此確認，係nsp12之RdRp域結合nsp7及8驅動產生此二核苷酸引子而非NiRAN。

實例 15 ： Nsp12 介導之 pppGpU 合成引導 (-) ssRNA 序列上之引子延伸的精確起始為了更佳地理解兩個路徑在負股合成期間如何調節，在具有或不具有poly(A) ₁₅尾之情況下，使用對應於基因體之3'端之最後20個核苷酸(ST20)之雜聚合RNA。在不存在poly(A)序列下，合成假性自引動的產物，且其可藉由阻斷模板之3'端而消除(圖9A)。引人注目地，觀測到在poly(A) ₁₅尾存在下，大多數合成係在RNA-poly(A)接合點附近而非自poly(A)序列之末端起始(圖9B-ve圖)。此指示poly(A)尾及3'基因體RNA序列元件導引RTC定位於基因體之真實3'端，亦即其與poly(A)尾之接合處，以用於起始合成。此外，複合物與UTP一起預培育促進經由蛋白質引動的路徑1全長模板(ST20 + poly(A) ₁₅)之低水準合成，其在蛋白酶K消化之後釋放(圖9A)。在抗nsp8之情況下之西方墨點分析確認，全長RNA產物與nsp8共價連接，且此視NiRAN域而定(圖6E，實心箭頭)。在NiRAN K37A突變體之情況下未發現此等蛋白質引動的ST20-Poly(A) ₁₅產物(圖6E，泳道12-13)。

為了判定精確序列起始位點，對反應物補充各種化學合成之pppNpN二核苷酸引子。添加與緊鄰poly(A)尾之最後兩個鹼基互補之序列pppGpU大大增加反應速率及產物形成水準(圖9B)。相比之下，pppUpU、pppUpG及pppApU二核苷酸對於反應具有極小效果。已得出以下結論：聚合酶複合物(RTC)較佳地在pppGpU二核苷酸情況下起始合成，自緊靠poly(A)尾之上游之基因體-poly(A)接合點之精確3'端模板化。假定此二核苷酸之合成為速率限制步驟，且可經由添加游離pppGpU而超越。

有趣的是，與pppUpU相比，不容易觀測到游離pppGpU，指示其仍結合於聚合酶活性位點中且在製造時快速延伸。相比之下，pppUpU似乎更有效地合成，然而其由聚合酶RTC釋放，指示其為起始(-) RNA合成次最佳的。圖7H再現在SARS-CoV基因體之3'端處平行操作之兩個路徑。總而言之，結果顯示，SARS-CoV RTC經由兩個不同路徑促進RNA合成起始：路徑1為經由暗示小核糖核酸病毒科之蛋白質引動，及路徑2係藉助於pppNpN引子之重新合成，pppGpU對於在基因體-poly(A)接合點處起始而言為較佳的。

實例 16 ： AT-9010 及 STP 終止 RNA 合成，但由 SARS-CoV nsp14 核酸外切酶切除鑒於UTP及GTP在(-) RNA引動事件中之特定作用，探究尿嘧啶-或鳥嘌呤-核苷/核苷酸是否可抑制引動活性。由於大部分NA一般藉由靶向用於併入病毒RNA中之病毒RdRp而發揮抗病毒效果(Pruijers及Denison)，備受關注的是確立此外NiRAN域是否將構成抗病毒目標。

為了量測引子依賴性聚合及切除分析，關於引子非依賴性聚合酶分析，使用0.5 µM之nsp12最終濃度形成nsp12:7:8複合物。核苷酸併入分析如Shannon等人2020中所描述。對於核苷酸切除而言，藉由在70℃加熱10 min終止聚合反應，在30℃再退火引子:模板＞30 min，且添加50 nM nsp14/nsp10 (1:5)以用於時程反應。等分試樣使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(20%丙烯醯胺，7M尿素)分析且使用Typhoon FluorImager觀測。

研究兩種之活性代謝物之抑制潛能：尿嘧啶類似物索非布韋(SOF)及其鳥苷等效物AT-511。SOF在臨床上批准用於治療C型肝炎病毒(HCV) (Dousson, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09797-8m)。然而，其已顯示針對SARS-CoV-2感染之功效有限(Good 2020b, Han 2021)。相比之下，最近顯示AT-527 (AT-511之半硫酸鹽)在多種細胞株中充當強效廣譜抗CoV抑制劑(Good 2020b)。其現處於用於治療HCV感染(Good 2020a)及COVID-19 (Good 2020b)之II期臨床試驗中。

SOF及AT-511為含有2'-氟-2'-C-甲基修飾之核糖之胺基磷酸酯前藥，其中僅核鹼基不同(圖10A)。在細胞中，此等前藥由細胞激酶代謝成活性5'-三磷酸酯形式(分別為AT-9010及STP)，其可能充當病毒RdRp併入病毒RNA中之受質，如對於HCV所顯示(綜述於Dousson中)。使用nsp12:7:8 RTC及雜聚合RNA引子/模板對，比較針對此等兩種NA之RdRp選擇性(Shannon)。AT-9010及STP分別作為GTP或UTP之替代物藉由RdRp併入RNA中，從而引起立即鏈終止(圖10B)。在GTP存在下，AT-9010為競爭性鳥苷受質，與GTP相差22倍(圖10C及圖10E以及表8)。相比之下，STP:UTP競爭實驗(20:1)顯示，STP在此比率下不為競爭性的(圖13D)。然而，發現在併入之後，兩種藥物均對SARS-CoV ExoN介導之切除敏感(圖10D至圖10E)，指示SARS-CoV RTC校正活性可能危及其功效。因此，AT-527之強效抗CoV活性似乎不大可能僅僅將由RdRp介導之AT-9010併入RNA中提供。

實例 17 ： RdRp 抑制： 引子延伸及鏈終止在聚合酶分析緩衝液(20 mM Tris，pH 8；10 mM KCl；1 mM DTT；2 mM MgCl ₂)中，用0.5 µM SARS-CoV-1 nsp12:7L8:8聚合酶複合物(1:3:3莫耳比)、0.2 µM引子(Cy-5-SP10)及0.2 µM模板(ST20-U) RNA、50 μM NTP或CTP/ATP/UTP (無GTP)，以及10、50或250 µM AT9010，進行聚合酶延伸分析。使用[γ-32 ^P] ATP及PNK，Cy-5-SP10在5'端處經放射性標記。接著，藉由在70℃加熱10 min將Cy-5-SP10退火為互補模板ST20-U，且接著冷卻至室溫(其中引子/模板之比率為1:1)。在ST20-U作為模板之情況下，引子延伸分析始終進行，且藉由添加50 μM NTP或CTP/ATP/UTP (無GTP)混合物起始反應。在30℃培育之後，藉由添加等體積之負載緩衝液(甲醯胺+ 10 mM EDTA)淬滅反應。在20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠中分析引子延伸分析之RNA聚合產物。使用光刺激培養盤及磷光成像儀觀測RNA產物。結果顯示於圖11A中，其顯示AT9010作為GTP類似物併入生長鏈中且AT9010併入導致鏈終止。

即使在GTP存在下，AT9010經併入，因此其可與GTP競爭。為了定量此等結果，量測相對強度且如圖11B中所示進行圖示，其顯示產物條帶之總和與所有條帶之總和之比較，以查看AT9010是否為聚合之競爭性(或異位NIRAN位點)抑制劑=隨著時間推移產物條帶之級分之總和。此顯示，AT9010對於引子延伸不存在抑制。量測AT9010產物條帶1 (AT9010-1)之分率與源自在位置14處之GTP併入之產物條帶(AT9010-2+U19+A2)之分率總和的比較，且顯示於表7中。表 7

	50 μM AT9010	250 μM AT9010
時間(min)	14G	17G+19+20	14G	17G+19+20
0.500	0.003	0.110	0.004	0.090
1.000	0 005	0.147	0 005	0.115
5.000	0 022	0.414	0017	0.319
10.000	0.029	0.587	0022	0.442

此允許計算AT9010 (僅對於50及250 µM AT9010，在250 µM下校正5，GTP始終為50 µM)向對於天然GTP之差異，其顯示於表8中。表 8

ATEA-GTP 之差異
時間(min)	50 μM	250 μM
0 5	37.4	22.8
1	31.8	21.8
5	18.5	19.1
10	20.1	20.1
平均值	270	21.0
標準差	7.9	1.5

結果顯示在50 µM下AT9010:GTP之倍數差異= 27.0 +/- 7.9，且在250 µM下AT9010:GTP之倍數差異= 21.0 +/- 1.5。

接下來，評定使用雜聚RNA引子:模板對，AT9010藉由純化的重組SARS-CoV及SARS-CoV-2 RTC進行之併入及(非)延伸。以1:1.5之莫耳比於110 mM KCl中，在70℃使對應於SARS-CoV基因體之3'端之引子模板(10:20)對退火10 min，接著歷經數小時緩慢冷卻至室溫。由Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)合成髮夾RNA。藉由首先將nsp7及8以等莫耳濃度(100 µM)在室溫一起培育30 min來形成活性RTC。添加Nsp12、額外nsp8及蛋白質凝膠過濾緩衝液，形成由呈1:3:6比率之nsp12:7:8與10 µM nsp12組成之最終複合物。複合物進一步在室溫培育10 min，接著與RNA一起在含有20 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、5 mM MgCl ₂之預混物中預培育。對於單核苷酸併入分析而言，在具有或不具有以下核苷酸(ATP)之情況下，用50 µM (最終濃度)之所有AT-9010或STP起始反應。最終反應濃度為0.5 µM nsp12，0.4 µM RNA。在指示時間點之後，用5X體積之FBD終止溶液(甲醯胺，10 mM EDTA)淬滅反應。如圖11C中所示，在不存在GTP下，即使在低濃度下，AT-9010快速併入病毒RNA中。如圖11D中所示，即使在500 µM之下一正確核苷酸(ATP)之濃度下，未觀測到延伸超過所併入之AT-9010，表明引入的NTP未對準係歸因於終止引子之2'-C-Me。如圖11E中所示，在等莫耳濃度之GTP存在下，AT-9010充當競爭性鳥苷受質，相較於其天然GTP對應體僅相差約5倍。此外，將AT-9010併入與結構上相關STP進行比較。如圖11F中所示，儘管當單獨存在時充當受質，但STP與UTP不具競爭性，即使在高5倍之濃度下。

對於AT-9010-GTP競爭實驗而言，蛋白質-RNA複合物如上文所描述進行預培育，且用所有四種NTP，或僅用CTP、UTP及ATP (50 µM各NTP) (補充有各種濃度之AT-9010 (10-250 µM))來起始。為了計算AT-9010與GTP之間的差異，將AT-9010產物條帶(自50或250 µM濃度)與在三個時間點之源自GTP併入之產物條帶之分率總和進行比較。校正差異以解釋AT-9010與GTP之間的濃度差異。對於類似物切除而言，如上文所描述在相同條件下對髮夾RNA進行聚合反應(經標記之RTC，2'及20')，接著藉由在70℃加熱10 min終止。將髮夾在30℃再退火＞30 min，添加50 nM nsp14/nsp10 (1:5)以用於時程反應(經標記之Exo，2'、10'及60')。等分試樣使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(20%丙烯醯胺，7M尿素)分析且使用Typhoon FluorImager觀測。

聚合酶在鏈終止NA之插入之後停頓可允許藉由校正3'-至-5'核酸外切酶nsp14/nsp10進行切除(Ferron等人, Structural and molecular basis of mismatch correction and ribavirin excision from coronavirus RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E162-E171 (2018))，然而潛在地抑制AT-9010功效。如圖11E及11G中所示，在併入RNA中後，AT-9010及STP均由SARS-CoV-2 ExoN切除。此外，相對於未經修飾之RNA 3'端，AT-9010及STP分別顯示對SARS-CoV-2 ExoN介導之切除具有~4.8倍及~1.2倍抗性。

實例 18 ：與 2'-C-Me 2'F-UTP 之 比較研究在聚合酶分析緩衝液(20 mM Tris，pH 8；10 mM KCl；1 mM DTT；2 mM MgCl ₂)中，用0.5 µM SARS-CoV-1 nsp12:7L8:8聚合酶複合物(1:3:3莫耳比)、0.2 µM引子(Cy-5-SP10)及0.2 µM模板(ST20-U) RNA、50 μM GTP/ATP/CTP (無UTP)，以及10或50 µM之SofosbuvirTP (2'C-Me 2'F-UTP) (STP)進行聚合酶延伸分析。

使用[γ-32 ^P] ATP及PNK，Cy-5-SP10在5'端處經放射性標記。接著，藉由在70℃加熱10 min將Cy-5-SP10退火為互補模板ST20-U，且接著冷卻至室溫(其中引子/模板之比率為1:1)。在ST20-U作為模板之情況下，引子延伸分析始終進行，且藉由添加50 μM GTP/ATP/CTP (無UTP)混合物起始反應。在30℃培育之後，藉由添加等體積之負載緩衝液(甲醯胺+ 10 mM EDTA)淬滅反應。在20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠中分析引子延伸分析之RNA聚合產物。使用光刺激培養盤及磷光成像儀觀測RNA產物。如圖12A中所示，2'C-Me 2'F-UTP作為UTP類似物併入生長鏈中，且2'C-Me 2'F-UTP之導致鏈終止。如圖12B中所示，相較於在U位置處之錯併入，2'C-Me 2'F-UTP以約40%效率併入。由於錯配已經相差＞250倍，不研究與UTP之競爭。不同於AT9010，2'F-2'-C-甲基UTP不為SARS-CoV RDRP之受質(相差＞250倍)。

實例 19 ： AT-9010 與 NiRAN 活性位點結合 ， 從而抑制 nsp8 及 nsp9-UMP 化 ( 路徑 1)為了判定藥物是否能夠另外靶向NiRAN轉移活性，用UTP或GTP，與增加濃度之AT-9010或STP，進行量測nsp8之標記的競爭實驗(圖13A至圖13C)。與用作對照之 ^m7GTP相比，兩種藥物均能夠抑制標記。有趣的是，儘管nsp8優先經UMP標記，但在兩個酶濃度(1 μM及5 μM nsp12，與5倍過量的nsp8)下恆定的，尿嘧啶類似物STP在阻斷nsp8-標記時之效率比AT-9010低約5倍(圖13B)。藉由AT-9010抑制nsp8-UMP標記之IC ₅₀(半最大抑制濃度)計算值給出nsp12之濃度大致一半的IC ₅₀值(分別0.87及1.9 µM)，指示AT-9010以大約1:1化學計量與NiRAN域結合，遠勝出UTP。此外，鑒於反應中過量之nsp8，此等結果表明，AT-9010仍穩定地結合於NiRAN活性位點中而非轉移至nsp8。此外，STP及AT-9010兩者均顯示抑制nsp8之GMP化(圖13C)。

此外，在增加濃度之AT-9010或其尿嘧啶等效物STP存在下，進行量測藉由SARS-CoV及SARS-CoV-2 RTC進行nsp9-UMP化之效率的競爭實驗，其中結果顯示於圖13D中。兩種藥物均以可與SARS-CoV及SARS-CoV-2 RTC相當的水準抑制nsp9標記。當以與UTP等莫耳濃度提供時，對於SARS-CoV-2複合物，nsp9-UMP化由STP及AT-9010抑制約85%-90%，顯示兩種藥物對於NiRAN結合而言勝出UTP。在增加濃度之AT-9010或其尿嘧啶等效物STP存在下，進行量測藉由SARS-CoV及SARS-CoV-2 RTC進行nsp8-UMP化之效率之額外競爭實驗。如圖13E中所示，AT-9010在阻斷nsp8標記時之效率比尿嘧啶等效物STP高約4-5倍。此提供額外確認，AT-9010仍穩定地結合於NiRAN活性位點中而非轉移至nsp8且循環。

實例 20 ： 熱位移分析證實 AT-9010 優先與 Nsp12 NiRAN 活性位點結合。藉由Thermofluor分析，使用CFX Connect BioRad 即時PCR機器，在由10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl及5 mM MgCl ₂構成之緩衝液(補充有或未補充有新製的0.5 mM MnCl ₂)中，以2 µM之蛋白質濃度(Nsp12 WT及突變體)，來量測化合物結合對於蛋白質穩定性的影響。化合物及dNTP濃度固定在100 µM。在96孔薄壁PCR盤中，將2 µL抑制劑或dNTP添加至16 µL緩衝液中，隨後添加2 µL蛋白質。最後，添加2 µL螢光染料SYPRO橙(最終5倍)。所給出之解鏈溫度(T _m)值為三個獨立實驗之平均值及標準差。在MnCl ₂存在下nsp12之熱位移分析確認，AT-9010比任何其他天然核苷酸提供更大的熱力學穩定性(圖13F)。NiRAN及RdRp活性位點突變體(分別為K73A及SAA)之比較顯示，此穩定性增加係由AT-9010優先結合於NiRAN活性位點而非RdRp活性位點中提供(圖13F至圖13G)。相較於UTP結合的複合物或STP結合的複合物，GTP-nsp12複合物及AT-9010-nsp12複合物兩者均顯示穩定性增加。與抑制結果一致，此等結果指示，鳥苷為NiRAN活性位點之較佳鹼基，且AT-9010之2'-氟-2'-C-甲基核糖修飾提供額外穩定性。使用Sars-CoV-2 WT Nsp12，發現類似結果，其顯示於圖13H中。

實例 21 ： AT-9010 經由路徑 2 抑制 RNA 合成。測試兩種藥物抑制自poly(A) ₂₇模板進行RNA合成之起始之能力。不管AT-9010為鳥苷核苷酸之事實，其與STP同等好地抑制poly(U) _nRNA之合成(圖14A)。藉由AT-9010之抑制顯示，大多數其抑制活性可能並不歸因於RdRp介導之併入，此係由於嘌呤-嘌呤不匹配(在此情況下，AT-9010:A等效於G:A)向對於天然UTP:A將明顯不受歡迎。RNA合成之抑制可與nsp12 K73A突變體相當，指示抑制無法經由與NiRAN域結合而異位(圖14B)。實際上，抑制經由阻斷RdRp活性位點處之RNA合成起始而發生。理論上有利於AT-9010之利用poly(C)模板之等效物實驗顯示STP幾乎失活，而AT-9010顯著降低活性(圖14C)。因此似乎儘管兩種藥物能夠抑制RNA合成之重新NiRAN非依賴性起始，但AT-9010抑制為模板非依賴性的。在添加pppGpU及其他NTP之前將複合物與STP或AT-9010一起預培育，以類似水準抑制ST20p(A) ₁₅RNA之合成；同樣，抑制可與WT及K73A NiRAN突變體複合物相當，顯示兩種藥物另外能夠結合於RdRp活性位點中且預防二核苷酸引子之合成及/或結合(圖14D)。

實例 22 ： AT-9010 比 SOF 更佳地抑制 NiRAN 依賴性及 NiRAN 非依賴性路徑如實例10中所描述進行RNA聚合分析。藉由添加200 μM α- ³²P-UTP (0.5 μCi/μL)起始重新分析，該分析使用0.35 µM poly(A) ₂₇RNA作為模板。在具有或不具有400 μM AT9010之情況下進行反應。在30℃培育之後，藉由添加等體積之負載緩衝液(甲醯胺+ 10 mM EDTA)淬滅反應。在1%瓊脂糖-甲醛凝膠中分析來自重新分析之RNA聚合產物。使用光刺激培養盤及磷光成像儀觀測RNA產物。如圖15A中所示，在相對於UTP 2倍過量之AT9010之情況下，幾乎完全抑制poly(A)模板上之重新合成，指示AT9010抑制蛋白質引動的RNA聚合之能力。

接著，如上文所描述進行引子非依賴性RNA合成分析，其中在劑量自0遞增至10 μM之AT9010或10遞增至320 μM之2'C-Me 2'F-UTP之情況下進行反應。AT9010之結果顯示於圖15B之左圖中，其顯示AT9010以約1.5-2 μM之EC ₅₀抑制NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成。此顯示，AT9010在生理劑量下極強力地抑制NiRAN介導之蛋白質引動的合成。替代地，2'C-Me 2'F-UTP之結果顯示於圖15B之右圖。此顯示2'C-Me 2'F-UTP之EC ₅₀為約20-40 μM。此藥物濃度水準無法在2'C-Me 2'F-UTP之生理劑量下達成，因此其在抑制NiRAN之蛋白質引動的RNA合成時無效。

在聚合酶分析緩衝液(20 mM Tris，pH 8；10 mM KCl；1 mM DTT；2 mM MgCl ₂)中，用0.5 µM SARS-CoV-1 nsp12:8聚合酶複合物(1:3莫耳比)；0.5 µM SARS-CoV-1 nsp12:7L8聚合酶複合物(1:3莫耳比)；或0.5 µM SARS-CoV-1 nsp12:7L8:8聚合酶複合物(1:3:3莫耳比)，與0.35 µM poly(A) ₂₇RNA，進行額外重新合成分析。藉由添加200 μM [α-32P] UTP (0.5 μCi/μL)起始重新分析，該分析使用0.35 µM poly(A) ₂₇RNA作為模板。在30℃培育之後，藉由添加等體積之負載緩衝液(甲醯胺+ 10 mM EDTA)淬滅反應。在1%瓊脂糖-甲醛凝膠上分析來自重新分析之RNA聚合產物。使用光刺激培養盤及磷光成像儀觀測RNA產物。結果顯示於圖15C中。泳道1為利用0.5 µM SARS-CoV-1 nsp12:8聚合酶複合物之分析，其顯示無引子非依賴性合成。泳道2為利用0.5 µM SARS-CoV-1 nsp12:7L8聚合酶複合物之分析，其顯示引子非依賴性合成。泳道3為利用0.5 µM SARS-CoV-1 nsp12:7L8:8聚合酶複合物之分析，其顯示頂部條帶中之引子非依賴性合成以及蛋白質引動的合成。

藉由AT9010抑制經由SARS NiRAN域進行之SARS引子非依賴性RNA聚合之此能力亦可解釋化合物 1A在抑制SARS病毒複製方面之效用的差異，同時在抑制MERS病毒複製方面不太有效(參見實例3)，此係因為MERS及SARS NiRAN域相對於MERS及SARS RdRp域顯著更異源(參見Lehmann等人, Nucleic Acids Res. 2015年9月30日; 43(17): 8416-8434)。

實例 23 ： 使用冷凍 EM 來更好地 觀察結合

經延伸之 nsp12-nsp7-nsp8-RNA 複合物之組裝以用於 冷凍 EM為了組裝經延伸之RdRp複合物，以1:3:6之莫耳比，將nsp12與nsp7及nsp8一起在4℃在緩衝液中培育3 h，該緩衝液含有25 mM Tris-HCl (pH 8.0)、50 mM NaCl、5 mM MgCl ₂、4 mM DTT。接著，藉由Mono Q 5/50 GL離子交換層析(GE Healthcare, USA)純化混合物，產生穩定的nsp7-nsp8-nsp12複合物。將蛋白質複合物去鹽至緩衝液F (25 mM Tris-HCl (pH 8.0)、100 mM NaCl、5 mM MgCl ₂、4 mM DTT)。將純化的RdRp複合物緩衝液交換至25 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl、5 mM MgCl ₂、4 mM DTT，且濃縮至10 mg/ml以用於冷凍EM實驗。由GenScript化學合成30聚體寡核糖核苷酸模板及20聚體寡核糖核苷酸引子。模板及引子寡核糖核苷酸藉由加熱溶液至95℃退火且逐漸冷卻至4℃。以2:1之莫耳比，將退火的RNA骨架與nsp12-nsp7-nsp8複合物一起在4℃培育30 min，以形成nsp12-nsp7-nsp8-RNA複合物。隨後添加AT9010以用於化合物併入。

冷凍 EM 樣品製備及資料收集總而言之，將3 µL在5 mg/mL之蛋白溶液(+ 0.025% DDM)施加至輝光放電多孔碳網格(Quantifoil，300目，R1.2/1.3)上。過量樣品以3之吸力(blotting force)吸取(blotted) 5.0 s，接著剩餘溶液藉由在4℃及100%濕度下使用Vitrobot Mark IV (Thermo Fischer Scientific)投入液體乙烷中而玻璃化。用配備有K3直接電子偵測器(Gatan, USA)之300 keV Titan Krios電子顯微鏡(Thermo Fisher Scientific, USA)，以超解析度計數模式操作，來收集冷凍EM資料。使用SerialEM (Mastronarde, 2005)，在105K放大率下自動記錄所有影片，其中物理像素大小為0.83 Å。將80.5 e-/Å2之總劑量分至50個框架中。以在-1.5 µm至-2.5 µm範圍內之散焦收集7,459個影片顯微照片，且Gatan Quantum GIF能量過濾器(Gatan, USA)之隙縫寬度設定成20 eV。資料收集及精化之統計資料顯示於表S1中。

冷凍 EM 影像處理

所有劑量分割影片用Relion自身實施進行運動校正。CTF估計、2D分類、3D分類及精化全部均在冷凍SPARC中進行。使用blob挑選器自動挑選總計2,410,466個粒子且用320像素之框大小提取。在基於複合物完整性進行三輪2D分類之後，選擇248,401個粒子。此粒子集合用於進行具有三類之Ab-Initio重構，其接著用作非均勻精化之3D體積模板。使用對應於完整nsp12-nsp7-nsp8-RNA複合物之3D體積用於產生100個2D投影，其接著用作基於模板之粒子挑選的模板。使用模板挑選器，基於如藉由CTFFIND4估計之比5Å更佳的適配解析度，自3,622個過濾的顯微照片之集合挑選大致3,640,595個粒子。用360像素之框大小提取粒子。在基於複合物完整性進行四輪2D分類之後，選擇總計234,421個粒子。此粒子集合用於進行具有三類之Ab-Initio重構，隨後非均勻精化。使來自該類別之181,669個具有良好特徵之粒子之子集經受均勻精化、局部精化及不均勻精化，從而產生2.98 Å圖譜。

模型建構及精化為了建構nsp12-nsp7-nsp8-RNA複合物之模型，置放SARS-CoV-2 nsp12-nsp7-nsp8-RNA複合物之結構(來自PDB 7CYQ，其中移除一個nsp9及nsp13)，且使用UCSF Chimera剛性體適配於冷凍EM圖譜中。利用冷凍EM圖譜之指南將模型人工建構於Coot中(Emsley等人, 2010)，且結合使用Phenix之真實空間精化(Afonine等人, 2018)。模型驗證統計資料顯示於表9中。表 9 ：冷凍 EM 資料收集、精化及驗證統計資料

Nsp12-nsp7-nsp8 複合物	RNA 及AT9010 結合的(PDB ID：) (EMDB ID：)
資料收集與處理( 對於各資料集)
顯微鏡	Titan Krios
電壓(keV)	300
攝影機	Gatan K3 Summit
放大率	105,000
偵測器處之像素大小(Å/像素)	0.83
總電子暴露(e ^-/Å ²)	80.5
在暴露期間收集之框架數目	50
散焦範圍(µm)	-1.5 ~ -2.5
相位板(若使用)	N/A
-相移範圍(以度為單位)	N/A
-每相位板位置之影像數目	N/A
自動化軟體	SerialEM
傾斜角	0
能量過濾隙縫寬度(eV)	20
所收集之顯微照片(數目)	7,459
所使用之顯微照片(數目)	5,609
總提取粒子(數目)	3,640,595
對於各重構：
精化粒子(數目)	181,669
最終粒子(數目)	181,669
點群或螺旋對稱參數	C1
解析度(FSC 0.143，Å)	2.98
解析度範圍(局部，Å)	2.7-3.3
圖譜銳化B因子(Å ²)	82.7
圖譜銳化方法	cryoSPARC v2.15.0
模型組成
蛋白質	1302
配體	8
RNA	44
模型精化
精化套裝軟體	PHENIX-1.19_4085
-真實或倒易空間	真實空間
模型圖譜CC	0.84
模型解析度(Å)	3.14
FSC臨限值	0.5
B因子(Å ²)
蛋白質殘基	69.09
配體	67.51
RNA	134.15
與理想值之R.m.s.偏差
鍵長度(Å)	0.002
鍵角(°)	0.538
驗證
MolProbity評分	1.9
CaBLAM離群值	5.13
衝突評分(Clashscore)	7.89
不良旋轉異構體(%)	0.09
C-β偏差	0.00
EMRinger評分(若比4 Å解析度更佳)	3.32
拉曼圖(Ramachandran plot)
有利的(%)	92.5
離群值(%)	0.31

實例 24 ：藉由 AT-9010 進行 nsp12 抑制之結構基礎 .先前報導之在存在及不存在RNA下之SARS-CoV-2 RTC之結構(Gao 2020; Wang 2020)已為在結構層級上理解抑制鋪平了道路(Yin 2020)。為了研究結合及併入AT-9010之RNA中，且特定言之在其存在下RdRp與NiRAN活性位點之間的關係，在AT-9010存在下，使用與SARS-CoV-2 RTC結合之dsRNA進行冷凍EM研究。單一粒子之影像處理允許在2.98 Å解析度下重構RTC/RNA/AT-9010四元組裝(圖16A)，顯示AT-9010同時與nsp12之NiRAN及RdRp活性位點結合(圖16B)。整體結構類似先前報導之結構，具有一個nsp12、一個nsp7及兩個nsp8蛋白(圖16B)。RdRp域與引子-模板dsRNA對結合，其中AT-9010之5'-單磷酸酯併入於RNA引子之3'端(圖16B)。存在第二游離AT-9010三磷酸酯，經負載至聚合酶中之NTP結合位點處(自左側由模體C；底部由模體A、D；及頂部由模體F加框) (圖16C至圖16D)。因此，此結構表示呈移位後狀態之SARS-CoV-2聚合酶之第一快照，其中引入NTP準備併入。模體A及C之殘基Asp618及Asp760分別配位單一催化性鎂離子，其與第二AT-9010之磷酸酯相互作用(圖16C至圖16D)。最後，結構亦顯示呈其二磷酸酯形式之AT-9010，其結合於NiRAN域之活性位點中(圖16E)。

實例 25 ： nsp12 活性位點將 AT-9010 併入 RNA 中且終止合成。RNA模板之可見5'端由設計成促進AT-9010併入RNA產物股中之4個連續胞苷鹼基(C24-C27)構成。AT-9010併入在RNA產物之位置1處，與模板股之C27配對。觀測到呈預併入狀態之第二AT-9010，與模板之C26配對。因此，RdRp-RNA複合物呈移位後狀態，其中+1位點由第二AT-9010佔據，防止其他NTP經負載(圖16C)。

所併入之AT-9010之鳥嘌呤與模板之胞嘧啶(C27)進行標準地鹼基配對(圖16B至圖16C)。核糖與Ser814及5'磷酸酯形成氫鍵，此係藉由Cys813配位。2'-氟-2'-C-甲基核糖修飾之效果為兩倍。首先，2'羥基經氟基置換消除Ser759 (模體C)及2'-OH與之間的相互作用，此通常使核糖穩定。此空間地移位藉由模體C及RNA產物之殘基正常配位的催化性離子。此觀測藉由結構中缺乏第二催化性Mg ²⁺而證實，後一離子通常藉由模體C中之催化性Asp760及與RNA產物之最後併入之核苷酸的3'-OH及磷酸酯配位。此離子在定位RNA產物之3'端及進入的NTP中起關鍵作用。其次，AT-9010核糖之疏水性甲基藉由產生防止進入的NTP之核糖之正確定位之疏水性阻礙而放大抑制效果。此防止產物股進一步延伸，無關於3'-OH之存在，從而解釋AT-9010為何充當鏈終止劑。因此，第二三磷酸酯AT-9010停頓在+1位點位置處。鳥嘌呤與模板股之胞嘧啶(C26)正確地鹼基配對，且在併入之前，由殘基Lys545 (模體F)及Ser682 (模體B)進一步穩定，該兩個殘基在保真度檢查期間很重要(圖16C至圖16D)。歸因於疏水性排斥，核糖基團相較於其理論位置移位45°，其大部分係由所併入之AT-9010之甲基驅動(圖16D及圖16F至圖16G)。因此，通常在併入之後負責使焦磷酸穩定之Asp623 (模體A)之側鏈經推開。

α-及β-磷酸酯由Mg2+配位，且γ-磷酸酯藉由亦在模體A中之Lys621及模體D中之Lys798穩定。不遵從允許金屬配位及鍵合事件(用於併入)所必需之α-磷酸酯與3'-OH之間的距離，從而預防併入。實際上，可以觀測到，AT-9010處於變化的結構位置中，其中α-及β-磷酸酯空間上重疊焦磷酸(β-及γ-磷酸酯)之位置(圖16D及圖16F至圖16G)。

實例 26 ： NiRAN 域在 UMP 化 活性位點處結合 AT-9010 。NiRAN域結構上與酶之假激酶家族相關(Slanina)，從而允許對酶之催化性殘基定界(圖17A)。然而，亦可針對NiRAN域鑑別CoV獨特序列及結構元件。結構顯示與NiRAN域結合之呈其二磷酸酯形式之AT-9010。結合位點由封閉空腔構成，其通向含有由保守Asn209及Asp218配位之兩個催化性離子的凹槽(參見下文)。凹槽進一步加寬至藉由2個β股(β2-β3殘基33-48)形成之平坦表面(圖17B至圖17C)。AT-9010之鹼基及經修飾之核糖緊貼於空腔中(圖17D)，而α及β磷酸酯在凹槽中由兩個催化性離子及Lys73配位。鳥嘌呤鹼基藉由疏水相互作用及經由與殘基Arg55、Thr120及Tyr217之氫鍵而強烈地經穩定，該等殘基在CoV-NiRAN序列中保守(圖17E)但在其他假激酶中不存在(圖17A)。此外，經修飾之核糖之2'-氟基經由與Lys50之相互作用使結合袋中之核苷酸穩定(圖17E)。AT-9010之結合模式暗示與酪蛋白激酶結合之ATP之定向(Xu 1995)，但驚人地不同於假激酶結構(Sreelatha, Yang)及最近公開的GDP結合的NiRAN結構(Yan 2021)中之核苷酸的位置。與本文中所報導之AT-9010結合的NiRAN相比，GDP之二磷酸酯部分掩埋在由Lys50、Asn52、Lys73及Arg116形成之封閉空腔中，且由單個Mg ²⁺離子配位(圖17E)。類似地，具有非可水解NTP之假激酶結構顯示由等效殘基形成之空腔中之γ-磷酸酯結合，其中核糖沿著將近凹槽之寬表面穩定(圖17C)。因此合理地提出，AT-9010具有一種由空腔之疏水性及經修飾之核糖兩者驅動之獨特的結合模式。鹼基及核糖藉由保守殘基而在空腔中穩定，從而解釋了NiRAN功能之強效抑制，與酶抑制及熱位移資料一致。

實例 27. AT-511 ( 化合物 1A) 不在病毒基因體中誘導突變將AT-511 (化合物1A)之誘變效果與以下三種參考化合物進行比較：瑞德西韋、莫努拉韋及GC 376。

細胞株使HUH 7.5細胞在高葡萄糖(4500 mg/l)達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium High glucose) (Life Technologies)中生長，該培養基具有7.5%熱滅活胎牛血清(fetal calf serum，FCS；Life Technologies)，在37℃與5% CO ₂以及1%青黴素/鏈黴素(PS，分別5000 U.mL ⁻¹及5000 μg.mL ⁻¹；Life Technologies)，補充有1%非必需胺基酸(Life Technologies)及L-麩醯胺酸(Life Technologies)。

病毒株SARS-CoV-2病毒株BavPat1係經由EVA GLOBAL獲自Pr. C. Drosten (https://www.european-virus-archive.com/)。

為了製備病毒工作儲備液，以0.001之感染倍率(MOI)接種一瓶25 cm ²培養燒瓶之用具有2.5%FCS之MEM培養基生長之匯合VeroE6 TMRPSS2細胞。在複製峰時收集細胞上清液培養基且在以等分試樣冷凍儲存在-80℃之前補充25 mM HEPES (Sigma-Aldrich)。具有感染性病毒之所有實驗均在3級生物安全實驗室中進行。

EC ₅₀ 及 CC ₅₀ 測定在感染前一天，將每孔5×10 ⁴個HUH7.5細胞接種於96孔培養盤中之100 μL分析培養基(含有2.5% FCS)中。次日，將化合物之八個2倍連續稀釋液添加至細胞中(每孔25 μL，在分析培養基中)，重複三次，自0.16 μM至20 μM。在培養盤上，用八個2倍連續稀釋液(0.16 μM至20 μM)，添加對照化合物(G376, Medchemexpress)，重複兩次。對四個病毒對照孔補充25 μL分析培養基。在15 min之後，將稀釋於培養基中之25 μL病毒混合物添加至孔中。基於複製動力學，在分析之前校準所使用之病毒工作儲備液之量，以使得如先前描述病毒複製仍在指數生長期中以用於讀取(Delang等人, 2016；Touret等人, 2020, 2019)。在此實驗中，此對應於300 TCID ₅₀/孔。對四個細胞對照孔(亦即無病毒)補充50 μL分析培養基。在藉由即時RT-PCR定量病毒基因體之前，將培養盤在37℃培育2天。為此，將100 μL病毒上清液收集於先前負載有含有蛋白酶K及RNA載劑之VXL溶解緩衝液的S-Block (Qiagen)中。使用Qiacube HT自動裝置及QIAamp 96 DNA套組HT，按照製造商說明書進行RNA提取。使用3.8 μL提取之RNA及6.2 μL RT-qPCR混合物，以及標準快速循環參數，亦即在50℃ 10 min，在95℃ 2 min及40個擴增循環(95℃持續3秒，隨後在60℃持續30秒)，藉由即時RT-qPCR (GoTaq 1步驟qRt-PCR, Promega)定量病毒RNA。藉由已知量(102至108個複本/反應)之適當T7生成之合成RNA標準物之四個2 log連續稀釋液提供定量。在QuantStudio 12K Flex 即時PCR系統(Applied Biosystems)上進行RT-qPCR反應，且使用QuantStudio 12K Flex應用生物系統軟體v1.2.3分析。靶向SARS-CoV-2 N基因之引子及探針序列為：Fw：GGCCGCAAATTGCACAAT；Rev：CCAATGCGCGACATTCC；探針：FAM-CCCCCAGCGCTTCAGCGTTCT-BHQ1。如下計算病毒抑制： 100×(量平均值VC -樣品量)/量平均值VC

如先前描述，使用對數內插法測定50%及90%有效濃度(EC ₅₀，EC ₉₀；抑制病毒RNA複製50%及90%所需之化合物濃度) (Touret等人, 2019/2020)。對於50%細胞毒性濃度(CC ₅₀)之評估而言，使用與測定EC ₅₀相同的培養條件，不添加病毒，且使用CellTiter Blue® (Promega)按照製造商說明書來量測細胞活力。使用對數內插法測定CC ₅₀。使用GraphPad Prism 7軟體(Graphpad software)來分析所獲得之所有資料。

抗病毒分析之實施為了建立HUH 7.5細胞中之抗病毒分析，首先評估細胞中之SARS-CoV-2之病毒複製。HUH7.5細胞用SARS-CoV-2之1/3倍稀釋液感染，重複三次，且在感染後24及48小時收集細胞上清液。為了評估病毒複製(重新病毒顆粒產生)，將最終病毒產生與接種體比較：相同病毒量但在孔中無細胞(圖18)。分析不同稀釋液以評定吾人之三份重複之再現性及病毒複製之階段。最後為了選擇正確稀釋，鑑別以下標準：i)在指數期結束/平線區開始時，ii)具有足夠複製(6CT對應於~2 log)，iii)以及實驗之間的低變化性。結果呈現於圖18中。在感染後24小時，病毒複製不足以用於抗病毒分析，此係因為相較於接種體，複製抑制作用將在循環臨限值(cycle threshold；CT)上產生微弱的不同，實際上小於5 CT。在感染後48 h，對於六個第一稀釋，病毒複製導致超過2 log/6 CT。第三稀釋在平線區之開始/指數期結束時，顯示與接種體相差超過3 log，且三個重複中幾乎無變化。因此，對應於300 TCID ₅₀/孔之稀釋液3符合抗病毒分析之最佳條件之所有標準，且選擇用於測定EC ₅₀。

用 AT-511 之 抗病毒分析評估HUH7.5中之AT-511抗病毒活性且與三種參考抗病毒化合物：瑞德西韋、莫努拉韋及GC376比較。所有化合物均在相同條件下及在相同濃度下評定：始於20 μM至0.16 μM。(圖19)。吾人亦在相同條件下評估化合物細胞毒性(表10)。在此等濃度下，在HUH 7.5細胞中未觀測到細胞毒性(表10)。瑞德西韋及GC376在此細胞株中顯示病毒複製之強效抑制，其中EC ₅₀值低於0.15 μM (圖19；表10)。AT-511及莫努拉韋亦具有抗病毒活性，其中EC ₅₀分別為1.1及1.7 μM (圖19；表10)。表 10. 某些化合物在 HUH7.5 細胞中之抗病毒活性及細胞毒性

μM	AT-511	瑞德西韋	莫努拉韋	GC376
EC ₅₀	1.13	＜0.15	1.71	＜0.15
EC ₉₀	3.39	＜0.15	4.21	＜0.15
CC ₅₀	＞20	＞20	＞20	＞20

四種抗病毒劑之誘變效果之評估藉由比較在抗病毒分析終點後之病毒RNA與在相同培養條件下但無抗病毒(病毒對照，下文稱為Vc)所獲得之病毒RNA，來測定四種化合物的誘變效果。在抗病毒分析之條件下，自細胞培養上清液提取病毒RNA，其中在5 μM下測試化合物，因此所有化合物均處於高於其EC ₉₀之濃度。

使用SuperScript IV單步RT-PCR系統(Thermo Fisher Scientific)及特定引子(表11)，自所提取之病毒RNA產生十三個重疊擴增子。表 11. 基因體擴增之引子之清單

名稱	序列	開始	結束	Tm	GC%
1F	ACCAACCAACTTTCGATCTCTTGT	31	54	60.69	41.67
1R	TTTCGAGCAACATAAGCCCGTT	2621	2642	61.13	45.45
2F	AACAACCTACTAGTGAAGCTGTTGA	2565	2598	60.16	40.00
2R	TTGACATGTCCACAACTTGCGT	5006	5027	61.26	45.45
3F	CTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGGACT	4940	4966	60.69	40.74
3R	TGCCAAAAACCACTCTGCAACT	7234	7255	61.47	45.45
4F	GTGGTTTAGATTCTTTAGACACCTATCCT	7143	7171	60.59	37.93
4R	AGGTGTGAACATAACCATCCACTG	9644	9667	60.81	45.83
5F	ACTCATTCTTACCTGGTGTTTATTCTGT	9558	9585	60.69	35.71
5R	CTGGACACATTGAGCCCACAAT	11923	11944	61.14	50.00
6F	TGCACATCAGTAGTCTTACTCTCAGT	11864	11889	61.25	42.31
6R	TGTGACTCTGCAGTTAAAGCCC	14186	14207	60.81	50.00
7F	AGACGGTGACATGGTACCACAT	13758	13779	61.41	50.00
7R	ACACGTTGTATGTTTGCGAGCA	15354	15375	61.63	45.45
8F	TGATTGTTACGATGGTGGCTGT	14880	14901	60.29	45.45
8R	GTGCAGGTAATTGAGCAGGGTC	17437	17458	61.52	54.55
9F	TGATTTGAGTGTTGTCAATGCCAG	17382	17405	60.26	41.67
9R	ATTAGCAGCAATGTCCACACCC	19845	19886	61.21	50.00
10F	AATGTAGCATTTGAGCTTTGGGC	19774	19796	60.37	43.48
10R	ACCAGCTGTCCAACCTGAAGAA	22324	22345	61.82	50.00
11F	ACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGC	22263	22290	60.68	35.71
11R	ATGAGGTGCTGACTGAGGGAAG	24715	24736	61.74	54.55
12F	GTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCA	24649	24673	60.74	44.00
12R	ACTGCTACTGGAATGGTCTGTGT	27142	27164	61.58	47.83
13F	GGTGACTCAGGTTTTGCTGCAT	27087	27108	61.65	50.00
13R	CGTAAACGGAAAAGCGAAAACGT	29571	29593	61.08	43.48

PCR產物以等莫耳比例合併且藉由在~200 bp長度片段中音波處理片段化。藉由使用AB Library Builder系統(ThermoFisher Scientific)，向片段化DNA添加用於樣品鑑別之條碼建構文庫。使用Ion Library TaqMan™定量套組(Thermo Fisher Scientific)，藉由即時PCR進行定量步驟。使用自動化Ion Chef儀(ThermoFisher)，對池進行乳液PCR且負載至530晶片上。在S5 Ion torrent technology v5.12 (Thermo Fisher Scientific)上進行定序。使用CLC基因體學工作台軟體v.20 (Qiagen)，在修整讀段(讀段之品質評分＜0.99，且移除長度＜100 pb，且自讀段移除前30及後30個核苷酸)，將讀段映射於參考上(在重新片段重疊組之Blast之後測定)後，獲得共通序列。亦產生重新片段重疊組以確保共通序列不受參考序列影響。分析頻率超過1%、0.5%、0.2%及0.1%之類似物種。

原始定序結果定序結果呈現於表12中。表 12. 定序資料之評定

分析	在修整後之讀段數目	匹配讀段之數目	平均覆蓋度(每位置讀段數目)	平均中位數覆蓋度(每位置讀段數目)
莫努拉韋1	20 768 161	16 322 335	99 408	92 264
莫努拉韋2	16 324 258	1 632 258	95 108	89 143
Vc 1	17 821 405	17 815 993	109 753	106 058
Vc 2	14 971 419	14 911 091	87 359	85 334
AT 511 1	21 424 942	21 359 545	136 907	131 919
AT 511 2	18 294 504	18 223 771	108 465	102 679
瑞德西韋1	14 720 155	14 406 008	86 700	69 146
瑞德西韋2	20 379 943	19 786 728	118 267	94 419
GC 376 1	19 588 783	18 927 046	110 631	106 566
GC 376 2	18 454 730	18 149 803	99 101	102 344

平均覆蓋度＞80 000且適合於在各位置處低至0.1%之亞群的統計分析。

測定10個樣品之共通序列，且如所預期，與參考序列及彼此之間無差異(在給定位置處無頻率＞50%之突變)。

突變頻率相較於VeroE6，針對HUH 7.5中生長之病毒觀測到之突變頻率略微更高(Shannon等人, 2020)。「頻率低限」定義為在覆蓋給出位置之至少0.1%讀段中觀測到之基因體位置處存在的突變。

針對應用在1%、0.5%、0.2%及0.1%下之頻率低限之各實驗(Vc、莫努拉韋、瑞德西韋、AT511及GC376)定義突變數目，如下文及圖20A至圖20D中所呈現。表13A及表13B顯示對於病毒對照，頻率＞0.1%之突變數目及轉位類型。表14A至17B顯示莫努拉韋、瑞德西韋、AT511及GC376之突變數目及轉位類型。

所有條件之基因體資料之間未觀測到突變數目之顯著差異，其中頻率低限＞ 0.5%。如所預期，在0.2%及0.1%臨限值下，相較於Vc，在有效濃度之莫努拉韋存在下之基因體RNA顯示突變數目顯著增加(表14A及表14B)。突變主要為轉位(顛換未顯示)。表 13A. 病毒對照之突變數目

頻率低限	Vc 1 偵測到之突變數目	Vc 2 偵測到之突變數目	平均值偵測到之突變數目
＞1%	16	13	14.5
＞0.5%	29	21	25
＞0.2%	46	52	49
＞0.1%	842	881	861.5

表 13B. 對於 病毒對照 ，頻率 ＞0.1% 之轉位類型

突變類型	Vc 1之突變數目	Vc 2之突變數目	平均值
T＞C	412	437	206
A＞G	369	386	184.5
C＞T	19	18	9.5
G＞A	6	5	3

表 14A. 莫努拉韋之突變數目

頻率低限	莫努拉韋1 偵測到之突變數目	莫努拉韋2 偵測到之突變數目	平均值偵測到之突變數目
＞1%	24	19	21.5
＞0.5%	36	34	35
＞0.2%	231	185	208
＞0.1%	2818	2824	2821

表 14B. 對於 莫努拉韋 ，頻率 ＞0.1% 之轉位類型

突變類型	莫努拉韋1之突變數目	莫努拉韋2之突變數目	平均值
T＞C	932	889	910.5
A＞G	813	871	842
C＞T	602	582	592
G＞A	385	385	385

當臨限值設定為0.2%時，當相較於病毒對照時，瑞德西韋及GC376可誘導略微增加數目之突變。趨勢在0.1%下不太可見，表明直接或間接誘變有限。表 15A. 瑞德西韋之突變數目

頻率低限	瑞德西韋1 偵測到之突變數目	瑞德西韋2 偵測到之突變數目	平均值偵測到之突變數目
＞1%	21	17	19
＞0.5%	30	28	29
＞0.2%	99	103	101
＞0.1%	1137	1014	1075.5

表 15B. 對於 瑞德西韋 ，頻率 ＞0.1% 之轉位類型

突變類型	瑞德西韋1之突變數目	瑞德西韋2之突變數目	平均值
T＞C	535	425	480
A＞G	438	412	425
C＞T	77	68	72.5
G＞A	12	15	13.5

表 16A. GC 376 之突變數目

頻率低限	GC 376 1 偵測到之突變數目	GC 376 2 偵測到之突變數目	平均值偵測到之突變數目
＞1%	23	18	20.5
＞0.5%	35	28	31.5
＞0.2%	137	98	117.5
＞0.1%	1395	949	1172

表 16B. 對於 GC 376 ，頻率 ＞0.1% 之轉位類型

突變類型	GC 376 1之突變數目	GC 376 2之突變數目	平均值
T＞C	662	403	532.5
A＞G	545	368	465.5
C＞T	51	73	62
G＞A	9	20	14.5

相較於在0.2%及0.1%頻率低限兩者下，在呈有效濃度之AT-511存在下之病毒RNA並不顯示增加數目之突變。表 17A. AT-511 之突變數目

頻率低限	AT-511 1 偵測到之突變數目	AT-511 2 偵測到之突變數目	平均值偵測到之突變數目
＞1%	15	18	16.5
＞0.5%	22	27	24.5
＞0.2%	53	55	54
＞0.1%	1020	923	971.5

表 17B. 對於 AT-511 ，頻率 ＞0.1% 之轉位類型

突變類型	AT-511 1之突變數目	AT-511 2之突變數目	平均值
T＞C	489	457	473
A＞G	454	404	429
C＞T	22	27	24.5
G＞A	7	5	6

實例 28來自進行中的臨床試驗之住院COVID-19患者之期中資料顯示，一天兩次(BID) 550 mg AT-527 (化合物2A)導致病毒複製快速且持續降低。使用其替代物核苷代謝物AT-273之血漿含量超過AT-527用於抑制SARS-CoV-2複製之活體外90%有效濃度(EC90 = 0.5 µM)，藉由其活性三磷酸酯代謝物AT-9010之預測的肺暴露而告知AT-527的給藥。然而，指引評定肺中之藥物處置為確保在SARS-CoV-2感染之原發性部位處達到抗病毒藥物含量所必需的。

方法兩個8名健康參與者之組已入選以275或550mg BID口服接受AT-527 2.5天。在最後一次劑量後4及12 h，各參與者(4名/時間點/組)經由標準氣管鏡進行單一支氣管肺泡灌洗術(BAL)。亦在最後一次劑量之後進行大量血漿PK取樣。分析AT-273之BAL及血漿樣品。藉由校正BAL及對應血漿樣品中之尿素含量而計算肺上皮黏液(ELF)中之AT-273含量。安全性評定包括不良事件(AE)、生命徵象、心電圖(ECG)及標準實驗室測試。

結果AT-527具有良好耐受性，具有很少的非嚴重及非藥物相關之自我限制性AE。血漿及肺ELF中之平均AT-273含量為劑量相關的且用AT-527 550 mg BID達成0.5 µM之目標含量(圖21)。此等結果表明，在較高劑量之AT-527下，可達成ELF中之較高AT-273含量。AT-273之ELF及血漿含量顯著相關(r = 0.86，P ＜0.001)，允許根據更常用的血漿樣品可靠地預測ELF含量。

結論用AT-527 550 mg BID，在肺中達成抗病毒相關藥物暴露，且較高AT-527劑量可能提供更加持續高於目標含量之ELF AT-273含量。此等結果進一步確認使用一天兩次550 mg/天直至1100-mg或更多之劑量，化合物2A (AT-527)對於SARS-CoV-2感染之治療及防治功效。

本說明書已參考本發明之實施例描述。鑒於本文中之教示，一般熟習此項技術者將能夠出於所需目的而修改本發明，且認為此類變化在本發明之範疇內。

圖1，各域中之SARS-CoV-2 nsp12與保守模體之圖(根據Gao等人, Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19. Science 10.1126/science. abb7498 (2020)修改)。圖2A，顯示在增加濃度之AT9010及2'-Me-GTP之情況下，使用RNA受質GpppA，過濾結合分析之結果的條形圖，該過濾結合分析量測SARS CoV1 nsp14之N7-Mt酶活性的抑制。x軸顯示如以µM為單位量測之AT9010及2'-Me-GTP之濃度。y軸顯示如以藉由閃爍計數器量測之每分鐘計數(counts per minute；CPM)之百分比量測的殘餘MT酶(MTase)活性。圖2B，顯示在增加濃度之AT9010及2'-Me-GTP之情況下，使用RNA受質GpppAC ₄，過濾結合分析之結果的條形圖，該過濾結合分析量測SARS CoV1 nsp14之N7-Mt酶活性的抑制。x軸顯示如以µM為單位量測之AT9010及2'-Me-GTP之濃度。y軸顯示如以藉由閃爍計數器量測之每分鐘計數(counts per minute；CPM)之百分比量測的殘餘MT酶活性。圖3A左側為考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠，且右側為在針對放射活性進行暴露之後的同一凝膠。此等顯示NiRAN競爭分析之結果，該NiRAN競爭分析使用5µM UTP +增加濃度之2'F,2'CH3-GTP (AT9010，200524A)以測定AT9010是否抑制nsp8經具有放射標記之UTP的nsp12-NiRAN標記。凝膠之上部條帶表示nsp12之量，且下部條帶表示nsp8之量。各泳道表示0至12.80 µM之AT9010的濃度。圖3B左側為考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠，且右側為在針對放射活性進行暴露之後的同一凝膠。此等顯示NiRAN競爭分析之結果，該NiRAN競爭分析使用5µM GTP +增加濃度之2'F,2'CH3-GTP (AT9010，200524A)以測定AT9010是否抑制nsp8經具有放射標記之GTP的nsp12-NiRAN標記。凝膠之上部條帶表示nsp12之量，且下部條帶表示nsp8之量。各泳道表示0至12.80 µM之AT9010的濃度。圖3C左側為考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠，且右側為在針對放射活性進行暴露之後的同一凝膠。此等顯示NiRAN競爭分析之結果，該NiRAN競爭分析使用5µM GTP及UTP +增加濃度之2'Me-GTP以測定2'Me-GTP是否抑制nsp8經具有放射標記之GTP或UTP的nsp12-NiRAN標記。凝膠之上部條帶表示nsp12之量，且下部條帶表示nsp8之量。各泳道表示0至12.80 µM之2'Me-GTP的濃度。圖3D為參見圖3C中在針對放射活性進行暴露之後的同一SDS-PAGE凝膠。包括較輕暴露之UTP泳道。此等顯示NiRAN競爭分析之結果，該NiRAN競爭分析使用5µM GTP及UTP +增加濃度之2'Me-GTP以測定2'Me-GTP是否抑制nsp8經具有放射標記之GTP或UTP的nsp12-NiRAN標記。凝膠之上部條帶表示nsp12之量，且下部條帶表示nsp8之量。各泳道表示0至12.80 µM之2'Me-GTP的濃度。圖3E為AT9010與GTP及UTP之間以及2'Me-GTP與GTP及UTP之間的競爭的IC ₅₀曲線的圖形說明。x軸顯示以µM為單位量測之抑制劑濃度的對數標度，且y軸顯示剩餘活性百分比，其中各組合之IC ₅₀顯示在下方。圖4A為15% SDS PAGE凝膠，其顯示在無RNA之情況下，在變化濃度之MnCl ₂、MgCl ₂或兩種離子存在下，nsp8經nsp12之NiRAN域標記。將下部凝膠暴露隔夜以顯示放射性UMP。圖4B為15% SDS PAGE凝膠，其顯示在有poly(A) ₂₇RNA之情況下，在變化濃度之MnCl ₂、MgCl ₂或兩種離子存在下，與nsp12:7L8:8 RTC進行的反應。將下部凝膠暴露隔夜以顯示放射性poly(U) _n產物。圖4C為14%丙烯醯胺尿素-PAGE凝膠，其顯示在有poly(A) ₂₇RNA之情況下，在變化濃度之MnCl ₂、MgCl ₂或兩種離子存在下，與nsp12:7L8:8 RTC進行的反應。將凝膠暴露隔夜以顯示放射性poly(U) _n產物。圖5A為15% SDS PAGE凝膠。將nsp12、nsp7及nsp8之各種組合，以及nsp7及8之共價連接型式(nsp7L8)在37℃與α ³²P-UTP一起培育1小時。在15% SDS PAGE凝膠上分離樣品，以移除未共價結合的核苷酸且針對總蛋白(頂部)進行染色，接著暴露以顯示放射活性(下部)。Nsp8及少量雜質蛋白質(*)以nsp12依賴性方式標記。圖5B為15% SDS PAGE凝膠，其顯示nsp8經NiRAN活性位點突變體標記。用α ³²P-UTP (左)及α ³²P-GTP (右)標記nsp8係用具有不同單一NiRAN丙胺酸突變之nsp12:7:8複合物進行。圖5C為暴露隔夜之15% SDS PAGE凝膠，其顯示各種nsp8突變體經nsp12標記，及nsp8 WT經各種nsp12 NiRAN突變體標記。最後一個泳道顯示RdRp SAA活性位點突變體。圖5D為變性SDS-PAGE凝膠，其顯示具有α ³²P-UTP之SARS-CoV-2 nsp12:7:8複合物之活性的分析。泳道1，無RNA；泳道2，在添加poly(A) ₂₇RNA之前，蛋白質複合物與UTP + α ³²P-UTP一起預培育；泳道3，在添加UTP + α ³²P-UTP之前，蛋白質複合物與poly(A) ₂₇RNA一起預培育；泳道4-5，與泳道2及3相同但在反應完成後用蛋白酶K (PK)消化。圖5E為暴露隔夜之15% SDS PAGE凝膠，其顯示nsp8經具有四個α ³²P放射性標記之核苷酸之nsp12標記。圖5F為暴露隔夜之15% SDS PAGE凝膠，其顯示經由在低或高pH下處理評定nsp8-UMP鍵的穩定性。標記反應係在不存在(左側凝膠)或存在poly(A) ₂₇RNA (右側凝膠)下，用nsp12 +單獨8(頂部凝膠)或用nsp12:7:8 RTC (下部凝膠)進行。圖5G為暴露隔夜之15% SDS PAGE凝膠，其顯示以化學方式(HCl或NaOH)或用鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase；AP)、CapClip酶、核酸酶P1 (P1)或蛋白酶K (PK)之酶方式處理nsp12:nsp8複合物的結果。圖6A為用Instant Blue進行蛋白質染色(頂部)及暴露隔夜(下部)之15% SDS PAGE凝膠，其顯示nsp12、nsp7、nsp8之各種組合以及共價連接型式nsp7L8與α ³²P-UTP及poly(A) ₂₇RNA一起培育的結果。圖6B為如上文所描述進行之合成反應的結果，該合成反應在14%丙烯醯胺7M尿素凝膠上分離之量測nsp12:7:8複合物之活性。輸入模板RNA之大小顯示為p(A) ₂₇，其中p(U) ₅₄及p(U) ₈₁顯示多聚poly(U)合成產物。C表示反應對照，而PK顯示在用蛋白酶K蛋白質消化之後的相同樣品。圖6C為暴露隔夜之14%丙烯醯胺7M尿素-PAGE定序凝膠，其顯示使用SARS-CoV nsp12、nsp7及nsp8之各種組合以及共價連接型式之nsp7及8 (nsp7L8)與UTP (補充有α ³²P-UTP)及poly(A) ₂₇RNA一起在37℃培育1小時進行的合成反應。此等樣品對應於圖6a中所顯示之樣品。圖6D為暴露隔夜之14%丙烯醯胺7M 尿素-PAGE定序凝膠，其顯示用nsp12:7:8複合物與以下三種RNA受質進行之合成反應：i) poly(A) ₂₇模板RNA；ii)在3'端處經由用磷酸基置換3'OH而封端之poly(A) ₂₇模板RNA(poly(A) ₂₇-P)；及iii)在5'端處用 ³²P標記的poly(A) ₂₇模板( ³²P-poly(A) ₂₇)。經由添加補充有α ³²P-UTP (對於前兩種RNA)及僅冷UTP (對於 ³²P-poly(A) ₂₇)之UTP來量測合成。C表示反應對照，而PK顯示在用蛋白酶K蛋白質消化之後的相同樣品。圖6E為利用抗nsp8 (5A10)之變性SDS-PAGE西方墨點分析。在添加不同RNA及剩餘NTP (若有指示)之前，將nsp12:7:8複合物與UTP一起預培育30 min；poly(A) ₂₇(泳道1、2、11)、ST20poly(A) ₁₅(泳道3-6、12、13)、用cy3進行3'封端之ST20poly(A) ₁₅(泳道7-8)、ST20 (泳道9、10、14)。緊接地在RNA添加之後(時間0)或在培育60 min之後立即停止反應。僅當UTP與ST20poly(A) ₁₅給出時，合成以類似於poly(A)模板(紅色線，nsp8-p(U) _n)之方式的方式發生。圖6F為7M尿素-PAGE，其顯示分別在UTP、ATP或GTP (補充有對應α ³²P-NTP)之情況下，利用poly(A) ₂₇、poly(U) ₂₇或poly(C) ₂₇RNA模板之nsp12:7:8複合物的活性。由下而上，實心斑點分別顯示尿苷(紅色)、腺苷(黃色)及鳥苷(綠色)之三-、二-及單-磷酸。Asterix顯示具有相同色彩方案之pppNpN二核苷酸產物。圖6G為3個15% SDS PAGE凝膠，其顯示分別在UTP、ATP或GTP (補充有對應α ³²P-NTP)之情況下，在處理之前(左圖)及用蛋白酶K (中間圖)或核酸酶P1 (右圖)處理後，利用poly(A) ₂₇、poly(U) ₂₇或poly(C) ₂₇RNA模板之nsp12:7:8複合物的活性。上圖顯示在針對放射活性進行暴露之後的凝膠，下圖為針對總蛋白染色的相同凝膠。圖7A為暴露隔夜之變性SDS PAGE凝膠，其顯示在野生型(WT) nsp12或各種NiRAN活性位點突變體之情況下，12:7:8複合物對於poly(A) ₂₇模板RNA的活性。在凝膠頂部之箭頭顯示蛋白質引動的產物。圖7B為暴露隔夜之變性SDS PAGE凝膠，其顯示在添加RTC + UTP，隨後poly(A) ₂₇RNA (左)及RTC + poly(A) ₂₇RNA，隨後UTP之添加次序實驗時程之後的活性。蛋白酶K (PK)添加釋放蛋白質引動的產物。圖7C為暴露隔夜之變性SDS PAGE凝膠，其顯示圖7B中顯示之添加實驗次序之分析。將nsp12:7:8複合物與UTP或RNA一起在37℃培育30 min。在培育之後，添加互補試劑且在指示時間點停止反應。圖7D為暴露隔夜之變性SDS PAGE凝膠，其顯示在添加實驗之時程次序之後的活性，其顯示除SAA RdRp突變體以外，各種NiRAN突變體12:7:8複合物之活性。在RNA添加之前，將複合物與UTP一起預培育。PK表示用蛋白酶K消化之60 min時間點。圖7E為暴露隔夜之變性SDS PAGE凝膠，其顯示在添加實驗次序之後的活性，其顯示除SAA RdRp突變體以外，各種NiRAN突變體12:7:8複合物的活性。在野生型(WT) nsp12或各種NiRAN活性位點突變體之情況下，12:7:8複合物對於poly(A) ₂₇模板RNA之活性。將nsp12:7:8複合物與UTP或RNA一起在37℃培育30 min。在培育之後，添加互補試劑。圖7F為兩個線圖，其顯示在WT RTC及各種突變體之情況下，隨著時間推移蛋白質引動的活性(左圖)及重新合成活性(右圖)的定量。x軸為以分鐘為單位量測之時間，且y軸為螢光強度之對數。圖7G為基於圖7D中之p(U) ₅₄產物之兩個條形圖：相較於WT，NiRAN突變體之剩餘蛋白質引動的活性(左圖)；及重新合成活性之定量(右圖)。圖7H為藉由SARS-CoV RTC進行之兩個RNA合成起始路徑之草圖表示。在路徑1中，NiRAN結合的UTP (i)轉移至nsp8，得到UMP-nsp8 (ii)，其進一步定位至poly(A) 3'端(iii)以引動RNA合成(iv)。在路徑2中，ST20p(A)15序列驅動雜聚-polyA接合(v)處之nsp12 RdRp活性位點結合，以合成能夠引動互補股(vii)之RNA合成的pppGpU二核苷酸引子(vi)。ST20p(A)15二級結構基於RNAfold網頁伺服器。圖8A為SDS變性凝膠，其顯示隨著時間推移(0-50 min)，在變化濃度之pppUpU (0-100 µM)存在下評定之藉由nsp12:7:8複合物自poly(A) ₂₇模板合成poly(U) _nRNA。圖8B為繪製p(U) ₅₄(左)及pppUpU (右)產物之定量的2-線曲線，該定量用量測強度(y軸)之ImageQuant分析軟體進行，且繪製為以分鐘為單位量測之時間(x軸)之函數。圖9A為使用Typhoon FluorImager觀測到之20%丙烯醯胺7M尿素-PAGE凝膠。凝膠顯示在具有或不具有poly(A)尾之情況下自模板合成雜聚RNA。將模擬SARS-CoV-1或2基因體(ST20)之3'端由poly(A) ₁₄序列(ST20pA ₁₄)延伸之RNA模板與RTC及補充有α ³²P-UTP之NTP一起培育(左側10個泳道)。相同模板分別用磷酸基(ST20-3'P)或cy5螢光染料(STP20p(A) ₁₄cy5)進行3'-封端。使用p(A) ₂₇模板之對照顯示在凝膠之右側部分之3個泳道上。大小標記顯示為ST20及ST20p(A) ₁₅(最右側泳道)。顯示對應於凝膠頂部部分之在凝膠底部分離之UMP、pppUpU及UTP。圖9B為使用Typhoon FluorImager觀測到之20%丙烯醯胺7M尿素-PAGE凝膠。在頂部處為模擬SARS-CoV-1或2基因體-poly(A)接合序列之RNA模板，如所指示，將該RNA模板與RTC、NTP (補充有α ³²P-UTP)及10 µM化學合成之可靠的二核苷酸5'-三磷酸一起培育。圖10A為顯示相較於STP，鳥苷核苷酸前藥AT-511與活性代謝物AT-9010之間的結構差異的表圖10B為顯示RNA延伸產物之20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其量測相對於GTP及UTP作為第一核苷酸(左圖)、在具有(右圖)及不具有(中間圖)之後NTP之情況下，AT-9010及STP的併入產物。圖10C為顯示RNA延伸產物之20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其表示在引子延伸分析中NTP與AT9010之併入。圖10D為在AT-9010及AT-9010與GTP存在下，顯示RNA延伸產物之20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像。在GTP存在下，AT-9010為競爭性鳥苷受質，與GTP相差(discriminated) 22倍。圖10E為在STP及UTP (20:1) (顯示STP在此比率下不為競爭性的)存在下，顯示RNA延伸產物之20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像。圖11A為顯示RNA延伸產物之20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其表示在引子延伸分析中NTP與AT9010之併入。左側之凝膠顯示其中AT9010與所有NTP一起使用之實驗的結果，且右側之凝膠顯示其中AT9010與ATP/CTP/UTP (無GTP)一起使用之實驗的結果。各泳道為以秒為單位量測之時間點，且各凝膠顯示不同濃度之AT9010 (0、50、250 µM)的結果。圖11B為比較圖11A中量測之RNA延伸產物條帶之總和的曲線。x軸為以分鐘為單位量測之時間，且y軸為數值量測之產物條帶的總和。圖11C為使用Typhoon FluorImager觀測到之20%丙烯醯胺7M尿素-PAGE凝膠，其顯示在指示濃度下單獨AT-9010(10 µM，左)或在NTP (各自50 µM)存在下之併入。藉由比較在兩個濃度下及在三個時間點處，AT-9010插入相對於全長產物之量，來計算GTP相對於AT-9010併入之倍數偏好。圖11D為使用Typhoon FluorImager觀測到之20%丙烯醯胺7M尿素-PAGE凝膠，其顯示在指示濃度下，在NTP存在下AT-9010之併入，顯示RNA鏈終止。藉由比較在兩個濃度下及在三個時間點處，AT-9010插入相對於全長產物之量，來計算GTP相對於AT-9010併入之倍數偏好。圖11E為使用Typhoon FluorImager觀測到之20%丙烯醯胺7M尿素-PAGE凝膠，其顯示AT-9010及STP經RTC併入之時程，隨後ExoN (標記為EXO)切除時程。圖11F為使用Typhoon FluorImager觀測到之20%丙烯醯胺7M尿素-PAGE凝膠，其顯示在指示濃度下在NTP存在下之STP的併入，顯示無顯著TNA鏈終止。圖11G為顯示在圖11E中顯示之ExoN切除之後剩餘產物之定量的曲線圖。x軸為時間，且y軸為剩餘產物%。圖12A為顯示RNA延伸產物之20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其表示在引子延伸分析中NTP與2'C-Me 2'F-UTP (索非布韋)之併入。凝膠顯示其中2'C-Me 2'F-UTP與ATP/CTP/GTP (無UTP)一起使用之實驗之結果。各泳道為以秒為單位量測之時間點，且各凝膠顯示不同濃度之2'C-Me 2'F-UTP (0、10、50 µM)之結果。圖12B為比較圖12A中量測之RNA延伸產物條帶之總和的曲線。x軸為以分鐘為單位量測之時間，且y軸為數值量測之產物條帶的總和。圖13A為20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，該凝膠顯示在與增加濃度之AT-9010或STP (n=3，顯示SD)競爭下，在5 µM恆定濃度之UTP (補充有α ³²P-NTP)之情況下，nsp8經nsp12標記。凝膠顯示3個個體資料集之表示。總強度用ImageQuant定量，且以剩餘活性% (y軸)繪製。使用5 µM nsp12與5倍莫耳過量之nsp8之IC ₅₀計算值為0.87 ± 0.1 (對於AT-9010)及4.6 ± 0.2 (對於STP) (5倍差)。x軸為以µM為單位量測之抑制劑之對數標度。圖13B為20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其顯示在與增加濃度之抑制劑(AT-9010、STP或 ^m7GTP)競爭下，用恆定濃度之補充有α ³²P-NTP之GTP (頂部)或UTP (下部) (總共5 µM)，5倍莫耳過量之nsp8經nsp12 (5 µM)標記。圖13C顯示量測用ImageQuant軟體定量之總標記強度之曲線圖，且以剩餘活性% (y軸)繪製。AT-9010針對GTP及UTP之IC ₅₀計算值分別為2.7 ± 0.3及1.9 ± 0.1，且STP針對GTP及UTP之IC ₅₀計算值分別為5 ± 0.8及8.2 ± 1.4。資料係自兩個個別重複計算，其中每重複最少6個點。x軸為以µM為單位量測之抑制劑之對數標度。圖13D顯示插圖中之放射性標記的凝膠，其顯示在增加濃度之AT-9010或STP存在下，Sars-CoV-2 nsp9經nsp12標記。放射性標記之定量繪製為抑制劑濃度之函數。總標記強度用ImageQuant軟體定量，且相較於抑制劑濃度(x軸)以剩餘活性% (y軸)繪製。圖13E顯示插圖中之放射性標記的凝膠，其顯示在增加濃度之AT-9010或STP存在下，Sars-CoV-2 nsp8經nsp12標記。放射性標記之定量繪製為抑制劑濃度之函數。總標記強度用ImageQuant軟體定量，且相較於抑制劑濃度(x軸)以剩餘活性% (y軸)繪製。圖13F為一組量測在不同天然NTP或抑制劑(x軸)存在下，Sars-CoV-1 nsp12 WT (左)、NiRAN突變體K73A (中間)及RdRp突變體SAA (右)之熱穩定性的條形圖。用5 mM MgCl ₂及0.5 mM MnCl ₂進行反應，重複三次，顯示SD。y軸以ΔT _m(℃)量測。圖13G為一組量測在不同天然NTP或抑制劑(x軸)存在下，Sars CoV-1 nsp12 WT (左)、NiRAN突變體K73A (中間)及RdRp突變體SAA (右)之熱穩定性的條形圖。用5 mM MgCl ₂進行反應，重複三次，顯示SD。y軸以ΔT _m(℃)量測。圖13H為量測在不同天然NTP或抑制劑(x軸)存在下Sars CoV-2 nsp12 WT之熱穩定性之條形圖。用5 mM MgCl ₂進行反應，重複三次，顯示SD。y軸以ΔT _m(℃)量測。圖14A為20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其顯示在AT-9010及STP之情況下，自poly(A) ₂₇模板進行之nsp12:7:8 RTC合成的抑制。凝膠為2個獨立實驗之表示。圖14B為20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其顯示在變化濃度之AT-9010或STP之情況下，RNA合成的抑制，對於在UTP及GTP (200 µM，補充有α ³²P-NTP)存在下，poly(A) ₂₇及poly(C) ₂₇模板比較WT及NiRAN突變複合物。圖14C為20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其顯示在AT-9010及STP之情況下，自poly(C) ₂₇模板進行之nsp12:7:8 RTC合成的抑制。凝膠為3個獨立實驗之表示。圖14D為20% (wt/vol)聚丙烯醯胺/7 M尿素凝膠之磷光體像，其顯示在WT (頂部凝膠)或NiRAN突變體(K73A) nsp12 (下部凝膠)之情況下，自ST20p(A) ₁₅模板之合成經nsp12:7:8 RTC抑制。下圖表示兩個獨立實驗之平均活性，其中相較於無抑制劑對照，計算三個時間點之差異。x軸為M抑制劑，且y軸為抑制百分比。圖15A為在具有或不具有AT9010之情況下之重新分析之放射性標記的RNA聚合產物的1%瓊脂糖-甲醛凝膠。左側之凝膠顯示在50 min時程內不具有AT9010情況下之放射性標記的RNA聚合產物。左側之凝膠顯示在50 min時程內具有400 µM AT9010情況下之放射性標記的RNA聚合產物。圖15B為利用增加濃度之AT9010及2'C-Me 2'F-UTP (索非布韋)之蛋白質引動的RNA合成分析之放射性標記的RNA聚合產物的1%瓊脂糖-甲醛凝膠。左側之凝膠顯示其中使用AT9010之實驗之結果。各泳道表示在升高濃度之AT9010 (0、0.625、1.25、2.5、5及10 µM)下的結果。右側之凝膠顯示其中使用2'C-Me 2'F-UTP之實驗之結果。各泳道表示在升高濃度之2'C-Me 2'F-UTP (10、20、40、80、160及320 µM)下之結果。圖15C為測試不同聚合酶複合物組分之RNA合成分析之放射性標記的RNA聚合產物的1%瓊脂糖-甲醛凝膠。泳道1顯示無引子非依賴性合成。泳道2顯示引子非依賴性合成。泳道3顯示引子非依賴性合成以及蛋白質引動的合成。圖16A為SARS-CoV-2 nsp7-(nsp8) ₂-nsp12/RNA/NTP四元複合物之2.98 Å解析度冷凍EM結構。圖16B為nsp7-(nsp8)2-nsp12:AT-9010封端之RNA:(AT9010) ₂複合物之冷凍EM結構之帶狀表示。圓形區域突出顯示且放大，顯示RdRp活性位點(左下方)中兩個AT9010分子之密度圖及棒狀表示，且一個AT-9010共價併入RNA股(右上方)中。圖16C為RNA AT-9010與nsp12之間的Nucplot分子分析。圖16D顯示AT-9010分子之接觸之ligplot 2D分析。圖16E顯示具有密度圖之與NiRAN域結合的AT-9010 (棒)。圖16F顯示，一個AT9010分子在5'-單磷酸形式下併入引子RNA股中，且終止RNA延伸。在NTP結合位點中，AT-9010分子之棒狀表示由一個離子配位。圖16G顯示AT-9010分子與瑞德西韋之重疊。核糖之位置移位45°，且磷酸處於併入後位置。圖17A顯示繪製於NiRAN結構上之序列保守性(圖表中概述)。序列比對衍生自若干假激酶結構及NiRAN之結構重疊。保守殘基為最深的陰影。圖17B顯示NiRAN結構之帶狀及表面表示。催化殘基經數值標記且以棒狀顯示(左圖)。NiRAN離子之靜電表示呈深色陰影球(右圖)。催化位點自離子朝向平坦開口行進。離子下方為空腔之入口。圖17C顯示NiRAN:GDP複合物之靜電表示以及GDP、K73及Mg ²⁺離子之間的相互作用的詳細表示。出於比較目的顯示具有ATP之假激酶SelO複合物(不可水解的類似物)。除了翻轉之核糖以外，總體位置類似。圖17D顯示在NiRAN處之AT-9010結合之詳細棒狀表示，以及空腔中之其分片表示(sliced representation)。圖17E顯示NiRAN之空腔中之AT-9010結合之詳細相互作用的Ligplot 2D表示。圖18為顯示如實例27中所描述，在感染後24及48小時，HUH 7.5細胞中之SARS-CoV-2複製的圖。y軸為循環臨限值(cycle threshold；CT)，且x軸為SARS-CoV-2稀釋度。圖19顯示如實例27中所論述及表10所顯示之AT-511、瑞德西韋、GC 376及莫努拉韋之病毒抑制。y軸為以百分比為單位量測之病毒RNA抑制，且x軸為以μM量測之對數濃度。圖20A為當如實例27中所描述應用＞1%之頻率低限(frequency threshold)時，在AT-511、瑞德西韋、GC 376及莫努拉韋存在下觀測到之突變數目。「頻率低限」定義為在覆蓋給出位置之至少0.1%讀段中觀測到之基因體位置處存在的突變。x軸標記有化合物，且y軸標記有突變數目。圖20B為當如實例27中所描述應用＞0.5%之頻率低限時，在AT-511、瑞德西韋、GC 376及莫努拉韋存在下觀測到之突變數目。「頻率低限」定義為在覆蓋給出位置之至少0.1%讀段中觀測到之基因體位置處存在的突變。x軸標記有化合物，且y軸標記有突變數目。圖20C為當如實例27中所描述應用＞0.2%之頻率低限時，在AT-511、瑞德西韋、GC 376及莫努拉韋存在下觀測到之突變數目。「頻率低限」定義為在覆蓋給出位置之至少0.1%讀段中觀測到之基因體位置處存在的突變。x軸標記有化合物，且y軸標記有突變數目。圖20D為當如實例27中所描述應用＞0.1%之頻率低限時，在AT-511、瑞德西韋、GC 376及莫努拉韋存在下觀測到之突變數目。「頻率低限」定義為在覆蓋給出位置之至少0.1%讀段中觀測到之基因體位置處存在的突變。x軸標記有化合物，且y軸標記有突變數目。圖21為顯示在以550 mg BID最後一次經口投與AT-527 2.5天之4及12 h後，血漿及肺上皮黏液(epithelial lining fluid；ELF)中之AT-527 (化合物2A)代謝物AT-273之濃度(µM)的圖。

Claims

一種式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式的藥物，該治療包含投與有效量的該式I化合物，其中式I為：
式 I其中 R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基。
如請求項1之用途，其中該化合物為
(化合物1)，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之用途，其中該化合物為
(化合物2)。
如請求項1之用途，其中該化合物為
(化合物1A)，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之用途，其中該化合物為
(化合物1B)，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之用途，其中該化合物為
(化合物2A)。
如請求項1之用途，其中該化合物為
(化合物2B)。
一種式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式的藥物，該治療包含投與有效量的該式II化合物，其中式II為：
(式II)，其中： R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基。
如請求項8之用途，其中該化合物為：
(化合物3)，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項8之用途，其中該化合物為：
(化合物4)。
如請求項8之用途，其中該化合物為：
(化合物3A)，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項8之用途，其中該化合物為：
(化合物3B)，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項8之用途，其中該化合物為：
(化合物4A)。
如請求項8之用途，其中該化合物為：
(化合物4B)。
一種式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式的藥物，該治療包含投與有效量的該式III化合物，其中式III為：
(式III)，或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基； X選自F、Cl、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基及C ₁-C ₃羥基烷基；及 Y為Cl或F。
一種式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式的藥物，該治療包含投與有效量的該式IV化合物，其中式IV為：
(式IV)，其中 R ⁶選自氫、-C(O)R ^6A、-C(O)OR ^6A、C _1-6烷基、-CH ₂-O-R ^6A； R ^6A選自氫、C _1-6烷基、C ₁-C ₆鹵烷基(例如-CHCl ₂、-CCl ₃、-CH ₂Cl、-CF ₃、-CHF ₂、-CH ₂F)、芳基、芳基(C _1-6烷基)-，其中芳基視情況經選自以下一個取代基取代：烷氧基、羥基、硝基、溴、氯、氟、疊氮基及鹵烷基； R ⁷為NH ₂、H或-NR ⁸R ⁹； R ⁸及R ⁹獨立地選自氫、C _1-6烷基、-C(O)R ^6A及-C(O)OR ^6A； Y選自F及Cl； Z選自甲基、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基、C ₁-C ₃羥基烷基及鹵素(包括Cl及F)；及 R ¹、R ²、R ³、R ^4a、R ^4b及R ⁵如本文所定義。
一種式V、式VI或式VII化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式的藥物，該治療包含投與有效量的式V、式VI或式VII化合物，其中式V、式VI及式VII為：
(式V)、
(式VI)、
(式VII)，其中： R ¹⁰選自
及R ^10A； R ^10A為活體內代謝成單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯之穩定的磷酸酯前藥； R ¹¹選自氫及R ¹；及 R ¹選自C ₁-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基。
一種式VIII化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV-2病毒突變株或抗性形式的藥物，該治療包含投與有效量的式VIII化合物，其中式VIII為：
(式VIII)，或其醫藥學上可接受之鹽：其中 R ¹選自C _1-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基及-C(O)C ₁-C ₆烷基； R ²為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _3-7環烷基、芳基(包括苯基及萘基)、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、雜芳基或雜烷基； R ³為氫或C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)； R ^4a及R ^4b獨立地選自氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)及C _3-7環烷基；及 R ⁵為氫、C _1-6烷基(包括甲基、乙基、丙基及異丙基)、C _1-6鹵烷基、C _3-7環烷基、芳基(C ₁-C ₄烷基)-、芳基、雜芳基或雜烷基； R ⁶選自氫、-C(O)R ^6A、-C(O)OR ^6A、C _1-6烷基、-CH ₂-O-R ^6A； R ^6A選自氫、C _1-6烷基、C ₁-C ₆鹵烷基(例如-CHCl ₂、-CCl ₃、-CH ₂Cl、-CF ₃、-CHF ₂、-CH ₂F)、芳基、芳基(C _1-6烷基)-，其中芳基視情況經選自以下一個取代基取代：烷氧基、羥基、硝基、溴、氯、氟、疊氮基及鹵烷基； R ⁷為NH ₂、H或-NR ⁸R ⁹； R ⁸及R ⁹獨立地選自氫、C _1-6烷基、-C(O)R ^6A及-C(O)OR ^6A； Y選自F及Cl；及 Z選自甲基、C ₁-C ₃鹵烷基(包括C _1-3氟烷基及C _1-3氯烷基，諸如CH ₂F、CHF ₂、CF ₃、CH ₂CF ₃、CH ₂CHF ₂、CH ₂CH ₂F、CF ₂CH ₃、CF ₂CF ₃及CH ₂Cl)、C ₂-C ₄烯基、C ₂-C ₄炔基、C ₁-C ₃羥基烷基及鹵素(包括Cl及F)。
如請求項18之用途，其中該SARS-CoV-2病毒為SARS-CoV-2之突變株。
一種化合物之用途，其用於製造用於治療或預防人類中SARS-CoV感染之藥物，其包含以下步驟：(a)鑑別能夠抑制套病毒RdRp相關核苷酸轉移酶(NiRAN)域介導之嚴重急性呼吸道症候群(severe acute respiratory syndrome；SARS)相關冠狀病毒之非結構蛋白(nsp) 12之活性的化合物，其包含測定該化合物抑制NiRAN域介導的活性的能力，其中該NiRAN域介導的活性選自：(i)用天然尿苷三磷酸(UTP)對非結構蛋白8 (nsp8)進行UMP化；(ii)用天然尿苷三磷酸(UTP)對nsp8進行核苷酸化；(iii)藉由NiRAN域，用天然鳥苷-三磷酸(GTP)對nsp8進行核苷酸化；(iv)天然GTP轉移至非結構蛋白(nsp) 8；(v)天然UTP轉移至nsp 8；及(vi)起始或完成蛋白質引動的RNA合成；或其組合；其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，能夠抑制一或多個選自(i)至(vi)之NiRAN域介導的活性至少25%或更多的化合物係鑑別為能夠抑制NiRAN域介導的活性的化合物；及 (b)向有需要之人類投與有效量之該化合物。
如請求項20之用途，其中鑑別為能夠抑制NiRAN域介導之活性之該化合物防止蛋白質引動的RNA合成(protein primed RNA synthesis)之起始或完成。
如請求項20或21之用途，其中該化合物亦用來抑制NiRAN非依賴性RNA合成中二核苷酸重新合成或RNA依賴性RNA合成之鏈終止。
如請求項20至22中任一項之用途，其中該化合物為核苷酸。
如請求項20至23中任一項之用途，其中該核苷酸為基於鳥苷之核苷酸。
一種化合物之用途，其用於製造用於治療或預防人類中SARS-CoV感染之藥物，其包含以下步驟： (a)： i. 選擇核苷酸； ii. 活體外篩選該核苷酸以判定該化合物是否抑制該病毒之NiRAN域介導的活性；其中若該化合物呈現以下，則判定其抑制NiRAN域介導的活性：(i)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP及/或GTP與NiRAN之活性區域的結合至少25%或更多；(ii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP與NiRAN之活性UMP化位點的結合至少25%或更多；(iii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然NTP與NiRAN之活性NMP化位點的結合至少25%或更多；(iv)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP及/或GTP與該NiRAN域中之不變的離胺酸殘基K73的結合至少25%或更多；(v)防止或降低天然UTP及/或GTP進入該NiRAN域的該活性位點；(vi)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP及/或GTP進入該NiRAN域的該活性位點至少25%或更多，其中該活性位點為襯有以下殘基的袋：K73、R74、H75、N79、E83、R116、N209、G214、D218、F219及F222；(vii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止或降低天然UTP及/或GTP進入該NiRAN域之該活性位點至少25%或更多，其中該活性位點為襯有以下殘基的袋：K50、R55、T120、N209、Y217；(viii)與不變的離胺酸殘基K73結合；(ix)與該NiRAN域的該活性位點袋結合；(x)與該NiRAN域的該活性位點袋結合，其中該活性位點袋襯有以下殘基：K73、R74、H75、N79、E83、R116、N209、G214、D218、F219及F222；(xi)與該NiRAN域的該活性位點袋結合，其中該活性位點袋襯有以下殘基：K50、R55、T120、N209、Y217；(xii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，藉由該NiRAN域防止天然UTP及/或GTP轉移至少25%或更多；(xiii)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止天然GTP及/或UTP轉移至nsp8至少25%或更多；或(xiv)如活體外分析中所量測及相較於無該化合物的相同分析，防止蛋白質引動的RNA合成之起始或完成至少25%或更多；或其組合；及 (b)若該化合物抑制該病毒之該NiRAN域介導的活性，則向該有需要之人類投與該化合物。
如請求項25之用途，其中該核苷酸為基於鳥苷之核苷酸。
如請求項25至26之用途，其中該核苷酸為穩定的磷酸酯前藥。
如請求項25至27之用途，其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，該化合物抑制蛋白質引動的RNA合成及/或引子非依賴性RNA合成至少25%或更多。
如請求項25至28之用途，其中如活體外分析中所量測及相較於無該化合物之相同分析，該化合物抑制蛋白質引動的RNA合成及/或引子非依賴性RNA合成以及RNA依賴性RNA鏈延伸至少25%或更多。
如請求項25至28中任一項之用途，其中該化合物不為式I化合物。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：α (Pango譜系：B.1.1.7)、β (Pango譜系：B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)、γ (Pango譜系：P.1、P.1.1、P.1.2)、δ (Pango譜系：B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3)、η (Pango譜系：B.1.525)、ι (Pango譜系：B.1.526)、κ (Pango譜系：B.1.617.1)、λ (Pango譜系：C.37)、ε (Pango譜系：B.1.427、B.1.429)、ζ (Pango譜系：P.2)、θ (Pango譜系：P.3)或μ (Pango譜系：B.1.621)。
如請求項1至19之用途，其中該病毒為選自以下之SARS-CoV-2變異株：Pango譜系R.1、R.2、B.1.466.2、B.1.1.318、B.1.1.519、C.36.3、C.36.3.1、B.1.214.2、B.1.1.523、B.1.617.3、B.1.619、B.1.620、B.1.621、A.23.1 (+E484K)、A.27、A.28、C.16、B.1.351 (+P384L)、B.1351 (+E516Q)、B.1.1.7 (+L452R)、B.1.1.7 (+S494P)、C.36 (+L452R)、AT.1、B.1.526.1、B.1.526.2、B.1.1.318、B.1.1.519、AV.1、P.1 (+P681H)、B.1.671.2 (+K417N)或C.1.2。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2 δ變體(Pango譜系：B.1.617.2、AY.1、AY.2、AY.3)。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2 λ變體(Pango譜系：C.37)。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2 μ變體(Pango譜系：B.1.621)。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2病毒，其具有選自以下之nsp12蛋白胺基酸取代：S861X，其中X為任何胺基酸；胺基酸取代F480V；胺基酸取代V557L；胺基酸取代D484Y；胺基酸取代F480X，其中X=任何胺基酸；胺基酸取代V557X，其中X=任何胺基酸；胺基酸取代S861X，其中X為任何胺基酸；及胺基酸取代D484X，其中X=任何胺基酸。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2病毒，其在該nsp12蛋白之該RdRp域的該活性位點中具有突變。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2病毒，其具有nsp12蛋白胺基酸取代F480V。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2病毒，其具有nsp12蛋白胺基酸取代V557L。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2病毒，其具有nsp12蛋白胺基酸取代D484Y。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2病毒，其具有nsp12蛋白胺基酸取代E802D。
如請求項1至30之用途，其中該病毒為SARS-CoV-2病毒，其具有nsp12蛋白胺基酸取代E802A。
如請求項1至42之用途，其中該用途進一步包含投與有效量之至少一種額外活性劑。
如請求項1至43之用途，其中該額外活性劑選自以下：馬瑞利單抗(mavrilimumab)、瑞德西韋(remdesivir)、巴瑞替尼(baricitinib)、地塞米松(dexamethasone)、普賴松(prednisone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、皮質醇(hydrocortisone)、托西利單抗(tocilizumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、賽瑞單抗(sarilumab)、卡瑞單抗(casirivimab)、依德單抗(imdevimab)、卡那單抗(canakinumab)、阿奇黴素(azithromycin)、氯奎(chloroquine)/羥氯奎(hydroxychloroquine)、阿莫地喹(amodiaquine)、青蒿琥酯(artesunate)、咯匹那韋(lopinavir)、利托那韋(ritonavir)、法匹拉韋(favipiravir)、利巴韋林(ribavirin)、EIDD-2801、氯硝柳胺(niclosamide)、硝唑尼特(nitazoxanide)、奧司他韋(oseltamivir)、艾弗麥克素(ivermectin)、莫努拉韋(molnupiravir)、重組ACE-2、索曲韋單抗(sotrovimab)、布地奈德(budesonide)、AZD7442、多西環素(doxycycline)；干擾素、瑞達韋單抗(regdanvimab)、阿那白滯素(anakinra)、盧利替尼(ruxolitinib)、托法替尼(tofacitinib)、阿卡拉布魯替尼(acalabrutinib)、伊馬替尼(imatinib)、博瑞索卡替尼(brensocatib)、拉瓦利單抗(ravulizumab)、奈米路單抗(namilumab)、英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、奧替利單抗(otilimab)、medi3506、巴尼單抗(bamlanivimab)、艾特森韋單抗(etesevimab)、索曲韋單抗(sotrovimab)、樂利單抗(leronlimab)、里森基單抗(Risankizumab)、朗齊魯單抗(lenzilumab)、IMU-838、氟伏沙明(fluvoxamine)、EXO-CD24、樂利單抗、秋水仙鹼(colchicine)、反丁烯二酸二甲酯、血管收縮素轉化酶抑制劑/血管收縮素II受體阻斷劑、士他汀(statin)、克羅匹多(clopidogrel)、抗凝劑、貝西替尼(bemcentinib)、奧美拉唑(omeprazole)、法莫替丁(famotidine)、姿魯克普蘭(zilucoplan)、抗壞血酸/維生素C、維生素D3、阿肽地爾(aviptadi)、特瑞匹坦(tradipitant)、一氧化氮、氟伏沙明(fluvoxamine)、普克魯胺(proxalutamide)、魯克斯特(ruconest)、TRV027、氟伏沙明、異氟醚(isoflurane)、七氟烷(sevoflurane)、VIR-7831 (GSK4182136)、LSALT肽、BRII-196/BRII-198、AZD7442 (IV)、SNG001、AZD7442 (IM)、卡莫司他(camostat)、C135-LS + C144-LS、SAB-185、NP-120 (芬普地爾(fenprodil))、氯沙坦(losartan)、奧馬珠單抗(omalizumab)、盧利替尼(ruxolitinib)、同種異體骨髓間葉基質細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell；BM-MSC)、同種異體臍帶間葉基質細胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cell；UC-MSC)、伊科奇單抗(ixekizumab)/阿普司特(apremilast)、CPI-006、坎地沙坦(cadesartan)、纈沙坦(valsartan)、雷米普利(ramipril)、培哚普利(perindopril)、依貝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(losartan)、依那普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、瑞米西爾-L (remestemcel-L)、達格列淨(dapagliflozin)、艾希匹德(alcetrapid)、百慕時(pulmozyme) (去氧核糖酶α)、EB05、全氟戊烷(perflenapent) (NANO2)、呋喃苯胺酸(furosemide)、peg干擾素λ-1A (peginterferon Lambda-1A)、樂複能(novaferon) (嵌合干擾素α)、LAU-7B (非瑞替尼(fenretinide))、牛脂質提取物界面活性劑懸浮液(bovine lipid extract surfactant suspension；BLES)、環索奈德(ciclesonide)、MK-4482、奧紮莫耳(ozanimol)、希托洛(hiltonol) (多核糖肌苷酸(Polyriboinosinic acid)-多核糖胞苷酸(polyribocytidylic acid) (聚ICLC)、茵諾普(innohep) (亭紮肝素鈉(tinzaparin sodium))、洛維諾西(lovenox) (依諾肝素鈉(enoxaparin sodium))、法安明(fragmin) (達肝素鈉(dalteparin sodium))、肝素鈉、二胺苯碸(dapsone)、利伐沙班(rivaroxaban)、膽鈣化醇(cholecalciferol)、方達珀魯(fondaparinux)、茵諾普、法安明(fragmin)、SY-005 (重組人類磷脂結合蛋白(Annexin) A5)、辛伐他汀(simvastatin)、替卡格雷(ticagrelor)、雷米普利(ramipril)、賴諾普利(lisinopril)、培哚普利特丁胺(perindopril erbumine)、依那普利(enalapril)、群多普利(trandolapril)、卡托普利(captopril)、纈沙坦(valsatan)、坎地沙坦酯(candesartan cilexetil)、依貝沙坦(irbesartan)、替米沙坦(telmisartan)、奧美沙坦美度米(olmesartan medoxomil)、RVX000222 (阿帕他隆(Apabetalone))、S-1226 (二氧化碳潘氟隆(Perflubron))、胎盤源性蛻膜基質細胞(decidual stromal cell；DSC)、索馬魯肽(ozempic/semaglutide)、(Vascepa™) (二十碳五烯酸(icosapent))、PF-07304814、PF-07321332、EDP-235、PBI-0451、ALG-097111、索曲韋單抗(sotrovimab) (VIR-7831)、VIR-7832、BRII-196、BRII-198、ADG20、ADG10或VIR-7831，或其組合。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為瑞德西韋。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為皮質類固醇。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為地塞米松。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為普賴松、甲基普賴蘇穠或皮質醇。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為巴瑞替尼。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為托西利單抗。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為莫努拉韋。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為索非布韋。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為GC376。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為PF-07304814。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為PF-07321332。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為EDP-235。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為PBI-0451。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為ALG-097111。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為索曲韋單抗(VIR-7831)。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為VIR-7832。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為BRII-196。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為BRII-198。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為ADG20。
如請求項43至44之用途，其中該額外活性劑為ADG10。
如請求項1至64之用途，其中相較於在天然病毒群體中觀測到之突變率，用於投與之化合物不會驅動或誘導該SARS-CoV病毒進一步突變。
如請求項1至65之用途，其中該SARS-CoV病毒已對一或多種抗病毒治療產生抗性。
如請求項66之用途，其中該SARS-CoV病毒對瑞德西韋具有抗性。
如請求項66之用途，其中該SARS-CoV病毒對莫努拉韋具有抗性。
一種鑑別能夠抑制或預防SARS-CoV感染之化合物之方法，其包含： i. 於活體外使該化合物在UTP及poly(A) RNA模板存在下與SARS相關冠狀病毒之nsp12、nsp7及nsp8蛋白接觸；及 ii. 判定該化合物是否在UTP存在下抑制poly(A) RNA模板上之重新RNA合成；其中如活體外分析中所量測，相較於無該化合物之相同分析，在UTP存在下該poly(A) RNA模板上之蛋白質引動的RNA合成受到抑制至少25%或更多即指示化合物能夠抑制蛋白質引動的RNA合成。
如請求項69之方法，其中該nsp12、nsp7及nsp8係以nsp12:7L8:8聚合酶複合物形式提供。
如請求項69之方法，其中nsp12:7L8:8聚合酶複合物呈1:3:3莫耳比或1:3:6莫耳比。
如請求項69至71之方法，其中若相較於其中不存在該化合物之對照，該化合物降低該poly(A) RNA模板之引子非依賴性RNA合成至少50%或更多，則該化合物係鑑別為能夠抑制蛋白質引動的RNA合成。
如請求項69至71之方法，其中相較於其中不存在該化合物之對照，該化合物降低該poly(A) RNA模板之蛋白質引動的RNA合成至少90%或更多。
如請求項69至73之方法，其中該SARS-CoV感染為SARS-CoV-2感染。
一種用於治療或預防有需要之人類中SARS-CoV感染之方法，其包含：(i)選擇呈現破壞NiRAN介導之蛋白質引動的RNA合成之作用機制的核苷酸藥物；及(ii)向宿主投與有效量的該藥物以治療或預防該感染。
如請求項75之方法，其中該SARS-CoV感染為SARS-CoV-2感染。