TW202203907A

TW202203907A - 截短側耳素類的新醫療用途

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Publication number: TW202203907A
Application number: TW110113772A
Authority: TW
Inventors: 蘇珊娜波納; 沃爾夫岡維恰; 史蒂文格隆; 傑德亞榭爾; 羅森馬里瑞德
Original assignee: 奧地利商納畢瓦治療有限責任公司
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2021-04-16
Publication date: 2022-02-01
Also published as: WO2021209173A1; US20230218558A1; EP4135681A1; CN115397407A

Abstract

一種式(I)之化合物，

其中 n為0至4； m為0或1，其先決條件係硫原子與R₃ 係於鄰位位置(若m=0，則R₃ 係於2´位置，以及若m=1，則R₃ 係於1´位置)； R為乙基或乙烯基； R₁ 為氫或(C_1-6 )烷基， R₂ 為氫或 - (C_3-6 )環烷基，或 - 未經取代之(C_1-6 )烷基，或 - 經下列之一或多者取代的(C_1-6 )烷基： - 羥基；較佳為一或二者， - 甲氧基， - 鹵素， - (C_3-6 )環烷基，或 R₁ 及R₂ 與彼等所附接之氮原子一起形成含有至少1個氮原子或1個氮原子和1個例如選自N或O之額外雜原子的5至7員雜環，或 R₁ 為羥基以及R₂ 為甲醯基； R₃ 為OH、OR₄ 、鹵素原子，或 R₃ 係鍵結至2´且表示-O-(CH₂ )_p -O-，其中p為2或3； R₄ 為未經取代之(C_1-6 )烷基或(C_3-6 )環烷基，或其藥學可接受之鹽、溶劑合物、前藥或代謝物，其係特別用於治療或預防由病毒媒介之疾病。

Description

截短側耳素類的新醫療用途

本發明係關於截短側耳素類的新醫療用途。

截短側耳素，如下式所示之化合物，

係天然抗生素，由例如Pleurotus mutilus及P. passeckerianus產生，詳見例如The Merck Index (12版，項目7694)。

已研發一些具有截短側耳素之主環結構且於一級羥基經取代的其他截短側耳素，例如作為抗菌劑。WO 2008/113089已揭示一群截短側耳素衍生物(經胺基-羥基取代之環己基硫基乙醯基木替靈)特別重要，因其具有顯著抗菌活性。如WO 2008/113089中所述，14-O-{[(4-胺基-2-羥基-環己基)-硫基(sulfanyl)]-乙醯基}-木替靈因其抗革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌活性之故而為特別有用的化合物。

衍生自截短側耳素之藥學活性化合物(半合成化合物)為細菌中之核糖體蛋白質合成的抑制劑。用於人類用途之半合成截短側耳素的代表為瑞他帕木靈(Retapamulin) (核准為AltargoP^® 、AltabaxP^® )，經核准為用於短期治療膿疱病及受感染小型撕裂傷、擦傷或縫合傷口之局部藥劑；以及樂法木靈(Lefamulin) (核准為Xenleta^® )，其用於治療罹患社區感染型細菌性肺炎(CABP)之成人。提木靈(Tiamulin) (Denagard^® )及法尼木靈(Valnemulin) (Econor^® )係兩種另外的半合成截短側耳素衍生物，其已於獸醫學中系統性使用作為抗生素多年。

核准之衍生自截短側耳素的半合成化合物已顯示優異的抗細菌生物體活性，該細菌生物體尤其包含肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌(包含MRSA)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、退伍軍人症嗜肺桿菌(Legionella pneumophila)、肺炎披衣菌(Chlamydophila pneumoniae)及肺炎黴漿菌。

病毒性疾病為全世界發病率及死亡率的主因。呼吸道病毒諸如流行性感冒、呼吸道融合病毒、某些腺病毒、鼻病毒及冠狀病毒，特別是新出現的嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2；COVID-19)對於公眾健康具有重大影響。

於Asheshov, Igor N.等人之Antibiotics & Chemotherapy 4/4 (1954), 380-394中，首次描述截短側耳素之抗病毒活性，其中在濃度為2 mg/mL時截短側耳素本身對於A型流行性感冒病毒株(PR8)具有抗病毒活性。對照之下，於該研究中，截短側耳素未顯示對於小兒麻痺病毒之抗病毒活性。

此外，於Alacórn, Balbino等人之Antiviral Research, 4 (1984), 231-243中，描述截短側耳素具有抗DNA及RNA病毒二者之抗病毒活性，特別是對第1型單純疱疹(HSV-1)病毒，在40 μM (15 µg/mL)之試驗化合物濃度對於HSV-1 (CPE50)所誘發的細胞病變作用提供50%保護作用，以及具有抗水泡性口炎病毒(VSV)之活性。

於WO 2009/106839中，主張使用提木靈作為抗病毒劑，在提木靈濃度為0.1至10 μg/mL時，其與病毒培養4小時後之病毒攝入分析(viral up-take assay)中，提木靈對於A型流行性感冒病毒、第1型及第2型豬繁殖及呼吸道症侯群病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)展現相較於法尼木靈之效果以及展現出提木靈對於例示的胞內體pH之效果。法尼木靈未展現抗病毒活性，且該專利指出未發現其他截短側耳素抗生素對於病毒具有效果。

描述由提木靈造成的胞內體或溶酶體pH改變以及相關防止病毒膜與胞內體及溶酶體融合(其為病毒進入的先決條件)為有潛力的作用模式。

CN 103204787B和CN 103242210二者均揭露另外的截短側耳素衍生物，以及大致上提及其於抗病毒藥物之用途，然而，未揭露任何抗病毒作用的實際證明。

關於樂法木靈之有潛力抗病毒效果及抗發炎效果的一些說明係於2020/5/11之“Q1 2020 Nabriva Therapeutics PLC Earnings Call”，(其副本可見https:// www.yahoo.com/news/edited-transcript-nbrv-oq-earnings-144108621.html，於2020年6月10日下載，以及2020年5月11日之新聞稿(https://investors.nabriva.com/news-releases/ news-release-details/nabriva-therapeutics-reports-first-quarter-2020-financial)，於2020年5月28日下載。

令人意外的，目前已發現於WO 2008/113089 A1中所揭露的截短側耳素衍生物可有效對抗病毒，因此，可有效對抗由病毒媒介之疾病。

因此，於第一態樣中，本發明係關於如請求項1至6所定義之化合物，特別是樂法木靈，或其藥學可接受之鹽、溶劑合物、前藥或代謝物，其係特別用於治療或預防由病毒媒介之疾病。

於另一態樣中，本發明係關於治療或預防由病毒媒介之疾病的方法，其包含對需要此治療之個體投與如請求項1至6中任一項所定義之化合物，特別是樂法木靈，或其藥學可接受之鹽、溶劑合物、前藥或代謝物。

樂法木靈為通式(I)之化合物的國際非專利藥品名(INN)，更特別地，樂法木靈為式(VII)之化合物，

，即，14-O-{[(1R, 2R, 4R)-4-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈(亦已知為「BC-3781」)。

下文中，術語「樂法木靈」於一般使用且無額外解釋時，意欲同時包含樂法木靈之游離鹼形式以及其鹽及溶劑合物。

已研發樂法木靈用於治療人類之嚴重細菌感染的全身性用途(systemic use)，美國已於2019年核准用於醫療用途以治療罹患社區感染型細菌性肺炎(CABP)之成人。

本發明係關於治療及預防由病毒媒介之疾病，例如，病毒性疾病或病毒感染。

實驗結果顯示除了抗菌活性之外，樂法木靈亦有效地減少由不同病毒媒介之細胞病變作用。該抗病毒效果特別針對一些特徵在於為正義或反義單股RNA病毒之病毒。抗病毒活性顯示於有套膜及無套膜病毒二者，特別是數種有套膜的正義或反義單股RNA病毒(諸如冠狀病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科、及黃病毒科)。此外，一些已經研究的病毒，包含麻疹病毒，已知是通過呼吸途徑傳播，特別是空氣傳播。冠狀病毒及呼吸道融合病毒亦造成人類呼吸道感染。

於本發明之較佳實施態樣中，病毒為正義或反義單股RNA病毒，較佳地，病毒係選自由下列所組成之群組： - 冠狀病毒科，特別包含人類冠狀病毒， - 副黏液病毒科，特別包含副黏液病毒亞科，諸如麻疹病毒，以及肺炎病毒亞科，諸如呼吸道融合病毒， - 正黏液病毒科，特別包含流行性感冒病毒， - 黃病毒科，特別包含登革熱病毒及茲卡病毒，以及 - 小核糖核酸病毒科，特別包含鼻病毒。

於另一實施態樣中，該疾病為空氣傳播疾病。空氣傳播疾病係由藉由空氣傳播的病毒所媒介。

病毒感染會影響各種器官。於本發明一較佳實施態樣中，該疾病為呼吸道疾病，包含上呼吸道感染及下呼吸道感染，特別是下呼吸道感染。

特別是，該疾病為急性呼吸道症候群，諸如流行性感冒、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)、中東呼吸道症候群(MERS)或COVID-19。

於本發明另一實施態樣中，該疾病係由選自由下列病毒科之病毒所組成之群組的病毒媒介：冠狀病毒科，特別是諸如SARS-CoV、SARS-CoV2、MERS-CoV或HCoV-229E之冠狀病毒；正黏液病毒科，特別是諸如A型及B型流行性感冒病毒之流行性感冒病毒；副黏液病毒科，特別是呼吸道融合病毒；以及腺病毒科，特別是腺病毒。

於一實施態樣中，該病毒為冠狀病毒，特別是選自由下列所組成之群組：SARS-CoV、SARS-CoV2、MERS-CoV、及HCoV-229E以及其突變。此等冠狀病毒已知造成(嚴重)急性呼吸道症候群，諸如SARS、MERS或COVID-19。

如本文所理解之治療(treating、treatment或treat)包含一方面完全治癒(curing、curation或cure)病況(由病毒媒介之疾病)以使其結束，以及另一方面亦改善(ameliorating、amelioration或ameliorate)病況以使其症狀至少部分或個別地減少。

治療通常包含對有需要之個體(即，確診為罹患由病毒媒介之疾病的個體)投與根據本發明之化合物。

預防(preventing、prevention或prevent)包含在確診病況之前或在病況之(所有)疾病症狀發作之前投與化合物。

預防由病毒媒介之疾病包含在疾病症狀發作之前投與該等化合物。於個體已經病毒感染後但尚未顯示任何症狀，或其中個體已曝露及/或容易曝露於病毒，可考慮預防。

根據本發明之待投與之化合物(特別是樂法木靈)的適當劑量當然將視例如個別宿主、投與模式以及治療之病況的性質及嚴重程度而變。然而，通常，為了在較大型哺乳動物(例如人類)中獲得令人滿意的結果，需要的日劑量係在約0.5 mg至3 g範圍內之根據本發明所使用之化合物，以便利方式投與，例如，以一天多達四次之分開劑量投與。

根據本發明所使用之化合物可以任何便利途徑投與，例如經腸投與，例如包含鼻腔、頰內、直腸、口服投與；非經腸投與，例如包含靜脈內、肌內、皮下投與；或局部投與，例如包含肺、皮上、鼻內、氣管內投與，例如呈膜衣錠或非膜衣錠、膠囊、可注射溶液或懸浮液形式(例如呈安瓿、藥瓶形式)，呈軟膏、乳膏、凝膠、糊劑、吸入器粉末、泡沫劑、酊劑、唇膏、滴劑、噴霧形式，或呈栓劑形式，例如以與抗生素劑妥布黴素(tobramycin)或巨環內酯類(macrolides)，諸如紅黴素，例如克拉黴素(clarithromycin)或亞茲索黴素(azithromycin)類似方式投與。

較佳的，根據本發明所使用之化合物係經由吸入、經由靜脈內或皮下注射、或口服投與。

注射用之較佳樂法木靈藥學組成物係揭露於WO 2016/202788 A1，該案內容係以引用方式併入本文中。

根據本發明所使用之化合物，特別是樂法木靈，可呈藥學可接受之鹽例如酸加成鹽形式，或呈游離形式，視情況呈溶劑合物形式投與。

於一實施態樣中，該化合物係呈鹽及/或溶劑合物形式。

根據本發明使用之化合物之鹽包含酸加成鹽。藥學可接受之酸加成鹽包含根據本發明所使用之化合物與酸之鹽，該酸係例如氫反丁烯二酸(hydrogen fumaric acid)、反丁烯二酸、酒石酸、乙-1,2-二磺酸、順丁烯二酸、萘-1,5-磺酸、乙酸、蘋果酸、乳酸(即，L-乳酸)、丁二酸、柳酸、壬二酸、2-[(2,6-二氯苯基)胺基]苯乙酸、鹽酸、氘氯酸(deuterochloric acid)，較佳為鹽酸、乙酸、L-乳酸、及順丁烯二酸。

其中，於樂法木靈之情況中，樂法木靈之乙酸鹽尤佳。

較佳之樂法木靈結晶形式以及結晶鹽形式係揭露於WO 2011/146954 A1，該案內容係以引用方式併入本文中。其中，以WO 2011/146954 A1中所揭露之樂法木靈乙酸鹽的結晶形式B尤佳。

本發明亦提供樂法木靈與伊康酸之酸加成鹽形式，特別是樂法木靈伊康酸鹽。本文所揭露之樂法木靈伊康酸鹽為新化合物(實施例12)。伊康酸可去質子成陰離子伊康酸氫根(hydrogen itaconate)及伊康酸根。包含樂法木靈作為陽離子及衍生自伊康酸之陰離子的酸加成鹽預期可用作抗病毒劑。

根據本發明所使用之化合物，特別是樂法木靈，可單獨或與一或多種其他藥學活性劑組合用於本文所審慎考慮之藥學治療。此等其他藥學活性劑包含例如其他抗病毒劑。此等其他抗病毒劑可較佳地選自由下列所組成之群組：核苷及核苷酸類似物以及RNA聚合酶抑制劑，例如瑞德西韋或利巴韋林(Ribavirin)；病毒蛋白酶抑制劑，諸如洛匹那韋(Lopinavir)或利托那韋(Ritonavir)；病毒神經胺酸酶(viral neuraminidase)抑制劑，諸如奧司他韋；以及用於抗病毒療法之其他藥劑，諸如羥氯喹(Hydroxychloroquine)、干擾素(α干擾素及/或β干擾素)、或其他廣效抗病毒劑。

組合包含：二或更多種藥學活性劑係於相同調配物中之固定組合；於分開之調配物中之二或更多種藥學活性劑係以相同包包裝(例如，具有共用投與指示)銷售之套組；以及藥學活性劑係單獨包裝但給予同時或依序投與之指示的自由組合。

包含根據本發明所使用之化合物(特別是樂法木靈)的藥學組成物可另外包含至少一種藥學可接受之賦形劑，例如載體或稀釋劑，例如，包含填料、黏合劑、崩散劑(disintegrator)、流動調整劑(flow conditioner)、潤滑劑、糖及甜味劑、香料(fragrance)、防腐劑、安定劑、濕潤劑及/或乳化劑、助溶劑、調整滲透壓之鹽及/或緩衝劑。

此等藥學組成物可根據例如類似慣用方法，例如，藉由混合、製粒、包膜衣、溶解、噴霧乾燥、或冷凍乾燥程序來製造。單位劑量形式可含例如約0.5 mg至約3000 mg，諸如10 mg至約600 mg。

需要如本發明所審慎考慮之治療的個體可為任何罹患由病毒媒介之疾病的活個體。尤其是，個體可為人類或動物。實施例

本文(包含實例)係使用下列縮寫：

¹ H-NMR	質子核磁共振譜法
℃	攝氏度數
µM	微莫耳濃度
BALB/c	實驗室飼養之小鼠品系
BC-3781	樂法木靈(lefamulin)
CC	細胞對照組
CoV	冠狀病毒
CPE	細胞病變作用，特別是病毒所誘發者
DMEM	Dulbecco改良之Eagle培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)
DMF	N,N-二甲基甲醯胺
DMSO	二甲亞碸
EC₅₀	最大有效濃度的一半(50%)
eq	當量
FBS	胎牛血清
HeLa	永生人類上皮細胞系(immortal human epithelial cell line)
HEp2	人類上皮細胞系
Huh7	人類肝細胞系
MDCK	Madin-Darby Canine腎細胞
MOI	感染多重數(Multiplicity of infection)
MRC-5	MRC(醫學研究委員會)細胞株5
M	莫耳濃度
MS	質譜法
m/z	質量/電荷比
MTBE	甲基-三級丁基醚
nm	奈米
TC₅₀	最大毒性濃度的一半(50%)
TCID₅₀	50% (最大半數)組織培養感染劑量
VC	病毒CPE減少
XTT	2,3-雙-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-苯胺甲醯基(carboxanilide)

實施例 1

目標：此分析測量藉由不同濃度之樂法木靈(BC-3781)，於感染α冠狀病毒229E (HCoV-229E或CoV_229E )6天後的MRC-5細胞中，抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：將MRC-5細胞接種於96孔平底組織培養盤(密度為每孔3 x 10³ 個細胞)且使之黏著一夜。之後，將溶解於DMSO中之稀釋的試驗化合物(呈乙酸鹽形式之樂法木靈、呈反丁烯二酸鹽形式之提木靈)添加至該盤，且培養4小時，之後添加病毒。添加稀釋至預定效價之病毒以得到於感染6天後為85至95%之細胞毒殺(cell killing) (MOI為0.001)。

於37℃以及於5% CO₂ 培養6天後，藉由XTT四唑鎓染料染色以測量細胞存活力。細胞培養盤之光密度係以分光光度法在450及650 nm判定。使用四參數曲線擬合分析計算病毒感染之細胞的減少百分比以及未受感染之藥物對照孔的細胞存活力百分比，以判定抑制50%之細胞病變作用的有效濃度(EC₅₀ )以及細胞毒性濃度(TC₅₀ )。抗病毒化合物瑞德西韋係用作陽性對照組。結果：

令人意外的，濃度為10 µM (此為對於細胞對照組之存活力無細胞毒性作用的濃度)之樂法木靈使病毒CPE降低91.82%。所計算之抑制50%之病毒細胞病變作用的EC₅₀ 為3.87 µM。於樂法木靈濃度為50 µM時，樂法木靈顯示細胞毒性作用；所計算之TC₅₀ 為55.3 µM。EC₅₀ 與TC₅₀ 之比(亦已知為治療指數)為14.3。

對照之下，濃度為10 µM之提木靈僅使病毒CPE減少10.53%且未觀察到細胞毒性。於下一個較高的50 µM試驗濃度，CPE減少81.68%且觀察到細胞毒性。所計算之EC₅₀ 為24.4 µM以及所計算之TC₅₀ 為62.9 µM。提木靈之治療指數為2.58，意外地遠低於樂法木靈之治療指數。

已研發抗病毒化合物瑞德西韋作為伊波拉病毒(Ebola virus)之治療，亦已知其具有抗冠狀病毒之抗病毒活性(臨床研究進行中)。因此，瑞德西韋於本文中用作陽性對照組。瑞德西韋顯示EC₅₀ 為0.11 µM，TC₅₀ 為＞ 5，以及治療指數為＞ 45.5。

結果以圖形方式顯示於圖1 (樂法木靈)、2 (提木靈)及3 (瑞德西韋) (VC….病毒CPE之減少，CC…..細胞對照組)。實施例 2 ：

目標：此分析測量樂法木靈於各種治療條件下，於感染α冠狀病毒229E (HCoV-229E或CoV_229E )的MRC-5中，抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法： 此分析係以與上述實施例1類似方式進行，具有以下關於試驗候選者之差異。樂法木靈(呈乙酸鹽形式)係在添加病毒前先培養4 h、1 h或0 h以及於感染後1 h添加之不同處理條件下評估。為進行此特別組別實驗，冠狀病毒係以1:200稀釋於分析介質中，並以100 µL/孔添加以達到未經處理之病毒對照孔中大約90%細胞毒殺(MOI為0.001)。結果

抗病毒效力及細胞毒性資料係彙總於下表。樂法木靈顯示對於抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)之時間依賴性效果。於病毒曝露後(感染後1h)之處理設定中，觀察到劑量依賴性效果。於50 µM之濃度，病毒CPE降低86.83 % (資料細節未顯示)。

實施例 3

目標：此分析測量藉由不同濃度之樂法木靈(BC-3781)，在人類呼吸道融合病毒(RSV_A2 株)於HEp2細胞中複製後，在病毒感染6天後，抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：將HEp2細胞接種於96孔平底組織培養盤(密度為每孔5 x 10³ 個細胞)且使之黏著一夜。之後，將溶解於DMSO中之稀釋的試驗化合物(呈乙酸鹽形式之樂法木靈、呈反丁烯二酸鹽形式之提木靈)添加至該盤，且培養4小時，之後添加病毒。添加稀釋至預定效價之病毒以得到於感染6天後為85至95%之細胞毒殺(MOI為0.001)。

於37℃以及於5% CO₂ 培養6天後，藉由XTT四唑鎓染料染色以測量細胞存活力。細胞培養盤之光密度係以分光光度法在450及650 nm判定。使用四參數曲線擬合分析計算病毒感染之細胞的減少百分比以及未受感染之藥物對照孔的細胞存活力百分比，以判定抑制50%之細胞病變作用的有效濃度(EC₅₀ )以及細胞毒性濃度(TC₅₀ )。抗病毒化合物TMC353121 (RSV融合抑制劑)用作陽性對照組。結果：

令人意外的，濃度為10 µM及50 µM (此為對於細胞對照組之存活力無細胞毒性作用的濃度)之樂法木靈分別使病毒細胞病變作用(CPE)降低92.17%及100%。所計算之抑制50%之病毒CPE的EC₅₀ 為5.34 µM。於樂法木靈濃度為100 µM時，樂法木靈顯示細胞毒性作用，所計算之TC₅₀ 為70.7 µM。EC₅₀ 與TC₅₀ 之比(亦已知為治療指數)為13.2。

對照之下，濃度為10 µM之提木靈僅使病毒CPE減少16.76%且於該濃度觀察到細胞毒性作用(84%存活力)。於下一個較高的50 µM試驗濃度，病毒CPE減少43.28%且細胞毒性作用更明顯(70.0%存活力)。所計算之EC₅₀ 係＞67.9 µM，高於所計算之TC₅₀ 的67.9 µM。因此無法計算提木靈之治療指數。令人意外的，樂法木靈之抗病毒活性及治療指數均遠高於提木靈。

已研發抗病毒化合物TMC353121作為特殊呼吸道融合病毒融合抑制劑(臨床研究進行中)。因此，TMC353121於本文中用作陽性對照組。TMC353121顯示EC₅₀ 為0.006 µM，TC₅₀ 為＞ 0.1 µM以及治療指數為＞ 167。

結果係以圖形方式顯示於圖4 (樂法木靈)、5 (提木靈)及6 (TMC353121) (VC….病毒CPE之減少，CC…..細胞對照組)。實施例 4

目標：此分析測量於改變感染多重數(MOI)之HEp2細胞中人類呼吸道融合病毒(RSV_A2 株)複製後抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：此分析係以與上述實施例3類似方式進行，具有以下關於試驗之差異。添加稀釋至預定效價之病毒以得到於感染6天後為85至95%之細胞毒殺，以及採用獲得MOI分別為0.003、0.001、0.0008、及0.0004之添加量。此研究中係研究樂法木靈(呈乙酸鹽形式)以及作為陽性對照組之TMC353121。結果：

抗病毒效力及細胞毒性資料係彙總於下表。於MOI為0.0004重現於低µM範圍之樂法木靈的EC₅₀ 值。對照之下，較高MOI因而對於所研究細胞有較高病毒負荷量，降低樂法木靈之抗病毒效果。此效果於高度有效對照物質TMC353121較不明顯。

實施例 5

目標：此分析測量兩種不同呼吸道融合病毒株RSV A_LONG 及RSV B₁₈₅₃₇ 於HEp2細胞中複製後，抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：此分析係以與上述實施例3類似方式進行，差異係為接種密度為每孔5 x 10³ 個細胞之細胞在以不同濃度之試驗化合物進行4小時細胞預處理之後，分別與病毒株RSV A_LONG 或RSV B₁₈₅₃₇ 一起培養。病毒經稀釋並以得到RSV A_LONG 及RSV B₁₈₅₃₇ 之MOI分別為0.01及0.001之量添加。結果：

抗病毒效力及細胞毒性資料係彙總於下表。對照化合物TMC353121係與樂法木靈並行評估，得到對抗所研究的病毒株RSV A及RSV B之EC₅₀ 值為0.01 nM。樂法木靈得到對抗RSV B₁₈₅₃₇ 之EC₅₀ 值為17.7 µM。因此分析中對於HEp2細胞之細胞毒性的TC₅₀ 值為71.1 µM，故無法判定抗RSV A_LONG 活性。

實施例 6

目標：此分析測量在麻疹病毒株Edmonston於HeLa細胞中複製的期間抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：將HeLa細胞接種於96孔平底組織培養盤(密度為每孔5 x 10³ 個細胞)且使之黏著一夜。之後，將稀釋的試驗化合物(呈乙酸鹽形式之樂法木靈、作為對照組之利巴韋林)添加至該盤，且培養4小時，之後添加病毒。添加稀釋至預定效價之病毒以得到於感染6天後為85至95%之細胞毒殺(稀釋1：50，MOI為0.008)。

如實施例1及3所述進行細胞存活力判定以及EC₅₀ 及TC₅₀ 之計算。結果：

抗病毒效力及細胞毒性資料係彙總於下表。利巴韋林係作為對照化合物與樂法木靈並行評估，得到EC₅₀ 值為1.88 µg/mL。令人意外的，樂法木靈得到為0.89 µM之更低的EC₅₀ 值，以及81.7之高TI計算值。

實施例 7

目標：此分析測量登革熱病毒株DENV2_{New Guinea} 於Huh7細胞中複製的期間抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：將Huh7細胞接種於96孔平底組織培養盤(密度為每孔5 x 10³ 個細胞)且使之黏著一夜。之後，將稀釋的試驗化合物(呈乙酸鹽形式之樂法木靈、作為對照組之利巴韋林)添加至該盤，且培養4小時，之後添加病毒。登革熱病毒株DENV2_{New Guinea} 係獲自ATCC (VR-1584)，且於恆河猴腎細胞中生長以生產原種病毒庫(stock virus pool)。添加稀釋至預定效價之病毒以得到於感染6天後為85至95%之細胞毒殺(MOI為0.001)。

如實施例1及3所述進行細胞存活力判定以及EC₅₀ 及TC₅₀ 計算。結果：

抗病毒效力及細胞毒性資料係彙總於下表。利巴韋林係作為對照化合物與樂法木靈並行評估，得到EC₅₀ 值為4.73 µg/mL。樂法木靈得到EC₅₀ 值為6.79 µM。利巴韋林及樂法木靈二者於濃度分別為48.5 µg/mL及23.3 µM時均顯示對該特定細胞系有一些細胞毒性。

實施例 8

目標：此分析測量於4小時細胞預處理之後，在茲卡病毒株ZIKV_PRVABC59 於Huh7細胞中複製的期間，抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：將Huh7細胞接種於96孔平底組織培養盤(密度為每孔5 x 10³ 個細胞)且使之黏著一夜。之後，將稀釋的試驗化合物(呈乙酸鹽形式之樂法木靈、作為對照組之索非布韋(Sofosbuvir))添加至該盤，且培養4小時，之後添加病毒。獲自ATCC (目錄VR-1843)之茲卡病毒株PRVABC59係得自ATCC (VR-1584)，且於恆河猴腎細胞中生長以生產原種病毒庫。添加稀釋至預定效價之病毒以得到於感染6天後為85至95%之細胞毒殺(MOI為0.001)。

抗病毒效力及細胞毒性資料係彙總於下表。對照化合物索非布韋係與樂法木靈並行評估，且得到EC₅₀ 值為0.65 µg/mL。樂法木靈得到EC₅₀ 值為2.78 µM，且計算之治療指數為8.42。

實施例 9

目標：此分析測量於4小時細胞預處理之後，在人類鼻病毒HRV16株11757株於H1-HeLa細胞中複製的期間，抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：將H1-HeLa細胞接種於96孔平底組織培養盤(密度為每孔5 x 10³ 個細胞)且使之黏著一夜。之後，將稀釋的試驗化合物(呈乙酸鹽形式之樂法木靈、作為對照組之如平利韋(Rupintrivir))添加至該盤，且培養4小時，之後添加病毒。添加稀釋至預定效價之病毒HRV16₁₁₇₅₇ 以在未經處理之病毒對照孔中得到85至95%細胞毒殺(MOI為0.0005)。

為治療鼻病毒而研發之蛋白酶抑制劑如平利韋係並行評估，得到EC₅₀ 值為4.90 nM。樂法木靈得到EC₅₀ 值為9.34 µM，且計算之治療指數為2.58。

實施例 10

目標：此分析測量於4小時細胞預處理之後，在流行性感冒病毒株A/PR/8/34於MDCK細胞中複製的期間，抑制病毒誘發之細胞病變作用(CPE)的能力以及細胞存活力。

方法：將MDCK細胞接種於96孔平底組織培養盤(密度為每孔5 x 10³ 個細胞)且使之黏著一夜。之後，將稀釋的試驗化合物(呈乙酸鹽形式之樂法木靈、作為對照組之奧司他韋(Oseltamivir))添加至該盤，且培養4小時，之後添加病毒。添加稀釋至預定效價之流行性感冒病毒株A/PR/8/34以在未經處理之病毒對照孔中得到90%細胞毒殺(MOI為0.0004)。

奧司他韋係作為既有流行性感冒藥物並行評估，得到EC₅₀ 值為0.06 µM。濃度大於23 µM之樂法木靈對於MDCK細胞有細胞毒性。於5 µM樂法木靈測得18.4%之流行性感冒媒介之CPE的最大抑制作用。因此，因於50 µM觀察到細胞毒性，無法判定樂法木靈之EC₅₀ 。然而，於使用相關之適應小鼠的A型流行性感冒株(A型流行性感冒/波多黎各/8/34 (H1N1))之流行性感冒感染小鼠模型(見以下實施例11)中，觀察到活體內活性。

實施例 11

目標：研究於活體內流行性感冒病毒感染模型中之樂法木靈的效果。於流行性感冒病毒模型中，以適應小鼠之A型流行性感冒(H1N1)株使小鼠感染(challenged)。

方法：將成年雌性BALB/c小鼠隨機分配成三個有15隻動物之實驗組別，並使之適應環境一週。於第-1天開始皮下投與治療。陰性對照組每天兩次接受所投與之載劑。以不同給藥量研究樂法木靈。於低劑量方案中，從第-1天至第6天係每天投與35 mg/kg之樂法木靈兩次(相當於劑量為70 mg/kg/天)。於高劑量方案中，分三次注射投與劑量為105/mg/kg/天之樂法木靈直到第3天，以及因注射位置之投與問題，從第3天開始改變。接下來的劑量係每天投與70 mg/kg兩次(相當於140 mg/kg/天)。於第0天，所有組別均接受A型流行性感冒/波多黎各/8/34 (H1N1)的感染。

於研究期間，每天對動物之流行性感冒病毒感染的臨床症狀計分，包括異常毛皮狀態(豎毛)、異常姿勢(弓背)、異常呼吸(急促及/或不規則呼吸率)、移動率降低、有眼部分泌物、閉眼及/或存活。將疾病之嚴重度的症狀加至評分系統，產生最大可能分數5。臨床症狀判斷為嚴重時，於預定的研究結束之前將個別動物移出研究。

於第6天，解剖肺組織，評估大體病理學(gross pathology)，保存於固定劑中並儲存以用於組織病理學。

於肉眼評估後對肺實質化(Lung consolidation)計分如下：＞50% (跨越所有肺葉)區域被肺泡內水腫(intra-alveolar edema)/出血佔據；廣泛性血管變性(extensive vascular degeneration)。於第6天移除並固定的肺以顯微鏡進行組織病理學的評估。評估四個主要示值讀數(支氣管/支氣管變性/增生、支氣管間質性發炎、肺泡發炎/變性、肺泡水腫/出血)並計分，得到最大總組織病理學分數為16分，其中較低數字表示較少組織病理異常症狀。

肺樣本亦經處理以及儲存以用於第3天及第6天之病毒效價。於第3天及第6天，收集肺，均質化並使之澄清以藉由在Madin-Darby Canine腎(MDCK)細胞上之TCID₅₀ 分析來判定病毒負荷量。結果：

臨床監測結果顯示於圖7A至7D。使用奧司他韋之陽性對照組處理之表現如同預期。觀察到奧司他韋之臨床分數及體重減輕減少。樂法木靈於所研究劑量對於體重無顯著效果(圖7A)。於高劑量時，相較於載劑，樂法木靈造成臨床分數提高以及存活率降低，其可能與所研究之劑量的局部耐受性(SC)組織、濃度及調配物有關(圖7B及7C)。在較低樂法木靈劑量下，獲致90 %存活率，然而至第6天載劑組僅20 %存活(圖7C)。

此外，於低劑量之樂法木靈觀察到肉眼評估之肺實質化有顯著改善。於組織病理學中，在檢查試樣內，整體個別動物分數之範圍(4至13範圍)為明顯(圖7D)。病灶與文獻中所述之病灶相似。嚴重度/肺泡病理學之分布面積增加係與支氣管變性/增生、支氣管間質性發炎及肺泡水腫/出血增加相關。以高劑量之樂法木靈治療造成支氣管變性及肺泡發炎明顯減少，造成該組別的組織病理學分數相較於載劑處理之對照組的組織病理學整體明顯降低，且與奧司他韋相當。

在第3天與第6天之間，所有組別的肺病毒效價均降低(圖8)。相較於載劑處理之對照組，兩種劑量之樂法木靈以及奧司他韋均造成肺病毒效價降低。

臨床示值讀數及對於肺病毒效價之降低作用進一步支持樂法木靈於治療病毒性疾病之潛力。實施例 12

目標：本實施例目標在於合成樂法木靈伊康酸鹽作為可能的新活性藥學成分，其包含呈質子化形式之樂法木靈作為陽離子以及伊康酸根作為衍生自二羧酸的伊康酸之陰離子。方法及結果：

將伊康酸(0.5 eq)添加至呈游離鹼形式之樂法木靈(1 g，1 eq)於DMF (2 mL)之溶液中且於室溫攪拌一夜。將所得之反應混合物逐滴添加至MTBE。過濾所獲得之沉澱物，以MTBE洗滌，且於減壓下乾燥，以得到呈無色固體形式之樂法木靈伊康酸鹽(1.20 g)。¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ , δ, ppm，特徵信號，描述於Berner, H.; Schulz, G.; Schneider H. Tetrahedron1980 , 36, 1807-1811之木替靈編號系統): 6.15 (dd, 1 H, H-19, J=17.6, 11.2 Hz), 5.63 (s, 0.5H, 伊康酸根), 5.55 (d, 1H, H-14, J=8.0 Hz), 5.25-5.00 (m, 2.5H, H-20, 伊康酸根), 3.55及3.29 (AB, 2H, H-22, J=15.2 Hz), 3.43 (d, 1H, H-11, J=5.6 Hz), 3.05 (s, 1H, 伊康酸根), 1.37 (s, 3H, CH₃ -15), 1.06 (s, 3H, CH₃ -18), 0.82 (d, 3H, CH₃ -17, J=7.2 Hz), 0.63 (d, 3H, CH₃ -16, J=6.8 Hz)。 MS m/z: 508 [M + H⁺ ], 552 [M + HCOO^- ]。

[圖1]表明樂法木靈於經α冠狀病毒229E (HCoV-229E)感染6天後之MRC-5細胞中對抗該病毒之效果。 [圖2]表明提木靈於相同分析中之效果。 [圖3]表明瑞德西韋(Remdesivir)於相同分析中之效果。 [圖4]表明樂法木靈於經A型呼吸道融合病毒感染6天後之HEp2細胞中對抗該病毒之效果。 [圖5]表明提木靈於相同分析中之效果。 [圖6]表明TMC353121於相同分析中之效果。 [圖7A至7D]表明樂法木靈及奧司他韋(Oseltamivir)於流行性感冒感染小鼠模型中對臨床症狀的效果，特別是對於體重(A)、臨床分數(B)、存活率(C)、及肺樣本組織病理評分(D)的效果。 [圖8]表明樂法木靈及奧司他韋於流行性感冒感染小鼠模型中於MDCK細胞中對於判定作為50%組織培養感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID₅₀ )的肺病毒效價之效果。

Claims

一種式(I)之化合物，
其中 n為0至4； m為0或1，其先決條件係硫原子與R₃ 係於鄰位位置(若m=0，則R₃ 係於2´位置，以及若m=1，則R₃ 係於1´位置)； R為乙基或乙烯基； R₁ 為氫或(C_1-6 )烷基， R₂ 為氫或 - (C_3-6 )環烷基，或 - 未經取代之(C_1-6 )烷基，或 - 經下列之一或多者取代的(C_1-6 )烷基： - 羥基；較佳為一或二者， - 甲氧基， - 鹵素， - (C_3-6 )環烷基，或 R₁ 及R₂ 與彼等所附接之氮原子一起形成含有至少1個氮原子或1個氮原子和1個例如選自N或O之額外雜原子的5至7員雜環，或 R₁ 為羥基以及R₂ 為甲醯基； R₃ 為OH、OR₄ 、鹵素原子，或 R₃ 係鍵結至2´且表示-O-(CH₂ )_p -O-，其中p為2或3； R₄ 為未經取代之(C_1-6 )烷基或(C_3-6 )環烷基，或其藥學可接受之鹽、溶劑合物、前藥或代謝物，其係特別用於治療或預防由病毒媒介之疾病。
如請求項1之化合物，其中，該化合物係選自由式(II)、(III)、(IV)、(V)及(VI)之化合物所組成之群組：

其中，於各情況中，n、R₁ 及R₂ 係如請求項1中所定義。
如請求項1或2使用之化合物，其中，該化合物選自由下列所組成之群組： 14-O-{[(1R, 2R, 4R)-4-胺基-2-羥基-環己基硫基(sulfanyl)]-乙醯基}-木替靈(mutilin)， 14-O-{[(1S, 2S, 4S)-4-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-5-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈， 14-O-{[(1S, 2S, 5R)-5-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈， 14-O-{[(1R, 2R, 4S)-4-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5R)-5-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈， 14-O-{[(1S, 2S, 5S)-5-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈， 14-O-{[(1R, 2R, 3R)-3-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 3S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 4R)-4-二乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 4R)-4-乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-5-乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-5-二乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 4S)-4-二乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5R)-5-二乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 3R)-3-乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 3S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 3R)-3-二乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 3S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 4S)-4-(甲醯基-羥基-胺基)-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-5-(甲醯基-羥基-胺基)-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 3R/S)-3-(甲醯基-羥基-胺基)-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 3R/S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-2-羥基-5-甲基胺基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-5-烯丙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-2-羥基-5-(2-甲氧基-乙基胺基)-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 4R*)-2-羥基-4-(2-羥基-乙基胺基)-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4S*)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 4R*)-4-環己基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4S*)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 4R*)-4-環丙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4S*)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S*)-4-環丙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5R*)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 4S*)-4-環丙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 4R*)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5R*)-2-羥基-5-嗎啉-4-基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5S*)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S*)-2-羥基-5-嗎啉-4-基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S, 5R*)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-5-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-19,20-二氫-木替靈及其(1S, 2S, 5R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5S)-5-乙基胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-19,20-二氫-木替靈及其(1S, 2S, 5R)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R, 5R)-5-胺基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-19,20-二氫-木替靈及其(1S, 2S, 5S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R)-4-胺基甲基-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S)非鏡像異構物， 14-O-{[5-胺基-2-氯-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈， 14-O-{[4-胺基-2-氯-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈， 14-O-[(4-胺基-1-羥基-環己基甲基硫基)乙醯基]-木替靈， 14-O-{[(1R, 2R)-2-羥基-5-(3-甲基胺基-丙基)-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R)-2-羥基-4-(3-甲基胺基-丙基)-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R)-5-(3-胺基-丙基)-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S)非鏡像異構物， 14-O-{[(1R, 2R)-4-(3-胺基-丙基)-2-羥基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(1S, 2S)非鏡像異構物， 14-O-{[(6R, 8R)-8-胺基-1,4-二氧雜-螺[4.5]癸-6-基硫基]-乙醯基}-木替靈及其(6S, 8S)非鏡像異構物， 14-O-{[4-胺基-2-甲氧基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈，以及 14-O-{[5-胺基-2-甲氧基-環己基硫基]-乙醯基}-木替靈。
如請求項1至3中任一項之化合物，其中，該化合物為樂法木靈(Lefamulin)。
如請求項1至4中任一項之化合物，其中，該化合物係呈鹽及/或溶劑合物形式。
如請求項1至5中任一項之化合物，其中，該化合物為呈樂法木靈乙酸鹽形式之樂法木靈。
如前述請求項中任一項之化合物，其中，該疾病為呼吸道疾病。
如前述請求項中任一項之化合物，其中，該疾病為急性呼吸道症候群，諸如流行性感冒、嚴重急性呼吸道症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)、中東呼吸道症候群(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)或COVID-19。
如前述請求項中任一項之化合物，其中，該病毒為正義或反義單股RNA病毒(positive- or negative-sense single-stranded RNA virus)，較佳地該病毒係選自由下列所組成之群組： - 冠狀病毒科，特別包含人類冠狀病毒， - 副黏液病毒科，特別包含副黏液病毒亞科，諸如麻疹病毒，以及肺炎病毒亞科，諸如呼吸道融合病毒， - 正黏液病毒科，特別包含流行性感冒病毒， - 黃病毒科，特別包含登革熱病毒及茲卡病毒，以及 - 小核糖核酸病毒科，特別包含鼻病毒。
如前述請求項中任一項之化合物，其中，該疾病為空氣傳播疾病。
一種治療或預防由病毒媒介之疾病的方法，其包含對需要此治療之個體投與如請求項1至6中任一項所定義之化合物，特別是樂法木靈，或其藥學可接受之鹽、溶劑合物、前藥或代謝物。
如請求項11之治療方法，其中，該疾病為呼吸道疾病。
如請求項11至12中任一項之治療方法，其中，該疾病為急性呼吸道症候群，諸如流行性感冒、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)、中東呼吸道症候群(MERS)或COVID-19。
如請求項11至13中任一項之治療方法，其中，該病毒為正義或反義單股RNA病毒，較佳地該病毒係選自由下列所組成之群組： - 冠狀病毒科，特別包含人類冠狀病毒， - 副黏液病毒科，特別包含副黏液病毒亞科，諸如麻疹病毒，以及肺炎病毒亞科，諸如呼吸道融合病毒， - 正黏液病毒科，特別包含流行性感冒病毒， - 黃病毒科，特別包含登革熱病毒及茲卡病毒，以及 - 小核糖核酸病毒科，特別包含鼻病毒。
如請求項11至14中任一項之治療方法，其中，該疾病為空氣傳播疾病。