TW202221035A

TW202221035A - 抗ilt2抗體及其用途

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Publication number: TW202221035A
Application number: TW110129661A
Authority: TW
Inventors: 依萊娜曼朵; 楚里沛瑞茲; 達娜海維斯力芙; 伊萊娜戈德席汀; 多爾阿里錫科米茲; 多爾安娜弗里德曼; 莫堤哈金; 阿維多舒爾曼; 耶爾沙皮爾; 莫錫戴希拉班
Original assignee: 以色列商拜恩德生物製品有限公司
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2022-06-01
Also published as: US20220048991A1; WO2022034524A2; CO2023002375A2; KR20230058074A; EP4196227A2; IL300588A; AU2021325430A1; CA3190634A1; JP2023537396A; WO2022034524A3; US12071479B2; BR112023002301A2; CN116096756A; MX2023001776A

Abstract

本文提供單株抗ILT2抗體或其抗原結合片段，以及包含所述單株抗ILT2抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物和產生所述單株抗ILT2抗體或其抗原結合片段的方法。還提供使用本文的抗體或組成物治療癌症的方法。還提供患者選擇方法。

Description

抗ILT2抗體及其用途

本發明所屬領域為單株抗體以及調節針對癌症的免疫反應。相關申請的交叉引用

本申請要求以下申請的優先權：2020年8月12日提交的PCT專利申請PCT/IL2020/050889；2021年2月4日提交的美國臨時專利申請63/145,604；以及2021年2月15日提交的美國臨時專利申請63/149,371。那些優先權申請案的揭露內容通過引用以其整體併入本文。序列表

本申請含有已經以ASCII格式電子提交並通過引用以其整體特此併入的序列表。2021年8月10日創建的序列表的電子副本命名為022548_TW091_SL.txt並且大小為105,080位元組。

免疫球蛋白樣轉錄物2（Immunoglobulin-like transcript 2，ILT2）也稱為白細胞免疫球蛋白樣受體超家族B成員1（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1，LILRB1）、LIR1和CD85j，它是在免疫細胞上表現的細胞表面蛋白，並且已知其可抑制免疫反應。所述蛋白質含有細胞外區域中的4個IgC結構域和4個細胞內ITIM結構域。它是ILT家族的成員，所述家族由ILT1、ILT2、ILT3和ILT4構成。ILT2與ILT4最相似，具有約80%同源性。ILT2的已知配體包括I型MHC以及非經典MHC分子，如HLA-F、HLA-G、HLA-B27和UL18（人CMV）。人體中ILT2的已知最強相互作用物是HLA-G1。

HLA-G1在多種癌細胞的表面上廣泛表現，所述癌細胞包括乳腺癌、子宮頸癌、CRC（結直腸癌）、肺癌、胃癌、胰腺癌、甲狀腺癌和卵巢癌細胞，以及膠質母細胞瘤多形性細胞和黑色素瘤細胞。其表現與較差臨床結局相關。此外，腫瘤微環境中免疫細胞上的ILT2表現與對溶瘤免疫療法的較差臨床反應相關，即使在不存在HLA-G1時。利用免疫反應作為抵抗癌症的武器和用於癌症監督是一種用於癌症預防和治療的有前景的方式。然而，ILT2表現為有效免疫療法的障礙。非常需要可以避開ILT2-HLA-G1軸以及ILT2的非HLA-G1依賴性功能的治療方式。

本文提供與ILT2結合並抑制ILT2介導的免疫抑制的單株抗體，以及包含所述單株抗體的醫藥組成物。還提供包括投予本文所述的組成物的治療癌症的方法，產生本文所述的抗體、抗原結合片段和組成物的方法，以及增加基於PD-1/PD-L1的療法的功效的方法。

根據一態樣，提供一種單株抗體或抗原結合片段，其與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的人類免疫球蛋白樣受體超家族B成員1（ILT2）的序列結合。

根據一些實施例，所述序列選自SEQ ID NO: 68至70。

根據一些實施例，所述序列是SEQ ID NO: 71或72。

根據一些實施例，所述抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 71和72結合。

根據一些實施例，本文的抗體或抗原結合片段結合ILT2並抑制ILT2與β-2-微球蛋白（beta-2-microglobulin，B2M）之間的直接相互作用。

根據一些實施例，所述抗體或抗原結合片段通過抑制ILT2與B2M的直接相互作用來抑制ILT2與HLA蛋白或I型MHC蛋白的相互作用。

根據一些實施例，所述HLA是HLA-G。

根據一些實施例，所述抗體是IgG4抗體並且包含含有S228P和L235E突變（Eu編號）的人類IgG4抗體的重鏈恆定區。

根據一態樣，提供一種單株抗ILT2 IgG4抗體，其包含三個重鏈CDR（CDR-H1至3）和三個輕鏈CDR（CDR-L1至3），所述CDR分別地包含： a. SEQ ID NO: 13至18， b. 分別地，SEQ ID NO: 1至6，或者 c. 分別地，SEQ ID NO: 7至12，並且其中所述抗體包含人類IgG4抗體的重鏈恆定區，並且在所述重鏈恆定區中包含S228P和L235E突變中的一個或兩個（Eu編號）。

根據一些實施例，本文的抗體包含重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含選自SEQ ID NO: 19、21和23的胺基酸序列或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，本文的抗體包含輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含選自SEQ ID NO: 20、22、24和45的胺基酸序列或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，SEQ ID NO: 15中的X是A，並且所述重鏈包含選自SEQ ID NO: 28和56至59的可變結構域序列或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述輕鏈包含選自SEQ ID NO: 24和60至62的可變結構域序列或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述重鏈恆定區包含SEQ ID NO: 55或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述重鏈包含SEQ ID NO: 48或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述重鏈包含SEQ ID NO: 51或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述重鏈包含SEQ ID NO: 52或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述重鏈包含SEQ ID NO: 64或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 65或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 66或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述重鏈包含SEQ ID NO: 67或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一些實施例，所述重鏈包含SEQ ID NO: 53或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 54或與其至少95%相同的胺基酸序列。

根據一態樣，提供一種單株抗體，其包含分別含有SEQ ID NO: 48和49的重鏈和輕鏈。

根據一些實施例，本文的抗體或抗原結合片段用於以下中的至少一項：結合ILT2、誘導/增強抗腫瘤T細胞反應、增加T細胞增殖、降低癌症誘發的抑制子骨髓活性、增加自然殺傷細胞的細胞毒性、增加巨噬細胞吞噬作用、增加M1發炎性巨噬細胞的生成、減少M2抑制性巨噬細胞的生成、增加腫瘤微環境中的樹突細胞數量、增加樹突細胞活化、治療表現HLA-G的癌症以及治療表現I型MHC的癌症。

根據一些實施例，本文的抗體或抗原結合片段與調理劑組合用於治療表現HLA-G或I型MHC的癌症。

根據一些實施例，本文的抗體或抗原結合片段與基於抗PD-L1/PD-1的療法（例如，免疫療法）組合用於治療表現HLA-G或I型MHC的癌症。在某些實施例中，所述基於抗PD-L1/PD-1的療法是派姆單抗（pembrolizumab）療法。

根據一態樣，提供一種包含本文的抗體或抗原結合片段的醫藥組成物。

根據一態樣，提供一種治療有需要的受試者的表現HLA-G或I型MHC的癌症的方法，所述方法包括向所述受試者投予本文的醫藥組成物或本文的抗體或抗原結合片段。

根據一態樣，提供一種增加基於抗PD-L1/PD-1的療法在有需要的受試者中針對表現HLA-G、I型MHC或二者的癌細胞的功效的方法，所述方法包括向接受基於抗PD-L1/PD-1的療法的受試者投予本文的醫藥組成物或本文的抗體或抗原結合片段。

根據一些實施例，所述方法還包括向所述受試者投予調理劑（opsonizing agent）。

根據一些實施例，所述調理劑是EGFR抑制劑，視情況地其中所述EGFR抑制劑是西妥昔單抗（cetuximab）。

根據一些實施例，所述方法還包括向所述受試者投予基於抗PD-L1/PD-1的療法（例如，免疫療法）。在某些實施例中，所述基於抗PD-L1/PD-1的免疫療法是派姆單抗療法。

根據一態樣，提供一種鑒定與重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NO: 48和49的參考抗體競爭結合至ILT2的抗體的方法，所述方法包括：使抗體文庫與包含選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的ILT2序列的多肽序列接觸，以及從所述文庫選擇結合所述ILT2序列的抗體，從而獲得與所述參考抗體競爭結合至ILT2的抗體。

根據一態樣，提供一種產生藥劑（例如，ILT2結合蛋白或分子）的方法，所述方法包括：獲得與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的人類ILT2序列結合的藥劑；或者獲得宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的人類ILT2序列結合的藥劑的一個或多個核苷酸序列，以及在允許所述藥劑表現的條件下培養所述宿主細胞，從而產生所述藥劑。根據一些實施例，所述藥劑與選自SEQ ID NO: 68至70的序列結合。根據一些實施例，所述藥劑與SEQ ID NO: 71和72中的一個或兩個結合。根據一些實施例，所述藥劑與SEQ ID NO: 71和72結合。

根據一態樣，提供由本文的方法所產生的藥劑。

根據一態樣，提供一種分離的核酸分子，其編碼本文的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述核酸分子是表現載體。

根據一態樣，提供一種宿主細胞，其包含本文的分離的核酸分子。

本文的其他實施例和完整適用範圍將根據下文給出的詳細描述而變得清楚。然而，應理解，雖然所述詳細描述和具體例子指示本文的較佳實施例，但是它們只是以說明性方式給出，因為根據該詳細描述，在本文的精神和範圍內的多種變化和修改對於熟習此項技術者而言將變得清楚。

本文涉及結合ILT2並抑制ILT2介導的免疫抑制的單株抗體或抗原結合片段和醫藥組成物。還提供治療癌症並增強PD-1/PD-L1免疫療法的方法。

本文至少部分是基於以下驚人發現：ILT2拮抗與基於PD-1和PD-L1的免疫療法協同作用以對抗癌細胞。具體而言，發現ILT2阻斷抗體與抗PD-1抗體的組合增加免疫細胞的促發炎性細胞因子分泌。該增加不僅是加性的，而且超過單獨的每種藥劑的作用之和。實際上，對於至少一種細胞因子，觀察到從頭增加，其中單獨的藥劑都沒有任何作用。這種組合治療允許將癌症從PD-1/PD-L1難治性轉化為PD-1/PD-L1反應性。

另外令人驚訝地發現，患者免疫細胞中的ILT2表現水準與ILT2阻斷療法的有效性相關。所述療法的反應者具有高ILT2水準，而無反應者具有低ILT2水準。特定地，迴圈CD8陽性T細胞上的ILT2水準預示治療結局。

最後，發現本文的抗體結合D1與D2結構域之間的ILT2間域（interdomain）內的獨特表位。已知此區域是ILT2與β-2-微球蛋白（B2M）之間的相互作用結構域。本文的抗體是直接阻斷這種相互作用的第一種已知抗體。此外，發現本文的抗體具有關於其他抗ILT2抗體未報導的免疫刺激作用。本發明抗體能夠調節T細胞、NK細胞、樹突細胞和巨噬細胞針對表現I型MHC（例如，HLA-G）的癌細胞的免疫監督。特定地，第一次，用作單一療法的抗ILT2抗體顯示出增強癌細胞的吞噬作用。抗體

在第一態樣，本文提供一種抗體，其包含三個重鏈CDR（CDR-H）和三個輕鏈CDR（CDR-L），其中：CDR-H1包含SEQ ID NO: 1中所示的胺基酸序列（DHTIH），CDR-H2包含如SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列（YIYPRDGSTKYNEKFKG），CDR-H3包含如SEQ ID NO: 3中所示的胺基酸序列（TWDYFDY），CDR-L1包含如SEQ ID NO: 4中所示的胺基酸序列（RASESVDSYGNSFMH），CDR-L2包含如SEQ ID NO: 5中所示的胺基酸序列（RASNLES），並且CDR-L3包含如SEQ ID NO: 6中所示的胺基酸序列（QQSNEDPYT）。在一些實施例中，所述抗體還包含IgG4抗體（例如，人類IgG4）的重鏈恆定區。

在另一態樣，本文提供一種抗體或抗原結合片段，其包含三個重鏈CDR（CDR-H）和三個輕鏈CDR（CDR-L），其中：CDR-H1包含SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列（GYTFTSYGIS），CDR-H2包含如SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列（EIYPGSGNSYYNEKFKG），CDR-H3包含如SEQ ID NO: 9中所示的胺基酸序列（SNDGYPDY），CDR-L1包含如SEQ ID NO: 10中所示的胺基酸序列（KASDHINNWLA），CDR-L2包含如SEQ ID NO: 11中所示的胺基酸序列（GATSLET），並且CDR-L3包含如SEQ ID NO: 12中所示的胺基酸序列（QQYWSTPWT）。在一些實施例中，所述抗體還包含IgG4抗體（例如，人類IgG4）的重鏈恆定區。

在另一態樣，本文提供一種抗體或抗原結合片段，其包含三個重鏈CDR（CDR-H）和三個輕鏈CDR（CDR-L），其中：CDR-H1包含SEQ ID NO: 13中所示的胺基酸序列（SGYYWN），CDR-H2包含如SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列（YISYDGSNNYNPSLKN），CDR-H3包含如SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列（GYSYYYAMDX），其中X選自A、C和S，CDR-L1包含如SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列（RTSQDISNYLN），CDR-L2包含如SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列（YTSRLHS），並且CDR-L3包含如SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列（QQGNTLPT）。在一些實施例中，所述抗體還包含IgG4抗體（例如，人類IgG4）的重鏈恆定區。

在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是GYSYYYAMDA（SEQ ID NO: 25）。在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是SEQ ID NO: 25，並且所述抗體或抗原結合片段是人源化抗體。在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是GYSYYYAMDS（SEQ ID NO: 26）。在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是SEQ ID NO: 26，並且所述抗體或抗原結合片段是人源化抗體。在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是GYSYYYAMDC（SEQ ID NO: 27）。在一些實施例中，SEQ ID NO: 16是SEQ ID NO: 27，並且所述抗體或抗原結合片段是鼠類抗體。

在另一態樣，提供一種抗體或抗原結合片段，其結合結構域D1與D2之間的人白細胞免疫球蛋白樣受體超家族B成員1（ILT2）間域（interdomain）。

在另一態樣，提供一種抗體或抗原結合片段，其與選自以下的ILT2序列結合：VKKGQFPIPSITWEH（SEQ ID NO: 41）、LELVVTGAYIKPTLS（SEQ ID NO: 42）、VILQCDSQVAFDGFS（SEQ ID NO: 43）、WYRCYAYDSNSPYEW（SEQ ID NO: 44）、KGQFPIPSITWEHAGR（SEQ ID NO: 68）、GQFPIPSITWEHAGR（SEQ ID NO: 69）和SESSDPLELVVTGAYIK（SEQ ID NO: 70）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可以與1、2、3、4、5、6或所有7個所述序列結合。

在另一態樣，提供一種抗體或抗原結合片段，其結合ILT2並抑制ILT2與B2M之間的相互作用。

在一些實施例中，抗體是單株抗體。在一些實施例中，抗體是多株抗體。在一些實施例中，抗體是鼠類抗體。在一些實施例中，抗體是人源化抗體。如本文所用，「人源化」抗體是指具有人類主鏈，但是具有源自或得自非人類抗體的CDR的抗體。在一些實施例中，在人源化期間，CDR可以被改變，但是通常仍然源自非人類親代抗體的CDR。在一些實施例中，抗原結合片段是單鏈抗體。在一些實施例中，抗原結合片段是單結構域抗體。

在一些實施例中，抗體包含IgG4恆定區。在一些實施例中，抗體是包含人類IgG4恆定區的人源化抗體。在一些實施例中，相對於野生型IgG4恆定區，所述IgG4恆定區是工程化的IgG4恆定區並且含有突變。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包含以下胺基酸序列： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK （SEQ ID NO: 50）。在一些實施例中，人類IgG4恆定區由SEQ ID NO: 50組成。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包含與SEQ ID NO: 50的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包含與SEQ ID NO: 50的至少95%同一性。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包含與SEQ ID NO: 50的至少97%同一性。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包含與SEQ ID NO: 50的至少99%同一性。

在一些實施例中，IgG4恆定區包含至少一個突變。在一些實施例中，所述突變降低與Fc受體（如Fcγ受體（FcγR））的結合，或者減少IgG4抗體的Fab-臂交換。在一些實施例中，所述突變位於絲胺酸108。在一些實施例中，絲胺酸突變為脯胺酸。在一些實施例中，絲胺酸108是SEQ ID NO: 50的絲胺酸108（或者根據Eu編號的S228）。絲胺酸108突變為脯胺酸也被稱為S228P突變。在一些實施例中，所述突變位於白胺酸115（或者根據Eu編號的L235）。在一些實施例中，白胺酸突變為麩胺酸。在一些實施例中，白胺酸115是SEQ ID NO: 50的白胺酸115。白胺酸115突變為麩胺酸也被稱為L235E突變。熟習此項技術者應理解，任何胺基酸在重鏈恆定區中的精確數字位置將取決於重鏈可變區的長度。因此，絲胺酸的位置表示為恆定區內的108，並且白胺酸的位置表示為115（參見例如，SEQ ID NO: 50）。還應理解，對恆定區的修飾（例如，鹼基的添加或缺失）也可以改變數位位置，但是也設想IgG4的任何類似物或衍生物，只要其包括所述突變即可。在一些實施例中，IgG4恆定區包含多個突變。在一些實施例中，IgG4恆定區包含絲胺酸108和白胺酸115的突變。在一些實施例中，IgG4恆定區包含S108P和L115E突變（或者根據Eu編號的S228P和L235E突變）。

在一些實施例中，IgG4恆定區包含以下胺基酸序列，其中對野生型人類IgG4恆定區的突變（S228P和L235E；Eu編號）在框中顯示： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFEEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK （SEQ ID NO: 55）。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 55或由其組成。在一些實施例中，本文的抗體包含SEQ ID NO: 55。在一些實施例中，本文的抗體的重鏈恆定區包含SEQ ID NO: 55。在一些實施例中，本文的抗體的重鏈恆定區由SEQ ID NO: 55組成。在一些實施例中，IgG4恆定區是SEQ ID NO: 55的類似物或衍生物，例如，含有改進抗體的可製造性或降低免疫原性的其他突變。在一些實施例中，IgG4恆定區包含與SEQ ID NO: 55的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，IgG4恆定區包含與SEQ ID NO: 55的至少95%同一性。在一些實施例中，IgG4恆定區包含與SEQ ID NO: 55的至少97%同一性。在一些實施例中，IgG4恆定區包含與SEQ ID NO: 55的至少99%同一性。

在一些實施例中，IgG4恆定區的類似物還包含至少一個其他突變。在一些實施例中，至少一個其他突變在SEQ ID NO: 55中。在一些實施例中，至少一個其他突變不在位置108。在一些實施例中，至少一個其他突變不在位置115。在一些實施例中，至少一個其他突變不在位置108或115。IgG4的其他突變是業內熟知的，並且可以採用這些突變中的任一個。其他突變的例子包括但不限於E233P、F234A、L235A、G237A、P239G、F243L、T250Q、T250E、M252Y、S254T、T256E、E258F、D259I、V264A、D265A、F296Y、T307A、T307Q、V308W、V308Y、V308F、Q311V、K317Q、A330R、E356K、K370Q、K370E、E380A、R409K、V427T、M428L、M428F、H434K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435R、Y436H、K439E、L445P、G236的缺失、G446的缺失和K447的缺失（編號是根據Eu編號給出）。再一次，針對這些突變給出的數字位置是常用記法（Eu編號），但是將取決於重鏈可變區的長度。在SEQ ID NO: 50內，這些位置對應於E113、F114、L115、G117、P119、F123、T130、M132、S134、T136、E138、D139、V144、D145、F176、T187、V188、Q191、K197、A210、E236、K250、E260、R289、V307、M308、H313、N314、H315、Y316、K319、L325、G326和K327。還應理解，可以採用突變的特定組合，如E233P/F234A/L235A/G236del/G237A或S228P/F234A/L235A/G237A/P238S。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合ILT2。在一些實施例中，ILT2是人類ILT2。在一些實施例中，ILT2是哺乳動物ILT2。在一些實施例中，ILT2是靈長類動物ILT2（例如，食蟹猴ILT2）。在一些實施例中，ILT2是鼠類ILT2。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合ILT2的細胞外結構域。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合ILT2的配體袋。在一些實施例中，配體是B2M。在一些實施例中，配體不是HLA。在一些實施例中，配體是HLA。在一些實施例中，HLA是HLA-G。在一些實施例中，配體不是MHC。在一些實施例中，配體是MHC。在一些實施例中，MHC是MHC I類（I型MHC）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合ILT2間域。在一些實施例中，間域是D1與D2結構域之間的介面。在一些實施例中，間域是D1與D2結構域之間的鉸鏈結構域。在一些實施例中，間域不包含D1的N末端結構域。在一些實施例中，間域是SEQ ID NO: 31的胺基酸54至184。在一些實施例中，SEQ ID NO: 31的胺基酸54-184包含間域。在一些實施例中，間域是SEQ ID NO: 31的胺基酸90-184。在一些實施例中，胺基酸90至184包含間域。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合間域內的表位。在一些實施例中，表位占間域的至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，表位在D2內。在一些實施例中，抗體或抗原結合結構域結合D2中的表位。在一些實施例中，表位至少部分在D2中。在一些實施例中，抗體或抗原結合結構域結合至少部分在D2中的表位。在一些實施例中，表位跨越D1和D2。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段不結合與HLA-G的α3結構域相互作用的ILT2結構域。

在一些實施例中，ILT2是哺乳動物ILT2。在一些實施例中，ILT2是人類ILT2。在一些實施例中，ILT2具有NCBI參考序列：NP_006660.4中提供的胺基酸序列。在一些實施例中，ILT2具有以下胺基酸序列： MTPILTVLIC LGLSLGPRTH VQAGHLPKPT LWAEPGSVIT QGSPVTLRCQ GGQETQEYRL YREKKTALWI TRIPQELVKK GQFPIPSITW EHAGRYRCYY GSDTAGRSES SDPLELVVTG AYIKPTLSAQ PSPVVNSGGN VILQCDSQVA FDGFSLCKEG EDEHPQCLNS QPHARGSSRA IFSVGPVSPS RRWWYRCYAY DSNSPYEWSL PSDLLELLVL GVSKKPSLSV QPGPIVAPEE TLTLQCGSDA GYNRFVLYKD GERDFLQLAG AQPQAGLSQA NFTLGPVSRS YGGQYRCYGA HNLSSEWSAP SDPLDILIAG QFYDRVSLSV QPGPTVASGE NVTLLCQSQG WMQTFLLTKE GAADDPWRLR STYQSQKYQA EFPMGPVTSA HAGTYRCYGS QSSKPYLLTH PSDPLELVVS GPSGGPSSPT TGPTSTSGPE DQPLTPTGSD PQSGLGRHLG VVIGILVAVI LLLLLLLLLF LILRHRRQGK HWTSTQRKAD FQHPAGAVGP EPTDRGLQWR SSPAADAQEE NLYAAVKHTQ PEDGVEMDTR SPHDEDPQAV TYAEVKHSRP RREMASPPSP LSGEFLDTKD RQAEEDRQMD TEAAASEAPQ DVTYAQLHSL TLRREATEPP PSQEGPSPAV PSIYATLAIH （SEQ ID NO: 31）。

在一些實施例中，ILT2具有NCBI參考序列：NP_001075106.2中提供的胺基酸序列。在一些實施例中，ILT2具有NCBI參考序列：NP_001075107.2中提供的胺基酸序列。在一些實施例中，ILT2具有NCBI參考序列：NP_001075108.2中提供的胺基酸序列。在一些實施例中，ILT2具有NCBI參考序列：NP_001265328.2中提供的胺基酸序列。

在一些實施例中，ILT2的D1結構域包含以下胺基酸序列或由其組成 GHLPKPTLWA EPGSVITQGS PVTLRCQGGQ ETQEYRLYRE KKTALWITRI PQELVKKGQF PIPSITWEHA GRYRCYYGSD TAGRSESSDP LELVVTGA （SEQ ID NO: 46）。在一些實施例中，ILT2的D1結構域包含SEQ ID NO: 31的胺基酸24至121或由其組成。在一些實施例中，ILT2的D2結構域包含以下胺基酸序列或由其組成 YIKPTLSAQP SPVVNSGGNV ILQCDSQVAF DGFSLCKEGE DEHPQCLNSQ PHARGSSRAI FSVGPVSPSR RWWYRCYAYD SNSPYEWSLP SDLLELLVLG V（SEQ ID NO: 47）。在一些實施例中，ILT2的D2結構域包含SEQ ID NO: 31的胺基酸122至222或由其組成。在一些實施例中，ILT2的間域包含SEQ ID NO: 31的胺基酸Gln41、Lys65、Trp90、Gly120、Ala121、Val122、Ile123、Gln148、Val149、Ala150、Phe151、Asp201、Asn203和Glu207。在一些實施例中，表位包含SEQ ID NO: 31的胺基酸Gln41、Lys65、Trp90、Gly120、Ala121、Val122、Ile123、Gln148、Val149、Ala150、Phe151、Asp201、Asn203和Glu207。在一些實施例中，表位包含選自SEQ ID NO: 31的胺基酸Gln41、Lys65、Trp90、Gly120、Ala121、Val122、Ile123、Gln148、Val149、Ala150、Phe151、Asp201、Asn203和Glu207的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸。

在一些實施例中，表位包含選自SEQ ID NO: 31的胺基酸Gln41、Lys65、Trp90、Gly120、Ala121、Val122、Ile123、Gln148、Val149、Ala150、Phe151、Asp201、Asn203和Glu207的至少10個胺基酸。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 41中提供的ILT2序列結合。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 42中提供的ILT2序列結合。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 43中提供的ILT2序列結合。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 44中提供的ILT2序列結合。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合三維表位，所述三維表位包含來自SEQ ID NO: 41、42、43和44中的至少兩項的殘基（例如，包含SEQ ID NO: 41、42、43和44中的至少兩項的三維表位）。在一些實施例中，三維表位包含來自SEQ ID NO: 41、42、43和44中的至少3項的殘基（例如，包含SEQ ID NO: 41、42、43和44中的至少3項的三維表位）。在一些實施例中，三維表位包含來自SEQ ID NO: 41、42、43和44的殘基（例如，包含SEQ ID NO: 41、42、43和44的三維表位）。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 41結合（例如，與包含SEQ ID NO: 41或在其內的ILT2表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 42結合（例如，與包含SEQ ID NO: 42或在其內的ILT2表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 43結合（例如，與包含SEQ ID NO: 43或在其內的ILT2表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 44結合（例如，與包含SEQ ID NO: 44或在其內的ILT2表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 68結合（例如，與包含SEQ ID NO: 68或在其內的ILT2表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 69結合（例如，與包含SEQ ID NO: 69或在其內的ILT2表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 70結合（例如，與包含SEQ ID NO: 70或在其內的ILT2表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與三維表位結合，所述三維表位包含來自SEQ ID NO: 41至44和68至70中的至少兩個的殘基（例如，與包含SEQ ID NO: 41至44和68至70中的至少兩個的三維表位結合）。在一些實施例中，三維表位包含來自SEQ ID NO: 41至44和68至70中的至少3個的殘基（例如，三維表位包含SEQ ID NO: 41至44和68至70中的至少3個）。在一些實施例中，三維表位包含來自SEQ ID NO: 41至44和68至70中的至少4個的殘基（例如，三維表位包含SEQ ID NO: 41至44和68至70中的至少4個）。在一些實施例中，三維表位包含來自SEQ ID NO: 41、42和68至70的殘基（例如，三維表位包含SEQ ID NO: 41、42和68至70）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與選自SEQ ID NO: 68至70的序列結合（例如，與包含SEQ ID NO: 68至70中的任一項或在其內的表位結合）。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與序列GQFPIPSITW（SEQ ID NO: 71）結合（例如，與包含所述序列或在其內的ILT2表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與序列ELVVTGAYIK（SEQ ID NO: 72）結合（例如，與包含所述序列或在其內的ILT2表位結合）。在特定實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 71和72結合（例如，與包含SEQ ID NO: 71和72或在其內的表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與選自SEQ ID NO: 68至72的序列結合（例如，與包含所述序列或在其內的表位結合）。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與選自SEQ ID NO: 41至44和68至72的序列結合（例如，與包含所述序列或在其內的表位結合）。在一些實施例中，SEQ ID NO: 71是SEQ ID NO: 41內的表位。在一些實施例中，SEQ ID NO: 71是SEQ ID NO: 68內的表位。在一些實施例中，SEQ ID NO: 71是SEQ ID NO: 69內的表位。在一些實施例中，SEQ ID NO: 72是SEQ ID NO: 42內的表位。在一些實施例中，SEQ ID NO: 72是SEQ ID NO: 70內的表位。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合ILT2表位，所述ILT2表位包含選自Q18、G19、K42、L45、S64、I65、T66、W67、E68、G97、A98、Y99、I100、Q125、V126、A127、F128、D178、N180、S181和E184的ILT2殘基。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合ILT2表位，所述ILT2表位包含選自G97、A98、Y99、I100、Q125和V126的ILT2殘基。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合ILT2表位，所述ILT2表位包含選自Q18、G19、K42、L45、S64、I65、T66、W67、E68、G97、A98、Y99、I100、Q125、V126、A127、F128、D178、N180、S181和E184的多個ILT2殘基。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合ILT2表位，所述ILT2表位包含選自G97、A98、Y99、I100、Q125和V126的多個ILT2殘基。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合選自Q18、G19、K42、L45、S64、I65、T66、W67、E68、G97、A98、Y99、I100、Q125、V126、A127、F128、D178、N180、S181和E184的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個殘基。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合選自G97、A98、Y99、I100、Q125和V126的1、2、3、4、5或6個殘基。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合G97、A98、Y99、I100、Q125和V126。應理解，本文所用的ILT2殘基編號是關於SEQ ID NO: 31。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段是ILT2拮抗劑。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段不是ILT2激動劑。在一些實施例中，拮抗屬於ILT2介導的免疫抑制。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2介導的免疫抑制。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2信號傳導。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2與B2M之間的相互作用。在一些實施例中，所述相互作用是直接相互作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2與B2M的接觸。在一些實施例中，所述接觸是直接接觸。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2與HLA之間的相互作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2與MHC之間的相互作用。在一些實施例中，MHC是HLA。在一些實施例中，HLA是HLA-G。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2與HLA、MHC或二者之間的相互作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段通過抑制ILT2與B2M的相互作用來抑制ILT2與HLA、MHC或二者之間的相互作用。在一些實施例中，所述相互作用是通過B2M介導的。在一些實施例中，抗體通過抑制與B2M的相互作用來間接抑制與HLA、MHC或二者的相互作用。在一些實施例中，所述相互作用是B2M介導的相互作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2與B2M/HLA複合物之間的相互作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段抑制ILT2與B2M/MHC複合物之間的相互作用。在一些實施例中，所述複合物包含B2M單體。在一些實施例中，所述複合物包含HLA或MHC單體。在一些實施例中，所述複合物包含B2M二聚體。在一些實施例中，所述複合物包含HLA或MHC二聚體。

在一些實施例中，ILT2介導的免疫抑制是對免疫細胞的抑制。在一些實施例中，免疫細胞選自T細胞、巨噬細胞、樹突細胞和自然殺傷（NK）細胞。在一些實施例中，ILT2介導的免疫抑制是對T細胞、巨噬細胞、樹突細胞和NK細胞的抑制。在一些實施例中，ILT2介導的免疫抑制是對T細胞、巨噬細胞和NK細胞的抑制。在一些實施例中，T細胞是CD8陽性T細胞。在一些實施例中，T細胞是T _EMRA細胞（重表現CD45RA的終末分化的效應記憶細胞）。在一些實施例中，免疫細胞選自CD8陽性T細胞、T _EMRA細胞、樹突細胞、巨噬細胞和自然殺傷（NK）細胞。在一些實施例中，免疫細胞是T細胞。在一些實施例中，免疫細胞是NK細胞。在一些實施例中，免疫細胞是巨噬細胞。在一些實施例中，巨噬細胞是腫瘤相關的巨噬細胞（TAM）。在一些實施例中，免疫細胞是樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞是致耐受性樹突細胞。在一些實施例中，免疫細胞是周邊血液免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞是周邊血液單核細胞（PBMC）。在一些實施例中，免疫細胞是腫瘤內免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞是腫瘤微環境（TME）中的免疫細胞。在一些實施例中，ILT2介導的免疫抑制是對巨噬細胞吞噬作用的抑制。在一些實施例中，ILT2介導的免疫抑制是對NK細胞的細胞毒性的抑制。在一些實施例中，ILT2介導的免疫抑制是對T細胞的細胞毒性的抑制。在一些實施例中，ILT2介導的免疫抑制是對T細胞增殖的抑制。在一些實施例中，ILT2介導的免疫抑制是對免疫細胞增殖的抑制。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段不結合白細胞免疫球蛋白樣受體超家族B中除了ILT2以外的成員。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段對ILT2具有特異性。在K _D≤ 1 μM，較佳地≤ 100 nM或≤ 10 nM時，稱抗體與抗原特異性結合。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段優先與ILT2結合。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段不抑制白細胞免疫球蛋白樣受體超家族B中除了ILT2以外的成員。

如本文所用，「增加的結合功效」是指與目標或抗原的特異性結合大於同種型對照的所述結合。在一些實施例中，增加的結合是結合功效的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%的增加。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，增加的結合是如與不具有結合的同種型對照相比，存在結合。抗體與特定結構域的結合將是熟習此項技術者熟知的。抗體結合可以以熟習此項技術者已知的任何方式來測定，包括但不限於：X射線晶體學、免疫沈澱、免疫印跡、競爭測定、表面電漿共振和動力學排斥測定。在一些實施例中，增加的結合功效是特異性結合。

可以稱本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以大於或等於10 ³M ^-1sec ^-1、5 X 10 ³M ^-1sec ^-1、10 ⁴M ^-1sec ^-1或5 X 10 ⁴M ^-1sec ^-1的締合速率（k(締合)）結合目標抗原（例如，ILT2）。每種可能性表示本文的單獨實施例。可以稱本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-6M或更強的K _D結合目標抗原，而大多數抗體的典型K _D為至少10 ^-9M。在一些實施例中，K _D是親和力的量度。熟習此項技術者應理解，該更強的結合是更高的親和力，是以更低的K _D結合。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-6M與10 ^-12M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-6M與10 ^-11M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-6M與10 ^-10M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-6M與10 ^-9M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-7M與10 ^-12M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-8M與10 ^-12M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-9M與10 ^-12M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-7M與10 ^-11M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-8M與10 ^-11M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-9M與10 ^-11M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-7M與10 ^-10M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-8M與10 ^-10M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-9M與10 ^-10M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-7M與10 ^-9M之間的K _D結合目標抗原。在一些實施例中，本文公開的抗體或抗原結合片段、變異體或衍生物以10 ^-8M與10 ^-9M之間的K _D結合目標抗原。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含重鏈，所述重鏈包含SEQ ID NO: 19的胺基酸序列（QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDGSTKYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARTWDYFDYWGQGTTLTVSS）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 19至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 19至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含重鏈，所述重鏈包含SEQ ID NO: 21的胺基酸序列（QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWVGEIYPGSGNSYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARSNDGYPDYWGQGTTLTVSS）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 21至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 21至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含重鏈，所述重鏈包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列（DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDXWGQGTSVTVSS），其中X選自A、C和S。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 23至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 23至少95%相同的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列（DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 20至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 20至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO: 22的胺基酸序列（DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 22至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 22至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列（DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPTFGQGTKLEIK）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 24至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 24至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列（DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPTFGSGTKLEIK）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 45至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 45至少95%相同的胺基酸序列。

在一些實施例中，SEQ ID NO: 23是DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 28）。在一些實施例中，SEQ ID NO: 23是SEQ ID NO: 28，並且抗體或抗原結合片段是人源化的。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 28至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 28至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，SEQ ID NO: 23是DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDSWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 29）。在一些實施例中，SEQ ID NO: 23是SEQ ID NO: 29，並且抗體或抗原結合片段是人源化的。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 29至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 29至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，SEQ ID NO: 23是DVQLQGSGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTSEDTATYYCAHGYSYYYAMDCWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 30）。在一些實施例中，SEQ ID NO: 23是SEQ ID NO: 30，並且抗體或抗原結合片段是鼠的。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 30至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 30至少95%相同的胺基酸序列。

在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是SEQ ID NO: 25，並且重鏈包含SEQ ID NO: 28或由其組成。在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是SEQ ID NO: 25，並且重鏈包含DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 56）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 56至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 56至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區由SEQ ID NO: 56組成。在一些實施例中，重鏈可變區由具有與SEQ ID NO: 56的至少95%同一性的序列組成。在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是SEQ ID NO: 25，並且重鏈包含DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSS。（SEQ ID NO: 57）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 57至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 57至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區由SEQ ID NO: 57組成。在一些實施例中，重鏈可變區由與SEQ ID NO: 57至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是SEQ ID NO: 25，並且重鏈包含QVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 58）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 58至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 58至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區由SEQ ID NO: 58組成。在一些實施例中，重鏈可變區由與SEQ ID NO: 58至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，SEQ ID NO: 15是SEQ ID NO: 25，並且重鏈包含QVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGYISYDGSNNYNPSLKNRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 59）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 59至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 59至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區由SEQ ID NO: 59組成。在一些實施例中，重鏈可變區由與SEQ ID NO: 59至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，重鏈包含選自SEQ ID NO: 28和56至59的序列。在一些實施例中，重鏈包含選自SEQ ID NO: 56至59的序列。在一些實施例中，重鏈可變區由選自SEQ ID NO: 28和56至59的序列組成。在一些實施例中，重鏈可變區由選自SEQ ID NO: 56至59的序列組成。

在一些實施例中，重鏈包含DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO: 48）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 48至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 48至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈由SEQ ID NO: 48組成。在一些實施例中，重鏈由與SEQ ID NO: 48至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，重鏈包含DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDSWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO: 51）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 51至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 51至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈由SEQ ID NO: 51組成。在一些實施例中，重鏈由與SEQ ID NO: 51至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，重鏈包含DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDCWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO: 52）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 52至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 52至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈由SEQ ID NO: 52組成。在一些實施例中，重鏈由與SEQ ID NO: 52至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，重鏈包含DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO: 64）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 64至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 64至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈由SEQ ID NO: 64組成。在一些實施例中，重鏈由與SEQ ID NO: 64至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，重鏈包含DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO: 65）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 65至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 65至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈由SEQ ID NO: 65組成。在一些實施例中，重鏈由與SEQ ID NO: 65至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，重鏈包含QVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGYISYDGSNNYNPSLKNRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO: 67）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 67至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 67至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈由SEQ ID NO: 67組成。在一些實施例中，重鏈由與SEQ ID NO: 67至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，重鏈包含QVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO: 106）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 106至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 106至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈由SEQ ID NO: 106組成。在一些實施例中，重鏈由與SEQ ID NO: 106至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，重鏈包含QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWVGEIYPGSGNSYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARSNDGYPDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO: 53）。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 53至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 53至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈由SEQ ID NO: 53組成。在一些實施例中，重鏈由與SEQ ID NO: 53至少95%相同的序列組成。

在一些實施例中，抗體包含κ輕鏈。在一些實施例中，輕鏈的恆定區是κ恆定區。在一些實施例中，κ恆定區包含RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO: 63）。在一些實施例中，κ恆定區由SEQ ID NO: 63組成。在一些實施例中，κ恆定區是SEQ ID NO: 63的類似物或衍生物。在一些實施例中，κ恆定區包含與SEQ ID NO: 63的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，κ恆定區包含與SEQ ID NO: 63的至少95%同一性。在一些實施例中，κ恆定區包含與SEQ ID NO: 63的至少97%同一性。在一些實施例中，κ恆定區包含與SEQ ID NO: 63的至少99%同一性。

在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSTSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 60）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 60至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 60至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區由SEQ ID NO: 60組成。在一些實施例中，輕鏈可變區由與SEQ ID NO: 60至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 61）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 61至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 61至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區由SEQ ID NO: 61組成。在一些實施例中，輕鏈可變區由與SEQ ID NO: 61至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 24）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 24至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 24至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區由SEQ ID NO: 24組成。在一些實施例中，輕鏈可變區由與SEQ ID NO: 24至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 62）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 62至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 62至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區由SEQ ID NO: 62組成。在一些實施例中，輕鏈可變區由與SEQ ID NO: 62至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含選自SEQ ID NO: 24和60至62的序列。在一些實施例中，輕鏈包含選自SEQ ID NO: 60至62的序列。在一些實施例中，輕鏈可變區由選自SEQ ID NO: 24和60至62的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含選自SEQ ID NO: 60至62的序列。在一些實施例中，輕鏈可變區由選自SEQ ID NO: 60至62的序列組成。

在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO: 49）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 49至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 49至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈由SEQ ID NO: 49組成。在一些實施例中，輕鏈由與SEQ ID NO: 49至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO: 66）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 66至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 66至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈由SEQ ID NO: 66組成。在一些實施例中，輕鏈由與SEQ ID NO: 66至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO: 54）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 54至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 54至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈由SEQ ID NO: 54組成。在一些實施例中，輕鏈由與SEQ ID NO: 54至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSTSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO: 107）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 107至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 107至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈由SEQ ID NO: 107組成。在一些實施例中，輕鏈由與SEQ ID NO: 107至少95%相同的序列組成。在一些實施例中，輕鏈包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO: 108）。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 108至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO: 108至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈由SEQ ID NO: 108組成。在一些實施例中，輕鏈由與SEQ ID NO: 108至少95%相同的序列組成。

在一些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 48的重鏈和含有SEQ ID NO: 49的輕鏈。在一些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO: 48組成的重鏈和由SEQ ID NO: 49組成的輕鏈。在一些實施例中，抗體由包含SEQ ID NO: 48的重鏈和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈組成。在一些實施例中，抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈由SEQ ID NO: 48組成，並且所述輕鏈由SEQ ID NO: 49組成。在一些實施例中，抗體是15G8-13。

在一些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 51的重鏈和含有SEQ ID NO: 49的輕鏈。在一些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO: 51組成的重鏈和由SEQ ID NO: 49組成的輕鏈。在一些實施例中，抗體由包含SEQ ID NO: 51的重鏈和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈組成。在一些實施例中，抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈由SEQ ID NO: 51組成，並且所述輕鏈由SEQ ID NO: 49組成。在一些實施例中，抗體是在位置108具有絲胺酸的15G8-13。

本文涵蓋具有上述重鏈和輕鏈的任何組合的抗體。

在一些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 52的重鏈和含有SEQ ID NO: 49的輕鏈。在一些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO: 52組成的重鏈和由SEQ ID NO: 49組成的輕鏈。在一些實施例中，抗體由包含SEQ ID NO: 52的重鏈和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈組成。在一些實施例中，抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈由SEQ ID NO: 52組成，並且所述輕鏈由SEQ ID NO: 49組成。在一些實施例中，抗體是在位置108具有半胱胺酸的15G8-13。

在一些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 64的重鏈和含有SEQ ID NO: 49的輕鏈。在一些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO: 64組成的重鏈和由SEQ ID NO: 49組成的輕鏈。在一些實施例中，抗體由包含SEQ ID NO: 64的重鏈和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈組成。在一些實施例中，抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈由SEQ ID NO: 64組成，並且所述輕鏈由SEQ ID NO: 49組成。在一些實施例中，抗體是15G8-23。

在一些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 65的重鏈和含有SEQ ID NO: 66的輕鏈。在一些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO: 65組成的重鏈和由SEQ ID NO: 66組成的輕鏈。在一些實施例中，抗體由包含SEQ ID NO: 65的重鏈和包含SEQ ID NO: 66的輕鏈組成。在一些實施例中，抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈由SEQ ID NO: 65組成，並且所述輕鏈由SEQ ID NO: 66組成。在一些實施例中，抗體是15G8-32。

在一些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 67的重鏈和含有SEQ ID NO: 49的輕鏈。在一些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO: 67組成的重鏈和由SEQ ID NO: 49組成的輕鏈。在一些實施例中，抗體由包含SEQ ID NO: 67的重鏈和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈組成。在一些實施例中，抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈由SEQ ID NO: 67組成，並且所述輕鏈由SEQ ID NO: 49組成。在一些實施例中，抗體是15G8-53。

在一些實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 53的重鏈和含有SEQ ID NO: 54的輕鏈。在一些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO: 53組成的重鏈和由SEQ ID NO: 54組成的輕鏈。在一些實施例中，抗體由包含SEQ ID NO: 53的重鏈和包含SEQ ID NO: 54的輕鏈組成。在一些實施例中，抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈由SEQ ID NO: 53組成，並且所述輕鏈由SEQ ID NO: 54組成。在一些實施例中，抗體是19E3。

在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於治療或改善有需要的受試者的癌症。在一些實施例中，癌症是HLA-G陽性癌症。在一些實施例中，癌症是I型MHC陽性癌症。在一些實施例中，癌症是表現HLA-G的癌症。在一些實施例中，癌症是表現I型MHC的癌症。在一些實施例中，癌症是實體癌。在一些實施例中，癌症是腫瘤。在一些實施例中，癌症選自肝膽管癌、子宮頸癌、泌尿生殖器癌症（例如，尿路上皮癌）、睾丸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、神經系統癌症、眼癌、肺癌、軟組織癌、骨癌、胰腺癌、膀胱癌、皮膚癌、腸癌、肝癌、直腸癌、結直腸癌、食道癌、胃癌、胃食道癌、乳腺癌（例如，三陰性乳腺癌）、腎癌（例如，腎腫瘤）、頭頸癌、白血病和淋巴瘤。在一些實施例中，癌症選自乳腺癌、肝膽管癌、子宮頸癌、結直腸癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、肺癌（例如，非小細胞肺癌）、腎癌、皮膚癌（例如，黑色素瘤或鱗狀細胞癌）、泌尿生殖器癌症和胰腺癌。在一些實施例中，癌症選自乳腺癌、肝膽管癌（例如，肝細胞癌、膽囊癌、膽管上皮癌等）、子宮頸癌、結直腸癌（例如，KRAS野生型結直腸癌）、食道癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚癌、泌尿生殖器癌症、胰腺癌和白血病。

在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於將腫瘤微環境從免疫抑制性轉變為免疫刺激性。在一些實施例中，所述轉變腫瘤微環境包括以下中的一項或多項：誘導/增強抗腫瘤T細胞反應、增加T細胞增殖、降低癌症誘發的抑制子骨髓活性、增加樹突細胞（DC）啟動、增加樹突細胞至腫瘤的歸巢、增加巨噬細胞吞噬作用、增加M1巨噬細胞的生成、減少M2巨噬細胞的生成和增加NK細胞活性。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加針對癌細胞的T細胞反應。在一些實施例中，T細胞反應包括增加的促發炎性細胞因子分泌。在一些實施例中，T細胞反應包括增加的細胞毒性。在一些實施例中，T細胞反應包括增加的T細胞增殖。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加癌細胞的巨噬細胞吞噬作用。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加樹突細胞至腫瘤或癌症的歸巢。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加巨噬細胞吞噬作用。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加癌症的巨噬細胞吞噬作用。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加M1巨噬細胞的生成。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於減少M2巨噬細胞的生成。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加NK細胞針對癌細胞的細胞毒性。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於降低癌症誘發的抑制子骨髓活性。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於降低致耐受性樹突細胞（DC）活性。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加M1單核細胞活性或數量。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於減少M2單核細胞活性或數量。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加M1巨噬細胞的生成。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於減少M2巨噬細胞的生成。在一些實施例中，M1單核細胞/巨噬細胞是發炎性巨噬細胞/單核細胞。在一些實施例中，M2單核細胞/巨噬細胞是抑制性巨噬細胞/單核細胞。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加腫瘤中的DC數量。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加DC至腫瘤的募集。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加DC至腫瘤的募集。在一些實施例中，至腫瘤是至腫瘤微環境（TME）。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加DC啟動。在一些實施例中，增加DC啟動包括降低致耐受性樹突細胞活性。在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段用於增加呈獻抗原呈獻。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段在受試者中誘發至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種抗癌作用。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段在受試者中誘導至少2種作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段在受試者中誘導至少3種作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段在受試者中誘導至少4種作用。在一些實施例中，所述作用選自：增加的NK細胞的細胞毒性、增加的T細胞的細胞毒性、增加的T細胞增殖、增加的巨噬細胞吞噬作用、增加的M1巨噬細胞的生成、減少的M2巨噬細胞的生成、增加的樹突細胞至癌症的腫瘤的歸巢和增加的樹突細胞活化。在一些實施例中，所述作用選自：a) 增加的NK細胞的細胞毒性；b) 增加的T細胞的細胞毒性、增殖或二者；c) 增加的巨噬細胞吞噬作用、增加的M1巨噬細胞的生成、減少的M2巨噬細胞的生成或其組合；以及d) 增加的樹突細胞至癌症的腫瘤的歸巢、增加的樹突細胞活化及其組合。在一些實施例中，細胞毒性是針對癌症的細胞毒性。在一些實施例中，吞噬作用是癌症或癌細胞的吞噬作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段在受試者中誘導在T細胞、NK細胞、樹突細胞和巨噬細胞上的抗癌作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段在受試者中誘導在T細胞、NK細胞、樹突細胞和巨噬細胞中的至少3種上的抗癌作用。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段誘導所述作用作為單一療法。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段不進行組合而誘發所述作用。

在一些實施例中，增加的細胞毒性包括增加的促發炎性細胞因子分泌。促發炎性細胞因子是業內熟知的並且包括但不限於：IL-1、IL-1B、IL-6、TNFα、IFNγ、MCP-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-17、IL-21和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）。在一些實施例中，促發炎性細胞因子選自IL-6、干擾素γ（IFNγ）和GM-CSF。在一些實施例中，促發炎性細胞因子是GM-CSF。

「抗ILT2抗體」、「識別ILT2的抗體」或「針對ILT2的抗體」是以足夠親和力和特異性與ILT2結合的抗體。在一些實施例中，抗ILT2抗體具有ILT2作為與其結合的抗原。

「抗原」是能夠引發抗體形成並且被抗體結合的分子或分子的一部分。抗原可以具有一個或超過一個表位。上文所提及的特異性反應意欲表明，抗原將以高度選擇性的方式與其相應抗體而不是與可能被其他抗原誘發的多種其他抗體反應。

根據本文的術語「抗原決定簇」或「表位」是指抗原分子中與特定抗體特異性反應的區域。應用業內已知的方法，可以將源自表位的肽序列單獨或與載體部分結合用於免疫動物並產生另外的多株或單株抗體。還可以使用IMGT資訊系統（www://imgt. cines.fr/）（IMGT®/V-Quest）分析免疫球蛋白可變結構域，以鑒定可變區區段（包括CDR）。參見例如，Brochet等人, Nucl Acids Res. (2008) J6:W503-508。

Kabat等人還定義用於可變結構域序列的編號系統，其適用於任何抗體。一般熟習此項技術者可以在不依賴超出序列本身的任何實驗資料的情況下，明白地將這個「Kabat編號」系統指定給任何可變結構域序列。如本文所用，「Kabat編號」是指Kabat等人, 美國衛生與公眾服務部,“Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983)中所述的編號系統。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段用於與另一藥劑組合使用。在一些實施例中，與另一藥劑組合使用是用於治療表現HLA-G和/或I型MHC的癌症。在一些實施例中，所述藥劑是調理劑。在一些實施例中，所述藥劑是抗PD-1和/或抗PD-L1藥劑。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段用於與基於抗PD-1/PD-L1的療法組合使用。

如本文所用，「調理劑」是可以與目標細胞（例如，癌細胞、具有細胞內病原體的細胞等）結合並調理目標細胞的任何藥劑。例如，認為可以與目標細胞結合的任何抗體是調理目標細胞的藥劑，其中所述抗體具有Fc區。在一些實施例中，調理劑是誘導抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）的抗體。調理劑的例子包括但不限於抗CD47抗體、抗CD20抗體、抗HER2抗體、抗EGFR抗體、抗CD52抗體和抗CD30抗體。在一些實施例中，調理劑選自利妥昔單抗（Rituxan®）、曲妥珠單抗（Herceptin®）、帕妥珠單抗（Perjeta®）、西妥昔單抗（Erbitux®）和帕尼單抗（Vectibix®）。在一些實施例中，調理劑是抗EGFR抗體。在一些實施例中，調理劑是西妥昔單抗。

如本文所用，「抗PD-1/PD-L1療法」和「PD-1/PD-L1療法」是同義的並且可互換使用，並且是指包括阻斷PD-1和PD-L1信號傳導軸的治療方案。在一些實施例中，癌症是PD-L1陽性癌症。在一些實施例中，PD-1/PD-L1療法是PD-1/PD-L1免疫療法。在一些實施例中，PD-1/PD-L1療法是PD-1/PD-L1阻斷。在一些實施例中，PD-1/PD-L1療法是阻斷基於PD-1的免疫抑制的藥劑。在一些實施例中，PD-1/PD-L1療法包含抗PD-1阻斷抗體（例如，選自納武單抗（Optivo®）、派姆單抗（Keytruda®）和西米普利單抗（Lybtayo®））。在一些實施例中，PD-1/PD-L1療法包含抗PD-L1阻斷抗體（例如，選自阿特珠單抗（Tecentriq®）、阿維魯單抗（Bavencio®）和度伐魯單抗（Imfinzi®））。在一些實施例中，PD-1/PD-L1療法增加免疫監督。在一些實施例中，PD-1/PD-L1療法是抗癌療法。在一些實施例中，PD-1/PD-L1療法增加腫瘤免疫監督。除非另有指示，否則術語「抗體」（也稱為「免疫球蛋白」）涵蓋單株抗體和抗體片段（本文中也稱為抗體部分），只要它們展現所需生物活性。在某些實施例中，本文還涵蓋嵌合抗體或人源化抗體的用途。在「抗體或其抗原結合片段」的情況下，術語「抗體」是指具有兩條重鏈和兩條輕鏈的完整抗體。

天然存在的抗體結構的基礎單元是約150,000道耳吞的異四聚糖蛋白複合物，其由兩條相同的輕（L）鏈和兩條相同的重（H）鏈構成，所述輕鏈和重鏈通過非共價締合且通過二硫鍵連接在一起。每條重鏈和輕鏈也具有規律間隔的鏈內二硫橋。存在五個人類抗體類別（IgG、IgA、IgM、IgD和IgE），並且在這些類別內，基於結構差異被認定為多個子類（例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4），所述結構差異如單一抗體分子中免疫球蛋白單元的數量、單獨單元的二硫橋結構以及鏈長度和序列的差異。抗體的類別和子類是其同種型。

重鏈和輕鏈的胺基末端區域的序列比羧基末端區域更具多樣性，並且因此稱為可變結構域。抗體結構的這個部分賦予所述抗體的抗原結合特異性。重鏈可變（VH）結構域和輕鏈可變（VL）結構域一起形成單一抗原結合位點，因此，基礎免疫球蛋白單元具有兩個抗原結合位點。相信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變結構域之間形成介面（Chothia等人, J Mol Biol. (1985) 186, 651-63；Novotny和Haber, Proc Natl Acad Sci USA(1985) 82:4592-6）。

重鏈和輕鏈的羧基末端部分形成恆定結構域，即CH1、CH2、CH3、CL。儘管這些結構域中的多樣性顯著較低，一個動物物種與另一個動物物種之間存在差異，並且此外，在同一個體記憶體在幾個不同的抗體同種型，它們各自具有不同功能。

術語「架構區」或「FR」是指抗體的可變結構域中的胺基酸殘基，它們不同於如本文所定義的超變區胺基酸殘基。如本文所用的術語「超變區」是指抗體的可變結構域中的胺基酸殘基，它們負責抗原結合。超變區包含來自「互補決定區」或「CDR」的胺基酸殘基。CDR主要負責與抗原表位的結合。FR和CDR的範圍已經被精確定義（參見，Kabat等人）。在一些實施例中，CDR是使用KABAT系統來確定。在一些實施例中，CDR是使用Chothia系統來確定。在一些實施例中，Chothia系統是強化Chothia系統（Martin系統）。

本文中的單株抗體明確包括「嵌合」抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或子類的抗體中的相應序列相同或同源，而所述一條或多條鏈中的其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或子類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現所需生物活性（美國專利4,816,567；以及Morrison等人, Proc Natl Acad Sci USA(1984) 57:6851-5）。另外，可以進行互補決定區（CDR）移植以改變抗體分子的某些特性，包括親和力或特異性。CDR移植的非限制性例子揭露於美國專利5,225,539中。

嵌合抗體是分子，其不同部分源自不同動物物種，如具有源自鼠mAb的可變區和人免疫球蛋白恆定區的那些。具有基本上來自人類抗體（稱為受體抗體）的可變區架構殘基和基本上來自小鼠類抗體（稱為供體抗體）的互補決定區的抗體也被稱為人源化抗體。嵌合抗體主要用於在應用中降低免疫原性以及在生產中增加產量，例如，在鼠mAb具有更高的雜交瘤產量但更高的人體免疫原性的情況下，從而使用人/鼠嵌合mAb。嵌合抗體及其產生方法是業內已知的（例如，PCT專利申請WO 86/01533、WO 97/02671、WO 90/07861、WO 92/22653以及美國專利5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101和5,225,539）。如本文所用，術語「人源化抗體」是指包含來自人類抗體的架構區和來自非人類（通常是小鼠或大鼠）免疫球蛋白的一個或多個CDR的抗體。人源化免疫球蛋白的部分（可能除了CDR以外）與天然人免疫球蛋白序列的相應部分基本上相同。然而，在一些情形中，例如架構區中的特定胺基酸殘基可以進行修飾，以優化人源化抗體的表現。重要的是，預期人源化抗體會與提供CDR的供體抗體結合至相同抗原。其他細節參見例如轉讓給英國醫學研究理事會（Medical Research Council）的美國專利5,225,539。術語「來自受體人免疫球蛋白的架構區」和「源自受體人免疫球蛋白的架構區」和類似的語法表現在本文中可互換使用，以指代具有受體人免疫球蛋白的相同胺基酸序列的架構區或其部分。

如本文所用的術語「單株抗體」或「mAb」是指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即，構成所述群體的單獨抗體是相同的和/或結合相同表位，但是在單株抗體的產生期間可能出現的可能變異體除外，此類變異體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇（表位）的不同抗體的多株抗體製劑相反，每種單株抗體針對抗原上的單一決定簇。除了其特異性以外，單株抗體的有利之處在於，它們未被其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體的特徵為是從基本上同質的抗體群體獲得的。要根據本文所提供方法使用的單株抗體可以通過由Kohler等人, Nature(1975) 256:495首次描述的雜交瘤方法來製備，或者可以通過重組DNA方法（參見例如，美國專利4,816,567）來製備。單株抗體也可以使用例如以下文獻中描述的技術從噬菌體抗體文庫分離：Clackson等人, Nature(1991) 352:624-8；以及Marks等人, J Mol Biol. (1991) 222:581-97。

本文的mAb可以屬於任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE或IgA。可以在體外或在體內培育產生mAb的雜交瘤。高滴度的mAb可以從體內產生獲得，其中將來自單獨雜交瘤的細胞腹膜內注射至原始致敏的Balb/c小鼠中，以產生含有高濃度的所需mAb的腹水。同種型IgM或IgG的mAb可以使用熟習此項技術者熟知的管柱層析方法從此類腹水純化，或者從培養上清液純化。

「抗體片段」、「抗原結合片段」和「抗原結合部分」同義地使用，並且包含完整抗體的一部分，較佳地包含其抗原結合區。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab') ₂和Fv片段、scFv、雙抗體、串聯雙抗體（taDb）、線性抗體（例如，美國專利5,641,870，實例2；Zapata等人, Protein Eng. (1995) 8(10):1057-62）；單臂化抗體、單一可變結構域抗體、微型抗體、單鏈抗體分子、從抗體片段形成的多特異性抗體（例如，包括但不限於Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、二-scFv、雙-scFv或串聯(二,三)-scFv），以及雙特異性T細胞接合器（BiTE）。

對抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自具有單一抗原結合位點；和殘餘「Fc」片段，其名稱反映其易於結晶的能力。胃蛋白酶處理產生F(ab') ₂片段，其具有兩個抗原結合位點並且仍然能夠交聯抗原。

「Fv」是含有完整抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。此區域由處於緊密非共價締合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。總之，六個超變區將抗原結合特異性賦予抗體。然而，即使單一可變結構域（或者僅含三個對抗原具有特異性的超變區的半個Fv）具有識別並結合抗原的能力，其親和力也低於整個結合位點。

Fab片段也含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域（CH1）。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於在重鏈CH1結構域的羧基末端添加幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH是本文中如下Fab'的名稱：其中恆定結構域的一個或多個半胱胺酸殘基帶有至少一個游離硫醇基。F(ab') ₂抗體片段最初作為Fab'片段對產生，所述Fab'片段之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段的其他化學偶聯物也是已知的。

可以將來自任何脊椎動物物種的抗體（免疫球蛋白）的「輕鏈」基於其恆定結構域的胺基酸序列指定為兩個明顯不同的類型（稱為κ和λ）之一。

根據其重鏈的恆定結構域的胺基酸序列，可以將抗體指定為不同類別。存在完整抗體的五個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且可以將這些類別中的幾個類別進一步分為子類（同種型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應於不同抗體類別的重鏈恆定結構域分別稱為a、δ、e、γ和μ。不同免疫球蛋白類別的次單元結構和三維構型是熟知的。

「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在於單一多肽鏈中。在一些實施例中，Fv多肽還包含VH與VL結構域之間的多肽接頭，其使得scFv能夠形成用於抗原結合的所需結構。關於scFv的綜述參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg和Moore編輯, Springer-Verlag, 紐約, 第269-315頁 (1994)。

術語「雙抗體」是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含在同一多肽鏈中連接至輕鏈可變結構域（VL）的重鏈可變結構域（VH）（VH - VL）。通過使用過短而不允許同一條鏈上的兩個結構域之間配對的接頭，迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域配對，並產生兩個抗原結合位點。雙抗體是Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)。

術語「多特異性抗體」是以最廣泛含義使用，並且明確涵蓋具有多表位特異性的抗體。此類多特異性抗體包括但不限於包含重鏈可變結構域（VH）和輕鏈可變結構域（VL）的抗體，其中VH/VL單元具有多表位特異性；具有兩個或更多個VL和VH結構域的抗體，其中每個VH/VL單元與不同表位結合；具有兩個或更多個單一可變結構域的抗體，其中每個單一可變結構域與表位結合；全長抗體；抗體片段，如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙抗體、雙特異性雙抗體、三抗體、三功能抗體、已經共價或非共價連接的抗體片段。「多表位特異性」是指與一個或多個相同或不同目標上的兩個或更多個不同表位特異性結合的能力。

本文還提供具有本文所述的抗ILT2抗體的結合特異性（例如，包含抗原結合部分，如六個CDR或者VH和VL）的多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）。在一些實施例中，多特異性抗體另外具有另一種不同抗體的結合特異性，所述不同抗體可以靶向ILT2或不同蛋白質，如癌症抗原或另一細胞表面分子，所述細胞表面分子的活性介導病狀，如癌症。多特異性抗體及其製備是業內已知的。在一些實施例中，在本文所述的治療性方法、套組或製品中，使用本文所述的多特異性抗體代替本文所述的抗ILT2抗體。

本文的單株抗體可以使用業內熟知的方法來製備。例子包括多種技術，如以下文獻中的那些：Kohler, G.和Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975)；Kozbor等人, Immunology Today(1983) 4:72；Cole等人, 第77-96頁，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)。

除了在體內產生抗體的常規方法，可以使用噬菌體展示技術在體外生成抗體。重組抗體的這種產生與常規抗體產生相比顯著更快，並且可以針對極大數量的抗原生成重組抗體。此外，在使用常規方法時，證實許多抗原是非免疫原性的或極高毒性的，因此無法用於在動物中生成抗體。另外，重組抗體的親和力成熟（即，增加親和力和特異性）非常簡單並且相對較快。最後，可以在一個選擇程序中生成針對特定抗原的大量不同抗體。為了生成重組單株抗體，可以使用全部基於展示文庫的多種方法來生成具有不同抗原識別位點的抗體的大型庫。這個文庫可以以幾種方式來製備：可以通過選殖重鏈種系基因庫中的合成CDR3區域，從而生成大型抗體組庫，來生成合成組庫，可以從所述組庫選擇具有各種特異性的重組抗體片段。可以使用人淋巴細胞庫作為起始材料用於構建抗體文庫。可以構建人IgM抗體的初始組庫，從而產生具有高多樣性的人文庫。這種方法已經成功地廣泛用於選擇針對不同抗原的大量抗體。用於噬菌體文庫構建和重組抗體選擇的方案提供於熟知的參考文本中：Current Protocols in Immunology, Colligan等人 (編輯), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), 第17章, 第17.1節。

可以通過業內已知的任何方法將非人類抗體人源化。在一種方法中，將非人類互補決定區（CDR）插入人類抗體或共有抗體架構序列中。然後可以將其他變化引入抗體架構中以調節親和力或免疫原性。

在一些實施例中，如本文所述的抗體是中和抗體。如此處所討論的「中和」定義為通過本文的抗體減少蛋白質功能。在一個實施例中，如此處所討論的「中和」是抗體與免疫細胞表面，較佳地與不成熟和成熟的髓系來源細胞、T細胞和NK細胞的結合，從而阻斷這些細胞內部的抑制信號的傳播，並賦予抑制性較低的表型和功能。

在一些實施例中，本文的抗體或抗原結合片段是本文的藥劑。

在一些實施例中，本文提供編碼本文的抗體的核酸序列。在一個實施例中，如本文所述的抗體由如下核酸分子編碼，所述核酸分子包含具有與如本文所述的核苷酸序列的至少75%同一性的核苷酸序列。在一個實施例中，如本文所述的抗體由如下核酸分子編碼，所述核酸分子包含具有與如本文所述的核酸序列的至少80%同一性的核酸序列。在一個實施例中，如本文所述的抗體由如下核酸分子編碼，所述核酸分子包含具有與如本文所述的核酸序列的至少85%同一性的核酸序列。在一個實施例中，如本文所述的抗體有如下核酸編碼，所述核酸包含具有與如本文所述的核酸序列的至少90%同一性的核酸序列。在一個實施例中，如本文所述的抗體有如下核酸編碼，所述核酸包含具有與如本文所述的核酸序列的至少95%同一性的核酸序列。

根據另一態樣，提供一種編碼本文的抗體或抗原結合片段的核酸序列。

根據另一態樣，提供一種編碼本文的抗體或抗原結合片段的核酸分子。

在一些實施例中，編碼本文的抗體或抗原結合片段的重鏈可變區的核酸序列包含選自以下的核酸序列： caggttcagctgcagcagtctggagctgagctggcgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcacaagctatggtataagctgggtgaagcagagaactggacagggccttgagtgggttggagagatttatcctggaagtggtaattcttactacaatgagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcgtacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagatcgaatgatggttaccctgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca（SEQ ID NO: 32）、 gatgtacagcttcaggggtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgtctctcacctgctctgtcactggctactccatcaccagtggttattactggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggaatggatgggctacataagctacgatggtagcaataactacaacccatctctcaaaaatcgaatctccatcactcgtgacacatctaagaaccagtttttcctgaagttgaattctgtgacttctgaggacacagccacatattactgtgcccatggttactcatattactatgctatggactgctggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca（SEQ ID NO: 33）、 gatgtccagctgcaaggctctggccctggactggttaagccttccgagacactgtccctgacctgctctgtgaccggctactctatcacctccggctactactggaactggatcagacagttccccggcaagaaactggaatggatgggctacatctcctacgacggctccaacaactacaaccccagcctgaagaaccggatcaccatctctcgggacacctccaagaaccagttctccctgaagctgaactccgtgaccgctgccgataccgctacctactactgtgctcacggctactcctactactacgccatggatgcttggggccagggcacatctgtgacagtgtcctct（SEQ ID NO: 34）和 caggttcagctgcaacagtctgacgctgagttggtgaaacctggagcttcagtgaagatatcctgcaaggtttctggctacaccttcactgaccatactattcactggatgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggatatatttatcctagagatggtagtactaagtacaatgagaagttcaagggcaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctatttctgtgcaagaacctgggactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca（SEQ ID NO: 35）。

在一些實施例中，編碼本文的抗體或抗原結合片段的輕鏈可變區的核酸序列包含選自以下的核酸序列： gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgcagagccagtgaaagtgttgatagttatggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccattaatcctgtggaggctgatgatgttgcaacctattactgtcagcaaagtaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa（SEQ ID NO: 36）、 gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcaggacaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctcctacacatcaagattgcactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttcccacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa（SEQ ID NO: 37）、 gacatccagatgacccagtctccatcctctctgtctgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcggacctctcaggacatctccaactacctgaactggtatcagcagaaacccggcaaggccgtgaagctgctgatctcctacacctccagactgcactctggcgtgccctccagattttctggctctggatctggcaccgactacaccctgaccatcagttctctgcagcctgaggacttcgccacctactactgtcagcagggcaacaccctgcctacctttggccagggcaccaagctggaaatcaag（SEQ ID NO: 38）和 gacatccagatgacacaatcttcatcctacttgtctgtatctctaggaggcagagtcaccattacttgcaaggcaagtgaccacattaataattggttagcctggtatcagcagaaaccaggaaatgctcctaggctcttaatatctggtgcaaccagtttggaaactggggttccttcaagattcagtggcagtggatctggaaaggattacactctcagcattaccagtcttcagactgaagatgttgctacttattactgtcaacagtattggagtactccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa（SEQ ID NO: 39）。

在一些實施例中，編碼本文的抗體或抗原結合片段的重鏈的核酸序列包含以下序列或由其組成：gatgtccagctgcaaggctctggccctggactggttaagccttccgagacactgtccctgacctgctctgtgaccggctactctatcacctccggctactactggaactggatcagacagttccccggcaagaaactggaatggatgggctacatctcctacgacggctccaacaactacaaccccagcctgaagaaccggatcaccatctctcgggacacctccaagaaccagttctccctgaagctgaactccgtgaccgctgccgataccgctacctactactgtgctcacggctactcctactactacgccatggatgcttggggccagggcacatctgtgacagtgtcctctgcttccaccaagggaccctctgtgttccctctggctccttgctccagatccacctctgagtctaccgctgctctgggctgcctggtcaaggattactttcctgagcctgtgaccgtgtcttggaactctggtgctctgacctccggcgtgcacacatttccagctgtgctgcagtcctccggcctgtactctctgtcctctgtcgtgaccgtgccttctagctctctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccttccaacaccaaggtggacaagcgcgtggaatctaagtacggccctccttgtcctccatgtcctgctccagaattcgaaggcggcccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcaagaggaccccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagttcaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcctagctccatcgaaaagaccatctccaaggctaagggccagcctcgggaacctcaggtttacaccctgcctccaagccaagaggaaatgaccaagaatcaggtgtcactgacatgcctcgtgaagggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtctaatggccagccagagaacaattacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctctttcttcctgtattcccgcctgaccgtggacaagtccagatggcaagagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaagtccctgtctctgtccctgggcaaa（SEQ ID NO: 109）。在一些實施例中，編碼本文的抗體或抗原結合片段的重鏈的核酸序列還包含編碼信號肽的序列。在一些實施例中，編碼信號肽的序列是N末端序列。在一些實施例中，編碼信號肽的序列包含以下序列或由其組成：atggatctgctgcacaagaacatgaagcacctgtggttctttctgctgctggtggccgctcctagatgggtgttgtct（SEQ ID NO: 110）。在一些實施例中，編碼本文的抗體或抗原結合片段的重鏈的序列還包含終止密碼子。在一些實施例中，終止密碼子是多種終止密碼子。在一些實施例中，終止密碼子選自tga、tag和taa。

在一些實施例中，編碼本文的抗體或抗原結合片段的輕鏈的核酸序列包含以下序列或由其組成：gacatccagatgacccagtctccatcctctctgtctgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcggacctctcaggacatctccaactacctgaactggtatcagcagaaacccggcaaggccgtgaagctgctgatctcctacacctccagactgcactctggcgtgccctccagattttctggctctggatctggcaccgactacaccctgaccatcagttctctgcagcctgaggacttcgccacctactactgtcagcagggcaacaccctgcctacctttggccagggcaccaagctggaaatcaagagaaccgtggctgccccttccgtgttcatcttcccaccatctgacgagcagctgaagtccggcacagcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccctcgggaagccaaggtgcagtggaaggtggacaatgccctgcagtccggcaactcccaagagtctgtgaccgagcaggactccaaggactctacctacagcctgtcctccacactgaccctgtctaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaagtgacccaccagggactgtctagccccgtgaccaagtctttcaacagaggcgagtgc（SEQ ID NO: 111）。在一些實施例中，編碼本文的抗體或抗原結合片段的輕鏈的核酸序列還包含編碼信號肽的序列。在一些實施例中，編碼本文的抗體或抗原結合片段的輕鏈的序列還包含終止密碼子。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段是鼠的，並且編碼重鏈的序列選自SEQ ID NO: 32、33和35。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段是鼠的，並且編碼輕鏈的序列選自SEQ ID NO: 36、37和39。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段是人源化的，並且編碼重鏈的序列是SEQ ID NO: 34。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段是人源化的，並且編碼輕鏈的序列是SEQ ID NO: 38。

如本文可互換使用的「多核苷酸」或「核酸」是指任何長度的核苷酸聚合物，並且包括DNA和RNA。

編碼多肽的多核苷酸可以從任何來源獲得，所述來源包括但不限於從相信具有多肽mRNA並以可檢測水準表現所述多肽mRNA的組織製備的cDNA文庫。因此，編碼多肽的多核苷酸可以便捷地從自人類組織製備的cDNA文庫獲得。編碼多肽的基因也可以從基因組文庫獲得，或者通過已知的合成程序（例如，自動化核酸合成）獲得。

例如，多核苷酸可以編碼整個免疫球蛋白分子鏈，如輕鏈或重鏈。完整重鏈不僅包括重鏈可變區（VH），還包括重鏈恆定區（CH），其通常將包含三個恆定結構域：CH1、CH2和CH3；以及「鉸鏈」區。在一些情況下，恆定區的存在是所欲的。

可以由多核苷酸編碼的其他多肽包括抗原結合抗體片段，如單結構域抗體（「dAb」）、Fv、scFv、Fab'和CHI，並且已經切除CK或CL結構域。因為微型抗體小於常規抗體，它們可以在臨床/診斷應用中實現更好的組織滲透，而且在為二價的情況下，它們可以保留比單價抗體片段（如dAb）更高的結合親和力。因此，除非上下文另有要求，否則如本文所用的術語「抗體」不僅涵蓋完整抗體分子，而且涵蓋上述類型的抗原結合抗體片段。相對於相應的人受體架構，所編碼多肽中存在的每個架構區可以包含至少一個胺基酸取代。因此，例如，相對於受體架構區，架構區可以包含總計三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五個胺基酸取代。鑒於構成所公開蛋白質產物的單獨胺基酸的特性，熟習此項技術者將認可一些合理的取代。可以例如基於所涉及殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性方面的相似性來進行胺基酸取代，即，「保守取代」。

合適地，可以分離和/或純化本文所述的多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸是分離的多核苷酸。

如本文所用，術語「非天然存在的」物質、組成物、實體和/或物質、組成物或實體的任何組合或其任何語法變異體是條件性術語，其明確排除（但是僅排除）所述物質、組成物、實體和/或物質、組成物或實體的任何組合的如下那些形式：被一般熟習此項技術者熟知為「天然存在的」，或者被（或者可能在任何時間被）法官或者行政機關或司法機關確定或解釋為「天然存在的」。 治療和診斷方法

根據另一態樣，提供一種治療有需要的受試者的表現HLA、I型MHC或二者的癌症的方法，所述方法包括向所述受試者投予本文的抗體或抗原結合片段。

根據另一態樣，提供一種治療有需要的受試者的癌症的方法，所述方法包括確認受試者中ILT2的表現高於預定閾值，以及向所述受試者投予抑制基於ILT2的免疫抑制的藥劑，從而治療受試者的癌症。

根據另一態樣，提供一種治療有需要的受試者的癌症的方法，所述方法包括：向所述受試者投予抑制ILT2介導的免疫抑制的藥劑；以及向所述受試者投予基於PD-1/PD-L1的療法；從而治療受試者的癌症。

根據另一態樣，提供一種增加基於PD-1/PD-L1的療法針對癌細胞的功效的方法，所述方法包括使所述癌細胞與抑制ILT2介導的免疫抑制的藥劑接觸。

根據另一態樣，提供一種結合ILT2並抑制ILT2介導的免疫細胞抑制的藥劑，其與基於抗PD-L1/PD-1的療法組合用於治療患有癌症的受試者。

如本文所用，術語「治療（treatment）」或「治療（treating）」疾病、障礙或病症涵蓋減輕其至少一種症狀、降低其嚴重程度或抑制其進展（例如，癌症轉移）。治療不一定意味著疾病、障礙或病症被完全治癒。為了有效治療，本文的有用組成物僅需要降低疾病、障礙或病症的嚴重程度、降低與其相關的症狀的嚴重程度，或者提供患者或受試者的生活品質的改善。

如本文所用術語「治療」是指試圖在所治療的個體中改變病程的臨床干預，並且可以用於預防而進行或者在臨床病理學過程期間進行。治療的所需作用包括預防疾病的發生或復發、減輕症狀、減少疾病的病理學後果、降低疾病進展速率、改善疾病狀態、緩解或改進預後。術語「治療」還可以涵蓋影響培養中的細胞或組織的離體程序。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段是作為單一療法來投予。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段是與PD-1/PD-L1療法一起投予。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段是與調理劑一起投予。在一些實施例中，調理劑不是抗CD47藥劑。在一些實施例中，抗CD47藥劑是抗CD47抗體。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段不是與抗CD47藥劑或療法一起投予。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段不與抗CD47藥劑或療法組合。

在一些實施例中，治療包括增加免疫監督。在一些實施例中，治療包括增加免疫反應。在一些實施例中，治療包括減小腫瘤負荷。在一些實施例中，治療包括減少癌症轉移。在一些實施例中，治療包括增加針對癌症的細胞毒性。在一些實施例中，治療包括增加針對癌症的發炎性反應。在一些實施例中，治療包括增加癌症的吞噬作用。

如本文所用術語「受試者」是指個體或患者，其為脊椎動物，例如，哺乳動物，尤其包括人類。在一些實施例中，受試者是人類。在一些實施例中，受試者是哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、狗、兔子或非人類靈長類動物）。在一些實施例中，受試者患有癌症。

在一些實施例中，癌症是表現HLA的癌症。在一些實施例中，HLA是HLA-G，如HLA-G1和HLA-G的其他亞型。在一些實施例中，癌症是表現I型MHC的癌症。在一些實施例中，癌症是表現PD-L1的癌症。在一些實施例中，癌症是實體癌。在一些實施例中，癌症是血液癌症。在一些實施例中，癌症是基於PD-1和/或PD-L1的療法難治的。在一些實施例中，癌症從未對基於PD-1和/或PD-L1的療法有反應。在一些實施例中，癌症對基於PD-1和/或PD-L1的療法有反應，但是變為難治的。在一些實施例中，本文的方法將難治性癌症轉化為反應性癌症。

在一些實施例中，癌症是無法切除的、轉移的，或者是標準批准療法難治的或並非標準批准療法的候選疾病，或者上述的任何組合。

在一些實施例中，所述方法包括確認癌症表現HLA、I型MHC或二者。在一些實施例中，所述方法包括確認癌症表現HLA。在一些實施例中，所述方法包括確認癌症表現I型MHC。在一些實施例中，所述方法包括確認癌症表現I型MHC（即，I類HLA，在人體中）。在一些實施例中，確認包括測量癌症中的表現。在一些實施例中，確認包括測量癌症表面上的表現。在一些實施例中，在癌症中和/或在癌症上是在癌細胞中和/或在癌細胞上。在一些實施例中，確認包括測量癌症分泌的HLA-G。在一些實施例中，確認包括測量可溶HLA-G。在一些實施例中，可溶HLA-G是在體液中。在一些實施例中，體液是血液。

在一些實施例中，所述方法包括確認受試者中ILT2的表現。在一些實施例中，所述方法包括確認受試者中ILT2的表現高於預定閾值。在一些實施例中，確認包括測量受試者中ILT2的表現。在一些實施例中，確認是在投予之前。在一些實施例中，測量是在投予之前。在一些實施例中，ILT2的表現是在免疫細胞中的表現。在一些實施例中，ILT2的表現是在受試者的免疫細胞中的表現。在一些實施例中，免疫細胞是周邊血液免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞是周邊血液單核細胞（PBMC）。在一些實施例中，免疫細胞是腫瘤內免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞是腫瘤微環境（TME）中的免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞選自CD8陽性T細胞、巨噬細胞、NK細胞和T _EMRA細胞。在一些實施例中，免疫細胞是CD8陽性T細胞。在一些實施例中，免疫細胞是周邊血液CD8陽性T細胞。

在一些實施例中，投予本文的抗體或抗原結合片段包括投予包含本文的抗體或抗原結合片段的醫藥組成物。在一些實施例中，投予治療有效量的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，醫藥組成物還包含載劑、賦形劑或佐劑。在一些實施例中，載劑是醫藥上可接受的載劑。

如本文所用，術語「載劑」、「賦形劑」或「佐劑」是指醫藥組成物中並非活性劑的任何組分。如本文所用，術語「醫藥上可接受的載劑」是指無毒的、惰性固體、半固體液體填充劑、稀釋劑、包封材料、任何類型的配製輔助劑，或僅為無菌水性介質，如鹽水。可以用作醫藥上可接受的載劑的材料的一些例子是糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇，如丙二醇；多元醇，如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；無熱原水；等滲鹽水、林格氏溶液；乙醇和磷酸鹽緩衝溶液，以及用於醫藥調配物中的其他無毒相容物質。可以在本文中用作載劑的物質的一些非限制性例子包括糖、硬脂酸、硬脂酸鎂、硫酸鈣、多元醇、無熱原水、等滲鹽水、磷酸鹽緩衝溶液，以及用於其他醫藥調配物中的其他無毒的醫藥上相容的物質。潤濕劑和潤滑劑（如十二烷基硫酸鈉）以及賦形劑、穩定劑、抗氧化劑和防腐劑也可以存在。可以使用任何無毒的、惰性且有效的載劑來配製本文中考慮的組成物。

載劑可以包含以重量計總共約0.1%至約99.99999%的本文呈現的醫藥組成物。

術語「治療有效量」是指藥物的有效治療哺乳動物中的疾病或障礙的量。術語「治療有效量」是指在所需劑量和時間段下有效實現所需治療或預防結果的量。確切劑型和方案將由醫師根據患者的狀況來確定。

在一些實施例中，所述方法還包括向受試者投予調理劑。在一些實施例中，所述方法還包括使細胞與調理劑接觸。在一些實施例中，調理劑是表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑。在一些實施例中，EGFR抑制劑是西妥昔單抗。在一些實施例中，調理劑不是抗CD47藥劑。在一些實施例中，所述方法還包括向受試者投予基於PD-1/PD-L1的療法。在一些實施例中，所述方法還包括使細胞與基於PD-1/PD-L1的療法接觸。在一些實施例中，所述方法還包括使細胞在基於PD-1/PD-L1的療法的存在下生長。在一些實施例中，基於PD-1/PD-L1的療法是PD-1或PD-L1阻斷抗體（例如，派姆單抗）。在一些實施例中，所述方法不包括投予抗CD47藥劑或療法。在一些實施例中，所述方法沒有投予抗CD47藥劑或療法。在一些實施例中，所述方法還包括投予抗CD47藥劑或療法。

在一些實施例中，抑制基於ILT2的免疫抑制的藥劑與ILT2結合。在一些實施例中，所述藥劑結合ILT2細胞外結構域。在一些實施例中，所述藥劑是ILT2拮抗劑。在一些實施例中，所述藥劑是ILT2阻斷抗體。在一些實施例中，所述藥劑抑制ILT2與B2M的相互作用。在一些實施例中，所述藥劑是本文的抗體。

在一些實施例中，抑制基於ILT2的免疫抑制的藥劑是在調理劑之前、之後或同時投予。在一些實施例中，抑制基於ILT2的免疫抑制的藥劑和調理劑是在單一組成物中投予。在一些實施例中，抑制基於ILT2的免疫抑制的藥劑和調理劑是在分開的組成物中投予。

在一些實施例中，抑制基於ILT2的免疫抑制的藥劑是在PD-1/PD-L1療法之前、之後或同時投予。在一些實施例中，抑制基於ILT2的免疫抑制的藥劑和PD-1/PD-L1療法是在單一組成物中投予。在一些實施例中，抑制基於ILT2的免疫抑制的藥劑和PD-1/PD-L1療法是在單獨組成物中投予。在一些實施例中，所述藥劑或療法中的至少一種適於共投予（co-administration）。

如本文所用的術語「適於共投予」是指抗體以使得可將其安全且容易地投予至受試者的形式存在。在一些非限制性實施例中，共投予可以通過注射（即，腫瘤內注射、靜脈內注射或輸注或者皮下注射）或通過其他已知方法（如口服投予或吸入）來進行。在一些實施例中，抗體將包含於醫藥組成物內，如可以被安全且容易地投予至受試者。在一些實施例中，醫藥組成物包含抗體和醫藥上可接受的載劑或賦形劑。

在一些實施例中，HLA是HLA-G。在一些實施例中，HLA是非典範HLA。在一些實施例中，HLA是典範HLA。在一些實施例中，確認mRNA表現。在一些實施例中，確認蛋白質表現。在一些實施例中，確認蛋白質的表面表現。測量表現的方法是業內熟知的，並且包括PCR、Q-PCR、RNA印跡、免疫印跡、原位雜交、免疫染色和FACS。在一些實施例中，所述方法包括癌症的FACS分析以確認表面表現。

應理解，本文的抗體或抗原結合片段和醫藥組成物可以用於如本文所述的治療方法中，可以用於如本文所述的治療中，和/或可以用於製造用於如本文所述的治療的藥物。本文還提供套組和製品，其包含本文所述的抗體或抗原結合片段或醫藥組成物。 調配物

本文還考慮用於人類醫藥用途的醫藥調配物，其包含識別ILT2的至少一種抗體作為活性劑，所述醫藥調配物用於製造用於本文以不同方式描述的病症的治療、診斷或預防的治療組成物。

在此類醫藥和藥物調配物中，活性劑較佳地與一種或多種醫藥上可接受的載劑以及視情況地任何其他治療成分一起使用。在與配製品中的其他成分相容並且對其接受者沒有過度有害的意義上，一種或多種載劑必須是醫藥上可接受的。活性劑是以有效實現如上所述的所需藥理學作用的量以及以適合於實現所需每日劑量的量來提供。

通常，將使包含抗體的抗原結合部分的本文的分子懸浮於用於治療用途的無菌鹽水溶液中。醫藥組成物可以替代地配製以控制活性成分（包含抗體的抗原結合部分的分子）的釋放或延長其在患者系統中的存在。多種合適的藥物遞送系統是已知的，並且包括例如可植入的藥物釋放系統、水凝膠、羥甲基纖維素、微膠囊、脂質體、微乳液、微球體等。受控釋放製劑可以通過使用聚合物複合或吸附根據本文的分子來製備。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的基質以及硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酸酐共聚物的基質。根據本文的分子（即，抗體或抗體片段）從這種基質的釋放速率取決於所述分子的分子量、所述分子在所述基質內的量以及分散顆粒的大小。

本發明的醫藥組成物可以通過任何合適的手段來投予，如口服、局部、鼻內、皮下、肌內、靜脈內、動脈內、關節內、病灶內或腸胃外。通常，靜脈內（IV）或關節內投予將是較佳的。

對於一般熟習此項技術者將是明顯的，根據本文的分子的治療有效量將尤其取決於投予方案、所投予分子的單位劑量、分子是否與其他治療劑組合投予、患者的免疫狀態和健康、所投予分子的治療活性以及治療醫師的判斷。

儘管本文的分子（抗體或其片段）的適當劑量根據投予途徑、分子類型（多肽、多核苷酸、有機分子等）、患者的年齡、體重、性別或狀況而變化，並且最終應由醫師來決定，在口服投予的情況下，每日劑量通常可以在每kg體重約0.01 mg至約500 mg之間，較佳地約0.01 mg至約50 mg，更佳地約0.1 mg至約10 mg。在腸胃外投予的情況下，每日劑量通常可以在每kg體重約0.001 mg至約100 mg之間，較佳地約0.001 mg至約10 mg，更佳地約0.01 mg至約1 mg。每日劑量可以例如按通常為每天1-4次單獨投予的方案來投予。其他較佳的投予方法包括關節內投予每kg體重約0.01 mg至約100 mg。達到有效量方面的各種考慮因素描述於例如以下文獻中：Goodman和Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 第8版, Pergamon Press, 1990；以及Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Co., 伊斯頓, 賓夕法尼亞州, 1990。

組合化學療法的合適的投予方案是業內已知的，並且描述於例如以下文獻中：Saltz等人, Proc ASCO(1999) 18:233a和Douillard等人, Lancet(2000) 355:1041-7。

將作為活性成分的本文的分子溶解、分散或混合於眾所周知的醫藥上可接受並且與活性成分相容的賦形劑中。合適的賦形劑是例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）、右旋糖、甘油等及其組合。其他合適的載劑是熟習此項技術者熟知的。另外，如果期望，組成物可以含有少量輔助物質，如潤濕或乳化劑、pH緩衝劑。 製造方法

根據另一態樣，提供一種產生藥劑的方法，所述方法包括：獲得與ILT2細胞外結構域或其片段結合的藥劑，測試所述藥劑抑制ILT2與B2M之間的相互作用的能力，以及選擇抑制ILT2與B2M之間的相互作用的至少一種藥劑；從而產生藥劑。如本文所用，藥劑可以是例如分子或蛋白質。

根據另一態樣，提供一種產生藥劑的方法，所述方法包括：培養包含含有編碼藥劑的核酸序列的一種或多種載體的宿主細胞，其中所述核酸序列是通過以下方式選擇的藥劑的核酸序列： i. 獲得與ILT2細胞外結構域或其片段結合的藥劑； ii. 測試所述藥劑抑制ILT2與B2M之間的相互作用的能力；以及 iii. 選擇抑制ILT2與B2M之間的相互作用的至少一種藥劑；從而產生藥劑。

根據另一態樣，提供一種產生藥劑的方法，所述方法包括：獲得與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的人類ILT2序列結合的藥劑；從而產生藥劑。

根據另一態樣，提供一種鑒定與重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NO: 48和49的參考抗體競爭結合至ILT2的抗體的方法，所述方法包括使抗體文庫與包含選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的ILT2序列的多肽序列接觸，以及從所述文庫選擇與所述ILT2序列結合的抗體，從而獲得與所述參考抗體競爭結合至ILT2的抗體。

根據另一態樣，提供一種產生藥劑的方法，所述方法包括：培養包含含有編碼藥劑的核酸序列一種或多種載體的宿主細胞，其中所述核酸序列是通過獲得與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的人類ILT2序列結合的藥劑來選擇的藥劑的核酸序列；從而產生藥劑。

在一些實施例中，所述方法包括獲得與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的序列結合的藥劑。在一些實施例中，核酸序列是通過獲得與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的序列結合的藥劑來選擇的藥劑的核酸序列。在一些實施例中，所述方法包括獲得與選自SEQ ID NO: 68至70的序列結合的藥劑。在一些實施例中，核酸序列是通過獲得與選自SEQ ID NO: 68至70的序列結合的藥劑來選擇的藥劑的核酸序列。在一些實施例中，所述方法包括獲得與選自SEQ ID NO: 71和72的序列結合的藥劑。在一些實施例中，核酸序列是通過獲得與選自SEQ ID NO: 71和72的序列結合的藥劑來選擇的藥劑的核酸序列。在一些實施例中，所述方法包括獲得與SEQ ID NO: 71和72的序列結合的藥劑。在一些實施例中，核酸序列是通過獲得與SEQ ID NO: 71和72的序列結合的藥劑來選擇的藥劑的核酸序列。在一些實施例中，參考抗體是15G8。在一些實施例中，參考抗體是15G8-13。

在一些實施例中，所述方法還包括測試藥劑抑制ILT2介導的免疫抑制的能力，以及選擇抑制ILT2介導的免疫抑制的至少一種藥劑。在一些實施例中，核酸序列屬於通過以下方式選擇的藥劑：測試藥劑抑制ILT2介導的免疫抑制的能力，並且選擇抑制ILT2介導的免疫抑制的藥劑。在一些實施例中，所述方法包括測試所述藥劑誘發以下中的至少三項的能力：增加的巨噬細胞對癌細胞的吞噬作用、增加的針對癌細胞的T細胞活性、增加的M1巨噬細胞的生成、減少的M2巨噬細胞的生成、增加的樹突細胞至腫瘤微環境的募集、增加的樹突細胞活化，以及增加的自然殺傷（NK）細胞針對的細胞毒性；以及選擇誘發所述至少三項的至少一種藥劑。在一些實施例中，所述方法包括測試藥劑在以下的至少三種中誘導作用的能力：T細胞、NK細胞、樹突細胞和巨噬細胞。在一些實施例中，所述方法包括測試藥劑在T細胞、NK細胞、樹突細胞和巨噬細胞中誘發作用的能力。

在一些實施例中，增肌功效包括抗癌作用的協同增加。在一些實施例中，抗癌作用是促發炎性細胞因子分泌。在一些實施例中，促發炎性細胞因子選自GM-CSF、IL-6和IFNγ。在一些實施例中，促發炎性細胞因子是GM-CSF、IL-6或IFNγ。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，促發炎性細胞因子是GM-CSF。在一些實施例中，增加的功效包括T細胞啟動的協同增加。在一些實施例中，增加的功效包括T細胞的細胞毒性的協同增加。在一些實施例中，增加的功效包括T細胞啟動和細胞毒性二者的協同增加。在一些實施例中，所述增加包括增加的膜CD107a表現。在一些實施例中，所述增加的特徵為增加的膜CD107a表現。在一些實施例中，所述增加是與不投予或接觸藥劑時的功效相比。在一些實施例中，增加功效包括將基於PD-1/PD-L1的療法難治的癌症轉化為對所述療法有反應的癌症。在一些實施例中，癌症表現HLA。在一些實施例中，癌症表現I型MHC。

在一些實施例中，增加的巨噬細胞發炎性活性包括增加的巨噬細胞對癌細胞的吞噬作用。在一些實施例中，增加的巨噬細胞發炎性活性包括增加M1巨噬細胞的生成。在一些實施例中，增加的巨噬細胞發炎性活性包括減少M2巨噬細胞的生成。在一些實施例中，增加的巨噬細胞發炎性活性包括增加巨噬細胞上的M1表型。在一些實施例中，增加的巨噬細胞發炎性活性包括減少巨噬細胞上的M2表型。

在一些實施例中，樹突細胞活性包括樹突細胞啟動。在一些實施例中，樹突細胞活性包括樹突細胞至腫瘤的募集。在一些實施例中，樹突細胞活性是針對癌細胞的活性。在一些實施例中，針對癌細胞的活性是在TME中的活性。在一些實施例中，腫瘤是TME。在一些實施例中，腫瘤包含TME。在一些實施例中，腫瘤包括腫瘤及其TME。在一些實施例中，樹突細胞活性包括呈獻抗原呈獻。

在一些實施例中，測試藥劑的能力包括藥劑增加以下中的至少1、2、3、4、5種或全部的能力：針對癌細胞的T細胞活性、巨噬細胞發炎性活性、樹突細胞活性和自然殺傷（NK）細胞針對癌細胞的細胞毒性。每種可能性表示本文的單獨實施例。在一些實施例中，選擇至少一種藥劑包括選擇增加以下中的至少1、2、3、4、5種或全部的藥劑：針對癌細胞的T細胞活性、巨噬細胞發炎性活性、樹突細胞活性和自然殺傷（NK）細胞針對癌細胞的細胞毒性。在一些實施例中，增加巨噬細胞發炎性活性是增加M1巨噬細胞的生成和/或增加巨噬細胞對癌細胞的吞噬作用。在一些實施例中，增加巨噬細胞發炎性活性是減少M2巨噬細胞的生成。在一些實施例中，測試藥劑的能力包括藥劑增加巨噬細胞發炎性活性的能力。在一些實施例中，測試藥劑的能力包括藥劑增加樹突細胞活性的能力。在一些實施例中，至腫瘤是至TME。在一些實施例中，測試藥劑的能力包括藥劑增加NK細胞針對癌細胞的細胞毒性的能力。

在一些實施例中，所述方法還包括測試藥劑抑制ILT2與B2M的相互作用的能力。在一些實施例中，所述相互作用是直接相互作用。在一些實施例中，所述方法還包括測試藥劑抑制ILT2與B2M的接觸的能力。在一些實施例中，相互作用是結合。在一些實施例中，接觸是結合。在一些實施例中，所述方法還包括測試藥劑結合表位的能力。

以下實例意圖說明如何製備和使用本發明的化合物和方法，並且決不應被視為限制。儘管現在將結合具體實施例來描述本文，明顯的是，許多修改和改變對於熟習此項技術者將是清楚的。因此，意圖包括落在所附申請專利範圍的精神和廣泛範圍內的所有此類修改和改變。實例

一般來說，本文所用的命名法和本文中使用的實驗室程序包括分子、生物化學、微生物學和重組DNA技術。此類技術在文獻中有充分解釋。參見例如，“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook等人, (1989)；“Current Protocols in Molecular Biology” 第I-III卷 Ausubel, R. M., 編輯 (1994)；Ausubel等人, “Current Protocols in Molecular Biology,” John Wiley and Sons, 巴爾的摩, 馬里蘭州 (1989)；Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning,” John Wiley & Sons, 紐約 (1988)；Watson等人, “Recombinant DNA,” Scientific American Books, 紐約；Birren等人 (編輯) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series,” 第1-4卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 紐約 (1998)；如美國專利號4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；“Cell Biology: A Laboratory Handbook,” 第I-III卷 Cellis, J. E., 編輯 (1994)；“Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique”，Freshney, Wiley-Liss, 紐約 (1994), 第三版；“Current Protocols in Immunology” 第I-III卷 Coligan J. E., 編輯 (1994)；Stites等人 (編輯), “Basic and Clinical Immunology” (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell和Shiigi (編輯), “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)；“Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols.” Vincent Ossipow, Nicolas Fischer. Humana Press (2014)；“Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols.” Maher Albitar. Springer Science & Business Media (2007)，所有所述文獻都是通過引用併入。在本檔通篇中提供其他通用參考文獻。 材料和方法

抗體- 商業抗ILT2 mAb是：殖株#1 - GHI/75（BioLegend，目錄號333704），殖株#2 - HP-F1（eBioscience，目錄號16-5129）。所用另外的mAb：HLA-G（MEM-G/9；Abcam，目錄號ab7758；G-0031,），ILT4（42D1，Biolegend，目錄號338704），ILT6（Sino Biological，目錄號13549-MM06），LILRA1（R&D systems，目錄號MAB30851），泛HLA（W6/22；eBioscience，目錄號16-9983-85）以及His（Proteintech，目錄號10001-0-AP）。

流式細胞分析- 一般來說，在所有步驟期間將細胞保持在冰上或4ºC下。在染色前，將5X10 ⁵個細胞用FACS緩衝液（含有0.1% BSA的PBS）中的50 µg/mL人IgG（Sigma，目錄號I4506）封閉15 min。抗體以製造商推薦的濃度使用並且在暗中培育30 min。培育以100 μL在96孔U形底板中進行，將細胞用200 μL FACS緩衝液洗滌兩次並轉移至FACS管的150 μL FACS緩衝液中以供分析。在Gallios流式細胞儀（Beckman coulter）上使用用於Gallios流式細胞分析採集軟體的Kaluza分析細胞。

髓樣細胞（ Myeloid cell ）分化- 單核細胞是通過陰性選擇方法使用EasySep™人單核細胞富集套組（STEMCELL，目錄號19059）從來自健康供體的新鮮血樣分離。通過對相關標記的FACS分析以及通過對特徵性細胞因子分泌的分析，針對所指示表型測試不同細胞群。對於成熟，以0.8X10 ⁶/mL的密度在含有生長因子的RPMI培養基中培養單核細胞，在第3天和第6天更換培養基。使發炎性M1巨噬細胞在50 ng/mL GM-CSF（M1表型）的存在下成熟6天，然後在20 ng/mL IFN-γ和50 ng/mL LPS的存在下成熟48 hr。將抑制性M2巨噬細胞使用50 ng/mL M-CSF分化6天，然後使用10 ng/mL M-CSF和20 ng/mL IL-4和IL-10分化48 hr。將樹突細胞通過50 ng/mL GM-CSF和20 ng/mL IL-4誘導6天，並且進一步分化為成熟（100 ng/mL LPS）或致耐受性（IL-10 100 U/mL和IFN-a2b 1000 U/mL）樹突細胞。

轉染- 通過將HLA-G1 cDNA選殖至PCDNA3.1載體中來生成HLA-G1（編碼全長HLA-G轉錄物）質體。轉染是使用jetPEI ^®轉染試劑（PolyPlus Transfections）來進行。通過將人類ILT2蛋白的細胞外部分與小鼠CD3基因的跨膜和胞質殘基框內組合來生成ILT2/CD3z質體。使用如製造商所述的Nucleofector II（Lonza）將質體核轉染至小鼠BW5417.3 T細胞株中。在含有G418的培養基中選擇穩定轉染子。

NK 和癌細胞株共培養測定- 將NK細胞與所指示的細胞株在抗ILT2抗體和匹配的同種型對照的存在下在37ºC下一起培育5小時。使用螢光分析LDH檢測套組（Promega）測量細胞毒性水準。

流式細胞分析阻斷測定- 將在N末端與人IgG1的Fc部分融合的重組人類ILT2蛋白與生物素（Innova bioscience）綴合。將總計5X10 ⁵個A375/HLA-G1細胞以100 µL的體積在抗ILT2殖株#1或同種型匹配對照mAb和與生物素綴合的ILT2-Fc（10 μg/mL）的存在下在室溫下培育30分鐘。在幾個洗滌步驟後，以0.2 μg/mL的終濃度添加鏈黴抗生物素蛋白-PE並且在冰上培育30 min，之後進行FACS分析。

BW ILT2/CD3z 鏈嵌合體測定- 將3X10 ⁴個BW/ILT2z與等效數量的A375/WT或A375/HLA-G1細胞混合24 hr。使用所指示濃度的功能性mAb和匹配的同種型對照。通過商業ELISA套組（BioLegend）評價分泌的小鼠IL2的量。

吞噬作用測定- 使用人單核細胞富集套組從獲自健康血液庫供體的血沉棕黃層樣品分離單核細胞。使單核細胞在補充有10%人血清和M-CSF（50 ng/ml）的RPMI培養基中生長6至7天，以生成巨噬細胞。使成熟巨噬細胞脫離並重接種於96孔板中（15K個細胞/孔），並且在37c和5% CO2下O.N培育。將來自各種適應症的靶初生癌細胞或細胞株用pHrodo紅色細胞標記染料標記，洗滌並添加至巨噬細胞（75K個細胞/孔，以實現1 : 5的效應物:目標比率）。用IncuCyte S3儀器測定測定板。

IncuCyte pHrodo紅色細胞標記染料的螢光在酸性環境（如吞噬體中固有的酸性環境）中增加，從而使得能夠通過測量螢光對吞噬事件進行定量。IncuCyte儀器每30 min對測定板採樣（4個圖像/孔，X10放大），用於螢光紅色信號強度和相點陣圖。吞噬事件反映為紅色螢光信號的積累，並且吞噬速率是從紅色螢光信號積累的動力學來反映。實例 1 ：在癌細胞和癌症相關免疫細胞上發現 ILT2 和 HLA-G

ILT2是在健康免疫細胞以及許多腫瘤細胞的表面上發現的已知免疫抑制性分子。已經顯示ILT2結合MHC-1以及HLA類分子（HLA-G，以及HLA-F和HLA-B27），並且與CD8競爭且由此抑制T細胞啟動。為了進一步理解表現ILT2的細胞的範圍，使用商業抗體（抗體#1）對多種免疫細胞進行流式細胞分析分析。如文獻中所報導，源自黑色素瘤患者的細胞毒性T細胞（CTL）以及自然殺傷（NK）細胞對ILT2的表面表現呈陽性（圖 1）。也檢查來自健康供體血液的單核細胞，並且發現其高度表現ILT2（圖 2，圖最左側）。在單核細胞分化為不同髓樣細胞群（樹突細胞和巨噬細胞）後，不論是不成熟的、發炎性的還是致耐受性的，都保留ILT2表現（圖 2，圖右側）。

通過TCGA資料庫的生物資訊學分析來檢查不同癌症適應症中的ILT2表現（圖 3A）。有趣的是，觀察到ILT2 RNA表現水準與TCGA中表示的樣品腫瘤中髓源性抑制細胞（MDSC）和抑制性M2腫瘤相關巨噬細胞（TAM）的存在之間的關聯（圖 3B）。通過流式細胞分析對來自不同實體瘤的新鮮腫瘤樣品的分析證實了腫瘤微環境（TME）中先天和適應性免疫細胞的ILT2表現。從非小細胞肺癌（NSCLC）、腎癌（RCC）、頭頸癌、食道癌和結腸癌患者收集腫瘤樣品，並且通過酶促消化生成單細胞懸浮液。對於總免疫細胞、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞和自然殺傷細胞（NK），ILT2陽性細胞的百分比呈現於圖 3C中。因此，明顯地，同時在具有抗癌活性的細胞（發炎性細胞）上以及在具有癌症促進和免疫抑制活性的細胞（致耐受性和MDSC）上表現ILT2。

還在各種癌症中研究HLA-G表現。將來自不同適應症的癌症樣品的組織微陣列（TMA）通過免疫組織化學用商業多株HLA-G抗體染色。指示每個癌症類型的樣品病例的百分比（圖 4A）。另外，對於幾種適應症，檢查擴展的TMA。通過用染色強度乘以陽性細胞的百分比來計算HLA-G染色的得分。在高百分比的食道癌、胃癌、頭頸癌和腎癌中檢測到高於100的HLA-G染色的高得分（圖 4B）。每種適應症中陽性病例的百分比顯示於表 1中。表 1 ：按腫瘤類型，對於 HLA-G 呈陽性的病例的百分比

癌症	腫瘤類型	N	陽性病例 (%)
男性泌尿生殖系統	前列腺腺癌和睾丸精原細胞瘤	6	0
甲狀腺	甲狀腺癌	6	0
卵巢	卵巢 - 腺癌和顆粒細胞瘤	8	11
CNS	大腦、小腦、眼	15	17
肺	肺 - 腺癌、大細胞、小細胞和鱗狀細胞癌	12	17
肉瘤	骨、腹腔、腹膜後腔、軟組織	15	20
胰腺	胰腺腺癌	9	22
膀胱	膀胱移行細胞癌	3	33
皮膚	鱗狀細胞癌和黑色素瘤	6	33
大腸	結腸腺癌和直腸腺癌	5	40
腎	腎 - 透明細胞癌、腎母細胞瘤、嫌色性腺瘤、肉瘤樣癌	12	42
上胃腸道	食道癌和胃腺癌	9	56
乳房	乳房 - 浸潤性導管癌	3	67
H&N	H&N - 喉鱗狀細胞癌	3	67
淋巴瘤	霍奇金淋巴瘤、彌漫性小B細胞和T細胞淋巴瘤	9	78

HLA-G具有可溶分泌形式以及更常見的膜形式。為了檢查癌症患者中可溶HLA-G的表現水準，使用商業ELISA檢查血漿樣品中HLA-G的存在。發現如與正常（健康）對照相比，HLA-G在幾種癌症適應症中過表現（圖 5）。此外，在某些癌症類型中，可以檢測到具有顯著更高水準的患者群體。實例 2 ： ILT2 阻斷抗體的生成

採用雜交瘤技術生成單株ILT2拮抗劑抗體。最初生成69種ILT2特異性雜交瘤。根據其在所檢查的各種測定中的較佳結合、交叉反應性譜和功能活性選擇3種前導抗體。所選抗體是19E3、15G8和17F2。使用常用方法對這些抗體進行測序。所選抗體的可變區的序列顯示於圖 6A中。通過KABAT系統確定CDR。使用常用CDR移植方法將15G8和19E3人源化。簡言之，鑒定來自初始雜交瘤來源抗體的必需的CDR和架構殘基並將其移植至種系人類抗體的可變區和恆定區中。最終人源化抗體是IgG4抗體。

用於移植的IgG4重鏈恆定區含有已知會降低與FcγR的結合的兩個點突變。這些突變照慣例稱為S228P和L235E，但是它們的確切位置取決於重鏈可變區的長度。在15G8抗體的情況下，位置227的絲胺酸突變為脯胺酸並且位置234的白胺酸突變為麩胺酸。在19E3的情況下，位置225的絲胺酸突變為脯胺酸並且位置232的白胺酸突變為麩胺酸。最終人源化15G8還含有單一胺基酸變化，其去除CDR-H3中的半胱胺酸並將其用丙胺酸或絲胺酸替代。進行此變化以改進可開發性。確認兩種所得抗體的結合，並且選擇具有丙胺酸的15G8抗體用於進一步測試。下文提及的所有人源化15G8都是指丙胺酸變異體。

在15G8 CDR的移植期間，生成五條重鏈和四條κ輕鏈。將這些鏈命名為VH1至5和Vk1至4。這些鏈的序列提供於表 2中。通過將每條重鏈與每條輕鏈組合，二十種不同的所得抗體是可能的。全部二十種可能抗體在HEK EBNA細胞中暫態表現，並且使用Biacore T200針對與重組ILT2肽的結合測試上清液。使用嵌合15G8抗體作為對照。結合結果歸納於表 3中。表 2 ：人源化 15G8 鏈

描述	序列	SEQ
VH1	DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTSVTVSS	28
VH2	DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSS	56
VH3	DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSS	57
VH4	QVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSS	58
VH5	QVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSITSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGYISYDGSNNYNPSLKNRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTTVTVSS	59
Vk1	DIQMTQSTSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIK	60
Vk2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIK	61
Vk3	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPTFGQGTKLEIK	24
Vk4	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPTFGQGTKLEIK	62

SEQ：SEQ ID NO. 表 3 ：全部二十種抗體組合的結合測定的結果

抗體	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(/M)	相對 KD	表現 (ug/mL)	所選抗體的命名
對照	8.08x10^5	1.02x10^-2	1.26x10^-8	1	3.65	-
VH1/Vk1	1.06x10^6	9.31x10^-3	8.77x10^-9	0.7	1.27	-
VH1/Vk2	7.69x10^5	6.78x10^-3	8.82x10^-9	0.7	5.3	-
VH1/Vk3	1.30x10^6	9.05x10^-3	6.94x10^-9	0.55	6.81	15G8-13
VH1/Vk4	4.57x10^5	8.54x10^-3	1.87x10^-8	1.48	23.5	-
VH2/Vk1	7.60x10^5	7.28x10^-3	9.58x10^-9	0.76	1.7	-
VH2/Vk2	7.52x10^5	6.60x10^-3	8.79x10^-9	0.7	6.38	-
VH2/Vk3	9.15x10^5	7.60x10^-3	8.31x10^-9	0.66	7.69	15G8-23
VH2/Vk4	5.54x10^5	7.89x10^-3	1.42x10^-8	1.13	26.6	-
VH3/Vk1	7.99x10^5	6.81x10^-3	8.52x10^-9	0.68	3.49	-
VH3/Vk2	8.11x10^5	6.64x10^-3	8.19x10^-9	0.65	11.2	15G8-32
VH3/Vk3	6.77x10^5	6.11x10^-3	9.03x10^-9	0.72	10.3	-
VH3/Vk4	6.61x10^5	8.32x10^-3	1.26x10^-8	1	29	15G8-34
VH4/Vk1	9.15x10^5	7.92x10^-3	8.66x10^-9	0.69	1.74	-
VH4/Vk2	6.90x10^5	6.85x10^-3	9.93x10^-9	0.79	6.38	-
VH4/Vk3	8.86x10^5	8.43x10^-3	9.51x10^-9	0.75	7.87	-
VH4/Vk4	7.24x10^5	9.77x10^-3	1.35x10^-8	1.07	24.8	15G8-44
VH5/Vk1	1.16x10^6	9.94x10^-3	8.55x10^-9	0.68	3.09	-
VH5/Vk2	1.26x10^6	9.54x10^-3	7.57x10^-9	0.6	6.77	-
VH5/Vk3	6.82x10^5	7.20x10^-3	1.06x10^-8	0.84	12.4	15G8-53
VH5/Vk4	1.14x10^6	1.17x10^-2	1.03x10^-8	0.82	27.9	15G8-54

根據進一步研究選擇二十種組合中的七種。不管重鏈如何，含有輕鏈Vk1的抗體始終產生最低抗體產量，因此不選擇含有Vk1的抗體。Vk4始終產生最高抗體產量，因此選擇VH3、VH4和VH5的組合。儘管Vk4與VH1和VH2的組合也產生高表現，但發現這些抗體的KD比對照抗體差，並且對於所有含有VH1和VH2的抗體而言更差。選擇全部VH1/Vk3、VH2/Vk3和VH3/Vk2，因為它們具有最低的相對KD值。由於高表現與低相對KD值的組合，也選擇VH5/Vk3。

將這七種抗體通過蛋白A色譜純化，並計算其濃度。進行幾種測定以表徵所選抗體的功能性能力。

首先，測試七種15G8抗體與膜ILT2的結合。用人類ILT2轉染BW細胞，並且將5x10 ⁵個BW-ILT2與七種抗體或與對照IgG以10 µg/ml在染色緩衝液（0.05% BSA，於PBS中）中一起培育30分鐘，之後在染色緩衝液中洗滌，並且與二級PE綴合的驢抗小鼠類抗體一起培育。然後使用染色緩衝液將細胞洗滌兩次，並使用Cytoflex流式細胞儀（Beckman Coulter）分析，並使用CytExpert軟體（2.3版）分析資料。如在圖 6B中可見，總體結合動力學在七種抗體之間類似，但是在計算EC50值時（表 4），四種所述抗體優於其他三種。進一步測試這四種抗體的功能性。表 4 ：結合表面 ILT2 的 EC50 值

抗體	EC50
對照	0.16
15G8-13	0.06
15G8-23	0.01
15G8-32	0.06
15G8-34	0.15
15G8-44	0.14
15G8-53	0.04
15G8-54	0.39

針對幾種癌症類型測試人源化15G8抗體增強腫瘤細胞的吞噬作用的能力。進行巨噬細胞對腫瘤細胞株的吞噬作用的即時監測（參見材料和方法）。如在圖 6C- 圖 6D中可見，所測試的不同人源化ILT2阻斷抗體可以增強對HLA-G陽性腫瘤細胞（圖 6C）和僅I型MHC陽性腫瘤細胞（圖 6D）二者的吞噬作用。變異體15G8-13、15G8-23和15G8-34顯示在A375-HLA-G的吞噬作用方面比其他變異體略高的功效（圖 6C）。因此在另外的吞噬作用實驗中進一步評價15G8-13和15G8-23。如在圖 6E 至圖 6F中所展示，兩種抗體都可以增強所測試細胞株的吞噬作用，但15G8-13顯示活性略高，尤其在低濃度下。

之後，在系統中測試人源化15G8變異體增強NK細胞效應活性的能力，其中將NK細胞與靶癌細胞株一起培育，之後通過測量LDH水準來評價細胞毒性。如在圖 6G 至圖 6H中可見，不同變異體都可以以劑量依賴性方式顯著增強NK細胞針對HLA-G陽性（圖 6G）和僅I型MHC細胞（圖 6H）二者的細胞毒性。變異體15G8-13再一次顯示略高的活性，這次是在增強NK細胞的細胞毒性方面。由於其輕微但一貫的優越性，選擇15G8-13用於所有後續分析，並且在下文中簡稱為15G8人源化抗體。實例 3 ： ILT2 阻斷抗體的比較

使用三種不同系統測試三種CDR不同的抗ILT2抗體與ILT2結合的能力。使用ELISA測試與重組ILT2的結合（圖 7A），並且使用用ILT2轉染的BW細胞測試與膜ILT2的結合（圖 7B 至圖 7C）。嵌合和人源化抗體顯示類似的結合（圖 7C 至圖 7D）。使用商業小鼠抗人類ILT2抗體（Biolegend；殖株GHI/75）作為陽性對照。三種測試抗體成功結合ILT2，不論ILT2是在溶液中（圖 7A）還是在細胞表面上（圖 7B）。還使用結合ELISA檢查與幾種類似ILT家族成員（PIRB、ILT6和LILRA1）的交叉反應性（圖 7A）。使用針對這些蛋白質的抗體作為陽性對照。所述抗體都不與PIRB、ILT6和LILRA1交叉反應。所述抗體對於免疫染色也是有效的（圖 7D）。有趣的是，在從癌症患者的血液分離PBMC時發現，與在健康對照中相比，在癌症患者中，在更多T細胞和NK細胞上表現ILT2（圖 7E）。實例 4 ： ILT2 抗體阻斷 ILT2-HLA-G 相互作用

使用四種不同測定來測試所生成的抗ILT2抗體阻斷HLA-G與ILT2之間的相互作用的能力。首先，進行阻斷流式細胞分析測定。在本文的抗體和陽性對照抗體的存在下將HLA-G轉染的A375細胞與生物素化ILT2一起培育。使用市售抗ILT2抗體GHI/75（BioLegend，目錄號333704）作為陽性對照。使用鏈黴抗生物素蛋白-PE通過流式細胞分析分析確定ILT2-生物素與細胞的結合（圖 8A）。通過針對陰性對照（在對照IgG存在下的ILT2結合）標準化來確定阻斷百分比。代表性FACS分析呈現於圖 8B中，其顯示在沒有抗體的情況下（灰色線）、在15G8存在下（淺灰色線）以及在同種型對照存在下（黑色線）的ILT2結合。在不同抗體濃度下計算阻斷百分比（圖 8C）。嵌合鼠和人源化抗體顯示類似的阻斷能力（圖 8D）。

還在BW ILT2/小鼠Z鏈嵌合體報告物測定中檢查ILT2抗體功能性阻斷HLA-G與ILT2之間的相互作用的能力。用與小鼠T細胞ζ鏈融合的人類ILT2轉染BW細胞（BW-ILT2）。然後在所選ILT2抗體的存在下將細胞與A375-HLA-G細胞一起培育。在功能性ILT2-HLA-G相互作用後，BW細胞分泌報告細胞因子，即小鼠IL-2。對相互作用的阻斷會減少所述報告細胞因子的分泌。在培育24小時後通過ELISA確定小鼠IL-2的分泌。結果表示來自每種處理的一式三份孔的mIL-2水準±SE的平均值（圖 8E）。使用商業小鼠抗人類ILT2抗體（Biolegend；殖株GHI/75）作為兩種測定的陽性對照（PC）。在不同抗體濃度下計算阻斷百分比（圖 8F）。使用此相同BW ILT2/小鼠Z鏈嵌合體報告物測定排除新抗體可能靠自身具有ILT2啟動作用的可能性。在沒有癌細胞的情況下將細胞與ILT2抗體一起培育，並且再次測量小鼠IL-2分泌（圖 8G）。發現新ILT2抗體沒有激動作用，但是通過相同的雜交瘤方法生成的其他抗體（1G7）可以結合ILT2並誘導其活性。

還在人類Jurkat細胞（T細胞）中檢查功能性阻斷。在使用或不使用外源性表現HLA-G和單鏈抗CD3（OKT3）的A375癌細胞的情況下培育Jurkat細胞。測量促發炎性人IL-2的分泌。在使用未修飾的Jurkat細胞（呈ILT2陰性的細胞）時，在將Jurkat細胞與癌細胞共培養時分泌高水準的IL-2（圖 8H）。並不令人驚訝地，添加15G8抗體對IL-2分泌沒有影響，因為不存在要阻斷的ILT2。因此轉染Jurkat細胞以表現人類ILT2。首先，在使用和不使用外源性表現OKT3的A375癌細胞的情況下培養ILT2陽性Jurkat細胞。這些癌細胞是天然I型MHC陽性的。來自癌細胞的I型MHC強烈抑制IL-2分泌（圖 8I）。在這種情形中，添加15G8抗體以劑量依賴性方式阻斷ILT2/I型MHC相互作用並且增加IL-2分泌。使用泛HLA抗體作為陽性對照，並且在相等濃度下，15G8抗體與泛HLA抗體相當（圖 8I）。為了增強抑制作用，還用HLA-G轉染A375細胞，使它們呈I型MHC和HLA-G陽性。這些細胞產生甚至更強的對ILT2陽性細胞的抑制作用，從而將IL-2分泌減少至單獨培養的Jurkat細胞的IL-2分泌（圖 8J）。在投予15G8抗體時再次觀察到劑量依賴性作用，並且在相等劑量下，15G8抗體和泛HLA抗體再次同等有效（圖 8J）。值得注意，在僅使用HLA-G特異性抗體代替泛HLA時，所述作用顯著降低，並且與以1/100濃度使用的15G8抗體相當（圖 8K）。

還使用此Jurkat系統比較15G8抗體與兩種市售抗體：GHI/75和HP-F1。在存在和不存在不同濃度的15G8、GHI/75和HP-F1的情況下將表現人類ILT2的Jurkat細胞與表現HLA-G/OKT3的A375細胞一起培養。如已經觀察到的，15G8引起統計學上顯著的、劑量依賴性的IL-2分泌的增加（圖 8L）。如與單獨的培養基相比，GHI/75對IL2分泌沒有影響，但是如與IgG對照相比導致少量增加（圖 8M）。HP-F1產生少量但顯著的增加，所述增加達到穩定期並且沒有隨著投予增加而增加（圖 8N）。如與僅4 μg/ml的15G8相比，即使在20 μg/ml下，HP-F1也較差。

最後，在TIL和NK細胞中直接測量啟動。將TIL與A375-HLA-G-OKT3細胞一起培育5分鐘，之後檢測T細胞活化標記，即磷酸化ZAP70。將NK細胞與A253-HLA-G細胞一起培育2分鐘，之後檢測NK細胞活化標記，即磷酸化Syk。在與癌細胞共培養時，在兩種細胞類型中觀察到啟動，但是這種啟動在ILT2抗體的存在下被增強（圖 8O 至圖 8P）。這些結果證實，ILT2抗體可以有效阻斷ILT2-HLA-G相互作用，從而導致增強的T細胞和NK細胞啟動。實例 5 ： ILT2 抗體增強 HLA-G 和 I 型 MHC 陽性腫瘤細胞的吞噬作用

使用兩種不同系統測試生成的抗ILT2抗體增強腫瘤細胞的吞噬作用的能力。從健康供體的血液分離單核細胞，並且在M-CSF的存在下培育6至7天以生成巨噬細胞。首先，採用基於流式細胞分析的測定。在所指示抗體的存在下將用PKH67-FITC染色的不同癌細胞株與用eFluor 670-APC染色的巨噬細胞一起培育。通過雙重染色的巨噬細胞的百分比確定吞噬作用水準，所述雙重染色指示目標細胞的吞食。吞噬作用水準呈現為相對於對照（僅培養基）的百分比。如在圖 9A中所示，不同ILT2阻斷抗體可以增強巨噬細胞對HLA-G陽性A375細胞的吞噬作用。另外，使用即時IncuCyte ^®分析系統來檢查巨噬細胞增強腫瘤細胞的吞噬作用的能力。將目標細胞株用pHrodo ^™紅色細胞標記染料標記，洗滌，並與重複進行的各種處理一起添加至巨噬細胞。IncuCyte ^®pHrodo ^™紅色細胞標記染料的螢光在酸性環境（如吞噬體中固有的酸性環境）中增加，從而使得能夠通過測量螢光對吞噬事件進行定量。IncuCyte ^®儀器每30 min對測定板採樣，用於螢光紅色信號強度和相點陣圖。吞噬事件反映為紅色螢光信號的積累，並且吞噬速率是從紅色螢光信號積累的動力學來反映。使用此即時系統，確認人源化抗ILT2抗體增強HLA-G陽性A375細胞的吞噬作用的能力（圖 9B）。另外，使用IncuCyte ^®系統證實，生成的阻斷ILT2抗體可以增強HLA-G陽性以及各種I型MHC陽性（WT）癌細胞株二者的吞噬作用（圖 9C ）。

使用上述IncuCyte ^®即時系統檢查將生成的ILT2抗體與抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）誘導的抗體Erbitux組合對癌細胞的吞噬作用的影響。與單獨的每種抗體的活性相比，ILT2阻斷抗體與Erbitux的組合顯著增加過表現HLA-G的癌細胞株的吞噬作用（圖 9D）。實際上，Erbitux與15G8人源化抗體的組合具有協同作用，其中組合處理對吞噬作用的增加是大於僅為相加性的。實例 6 ：所選 ILT2 抗體可以恢復被 HLA-G 抑制的 T 細胞活性

為了檢查生成的抗ILT2抗體恢復被HLA-G抑制的T細胞活性的能力，將人CD8 T細胞與野生型721.221細胞（221 WT）或過表現可溶HLA-G5的721.221細胞（221-HLA-G）共培育。在5天后使用標準ELISA測量T細胞的IFNγ分泌水準。結果顯示為高於僅221-HLA-G的作用的倍數百分比，並且表示4次獨立實驗的平均值。圖 10A中展示的結果證實，幾種ILT2抗體可以恢復HLA-G抑制的T細胞活性。還通過與A375-HLA-G-OKT3細胞一起培育對此進行測試。在72小時後，還測量人顆粒酶B的分泌，並且發現其在15G8抗體的存在下以劑量依賴性方式增加（圖 10B）。實例 7 ：所選 ILT2 抗體可以增強針對 HLA-G 和 I 型 MHC 陽性腫瘤細胞的 NK 細胞毒性

在系統中測試生成的抗ILT2抗體增強NK細胞效應活性的能力，其中將NK細胞與各種靶癌細胞株一起培育。將細胞以7.5 : 1的效應物與目標比率共培育5小時，之後使用螢光分析LDH檢測套組檢測細胞毒性水準。如下計算特異性細胞毒性的百分比：

如圖 11A中所示，本文的ILT2抗體可以以劑量依賴性方式顯著增強NK細胞針對HLA-G陽性細胞和各種I型MHC陽性癌細胞株二者的細胞毒性（圖 11B）。還測量顆粒酶B（圖 11C）和干擾素γ（圖 11D）分泌，並且發現其以劑量依賴性方式增加。將初生NK細胞與靶HLA-G+黑色素瘤細胞共培養，之後通過FACS分析IFNγ、ILT2、CD56和CD107A的表現。特別分析ILT2陽性、CD56陽性NK細胞群，並且觀察到IFNγ表現和膜CD107A表現的劑量依賴性增加（圖 11E- 圖 11F）。在對每次實驗單獨繪圖時，ILT2陽性細胞%與增加的IFNγ和CD107A表現之間的關聯顯然是明顯的（圖 11G 至圖 11H）。實例 8 ： ILT2 抗體增加發炎性巨噬細胞的生成

在體外檢查阻斷ILT2對巨噬細胞成熟的影響。在人源化阻斷ILT2抗體或對照IgG的存在下，使從健康供體分離的單核細胞在M-CSF（50 mg/mL）的存在下分化5天，以生成成熟巨噬細胞（M0）。使巨噬細胞在LPS（50 ng/mL）的存在下進一步分化以生成M1巨噬細胞，或用IL-4（25 ng/mL）分化以生成M2巨噬細胞。如圖 12中所示，在巨噬細胞成熟過程期間ILT2阻斷抗體的存在增加所測試大多數供體的巨噬細胞上HLA-DR（M1發炎性巨噬細胞的標記）的表現，不論它們分化為M0、M1還是M2巨噬細胞。另外，分化為M1巨噬細胞的巨噬細胞在所測試的大多數供體中也具有增加的CD80水準。總之，這些結果證實，所選ILT2拮抗劑抗體可以誘導展示更高HLA-DR和CD80水準的巨噬細胞，其表示具有更多發炎性M1表型的巨噬細胞。實例 9 ： ILT2 阻斷抗體增強免疫細胞針對來自患者的腫瘤細胞的活性

在離體系統中用來自癌症患者（RCC和H&N）的腫瘤樣品檢查生成的抗ILT2抗體的活性。為了測試抗體增加來自患者的腫瘤細胞的吞噬作用的能力，將從單核細胞生成的巨噬細胞與從腫瘤樣品分離的腫瘤細胞一起培育。如上文所詳述使用IncuCyte ^®即時分析系統檢查吞噬作用水準。如在圖 13A中所示，ILT2抗體可以增強來自不同癌症適應症的患者的腫瘤細胞的吞噬作用。此外，所述作用具有劑量依賴性，並且即使使用自體巨噬細胞時也存在，並且對於RCC（圖 13B）和來自H&N的鱗狀細胞癌（ 13C）二者都被見到。另外，檢查ILT2抗體增強PBMC活性的作用。將來自患者的腫瘤樣品的單細胞懸浮液與從相同患者分離的PBMC在IL-2的存在下一起培育（啟動的PBMC）。如圖 14G中所示，在ILT2抗體的存在下，促發炎性TNF-a細胞因子的PBMC分泌在腫瘤細胞存在下升高。總之，這些結果證實阻斷ILT2抗體增加免疫細胞針對來自各種癌症適應症的腫瘤細胞的活性的能力。實例 10 ：可以將 ILT2 阻斷抗體與 PD-1/PD-L1 療法組合

對於大部分，ILT2和PD-1在不同免疫細胞上表現，所述免疫細胞包括周邊血液細胞和腫瘤微環境駐留免疫細胞二者（圖 14A）。對來自CRC患者的腫瘤內CD8陽性T細胞中的ILT2和PD-1表現的分析發現，T中樞記憶細胞（Tcm）和消耗的T細胞（Tex）二者都表現高水準的PD-1（圖 14B），但是表現低水準的ILT2（圖 14C）。CD45RA重表現T細胞（T _EMRA）顯示完全相反的模式，其表現高水準的ILT2和低水準的PD-1。這種二分性並非癌症特有的現象，發現來自健康供體血液的大部分（83%）T _EMRA細胞呈ILT2陽性，而僅小部分（17%）的總CD8陽性T細胞呈陽性（圖 14D）。然而，在TME中，ILT2表現在T細胞中增強。通過從食道癌患者分離的腫瘤的酶促消化生成單細胞懸浮液。FACS分析顯示，大部分CD8陽性腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）是T _EMRA細胞（50%），並且這些T _EMRA細胞100%呈ILT2陽性，但是幾乎完全呈PD-1陰性（95%）（圖 14E）。

在來自10名健康供體的SEB啟動（10 ng/ml）的PBMC中測試本文的抗ILT2抗體與抗PD-1的組合的作用。使用膜CD107a的表現作為增加的細胞毒性的標記。總的來說，15G8抗體平均產生表面CD107a的少量增加，而抗PD-1產生略大的反應，所述反應是供體依賴性的（圖 14F）。所述兩種抗體的組合平均產生增加的CD107a水準；然而，基於具體供體樣品，這些變化是可變的。圖 14G呈現三個示例性樣品。第一供體在將抗PD-1與15G8組合時見到加性作用，其中總CD107a水準與單獨的每種抗體的作用之和大致相等。第二供體對抗PD-1的反應比對抗ILT2的反應更強，但是意外地，所述兩種抗體的組合具有超過加性的作用。抗PD-1產生表現的19%增加，抗ILT2產生3.7%增加，但是組合處理導致33.2%增加。這種協同作用在供體#3的細胞中甚至更顯著。在供體#3中，15G8比抗PD-1更有效（13.1%增加與9.3%增加），並且組合療法顯著更有效（41%），其產生的作用幾乎是從僅為相加性組合預測的作用的兩倍。

接下來，評估用PD-1阻斷抗體和生成的ILT2抗體對患者腫瘤細胞的組合處理。在抗PD1抗體、本文的抗體及其組合的存在下，將各種患者癌細胞與自體PBMC一起培育。使用IgG作為對照，並且測量促發炎性分子的分泌作為讀出。在組合處理中觀察到增強的促發炎性細胞因子的分泌（圖 14H 至圖 14J）。如與IgG對照相比，通過人源化抗體15G8對來自第一患者的結腸腺癌細胞的處理完全沒有增強IFNγ分泌，而抗PD-1產生細胞因子分泌的穩健增加（圖 14H）。然而意外地，抗PD-1與ILT2抗體的組合將分泌增加超過50%。第二患者顯示類似的趨勢，其中ILT2抗體或抗PD-1誘導少量增加，並且在組合使用所述兩種抗體時存在增強的協同增加（圖 14I）。如與對照相比，單獨的任一種抗體都沒有改變GM-CSF表現，然而，令人驚訝地，所述兩種抗體的組合產生對照GM-CSF水準的近100%的穩健增加（圖 14J）。

接下來，使用混合淋巴細胞反應評估組合療法。從不同健康供體分離樹突細胞和CD8陽性T細胞，並且從自H&N癌症患者分離的單核細胞生成巨噬細胞。以5 : 1的效應細胞與目標的比率將細胞與所指示治療（各自20 ug/mg）組合。在抗ILT2抗體或抗PD-1抗體存在時，T細胞的IFNγ分泌被增強，並且這種作用在組合使用兩種抗體的情況下增加（圖 14K 至圖 14L）。如與樹突細胞培養物（圖 14K）相比，在巨噬細胞培養物中觀察到更強的累積作用（圖 14L）。這些結果明確顯示，抗ILT2和抗PD-1療法對增強免疫細胞發炎性反應具有協同和重新（de novo）作用。實例 11 ： ILT2 阻斷抗體降低體內腫瘤負荷

在異種移植體內模型中檢查抗ILT2抗體的功效。向免疫受損的SCID-NOD或NSG小鼠接種癌細胞株（A375-HLA-G、A375-WT、COLO-320-HLA-G），並且在ILT2抗體的存在下將從健康供體血液生成的人巨噬細胞注射至小鼠中。如圖 15A中所示，在此模型中投予生成的ILT2抗體導致顯著腫瘤抑制，這最有可能是由人巨噬細胞在此系統中的活性介導的。另外，在HLA-G陽性以及I型MHC陽性腫瘤細胞中觀察到抗腫瘤功效。

還在肺病灶黑色素瘤異種移植體內模型中檢查抗ILT2抗體的功效。向免疫受損的SCID-NOD小鼠接種黑色素瘤細胞（MEL526-HLA-G）。在所選ILT2抗體的存在下將從健康供體血液分離的人PBMC注射至小鼠中，在接種後一天開始，並且在第2天、第10天、第18天重複（圖 15B）。在第1天、第4天、第8天、第11天、第15天、第18天、第22天和第25天投予ILT2抗體。如圖 15C中所示，投予生成的ILT2抗體導致腫瘤細胞的轉移顯著減少，所述轉移由小鼠肺中黑色病灶的形成來表示。與用對照IgG處理的小鼠相比，用ILT2抗體處理的小鼠肺具有極少的此類病灶。這種作用也通過這些小鼠的肺重量的下降來證實（圖 15D），並且最有可能是由投予至小鼠的人淋巴細胞介導的，與所投予抗體對ILT2的抑制組合。因此，抗ILT2抗體有效預防轉移和腫瘤形成。

接下來，在相同的體內小鼠模型中測試新抗體在治療已形成的腫瘤方面的有效性。通過IV投予如上MEL526-HLA-G細胞來移入SCID-NOD小鼠。在15天后，將從健康供體分離的人PBMC投予至相關小鼠組中，並且在第25天、第35天和第51天重複此投予（參見圖 15E）。在第14天、第17天、第20天、第24天、第27天、第30天、第34天、第37天和第50天投予抗體（ILT2抗體、抗PD-1抗體或二者的組合）（參見圖 15E）。在第53天將小鼠處死，並將肺稱重。通過從測試小鼠的肺重量減去未經實驗的小鼠的肺重量來計算腫瘤重量。抗PD-1抗體減小腫瘤重量，但並不顯著，而ILT2抗體和組合治療具有顯著作用（圖 15F）。

測試腫瘤來源的CD8 T細胞、T _EMRA細胞和NK細胞的CD107A和CD69表現。在總CD8 T細胞中，抗PD-1抗體誘發CD107A表現的不顯著的增加，同時ILT2抗體而不是組合療法誘發顯著變化（圖 16A）。在T _EMRA細胞中，ILT2抗體和組合療法二者都誘發顯著增加（圖 16B）。在NK細胞中，抗PD1和抗ILT2抗體二者都顯著增加CD69陽性細胞的百分比，但是令人驚訝地，組合療法具有顯著增強的作用，其中CD69陽性細胞的總百分比大於單獨的任一種療法的組合（圖 16C）。令人驚訝地，當在CD8 T細胞中檢查CD69表現時，抗PD1和抗ILT2都不增加表現，然而，組合治療誘發CD69表現的非常顯著的增加（圖 16D）。此外，確定ILT2抗體的作用與ILT2表現相關。在將實驗分解至具有低或高ILT2表現的接受PBMC的小鼠中時，觀察到活化標記的顯著差異。在T _EMRA細胞中，如與低ILT2表現PBMC相比，高ILT2表現PBMC包括超過一倍的CD107A表現（圖 16E）。類似地，在檢查NK細胞時，在投予組合治療時，高ILT2表現PBMC誘發近90%的細胞表現CD69；而低ILT2表現PBMC誘發少於40%的NK細胞表現CD69（圖 16F）。因此，PBMC中ILT2的表現水準對於所述抗體的最強效作用是必需的。實例 12 ：體內人源化 H&N 模型

在第二體內模型中，向人源化小鼠（人CD34+移入的小鼠）接種A253-HLA-G細胞。在腫瘤達到80立方毫米大小時，用對照IgG或ILT2抗體（15G8，二者都為10 mg/kg）治療小鼠。一週兩次重複所述治療（圖 17A）直至第43天，並且在不同時間點通過卡尺測量腫瘤以確定腫瘤大小。ILT2抗體在4只小鼠中的2只（小鼠# 23和28）中完全阻止腫瘤生長，其中腫瘤截至第43天被根除（圖 17B）。為了確定對治療的不同反應是否是由於小鼠免疫細胞中ILT2的不同表現水準所致，在基線時測定來自周邊血液的CD8 T細胞的ILT2表現。實際上，具有完全反應的兩隻小鼠的T細胞都具有高ILT2表現，另外兩隻小鼠的表現水準顯著更低（圖 17C）。此外，通過在治療後檢查TME，顯示區分反應者與無反應者的其他三種藥效學反應標記，即T細胞中的CD107A表現（圖 17D）、M1/M2巨噬細胞比率（圖 17E）以及總CD80陽性樹突細胞（圖 17F）。這些結果指明以下事實：抗ILT2在腫瘤微環境的骨髓和淋巴區室中生成轉變，並且也可以增加樹突細胞呈獻抗原的能力並將更多T細胞募集至腫瘤。實例 13 ： 15G8 人源化抗體的表位定位

發送15G8抗體用於表位定位，以確定其在ILT2上結合的位置。由MAbSilico公司進行定位。使用以下結構對所用ILT2的結構進行建模：6AEE（四個Ig樣結構域，一些環丟失）、1VDG（未公開，結構域1和2）、1G0X（結構域1和2）以及4LL9（結構域3和4）。6AEE和1G0X結構得自Wang等人, Cell Mol Immunol. (2020) 17(9):966-75，並且4LL9結構得自Chapman等人, Immunity(2000) 13(5):727-36。區域D1定義為ILT2的殘基24-121。區域D2定義為ILT2的殘基122-222。區域D3定義為ILT2的殘基223-321。區域D4定義為ILT2的殘基322-409。使用MODELLER構建抗體的3D模型。

基於排名前30的對接位姿，針對目標的殘基屬於表位的概率對所述殘基進行評分。可能屬於表位的殘基顯示於圖 18A的序列上以及圖 18B中目標的結構上。根據這些殘基，在目標上限定四個主要相互作用區域（圖 18C）。這些相互作用區域中的全部四個都發現於ILT2的間域部分中，所述間域部分是D1與D2之間的鉸鏈部分。

然而，大多數ILT2抗體的結合表位是未知的，國際專利公開案WO2020/136145確實披露了多種抗體的表位資訊。發現兩個通用結合區，一個在D1區域內，一個在D4區域內。特定地，命名為3H5、12D12和27H5的三種抗體的特徵為與突變體的結合的喪失，所述突變體在D1中的E34、R36、Y76、A82和R84處具有取代。那些抗體中之一3H5顯示減少的與突變的結合，所述突變在D1的G29、Q30、T32、Q33和D80處具有取代。這些殘基僅位於D1區域中，並且都在定義為15G8抗體的結合表位的4個區域外部（都在間域內）（注意，在圖 18A中，序列開始於一個胺基酸之後，使得例如WO2020/136145的E34在圖 18A中是E33）。因此，抗體15G8結合至與WO2020/136145公開案的抗體的三維表位不同的三維表位（圖 18D）。

接下來，憑經驗測試由15G8抗體結合的特定表位。經驗定位由Neoproteomics Inc.使用羥自由基足跡法（HRF）和質譜技術來進行（參見材料和方法）。從胰蛋白酶消化和雙重胰蛋白酶和Asp-N消化二者獲得的ILT2蛋白的總體序列覆蓋率為約90.7%。對於通過胰蛋白酶消化的ILT2蛋白，通過LCMS和MS/MS分析檢測到總計23種肽。在這23種肽中，觀察到20種被標記（表 5；最高標準化保護比率（NR）值加粗。肽位置和相應序列顯示於第1欄和第2欄中）。對於通過胰蛋白酶和Asp-N消化的ILT2蛋白，通過LCMS和MS/MS分析檢測到總計15種肽。在這15種肽中，觀察到14種被標記（表 6；最高標準化保護比率（NR）值加粗。確認加粗的殘基被修飾）。表 5 ：源自胰蛋白酶消化的 ILT2 中修飾的肽的速率常數。

在 ILT2 中的位置	ILTS 的序列 (SEQ ID NO)	游離 ILT2 ， K 游離， s ^-1	ILT2-BND-22 複合物， K 複合物， s ^-1	比率， K 游離 / K 複合物	NR 比率 /1.44
5-24	PTLWAEPGSVITQGSPVTLR (73)	8.93 ± 1.86	7.04 ± 1.24	1.27	0.88
25-35	CQGGQETQEYR (74)	1.18 ± 0.11	0.77 ± 0.070	1.53	1.06
42-48	TALWITR (75)	2.62 ± 0.50	1.56 ± 0.26	1.68	1.17
49-55	IPQELVK (76)	2.41 ± 0.42	1.5 ± 0.24	1.61	1.12
56-71	KGQFPIPSITWEHAGR (68)	9.09 ± 0.87	2.31 ± 0.17	3.94	2.74
57-71	GQFPIPSITWEHAGR (69)	6.93 ± 0.68	1.97 ± 0.38	3.52	2.44
74-83	CYYGSDTAGR (77)	0.58 ± 0.057	0.32 ± 0.078	1.81	1.26
84-100	SESSDPLELVVTGAYIK (70)	1.26 ± 0.15	0.37 ± 0.055	3.41	2.35
101-134	PTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCK (78)	5.46 ± 0.85	11.08 ± 1.94	0.49	0.34
135-151	EGEDEHPQCLNSQPHAR (79)	5.62 ± 0.81	6.81 ± 1.08	0.83	0.58
156-167	AIFSVGPVSPSR (80)	1.51 ± 0.20	1.0 ± 0.13	1.51	1.05
156-168	AIFSVGPVSPSRR (81)	1.6 ± 0.17	0.94 ± 0.013	1.7	1.18
168-172	RWWYR (82)	0	0	-	-
173-200	CYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSK (83)	7.67 ± 0.73	5.39 ± 0.57	1.42	0.99
201-230	KPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNR (84)	4.24 ± 0.37	2.64 ± 0.19	1.61	1.12
236-265	DGERDFLQLAGAQPQAGLSQAN*FTLGPVSR (85)	4.55 ± 0.84	3.21 ± 0.40	1.41	0.98
240-265	DFLQLAGAQPQAGLSQAN*FTLGPVSR (86)	3.55 ± 0.70	2.37 ± 0.11	1.5	1.04
240-265	DFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSR (87)	1.96 ± 0.24	1.55 ± 0.17	1.26	0.88
266-272	SYGGQYR (88)	0	0		-
273-301	CYGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFYDR (89)	5.83 ± 0.83	5.16 ± 0.82	1.13	0.78
336-344	EGAADDPWR (90)	5.37 ± 0.69	5.33 ± 0.98	1	0.69
354-372	YQAEFPMGPVTSAHAGTYR (91)	23.01 ± 6.49	15.19 ± 1.98	1.51	1.05
373-380	CYGSQSSK (92)	0	0	-	-

平均值-1.37，中值-1，標準化比率- (1.37+1.50)/2=1.44，無標記-「0」，「*」-潛在糖基化位點。表 6 ：源自胰蛋白酶 /Asp-N 消化的 ILT2 中修飾的肽的速率常數

位置	序列 (SEQ ID NO)	游離 ILT2 ， K 游離， s ^-1	ILT2-15G8 複合物， K 複合物， s ^-1	比率， K 游離 / K 複合物	NR 比率 /1.53
5-24	PTLWAEPGSVITQGSPVTLR (93)	15.07 ± 1.16	19.66 ± 1.7	0.78	0.51
10-24	EPGSVITQGSPVTLR (94)	1.91 ± 0.97	1.05 ± 0.030	1.82	1.19
42-48	TALWITR (95)	2.84 ± 0.49	1.74 ± 0.31	1.63	1.07
49-55	IPQELVK (96)	2.69 ± 0.42	2.02 ± 0.32	1.33	0.85
57-66	GQFPIPSITW (71)	4.32 ± 0.51	0.72 ± 0.082	6	3.92
91-100	ELVVTGAYIK (72)	0.70 ± 0.082	0.14 ± 0.0071	5	3.27
138-151	EDEHPQCLNSQPHAR (97)	0.82 ± 0.11	0.77 ± 0.14	1.06	0.69
156-167	AIFSVGPVSPSR (98)	1.8 ± 0.21	1.15 ± 0.088	1.57	1.03
183-193	EWSLPS (99)	0.52 ± 0.11	0.33 ± 0.065	1.58	1.03
189-200	DLLELLVLGVSK (100)	2.92 ± 0.27	1.81 ± 0.017	1.61	1.05
192-200	ELLVLGVSK (101)	1.16 ± 0.21	0.84 ± 0.13	1.38	0.9
266-272	SYGGQYR (102)	0	0	-	-
291-299	DILIAGQFY (103)	0.89 ± 0.092	0.44 ± 0.066	2.02	1.32
354-372	YQAEFPMGPVTSAHAGTYR (104)	5.98 ± 0.90	3.35 ± 0.27	1.79	1.17
357-372	EFPMGPVTSAHAGTYR (105)	18.19 ± 2.27	15.01 ± 1.98	1.21	0.79

平均值-1.48，中值-1.58，標準化比率- (1.48+1.58)/2=1.53，無標記-「0」

HRF方法引入穩定的側鏈氧化修飾，從而導致比品質漂移，這是從串聯質譜資料鑒定的。對於肽離子（具有特定m/z）的未氧化形式和所有氧化形式提取並整合選擇離子色譜圖（SIC）。使用這些峰面積值來表徵呈劑量反應（DR）圖形式的反應動力學，其測量隨羥自由基暴露而變化的未修飾肽的損失。與游離蛋白質中的相同區域相比，複合物中的溶劑保護區域展現降低的氧化反應。氧化速率（稱為速率常數，K）的差異指示結合介面的潛在位置。

使用來自一個重複實驗的MS資料計算每種肽和特定殘基的K值。所檢測的所有肽的總體擬合結果和誤差顯示於表 5和表 6中。第三欄和第四欄分別表示游離ILT2及其複合物的K值。緊鄰每個K值顯示表示擬合誤差的誤差棒。第五欄顯示比率R（=K游離/K複合物）。第六欄顯示標準化比率（NR），其計算為R/((平均值 + 中值)/2)。如果給定肽的R值小於1，表明由於在複合物形成期間引入的結構變化，相應區域經歷溶劑可及性的增加。R值接近1表明，所述區域的溶劑可及性保持不變，而R ＞ 1表明，相應區域展現隨著複合物形成而變化的針對溶劑的保護。然而，大多數肽的R值（表 5中的第五欄）落在0.49與3.94之間，平均值為1.37且中值為1.5（從統計學分析排除3.41、3.52和3.94的值）。大多數肽的R值（表 6中的第五欄）落在0.78與6之間，平均值為1.48且中值為1.58（從統計學分析排除5和6的值）。此外，分別顯示所有胰蛋白酶肽和胰蛋白酶/Asp-N肽的R值在ILT2內的分佈的圖 19A和圖 19B也表明，ILT2的大多數肽展現在複合物形成時大於1的修飾變化。使用與代謝組學中用於校正樣品間非生物學差異的策略（平均標度，除以集中趨勢）類似的策略，使用平均值和中值的均值將所述比率標準化為1的值。使用1.44和1.53的標準化因子針對分別源自胰蛋白酶和胰蛋白酶/Asp-N實驗的R值標準化比率（NR）。在這些研究中，2+的NR被視為複合物形成時氧化中的重要保護。

總的來說，表 5顯示來自ILT2的3種肽，其覆蓋56-71、57-71和84-100的ILT2區域，並且相對於單獨的ILT2，在ILT2-15G8複合物中分別展現2.74、2.44和2.35的最高保護。表 6發現覆蓋胺基酸57-66和91-100的兩種肽，其分別顯示3.92和3.27的最高保護。這些區域是與15G8 mAb的結合介面的一部分。

五種重要肽的單獨DR圖顯示於圖 19C 至圖 19G中。這些說明了作為複合物形成的結果的五種最受保護的肽的比較性DR圖。游離ILT2形式和ILT2-15G8複合物的DR圖分別以藍色和紅色顯示。紅色和藍色實線顯示對理論一階方程的最佳擬合。表 5和表 6以及圖 19C 至圖 19G顯示五種肽對溶劑可及性的最大降低/保護，所述五種肽覆蓋ILT2的殘基56-71（SEQ ID NO: 3）、57-71（SEQ ID NO: 4）、84-100（SEQ ID NO: 5）、57-66（SEQ ID NO: 6）和91-100（SEQ ID NO: 7）。57-66（NR=3.92）、91-100（NR=3.27）、56-71（NR=2.74）、57-71（NR=2.44）和84-100（NR=2.35）肽的總體保護水準表明，這些區域是與15G8的結合介面的一部分。

有趣的是，定義為15G8表位的區域（其是D1與D2之間的間域）已經被鑒定為ILT2的主要相互作用區域，其在與HLA複合時與β-2-微球蛋白（B2M）結合（參見Kuroki等人, J Immuno. (2019) 203(12):3386-94）。（圖 18E 至圖 18F）。實際上，殘基G97、A98、Y99、I100、Q125和V126被Kuroki等人（Kuroki中的補充圖S2）明確鑒定為與B2M相互作用。Kuroki的殘基97至100（其對應於表 5和表 6中的殘基96至99）落在針對15G8的兩個相互作用肽內，因此是15G8表位的殘基。這強烈表明，15G8以B2M依賴性方式抑制ILT2與HLA的結合，並且實際上阻斷ILT2與B2M直接結合。相比之下，所報導的其他抗體（3H5、12D12和27H5）結合至ILT2的N末端D1區域，所述D1區域與HLA-G的α3結構域相互作用（參見Kuroki中的補充圖S2）。這是非常重要的，因為Kuroki等人發現，針對ILT2的主要相互作用位點是B2M位點，並且與α3結構域的結合是額外的且靈活的。這可以解釋15G8實現T細胞、NK細胞和巨噬細胞/樹突細胞功能的獨特能力：其阻斷ILT2的主要相互作用位點，但不阻斷二級位點。

為了測試15G8是否可以阻斷ILT2與B2M之間的相互作用，進行B2M阻斷ELISA。用重組人B2M-His標記（3 µg/ml；Sino Biologics，11976-H08H）將96孔鎳板塗布過夜。在存在或不存在滴定的BND-22或無關抗體（抗人CD28，Biolegend，302934）（Ab範圍為80-0.1 µg/ml，X3倍）的情況下，添加生物素化ILT2-Fc（20 µg/ml；Sino Biologics，1614-H02H；Innova Biosciences，370-0010）並在37ºC下保持2小時，從而允許ILT2與B2M結合。通過HRP綴合的鏈黴抗生物素蛋白（R&D Systems，DY998）檢測ILT2與B2M的結合。使用ELISA讀取儀（Biotek Synergy-H1讀板器）測量吸光度。

如圖 20中所示，15G8阻斷ILT2-B2M相互作用，特別是在較高抗體濃度下。相比之下，在此系統中沒有影響的無關抗體沒有阻斷這種相互作用。通過直接證實15G8可以破壞ILT2與B2M之間的結合，這些結果證明了先前的觀察：15G8表位包括已知明確參與ILT2與B2M的相互作用的殘基。

被鑒定為對吞噬作用具有任何作用的唯一ILT2抗體是GHI/75，顯示其可增強抗CD47阻斷介導的癌細胞吞噬作用，但是沒有顯示其對其自身有影響（參見Barkal等人, Nat Immunol. (2018) 19(1):76-84）。發現組合的GHI/75和抗CD47的作用不是B2M依賴性的，因為B2M的缺失對增加的吞噬作用沒有影響。因此，單獨的15G8對吞噬作用的作用（圖 13A 至圖 13C）是B2M依賴性的，這可以解釋這種抗體的獨特能力。直接測試15G8抗體在這方面的優越性。在IgG對照、15G8或GHI/75的存在下將表現外源HLA-G的A375或SKMEL28癌細胞與巨噬細胞共培養。還在A375細胞中測試HP-F1抗體。在所指示抗體的存在下將用PKH67-FITC染色的癌細胞株與用eFluor 670-APC染色的巨噬細胞一起培育。通過雙重染色的巨噬細胞的百分比確定吞噬作用水準，所述雙重染色指示目標細胞的吞食。計算與IgG對照相比，吞噬作用的增加%。在兩種細胞類型中，如與對照相比，15G8增加吞噬作用（圖 21A 至圖 21B）。如所預期，GHI/75和HP-F1都對吞噬作用沒有任何影響。從而確認，15G8是可以作為單一療法增強吞噬作用的第一種抗ILT2抗體。

這提出了GHI/75和其他商業抗體的表位的問題。雖然沒有公開這些抗體的表位，但是進行競爭ELISA測定以觀察15G8以及市售抗體GHI/75、HP-F1和MAB20172（R&D Systems，殖株292319）是否可以同時結合ILT2。在ILT2結合ELISA中以恒定濃度（1 μg/mL）使用生物素化15G8抗體。以遞增濃度添加GHI/75、HP-F1或MAB20172，並且評估競爭。不管添加的這三種抗體的量是多少，它們都不與15G8競爭結合至ILT2（圖 21C 至圖 21D）。相比之下，在添加裸（未生物素化）15G8時，如所預期的結合以劑量依賴性方式降低。這表明，GHI/75、HP-F1和MAB20172結合至與15G8不同的表位。這使15G8成為曾被鑒定為結合這個表位、特異性阻斷與B2M的相互作用並且能夠針對癌症同時啟動/募集T細胞、NK細胞和巨噬細胞/樹突細胞的第一種抗ILT2抗體。實例 14 ：用於鑒定能夠抑制 ILT2 與 B2M 之間的相互作用的抗體的篩選方法

B2M是形成HLA-G以及其他ILT2配體的部分的蛋白質。如實例13中所示，15G8具有在負責ILT2與B2M之間的相互作用的特定區域中與ILT2結合的獨特特性。這種結合使得15G8能夠抑制或阻斷ILT2與其配體（例如，HLA-G）的結合，從而產生免疫啟動作用。如上文實例13中所示，所述特定結合區域的特徵為駐留在ILT2 D1與D2結構域的介面內，並且使用經驗方法進一步確定為包括SEQ ID NO: 68、69、70、71和72內的殘基。還使用電腦方法確證15G8結合區域（圖 18A）。

考慮可以產生特徵為與類似表位結合並且具有特異性阻斷ILT2與B2M之間的相互作用的能力的其他抗體。此類抗體可以通過包括以下的方法來引發：用完整重組ILT2、或僅用包括D1-D2介面區的D1和D2結構域、或用類似於（例如，包含、在其內或與其相同）SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71和/或SEQ ID NO: 72的線性肽對動物進行免疫。在所有情形中，針對其阻斷ILT2-B2M結合的能力進一步篩選引發的抗體。可以針對與ILT2中B2M結合區域的特異性結合來篩選引發的抗體，例如，使用經驗技術，如上文所述的羥自由基足跡法（HRF）和質譜技術（「材料和方法」），或者用於表位結合確定的其他類似的已知技術，如與質譜進一步偶聯的氫氘交換（HDX）。

類似地，可以針對與重組ILT2或與在細胞上表現的ILT2結合的抗體篩選初始抗體文庫。例如，可以針對與ILT2片段的結合進行篩選，所述ILT2片段由包括D1-D2介面區域的D1和D2結構域構成。還可以針對與類似於（例如，包含、在其內或與其相同）SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71和/或SEQ ID NO: 72的線性肽或者與由這兩種肽和ILT2序列中駐留在所述肽之間的胺基酸構成的多肽的結合進行篩選。可以如上所述使用不同的經驗表位定位技術進一步篩選展現與這些序列的結合的抗體。

在一些情形中，篩選可以涉及使用如下測定來評價候選抗體特異性阻斷ILT2-B2M相互作用的能力，所述測定用於檢測對ILT2與不同蛋白質的結合的阻斷，所述蛋白質是重組的或細胞表現的且包括B2M或B2M部分。在一些情形中，篩選可以涉及評價候選抗體與15G8抗體特異性競爭的能力，已顯示15G8抗體可阻斷ILT2與B2M的結合。

對具體實施例的前述描述將充分揭示本文的一般性質，使得他人可以在不進行過度實驗的情況下以及在不背離一般概念的情況下，通過運用當前知識，針對各種應用容易地修改和/或調整此類具體實施例，並且因此，此類調整和修改應該並且意圖包含在所公開實施例的等效物的含義和範圍內。應理解，本文所用的措辭或術語是用於描述的目的而不是限制的目的。在不背離本文的情況下，用於進行所公開的各種功能的手段、材料和步驟可以採取多種替代性形式。

在本說明書和實施例通篇中，將理解詞語「具有（have）」和「包含（comprise）」或者變異體如「具有（has）」、「具有（having）」、「包含（comprises）」或「包含（comprising）」暗示包括所述的整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。在涉及可測量值（如量、持續時間等）時，「約」意欲涵蓋相對於指定值± 20%、或在一些情況下± 10%、或在一些情況下± 5%、或在一些情況下± 1%、或在一些情況下± 0.1%的變化，因為此類變化適合於進行所公開方法。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數並且複數術語應包括單數。表 7 ：抗體序列（ SEQ ID NO ）

Ab	H-CDR1	H-CDR2	H-CDR3	L-CDR1	L-CDR2	L-CDR3	VH	VL	VH nt	VL nt	HC	LC
17F2 (mu)	1	2	3	4	5	6	19	20	35	36	53	54
19E3 (mu)	7	8	9	10	11	12	21	22	32	39	53	54
15G8 (X108) (hu)	13	14	15	16	17	18	23	24	N/A	38	N/A	49
15G8-13 (A108) (hu)	25	28	34	48
15G8-13 (S108) (hu)	26	29	116	51
15G8-13 (C108) (mu)	27	30	45	33	37	52	49
15G8-23 (hu)	25	56	24	112	38	64	49
15G8-32 (hu)	25	57	61	113	115	65	66
15G8-53 (hu)	25	59	24	114	38	67	49

*除非另外標明，否則序列是胺基酸序列（nt：核苷酸）

無。

圖 1.描繪ILT2在淋巴細胞上的表現的長條圖。使用5 µg/mL終濃度的商業抗體#1。將結合描繪為黑色長條圖，而同種型對照染色以淺灰色長條圖顯示。

圖 2.描繪ILT2在各種免疫細胞上的表現的長條圖。使用5 µg/mL終濃度的商業抗體#1。將結合描繪為黑色長條圖，而同種型對照染色以淺灰色長條圖顯示。

圖 3A 至圖 3C.（ 3A）來自TCGA資料庫的癌症適應症的表格，在所述癌症適應症中，ILT2 RNA過表現。（ 3B）腫瘤中的MDSC（髓源性抑制細胞）富集與ILT2表現之間的關聯的點圖。還呈現描繪M2富集與ILT2表現之間的關聯的橫條圖。（ 3C）.不同腫瘤中表現ILT2的各種免疫細胞的百分比的散點圖。

圖 4A 至圖 4B.（ 4A）如通過免疫組織化學（IHC）所確定，呈HLA-G陽性的各種癌症的病例百分比的橫條圖。（ 4B）各種癌症的HLA-G IHC得分的散點圖。

圖 5.各種癌症中可溶HLA-G水準的散點圖。

圖 6A 至圖 6H.（ 6A）三種抗ILT2抗體的重鏈和輕鏈的序列。如通過KABAT系統確定的CDR加底線。（ 6B）人源化15G8抗體與用人類ILT2轉染的BW細胞的表面上表現的ILT2的結合的線圖。所述圖指示與僅二抗相比，所測試不同抗體的高於背景的倍數（FAB）水準。（ 6C-6F）對於在15G8抗體的存在下與巨噬細胞共培養的（ 6C）A375-HLA-G、（ 6D）COLO-320-WT、（ 6E）COLO-320-WT和（ 6F）COLO-320-HLA-G癌細胞，將吞噬作用測量為吞噬事件的平均螢光強度（MFI）的橫條圖。（ 6G-6H）來自在15G8抗體的存在下與表現（ 6G）A375-HLA-G和（ 6H）A253 WT的各種癌細胞株共培養的NK細胞株細胞的細胞毒性百分比的橫條圖。

圖 7A 至圖 7E.（ 7A）與ILT2和ILT2家族成員的抗體結合值的表格。（ 7B）與用人類ILT2轉染的BW細胞的細胞表面上的ILT2的抗體結合的長條圖。（ 7C）嵌合和人源化19E3（左圖）以及嵌合和人源化15G8（右圖）與用人類ILT2轉染的BW細胞的表面上表現的ILT2的結合的線圖。（ 7D）用19E3抗體對胃癌樣品的免疫染色。（ 7E）使用15G8人源化抗體，來自健康對照和癌症患者的PBMC樣品中表現ILT2的各種免疫細胞的百分比的散點圖。

圖 8A 至圖 8P.（ 8A）每種ILT2抗體和陽性對照（PC，GHI/75抗體）的阻斷百分比的橫條圖。（ 8B）在ILT2阻斷抗體的存在下ILT2-生物素與表現HLA-G的細胞的結合的長條圖。通過流式細胞分析分析使用鏈黴抗生物素蛋白-PE確定ILT2-生物素與細胞的結合。無抗體（灰色線）、15G8（淺灰色線）、同種型對照（黑色線）。（ 8C）如通過ILT2-生物素與表現HLA-G的細胞的結合所確定的15G8人源化抗體的阻斷活性的線圖。（ 8D）如通過在抗體的存在下ILT2-生物素與表現HLA-G的細胞的結合所確定，嵌合和人源化19E3（左圖）以及嵌合和人源化15G8（右圖）的阻斷活性的線圖。（ 8E）在存在HLA-G表現細胞並且存在或不存在ILT2阻斷抗體的情況下，來自表現ILT2信號傳導報告物構建體的細胞的小鼠IL-2分泌的橫條圖。PC = 陽性對照（GHI/75抗體）。（ 8F）如通過報告物測定所確定的15G8人源化抗體的阻斷活性的線圖。（ 8G）在存在或不存在ILT2阻斷抗體和陽性對照抗體的情況下，來自表現ILT2信號傳導報告物構建體的細胞的小鼠IL-2分泌的橫條圖。（ 8H 至 8K）來自在存在或不存在ILT2阻斷抗體和陽性對照（ 8I 至 8J）泛HLA抗體或（ 8K）HLA-G特異性抗體的情況下與（ 8I）僅具有I型MHC表現或（ 8J 至 8K）表現I型MHC和外源HLA-G二者的A375癌細胞共培養的（ 8H）缺少ILT2或（ 8I 至 8K）表現ILT2的Jurkat細胞的人IL-2分泌的橫條圖。（ 8L 至 8N）來自在存在或不存在（ 8L）15G8抗體、（ 8M）GHI/75抗體和（ 8N）HP-F1抗體的情況下與表現HLA-G的A375癌細胞一起培養的表現ILT2的Jurkat細胞的人IL-2分泌的橫條圖。（ 8O 至 8P）分別在存在和不存在15G8抗體的情況下與HLA-G陽性癌細胞一起培育的TIL細胞和NK細胞中，活化標記（ 8O）磷酸化ZAP70和（ 8P）磷酸化Syk的表現的點圖。

圖 9A 至圖 9D.（ 9A）如通過基於FACS的方法所確定，將吞噬作用測量為在ILT2抗體的存在下與巨噬細胞共培養的表現HLA-G的癌細胞相對於對照的百分比的橫條圖。（ 9B）如通過Incucyte ^®系統所確定，在ILT2抗體的存在下巨噬細胞對癌細胞的即時吞噬作用的線圖。（ 9C）將吞噬作用測量為在ILT2抗體15G8的存在下與巨噬細胞共培養的各種表現HLA-G和I型MHC的癌細胞相對於對照的百分比的橫條圖。（ 9D）在ILT2抗體、西妥昔單抗（Erbitux®）、hIgG對照或其組合的存在下與A253-HLA-G細胞共培養的巨噬細胞的吞噬作用的橫條圖。

圖 10A 至圖 10B.來自在ILT2抗體的存在下與（ 10A）野生型721.221細胞或表現HLA-G的721.221細胞或者（ 10B）HLA-G表現A375細胞共培養的啟動的CD8 T細胞的IFNγ分泌和顆粒酶B分泌的橫條圖。

圖 11A 至圖 11H.（ 11A-11B）來自在ILT2抗體的存在下與表現（ 11A）HLA-G和（ 11B）I型MHC的各種癌細胞株共培養的NK細胞株細胞的細胞毒性百分比的橫條圖。（ 11C-11D）（ 11C）來自在15G8 ILT2抗體的存在下分別與H&N癌細胞和黑色素瘤細胞共培養的NK細胞株細胞的顆粒酶B和（ 11D）IFNγ分泌的橫條圖。（ 11E-11F）在ILT2抗體的存在下與靶癌細胞一起培育的ILT2陽性初生NK細胞中（ 11E）IFNγ表現和（ 11F）CD107A表現的橫條圖。（ 11G-11H）單獨表現的散點圖，其顯示ILT2陽性細胞與回應於ILT2抗體的（ 11G）IFNγ表現和（ 11H）CD107A表現的關聯。

圖 12.巨噬細胞中如通過流式細胞分析所確定的HLA-DR和CD80表現（MFI）的線圖，所述巨噬細胞在IgG或抗ILT2抗體的存在下從自健康供體分離的單核細胞分化為M0、M1或M2巨噬細胞。針對所測試的每種條件指示展示與對照IgG相比增加的指定標記表現的患者數量。

圖 13A 至圖 13C.（ 13A）與各種初生腫瘤細胞共培養的巨噬細胞的吞噬作用的橫條圖。（ 13B-13C）在本文的人源化抗體的存在下，自體巨噬細胞對從（ 13B）RCC患者和（ 13C）H&N患者分離的初生腫瘤細胞的劑量依賴性吞噬作用的橫條圖。

圖 14A 至圖 14L.（ 14A）來自RCC和食道癌患者的腫瘤細胞（左側圖）和PBMC（右側圖）中ILT2和PD-1表現的點圖。（ 14B 至 14C）在CRC患者的TME中，CD8 T細胞群中的（ 14B）PD-1和（ 14C）ILT2 RNA表現的箱線圖。（ 14D 至 14E）來自（ 14D）健康供體周邊血液的CD8 T細胞中的ILT2表現以及來自（ 14E）食道癌的TIL中的ILT2和PD-1表現的點圖。（ 14F）在15G8、抗PD-1抗體或二者的組合的存在下，用葡萄球菌腸毒素B（SEB）啟動的來自10名健康供體的PBMC上的膜CD107a增加的散點圖。（ 14G）來自3名供體的示例性PBMC中的表現的CD107a增加的橫條圖。（ 14H 至 14J）在抗PD-1抗體、人源化抗ILT2抗體或二者的存在下，來自與各種初生癌細胞共培養的啟動的PBMC的發炎性細胞因子（ 14H）IFNγ、（ 14I）TNFα、（ 14J）GM-CSF分泌水準的橫條圖。（ 14K 至 14L）.在混合淋巴細胞反應中來自與（ 14K）樹突細胞或（ 14L）巨噬細胞共培養的T細胞的IFNγ分泌水準的橫條圖。

圖 15A 至圖 15F.（ 15A）在補充有人巨噬細胞和抗ILT2抗體的免疫低下小鼠中生長的表現HLA-G和I型MHC的腫瘤的腫瘤體積的線圖。（ 15B）。用於預防肺部腫瘤的小鼠治療方案的圖解說明。（ 15C）在使用或不使用人PBMC和ILT2抗體的情況下，接種有HLA-G陽性癌細胞的免疫低下小鼠的肺部照片。（ 15D）歸納來自 15C的資料的散點圖。（ 15E）用於治療已經建立的肺部腫瘤的小鼠治療方案的圖解說明。（ 15F）腫瘤重量的箱線圖。

圖 16A 至圖 16F.（ 16A 至 16F）以下的箱線圖：（ 16A）總CD8 T細胞中的CD107A表現，（ 16B）T _EMRA細胞中的CD107A表現，（ 16C）NK細胞中的CD69表現，（ 16D）總CD8 T細胞中的CD69表現，在具有低或高ILT2水準的接受來自供體的PBMC的小鼠中，分別在其T _EMRA細胞或NK細胞中，（ 16E）T _EMRA細胞中的CD107表現和（ 16F）組合處理的NK細胞中的CD69表現。*是P ＜ 0.005。**是P ＜ 0.0005。***是P ＜ 0.0001。

圖 17A 至圖 17F.（ 17A）用於接種有頭頸癌且用抗ILT2或對照抗體治療的人源化NSG小鼠的治療方案的圖解說明。（ 17B）來自IgG和抗ILT2治療的小鼠的腫瘤重量的線圖。（ 17C 至 17E）（ 17C）在對BND-22治療有反應（R）或無反應（NR）的小鼠中，外周CD8 T細胞中的基線ILT2水準的橫條圖。用抗ILT2抗體治療的四隻小鼠中的腫瘤內治療後（ 17D）CD107A表現、（ 17E）M1/M2比率和（ 17F）總CD80陽性樹突細胞數量。

圖 18A 至圖 18F.（ 18A）ILT2的部分序列，其顯示具有顯著預測結合的殘基。根據這些殘基屬於表位的原始概率，將其分為四個種類。星號指示所選突變的位置。（ 18B 至 18C）對ILT2表面結構的3D渲染，其顯示（ 18B）來自18A的殘基的位置以及（ 18C）ILT2上的四個主要相互作用區域。（ 18D 至 18F）ILT2的3D條帶圖或表面圖，其顯示（ 18D）來自WO 2020/136145的15G8抗體的表位和3H5、12D12和27H5抗體的表位（左上圓圈），以及3H5抗體的二級表位（右上圓圈），（ 18E 至 18F）以及ILT2上的15G8表位與具有（ 18E）HLA-A或（ 18F）HLA-G的複合物中的B2M的相互作用。

圖 19A 至圖 19G.游離ILT2相對於ILT2-15G8複合物的保護比率的分佈。（ 19A）源自ILT2蛋白的胰蛋白酶消化的資料的橫條圖。分佈的中值是1.5，平均值是1.37。（ 19B）源自ILT2蛋白的胰蛋白酶和Asp-N消化的資料的橫條圖。分佈的中值是1.58，平均值是1.48。標記所選受保護區域。（ 19C-19G）游離ILT2肽相對於複合物的劑量-反應圖比較。線條以及正方形和圓形分別表示對照和複合物。（ 19C）肽56-71：游離ILT2 K = 9.09 s ^-1，複合物K = 2.31 s ^-1，表明由於複合物形成，降低3.94倍。（ 19D）肽57-71：游離ILT2 K = 6.93 s ^-1，複合物K = 1.97 s ^-1，表明由於複合物形成，降低3.52倍。（ 19E）肽84-100：游離ILT2 K = 1.26 s ^-1，複合物K = 0.37 s ^-1，表明由於複合物形成，降低3.41倍。（ 19F）肽57-66：游離ILT2 K = 4.32 s ^-1，複合物K = 0.72 s ^-1，表明由於複合物形成，降低6倍。（ 19G）肽91-100：游離ILT2 K = 0.7 s ^-1，複合物K = 0.14 s ^-1，表明由於複合物形成，降低5倍。

圖 20.在ELISA測定中，在15G8或無關抗體的存在下，ILT2-Fc與人B2M結合的圖。

圖 21A 至圖 21D.（ 21A 至 21B）如與IgG對照相比，在各種抗ILT2抗體的存在下與巨噬細胞共培養的（ 21A）A375-HLA-G和（ 21B）SKMEL28-HLA-G癌細胞的增加的吞噬作用%的橫條圖。（ 21C-21D）在競爭性未生物素化（ 21C）GHI/75、HP-F1以及（ 21D）MAB20172和15G8抗體的存在下使用生物素化15G8抗體的競爭ILT2結合ELISA的線圖。

無。

無。

Claims

一種單株抗體或其抗原結合片段，所述單株抗體或其抗原結合片段與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的人類ILT2序列結合。
如請求項1所述的抗體或抗原結合片段，其中所述序列選自SEQ ID NO: 68至70。
一種單株抗體或其抗原結合片段，所述單株抗體或其抗原結合片段與選自SEQ ID NO: 71和72的人類ILT2序列結合。
如請求項3所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 71和72結合。
如請求項1至4中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段結合ILT2並抑制所述ILT2與β-2-微球蛋白（beta-2-microglobulin，B2M）之間的直接相互作用。
如請求項5所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段通過對ILT2與B2M的直接相互作用的所述抑制來抑制所述ILT2與HLA蛋白或I型MHC蛋白的相互作用。
如請求項6所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HLA是HLA-G。
如請求項1至7中任一項所述的抗體，其中所述抗體是IgG4抗體並且包含含有S228P和L235E突變（Eu編號）的人類IgG4抗體的重鏈恆定區。
一種單株抗ILT2 IgG4抗體，其包含三個重鏈CDR（CDR-H1至3）和三個輕鏈CDR（CDR-L1至-3），其中所述CDR-H1至3和CDR-L1至3分別地包含 a. SEQ ID NO: 13至18， b. SEQ ID NO: 1至6，或者 c. SEQ ID NO: 7至12，並且其中所述抗體包含人類IgG4抗體的重鏈恆定區，並且在所述重鏈恆定區中包含S228P和L235E突變中的一個或兩個（Eu編號）。
如請求項9所述的IgG4抗體，其包含含有選自SEQ ID NO: 19、21和23的胺基酸序列或與其至少95%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域。
如請求項9或10所述的IgG4抗體，其包含含有選自SEQ ID NO: 20、22、24和45的胺基酸序列或與其至少95%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
如請求項9至11中任一項所述的IgG4抗體，其中所述CDR-H1至3和CDR-L1至3分別包含SEQ ID NO: 13至18， SEQ ID NO: 15中的X是A，並且所述重鏈包含選自SEQ ID NO: 28和56至59的可變結構域序列或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項12所述的IgG4抗體，其中所述輕鏈包含選自SEQ ID NO: 24和60至62的可變結構域序列或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項9至13中任一項所述的IgG4抗體，其中所述重鏈恆定區包含SEQ ID NO: 55或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項14所述的IgG4抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 48或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項14所述的IgG4抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 51或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項14所述的IgG4抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 52或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49的胺基酸序列或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項14所述的IgG4抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 64或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項14所述的IgG4抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 66或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項14所述的IgG4抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 67或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 49或與其至少95%相同的胺基酸序列。
如請求項14所述的IgG4抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 53或與其至少95%相同的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 54或與其至少95%相同的胺基酸序列。
一種包含重鏈和輕鏈的單株抗體，其中所述重鏈和所述輕鏈分別包含SEQ ID NO: 48和49。
如請求項1至22中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其用於以下中的至少一項：結合ILT2、誘導/增強抗腫瘤T細胞反應、增加T細胞增殖、降低癌症誘發的抑制子骨髓活性、增加自然殺傷細胞的細胞毒性、增加巨噬細胞吞噬作用、增加M1發炎性巨噬細胞的生成、減少M2抑制性巨噬細胞的生成、增加腫瘤微環境中的樹突細胞數量、增加樹突細胞活化、治療表現HLA-G的癌症以及治療表現I型MHC的癌症。
如請求項1至23中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其與調理劑（opsonizing agent）組合用於治療表現HLA-G或I型MHC的癌症。
如請求項1至24中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其與基於抗PD-L1/PD-1的免疫療法組合用於治療表現HLA-G或I型MHC的癌症，視情況地其中所述基於抗PD-L1/PD-1的免疫療法是派姆單抗（pembrolizumab）免疫療法。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至25中任一項所述的抗體或抗原結合片段和醫藥上可接受的賦形劑。
一種治療有需要的受試者的表現HLA-G或I型MHC的癌症的方法，所述方法包括向所述受試者投予如請求項26所述的醫藥組成物或如請求項1至25中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
如請求項27所述的方法，其還包括向所述受試者投予基於抗PD-L1/PD-1的免疫療法，視情況地其中所述基於抗PD-L1/PD-1的免疫療法是派姆單抗免疫療法。
一種增加基於抗PD-L1/PD-1的療法在有需要的受試者中針對表現HLA-G或I型MHC的癌細胞的功效的方法，所述方法包括向所述受試者向接受基於抗PD-L1/PD-1的療法的受試者投予如請求項26所述的醫藥組成物或如請求項1至25中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
如請求項27至29中任一項所述的方法，進一步包括向所述受試者投予調理劑。
如請求項30所述的方法，其中所述調理劑是EGFR抑制劑，視情況地其中所述EGFR抑制劑是西妥昔單抗（cetuximab）。
一種鑒定與重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NO: 48和49的參考抗體競爭結合至ILT2的抗體的方法，所述方法包括：使抗體文庫與包含選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的ILT2序列的多肽序列接觸，以及從所述文庫選擇結合所述ILT2序列的抗體，從而獲得與所述參考抗體競爭結合至ILT2的抗體。
一種產生ILT2結合分子的方法，所述方法包括：獲得宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼與選自SEQ ID NO: 41至44和68至70的人類ILT2序列結合的分子的一個或多個核苷酸序列，在允許所述分子表現的條件下培養所述宿主細胞，從而產生ILT2結合分子。
如請求項33所述的方法，其中所述分子與選自SEQ ID NO: 68至70的序列結合。
如請求項33或34所述的方法，其中所述分子與SEQ ID NO: 71和72中的一個或兩個結合。
如請求項33至35中任一項所述的方法，其中所述分子與SEQ ID NO: 71和72結合。
一種由請求項33至36中任一項所述的方法所產生的ILT2結合分子。
一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至25中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
如請求項38所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子是表現載體。
一種宿主細胞，其包含如請求項38或39所述的分離的核酸分子。