TW202222349A - 蛋白－藥物偶聯物和定點偶聯方法 - Google Patents

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Abstract

本申請涉及一種蛋白-藥物偶聯物，其包含抗原結合蛋白部分和藥物偶聯物部分；該抗原結合蛋白部分包括一個或多個抗原結合片段，以及與該抗原結合片段直接或間接連接的至少兩個連接肽；該兩個連接肽可各自獨立地含有第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2；該藥物偶聯物部分共價結合於該Cys1上。本申請還涉及一種蛋白-藥物偶聯物的製備方法，以及該蛋白-藥物偶聯物在預防或治療腫瘤或其他疾病中的用途。

Description

蛋白-藥物偶聯物和定點偶聯方法
本發明一般涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種蛋白-藥物偶聯物以及一種製備該蛋白-藥物偶聯物的方法。
抗體偶聯藥物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)是由靶向腫瘤抗原的抗體經由連接子與高效細胞毒性的小分子化學藥物偶聯產生的，利用抗體與靶抗原特異性結合的特點，將小分子藥物靶向遞送至腫瘤細胞進而發揮殺傷腫瘤的作用。近年來，隨著新的連接子、小分子毒素、抗體以及靶點發現技術的不斷發展，ADC早期的問題不斷被克服，陸續有ADC藥物的上市，在血液瘤、實體瘤展現良好的臨床效果。另一方面，近年來，ADC技術也被應用於非腫瘤領域；例如，AbbVie公司將類固醇偶聯於抗TNFα的抗體上用於治療多種TNFα介導的自身免疫性疾病。
偶聯方法和連接子結構對於ADC藥物的穩定性至關重要。半胱胺酸偶聯技術是早期的化學偶聯方法的代表；其利用IgG1抗體天然的4個鏈間二硫鍵作為偶聯用的活性巰基，相較於賴胺酸醯胺偶聯技術，該技術具有可控的DAR值(藥物/抗體比)，但是仍產生DAR值為0到8的分佈的混合物。由於此類 技術產生的偶聯產物成分不均一，其穩定性和藥學性能有較大不足。近年來，隨著細胞毒性藥物與定點偶聯方法的不斷發展，第三代ADC技術經由藥物與抗體經特定位點偶聯獲得穩定的DAR值，提高了抗體偶聯藥物的穩定性和藥物代謝動力學性能。第三代ADC代表的偶聯技術主要包括ThioMab、ThioBridge、引入非天然胺基酸、轉肽反應、N-糖鏈偶聯等。ThioMab技術最早由Genentech公司開發，在半胱胺酸偶聯技術基礎上，其在抗體中的除天然二硫鍵以外的特定位點引入兩個或多個半胱胺酸作為偶聯位點，用以產生位點專一的DAR為2的高均質性的抗體偶聯藥物；但是由於其引入的突變不是天然存在的胺基酸序列，因而面臨潛在的分子穩定性和免疫原性的風險。ThioBridge技術則是將單抗本身的二硫鍵還原，利用二溴馬來醯亞胺或二溴吡啶二苯醚等試劑與還原的鏈間半胱胺酸反應，使其重新橋接，得到主要組分是DAR為4的產物，但是該技術仍有發生二硫鍵錯配的風險。非天然胺基酸偶聯技術使用一種特殊的編碼非天然胺基酸的tRNA合成酶，使得細胞可以合成帶有對乙醯苯丙胺酸(p-acetylphenylalanine)殘基的各種抗體，利用對乙醯苯丙胺酸殘基的羰基與帶有烷氧基胺基團的連接子發生偶聯反應，得到主要組分是DAR為2的產物；由於該技術需要使用經過改造的宿主細胞來產生非天然胺基酸，因而其明顯的不足是抗體生產的產率較低而成本較高。利用轉肽反應的偶聯技術是在抗體的重鏈或輕鏈的C’末端引入一段序列LPETG，轉肽酶Sortase A特異識別該序列並水解蘇胺酸和甘胺酸間的肽鍵，然後再把含有甘胺酸的偶聯物連接到蘇胺酸上；但是該技術產生的偶聯產物中引入了額外的肽段序列，因而也面臨潛在的免疫原性的風險。N-糖鏈偶聯技術如GlycoConnect技術使用內切糖苷酶Endo S2修剪位於抗體CH2區的Asn297(Eu編號)的糖鏈，然後使用突變的半乳糖轉移酶 GalT(Y289L)和N-疊氮基乙醯半乳糖胺(GalNAz)引入疊氮基，利用點擊化學(Click Chemistry)將該疊氮基與小分子藥物偶聯，產生穩定且均勻的DAR為2的抗體偶聯藥物；由於該技術需要使用特殊的突變的酶，其工藝開發成本較高。
目前，儘管已經開發了多種可以定點偶聯產生具有可控的DAR值的偶聯技術，但是這些技術或是引入胺基酸突變、或是引入額外的胺基酸序列、或是改變Fc上的糖鏈結構、或是引入非天然胺基酸，其工藝開發過程繁雜且成本較高。而且現有技術中沒有通用的針對重鏈抗體、單鏈抗體或者雙特異性抗體或者融合蛋白來製備蛋白-藥物偶聯物的偶聯技術。因而仍亟需開發新的無需複雜的製備工藝的定點偶聯技術，以提高偶聯產物的穩定性，減少免疫原性。
本申請提供了蛋白-藥物偶聯物的定點偶聯方法及由該方法製備所得的蛋白藥物偶聯物。具有下列性質中的一種或多種：1)可以定點偶聯產生均一DAR值(藥物/抗體比)或均一CAR值(偶聯物/抗體比)的偶聯產物；2)相較於其他定點偶聯技術如THIOMAB技術等，可利用天然鉸鏈區胺基酸序列，不引入胺基酸突變或額外肽段序列，也不改變Fc上的糖鏈結構；3)可對天然鉸鏈區的胺基酸序列進行長度或特定位點胺基酸種類的優化，提高產物的表達量和均一度；4)無需特別複雜的偶聯技術或工藝；5)該定點偶聯方法的副產物少，可開發性強；6)抗原結合片段可擴展到多種形式，全人VH結構域、駱駝科VHH結構域、單鏈抗體scFv、可溶性受體融合蛋白等；7)抗原結合片段可擴展成多價多特異性形式；8)有良好的穩定性和半衰期；9)有更好的靶細胞內化作用；10)有更好的組織穿透性。
一方面，本申請提供了一種蛋白-藥物偶聯物，其包含抗原結合蛋白部分和藥物偶聯物部分；該抗原結合蛋白部分包括一個或多個抗原結合片段，以及與該抗原結合片段直接或間接連接的至少兩個連接肽；該至少兩個連接肽包括第一連接肽和第二連接肽；其中，該第一連接肽包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2，該藥物偶聯物部分經由該Cys1偶聯至該第一連接肽；且該第二連接肽包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2，該藥物偶聯物部分經由該Cys1偶聯至該第二連接肽。
在某些實施方式中，該第一連接肽的該Cys2與該第二連接肽的該Cys2之間經由二硫鍵連接。
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段中不包含能夠影響藥物偶聯物與該第一連接肽和/或該第二連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物，該影響表現為顯著降低藥物偶聯物在Cys1位點的偶聯機率。
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段中不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段中不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的半胱胺酸或者前述半胱胺酸與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
在某些實施方式中，該第一連接肽和該第二連接肽的胺基酸序列可以相同或不同。
在某些實施方式中，該第一連接肽和/或該第二連接肽自N端至C端包含Cys1-(X)n-Cys2所示的胺基酸序列；其中，n為大於或等於3的整數，X是不為Cys的任意胺基酸。
在某些實施方式中，該第一連接肽和/或該第二連接肽源自抗體鉸鏈區序列或其衍生序列。其中，該衍生序列為經由對抗體鉸鏈區序列進行改造獲得，該改造不涉及抗體鉸鏈區中Cys1和Cys2的改變。例如，該改造為調整抗體鉸鏈區序列中Cys1和Cys2之間的胺基酸種類、數目和/或在Cys1前進行柔性連接胺基酸的添加。
在某些實施方式中，該連接肽源自人IgG鉸鏈區，例如，該抗體鉸鏈區為人IgG1鉸鏈區。
在某些實施方式中，該連接肽為人IgG1的鉸鏈區，該第一連接肽和該第二連接肽的序列各自獨立地如SEQ ID NO：73所示，連接肽中該Cys1為人IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-220，該Cys2為人IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-226。
在某些實施方式中，該第一連接肽和該第二連接肽可以各自獨立地源自人IgG1的鉸鏈區的衍生序列，其胺基酸序列如SEQ ID NOs：74-105、145-146中任一項所示；該第一連接肽中該Cys1為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-220的Cys，該第一連接肽中該Cys2為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-226的Cys；該第二連接肽中該Cys1為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-220的Cys，該第二連接肽中該Cys2為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-226的Cys。
在某些實施方式中，該連接肽為小鼠IgG2c的鉸鏈區，該第一連接肽和該第二連接肽的序列各自獨立地如SEQ ID NO：147所示，該連接肽中的 該Cys1為小鼠IgG2c的鉸鏈區序列的第一個半胱胺酸，該Cys2為其序列的第二個半胱胺酸。
在某些實施方式中，蛋白-藥物偶聯物的抗原結合蛋白部分包括的多個抗原結合片段連接於同一該連接肽或分別連接於不同的該連接肽。
在某些實施方式中，該多個抗原結合片段可以部分或全部相同或彼此均不同。
在某些實施方式中，該多個抗原結合片段包括第一抗原結合片段和第二抗原結合片段。第一抗原結合片段和第二抗原結合片段可以相同或不同。例如，該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段結合相同的靶點且胺基酸序列相同；例如，該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段結合相同的靶點但胺基酸序列不相同；例如，該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段結合不同的靶點。
在某些實施方式中，該多個抗原結合片段包含第一抗原結合片段、第二抗原結合片段、第三抗原結合片段和第四抗原結合片段。第一抗原結合片段、第二抗原結合片段、第三抗原結合片段和第四抗原結合片段可以部分或全部相同或彼此均不同。例如，該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段結合相同的靶點且胺基酸序列相同；例如，該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段結合相同的靶點但胺基酸序列不相同；例如，該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段結合不同的靶點。例如，該第三抗原結合片段和該第四抗原結合片段結合相同的靶點且胺基酸序列相同；例如，該第三抗原結合片段和該第四抗原結合片段結合相同的靶點但胺基酸序列不相同；例如，該第三抗原結合片段和該第四 抗原結合片段結合不同的靶點。例如，該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段和該第三抗原結合片段和該第四抗原結合片段結合不同的靶點。
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段可以各自獨立地為VHH結構域、VH、VL、Fab、ScFv、受體蛋白可溶性胞外區、配體蛋白、脂質運載蛋白lipocalins、神經細胞黏附分子NCAM、纖維結合蛋白fibronectin和/或錨蛋白重複片段蛋白DARPins等衍生蛋白結構。
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段能夠特異性結合腫瘤抗原或非腫瘤抗原。
在某些實施方式中，其中該腫瘤抗原包括CD19、BCMA、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、TnAg、FLT3、CD38、CD123、CD44v6、B7H3、B7H4、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PSMA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-beta、SSEA-4、MUC1、EGFR、NCAM、CAIX、LMP2、EphA2、岩藻糖基GM1(fucosyl GM1)、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、GD2、FOLR1、FOLR2、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸(polysialic acid)、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TAARP、WT1、ETV6-AML、SPA17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、FOSL1、hTERT、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、AR(雄激素受體)、細胞週期蛋白B1(Cyclin B1)、MYCN、RhoC、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD20、CD30、HER2、ROR1、FLT3、TAAG72、CD22、CD33、GD2、gp100Tn、FAP、 酪胺酸酶(tyrosinase)、EPCAM、CEA、IGF-1R、EphB2、間皮素(mesothelin)、鈣黏蛋白17(Cadherin17)、CD32b、EGFRvIII、GPNMB、GPR64、HER3、LRP6、LYPD8、NKG2D、SLC34A2、SLC39A6、SLITRK6、GUCY2C、5T4和/或TACSTD2等。
在某些實施方式中，該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段各自獨立地抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該抗原結合片段包含選自下述的任意一組胺基酸序列：(1)HCDR1：SEQ ID NO：7，HCDR2：SEQ ID NO：22，HCDR3：SEQ ID NO：38；(2)HCDR1：SEQ ID NO：10，HCDR2：SEQ ID NO：25，HCDR3：SEQ ID NO：41；(3)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：26，HCDR3：SEQ ID NO：42；(4)HCDR1：SEQ ID NO：13，HCDR2：SEQ ID NO：28，HCDR3：SEQ ID NO：44；(5)HCDR1：SEQ ID NO：14，HCDR2：SEQ ID NO：29，HCDR3：SEQ ID NO：42；(6)HCDR1：SEQ ID NO：9，HCDR2：SEQ ID NO：24，HCDR3：SEQ ID NO：40；和(7)HCDR1：SEQ ID NO：8，HCDR2：SEQ ID NO：23，HCDR3：SEQ ID NO：39。
在某些實施方式中，該抗原結合片段包含VH，且該VH包括SEQ ID NOs：55-59、61和62中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段各自獨立地抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分別依次包含SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段各自獨立地包含VL和VH，且該VL包括SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，該VH包括SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段各自獨立地包含一對VH和VL和/或另一種VH，且該一對VH和VL分別包括SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，和該另一種VH包括SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。例如，該一對VH和VL可以形成scFv。
在某些實施方式中，該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段各自獨立地包含VH，且該VH包括SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列；和，該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段各自獨立地包含一對VH和VL，且該一對VH和VL分別包括SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：131所示的胺基酸序列。例如，該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段可以包含Fab。
在某些實施方式中，該蛋白-藥物偶聯物中的抗原結合蛋白部分還可以包含能夠使得第一連接肽和第二連接肽配對的配對單元部分，該配對單元可以包含至少第一配對亞單元和第二配對亞單元，且該第一配對亞單元可以經由共價鍵或者非共價鍵與該第二配對亞單元相互作用。
在某些實施方式中，該配對單元為Fc片段或突變的Fc片段。
在某些實施方式中，該第一配對亞單元的N端與該第一連接肽的C端連接，且該第二配對亞單元的N端與該第二連接肽的C端連接，或者，該第一配對亞單元的N端與該第二連接肽的C端連接，且該第二配對亞單元的N端與該第一連接肽的C端連接。
在某些實施方式中，該蛋白-藥物偶聯物包含SEQ ID NOs：64-71、106-129、148-149中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該蛋白-藥物偶聯物的該藥物偶聯物部分包括分別與第一連接肽和第二連接肽連接的兩個藥物偶聯物，該藥物偶聯物包含載荷藥物以及視需要地連接子。
在某些實施方式中，該蛋白-藥物偶聯物中該藥物偶聯物包含至少一個載荷藥物。該載荷藥物可以包含但不局限於小分子化合物、毒素分子、抗生素、寡核苷酸、蛋白降解靶向嵌合體(PROTAC)、親和配體、螢光或核素標記基團、多肽、免疫調節劑等。
在某些實施方式中，該連接子包含可斷裂的連接子或非可斷裂的連接子；其中，該可斷裂的連接子包含蛋白酶可切割的連接子。
在某些實施方式中，該藥物偶聯物包括mc-vc-PAB-MMAE(如圖6所示)。
在某些實施方式中，該藥物偶聯物包括PROTAC，例如一種BRD4的蛋白降解劑(如圖64所示)。
在某些實施例中，該蛋白-藥物偶聯物為抗體-藥物偶聯藥物(ADC)。
另一方面，本申請提供了一種製備本申請所述的蛋白-藥物偶聯物的方法，其包括使該藥物偶聯物與該第一連接肽和/或該第二連接肽上的該Cys1的反應性巰基進行共價結合。
另一方面，本申請提供了一種製備蛋白-藥物偶聯物的方法。該蛋白-藥物偶聯物包含抗原結合蛋白部分和藥物偶聯物部分；該抗原結合蛋白部分 包括一個或多個抗原結合片段，以及與該抗原結合片段直接或間接連接的至少兩個連接肽；該兩個連接肽包含第一連接肽和第二連接肽，其中該第一連接肽包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2，且該第二連接肽包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2；該方法包括使該藥物偶聯物部分經由該第一連接肽的該Cys1與該第一連接肽聯結，和/或使該藥物偶聯物部分經由該第二連接肽的該Cys1與該第二連接肽聯結。
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段中不包含能夠影響藥物偶聯物與該第一連接肽和/或該第二連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物，該影響表現為顯著降低藥物偶聯物在Cys1位點的偶聯機率。
在某些實施方式中，該方法中的該一個或多個抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的半胱胺酸或者前述半胱胺酸與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
在某些實施方式中，該方法中的該第一連接肽和該第二連接肽的胺基酸序列可以相同或不同。
在某些實施方式中，該方法中的該第一連接肽和/或該第二連接肽自N端至C端包含Cys1-(X)n-Cys2所示的胺基酸序列；其中，n為大於或等於3的整數，X是指不為Cys的任意胺基酸。
在某些實施方式中，該第一連接肽和/或該第二連接肽源自抗體鉸鏈區序列或其衍生序列。
在某些實施方式中，該方法中的該衍生序列為經由對抗體鉸鏈區序列進行改造獲得，該改造不涉及抗體鉸鏈區中Cys1和Cys2的改變。在某些實施方式中，該改造為調整抗體鉸鏈區序列中Cys1和Cys2之間的胺基酸種類、數目和/或在Cys1前進行柔性連接胺基酸的添加。
在某些實施方式中，該方法中的該連接肽為人IgG鉸鏈區，較佳地人IgG1鉸鏈區。
在某些實施方式中，該方法中的該第一連接肽為人IgG1的鉸鏈區，該第一連接肽序列如SEQ ID NO：73所示，該第一連接肽中該Cys1為人IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-220，該Cys2為人IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-226。
在某些實施方式中，該方法中的該第二連接肽為人IgG1的鉸鏈區，該第二連接肽序列如SEQ ID NO：73所示，該第二連接肽中該Cys1為人IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-220，該Cys2為人IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-226。
在某些實施方式中，該方法中的該第一連接肽可以源自人IgG1的鉸鏈區的衍生序列，其胺基酸序列如SEQ ID NOs：74-105、145-146中任一項所示的序列，該第一連接肽中該Cys1為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-220的Cys，連接肽中該Cys2為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-226的Cys。
在某些實施方式中，該方法中的該第二連接肽可以源自人IgG1的鉸鏈區的衍生序列，其胺基酸序列如SEQ ID NOs：74-105、145-146中任一項所 示的序列，該第二連接肽中該Cys1為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-220的Cys，連接肽中該Cys2為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-226的Cys。
在某些實施方式中，該方法中的該第一連接肽為小鼠IgG2c的鉸鏈區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：147所示，該第一連接肽中該Cys1為其序列的第一個半胱胺酸，該Cys2為其序列的第二個半胱胺酸。
在某些實施方式中，該方法中的該第二連接肽為小鼠IgG2c的鉸鏈區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：147所示，該第二連接肽中該Cys1為其序列的第一個半胱胺酸，該Cys2為其序列的第二個半胱胺酸。
在某些實施方式中，該方法包括還原、偶聯以及視需要地純化步驟。
在某些實施方式中，該還原包括在還原劑的條件下使該第一連接肽的該Cys1和該第二連接肽的該Cys1之間的二硫鍵還原。
在某些實施方式中，該還原包括使用還原劑DTT和/或TCEP；在某些實施方式中，該還原劑為TCEP。
在某些實施方式中，該還原劑的用量為1至50莫耳倍數；在某些實施方式中，該還原劑的用量為1至6莫耳倍數；在某些實施方式中，還原劑用量為1.5至3莫耳倍數。
在某些實施方式中，該還原的反應時長為1至17小時；在某些實施方式中，該還原反應時長為1至3小時；在某些實施方式中，還原反應時長為1.5至2小時。
在某些實施方式中，該還原的反應溫度為0至40℃；在某些實施方式中，該還原的反應溫度為0℃或室溫(25-30℃)或37℃。
在某些實施方式中，該還原的反應緩衝液pH為4.0至9.0；在某些實施方式中，該還原反應緩衝液pH為5.0至8.0；在某些實施方式中，該pH為5.0至7.0；在某些實施方式中，該pH為5.0至6.0。
在某些實施方式中，該偶聯包括使該藥物偶聯物與該第一連接肽和/或該第二連接肽上的該Cys1的反應性巰基進行共價結合。
在某些實施方式中，該藥物偶聯物包括mc-vc-PAB-MMAE或PROTAC或CpG寡核苷酸。
在某些實施方式中，該藥物偶聯物的用量為1至50莫耳倍數；在某些實施方式中，該藥物偶聯物的用量為1至10莫耳倍數；在某些實施方式中，藥物偶聯物用量為3至7莫耳倍數。
在某些實施方式中，該藥物偶聯物是mc-vc-PAB-MMAE，mc-vc-PAB-MMAE的用量為1至50莫耳倍數；在某些實施方式中，mc-vc-PAB-MMAE的用量為3至18莫耳倍數；在某些實施方式中，mc-vc-PAB-MMAE的用量為3至7莫耳倍數。
在某些實施方式中，該藥物偶聯物PROTAC的用量為10至15莫耳倍數。
在某些實施方式中，該偶聯的反應時長為0.5至10小時；在某些實施方式中，該偶聯反應時長為0.5至3小時；在某些實施方式中，偶聯反應時長為0.5至1小時。
在某些實施方式中，該偶聯的反應溫度為0至40℃；在某些實施方式中，該偶聯的反應溫度為室溫(25-30℃)。
在某些實施方式中，該偶聯的反應緩衝液pH為4.0至9.0；在某些實施方式中，該偶聯的反應緩衝液pH為5.0至8.0；在某些實施方式中，該pH為5.0至7.0；在某些實施方式中，該pH為7.0至8.0；在某些實施方式中，該pH為5.0至6.0。
在某些實施方式中，該蛋白-藥物偶聯物的純度大於80%。例如，該蛋白-藥物偶聯物的純度大於82%、大於85%、大於88%或大於90%。
在某些實施方式中，該製備方法可以提供一種包括“還原”和“偶聯”的反應步驟和反應條件參數的組合；該反應步驟和反應條件參數的組合可以進一步提高偶聯產物中單一組分的含量，減少額外的“純化”步驟的需求；在某些實施方式中，經過偶聯步驟後無需額外的純化步驟即可以得到純度大於90%的高均質性的偶聯產物；進一步在某些實施方式中，該高均質性的偶聯產物是位點特異性地偶聯於Cys1的CAR=2的蛋白-藥物偶聯物。
另一方面，本申請提供了包含該蛋白-藥物偶聯物和藥學上可接受的載體的醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了預防和/或治療疾病的方法，其包括施用該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物，視需要地，該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物與其他療法或藥物聯用。
另一方面，本申請提供了該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤或其他疾病。
另一方面，本申請提供了該蛋白-藥物偶聯物與其他療法或藥物聯用在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤或其他疾病。
在某些實施方式中，該其他療法或藥物選自下組：化療、放療、miRNA和寡核苷酸。
在某些實施方式中，該腫瘤選自下組中的任意一種或多種：淋巴瘤、多發性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、間皮瘤、食管癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、胸腺癌和結直腸癌。
另一方面，本申請提供了診斷特定疾病的方法，其包括使用該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了檢測特定靶標的方法，其包括使用該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物，較佳地，該檢測為非疾病診斷目的的。
另一方面，本申請提供了用於檢測的試劑盒，其包括該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物，和視需要地使用說明。
另一方面，本申請提供了給藥裝置，其包括該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物，以及施用該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物的裝置。
本申請的發明人意外的發現：在沒有輕鏈的情況下，人IgG1重鏈鉸鏈區的Cys-220(Eu編碼)有機會形成重鏈間的二硫鍵，但是這個二硫鍵沒有其他的二硫鍵穩定，只需要用較弱的還原劑就可以把Cys-220的二硫鍵和其他二硫鍵區分開，使Cys-220的二硫鍵可以被有效地打開而其他二硫鍵保持完整，進而使得Cys-220成為幾乎唯一的游離半胱胺酸殘基作為定點偶聯位元點與藥物偶聯物進行共價結合。經由對人IgG1天然鉸鏈區的Cys-220和Cys-226之間的胺基酸種類和數量進行調整或在Cys-220前添加柔性連接肽形成的鉸鏈區衍生序列同樣能夠作為連接肽以實現在對應於天然鉸鏈區Cys-220位元點的定點偶聯。
在符合本領域常識的基礎上，上述各條件，可任意組合，即得本申請各較佳實例。
圖1顯示的是人IgG1抗體的二硫鍵結構。
圖2顯示了具有人IgG1抗體鉸鏈區序列的重鏈抗體HCAb的結構，以及鉸鏈區二硫鍵結構在人IgG1和HCAb之間的差異。
圖3顯示了在HCAb結構中，位於鉸鏈區的220位置(Eu編號)的半胱胺酸Cys-220的兩種可能狀態：Cys-220形成或者未形成重鏈之間的二硫鍵。
圖4顯示了HCAb PR000020的非還原樣品分子量分析的質譜反褶積處理圖譜。
圖5顯示了HCAb PR000020的木瓜蛋白酶Papain酶切分析結果：(A)Cys-220是否形成重鏈之間的二硫鍵的假設以及相應的酶切產物組分推測；(B)酶切產物的非還原SDS-PAGE的結果。
圖6顯示了(A)含有藥物偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的ADC示意圖和mc-vc-PAB-MMAE(也稱為VcMMAE)的結構，mc-vc-PAB-MMAE由連接子mc-vc-PAB和載荷藥物MMAE組成，(圖中“抗體”和“ADCs”僅作為一般性的示意，不指代本發明的“抗原結合蛋白”或“蛋白-藥物偶聯物”的特定結構)；和(B)質譜分析中mc-vc-PAB-MMAE的特徵碎片結構。
圖7顯示了HCAb PR000020及其偶聯產物PR000020-ADC結合高表達CTLA4的細胞的結合活性。
圖8顯示了HCAb PR000020及其偶聯產物PR000020-ADC的HIC-HPLC分析結果：(A)HCAb偶聯前；(B)偶聯後，純化前；(C)偶聯及一步HIC純化後。
圖9顯示了HCAb PR000020及其偶聯產物PR000020-ADC的RP-HPLC分析結果：(A)HCAb偶聯前；(B)偶聯後，純化前；(C)偶聯及一步HIC純化後。
圖10顯示了HCAb PR000020的偶聯產物PR000020-ADC的分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)非還原樣品；(B)還原樣品。
圖11顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR000020-ADC的化合物偶聯位點：(A)PR000020-ADC的胺基酸序列，含有Cys-IAM的多肽片段用灰色背景標識；(B)PR000020-ADC樣品中含有Cys-IAM的多肽片段；(C)PR000020樣品中含有Cys-IAM的多肽片段；(B)和(C)中表的各列名釋義見(C)下方。
圖12顯示了HCAb PR000759蛋白表達純化後的樣品的SEC-HPLC分析結果。
圖13顯示了HCAb PR000759的偶聯產物PR000759-ADC經一步HIC純化後的樣品的HIC-HPLC分析結果。
圖14顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR000759-ADC的化合物偶聯位點，和篩選出的帶有偶聯位點的肽段；其中表的各列名釋義同圖11(C)。
圖15顯示了HCAb PR000759及其偶聯產物PR000759-ADC的分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)PR000759的非還原樣品；(B)PR000759-ADC的非還原樣品；(C)PR000759-ADC的還原樣品。
圖16顯示了HCAb PR001046蛋白表達純化後的樣品的SEC-HPLC分析結果。
圖17顯示了HCAb PR001046的偶聯產物PR001046-ADC經一步HIC純化後的樣品的HIC-HPLC分析結果。
圖18顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR001046-ADC的化合物偶聯位點，和篩選出的帶有偶聯位點的肽段；其中表的各列名釋義同圖11(C)。
圖19顯示了HCAb PR001046及其偶聯產物PR001046-ADC的分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)PR001046的非還原樣品；(B)PR001046-ADC的非還原樣品；(C)PR001046-ADC的還原樣品。
圖20顯示了HCAb PR001046及其偶聯產物PR001046-ADC結合高表達BCMA的細胞的結合活性。
圖21顯示了PR001046-ADC的特異性的細胞毒性：(A)特異性地殺傷BCMA+細胞NCI-H929以及混合細胞；(B)不同純度的ADC(D2組分)對於細胞毒性的影響。
圖22顯示了HCAb PR004432蛋白表達純化後的樣品的SEC-HPLC分析結果。
圖23顯示了HCAb PR004432的偶聯產物PR004432-ADC經一步HIC純化後的樣品的RP-HPLC分析結果。
圖24顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR004432-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的肽段，以及對應的偶聯位點覆蓋率。
圖25顯示了HCAb PR004432的偶聯產物PR004432-ADC的分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)非還原樣品；(B)還原樣品。
圖26顯示了HCAb PR004432及其偶聯產物PR004432-ADC結合高表達5T4的細胞的結合活性。
圖27顯示了PR004432-ADC對高表達5T4的細胞的特異性的細胞毒性。
圖28顯示了HCAb PR004433蛋白表達純化後的樣品的SEC-HPLC分析結果。
圖29顯示了HCAb PR004433的偶聯產物PR004433-ADC經一步HIC純化後的樣品的HIC-HPLC分析結果。
圖30顯示了HCAb PR004433及其偶聯產物PR004433-ADC的HIC-HPLC分析結果：(A)HCAb偶聯前；(B)偶聯後，純化前；(C)偶聯及一步HIC純化後。
圖31顯示了HCAb PR004433的偶聯產物PR004433-ADC的分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)非還原樣品；(B)還原樣品。
圖32顯示了HCAb PR004433及其偶聯產物PR004433-ADC結合表達BCMA的細胞的結合活性：(A)結合高表達人BCMA的細胞HEK293T-hBCMA；(B)結合高表達人BCMA的細胞NCI-H929；(C)不結合BCMA陰性細胞SNU-16。
圖33顯示了PR004433-ADC的特異性的細胞毒性：(A)對HEK293T-hBCMA有特異性的細胞毒性；(B)對HEK293T沒有細胞毒性；(C)對NCI-H929有特異性的細胞毒性；(D)對SNU-16沒有細胞毒性。
圖34顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR004433-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的肽段，以及對應的偶聯位點覆蓋率。
圖35顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR000020-ADC的化合物偶聯位點時，篩選出的帶有偶聯位點的肽段所對應的二級譜圖。
圖36顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR000020-ADC的化合物偶聯位點時，酶解肽段PHGSDIWGQGTMVTVSSEPKSC#DK(#表示偶聯位點)在ADC樣品(上)和單抗樣品(下)的XIC圖。
圖37顯示了利用LC-MS分析PR002129中Cys-220的二硫鍵：(A)顯示了在PR002129的結構中，Cys-220的兩種可能狀態；(B)PR002129的非還原樣品分子量分析的質譜反褶積處理圖譜。
圖38顯示了HCAb PR000184及其C220S衍生變體的DSC熱力學分析曲線圖：(A)PR000184；(B)PR000184(C220S)。
圖39顯示了HCAb PR000453及其C220S衍生變體的DSC熱力學分析曲線圖：(A)PR000453；(B)PR000453(C220S)。
圖40顯示了HCAb PR004432、其C220S衍生變體和其偶聯產物利用Uncle分析平臺測定熔解溫度Tm：(A)PR004432；(B)PR004432(C220S)；(C)PR004432-ADC。
圖41舉例說明瞭本發明具體實施方式中該“蛋白-藥物偶聯物”的組成部分以及相關術語。
圖42顯示了示例性的抗原結合蛋白：(A)具有兩個抗原結合片段和兩個連接肽的抗原結合蛋白；(B)具有四個抗原結合片段和兩個連接肽的抗原結合蛋白。
圖43顯示了利用圖42所示的抗原結合蛋白進行偶聯產生的示例性的蛋白-藥物偶聯物：(A)具有兩個抗原結合片段和兩個連接肽的蛋白-藥物偶聯物；(B)具有四個抗原結合片段和兩個連接肽的蛋白-藥物偶聯物。
圖44顯示了不同物種的鉸鏈區序列和二硫鍵結構：(A)人、小鼠和羊駝的不同IgG同型的鉸鏈區序列，半胱胺酸Cys被標識出；(B)人IgG1鉸鏈區序列和二硫鍵結構；(C)人IgG4鉸鏈區序列和二硫鍵結構；(D)小鼠IgG1鉸鏈區序列和二硫鍵結構；(E)小鼠IgG2a鉸鏈區序列和二硫鍵結構。
圖45顯示了HCAb PR004433在不同的還原和偶聯反應條件下製備的偶聯產物利用LC-MS分析非還原樣品的完整分子量所得到的質譜圖中的總離子流圖(TIC)，分別對應於實施例10.1的表10-1和表10-2中的實驗編號：(A)實驗#8；(B)實驗#9；(C)實驗#11；(D)實驗#12。
圖46顯示了HCAb PR004433及其變體分子結合NCI-H929細胞的結合活性。
圖47顯示了HCAb PR006468的偶聯產物PR006468-ADC的非還原樣品的完整分子量分析的質譜反褶積處理圖譜。
圖48顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR006468-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的肽段，以及對應的偶聯位點覆蓋率。
圖49顯示了BCMA結合蛋白(HCAb PR004433，HCAb PR006468)及其偶聯產物(PR004433-ADC，PR006468-ADC)結合NCI-H929細胞的結合活性。
圖50顯示了PR006468-ADC和PR004433-ADC對NCI-H929細胞的細胞毒性。
圖51顯示了PR002129的偶聯產物PR002129-ADC的HIC-HPLC分析結果：(A)偶聯後，純化前；(B)偶聯及一步HIC純化後。
圖52顯示了PR002129的偶聯產物PR002129-ADC的分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)HIC純化前樣品的非還原分子量；(B)HIC純化後樣品的還原分子量；(C)HIC純化後樣品的非還原分子量。
圖53顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR002129-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的肽段，以及對應的偶聯位點覆蓋率。
圖54顯示了PR002129及其偶聯產物PR002129-ADC結合高表達ROR1的細胞的結合活性。
圖55顯示了SIRPa-Fc融合蛋白PR006345的偶聯產物PR006345-ADC的純化前樣品的HIC-HPLC分析結果。
圖56顯示了SIRPa-Fc融合蛋白PR006345的偶聯產物PR006345-ADC的純化前樣品的非還原分子量分析的質譜反褶積處理圖譜。
圖57顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR006345-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的肽段，以及對應的偶聯位點覆蓋率。
圖58顯示了PR006345及其偶聯產物PR006345-ADC結合高表達CD47的細胞的結合活性。
圖59顯示了四價雙特異性抗原結合蛋白PR005744的結構。
圖60顯示了PR005744在NCI-H929細胞上的內化。
圖61顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR005744-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的肽段，以及對應的偶聯位點覆蓋率。
圖62顯示了PR005744及其偶聯產物PR005744-ADC結合NCI-H929細胞的結合活性。
圖63顯示了PR005744-ADC對NCI-H929細胞的細胞毒性。
圖64顯示了BRD4蛋白降解劑(PROTAC)的分子結構。
圖65顯示了HCAb PR004433與PROTAC進行偶聯的產物PR004433-PROTAC的純化前樣品的非還原分子量分析的質譜反褶積處理圖譜。
圖66顯示了HCAb PR004433及其偶聯產物PR004433-PROTAC結合NCI-H929細胞的結合活性。
圖67顯示了二價雙特異性抗原結合蛋白2129/4433的結構。
圖68顯示了2129/4433的偶聯產物2129/4433-ADC的純化前樣品的HIC-HPLC分析結果。
圖69顯示了利用LC-MS肽譜圖分析2129/4433-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的肽段，以及對應的偶聯位點覆蓋率。
圖70顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR001046-ADC的化合物偶聯位點時，篩選出的帶有偶聯位點的肽段所對應的二級譜圖。
圖71顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR006468-ADC的化合物偶聯位點時，篩選出的帶有偶聯位點的肽段所對應的二級譜圖。
圖72顯示了利用LC-MS肽譜圖分析2129/4433-ADC的化合物偶聯位點時，篩選出的帶有偶聯位點的肽段所對應的二級譜圖。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中，術語“免疫球蛋白”(Ig)與“抗體”在本文中可互換使用。基本的四鏈抗體單元是異四聚體蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構成。在IgG的情況中，每個L鏈經由一個共價二硫鍵連接到H鏈，而兩條H鏈經由一個或多個二硫鍵彼此相連，二硫鍵的數目取決於H鏈的同種型。每個H和L鏈還具有規律間隔的鏈內二硫鍵。每條H鏈在胺基端具有可變結構域(VH)，接著是三個(對於每條α和γ鏈)或四個(對於μ和ε同種型)恆定結構域(CH)。每條L鏈在胺基端具有可變結構域(VL)，接著是一個恆定結構域(CL)。人IgG有四個亞型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人或鼠類的抗體L鏈還進一步分為κ鏈和λ鏈兩種，相應地，其可變結構域分為Vκ和Vλ，其恆定結構域分為Cκ和Cλ。
在本申請中，術語“結合蛋白”或者“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。典型地，該“結合蛋白”或者“抗原結合蛋白”可以包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高變區和相對保守的框架區(FR)。每個VH和VL可由三個CDR和四個FR區構成。VH和VL含有與抗原相互作用的結合位點。VH的三個CDR分別表示為HCDR1、HCDR2和HCDR3，也可表示為VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；VL的三個CDR分別表示為LCDR1、LCDR2和LCDR3，也可表示為VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。抗原結合蛋白的實例可以包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物、受體蛋白可溶性胞外區、配體蛋白或其他形式的融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，該CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的。但是，本領域人員公知，在本領域中可以經由多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬裡蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Bio1 273：927-48,1997)。在本發明的技術方案中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則來確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。該Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍，詳見下表。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變 區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如經由本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當在本發明的保護範圍中。
Figure 110145684-A0101-12-0026-1
其中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第24位至第34位的胺基酸序列；H26-H32可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位至第32位的胺基酸序列。本領域技術人員應當知曉的是，在用Chothia編碼CDR時，有些位置會有插入位元點的情況(可參見http：//bioinf.org.uk/abs/)。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的細胞中獲得的抗體，即集群中的抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以經由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，但是不被解釋為需要經由任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以經由重組DNA方法製備。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因全部轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的胺基酸序列所組成。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術等。
在本申請中，術語“特異性結合”通常是指抗原結合蛋白與抗原表位結合，並且該結合需要抗原結合蛋白和表位之間的一些互補性。根據該定義，當抗體相比於其將結合隨機的，不相關的表位而言更容易經由其抗原結合蛋白與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。“表位”是指抗原上與抗原結合蛋白(如抗體)結合的特定的原子基團(例如，糖側鏈、磷醯基、磺醯基)或胺基酸。
在本申請中，術語“Fab”通常指常規抗體(例如IgG)中與抗原結合的部分，包括抗體的重鏈可變區VH、輕鏈可變區VL和重鏈恆定區結構域CH1以及輕鏈恆定區CL。在常規抗體中，VH的C端與CH1的N端聯結形成重鏈 Fd片段，VL的C端與CL的N端聯結形成輕鏈，CH1的C端又進一步與重鏈的鉸鏈區和其他恆定區結構域聯結形成重鏈。在某些實施方式中，“Fab”也指Fab的變體結構。例如，在某些實施方式中，VH的C端與CL的N端聯結形成一個多肽鏈，VL的C端與CH1的N端聯結形成另一個多肽鏈，形成Fab(cross VH/VL)的結構；在某些實施方式中，Fab的CH1不與鉸鏈區聯結，而是CL的C端與重鏈的鉸鏈區聯結，形成Fab(cross Fd/LC)的結構。
在本申請中，術語“VH”通常指抗體的重鏈可變區VH結構域。在某些實施方式中，“VH”可以是人或者其他動物的常規抗體(H2L2結構)的重鏈可變區VH。在某些實施方式中，“VH”也可以是駱駝科等動物的重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VHH。在某些實施方式中，“VH”還可以是利用Harbour HCAb轉基因小鼠產生的全人源重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VH。
在本申請中，術語“抗原結合片段”通常指任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域。在某些實施方式中，“抗原結合片段”可以是“Fab”。在某些實施方式中，“抗原結合片段”也可以是“VH”。在某些實施方式中，“抗原結合片段”也可以是單鏈抗體scFv。在某些實施方式中，“抗原結合片段”還可以是其他抗原結合形式(例如受體蛋白可溶性胞外區、配體蛋白、脂質運載蛋白(lipocalins)、神經細胞黏附分子(NCAM)、纖維結合蛋白(fibronectin)、錨蛋白重複片段蛋白(DARPins)等衍生蛋白結構)。
在本申請中，術語“配對單元”通常是指一組含有至少兩個可以互相配對的亞單元的結構。該互相配對的亞單元之間可以互相結合，該結合需要亞單元之間的互補性；該互相配對的亞單元之間可以發生共價鍵或者非共價鍵相互作用；該非共價鍵相互作用可以包括範德華力、氫鍵、疏水作用、靜電作用、 偶極作用等。“配對單元”可以是天然存在的或者經過修飾的具有同源或者異源多聚體形式的多肽鏈的集合；例如，“配對單元”可以是抗體Fc片段或其變體的二聚體形式；“配對單元”可以是CD79的α鏈和β鏈；“配對單元”可以是CD8的α鏈和β鏈；“配對單元”可以是T細胞受體(TCR)的α鏈和β鏈。
在本申請中，術語“Fc片段”通常是指抗體的可結晶片段(fragment crystallizable,Fc)，即包含由重鏈恆定結構域CH2和CH3組成的多肽鏈。在某些實施方式中，Fc片段可以是天然的二聚體形式；在另一些實施方式中，Fc片段可以是修飾的單體形式。
在本申請中，術語“CTLA4”通常是指細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4(也稱為CD152)、其功能變體和/或其功能片段。CTLA4序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人CTLA4序列可以在Uniprot登錄號P16410中找到；示例性的全長的食蟹猴CTLA4序列可以在Uniprot登錄號G7PL88中找到。針對CTLA4的藥物可能應用於治療黑色素瘤、肺癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌等腫瘤。
在本申請中，術語“BCMA”通常是指腫瘤壞死因數受體超家族成員17(也稱為CD269，B細胞成熟蛋白)、其功能變體和/或其功能片段。BCMA序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人BCMA序列可以在Uniprot登錄號Q02223中找到；示例性的全長的食蟹猴BCMA序列可以在NCBI登錄號XP_005591343中找到。針對BCMA的藥物可能應用於治療多發性骨髓瘤和其他血液系統惡性腫瘤。
在本申請中，術語“MSLN”通常是指間皮素分子(也稱為MPF)、其功能變體和/或其功能片段。MSLN序列是本領域已知的。例如，示例性的全長 的人MSLN序列可以在Uniprot登錄號Q13421中找到；示例性的全長的食蟹猴MSLN序列可以在NCBI登錄號XP_005590873中找到。針對MSLN的藥物可能應用於治療間皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等腫瘤。
在本申請中，術語“5T4”通常是指滋養細胞糖蛋白(也稱為TPBG)、其功能變體和/或其功能片段。5T4序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人5T4序列可以在Uniprot登錄號Q13641中找到；示例性的全長的食蟹猴5T4序列可以在Uniprot登錄號Q4R8Y9中找到。針對5T4的藥物可能應用於治療胸腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、小腸癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌等腫瘤。
在本申請中，術語“ROR1”通常是指失活酪胺酸蛋白激酶跨膜受體ROR1(也稱為NTRKR1)、其功能變體和/或其功能片段。ROR1序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人ROR1序列可以在Uniprot登錄號Q01973中找到；示例性的全長的食蟹猴ROR1序列可以在NCBI登錄號XP_015290264中找到。針對ROR1的藥物可能應用於治療白血病、非霍奇金淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤。
在本申請中，術語“CD47”通常是指白細胞表面抗原CD47、其功能變體和/或其功能片段。CD47序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人CD47序列可以在Uniprot登錄號Q08722中找到。針對CD47的藥物可能應用於治療白血病、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、頭頸癌等腫瘤。
在本申請中，術語“SIRPα”通常是指信號調節蛋白α(也稱為BIT、MFR、MYD1、PTPNS1、SHPS1或SIRP)、其功能變體和/或其功能片段。 SIRPα是CD47的受體。SIRPα序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人SIRPα序列可以在Uniprot登錄號P78324中找到。
在本申請中，術語“蛋白-藥物偶聯物”通常是指一類將藥物偶聯物經由共價鍵結合到抗原結合蛋白而形成的藥物分子。該藥物偶聯物包含至少一個載荷藥物。本領域已知多種蛋白-藥物偶聯物及其製備方法。在某些實施例中，該蛋白-藥物偶聯物可以是抗體-藥物偶聯藥物(ADC)。例如，示例性的蛋白-藥物偶聯物可包括但不限於曲妥珠單抗(trastuzumab)，奧瑞珠單抗(ocrelizumab)，帕妥珠單抗(pertuzumab)，利妥昔單抗(rituximab)等抗體可以經由連接子單元將載荷藥物模組共價附著至抗體以形成抗體-藥物偶聯物，以實現靶向治療效應。在某些實施例中，“蛋白-藥物偶聯物”可以包含抗原結合片段、連接肽和藥物偶聯物。在某些實施例中，“蛋白-藥物偶聯物”的該藥物偶聯物可以是mc-vc-PAB-MMAE(也稱為VcMMAE)。
在本申請中，術語“藥物偶聯物”通常是指一類可以經由特定官能團以共價鍵結合到其他分子的、具有特定結構的原子和基團的集合體；其包含至少一個載荷藥物，和視需要地包含連接子。本領域已知多種載荷藥物、多種連接子或連接子構件。在某些實施例中，該藥物偶聯物可以是mc-vc-PAB-MMAE(也稱為VcMMAE)。
在本申請中，術語“載荷藥物”通常是指一類具有藥學活性的小分子化合物或者毒素或其他藥物分子形式，可以是但不局限於小分子化合物、毒素分子、抗生素、寡核苷酸、蛋白降解靶向嵌合體(PROTAC)、親和配體、螢光基團、核素基團、多肽、免疫調節分子等。本領域已知多種載荷藥物，例如單甲基 奧瑞司他汀E(“MMAE”，momomethyl auristatin E)，美登素(“DM1”，Mertansine)，Toll樣受體激動劑分子。
在本申請中，術語“連接肽”或“肽段”通常是指本申請中該“蛋白-藥物偶聯物”中的多肽鏈的一部分，該連接肽含有至少一個半胱胺酸以作為與藥物偶聯物共價結合的位點。在本申請中，該連接肽可以包括第一連接肽和/或第二連接肽，該第一連接肽與該第二連接肽的胺基酸序列可以相同或不同。
在本申請中，術語“連接子”、“連接子單元”、“接頭”或“接頭單元”通常是指為可用於連接一個或多個載荷藥物與抗原結合蛋白以形成“蛋白-藥物偶聯物”的化學官能模組。連接子可包含一種或多種連接子構件，本領域已知多種連接子構件，例如，馬來醯亞胺基己醯基(“MC”，maleimidocaproyl)，纈胺酸-瓜胺酸(“val-cit”或“vc”，valine-citrulline)，對胺基苄氧羰基(“PAB”，p-aminobenzyloxycarbonyl)。在本申請中，該“連接子”可以包括由胺基酸組成的多肽連接子，但是該“連接子”與前述“連接肽”不同，前述“連接肽”是抗原結合蛋白的一部分。
在本申請中，術語“綴合物”通常是指本申請中該“藥物偶聯物”與特定官能團發生共價結合形成的原子和基團的集合體。在某些實施例中，該綴合物可以是藥物偶聯物與巰基發生反應形成的。例如，在某些實施例中，該綴合物可以是mc-vc-PAB-MMAE的馬來醯亞胺活性反應基團與巰基發生加成反應形成的穩定的原子/基團的集合體。
在本申請中，術語“DAR”(Drug-Antibody Ratio)通常是指載荷藥物-抗體比例，即抗體所連接載荷藥物數量的平均值。目前的蛋白-藥物偶聯物所帶的載藥量通常為0~8個載荷藥物分子(D0~D8)/抗體。通常，也用“D0”、“D2”、 “D4”、“D6”和“D8”分別表示偶聯產物中的沒有偶聯載荷藥物分子(DAR=0)、偶聯了2個載荷藥物分子(DAR=2)、偶聯了4個載荷藥物分子(DAR=4)、偶聯了6個載荷藥物分子(DAR=6)和偶聯了8個載荷藥物分子(DAR=8)的蛋白-藥物偶聯物組分。在某些實施例中，“D0”也稱為“裸抗”。HIC-HPLC分析方法是測定蛋白-藥物偶聯物的DAR和載藥量分佈的常用分析方法。
在本申請中，術語“CAR”(Conjugate/Antigen binding protein Ratio)來表示藥物偶聯物-抗原結合蛋白比例，即抗原結合蛋白所連接藥物偶聯物數量的平均值。通常一個藥物偶聯物包含至少一個載荷藥物；在一些實施方式中，現有技術可以使一個藥物偶聯物部分只含有一個載荷藥物，即此情形中，“CAR”和“DAR”的值可以等同；在另一些實施方式中，現有技術可以使一個藥物偶聯物部分經由連接子連接多個載荷藥物(參見，Kumara等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters(2018),28,3617-3621)，即在此情形中，“DAR”的值可以數倍於“CAR”的值；例如，當一個藥物偶聯物含有兩個載荷藥物時，DAR值可以為CAR值的2倍。
在本申請的具體實施例中，經由利用人IgG1抗體重鏈鉸鏈區的天然序列(SEQ ID NO：73)中的半胱胺酸Cys-220(Eu編號)作為偶聯位點，聯結本申請該藥物偶聯物，可以產生均一CAR值的蛋白-藥物偶聯物，特別地，該方法可以產生均一的CAR=2的蛋白-藥物偶聯物。在本申請的一些具體實施例中，當使用mc-vc-PAB-MMAE作為藥物偶聯物進行偶聯時，由於一個mc-vc-PAB-MMAE只含有一個載荷藥物MMAE，因此CAR值和DAR值可以等同，也可以使用DAR值來指代一個抗原結合蛋白所連接的藥物偶聯物的數量；特別地，該 方法可以產生均一DAR值的蛋白-藥物偶聯物，例如，該蛋白-藥物偶聯物的DAR=2。
在本申請中，術語“源自”通常是指從親本胺基酸或核苷酸序列得到的衍生胺基酸或核苷酸序列，它通常指親本序列和衍生序列的結構相似性，不暗含或包含對源自親本序列的衍生序列的過程或來源限制，因此使用“源自”討論蛋白或多核苷酸時，不管其物理起源。在某些情形中，“源自”可以是指衍生序列是未經修飾的、親本序列的一部分。例如，在本申請的具體實施例中，Cys1、Cys2可以是未經修飾的天然的抗體鉸鏈區序列的一部分。
一方面，本申請提供了以下實施方案：
1.蛋白-藥物偶聯物，其基本上由第一多肽鏈和第二多肽鏈組成，該第一多肽鏈包含第一半胱胺酸(Cys1)和第二半胱胺酸(Cys2)，該第二多肽鏈包含第一半胱胺酸(Cys1)第二半胱胺酸(Cys2)，且該第一多肽鏈的Cys1處偶聯有結構-L1-P1，該第二多肽鏈的Cys1處偶聯有結構-L2-P2。
2.根據實施方案1所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該結構-L1-P1可以沒有L1。
3.根據實施方案1至2中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該結構-L2-P2可以沒有L2。
4.根據實施方案1至3中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該L1和/或該L2包含連接子。
5.根據實施方案4所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該連接子包括可斷裂連接子。
6.根據實施方案4-5中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該連接子包括蛋白酶敏感型連接子。
7.根據實施方案4至6中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該連接子包括mc-vc-PAB。
8.根據實施方案1至7中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該P1和/或該P2包含載荷藥物。
9.根據實施方案8所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該載荷藥物包含藥物活性成分和標記分子。
10.根據實施方案8至9中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該載荷藥物包括小分子化合物、毒素分子、寡核苷酸、蛋白降解靶向嵌合體(PROTAC)、親和配體、標記基團、抗生素、多肽和/或免疫調節分子。
11.根據實施方案1至10中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該P1和P2可以相同或不同。
12.根據實施方案1至11中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該L1和L2可以相同或不同。
13.根據實施方案1至12中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該L1和P1以共價結合方式連接。
14.根據實施方案1至13中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該L2和P2以共價結合方式連接。
15.根據實施方案1至14中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈包含第一抗原結合片段。
16.根據實施方案1至15中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第二多肽鏈包含第二抗原結合片段。
17.根據實施方案15或16所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一抗原結合片段和/或第二抗原結合片段靶向腫瘤抗原或非腫瘤抗原。
18.根據實施方案15至17中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該抗原結合片段包含VH、VL、scFv、Fab、dAb、受體蛋白可溶性胞外區和/或衍生蛋白結構等。
19.根據實施方案1至18中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其還包含配對單元。
20.根據實施方案19所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該配對單元為Fc結構域。
21.根據實施方案1至20中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈包含第一連接肽，該第二多肽鏈包含第二連接肽。
22.根據實施方案15至21中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該抗原結合片段經由該連接肽與該配對單元連接。
23.根據實施方案15至22中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該抗原結合片段的C端與該第一連接肽和/或第二連接肽的N端連接。
24.根據實施方案15至23中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一連接肽和/或第二連接肽的C端與該配對單元的N端連接。
25.根據實施方案1至24中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈或第二多肽鏈各自獨立地包含SEQ ID NO：64-77、106-129、148-149中任一項所示的胺基酸序列。
26.根據實施方案1至25中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈自N端至C端依次包含該第一抗原結合片段、該第一連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)和該配對單元。
27.根據實施方案1至26中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第二多肽鏈自N端至C端依次包含該第二抗原結合片段、該第二連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)和該配對單元。
28.根據實施方案1至27中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈自N端至C端依次包含該第一抗原結合片段的VH、該第一抗原結合片段的VL、該第一連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
29.根據實施方案28所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第二多肽鏈自N端至C端依次包含該第二抗原結合片段的VH、該第二抗原結合片段的VL、該第二連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
30.根據實施方案1至27中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈自N端至C端依次包含該第一抗原結合片段的VL、該第一抗原結合片段的VH、該第一連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
31.根據實施方案30所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第二多肽鏈自N端至C端依次包含該第二抗原結合片段的VL、該第二抗原結合片段的VH、該第二連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
32.根據實施方案1至27中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈自N端至C端依次包含該第一抗原結合片段的VH、該第一連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
33.根據實施方案32所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第二多肽鏈自N端至C端依次包含該第二抗原結合片段的VH、該第二連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
34.蛋白-藥物偶聯物，根據實施方案1至33中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，以及第三多肽鏈和/或第四多肽鏈。
35.根據實施方案1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其還包含第三抗原結合片段和/或第四抗原結合片段。
36.根據實施方案34或35所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第三抗原結合片段和/或第四抗原結合片段包括抗體或其抗原結合片段。
37.根據實施方案35至36中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈自N端至C端依次包含該第三抗原結合片段、該第一抗原結合片段、該第一連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)和該配對單元。
38.根據實施方案35至37中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第二多肽鏈自N端至C端依次包含該第四抗原結合片段、該第二抗原結合片段、該第二連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)和該配對單元。
39.根據實施方案35至38中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈自N端至C端依次包含該第三抗原結合片段的VL、該第三抗原結合片段的CL、該第一抗原結合片段的VH、該第一連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
40.根據實施方案35至39中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第二多肽鏈自N端至C端依次包含該第四抗原結合片段的VL、該第四抗原結合片段 的CL、該第二抗原結合片段的VH、該第二連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
41.根據實施方案35至40中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第三多肽鏈自N端至C端，依次包含該第三抗原結合片段的VH和該第三抗原結合片段的CH1。
42.根據實施方案35至41中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第四多肽鏈自N端至C端，依次包含該第四抗原結合片段的VH和該第四抗原結合片段的CH1。
43.根據實施方案35至42中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第三抗原結合片段和/或第四抗原結合片段為Fab。
44.根據實施方案35至43中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段的胺基酸序列相同，和/或，該第三抗原結合片段和該第四抗原結合片段的胺基酸序列相同。
45.根據實施方案35至44中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈和該第二多肽鏈的胺基酸序列相同，和/或，該第三多肽鏈和該第四多肽鏈的胺基酸序列相同。
46.根據實施方案1至27中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一多肽鏈自N端至C端依次包含該第一抗原結合片段的受體蛋白可溶性胞外區、該第一連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
47.根據實施方案46所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第二多肽鏈自N端至C端依次包含該第二抗原結合片段的受體蛋白可溶性胞外區、該第二連接肽(例如，IgG的鉸鏈區)、CH2和CH3。
抗原結合蛋白
一方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白。
在本申請中，該抗原結合蛋白包含至少兩個連接肽、一個或者多個抗原結合片段。
在本申請中，兩個連接肽分別為第一連接肽和第二連接肽；第一連接肽和第二連接肽的胺基酸序列可以相同或不同。
在本申請的該抗原結合蛋白中，該第一連接肽可以至少包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2，且該第二連接肽可以至少包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2。
在本申請的該抗原結合蛋白中，該第一連接肽的Cys1和該第二連接肽的Cys1之間可以形成二硫鍵，稱為“二硫鍵Cys1-Cys1”。
在本申請的該抗原結合蛋白中，該第一連接肽的Cys2和該第二連接肽的Cys2之間可以形成二硫鍵，稱為“二硫鍵Cys2-Cys2”。
在本申請的該抗原結合蛋白中，該“二硫鍵Cys1-Cys1”弱於該“二硫鍵Cys2-Cys2”。特別地，在具體的實施方式中，二硫鍵Cys1-Cys1相比二硫鍵Cys2-Cys2，更容易被還原劑所打開。
在本申請中，該抗原結合蛋白中的該第一連接肽的該Cys1和該Cys2之間可以相隔至少3個(例如，4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個或更多)不為半胱胺酸的胺基酸。
在本申請中，該抗原結合蛋白中的該第二連接肽的該Cys1和該Cys2之間可以相隔至少3個(例如，4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個或更多)不為半胱胺酸的胺基酸。
例如，該第一連接肽自N端至C端可以包含Cys1-(X)n-Cys2所示的胺基酸序列，其中，n可以為大於或等於3的整數(例如n可為3，n可為4，n可為5，n可為6，n可為7，n可為8，n可為9，n可為10，n可為11，n可為12，n可為13，n可為14，n可為15，或n可為大於15的整數)；該X指的是不為Cys的任意胺基酸。
例如，該第二連接肽自N端至C端可以包含Cys1-(X)n-Cys2所示的胺基酸序列，其中，n可以為大於或等於3的整數(例如n可為3，n可為4，n可為5，n可為6，n可為7，n可為8，n可為9，n可為10，n可為11，n可為12，n可為13，n可為14，n可為15，或n可為大於15的整數)；該X指的是不為Cys的任意胺基酸。
在本申請中，該抗原結合蛋白中的該連接肽可以是含有至少兩個半胱胺酸(Cys1和Cys2)的天然存在的胺基酸序列，也可以是對“含有至少兩個半胱胺酸的天然存在的胺基酸序列”進行改造獲得的衍生序列。該“改造”不涉及天然存在的胺基酸序列中Cys1和Cys2的改變；例如，該改造為調整天然存在的胺基酸序列中Cys1和Cys2之間的胺基酸種類、數目和/或在Cys1前進行柔性連接肽(如GSGS、GGGGS)的添加。
例如，該第一連接肽或第二連接肽可以為人IgG的鉸鏈區(SEQ ID NO：73)，該Cys1為人IgG鉸鏈區根據EU編碼的Cys-220。
例如，該第一連接肽可以為人IgG1的鉸鏈區，連接肽序列如SEQ ID NO：73所示，連接肽中該Cys1為天然IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-220，該Cys2為天然IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-226。又例如，該第一連接肽可以為源自人IgG1的鉸鏈區的衍生序列，其胺基酸序列如SEQ ID NOs：74-105、 145-146中任一項所示的序列，連接肽中該Cys1為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-220的Cys，連接肽中該Cys2為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-226的Cys。
例如，該第二連接肽可以為人IgG1的鉸鏈區，連接肽序列如SEQ ID NO：73所示，連接肽中該Cys1為天然IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-220，該Cys2為天然IgG1鉸鏈區根據EU編碼的Cys-226。又例如，該第二連接肽可以為源自人IgG1的鉸鏈區的衍生序列，其胺基酸序列如SEQ ID NOs：74-105、145-146中任一項所示的序列，連接肽中該Cys1為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-220的Cys，連接肽中該Cys2為對應於人IgG1鉸鏈區Cys-226的Cys。
例如，該第一連接肽或第二連接肽可以為小鼠IgG2c的鉸鏈區(SEQ ID NO：147)，該Cys1為其序列的第一個半胱胺酸，該Cys2為其序列的第二個半胱胺酸。
在本申請中，該“一個或多個抗原結合片段”中的“多個抗原結合片段”可以部分或全部相同或都不同；該“相同”是指兩種或以上的抗原結合片段的胺基酸序列相同，該“不同”是指兩種或以上抗原結合片段的胺基酸序列不同，兩種或以上的抗原結合片段可以識別不同的抗原或表位，也可以是，兩種或以上的抗原結合蛋白識別相同的抗原或相同表位元，但序列和結構不同。
在本申請中，該抗原結合蛋白可以包含至少兩個該抗原結合片段。在本申請中，該抗原結合蛋白可以包含第一抗原結合片段和第二抗原結合片段(如圖42(A)所示結構)，第一抗原結合片段和第二抗原結合片段的胺基酸序列可以相同或不同，第一抗原結合片段和第二抗原結合片段的靶點可以相同或不同。
在本申請中，該抗原結合蛋白還可以進一步包含第三抗原結合片段和/或第四抗原結合片段(如圖42(B)所示結構)；第一、二、三、四抗原結合片段可以部分或全部相同或不同。
在本申請中，一個或多個抗原結合片段可以連接於同一連接肽，也可以連接於不同連接肽。該抗原結合片段可以位於該連接肽的N端或者C端。
在本申請中，該抗原結合蛋白包含第一連接肽和該第二連接肽，包含第一抗原結合片段和第二抗原結合片段，該抗原結合蛋白可以包括以下結構：
(a)該第一抗原結合片段的C端可以與該第一連接肽的N端直接或間接連接，且該第二抗原結合片段的C端可以與該第二連接肽的N端直接或間接連接，具有如圖42(A)所示結構；
(b)該第一抗原結合片段的N端可以與該第一連接肽的C端直接或間接連接，且該第二抗原結合片段的C端可以與該第二連接肽的N端直接或間接連接；
(c)該第一抗原結合片段的N端可以與該第一連接肽的C端直接或間接連接，且該第二抗原結合片段的N端可以與該第二連接肽的C端直接或間接連接；
(d)該第一抗原結合片段的C端可以與該第一連接肽的N端直接或間接連接，且該第二抗原結合片段的N端可以與該第二連接肽的C端直接或間接連接。
在本申請中，該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段可以指任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域，既可以是來源於駱駝或者HCAb轉基因鼠的VHH結構域，也可以是單鏈抗體scFv；或者是其他抗原結合形式(如受體蛋白可溶性胞外區、配體蛋白、脂質運載蛋白lipocalins、神經細胞黏附分子NCAM、纖維結合蛋白fibronectin、錨蛋白重複片段蛋白DARPins等衍生蛋 白結構)。但是，該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段中不包含能夠影響藥物偶聯物與連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團。
在本申請中，該第一抗原結合片段和/或第二抗原結合片段中不包含能夠影響藥物偶聯物與連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團。例如，該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽和/或第二連接肽的Cys1的側鏈巰基形成共價鍵例如二硫鍵的官能團。例如，在某些具體實施例中，該第一抗原結合片段和/或第二抗原結合片段不包含含有恆定區Cys-214(Eu編號)的輕鏈或輕鏈片段。
在本申請中，該抗原結合蛋白還可以進一步包含第三抗原結片段和/或第四抗原結合片段。進一步包含的第三抗原結合片段和/或第四抗原結合片段進一步連接在上述(a)或(b)或(c)或(d)的該抗原結合蛋白的N端或者C端：
例如，該第三抗原結合片段的C端可以與該第一抗原結合片段的N端直接或者間接相連，且該第一抗原結合片段的C端可以與該第一連接肽的N端連接；和/或，該第四抗原結合片段的C端可以與該第二抗原結合片段的N端直接或者間接相連，且該第二抗原結合片段的C端可以與該第二連接肽的N端連接；具有如圖42(B)所示結構。
在本申請的該抗原結合蛋白的結構中，該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段可以包含任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域，既可以是“Fab”，也可以是“VH”，也可以是單鏈抗體scFv；還可以是其他抗原結合形式(例如受體蛋白可溶性胞外區、配體蛋白、脂質運載蛋白(lipocalins)、神經細胞黏附分子(NCAM)、纖維結合蛋白(fibronectin)、錨蛋白重複片段蛋白(DARPins)等衍生蛋白結構。
在本申請中，該抗原結合蛋白還可以包含能夠使得第一連接肽和第二連接肽配對的配對單元，該配對單元可以包含第一配對亞單元和第二配對亞單元，且該第一配對亞單元可以經由共價鍵或者非共價鍵與該第二配對亞單元相互作用。
在某些實施方式中，“配對單元”可以是抗體Fc片段或其變體的二聚體形式；
在某些實施方式中，“配對單元”可以是非對稱的二聚體形式，例如第一配對亞單元是具有“knob”突變(T366W)的Fc片段單體，而第二配對亞單元是具有“hole”突變(T366S/L368A/Y407V)的Fc片段單體；
在某些實施方式中，“配對單元”可以是非對稱的二聚體形式，例如第一配對亞單元是CD8的α鏈，而第二配對亞單元是CD8的β鏈；
在某些實施方式中，“配對單元”可以是非對稱的二聚體形式，例如第一配對亞單元是CD79的α鏈，而第二配對亞單元是CD79的β鏈；
在某些實施方式中，“配對單元”可以是非對稱的二聚體形式，例如第一配對亞單元是T細胞受體的α鏈，而第二配對亞單元是T細胞受體的β鏈。
在某些實施方式中，該第一配對亞單元的N端可以與該第一連接肽的C端連接，且該第二配對亞單元的N端與該第二連接肽的C端連接；或者，該第一配對亞單元的N端可以與該第二連接肽的C端連接，且該第二配對亞單元的N端與該第一連接肽的C端連接。
在某些具體實施方式中，本申請提供了一種具有如圖42(A)所示結構的抗原結合蛋白，其具有如下結構特徵：
該抗原結合蛋白可以包含第一連接肽和第二連接肽，第一抗原結合片段和第二抗原結合片段，和配對單元；
該第一連接肽和第二連接肽的胺基酸序列可以相同或不同；
該第一抗原結合片段與該第二抗原結合片段的靶點可以相同或不同；該第一抗原結合片段與該第二抗原結合片段的胺基酸序列可以相同或不同；
該配對單元可以是Fc片段同源或異源二聚體；
該第一抗原結合片段的C端與可以該第一連接肽的N端直接或間接連接，且該第二抗原結合片段的C端可以與該第二連接肽的N端直接或間接連接；
該第一連接肽和第二連接肽的C端分可以別與該Fc片段的N端連接；
該第一連接肽可以包含至少兩個半胱胺酸Cys1和Cys2，該Cys1和Cys2之間相隔至少3個不為Cys的任意胺基酸；
該第二連接肽可以包含至少兩個半胱胺酸Cys1和Cys2，該Cys1和Cys2之間相隔至少3個不為Cys的任意胺基酸；
該第一連接肽的Cys1和該第二連接肽的Cys1之間可以形成二硫鍵；
該第一連接肽的Cys2和該第二連接肽的Cys2之間可以形成二硫鍵；
該第一連接肽和/或該第二連接肽可以源自人IgG1鉸鏈區序列(SEQ ID NO：73)或其衍生序列(SEQ ID NOs：74-105、145-146)或者源自小鼠IgG2c的鉸鏈區序列(SEQ ID NO：147)；
該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段可以指任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域，既可以是來源於駱駝或者HCAb轉基因鼠的VHH結構域，也可以是單鏈抗體scFv；或者是其他抗原結合形式(如受體蛋白可 溶性胞外區、配體蛋白、脂質運載蛋白lipocalins、神經細胞黏附分子NCAM、纖維結合蛋白fibronectin、錨蛋白重複片段蛋白DARPins等衍生蛋白結構)；
該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段中不包含能夠影響藥物偶聯物與連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團；例如，不包含能夠與該第一連接肽和該第二連接肽中Cys1的側鏈巰基形成共價鍵官能團；例如，不包含能夠與該第一連接肽和該第二連接肽中Cys1的側鏈巰基形成二硫鍵的官能團；例如，不包含含有恆定區Cys-214(Eu編號)的輕鏈或輕鏈片段；
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段中不包含能夠影響藥物偶聯物與該第一連接肽和/或該第二連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物，該影響表現為顯著降低該藥物偶聯物在Cys1位點的偶聯機率，該顯著降低可以包括下述一項或多項：
1)顯著降低該Cys1與該藥物偶聯物進行偶聯的機率，
2)當存在該官能團或該綴合物時，使得該連接肽的Cys1與該藥物偶聯物偶聯的機率可能降低至50%、40%、30%、20%、10%或更低，
3)當存在該官能團或該綴合物時，使得製備得到的該蛋白-藥物偶聯物的純度為低於50%，例如，低於40%、30%、20%、10%或更低，
4)當存在該官能團或該綴合物時，該官能團或該綴合物與該Cys1之間發生相互作用，使得該Cys1不能與該藥物偶聯物進行偶聯，或者，使得該Cys1不能在本申請所述的方法中與該藥物偶聯物進行偶聯；
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段可以不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物；
在某些實施方式中，該一個或多個抗原結合片段可以不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的半胱胺酸或者前述半胱胺酸與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
在某些具體實施方式中，本申請還提供了一種具有如圖42(B)所示結構的抗原結合蛋白，其具有如下結構特徵：
具有如圖42(A)所示結構的抗原結合蛋白的結構特徵；
在具有如圖42(A)所示結構的抗原結合蛋白的基礎上進一步包含了第三抗原結合片段和第四抗原結合片段；
該第三抗原結合片段的C端可以與該第一抗原結合片段的N端直接或者間接相連，且該第一抗原結合片段的C端可以與該第一連接肽的N端連接；
該第四抗原結合片段的C端可以與該第二抗原結合片段的N端直接或者間接相連，且該第二抗原結合片段的C端可以與該第二連接肽的N端連接；
該第一抗原結合片段，該第二抗原結合片段，該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段可以部分或完全相同或都不同；例如，第一、二抗原結合片段相同，第三、四結合片段相同，第一、三抗原結合片段不同，第二、四抗原結合片段不同；
該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段可以包含任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域，既可以是“Fab”，也可以是“VH”，也可以是單鏈抗體scFv；還可以是其他抗原結合形式(例如受體蛋白可溶性胞外區、配體 蛋白、脂質運載蛋白(lipocalins)、神經細胞黏附分子(NCAM)、纖維結合蛋白(fibronectin)、錨蛋白重複片段蛋白(DARPins)等衍生蛋白結構；
該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段中同樣不包含能夠影響藥物偶聯物與連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物；例如不包含能夠與該第一連接肽和該第二連接肽中Cys1的側鏈巰基形成二硫鍵的官能團；
該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物；
該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的半胱胺酸或者前述半胱胺酸與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
本申請的抗原結合蛋白可以靶向特定抗原。
該抗原結合蛋白可包含一個或多個抗原結合片段，可以結合靶細胞上的特定抗原。例如，該靶細胞上的特定抗原可以為腫瘤抗原。又例如，該腫瘤抗原可以是CD19、BCMA、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、Tn Ag、FLT3、CD38、CD123、CD44v6、B7H3、B7H4、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PSMA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-beta、SSEA-4、MUC1、EGFR、NCAM、CAIX、LMP2、EphA2、岩藻糖基GM1(fucosyl GM1)、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、GD2、FOLR1、FOLR2、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸(polysialic acid)、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、 GPR20、LY6K、OR51E2、TAARP、WT1、ETV6-AML、SPA17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、FOSL1、hTERT、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、AR(雄激素受體)、細胞週期蛋白B1(Cyclin B1)、MYCN、RhoC、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD20、CD30、HER2、ROR1、FLT3、TAAG72、CD22、CD33、GD2、gp100Tn、FAP、酪胺酸酶(tyrosinase)、EPCAM、CEA、IGF-1R、EphB2、間皮素(mesothelin)、鈣黏蛋白17(Cadherin17)、CD32b、EGFRvIII、GPNMB、GPR64、HER3、LRP6、LYPD8、NKG2D、SLC34A2、SLC39A6、SLITRK6、GUCY2C、5T4和/或TACSTD2等。
例如，該腫瘤抗原可以是MSLN；例如，該腫瘤抗原可以是BCMA；例如，該腫瘤抗原可以是5T4；例如，該腫瘤抗原可以是ROR1。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體或其抗原結合片段。例如，該抗原結合片段可以包括抗體重鏈可變區VH，又例如，該抗原結合片段可以包括單鏈抗體可變區scFv，又例如，該抗原結合片段可以包括受體蛋白可溶性胞外區融合蛋白。
例如，該抗原結合蛋白可以包含靶向CTLA4的抗體或其抗原結合片段、靶向MSLN的抗體或其抗原結合片段、靶向BCMA的抗體或其抗原結合片段、靶向5T4的抗體或其抗原結合片段、靶向ROR1的抗體或其抗原結合片段和/或靶向CD47的SIRPα胞外區衍生的可溶性融合蛋白。
在本申請中，該CTLA4抗原結合片段可包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO：7、22和38 所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。例如，其重鏈可變區VH可包括如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。又例如，該CTLA4抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。
在本申請中，該CTLA4抗原結合片段可包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO：8、23和39所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。例如，其重鏈可變區VH可包括如SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。又例如，該CTLA4抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列。
在本申請中，該MSLN抗原結合片段可包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO：10、25和41所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。例如，其重鏈可變區VH可包括如SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。又例如，該MSLN抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列。
在本申請中，該5T4抗原結合片段可包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO：13、28和44所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。例如，其重鏈可變區VH可包括如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。又例如，該5T4抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列。
在本申請中，該BCMA抗原結合片段可包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO：9、24和40所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。例如， 其重鏈可變區VH可包括如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。又例如，該BCMA抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。
在本申請中，該BCMA抗原結合片段可包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO：11、26和42所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。例如，其重鏈可變區VH可包括如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。又例如，該BCMA抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列。
在本申請中，該BCMA抗原結合片段可包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO：14、29和42所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。例如，其重鏈可變區VH可包括如SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。又例如，該BCMA抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。又例如，該BCMA抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NOs：106-129、148中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該ROR1抗原結合片段可包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO：49、51和53所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO：12、27和43所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。例如，其輕鏈可變區VL可包括如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，其重鏈可變區VH可包括如SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。又例如，該ROR1抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列。
在本申請中，該CD47抗原結合蛋白可包含一個多肽鏈，如SEQ ID NO：149所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白還可以包括重鏈恆定區CH2和CH3以及鉸鏈區，該重鏈恆定區(含鉸鏈區)的序列包括如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列，該鉸鏈區序列較佳人IgG1抗體重鏈鉸鏈區序列(SEQ ID NO：73)。
在本申請中，該抗原結合蛋白還可以是具有如圖59所示的對稱的、含有四個抗原結合片段的且含有四條多肽鏈的結構；該抗原結合蛋白包括抗原結合片段A和抗原結合片段B；該抗原結合片段A和該抗原結合片段B靶向不同的抗原或抗原表位；該抗原結合片段A為Fab結構，該抗原結合片段B為VH結構；在該抗原結合蛋白中，該抗原結合片段A的數量為二個，該抗原結合片段B的數量為二個；該抗原結合蛋白從N端至C端依次為抗原結合片段A、抗原結合片段B和Fc，其中該抗原結合片段A與該抗原結合片段B之間直接相連，該抗原結合片段B與該Fc經由連接肽(或鉸鏈區)連接。該抗原結合蛋白具有四條多肽鏈，該四條多肽鏈包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈；該第一多肽鏈和該第二多肽鏈具有相同的胺基酸序列，稱為“長鏈”；該第三多肽鏈和該第四多肽鏈具有相同的胺基酸序列，稱為“短鏈”；該短鏈從N端至C端依次包括VH_A-CH1，該長鏈從N端至C端依次包括VL_A-CL-VH_B-L-CH2-CH3；其中，VH_A和VL_A分別為該抗原結合片段A的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH_B為該抗原結合片段B的重鏈可變區，該L為連接肽。在某些實施方式中，該連接肽具有如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。在某些實施方式中，該抗原結合片段A包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：131所示的胺基酸序列，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO： 130所示的胺基酸序列；該抗原結合片段B包含重鏈可變區，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。在某些實施方式中，該抗原結合蛋白包含兩條相同的“短鏈”和兩條相同的“長鏈”(圖59)，該“短鏈”包括如SEQ ID NO：134所示的胺基酸序列，該“長鏈”包括如SEQ ID NO：135所示的胺基酸序列。
本申請中，該CDR均可包含在所限序列的基礎上進行突變的情形。該突變為在該VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換。本申請中，在類似“具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換”中“胺基酸突變”是指相較於原胺基酸序列而言，變體的序列存在胺基酸的突變，包括在原胺基酸序列的基礎上發生胺基酸的插入、缺失或替換。示例性的解釋是對CDR的突變可以包含3個、2個或1個胺基酸的突變，這些CDR之間可以視需要地選擇相同或不同數目的胺基酸殘基進行突變，例如可以是對CDR1進行1個胺基酸的突變，對CDR2和CDR3不進行胺基酸突變。
本申請中，該VH、VL、或該多肽鏈均可包含在所限定的序列的基礎上進行突變的情形。該突變為所限定的胺基酸序列上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加，且該突變的胺基酸序列與所限定的胺基酸序列具有至少85%序列同源性，並保持或改善了該抗體或其抗原結合片段、結合蛋白的結合活性；該至少85%序列同源性較佳為至少90%序列同源性；更佳為至少95%序列同源性；最佳為至少99%序列同源性。
在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以經由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G) 或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何演算法。該同源性也可以經由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA演算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST演算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
藥物偶聯物
本申請該蛋白-藥物偶聯物可以包含至少一個藥物偶聯物；該藥物偶聯物可以以共價結合形式聯結在該蛋白-藥物偶聯物中的蛋白部分上。
該藥物偶聯物可以包含至少一個載荷藥物。該載荷藥物可以包含藥物活性物成分和/或標記分子。
在本申請中，載荷藥物是一類具有藥學活性的小分子化合物或者毒素或其他藥物分子形式，可以是但不局限於小分子化合物、毒素分子、抗生素、 寡核苷酸、蛋白降解靶向嵌合體(PROTAC)、親和配體、螢光基團、核素基團、多肽、免疫調節分子(例如，Toll樣受體激動劑分子，STING激動劑分子)等。本領域已知多種載荷藥物。例如，小分子化合物通常是指具有較強細胞毒性的一類物質。示例性的小分子化合物可經由包括但不限於微管蛋白結合、DNA結合、抑制RNA聚合酶、蛋白質合成或抑制拓撲異構酶等機制來發揮此類細胞毒性和細胞抑制性效應。例如，小分子化合物可以是微管蛋白抑制劑；例如，該微管蛋白抑制劑可以是美登素(例如，DM1或DM4)和奧瑞司他汀(例如，MMAE或MMAF)等等。例如，該小分子化合物可以是DNA損傷劑；例如，該DNA損傷劑可以是卡奇黴素(Calicheamicins)、吡咯並苯并二氮雜卓(PBD，pyrrolobenzodiazepines)等等。例如，蛋白降解靶向嵌合體(PROTAC)是一類能夠經由誘導靶蛋白的多聚泛素化而導致靶蛋白降解的化合物；例如，該PROTAC可以是BET蛋白降解劑。
在本申請中，該藥物偶聯物還可以包含至少一個連接子。例如，該連接子可包含可斷裂連接子或非可斷裂連接子。該連接子用於將一個或多個載荷藥物連接到抗原結合蛋白。在本申請中，可斷鏈的連接子可以是便於釋放藥物的“可切割”連接子。例如，可切割連接子可以包括但不局限於酸敏感連接子，蛋白酶敏感連接子，光敏感連接子，或含二硫化物連接子。
在本申請中，該連接子可具有能夠與抗原結合蛋白上存在的游離半胱胺酸反應以形成共價鍵的官能團。例如，此類反應性官能團可以包括但不局限於馬來醯亞胺，鹵代乙醯胺，α-鹵代乙醯基，活化的酯諸如琥珀醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、醯氯、磺醯氯、異氰酸酯、和異硫氰酸酯。例如，該連接子可具有能夠與抗原結合蛋白上存在的親電子基團反 應的官能團。例如，此類反應性官能團可以包括但不局限於醯肼(hydrazide)，肟(oxime)，胺基(amino)，肼(hydrazine)，硫代半卡巴腙(thiosemicarbazone)，肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)，和芳醯肼(arylhydrazide)。
在本申請中，連接子可包含一種或多種連接子構件，本領域已知多種連接子構件，例如，馬來醯亞胺基己醯基(“MC”，maleimidocaproyl)，馬來醯亞胺基丙醯基(“MP”)，纈胺酸-瓜胺酸(“val-cit”或“vc”，valine-citrulline)，對胺基苄氧羰基(“PAB”，p-aminobenzyloxycarbonyl)。
在本申請中，該藥物偶聯物是mc-vc-PAB-MMAE(也稱為VcMMAE，結構如圖6所示，CAS No.：646502-53-6)，其包含連接子mc-vc-PAB和載荷藥物MMAE。
在本申請中，該藥物偶聯物還可以是BRD4蛋白降解劑(結構如圖64所示)，其包含靶向BET的PROTAC GNE-987和含二硫化物的連接子。
蛋白-藥物偶聯物
另一方面，本申請提供了一種蛋白-藥物偶聯物。
在本申請中，該蛋白-藥物偶聯物包含至少一個抗原結合蛋白部分和至少一個藥物偶聯物部分。
在本申請中，該抗原結合蛋白部分是前面“抗原結合蛋白”描述的靶向特定抗原的、包含一個或多個抗原結合片段的和至少兩個連接肽的抗原結合蛋白。
在本申請中，該藥物偶聯物包含至少一個載荷藥物。該載荷藥物可以包含但不局限於小分子化合物、毒素分子、抗生素、寡核苷酸、蛋白降解靶 向嵌合體(PROTAC)、親和配體、螢光標記基團、核素標記基團、多肽、免疫調節分子(例如，Toll樣受體激動劑)等。
在本申請中，該藥物偶聯物還可以包含至少一個連接子。
在本申請中，該載荷藥物可以經由該連接子以共價鍵結合方式偶聯到該抗原結合蛋白；在本申請中，該載荷藥物可以經由該連接子以共價鍵結合方式偶聯到該抗原結合蛋白中的該連接肽上。
在本申請中，該藥物偶聯物可以經由該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1與該抗原結合蛋白聯結，進而產生該蛋白-藥物偶聯物。
在本申請中，經由斷裂抗原結合蛋白第一連接肽和第二連接肽的Cys1間的二硫鍵形成反應性巰基官能團實現與藥物偶聯物在Cys1處的共價結合。
在本申請中，該一個或多個抗原結合片段不包含能夠影響藥物偶聯物與連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團；例如，不包含能夠與該連接肽中Cys1的側鏈巰基形成共價鍵官能團；例如，不包含能夠與該連接肽中Cys1的側鏈巰基形成二硫鍵的官能團。
在本申請中，該藥物偶聯物與該抗原結合蛋白的聯結主要發生在該第一連接肽和/或該第二連接肽的Cys1位點，幾乎不發生在其他半胱胺酸位點(例如，Cys2位點)。例如，該連接肽的Cys1被該藥物偶聯物所結合的機率至少為50%，也可以至少為55%，也可以至少為60%，也可以至少為65%，也可以至少為70%，也可以至少為75%，也可以至少為80%，也可以至少為85%，也可以至少為90%，也可以至少為95%，也可以至少為99%。例如，該連接肽的 Cys2被該藥物偶聯物所結合的機率至多為50%，也可以至多為45%，也可以至多為40%，也可以至多為35%，也可以至多為30%，也可以至多為25%，也可以至多為20%，也可以至多為15%，也可以至多為10%，也可以至多為5%。
在本申請中，以該第一連接肽和/或第二連接肽中的Cys1作為偶聯位點，聯結本申請該藥物偶聯物，可以產生均一DAR值的蛋白-藥物偶聯物。在一些具體的實施例中，產生含有兩個藥物偶聯物(即CAR=2；當該藥物偶聯物的一個單元僅含有一個載荷藥物時，也是DAR=2，也作D2)的均一偶聯產物。在一些具體的實施例中，偶聯產物中的具有CAR=2(或DAR=2，也作D2)的蛋白-藥物偶聯物分子為主要組分，該CAR=2(或DAR=2，也作D2)的組分的含量至少為50%，也可以至少為55%，也可以至少為60%，也可以至少為65%，也可以至少為70%，也可以至少為75%，也可以至少為80%，也可以至少為85%，也可以至少為90%，也可以至少為95%。在一些具體的實施例中，偶聯產物中含有超過80%的CAR=2(或DAR=2，也作D2)的組分，且偶聯主要發生於第一連接肽和第二連接肽中的該Cys1；無需經過進一步純化步驟，即可得到均一DAR值的蛋白-藥物偶聯物。
在本申請中，利用人IgG1抗體重鏈鉸鏈區的天然序列(SEQ ID NO：73)中的半胱胺酸Cys-220(Eu編號)作為偶聯位點，聯結本申請該藥物偶聯物，可以產生均一DAR值的蛋白-藥物偶聯物。在一些具體的實施例中，產生含有兩個藥物偶聯物(即CAR=2；當該藥物偶聯物的一個單元僅含有一個載荷藥物時，也是DAR=2，也作D2)的均一偶聯產物。在一些具體的實施例中，偶聯產物中的具有CAR=2(或DAR=2，也作D2)的蛋白-藥物偶聯物分子為主要組分，該CAR=2(或DAR=2，也作D2)的組分的含量至少為50%，也可以至少為55%， 也可以至少為60%，也可以至少為65%，也可以至少為70%，也可以至少為75%，也可以至少為80%，也可以至少為85%，也可以至少為90%，也可以至少為95%。在一些具體的實施例中，偶聯產物中含有超過80%的CAR=2(或DAR=2，也作D2)的組分，且偶聯主要發生於人IgG1鉸鏈區中的Cys-220(Eu編號)；無需經過進一步純化步驟，即可得到均一DAR值的蛋白-藥物偶聯物。
在本申請中，該蛋白-藥物偶聯物可以具有如圖41或圖43所示結構。
在本申請中，該蛋白-藥物偶聯物可以是抗體偶聯藥物(ADC)。
本申請還提供了一種利用具有如圖42(A)所示結構的抗原結合蛋白進行藥物偶聯，得到的具有如圖43(A)所示結構的蛋白-藥物偶聯物，其具有如下結構特徵：
具有如圖42(A)所示結構的抗原結合蛋白的結構特徵；
該蛋白-藥物偶聯物包含第一連接肽和該第二連接肽，第一抗原結合片段和二抗原結合片段；
該第一連接肽和該第二連接肽的胺基酸序列可以相同或不同；
該第一抗原結合片段與該第二抗原結合片段的靶點可以相同或不同；該第一抗原結合片段和該第二抗原結合片段的胺基酸序列可以相同或不同；
該蛋白-藥物偶聯物還包含配對單元，例如Fc片段；
該第一連接肽和該第二連接肽包含至少兩個半胱胺酸，從N端到C端分別命名為Cys1和Cys2；
該第一連接肽和/或第二連接肽的序列可以是人IgG1鉸鏈區序列(SEQ ID NO：73)或其衍生序列(SEQ ID NOs：74-105、145-146)，該第一連接肽和/或第二連接肽的該Cys1可以是人IgG1鉸鏈區序列的Cys-220(Eu編號)或衍生序列中對應於人IgG1鉸鏈區序列的Cys-220(Eu編號)的Cys；且該Cys2可以是人IgG1鉸鏈區序列的Cys-226(Eu編號)或衍生序列中對應於人IgG1鉸鏈區序列的Cys-226(Eu編號)的Cys；
該第一連接肽和/或第二連接肽的序列還可以是小鼠IgG2c的鉸鏈區序列(SEQ ID NO：147)或其衍生序列，該第一連接肽和/或第二連接肽的該Cys1可以是小鼠IgG2c的鉸鏈區序列或其衍生序列的第一個半胱胺酸，且該Cys2可以是小鼠IgG2c的鉸鏈區序列或其衍生序列的第二個半胱胺酸；
該蛋白-藥物偶聯物在製備過程中，該第一連接肽和該第二連接肽的Cys2間的二硫鍵(即圖42(A)所示結構的抗原結合蛋白的“二硫鍵Cys2-Cys2”)被保留；
該蛋白-藥物偶聯物在製備過程中，該第一連接肽和該第二連接肽的Cys1間的二硫鍵(即圖42(A)所示結構的抗原結合蛋白的“二硫鍵Cys1-Cys1”)被斷裂用於藥物偶聯物的偶聯；
該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段不影響該藥物偶聯物在該第一連接肽和/或第二連接肽的該Cys1位點的偶聯；
該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段中不包含能夠影響該藥物偶聯物在該第一連接肽和/或該第二連接肽的Cys1上發生偶聯的官能團；
該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段中不包含能夠與Cys1的側鏈巰基形成共價鍵的官能團；
該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段中不包含能夠與Cys1形成二硫鍵的官能團。
本申請還提供了一種利用具有如圖42(B)所示結構的抗原結合蛋白進行藥物偶聯，得到的具有如圖43(B)所示結構的蛋白-藥物偶聯物，其具有如下結構特徵：
具有如圖42(B)所示結構的抗原結合蛋白的結構特徵；
該蛋白-藥物偶聯物包含第一連接肽和該第二連接肽，包含第一抗原結合片段，該第二抗原結合片段，該第三抗原結合片段和該第四抗原結合片段；
該第一連接肽和該第二連接肽的胺基酸序列可以相同或不同；
該第一抗原結合片段，該第二抗原結合片段，該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段可以部分或完全相同或都不同；例如，第一、二抗原結合片段相同，第三、四結合片段相同，第一、三抗原結合片段不同，第二、四抗原結合片段不同；該相同或不同的部分可以是該抗原結合片段結合的靶點和/或胺基酸序列。
該蛋白-藥物偶聯物還包含配對單元，例如Fc片段；
該第一連接肽和該第二連接肽包含至少兩個半胱胺酸，從N端到C端分別命名為Cys1和Cys2；
該第一連接肽和/或第二連接肽的序列可以是人IgG1鉸鏈區序列(SEQ ID NO：73)或其衍生序列(SEQ ID NOs：74-105、145-146)，該第一連接肽和 /或第二連接肽的該Cys1可以是人IgG1鉸鏈區序列的Cys-220(Eu編號)或衍生序列中對應於人IgG1鉸鏈區序列的Cys-220(Eu編號)的Cys；且該Cys2可以是人IgG1鉸鏈區序列的Cys-226(Eu編號)或衍生序列中對應於人IgG1鉸鏈區序列的Cys-226(Eu編號)的Cys；
該第一連接肽和/或第二連接肽的序列還可以是小鼠IgG2c的鉸鏈區序列(SEQ ID NO：147)或其衍生序列，該第一連接肽和/或第二連接肽的該Cys1可以是小鼠IgG2c的鉸鏈區序列或其衍生序列的第一個半胱胺酸，且該Cys2可以是小鼠IgG2c的鉸鏈區序列或其衍生序列的第二個半胱胺酸；
該蛋白-藥物偶聯物在製備過程中，該第一連接肽和該第二連接肽的Cys2間的二硫鍵(即圖42(B)所示結構的抗原結合蛋白的“二硫鍵Cys2-Cys2”)被保留；
該蛋白-藥物偶聯物在製備過程中，該第一連接肽和該第二連接肽的Cys1間的二硫鍵(即圖42(B)所示結構的抗原結合蛋白的“二硫鍵Cys1-Cys1”)被斷裂用於藥物偶聯物的偶聯；
該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段和/或該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段不包含能夠影響藥物偶聯物與連接肽在Cys1處進行定點偶聯的官能團；
該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段和/或該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段中不包含能夠與Cys1的側鏈巰基形成共價鍵的官能團；
該第一抗原結合片段和/或該第二抗原結合片段和/或該第三抗原結合片段和/或該第四抗原結合片段中不包含能夠與Cys1的側鏈巰基形成二硫鍵的官能團。
本申請還提供了一種蛋白-藥物偶聯物。
在某些情形中，該藥物偶聯物可以包括第一多肽鏈和第二多肽鏈。該第一多肽鏈自N端至C端，可依次包含第一抗原結合片段、第一連接肽和第一配對亞單元。該第二多肽鏈自N端至C端，可依次包含第二抗原結合片段、第二連接肽和第二配對亞單元。其中，該第一配對亞單元和該第二配對亞單元可以相互作用以形成二聚體。
例如，該第一多肽鏈自N端至C端，可依次包含第一抗原結合片段的VH、第一抗原結合片段的VL、第一連接肽(例如，人IgG1鉸鏈區或小鼠IgG2c鉸鏈區或衍生序列)、CH2和CH3，且藥物偶聯物經由該第一連接肽的Cys1(例如，IgG鉸鏈區的Cys220(EU編碼))與該第一多肽鏈連接。例如，該第二多肽鏈自N端至C端，可依次包含第二抗原結合片段的VH、第二抗原結合片段的VL、第二連接肽(例如，人IgG1鉸鏈區或小鼠IgG2c鉸鏈區或衍生序列)、CH2和CH3，且藥物偶聯物經由該第二連接肽的Cys1(例如，IgG鉸鏈區的Cys220(EU編碼))與該第二多肽鏈連接。
例如，該第一多肽鏈自N端至C端，可依次包含第一抗原結合片段的VH、第一連接肽(例如，人IgG1鉸鏈區或小鼠IgG2c鉸鏈區或衍生序列)、CH2和CH3，且藥物偶聯物經由該第一連接肽的Cys1(例如，IgG鉸鏈區的Cys220(EU編碼))與該第一多肽鏈連接。例如，該第二多肽鏈自N端至C端，可依次包含第二抗原結合片段的VH、第二連接肽(例如，人IgG1鉸鏈區或小鼠 IgG2c鉸鏈區或衍生序列)、CH2和CH3，且藥物偶聯物經由該第二連接肽的Cys1(例如，IgG鉸鏈區的Cys220(EU編碼))與該第二多肽鏈連接。
例如，該第一多肽鏈自N端至C端，可依次包含第一抗原結合片段的受體蛋白可溶性胞外區、第一連接肽(例如，人IgG1鉸鏈區或小鼠IgG2c鉸鏈區或衍生序列)、CH2和CH3，且藥物偶聯物經由該第一連接肽的Cys1(例如，IgG鉸鏈區的Cys220(EU編碼))與該第一多肽鏈連接。例如，該第二多肽鏈自N端至C端，可依次包含第二抗原結合片段的受體蛋白可溶性胞外區、第二連接肽(例如，人IgG1鉸鏈區或小鼠IgG2c鉸鏈區或衍生序列)、CH2和CH3，且藥物偶聯物經由該第二連接肽的Cys1(例如，IgG鉸鏈區的Cys220(EU編碼))與該第二多肽鏈連接。
在某些情形中，該蛋白-藥物偶聯物可包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈。該第一多肽鏈自N端至C端，可依次包含第三抗原結合片段、第一抗原結合片段、第一連接肽和第一配對亞單元。該第二多肽鏈自N端至C端，可依次包含第四抗原結合片段、第二抗原結合片段、第二連接肽和第二配對亞單元。其中，該第一配對亞單元和該第二配對亞單元可以相互作用以形成二聚體。該第三多肽鏈可包含第三抗原結合片段。該第四多肽鏈可包含第四抗原結合片段。
例如，該第一多肽鏈自N端至C端，可依次包含第三抗原結合片段的VL、第三抗原結合片段的CL、第一抗原結合片段的VH、第一連接肽(例如，人IgG1鉸鏈區或小鼠IgG2c鉸鏈區或衍生序列)、CH2和CH3，且藥物偶聯物經由該第一連接肽的Cys1(例如，IgG鉸鏈區的Cys220(EU編碼))與該第一多肽鏈連接。例如，該第二多肽鏈自N端至C端，可依次包含第四抗原結合片段 的VL、第四抗原結合片段的CL、第二抗原結合片段的VH、第二連接肽(例如，人IgG1鉸鏈區或小鼠IgG2c鉸鏈區或衍生序列)、CH2和CH3，且藥物偶聯物經由該第二連接肽的Cys1(例如，IgG鉸鏈區的Cys220(EU編碼))與該第二多肽鏈連接。例如，該第三多肽鏈自N端至C端，可依次包含第三抗原結合片段的VH和第三抗原結合片段的CH1。例如，該第四多肽鏈自N端至C端，可依次包含第四抗原結合片段的VH和第四抗原結合片段的CH1。例如，該第三抗原結合片段和/或第四抗原結合片段可以為Fab。
核酸、載體、宿主細胞
另一方面，本申請提供了一種或多種核酸分子，其可以編碼如本申請所述的蛋白-藥物偶聯物。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該蛋白-藥物偶聯物，也可以編碼其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、多肽鏈或重鏈中的一種或多種)。
本申請所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是經由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如可以經由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)可以經由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如經由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如可以經由化學合成。
例如，該分離的核酸可以是經由重組DNA技術製備的核酸分子。
另一個方面，本申請提供了一種或多種載體，其包含本申請所述的一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動 子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。例如，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。在本申請中，適當的啟動子可包括，例如用於SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子(如CMV)，其中啟動子的某部分可與其他細胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因啟動子的某部分融合，其可包含或不包含另外的內含子。本申請所述的一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。
該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。例如，該表達載體可以包含真核細胞表達載體和/或原核細胞表達載體。
另一方面，本申請提供了宿主細胞，該宿主細胞可包含本申請所述的一種或多種核酸分子和/或本申請所述的一種或多種載體。例如，每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本申請所述的核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本申請所述的核酸分子或載體。例如，可將本申請所述的載體引入該宿主細胞中，例如原核細胞(例如，細菌細胞)，哺乳動物真核細胞或者其他真核細胞，如來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。可經由本領域已知的方法將本申請所述的載體引入該宿主細胞中，例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。 例如，該宿主細胞可以為COS、CHO、NSO、sf9、sf21、DH5a、BL21(DE3)或TG1。例如，該原核細胞可以選擇E.coli細胞如TG1、BL21。例如，該真核細胞可以選擇如CHO細胞、CHO-K1細胞、CHOZN細胞、CHO-S細胞、ExpiCHO-S細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、HEK293-T細胞、HEK293-F細胞或HEK293-6E細胞。
方法、醫藥組成物和用途
另一方面，本申請還提供了一種製備該蛋白-藥物偶聯物的方法，其包括使該藥物偶聯物與該連接肽的特定的半胱胺酸(例如，該第一連接肽的Cys1和/或該第二連接肽的Cys1)以共價鍵方式結合，以得到本申請所述的蛋白-藥物偶聯物。例如，該製備方法可以是一種基於特定位點的游離半胱胺酸的反應性巰基官能團進行藥物偶聯的過程，該製備方法可以產生出具有偶聯位點特異性和均質性的蛋白-藥物偶聯物。又例如，在某些具體實施方式中，該製備方法可以產生出高均質性的CAR=2(一個抗原結合蛋白攜帶兩個偶聯物)的蛋白-藥物偶聯物。
該製備方法可以包括由“還原”、“再氧化”、“偶聯”和“純化”等多種實施步驟組成的一個或多個步驟的組合。例如，該製備方法可以包括“還原”、“偶聯”和“純化”等步驟；又例如，該製備方法可以包括“還原”和“偶聯”等步驟。該實施步驟可以包含一個或多個反應過程。在該反應過程中，反應條件例如反應溫度、反應時間、反應緩衝液類型及pH、還原劑類型及用量、偶聯物分子類型及用量等，都可能對該製備方法的結果產生重大影響，例如對藥物偶聯的效率和終產物的品質產生重大影響。該反應過程還可以包含不同反應條件參數的組合；例如，使二硫鍵還原的反應過程可以結合不同的還原劑類型、不同的還原劑用量、 不同的還原反應溫度、不同的反應緩衝液、不同的pH和不同的反應時長等多個參數條件。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“還原”步驟可以使用還原劑DTT(dithiothreitol)或TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“還原”步驟的還原劑用量為約1~50莫耳倍數，例如，約1~30莫耳倍數，約1~20莫耳倍數，約1~10莫耳倍數，約1~7莫耳倍數，約1~6莫耳倍數，約1~5莫耳倍數，約1.5~6莫耳倍數或約1.5~5莫耳倍數。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“還原”步驟的反應時長為約1~17小時，例如，約1~10小時，約1~7小時，約1~5小時，約1~4小時，約1~3小時或約1.5~2小時。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“還原”步驟的反應溫度為約0~40℃，例如，0~37℃，約0~30℃，約20~37℃，約20~30℃，或室溫(約25-30℃)。例如，反應溫度為0℃、室溫(25-30℃)或37℃。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“還原”步驟的反應緩衝液pH為約4.0~9.0、約5.0~8.0或約5.0~7.0。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“還原”步驟可以使用還原劑TCEP，還原劑用量為1~7莫耳倍數，反應時長為1~3小時，反應溫度為23~30℃，反應緩衝液pH為5.0~7.0。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“還原”步驟可以使用還原劑DTT(dithiothreitol)或TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)，還原劑用量為1~50莫耳倍數，反應時長為1~17小時，反應溫度為0~40℃，反應緩衝液pH為 5.0~8.0。較佳地，還原劑為TCEP，TCEP用量可以為1~7莫耳倍數，反應時長可以為1~3小時，反應緩衝液pH為5.0~7.0，反應溫度為0℃或室溫(25-30℃)或37℃。更佳地，還原劑TCEP用量可以為1.5~6莫耳倍數，反應時長可以為1.5~2小時，反應緩衝液pH為5.0~6.0，反應溫度為0℃或室溫(25-30℃)或37℃。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟可以使用mc-vc-PAB-MMAE(圖6)作為藥物偶聯物。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟可以使用BRD4蛋白降解劑(圖64)作為藥物偶聯物。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟的藥物偶聯物用量為約1~50莫耳倍數，例如，約1~30莫耳倍數，約1~20莫耳倍數，約10~15莫耳倍數，約1~10莫耳倍數，約1~7莫耳倍數或約3~7莫耳倍數。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟的反應時長為約0.5~10小時，例如，約0.5~10小時，約0.5~3小時，約0.5~2小時，約1~2小時或約0.5~1。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟的反應溫度為約0~40℃，例如，0~37℃，約0~30℃，約20~37℃，約20~30℃，或室溫(約25-30℃)。例如，反應溫度為室溫(25-30℃)。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟的反應緩衝液pH為約4.0~9.0、約5.0~8.0或約5.0~7.0。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟可以使用mc-vc-PAB-MMAE(圖6)作為藥物偶聯物，藥物偶聯物用量為3~7莫耳倍數，反應時長為0.5~2小時，反應溫度為23~30℃，反應緩衝液pH為5.0~7.0。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟可以使用mc-vc-PAB-MMAE(圖6)作為藥物偶聯物，藥物偶聯物用量為1~50莫耳倍數，反應時長為0.5~10小時，反應溫度為0~40℃，反應緩衝液pH為5.0~8.0。較佳地，mc-vc-PAB-MMAE用量可以為3~18莫耳倍數，反應時長可以為0.5~3小時，反應緩衝液pH為5.0~7.0，反應溫度為室溫(25-30℃)。更佳地，mc-vc-PAB-MMAE用量可以為3~7莫耳倍數，反應時長可以為0.5小時，反應緩衝液pH為5.0~6.0，反應溫度為室溫(25-30℃)。
在一些具體實施方式中，該製備方法的該“偶聯”步驟可以使用BRD4蛋白降解劑(圖64)作為藥物偶聯物，藥物偶聯物用量為10~15莫耳倍數，反應時長為1~3小時，反應溫度為23~30℃，反應緩衝液pH為7.0~9.0。
在一些具體實施方式中，該製備方法還可以提供一種包括“還原”和“偶聯”等步驟的組合和反應條件參數的組合。一種較佳的該反應條件參數的組合可以是：反應緩衝液為含20mM His-HCl的pH 6.0的緩衝液，還原劑TCEP用量為1.5~6.0莫耳倍數，還原反應時長為1.5~2.0小時，還原反應溫度為室溫(25-30℃)，偶聯物為mc-vc-PAB-MMAE，偶聯物用量為3.0~7.0莫耳倍數，偶聯反應時長為0.5小時，偶聯反應溫度為室溫(25-30℃)。
在一些具體實施方式中，該製備方法還可以提供一種“純化”步驟。該“純化”步驟利用疏水相互作用色譜層析方法(HIC)將偶聯反應產物中各組分進行分離，以獲取某一特定組分，例如，利用HIC純化分離偶聯產物得到CAR=2的蛋白-藥物偶聯物。
在一些具體實施方式中，該製備方法還可以進一步提高偶聯產物中單一組分的含量，減少進一步的純化的需求；更佳地，經過偶聯步驟後無需額外純化步驟即可以得到純度大於90%的CAR=2高均質性的偶聯產物。
在一些具體實施方式中，該製備方法還可以提供一種包括“還原”和“偶聯”等步驟的組合和反應條件參數的組合；在該反應步驟和反應條件參數的組合下，該連接肽的第一半胱胺酸(Cys1)的二硫鍵可以被有效地打開而其他二硫鍵保持完整，使得Cys1成為幾乎唯一的游離半胱胺酸殘基，進而作為特異性的偶聯位點。
另一方面，本申請提供了一種醫藥組成物，該醫藥組成物可以包含該蛋白-藥物偶聯物，以及藥學上可接受的載體。例如，該醫藥組成物還可以包括其他抗原結合蛋白或治療劑。
另一方面，本申請提供了一種該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物在製備診斷、預防和/或治療疾病的藥物中的應用。例如，該藥物可以用於治療腫瘤或其他疾病。
另一方面，本申請提供了一種該蛋白-藥物偶聯物與其他療法或藥物聯用在製備藥物中的用途，該藥物可以用於治療腫瘤或其他疾病。例如，該其他療法或藥物可以選自下組：化療、放療、miRNA和寡核苷酸。
另一方面，本申請提供了一種體外或體內檢測特異性抗原的方法，其可以包括使用如該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物進行檢測。在某些適用情形中，該方法可以為非診斷目的的。
另一方面，本申請提供了用於該蛋白-藥物偶聯物或醫藥組成物施用的給藥裝置。
[實施例]
下面經由實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在該實施例範圍之中。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法．這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實施例1抗體的製備
Harbour HCAb小鼠(Harbour Antibodies BV，WO2010/109165A2)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生僅有重鏈的抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。該小鼠產生的抗體具有人的抗體重鏈可變結構域和小鼠恆定結構域。在獲得針對某一特定靶點的重鏈抗體的VH序列以後，利用常規的分子生物學手段將VH序列和人的IgG抗體重鏈Fc序列(較佳為含有人IgG1鉸鏈區和CH2以及CH3區的序列，如SEQ ID NO：72所示序列)進行融合表達，得到全人源重組HCAb抗體分子。
Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。利用融合瘤技術或者單B細胞分選技術或者其他技術篩選出針對某一特定靶點的抗體。將抗體的VL和VH序列與相應的人的κ輕鏈恆定區和IgG1重鏈恆定區序列進行融合表達，得到重組全人源抗體分子。
實施例1.1獲得抗CTLA4的全人源HCAb抗體
用可溶的重組人CTLA4蛋白(ACRO Biosystems,#CT4-H5229)對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中CTLA4特異的抗體滴度達到一定的水準後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用小鼠漿細胞分選試劑盒(Miltenyi,#130-092-530)分選CD138陽性的漿細胞。用常規的分子生物學手段從漿細胞中擴增人VH基因，並將擴增的人VH基因片段構建到編碼人IgG1抗體重鏈Fc區域序列的哺乳動物細胞表達質粒pCAG載體中。質粒轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)進行表達，得到全人源HCAb抗體上清。用ELISA測試HCAb抗體上清與重組人CTLA4蛋白的結合，鑑定出陽性HCAb抗體。對這些HCAb抗體進行進一步的鑑定，根據其對人CTLA4的結合能力、食蟹猴CTLA4的結合能力、抑制CTLA4與B7-1結合能力等參數，選出數個候選HCAb抗體分子。然後對候選HCAb抗體分子進行序列分析和優化，得到數個變體序列。將HCAb抗體的VH序列和人的IgG1重鏈鉸鏈區及Fc序列進行融合表達，得到全人源重組HCAb抗體分子。抗CTLA4的重組全人源HCAb抗體列於表1-1。
實施例1.2獲得抗BCMA的全人源HCAb抗體
用可溶的重組人BCMA-ECD-Fc融合蛋白(ACRO Biosystems,#BC7-H82F0)對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。抗原蛋白與免疫佐劑混合成免疫原試劑，然後經由皮下經腹股溝注射或經由腹腔注射。在每一輪免疫中，每隻小鼠接受的總注射劑量是100微升。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50微克抗原蛋白與完全弗氏佐劑(Sigma,#F5881)以體積比1：1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25微克抗原蛋白與Sigma Adjuvant System佐劑(Sigma,#S6322)混合配製的免疫原試劑的免疫。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩週，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、 56、70天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體滴度。在進行Harbour HCAb小鼠脾B細胞分離前5天，以每隻小鼠25微克抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。
當檢測小鼠血清中BCMA特異的抗體滴度達到一定的水準後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用BD FACSAriaTM III細胞分選儀分選CD138陽性的漿細胞和BCMA抗原陽性的B細胞群。提取RNA，反轉錄cDNA後PCR擴增人VH基因。擴增的VH基因片段構建到編碼人IgG1抗體重鏈Fc結構域序列的哺乳動物細胞表達質粒pCAG載體中，質粒轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)進行表達，表達的HCAb的抗體上清與重組人BCMA-Fc,Avitag重組蛋白(ACRO Biosystems,#BC7-H82F0)進行Mirrorball(SPT Labtech,mirrorball® fluorescence cytometer)篩選，獲得的陽性單株抗體上清用流式細胞術FACS進一步的鑑定。用FACS測試抗體上清與高表達人BCMA的HEK293T細胞株HEK293T/hBCMA(北京康源博創，KC-0233)、高表達食蟹猴BCMA的HEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA(北京康源博創，KC-0979)和高表達人BCMA的細胞系NCI-H929(ATCC,CRL-9068)等細胞的結合能力。經由多輪篩選，獲得了數個陽性候選HCAb抗體分子。利用常規的測序手段獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列。將HCAb抗體的VH序列和人的IgG1重鏈鉸鏈區及Fc序列進行融合表達，得到全人源重組HCAb抗體分子。
針對抗BCMA的HCAb抗體PR001046的可變區VH的CDR區進行兩輪定點突變，以獲得結合BCMA的親和力提高的突變體，如PR001046_R2_4G10(即PR004433)。抗BCMA的重組全人源HCAb抗體列於表1-1。
實施例1.3獲得抗MSLN的全人源HCAb抗體
用可溶的重組人MSLN蛋白(ACRO Biosystems,#MSN-H5223)對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。用類似實施例1.2該方法篩選並獲得抗MSLN的全人源HCAb抗體。抗MSLN的重組全人源HCAb抗體列於表1-1。
實施例1.4獲得抗5T4的全人源HCAb抗體
用可溶的重組人5T4蛋白(NovoProtein,#C678)對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。用類似實施例1.2該方法篩選並獲得抗5T4的全人源HCAb抗體。抗5T4的重組全人源HCAb抗體列於表1-1。
實施例1.5獲得抗ROR1的抗原結合蛋白
用可溶的重組人ROR1蛋白(AcroBiosystems,#RO1-H5250)對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。用類似實施例1.2該方法並結合噬菌體展示篩選獲得抗ROR1的抗體株1015M2-H4。將1015M2-H4的VH和VL利用重疊PCR製備得到單鏈可變區片段scFv；然後把scFv和一段含有核酸限制性內切酶BamHI的酶切位點的序列(對應胺基酸序列為GGGAS)以及人的IgG重鏈Fc(包含人IgG1鉸鏈區和CH2以及CH3區，如SEQ ID NO：72所示序列)進行融合表達，得到具有scFv-Fc二聚體結構的抗ROR1的抗原結合蛋白分子PR002129。抗ROR1的抗原結合蛋白列於表1-1。
實施例1.6抗體的表達和純化
本實施例介紹了利用哺乳動物宿主細胞(例如，人胚腎細胞HEK293或中國倉鼠卵巢細胞CHO及其衍生細胞)、暫態轉染表達和親和捕獲分離等技術來製備抗體的一般方法。本方法適用於含有Fc區的目標抗體；目標抗體可以由一條或多條蛋白質多肽鏈組成；可以來源於一個或多個表達質粒。
將抗體多肽鏈的胺基酸序列經由密碼子優化方法轉換成核苷酸序列；合成編碼的核苷酸序列並株到與宿主細胞相容的表達載體上。將編碼抗體多肽鏈的質粒按照特定比例同時轉染哺乳動物宿主細胞，利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到具有正確折疊和多肽鏈組裝的重組蛋白。具體地，將FreeStyleTM 293-F細胞(Thermo,#R79007)在FreeStyleTM F17 Expression Medium培養基(Thermo,#A1383504)中擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6-8x105細胞/ml，於37℃ 8% CO2搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2x106細胞/ml。準備30ml培養的細胞。將編碼抗體多肽鏈的質粒按照一定比例混合共計30μg質粒(質粒與細胞的比例為1μg：1ml)溶解於1.5ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo,#31985088)，並用0.22μm濾膜過濾除菌。再取1.5ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences,#23966-2)120μl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質粒中，室溫孵育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS pH7.4緩衝液平衡含有MabSelectTM(GE Healthcare,#71-5020-91)的重力管柱(Bio-Rad,#7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS緩衝液沖洗管柱，再用pH3.5的0.1M甘胺酸沖提目的蛋白，隨後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore,#UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液或者含有其他成分的緩衝液，得到純化的重組蛋白溶液。最後用NanoDrop(Thermo,NanoDropTM One)測定濃度，分裝、存儲備用。
本申請所使用的抗原結合蛋白總結於表1-1，其對應的多肽鏈和CDR區的胺基酸序列的序列編號SEQ ID NOs列於表1-2、表1-3、表1-4和表1-5。
Figure 110145684-A0101-12-0078-2
Figure 110145684-A0101-12-0078-3
 表1-2本申請中HCAb抗體的序列編號表。
Figure 110145684-A0101-12-0079-4
Figure 110145684-A0101-12-0079-5
Figure 110145684-A0101-12-0079-6
實施例2分析方法
實施例2.1利用SEC-HPLC(分子尺寸排阻-高效液相色譜)分析蛋白純度和聚體
本實施例使用分析型分子尺寸排阻層析色譜法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型色譜管柱TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience,#08541,5μm,7.8mm×30cm)連接到高效液相色譜儀HPLC(Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10μg)用0.22μm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS緩衝液將樣品以1.0ml/min的流速流過色譜管柱，最長時間為25分鐘，檢測波長280nm，室溫運行。 採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組分的滯留時間。
實施例2.2利用HIC-HPLC(疏水相互作用-高效液相色譜)分析蛋白純度、疏水性和偶聯產物組分
本實施例使用分析型疏水相互作用層析色譜法(HIC)來分析蛋白樣品的純度和疏水性。將分析型色譜管柱TSKgel Buty1-NPR(Tosoh Bioscience,#14947,4.6mm×3.5cm,2.5μm)連接到高效液相色譜儀(HPLC)(型號：Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。設定方法由約22分鐘內從100%緩衝液A(25mM磷酸鹽緩衝液，1.5M硫酸銨((NH4)2SO4)，pH 7.0~7.2)至100%緩衝液B(20mM磷酸鹽緩衝液，20%異丙醇(IPA)，pH 7.0~7.2)的線性梯度，流速設定為0.7ml/min，蛋白樣品濃度1mg/ml，進樣體積20μl，檢測波長280nm，室溫運行。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組分的滯留時間；可以經由不同的滯留時間來推測偶聯產物的不同組分所攜帶的偶聯分子數目。
實施例2.3利用RP-HPLC(反相-高效液相色譜)分析蛋白純度、疏水性和偶聯產物組分
本實施例使用分析型反相高效液相色譜法(RP)來分析蛋白樣品的純度和疏水性。本領域技術人員可以使用不同型號的高效液相色譜儀和分析型色譜管柱按照技術說明書並經過實驗摸索以建立相似的分析手段，本實施例僅列舉其中代表性方法。
在一些具體實施方式中，例如在本發明的實施例5.2中，將分析型色譜管柱Zorbax RRHD 300-Diphenyl(Agilent Technologies,#858750-944,2.1× 100mm,1.8μm)連接到高效液相色譜儀(HPLC)(型號：Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，按照說明書對系統進行平衡。設定方法由60分鐘內從100%緩衝液A(1%三氟乙酸TFA溶於水)至100%緩衝液B(1%三氟乙酸TFA溶於乙腈)的線性梯度，流速設定為0.35ml/min，運行溫度為50℃，檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組分的滯留時間。
在另一些具體實施方式中，例如在本發明的實施例8.2中，將分析型色譜管柱PLRP-S 1000A(Agilent Technologies,#PL1912-1502,2.1×50mm,5.0μm)連接到高效液相色譜儀(HPLC)(型號：Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，按照說明書對系統進行平衡。設定方法由40分鐘內從100%緩衝液A(0.05%三氟乙酸TFA溶於水)至100%緩衝液B(0.05%三氟乙酸TFA溶於乙腈)的線性梯度，流速設定為0.25ml/min，運行溫度為60℃，檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組分的滯留時間。
隨後，可以經由不同的滯留時間來推測偶聯產物的不同組分所攜帶的偶聯分子數目。
實施例2.4利用LC-MS(液相色譜質譜聯用)測定分子量
本實施例使用液相色譜質譜聯用方法(LC-MS)來分析蛋白樣品的分子量。本領域技術人員可以使用不同型號的液相色譜儀(LC)和質譜儀(MS)按照技術說明書並經過實驗摸索以建立相似的分析手段，本實施例僅列舉其中代表性方法。
樣本預處理
在一些具體實施方式中，測定蛋白樣品的分子量需要對樣品進行去糖處理以去除糖鏈等修飾，例如用糖苷酶PNGase F(NEB,#P0705L)在37℃處理樣品至少4小時。例如，在本發明的所有實施例中測定蛋白樣品分子量的時候，如無特殊強調，待測蛋白樣品都利用糖苷酶PNGase F進行去糖處理。
在一些具體實施方式中，測定蛋白樣品的還原分子量需要對樣品進行還原處理，例如用10nM DTT(dithiothreitol)在37℃處理樣品10分鐘。例如，在本發明的所有實施例中，經過還原處理的樣品稱為還原樣品，未經還原處理的樣品稱為非還原樣品。
LC條件設定
在一些具體實施方式中，將色譜管柱bioZen 3.6μm Intact C4(Phenomenex,#00F-4767-AN,2.1×150mm,3.6μm)連接到超高效液相色譜儀(UPLC)(型號：Agilent Technologies,Agilent 1290 UPLC)，按照說明書對系統進行平衡。緩衝液A為0.1%甲酸FA溶於水，緩衝液B為0.1%甲酸FA溶於乙腈。進樣約1μg，流速設定為0.3ml/min，運行溫度為80℃。當測試還原樣品時，在12分鐘內用緩衝液A和B混合成線性梯度：前8分鐘使用10-60% B，後4分鐘使用80% B。當測試非還原樣品時，在9分鐘內用緩衝液A和B混合成線性梯度：前6分鐘使用15-60% B，後3分鐘使用80% B。
在另一些具體實施方式中，將色譜管柱ACQUITY UPLC Protein BEH C4(Waters,# 186004495,2.1×50mm,1.7μm,300Å)連接到超高效液相色譜儀(UPLC)(型號：Waters Acquity UPLC)，按照說明書對系統進行平衡。緩衝液A為0.1%甲酸FA溶於水，緩衝液B為0.1%甲酸FA溶於乙腈。進樣約10μL，流速設定為0.2~0.5ml/min，運行溫度為80℃，檢測波長214nM。當測試還原 樣品時，在20分鐘內用緩衝液A和B混合成線性梯度：14分鐘使用25-90% B,後6分鐘使用25% B。當測試非還原樣品時，在8分鐘內用緩衝液A和B混合成線性梯度：前4分鐘使用5-95% B，後4分鐘使用95-5% B。
MS條件設定
在一些具體實施方式中，使用的質譜儀型號為AB Sceix X500B，運行模式為TOF-MS；當測試還原樣品時，掃描範圍是600-4000m/z；當測試非還原樣品時，掃描範圍是900-6000m/z。使用Sceix OS軟體對原始質譜圖進行反褶積處理得到分子量圖。
在另一些具體實施方式中，使用的質譜儀型號為Waters Xevo G2-XS Q-TOF，分子量掃描範圍是500~4000Da。使用Water MaxEnt或者Agilent MassHunter BioConfirm軟體對原始質譜圖進行反褶積處理。
LC-MS聯用
本發明申請的多個具體實施方式中使用了不同的LC條件和MS條件的組合設定，以實現LC-MS聯用來測定蛋白樣品的分子量。例如，在實施例3.1和實施例5.2中，使用的條件組合為(色譜管柱：ACQUITY UPLC Protein BEH C4；LC儀器：Waters Acquity UPLC；MS儀器：Water sXevo G2-XS Q-TOF)。又例如，在實施例3.2、實施例8.2、實施例9.2、實施例10.1、實施例11.2、實施例12.1、實施例13.2、實施例14.2和實施例16.1中，使用的條件組合為(色譜管柱：bioZen 3.6μm Intact C4；LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)。又例如，在實施例6.2、實施例7.2中，使用的條件組合為(色譜管柱：Agilent PLRP-S 1000A；LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：Waters Xevo G2-XS Q-TOF)。
實施例2.5利用Uncle測定蛋白的分子穩定性和分子聚集性
Uncle(Unchained Labs)是一個多功能一站式的蛋白穩定性分析平臺，它經由全螢光，靜態光散射(SLS)和動態光散(DLS)檢測方法來表徵蛋白質的穩定性。同一組樣品可同時得到熔解溫度(Tm)，聚集溫度(Tagg)和粒徑(diameter)等參數。在本實施例中，選擇Uncle的“Tm & Tagg with optional DLS”應用程式進行操作，取9μL樣品加入Uni管中，設置以0.3℃/分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃。進行初始和最終DLS測量四次採集，每次採集5秒。實驗運行結束後，Uncle分析軟體採用重心均值(BCM)公式來計算每個樣品的Tm值；經由SLS在266nm或473nm波長下的螢光強度的曲線(聚集曲線)來計算Tagg值；樣品的粒徑和分散度則經由DLS相關的函數來計算。
實施例2.6利用DSC(差示掃描量熱法)測定蛋白的熔解溫度
本實施例使用Malvern VP-capillary DSC儀器經由差示掃描量熱法(DSC)分析蛋白樣品的熔融溫度(Tm)。將樣品用緩衝液稀釋至檢測濃度(0.5mg/mL)後置於DSC樣品池，將緩衝液置於參比池。對DSC樣品池和參比池進行完全一樣的等溫升溫控制，其中掃描溫度區間為25-100℃，掃描速度為1℃/分鐘，掃描前平衡時間為3分鐘，每個待測樣品分析一次。由補償樣品池溫差的熱量組成的峰圖即為樣品的熱力學曲線圖，曲線峰頂溫度即為樣品的Tm值。含有多個結構域的蛋白樣品由於不同結構域的穩定性不同，其曲線可能呈現多個峰。
實施例2.7利用DSF(差示掃描螢光法)測定蛋白的熔解溫度
差示掃描螢光法(Differential Scanning Fluorimetry,DSF)是一種常用的高通量的測定蛋白質熱穩定性的方法。它使用即時螢光定量PCR儀器經由監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化，來反映蛋白質的變性的過程，從 而反映出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子熔融溫度(Tm)。將10μg蛋白加入96-孔PCR板(Thermo,#AB-0700/W)，接著加入2μl 100×稀釋的染料SYPROTM(Invitrogen,#2008138)，然後加入緩衝液使得終體積為40μl每孔。將PCR板密封，放置於即時螢光定量PCR儀器(Bio-Rad CFX96 PCR System)，先於25℃孵育5分鐘，然後以0.2℃/0.2分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃，在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行資料分析並計算出樣品的Tm。
實施例3鑑定Cys-220位點二硫鍵的形成
如圖1所示，人IgG1抗體是含有兩條相同重鏈和兩條相同輕鏈的四聚體結構，兩個重鏈之間形成了兩個鏈間二硫鍵，一個重鏈和對應輕鏈之間形成了一個鏈間二硫鍵；這些抗體的天然鏈間二硫鍵經還原後形成的數個巰基成為了可用的半胱胺酸偶聯位點。圖44(B)顯示了人IgG1的鉸鏈區序列(SEQ ID NO：73)，其含有三個半胱胺酸，其對應位點按照Eu編號分別為Cys-220、Cys-226和Cys-229；其中，兩個重鏈鉸鏈區的Cys-226和Cys-229分別各自形成一個重鏈間二硫鍵，而Cys-220則與靠近輕鏈C’末端的Cys-214形成重鏈和輕鏈之間的二硫鍵。
圖2顯示了具有人IgG1抗體鉸鏈區序列的重鏈抗體HCAb的結構，以及鉸鏈區二硫鍵結構在人IgG1和HCAb之間的差異。由於沒有輕鏈的存在，位於鉸鏈區的Cys-220顯然無法再和輕鏈Cys-214形成二硫鍵。Cys-220的狀態有如圖3所示的兩種可能性：(一)Cys-220沒有形成重鏈間二硫鍵，其側鏈巰基(-SH)會與環境中(如細胞質)的含巰基分子(如谷胱甘肽)形成二硫鍵；(二)如同Cys-226或Cys-229那樣，Cys-220形成兩條重鏈之間的鏈間二硫鍵，因此鉸鏈區會形成三個二硫鍵。
本實施例研究了數個含有Cys-220的抗原結合蛋白(包括重鏈抗體HCAb和單鏈抗體scFv-Fc等結構)分子中Cys-220位點二硫鍵的形成。
實施例3.1研究HCAb PR000020中Cys-220
本實施例採用不同的實驗方法來鑑定在HCAb PR000020(分子資訊見表1-1)中Cys-220的狀態。
利用LC-MS分子量分析來鑑定Cys-220
如果Cys-220沒有形成重鏈間二硫鍵(假設1)，而是其側鏈巰基與環境中的其他含巰基分子形成二硫鍵，那麼該HCAb的非還原分子量(即完整分子量)會大於形成重鏈間二硫鍵時的分子量理論值(假設2)。按照假設2，PR000020的非還原分子量理論值為77,640Da；按照假設1，其非還原分子量可能為77,878Da(增加了2個半胱胺酸(+119Da×2))或78,250Da(增加了2個谷胱甘肽(+305Da×2))。
將純化的HCAb PR000020蛋白用糖苷酶PNGase F作去糖處理，並用實施例2.4該方法(LC儀器：Waters Acquity UPLC；MS儀器：Waters Xevo G2-XS Q-TOF)測定其非還原分子量，結果為77,643Da(反褶積分子量圖譜見圖4)，與按照假設2的預測分子量幾乎一致。由此，可以推斷Cys-220形成了重鏈間二硫鍵。
Figure 110145684-A0101-12-0086-7
Figure 110145684-A0101-12-0087-8
利用木瓜蛋白酶Papain酶切分析來鑑定Cys-220
木瓜蛋白酶Papain可以較特異地水解位於鉸鏈區的His-224和Thr-225之間的肽鍵(參見Endo,S.,& Arata,Y.(1985).)。將純化的HCAb PR000020蛋白用Papain進行酶切。由圖5(A)所示，如果Cys-220沒有形成重鏈間二硫鍵(假設1)，那麼Papain水解HCAb將會產生約13KDa的片段(單個VH結構域)和約50KDa的Fc片段；如果Cys-220形成重鏈間二硫鍵(假設2)，那麼Papain水解HCAb將會產生約27KDa的片段(由Cys-220的二硫鍵連接在一起的兩個VH結構域)和約50KDa的Fc片段。圖5(B)顯示了酶切產物的非還原SDS-PAGE的結果；HCAb的酶切產物(對應第3和第4泳道)在28KDa附近有明顯條帶，而在14KDa附近沒有條帶，因此證實了假設2的成立，即Cys-220形成了重鏈間二硫鍵。
綜上該，利用LC-MS分子量分析方法和Papain酶切分析方法都證明瞭Cys-220形成了重鏈間二硫鍵。
實施例3.2研究scFv-Fc PR002129中Cys-220
本實施例研究在scFv-Fc PR002129(表1-1)中Cys-220的狀態。PR002129的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示，其含有人IgG1鉸鏈區序列(SEQ ID NO：73)。PR002129是含有重鏈Fc的二聚體結構，其每一條多肽鏈(重鏈)包含一個單鏈可 變區片段scFv，一個連接肽序列和人的IgG1重鏈Fc序列；其中，scFv來源於抗ROR1的抗體1015M2-H4的VH和VL序列，連接肽序列包含人IgG1鉸鏈區序列和一段GGGAS序列(為了引入合適的限制性內切酶位點)。
在PR002129及其他類似的scFv-Fc結構中，Cys-220的狀態也有如圖37(A)中所示的兩種可能性：形成或者不形成鏈間二硫鍵。如果Cys-220沒有形成重鏈間二硫鍵，其側鏈巰基(-SH)會與環境中的含巰基分子(如，半胱胺酸或者谷胱甘肽)形成二硫鍵，使其實際分子量明顯大於理論分子量。
利用LC-MS分子量分析來鑑定Cys-220
將純化的PR002129蛋白用糖苷酶PNGase F作去糖處理，並用實施例2.4該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)測定其非還原分子量(圖37(B)所示其反褶積分子量圖譜)，結果為104,510Da，與不同假設的預測分子量進行比較(表3-2)，推斷出Cys-220沒有聯結其他含巰基分子，因此Cys-220形成了重鏈間二硫鍵。
Figure 110145684-A0101-12-0088-9
實施例3.3鉸鏈區序列分析和Cys-220的二硫鍵
人的不同IgG同種型的鉸鏈區序列是已知的，鉸鏈區結構和二硫鍵也做了較充分的研究，例如人IgG1經由輕鏈的最後一個Cys(即Eu編碼的Cys-214)和 重鏈的第五個Cys(即Eu編碼的Cys-220)形成鏈間二硫鍵，而IgG2、IgG3和IgG4則是經由輕鏈的最後一個Cys和重鏈的第三個Cys形成鏈間二硫鍵(參見，Liu,H.等人mAbs(2012),4(1),17-23)。
本申請發明人進一步對IgG1的晶體結構(PDB登錄號1HZH)進行分析，Cys-220與輕鏈Cys-214形成穩定的二硫鍵，而且兩個重鏈鉸鏈區的Cys-220的Cβ原子之間位置相對較遠，從該IgG1結構上推測這兩個Cys-220之間難以形成二硫鍵。但是另一方面，前述研究已經驗證了在缺失輕鏈的結構中Cys-220形成重鏈間二硫鍵的事實。因此，推測為：Cys-220可以像Cys-226或Cys-229那樣形成重鏈間二硫鍵，但是其二硫鍵的穩定性可能比Cys-226的或Cys-229的要弱。因此經由優化可以使其特定地打開Cys-220的二硫鍵而保持其他二硫鍵不變；這樣，Cys-220有可能為半胱胺酸偶聯提供了定點偶聯用的錨點。
本申請發明人再進一步研究不同物種的IgG抗體鉸鏈區序列和二硫鍵結構(圖44)發現，人和小鼠以及羊駝的鉸鏈區序列差異很大，其鉸鏈區序列長度和所含Cys的數量都不相同(圖44(A))。發明人利用已知的IgG全長抗體晶體結構分析鉸鏈區的二硫鍵結構，如圖44(B)顯示了人IgG1鉸鏈區(PDB登錄號1HZH)；圖44(C)顯示了人IgG4鉸鏈區(PDB登錄號5DK3)；圖44(D)顯示了小鼠IgG1鉸鏈區(PDB登錄號1IGY)；圖44(E)顯示了小鼠IgG2a鉸鏈區(PDB登錄號1IGT)。在已知的晶體結構中，只有人IgG1和小鼠IgG1的鉸鏈區貢獻了重鏈和輕鏈之間的二硫鍵，人IgG1經由Cys-220(Eu編號)作為鉸鏈區的第一個Cys與輕鏈形成二硫鍵，小鼠IgG1經由Cys-235(殘基編號)作為鉸鏈區的第一個Cys與輕鏈形成二硫鍵；但是，不同的是，在人IgG1鉸鏈區中，第一個Cys(Cys-220，Eu編號)和第二個Cys(Cys-226，Eu編號)之間相隔了5個其他種類胺基酸 殘基，而在小鼠IgG1鉸鏈區中，第一個Cys(Cys-235，殘基編號)和第二個Cys(Cys-237，殘基編號)之間相隔了1個其他種類胺基酸殘基。
本申請發明人進一步推測人IgG1重鏈的Cys-220在缺失輕鏈時可以形成較弱的重鏈間二硫鍵，而這一特性可能與Cys-220相對於Cys-226之間的距離(即第一Cys和第二Cys之間的距離)相關；第一Cys和第二Cys之間可能需要間隔一定數目的其他種類胺基酸殘基才能使兩個Cys分別形成不同的二硫鍵且二硫鍵的穩定性(或鍵能)有差異。在後續的實施例中，進一步研究了兩個Cys之間的間隔和由鉸鏈區序列衍生的變體連接肽序列，以及利用第一個Cys進行藥物偶聯的應用。在圖44(A)所示鉸鏈區序列中，只有小鼠IgG2c的鉸鏈區中Cys的數目和排列與人IgG1的相似，可以推測小鼠IgG2c的鉸鏈區序列中第一個Cys可能和人IgG1鉸鏈區的Cys-220有相似的能力。
實施例3.4Cys-220的二硫鍵缺失並不影響分子穩定性
本實施例為了研究Cys-220的二硫鍵對於分子結構穩定性的影響。本實施例選取了數個HCAb分子，製備其C220S突變衍生分子(將鉸鏈區Cys-220突變成絲胺酸Ser以破壞其二硫鍵的形成)，或者以實施例4該方法製備藥物偶聯衍生物(ADC)；然後利用實施例2.5該Uncle方法或實施例2.6該DSC方法測定分子熔解溫度(Tm)，以表徵其熱穩定性。該HCAb分子來自表1-1。
圖38顯示了HCAb PR000184及其衍生分子的DSC熱力學分析曲線圖；圖39顯示了HCAb PR000453及其衍生分子的DSC熱力學分析曲線圖；圖40顯示了HCAb PR004432及其衍生分子的Uncle熱力學分析曲線圖；結果總結於表3-3，其列出了每個樣品的最低熔解溫度(Tm1)。由此可見，C220S突變 並沒有對分子結構的熱穩定性帶來明顯的影響；而且，利用Cys-220的偶聯也沒有對熱穩定性造成顯著的改變。
Figure 110145684-A0101-12-0091-10
由此可見，Cys-220的二硫鍵缺失並不影響分子穩定性。
實施例4偶聯反應、純化
實施例4.1偶聯反應
基於半胱胺酸殘基的藥物偶聯過程包括由“還原”、“再氧化”和“偶聯”等不同反應過程組成的一個或多個步驟的組合。在這些反應過程中，反應條件如反應溫度、反應時間、反應緩衝液類型及pH、還原劑類型及用量、偶聯物分子類型及用量等都對整個偶聯反應的效率和終產物的品質產生重大影響。這些反應條件包括不同參數的組合，本實施例僅列舉其中代表性方法；本領域技術人員也可以如 本實施例所教導方法結合採用不同的參數條件並經過實驗摸索以建立相似的偶聯反應過程。
還原
本實施例嘗試使用還原劑為強還原劑DTT(dithiothreitol)或還原能力適中的TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)。還原劑的用量為x莫耳倍數(x=1~50)；還原反應時長為y小時(y=1~17)；反應的溫度為0~40℃，反應的緩衝液pH為4.0~9.0。
再氧化
本實施例還可能嘗試使用氧化劑DHAA(dehydroascorbic acid)對樣品進行處理。
偶聯
本實施例還嘗試使用的藥物偶聯物為mc-vc-PAB-MMAE(也稱為VcMMAE，分子結構見圖6，分子量為1315.78Da；生產商：聯寧生物製藥，貨號：SET0201)，該化合物含有一個馬來醯亞胺活性反應基團，可以與巰基發生加成反應，形成穩定的硫醚鍵。本實施例嘗試的藥物偶聯物用量為z莫耳倍數(z=1~20)；偶聯反應時長為h小時(h=0.5~3)；反應溫度為25~30℃，pH為4.0~9.0。偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物，同時置換到合適的緩衝液中保存。
本申請的多個具體實施方式可能使用了多種偶聯反應條件和步驟，包括但不限於本實施例該方法中的一個或者多個步驟的組合。
實施例4.2利用HIC(疏水相互作用)純化偶聯產物
本實施例使用疏水相互作用將偶聯產物中各組分進行分離。將偶聯所得樣品，經由AKTA pure層析系統(Cytiva Life Sciences,AKTA pure)，利用ToyoScreen Phenyl-600M疏水作用色譜層析管柱(Tosoh Bioscience,#21892)進行純化。在30個管柱體積內，將疏水相從0%線性提升到100%，期間對各組峰分別收集。所收集組分，經過HIC-HPLC檢測(實施例2.2該方法)後，進行合併、濃縮、換液得到偶聯產物。
實施例5HCAb PR000020的偶聯和分析
本實施例研究了抗CTLA4的HCAb抗體PR000020(SEQ ID NO：64)與mc-vc-PAB-MMAE利用半胱胺酸偶聯到Cys-220位點來製備具有均一DAR值的抗體偶聯藥物。
實施例5.1偶聯反應條件優化
本實施例先用實施例1.6中該方法生產和純化HCAb PR000020重組蛋白；然後利用實施例4.1中該方法，使用多個不同的還原、再氧化和偶聯條件的組合條件，對純化的HCAb PR000020進行偶聯反應(表5-1)，試圖得到較優的反應條件。所使用的還原劑為TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)或DTT(dithiothreitol)；氧化劑為DHAA(dehydroascorbic acid)；藥物偶聯物為mc-vc-PAB-MMAE(生產商：聯寧生物製藥，貨號：SET0201)。平行用6組條件對HCAb PR000020進行偶聯，以及使用trastuzumab(第7組實驗)作為IgG1對照。在本實驗中，還原或偶聯反應的pH為6.5-7.0，溫度為室溫(25-30℃)。每組實驗的偶聯的產物用實施例2.2該HIC-HPLC分析方法分析其偶聯產物的組分，列於表5-2。
Figure 110145684-A0101-12-0093-11
Figure 110145684-A0101-12-0094-12
Figure 110145684-A0101-12-0094-13
結合表5-1和表5-2，實驗條件5和6產生的主要產物是偶聯了2個化合物分子的抗體偶聯藥物(DAR=2)。因此，初步確定的優化偶聯反應條件為：還原劑選擇還原能力適中的TCEP，還原劑的用量在1.5-2.5莫耳倍數之間，還原反應的溫度為25-30℃，反應pH為6.5-7.0，反應時長為3小時；偶聯所用的藥物偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的用量為7-10莫耳倍數之間，溫度為25-30℃，pH為6.5-7.0，反應時長為1-2小時。
偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物，並用實施例4.2該HIC方法純化偶聯產物，得到DAR=2的主要產物。
實施例5.2偶聯產物分析
本實施例利用高效液相色譜和質譜等技術對純化的重組HCAb PR000020和其偶聯產物PR000020-ADC(包括偶聯後產物和經過一步HIC純化後的產物)進行定量分析，以確定其偶聯產物組分的構成。
利用實施例2.2中該HIC-HPLC方法對上述樣品進行分析。圖8和下表分別顯示了HCAb PR000020及其偶聯產物PR000020-ADC的HIC-HPLC分析結果：(A)HCAb偶聯前；(B)偶聯後，純化前；(C)偶聯及一步HIC純化後。表5-3顯示HCAb PR000020偶聯前的樣品純度高達95%；表5-4顯示HCAb PR000020經實施例5.1偶聯細胞毒化合物後的產物中，75%的組分是偶聯了2個化合物的產物(DAR=2)；表5-5顯示了該偶聯產物經過一步HIC純化(實施例4.2)後得到的產物中，99%的組分是偶聯了2個化合物的產物。
Figure 110145684-A0101-12-0095-14
Figure 110145684-A0101-12-0096-15
Figure 110145684-A0101-12-0096-16
Figure 110145684-A0101-12-0096-17
利用實施例2.3中該RP-HPLC方法(使用分析型色譜管柱Zorbax RRHD 300-Diphenyl)對上述樣品進行分析。圖9和下表分別顯示了HCAb PR000020及其偶聯產物PR000020-ADC的RP-HPLC分析結果：(A)HCAb偶聯前；(B)偶聯後，純化前；(C)偶聯及一步HIC純化後。表5-6顯示HCAb PR000020 偶聯前的樣品純度高達99%；表5-7顯示HCAb PR000020經實施例5.1偶聯細胞毒化合物後的產物中，75%的組分是偶聯了2個化合物的產物(DAR=2)；表5-8顯示了該偶聯產物經過一步HIC純化(實施例4.2)後得到的產物中，96%的組分是偶聯了2個化合物的產物。
Figure 110145684-A0101-12-0097-18
Figure 110145684-A0101-12-0097-19
Figure 110145684-A0101-12-0097-20
Figure 110145684-A0101-12-0098-21
利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Waters Acquity UPLC；MS儀器：Waters Xevo G2-XS Q-TOF)對偶聯產物PR000020-ADC的純化後樣品進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖10分別顯示了偶聯產物PR000020-ADC的分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)非還原樣品；(B)還原樣品。用PR000020的胺基酸序列計算其完整分子量(非還原分子量)和重鏈分子量(還原分子量)的理論值；偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的分子量為1315.78Da；推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量理論值。對圖譜中的峰和對應分子量進行分析，並經由積分計算峰面積以推測相應組分的含量(下表)。表5-9顯示了DAR=2的組分是主要成分；相應地，如表5-10所示，在還原樣品中，近90%的重鏈偶聯有1個化合物(+1D)。
Figure 110145684-A0101-12-0098-22
Figure 110145684-A0101-12-0099-23
綜合以上多種分析手段的結果，可以推論出：利用半胱胺酸偶聯，偶聯產物中主要成分是DAR=2的組分，經過進一步HIC純化，可以得到純度>90%的DAR=2高均質性的產物。
實施例5.3用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用LC-MS來分析ADC偶聯位點。簡言之，將未偶聯的HCAb PR000020和偶聯產物PR000020-ADC的純化後樣品，用DTT(dithiothreitol)還原；然後，半胱胺酸的活性巰基用碘代乙醯胺(iodoacetamide,IAM)進行封閉；接著，用胰蛋白酶trypsin消化酶切樣品；將酶切產物肽段用LC-MS分析。最後，將所得到的資料採用軟體Peaks Studio(Bioinformatics Solutions Inc.)進行搜庫，經由將偶聯藥物可能發生於半胱胺酸Cys上設置為可變修飾，結合原始的二級質譜圖資訊，並經由提取離子流色譜圖(XIC)進行比對，最終確定藥物偶聯位點。
如果Cys與mc-vc-PAB-MMAE發生反應形成穩定的硫醚鍵，那麼該Cys位點就不能經由前述的還原烷基化處理方法形成IAM修飾。HCAb PR000020的每一條重鏈上有9個Cys(按照胺基酸序列順序位置編號，分別為：C23,C96,C124,C130,C133,C165,C225,C271,C329)，其中C124對應Eu編號是220。經分析，在未偶聯的PR000020樣品中，所有9個Cys中，除C225由 於前後較為密集的胰酶酶切位點分佈導致未被檢出，其餘8個位點上的Cys均被檢測到由於還原烷基化處理帶來較高程度的IAM修飾，圖11(C)列出了未偶聯樣品中所鑑定到的含有IAM修飾的Cys(Cys-IAM)的肽段列表。在偶聯產物PR000020-ADC樣品中，總共檢測到1個藥物偶聯位點，為C124(即Eu編號的Cys-220)，而其它8個Cys均被檢測到IAM修飾，圖11(B)列出了偶聯樣品中所鑑定到的含有IAM修飾的Cys(Cys-IAM)的肽段列表，這些肽段在圖11(A)的PR000020-ADC的胺基酸序列上用灰色背景標識。由此可見，在PR000020-ADC樣品中，C124(即Cys-220)沒有發生IAM修飾。
採用Peaks Studio進行搜庫時，將偶聯藥物(mc-vc-PAB-MMAE，品質差異為1315.78Da)可能發生於Cys上的情況設置為可變修飾。搜庫結果顯示僅在偶聯樣品中鑑定到含C124(即Cys-220)的肽段PHGSDIWGQGTMVTVSSEPKSC#DK(#表示修飾位點)發生了修飾(即藥物偶聯)。該肽段的二級質譜圖如圖35所示(m/z=966.2409,z=4,RT=83.77min)。由於在實驗過程中mc-vc-PAB-MMAE會發生碎裂(如圖6(B)所示特徵碎片結構)，導致了y離子的缺失，因此可以在該肽段二級譜圖的低品質端觀察到其特徵碎片離子的存在，也由此進一步證實了C124(即Cys-220)的偶聯修飾。經由比對PR000020-ADC樣品與PR000020單抗樣品中該肽段的提取離子流色譜圖(XIC圖，圖36)發現，發生藥物偶聯的肽段(RT=83.77min)的信號僅在ADC樣品中檢出，而作為對照的單抗樣品中沒有檢測到相應的信號，這就進一步證明瞭該半胱胺酸殘基為藥物偶聯位點。
綜上該，利用LC-MS肽圖分析PR000020-ADC偶聯產物證實了藥物偶聯發生在位點Cys-220。
實施例5.4結合CTLA4高表達細胞
本實施例是為了研究HCAb抗體PR000020和其偶聯產物PR000020-ADC結合高表達CTLA4的細胞的活性。
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表達人CTLA4的HEK293T細胞株HEK293/hCTLA4(和鉑醫藥構建)等細胞的結合能力。具體地，消化HEK293/hCTLA4細胞並用DMEM培養基重新懸浮；將細胞密度調整為1x106細胞/mL。未表達CTLA4的HEK293細胞作為陰性對照。接著將細胞以100μL/孔接種於96孔V底板(Corning,#3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100μL/孔加入96孔板並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為500nM按照3倍濃度梯度稀釋的共12個濃度。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。然後，加入100μL/孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)漂洗細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100μL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488 anti-human IgG Fc,Biolegend,#409322,1：1000稀釋)，放置於4℃，避光孵育1小時。隨後以200μL/孔加入預冷的FACS緩衝液漂洗細胞兩次，然後於4℃下500g離心5分鐘，棄上清。最後，以200μL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10(FlowJo,LLC)處理和分析資料。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，經由四參數非線性擬合，得到抗體對靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖7中所示，抗體PR000020及其純化後的偶聯產物PR000020-ADC都與HEK293/hCTLA4細胞有較強的特異性結合活性。
實施例6HCAb PR000759的偶聯和分析
本實施例研究了抗MSLN的HCAb抗體PR000759(SEQ ID NO：67)與mc-vc-PAB-MMAE利用半胱胺酸偶聯到Cys-220位點來製備具有均一DAR值的抗體偶聯藥物。
實施例6.1偶聯反應條件優化
以實施例5.1所得到的初步確定的優化偶聯反應條件為基礎，針對該抗體分子做進一步優化。如表6-1所示，平行用5組條件對純化的HCAb PR000759重組蛋白進行偶聯；還原劑選擇TCEP，選擇的藥物偶聯物為mc-vc-PAB-MMAE，偶聯所用的藥物偶聯物用量為5-18莫耳倍數，反應時長為1-2小時。在本實驗中，還原或偶聯反應的pH為6.5-7.0，溫度為室溫(25-30℃)。每組實驗的偶聯的產物用實施例2.2該HIC-HPLC分析方法分析其偶聯產物的組分，列於表6-1。在本實施例中，實驗組#2的偶聯反應條件可以實現DAR=2組分(表6-1中的’D2%’)占比最高。偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物，並用實施例4.2該HIC方法純化偶聯產物，得到DAR=2的主要產物。
Figure 110145684-A0101-12-0102-24
實施例6.2偶聯產物分析
本實施例利用高效液相色譜和質譜等技術對純化的重組HCAb PR000759和其偶聯產物PR000759-ADC(包括偶聯後產物和經過一步HIC純化後的產物)進行定量分析，以確定其偶聯產物組分的構成。
利用實施例2.1中該SEC-HPLC方法和實施例2.2中該HIC-HPLC方法對上述樣品進行分析。圖12和表6-2顯示了HCAb PR000759重組蛋白偶聯前的樣品的SEC-HPLC分析結果，顯示其純度高達95%。圖13和表6-3顯示了偶聯產物PR000759-ADC經過一步HIC純化(實施例4.2)後得到的產物的HIC-HPLC分析結果，顯示其94%的組分是偶聯了2個化合物的產物(DAR=2)。
Figure 110145684-A0101-12-0103-25
Figure 110145684-A0101-12-0103-26
 表6-3 PR000759-ADC純化後樣品(lot.# HSP307A-181229 MIX)的HIC-HPLC分析結果
利用實施例2.4中該方法對HCAb PR000759和PR000759-ADC的純化後樣品進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖15顯示了分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)PR000759的非還原樣品；(B)PR000759-ADC的非還原樣品；(C)PR000759-ADC的還原樣品。按照實施例5.2中該分子量分析方法過程推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量(下表)。表6-4顯示了HCAb PR000759的實際測定分子量。表6-5顯示了在PR000759-ADC的非還原樣品中，DAR=2的組分是主要成分(占91%)，推算出PR000759-ADC產物的平均DAR值為2.10。相應地，如表6-6所示，在PR000759-ADC的還原樣品中，偶聯有1個化合物的重鏈(+1D)是主要成分，推算出PR000759-ADC產物的平均DAR值為1.98。
Figure 110145684-A0101-12-0104-28
Figure 110145684-A0101-12-0104-29
Figure 110145684-A0101-12-0105-30
Figure 110145684-A0101-12-0105-31
綜合以上多種分析手段的結果，可以推論出：利用半胱胺酸偶聯，偶聯產物中主要成分是DAR=2的組分，經過進一步HIC純化，可以得到純度>90%的DAR=2高均質性的產物。
實施例6.3用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用LC-MS來分析ADC偶聯位點。第一步，預處理待測樣本PR000759-ADC。將樣品轉移至10KD超濾管中，經三次超濾後將樣品置換到含8M尿素的緩衝液；再加入終濃度為20mM的DTT(dithiothreitol)，於37℃反應1小時；隨後加入終濃度為50mM的吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)，於室 溫下避光反應30分鐘；再次超濾後置換到含50mM碳酸氫銨的緩衝液，並以樣品：酶=50：1的比例加入胰蛋白酶trypsin，於37℃過夜酶解。第二步，分析待測樣品。樣品經胰酶酶切後經由LC-MS/MS進行鑑定，採用軟體Peaks Studio(Bioinformatics Solutions Inc.)進行搜庫，其參數設置為：trypsin酶解；碎片離子品質容許誤差：0.05Da；母離子品質容許誤差：10ppm；最大漏切數：2；可變修飾為：Carbamidomethylation 57.02，Oxidation(M)15.99，Deamidation(NQ)0.98，Pyroglutamate formation(N-term E)-18.01，ADC drug 1315.78。
搜庫結果經嚴格卡值過濾後得到可信肽段(-10lgP
Figure 110145684-A0101-12-0106-168
20)，其序列覆蓋率近100%。從肽段列表中，篩選出帶有mc-vc-PAB-MMAE偶聯位點的三條肽段(圖14)，結果顯示PR000759-ADC在第127位(Eu編號為220)、第136位(Eu編號為229)和第168位(Eu編號為261)的半胱胺酸上鑑定到帶有偶聯修飾(如圖14中粗體的C所示)。進一步對這三條肽段的對應的二級譜圖進行了逐一核對，證實在其發生△mass=1315.78Da的修飾均為高度可信的；另外，將二級譜圖的低品質端進行放大，可以清楚的看到mc-vc-PAB-MMAE發生碎裂後產生的特徵碎片離子的存在，也進一步證實了偶聯修飾位點。
在該肽圖分析中，無法精確定量每一種偶聯位點在產物中所占比例；但是結合之前的HIC-HPLC和LC-MS分子量分析，證明絕大多數偶聯發生在PR000759的第127位的半胱胺酸(即Cys-220)以形成DAR=2的偶聯產物。
實施例7 HCAb PR001046的偶聯和分析
本實施例研究了抗BCMA的HCAb抗體PR001046(SEQ ID NO：68)與mc-vc-PAB-MMAE利用半胱胺酸偶聯到Cys-220位點來製備具有均一DAR值的抗體偶聯藥物。
實施例7.1 偶聯反應條件優化
以實施例5.1所得到的初步確定的優化偶聯反應條件為基礎，針對該抗體分子做進一步優化。如表7-1所示，平行用6組條件對純化的HCAb PR001046重組蛋白進行偶聯；還原劑選擇TCEP，選擇的藥物偶聯物為mc-vc-PAB-MMAE，偶聯所用的藥物偶聯物用量為5-8莫耳倍數，反應時長為1-3小時。在本實驗中，還原或偶聯反應的pH為6.5-7.0，溫度為室溫(25-30℃)。每組實驗的偶聯的產物用實施例2.2該HIC-HPLC分析方法分析其偶聯產物的組分，列於表7-1。當TCEP用量在1.3-1.5莫耳倍數時，DAR=2組分得率(表7-1中的’D2%’)最高。偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物，並用實施例4.2該HIC方法純化偶聯產物，得到DAR=2的主要產物。
Figure 110145684-A0101-12-0107-32
實施例7.2偶聯產物分析
本實施例利用高效液相色譜和質譜等技術對純化的重組HCAb PR001046和其偶聯產物PR001046-ADC(包括偶聯後產物和經過一步HIC純化後的產物)進行定量分析，以確定其偶聯產物組分的構成。
利用實施例2.1中該SEC-HPLC方法和實施例2.2中該HIC-HPLC方法對上述樣品進行分析。圖16和表7-2顯示了HCAb PR001046重組蛋白偶聯前的樣品的SEC-HPLC分析結果，顯示其純度高達98%。圖17和表7-3顯示了偶聯產物PR001046-ADC經過一步HIC純化(實施例4.2)後得到的產物的HIC-HPLC分析結果，顯示其88%的組分是偶聯了2個化合物的產物(DAR=2)。
Figure 110145684-A0101-12-0108-33
Figure 110145684-A0101-12-0108-34
 表7-3 PR001046-ADC純化後樣品(lot.# HSP307B-181229 MIX)的HIC-HPLC分析結果
利用實施例2.4中該方法對HCAb PR001046和PR001046-ADC的純化後樣品進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖19顯示了分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)PR001046的非還原樣品；(B)PR001046-ADC的非還原樣品；(C)PR001046-ADC的還原樣品。按照實施例5.2中該分子量分析方法過程推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量(下表)。表7-4顯示了HCAb PR001046的實際測定分子量。表7-5顯示了在PR001046-ADC的非還原樣品中，DAR=2的組分是主要成分(占81%)，推算出PR001046-ADC產物的平均DAR值為2.39。相應地，如表7-6所示，在PR001046-ADC的還原樣品中，偶聯有1個化合物的重鏈(+1D)是主要成分，推算出PR001046-ADC產物的平均DAR值為2.20。
Figure 110145684-A0101-12-0109-35
Figure 110145684-A0101-12-0109-36
Figure 110145684-A0101-12-0110-37
Figure 110145684-A0101-12-0110-38
綜合以上多種分析手段的結果，可以推論出：利用半胱胺酸偶聯，偶聯產物中主要成分是DAR=2的組分，經過進一步HIC純化，可以得到純度>80%的DAR=2高均質性的產物。
實施例7.3用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用實施例6.3中該方法來分析PR001046-ADC的偶聯位點。
圖18列出了帶有mc-vc-PAB-MMAE偶聯位點的三條肽段，結果顯示PR001046-ADC在第127位(Eu編號為220)、第136位(Eu編號為229)和第 168位(Eu編號為261)的半胱胺酸上鑑定到帶有偶聯修飾(如圖18中粗體的C所示)。進一步對這三條肽段的對應的二級譜圖進行了逐一核對，證實在其發生△mass=1315.78Da的修飾均為高度可信的；例如，圖70顯示了含有C220偶聯位點的肽段的二級譜圖。
在該肽圖分析中，無法精確定量每一種偶聯位點在產物中所占比例；但是結合之前的HIC-HPLC和LC-MS分子量分析，證明絕大多數偶聯發生在PR001046的第127位的半胱胺酸(即Cys-220)以形成DAR=2的偶聯產物。
實施例7.4結合BCMA高表達細胞
本實施例是為了研究HCAb抗體PR001046和其偶聯產物PR001046-ADC結合高表達BCMA的細胞的活性。
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表達人BCMA的HEK293T細胞株HEK293T-hBCMA(北京康源博創，KC-0233)的結合能力。具體地，消化細胞並用DMEM完全培養基重新懸浮，調整細胞密度為1x106細胞/mL。以10μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100μL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific,Jackson ImmunoResearch Inc.,#109-545-098,1：500稀釋)，4℃，避光孵育30分鐘。用100μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10(FlowJo,LLC)處理和分析資料。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，經由四參數非線性擬合，得到抗體對靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖20中所示，抗體PR001046及其純化後的偶聯產物PR001046-ADC都與HEK293T-hBCMA細胞有較強的特異性結合活性。
實施例7.5細胞毒性殺傷實驗
本實施例為了研究抗BCMA的抗體偶聯產物PR001046-ADC對高表達人BCMA的細胞系NCI-H929(ATCC,CRL-9068)的特異性細胞殺傷活性，並且對不表達人BCMA的SNU-16(ATCC,CRL-5974)細胞沒有殺傷活性。
將NCI-H929細胞和SNU-16細胞分別接種於96孔板(Perkin Elmer,#6005225)，接種細胞數量分別為：10000細胞/50μL/孔(NCI-H929)、5000細胞/50μL/孔(SNU-16)、10000細胞NCI-H929和5000細胞SNU-16/100μL/孔混合(NCI-H929+SNU-16)。然後，以50μL/孔加入預先梯度稀釋的待測樣品，PR001046和PR001046-ADC的濃度為1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml，mc-vc-PAB-MMAE的濃度為10nM、1nM和0.1nM。接著，在37℃和5% CO2環境下孵育72小時，加入CellTiter-Glo細胞活力檢測試劑(Promega,#G7573)，室溫下孵育至少10分鐘得到穩定發光信號，酶標儀檢測發光值。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析。本實施例中，使用了多組不同的PR001046-ADC樣品，包括純化前或純化後的含有不同DAR=2(D2)組分百分比的樣品。
圖21中所示，0.1μg/ml及以上濃度的PR001046-ADC可以特異性地殺傷BCMA陽性細胞NCI-H929以及NCI-H929與SNU-16的混合細胞，但是不能殺傷BCMA陰性細胞SNU-16。如圖21(A)所示，未偶聯的PR001046或 mc-vc-PAB-MMAE化合物不能對細胞產生有效的殺傷。另一方面，如圖21(B)所示，偶聯產物主要成分(DAR=2)的純度對於殺傷能力沒有顯著影響。
實施例8HCAb PR004432的偶聯和分析
本實施例研究了抗5T4的HCAb抗體PR004432(SEQ ID NO：69)與mc-vc-PAB-MMAE利用半胱胺酸偶聯到Cys-220位點來製備具有均一DAR值的抗體偶聯藥物。
實施例8.1偶聯反應條件優化
以實施例5.1所得到的初步確定的優化偶聯反應條件為基礎，針對該抗體分子做進一步優化。如表8-1所示，平行用2組條件對純化的HCAb PR004432重組蛋白進行偶聯；還原劑選擇TCEP，TCEP用量為4莫耳倍數，選擇的藥物偶聯物為mc-vc-PAB-MMAE，偶聯所用的藥物偶聯物用量為12莫耳倍數，反應時長為1-2小時。在本實驗中，還原或偶聯反應的pH為6.5-7.0，溫度為室溫(25-30℃)。每組實驗的偶聯的產物用實施例2.3該RP-HPLC分析方法(使用分析型色譜管柱PLRP-S 1000A)分析其偶聯產物的組分，列於表8-1；DAR=2組分得率(’D2%’)約60%。偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物，並用實施例4.2該HIC方法純化偶聯產物，得到DAR=2的主要產物。
Figure 110145684-A0101-12-0113-39
實施例8.2偶聯產物分析
本實施例利用高效液相色譜和質譜等技術對純化的重組HCAb PR004432和其偶聯產物PR004432-ADC(包括偶聯後產物和經過一步HIC純化後的產物)進行定量分析，以確定其偶聯產物組分的構成。
利用實施例2.1中該SEC-HPLC方法和實施例2.3中該RP-HPLC方法(使用分析型色譜管柱PLRP-S 1000A)對上述樣品進行分析。圖22和表8-2顯示了HCAb PR004432重組蛋白偶聯前的樣品的SEC-HPLC分析結果，顯示其純度高達98%。圖23和表8-3顯示了偶聯產物PR004432-ADC經過一步HIC純化(實施例4.2)後得到的產物的RP-HPLC分析結果，顯示其90.6%的組分是偶聯了2個化合物的產物(DAR=2)。
Figure 110145684-A0101-12-0114-40
Figure 110145684-A0101-12-0114-42
Figure 110145684-A0101-12-0115-43
利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)對PR004432-ADC的純化後樣品進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖25顯示了分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)PR004432-ADC的非還原樣品；(B)PR004432-ADC的還原樣品。按照實施例5.2中該分子量分析方法過程推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量(下表)。表8-4顯示了在PR004432-ADC的非還原樣品中，DAR=2的組分是主要成分(占98.3%)，推算出PR004432-ADC產物的平均DAR值為1.97。相應地，如表8-5所示，在PR004432-ADC的還原樣品中，偶聯有1個化合物的重鏈(+1D)是主要成分(占96.5%)，推算出PR004432-ADC產物的平均DAR值為1.93。
Figure 110145684-A0101-12-0115-44
 (*可能包含C’端未剪切Lys(+128Da)或其他修飾帶來的分子量偏差)
Figure 110145684-A0101-12-0116-45
綜合以上多種分析手段的結果，可以推論出：利用半胱胺酸偶聯，偶聯產物中主要成分是DAR=2的組分，經過進一步HIC純化，可以得到純度>90%的DAR=2高均質性的產物。
實施例8.3用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用實施例6.3中該方法來分析PR004432-ADC的偶聯位點。簡言之，PR004432-ADC樣品經trypsin酶解後用LC-MS/MS鑑定，所得資料用軟體BioPharmView(SCIEX)搜庫，搜庫參數設置為：trypsin酶解；碎片離子品質容許誤差；0.05Da；母離子品質容許誤差：10ppm；最大漏切數：1；可變修飾：Carbamidomethylation 57.02，Oxidation(M)15.99，Deamidation(NQ)0.98，mc-vc-PAB-MMAE 1315.78。找到帶有化合物偶聯修飾(分子量差異1315.78)的相關目標肽段，查看相應二級譜圖進一步確認。偶聯位點佔有率(該位點聯結有化合物的比例)用下面公式計算：
Figure 110145684-A0101-12-0116-46
圖24顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR004432-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的3條肽段，以及相應的偶聯位點覆蓋率。分析所有含有Cys位點並發生偶聯修飾的肽段，每一條肽段對應的二級譜圖也經過逐一核對，以證實其發生的偶聯修飾均為高度可信的。例如，含有SC(+1315.78)DK的肽段占比97.12%，這說明，97.12%的Cys-220位點被偶聯有化合物。類似地，只有1.5%的Cys-226或Cys-229位點發生偶聯。
實施例8.4結合5T4高表達細胞
本實施例是為了研究HCAb抗體PR004432和其偶聯產物PR004432-ADC結合高表達BCMA的細胞的活性。
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表達人5T4的人乳腺癌細胞株HCC1954(ATCC,CRL-2338)的結合能力。具體地，調整細胞密度為1x106細胞/mL，以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100μL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific,Jackson ImmunoResearch Inc.,#109-545-098,1：500稀釋)，4℃，避光孵育30分鐘。用100μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BDFACS CANTOII流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10(FlowJo,LLC)處理和分析資料。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，經由四參數非線性擬合，得到抗體對靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖26中所示，抗體PR004432及其純化後的偶聯產物PR004432-ADC都與HCC1954細胞有較強的特異性結合活性。
實施例8.5細胞毒性殺傷實驗
本實施例為了研究抗5T4的抗體偶聯產物PR004432-ADC對高表達人5T4的人乳腺癌細胞株HCC1954(ATCC,CRL-2338)的細胞殺傷活性。
將HCC1954細胞以4000細胞/50μL/孔接種於96孔板(Perkin Elmer,#6005225)，於37℃和5% CO2下孵育過夜。然後，以50μL/孔加入預先梯度稀釋的待測樣品，PR004432、PR004432-ADC和PR004433-ADC從最高終濃度為30nM以3倍濃度梯度稀釋，mc-vc-PAB-MMAE從最高終濃度為60nM以3倍濃度梯度稀釋；另設置不加待測樣品的孔為對照孔。接著，在37℃和5% CO2環境下孵育72小時，加入CellTiter-Glo細胞活力檢測試劑(Promega,#G7573)，室溫下孵育至少10分鐘得到穩定發光信號，酶標儀檢測發光值。將發光值按如下公式計算細胞活率：
細胞活率(%)=(A/B)×100%
其中：A=實驗孔(靶細胞+待測樣品+培養基)；B=對照孔(靶細胞+培養基)
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，經由四參數非線性擬合，得到抗體對靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖27顯示了抗5T4的HCAb PR004432及其偶聯產物PR004432-ADC、抗BCMA的HCAb PR004433的偶聯產物PR004433-ADC、未偶聯的細胞毒化合物mc-vc-PAB-MMAE等待測樣品對高表達人5T4的細胞HCC1954的細胞毒性殺傷。僅PR004432-ADC能夠對HCC1954產生有效的特異性的細胞毒性殺傷，且呈現抗體濃度依賴性；mc-vc-PAB-MMAE僅在最高濃度(60nM)時有 殺傷效果，而其他分子都不能對細胞產生有效的殺傷。此結果證實了PR004432-ADC的靶點依賴的高特異性和高效力。
實施例9HCAb PR004433的偶聯和分析
本實施例研究了抗BCMA的HCAb抗體PR004433(SEQ ID NO：70)與mc-vc-PAB-MMAE利用半胱胺酸偶聯到Cys-220位點來製備具有均一DAR值的抗體偶聯藥物。
實施例9.1偶聯反應條件優化
以實施例5.1所得到的初步確定的優化偶聯反應條件為基礎，針對該抗體分子做進一步優化。如表9-1所示，平行用6組條件對純化的HCAb PR004433重組蛋白進行偶聯；還原劑選擇TCEP，TCEP用量在1.7-2.1莫耳倍數，選擇的藥物偶聯物為mc-vc-PAB-MMAE，偶聯所用的藥物偶聯物用量為7莫耳倍數，反應時長為2小時。在本實驗中，還原或偶聯反應的pH為6.5-7.0，溫度為室溫(25-30℃)。每組實驗的偶聯的產物用實施例2.2該HIC-HPLC分析方法分析其偶聯產物的組分，尤其是DAR=2的組分含量(’D2%’)，列於表9-1。偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物，並用實施例4.2該HIC方法純化偶聯產物，得到DAR=2的主要產物。
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實施例9.2偶聯產物分析
本實施例利用高效液相色譜和質譜等技術對純化的重組HCAb PR004433和其偶聯產物PR004433-ADC(包括偶聯後產物和經過一步HIC純化後的產物)進行定量分析，以確定其偶聯產物組分的構成。
利用實施例2.1中該SEC-HPLC方法和實施例2.2中該HIC-HPLC方法對上述樣品進行分析。圖28和表9-2顯示了HCAb PR004433重組蛋白偶聯前的樣品的SEC-HPLC分析結果，顯示其純度高達98%。圖29和表9-3顯示了偶聯產物PR004433-ADC經過一步HIC純化(實施例4.2)後得到的產物的HIC-HPLC分析結果，顯示其90.8%的組分是偶聯了2個化合物的產物(DAR=2)。圖30和下表分別顯示了HCAb PR004433及其偶聯產物PR004433-ADC的HIC-HPLC分析結果：(A)PR004433偶聯前(表9-4)；(B)偶聯後，純化前(表9-5)；(C)偶聯及一步HIC純化後(表9-6)。
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利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)對PR004433-ADC的純化後樣品進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖31顯示了分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)PR004433-ADC的非還原樣品；(B)PR004433-ADC的還原樣品。按照實施例5.2中該分子量分析方法過程推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量(下表)。表9-7顯示了在PR004433-ADC的非還原樣品中，DAR=2的組分是主要成分(占98%)，推算出PR004433-ADC產物的平均DAR值為2.02。相應地，如表9-8所示，在PR004433-ADC的還原樣品中，偶聯有1個化合物的重鏈(+1D)是主要成分(占90.5%)，推算出PR004433-ADC產物的平均DAR值為2.02。
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Figure 110145684-A0101-12-0123-57
綜合以上多種分析手段的結果，可以推論出：利用半胱胺酸偶聯，偶聯產物中主要成分是DAR=2的組分，經過進一步HIC純化，可以得到純度>90%的DAR=2高均質性的產物。
實施例9.3用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用實施例8.3中該方法來分析PR004433-ADC的偶聯位點。
圖34顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR004433-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的3條肽段，以及相應的偶聯位點覆蓋率。分析所有含有Cys位點並發生偶聯修飾的肽段，每一條肽段對應的二級譜圖也經過逐一核對，以證實其發生的偶聯修飾均為高度可信的。例如，含有SC(+1315.78)DK的肽段占比98%，這說明，98%的Cys-220位點被偶聯有化合物。類似地，只有4%的Cys-226或Cys-229位點發生偶聯。
實施例9.4結合BCMA高表達細胞
本實施例利用實施例7.4中該方法研究HCAb抗體PR004433或其偶聯產物PR004433-ADC與高表達人BCMA的HEK293T細胞株HEK293T-hBCMA(北京康源博創，KC-0233)、高表達人BCMA的細胞系NCI-H929(ATCC,CRL-9068)或不表達人BCMA的細胞系SNU-16(ATCC,CRL-5974)等細胞的結合能力。
圖32中所示，PR004433和PR004433-ADC都可以與HEK293T-hBCMA細胞(圖32(A))和NCI-H929細胞(圖32(B))有較強的特異性結合；而且，PR004433不能結合BCMA陰性細胞SNU-16(圖32(C))。
實施例9.5細胞毒性殺傷實驗
本實施例為了研究抗BCMA的抗體偶聯產物PR004433-ADC對高表達人BCMA的HEK293T細胞株HEK293T-hBCMA(北京康源博創，KC-0233)和高表達人BCMA的腫瘤細胞系NCI-H929(ATCC,CRL-9068)的特異性細胞殺傷活性，並且對不表達人BCMA的細胞HEK293T(ATCC,CRL-11268)和SNU-16(ATCC,CRL-5974)沒有殺傷活性。
將HEK293T-hBCMA、NCI-H929、HEK293T和SNU-16細胞分別接種於96孔板(Perkin Elmer,#6005225)，接種細胞數量分別為：2500細胞/50μL/孔(HEK293T-hBCMA)，5000細胞/50μL/孔(NCI-H929)，2500細胞/50μL/孔(HEK293T)，5000細胞/50μL/孔(SNU-16)。隨後於37℃和5% CO2下孵育過夜。然後，以50μL/孔加入預先梯度稀釋的待測樣品，PR004433、PR004433-ADC和PR004432-ADC從最高終濃度為10nM以3倍濃度梯度稀釋，mc-vc-PAB-MMAE從最高終濃度為20nM以3倍濃度梯度稀釋；另設置不加待測樣品的孔為對照孔。接著，在37℃和5% CO2環境下孵育72小時，加入CellTiter-Glo細胞活力檢測試劑(Promega,#G7573)，室溫下孵育至少10分鐘得到穩定發光信號，酶標儀檢測發光值。將發光值按如下公式計算細胞活率：
細胞活率(%)=(A/B)×100%
其中：A=實驗孔(靶細胞+待測樣品+培養基)；B=對照孔(靶細胞+培養基)
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，經由四參數非線性擬合，得到抗體對靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖33顯示了抗BCMA的HCAb PR004433及其偶聯產物PR004433-ADC、抗5T4的HCAb PR004432的偶聯產物PR004432-ADC、未偶聯的細胞毒化合物mc-vc-PAB-MMAE等待測樣品對BCMA陽性細胞(HEK293T-hBCMA和NCI-H929)和BCMA陰性細胞(HEK293T和SNU-16)的細胞毒性殺傷。僅PR004433-ADC能夠對BCMA陽性細胞HEK293T-hBCMA(圖33(A))和NCI-H929(圖33(C))產生有效的特異性的細胞毒性殺傷，且呈現抗體濃度依賴性，對BCMA陰性細胞沒有細胞毒性；而其他分子都不能對細胞產生有效的殺傷。此結果證實了PR004433-ADC的靶點依賴的高特異性和高效力。
實施例10HCAb PR004433的偶聯反應條件優化
在實施例9中已經研究了抗BCMA的HCAb抗體PR004433(SEQ ID NO：70)與mc-vc-PAB-MMAE利用半胱胺酸偶聯到Cys-220位點來製備具有均一DAR值的抗體偶聯藥物；但是如實施例9.1該實驗過程和表9-1所列出的反應條件和結果所示，其經過一步偶聯後的產物中，DAR=2的組分含量(’D2%’)約為50-60%，需要經過一步HIC純化(實施例4.2該方法)來去除非主要組分得到高純度的DAR=2組分。
本實施例進一步優化偶聯反應條件，使得經過一步偶聯後的產物中，DAR=2的組分含量提高，減少了進一步純化的需求；更佳地，經過偶聯步驟後無需額外純化步驟即可以得到純度大於90%的DAR=2高均質性的產物。
實施例10.1偶聯反應條件優化
由於在還原和偶聯等反應過程中，多種反應條件如反應溫度、反應時間、反應緩衝液類型及pH、還原劑類型及用量、偶聯物分子類型及用量等都可能帶來很大影響，因此在實施例4.1中該方法的基礎上，本實施例設計了一系列實驗，固定其中一些實驗條件參數，而對另一些實驗條件參數進行改變，嘗試得到更優的反應條件。具體地，本實施例使用了17組不同的還原和偶聯條件的組合對HCAb PR004433進行偶聯反應並對偶聯產物進行分析，相較於實施例9，本實施例還進一步考察了反應緩衝液pH和還原反應溫度等參數對偶聯的影響。在本實驗中，PR004433的濃度為5mg/ml；反應緩衝液為20mM His-HCl，其pH可調節；還原劑為TCEP，其莫耳當量可變；還原反應溫度和反應時長為變數；偶聯藥物分子為mc-vc-PAB-MMAE(生產商：聯寧生物製藥，貨號：SET0201)，其莫耳當量可變；偶聯反應溫度為室溫，反應時長為30分鐘。表10-1列出了該17 組實驗及其各反應條件參數。對於每組實驗，其偶聯產物利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B；樣品未經去糖預處理)進行非還原樣品的完整分子量分析，並利用每個樣品的質譜圖中的總離子流圖(TIC)並結合實施例5.2使用的分子量分析過程來推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量；分析結果列於表10-2。在表10-2中，“D0%”、“D2%”、“D4%”和“D6%”分別表示沒有偶聯化合物(DAR=0)、偶聯了2個化合物(DAR=2)、偶聯了4個化合物(DAR=4)和偶聯了6個化合物(DAR=6)的組分的含量，並據此計算出平均DAR值。其中，實驗#8、#9、#11和#12產生的偶聯產物中DAR=2組分含量超過了85%，其平均DAR值也非常接近2.0；這四組實驗的偶聯產物樣品的質譜圖的TIC圖分別對應於圖45的(A)-(D)。
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特別地，實驗#12產生的偶聯產物中DAR=2組分含量超過了90%，其他組分含量極低，說明HCAb PR004433利用實驗#12的反應條件可以產生高純度的偶聯產物，無需經過額外純化步驟，即可得到DAR值確定的高均一性的產物。這相較於實施例9中的偶聯方法是顯著的進步。
對實驗#12產生的偶聯產物進一步利用實施例9.3中該方法來分析抗體偶聯藥物分子的偶聯位點，結果表明，96.22%的Cys-220位點被偶聯；類 似地，只有6%的Cys-226或Cys-229位點發生偶聯。因此，實驗#12產生的偶聯產物中是高均一性的定點偶聯於Cys-220的抗體偶聯藥物分子。
本實施例充分地說明瞭，本申請的發明人對整個偶聯過程的各種反應條件進行了多次的嘗試和優化，找到了更優化的反應條件組合，在一些反應條件組合下，Cys-220的二硫鍵可以被有效地打開而其他二硫鍵保持完整，使得Cys-220成為幾乎唯一的游離半胱胺酸殘基，進而作為特異性的偶聯位點。
實施例11人IgG1鉸鏈區序列的變化
本實施例研究了基於人IgG1抗體重鏈鉸鏈區的天然序列(SEQ ID NO：73)產生的連接肽變體序列中第一個Cys(Cys1)和第二個Cys(Cys2)之間所間隔的胺基酸的數目和種類，和對第一個Cys作為特異性定點偶聯位元點產生均一CAR值(偶聯物/抗原結合蛋白比)的偶聯產物的影響。
實施例11.1改變HCAb PR004433的鉸鏈區連接肽以產生變體序列
本實施例在HCAb PR004433的基礎上，針對鉸鏈區設計了不同長度的隨機化引子經由蛋白工程改造產生一系列具有不同鉸鏈區連接肽的抗原結合蛋白。例如，利用表11-1中該引子，可以在Cys1和Cys2之間插入分別為3、4、5、6、7、8、9或10個任意胺基酸，以產生如SEQ ID NOs：74-81任一所示連接肽序列。然後，每一種長度的連接肽隨機挑選3種不同突變序列進一步研究Cys1和Cys2之間的不同胺基酸組成，且Cys1和Cys2之間的胺基酸不能是半胱胺酸。隨後，在後續實施例中，具有不同長度和胺基酸組成的連接肽的抗原結合蛋白(PR004433變體序列)利用前述方法進行表達純化，並與藥物偶聯物mc-vc-PAB-MMAE偶聯，分析偶聯產物的組分和偶聯位點。表11-2列出了一系列由隨機化產生的不同長度的連接肽序列。將HCAb PR004433的鉸鏈區序列替換成表 11-2中的連接肽序列以產生多種PR004433衍生的抗原結合蛋白變體序列(表11-3)，這些抗原結合蛋白的可變區和Fc恆定區之間的連接肽具有不同的長度和胺基酸組成。
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實施例11.2HCAb PR004433衍生的變體分子的表達和鑑定
表11-3中的PR004433衍生的抗原結合蛋白按照實施例1.6中該方法進行表達純化，並利用實施例2.1中該SEC-HPLC方法分析純度和利用實施例2.7中該DSF方法確定其最低熔解溫度(Tm1)。抗原結合蛋白的表達純化和熱穩定性分析結果列於表11-4；由此可見，當HCAb PR004433的鉸鏈區序列替換成各種連接肽的變體序列後，且當Cys1和Cys2之間間隔至少3個其他胺基酸時， PR004433衍生的變體序列都能夠有效的表達，且絕大多數變體分子的表達產量和熱穩定性Tm1沒有受到影響。
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本實施例進一步利用實施例3.2中該LC-MS分子量分析方法來確定不同的連接肽變體序列中Cys1的狀態。在PR004433衍生的變體序列中，Cys1(或Cys-220)的狀態有如圖3所示的兩種可能性：形成或者不形成鏈間二硫鍵。如果Cys1沒有形成重鏈間二硫鍵，其側鏈巰基(-SH)會與環境中的含巰基分子(如，半胱胺酸或者谷胱甘肽)形成二硫鍵，使其實際分子量明顯大於理論分子量。將純化的抗原結合蛋白用糖苷酶PNGase F作去糖處理，並用實施例2.4該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)測定其完整(非還原)分子量，與相應的理論分子量進行比較；表11-5顯示了分子量的理論值和測定值是非常一致的，因此，該抗原結合蛋白的Cys1沒有聯結其他含巰基分子。 由此推斷出，當Cys1和Cys2之間間隔3個至10個其他胺基酸時，Cys1能夠形成重鏈間二硫鍵(即第一連接肽的Cys1和第二連接肽的Cys1之間形成二硫鍵)。
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本實施例還進一步利用實施例9.4中該方法研究HCAb抗體PR004433及其變體分子與高表達人BCMA的NCI-H929(ATCC,CRL-9068)細胞的結合能力。如圖46中所示，PR004433變體分子結合NCI-H929的能力與親本分子PR004433的結合能力幾乎相同，說明對PR004433的鉸鏈區(連接肽)序列的改變不會影響其抗原結合片段與靶點的結合。
實施例11.3 HCAb PR004433衍生的變體分子的偶聯產物分析
本實施例還進一步利用實施例10中該偶聯方法對表11-4中所列的PR004433衍生的變體分子進行偶聯反應，在實施例10.1所得到的較優的反應條件參數的基礎上，經由改變還原劑TCEP的用量，來產生不同的偶聯反應產物。在本實驗中，具有不同連接肽的PR004433衍生的變體分子(PR006031、PR006034、PR006037、PR006040、PR006312、PR006314、PR006317和PR006320)的濃度為5mg/ml，反應緩衝液為含20mM His-HCl的pH 6.0緩衝液，還原劑TCEP的用量從1.5到6.0倍莫耳當量變化，還原反應於室溫2小時，偶聯物mc- vc-PAB-MMAE的用量為7.0莫耳倍數，偶聯反應於室溫0.5小時；其偶聯產物不經過HIC純化步驟。進一步地，偶聯產物也利用實施例10.1所使用的分子量分析方法來推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量，分析結果列於表11-6；例如，PR006031中的連接肽的Cys1和Cys2間隔了3個胺基酸，當使用2.0當量的TCEP作為還原劑並利用上述反應參數進行偶聯，其偶聯產物中的DAR=2組分含量為84.3%，偶聯產物的平均DAR值為2.12；又例如，PR006320中的連接肽的Cys1和Cys2間隔了10個胺基酸，當使用3.0當量的TCEP作為還原劑並利用上述反應參數進行偶聯，其偶聯產物中的DAR=2組分含量為94.8%，偶聯產物的平均DAR值為1.99。
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本實施例說明瞭，當連接肽的Cys1和Cys2之間相隔至少3個其他胺基酸時，Cys1能夠形成重鏈間二硫鍵(即第一連接肽的Cys1和第二連接肽的Cys1之間形成二硫鍵，此二硫鍵稱為“Cys1-Cys1”)，而且Cys2也能夠形成重鏈間二硫鍵(即第一連接肽的Cys2和第二連接肽的Cys2之間形成二硫鍵，此二硫鍵稱為“Cys2-Cys2”)。但是，二硫鍵Cys1-Cys1的穩定性可能弱於其他二硫鍵。在一些反應條件組合下，二硫鍵Cys1-Cys1可以被有效地打開而其他二硫鍵(例如，Cys2-Cys2)保持完整，使得Cys1成為幾乎唯一的游離半胱胺酸殘基，進而作為特異性的偶聯位點。使用含該連接肽的抗原結合蛋白產生的蛋白-藥物偶聯物，其偶聯位點在Cys1且CAR(或DAR)約為2。
實施例12位於小鼠IgG2c鉸鏈區的偶聯和分析
本實施例研究了利用小鼠IgG2c抗體重鏈鉸鏈區(SEQ ID NO：147)與mc-vc-PAB-MMAE經由半胱胺酸偶聯來製備抗體偶聯藥物。小鼠IgG2c的鉸鏈區具有三個半胱胺酸，第一半胱胺酸(Cys1)和第二半胱胺酸(Cys2)之間間隔了5個其他胺基酸殘基。
在HCAb PR004433(SEQ ID NO：70)的基礎上，將其人IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO：73)部分替換成小鼠IgG2c抗體鉸鏈區序列(SEQ ID NO：147)；即，將PR004433的VH(SEQ ID NO：62)與小鼠IgG2c抗體鉸鏈區(SEQ ID NO：147)以及人IgG1重鏈恆定區CH2和CH3序列進行融合表達，得到新的HCAb分子PR006468(SEQ ID NO：148)。
實施例12.1 PR006468的偶聯和分析
將PR006468按照實施例1.6中該方法進行表達純化，並利用實施例2.1中該SEC-HPLC方法分析純度。然後，進一步利用實施例10中該偶聯方法對純化的PR006468重組蛋白進行偶聯反應。
在本實驗中，PR006468的濃度為1.75mg/ml，反應緩衝液為含20mM His-HCl pH 6.0緩衝液，還原劑TCEP的用量為7.0倍莫耳當量，還原反應於37℃ 2小時，偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的用量為7.0莫耳當量，偶聯反應於室溫0.5小時。偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物，並用實施例4.2該方法純化偶聯產物PR006468-ADC。
利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)對PR006468-ADC的純化後樣品進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖47顯示了PR006468-ADC的非還原分子量分析的質譜反褶積處理圖譜。按照實施例5.2中該分子量分析方法過程推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量。表12-1顯示了在PR006468-ADC的非還原樣品中，DAR=2的組分是主要成分(占95.5%)，並推算出PR006468-ADC產物的平均DAR值為2.09。
Figure 110145684-A0101-12-0144-76
 [*1]可能存在O糖基化(+947Da)；[*2]mc-vc-PAB-MMAE可能發生部分斷裂(-762Da)。
實施例12.2用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用實施例8.3中該方法來分析PR006468-ADC的偶聯位點。
圖48顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR006468-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的3條肽段，以及相應的偶聯位點覆蓋率。分析所有含有Cys位點並發生偶聯修飾的肽段，每一條肽段對應的二級譜圖也經過逐一核對，以證實其發生的偶聯修飾均為高度可信的。例如，含有C(+1315.78)PPLK的肽段占比90.8%(圖71顯示了該肽段的二級譜圖)，這說明，90.8%的小鼠鉸鏈區Cys1位點被偶聯有化合物。類似地，僅有5.8%的Cys2位點發生偶聯。
因而，小鼠IgG2c鉸鏈區序列也可以用於本發明所述的位點特異的半胱胺酸偶聯。
實施例12.3結合BCMA高表達細胞
本實施例利用實施例7.4中該方法研究抗原結合蛋白PR006468(包含小鼠IgG2c鉸鏈區)、PR004433(包含人IgG1鉸鏈區)及其偶聯產物PR006468-ADC和PR004433-ADC與高表達人BCMA的腫瘤細胞NCI-H929(ATCC,CRL-9068)的結合能力。
圖49中所示，PR006468和PR004433有相似的結合能力，相應地，PR006468-ADC和PR004433-ADC也有相似的結合能力。這說明瞭，將抗原結合蛋白中的人IgG1鉸鏈區序列替換成小鼠IgG2c鉸鏈區序列，不會影響抗原結合蛋白及其偶聯產物的靶點結合能力。
實施例12.4細胞毒性殺傷實驗
本實施例利用實施例9.5中該方法研究抗原結合蛋白PR006468(包含小鼠IgG2c鉸鏈區)、PR004433(包含人IgG1鉸鏈區)及其偶聯產物PR006468-ADC和PR004433-ADC對高表達人BCMA的腫瘤細胞NCI-H929(ATCC,CRL-9068)的特異性細胞殺傷活性。
圖50中所示，PR006468-ADC和PR004433-ADC都對NCI-H929產生有效的特異性的細胞毒性殺傷，且呈現抗體濃度依賴性，而其他分子不能對細胞產生有效的殺傷；且PR006468-ADC和PR004433-ADC的靶細胞殺傷效力幾乎一致。這也說明瞭，具有小鼠IgG2c鉸鏈區序列的偶聯產物也能保留原有的功能。
實施例13 scFv-Fc PR002129的偶聯和分析
本實施例研究了抗ROR1的抗原結合蛋白PR002129(SEQ ID NO：71)與mc-vc-PAB-MMAE利用半胱胺酸偶聯到Cys-220位點來製備具有均一DAR值的抗體偶聯藥物。PR002129的序列來源於實施例1.5，其含有人IgG1鉸鏈區序列。
實施例13.1 偶聯反應條件優化
以實施例5.1所得到的初步確定的偶聯反應條件為基礎，並結合實施例10.1所得到的較優的反應條件參數，對該抗原結合蛋白進行偶聯。如表13-1所示，平行多組條件對純化的scFv-Fc PR002129重組蛋白進行偶聯。每組實驗的偶聯的產物用實施例2.2該HIC-HPLC分析方法分析其偶聯產物的組分，尤其是DAR=2的組分含量(’D2%’)。偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物；並可選地，使用實施例4.2該方法純化偶聯產物，得到DAR=2的主要產物。其中，實驗#20210202-2使用的反應條件為：反應緩衝液為含20mM His- HCl pH 6.0緩衝液，還原劑TCEP的用量為2.3倍莫耳當量，還原反應於室溫2小時，偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的用量為7.0莫耳當量，偶聯反應於室溫0.5小時。
Figure 110145684-A0101-12-0147-77
實施例13.2 偶聯產物分析
本實施例利用高效液相色譜和質譜等技術對純化的重組PR002129和其偶聯產物PR002129-ADC(包括偶聯後產物和經過一步HIC純化後的產物)進行定量分析，以確定其偶聯產物組分的構成。
利用實施例2.2中該HIC-HPLC方法對上述樣品進行分析。圖51和下表分別顯示了PR002129的偶聯產物PR002129-ADC的HIC-HPLC分析結果：(A)偶聯後，純化前(表13-2)；(B)偶聯及一步HIC純化後(表13-3)。偶聯產物PR002129-ADC在HIC純化前，其DAR=2的組分占比73.2%，推算出的平均DAR值為2.07；經過一步HIC純化後，其97.9%的組分是DAR=2。
Figure 110145684-A0101-12-0148-78
Figure 110145684-A0101-12-0148-79
利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)對PR002129-ADC的純化前和純化後樣品進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖52顯示了分子量分析的質譜反褶積處理圖譜：(A)HIC純化前樣品的非還原分子量；(B)HIC純化後樣品的還原分子量；(C)HIC純化後樣品的非還原分子量。按照實施例5.2中該分子量分析方法過程推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量(下表)。表13-4顯示了在HIC純化前的PR002129-ADC的非還原樣品中，DAR=2的組分占比74.1%，推算出的平均DAR值為2.03。表13-5顯示了在純化後的PR002129-ADC的非還原樣品中，DAR=2的組分是主要成分；相應地，如表13-6所示，在其還原樣品中，偶聯有1個化合物的重鏈(+1D)是主要成分(占88%)，推算出PR002129-ADC產物的平均DAR值為1.9。
Figure 110145684-A0101-12-0149-80
Figure 110145684-A0101-12-0149-81
Figure 110145684-A0101-12-0149-82
Figure 110145684-A0101-12-0150-83
綜合以上多種分析手段的結果，可以推論出：利用半胱胺酸偶聯，偶聯產物中主要成分是DAR=2的組分，經過進一步HIC純化，可以得到純度約為90%的DAR=2高均質性的產物。
實施例13.3 用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用實施例8.3中該方法來分析PR002129-ADC的偶聯位點。
圖53顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR002129-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的3條肽段，以及相應的偶聯位點覆蓋率。分析所有含有Cys位點並發生偶聯修飾的肽段，每一條肽段對應的二級譜圖也經過逐一核對，以證實其發生的偶聯修飾均為高度可信的。例如，含有SC(+1315.78)DK的肽段占比88%，這說明，88%的Cys-220位點被偶聯有化合物。
實施例13.4 結合ROR1高表達細胞
本實施例是為了研究抗原結合蛋白PR002129及其偶聯產物PR002129-ADC結合高表達ROR1的細胞的活性。
利用流式細胞術FACS測試抗原結合蛋白與高表達人ROR1的腫瘤細胞PanC-1(ATCC,CRL-1469)的結合能力。具體地，消化細胞並用DMEM完全培養基重新懸浮，調整細胞密度為1×106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測結合蛋白。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，加入100 μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100μL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific,Jackson ImmunoResearch Inc.,#109-545-098,1：500稀釋)，4℃，避光孵育30分鐘。用100μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10(FlowJo,LLC)處理和分析資料。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，經由四參數非線性擬合，得到抗體對靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖54中所示，PR002129及其偶聯產物PR002129-ADC都與PanC-1細胞有很強的特異性結合活性，且結合能力相當。
實施例14 SIRPa-Fc融合蛋白的偶聯和分析
本實施例將本發明申請的藥物偶聯方法應用到非抗體類的融合蛋白上，利用該連接肽的第一個Cys(例如，人IgG1鉸鏈區的Cys-220)對融合蛋白進行位點特異性的偶聯。這是一種全新的嘗試，將藥物偶聯不局限於抗體，而是擴展到任意融合蛋白，只需要其含有該連接肽的結構；這說明瞭本發明申請的藥物偶聯方法具有通用性。
ALX148是人SIRPa的高親和力變體融合蛋白(Kauder SE等人，PLoS ONE(2018)13(8)：e0201832)，其序列公開於專利US10829771B2。與人SIRPa野生型序列相比，ALX148與CD47親和力提高了約3000倍。
本實施例將ALX148中SIRPa變體部分序列與含有人IgG1鉸鏈區和Fc的序列(SEQ ID NO：72)進行融合表達，得到SIRPa-Fc融合蛋白PR006345(SEQ ID NO：149)。隨後對PR006345進行偶聯和分析。
實施例14.1 偶聯反應條件優化
本實施例利用實施例10中該偶聯方法對SIRPa-Fc融合蛋白PR006345進行偶聯反應，在實施例10.1所得到的較優的反應條件參數的基礎上，經由改變還原劑TCEP的用量，來產生不同的偶聯反應產物。在本實驗中，PR006345的濃度為4.1mg/ml，反應緩衝液為含20mM His-HCl pH 6.0緩衝液，還原劑TCEP的用量從1.5到3.0倍莫耳當量變化，還原反應於室溫2小時，偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的用量為7.0莫耳倍數，偶聯反應於室溫0.5小時；其偶聯產物不經過HIC純化步驟。進一步地，偶聯產物也利用實施例10.1所使用的分子量分析方法來推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量，分析結果列於表14-1。
Figure 110145684-A0101-12-0152-84
實驗#2產生的偶聯產物利用LC-MS分子量分析方法測定出DAR=2組分含量為89%，偶聯產物的平均DAR值為2.23。
實施例14.2偶聯產物分析
本實施例利用高效液相色譜和質譜等技術對SIRPa-Fc融合蛋白PR006345和實驗#2產生的偶聯產物PR006345-ADC(不經過HIC純化)進行分析，以確定其偶聯產物組分的構成。
利用實施例2.2中該HIC-HPLC方法對上述樣品進行分析。圖54和表14-2顯示了未純化的偶聯產物PR006345-ADC的HIC-HPLC分析結果；其DAR=2的組分占比75.4%，推算出的平均DAR值為1.83。
利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)對未純化的偶聯產物PR006345-ADC進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖56顯示了分子量分析的質譜反褶積處理圖譜。按照實施例5.2中該分子量分析方法過程推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量(表14-3)；其DAR=2的組分占比89%，推算出的平均DAR值為2.23。
Figure 110145684-A0101-12-0153-85
Figure 110145684-A0101-12-0154-86
綜合以上多種分析手段的結果，可以推論出：利用半胱胺酸偶聯，SIRPa-Fc融合蛋白的偶聯產物中主要成分是DAR=2的組分。
實施例14.3用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用實施例8.3中該方法來分析PR006345-ADC的偶聯位點。
圖57顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR006345-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的3條肽段，以及相應的偶聯位點覆蓋率。分析所有含有Cys位點並發生偶聯修飾的肽段，每一條肽段對應的二級譜圖也經過逐一核對，以證實其發生的偶聯修飾均為高度可信的。例如，含有SC(+1315.78)DK的肽段占比92.45%，這說明，92.45%的Cys-220位點被偶聯有化合物。
實施例14.4 結合CD47高表達細胞
本實施例是為了研究SIRPa-Fc融合蛋白PR006345及其偶聯產物PR006345-ADC結合高表達CD47的細胞的活性。
利用流式細胞術FACS測試抗原結合蛋白與高表達人CD47的CHOK1-hCD47細胞(GenScript,M00581)的結合能力。具體地，消化細胞並用DMEM完全培養基重新懸浮，調整細胞密度為1×106細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測結合蛋白。將細胞放置於4℃，避光孵育1小時。之後，加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100μL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific,Jackson ImmunoResearch Inc.,#109-545-098,1：500稀釋)，4℃，避光孵育30分鐘。用100μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10(FlowJo,LLC)處理和分析資料。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，經由四參數非線性擬合，得到抗體對靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖58中所示，PR006345及其偶聯產物PR006345-ADC都與CD47有很強的特異性結合活性，且結合能力相當。
實施例15雙特異性抗原結合蛋白PR005744的偶聯和分析
本實施例利用抗原結合片段VH和抗原結合片段Fab構建了具有如圖59所示的四價雙特異性Fab-HCAb結構，並將本申請的藥物偶聯方法應用到該結構 上，利用該連接肽的第一個Cys(例如，人IgG1鉸鏈區的Cys-220)對其進行位點特異性的偶聯。
該結構屬於如圖42(B)所示的雙特異性對稱結構，其中一種抗原結合片段是Fab，而另一種抗原結合片段是VH。該結構雖然有兩條不同的多肽鏈(稱為短鏈和長鏈)，但是短鏈並不與長鏈的連接肽上的第一個Cys(Cys-220)形成二硫鍵；因而在一些反應條件組合下，該Cys的二硫鍵可以被有效地打開而其他二硫鍵保持完整，使得該Cys可以作為定點偶聯位元點。
實施例15.1 PR005744的構建和製備
本實施例利用抗BCMA的HCAb PR004433的VH序列(SEQ ID NO：62)和抗BCMA的IgG抗體PR000892的VH(SEQ ID NO：130)和VL序列(SEQ ID NO：131)構建如圖59所示的具有四價Fab-HCAb結構的雙特異性(雙結合表位)的抗原結合蛋白PR005744。其中，PR000892的序列公開於發明專利CN111234020B。PR004433、PR000892和PR005744的序列編號列於表15-1和表15-2。
Figure 110145684-A0101-12-0156-87
Figure 110145684-A0101-12-0156-88
抗原結合蛋白PR005744利用實施例1.6中該方法進行製備。隨後，測試其結合BCMA的能力和其在BCMA高表達細胞NCI-H929(ATCC,CRL-9068)上內化的能力。
實施例15.2 PR005744的內化作用
本實施例是為了研究靶向BCMA的抗原結合蛋白內化介導對表達人BCMA的細胞的殺傷。具體地，將NCI-H929(ATCC,CRL-9068)細胞以2×105個/孔接種至96-孔板(Beyotime,# FT018)；隨後加入用FACS緩衝液稀釋的200nM待測抗原結合蛋白；然後置於4℃孵育1小時；接著，取樣品於37℃分別孵育不同時間(如30分鐘、1小時、2小時和4小時)；然後，離心並重新懸浮細胞，加入螢光二抗(Jackson ImmunoResearch Inc.,#109-545-098)後再於4℃孵育30分鐘。最後，使用流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10(FlowJo,LLC)處理和分析資料。以37℃孵育0分鐘(T0)時的螢光信號MFI為基線，不同孵育時間的樣品的MFI與T0的基線進行扣減並計算相對減少量，以此反映抗原結合蛋白的內化作用的效率。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析。
圖60中所示，雙特異性抗原結合蛋白PR005744顯示很強的內化作用，其在30分鐘內可以使超過60%的BCMA被內化。
實施例15.3 PR005744的偶聯產物分析
進一步地，利用實施例9.1或實施例10.1中該方法對PR005744進行偶聯。在本實驗中，反應緩衝液為20mM His-HCl pH 6.0；還原劑為TCEP，其莫耳當量可變；還原反應於室溫2小時，偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的用量為7.0莫耳倍數，偶聯反應於室溫0.5小時。對於每組實驗，其偶聯產物利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)進行非還原樣 品去糖處理的完整分子量分析，並利用每個樣品的質譜圖中的總離子流圖或反褶積圖來推算出偶聯了不同數目的化合物的組分的分子量及其在樣品中的含量；分析結果列於表15-3。例如，當使用該反應條件參數的組合(反應緩衝液為含20mM His-HCl的pH 6.0緩衝液，還原劑TCEP用量為3.5莫耳倍數，還原反應於室溫2小時，偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的用量為7.0莫耳倍數，偶聯反應於室溫0.5小時)時，其偶聯產物中約84%的組分是偶聯有2個藥物偶聯物的(即DAR=2，D2%)。
Figure 110145684-A0101-12-0158-89
實施例15.4 用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用實施例8.3中該方法來分析PR005744-ADC的偶聯位點。
圖61顯示了利用LC-MS肽譜圖分析PR005744-ADC的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的3條肽段，以及相應的偶聯位點覆蓋率。分析所有含有Cys位點並發生偶聯修飾的肽段，每一條肽段對應的二級譜圖也經過逐一核對，以證實其發生的偶聯修飾均為高度可信的。例如，含有SC(+1315.78)DK的肽段占比99.07%，這說明，幾乎所有的Cys-220位點被偶聯 有化合物。這證實了藥物偶聯特異地發生於PR005744中連接肽的第一個Cys(即Cys-220)。
實施例15.5 結合BCMA高表達細胞
本實施例利用實施例7.4中該方法研究PR005744及其偶聯產物PR005744-ADC與高表達人BCMA的腫瘤細胞NCI-H929(ATCC,CRL-9068)的結合能力。
圖62中所示，PR005744及其偶聯產物PR005744-ADC都能夠與NCI-H929細胞特異性地結合，且結合能力相當。
實施例15.6細胞毒性殺傷實驗
本實施例利用實施例9.5中該方法研究PR005744及其偶聯產物PR005744-ADC對高表達人BCMA的腫瘤細胞NCI-H929(ATCC,CRL-9068)的特異性細胞殺傷活性。
圖63中所示，PR005744-ADC對NCI-H929產生有效的特異性的細胞毒性殺傷，且呈現濃度依賴性，而PR005744不能對細胞產生有效的殺傷。
實施例16 HCAb PR004433-PROTAC的偶聯和分析
本實施例研究了抗BCMA的HCAb抗體PR004433(SEQ ID NO：70)與蛋白降解靶向嵌合體(PROTAC)利用半胱胺酸偶聯到Cys-220位點來製備抗體偶聯藥物。
PROTAC是一類能夠經由誘導靶蛋白的多聚泛素化而導致靶蛋白降解的化合物。PROTAC的作用機理與傳統的細胞毒性小分子化合物如MMAE有很大的不同，分子結構也更為複雜。目前，PROTAC雖然對不少靶點有較好的藥效，但是其組織選擇性卻比較有限，而且難以區分不同的細胞類型。有文獻報導，將PROTAC偶聯到結合HER2的抗體上，可以增強PROTAC的選 擇性，使其只能降解HER2陽性的腫瘤細胞中的靶點(Maneiro MA等人，ACS Chem Biol.2020；15(6)：1306-1312.)。
本實施例使用的PROTAC是一種BRD4蛋白降解劑(結構如圖64所示)，其包含靶向BET的PROTAC GNE-987和含二硫化物的連接子。將該PROTAC作為藥物偶聯物，利用本發明申請的藥物偶聯方法對HCAb抗體PR004433進行位點特異性的偶聯。這是一種全新的嘗試，將藥物偶聯物不局限於傳統的細胞毒性化合物如MMAE，而是擴展到其他載荷藥物類型；這說明瞭本發明申請的藥物偶聯方法具有通用性。
實施例16.1 PROTAC的偶聯反應和分析
本實施例利用實施例10中該偶聯方法及進一步改變的條件對HCAb PR004433進行偶聯反應，藥物偶聯物為一種BRD4蛋白降解劑化合物(結構見圖64，分子量1306.58Da；生產商：MedChemExpress，貨號：HY-129938)，該化合物在本實施例中簡稱為PROTAC。在偶聯實驗中，PR004433的濃度為5.0mg/ml，反應緩衝液為含20mM His-HCl pH 6.0緩衝液，還原劑TCEP的用量為3.0莫耳當量，還原反應於室溫2小時；還原反應後用30kd超濾管將產物置換到含50mM Tris-HCl的pH 8.0緩衝液中；偶聯物PROTAC的用量為10.0到15.0莫耳當量，偶聯反應於室溫2小時；其偶聯產物(PR004433-PROTAC)不經過HIC純化步驟。
在偶聯反應時，該PROTAC分子的甲碸基(Methylsulfonyl，CH3SO2)斷裂，暴露出反應性巰基，進而與抗體上的反應性巰基形成二硫鍵。因此，每一個PROTAC偶聯到抗體上使得總分子量增加1226Da。
進一步地，利用實施例2.4中該方法(LC儀器：Agilent 1290 UPLC；MS儀器：AB Sceix X500B)對偶聯產物PR004433-PROTAC進行分子量分析。在進行LC-MS分析之前，待測樣品經過去糖處理。圖65顯示了PR004433-PROTAC的非還原分子量分析的質譜反褶積處理圖譜，並據此推算出偶聯了不同數目的PROTAC的組分的分子量及其在樣品中的含量。表16-1顯示了在PR004433-PROTAC的非還原樣品中，DAR=2的組分是主要成分(占66.4%)，並推算出偶聯產物的平均DAR值為1.6。
Figure 110145684-A0101-12-0161-90
實施例16.2 結合BCMA高表達細胞
本實施例利用實施例7.4中該方法研究HCAb PR004433及其偶聯產物PR004433-PROTAC與高表達人BCMA的腫瘤細胞NCI-H929(ATCC,CRL-9068)的結合能力。
圖66中所示，PR004433及其偶聯產物PR004433-PROTAC都能夠與NCI-H929細胞特異性地結合。
實施例17 雙特異性抗原結合蛋白2129/4433的偶聯和分析
本實施例利用抗BCMA的HCAb PR004433的VH序列(SEQ ID NO：62)和抗ROR1的抗體PR002129的scFv序列(具有如SEQ ID NO：60所示的VH和SEQ ID NO：63所示的VL)構建如圖67所示的具有非對稱結構的二價雙特異性的抗原結合蛋白2129/4433。並將本發明申請的藥物偶聯方法應用到該結構上，利用該連接肽的第一個Cys(例如，人IgG1鉸鏈區的Cys-220)對其進行位點特異性的偶聯。
該結構屬於如圖42(A)所示的結構，但是其第一抗原結合片段和第二抗原結合片段具有不同的結構和胺基酸序列，該第一抗原結合片段是VH結構，該第二抗原結合片段是scFv結構，因而它是含有兩條不同多肽鏈的非對稱結構。第一多肽鏈含有第一連接肽(包含人IgG1鉸鏈區序列)，第二多肽鏈含有第二連接肽(包含人IgG1鉸鏈區序列)。第一連接肽上的第一個Cys(Cys-220)和第二連接肽上的第一個Cys(Cys-220)形成二硫鍵；因而在一些反應條件組合下，Cys-220的二硫鍵可以被有效地打開而其他二硫鍵保持完整，使得該Cys可以作為定點偶聯位元點。
實施例17.1 2129/4433的構建和製備
將編碼PR004433多肽鏈(SEQ ID NO：70)的質粒和編碼PR002129多肽鏈(SEQ ID NO：71)的質粒共轉染並按照實施例1.6中該方法進行表達和一步親和純化，其產物中有PR004433的同源二聚體(4433/4433)和PR002129的同源二聚體(2129/2129)以及PR004433和PR002129的各一條鏈形成的異源二聚體(2129/4433，圖67)。其中，異源二聚體蛋白2129/4433是本實驗的目的蛋白。由於這三個組分(4433/4433，2129/2129，2129/4433)有不同的分子量和不同的等電 點(表17-1)，因而可以利用離子交換層析或者分子尺寸排阻層析等方法對產物做進一步的分離，以得到純化的異源二聚體目的蛋白2129/4433。
進一步地，利用實施例3.2中該LC-MS分子量分析方法確認了異源二聚體蛋白2129/4433中2129-鏈和4433-鏈上的Cys-220之間形成了重鏈間二硫鍵。
Figure 110145684-A0101-12-0163-91
實施例17.2 2129/4433的偶聯產物分析
利用實施例10.1中該方法對純化的異源二聚體蛋白2129/4433進行偶聯。在本實驗中，2129/4433的濃度為3.2mg/ml，反應緩衝液為含20mM His-HCl pH 6.0緩衝液，還原劑TCEP的用量為2.1~2.5莫耳當量，還原反應於室溫2小時，偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的用量為7.0莫耳當量，偶聯反應於室溫0.5小時。偶聯結束之後，經由脫鹽管柱將產物去除多餘藥物偶聯物，得到偶聯產物2129/4433-ADC。可選地，進一步用實施例4.2該HIC方法純化偶聯產物。
然後，利用實施例2.2中該HIC-HPLC方法對未經HIC純化的2129/4433-ADC樣品進行分析。圖68和表17-2顯示了2129/4433-ADC純化前樣 品的HIC-HPLC分析結果：在HIC純化前，其DAR=2的組分占比68.7%，推算出的平均DAR值為2.26。
Figure 110145684-A0101-12-0164-92
實施例17.3 用LC-MS肽圖分析化合物偶聯位點
本實施例利用實施例8.3中該方法來分析2129/4433-ADC的偶聯位點。
圖69顯示了利用LC-MS肽譜圖分析2129/4433-ADC經HIC純化後樣品(DAR=2的組分占比100%)的化合物偶聯位點，包括篩選出的帶有偶聯位點的3條肽段，以及相應的偶聯位點覆蓋率。分析所有含有Cys位點並發生偶聯修飾的肽段，每一條肽段對應的二級譜圖也經過逐一核對，以證實其發生的偶聯修飾均為高度可信的。例如，含有SC(+1315.78)DK的肽段占比99.6%(圖72顯示了該肽段的二級譜圖)；這說明，幾乎所有的Cys-220位點被偶聯有化合物。
實施例18偶聯免疫調節激動劑分子
Toll樣受體9(TLR9)是廣泛表達於樹突狀細胞和巨噬細胞等免疫細胞中的重要受體分子，在人體先天免疫中發揮重要作用。CpG寡核苷酸是TLR9的天然的激動型配體，TLR9結合CpG後可以啟動免疫細胞。本實施例將CpG寡核苷酸 經由含馬來醯亞胺基團或巰基的連接子利用半胱胺酸偶聯到前述實施例中的抗原結合蛋白上得到偶聯產物。例如，抗5T4的HCAb PR004432與含3’-端巰基修飾的CpG寡核苷酸CpG-1826(序列5'-tccatgacgttcctgacgtt-3')利用本發明該方法偶聯到該連接肽的Cys1位點(例如，Cys-220)來製備偶聯藥物PR004432-CpG；抗ROR1的結合蛋白PR002129與CpG偶聯到Cys-220位點來製備偶聯藥物PR002129-CpG；SIRPa-Fc融合蛋白PR006345與CpG偶聯到Cys-220位點來製備偶聯藥物PR006345-CpG。這些CpG偶聯藥物特異地識別腫瘤上的抗原靶點，利用腫瘤微環境內的免疫細胞上Fc受體介導內化並經由CpG啟動TLR9，進一步啟動免疫細胞，利用多種機制提高抗腫瘤效果。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方案的範圍內。

Claims (73)

  1. 一種蛋白-藥物偶聯物，其包含抗原結合蛋白部分和藥物偶聯物部分；該抗原結合蛋白部分包括一個或多個抗原結合片段，以及與該抗原結合片段直接或間接連接的至少兩個連接肽；該至少兩個連接肽包括第一連接肽和第二連接肽；其中該第一連接肽包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2，該藥物偶聯物部分經由該Cys1偶聯至該第一連接肽；且該第二連接肽包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2，該藥物偶聯物部分經由該Cys1偶聯至該第二連接肽。
  2. 如請求項1所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一連接肽的該Cys2與該第二連接肽的該Cys2之間經由二硫鍵連接。
  3. 如請求項1或2所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段中不包含能夠影響藥物偶聯物與該第一連接肽和/或該第二連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物，該影響表現為顯著降低藥物偶聯物在Cys1位點的偶聯機率。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的半胱胺酸或者前述半胱胺酸與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一連接肽與該第二連接肽相同或不同。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一連接肽的該Cys1和該Cys2之間相隔至少3個除半胱胺酸以外的任意胺基酸，和/或該第二連接肽的該Cys1和該Cys2之間相隔至少3個除半胱胺酸以外的任意胺基酸。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一連接肽和/或該第二連接肽自N端至C端包含Cys1-(X)n-Cys2所示的胺基酸序列；其中，n為大於或等於3的整數，X是除半胱胺酸以外的任意胺基酸。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一連接肽和/或該第二連接肽源自抗體鉸鏈區序列或其衍生序列。
  10. 如請求項9所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該抗體鉸鏈區為IgG鉸鏈區。
  11. 如請求項9或10所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該抗體鉸鏈區為人IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO：73)或者小鼠IgG2c鉸鏈區(SEQ ID NO：147)。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該Cys1為人IgG1鉸鏈區如EU編碼的Cys-220，或與之對應的半胱胺酸，或者該Cys1為小鼠IgG2c鉸鏈區的第一個半胱胺酸。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一連接肽和該第二連接肽的序列各自獨立地如SEQ ID NOs：73-105、145-147中任一項所示的胺基酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該多個抗原結合片段連接於同一該連接肽或分別連接於不同的該連接肽。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該多個抗原結合片段可以部分或全部相同或彼此均不同。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該多個抗原結合片段包括第一抗原結合片段和第二抗原結合片段。
  17. 如請求項1至16中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該多個抗原結合片段進一步包含第三抗原結合片段和/或第四抗原結合片段。
  18. 如請求項1至17中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段可以各自獨立地為VHH結構域、VH、VL、Fab、ScFv、受體蛋白可溶性胞外區、配體蛋白、脂質運載蛋白lipocalins、神經細胞黏附分子NCAM、纖維結合蛋白fibronectin和/或錨蛋白重複片段蛋白DARPins。
  19. 如請求項1至18中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段能夠特異性結合腫瘤抗原或非腫瘤抗原。
  20. 如請求項19所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該腫瘤抗原包括CD19、BCMA、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、Tn Ag、FLT3、CD38、CD123、CD44v6、B7H3、B7H4、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PSMA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-beta、SSEA-4、MUC1、EGFR、NCAM、CAIX、LMP2、EphA2、岩藻糖基GM1(fucosyl GM1)、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、GD2、FOLR1、FOLR2、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸(polysialic acid)、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TAARP、 WT1、ETV6-AML、SPA17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、FOSL1、hTERT、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、AR(雄激素受體)、細胞週期蛋白B1(Cyclin B1)、MYCN、RhoC、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD20、CD30、HER2、ROR1、FLT3、TAAG72、CD22、CD33、GD2、gp100Tn、FAP、酪胺酸酶(tyrosinase)、EPCAM、CEA、IGF-1R、EphB2、間皮素(mesothelin)、鈣黏蛋白17(Cadherin17)、CD32b、EGFRvIII、GPNMB、GPR64、HER3、LRP6、LYPD8、NKG2D、SLC34A2、SLC39A6、SLITRK6、GUCY2C、5T4和/或TACSTD2。
  21. 如請求項1至20中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段各自獨立地包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該抗原結合片段包含選自下述的任意一組胺基酸序列：(1)HCDR1：SEQ ID NO：7，HCDR2：SEQ ID NO：22，HCDR3：SEQ ID NO：38；(2)HCDR1：SEQ ID NO：10，HCDR2：SEQ ID NO：25，HCDR3：SEQ ID NO：41；(3)HCDR1：SEQ ID NO：11，HCDR2：SEQ ID NO：26，HCDR3：SEQ ID NO：42；(4)HCDR1：SEQ ID NO：13，HCDR2：SEQ ID NO：28，HCDR3：SEQ ID NO：44；(5)HCDR1：SEQ ID NO：14，HCDR2：SEQ ID NO：29，HCDR3：SEQ ID NO：42；(6)HCDR1：SEQ ID NO：9，HCDR2：SEQ ID NO：24，HCDR3：SEQ ID NO：40；和(7)HCDR1：SEQ ID NO：8，HCDR2：SEQ ID NO：23，HCDR3：SEQ ID NO：39。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段各自獨立地包含VH，且該VH包括SEQ ID NOs：55-59、61和62中任一項所示的胺基酸序列。
  23. 如請求項1至22中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段各自獨立地包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分別依次包含SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。
  24. 如請求項1至23中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該一個或多個抗原結合片段包含至少一對VH和VL，且該一對VH和VL分別包括SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列；或者該一個或多個抗原結合片段包含至少一對VH和VL和/或另一種VH，且該一對VH和VL分別包括SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：131所示的胺基酸序列，和該另一種VH包括SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
  25. 如請求項1至24中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其還包含與該連接肽直接或間接連接的配對單元部分，該配對單元包含至少第一配對亞單元和第二配對亞單元，且該第一配對亞單元可以經由共價鍵或者非共價鍵與該第二配對亞單元相互作用。
  26. 如請求項25所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該配對單元為抗體Fc片段或突變的Fc片段。
  27. 如請求項25或26所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該第一配對亞單元的N端與該第一連接肽的C端連接，且該第二配對亞單元的N端與該第 二連接肽的C端連接；或者，該第一配對亞單元的N端與該第二連接肽的C端連接，且該第二配對亞單元的N端與該第一連接肽的C端連接。
  28. 如請求項1至27中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其包含SEQ ID NOs：64-71、106-129、148和149中任一項所示的胺基酸序列，或SEQ ID NOs：134和135所示的胺基酸序列的組合。
  29. 如請求項1至28中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該藥物偶聯物部分包括分別與第一連接肽和第二連接肽連接的兩個藥物偶聯物，該藥物偶聯物包含載荷藥物以及視需要地連接子。
  30. 如請求項29所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該載荷藥物包含小分子化合物、寡核苷酸、蛋白降解靶向嵌合體(PROTAC)、親和配體、螢光標記基團、核素標記基團、毒素分子、抗生素分子、免疫調節劑和/或多肽等。
  31. 如請求項29或30所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該連接子包含可斷裂的連接子或非可斷裂的連接子。
  32. 如請求項29至31中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該可斷裂的連接子包含蛋白酶可切割的連接子。
  33. 如請求項1至32中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其中該藥物偶聯物包括mc-vc-PAB-MMAE和/或PROTAC。
  34. 如請求項1至33中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，其為抗體-藥物偶聯物。
  35. 一種製備如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物的方法，其包括使該藥物偶聯物與該第一連接肽和/或該第二連接肽上的該Cys1的反應性巰基進行共價結合。
  36. 一種製備蛋白-藥物偶聯物的方法，該蛋白-藥物偶聯物包含抗原結合蛋白部分和藥物偶聯物部分，該抗原結合蛋白部分包括一個或多個抗原結合片段，以及與該抗原結合片段直接或間接連接的至少兩個連接肽；該兩個連接肽包含第一連接肽和第二連接肽，其中該第一連接肽包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2，該第二連接肽包含第一半胱胺酸Cys1和第二半胱胺酸Cys2；該方法包括使該藥物偶聯物部分經由該第一連接肽的該Cys1與該第一連接肽聯結，和/或使該藥物偶聯物部分經由該第二連接肽的該Cys1與該第二連接肽聯結。
  37. 如請求項36所述的方法，其中該一個或多個抗原結合片段中不包含能夠影響藥物偶聯物與該第一連接肽和/或該第二連接肽在Cys1處進行偶聯的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物，該影響表現為顯著降低藥物偶聯物在Cys1位點的偶聯機率。
  38. 如請求項36或37所述的方法，其中該一個或多個抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的官能團或者前述官能團與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
  39. 如請求項36至38中任一項所述的方法，其中該一個或多個抗原結合片段不包含能夠與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1形成二硫鍵的半胱胺酸或者前述半胱胺酸與其他藥物偶聯物形成的綴合物。
  40. 如請求項36至39中任一項所述的方法，其中該第一連接肽和該第二連接肽相同或不同。
  41. 如請求項36至40中任一項所述的方法，其中該第一連接肽和/或該第二連接肽自N端至C端包含Cys1-(X)n-Cys2所示的胺基酸序列；其中，n為大於或等於3的整數，X是指除半胱胺酸以外的任意胺基酸。
  42. 如請求項36至41中任一項所述的方法，其中該第一連接肽和/或該第二連接肽源自抗體鉸鏈區序列或其衍生序列。
  43. 如請求項42所述的方法，其中該衍生序列為經由對抗體鉸鏈區序列進行改造獲得，該改造不涉及抗體鉸鏈區中Cys1和Cys2的改變。
  44. 如請求項43所述的方法，其中該改造為調整抗體鉸鏈區序列中Cys1和Cys2之間的胺基酸種類、數目和/或在Cys1前進行柔性連接胺基酸的添加。
  45. 如請求項42至44中任一項所述的方法，其中該抗體鉸鏈區為IgG鉸鏈區。
  46. 如請求項42至45中任一項所述的方法，其中該抗體鉸鏈區為人IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO：73)或者小鼠IgG2c鉸鏈區(SEQ ID NO：147)。
  47. 如請求項36至46中任一項所述的方法，其中該Cys1為人IgG1鉸鏈區如EU編碼的Cys-220，或與之對應的半胱胺酸，或者該Cys1為小鼠IgG2c鉸鏈區的第一個半胱胺酸。
  48. 如請求項36至47中任一項所述的方法，其中該第一連接肽和該第二連接肽的序列各自獨立地如SEQ ID NOs：73-105、145-147中任一項所示的胺基酸序列。
  49. 如請求項36至48中任一項所述的方法，其包括還原、偶聯以及視需要地純化步驟。
  50. 如請求項49所述的方法，其中該還原包括在還原劑的條件下使該抗原結合蛋白部分中該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽的該Cys1之間形成的二硫鍵被斷裂形成反應性巰基，而該第一連接肽的Cys2和該第二連接肽的Cys2之間形成的二硫鍵被保留。
  51. 如請求項49或50所述的方法，其中該還原包括使用還原劑DTT和/或TCEP；較佳地，該還原劑為TCEP。
  52. 如請求項50或51所述的方法，其中該還原劑的用量為1至50莫耳倍數；較佳地，該還原劑的用量為1至6莫耳倍數。
  53. 如請求項49至52中任一項所述的方法，其中該還原的反應時長為1至17小時；較佳地，該還原的反應時長為1.5至3小時；更佳地，該還原的反應時長為2小時。
  54. 如請求項49至53中任一項所述的方法，其中該還原的反應溫度為0至40℃；較佳地，該還原的反應溫度為0℃或室溫(25-30℃)或37℃；進一步較佳地，該還原的反應溫度為室溫(25-30℃)。
  55. 如請求項49至54中任一項所述的方法，其中該還原的反應緩衝液pH為5.0至8.0；較佳地，該還原的反應緩衝液pH為5.0至7.0；更佳地，該還原的反應緩衝液pH為5.0至6.0。
  56. 如請求項49至55中任一項所述的方法，其中該偶聯包括使該藥物偶聯物與該第一連接肽的該Cys1和/或該第二連接肽上的該Cys1的反應性巰基進行共價結合。
  57. 如請求項36至56中任一項所述的方法，其中該藥物偶聯物包括mc-vc-PAB-MMAE或PROTAC。
  58. 如請求項36至57中任一項所述的方法，其中該藥物偶聯物mc-vc-PAB-MMAE的用量為1至50莫耳倍數；較佳地，該藥物偶聯物的用量為3至18莫耳倍數；進一步優先地，該藥物偶聯物的用量為3至7莫耳倍數。
  59. 如請求項36至58中任一項所述的方法，其中該藥物偶聯物PROTAC的用量為10至15莫耳倍數。
  60. 如請求項36至49中任一項所述的方法，其中該偶聯的反應時長為0.5至10小時；較佳地，該偶聯的反應時長為0.5至3小時；更佳地，該偶聯的反應時長為0.5至2小時。
  61. 如請求項49至60中任一項所述的方法，其中該偶聯的反應溫度為0至40℃；優先地，該偶聯的反應溫度為室溫(25-30℃)。
  62. 如請求項49至61中任一項所述的方法，其中該偶聯的反應緩衝液pH為5.0至8.0；較佳地，該偶聯的反應緩衝液pH為5.0至7.0；更佳地，該偶聯的反應緩衝液pH為5.0至6.0。
  63. 如請求項36至62中任一項所述的方法，其中製備所得的蛋白-藥物偶聯物的純度大於80%。
  64. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物，以及藥學上可接受的載體。
  65. 一種預防和/或治療疾病的方法，其包括施用如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物和/或如請求項64所述的醫藥組成物，視需要地，該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物與其他療法或藥物聯用；該疾病為腫瘤或其他疾病。
  66. 一種如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物和/或如請求項64所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤或其他疾病。
  67. 一種如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物和/或如請求項64所述的醫藥組成物與其他療法或藥物聯用在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤或其他疾病。
  68. 如請求項78或80所述的用途，其中該其他療法或藥物選自下組：化療、放療、miRNA和寡核苷酸。
  69. 如請求項65至67中任一項所述的方法或用途，其中該腫瘤選自下組中的任意一種或多種：淋巴瘤、多發性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、間皮瘤、食管癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、胸腺癌和結直腸癌。
  70. 一種診斷特定疾病的方法，其包括使用如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物和/或如請求項64所述的醫藥組成物。
  71. 一種檢測特定靶標的方法，其包括使用如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物和/或如請求項64所述的醫藥組成物，較佳地，該檢測為非疾病診斷目的的。
  72. 一種檢測試劑盒，其包括如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物和/或如請求項64所述的醫藥組成物，和視需要地使用說明。
  73. 一種給藥裝置，其包括如請求項1至34中任一項所述的蛋白-藥物偶聯物和/或如請求項64所述的醫藥組成物，以及施用該蛋白-藥物偶聯物和/或該醫藥組成物的裝置。
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