TW202221118A - 複製壓力路徑劑組合物及治療癌症之方法 - Google Patents

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克里斯汀 哈西格
雷恩 漢森
斯內紮娜 米盧蒂諾維奇
傑森 克斯坦森
扎卡里 賀比
蘇希爾 喬德利
安東尼 賽勒斯提
克里斯頓 透納
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Abstract

本文提供治療受試者之癌症的方法，其中該癌症係染色體外DNA陽性(ecDNA陽性)或治療抗性，該方法包含將治療有效量之複製壓力(RS)路徑劑單獨或與靶向治療劑組合投與給該受試者。

Description

複製壓力路徑劑組合物及治療癌症之方法
癌症經常被證明對用於治療其之治療劑具有抗性，此使得延長癌症患者無惡化存活之努力受挫。在一些情形中，觀察到治療抗性癌症對於染色體外DNA (ecDNA)呈陽性，該ecDNA有時含有經擴增之致癌基因，此導致治療抗性。
在一態樣中，提供治療受試者之腫瘤或腫瘤細胞之方法。在一些實施例中，方法包含以足以誘導腫瘤或腫瘤細胞中之複製壓力之量投與複製壓力路徑劑(RSPA)；及投與癌症靶向治療劑，其中腫瘤或腫瘤細胞具有ecDNA印記，且其中腫瘤之生長或大小或腫瘤細胞之生長或數量減少。在一些實施例中，ecDNA印記選自由以下組成之群：基因擴增；p53功能缺失突變；缺乏微衛星不穩定性(MSI-H)；低度之PD-L1表現；低度之腫瘤發炎印記(TIS)；低度之腫瘤突變負荷(TMB)；等位基因取代、插入、或缺失(插入或缺失(indel))之頻率增加；及其任何組合。在一些實施例中，基因擴增包含致癌基因、抗藥性基因、治療靶標基因或檢查點抑制劑基因之擴增。在一些實施例中，癌症靶向治療劑針對靶標基因之蛋白質產物之活性，且其中利用癌症靶向治療劑及RSPA治療減少靶標基因在腫瘤或腫瘤細胞中之擴增或表現。在一些實施例中，癌症靶向治療劑係在RSPA之前投與。在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞在投與癌症靶向治療劑之後產生ecDNA印記。在一些實施例中，癌症靶向治療劑係與RSPA同時投與。在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞在治療前產生ecDNA印記。在一些實施例中，方法防止腫瘤或腫瘤細胞中ecDNA之增加。在一些實施例中，癌症靶向治療劑靶向致癌基因之蛋白質產物。在一些實施例中，致癌基因包含點突變、插入、缺失、融合或其組合。在一些實施例中，癌症靶向治療劑靶向選自由以下組成之群之基因：ABCB1、AKT、ALK、AR、BCL-2、BCR-ABL、BRAF、CDK4、CDK6、c-MET、EGFR、ER、ERBB3、ERRB2、AK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GR、HRAS、IGF1R、KIT、KRAS、MCL-1、MDM2、MDM4、MTOR、MYC、MYCL、MYCN、NRAS、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFR、PIK3Cδ、PIK3CA/B、RET及ROS1。在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞包含第一基因或其部分之擴增。在一些實施例中，第一基因係致癌基因或抗藥性基因。在一些實施例中，擴增存在於ecDNA上。在一些實施例中，第一基因選自由以下組成之群：ABCB1、AKT、ALK、AR、BCL-2、BCR-ABL、BRAF、CDK4、CDK6、c-MET、EGFR、ER、ERBB3、ERRB2、AK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GR、HRAS、IGF1R、KIT、KRAS、MCL-1、MDM2、MDM4、MTOR、MYC、MYCL、MYCN、NRAS、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFR、PIK3Cδ、PIK3CA/B、RET及ROS1。在一些實施例中，癌症靶向治療劑針對第一基因。在一些實施例中，受試者先前未利用該癌症靶向治療劑進行治療。在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞先前未利用該癌症靶向治療劑進行治療。在一些實施例中，方法防止腫瘤或腫瘤細胞中ecDNA之增加。在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞在利用癌症靶向治療劑及RSPA治療之前對先前治療劑有抗性或無反應性。在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞先前已利用先前治療劑進行治療。在一些實施例中，受試者先前已利用先前治療劑進行治療。在一些實施例中，癌症靶向治療劑針對靶標基因之蛋白質產物之活性，且其中利用癌症靶向治療劑及RSPA治療減少靶標基因在腫瘤或腫瘤細胞中之擴增或表現。在一些實施例中，靶標基因係致癌基因、抗藥性基因、治療靶標基因或檢查點抑制劑基因。在一些實施例中，靶標基因選自由以下組成之群：ABCB1、AKT、ALK、AR、BCL-2、BCR-ABL、BRAF、CDK4、CDK6、c-MET、EGFR、ER、ERBB3、ERRB2、AK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GR、HRAS、IGF1R、KIT、KRAS、MCL-1、MDM2、MDM4、MTOR、MYC、MYCL、MYCN、NRAS、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFR、PIK3Cδ、PIK3CA/B、RET及ROS1。在一些實施例中，ecDNA印記係在開始治療腫瘤或腫瘤細胞之前得知。在一些實施例中，ecDNA印記係在開始治療腫瘤或腫瘤細胞之後得知。在一些實施例中，與在不存在RSPA之情形下利用癌症靶向治療劑治療相比，方法改良客觀反應率及/或延長治療反應之持續時間。在一些實施例中，與在不存在RSPA之情形下利用癌症靶向治療劑治療相比，該方法延長無惡化存活期。
在另一態樣中，提供治療ecDNA相關腫瘤或腫瘤細胞之方法，其包含將RSPA及癌症靶向治療劑投與給鑑別為具有帶有ecDNA之腫瘤或腫瘤細胞之受試者，其中腫瘤之生長或大小或腫瘤細胞之生長或數量因治療而減小。在一些實施例中，受試者之腫瘤或腫瘤細胞鑑別為具有ecDNA印記。在一些實施例中，ecDNA印記選自由以下組成之群：基因擴增；p53功能缺失突變；缺乏微衛星不穩定性(MSI-H)；低度之PD-L1表現；低度之腫瘤發炎印記(TIS)；低度之腫瘤突變負荷(TMB)；等位基因取代、插入、或缺失(插入或缺失(indel))之頻率增加；及其任何組合。在一些實施例中，基因擴增包含致癌基因、抗藥性基因、治療靶標基因或檢查點抑制劑基因之擴增。在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞係藉由使細胞中之ecDNA成像、使用致癌基因結合劑檢測ecDNA或藉由DNA定序鑑別為具有ecDNA。在一些實施例中，在循環腫瘤DNA中鑑別出ecDNA。
在本文方法之各個態樣中，在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞係由實體腫瘤組成。在一些實施例中，實體腫瘤中存在之ecDNA因治療而減少或消失。在一些實施例中，與治療前ecDNA之含量相比，實體腫瘤中ecDNA之含量在治療後減少。在一些實施例中，與治療前實體腫瘤中致癌基因擴增之程度及/或複本數變異(CNV)之程度相比，實體腫瘤中致癌基因擴增之程度及/或CNV之程度在治療後減少。在一些實施例中，腫瘤或腫瘤細胞包括循環腫瘤細胞。在一些實施例中，循環腫瘤細胞中ecDNA之存在因治療而減少或消失。在一些實施例中，與治療前ecDNA之含量相比，循環腫瘤細胞中ecDNA之含量在治療後減少。在一些實施例中，與治療前循環腫瘤細胞中致癌基因擴增之程度及/或複本數變異(CNV)之程度相比，循環腫瘤細胞中致癌基因擴增之程度及/或CNV之程度在治療後減少。在一些實施例中，在循環腫瘤DNA中鑑別出ecDNA之存在或含量。在一些實施例中，RSPA選自由以下組成之群：RNR抑制劑、ATR抑制劑、CHK1抑制劑、WEE1抑制劑及PARG抑制劑。在一些實施例中，RNR抑制劑選自由以下組成之群：吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、曲阿平(triapine)、5-氯-2-(n-((1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基苯基)-1-(5-側氧基-4,5-二氫-1,3,4-噁二唑-2-基)丙基)胺磺醯基)苯甲醯胺、氯法拉濱(clofarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、莫特沙芬釓(motexafin gadolinium)、克拉屈濱(cladribine)、替紮他濱(tezacitabine)及COH29 (N-[4-(3,4-二羥基苯基)-5-苯基-1,3-噻唑-2-基]-3,4-二羥基苯甲醯胺)。在一些實施例中，CHK1抑制劑選自由以下組成之群：GDC-0575、普瑞色替(prexasertib)、LY-2880070、SRA737、XCCS-605B、雷布色替(rabusertib)(LY-2603618)、SCH-900776、RG-7602、AZD-7762、PF-477736及BEBT-260。在一些實施例中，WEE1抑制劑選自由以下組成之群：AZD1775 (MK1775)、ZN-c3、Debio 0123、IMP7068、SDR-7995、SDR-7778、NUV-569、PD0166285、PD0407824、SC-0191、DC-859/A、伯舒替尼(bosutinib)及Bos-I。在一些實施例中，ATR抑制劑選自由以下組成之群：RP-3500、M-6620、柏唑色替(berzosertib) (M-6620、VX-970；VE-822)、AZZ-6738、AZ-20、M-4344 (VX-803)、BAY-1895344、M-1774、IMP-9064、nLs-BG-129、SC-0245、BKT-300、ART-0380、ATRN-119、ATRN-212、NU-6027。在一些實施例中，癌症靶向治療劑選自由以下組成之群：阿貝西利(abemaciclib)、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine)、阿法替尼(afatinib)、阿雷替尼(alectinib)、ALRN-6924、AMG232、AMG-510、阿帕替尼(apatinib)、ARS-3248、AXL1717、貝伐珠單抗(bevacizumab)、硼替佐米(bortezomib)、布加替尼(brigatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡馬替尼(capmatinib)、色瑞替尼(ceritinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、CGM097、克唑替尼(crizotinib)、克唑替尼、達拉菲尼(dabrafenib)、達克替尼(dacomitinib)、達沙替尼(dasatinib)、多柔比星(doxorubicin)、DS-3032b、恩考芬尼(encorafenib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄達替尼(erdafitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、依維莫司(everolimus)、fam-曲妥珠單抗德魯替康(fam-trastuzumab deruxtecan)、芬妥木單抗(figitumumab)、吉非替尼(gefitinib)、棉子酚、HDM201、伊達那林(idasanutlin)、伊馬替尼(imatinib)、英菲格拉替尼(infigratinib)、伊尼帕利(iniparib)、拉帕替尼(lapatinib)、拉羅替尼(larotrectinib)、LEE011、樂伐替尼(lenvatinib)、LGX818、勞拉替尼(lorlatinib)、MEK162、MK-8242 (SCH-900242)、MRTX849、納維托克(navitoclax)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼羅替尼(nilotinib)、奧巴克拉(obatoclax)、奧拉帕尼(olaparib)、OSI-906、奧希替尼(osimertinib)、帕博西尼(palbociclib)、帕尼單抗(panitumumab)、PD-0332991、派瑞索菲(perisofine)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、PL225B、瑞波替尼(repotrectinib)、瑞博西尼(ribociclib)、RO5045337、沙利黴素(salinomycin)、沙利雷塞(salirasib)、SAR405838 (MI-77301)、索拉菲尼(sorafenib)、索托拉西(sotorasib)、舒尼替尼(sunitinib)、他莫昔芬(tamoxifen)、替西羅莫司(temsirolimus)、替吡法尼(tipifarnib)、替維替尼(tivantinib)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、妥卡替尼(tucatinib)、UPR1376、VAL-083、威羅菲尼(vemurafenib)、威羅菲尼、長春福肽(vintafolide)及佐帕他林(zoptarelin)。在一些實施例中，RSPA係RNR抑制劑且RSPA係以相對低於其作為單一藥劑推薦使用時之醫療劑量投與。在一些實施例中，RNR抑制劑係吉西他濱。在一些實施例中，RNR抑制劑不為吉西他濱或羥基脲。在一些實施例中，RSPA不為吉西他濱。在一些實施例中，當癌症靶向治療劑係EGFR抑制劑時，RSPA不為吉西他濱。
在一態樣中，提供治療有需要之受試者之癌症的方法。在一些情形中，方法包含：向受試者投與治療有效量之複製壓力(RS)路徑抑制劑(在本文中亦稱為複製壓力路徑劑或RSPA)，其中癌症已測定為染色體外DNA陽性(ecDNA陽性)。在一些情形中，RS路徑抑制劑包含RNR抑制劑、ATR抑制劑、CHK1抑制劑、E2F抑制劑、WEE1抑制劑、PARG抑制劑或RRM2抑制劑。在一些情形中，RNR抑制劑包含吉西他濱、羥基脲、曲阿平或5-氯-2-(n-((1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基苯基)-1-(5-側氧基-4,5-二氫-1,3,4-噁二唑-2-基)丙基)胺磺醯基)苯甲醯胺。在一些情形中，CHK1抑制劑包含GDC-0575、普瑞色替或SRA737。在一些情形中，ecDNA陽性癌症包含ecDNA上之經擴增致癌基因。在一些情形中，致癌基因包含BRAF、CCND1、CDK4、CDK6、c-Myc、EGFR、ERB2、FGFR、HRAS、IGF1R、KRAS、MDM2、MDM4、MET、MYCL、MYCN及NRAS中之一或多者。在一些情形中，方法進一步包含向受試者投與治療有效量之抑制經擴增致癌基因之蛋白質產物之靶向治療劑。在一些情形中，靶向治療劑包含阿貝西利、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛、阿法替尼、阿雷替尼、ALRN-6924、AMG232、AMG-510、阿帕替尼、ARS-3248、AXL1717、AZD-3759、貝伐珠單抗、硼替佐米、布加替尼、卡博替尼、卡馬替尼、色瑞替尼、西妥昔單抗、CGM097、克唑替尼、達拉菲尼、達克替尼、達沙替尼、DS-3032b、恩考芬尼、恩曲替尼、厄達替尼、厄洛替尼、依維莫司、fam-曲妥珠單抗德魯替康、芬妥木單抗、吉非替尼、棉子酚、HDM201、伊達那林、伊馬替尼、英菲格拉替尼、伊尼帕利、拉帕替尼、拉羅替尼、LEE011、樂伐替尼、LGX818、勞拉替尼、MEK162、MK-8242 SCH 900242、MRTX849、納維托克、奈昔木單抗、尼羅替尼、奧巴克拉、奧拉帕尼、OSI-906、奧希替尼、帕博西尼、帕尼單抗、PD-0332991、派瑞索菲、帕妥珠單抗、PL225B、瑞波替尼、瑞博西尼、RO5045337、沙利黴素、沙利雷塞、SAR405838 MI-77301、索拉菲尼、索托拉西、舒尼替尼、他莫昔芬、替西羅莫司、替吡法尼、替維替尼、托法替尼、曲美替尼、曲妥珠單抗、妥卡替尼、UPR1376、VAL-083、威羅菲尼、威羅菲尼、長春福肽或佐帕他林多柔比星。在一些情形中，RS路徑抑制劑及靶向治療劑係一起投與。在一些情形中，RS路徑抑制劑及靶向治療劑係分開投與。
在一態樣中，提供治療受試者之抗性癌症的方法。在一些情形中，方法包含向受試者投與治療有效量之(a) 複製壓力(RS)路徑抑制劑，及(b) 靶向治療劑。在一些情形中，RS路徑抑制劑包含RNR抑制劑、ATR抑制劑、CHK1抑制劑、WEE1抑制劑、E2F抑制劑或RRM2抑制劑。在一些情形中，RNR抑制劑包含吉西他濱、羥基脲、曲阿平或5-氯-2-(n-((1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基苯基)-1-(5-側氧基-4,5-二氫-1,3,4-噁二唑-2-基)丙基)胺磺醯基)苯甲醯胺。在一些情形中，CHK1抑制劑包含GDC-0575、普瑞色替或SRA737。在一些情形中，治療抗性癌症係ecDNA陽性。在一些情形中，ecDNA陽性癌症包含ecDNA上之經擴增致癌基因。在一些情形中，經擴增致癌基因包含BRAF、CCND1、CDK4、CDK6、c-Myc、EGFR、ERB2、FGFR、HRAS、IGF1R、KRAS、MDM2、MDM4、MET、MYCL、MYCN及NRAS中之一或多者。在一些情形中，方法進一步包含向受試者投與治療有效量之抑制經擴增致癌基因之蛋白質產物之靶向治療劑。在一些情形中，靶向治療劑包含阿貝西利、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛、阿法替尼、阿雷替尼、ALRN-6924、AMG232、AMG-510、阿帕替尼、ARS-3248、AXL1717、AZD-3759、貝伐珠單抗、硼替佐米、布加替尼、卡博替尼、卡馬替尼、色瑞替尼、西妥昔單抗、CGM097、克唑替尼、達拉菲尼、達克替尼、達沙替尼、DS-3032b、恩考芬尼、恩曲替尼、厄達替尼、厄洛替尼、依維莫司、fam-曲妥珠單抗德魯替康、芬妥木單抗、吉非替尼、棉子酚、HDM201、伊達那林、伊馬替尼、英菲格拉替尼、伊尼帕利、拉帕替尼、拉羅替尼、LEE011、樂伐替尼、LGX818、勞拉替尼、MEK162、MK-8242 SCH 900242、MRTX849、納維托克、奈昔木單抗、尼羅替尼、奧巴克拉、奧拉帕尼、OSI-906、奧希替尼、帕博西尼、帕尼單抗、PD-0332991、派瑞索菲、帕妥珠單抗、PL225B、瑞波替尼、瑞博西尼、RO5045337、沙利黴素、沙利雷塞、SAR405838 MI-77301、索拉菲尼、索托拉西、舒尼替尼、他莫昔芬、替西羅莫司、替吡法尼、替維替尼、托法替尼、曲美替尼、曲妥珠單抗、妥卡替尼、UPR1376、VAL-083、威羅菲尼、威羅菲尼、長春福肽或佐帕他林多柔比星。在一些情形中，RS路徑抑制劑及靶向治療劑係一起投與。在一些情形中，RS路徑抑制劑及靶向治療劑係分開投與。
在一態樣中，提供包含複製壓力(RS)路徑抑制劑及靶向治療劑之組合物。在一些情形中，RS路徑抑制劑包含RNR抑制劑、ATR抑制劑、CHK1抑制劑、WEE1抑制劑、E2F抑制劑或RRM2抑制劑。在一些情形中，RNR抑制劑包含吉西他濱、羥基脲、曲阿平或5-氯-2-(n-((1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基苯基)-1-(5-側氧基-4,5-二氫-1,3,4-噁二唑-2-基)丙基)胺磺醯基)苯甲醯胺。在一些情形中，CHK1抑制劑包含GDC-0575、普瑞色替或SRA737。在一些情形中，靶向治療劑靶向致癌基因之蛋白質產物。在一些情形中，致癌基因包含BRAF、CCND1、CDK4、CDK6、c-Myc、EGFR、ERB2、FGFR、HRAS、IGF1R、KRAS、MDM2、MDM4、MYCL、MYCN、MET或NRAS。在一些情形中，靶向治療劑包含阿貝西利、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛、阿法替尼、阿雷替尼、ALRN-6924、AMG232、AMG-510、阿帕替尼、ARS-3248、AXL1717、AZD-3759、貝伐珠單抗、硼替佐米、布加替尼、卡博替尼、卡馬替尼、色瑞替尼、西妥昔單抗、CGM097、克唑替尼、達拉菲尼、達克替尼、達沙替尼、DS-3032b、恩考芬尼、恩曲替尼、厄達替尼、厄洛替尼、依維莫司、fam-曲妥珠單抗德魯替康、芬妥木單抗、吉非替尼、棉子酚、HDM201、伊達那林、伊馬替尼、英菲格拉替尼、伊尼帕利、拉帕替尼、拉羅替尼、LEE011、樂伐替尼、LGX818、勞拉替尼、MEK162、MK-8242 SCH 900242、MRTX849、納維托克、奈昔木單抗、尼羅替尼、奧巴克拉、奧拉帕尼、OSI-906、奧希替尼、帕博西尼、帕尼單抗、PD-0332991、派瑞索菲、帕妥珠單抗、PL225B、瑞波替尼、瑞博西尼、RO5045337、沙利黴素、沙利雷塞、SAR405838 MI-77301、索拉菲尼、索托拉西、舒尼替尼、他莫昔芬、替西羅莫司、替吡法尼、替維替尼、托法替尼、曲美替尼、曲妥珠單抗、妥卡替尼、UPR1376、VAL-083、威羅菲尼、威羅菲尼、長春福肽或佐帕他林多柔比星。在一些情形中，RS路徑抑制劑係CHK1抑制劑且靶向治療劑係EGFR抑制劑。在一些情形中，組合物包含一或多種醫藥上可接受之賦形劑。
在一態樣中，提供治療受試者之癌症之方法。在一些情形中，方法包含向受試者投與治療有效量之第一靶向治療劑，直至受試者之癌症對該第一靶向治療劑產生抗性，隨後向受試者投與治療有效量之複製壓力(RS)路徑抑制劑，由此治療癌症。在一些情形中，第一靶向治療劑包含阿貝西利、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛、阿法替尼、阿雷替尼、ALRN-6924、AMG232、AMG-510、阿帕替尼、ARS-3248、AXL1717、AZD-3759、貝伐珠單抗、硼替佐米、布加替尼、卡博替尼、卡馬替尼、色瑞替尼、西妥昔單抗、CGM097、克唑替尼、達拉菲尼、達克替尼、達沙替尼、DS-3032b、恩考芬尼、恩曲替尼、厄達替尼、厄洛替尼、依維莫司、fam-曲妥珠單抗德魯替康、芬妥木單抗、吉非替尼、棉子酚、HDM201、伊達那林、伊馬替尼、英菲格拉替尼、伊尼帕利、拉帕替尼、拉羅替尼、LEE011、樂伐替尼、LGX818、勞拉替尼、MEK162、MK-8242 SCH 900242、MRTX849、納維托克、奈昔木單抗、尼羅替尼、奧巴克拉、奧拉帕尼、OSI-906、奧希替尼、帕博西尼、帕尼單抗、PD-0332991、派瑞索菲、帕妥珠單抗、PL225B、瑞波替尼、瑞博西尼、RO5045337、沙利黴素、沙利雷塞、SAR405838 MI-77301、索拉菲尼、索托拉西、舒尼替尼、他莫昔芬、替西羅莫司、替吡法尼、替維替尼、托法替尼、曲美替尼、曲妥珠單抗、妥卡替尼、UPR1376、VAL-083、威羅菲尼、威羅菲尼、長春福肽或佐帕他林多柔比星。在一些情形中，RS路徑抑制劑包含RNR抑制劑、ATR抑制劑、CHK1抑制劑、WEE1抑制劑、E2F抑制劑、RRM1抑制劑或RRM2抑制劑。在一些情形中，RNR抑制劑包含吉西他濱、羥基脲、曲阿平或5-氯-2-(n-((1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基苯基)-1-(5-側氧基-4,5-二氫-1,3,4-噁二唑-2-基)丙基)胺磺醯基)苯甲醯胺。在一些情形中，CHK1抑制劑包含GDC-0575、普瑞色替或SRA737。在一些情形中，癌症係在投與RS路徑抑制劑之前測定為ecDNA陽性。在一些情形中，ecDNA包含經擴增致癌基因。在一些情形中，經擴增致癌基因包含BRAF、CCND1、CDK4、CDK6、c-Myc、EGFR、ERB2、FGFR、HRAS、IGF1R、KRAS、MDM2、MDM4、MET、MYCL、MYCN及NRAS中之一或多者。在一些情形中，方法進一步包含向受試者投與抑制經擴增致癌基因之蛋白質產物之第二靶向治療劑。在一些情形中，第二靶向治療劑包含阿貝西利、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛、阿法替尼、阿雷替尼、ALRN-6924、AMG232、AMG-510、阿帕替尼、ARS-3248、AXL1717、AZD-3759、貝伐珠單抗、硼替佐米、布加替尼、卡博替尼、卡馬替尼、色瑞替尼、西妥昔單抗、CGM097、克唑替尼、達拉菲尼、達克替尼、達沙替尼、DS-3032b、恩考芬尼、恩曲替尼、厄達替尼、厄洛替尼、依維莫司、fam-曲妥珠單抗德魯替康、芬妥木單抗、吉非替尼、棉子酚、HDM201、伊達那林、伊馬替尼、英菲格拉替尼、伊尼帕利、拉帕替尼、拉羅替尼、LEE011、樂伐替尼、LGX818、勞拉替尼、MEK162、MK-8242 SCH 900242、MRTX849、納維托克、奈昔木單抗、尼羅替尼、奧巴克拉、奧拉帕尼、OSI-906、奧希替尼、帕博西尼、帕尼單抗、PD-0332991、派瑞索菲、帕妥珠單抗、PL225B、瑞波替尼、瑞博西尼、RO5045337、沙利黴素、沙利雷塞、SAR405838 MI-77301、索拉菲尼、索托拉西、舒尼替尼、他莫昔芬、替西羅莫司、替吡法尼、替維替尼、托法替尼、曲美替尼、曲妥珠單抗、妥卡替尼、UPR1376、VAL-083、威羅菲尼、威羅菲尼、長春福肽或佐帕他林多柔比星。在一些情形中，第一靶向治療劑係與RS抑制劑、第二靶向治療劑或二者組合投與。 以引用方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案皆以引用方式併入本文中，其併入程度如同明確地及個別地指出將每一個別公開案、專利或專利申請案以引用方式併入一般。
交叉參照
此專利申請案主張2020年8月12日申請之美國臨時申請案第63/064,555號及2021年3月30日申請之美國臨時申請案第63/168,120號之權益，其每一者以整體引用的方式併入本文中。
眾多致癌基因導向療法已針對經突變或活化之融合致癌基因靶標展示臨床效能，然而，該等相同療法對腫瘤並不總是產生良好客觀反應率(ORR)或無惡化存活(PFS)，尤其當相同致癌基因擴增時。儘管已作出相當大的努力，但腫瘤學領域仍未能解決以經擴增致癌基因為特徵之癌症群體之此顯著未滿足需求。資料表明，很大比例之該等擴增係局部擴增，在一些情況中發生於染色體外DNA (ecDNA)上，且此ecDNA現象可係治療失敗的原因。
圖1中所示之SNU16胃癌模型概括了在FGFR2經擴增癌症之情形中對靶向FGFR抑制劑療法「無反應性」之臨床觀察結果。腫瘤細胞主要含有ecDNA經擴增之MYC及FGFR2。儘管本文未顯示，但腫瘤細胞顯示對FGFR抑制劑療法之初始敏感性，其中在前兩週治療中具有實質細胞減少。然而，經過5週，細胞系再次正常生長且對FGFR抑制完全耐受。此快速抗性與ecDNA上FGFR2之減少及ecDNA上EGFR之顯著增加有關。潛在ecDNA機制因應靶向治療劑壓力使能夠獲得快速致癌基因庫改變。此活體外演化之動力學與臨床「無反應者」表型一致，儘管事實係原始腫瘤群體對FGFR抑制非常敏感。該等發現有助於解釋當該等致癌基因經由擴增活化時，觀察到致癌基因導向療法(例如FGFR、EGFR、MET)展示缺乏臨床效能。治療上靶向潛在ecDNA機制構成前所未有的正交策略，以克服與致癌基因經擴增腫瘤相關之治療抗性。與此一致，圖25顯示FGFR2利用英菲格拉替尼及ecDNA利用RNR抑制劑吉西他濱之同時抑制完全抑制細胞生長並防止產生抗性。類似地，圖26顯示變得對英菲格拉替尼有抗性之細胞主要係由ecDNA上之EGFR擴增驅動且初始對EGFR抑制劑厄洛替尼敏感，但在3週內產生繼發性抗性。然而，EGFR藉由厄洛替尼及RNR藉由吉西他濱之同時抑制完全抑制細胞生長並防止產生繼發性抗性。重要的是，FGFR2及EGFR分別藉由英菲格拉替尼及厄洛替尼之前期同時抑制僅延遲抗性之產生。
圖2中所示之第二活體內模型示範與ecDNA相關之另一抗性機制，其中使用選擇性KRASG12C抑制劑MRTX849針對活化突變體KRAS G12C之靶向療法導致初始腫瘤減少，隨後快速產生抗性並再生長。初始腫瘤沒有明顯的ecDNA，而抗性腫瘤顯示含有經擴增KRAS G12C之ecDNA的明顯證據。先前公佈之資料與BRAF突變型結腸直腸癌中致癌基因擴增驅動對EGFR及BRAF抑制劑之抗性之類似可能ecDNA介導之現象一致。該等結果指示ecDNA導向療法用以解決與突變活化MAPK路徑抑制相關之主要抗性機制之獨特效用。
腫瘤學領域一直在努力尋找適當遺傳背景/敏感性印記，以成功部署複製壓力(RS)複靶向療法，包括ATR、CHK1及WEE1。ATR抑制劑在ATM突變前列腺癌中顯示一些潛力，但研究仍在進行中。已提出與致癌基因擴增相關之合成性致死(例如尤其MYC、MYCN、MYCL、CCNE1，此乃因其與增加之RS相關)以及其他基因改變及/或HPV+。支撐該等相依性之資料遠非定論且過於複雜。本文提供其中ecDNA導向抑制(複製壓力路徑組分之抑制)展現與癌症靶向劑之合成性致死的方法。在一些情形中，與RS靶向劑之合成性致死包括癌症靶向劑與複製壓力路徑組分之抑制(例如與核糖核苷酸還原酶(RNR)或CHK1抑制劑)之合成性致死。在一些情形中，腫瘤背景鑑別為對複製壓力路徑抑制劑高度敏感且允許足夠治療指數以使能夠耐受有效之劑量。在一些情形中，複製壓力路徑組分之抑制導致ecDNA陽性細胞中減少之ecDNA複本數及增強之細胞毒性。在一些情形中，增強之細胞毒性係由複製壓力路徑組分之抑制及癌症靶標(例如，致癌基因)之抑制的組合所造成。 治療方法
在一態樣中，本文提供治療受試者之癌症之方法，例如治療受試者之腫瘤或腫瘤細胞之方法。在一些情形中，本文之方法包含以足以誘導腫瘤或腫瘤細胞中之複製壓力之量投與複製壓力路徑劑(RSPA)。在一些情形中，該方法進一步包含投與癌症靶向治療劑。在一些情形中，腫瘤或腫瘤細胞具有染色體外去氧核酸(ecDNA)印記。在一些情形中，腫瘤之生長或大小或腫瘤細胞之生長或數量減少。
在本文方法之態樣中，確定腫瘤或腫瘤細胞是否具有ecDNA印記。在一些情形中，當腫瘤或腫瘤細胞具有一或多個與ecDNA+腫瘤或腫瘤細胞相關之特徵時，確定腫瘤或腫瘤細胞是否具有ecDNA印記。舉例而言，在一些情形中，ecDNA印記選自由以下組成之群：基因擴增；p53功能缺失突變；缺乏微衛星不穩定性(MSI-H)；低度之PD-L1表現；低度之腫瘤發炎印記(TIS)；低度之腫瘤突變負荷(TMB)；等位基因取代、插入、或缺失(插入或缺失(indel))之頻率增加；及其任何組合。
在本文方法之態樣中，方法進一步包含投與針對靶標基因蛋白質產物之活性的癌症靶向治療劑。在一些情形中，利用癌症靶向治療劑及RSPA治療可減少靶標基因在腫瘤或腫瘤細胞中之擴增或表現。在一些情形中，癌症靶向治療劑係在RSPA之前投與。在一些情形中，癌症靶向治療劑係與RSPA同時投與。在一些情形中，癌症靶向治療劑係在RSPA之前投與。
在本文方法之態樣中，腫瘤或腫瘤細胞具有ecDNA印記。在一些情形中，腫瘤或腫瘤細胞在投與癌症靶向治療劑之後產生ecDNA印記。在一些情形中，腫瘤或腫瘤細胞在治療前產生ecDNA印記。在一些情形中，該方法防止腫瘤或腫瘤細胞中ecDNA增加。
在本文所提供方法之態樣中，癌症靶向治療劑靶向致癌基因之蛋白質產物。在一些情形中，致癌基因包含點突變、插入、缺失、融合或其組合。在一些情形中，癌症靶向治療劑靶向選自由以下組成之群之基因：AKT、ALK、AR、BCL-2、BCR-ABL、BRAF、CDK4、CDK6、c-MET、EGFR、ER、ERBB3、ERRB2、FAK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GR、HRAS、IGF1R、KIT、KRAS、MCL-1、MDM2、MDM4、MTOR、MYC、MYCL、MYCN、NRAS、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFR、PIK3CA/B、PIK3Cδ、RET及ROS1。在一些情形中，癌症靶向治療劑靶向表1中所提供之一或多個基因。
在本文所提供方法之態樣中，腫瘤或腫瘤細胞包含第一基因或其部分之擴增。在一些情形中，第一基因係致癌基因。在一些情形中，第一基因係抗藥性基因。在一些情形中，擴增存在於ecDNA上。在一些情形中，第一基因選自由以下組成之群：AKT、ALK、AR、BCL-2、BCR-ABL、BRAF、CDK4、CDK6、c-MET、EGFR、ER、ERRB2、ERBB3、FAK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GR、HRAS、IGF1R、KRAS、KIT、MCL-1、MDM2、MDM4MTOR、NRAS、PDGFR、RET及ROS1。在一些情形中，第一基因包含表1中所提供之一或多個基因。在一些情形中，癌症靶向治療劑針對該第一基因。在一些情形中，受試者先前未利用該癌症靶向治療劑進行治療。在一些情形中，腫瘤或腫瘤細胞先前未利用該癌症靶向治療劑進行治療。在一些情形中，方法防止腫瘤或腫瘤細胞中ecDNA之增加。在一些情形中，方法防止第一基因之擴增的進一步增加。在一些情形中，該進一步擴增係在僅投與癌症靶向治療劑之情形中發生，但當治療包括癌症靶向治療劑及RSPA二者時，擴增之進一步增加受到抑制或被阻止。
在本文所提供方法之態樣中，腫瘤或腫瘤細胞在利用癌症靶向治療劑及RSPA治療之前對先前治療劑有抗性或無反應性。在一些情形中，腫瘤或腫瘤細胞先前已利用先前治療劑進行治療。在一些情形中，受試者先前已利用先前治療劑進行治療。在一些情形中，在利用先前治療劑治療一段時期後，腫瘤或腫瘤細胞變得對此先前藥劑有抗性或無反應性，且利用本文之方法，當該等腫瘤或腫瘤細胞利用癌症靶向治療劑(在一些情況中不同於先前治療劑之藥劑)及RSPA進行治療時，腫瘤或腫瘤細胞之生長收到抑制。在一些情形中，治療減少所治療腫瘤或腫瘤細胞中ecDNA之量或含量或防止ecDNA之量或含量之進一步增加。
在本文所提供方法之態樣中，癌症靶向治療劑針對靶標基因之蛋白質產物之活性。在一些情形中，利用癌症靶向治療劑及RSPA之治療減少靶標基因在腫瘤或腫瘤細胞中之擴增或表現。在一些情形中，靶標基因係致癌基因、抗藥性基因、治療靶標基因或檢查點抑制劑基因。在一些情形中，靶標基因選自由以下組成之群：KRAS、HRAS、NRAS、BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、ALK、ROS1、RET、PDGFR、c-MET、IGF1R、FAK、BCR-ABL、MCL-1、CDK4、CDK6、ERRB2、ERBB3、MDM2、MTOR、FLT3、KIT、AKT、BCL-2、AR、ER、GR及MDM4。在一些情形中，靶標基因包含表1中所提供之一或多個基因。在一些情形中，靶標基因係發現於ecDNA上或發現擴增於ecDNA上且利用癌症靶向治療劑及RSPA進行治療減少ecDNA，包括包含靶標基因之複本的ecDNA。
在本文所提供方法之各個態樣中，在一些情形中，腫瘤或腫瘤細胞之ecDNA印記係在開始治療腫瘤或腫瘤細胞之前得知。舉例而言，腫瘤或腫瘤細胞經生檢或以其他方式收集並分析一或多個ecDNA印記。在一些情形中，確定如何治療腫瘤或腫瘤細胞係完全或部分地基於ecDNA印記之存在或不存在。在一些情形中，ecDNA印記係在腫瘤或腫瘤細胞之治療開始之後得知。
在本文所提供方法之態樣中，與在不存在RSPA之情形下利用癌症靶向治療劑治療相比，利用癌症靶向治療劑及RSPA之治療方法改良客觀反應率及/或延長治療反應之持續時間。在一些情形中，與在不存在RSPA之情形下利用癌症靶向治療劑治療相比，該方法延長無惡化存活期。
在一態樣中，提供治療ecDNA相關腫瘤或腫瘤細胞之方法。在一些情形中，方法包括將RSPA及癌症靶向治療劑投與給鑑別為具有帶有ecDNA之腫瘤或腫瘤細胞之受試者。在一些情形中，腫瘤之生長或大小或腫瘤細胞之生長或數量因治療而減小。
在本文所提供方法之態樣中，受試者之腫瘤或腫瘤細胞鑑別為具有ecDNA印記。在一些情形中，ecDNA印記選自由以下組成之群：基因擴增；p53功能缺失突變；缺乏微衛星不穩定性(MSI-H)；低度之PD-L1表現；低度之腫瘤發炎印記(TIS)；低度之腫瘤突變負荷(TMB)；等位基因取代、插入、或缺失(插入或缺失(indel))之頻率增加；及其任何組合。
在本文所提供方法之態樣中，腫瘤或腫瘤細胞係藉由使細胞中之ecDNA成像、使用致癌基因結合劑檢測ecDNA或藉由DNA定序鑑別為具有ecDNA。在一些情形中，在循環腫瘤DNA中鑑別出ecDNA。
在本文所提供方法之各個態樣中，腫瘤或腫瘤細胞包含實體腫瘤。在一些情形中，實體腫瘤中存在之ecDNA因利用癌症靶向治療劑及RSPA治療而減少或消失。在一些情形中，與治療前ecDNA之含量相比，實體腫瘤中ecDNA之含量在治療後減少。在一些情形中，與治療前實體腫瘤中致癌基因擴增之程度及/或複本數變異(CNV)之程度相比，實體腫瘤中致癌基因擴增之程度及/或CNV之程度在利用癌症靶向治療劑及RSPA治療後減少。
在本文所提供方法之各個態樣中，腫瘤或腫瘤細胞包括循環腫瘤細胞。在一些情形中，循環腫瘤細胞中存在之ecDNA因利用癌症靶向治療劑及RSPA治療而減少或消失。在一些情形中，與治療前ecDNA之含量相比，循環腫瘤細胞中ecDNA之含量在治療後減少。在一些情形中，與治療前循環腫瘤細胞中致癌基因擴增之程度及/或複本數變異(CNV)之程度相比，循環腫瘤細胞中致癌基因擴增之程度及/或CNV之程度在治療後減少。在一些情形中，在循環腫瘤DNA中鑑別出ecDNA之存在或含量。
在本文所提供使用利用RSPA及癌症靶向治療劑進行治療之方法之各個態樣中，RSPA選自由以下組成之群：RNR抑制劑、ATR抑制劑、CHK1抑制劑、WEE1抑制劑及PARG抑制劑。在一些情形中，RNR抑制劑選自由以下組成之群：吉西他濱、羥基脲、曲阿平、5-氯-2-(n-((1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基苯基)-1-(5-側氧基-4,5-二氫-1,3,4-噁二唑-2-基)丙基)胺磺醯基)苯甲醯胺、氯法拉濱、氟達拉濱、莫特沙芬釓、克拉屈濱、替紮他濱及COH29 (N-[4-(3,4-二羥基苯基)-5-苯基-1,3-噻唑-2-基]-3,4-二羥基苯甲醯胺)。在一些情形中，CHK1抑制劑選自由以下組成之群：GDC-0575、普瑞色替、LY-2880070、SRA737、XCCS-605B、雷布色替(LY-2603618)、SCH-900776、RG-7602、AZD-7762、PF-477736及BEBT-260。在一些情形中，WEE1抑制劑選自由以下組成之群：AZD1775 (MK1775)、ZN-c3、Debio 0123、IMP7068、SDR-7995、SDR-7778、NUV-569、PD0166285、PD0407824、SC-0191、DC-859/A、伯舒替尼及Bos-I。在一些情形中，ATR抑制劑選自由以下組成之群：RP-3500、M-6620、柏唑色替(M-6620、VX-970；VE-822)、AZZ-6738、AZ-20、M-4344(VX-803)、BAY-1895344、M-1774、IMP-9064、nLs-BG-129、SC-0245、BKT-300、ART-0380、ATRN-119、ATRN-212、NU-6027。
在本文所提供使用利用癌症靶向治療劑及RSPA進行治療之方法之各個態樣中，癌症靶向治療劑選自由以下組成之群：阿貝西利、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛、阿法替尼、阿雷替尼、ALRN-6924、AMG232、AMG-510、阿帕替尼、ARS-3248、AXL1717、AZD-3759、貝伐珠單抗、硼替佐米、布加替尼、卡博替尼、卡馬替尼、色瑞替尼、西妥昔單抗、CGM097、克唑替尼、達拉菲尼、達克替尼、達沙替尼、DS-3032b、恩考芬尼、恩曲替尼、厄達替尼、厄洛替尼、依維莫司、fam-曲妥珠單抗德魯替康、芬妥木單抗、吉非替尼、棉子酚、HDM201、伊達那林、伊馬替尼、英菲格拉替尼、伊尼帕利、拉帕替尼、拉羅替尼、LEE011、樂伐替尼、LGX818、勞拉替尼、MEK162、MK-8242 SCH 900242、MRTX849、納維托克、奈昔木單抗、尼羅替尼、奧巴克拉、奧拉帕尼、OSI-906、奧希替尼、帕博西尼、帕尼單抗、PD-0332991、派瑞索菲、帕妥珠單抗、PL225B、瑞波替尼、瑞博西尼、RO5045337、沙利黴素、沙利雷塞、SAR405838 MI-77301、索拉菲尼、索托拉西、舒尼替尼、他莫昔芬、替西羅莫司、替吡法尼、替維替尼、托法替尼、曲美替尼、曲妥珠單抗、妥卡替尼、UPR1376、VAL-083、威羅菲尼、威羅菲尼、長春福肽及佐帕他林多柔比星。在一些情形中，癌症靶向治療劑靶向由表1中所提供之一或多個基因編碼之蛋白質。
表 1 ：實例基因
基因 說明
ABCB(1-11) ABC結合盒子家族A
ABCC(1-13) ABC結合盒子家族C
ABCG(1-5) ABC結合盒子家族G
ABL1 編碼ABL激酶
AKT(1-3) 編碼AKT絲胺酸/蘇胺酸激酶之家族
ALK 間變性淋巴瘤激酶
NRC3C4 (AR) 雄激素受體
BCL2 編碼BCL-2細胞凋亡調節劑
BCR 編碼斷點簇集區蛋白質
BRAF 編碼B-raf絲胺酸/蘇胺酸激酶
CCND1 週期蛋白D1
CCNE1 週期蛋白E1
CDK4 細胞分裂蛋白激酶4
CDK6 細胞分裂蛋白激酶6
EGFR 表皮生長因子受體(亦稱為ERBBI及HER1)
ERBB(1-4) 受體蛋白之HER1-4家族，包括EGFR
ESR(1-2) 雌激素受體(α及β)
FAK 點狀黏著激酶
FGFR(1-4) 受體蛋白之FGFR1-4家族
FLT3 FMS樣酪胺酸激酶3，亦稱為CD135
NR3C1 (GR) 糖皮質激素受體
HRAS 編碼RAS GTPase/信號傳導蛋白HRAS
IGF1R 胰島素樣生長因子受體(IGF-1R)
KIT 編碼c-Kit，亦稱為CD117
KRAS 編碼RAS GTPase/信號傳導蛋白KRAS
MCL1 編碼MCL-1，骨髓性白血病細胞分化蛋白
MDM2 小鼠雙微體2
MDM4 小鼠雙微體4
MET 編碼c-Met蛋白(亦稱為HGFR)
MTOR 編碼雷帕黴素之機制靶標(mTOR)
MYC 編碼c-Myc
MYCL 編碼l-Myc
MYCN 編碼n-Myc
NRAS 編碼RAS GTPase/信號傳導蛋白NRAS
NRG1 編碼神經調節蛋白1
NTRK(1-3) 神經營養酪胺酸受體激酶
PDGFR 編碼血小板衍生生長因子受體
NR3C3 (PGR) 助孕酮受體
PIK3CA/B/D/G 編碼磷脂醯肌醇3-激酶亞單元α/β/δ/γ
PIK3Cδ 編碼磷脂醯肌醇3-激酶δ
RET 編碼RET原癌基因
ROS1 編碼ROS原癌基因1
S100A8(MRP8) 編碼S100鈣結合蛋白A8
在本文所提供方法之態樣中，RSPA係RNR抑制劑且RSPA係以相對低於其作為單一藥劑推薦使用時之醫療劑量投與。在一些情形中，RNR抑制劑係吉西他濱。或者，RNR抑制劑不為吉西他濱或羥基脲。
在本文所提供方法之態樣中，RSPA不為吉西他濱。在一些情形中，當癌症靶向治療劑係EGFR抑制劑時，RSPA不為吉西他濱。
雖然本文已顯示並闡述本發明之各種實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，該等實施例僅作為實例提供。熟習此項技術者可作出多種變化、改變及替代而不背離本發明。應瞭解，可採用本文所述本發明實施例之各種替代形式。 某些定義
如本文所用，「約」或「大約」意指在熟習此項技術者所測定特定值之可接受誤差範圍內，其可部分地取決於該值之量測或測定方式，亦即量測系統之侷限性。舉例而言，根據此項技術中之實踐，「約」可意指在1個或多於1個標準偏差內。作為另一實例，「約」可意指給定值之至多20%、至多10%、至多5%或至多1%之範圍。關於生物系統或過程，術語「約」可意指在一個數量級內，例如在一值之5倍或在2倍內。在申請及申請專利範圍中闡述特定值之情形中，除非另外陳述，否則術語「約」意指在特定值之可接受誤差範圍內。
如本文所用，術語「受試者」一般係指脊椎動物，例如哺乳動物(例如人類)。哺乳動物包括(但不限於)鼠類、猿、人類、農場動物、運動動物及寵物(例如，狗或貓)。亦涵蓋活體內獲得或活體外培養之生物實體之組織、細胞及其後代。在一些實施例中，受試者為患者。在一些實施例中，受試者關於疾病(例如癌症)係有症狀的。或者，在一些情形中，受試者關於該疾病係無症狀的。在一些情形中，受試者不患有該疾病。
如本文所用，術語「生物試樣」通常係指源自或獲得自受試者、哺乳動物(例如人類)之試樣。生物試樣預期包括(但不限於)毛髮、指甲、皮膚、汗液、淚液、眼液、鼻拭子或鼻咽洗液、痰、咽喉拭子、唾液、黏液、血液、血清、血漿、胎盤液、羊水、臍帶血、重液(emphatic fluid)、腔液、耳垢、油、腺體分泌物、膽汁、淋巴液、膿、微生物群、胎糞、母乳、骨髓、骨、CNS組織、腦脊髓液、脂肪組織、滑液、糞便、胃液、尿液、精液、陰道分泌物、胃、小腸、大腸、直腸、胰臟、肝、腎、膀胱、肺及源自或獲得自受試者之其他組織及流體。
如本文所用，術語「治療」通常係指出於獲得效應之目的而投與藥劑或進行程序。在一些情形中，效應在完全或部分預防疾病或其症狀方面係預防性的及/或在實現疾病及/或該疾病之一或多種症狀之部分或完全治癒方面係治療性的。如本文所用，「治療」可包括治療哺乳動物、特定地人類之腫瘤，且包括：(a) 防止疾病或疾病症狀發生於可能易患該疾病、但尚未診斷出患病(例如，包括可能與原發疾病相關或由其引起之疾病)之受試者中；(b) 抑制疾病，即阻止其發展；及(c) 減輕疾病，即，使疾病消退。治療可係指成功治療或改善或預防癌症之任何標記，包括任何客觀或主觀參數，例如減輕；緩解；減少症狀或疾病狀況對患者而言更易於耐受；使退化或衰退之速率減慢；或使退化之終點不那麼衰弱。症狀之治療或改善係基於一或多個客觀或主觀參數；包括醫師之檢查結果。因此，術語「治療」包括投與本發明之化合物或藥劑以預防或延遲、緩和或阻止或抑制與癌症或其他疾病相關之症狀或病況之發展。術語「治療效應」係指減少、消除或預防受試者之疾病、疾病症狀或疾病副作用。
如本文所用，術語「腫瘤」或「腫瘤細胞」通常係指生長及分裂超出其應有之程度或在其應死亡時不死亡之細胞。在一些情形中，腫瘤細胞存在於實體腫塊中，例如實體腫瘤，或在一些情形中，腫瘤細胞係以非實體形式存在，例如在血癌中。腫瘤或腫瘤細胞亦可包括轉移或轉移細胞，其中癌細胞離開原始(原發)腫瘤且可在身體之其他器官或組織中形成新的腫瘤。
如本文所用，術語「致癌基因」通常係指在不適當活化時可能導致癌症之基因。在腫瘤或腫瘤細胞中，該等基因通常經突變以去除負調節結構域或以高程度表現。
如本文所用，術語「ecDNA印記」通常係指ecDNA+之腫瘤或腫瘤細胞共有之一或多種特徵。在一些情形中，ecDNA印記選自由以下組成之群：基因擴增；p53功能缺失突變；缺乏微衛星不穩定性(MSI-H)；低度之PD-L1表現；低度之腫瘤發炎印記(TIS)；低度之腫瘤突變負荷(TMB)；等位基因取代、插入、或缺失(插入或缺失(indel))之頻率增加；及其任何組合。在一些情形中，ecDNA印記包括使用成像技術檢測或鑑別ecDNA。在一些情形中，ecDNA印記不包括ecDNA之任何成像或直接檢測。
如本文所用，術語「複製壓力路徑劑」、「RSPA」、「複製壓力路徑抑制劑」及「RS路徑抑制劑」通常係指在細胞(例如腫瘤細胞)中引起複製壓力之藥劑。在一些情形中，RSPA係複製壓力路徑組分之抑制劑，其中抑制增加複製壓力。如本文所用，複製壓力係指影響DNA複製及/或DNA合成之壓力且可包括(但不限於)複製叉進展複之減慢或停滯及/或對DNA合成之干擾。實例性複製壓力路徑劑包括(但不限於)抑制RNR (核糖核苷酸還原酶)、CHK1 (檢查點激酶1)、ATR (Rad3相關蛋白)、WEE1、E2F、PARG (聚(ADP核糖)糖水解酶)或RRM2 (核糖核苷酸還原酶調節亞單元2)之藥劑。
每當術語「至少」、「大於」或「大於或等於」在一系列兩個或以上數值中之第一數值之前時，術語「至少」、「大於」或「大於或等於」適用於該系列數值中之每一數值。舉例而言，大於或等於1、2或3相當於大於或等於1、大於或等於2或大於或等於3。
每當「不大於」、「小於」或「小於或等於」在一系列兩個或以上數值中之第一數值之前時，術語「不大於」、「小於」或「小於或等於」適用於該系列數值中之每一數值。舉例而言，小於或等於3、2或1相當於小於或等於3、小於或等於2或小於或等於1。 實例
以下實例係出於說明本發明之各個實施例之目的給出且不意欲以任何方式限制本發明。本發明實例以及本文所述之方法目前代表較佳實施例，係實例性的，且不欲限制本揭示內容之範圍。熟習此項技術者將想到其中之變化及如由申請專利範圍之範圍界定之本發明之精神內所涵蓋之其他用途。 實例 1 ： ecDNA 陽性癌症中 RS 路徑之抑制
圖3圖解說明在一些情形中由諸如HPV7(E7)、dNTP耗盡及其他情況之致癌基因活化之複製壓力路徑。
CHK1及RNR在DNA損傷反應網路內之複製壓力(RS)反應路徑中起作用。腫瘤細胞中之一系列因子可活化RS路徑，以在複製壓力期間維持增殖及存活。抑制此途徑中之靶標可藉由使RS程度升高至毒性程度而在該等腫瘤細胞中合成性致死。RNR及CHK1二者均係必需的；因此，與RNR及CHK1抑制劑之臨床開發相關的兩個挑戰係患者選擇及治療指數。
圖12圖解說明ecDNA驅動之腫瘤細胞對RNR或CHK1之抑制更敏感。與匹配之非ecDNA攜帶細胞相比，多種結構不同之RNR及CHK1抑制劑在ecDNA驅動之腫瘤細胞中展現出約5-10倍增強之毒性。利用RNR抑制劑治療導致MYC編碼之ecDNA之複本減少。
將Colo320 ecDNA+ (細胞系COLO320 DM)細胞及Colo320 ecDNA- (染色體擴增，細胞系COLO320 HSR)細胞(結腸直腸腺癌細胞系，ATCC)利用三種結構不同之RNR抑制劑處理，即吉西他濱、羥基脲(HU)或化合物1 (comp-1 (5-氯-2-(n-((1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基苯基)-1-(5-側氧基-4,5-二氫-1,3,4-噁二唑-2-基)丙基)胺磺醯基)苯甲醯胺))。如圖12中所示，與ecDNA陰性細胞系(Colo320 HSR)相比，ecDNA陽性細胞(Colo320 DM)對RNR抑制劑之敏感性高5-10倍。所有RNR抑制劑均誘導複製壓力標幟物(即在CHK1之絲胺酸位置317及345處之磷酸化)，且通常ecDNA陽性細胞與ecDNA陰性細胞相比具有增加之此複製壓力標幟物之誘導。評估RNR抑制劑羥基脲(HU)處理之ecDNA+ (Colo320 DM)細胞及對照細胞(媒劑處理)之ecDNA。如所預期，媒劑處理之細胞系具有高含量之ecDNA，而在利用RNR抑制劑羥基脲處理後，ecDNA複本數顯著減少。
測定ecDNA+細胞系(Colo320 DM)與ecDNA-細胞系(Colo320 HSR)相比對四種結構不同之CHK1抑制劑之敏感性。將兩種細胞系用GDC0575、普瑞色替、雷布色替或SRA737處理七天。如圖13中所示，與Colo320 HSR ecDNA-細胞相比，Colo320 DM ecDNA+細胞對CHK1抑制展示約5-10倍增強之敏感性。與此相比，利用CCT241533抑制CHK2及利用AZD0156抑制DDR靶標ATM均未揭示該兩個細胞系之間之任何差異敏感性。
圖5圖解說明在軟瓊脂之3維群落形成分析中ecDNA陽性對ecDNA陰性癌細胞對RNR使用吉西他濱之抑制之差異敏感性。在兩週軟瓊脂藥物敏感性分析中，對一組ecDNA+及ecDNA-細胞系進行詢問。所有細胞系均利用吉西他濱之五點劑量範圍處理兩週並用結晶紫染色(圖5，上部面板)以基於ImageJ分析量化個別菌落計數(繪製於圖5中，下部面板)。在與ecDNA-細胞系(DLD1、Colo320 HSR、Lovo及SW48)相比時，所有ecDNA+細胞系(SNU16、Colo320 DM、H716及H2170)均對吉西他濱展示5-10倍增強之敏感性。
圖31圖解說明在軟瓊脂之3維群落形成分析中ecDNA+細胞對WEE1使用阿達索替尼之抑制之敏感性。在兩週軟瓊脂藥物敏感性分析中，對一組ecDNA+細胞系進行詢問。所有細胞系均利用阿達索替尼之五點劑量範圍處理兩週並用結晶紫染色以量化個別菌落計數。所有細胞系均對阿達索替尼展示敏感性。
圖32圖解說明經由群落形成分析在HeLa細胞中經由阿達索替尼(MK-1775)之WEE1抑制消除對胺甲喋呤之抗性形成。在圖32左側面板中，使100個細胞在沒有胺甲喋呤之情形下鋪板達10天，然後用DMSO、普瑞色替(IC50、1/3 IC50或1/9 IC50)或阿達索替尼(MK-1775) (IC50、1/3 IC50或1/9 IC50)處理。在圖32右側面板中，使10000個細胞在胺甲喋呤之情形下鋪板達21天，且同時利用DMSO、普瑞色替(IC50、1/3 IC50或1/9 IC50)或阿達索替尼(MK-1775) (IC50、1/3 IC50或1/9 IC50)處理。
ecDNA+ (Colo320 DM)及ecDNA- (Colo320 HSR)細胞系模型之敏感性係藉由各自經七天時期利用增加濃度之普瑞色替(CHK1i)處理來測定。細胞增殖係使用MTS分析測定(圖14，頂部左側面板)，而細胞毒性係藉由使用CytoTox-Glo分析量測死細胞蛋白酶活性測定(圖14，頂部右側面板)。當分析增殖及細胞毒性變化時，與Colo320 HSR ecDNA-細胞相比，攜帶ecDNA之Colo320 DM顯示對利用CHK1i處理之敏感性增強200倍及13.71倍。
親代CT26WT E3細胞(ecDNA-細胞系)及阿達格拉西布抗性CT26WT E3細胞(ecDNA+)在存在及不存在1 µM阿達格拉西布之情形下對持續5天的增加濃度之普瑞色替(CHK1i)之敏感性係使用Cell Titer-glo分析測定。如圖14底部面板中所示，與非ecDNA攜帶親代CT26WT E3細胞相比，阿達格拉西布抗性CT26WT E3 ecDNA+細胞對CHK1抑制展示約10倍增強之敏感性。
將HeLa細胞利用單獨的CHK1抑制劑10 nM GDC-0575、利用單獨的100 nM胺甲喋呤或利用10 nM GDC-0575與100 nM胺甲喋呤之組合處理3週之時期。細胞鋪滿係在時間進程內經由高含量顯微鏡術量測。GDC-0575對細胞生長無效應。胺甲喋呤初始導致較少或沒有細胞生長，但在培養兩週後，細胞開始產生抗性且細胞生長恢復。與此相比，與CHK1抑制劑之組合阻止胺甲喋呤抗性之產生。此效應持續至8週之研究結束。圖6顯示與ecDNA陽性胺甲喋呤抗性HeLa癌細胞相關之資料。RNR抑制劑消除ecDNA介導之對胺甲喋呤治療之快速抗性，此導致所觀察到之合成性致死。圖9顯示親代HeLa細胞(左側面板)及胺甲喋呤抗性HeLa細胞(右側面板)之FISH影像。此資料顯示，未經處理之HeLa細胞具有極少ecDNA陽性細胞。與此相比，胺甲喋呤抗性HeLa細胞具有增加含量之ecDNA。胺甲喋呤抗性HeLa細胞中之初步CHK1靶標驗證顯示於圖7中。此資料顯示，活細胞顯微鏡術表明在HeLa細胞中在ecDNA上胺甲喋呤抗性經由DHFR擴增之形成中利用CHK1抑制之潛在合成性致死。
ecDNA+ (Colo320 ecDNA+)及ecDNA- (Colo320 ecDNA-)細胞系模型對WEE1抑制之敏感性係藉由各自經7天時期利用增加濃度之阿達索替尼或PD0166285處理來測定。細胞增殖係使用MTS分析測定(圖27，頂部面板)，而生存率係使用CellTiter-glo分析測定(圖27，底部面板)。當分析增殖及生存率變化時，Colo320 ecDNA+細胞與Colo320 ecDNA-細胞相比顯示對利用阿達索替尼及PD0166285處理之敏感性增強。
ecDNA+ (Colo320 ecDNA+)及ecDNA- (Colo320 ecDNA-)細胞系模型對ATR抑制之敏感性係藉由各自經7天時期利用增加濃度之AZD6738或BAY1895344處理來測定。細胞增殖係使用MTS分析測定(圖36，頂部面板)，而生存率係使用CellTiter-glo分析測定(圖36，底部面板)。當分析增殖及比較生存率變化時，Colo320 ecDNA+細胞與Colo320 ecDNA-細胞相比顯示對利用AZD6738及BAY1895344處理之敏感性增強。
將HeLa細胞利用單獨的WEE1抑制劑0.01-0.3 μM阿達索替尼、利用1 nM-100 nM PD0166285、利用單獨的100 nM胺甲喋呤、或利用0.01-0.3 μM阿達索替尼與100 nM胺甲喋呤之組合或1 nM-100 nM PD0166285與100 nM胺甲喋呤之組合處理3週之時期。細胞鋪滿係在時間進程內經由高含量顯微鏡術量測。胺甲喋呤初始導致較少或沒有細胞生長，但在培養兩週後，細胞開始產生抗性且細胞生長恢復。與此相比，與阿達索替尼之組合阻止胺甲喋呤抗性之產生。圖28顯示與阿達索替尼(MK1775)消除ecDNA陽性胺甲喋呤抗性HeLa癌細胞中之胺甲喋呤抗性相關之資料，如由NucRed所量測。圖29顯示與PD0166285消除ecDNA陽性胺甲喋呤抗性HeLa癌細胞中之胺甲喋呤抗性相關之資料。
將HeLa細胞利用PARG抑制劑3-100 μM PD00017273在有(圖35，頂部面板)或沒有(圖35，底部面板) 100 nM胺甲喋呤之情形下處理3週之時期。細胞鋪滿係在時間進程內經由高含量顯微鏡術量測。胺甲喋呤初始導致較少或沒有細胞生長，但在培養兩週後，細胞開始產生抗性且細胞生長恢復。與此相比，與PD00017273之組合阻止胺甲喋呤抗性之產生。
將HeLa細胞利用ATR抑制劑300 nM-10 μM AZD6738或10-300 nM BAY1895344在有(圖37，頂部面板)或沒有(圖37，底部面板) 100 nM胺甲喋呤之情形下處理3週之時期。細胞鋪滿係在時間進程內經由高含量顯微鏡術量測。AZD6738與100 nM胺甲喋呤一起顯示合成性致死，但AZD6738自身並不影響HeLa細胞生長。然而，BAY1895344自身在10 nM以上顯示毒性。
ecDNA介導對靶向療法之抗性的重要且臨床獨特機制。關於此之模型顯示於圖8中。此資料表明，存在利用ecDNA導向療法之直接機會，例如使用一或多種RS路徑靶向劑(包括但不限於靶向RNR、ATR、CHK1及WEE1之彼等)作為單一藥劑或與其他療法組合。首先，尚無針對具有非突變經擴增致癌基因之腫瘤之經批準靶向療法(例如FGFR、EGFR、MET、KRAS、MDM2擴增)。其次，當使用一或多種直接抑制某些致癌蛋白(例如KRAS、BRAF、EGFR)之活化突變形式之靶向藥劑時，由於局部擴增(例如，靶標基因自身之基於ecDNA之擴增)，利用一或多種該靶向藥劑治療之腫瘤產生癌症之後天抗性。 實例 2 ： ecDNA 陽性癌症之抗性路徑
為瞭解出現eccDNA介導之療法抗性之機制，確定含有eccDNA之抗性純系係預先存在的還是在療法壓力下重新形成的。條碼實驗係在HeLa細胞中實施，該等細胞藉助生成含有DHFR之ecDNA而變得對利用DHFR抑制劑胺甲喋呤(MTX)之長期治療產生抗性，由此克服MTX壓力。
條碼化與單細胞RNAseq分析之組合.
初始未經處理細胞群體係藉由穩定慢病毒介導條碼序列整合至每一細胞之基因體中來進行條碼化。此條碼亦將在每一細胞之RNA中表現。細胞之單細胞RNAseq分析將(藉助條碼)鑑別含有DHFR之高表現(其指示ecDNA上存在額外DHFR複本)之細胞。在數週MTX壓力及抗性細胞產生後，再次實施單細胞RNAseq以鑑別在治療前顯示高DHFR表現之條碼之細胞，該等細胞變得具有抗性並在MTX壓力下存活。此指示表現高DHFR之抗性細胞群體(藉助ecDNA上之額外複本)係預先存在的。或者，鑑別處理前不具有高DHFR表現但處理後顯示DHFR之高表現之細胞，其指示ecDNA係重新生成(圖10)。
使用平行抗性複製物條碼化.
初始未經處理之HeLa細胞群體係藉由穩定慢病毒介導獨特條碼序列整合至每一細胞之基因體中來進行條碼化，由此生成約200,000個獨特條碼化Hela細胞。將此條碼化細胞群體擴增並平行分成8個獨立抗性實驗。該等平行複製物中之細胞使用100nM MTX處理數週以產生抗性細胞群體。然後，由抗性細胞群體之每一複製物進行定序以確定哪些條碼變得具有抗性。在複製物之抗性細胞中鑑別出共通條碼，由此指示該等細胞在治療前由於預先存在之ecDNA的存在而具有抗性。另外，一部分條碼獨特出現在個別複製物上，此指示抗性係重新形成的。(圖11)。 實例 3 ：小鼠中 KRAS 突變腫瘤之治療
在小鼠中植入CT26WT E3 G12C KRAS突變腫瘤細胞。一旦腫瘤達到350 mm 3之平均體積，小鼠便開始使用KRAS抑制劑(阿達格拉西布)及/或RNR抑制劑(吉西他濱)進行以下治療方案中之一者：(1) 僅媒劑；(2) KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次；(3) RNR (吉西他濱) 10 mg/kg經腹膜內隔日一次；(4) RNRi (吉西他濱) 120 mg/kg經腹膜內每週一次；(5) RNRi (吉西他濱) 10 mg/kg經腹膜內隔日一次 + KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次；或(6) RNRi (吉西他濱) 120 mg/kg經腹膜內每週一次 + KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次。
作為單一藥劑，僅KRASi (阿達格拉西布)導致腫瘤生長之顯著延遲。然而，到第14天，腫瘤開始展現對KRASi (阿達格拉西布)之抗性且腫瘤恢復生長。當KRASi (阿達格拉西布)與RNR抑制劑(吉西他濱)組合時，腫瘤生長受到抑制並持續至研究第30天。為進一步評估組合之效應，將四隻對KRASi (阿達格拉西布)治療產生抗性之小鼠切換到治療5。與保持單一藥劑治療之小鼠相比，該等小鼠之腫瘤生長受到抑制。說明該等實驗結果之資料提供於圖15中。
在處死當天自小鼠獲得之腫瘤所產生離體培養物製備之中期抹片(metaphase spreads)中量測ecDNA。使用FISH測定鼠類KRAS之ecDNA計數。如圖16中所示，在治療1或3中未看到KRAS經擴增之ecDNA。與此相比，導致KRASi抗性之治療在治療組終止(D21)或在D16時累積高量之KRAS ecDNA。對於利用KRAS抑制劑及RNR抑制劑之組合治療之小鼠，在D16分離之腫瘤的KRAS ecDNA含量顯著降低。 實例 4 ：小鼠中 KRAS 突變腫瘤之治療
將小鼠植入CT26WT E3 G12C KRAS突變腫瘤細胞。一旦腫瘤達到350 mm 3之平均體積，小鼠便開始使用KRAS抑制劑(阿達格拉西布)及/或RNR抑制劑(吉西他濱)進行以下治療方案中之一者：(1) 僅媒劑；(2) KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次；(3) RNRi (吉西他濱) 20 mg/kg經腹膜內隔日一次；(4) RNRi (吉西他濱) 10 mg/kg經腹膜內隔日一次 + KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次；或RNRi (吉西他濱) 20 mg/kg經腹膜內隔日一次 + KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次。
如圖17中所示，在治療1-3中看到實質腫瘤生長，其中單一藥劑KRASi (阿達格拉西布)在腫瘤產生抗性且腫瘤生長加速之前提供腫瘤生長延遲約2週。KRASi及RNRi之組合顯著抑制腫瘤生長，使腫瘤體積減少至接近零。在較低劑量之RNRi (治療4)下，8隻小鼠中的7隻具有完全反應且在較高劑量之RNRi (治療5)下，7隻小鼠中的7隻具有完全反應。此研究中各治療之存活曲線顯示於圖18中。
自治療組小鼠獲得之腫瘤產生之中期停滯及固定離體培養物製備中期塗抹物，並藉由FISH可視化鼠類KRAS之ecDNA。KRAS經擴增之ecDNA係藉由人工計數及/或藉由經驗證電腦演算法ecSEG (基於Rajkumar等人之方法開發之軟體包，Semantic Segmentation of Metaphase Images Containing Extrachromosomal DNA, iScience, 第21卷, 2019年11月22日，第428-435頁)量化。
如圖19中所示，來自經媒劑治療及RNRi治療之小鼠(治療組1及3)的腫瘤，觀察到鮮為人知的ecDNA (92/100媒劑；78/95 RNRi)。在存在ecDNA之情形中，複本數較低，每中期塗抹物1-3個。與此相比，KRASi治療之小鼠(治療組2)，自快速生長之腫瘤中獲得之試樣顯示高ecDNA盛行率(117/161中期塗抹物具有ecDNA或KRAS之ecDNA及染色體擴增)以及顯著較高之ecDNA計數(在含有ecDNA之中期塗抹物中平均16個KRAS ecDNA)。評估來自治療組4及5之在第40天後自治療移除之若干小鼠中之ecDNA。如所預期，該等腫瘤中存在極低ecDNA，且在存在ecDNA之情形中，複本數為每中期塗抹物1-7個ecDNA。此資料強化RNRi作為抗ecDNA治療劑之作用機制。 實例 5 ：抗性腫瘤細胞之離體繁殖維持 KRAS ecDNA 以提供活體外抗性
使來自已對KRASi有抗性之CT26WT E3 G12C KRAS突變腫瘤之細胞在活體外在1 μM KRASi (阿達格拉西布)之存在下繁殖。細胞在藥物之存在下繼續生長，此證實抗藥性。親代CT26 WT E3細胞系在培養中維持對藥物之敏感性。ecDNA係藉由FISH成像觀察且藉由人工計數及ecSEG進行量測。如圖20中所示，抗藥性細胞具有高含量之ecDNA，而親代細胞系未展現可量測ecDNA。 實例 6 ：活體內腫瘤生長之 KRASi 及 RNRi 抑制
將來自實例5之離體培養的KRASi抗性腫瘤細胞植入NOD-SCID小鼠中。組B及C中之所有小鼠均自植入之日開始利用KRASi (阿達格拉西布)進行治療。當腫瘤達到200 mm 3之平均值時，對組C中之小鼠進行組合治療。治療組係如下：(A) 僅媒劑；(B) KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次；或(C) RNRi (吉西他濱) 20 mg/kg經腹膜內隔日一次 + KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次。如圖21中所示，KRASi及RNRi之組合抑制動物中之腫瘤生長。
利用相似條件重複植入以測試利用單獨的RNRi及與KRASi之組合治療之效能。如上所述，小鼠植入KRAS抗性腫瘤細胞。當腫瘤達到290 mm 3時，小鼠在第二天如下進行治療：(A) KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次；(B) RNRi (吉西他濱) 10 mg/kg經腹膜內隔日一次；或(C) RNRi (吉西他濱) 10 mg/kg經腹膜內隔日一次 + KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次。RNRi單獨及與KRASi之組合二者均抑制小鼠中之腫瘤生長，如圖22中所示。
利用相似條件重複實驗以測試利用CHK1i與KRASi之組合治療之效能。如上所述，小鼠植入KRAS抗性腫瘤細胞。當腫瘤達到約180 mm 3時，小鼠如下進行治療：(A) KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次；(B) CHK1i (普瑞色替) 20 mg/kg經皮下每天兩次，每7天連續3天；或(C) RNRi (吉西他濱) 10 mg/kg經腹膜內隔日一次 + KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次。CHK1i及RNRi二者與KRASi之組合均抑制小鼠中之腫瘤生長(參見圖23)。
亦利用相似條件重複實驗以測試利用WEE1i與KRASi之組合治療之效能。如上所述，小鼠植入KRAS抗性腫瘤細胞。當腫瘤達到約180 mm 3時，小鼠如下進行治療：(A) KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次、(B) WEE1i (阿達索替尼) 60 mg/kg經口每天一次、(C) WEE1i (阿達索替尼) 60 mg/kg經口每天一次 + KRASi (阿達格拉西布) 50 mg/kg經口每天一次，或(D) WEE1i (PD0166285) 0.3 mg/kg經腹膜內每天一次。WEE1i與KRASi之組合以及單獨的WEE1i阿達索替尼二者均抑制小鼠中之腫瘤生長，但利用阿達格拉西布及阿達索替尼觀察到最大抑制(參見圖45)。 實例 7 ： SNU16 細胞之活體外處理
藉由FISH分析中期SNU16細胞(人類胃未分化腺癌細胞系(ATCC))中MYC及FGFR2之存在。亦量化ecDNA。如圖24中所示，該等細胞中存在高含量之含有MYC及FGFR2之ecDNA，其中ecDNA之子集含有MYC及FGFR2二者。
將SNU16細胞用1 μM FGFR抑制劑(英菲格拉替尼)處理9週。在第3天、第14天、第28天、第42天、第56天及第63天收集DNA並實施qPCR以在每一時間點評估MYC、FGFR2及EGFR之複本數。亦藉由FISH分析英菲格拉替尼處理8週後之細胞及未經處理SNU16對照細胞之EGFR。如圖24中所示，由於細胞對FGFR抑制劑產生抗性(且因此在英菲格拉替尼中繼續存活)，故EGFR之複本數增加，而在開始SNU16細胞中已經擴增之MYC及FGFR2之複本數保持相對恆定。如在圖24中由FISH所示，EGFR擴增侷限於該等經處理細胞之ecDNA。
為評估在英菲格拉替尼抗性之產生過程中之ecDNA複本數動態，使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提取DNA並經由定量PCR (qPCR)使用Taqman複本數分析(ThermoFisher)擴增DNA。EGFR Taqman分析ID係Hs00997424_cn；GFGR2分析ID係Hs05182482_cn；且MYC分析ID係Hs03660964_cn。循環臨限值正規化至內部RNase P Taqman分析，且使用ΔΔCt方法及來自二倍體對照細胞系DLD1之DNA來計算基因複本數。
為收集中期細胞用於螢光原位雜交(FISH)，遵循如Turner等人，2019中所闡述之基本方案。簡言之，將細胞與乙醯甲基秋水仙素(colcemid)一起培育至少3小時，隨後用氯化鉀低滲溶液處理，並使用Carnoy溶液(3:1甲醇:冰乙酸v/v)固定。將中期經固定細胞滴於潤濕載玻片上，隨後在升乙醇系列中去水。與EGFR、FGFR2及MYC雜交之FISH探針係自Empire Genomics購買。在探針雜交後，載玻片利用0.4X SSC/0.3% IGEPAL緩衝液清洗，隨後在2X SSC/0.1% IGEPAL中進行最後清洗。將含有DAPI之安裝介質施加至載玻片，添加蓋玻片，並使用Keyence BZ-X800顯微鏡以630X總放大倍數對中期細胞進行成像。
來自FISH分析之影像用於量化含有EGFR、FGFR2或MYC之ecDNA的數量。將影像上傳於Boundless Bio, Inc開發之ecSEG軟體中。 實例 8 ： RNRi 阻止 SNU16 細胞中原發性及繼發性抗性之產生
圖25顯示FGFR2利用英菲格拉替尼及ecDNA利用RNR抑制劑吉西他濱之同時抑制完全抑制對英菲格拉替尼之原發性抗性之產生。將2x10 6個SNU16細胞分成6組並利用1uM英菲格拉替尼、1uM厄洛替尼、10nM吉西他濱、1uM英菲格拉替尼+ 1uM厄洛替尼及1uM英菲格拉替尼+10nM吉西他濱處理並在12週內記錄細胞生長。一旦細胞數量達到5x10 6，便終止每一處理臂。厄洛替尼處理自身對細胞生長無效應。吉西他濱在前2週延遲細胞生長，但之後細胞繼續快速生長。英菲格拉替尼強烈抑制細胞生長達5週，此後細胞產生抗性並迅速生長。厄洛替尼及英菲格拉替尼之組合處理在前5週具有強生長抑制性效應，此後細胞開始產生抗性且其生長速率在研究之剩餘時間增加。然而，利用英菲格拉替尼及吉西他濱之組合處理在研究之整個持續時間完全抑制細胞生長且沒有細胞能夠產生抗性。
圖26顯示在SNU16細胞中，RNR抑制劑阻止對厄洛替尼之繼發性抗性之產生。將英菲格拉替尼抗性SNU16細胞(如圖25中所示生成)再分成六組且每一組1 × 10 6個細胞利用1uM英菲格拉替尼、1uM厄洛替尼、10nM吉西他濱或1uM厄洛替尼+10nM吉西他濱處理並在5週內記錄細胞生長。一旦細胞數量達到5 × 10 6，便終止每一處理臂。英菲格拉替尼處理自身對細胞生長無效應。吉西他濱以及厄洛替尼在前2週延遲細胞生長，但之後細胞繼續快速生長。厄洛替尼及英菲格拉替尼之組合處理在前3週具有中等生長抑制性效應，此後細胞開始產生抗性且其生長速率在研究之剩餘時間增加。然而，利用厄洛替尼及吉西他濱之組合處理在研究之整個持續時間完全抑制細胞生長且沒有細胞能夠產生抗性。
圖30顯示在SNU16細胞中，WEE1抑制劑阿達索替尼阻止英菲格拉替尼處理時之抗性形成。將SNU16細胞再分成五組且每一組1 × 10 6個細胞利用1 μM英菲格拉替尼、1 μM厄洛替尼、1 μM英菲格拉替尼及1 μM厄洛替尼、0.1 μM阿達索替尼處理並在9週內記錄細胞生長。英菲格拉替尼導致短暫生長抑制且厄洛替尼處理自身對細胞生長無效應。英菲格拉替尼及厄洛替尼之組合處理使細胞生長延遲約6週，但此後細胞繼續快速生長。然而，利用英菲格拉替尼及阿達索替尼之組合處理在研究之整個持續時間完全抑制細胞生長且沒有細胞能夠產生抗性。
圖34顯示PARG抑制劑PD00017273顯著延遲SNU16細胞中在英菲格拉替尼處理時之抗性形成。將SNU16細胞再分成五組且每一組1 × 10 6個細胞利用英菲格拉替尼、厄洛替尼、PD00017273、英菲格拉替尼與厄洛替尼、或英菲格拉替尼及PD00017273處理並在9週內記錄細胞生長。PD00017273及厄洛替尼單獨對細胞生長具有較少或沒有效應，而英菲格拉替尼展示短暫生長抑制大約3週。英菲格拉替尼及厄洛替尼之組合處理使細胞生長延遲約6週，但此後細胞繼續快速生長。然而，利用英菲格拉替尼及PD00017273之組合處理減少細胞生長且使其在在研究之持續時間內保持低程度。
方法：將SNU16對照細胞在標準組織培養條件下在37℃及5% CO 2下在具有10% FBS之RPMI-1640培養基中培養。低傳代對照細胞用1 μM英菲格拉替尼處理9週之時期。使細胞按需傳代且培養基及英菲格拉替尼至少每週更換一次。在第3天及第2週、第4週、第6週、第8週及第9週收集DNA。在8週時自對照及英菲格拉替尼抗性細胞二者收集中期細胞。
SNU16 (CRL-5974)細胞系係自ATCC購買。使SNU16細胞在具有10% FBS及100U/ml青黴素/鏈黴素(Fisher Scientific)之RPMI 1640培養基(Fisher Scientific)中生長。對於抗性實驗，將SNU16細胞以每T75燒瓶2百萬個鋪板並利用1 µM英菲格拉替尼(Selleck Chemicals)、1 µM厄洛替尼(Selleck Chemicals)、10 nM吉西他濱(Sigma Aldrich)或組合進行處理。每週至少一次更換培養基並添加新鮮藥物。在數週之跨度內對細胞進行計數以量測細胞生長。 實例 9 ：在 HeLa ecDNA+ 相對於 HeLa ecDNA- Kinome CRISPR 篩選中之 WEE1 嚮導丟失
圖33顯示在合併之CRISPR篩選中HeLa ecDNA+細胞對WEE1剔除之敏感性增加超過HeLa ecDNA-細胞。針對HeLa ecDNA-細胞(WT)以及在ecDNA上含有經擴增DHFR之HeLa ecDNA+細胞，顯示靶向WEE1之10個不同嚮導之經正規化sgRNA嚮導丟失評分之位準。使HeLa ecDNA+在不存在(-MTX)或存在(+MTX) 1uM胺甲喋呤之情形中生長CRISPR篩選之持續時間。在第7天、第14天及第21天藉由NGS定序確定所有三個臂相對於合併嚮導庫內原始位準之嚮導丟失評分。水平虛線表示eccDNA+細胞系與ecDNA-細胞系中最有效WEE1嚮導之差異丟失評分，此指示ecDNA+細胞系對WEE1剔除之敏感性更高，進一步支持該等細胞對複製壓力誘導物之敏感性增加。 實例 10 ：在 ecDNA+ 細胞中基礎複製壓力標幟物升高且對 RS 誘導物之敏感性增加
圖38顯示ecDNA+細胞具有升高之基礎複製壓力位準。為測定固有單鏈DNA (ssDNA)損壞誘導之複製壓力，在未經處理及固定之ecDNA+ (Colo320 DM)及ecDNA- (Colo320 HSR)細胞系模型中藉由免疫螢光檢測高度磷酸化形式之複製蛋白A (RPA) 32 Ser4/Ser8。代表性盒鬚圖指示在ecDNA+及ecDNA-細胞中藉由免疫螢光所檢測之總p-RPA32 S4/S8灶之細胞量化% (最小臨限值＞3個斑點/細胞)。所處理並分析之具有＞3個斑點/細胞之總數為5000個ecDNA-及6000個ecDNA+細胞。使用非參數t測試計算統計學顯著性。發現ecDNA+細胞具有升高之基礎複製壓力。
圖39A-39B顯示相對於在染色體上具有可比的MYC基因擴增之ecDNA-細胞，ecDNA+細胞具有固有地降低之DNA複製叉速度。在圖39A，為分析複製束(包括叉速度之量測)，在未經處理之ecDNA+ (Colo320 DM)及ecDNA- (Colo320 HSR)細胞系模型中實施DNA纖維分析。兩個細胞模型各自用胸苷類似物氯去氧尿苷(CldU)及碘去氧尿苷(IdU)脈衝標記30 min。將細胞裂解，使DNA纖維展開並使用針對CldU及IdU之特異性抗體進行免疫染色。如圖39B中所示，與Colo320 HSR ecDNA-細胞相比，帶有Colo320 DM之ecDNA圖解說明平均降低之叉速度。在ecDNA+與ecDNA-細胞之間觀察到-0.18 kb/min之複製叉速度差異。使用非參數克默果夫-史密諾夫測試(Kolmogorov–Smirnov test)計算統計顯著性。
圖40A-40C顯示RNR之抑制阻斷核苷酸合成，與ecDNA-腫瘤細胞相比，此在ecDNA+腫瘤細胞中造成增強之複製壓力及減少之細胞轉變。如所展示，在ecDNA+ COLO320-DM細胞中RNR受抑制時觀察到之加劇複製壓力導致圖40A中細胞增殖/轉變之改變。圖40B中所示之資料顯示攜帶經擴增致癌基因之ecDNA之計數變化的代表性FISH影像及量化。圖40C中所示之資料展現RNRi對複製壓力之效應係核苷酸耗盡之結果。在圖40A中，為評估細胞轉變，實施活體外軟瓊脂群落形成分析，其中使具有COLO320-DM及SNU16之ecDNA細胞模型連同ecDNA-細胞模型COLO320-HSR及DLD1在3D格式分析中生長21天。細胞僅個別地在細胞接種之日以增加劑量之RNRi(即，(5-氯-2-[[rac-(1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基-苯基)-1-(2-側氧基-3H-1,3,4-噁二唑-5-基)丙基]胺磺醯基]苯甲醯胺))處理一次。在圖40B中，為確定攜帶MYC經擴增致癌基因之ecDNA的計數變化，將ecDNA+(COLO320-DM)細胞利用IC-90劑量(10uM)之RNRi處理21天。使對數生長期之細胞在中期停滯。在經固定中期塗抹物上實施MYC致癌基因之FISH (螢光原位雜交)並利用DAPI對細胞核進行複染。在圖40C中，為確定在ecDNA+ COLO320-DM細胞中RNR受抑制時所觀察到之加劇複製壓力是否係由於耗盡之細胞核苷酸池，將ecDNA+ COLO320-DM細胞利用IC-70劑量(7uM)之RNRi及增加劑量之外源性核苷(ATGUC)同時處理16hr。將細胞裂解並利用pRPA32-S33抗體作為ssDNA損傷誘導之複製壓力之標幟物進行免疫墨點分析。發現RNR之抑制阻斷核苷酸合成，與ecDNA(-)腫瘤細胞相比，此在ecDNA+腫瘤細胞中造成增強之複製壓力及減少之細胞轉變。
圖41A-41B顯示ecDNA+細胞在多個模型中因應CHK1i展現增強之複製壓力。如圖41A中所示，HeLa ecDNA+細胞顯示對GDC0575之Chk1抑制之敏感性增加超過HeLa ecDNA-細胞。HeLa ecDNA+細胞中之DHFR蛋白質含量顯著上調，該等細胞含有DHFR ecDNA且係在1uM胺甲喋呤(MTX)之存在下生長以維持抗性(MTX-R)。當利用200nM GDC0575處理24h時，HeLa ecDNA+細胞展現遠強於ecDNA-細胞之RS標幟物之誘導及DNA損傷。S345處增加之Chk1磷酸化指示RS活化之ATR激酶之更高活化程度，而增加之gH2AX指示由複製壓力觸發之DNA雙鏈斷裂造成之損傷增加。圖41B顯示確定在CHK1途徑受抑制時單鏈DNA (ssDNA)損傷誘導之複製壓力之實驗。在已預先利用CHK1i GDC-0575處理16 hr之經固定ecDNA+ (Colo320 DM)及ecDNA- (Colo320 HSR)細胞系模型中藉由免疫螢光檢測高度磷酸化形式之複製蛋白A (RPA) 32 Ser4/Ser8。代表性條形圖表示在ecDNA+及ecDNA-細胞中藉由免疫螢光所檢測P-RPA32 S4/S8灶陽性之總細胞核%(最小臨限值＞3個斑點/細胞核)。與匹配之ecDNA- (HSR)細胞相比，發現CHK1抑制使ecDNA+ (DM)細胞中之pRPA含量增加。
圖42A-42B顯示相對於ecDNA(-)細胞，ecDNA(+)癌細胞中之固有複製叉功能障礙進一步因RNR抑制而受損。為分析RNR路徑受抑制時之複製束(包括叉速度之量測)，在利用RNRi吉西他濱處理16 hr之ecDNA+ (Colo320 DM)及ecDNA- (Colo320 HSR)細胞系模型中實施DNA纖維分析。然後將兩個細胞模型各自用胸苷類似物氯去氧尿苷(CldU)及碘去氧尿苷(IdU)脈衝標記30 min (圖42A)。將細胞裂解，使DNA纖維展開並使用針對CldU及IdU之特異性抗體進行免疫染色。如圖42B中所示，儘管在利用RNRi處理時在Colo320 HSR ecDNA-細胞中亦觀察到複製叉速度之降低，但相對於ecDNA-細胞，ecDNA+癌細胞中之固有複製叉功能障礙在RNR抑制時進一步受損。在利用RNRi處理之ecDNA+與ecDNA-細胞之間觀察到-0.13 kb/min之複製叉速度差異。使用非參數克默果夫-史密諾夫測試計算統計顯著性。
圖43A-43B顯示相對於ecDNA-細胞，ecDNA+癌細胞中之固有複製叉功能障礙進一步因CHK1抑制而受損。為分析CHK1路徑受抑制時之複製束(包括叉速度之量測)，在利用CHK1i普瑞色替處理16 hr之ecDNA+ (Colo320 DM)及ecDNA- (Colo320 HSR)細胞系模型中實施DNA纖維分析。然後將兩個細胞模型各自用胸苷類似物氯去氧尿苷(CldU)及碘去氧尿苷(IdU)脈衝標記30 min (圖43A)。將細胞裂解，使DNA纖維展開並使用針對CldU及IdU之特異性抗體進行免疫染色。如圖43B中所示，儘管在利用CHK1i處理時在Colo320 HSR ecDNA-細胞中亦觀察到複製叉速度之降低，但相對於ecDNA(-)細胞，ecDNA(+)癌細胞中之固有複製叉功能障礙在CHK1抑制時進一步受損。在利用CHK1i處理之ecDNA+與ecDNA-細胞之間觀察到-0.1 kb/min之複製叉速度差異。使用非參數克默果夫-史密諾夫測試計算統計顯著性。
圖44顯示在癌細胞中使用藥理學抑制原發致癌驅動子之靶向療法導致RNR之RRM2亞單元之蛋白質含量降低。四個細胞系顯示先前已確定在ecDNA或HSR上含有經擴增之致癌基因或缺乏擴增(CT26)。致癌蛋白之抑制導致RRM2蛋白含量在24-48小時內迅速降低，此表明該等抑制劑可間接導致dNTP含量之降低及複製壓力之誘導。與此假設一致，分別在H2170及SNU16細胞中抑制ecDNA經擴增之HER2及FGFR2顯示gH2AX (崩塌複製叉及DNA損傷之已知標幟物)之伴隨增加。有趣地，含有FGFR2擴增作為HSR之KATOIII細胞及不含有任何致癌基因擴增之CT26細胞儘管RRM2含量降低，但並未顯示gH2AX之增加，此進一步支持攜帶ecDNA之細胞對RRM2含量之降低及複製壓力特別敏感。另外，SNU16細胞中RRM2含量之此降低顯示維持5-6週之延長時期，此表明缺乏維持RNR活性之補償機制。該等發現有力地加強在攜帶ecDNA之癌症中將靶向療法與RS誘導劑結合之理論基礎。 實例 11 ： ecDNA+ 對 ecDNA- 細胞中對靶向療法之抗性
表2 (下文)顯示ecDNA+對ecDNA-細胞中抗性產生之時間線。為量測隨時間之生長動力學，每一細胞系每週一次或兩次利用針對經擴增致癌基因之靶向抑制劑進行處理。在SKBR3及Calu-3之情形中，厄比替尼(irbinitinib)隨時間而增加，自2x相對EC50開始且然後增加至4x相對EC50，總持續時間為6週。在H2170之情形中，厄比替尼係在前期以EC90 (500nM)使用並監測細胞生長3週，此時細胞以與DMSO對照細胞相似之速率度生長。在SNU16及KATOIII之情形中，英菲格拉替尼係以EC90 (1uM)使用並分別監測細胞生長6及11週。
對於該等長期生長曲線，靶向療法之EC50係首先在短期5天生存率分析中測定。為測定厄比替尼之EC50，將H2170細胞以3000個細胞/孔鋪板於96孔板中；將SKBR3及Calu-3細胞以3500個細胞/孔鋪板於96孔板中。所有細胞連同DMSO對照一起均連續給予厄比替尼達5天(在12nM至1uM範圍內之連續稀釋)。EC50曲線係基於細胞生存率使用CellTiter-Glo 2.0試劑(Promega)測定。為測定英菲格拉替尼之EC50，將SNU16及KATOIII細胞以1000個細胞/孔鋪板於96孔板中並連同DMSO對照一起利用英菲格拉替尼連續處理5天(在4nM至1uM範圍內之連續稀釋)。EC50曲線係基於細胞生存率使用CellTiter-Glo 2.0試劑(Promega)測定。針對驅動子致癌基因之靶向療法端視致癌基因擴增之類型顯示不同效應。在ecDNA上含有致癌基因擴增之細胞系(例如H2170及SNU16)所展現之獲得抗性並在靶向療法之存在下繼續生長之能力明顯好於含有染色體致癌基因擴增之細胞系(例如SKBR3、Calu-3及KATOIII)(表2)。
表2：靶向療法效應
腫瘤細胞系 擴增 擴增類型 藥物處理 3-5天急性細胞毒性EC50 (μM) 長期培養生長性質
H2170 ERBB2 ecDNA 厄比替尼 0.110 增加之增殖 ＜ 3週
SKBR3 ERBB2 染色體 厄比替尼 0.043 ＜ 1%生存率＞ 6週
Calu3 ERBB2 染色體 厄比替尼 0.414 減少之增殖(50%)，＞ 6週
SNU16 FGF2 ecDNA 英菲格拉替尼 0.014 接近正常之增殖＜ 5週
KATOIII FGF2 染色體 英菲格拉替尼 0.013 ＜1 生存率＞ 10週
儘管本文已顯示並闡述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將瞭解，此等實施例僅作為實例來提供。熟習此項技術者可在不背離本發明之情況下構想出許多變化、改變及替代。應瞭解，可採用本文所述實施例之各種替代形式。以下申請專利範圍意欲界定本發明之範圍並由此涵蓋該等申請專利範圍及其等效內容範圍內之方法及結構。
本專利或申請案檔案含有至少一個有色圖式。在要求並支付必要費用之後專利事務局可提供本專利或專利申請公開案帶彩圖之複本。
參考闡釋其中利用本發明原理之說明性實施例之下文詳細描述及其附圖將會理解本發明之特徵及優點，在附圖中：
圖1顯示ecDNA藉由改變致癌基因依賴性使癌細胞能夠抵抗治療壓力且此可藉由使用吉西他濱及另一治療劑與RNR抑制之組合治療來克服。
圖2顯示在結腸直腸癌(CRC)模型中對利用選擇性KRAS G12C抑制劑阿達格拉西布(adagrasib)之治療的快速臨床前抗性(活體外及活體內)強烈與ecDNA相關。
圖3顯示核糖核苷酸還原酶(RNR)及CHK1在複製壓力反應中之功能。
圖4顯示ecDNA驅動之腫瘤細胞對RNR或CHK1之抑制更敏感。
圖5顯示在3D群落形成分析中ecDNA陽性(ecDNA(+))對ecDNA陰性(ecDNA(-))同類群組對RNR使用吉西他濱之抑制之差異敏感性。
圖6顯示在模型分析中HeLa胺甲喋呤抗性(MTX-R) ecDNA。
圖7顯示在HeLa MTX-R模型中之CHK1靶標驗證。
圖8顯示ecDNA介導對靶向療法之重要及臨床獨特之抗性機制。
圖9顯示親代HeLa細胞(左側面板)、MTX-R HeLa細胞(右側面板)之螢光原位雜交(FISH)影像。
圖10圖解說明使用條碼及單細胞RNAseq用於闡明預先存在對重新產生之ecDNA介導之抗性機制的研究。
圖11圖解說明使用條碼與產生胺甲喋呤抗性之複製群體以闡明預先存在對重新產生之ecDNA介導之抗性的研究。
圖12顯示結構不同之RNR抑制劑誘導Colo320系統中與ecDNA及相對敏感性相關之複製壓力標幟物。
圖13顯示ecDNA+細胞較ecDNA-細胞對CHK1抑制劑(CHK1i)更敏感。
圖14顯示對CHK1抑制劑之ecDNA依賴敏感性之分析及腫瘤細胞模型。
圖15顯示在利用各種藥劑治療之小鼠中KRAS抑制劑(KRASi)抗性腫瘤之生長。
圖16顯示在利用各種藥劑治療之小鼠中之ecDNA。
圖17顯示在利用各種藥劑治療之小鼠中之腫瘤生長。
圖18顯示利用各種藥劑治療之小鼠中之無事件存活。
圖19顯示在利用各種藥劑治療之小鼠中來自腫瘤之細胞中的ecDNA計數。
圖20顯示提供抗性腫瘤細胞之離體繁殖之KRAS ecDNA。
圖21顯示藉由KRASi阿達格拉西布及藉由阿達格拉西布及RNRi吉西他濱之組合抑制小鼠中之腫瘤生長。
圖22顯示藉由RNRi吉西他濱及KRASi阿達格拉西布抑制小鼠中之腫瘤生長。
圖23顯示藉由RNRi吉西他濱、及KRASi阿達格拉西布及CHK1i普瑞色替抑制小鼠中之腫瘤生長。
圖24顯示對英菲格拉替尼有抗性之SNU16細胞之生長及其中之ecDNA含量。
圖25顯示FGFR2 ecDNA驅動之SNU16細胞在各種藥劑之存在下之生長。
圖26顯示EGFR ecDNA驅動之SNU16細胞在各種藥劑之存在下之生長。
圖27顯示ecDNA+及ecDNA-細胞系對WEE1抑制之敏感性。
圖28顯示阿達索替尼(adavosertib)消除ecDNA+細胞中之胺甲喋呤抗性。
圖29顯示PD0166285消除ecDNA+細胞中之胺甲喋呤抗性。
圖30顯示阿達索替尼防止SNU16細胞中英菲格拉替尼治療之抗性。
圖31顯示ecDNA+細胞對WEE1抑制之敏感性。
圖32顯示WEE1抑制防止胺甲喋呤抗性。
圖33顯示HeLa ecDNA+及HeLa ecDNA-細胞對WEE1剔除之敏感性的比較。
圖34顯示PARG抑制延遲SNU16細胞對英菲格拉替尼治療之抗性形成。
圖35顯示PARG抑制防止胺甲喋呤抗性。
圖36顯示ecDNA+及ecDNA-細胞系對ATR抑制之敏感性。
圖37顯示ATR抑制防止胺甲喋呤抗性。
圖38顯示ecDNA+細胞之複製壓力。
圖39A顯示ecDNA+及ecDNA-細胞之複製叉速度。
圖39B顯示ecDNA+及ecDNA-細胞之複製叉速度。
圖40A-40C顯示RNR之抑制阻斷核苷酸合成，與ecDNA-腫瘤細胞相比，此在ecDNA+腫瘤細胞中增強複製壓力並減少細胞轉變。 圖 40A顯示RNR抑制改變細胞增殖/轉變。 圖 40B顯示量化攜帶經擴增致癌基因之ecDNA之計數變化的FISH影像。 圖 40C顯示RNR之抑制導致阻斷之核苷酸合成及增強之複製壓力。
圖41A-41B顯示ecDNA+細胞因應CHK1i具有增加之複製壓力。 圖 41A顯示ecDNA+細胞與ecDNA-細胞相比對CHK1抑制之增加之敏感性。 圖 41B顯示因CHK1路徑抑制所致之ssDNA損傷誘導之複製壓力。
圖42A-42B顯示與ecDNA-細胞相比，在ecDNA+癌細胞中因RNR路徑抑制所致之複製叉功能障礙增加。 圖 42A顯示利用RNR抑制劑處理之ecDNA+及ecDNA-細胞之DNA纖維分析。 圖 42B顯示利用RNR抑制劑處理之ecDNA+及ecDNA-細胞中之複製叉速度。
圖43A-43B顯示與ecDNA-細胞相比，在ecDNA+細胞中利用CHK1抑制增加複製叉功能障礙。 圖 43B顯示利用CHK1抑制劑處理之ecDNA+及ecDNA-細胞之DNA纖維分析。 圖 42B顯示利用CHK1抑制劑處理之ecDNA+及ecDNA-細胞之複製叉速度。
圖44顯示在利用致癌蛋白抑制劑治療之細胞中RRM2之降低蛋白質含量。
圖45顯示藉由WEE1i阿達索替尼或PD0166285；KRASi阿達格拉西布及組合抑制小鼠中之腫瘤生長。

Claims (57)

  1. 一種治療受試者之腫瘤或腫瘤細胞之方法，該方法包含： 以足以誘導該等腫瘤或腫瘤細胞中之複製壓力之量投與複製壓力路徑劑(RSPA)；及 投與癌症靶向治療劑， 其中該等腫瘤或腫瘤細胞具有ecDNA印記，且 其中該腫瘤之生長或大小或腫瘤細胞之生長或數量減少。
  2. 如請求項1之方法，其中該ecDNA印記選自由以下組成之群：基因擴增；p53功能缺失突變；缺乏微衛星不穩定性(MSI-H)；低度之PD-L1表現；低度之腫瘤發炎印記(TIS)；低度之腫瘤突變負荷(TMB)；等位基因取代、插入、或缺失(插入或缺失(indel))之頻率增加；及其任何組合。
  3. 如請求項2之方法，其中該基因擴增包含致癌基因、抗藥性基因、治療靶標基因或檢查點抑制劑基因之擴增。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該癌症靶向治療劑針對靶標基因之蛋白質產物之活性，且其中利用該癌症靶向治療劑及該RSPA之治療減少該靶標基因在該等腫瘤或腫瘤細胞中之擴增或表現。
  5. 如請求項4之方法，其中利用該癌症靶向治療劑及該RSPA進行治療使該靶標基因在該等腫瘤或腫瘤細胞中之擴增或表現減少達至少約1週、至少約2週、至少約1個月、至少約6週、至少約2個月、至少約4個月或至少約6個月。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該癌症靶向治療劑係在該RSPA之前投與。
  7. 如請求項5之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞係在投與該癌症靶向治療劑之後產生該ecDNA印記。
  8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該癌症靶向治療劑係與該RSPA同時投與。
  9. 如請求項8之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞係在治療前產生該ecDNA印記。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該方法防止該等腫瘤或腫瘤細胞中ecDNA之增加。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該癌症靶向治療劑靶向致癌基因之蛋白質產物。
  12. 如請求項11之方法，其中該致癌基因包含點突變、插入、缺失、融合或其組合。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該癌症靶向治療劑靶向選自由以下組成之群之基因：ABCB1、AKT、ALK、AR、BCL-2、BCR-ABL、BRAF、CDK4、CDK6、c-MET、EGFR、ER、ERBB3、ERRB2、FAK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GR、HRAS、IGF1R、KIT、KRAS、MCL-1、MDM2、MDM4、MTOR、MYC、MYCL、MYCN、NRAS、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFR、PIK3CA/B、PIK3Cδ、RET及ROS1。
  14. 如請求項1或2之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞包含第一基因或其部分之擴增。
  15. 如請求項14之方法，其中該第一基因係致癌基因或抗藥性基因。
  16. 如請求項14或15之方法，其中該擴增出現在ecDNA上。
  17. 如請求項14至16中任一項之方法，其中該第一基因選自由以下組成之群：ABCB1、AKT、ALK、AR、BCL-2、BCR-ABL、BRAF、CDK4、CDK6、c-MET、EGFR、ER、ERBB3、ERRB2、FAK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GR、HRAS、IGF1R、KIT、KRAS、MCL-1、MDM2、MDM4、MTOR、MYC、MYCL、MYCN、NRAS、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFR、PIK3CA/B、PIK3Cδ、RET及ROS1。
  18. 如請求項14至17中任一項之方法，其中該癌症靶向治療劑係針對該第一基因。
  19. 如請求項14至18中任一項之方法，其中該受試者先前未利用該癌症靶向治療劑進行治療。
  20. 如請求項14至18中任一項之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞先前未利用該癌症靶向治療劑進行治療。
  21. 如請求項14至20中任一項之方法，其中該方法防止該等腫瘤或腫瘤細胞中ecDNA之增加。
  22. 如請求項14至17中任一項之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞在利用該癌症靶向治療劑及該RSPA治療之前對先前治療劑有抗性或無反應性。
  23. 如請求項22之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞先前已利用該先前治療劑進行治療。
  24. 如請求項22之方法，其中該受試者先前已利用該先前治療劑進行治療。
  25. 如請求項22至24中任一項之方法，其中該癌症靶向治療劑針對靶標基因之蛋白質產物之活性，且其中利用該癌症靶向治療劑及該RSPA之治療可減少該靶標基因在該等腫瘤或腫瘤細胞中之擴增或表現。
  26. 如請求項25之方法，其中該靶標基因係致癌基因、抗藥性基因、治療靶標基因或檢查點抑制劑基因。
  27. 如請求項26之方法，其中該靶標基因選自由以下組成之群：ABCB1、AKT、ALK、AR、BCL-2、BCR-ABL、BRAF、CDK4、CDK6、c-MET、EGFR、ER、ERBB3、ERRB2、FAK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GR、HRAS、IGF1R、KIT、KRAS、MCL-1、MDM2、MDM4、MTOR、MYC、MYCL、MYCN、NRAS、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFR、PIK3CA/B、PIK3Cδ、RET及ROS1。
  28. 如請求項1至27中任一項之方法，其中該ecDNA印記係在開始治療該等腫瘤或腫瘤細胞之前得知。
  29. 如請求項1至27中任一項之方法，其中該ecDNA印記係在開始治療該等腫瘤或腫瘤細胞之後得知。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中與在不存在該RSPA之情形下利用該癌症靶向治療劑之治療相比，該方法改良客觀反應率及/或延長治療反應之持續時間。
  31. 如請求項1至29中任一項之方法，其中與在不存在該RSPA之情形下利用該癌症靶向治療劑之治療相比，該方法延長無惡化存活期。
  32. 一種治療ecDNA相關腫瘤或腫瘤細胞之方法，其包含： 將RSPA及癌症靶向治療劑投與鑑別為具有帶有ecDNA之腫瘤或腫瘤細胞之受試者， 其中該腫瘤之生長或大小或該等腫瘤細胞之生長或數量因治療而減小。
  33. 如請求項32之方法，其中該受試者之該等腫瘤或腫瘤細胞鑑別為具有ecDNA印記。
  34. 如請求項33之方法，其中該ecDNA印記選自由以下組成之群：基因擴增；p53功能缺失突變；缺乏微衛星不穩定性(MSI-H)；低度之PD-L1表現；低度之腫瘤發炎印記(TIS)；低度之腫瘤突變負荷(TMB)；等位基因取代、插入、或缺失(插入或缺失(indel))之頻率增加；及其任何組合。
  35. 如請求項34之方法，其中該基因擴增包含致癌基因、抗藥性基因、治療靶標基因或檢查點抑制劑基因之擴增。
  36. 如請求項32之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞藉由使細胞中之ecDNA成像、使用致癌基因結合劑檢測ecDNA或藉由DNA定序鑑別為具有ecDNA。
  37. 如請求項32之方法，其中在循環腫瘤DNA中鑑別出ecDNA。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞由實體腫瘤組成。
  39. 如請求項38之方法，其中該實體腫瘤中存在之ecDNA因治療而減少或消失。
  40. 如請求項38之方法，其中與治療前ecDNA之含量相比，該實體腫瘤中ecDNA之含量在治療後減少。
  41. 如請求項38之方法，其中與治療前該實體腫瘤中致癌基因擴增之程度及/或複本數變異(CNV)之程度相比，該實體腫瘤中致癌基因擴增之程度及/或CNV之程度在治療後減少。
  42. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該等腫瘤或腫瘤細胞包括循環腫瘤細胞。
  43. 如請求項42之方法，其中該等循環腫瘤細胞中存在之ecDNA因治療而減少或消失。
  44. 如請求項42之方法，其中與治療前ecDNA之含量相比，該等循環腫瘤細胞中ecDNA之含量在治療後減少。
  45. 如請求項42之方法，其中與治療前該等循環腫瘤細胞中致癌基因擴增之程度及/或複本數變異(CNV)之程度相比，該等循環腫瘤細胞中致癌基因擴增之程度及/或CNV之程度在治療後減少。
  46. 如請求項39至45中任一項之方法，其中在循環腫瘤DNA中鑑別出ecDNA之存在或含量。
  47. 如請求項1至46中任一項之方法，其中該RSPA選自由以下組成之群：RNR抑制劑、ATR抑制劑、CHK1抑制劑、WEE1抑制劑及PARG抑制劑。
  48. 如請求項47之方法，其中該RNR抑制劑選自由以下組成之群：吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、曲阿平(triapine)、5-氯-2-(n-((1S,2R)-2-(6-氟-2,3-二甲基苯基)-1-(5-側氧基-4,5-二氫-1,3,4-噁二唑-2-基)丙基)胺磺醯基)苯甲醯胺、氯法拉濱(clofarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、莫特沙芬釓(motexafin gadolinium)、克拉屈濱(cladribine)、替紮他濱(tezacitabine)及COH29 (N-[4-(3,4-二羥基苯基)-5-苯基-1,3-噻唑-2-基]-3,4-二羥基苯甲醯胺)。
  49. 如請求項47之方法，其中該CHK1抑制劑選自由以下組成之群：GDC-0575、普瑞色替(prexasertib)、LY-2880070、SRA737、XCCS-605B、雷布色替(rabusertib) (LY-2603618)、SCH-900776、RG-7602、AZD-7762、PF-477736及BEBT-260。
  50. 如請求項47之方法，其中該WEE1抑制劑選自由以下組成之群：AZD1775 (MK1775)、ZN-c3、Debio 0123、IMP7068、SDR-7995、SDR-7778、NUV-569、PD0166285、PD0407824、SC-0191、DC-859/A、伯舒替尼(bosutinib)及Bos-I。
  51. 如請求項47之方法，其中該ATR抑制劑選自由以下組成之群：RP-3500、M-6620、柏唑色替(berzosertib) (M-6620、VX-970；VE-822)、AZZ-6738、AZ-20、M-4344 (VX-803)、BAY-1895344、M-1774、IMP-9064、nLs-BG-129、SC-0245、BKT-300、ART-0380、ATRN-119、ATRN-212、NU-6027。
  52. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該癌症靶向治療劑選自由以下組成之群：阿貝西利(abemaciclib)、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine)、阿法替尼(afatinib)、阿雷替尼(alectinib)、ALRN-6924、AMG232、AMG-510、阿帕替尼(apatinib)、ARS-3248、AXL1717、貝伐珠單抗(bevacizumab)、硼替佐米(bortezomib)、布加替尼(brigatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡馬替尼(capmatinib)、色瑞替尼(ceritinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、CGM097、克唑替尼(crizotinib)、達拉菲尼(dabrafenib)、達克替尼(dacomitinib)、達沙替尼(dasatinib)、DS-3032b、恩考芬尼(encorafenib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄達替尼(erdafitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、依維莫司(everolimus)、fam-曲妥珠單抗德魯替康(fam-trastuzumab deruxtecan)、芬妥木單抗(figitumumab)、吉非替尼(gefitinib)、棉子酚、HDM201、伊達那林(idasanutlin)、伊馬替尼(imatinib)、英菲格拉替尼(infigratinib)、伊尼帕利(iniparib)、拉帕替尼(lapatinib)、拉羅替尼(larotrectinib)、LEE011、樂伐替尼(lenvatinib)、LGX818、勞拉替尼(lorlatinib)、MEK162、MK-8242 SCH 900242、MRTX849、納維托克(navitoclax)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼羅替尼(nilotinib)、奧巴克拉(obatoclax)、奧拉帕尼(olaparib)、OSI-906、奧希替尼(osimertinib)、帕博西尼(palbociclib)、帕尼單抗(panitumumab)、PD-0332991、派瑞索菲(perisofine)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、PL225B、瑞波替尼(repotrectinib)、瑞博西尼(ribociclib)、RO5045337、沙利黴素(salinomycin)、沙利雷塞(salirasib)、SAR405838 MI-77301、索拉菲尼(sorafenib)、索托拉西(sotorasib)、舒尼替尼(sunitinib)、他莫昔芬(tamoxifen)、替西羅莫司(temsirolimus)、替吡法尼(tipifarnib)、替維替尼(tivantinib)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、妥卡替尼(tucatinib)、UPR1376、VAL-083、威羅菲尼(vemurafenib)、長春福肽(vintafolide)及佐帕他林多柔比星(zoptarelin doxorubicin)。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其中該RSPA係RNR抑制劑且該RSPA係以相對低於其作為單一藥劑推薦使用時之醫療劑量投與。
  54. 如請求項53之方法，其中該RNR抑制劑係吉西他濱。
  55. 如請求項53之方法，其中該RNR抑制劑不為吉西他濱或羥基脲。
  56. 如請求項1至53中任一項之方法，其中該RSPA不為吉西他濱。
  57. 如請求項56之方法，其中當該癌症靶向治療劑係EGFR抑制劑時，該RSPA不為吉西他濱。
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