TW202223377A - 異天冬胺酸之檢測方法 - Google Patents

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Abstract

本文揭露了處理蛋白質和檢測蛋白質中的異天冬胺酸（ isoAsp）之方法。還揭露了被配置用於處理蛋白質和檢測蛋白質中的 isoAsp之質譜系統。

Description

異天冬胺酸之檢測方法
蛋白質翻譯後修飾（PTM）如精胺酸甲基化 1、磷酸化 2、泛蛋白化 3、糖基化 4-5和O-連接的β-N-乙醯胺基葡萄糖修飾 6-7在細胞生物學中發揮的功能現在已經得以很好地確立。蛋白質也可以發生自發的化學降解，在老化後或在應激條件下可容易檢測到 9。當前文獻包含許多關於在細胞蛋白質和生物治療劑二者中鑒定的此類化學修飾的表徵的研究 10-12。此類化學修飾之實例包括甲硫胺酸和色胺酸氧化、天冬醯胺脫醯胺以及天冬胺酸異構化 13-16。大多數穩定的修飾表現出非常特定的品質變化，如色胺酸（Trp）和甲硫胺酸（Met）氧化為+15.994 Da，以及天冬醯胺（Asn）脫醯胺為+0.984 Da 18。但是，在天冬胺酸異構化的情況下，修飾後品質沒有變化。
在用於人類應用的生物治療劑的開發期間，儘早鑒定對候選分子的活性和穩定性產生負面影響的化學負擔係有利的。通常會對蛋白質進行一系列強制降解研究，以確定它們的穩定性、適當的保質期、適當的儲存和運輸條件，這一過程稱為「分子評估」 30-31。受化學修飾影響的分子可能會被取消選擇或進行另一輪蛋白質工程以減輕不利影響 32。大多數化學修飾可以藉由液相層析-串聯質譜（LC-MS/MS）和數據處理進行鑒定 33-35。天冬胺酸異構化的鑒定提出了更具挑戰性的問題。由於修飾後產生的結構影響，幾種治療性mAb中的 isoAsp形成已顯示會導致活性喪失 36-38。因此，必須仔細監測和控制其在生物治療劑製造期間的發生 39。
因此，本領域需要檢測異天冬胺酸（ isoAsp）之有效方法。
在一方面，本文揭露了處理蛋白質之方法。在各種實施方式中，該方法包括：(a) 將蛋白質消化成肽，(b) 對該等肽進行質譜並藉由質譜（例如串聯質譜（MS/MS））測量異天冬胺酸（ isoAsp）N端肽鍵的碎裂；(c) 將該碎裂與閾值進行比較，其中該碎裂超過該閾值指示在所分析的肽中或最終在該蛋白質中存在該 isoAsp。在一些實施方式中，該等方法還包括 (d) 拒絕包含該 isoAsp的蛋白質，或改造該蛋白質以去除該 isoAsp。
在各種實施方式中，本文所述之方法還包括在 (b) 之前減少進行質譜的肽的電荷（z）。在一些實施方式中，在 (b) 中進行質譜的該等肽帶單電荷。在任何描述的方法中，該碎裂測量為b系列峰、y系列峰或兩者。
所揭露的方法可以用任何類型的質譜方法進行。例如，用於本文所述方法的質譜包括基質輔助雷射脫附/電離飛行時間/飛行時間（MALDI-TOF/TOF）或液相層析-質譜/質譜（LC-MS/MS）。在相關實施方式中，LC-MS/MS包括電灑電離。
在任何揭露的方法中，將蛋白質消化成肽可以在蛋白質的熱應激之後、然後用蛋白水解酶進行酶消化進行。例如，該蛋白水解酶包括胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜酶或彈性蛋白酶中的至少一種。
在各種實施方式中，在該蛋白質的胺基酸序列中該 isoAsp不與天冬醯胺相鄰和/或在該蛋白質的胺基酸序列中該 isoAsp不與蘇胺酸相鄰。
在各種實施方式中，在該蛋白質的胺基酸序列中該 isoAsp與相鄰的天冬胺酸殘基相鄰。在相關實施方式中，該相鄰的天冬胺酸係 isoAsp或L-Asp。
在揭露的方法中，肽碎裂的閾值水平用作確定 isoAsp是否存在於蛋白質中的標準。例如，閾值可為對照肽如合成肽的肽鍵的碎裂水平。在各種實施方式中，當 isoAsp N端的碎裂肽鍵的b峰和/或y峰存在時，該肽的碎裂超過該閾值。
在各種實施方式中，本文所述之方法還包括對對照肽進行質譜，從而獲得該對照肽的肽鍵的碎裂。在各種實施方式中，該對照肽不經受熱應激。在相關實施方式中，該對照肽係合成肽。在各種實施方式中，該合成肽可用於與一或多種蛋白質樣本進行比較。在各種實施方式中，該閾值為對照肽中L-Asp N端肽鍵的碎裂水平。在各種實施方式中，該對照肽的肽鍵的碎裂作為電子存儲值提供，或者由經受與被測蛋白質樣本相同的質譜方法的參考肽提供。
在任何揭露的方法中，蛋白質包括以下或由以下組成：抗體、抗體蛋白產物、雙特異性T細胞接合器（BiTE®）分子、抗體片段、抗體融合肽或其抗原結合片段、肽、生長因子或細胞介素。在相關實施方式中，該抗體係多株或單株抗體。如本文所用，術語「抗體蛋白產物」係指在各種情況下基於抗體的架構但在自然界中未發現的若干抗體替代物中的任一種。在一些方面，該抗體蛋白產物的分子量在至少約12 kDa - 1 MDa，例如至少約12 kDa - 750 KDa、至少約12 kDa - 250 kDa或至少約12 kDa - 150 kDa之範圍內。在某些方面，該抗體蛋白產物具有從單體（n = 1）到二聚體（n = 2）、到三聚體（n = 3）、到四聚體（n = 4）的價數（n）範圍，如果不是更高階的價數的話。在一些方面，抗體蛋白產物係基於完整抗體結構的那些和/或模擬保留完整抗原結合能力的抗體片段的那些，例如scFv、Fab和VHH/VH（下文討論）。保留其完整抗原結合位點的最小抗原結合抗體片段為Fv片段，其完全由可變（V）區組成。使用可溶性柔性胺基酸肽連接子將V區連接至scFv片段（可變單鏈片段）以使該分子穩定，或將恒定（C）結構域添加至V區以產生Fab片段[抗原結合片段]。scFv和Fab片段可以容易地在宿主細胞例如原核宿主細胞中產生。其他抗體蛋白產物包括經二硫鍵穩定的scFv（ds-scFv）、單鏈Fab（scFab）以及二聚及多聚抗體形式，如雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體，或包含由與寡聚結構域連接的scFv組成的不同形式的迷你抗體（miniAb）。最小的片段係駱駝科重鏈Ab的VHH/VH以及單結構域Ab（sdAb）。最常用於建造新穎抗體形式的構件為單鏈可變（V）結構域抗體片段（scFv），其包含由具有約15個胺基酸殘基的肽連接子連接的來自重鏈和輕鏈的V結構域（VH結構域和VL結構域）。肽體（peptibody）或肽-Fc融合物係另一種抗體蛋白產物。肽體的結構由接枝到Fc結構域上的生物活性肽組成。本領域已充分描述了肽體。參見，例如，Shimamoto等人., mAbs 4 (5): 586-591 (2012)。其他抗體蛋白產物包括單鏈抗體（SCA）、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體；雙特異性或三特異性抗體等。雙特異性抗體可分成五個主要類別：BsIgG、附加IgG、BsAb片段、雙特異性融合蛋白以及BsAb軛合物。參見，例如，Spiess等人, Molecular Immunology[分子免疫學] 67 (2) 部分A: 97/-106（2015）。在示例性方面，抗體蛋白產物包括雙特異性T細胞接合器（BiTE®）分子或由其組成，該雙特異性T細胞接合器分子係人工雙特異性單株抗體。BiTE®分子係融合蛋白，包含不同抗體的兩個scFv。一個與CD3結合，而另一個與靶抗原結合。BiTE®分子係本領域已知的。參見，例如Huehls等人, Immuno Cell Biol[免疫細胞生物學] 93 (3): 290-296 (2015)；Rossi等人, MAbs [單株抗體] 6 (2): 381-91 (2014)；Ross等人, PLoS One [公共科學圖書館期刊] 12 (8): e0183390。
在各種實施方式中，本文所述之方法還包括確定 isoAsp在蛋白質中的位置。在各種實施方式中，在蛋白質發現過程中或蛋白質生產過程期間檢測該 isoAsp。在各種實施方式中，該 isoAsp的不存在指示該蛋白質適合進一步處理。
在各種實施方式中，該方法還包括當該蛋白質包含 isoAsp時拒絕該蛋白質。「拒絕」蛋白質包括但不限於停止或修改蛋白質生產或純化過程或處置蛋白質供應。如果蛋白質生產過程停止，則可以進行另外的處理以進一步評估蛋白質穩定性、分子評估和/或品質控制。在各種實施方式中，拒絕蛋白質包括丟棄或處置一定量的包含該蛋白質的產物，和/或拒絕產生該蛋白質的殖株。
在其中該方法確定蛋白質包含 isoAsp的各種實施方式中，該方法還包括改造該蛋白質以去除對 isoAsp形成敏感的位點。例如，改造包括在該蛋白質中的 isoAsp的位置處誘導點突變。
在各種實施方式中，與在相同位置包含L-Asp的參考蛋白質相比， isoAsp的存在導致肽骨架中的結構變化。
在各種實施方式中， isoAsp的存在抑制該蛋白質之效力。在各種實施方式中，與在相同位置包含L-Asp的參考蛋白質相比， isoAsp的存在增加該蛋白質的免疫性。此外，本揭露提供了藉由確定蛋白質是否包含 isoAsp來評價該蛋白質之效力和/或免疫性之方法。
在任何所述方法中，該等肽中的至少一種在該肽的N端包含正電荷。
在各種實施方式中並且在對該肽進行質譜分析之前，該方法還包括向該肽的N端引入正電荷。在各種實施方式中，藉由將該肽與N端電荷衍生試劑一起孵育來引入該正電荷。在某些實施方式中，該N端電荷衍生試劑為(N-琥珀醯亞胺氧基羰基甲基)三(2,4,6三甲氧基苯基)溴化鏻（TMPP）或其衍生物。在某些實施方式中，該N端電荷衍生試劑為三[2,4,6-三甲氧基苯基]乙醯鏻（TMPP-Ac）或其衍生物。在各種實施方式中， isoAsp在該等肽中的至少一種的C端的5個胺基酸殘基內，例如在C端的4、3、2或1個胺基酸殘基內。
在另一方面，本文揭露了被配置用於進行本文所述方法之質譜系統。在各種實施方式中，使用本文揭露的質譜系統測量 isoAsp的N端肽鍵的碎裂。在相關實施方式中，該碎裂超過該閾值指示該蛋白質中存在 isoAsp。此外，本揭露提供了使用本揭露的質譜系統確定蛋白質中存在 isoAsp之方法。
在各種實施方式中，進行的質譜係基質輔助雷射脫附/電離飛行時間/飛行時間（MALDI-TOF/TOF）。在各種實施方式中，進行的質譜係液相層析-質譜/質譜（LC-MS/MS），如電灑電離LC-MS/MS。
除非另外特定地規定，否則單數的使用包括複數。除非另外規定，否則「或」的使用意指「和/或」。術語「包括（including）」以及其他形式（如「包括（includes）」和「包括（included）」）的使用不具限制性。
「約（about）」或「大約（approximately）」意指當修飾一個量（例如，「約」3 : 1比率）時，圍繞該經修飾的量的變化可發生。該等變化可藉由多種方式，例如典型測量和處置程式、因疏忽所致的錯誤、成分純度及其類似方式而發生。
「包含（comprising）」和「包含（comprises）」旨在意指方法包括列出的要素但不排除其他未列出的要素。當在所揭露的方法中使用時，術語「基本上由……組成（consisting essentially of）」和「基本上由……組成（consists essentially of）」包括列出的要素，排除改變方法的基本性質的未列出的要素，但是不排除其他未列出的要素。該等過渡術語中的每一個定義的實施方式都在本揭露內容之範圍內。
本文揭露了處理蛋白質之方法。在示例性方面，該蛋白質係大肽/多肽（＞ 50個胺基酸）、抗體、抗體蛋白產物、雙特異性T細胞接合器（BiTE®）分子、抗體片段、抗體融合肽或其抗原結合片段。在示例性實施方式中，該方法包括使用質譜檢測蛋白質中的 isoAsp。所揭露的方法係有利的，因為與 isoAsp的常規檢測相比，既不需要專門的儀器也不需要離子化學。本揭露還提供了被配置用於進行本文揭露的方法之質譜系統。在一些實施方式中，該蛋白質在其胺基酸序列中具有至少兩個連續的天冬胺酸殘基。
在示例性實施方式中，該方法包括：(a) 將蛋白質消化成肽，(b) 對該等肽進行質譜並藉由質譜（例如串聯質譜）測量 isoAsp N端肽鍵的碎裂；(c) 將該碎裂與閾值進行比較，其中該碎裂超過該閾值指示該蛋白質中存在該 isoAsp；並且 (d) 拒絕包含該 isoAsp的蛋白質，或改造該蛋白質以去除該 isoAsp。如本文所用，除非另有說明，否則 isoAsp係指蛋白質或肽的背景中的 isoAsp殘基。下文提供對該方法的進一步描述。考慮到對於一些應用可以容忍少量的 isoAsp。相應地，在一些實施方式中，(d) 包括如果 isoAsp處於或高於指定水平，則拒絕該蛋白質。在一些實施方式中，該方法還包括在對肽進行質譜之前，使用N端電荷衍生試劑如TMPP向肽的N端引入正電荷。
本文提供的實驗證明肽或蛋白質的胺基酸序列內 isoAsp殘基的N端肽鍵對MALDI-TOF/TOF碎裂更敏感。這一發現被用來區分含有 isoAsp的肽與其未修飾的對應物。在各種實施方式中，該方法包括藉由質譜測量 isoAsp殘基N端肽鍵的碎裂。質譜用於測量離子的品質/電荷。在一些實施方式中，電荷與肽的C端區域相關並且稱為「y系列峰」或「y峰」。在一些實施方式中，電荷與肽的N端區域相關並且稱為「b系列峰」或「b峰」。在一些實施方式中，碎裂測量為b系列峰、y系列峰或兩者。
在各種實施方式中，為了確定蛋白質樣本中 isoAsp的存在，將蛋白質樣本的碎裂與閾值進行比較，其中超過閾值的碎裂指示蛋白質中存在 isoAsp。閾值可以藉由測量對照肽的碎裂來確定，或者閾值可為已知與未修飾蛋白質如不包含 isoAsp的蛋白質的碎裂相對應的參考值。在一些實施方式中，閾值可以基於 isoAsp N端的碎裂肽鍵的b峰和/或y峰的存在。在相關實施方式中，當蛋白質樣本中存在 isoAsp N端的碎裂肽鍵的b峰和/或y峰時，碎裂超過閾值。
在一些實施方式中，將蛋白質樣本的碎裂與對照肽的碎裂進行比較。對照肽也稱為「參考肽」。對照或參考肽可為不包含 isoAsp殘基或已被改造為去除 isoAsp和/或包含L-Asp殘基的肽或蛋白質。在相關實施方式中，閾值可以基於對照肽中L-Asp N端肽鍵的碎裂水平。閾值係指指示蛋白質或肽中存在至少一個 isoAsp的碎裂水平。
在一些實施方式中，對照肽視需要經受與蛋白質樣本相同的方法（包括 (a)、(b) 和/或 (c)）。在一些實施方式中，對照肽的肽鍵的碎裂作為電子存儲值或參考值提供。示例性參考值基於來自電子存儲的先前經處理的蛋白質的質譜數據。在一些情況下，處理軟體生成與對照肽相比有關 isoAsp碎裂和 isoAsp N端碎片離子強度的電子規則。對照肽可為基於所處理的蛋白質特別設計的合成肽。可替代，對照肽可為不包含 isoAsp並且較佳地不包含任何修飾或改變的胺基酸的蛋白質片段。特別地，對照蛋白質在與樣本中的蛋白質的相同位置處包含L-Asp。
還證明，藉由電灑LC-MS/MS僅對含有 isoAsp的肽的單電荷離子進行的高能碰撞解離（HCD）產生了與MALDI-TOF/TOF產生的相似的串聯質譜（MS/MS）碎裂。 消化
在各種實施方式中，所揭露的方法包括將待測試的蛋白質樣本消化成肽。可以使用將蛋白質消化成肽的任何已知方法進行消化。例如，樣本蛋白質的消化可以在已經進行熱應激之後使用採用蛋白水解酶的酶消化來進行。
熱降解係指由於將蛋白質和/或肽暴露於升高的溫度，並且在一些情況下暴露於過高的溫度，而使聚合物分子劣化。在各種實施方式中，熱降解在38°C-400°C下進行。在示例性實施方式中，熱降解在40°C下進行2-4週、在40°C下進行3-6個月、在25°C下進行1-2個月、在25°C下進行1個月、在4°C下進行3-6個月或在4°C下進行6個月。在各種實施方式中，熱降解在4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、41°C、42°C、43°C、44°C、45°C、46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、55°C、60°C或65°C下進行。在各種實施方式中，熱降解進行1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、16小時、24小時或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或1週、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或至少2週；至少3週、至少4週或至少1個月、至少5週、至少6週、至少8週或至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、或至少6個月。在各種實施方式中，熱降解在pH 5-8之間進行。在示例性實施方式中，熱降解在pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或pH 8.0下進行。在各種實施方式中，熱降解係根據人用藥品技術要求國際協調理事會（ICH）指南進行的。在一些實施方式中，熱降解包括在40°C下在pH 5至pH 8範圍內的pH下孵育2-4週（如2週）。
蛋白質的酶消化涉及用酶切割肽鍵以形成肽。可以用具有不同特異性程度的酶進行消化。例如，可以用一或多種蛋白水解酶進行酶消化。蛋白水解酶包括但不限於胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜酶或彈性蛋白酶。在一些實施方式中，蛋白質樣本可以在用蛋白水解酶消化之前被還原和烷基化並且隨後藉由質譜進行分析。可以將蛋白質用氧化還原劑如二硫蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇和TCEP（三(2-羧乙基)膦）還原。可以將蛋白質用巰基試劑如碘乙醯胺（IAM）、碘乙酸（IAA）或另一種親電子劑烷基化，以防止二硫鍵的重新形成。在各種實施方式中，將蛋白質樣本和對照樣本（對照肽）二者均用蛋白水解酶消化。在各種實施方式中，將蛋白質樣本進行熱降解並隨後藉由質譜進行分析。 用 N 端電荷衍生試劑對含有異天冬胺酸的肽進行化學修飾
在本文中觀察到，與未向N端引入正電荷的參考肽相比，在質譜之前向一或多種肽的N端引入正電荷可以增強鑒定 isoAsp N端碎裂的峰的強度，如b n-1+ H 2O峰（其中n係肽中 isoAsp的殘基數）（參見實例7）。在各種實施方式中，本文揭露之方法還可包括肽的N端修飾。在各種實施方式中，該方法還包括在質譜分析之前向肽的N端引入正電荷。在各種實施方式中，藉由將肽與N端電荷衍生試劑一起孵育來引入正電荷。「N端電荷衍生試劑」係指能夠向一或多種肽或蛋白質的N端添加正電荷的試劑（即在肽或蛋白質的N端引入正電荷基團如四級銨或三級銨和四級鏻基團的試劑）。可與本文揭露的方法一起使用的示例性N端電荷衍生試劑包括但不限於(N-琥珀醯亞胺氧基羰基甲基)三(2,4,6三甲氧基苯基)溴化鏻（TMPP）、三[2,4,6-三甲氧基苯基]乙醯鏻（TMPP-Ac）、4-脒基苯甲酸、菸鹼酸、2-(6-脒基萘-2-基氧基)乙酸、4-(胍基甲基)苯甲酸或其衍生物。
TMPP的示例結構示於圖24中。不受理論限制，預期TMPP在其磷原子上保留正電荷，從而當肽被TMPP標記時允許正電荷被引導至肽的N端。所揭露的方法可以用包含所揭露的TMPP結構或其衍生物的試劑進行。所揭露的方法也可以用共用相似結構的試劑進行，該相似結構向肽或蛋白質的N端添加正電荷。
在各種實施方式中，例如用N端電荷衍生試劑如TMPP向一或多種肽的N端引入正電荷，可以改進由質譜對含有異天冬胺酸的肽的檢測。在各種實施方式中，當 isoAsp在該等肽中的至少一種的C端的5個胺基酸殘基內時，可以使用N端電荷衍生試劑。例如， isoAsp可以在C端的4、3、2或1個胺基酸殘基內。
在某些實施方式中，質譜係MALDI-TOF/TOF。在示例性實施方式中，使用N端電荷衍生試劑如TMPP對肽進行N端修飾，然後進行MALDI-TOF/TOF碎裂，導致與天冬胺酸對應物相比時，在修飾的肽中檢測到更強的b n-1+ H 2O產物離子（n表示肽中異天冬胺酸的殘基數）。 質譜
在示例性方面，該方法包括使用質譜檢測樣本中的 isoAsp。質譜用於測量離子的品質/電荷。在各種實施方式中，質譜包括以下或由以下組成：基質輔助雷射脫附/電離飛行時間/飛行時間（MALDI-TOF/TOF）。在各種實施方式中，質譜包括以下或由以下組成：液相層析-質譜/質譜（LC-MS/MS），也稱為液相層析-串聯質譜。
本文揭露了使用質譜檢測和確定 isoAsp殘基在肽中的位置。本文所述之實驗證明修飾的 isoAsp殘基的N端肽鍵對MALDI-TOF/TOF碎裂更敏感。在本揭露中，MALDI-TOF/TOF和MALDI-LIFT-TOF/TOF這兩個術語可互換使用。在示例性實施方式中，MALDI-TOF/TOF質譜用於表徵和確定 isoAsp殘基在合成肽和來自蛋白質樣本的由蛋白水解產生的肽中的位置。在替代實施方式中，可以使用LC-MS/MS質譜。不受理論的限制，預期MALDI-TOF可用於本文所述之關於減少電荷的方法中。對於包括LC-MS/MS之方法，質譜之前可以進行電荷減少。
在各種實施方式中，本文所述之方法還包括在 (b) 之前減少肽樣本的電荷。電荷減少（Smith. J Am Soc Mass Spectrom[美國質譜分析學會雜誌] 2008, 19(5), 629-31，藉由引用將其整體併入）用於將肽電荷態減少至z = 1+以藉由質譜檢測蛋白質樣本中的 isoAsp。在一些實施方式中，在 (b) 中進行質譜的該等肽帶單電荷。術語「單電荷」係指具有+1或-1電荷態的肽。在一些實施方式中，碎裂測量為b系列峰、y系列峰或兩者。
在各種實施方式中，本文所用的「電荷減少」係指降低肽的電荷量，從而減少肽中帶電荷種類的數量，這可以使肽的電荷態呈中性（或更接近中性）。在一些實施方式中，藉由使肽更小（例如藉由酶消化）來減少肽的電荷。在一些實施方式中，藉由有利的添加（例如使用鹼性化學品）來減少肽的電荷。在示例性實施方式中，可以按下列方式進行電荷減少。首先，藉由使用胰蛋白酶以外的酶，如胰凝乳蛋白酶，來減少肽的長度。得到的肽會更小，並因此具有更少的電荷。在這種情況下，電荷態為z = 1+，因此現在適於LC-MS/MS HCD碎裂。其次，使用鹼性化學品如1,8二氮雜雙環[5.4.0]-十一碳-7-烯（DBU）來例如誘導氣相鹼介導的電荷剝離，從而將肽的電荷從z = 3+減少到z = 1+，例如，允許z = 1+離子的LC-MS/MS HCD碎裂。
本揭露還提供了被配置用於進行本文揭露的方法之質譜系統。在各種實施方式中，使用本文揭露之質譜系統測量 isoAsp的N端肽鍵的碎裂。在相關實施方式中， isoAsp N端肽鍵的碎裂超過閾值指示蛋白質中存在 isoAsp。在各種實施方式中，質譜系統係MALDI-TOF/TOF。在各種實施方式中，質譜系統係LC-MS/MS。在各種實施方式中，質譜系統使用高能碰撞解離（HCD）。 蛋白質樣本
蛋白質樣本（為了簡明起見，在本文中也可以簡稱為「蛋白質」）包括可以被加工或分析穩定性和/或結構完整性的任何類型的蛋白質。在各種實施方式中，如此經受本文揭露的方法的蛋白質樣本包括以下或由以下組成：大肽、抗體、抗體片段、抗體融合肽或其抗原結合片段。在相關實施方式中，該抗體係多株或單株抗體。 品質與控制
在治療性單株抗體（mAb）和其他生物治療藥物中，天冬胺酸（Asp）到異天冬胺酸（ isoAsp）的異構化係一個關鍵的品質屬性（CQA），其需要在發現和生產過程期間仔細控制和監測。生物治療藥物中不期望的 isoAsp形成以及由此導致的肽骨架結構變化可能會對分子活性產生負面影響或變得具有免疫性，尤其是在互補決定區（CDR）內發生異構化時如此。
本文揭露的方法可用於在蛋白質發現（研究）過程或蛋白質生產（過程開發）過程期間監測 isoAsp。在各種實施方式中， isoAsp的不存在指示蛋白質適合進一步處理。在各種實施方式中 ， isoAsp的存在可導致蛋白質的一或多種以下變化：肽骨架的結構變化，蛋白質活性變化，或免疫性增加。在各種實施方式中，與在相同位置包含L-Asp的參考蛋白質相比， isoAsp的存在導致肽骨架中的結構變化。在一些實施方式中， isoAsp的存在抑制蛋白質之效力。在各種實施方式中，與在相同位置包含L-Asp的參考蛋白質相比， isoAsp的存在增加該蛋白質的免疫性。如本文所述，如果蛋白質含有過量的 isoAsp（在研究發現階段通常為約5%），則蛋白質（例如，包含該蛋白質的樣本、殖株、亞批或批次）可能會被拒絕
在各種實施方式中，拒絕包含 isoAsp的蛋白質包括拒絕一定量的包含該蛋白質的產物，或拒絕產生該蛋白質的殖株。在各種實施方式中，該方法還包括藉由蛋白質工程減少或抑制 isoAsp。在各種實施方式中，該方法還包括改造蛋白質以去除對天冬胺酸異構化敏感的位點，包括在編碼蛋白質中的 isoAsp的核酸位置處誘導點突變。在一些實施方式中，如果 isoAsp處於或高於指定水平，則拒絕包含 isoAsp的蛋白質。 天冬胺酸（ Asp ）到異天冬胺酸（ isoAsp ）的異構化
在治療性單株抗體（mAb）和其他生物治療藥物中，天冬胺酸（Asp）到異天冬胺酸（ isoAsp）的異構化係一個關鍵的品質屬性（CQA），其需要在發現和生產過程期間仔細控制和監測。生物治療藥物中不期望的 isoAsp形成以及由此導致的肽骨架結構變化可能會對分子活性產生負面影響或變得具有免疫性，尤其是在互補決定區（CDR）內發生異構化時如此。
藉由典型質譜（MS）表徵蛋白質中異天冬胺酸（ isoAsp）的形成可能是一項艱巨的任務，因為修飾的殘基與其未修飾的對應物係同分異構的 19。 isoAsp形成的化學過程已得以充分記錄（圖1），並通過環狀醯亞胺中間體的形成進行，該中間體的水解導致生成 isoAsp和Asp二者。根據實際的胺基酸序列和蛋白質結構，前者與後者的比率通常為約3 : 1，並且如果Asp後跟一個小殘基如甘胺酸，則有利於異構化 19。在此過程期間，天冬胺酸殘基處的外消旋化也是可能的，從而形成D- isoAsp和D-Asp二者。然而，外消旋化相對較少，而在長壽命蛋白質如晶狀體晶體蛋白和牙本質中已檢測到外消旋胺基酸 20-21,22。修復修飾的細胞蛋白中的 isoAsp殘基至關重要，並且已在微生物、哺乳動物和植物系統中鑒定出一種將蛋白質中的 isoAsp殘基部分地轉化回天冬胺酸的酶（蛋白質L-異天冬胺醯甲基轉移酶PIMT） 23-24。關於該酶的生物學和底物特異性的詳細綜述已發表 25（藉由引用以其全文併入）。
由於在多肽骨架中引入了額外的亞甲基基團，並且伴隨著羧基側鏈的縮短和重新定向 26，這種結構變化可影響蛋白質的功能，變得具有免疫性 27或導致不期望的聚集並導致不溶 26。β-澱粉樣蛋白（Aβ 1-42）中Asp1和Asp7的異構化首先在阿茲海默症（AD）腦組織中鑒定出，並牽涉成為在疾病發展期間中引發病理效應的原因 28。在最近的一項研究中，Julian和合作者 29證明了具有 isoAsp7修飾的Aβ對溶酶體中常見的組織蛋白酶的蛋白水解具有抗性。作者還提出了這種溶酶體儲存故障與AD發展之間的關聯。
IsoAsp可以藉由自動Edman降解來鑒定，其中Edman化學反應會在修飾的殘基處終止 40。然而，與LC-MS/MS相比，N端定序非常耗時，需要更大量的材料。Lehmann 41報導了使用LC-MS/MS分析肽中的 isoAsp，並證明了藉由(Asp/ isoAsp)-X鍵碎裂獲得的互補b/y離子強度比率可用於區分修飾的殘基與其未修飾的對應物。然而，Bondarenko和同事 42提供的MS/MS數據表明Lehmann得出的觀察結果可能不適用於所有的含有 isoAsp的肽。Fujii 43和Reilly 44已經報導了藉由MALDI-源後衰變（PSD）鑒定肽中的 isoAsp。藉由該技術，前者證實了Gonzalez 45首次報導的 isoAsp診斷離子yL-n + 1-46（其中L代表肽的長度（整數；總殘基數），n為異構化殘基的位置）的檢測。不幸的是，這種離子的強度通常非常低，並且通常僅限於藉由胰蛋白酶消化獲得的肽。該組還評價了來自一系列基於晶體蛋白序列的由類胰蛋白酶水解的合成肽的PSD碎裂的比率yL-n : yL-n+1。通常，對於含有 isoAsp的肽，與相應的含有L-Asp的肽相比，yL-n+1的強度增加。作者將這一觀察結果歸因於較短的異天冬胺醯側鏈與修飾的殘基的N端肽鍵中的羰基相互作用。Fuji等人利用源後衰變-基質輔助雷射脫附電離（MALDI-PSD）來評價人類老化晶狀體晶體蛋白（一種相對較小的蛋白質）的胰蛋白酶消化形成的 isoAsp的量。相比之下，本文揭露的方法能夠檢測具有連續天冬胺酸殘基的較大肽和蛋白質中的 isoAsp。
已報告使用ECD或ETD（c’ + 57和z•-57）檢測 isoAsp診斷離子 16,46-48。相比之下，本揭露描述了單電荷離子的碎裂，其允許區分 isoAsp修飾與其未修飾的對應物（Asp）。根據肽序列，特徵離子可能具有低強度，從而使解讀具有挑戰性。另外Costello 49使用MALDI-ISD（源內衰變）評價了源自β-2微球蛋白的含有 IsoAsp的肽。在供氫基質存在的情況下，還觀察到ECD樣c’ + 57和z•-57診斷離子。Julian描述了使用自由基定向解離（RDD）來鑒定胺基酸異構物。RDD方法已證明成功地用於鑒定 isoAsp形成以及絲胺酸和其他胺基酸的差向異構化 50-51。Smith 52報導了使用SLIM（無損離子操縱結構）儀器分離了β-澱粉樣肽（殘基6-16）的四種合成衍生物：其中Asp7未經修飾，被D-Asp、L- isoAsp或D- isoAsp替代。Cooks 53的研究證明了使用離子化學來區分含有Asp和 isoAsp的肽。羧酸酯側鏈用碳二亞胺修飾以獲得醯基異脲。隨後的1,3-醯基轉移導致N-醯基脲的形成。在碰撞誘導解離（CID）條件下，可以檢測到不同的醯基異脲和N-醯基脲碎片。然而，由於 isoAsp側鏈施加的空間位阻，不利於N-醯基脲的形成。因此，用修飾的肽觀察到的主要碎片係衍生自醯基異脲的碎片。此外，Popov 54-55報導了使用MALDI-TOF/TOF和CID來探索含有 isoAsp7的Aβ（殘基1-42）的碎裂。藉由使用一系列合成肽標準品，該等研究人員開發了一種無標記的Aβ定量方法。然而，該等研究人員似乎沒有提到 isoAsp的鑒定或用於鑒定 isoAsp本身的質譜。此外，預期該等研究人員報導的方法不會在具有連續天冬胺酸殘基的肽中檢測到連續的 isoAsp。
在各種實施方式中，本文揭露的方法可用於確定 isoAsp殘基在蛋白質中的位置。此外，本文揭露的內容可用於蛋白質生產過程期間的品質控制。所揭露的方法還可用於評估蛋白質在儲存或暴露於溫度變化、光或其他環境或化學因素之後的穩定性或結構穩定性。
給出以下實例僅用於說明本發明，而不以任何方式限制其範圍。 實例 一般方法
從Anaspec（弗里蒙特（Freemont），加利福尼亞州）獲得或內部合成九對包含Asp或 isoAsp的合成肽。肽序列為：LD/ isoDA、GD/ isoDLLLK、GLD/ isoDLLK、ALD/ isoDGK、ALD/ isoDEK、ALD/ isoDGE、AD/ isoDLGK、GFYPSDIAVEWESD/ isoDGQPENNYK和VVSLTVLHQD/ isoDWLNGK。δ-睡眠誘導肽DSIP和β-Asp DSIP（WAGGDASGE（SEQ ID NO: 2）和WAGG isoDASGE（SEQ ID NO: 1）購自巴亨公司（Bachem）（托倫斯（Torrance），加利福尼亞州）。MS級蛋白水解酶胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶購自賽默科學公司（Thermos Scientific）（沃爾瑟姆（Waltham），馬塞諸塞州）。二硫蘇糖醇（DTT）和碘乙醯胺（IAM）獲得自西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich）（聖路易斯（St Louis），密蘇里州）。使用的MALDI基質（4-HCCA）來自布魯克•道爾頓公司（Bruker Daltonics）（比勒利卡（Billerica），馬塞諸塞州）。使用的所有其他試劑均為可商購的最高等級試劑。始終使用Optima LC-MS級溶劑。 商業治療性 mAb 的熱應激和蛋白水解降解
將濃度為1.26 mg/mL的治療性mAb在0.1 M碳酸氫銨（pH 7.8）中於40°C孵育2週以誘導天冬胺酸異構化。將樣本進行還原（DTT）和烷基化（IAM），之後用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化以及隨後進行LC-MS/MS分析。 所選肽的 MALDI-TOF/TOF 分析
藉由使用配備有2,000 Hz smartbeam II（Nd:YAG）雷射器的布魯克（Bruker）UltrafleXtremeTOF/TOF質譜儀進行MALDI-MS。4-HCCA用作基質（0.1% TFA/50%乙腈中的飽和溶液）。 藉由 LC-MS/MS 作肽圖
使用的柱係Acquity UPLC肽BEH C18（2.1 x 150 mm，1.7 µm）柱。溶劑A為0.1%甲酸水溶液，並且溶劑B為0.1%甲酸乙腈溶液。柱在1% B中以0.25 mL/min的流速和50°C下平衡。上樣後，用1% B洗滌柱8 min，之後經70 min應用從1%到55% B的線性梯度。藉由214 nm處的吸光度監測肽洗脫，並將洗脫的肽引入Q-Exactive中以用於MS和MS/MS。使用了3.5 kV的噴霧電壓。數據依賴性MS方法由解析度為70,000的從m/z 300至2000的全MS組成。隨後進行10種最豐富先質的HCD（解析度為17,500）。全MS的AGC目標值設定為1E6，HCD的設置為5e4。採用了2 Da的隔離寬度和27的NCE。分析獲得的串聯MS數據用於肽鑒定。 實例 1 ：肽標準品中異天冬胺酸的鑒定
在目前的文獻中，MALDI-MS的主要應用已轉向成像 56-57、細菌物種鑒定 58和小分子文庫的高通量篩檢 59-61。大約二十年前推出的LIFT-TOF/TOF技術已證明其在肽表徵中的成功應用 62。簡而言之，與隨著低能離子-中性碰撞（為CID）變化的緩慢加熱過程 63相反，LIFT技術基於MS無場區中亞穩離子碎裂、先質和碎片離子門控、然後在反射器中能量聚焦的結果 64。
圖2A和2B分別提供了對於三肽L isoDA和LDA獲得的MALDI-TOF/TOF數據。對於L isoDA肽，主要離子（y 2）證明在 isoAsp殘基的N端鍵處的碎裂係較佳的。此外，天冬胺醯肽清楚地證明，主要切割位點在天冬胺酸殘基之後，產生b 2離子，這歸因於「天冬胺酸效應」 67。在進行相同的MALDI TOF/TOF碎裂之前，將2種肽以限定比例的L isoDA和LDA混合在一起，並測量y 2/b 2的比率（圖2C）。二元混合物中兩種離子的比率針對異天冬胺酸肽%的圖產生了一條曲線（y = 0.2188e0.023x；圖2C，其中R2 ＞ 0.99）而不是一條直線。從另一對 isoD/D肽（WAGG isoDASGE（SEQ ID NO: 1）和WAGGDASGE（SEQ ID NO: 2）獲得的結果示出在圖2D和2E中。 isoAsp肽MALDI-TOF/TOF譜的檢查顯示，與未修飾的肽相比，容易觀察到y 5離子的增強，再次證明了 isoAsp殘基N端的優先切割。b 5離子衍生自 isoD/D C端側的切割。y 5/b 5的比率是針對一系列明確限定的 isoD/D肽混合物測量的。比率與二元混合物中的 isoAsp%的圖也是一條曲線，其中y = 0.2039e0.019x且R2 ＞ 0.99（圖2F）。
Indeykina 68在他們對包含Asp7或 isoAsp7的合成澱粉樣蛋白-β（殘基1-16）肽的二元混合物進行串聯MS研究時，得出了類似的觀察結果。很可能含有 isoAsp的肽更容易電離。此外，在ESI輸注2種肽WAGG isoD/D ASGE（圖4A-4B）後，含有 isoAsp的肽顯示[M+H]+和[M+2H]2+兩種種類，而含有天冬胺酸的肽僅顯示單電荷種類[M+H]+，表明質子對含有 isoAsp的肽的親和力更大，或者離子結構在空間上有利於接受第二個質子。然而，在相同條件下，在 isoD肽中容易檢測到雙電荷種類。藉由MALDI-TOF/TOF評價了多種其他含有 isoAsp/Asp的肽標準品，如圖5至12所示，所有該等都證明了與 isoAsp殘基N端緊鄰的優先肽鍵碎裂。 實例 2 ：熱應激 mAb 中異天冬胺酸的鑒定
為了將上述觀察結果置於現實治療相關mAb的背景下，MALDI-TOF/TOF方法用於在熱誘導強制降解後鑒定mAb中的異構化Asp殘基。已有充分記錄證明，商業mAb在其重鏈CDR3結構域的102位具有Asp殘基，該殘基易於發生異構化和修飾，從而導致活性喪失 37,69。
在本實例中，將mAb在pH 7.8和40°C下孵育2週，然後進行還原、烷基化和胰蛋白酶消化。在相同條件下處理的未受應激的mAb用作對照。在熱應激下，還存在其他修飾，如Asn脫醯胺和Met氧化。因為它們之前已經被其他人鑒定和記錄 70，所以在該等實驗組中沒有檢查Asn脫醯胺和Met氧化。因此，本揭露描述了重鏈CDR3 Asp102異構化的表徵。
圖3A示出熱應激mAb的LC-UV胰蛋白酶水解圖譜（放大到目的區域）。LC-MS/MS數據的分析證明，包含重鏈Asp102的胰蛋白酶水解肽（W99GGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTK124；SEQ ID NO: 3）被洗脫在兩個分辨良好的峰中（圖3A），這兩個峰具有相同的 m/z值，1392.63（[M+2H]2+）。第一個峰與第二個峰的比率為大約1 : 1。雙電荷離子的LC-MS/MS CID數據係相同的，並且根據當前文獻 40中報告的數據，通常假定較早洗脫峰包含修飾的殘基（ isoAsp）。在對照蛋白質消化物中，較晚洗脫峰很小（數據未顯示）。兩種胰蛋白酶水解肽的MALDI-TOF/TOF結果示於圖3B和3C中，其中前者來自較早洗脫峰（44.1 min），並且後者來自較晚洗脫峰（44.7 min）。在圖3C中容易觀察到y 23的增強，示出Asp102 N端的碎裂增加，因此表明殘基已異構化。測定每種肽的兩個碎片y 23和y 24的比率，並且計算出兩種肽的R 異構物 50為2.04。對於該肽，y 22離子強度的增加顯示， isoAsp側鏈C端肽鍵在所用條件下更容易碎裂。因此，數據證明從RP-HPLC柱的洗脫順序不能用於將含有 isoAsp的肽與其未修飾的對應物明確鑒定開來，因為在這種情況下，含有 isoAsp的肽被晚點洗脫。
由於胰蛋白酶水解肽較大（26個殘基），因此進行了一項實驗以評價較短的肽是否具有改進的MALDI-TOF/TOF譜。在還原和烷基化後，將熱應激的和對照商業mAb二者均用胰凝乳蛋白酶消化，並藉由LC-MS/MS鑒定肽。再次發現十肽C96 SRWGGDGFY104（SEQ ID NO: 4）分辨為兩個層析分離的峰，這兩個峰具有相同的 m/z= 602.73（[M+2H] 2+；圖3D）。由於在肽的殘基98處存在Arg，因此碎片離子以b離子系列為主。圖3E和3F中它們的碎裂數據的並排比較顯示出圖3F中突出的b 6+ H 2O，較晚洗脫峰證明了修飾殘基N端肽鍵的碎裂被增強。因此，可以得出結論，較晚洗脫的肽係含有 isoAsp的肽。藉由確定兩個碎片（在此情況下為每種肽的b 6+ H 2O和b 10）的比率，計算出R 異構物為11.0。藉由檢測b 6+ H 2O離子所指示的加水機制已被檢查過 71，並被認為是由於來自 isoAsp羧酸側鏈的分子重排。
最初，不清楚為什麼只有MALDI-TOF/TOF才能成功鑒定含有 isoAsp的肽，而LC-MS/MS卻不能。在藉由LC-MS/MS鑒定胰凝乳蛋白酶水解肽期間，觀察到單電荷C96-Y104的HCD分析產生與MALDI TOF/TOF數據高度可比的光譜，即主要的b 6+ H 2O離子，表明Asp102係異構化殘基（圖13）。然而，對於較大的肽，例如26個殘基的胰蛋白酶水解肽（圖3B和3C；胰蛋白酶消化物），可能難以藉由ESI-HCD檢查單電荷離子，因為先質離子通常是雙電荷或三電荷種類。因此，LC-MS/MS可用於鑒定潛在的天冬胺酸異構化位點，唯一要注意的是具有化學傾向的蛋白質區域必須被切割成更小的肽（可能被非特異性蛋白酶切割），從而使得單電荷離子可以進行MS/MS HCD碎裂。值得注意的是，在對幹細胞因子 72中Asn10脫醯胺的研究中，與未修飾或含有Asp的肽相比，六肽（VT isoDNVK；SEQ ID NO: 5）的MS/MS產生了強的y 4離子。作者僅將這一觀察結果歸因於T- isoD鍵的異常切割。可替代地，可以利用電荷減少 73將肽電荷態減少到z = 1+，因此可能允許藉由更普遍使用的LC-MS/MS技術進行有效的Asp/ isoAsp鑒定。 實例 4 ：商業治療性抗體的熱應激和蛋白水解降解
將1.26 mg/mL的抗體在0.1 M碳酸氫銨（pH 7.8）中在40°C下孵育2週，之後在-70°C下冷凍以用於進一步實驗。在典型的消化中，將100 µL孵育的抗體藉由真空離心來乾燥。將樣本溶解在50 µL的在0.1 M Tris（pH 7.5）中的8 M尿素中，之後在50°C下用10 mM DTT還原1 h，然後在黑暗中用20 mM碘乙醯胺在室溫下烷基化30 min。藉由添加DTT淬滅烷基化。將樣本用150 µL 0.1 M Tris（pH 7.5）稀釋，並用按重量計1%的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化。以相同方式處理未經受熱應激的另一等分試樣的抗體，用作對照。另一組熱應激實驗係藉由在pH 5.2中孵育抗體進行的。重鏈Asp102異構化的量係相似的，並且此處僅提供pH 7.8下的數據。 實例 5 ：所選肽的 MALDI-TOF/TOF 分析
藉由使用配備有2,000 Hz smartbeam II（Nd:YAG）雷射器的布魯克（Bruker）UltrafleXtremeTOF/TOF質譜儀進行MALDI-MS。4-HCCA用作基質（10 mg/mL，在0.1% TFA/50%乙腈中）。將1 µL肽與等體積的基質混合，之後將1 µL混合物點在MTP 384磨光鋼靶板上，風乾，並插入儀器中進行品質測量。使用21 kV加速電壓和25 kV反射器電壓將質譜儀設定為正離子模式。雷射功率經過優化，並且在典型實驗中，累積5,000次雷射發射以創建光譜。使用LIFT池技術記錄所選肽的碎裂。採用7.5 kV的初始加速電壓和19 kV的LIFT池加速電壓。優化了先質和碎片二者的雷射功率。通常，在記錄碎片數據時使用約8,000到10,000次雷射發射。
8對合成肽的MALDI-TOF/TOF數據進一步展示在圖5至12中。在所有情況下，對於含有 isoD的肽，由修飾殘基N端肽鍵碎裂產生的離子強度更高。R 異構物值範圍為從1.5至5.8。因此，該技術可以容易地用於區分含有 isoD的肽與其未修飾的對應物。
總之，本文提供的數據證明，使用MALDI-TOF/TOF進行的碎裂提供了一種用以鑒定 isoAsp殘基位置的簡單且穩健的無標記的分析方法。這在肽標準品和熱降解的治療相關mAb中得到了證明。證明了 isoAsp殘基N端肽鍵對於PSD的碎裂更不穩定。含單電荷（ z= 1+） isoAsp的肽的LC-MS/MS HCD碎裂產生的MS/MS碎裂數據與MALDI-TOF/TOF碎裂數據高度可比。此外，本文已討論了藉由實施電荷減少、然後LC-MS/MS（HCD）來進行線上LC鑒定的潛力，但同樣依賴於層析分離以進行明確鑒定。本文所用的線上LC-MS/MS鑒定係指利用對消化的肽的電灑電離和線上層析分離，隨後分別進行MS和MS/MS檢測和碎裂。因為可以跳過手動收集步驟，所以使用線上LC-MS/MS鑒定改進了本文揭露的方法。手動收集層析分離之目的肽非常耗時。如果應用於後期過程開發分析方法，如多屬性方法 74，z = 1+離子的靶向LC-MS/MS碎裂和電荷減少都可能具有重要意義。
這種MALDI-TOF/TOF方法的一個潛在限制係含有Asp和 isoAsp的肽必須顯示層析分離，由此允許收集和隨後的MALDI-TOF/TOF分析。然而，如果可以實現層析分離， isoAsp的測定係直接且明確的。 實例 6 ：熱應激抗體蛋白產物的樣本中天冬胺酸異構化的鑒定
以下實例描述了為檢測包含相鄰異天冬胺酸和L-天冬胺酸的熱應激抗體蛋白產物的樣本中的 isoAsp而進行的實驗。
如上文實例4中所述，將熱應激抗體蛋白產物的樣本（40°C下3週）還原、用碘乙醯胺烷基化並用胰蛋白酶消化。隨後藉由LC-MS/MS分析消化物（胰蛋白酶水解作圖文件案名：QE20200623-01）。光譜分析揭示了兩個主峰和一個小肩峰（圖16）。還檢測到品質對應於琥珀醯亞胺衍生物的峰。峰標記為P1至P4，其中P3對應於環狀醯亞胺（圖16）。然後手動收集等分試樣，並藉由MALDI-TOF/TOF鑒定和分析對應於XDDHXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX之目的肽。P1被確定為未修飾的肽（圖19），P2（肩峰）被鑒定為XDisoDHXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX（圖20），P4被鑒定為X isoD DHXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX（圖20）在未受應激和應激的P1中，y 25與y 23的強度比率為大約1 : 1（圖19），表明P1係剩餘的未修飾肽。對於P2，y 25比y 23被確定為1.7比1，表明修飾係在isoDH處。對於P4，可容易檢測的y 26證明修飾位於isoDD（圖20）。在合成肽的情況下提出的峰得以確認。因此，已經觀察到如本文所述之方法可以分辨與肽的一級序列中的L-Asp殘基相鄰的 isoAsp殘基。
Orbitrap Fusion用於使肽的1+種類特異性碎裂，並將EThcD改編為 isoAsp鑒定的常規方法。 實例 7 ：對具有C端近側修飾殘基的兩種合成肽的評價
藉由實例1中描述的MALDI-TOF/TOF方法對具有C端近側修飾殘基的2種合成肽（GFYPSDIAVEWESNGQPEN isoDYK（SEQ ID NO: 27）和GFYPSDIAVEWESNGQPE isoDNYK（SEQ ID NO: 25））的評價顯示，雖然在修飾的殘基N端肽鍵碎裂有所增加，但增強幅度較小，因此使數據解釋更具挑戰性（圖22A和22B）。然而，在向N端引入正電荷基團後，如使用試劑(N-琥珀醯亞胺氧基羰基甲基)三(2,4,6三甲氧基苯基)溴化鏻（TMPP）進行化學修飾後，MALDI-TOF/TOF對所得到的含有 isoAsp的肽進行碎裂，當與含有Asp的對應物相比時，產生強的b n-1+ H 2O（其中n係肽中 isoAsp的殘基數）（圖23A和22B）。水的轉移來自縮短的 isoAsp羧基側鏈，這已被記錄過。因此，用N端電荷衍生試劑如TMPP修飾N端，然後進行MALDI-TOF/TOF，從而允許快速且明確地鑒定 isoAsp殘基，即使它靠近C端也可以這樣。
在此所引用的所有參考文獻（包括出版物、專利申請、和專利）均藉由引用在此併入，引用的程度如同每個參考文獻被個別地並且明確地指示藉由引用結合並且以其全部內容在此闡述。
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無
[圖1]係顯示胺基酸殘基天冬胺酸和天冬醯胺二者通過琥珀醯亞胺中間體形成異天冬胺酸的異構化途徑之示意圖。沒有考慮每個階段的手性和平衡。
[圖2A-2F]係對標準肽進行的基質輔助雷射脫附/電離飛行時間/飛行時間（MALDI-TOF/TOF）光譜法之質譜圖和圖；圖2A) L isoDA；圖2B) LDA；圖2C) y 2/b 2比率針對在兩種三肽的限定混合物中的 isoAsp肽%之圖。每個點代表三次重複測量的平均值。圖2D) β-Asp DSIP（WAGG isoDASGE；SEQ ID NO: 1；圖2E) DSIP（WAGGDASGE；SEQ ID NO: 2；圖2F) y 5/b 5比率針對在兩種九肽的限定混合物中的 isoAsp肽%之圖。每個點也係三次重複測量的平均值。
[圖3A-3F]係質譜圖，其示出藉由MALDI-TOF/TOF從熱應激治療性mAb中鑒定出含有 isoAsp殘基的肽。藉由MALDI-TOF/TOF收集和分析每種肽。
[圖4A-4B]係將肽WAGGDASGE（圖4A；SEQ ID NO: 2）和WAGG isoDASGE（圖4B；SEQ ID NO: 1）的ESI輸注物在Orbitrap Velos Pro中的一系列質譜圖，示出未修飾的肽僅顯示單電荷離子。
[圖5]係對照（頂部）和修飾的（底部）肽的MALDI-TOF/TOF碎裂的一系列質譜圖。在 isoD肽中觀察到b 9和y 8離子的增強。使用每個譜圖中這兩種離子之間的比率確定R 異構物為1.8。
[圖6]係合成對照（頂部圖）和修飾的（底部圖）肽的MALDI TOF/TOF分析的一系列質譜圖。在isoD肽中觀察到y 9離子的增強。藉由使用y 9和y 10對進行計算，確定R 異構物為3.1。
[圖7]係一系列質譜圖，其示出在修飾的肽中容易觀察到y 4離子的增強，表明 isoD殘基N端的肽鍵在MALDI TOF/TOF中更容易碎裂。藉由使用y 4和y 3對，計算R 異構物為3.7。
[圖8]係五肽ALDGE（頂部）（SEQ ID NO: 8）和AL isoDGE（底部）（SEQ ID NO: 9）的MALDI TOF/TOF碎裂的一系列質譜圖。藉由使用y 3和b 4對，確定R 異構物為2.3。有趣的是注意到，與對照肽相比，修飾的肽中的b 3碎片離子大大減少。
[圖9]係ALDEK（頂部）（SEQ ID NO: 10）和AL isoDEK（底部）（SEQ ID NO: 11）的MALDI TOF/TOF碎裂的一系列質譜圖，其示出修飾的肽中y 3離子的增強。藉由在計算中使用y 3和b 4，確定R 異構物為1.5。同樣，在 isoD肽中基本上沒有檢測到b 3碎片。
[圖10]係ALDGK（頂部）（SEQ ID NO: 12）和AL isoDGK（底部）（SEQ ID NO: 13）的MALDI-TOF/TOF碎裂的一系列質譜圖。藉由使用y 2和y 3對，確定R 異構物為2.1。
[圖11]係GLDLLK（頂部）（SEQ ID NO: 14）和GL isoDLLK（底部）（SEQ ID NO: 15）的MALDI-TOF/TOF碎裂的一系列質譜圖，其示出修飾的肽中觀察到y 4碎片增強。藉由使用每種肽的y 4和y 2碎片，確定R 異構物為2.8。
[圖12]係GDLLLK（頂部）（SEQ ID NO: 16）和G isoDLLLK（底部）（SEQ ID NO: 17）的MALDI-TOF/TOF碎裂的一系列質譜圖。雖然修飾殘基（y 5）N端碎片很小，但它顯著大於在對照肽中檢測到的碎片。在計算中使用y 5和b 4，確定R 異構物為5.8。
[圖13A-13B]係包含Asp102的胰凝乳蛋白酶水解肽的單電荷種類（M+H+； m/z1204.48）的液相層析-串聯質譜（LC-MS/MS）分析的一系列質譜圖示出修飾的肽給出非常突出的b 6+ H 2O碎片。該數據與使用MALDI-TOF/TOF觀察到的數據非常相似。
[圖14]係顯示肽碎裂和LIFT技術的MALDI-TOF/TOF儀器之儀器示意圖。
[圖15]係一系列層析圖，其示出熱應激抗體蛋白產物胰蛋白酶水解肽（目的肽的XIC）的Red/IAM
[圖16]係示出熱應激抗體蛋白產物Tryp之層析圖。峰P1、P2和P4具有相同的m/z。P3係環狀醯亞胺衍生物XDDHXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。懷疑的 isoAsp係 DD和 DH或 DDH，其中 isoAsp殘基加下劃線。
[圖17]係熱應激後熱應激抗體蛋白產物的LC層析胰蛋白酶圖譜。
[圖18]係示出4種目的肽的位置之層析圖。
[圖19]示出衍生自對照（未受應激）蛋白質（頂部圖）和熱應激物質P1（底部圖）之目的肽的MALDI碎裂後的譜圖。在這兩種情況下，y 25與y 23的強度比率為大約1 : 1，表明P1係剩餘的未修飾肽。
[圖20]示出衍生自熱應激物質P2（頂部圖）和P4（底部圖）的肽的MALDI碎裂後的光譜。對於P2，y 25比y 23被確定為1.7比1，表明修飾是在isoDH處。對於P4，可容易檢測到的y 26證明修飾是在isoDD處。
[圖21]示出對照與熱應激抗體蛋白產物樣本之質譜圖。
[圖22A-22B]：圖22A示出GFYPSDIAVEWESNGQPEDNYK（SEQ ID NO: 24）（上圖）和GFYPSDIAVEWESNGQPE isoDNYK（SEQ ID NO: 25）（下圖）的MALDI-TOF/TOF碎裂。圖22B示出肽GFYPSDIAVEWESNGQPENDYK（SEQ ID NO: 26）（上圖）和GFYPSDIAVEWESNGQPEN isoDYK（SEQ ID NO: 27）（下圖）的MALDI-TOF/TOF碎裂。
[圖23A-23B]：圖23A示出TMPP修飾的GFYPSDIAVEWESNGQPEDNYK（SEQ ID NO: 24）（上圖）和TMPP修飾的GFYPSDIAVEWESNGQPEisoDNYK（SEQ ID NO: 25）（下圖）的MALDI-TOF/TOF碎裂。圖23B示出TMPP修飾的GFYPSDIAVEWESNGQPENDYK（SEQ ID NO: 26）（上圖）和TMPP修飾的GFYPSDIAVEWESNGQPENisoDYK（SEQ ID NO: 27）（下圖）的MALDI-TOF/TOF碎裂。
[圖24]示出(N-琥珀醯亞胺氧基羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧基苯基)溴化鏻（TMPP）的示例性結構。
無
 

          <![CDATA[<110>  美商安進公司（Amgen Inc.）]]>
          <![CDATA[<120>  異天冬胺酸之檢測方法]]>
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          Trp Ala Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu 
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          Trp Ala Gly Gly Asp Ala Ser Gly Glu 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Val Thr Asp Asn Val Lys 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Ala Leu Asp Gly Glu 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Ala Leu Asp Gly Glu 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Ala Leu Asp Glu Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ala Leu Asp Glu Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Ala Leu Asp Gly Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Ala Leu Asp Gly Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gly Leu Asp Leu Leu Lys 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Leu Asp Leu Leu Lys 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gly Asp Leu Leu Leu Lys 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gly Asp Leu Leu Leu Lys 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Val Val Ser Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (10)..(10)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Val Val Ser Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      20          
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      20          
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Ala Asp Leu Gly Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Ala Asp Leu Gly Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Asp Asn Tyr Lys 
                      20          
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (19)..(19)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Asp Asn Tyr Lys 
                      20          
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Asn Asp Tyr Lys 
                      20          
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (20)..(20)]]>
          <![CDATA[<223>  ISO]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Asn Asp Tyr Lys 
                      20
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011

Claims (39)

  1. 一種處理蛋白質之方法，該方法包括： (a) 將蛋白質消化為肽， (b) 對該等肽進行質譜，並藉由質譜測量 isoAsp N端肽鍵的碎裂； (c) 將該碎裂與閾值進行比較，其中該碎裂超過該閾值指示該蛋白質中存在該 isoAsp；和 (d) 拒絕包含該 isoAsp的蛋白質，或改造該蛋白質以去除該 isoAsp。
  2. 如請求項1所述之方法，該方法還包括在 (b) 之前減少電荷。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中，在 (b) 中進行質譜的該等肽帶單電荷。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之方法，其中該碎裂測量為b系列峰、y系列峰或兩者。
  5. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該質譜係基質輔助雷射脫附/電離飛行時間/飛行時間（MALDI-TOF/TOF）。
  6. 如請求項2-5中任一項所述之方法，其中該質譜係液相層析-質譜/質譜（LC-MS/MS）。
  7. 如請求項6所述之方法，其中該LC-MS/MS包括電灑電離。
  8. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中 (a) 包括熱降解。
  9. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中 (a) 包括用蛋白水解酶進行酶消化。
  10. 如請求項9所述之方法，其中該蛋白水解酶包括胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜酶或彈性蛋白酶中的至少一種。
  11. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在該蛋白質的胺基酸序列中該 isoAsp不與天冬醯胺相鄰和/或在該蛋白質的胺基酸序列中該 isoAsp不與蘇胺酸相鄰。
  12. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在該蛋白質的胺基酸序列中該 isoAsp與相鄰的天冬胺酸殘基相鄰。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該相鄰的天冬胺酸係 isoAsp或L-Asp。
  14. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中當 isoAsp N端的碎裂肽鍵的b峰和/或y峰存在時，該碎裂超過該閾值。
  15. 如請求項1-13中任一項所述之方法，其中該閾值為對照肽中L-Asp N端肽鍵的碎裂。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該對照肽的肽鍵的碎裂作為電子存儲值提供。
  17. 如請求項15所述之方法，該方法還包括對該對照肽進行質譜，從而獲得該對照肽的肽鍵的碎裂。
  18. 如請求項15-17中任一項所述之方法，其中該對照肽係合成肽。
  19. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該蛋白質係大肽、抗體、抗體片段、抗體融合肽或其抗原結合片段。
  20. 如請求項19所述之方法，其中該抗體係多株或單株抗體。
  21. 如前述請求項中任一項所述之方法，該方法還包括確定該 isoAsp在該蛋白質中的位置。
  22. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在蛋白質發現過程或蛋白質生產過程中檢測該 isoAsp。
  23. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該 isoAsp的不存在指示該蛋白質適合進一步處理。
  24. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中拒絕包含該 isoAsp的蛋白質的該 (d) 包括拒絕一定量的包含該蛋白質的產物，或拒絕產生該蛋白質的殖株。
  25. 如請求項1-23中任一項所述之方法，其中 (d) 改造該蛋白質以去除該 isoAsp包括在該蛋白質中的 isoAsp的位置處誘導點突變。
  26. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中與在相同位置包含L-Asp的參考蛋白質相比， isoAsp的存在導致肽骨架中的結構變化。
  27. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中 isoAsp的存在抑制該蛋白質之效力。
  28. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中與在相同位置包含L-Asp的參考蛋白質相比， isoAsp的存在增加該蛋白質的免疫性。
  29. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該等肽中的至少一種在該肽的N端包含正電荷。
  30. 如前述請求項中任一項所述之方法，該方法還包括向該肽的N端引入正電荷。
  31. 如請求項30所述之方法，其中藉由將該肽與N端電荷衍生試劑一起孵育來引入該正電荷。
  32. 如請求項31所述之方法，其中該N端電荷衍生試劑為(N-琥珀醯亞胺氧基羰基甲基)三(2,4,6三甲氧基苯基)溴化鏻（TMPP）或其衍生物。
  33. 如請求項31所述之方法，其中該N端電荷衍生試劑為三[2,4,6-三甲氧基苯基]乙醯鏻（TMPP-Ac）或其衍生物。
  34. 如請求項29-33中任一項所述之方法，其中該 isoAsp在該等肽中的至少一種的C端的5個胺基酸殘基內。
  35. 一種質譜系統，該質譜系統被配置用於進行如前述請求項中任一項所述之方法。
  36. 如請求項35所述之質譜系統，其中測量該 isoAsp N端肽鍵的碎裂。
  37. 如請求項35或36所述之質譜系統，其中該碎裂超過該閾值指示該蛋白質中存在 isoAsp。
  38. 如請求項35-37中任一項所述之質譜系統，其中該質譜係基質輔助雷射脫附/電離飛行時間/飛行時間（MALDI-TOF/TOF）。
  39. 如請求項35-38中任一項所述之質譜系統，其中該質譜係液相層析-質譜（LC-MS/MS），如電灑電離LC-MS/MS。
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