TW202206108A - 含有抗ｃｅａｃａｍ５抗體接合物及ｆｏｌｆｏｘ之抗腫瘤組合 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及抗體-接合物，其包含抗CEACAM5抗體與醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)組合以用於治療癌症。本發明進一步涉及用於治療癌症的醫藥組合物和成套套組，其包含抗CEACAM5抗體與醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)的組合。

Description

含有抗CEACAM5抗體接合物及FOLFOX之抗腫瘤組合
本發明涉及抗體-接合物，其包含抗CEACAM5抗體與醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)組合以用於治療癌症。本發明進一步涉及用於治療癌症的醫藥組合物和成套套組，其包含抗CEACAM5抗體與醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)的組合。
癌胚抗原(CEA)是一種參與細胞黏附的醣蛋白。CEA於1965年首次被鑑定(Gold和Freedman,J Exp Med,121,439,1965)為通常在妊娠期的前六個月由胎兒腸道表現的以及在胰腺癌、肝癌和結腸癌中被發現的蛋白質。CEA家族屬於免疫球蛋白超家族。CEA家族由18個基因組成，細分為兩個蛋白質亞組：癌胚抗原相關細胞黏附分子(CEACAM)亞組和妊娠特異性醣蛋白亞組(Kammerer & Zimmermann,BMC Biology 2010,8：12)。
在人類中，CEACAM亞組由7個成員組成：CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8。大量研究已顯示，與最初鑑定的CEA相同，CEACAM5在結直腸、胃、肺、乳腺、前列腺、卵巢、子宮頸和膀胱腫瘤細胞表面上高度表現並且在少數正常上皮組織(諸如結腸中的柱狀上皮細胞和杯狀細胞、胃中的頸黏液細胞以及食道 和子宮頸中的鱗狀上皮細胞)中弱表現(Hammarström等人2002,“Tumor markers,Physiology,Pathobiology,Technology and Clinical Applications”編輯Diamandis E.P.等人，AACC Press，華盛頓，第375頁)。因此，CEACAM5可能構成適用於腫瘤特異性靶向方法(諸如免疫接合物)的治療標靶。
CEACAM家族成員的胞外結構域由重複的免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域構成，所述免疫球蛋白樣結構域根據序列同源性被分類為3種類型：A、B和N。CEACAM5含有七個這樣的結構域，即N、A1、B1、A2、B2、A3和B3。在一方面，CEACAM5 A1、A2和A3結構域，以及在另一方面，B1、B2和B3結構域顯示出高的序列同源性，人類CEACAM5的A結構域呈現出從84%至87%的成對序列相似性，並且B結構域為從69%至80%。此外，在其結構中呈現A或/和B結構域的其他人類CEACAM成員，即CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7和CEACAM8，顯示出與人類CEACAM5的同源性。特別地，人類CEACAM6蛋白的A和B結構域分別顯示出與人類CEACAM5的A1和A3結構域以及B1至B3結構域中的任何一個的序列同源性，其甚至高於在人類CEACAM5的A結構域和B結構域中觀察到的。
鑑於CEA靶向診斷或治療目的，產生許多抗CEA抗體。針對相關抗原的特異性一直在此領域中作為問題而被提及，例如由Sharkey等人(1990,Cancer Research 50,2823)提及的。由於上述同源性，先前描述的一些抗體可能表現出與存在於不同免疫球蛋白結構域中的CEACAM5重複表位的結合和/或顯示出與其他CEACAM成員(諸如CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7或CEACAM8)的交叉反應性，缺乏對CEACAM5的特異性。鑑於CEA靶向療法，抗CEACAM5抗體的特異性是希望的，使得其與表現人類CEACAM5的腫瘤細胞結合，但不與表現其他CEACAM成員的一些正常組織結合。值得注意的是，CEACAM1、CEACAM6和CEACAM8已被描述為是由人類和非人類靈長類動 物的中性粒細胞表現的(Ebrahimmnejad等人，2000,Exp Cell Res,260,365；Zhao等人，2004,J Immunol Methods 293,207；Strickland等人，2009 J Pathol,218,380)，其中它們已顯示會調節粒細胞生成以及在免疫反應中發揮作用。
在公告為WO 2014/079886的國際專利申請案中公開了一種抗體，其與人類和食蟹猴(Macaca fascicularis)CEACAM5蛋白的A3-B3結構域結合並且其不與人類CEACAM1、人類CEACAM6、人類CEACAM7、人類CEACAM8、食蟹猴CEACAM1、食蟹猴CEACAM6和食蟹猴CEACAM8顯著交叉反應。此抗體已與美登素生物鹼(maytansinoid)接合，從而提供對MKN45人胃癌細胞具有顯著細胞毒性活性的免疫接合物，其中IC50值
Figure 110114490-A0202-12-0003-31
1nM。
抗體-免疫接合物由與細胞生長抑制藥物附接的抗體構成。在一個實施例中，抗體經由化學連接子與細胞生長抑制藥物附接。這些免疫接合物在癌症化學療法中具有巨大潛力，並且能夠選擇性地將有效的細胞生長抑制劑遞送至靶癌細胞，導致與傳統化學療法相比提高的功效；降低的全身毒性；以及改善的藥動學、藥效學和生物分佈。迄今為止，已經開發出數百種針對各種癌症的多樣的免疫接合物，其中一些已被批准用於人類使用。
現今大多數化療方案的目標是投予細胞毒性藥物的組合，每種藥物具有不同的作用機制並且有利地具有協同效應，從而引起癌細胞的死亡。此類化療方案典型地由所使用的細胞毒性藥物、它們的劑量、投予頻率和持續時間來定義。幾十年來，已經開發出新的化療方案，並且現有的化療方案已被精修用於治療癌症。
然而，根據世界衛生組織，癌症是全球第二大死因，並且在2018年造成大約960萬死亡。因此，持續需要提供改善的用於治療癌症的藥物組合和方案。
本發明涉及一種免疫接合物，其包含抗CEACAM5抗體，其與醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)組合使用以治療癌症。
本發明進一步涉及一種醫藥組合物，其包含免疫接合物以及醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑，所述免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，並且進一步涉及所述醫藥組合物用於治療癌症的用途。
本發明還涉及一種套組，其在單獨或組合的配製品中包含(i)包含免疫接合物的醫藥組合物，所述免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，以及(ii)包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑的一種或多種醫藥組合物。
本發明並且進一步涉及所述套組用於治療癌症的用途。
雖然到目前為止並非所有可能的細胞生長抑制劑組合都顯示出進一步改善的治療作用，但本發明的發明人已經確定，特別地，相對於投予單獨的抗CEACAM5抗體或FOLFOX，包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物與FOLFOX的組合對治療癌症顯示出有利活性。
圖1：作為單一藥劑或呈組合的免疫接合物huMAb2-3-SPDB-DM4和FOLFOX方案在SCID小鼠中對抗皮下結腸患者來源的異種移植物(PDX)CR-IGR-0007P PDX的活性。處理組的腫瘤體積演變。曲線代表每組每天的中值+或-MAD(中值絕對偏差)。
圖2：作為單一藥劑或呈組合的免疫接合物huMAb2-3-SPDB-DM4和FOLFOX方案在SCID小鼠中對抗皮下結腸患者來源的異種移植物CR-IGR-0011C PDX的活性。處理組的腫瘤體積演變。曲線代表每組每天的中值+或-MAD。
定義
「抗體」可以是天然或常規抗體，其中兩條重鏈通過二硫鍵彼此連接，並且每條重鏈通過二硫鍵與輕鏈連接。有兩種類型的輕鏈：λ(1)和κ(k)。有五種主要的重鏈類別(或同種型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，它們決定了抗體分子的功能活性。每條鏈含有不同的序列結構域。輕鏈包含兩個結構域或區：可變結構域(VL)和恒定結構域(CL)。重鏈包含四個結構域：可變結構域(VH)和三個恒定結構域(CH1、CH2和CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)和重鏈(VH)兩者的可變區決定對抗原的結合識別和特異性。輕鏈(CL)和重鏈(CH)的恒定區結構域賦予重要的生物特性，諸如抗體鏈締合、分泌、跨胎盤遷移性、補體結合、和與Fc受體(FcR)的結合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N末端部分，並且由一條輕鏈和一條重鏈的可變部分組成。抗體的特異性在於抗體結合位點與抗原決定簇之間的結構互補性。抗體結合位點由主要來自高變區或互補決定區(CDR)的殘基構成。偶然地，來自非高變區或架構區(FR)的殘基會影響整體結構域結構並且因此影響結合位點。因此，互補決定區或CDR是指共同定義天然免疫球蛋白結合位點的天然Fv區的結合親和力和特異性的胺基酸序列。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有三個CDR，分別命名為CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L以及CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，常規抗體抗原結合位點包括六個CDR，其包含來自重鏈和輕鏈V區中的每一個的CDR組。
「架構區」(FR)是指插入在CDR之間的胺基酸序列，即免疫球蛋白輕鏈可變區和重鏈可變區的在單個物種的不同免疫球蛋白之間相對保守的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有四個CDR，分別命名為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L以及FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。人架構區是與天然存在的人抗體的架構區基本相同(約85%或更多，特別是90%、95%、97%、99%或100%)的架構區。
在本發明的上下文中，免疫球蛋白輕鏈或重鏈中的CDR/FR定義將基於IMGT定義來確定(Lefranc等人Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1)：55-77；www.imgt.org)。
如本文所用，術語「抗體」表示常規抗體及其片段以及單結構域抗體及其片段，特別是單結構域抗體以及嵌合、人類化、雙特異性或多特異性抗體的可變重鏈。
如本文所用，抗體或免疫球蛋白還包括「單結構域抗體」，所述單結構域抗體最近已被描述並且所述單結構域抗體是其互補決定區是單結構域多肽的一部分的抗體。單結構域抗體的例子包括重鏈抗體、天然不含輕鏈的抗體、源自常規四鏈抗體的單結構域抗體、工程改造的單結構域抗體。單結構域抗體可以源自任何物種，包括但不限於小鼠、人、駱駝、美洲駝、山羊、兔、牛。單結構域抗體可以是天然存在的單結構域抗體，稱為不含輕鏈的重鏈抗體。特別地，駱駝科物種，例如駱駝、單峰駝、美洲駝、羊駝和原駝，產生天然不含輕鏈的重鏈抗體。駱駝科重鏈抗體還缺乏CH1結構域。
這些沒有輕鏈的單結構域抗體的可變重鏈在本領域中被稱為「VHH」或「奈米抗體」。與常規VH結構域類似，VHH含有四個FR和三個CDR。奈米抗體具有優於常規抗體的優勢：它們是IgG分子的約十分之一，並且因此可以通過體外表現產生正確折疊的功能奈米抗體，同時實現高產率。此外，奈米抗體非常穩定並且對蛋白酶的作用具有抗性。Harmsen和De Haard HJ綜述了奈米抗體的特性和產生(Appl.Microbiol.Biotechnol.2007年11月；77(1)：13-22)。
如本文所用的術語「單株抗體」或「mAb」是指單一胺基酸序列的抗體分子，其針對特定抗原並且不應解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。單株抗體可以由B細胞或雜交瘤的單個殖株產生，但也可以是重組的，即通過蛋白質工程產生。
術語「人類化抗體」是指這樣的抗體，所述抗體是完全或部分非人來源的並且所述抗體已經被修飾以替代某些胺基酸，特別是在VH和VL結構域的架構區中的，以便避免或最小化人的免疫反應。大多數情況下，人類化抗體的恒定結構域是人CH和CL結構域。
(常規)抗體的「片段」包含完整抗體的一部分，特別是完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括由抗體片段形成的Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、雙抗體、雙特異性和多特異性抗體。常規抗體的片段也可以是單結構域抗體，諸如重鏈抗體或VHH。
術語「Fab」表示具有約50,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其中重鏈的N末端側的約一半和整個輕鏈通過二硫鍵結合在一起。它通常是通過用蛋白酶(諸如木瓜蛋白酶)處理IgG而從片段中獲得的。
術語「F(ab’)2」是指具有約100,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其略大於經由鉸鏈區的二硫鍵結合的2個相同Fab片段。它通常是通過用蛋白酶(諸如胃蛋白酶)處理IgG而從片段中獲得的。
術語「Fab’」是指具有約50,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，所述抗體片段是通過切斷F(ab’)2鉸鏈區的二硫鍵而獲得的。
單鏈Fv(「scFv」)多肽是共價連接的VH：：VL異二聚體，其通常由包含通過編碼肽的連接子連接的VH和VL編碼基因的基因融合物表現。本發明的人scFv片段包含保持適當構象的CDR，特別是通過使用基因重組技術。二價和多價抗體片段可以通過單價scFv的締合而自發地形成，或者也可以通過肽連接子偶聯單價scFv而產生，諸如二價sc(Fv)2。「dsFv」是通過二硫鍵穩定的VH：：VL異二聚體。「(dsFv)2」表示通過肽連接子偶聯的兩個dsFv。
術語「雙特異性抗體」或「BsAb」表示將兩種抗體的抗原結合位點結合在單個分子內的抗體。因此，BsAb能夠同時結合兩種不同的抗原。越來越 頻繁地使用基因工程改造來設計、修飾和產生具有希望的一組結合特性和效應子功能的抗體或抗體衍生物，如例如在EP 2 050 764 A1中所述。
術語「多特異性抗體」表示將兩種或更多種抗體的抗原結合位點結合在單個分子內的抗體。
術語「雙抗體」是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含在同一條多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變結構域(VL)連接的重鏈可變結構域(VH)。通過使用過短而無法允許同一條鏈上兩個結構域之間配對的連接子，迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合位點。
「與參考序列至少85%相同」的胺基酸序列是在其全長上與參考胺基酸序列的全長具有85%或更多，特別是90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列。
胺基酸序列之間的「序列同一性」的百分比可以通過比較兩個序列(最佳地在比較窗中比對)來確定，其中為了兩個序列的最佳比對，與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，在比較窗中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)。百分比是通過以下方式來計算的：確定兩個序列中出現一致核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數，以得到匹配位置數；用匹配位置數除以比較窗中的位置總數，並且將結果乘以100，得到序列同一性百分比。用於比較的序列的最佳比對是通過全域成對比對進行的，例如使用Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)的演算法。序列同一性的百分比可以很容易地確定，例如使用程式Needle，用BLOSUM62矩陣，以及以下參數：空位-起始=10，空位-延伸=0.5。
「保守胺基酸取代」是這樣的胺基酸取代，其中胺基酸殘基經另一個胺基酸殘基取代，所述另一個胺基酸殘基具有化學特性(例如，電荷、大小 或疏水性)相似的側鏈R基團。通常，保守胺基酸取代將基本上不改變蛋白質的功能特性。具有化學特性相似的側鏈的胺基酸基團的例子包括1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、擷胺酸、白胺酸和異白胺酸；2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸和蘇胺酸；3)含醯胺的側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸和組胺酸；6)酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸；以及7)含硫側鏈：半胱胺酸和甲硫胺酸。保守胺基酸取代基團也可以基於胺基酸大小來限定。
當提及多肽(即，本發明的抗體)或核苷酸序列時，「純化的」和「分離的」意指所指示的分子在基本不存在相同類型的其他生物大分子的情況下存在。如本文所用的術語「純化的」特別意指存在按重量計至少75%、85%、95%或98%的相同類型的生物大分子。編碼特定多肽的「分離的」核酸分子是指基本上不含不編碼主題多肽的其他核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可以包含不對組合物的基本特徵產生有害影響的一些另外的鹼基或部分。
如本文所用，術語「受試者」表示哺乳動物，諸如齧齒動物、貓科動物、犬科動物和靈長類動物。特別地，根據本發明的受試者是人類。
包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物
本發明涉及一種免疫接合物，其包含抗CEACAM5抗體與醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)組合使用，以用於治療癌症。
所述免疫接合物典型地包含抗CEACAM5抗體和至少一種細胞生長抑制劑。特別地，在免疫接合物中，所述抗CEACAM5抗體經由可切割或不可切割的連接子與所述至少一種細胞生長抑制劑共價附接。
抗CEACAM5抗體
根據一個實施例，免疫接合物包含人類化抗CEACAM5抗體。
根據一個實施例，免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，其中所述抗CEACAM5抗體包含由SEQ ID NO：1組成的CDR-H1、由SEQ ID NO：2組成的CDR-H2、由SEQ ID NO：3組成的CDR-H3、由SEQ ID NO：4組成的CDR-L1、由胺基酸序列NTR組成的CDR-L2、和由SEQ ID NO：5組成的CDR-L3。
在一個其他實施例中，免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，其中所述抗CEACAM5抗體包含由SEQ ID NO：6組成的重鏈(VH)可變結構域和由SEQ ID NO：7組成的輕鏈(VL)可變結構域。
在一個其他實施例中，免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，所述抗體包含：
-由序列
Figure 110114490-A0202-12-0010-3
Figure 110114490-A0202-12-0010-4
(SEQ ID NO：6，其中CDR以粗字體示出)組成的重鏈可變結構域，其中FR1-H跨度為胺基酸位置1至25，CDR1-H跨度為胺基酸位置26至33(SEQ ID NO：1)，FR2-H跨度為胺基酸位置34至50，CDR2-H跨度為胺基酸位置51至58(SEQ ID NO：2)，FR3-H跨度為胺基酸位置59至96，CDR3-H跨度為胺基酸位置97至109(SEQ ID NO：3)，並且FR4-H跨度為胺基酸位置110至120，以及
-由序列
DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：7，其中CDR以粗字體示出)組成的輕鏈可變結構域，其中FR1-L跨度為胺基酸位置1至26，CDR1-L跨度為胺基酸位置27至32(SEQ ID NO：4)，FR2-L跨度為胺基酸位置33至49，CDR2-L跨度為胺基酸位置50至52，FR3-L 跨度為胺基酸位置53至88，CDR3-L跨度為胺基酸位置89至97(SEQ ID NO：5)，並且FR4-L跨度為胺基酸位置98至107。
在一個其他實施例中，免疫接合物還包含抗CEACAM5抗體，其中所述抗CEACAM5抗體包含與SEQ ID NO：6具有至少90%同一性的重鏈(VH)可變結構域和與SEQ ID NO：7具有至少90%同一性的輕鏈(VL)可變結構域，其中CDR1-H由SEQ ID NO：2組成，CDR2-H由SEQ ID NO：3組成，CDR3-H由SEQ ID NO：4組成，CDR1-L由SEQ ID NO：6組成，CDR2-L由胺基酸序列NTR組成，並且CDR3-L由SEQ ID NO：7組成。
在一個其他實施例中，免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，其中所述抗CEACAM5抗體包含與SEQ ID NO：6具有至少92%、至少95%、至少98%同一性的重鏈(VH)可變結構域和與SEQ ID NO：7具有至少92%、至少95%、至少98%同一性的輕鏈(VL)可變結構域，其中CDR1-H由SEQ ID NO：2組成，CDR2-H由SEQ ID NO：3組成，CDR3-H由SEQ ID NO：4組成，CDR1-L由SEQ ID NO：6組成，CDR2-L由胺基酸序列NTR組成，並且CDR3-L由SEQ ID NO：7組成。
在一個其他實施例中，免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，其中所述抗CEACAM5抗體包含由SEQ ID NO：8組成的重鏈(VH)和由SEQ ID NO：9組成的輕鏈(VL)。
在一個其他實施例中，免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，其中所述抗CEACAM5抗體包含與SEQ ID NO：8具有至少90%序列同一性的重鏈(VH)和與SEQ ID NO：9具有至少90%序列同一性的輕鏈(VL)，其中CDR1-H由SEQ ID NO：2組成，CDR2-H由SEQ ID NO：3組成，CDR3-H由SEQ ID NO：4組成，CDR1-L由SEQ ID NO：6組成，CDR2-L由胺基酸序列NTR組成，並且CDR3-L由SEQ ID NO：7組成。
在一個其他實施例中，免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，其中所述抗CEACAM5抗體包含與SEQ ID NO：8具有至少92%、至少95%、至少98%同一性的重鏈(VH)和與SEQ ID NO：9具有至少92%、至少95%、至少98%同一性的輕鏈(VL)，其中CDR1-H由SEQ ID NO：2組成，CDR2-H由SEQ ID NO：3組成，CDR3-H由SEQ ID NO：4組成，CDR1-L由SEQ ID NO：6組成，CDR2-L由胺基酸序列NTR組成，並且CDR3-L由SEQ ID NO：7組成。
免疫接合物中包含的抗CEACAM5抗體也可以是單結構域抗體或其片段。特別地，單結構域抗體片段可以由可變重鏈(VHH)組成，所述可變重鏈包含如上所述的抗體的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H組成。所述抗體也可以是重鏈抗體，即不含輕鏈的抗體，其可以含有或可以不含CH1結構域。
所述單結構域抗體或其片段可以包含駱駝科單結構域抗體的架構區以及視情況地駱駝科單結構域抗體的恒定結構域。
免疫接合物中包含的抗CEACAM5抗體也可以是抗體片段，特別是人類化抗體片段，選自Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2和雙抗體。
所述抗體也可以是由抗體片段形成的雙特異性或多特異性抗體，至少一個抗體片段是根據本發明的抗體片段。多特異性抗體是多價蛋白複合物，如例如在EP 2 050 764 A1或US 2005/0003403 A1中所述。
免疫接合物中包含的抗CEACAM5抗體及其片段可以通過本領域熟知的任何技術產生。特別地，所述抗體通過如下文所述的技術產生。
免疫接合物中包含的抗CEACAM5抗體及其片段可以以分離的(例如，純化的)形式或含在載體(諸如膜或脂質囊泡(例如，脂質體))中使用。
免疫接合物中包含的抗CEACAM5抗體及其片段可以通過本領域中已知的任何技術來產生，所述技術諸如但不限於單獨的或組合的任何化學、生物學、遺傳或酶促技術。
知道所希望的序列的胺基酸序列，熟習此項技術者可以通過用於生產多肽的標準技術容易地生產抗CEACAM5抗體及其片段。例如，它們可以使用熟知的固相方法，特別是使用可商購的肽合成裝置(諸如由加利福尼亞州福斯特市的Applied Biosystems製造的裝置)並且遵循製造商的說明來合成。可替代地，抗CEACAM5抗體及其片段可以通過如本領域熟知的重組DNA技術來合成。例如，這些片段在將編碼所希望的(多)肽的DNA序列摻入表現載體中並且將此類載體引入將表現所希望的多肽的合適真核生物或原核生物宿主中後作為DNA表現產物獲得，隨後可以使用熟知的技術從其中將它們分離。
通過常規免疫球蛋白純化程序適當地從培養基中分離抗CEACAM5抗體及其片段，所述純化程序諸如例如蛋白A-Sepharose、氫氧磷灰石層析法、凝膠電泳、透析、或親和層析法。
基於常規重組DNA和基因轉染技術生產人類化抗體的方法是本領域熟知的(參見例如，Riechmann L.等人1988；Neuberger MS.等人1985)。可以使用本領域已知的各種技術將抗體人體化，所述技術包括例如申請WO 2009/032661中公開的技術、CDR-移植(EP 239,400；PCT公開WO 91/09967；美國專利號5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、鑲飾(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan EA(1991)；Studnicka GM等人(1994)；Roguska MA.等人(1994))、和鏈改組(chain shuffling)(美國專利號5,565,332)。用於製備此類抗體的通用重組DNA技術也是已知的(參見歐洲專利申請案EP 125023和國際專利申請案WO 96/02576)。
可以通過用蛋白酶(諸如木瓜蛋白酶)處理與CEACAM5特異性反應的抗體來獲得抗CEACAM5抗體的Fab。此外，可以通過以下方式產生抗CEACAM5抗體的Fab：將編碼抗CEACAM5抗體的Fab的兩條鏈的DNA序列插入用於原核生物表現或用於真核生物表現的載體，並且將載體引入原核生物或真核生物細胞(視情況而定)中以表現抗CEACAM5抗體的Fab。
可以用蛋白酶(諸如胃蛋白酶)處理與CEACAM5特異性反應的抗體來獲得抗CEACAM5抗體的F(ab’)2。另外，可以通過硫醚鍵或二硫鍵結合以下所述的Fab’產生抗CEACAM5抗體的F(ab’)2。
可以用還原劑(諸如二硫蘇糖醇)處理與CEACAM5特異性反應的F(ab’)2來獲得抗CEACAM5抗體的Fab’。此外，可以通過以下方式產生抗CEACAM5抗體的Fab’：將編碼抗體的Fab’鏈的DNA序列插入用於原核生物表現的載體或用於真核生物表現的載體，並且將載體引入原核生物或真核生物細胞(視情況而定)中以執行其表現。
可以通過以下方式產生抗CEACAM5抗體的scFv：取得如先前所述的CDR或VH和VL結構域的序列，構建編碼scFv片段的DNA，將DNA插入原核生物或真核生物表現載體中，並且然後將表現載體引入原核生物或真核生物細胞(視情況而定)中以表現scFv。為了產生人類化scFv片段，可以使用稱為CDR移植的熟知的技術，所述技術涉及選擇根據本發明的互補決定區(CDR)，並且將它們移植到已知三維結構的人scFv片段架構上(參見例如，W0 98/45322；WO 87/02671；US 5,859,205；US 5,585,089；US 4,816,567；EP 0173494)。
細胞生長抑制劑
用於根據本發明的用途的免疫接合物典型地包含至少一種細胞生長抑制劑。如本文所用的細胞生長抑制劑是指殺死細胞(包括癌細胞)的藥劑。 此類藥劑有利地停止癌細胞分裂和生長，並且導致腫瘤的大小縮小。術語細胞生長抑制劑在本文中與術語化療劑、細胞毒性劑或細胞生長抑制劑可互換使用。
在一個其他實施例中，所述細胞生長抑制劑係選自放射性同位素、蛋白質毒素、小分子毒素及其組合。
放射性同位素包括適用於治療癌症的放射性同位素。此類放射性同位素通常主要發射β-輻射。在一個其他實施例中，所述放射性同位素選自At211、Bi212、Er169、I131、I125、Y90、In111、P32、Re186、Re188、Sm153、Sr89、Lu的放射性同位素及其組合。在一個實施例中，所述放射性同位素是發射α-輻射的α-發射體同位素，更具體地Th227。
在一個其他實施例中，所述小分子毒素係選自抗代謝物、DNA烷化劑、DNA交聯劑、DNA嵌入劑、抗微管劑、拓撲異構酶抑制劑及其組合。
在一個其他實施例中，所述抗微管劑係選自紫杉烷、長春花生物鹼、美登素生物鹼、秋水仙鹼、鬼臼毒素、灰黃黴素及其組合。
在一個其他實施例中，美登素生物鹼係選自美登醇、美登醇類似物及其組合。
合適的美登醇類似物的例子包括具有經修飾的芳族環的那些以及在其他位置具有修改的那些。此類合適的美登素生物鹼公開在美國專利號4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；和5,846,545中。
具有經修飾的芳族環的合適的美登醇類似物的具體例子包括：
(1)C-19-去氯(美國專利號4,256,746)(通過安絲菌素P2的LAH還原來製備)；
(2)C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利號4,361,650和4,307,016)(通過使用鏈黴菌(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)去甲基或使用LAH去氯來製備)；以及
(3)C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-去氯(美國專利號4,294,757)(通過使用醯氯進行醯化來製備)。
具有其他位置的修飾的合適的美登醇類似物的具體例子包括：
(1)C-9-SH(美國專利號4,424,219)(通過使美登醇與H2S或P2S5反應來製備)；
(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美國專利號4,331,598)；
(3)C-14-羥甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利號4,450,254)(由Nocardia製備)；
(4)C-15-羥基/醯氧基(美國專利號4,364,866)(通過由鏈黴菌將美登醇轉化來製備)；
(5)C-15-甲氧基(美國專利號4,313,946和4,315,929)(從滑桃(Trewia nudiflora)中分離的)；
(6)C-18-N-去甲基(美國專利號4,362,663和4,322,348)(通過由鏈黴菌將美登醇去甲基來製備)；以及
(7)4,5-去氧基(美國專利號4,371,533)(通過美登醇的三氯化鈦/LAH還原來製備)。
在一個其他實施例中，本發明的細胞毒性接合物使用含硫醇的美登素生物鹼(DM1)，正式稱為N2’-脫乙醯基-N2’-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素，作為細胞毒性劑。DM1通過以下結構式(I)表示：
Figure 110114490-A0202-12-0017-5
在一個其他實施例中，本發明的細胞毒性接合物使用含硫醇的美登素生物鹼DM4，正式稱為N2’-脫乙醯基-N-2’(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素，作為細胞毒性劑。DM4通過以下結構式(II)表示：
Figure 110114490-A0202-12-0017-6
在本發明的進一步實施例中，可以使用其他美登素，包括在帶有硫原子的碳原子上帶有單或二烷基取代的含硫醇和二硫化物的美登素生物鹼。它們包括在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基、或C-20去甲基處具有醯化胺基酸側鏈的美登素生物鹼，所述醯化胺基酸側鏈帶有受阻硫氫基的醯基，其中帶有硫醇官能團的醯基碳原子具有一個或兩個取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有從1至10種試劑的直鏈或支鏈烷基或烯基以及可存在於溶液中的任何聚集體。
因此，在一個其他實施例中，所述美登素生物鹼係選自(N2’-脫乙醯基-N2’-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素)DM1或N2’-脫乙醯基-N-2’(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)及其組合。
在一個其他實施例中，在免疫接合物中，所述抗CEACAM5抗體經由可切割或不可切割的連接子與所述至少一種細胞生長抑制劑共價附接。
在一個其他實施例中，所述連接子係選自吡啶基二硫代丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDB)、4-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-磺基-丁酸(磺基-SPDB)、和(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)。
在一個其他實施例中，所述連接子與抗CEACAM5抗體的Fc區中的離胺酸殘基結合。在一個其他實施例中，所述連接子與美登素形成二硫鍵或硫醚鍵。
特別地，抗CEACAM5-免疫接合物可以選自：
i)式(III)的抗CEACAM5-SPDB-DM4-免疫接合物
Figure 110114490-A0202-12-0018-7
ii)式(IV)的抗CEACAM5-磺基-SPDB-DM4-免疫接合物
Figure 110114490-A0202-12-0019-8
以及
iii)式(V)的抗CEACAM5-SMCC-DM1-免疫接合物
Figure 110114490-A0202-12-0019-9
在一個其他實施例中，本發明的免疫接合物包含抗CEACAM5抗體(huMAb2-3)，所述抗體包含SEQ ID NO：8的重鏈(VH)和SEQ ID NO：9的輕鏈(VL)，其中huMAb2-3經由吡啶基二硫代丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDB) 與N2’-脫乙醯基-N-2’(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)共價連接。從而，獲得免疫接合物huMAb2-3-SPDB-DM4。
如本文所用的「連接子」意指包含共價鍵或原子鏈的化學部分，所述化學部分將多肽共價附接至藥物部分。
所述接合物可以通過體外方法來製備。為了將藥物或前藥與抗體連接，使用連接基團。合適的連接基團是本領域熟知的，並且包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團和酯酶不穩定基團。本發明的抗體與細胞毒性劑或生長抑制劑的接合可以使用多種雙官能蛋白質偶聯劑來進行，所述雙官能蛋白質偶聯劑包括但不限於吡啶基二硫代丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDB)、丁酸4-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫基]-2,5-二側氧基-1-吡咯烷基酯(硝基-SPDB)、4-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-磺基-丁酸(磺基-SPDB)、(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺基酯的雙官能衍生物(諸如二甲基二亞胺代己二酸酯HCL)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)-乙二胺)、雙重氮鎓衍生物(諸如雙-(對二重氮鎓苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳標記的1-異硫氰酸基苄基甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體接合的示例性螯合劑(WO 94/11026)。
連接子可以是「可切割連接子」，其促進細胞中細胞毒性劑或生長抑制劑的釋放。例如，可以使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、酯酶不穩定連接子、光不穩定連接子或含二硫化物的連接子(參見例如，美國專利號 5,208,020)。連接子也可以是「不可切割的連接子」(例如，SMCC連接子)，其在一些情況下可能導致更好的耐受性。
通常，接合物可以通過包括以下步驟的方法獲得：
(i)使視情況緩衝的細胞結合劑(例如，根據本發明的抗體)水溶液與連接子和細胞毒性化合物的溶液接觸；
(ii)然後視情況地分離在(i)中由未反應的細胞結合劑形成的接合物。
可以用緩衝液諸如例如磷酸鉀、乙酸鉀、檸檬酸鉀或N-2-羥乙基六氫吡嗪-N’-2-乙磺酸(Hepes緩衝液)來緩衝細胞結合劑的水溶液。緩衝液取決於細胞結合劑的性質。細胞毒性化合物呈在有機極性溶劑中的溶液，所述機極性溶劑例如二甲基亞碸(DMSO)或二甲基乙醯胺(DMA)。
反應溫度通常包括在20℃與40℃之間。反應時間可以從1至24小時變化。細胞結合劑與細胞毒性劑之間的反應可以通過尺寸排阻層析法(SEC)與折射和/或UV檢測器來監測。如果接合物產率太低，則可以延長反應時間。
熟習此項技術者可以使用多種不同的層析方法來進行步驟(ii)的分離：可以例如通過SEC、吸附層析法(諸如離子交換層析法，IEC)、疏水相互作用層析法(HIC)、親和層析法、混合支持層析法(諸如羥基磷灰石層析法)或高效液相層析法(HPLC)將接合物純化。也可以使用通過透析或滲濾進行的純化。
如本文所用，術語「聚集體」意指可以在兩種或更多種細胞結合劑之間形成的締合物，所述結合劑經接合修飾或未經修飾。聚集體可以在許多參數的影響下形成，所述參數諸如在溶液中細胞結合劑的高濃度、溶液的pH、高剪切力、鍵合二聚體的數量及其疏水特徵、溫度(參見Wang和Gosh,2008,J.Membrane Sci.,318：311-316，以及其中引用的參考文獻)；注意，這些參數中的一些的相對影響尚未明確確立。在蛋白質和抗體的情況下，熟習此項技術者 將參考Cromwell等人(2006,AAPS Jounal,8(3)：E572-E579)。聚集體中的含量可以用技術人員熟知的技術來確定，所述技術諸如SEC(參見Walter等人，1993,Anal.Biochem.,212(2)：469-480)。
在步驟(i)或(ii)之後，可以使含有接合物的溶液經受層析法、超濾和/或滲濾的附加步驟(iii)。
在這些步驟結束時在水溶液中回收接合物。
在一個其他實施例中，根據本發明的免疫接合物的特徵在於「藥物與抗體的比率」(或「DAR」)的範圍為從1至10、從2至5或從3至4。這通常是包含美登素生物鹼分子的接合物的情況。
此DAR值可以隨與用於接合的實驗條件(如生長抑制劑/抗體的比率、反應時間、溶劑的性質和助溶劑(如果有的話)的性質)一起使用的抗體和藥物(即，生長抑制劑)的性質而變化。因此，抗體與生長抑制劑之間的接觸導致一種混合物，所述混合物包含藥物與抗體的比率彼此不同的若干種接合物；視情況地裸抗體；視情況地聚集體。因此，確定的DAR是平均值。
可以用於確定DAR的方法在於通過分光光度法測量基本上純化的接合物的溶液在λD與280nm處的吸光度比率。280nm是通常用於測量蛋白質濃度(諸如抗體濃度)的波長。選擇波長λD以允許區分藥物與抗體，即如技術人員容易知道的，λD是藥物具有高吸光度時的波長，並且λD離280nm足夠遠以避免藥物和抗體的吸收峰的基本重疊。在美登素生物鹼分子的情況下，λD可以選擇為252nm。DAR計算方法可以源自Antony S.Dimitrov(編輯)，LLC,2009,Therapeutic Antibodies and Protocols，第525卷，445,Springer Science：
根據尺寸排阻層析法(SEC)分析的單體峰(允許計算「DAR(SEC)」參數)或使用經典的分光光度計設備(允許計算「DAR(UV)」參數)測量接合物 在λD處的吸光度(AλD)和280nm處的吸光度(A280)。吸光度可以表示如下：
AλD=(cD x εDλD)+(cA x εAλD)
A280=(cD x εD280)+(cA x εA280)
其中：
●cD和cA分別是在溶液中藥物和抗體的濃度
●εDλD和εD280分別是藥物在λD和280nm處的摩爾消光係數
●εAλD和εA280分別是在λD和280nm處抗體的摩爾消光係數。
用兩個未知項求解這兩個方程式得到以下方程式：
cD=[(εA280 x Aλ D)-(εAλD x A280)]/[(εDλD x εA280)-(εAλD x εD280)]
cA=[A280-(cD x εD280)]/εA280
然後由藥物濃度與抗體濃度的比率計算平均DAR：DAR=cD/cA。
FOLFOX
包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物與FOLFOX組合用於治療癌症。
FOLFOX本身是被批准用於人類使用的已知化療方案，其包括組合投予醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑，並且其典型地以最多12個兩週的週期投予。FOLFOX組合了藥物，每種藥物具有不同的作用機制並且有利地具有協同作用，從而引起癌細胞的死亡。
5-氟-尿嘧啶(CAS登記號51-21-8)是抗代謝物，所述抗代謝物主要抑制胸苷酸合成酶並且因此阻斷胸苷的合成。5-氟-尿嘧啶已用於治療結腸癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、和子宮頸癌。
醛葉酸(也稱為甲醯四氫葉酸(CAS登記號58-05-9))會穩定5-氟-尿嘧啶與胸苷酸合酶之間的複合物，增加5-氟-尿嘧啶的細胞毒性。在一個實施例中，醛葉酸是L-醛葉酸(N-[4-[[[(6S)-2-胺基-5-甲醯基-3,4,5,6,7,8-六氫-4-側氧基-6-蝶啶基]甲基]胺基]苯甲醯基]-L-麩胺酸)。在另一個實施例中，醛葉酸是L-醛葉酸的鈣鹽。醛葉酸還可以包含兩種或更多種立體異構物的混合物。
已知奧沙利鉑(CAS編號61825-94-3)在DNA鏈中形成交聯，從而阻止DNA複製和轉錄，並且已用於治療結直腸癌。
組合治療
根據本發明，包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物用於與醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)組合以用於治療癌症。本發明還涉及醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)，其用於與包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物組合來治療癌症。
本發明還涉及一種治療有需要的受試者的癌症的方法，其包括向有需要的受試者投予包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物，並且投予另外的醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑。
本發明還涉及包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物，其用於治療單獨或同時接受FOLFOX的有需要的受試者的癌症，其中醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑可以單獨地或同時投予。
在一個實施例中，癌症是實體瘤。根據一個實施例，癌症選自結直腸癌、胃癌、胰腺癌和食道癌。在一個其他實施例中，癌症是結直腸癌。
根據一個實施例，患者是患有惡性腫瘤的患者，特別是患有惡性實體瘤的患者，並且更特別地患有局部晚期或轉移性實體惡性腫瘤的患者。
根據一個實施例，將包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物和FOLFOX同時投予於有需要的受試者。
在一個其他實施例中，包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物和FOLFOX被配製為(i)包含所述免疫接合物和FOLFOX的單一醫藥組合物，或(ii)呈至少兩種單獨醫藥組合物的形式，其中，在單獨或組合的配製品中，至少一種醫藥組合物包含所述包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物，並且一種或多種醫藥組合物包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑。在至少兩種單獨的醫藥組合物中配製免疫接合物和FOLFOX的情況下，將所述至少兩種單獨的醫藥組合物同時投予於有需要的受試者。
根據另一個實施例，將包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物和FOLFOX單獨地或順序地投予於有需要的受試者。
根據此實施例，包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物和FOLFOX被配製呈至少兩種單獨醫藥組合物的形式，其中在單獨或組合的配製品中，(i)至少一種醫藥組合物包含所述免疫接合物，以及(ii)一種或多種醫藥組合物包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑。
在一個實施例中，以從60至210mg/m2的劑量投予免疫接合物。在另一個實施例中，以從100至300mg/m2的劑量投予醛葉酸或以100至200m/m2的劑量投予L-醛葉酸。在另一個實施例中，以從1000至2000mg/m2的劑量投予5-氟-尿嘧啶。在另一個實施例中，以從50至200mg/m2的劑量投予奧沙利鉑。
在另一個實施例中，投予本發明的醫藥組合物或組合，其中以從60至210mg/m2的劑量投予抗CEACAM5抗體，以從200至600mg/m2的劑量投予醛葉酸或以100至200mg/m2的劑量投予L-醛葉酸，以從2000至4000mg/m2的劑量投予5-氟尿嘧啶(5-FU)，並且以從50和約200mg/m2的劑量投予奧沙利鉑。在此實施例的一個方面，給藥方案包括在2小時至48小時的時間段內投 予所述劑量。在此實施例的一個方面，給藥頻率從每週一次至每三週一次變化。在一個實施例中，治療持續時間為至少4或6個月。
在一個其他實施例中，以8至16個週期投予包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物以及醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)。在一個實施例中，所述週期選自1週的週期、2週的週期或3週的週期。在一個實施例中，所述週期包括：
在所述週期中至少一次以從60至210mg/m2的劑量投予所述免疫接合物；
在所述週期中至少一次以從100至300mg/m2的劑量投予醛葉酸或以100至200m/m2的劑量投予L-醛葉酸；
在所述週期中至少一次以從1000至2000mg/m2的劑量投予5-氟-尿嘧啶，以及
在所述週期中至少一次以從50至200mg/m2的劑量投予奧沙利鉑。
在一個實施例中，在所述週期的第1天以從60至210mg/m2的劑量投予免疫接合物。在一個實施例中，在所述週期的第1天和第2天以從100至300mg/m2的劑量投予醛葉酸或以100至200m/m2/天的劑量投予L-醛葉酸。在一個實施例中，在所述週期的第1天和第2天以從1000至2000mg/m2的劑量投予5-氟-尿嘧啶。在一個實施例中，在所述週期的第1天以從50至200mg/m2的劑量投予奧沙利鉑。
單位「mg/m2」指示以mg化合物/m2投予的受試者體表計的量。熟習此項技術者知道如何基於有待治療的受試者的體表確定其所需的化合物量，而所述體表又可以基於高度和體重來計算。
本發明進一步涉及一種醫藥組合物，其包含免疫接合物並且進一步包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑，所述免疫接合物包含抗CEACAM5抗體。
本發明進一步涉及一種套組，其在單獨或組合的配製品中包含(i)包含免疫接合物的醫藥組合物，所述免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，以及(ii)包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑的一種或多種醫藥組合物。
本發明進一步涉及一種醫藥組合物，其包含免疫接合物並且進一步包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑，以用於治療癌症，所述免疫接合物包含抗CEACAM5抗體。
本發明進一步涉及一種套組，其在單獨或組合的配製品中包含(i)包含免疫接合物的醫藥組合物，所述免疫接合物包含抗CEACAM5抗體，以及(ii)包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑的一種或多種醫藥組合物，以用於治療癌症。
「醫藥上」或「醫藥上可接受的」是指當投予於哺乳動物、尤其是人(視情況而定)時不產生不良反應、過敏反應或其他不利反應的分子實體和組合物。醫藥上可接受的載劑或賦形劑是指任何類型的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或配製助劑。
如本文所用，「醫藥上可接受的載劑」包括生理學相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑等。合適的載劑、稀釋劑和/或賦形劑的例子包括以下中的一種或多種：水、胺基酸、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、緩衝磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽；胺基酸及衍生物，諸如組胺酸、精胺酸、甘胺酸、脯胺酸、甘胺醯甘胺酸；無機鹽NaCl、氯化鈣；糖或多元醇，諸如右旋糖、甘油、乙醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇；表面活性劑，諸如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆188；等等，以及它們的組合。在許多情況下，將較佳在組合物中包括等滲劑，諸如糖、多元醇或氯化鈉，並且配製品還可以含有抗氧化劑(諸如色胺)和穩定劑(諸如Tween 20)。
醫藥組合物的形式、投予途徑、劑量和方案天然取決於有待治療的病症；疾患的嚴重程度；患者的年齡、體重和性別等。
本發明的醫藥組合物可以配製用於外用、口服、腸胃外、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下或眼內投予等。
特別地，醫藥組合物含有載劑，其對於能夠注射的配製品是醫藥上可接受的。它們可以特別是等張的、無菌的、鹽水溶液(磷酸一鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或此類鹽的混合物)，或乾燥的、尤其是冷凍乾燥的組合物，其視情況添加無菌水或生理鹽水後得以構成可注射溶液。
所述醫藥組合物可以通過藥物組合裝置來投予。
用於投予的劑量可以根據各種參數進行調整，並且特別是根據所使用的投予方式、相關病理、或可替代地，所希望的治療持續時間進行調整。
為了製備醫藥組合物，可以將有效量的包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物以及醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑溶解或分散在醫藥上可接受的載劑或水性介質中。
適用於注射用途的藥物形式包括無菌水溶液或分散體；包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的配製品；和用於臨時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。在所有情況下，所述形式必須是無菌的，並且可以用用於在不降解的情況下遞送的適當裝置或系統進行注射。其在製造和儲存條件下必須穩定並且必須抵抗微生物(諸如細菌和真菌)的污染作用而保存。
可以在與表面活性劑適當混合的水中製備作為游離鹼或醫藥上可接受的鹽的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中製備分散體。在通常的儲存和使用條件下，這些製劑含有防腐劑以防止微生物的生長。
可以將包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物配製成呈中性或鹽形式的組合物。醫藥上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離胺基形成)，並且所述酸加成鹽是與無機酸(諸如例如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸)等形成的。由游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機鹼(諸如例如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物)以及有機鹼(諸如異丙胺、三甲胺、甘胺酸、組胺酸、普魯卡因等)。
載劑也可以是溶劑或分散介質，所述溶劑或分散介質含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物以及植物油。例如，通過使用包衣(諸如卵磷脂)、通過在分散體的情況下維持所需的細微性、以及通過使用表面活性劑，可以維持適當的流動性。防止微生物的作用可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等來實現。在許多情況下，將較佳包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來實現。
無菌可注射溶液通過以下方式來製備：將所需量的活性化合物與上面列舉的各種其他成分(根據需要)一起摻入適當的溶劑中來製備，隨後過濾滅菌。通常，通過將各種滅菌的活性成分摻入無菌媒介物中來製備分散體，所述無菌媒介物含有鹼性分散介質和來自以上列舉的那些的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，較佳的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，所述真空乾燥和冷凍乾燥技術由先前無菌過濾的其溶液產生活性成分和任何另外的所希望的成分的粉末。
還考慮製備用於直接注射的更大或高度濃縮的溶液，其中設想使用DMSO作為溶劑導致極快的滲透，將高濃度的活性劑遞送到小腫瘤區域。
在配製時，將以與劑量配製品相容的方式並且以治療有效的量投予溶液。配製品易於以多種劑型投予，諸如上述可注射溶液的類型，但也可以使用藥物釋放膠囊等。
對於以水溶液進行的腸胃外投予，例如，如果需要，應將溶液適當緩衝，並且將液體稀釋液首先用足夠的鹽水或葡萄糖使其等張。這些特定的水溶液尤其適用於靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內投予。在這點上，鑑於本公開文本，可以使用的無菌水性介質對於熟習此項技術者而言將是已知的。例如，可以將一個劑量溶解在1ml等張NaCl溶液中，並且添加到1000ml皮下灌注流體中或注射到建議的輸液部位(參見例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038和1570-1580頁)。根據所治療的受試者的狀況，將必然出現劑量的一些變化。負責投予的人將在任何情況下確定個體受試者的適當劑量。
包含抗CEACAM5抗體的免疫接合物被配製用於腸胃外投予，諸如靜脈內或肌肉內注射，其他醫藥上可接受的形式包括例如，用於口服投予的片劑或其他固體；定時釋放膠囊；以及當前使用的任何其他形式。
在某些實施例中，考慮使用脂質體和/或奈米顆粒將多肽引入宿主細胞中。脂質體和/或奈米顆粒的形成和使用是熟習此項技術者已知的。
奈米膠囊通常可以以穩定且可再現的方式捕獲化合物。為避免由於胞內聚合物超載引起的副作用，通常使用能夠在體內降解的聚合物來設計此類超細顆粒(大小約0.1μm)。考慮將滿足這些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯奈米顆粒或可生物降解的聚丙交酯或聚丙交酯共乙交酯奈米顆粒用於本發明，並且此類顆粒可以容易地製造。
脂質體由分散在水性介質中並且自發形成多層同心雙層囊泡(也稱為多層囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV通常具有從25nm至4μm的直徑。 MLV的超聲處理導致形成直徑在200至500Å範圍內的小單層囊泡(SUV)，核心中含有水溶液。脂質體的物理特徵取決於pH、離子強度和二價陽離子的存在。
實例
實例1：與FOLFOX組合的免疫接合物huMAb2-3-SPDB-DM4在SCID小鼠中對抗兩種皮下結腸患者來源的異種移植物CR-IGR-0007P PDX和CR-IGR-0011C PDX的活性。
實驗程序
在皮下植入雌性SCID小鼠中的兩種皮下結腸患者來源的異種移植物(PDX)(CR-IGR-0007P PDX和CR-IGR-0011C PDX)中評價作為單一藥劑或呈組合的huMAb2-3-SPDB-DM4和FOLFOX方案的活性。對照組不作處理。所用化合物的劑量以mg/kg給出。
對於CR-IGR-0007P PDX，在腫瘤植入後第26天，當中值腫瘤負荷達到166.0mm3時開始處理。在3個每週的靜脈投予週期後在第26、33和40天以5mg/kg投予huMAb2-3-SPDB-DM4。FOLFOX方案在3個每週的週期後投予，並且由以下組成：在第26、33和40天靜脈投予30mg/kg的醛葉酸和5mg/kg的奧沙利鉑，並且在第27、34和41天靜脈投予28mg/kg的5-FU。
對於CR-IGR-0011C PDX，在腫瘤植入後第19天，當中值腫瘤負荷達到123.5mm3時開始處理。在3個每週的靜脈投予週期後在第19、26和33天以5mg/kg投予huMAb2-3-SPDB-DM4。FOLFOX方案在3個每週的週期後投予，並且由以下組成：在第19、26和33天靜脈投予30mg/kg的醛葉酸和5mg/kg的奧沙利鉑，並且在第20、27和34天靜脈投予28mg/kg的5-FU。
對於抗腫瘤活性的評價，每天將動物稱重，並且每週2次用卡尺測量腫瘤。產生20%的在最低點的體重減輕(組的平均值)或10%或更多藥物 死亡的劑量被認為是過度毒性劑量。動物體重包括腫瘤重量。使用公式質量(mm3)=[長度(mm)×寬度(mm)×寬度(mm)]/2計算腫瘤體積。主要功效終點是△T/△C、百分比中值消退、部分和完全消退(PR和CR)。
通過從指定觀察日的腫瘤體積中減去第一處理日(分期日)的腫瘤體積，對於每個腫瘤計算每個處理(T)和對照(C)的腫瘤體積變化。計算處理組的中值△T，並且計算對照組的中值△C。然後計算比率△T/△c，並且表示為百分比： △T/△C=(△T/△C)x 100。
當△T/△C低於40%時，劑量被認為是治療活性的，並且當△T/△C低於10%時，劑量被認為是非常活性的。如果△T/△C低於0，則劑量被認為是高度活性的，並且消退的百分比是有日期的(Plowman J,Dykes DJ,Hollingshead M,Simpson-Herren L and Alley MC.Human tumor xenograft models in NCI drug development.In：Feibig HH BA編輯Basel：Karger.；1999第101-125頁)：
腫瘤消退%被定義為與第一處理的第一天的腫瘤體積相比，在指定觀察日在處理組中的腫瘤體積降低%。
在特定時間點並且對於每只動物，計算消退%。然後針對所述組計算中值消退%：
Figure 110114490-A0202-12-0032-10
部分消退(PR)：如果在處理開始時腫瘤體積降低至腫瘤體積的50%，則將消退定義為是部分的。
完全消退(CR)：當腫瘤體積=0mm3時，實現完全消退(當無法記錄腫瘤體積時，被認為是CR)。
結果
CR-IGR-0007P PDX的結果呈現在圖1和表1(下文)中。
在D54發現對照組的一隻小鼠死亡；CR-IGR-0007P是侵襲性腫瘤並且可以是惡病質的。huMAb2-3-SPDB-DM4以低於最大耐受劑量(MTD)的劑量投予，並且處理被良好耐受並且沒有誘導毒性。以在未帶有腫瘤的小鼠中確定的其各自MTD投予FOLFOX方案。在帶有CR-IGR-0007P腫瘤的這些小鼠中，細胞毒性處理被耐受，單獨地或組合有在8.1%至10.8%之間的體重減輕。
單一的huMAb2-3-SPDB-DM4是無活性的，其中在D49的△T/△C等於76%。作為單一藥劑的FOLFOX方案是活性的，其中△T/△C等於15%(p<0.0001)。
huMAb2-3-SPDB-DM4和FOLFOX方案的組合是高度活性的，具有次於0%的△T/△C(p<0.0001)、9%的腫瘤消退和1個PR(部分消退)。huMAb2-3-SPDB-DM4與FOLFOX的組合的作用從第36天至第57天顯著不同於單獨的huMAb2-3-SPDB-DM4的作用並且從第44天至第57天顯著不同於單獨的FOLFOX的作用。
總之，在CR-IGR-0007P PDX中，在以5mg/kg進行3個每週的靜脈投予後huMAb2-3-SPDB-DM4作為單一藥劑是無活性的，然而FOLFOX方案是活性的並且處理被良好耐受。huMAb2-3-SPDB-DM4和FOLFOX方案的組合比單一藥劑有更大活性。
表1-單獨的或呈組合的huMAb2-3-SPDB-DM4和FOLFOX方案在SCID小鼠中對抗皮下結腸患者來源的異種移植物CR-IGR-0007P的活性
Figure 110114490-A0202-12-0033-11
Figure 110114490-A0202-12-0034-12
CR-IGR-0011C PDX的結果呈現在圖2和表2(下文)中。
對照組小鼠展現出負體重變化(第32天的最低點為-6.7%)；CR-IGR-0011C是侵襲性腫瘤並且可以是惡病質的。huMAb2-3-SPDB-DM4以低於最大耐受劑量(MTD)的劑量投予，並且處理被良好耐受並且沒有誘導毒性。
以在未帶有腫瘤的小鼠中確定的其MTD投予FOLFOX方案。在帶有誘導體重減輕的CR-IGR-0011C腫瘤的這些小鼠中，細胞毒性處理單獨或組合地誘導累加的體重減輕，並且對於每組在D24添加用於實驗齧齒動物的高卡路里飲食補充劑。
單獨的或呈組合的FOLFOX方案誘導在5.6%至9.8%之間的體重減輕，除了用FOLFOX和huMAb2-3-SPDB-DM4的組合處理的組，在所述組中單個小鼠漸進地損失體重直到達到多於20%的體重減輕並且在D24死亡。這種死亡是由於腫瘤侵襲性和處理影響的增加，並且考慮到整個組，所述組合沒有觀察到累積毒性。
作為單一藥劑的huMAb2-3-SPDB-DM4是高度活性的，具有在D35次於0%的△T/△C(p<0.0001)、29%的腫瘤消退和2個PR。
作為單一藥劑的FOLFOX方案是無活性的，其中△T/△C等於71%(NS)。
huMAb2-3-SPDB-DM4和FOLFOX方案的組合是高度活性的，具有次於0%的△T/△C(p<0.0001)、76%的腫瘤消退、5個PR和1個CR(完全消退)。huMAb2-3-SPDB-DM4與FOLFOX的組合的作用從第22天至第35天顯著不同於單獨的huMAb2-3-SPDB-DM4的作用並且從第22天至第35天顯著不同於單獨的FOLFOX的作用。
總之，在CR-IGR-0001C PDX中，在以5mg/kg的3個每週的靜脈投予後huMAb2-3-SPDB-DM4作為單一藥劑是高度活性的。FOLFOX作為單一藥劑是無活性的。HUMAB2-3-SPDB-DM4與FOLFOX的組合比對應的單一藥劑有顯著更大活性。
表2-單獨的或呈組合的HUMAB2-3-SPDB-DM4和FOLFOX方案在SCID小鼠中對抗皮下結腸患者來源的異種移植物CR-IGR-0011C的活性
Figure 110114490-A0202-12-0035-13
序列說明
SEQ ID NO：1-5示出了抗CEACAM5抗體(huMAb2-3)的序列CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H、CDR1-L和CDR3-L。
SEQ ID NO：6示出了抗CEACAM5抗體(huMAb2-3)的重鏈(VH)可變結構域的序列。
SEQ ID NO：7示出了抗CEACAM5抗體(huMAb2-3)的輕鏈(VL)可變結構域的序列。
SEQ ID NO：8示出了抗CEACAM5抗體(huMAb2-3)的重鏈序列。
SEQ ID NO：9示出了抗CEACAM5抗體(huMAb2-3)的輕鏈序列。
<110> 法商賽諾菲公司(Sanofi)
<120> 含有抗CEACAM5抗體接合物及FOLFOX的抗腫瘤組合
<130> BET 19P5173
<160> 9
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的CDR-H1
<400> 1
Figure 110114490-A0202-12-0037-14
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的CDR-H2
<400> 2
Figure 110114490-A0202-12-0037-16
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的CDR-H3
<400> 3
Figure 110114490-A0202-12-0038-17
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的CDR-L1
<400> 4
Figure 110114490-A0202-12-0038-18
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的CDR-L3
<400> 5
Figure 110114490-A0202-12-0039-19
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的重鏈可變結構域
<400> 6
Figure 110114490-A0202-12-0039-20
Figure 110114490-A0202-12-0040-21
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的輕鏈可變結構域
<400> 7
Figure 110114490-A0202-12-0040-22
Figure 110114490-A0202-12-0041-23
<210> 8
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的重鏈
<400> 8
Figure 110114490-A0202-12-0041-24
Figure 110114490-A0202-12-0042-25
Figure 110114490-A0202-12-0043-26
Figure 110114490-A0202-12-0044-27
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5抗體的輕鏈
<400> 9
Figure 110114490-A0202-12-0044-28
Figure 110114490-A0202-12-0045-29
Figure 110114490-A0202-12-0046-30

Claims (22)

  1. 一種免疫接合物，其包含抗CEACAM5抗體與醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)組合以用於治療癌症。
  2. 如請求項1所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述抗CEACAM5抗體包含由SEQ ID NO：1組成的CDR-H1、由SEQ ID NO：2組成的CDR-H2、由SEQ ID NO：3組成的CDR-H3、由SEQ ID NO：4組成的CDR-L1、由胺基酸序列NTR組成的CDR-L2、和由SEQ ID NO：5組成的CDR-L3。
  3. 如請求項1或2所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述抗CEACAM5抗體包含由SEQ ID NO：6組成的重鏈(VH)可變結構域和由SEQ ID NO：7組成的輕鏈(VL)可變結構域。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述抗CEACAM5抗體包含由SEQ ID NO：8組成的重鏈(VH)和由SEQ ID NO：9組成的輕鏈(VL)。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述免疫接合物包括至少一種細胞生長抑制劑。
  6. 如請求項5所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述細胞生長抑制劑係選自由放射性同位素、蛋白質毒素、小分子毒素及其組合組成之群組。
  7. 如請求項6所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述小分子毒素係選自抗代謝物、DNA烷化劑、DNA交聯劑、DNA嵌入劑、抗微管劑、拓撲異構酶抑制劑及其組合。
  8. 如請求項7所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述抗微管劑係選自紫杉烷、長春花生物鹼、美登素生物鹼、秋水仙鹼、鬼臼毒素、灰黃 黴素及其組合。
  9. 如請求項8所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述美登素生物鹼係選自由N2’-脫乙醯基-N2’-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)或N2’-脫乙醯基-N-2’(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)及其組合組成之群組。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述抗CEACAM5抗體經由可切割或不可切割的連接子與所述至少一種細胞毒性劑共價附接。
  11. 如請求項10所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述連接子係選自由吡啶基二硫代丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDB)、4-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-磺基-丁酸(磺基-SPDB)、和(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)組成之群組。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其包含CEACAM5-抗體(huMAb2-3)，所述抗體包含由SEQ ID NO：8組成的重鏈(VH)和由SEQ ID NO：9組成的輕鏈(VL)，並且所述抗體經由吡啶基二硫代丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDB)與N2’-脫乙醯基-N-2’(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)共價連接。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述免疫接合物的特徵在於藥物與抗體的比率(DAR)的範圍為從1至10。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述癌症係選自由結直腸癌、胃癌、胰腺癌和食道癌組成之群組。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述免疫接合物和FOLFOX同時投予於有需要的受試者。
  16. 如請求項15所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述免疫 接合物和FOLFOX被配製為(i)包含所述免疫接合物和FOLFOX的單一醫藥組合物，或(ii)呈至少兩種單獨醫藥組合物的形式，其中在單獨或組合的配製品中，至少一種醫藥組合物包含所述免疫接合物，並且一種或多種醫藥組合物包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑。
  17. 如請求項1至14中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述免疫接合物和FOLFOX單獨地或依序地投予於有需要的受試者。
  18. 如請求項17中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中所述免疫接合物和FOLFOX被配製呈至少兩種單獨醫藥組合物的形式，其中在單獨或組合的配製品中，(i)至少一種醫藥組合物包含所述免疫接合物，以及(ii)一種或多種醫藥組合物包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑。
  19. 如請求項1至18中任一項所述的用於所述用途的免疫接合物，其中包含抗CEACAM5抗體以及醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑(FOLFOX)的所述免疫接合物以8至16個週期投予，其中一個週期包括：
    在所述週期中至少一次以從60至210mg/m2的劑量投予所述免疫接合物；
    在所述週期中至少一次以從100至300mg/m2的劑量投予L-醛葉酸或以100至200m/m2的劑量投予L-醛葉酸；
    在所述週期中至少一次以從1000至2000mg/m2的劑量投予5-氟-尿嘧啶，以及
    在所述週期中至少一次以從50至200mg/m2的劑量投予奧沙利鉑。
  20. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項所述的免疫接合物以及醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑。
  21. 一種套組，其在單獨或組合的配製品中包含(i)如請求項1至14中任一項所述的免疫接合物的醫藥組合物，和(ii)包含醛葉酸、5-氟-尿嘧啶和奧沙利鉑的一種或多種醫藥組合物。
  22. 如請求項20所述的醫藥組合物或如請求項21所述的套組，其用於治療癌症。
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