TW202144392A - 白介素２突變體及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及新型白介素2(IL-2)突變蛋白。本發明還提供包含該IL-2突變蛋白的融合蛋白、二聚體分子、免疫綴合物，以及編碼其的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞，以及包含其的醫藥組成物和治療用途。本發明進一步提供製備該IL-2突變蛋白、融合蛋白、二聚體分子、免疫綴合物的方法。

Description

白介素2突變體及其用途

本發明涉及新型白介素2(IL-2)突變蛋白及其用途。具體地，本發明涉及，與野生型IL-2相比，具有改善的性質，例如，改善的IL-2受體結合性質和改善的成藥性的IL-2突變蛋白。本發明還提供包含該IL-2突變蛋白的融合蛋白、二聚體、免疫綴合物，以及編碼該IL-2突變蛋白、二聚體、免疫綴合物的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞。本發明進一步提供製備該IL-2突變蛋白、融合蛋白、二聚體和免疫綴合物的方法、包含其的醫藥組成物和治療用途。

白介素-2(IL-2)，也稱作T細胞生長因子(TCGF)，是一種主要由活化的T細胞，尤其是CD4⁺ T輔助細胞產生的多功能細胞因子。在真核細胞中，人IL-2(uniprot：P60568)作為153個胺基酸的前體多肽合成，在去除N端20個胺基酸後，產生成熟的分泌性IL-2。其它物種的IL-2的序列也已經公開，參見NCBI Ref Seq No.NP032392(小鼠)、NP446288(大鼠)或NP517425(黑猩猩)。

白介素2具有4個反平行的、兩親性α螺旋，此4個α螺旋形成其功能必不可少的四級結構(Smith,Science 240,1169-76(1988)；Bazan,Science257,410-413(1992))。在大多數情況下，IL-2藉由三種不同受體起作用：白介素2受體α(IL-2R α；CD25)、白介素2受體β(IL-2R β；CD122)和白介素2受體γ(IL-2R γ； CD132)。IL-2R β和IL-2R γ對於IL-2的信號傳導至關重要，而IL-2R α(CD25)對於信號傳導不是必需的，但可以賦予IL-2對受體的高親和力結合(Krieg等，Proc Natl Acad Sci 107,11906-11(2010))。由IL-2R α、β、和γ聯合形成的三聚體受體(IL-2 α β γ)為IL-2高親和力受體(KD約10pM)，由β和γ組成的二聚體受體(IL-2 β γ)為中間親和力受體(KD約1nM)，單獨由α亞基形成的IL-2受體為低親和力受體。

免疫細胞表達二聚體或三聚體IL-2受體。二聚體受體在細胞毒性CD8⁺ T細胞和天然殺傷細胞(NK)上表達，而三聚體受體主要在激活的淋巴細胞和CD4⁺ CD25⁺FoxP3⁺抑制性調節T細胞(Treg)上表達(Byman,O.和Sprent.J.Nat.Rev.Immunol.12,180-190(2012))。由於靜息狀態的效應T細胞和NK細胞在細胞表面上沒有CD25，故對於IL-2相對不敏感。而Treg細胞在體內一貫表達最高水平的CD25，因此，正常情況下IL-2會優先刺激Treg細胞增殖。

IL-2藉由與不同細胞上IL-2受體的結合，在免疫反應中介導多重作用。一方面，IL-2具有免疫系統刺激作用，可以刺激T細胞和天然殺傷(NK)細胞增殖和分化。因此，IL-2已經被批准作為免疫治療劑用於癌症和慢性病毒感染的治療。而另一方面，IL-2也可以促進免疫抑制性CD4⁺CD25⁺調節性T細胞(即，Treg細胞)的維持(Fontenot等，Nature Immunol 6,1142-51(2005)；D’Cruz和Klein,Nature Immunol 6,1152-59(2005)；Maloy和Powrie,Nature Immunol6,1171-72(2005))，在患者中引起由激活的Treg細胞導致的免疫抑制。

此外，多年的臨床實踐經驗發現，儘管高劑量IL-2能在癌症例如黑色素瘤和腎癌治療中帶來顯著的臨床藥效，但是同時也會造成藥物相關的嚴重毒副作用，包括血管滲漏綜合症和低血壓等心血管系統毒性。研究表明，這 些毒性很有可能是由於IL-2對淋巴細胞(尤其是T細胞和NK細胞)的過度激活，刺激釋放炎症因子所致。例如，這會導致血管內皮細胞收縮，增大細胞間的間隙，造成組織液外流，從而引起血管滲漏副作用。

臨床上使用IL-2的另外一個限制性問題是其極短的半衰期導致給藥的困難。由於IL-2分子量只有15KDa，會主要藉由腎小球的過濾作用進行清除，人體半衰期只有1小時左右。為了達到足夠高的人體暴露量，在臨床上需要每隔8小時輸注一次大劑量IL-2。然而，頻繁的給藥不僅給病人帶來很重的負擔，更重要的是大劑量輸注IL-2會造成很高的峰值血藥濃度(Cmax)，這很可能是造成藥物毒性的另外一個關鍵因素。Rodrigo Vazquez-Lombardi等人(Nature Communications,8：15373,DOI：10.1038/ncomms15373)提出藉由製備白介素2-Fc融合物來改善白介素的藥效學性質，但是該融合蛋白的表達量低且易於形成聚集體。

在IL-2的生產方面，天然IL-2分子由於其胺基酸序列的特性，在哺乳動物細胞(CHO或者HEK293)中表達非常困難，而且分子穩定性也較差。因此，目前批准上市的IL-2分子Proleukin在原核細菌表達系統中生產。但是，IL2-Fc融合蛋白無法用細菌系統進行表達。因此，本領域存在改善IL-2分子和IL-2-Fc分子在哺乳動物細胞中表達的需要。

在本領域中已經提出了一些IL-2分子的改造方案。例如，Helen R.Mott等公開了具有消除的IL-2R α結合能力的人IL-2的突變蛋白F42A。Rodrigo Vazquez-Lombardi等人(Nature Communications,8：15373,DOI：10.1038/ncomms15373)也提出一種具有消除的IL-2R α結合能力的三重突變人IL-2突變蛋白IL-2^3X，該蛋白在胺基酸殘基位置38、43和61分別具有殘基突變R38D+K43E+E61R。CN1309705A公開了導致IL-2與IL-2R β γ結合降低的D20、N88和Q126位置的突 變。這些突變蛋白在藥物代謝動力學和/或藥效學性質方面仍有缺陷，並且在哺乳動物細胞中表達時也存在表達量低和/或分子穩定性較差的問題。

鑒於與IL-2免疫治療和生產相關的上述問題，本領域仍需要進一步開發具有改善性質的新IL-2分子，特別是展現出有利生產、純化、具有改善的藥物代謝動力學和藥效學性質的IL-2分子。

本發明藉由提供具有改善的成藥性質和/或改善的IL-2受體結合性質的長效IL-2突變蛋白分子，滿足了上述的需求。

因此，在一個方面，本發明提供了新的IL-2突變蛋白。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白具有以下的一個或多個特性，較佳地至少具有性質(i)和(ii)：

(i)改善的成藥性，尤其是在哺乳動物細胞中表達時改善的表達量和/或純化性能，

(ii)弱化與IL-2R β γ的結合；

(iii)降低或消除與IL-2R α的結合。

在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有性質(i)和(ii)，並相對於野生型IL-2蛋白，保持與IL-2R α的結合。在另一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有性質(i)至(iii)。

在一些實施方案中，本發明提供包含IL-2R β γ結合界面突變，且還包含IL-2R α結合界面突變和/或縮短的B’C’環區的IL-2突變蛋白。在一些較佳實施方案中，本發明提供包含IL-2R β γ結合界面突變和縮短的B’C’環區， 但不包含IL-2R α結合界面突變的IL-2突變蛋白。

此外，本發明提供了包含IL-2突變蛋白的融合蛋白、二聚體蛋白、免疫綴合物，醫藥組成物和組合產品；編碼其的核酸，包含該核酸的載體和宿主細胞；以及產生本發明的IL-2突變蛋白、融合蛋白二聚體蛋白、和免疫綴合物的方法。

再有，本發明也提供了利用本發明的IL-2突變蛋白、融合蛋白、二聚體蛋白和免疫綴合物治療疾病的方法和刺激受試者免疫系統的方法和用途。

在下面的圖式和具體實施方案中進一步說明本發明。然而，這些圖式和具體實施方案不應被認為限制本發明的範圍，並且本領域技術人員容易想到的改變將包括在本發明的精神和所附申請專利範圍的保護範圍內。

圖1顯示IL-2與IL-2R α複合物的晶體結構(PDB：1Z92)。

圖2顯示IL-2晶體結構(PBD：2ERJ)(A)，和人IL-2與人IL15的B’C’loop結構疊加(superpose)(B)。

圖3顯示從突變文庫IBYDL029篩選出的IL-2突變蛋白及其序列。

圖4顯示IL-2與IL-2R β γ的晶體結構(PBD：2ERJ)以及它們的接觸界面。

圖5顯示IL-2-Fc二聚體蛋白的分子模式圖。

圖6顯示本發明一些示例性IL-2弱化分子的結構。

圖7顯示選擇並構建的IL-2^mutant-Fc二聚體蛋白，在未經活化的正常T淋巴細胞CD4⁺ T細胞和CD8⁺ T細胞上(A-E)以及在活化的T淋巴細胞CD4⁺ CD25⁺ T 細胞上(F)，激活p-STAT5的信號曲線。

圖8顯示相對於對照rhIL-2蛋白，弱化IL-2^mutant-Fc二聚體蛋白在不同淋巴細胞亞群上激活p-STAT5的信號曲線。

圖9顯示由降低CD25結合親和力的弱化IL-2^mutant分子構建的IL-2-Fc二聚體蛋白，在荷瘤C57小鼠中施用時，對腫瘤體積的影響(A)；以及對動物體重以及體重變化的影響(B和C)。

圖10顯示由保持CD25結合親和力的弱化IL-2^mutant分子構建的IL-2-Fc二聚體蛋白，在荷瘤C57小鼠中施用時，對腫瘤體積的影響(A)；以及對動物體重以及體重變化的影響(B和C)。

圖11顯示在IL-2^mutantFc二聚體蛋白給藥前以及給藥後第3天和第7天，小鼠體重和體重變化的檢測結果(A和B)、以及血液中Treg、NK、CD4+、以及CD8+ T細胞的檢測結果(C-F)。

圖12顯示了野生型IL-2蛋白IL-2^WT(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列及其胺基酸殘基編號，並顯示了與突變蛋白IL-2^3X的序列比對。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任 意兩項或多項的組合。

如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”或“包括”某個突變或突變組合的IL-2突變蛋白時，也旨在涵蓋僅具有該突變或突變組合的IL-2突變蛋白。

在本文中，野生型“白介素-2”或“IL-2”是指作為引入本發明突變或突變組合的模版的親本IL-2蛋白，較佳天然存在的IL-2蛋白，例如來源於人、小鼠、大鼠、非人靈長類動物的天然IL-2蛋白，包括未經加工的(例如未去除信號肽)的形式和經加工的(例如去除了信號肽)的形式。包含信號肽的一個全長天然人IL-2序列顯示於SEQ ID NO：2中，其成熟蛋白的序列顯示於SEQ ID NO：3中。此外，該表述也包括天然存在的IL-2等位基因變體和剪接變體、同種型、同源物、和物種同源物。該表述也包括天然IL-2的變體，例如，該變體可以與天然IL-2具有至少95%-99%或更高同一性或具有不超過1-10個或1-5個胺基酸突變(例如，保守取代)，並較佳與天然IL-2蛋白具有基本相同的IL-2R α結合親和力和/或IL2R β γ結合親和力。因此，在一些實施方案中，野生型IL-2相比於天然IL-2蛋白可以包含不影響其對IL-2受體結合的胺基酸突變，例如，在位置125引入了突變C125S的天然人IL-2蛋白(uniprot：P60568)屬於本發明的野生型IL-2。一個包含C125S突變的野生型人IL-2蛋白的實例顯示於SEQ ID NO：1中。在一些實施方案中，野生型IL-2序列可以與SEQ ID NO：1或2或3的胺基酸序列具有至少85%、95%，甚至至少96%、97%、98%、或99%或更高的胺基酸序列同一性。

在本文中，胺基酸突變可以是胺基酸取代、缺失、插入和添加。 可以進行取代、缺失、插入和添加的任意組合來獲得具有期望性質(例如降低的IL-2R α結合親和力和/或改善的成藥性和/或弱化的IL-2R β γ)的最終突變蛋白構建體。胺基酸缺失和插入包括在多肽序列的胺基和/或羧基末端的缺失和插入，也包括在多肽序列內部的缺失和插入。例如，可以在全長人IL-2位置1缺失丙胺酸殘基，或在B’C’環區缺失一個或數個胺基酸以縮短該環區的長度。在一些實施方案中，較佳的胺基酸突變是胺基酸取代，例如單胺基酸取代的組合或胺基酸序列區段的置換。例如，可以是將野生型IL-2的B’C’環區序列整體或部分替換為不同的序列，較佳地以獲得長度縮短的B’C’環區序列。

在本發明中，當提及IL-2蛋白或IL-2序列區段中的胺基酸位置時，藉由參考野生型人IL-2蛋白(也稱作IL-2^WT)的胺基酸序列SEQ ID NO：1，予以確定(如圖8所示)。可以藉由與SEQ ID NO：1進行胺基酸序列比對，鑑鑑定在其它IL-2蛋白或多肽(包括全長序列或截短片段)上的對應胺基酸位置。因此，在本發明中，除非另有說明，否則IL-2蛋白或多肽的胺基酸位置為根據SEQ ID NO：1編號的胺基酸位置。例如，當提及“F42”時，是指SEQ ID NO：1的第42胺基酸位置的苯丙胺酸殘基F，或經比對在其它IL-2多肽序列上的對應位置的胺基酸殘基。為進行胺基酸位置確定而實施的序列比對，可以使用可從https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi獲得的Basic Local Alignment Search Tool，採用默認參數進行。

在本文中，在提及IL-2突變蛋白時，以如下方式來描述單胺基酸取代：[原始胺基酸殘基/位置/取代的胺基酸殘基]。例如，位置35的賴胺酸取代為谷胺酸，可以表示為K35E。當在一個給定位置(例如K35位)可以有多種可選胺基酸取代方式(例如D,E)時，該胺基酸取代可以表示為：K35D/E。相應地，可以藉由 加號“+”或“-”將各單胺基酸取代連接起來，以表示在多個給定位置的組合突變。例如K35E、T37E、R38E和F42A位置的組合突變，可以表示為：K35E+T37E+R38E+F42A，或K35E-T37E-R38E-F42A。

在本文中，可以藉由在比較窗內比較兩條最佳比對的序列來確定“序列同一性百分比”。較佳地，在參考序列(例如SEQ ID NO：1)的全長上確定序列同一性。用於比較的序列比對方法是本領域內公知的。適用於確定序列同一性百分比的算法包括例如BLAST和BLAST 2.0算法(參見Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-402,1977和Altschul等J.Mol.Biol.215：403-10,1990)。可藉由美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公眾獲取用於進行BLAST分析的軟件。出於本申請的目的，同一性百分比採用可從https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi獲得的Basic Local Alignment Search Tool，利用默認參數來確定。

如本文中使用的，術語“保守取代”意指不會不利地影響或改變包含胺基酸序列的蛋白/多肽的生物學功能的胺基酸取代。例如，可藉由本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守取代。典型的保守型胺基酸取代是指將一種胺基酸取代為具有相似的化學性質(例如電荷或疏水性)的另一種胺基酸。功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。在本發明中，保守取代殘基來自以下的保守替代表X，尤其是表X中的較佳保守胺基酸取代殘基。

表X

例如，野生型IL-2蛋白可以相對於SEQ ID NO：1-3之一具有保守胺基酸取代，或僅具有保守胺基酸取代，且在一個較佳實施方案中，保守取代不超過10個胺基酸殘基，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個殘基。再例如，本發明的突變IL-2蛋白可以相對於本文中具體給出的IL-2突變蛋白序列(例如SEQ ID NO：37-638之任一)具有保守胺基酸取代，或僅具有保守胺基酸取代且在一個較佳實施方案中，保守取代不超過10個胺基酸殘基，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個殘基。

“親和力”或“結合親和力”可以用於反映結合對子的成員之間相互作用的內在結合能力。分子X對其結合配偶體Y的親和力可以由平衡解離常數(K_D)表示，平衡解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別是k_dis和k_on)的比值。結合親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio親和力測定技術。

在本文中，抗原結合分子是可以特異性結合抗原的多肽分子，例如，免疫球蛋白分子、抗體或抗體片段，例如Fab片段和scFv片段。

在本文中，抗體Fc片段是指含有至少一部分的恆定區的免疫球蛋白重鏈的C-端區域，並且可以包括天然序列Fc片段和變體Fc片段。天然序列Fc片段涵蓋天然存在的各種免疫球蛋白Fc序列，例如各種Ig亞型以及其同種異型的Fc區(Gestur Vidarsson等，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions，20 October 2014,doi：10.3389/fimmu.2014.00520.)在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc片段從重鏈的Cys226或從Pro230延伸至羧基端。在另一實施方案中，Fc-片段的C-端賴胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。在另一些實施方案中，Fc片段是包含突變的變體Fc片段，例如包含L234A-L235A突變。除非本文中另外指出，Fc片 段中的胺基酸殘基的編號根據EU編號系統，也稱為EU索引，如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。在一些實施方案中，抗體Fc片段可以在N端帶有IgG1鉸鏈序列或部分IgG1鉸鏈序列，例如根據EU編號，E216到T225的序列或D221到T225的序列。在該鉸鏈序列中可以含有突變。

IL-2蛋白屬具有四個α螺旋束(A、B、C、D)結構的短鏈I型細胞因子家族成員。在本文中，術語“B’C’Loop”或“B’C’環區”或“B’C’環序列”可互換使用，是指IL-2蛋白的B螺旋和C螺旋之間的連接序列。藉由IL-2的晶體結構分析(例如PDB：2ERJ)，可以確定一個IL-2蛋白的B’C’環序列。為了本發明的目的，根據SEQ ID NO：1的編號，該B’C’環序列是指IL-2多肽中連接位置72的殘基和位置84的殘基的序列。在SEQ ID NO：1、2和3的野生型IL-2蛋白中，該連接序列包括A73-R83共11個胺基酸。相應地，在本文中，術語“縮短的環區”或“縮短的B’C’環區”是指相對於野生型IL-2蛋白，突變蛋白具有長度減小的B’C’環序列，即，根據SEQ ID NO：1的編號，胺基酸殘基aa72和aa84之間的連接序列長度縮短。“縮短的環區”可以藉由環序列的替換或截短來實現。該替換或截短可以發生在B’C’環序列的任何區域或部分。例如，替換或截短可是環區A73-R83序列的替換或自該序列C端的一個或多個胺基酸殘基截短。再例如，替換或截短可是環區Q74-R83序列的替換或自該序列C端的一個或多個胺基酸殘基截短。在進行該替換或截短後，如果需要，可以進一步在環區序列中引入單胺基酸替代，例如用於消除糖基化的胺基酸替代，和/或回復突變，以進一步改善突變蛋白的性能，例如成藥性能。因此，在本文中，經突變後的縮短B’C’環 區可以藉由在引入突變後連接位置72的殘基和位置84的殘基之間的序列來描述。

在本文中，“IL-2R α結合界面”突變是指，發生在IL-2與IL-2R α(即，CD25)相互作用的胺基酸位點上的突變。可以藉由分析IL-2與其受體複合物的晶體結構(例如PDB：1Z92)，確定這些相互作用位點。在一些實施方案中，該突變尤其是指在IL-2的胺基酸殘基35-72區域的突變，特別是在如下胺基酸位點上的突變：35；37；38；41；42；43；45；61；62；68；72。較佳地，與引入該突變前的對應蛋白相比，包含該突變的IL-2蛋白具有降低或消除的IL-2R α結合。

在本文中，“IL-2 β γ結合界面”突變是指，發生在IL-2與IL-2R β γ(即，CD122和CD132)相互作用的胺基酸位點上的突變。可以藉由IL-2與其受體複合物的晶體結構分析(例如PDB：2ERJ)，確定這些相互作用胺基酸位點。在一些實施方案中，該突變尤其是指在IL-2的胺基酸殘基12-20、胺基酸殘基84-95、和胺基酸殘基126區域的突變，特別是在如下胺基酸位點上的突變：12、15、16、19、20、84、87、88、91、92、95、126。較佳地，與引入該突變前的對應蛋白相比，包含該突變的IL-2蛋白具有減弱的IL-2R β γ結合。

在本文中，對IL-2R β γ受體結合而言，“弱化”IL-2蛋白分子是指，在IL-2R β γ結合界面引入突變，其中相對於引入此突變前的對應IL-2蛋白，該突變導致降低的對IL-2R β γ受體的結合親和力。進一步較佳地，相對於對應蛋白，該弱化分子具有降低的T細胞(例如CD25-T細胞或CD25+T細胞)和/或NK細胞激活活性。例如藉由檢測該弱化分子和對應蛋白激活T細胞pSTAT5信號的EC₅₀值比值，下降倍數可達到例如5倍以上，例如10倍以上、或50倍以上、或100倍以上、或甚至1000倍以上。例如，相對於對應蛋白，弱化分子對T細胞的激活活性可以下降10-50倍、或50-100倍、或100-1000倍、或更高倍數。因此，在本發明中， 在一些實施方案中，本發明的弱化分子具有“弱化”的對IL-2R β γ受體的結合親和力和“弱化”的T細胞激活活性。

本發明的各方面將在下面各小節中進一步詳述。

1．本發明的IL-2突變蛋白

本發明IL-2突變蛋白的有利生物學性質

本發明人經長期研究發現，可以組合實施如下分子突變和改造，來同時改善IL-2的藥效、降低IL-2的毒副作用、和實現良好的生產性能：

(i)在IL-2與IL-2R β γ受體的結合界面引入特定的殘基突變，弱化與IL-2R β γ受體的結合，一定程度地下調IL-2的活性。藉由包含弱化IL-2R β γ受體結合的此類突變，本發明的IL-2突變蛋白可以在激活淋巴細胞殺傷腫瘤的同時，避免由淋巴細胞過度激活導致的大量炎症因子釋放，和由此帶來的藥物相關毒性。此外，該弱化突變還可以藉由減低本發明IL-2突變蛋白與廣泛存在於淋巴細胞上的IL-2受體的結合親和力，減少由IL-2受體介導的IL-2突變蛋白清除，延遲IL-2突變蛋白的作用時效；

(ii)將本發明的突變IL-2蛋白構建成IL-2-Fc二聚體。該二聚體的形成可以增加本發明IL-2突變蛋白的分子量，極大地減小腎清除，並藉由FcRn介導的體內循環回收，進一步延長IL2-Fc融合蛋白的半衰期。從而，克服由IL-2的短半衰期和高頻大劑量施用帶來的高峰值血藥濃度問題；

(iii)對IL-2的B’C’loop結構進行改造，例如分別使用IL-15分子的loop進行替換或者將IL-2分子B’C’loop進行截短。該B’C’環突變可以顯著地增強本發明IL-2突變蛋白中B’C’loop結構的穩定性，顯著地提升IL-2突變蛋白和由其構建的IL-2-Fc二聚體分子的生產性能，例如顯著提升的表達量和純度。

而且，本發明人發現，在本發明的突變蛋白中，在保持上述優良性質的同時，還可以根據需要，調節IL-2突變蛋白與IL-2R α的結合活性，以滿足IL-2在抗腫瘤或自身免疫疾病治療等多方面不同的成藥需求，從而，進一步賦予本發明突變蛋白優良的藥效性質。

例如，本發明突變蛋白可以保持與野生型IL-2基本上相當的IL-2R α結合活性；或可以進一步組合如下突變：(iv)在IL-2與IL-2R α受體的結合界面的一個或多個特定的突變，以改變IL-2突變蛋白對IL-2R α的結合性能。

由此，藉由對序列的改造，本發明的IL2-Fc系列分子，一方面弱化與其受體IL2R β/γ的結合親和力，實現了更優秀的藥物代謝動力學實驗結果和藥效結果，另一方面在成藥性例如蛋白表達量和純度方面得到了顯著的提升。

因此，本發明提供了具有改善的成藥性質和改善的IL-2受體結合性質的IL-2突變蛋白。包含本發明IL-2突變蛋白的IL-2-Fc分子可以有效地避免對淋巴細胞的強激動造成的炎症因子的過度釋放，具有更加平穩長效的藥物代謝特性。因此，可以用較低的單次給藥劑量來達到足夠高的人體藥物暴露量，避免Cmax過高導致的藥物相關毒性。此外，更有意義的是，雖然本發明的長效IL-2-Fc分子相對於天然IL-2具有弱化的淋巴細胞免疫刺激活性，但是因為藥物代謝動力學性質的顯著改善，本發明分子的體內有效藥物濃度持續的時間更長，可以發揮較長時間的對淋巴細胞的持續刺激，達到與天然IL-2分子相當甚至更好的藥效動力學效果，在動物中實現更好的抗腫瘤藥效和耐受性。

改善的成藥性質

在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有改善的成藥性質，例如，當在哺乳動物細胞例如HEK293或CHO細胞中表達時，尤其是以Fc融合蛋白 表達時，具有選自以下的一項或多項性質：(i)優於野生型IL-2蛋白的表達量；和(ii)易於純化至更高的蛋白純度。

在本發明的一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白與野生IL-2相比表現出表達水平的增加。在本發明的一些實施方案中，增加的表達發生在哺乳動物細胞表達系統中。表達水平可藉由允許定量或半定量分析細胞培養上清液(較佳一步親和層析純化後的上清液)中的重組IL-2蛋白量的任何合適方法來測定。例如，可以藉由蛋白質印跡或ELISA，評估樣品中的重組IL-2蛋白量。在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白，與野生型IL-2相比，在哺乳動物細胞中的表達量增加至少1.1倍，或至少1.5倍，或至少2倍、3倍或4倍以上，或至少5、6、7、8或9倍，或甚至10倍以上，例如大約10、15、20、25、30和35倍。

在一些實施方案中，如藉由測定蛋白A親和層析後純化蛋白的純度所顯示的，本發明IL-2突變蛋白-Fc融合物，相對於野生型IL-2蛋白融合物，表現出更高的純度。在一些實施方案中，蛋白純度藉由SEC-HPLC技術檢測。在一些較佳的實施方案中，在一步蛋白A親和層析純化後，本發明IL-2突變蛋白-Fc融合物的純度可以達到70%、或80%、或90%以上，較佳地92%、93%、94%、95%、98%或99%以上。

在一些實施方案中，如藉由測定蛋白A親和層析後純化蛋白的純度所顯示的，本發明IL-2-Fc二聚體蛋白，相對於由野生型IL-2蛋白形成的對應IL-2-Fc二聚體蛋白，表現出更高的純度。在一些實施方案中，蛋白純度藉由SEC-HPLC技術檢測。在一些較佳的實施方案中，在一步蛋白A親和層析純化後，本發明IL-2-Fc二聚體蛋白的純度可以達到70%、或80%、或90%以上，較佳地92%、93%、94%、95%、98%或99%以上。

弱化的IL-2 β γ受體結合性

藉由在IL-2R β γ結合界面引入突變，在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於引入該突變前的對應蛋白，具有弱化的IL-2 β γ結合親和力。

在一些實施方案中，相對於引入IL-2R β γ結合界面突變進行弱化前，本發明的IL-2突變蛋白對IL-2R β和/或IL-2R β γ受體的結合親和力降低。在一些實施方案中，相對於進行弱化前，本發明的IL-2突變蛋白對IL-2R β受體的結合親和力降低，例如降低1-20倍或更高，包括在一些實施方案中，去除對IL-2R β受體的結合。在一些實施方案中，相對於進行弱化前，本發明的IL-2突變蛋白對IL-2R β γ受體的結合親和力降低，例如降低1-100倍或更高。在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白不與IL-2R β受體的結合，但仍能夠與IL-2R β γ受體結合，較佳地其中該與IL-2R β γ受體的結合，相比於進行弱化前，可以例如降低1-100倍，如大約20-80倍。可以藉由ForteBio親和測定技術，測定本發明IL-2突變蛋白，例如與Fc片段融合的本發明IL-2突變蛋白或其二聚體分子，與受體IL-2R β或IL-2R β γ受體的平衡解離常數(K_D)來確定結合親和力。

藉由在IL-2R β γ結合界面引入突變，在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於引入該突變前的對應蛋白，具有弱化的IL-2活性，例如選自以下至少一項的IL-2活性：

-相比於弱化前，降低對T細胞(例如CD4+和CD8+ T細胞，例如CD4+/CD8+ CD25- T細胞，CD4+ CD25+ T細胞)的激活；

-相比於弱化前，降低對NK細胞的激活；

-相比於弱化前，降低由IL-2刺激的T細胞/NK細胞炎症因子釋放。

在一個實施方案中，相對於弱化前，本發明IL-2突變蛋白導致減少的由IL-2介導的淋巴細胞(例如T細胞和/或NK細胞)激活和/或增殖。在一個實施方案中，淋巴細胞是CD4+和CD8+ T細胞，例如CD25^- T細胞。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白在淋巴細胞例如T細胞或NK細胞中對STAT5磷酸化信號的激活，來鑑定IL-2突變蛋白激活CD4+和CD8+ T細胞的能力。例如，如本申請實施例中所述，可以藉由流式細胞術分析細胞中的STAT5磷酸化，確定半最大有效濃度(EC₅₀)。例如藉由檢測該本發明的IL-2弱化分子和對應蛋白激活T細胞STAT5磷酸化信號的EC₅₀值的比值，本發明的IL-2突變分子具有“弱化”的T細胞激活活性。根據該比值，本發明IL-2突變分子的T細胞激活活性下降可達到例如5倍以上，例如10倍以上，或50倍以上，或100倍以上，或甚至1000倍以上。例如，相對於對應蛋白，本發明IL-2突變分子對T細胞的激活活性可以下降10-50倍，或50-100倍，或100-1000倍，或更高倍數。在一些較佳實施方案中，本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2，具有減少的由細胞表面IL-2受體介導的IL-2清除，表現出增加的體內半衰期。

在一些較佳實施方案中，本發明IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2具有減小的由IL-2與其受體介導的體內毒性。

保持或改變的IL-2R α受體結合

IL-2蛋白藉由與IL-2受體相互作用來引發信號傳導和發揮功能。野生型IL-2對不同IL-2受體顯示出不同的親和力。在靜息效應細胞(包括CD8⁺ T細胞和NK細胞)上表達與野生型IL-2具有較低親和力的IL-2 β和γ受體。在調節性T細胞(Treg)細胞和激活的效應細胞上表達與野生型IL-2具有高親和力的IL-2R α。由於高親和力的原因，野生型IL-2會優先結合細胞表面的IL-2R α，再招募IL- 2R β γ，藉由IL-2R β γ釋放下游p-STAT5信號，刺激Treg細胞和激活的效應細胞。不受理論的束縛，改變IL-2對IL-2R α受體的親和力，將改變IL-2優先激活CD25⁺細胞的偏向性，改變IL-2介導的Treg細胞的免疫下調作用。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，具有保持或改變的IL-2R α受體結合能力。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，保持對IL-2 R α受體的結合。在本文中，表述“保持對IL-2 R α受體的結合”是指IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白與IL-2 R α受體具有相當的結合活性。較佳地，“相當的結合活性”為，當採用相同的測量方式測定時，IL-2突變蛋白與野生型IL-2蛋白的結合活性數值(例如結合親和力K_D)之間的比值在1：20至20：1之間，較佳地，1：10至10：1之間。較佳地，IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2，不具有IL-2R α結合界面突變。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白是弱化IL-2突變分子，且保持對IL-2R α受體的結合。在再一些實施方案中，本發明的弱化IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，不具有IL-2R α結合界面突變。較佳地，該弱化IL-2突變分子具有改善的Treg選擇性和/或改善的NK細胞(例如，CD3^-CD56⁺NK細胞)選擇性。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白在不同淋巴細胞例如Treg細胞、NK細胞、CD4+和CD8+效應T細胞中對STAT5磷酸化信號的激活，來鑑定IL-2突變蛋白對淋巴細胞的選擇性。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，IL-2突變蛋白的選擇性可以藉由選擇性激活特定的(一種或多種)淋巴細胞而不實質性激活其它淋巴細胞的IL-2突變蛋白劑量窗口來反映。例如，在一些實施方案中，本發明的弱化IL-2突變蛋白可以表現出改善的 Treg選擇性和/或改善的NK細胞(CD3^-CD56⁺NK細胞)選擇性，該選擇性相對於效應T細胞，例如CD25^-/low CD4+和/或CD8+效應T淋巴細胞而言。在再一些實施方案中，改善的選擇性可以反映為IL-2突變蛋白的低藥物相關毒性。

在另一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，引入IL-2R α結合界面突變，該突變導致IL-2突變蛋白具有降低或消除的IL-2R α受體結合。

在再一些實施方案中，本發明的該IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，降低IL-2優先激活CD25⁺細胞的偏向性。在再一些實施方案中，本發明的該IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，降低IL-2介導的Treg細胞的免疫下調作用。

在另一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白具有免疫下調作用。在再一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白可以用於自身免疫疾病的治療。

因此，在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白具有選自例如以下的一項或多項的改善性質：

-與野生型IL-2相比，保持或改變(例如降低或增加)對高親和力IL-2R受體(IL-2R α β γ)的結合親和力；

-與野生型IL-2相比，保持或改變(例如降低或增加)對CD25+細胞(例如CD8+T細胞和Treg細胞)的激活；

-與野生型IL-2相比，保持或改變(例如去除或降低，或增加)IL-2優先激活CD25+細胞(例如Treg細胞)的偏向性；

-與野生型IL-2相比，保持或改變(例如降低或增加)由IL-2誘導的經Treg細胞引起的免疫反應下調作用。

在一些實施方案中，相對於野生型IL-2(例如SEQ ID NO：1中所示IL- 2^WT)，本發明IL-2突變蛋白對IL-2R α受體的結合親和力降低至少5倍、至少10倍或至少25倍，尤其是至少30倍、50倍或100倍以上。在較佳的實施方案中，本發明的突變蛋白不結合IL-2受體α。可以藉由ForteBio親和測定技術，測定本發明IL-2突變蛋白，例如與Fc片段融合的本發明IL-2突變蛋白或其二聚體分子，與受體IL-2R α受體的平衡解離常數(K_D)來確定結合親和力。

在一個實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白導致減少的由IL-2介導的CD25⁺細胞激活和/或增殖。在一個實施方案中，CD25⁺細胞是CD25⁺ CD8⁺ T細胞。在另一實施方案中，CD25⁺細胞是Treg細胞。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白在CD25⁺細胞中對STAT5磷酸化信號的激活，來鑑定IL-2突變蛋白激活CD25⁺細胞的能力。例如，如本申請實施例中所述，可以藉由流式細胞術分析細胞中的STAT5磷酸化，確定半最大有效濃度(EC₅₀)。

在一個實施方案中，相對於野生型IL-2，本發明IL-2突變蛋白去除或降低IL-2對CD25⁺細胞優先激活的偏向性。在一個實施方案中，CD25⁺細胞是CD25⁺ CD8⁺ T細胞。在另一實施方案中，CD25⁺細胞是Treg細胞。在一個實施方案中，在STAT5磷酸化測定試驗中，藉由檢測IL-2突變蛋白分別在CD25^-細胞中和在CD25⁺細胞中激活STAT5磷酸化信號的EC₅₀值，來鑑定IL-2突變蛋白激活CD25^-細胞的能力。例如，藉由計算在CD25^-和CD25⁺ T細胞上激活STAT5磷酸化信號的EC₅₀值的比值，確定IL-2突變蛋白對CD25⁺細胞的激活偏向性。較佳地，相對於野生型蛋白，突變蛋白對CD25⁺的偏向性降低了至少10倍，較佳至少100倍、150倍、200倍、300倍或更高。

本發明的突變蛋白

一方面，本發明提供一種IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更佳包含SEQ ID NO：1序列的IL-2)相比，包含突變：

(i)在IL-2與IL-2R α結合界面上，尤其是在選自位置35、37、38、41、42、43、45、61、68和72的至少一個位置上，具有消除或降低對IL-2R α受體的結合親和力的突變；

和/或

(ii)縮短的B’C’環區(即，連接胺基酸殘基aa72和aa84的序列)，較佳地，該縮短的環區具有小於10、9、8、7、6、或5個的胺基酸長度，且較佳7個胺基酸長度；較佳地，該縮短的B’C’環區導致改善的蛋白表達量和/或純度，

且包含突變：

(iii)在IL-2與IL-2R β γ結合界面上，尤其是在選自位置12、15、16、19、20、84、87、88、91、92、95、126的至少一個位置上，具有弱化對IL-2R β γ受體的結合的突變；

其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：1編號，

較佳地，該突變蛋白包含突變(i)和(iii)或包含突變(ii)和(iii)或包含(i)、(ii)和(iiii)。

IL-2R β γ結合界面突變

適用於本發明突變蛋白的IL-2R β γ結合界面突變，可以是任何能夠與本發明其他突變組合並導致弱化的IL-2R β γ結合親和力和/或弱化的淋巴細胞(例如T細胞/NK細胞)激活活性的突變。

這樣的突變的例子包括，但不限於：在IL-2與IL-2R β γ結合界面 上，尤其是在選自位置12、15、16、19、20、84、87、88、91、92、95、126的至少一個位置上，導致弱化的IL-2R β γ受體結合的突變。

在一些實施方案中，IL-2R β γ結合界面突變包含選自以下的突變：

L12R；L12K；L12E；L12Q；E15Q；E15R；E15A；E15S；H16N；H16T；H16Y；H16A；H16E；H16D；H16R；L19D；L19E；L19R；L19S；D20N；D20Q；D20E；D20A；D20R；D20S；D84N；D84E；D84Q；D84T；D84S；D84R；D84G；D84M；D84F；D84L；D84K；D84H；S87T；S87R；S87K；S87L；S87M；S87H；N88D；N88T；N88Q；N88R；N88E；N88K；N88H；N88M；N88S；N88L；V91I；V91L；V91D；V91E；V91N；V91Q；V91S；V91H；I92E；I92T；I92K；I92R；I92L；E95Q；E95G；E95D；E95N；Q126E；Q126D；Q126A；Q126S；D84N+E95Q；D84E+E95Q；D84T+E95Q；D84Q+E95Q；D84T+H16T；D84N+ V91I；D84T+ Q126E；D84N+Q126E；H16T +D84Q；H16T+ V91I。

在一些較佳實施方案中，該IL-2R β γ結合界面突變包含選自以下的突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88R；N88D；N88Q；N88T；Q126E；V91I。

在再一些較佳實施方案中，該IL-2R β γ結合界面突變包含

- 選自以下的突變：D84N；E95Q；H16N；或

- 選自以下的突變：D84Q；H16T+ V91I；或

- 選自以下的突變：D84T；Q126E；D84N+V91I；D84N+E95Q；或

- 選自以下的突變：N88D；N88R；D20N；D84N+ E95Q；D84T+ H16T；D84T+ Q126E；D84N+ Q126E；H16T+ D84Q。

在再一些較佳實施方案中，該IL-2R β γ結合界面突變包含選自以下的突變：D20N或N88D或N88R。

B’C’環區突變

在一個方面，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含B’C’環區突變，較佳地該突變導致穩定性增加的B’C’環區；更佳地，該突變導致本發明IL-2突變蛋白具有改善的成藥性，例如，增加的表達量和/或純度。

在一些實施方案中，所引入的突變導致，與野生型IL-2(較佳人IL-2，更佳包含SEQ ID NO：1序列的IL-2)相比，突變蛋白包含縮短的B’C’環區(即，胺基酸殘基aa72和aa84之間的連接序列長度縮短)。

較佳地，該縮短的環區具有小於10、9、8、7、6個或5個胺基酸長度，且較佳7個胺基酸長度，其中胺基酸殘基根據SEQ ID NO：1編號。

在本文中，適用於本發明的B’C’環區突變包括B’C’環區的截短和替換。在一個實施方案中，該突變包括B’C’環區胺基酸殘基aa73至aa83的截短或替換，例如截短為A(Q/G)SKN(F/I)H，或替換為SGDASIH。在另一實施方案中，該突變包括B’C’環區胺基酸殘基aa74至aa83的截短或替換，例如截短為(Q/G)SKN(F/I)H，或替換為GDASIH。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白包含B’C’環嵌合突變。相對於野生型IL-2，該突變蛋白包含對連接aa72至aa84的序列的全部或部分替代，例如替代為來自其它四螺旋短鏈細胞因子家族成員的短B’C’環序列。可以藉由晶體結構的疊加(superpose)，從其它四螺旋短鏈細胞因子IL家族成員， 例如IL-15，IL-4，IL-21，或來自非人物種(如小鼠)的IL家族成員，鑑定適用於替代野生型IL-2的短B’C’環。在一個實施方案中，用於替代的序列為來自白介素IL-15(尤其是人IL-15)的B’C’環序列。在一個實施方案中，該替代包括B’C’環區胺基酸殘基aa73至aa83的替代。在另一實施方案中，該替代包括B’C’環區胺基酸殘基aa74至aa83的替代。較佳地，經替代後，本發明IL-2突變蛋白具有選自以下的B’C’環序列(即，連接aa72至aa84的序列)：SGDASIH或AGDASIH。

在一些實施方案中，本發明IL-2突變蛋白包含B’C’環截短突變。相對於野生型IL-2，該突變蛋白包含對連接aa72至aa84的序列的截短。在一個實施方案中，該截短包括B’C’環區胺基酸殘基aa73至aa83的截短。在另一實施方案中，該截短包括B’C’環區胺基酸殘基aa74至aa83的截短。例如，可以自C端截短1、2、3或4個胺基酸。較佳地，經截短後，本發明IL-2突變蛋白的B’C’環區具有序列A(Q/G)SKN(F/I)H。較佳地，經截短後，本發明IL-2突變蛋白具有選自以下的B’C’環序列(即，連接aa72至aa84的序列)：

在一個較佳的實施方案中，本發明IL-2突變蛋白包含選自以下的B’C’環區序列(即，連接aa72至aa84的序列)：AQSKNFH或SGDASIH或AGDASIH。

關於適用於本發明的B’C’環突變，也可以參見本申請人的共同待決申請PCT/CN2019/107054。該申請整體併入本文作為參考。

IL-2R α結合界面突變

在一個方面，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，在IL-2R α結合界面，較佳地在位置35，37，38，41，42，43，45，61，68和72上，包含一個或多個突變。較佳地，該突變消除或降低對IL-2R α受體的結合親和力。

在一些實施方案中，本發明的IL-2R α結合界面突變包含選自以下組合(1)-(9)之一的突變組合：

在一些較佳的實施方案中，本發明的IL-2R α結合界面突變包含突變組合K35E+T37E+R38E+F42A，或由該突變組合組成。

在另一些較佳的實施方案中，本發明的IL-2R α結合界面突變包含突變組合K35E+T37E+R38E，或由該突變組合組成。

在另一些較佳的實施方案中，本發明的IL-2R α結合界面突變包含突變組合F42A，或由該突變組成。

在另一些實施方案中，包含本發明的IL-2R α結合界面突變的本發明IL-2突變蛋白具有改變的IL-2R α結合，例如採用ForteBio親和力測定，改變的IL-2R α結合。

關於適用於本發明的IL-2R α結合界面突變，也可以參見本申請人的共同待決申請號PCT/CN2019/107055。該申請整體併入本文作為參考。

較佳的示例性突變組合

在一些較佳實施方案中，本發明IL-2突變蛋白具有弱化的IL-2R β γ結合，且具有選自以下一項或全部兩項的改善性質：(i)降低的(或消除的)IL-2R α結合；和(ii)改善的表達水平和純度。

在一些實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(a)突變組合K35E+T37E+R38E+F42A；

(b)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。

在一些實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(a)突變組合K35E+T37E+R38E；

(b)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。

在一些實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(a)突變組合F42A；

(b)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N； H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。

在一些實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(a)B’C’環區序列AQSKNFH；

(b)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。較佳地，該IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白保持IL-2R α受體結合能力。

在一些實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(a)B’C’環區序列SGDASIH或AGDASIH；

(b)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。較佳地，該IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2蛋白保持IL-2R α受體結合。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2， 包含：

(i)突變組合K35E+T37E+R38E+F42A、或突變組合K35E+T37E+R38E、或突變F42A；

(ii)B’C’環區序列：AQSKNFH；或SGDASIH或AGDASIH；

(iii)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(i)突變組合K35E+T37E+R38E+F42A；

(ii)B’C’環區序列：AQSKNFH；

(iii)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(i)突變組合K35E+T37E+R38E+F42A；

(ii)B’C’環區序列：SGDASIH或AGDASIH；

(iii)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(i)突變組合K35E+T37E+R38E；

(ii)B’C’環區序列：AQSKNFH；

(iii)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。

在一些實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(i)突變組合K35E+T37E+R38E；

(ii)B’C’環區序列SGDASIH或AGDASIH；

(iii)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

以及任選地，(iv)突變T3A。

在一些較佳實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

(i)突變組合K35E+T37E+R38E+F42A；

(ii)B’C’環區序列SGDASIH或AGDASIH；

(iii)IL-2R β γ結合界面突變：D84N或D84N+E95Q；

以及任選地，(iv)突變T3A。更佳地，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：(i)突變組合K35E+T37E+R38E+F42A；(ii)B’C’環區序列AGDASIH；(iii)IL-2R β γ結合界面突變：D84N+E95Q。

在再一些較佳實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2蛋白，保持對IL-2R α受體的結合，且包含：

(i)B’C’環區序列AQSKNFH；SGDASIH或AGDASIH；

(ii)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：D20N、N88R和N88D；

以及任選地(iii)突變T3A。較佳地，IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2，不具有IL-2R α結合界面突變。

在另一些較佳實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2蛋白，保持對IL-2R α受體的結合，且包含：

(i)B’C’環區序列SGDASIH或AGDASIH；

(ii)IL-2R β γ結合界面突變：D20N或N88R或N88D；

以及任選地(iii)突變T3A。較佳地，IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2，不具有IL-2R α結合界面突變。

在另一些較佳實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型 IL-2蛋白，保持對IL-2R α受體的結合，且包含：

(i)B’C’環區序列AGDASIH；

(ii)IL-2R β γ結合界面突變：D20N、或N88R、或N88D；

以及任選地(iii)突變T3A。較佳地，IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2，不具有IL-2R α結合界面突變。

在再一些較佳實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白，相對於野生型IL-2(例如SEQ ID NO：1)對IL-2R α受體的結合；且包含：

(i)B’C’環區序列AGDASIH；

(ii)IL-2R β γ結合界面突變：N88R；

以及(iii)突變T3A。較佳地，IL-2突變蛋白相對於野生型IL-2，不具有IL-2R α結合界面突變。在一個實施實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白在胺基酸序列上與SEQ ID NO：1-3之一中所列出的野生型IL-2蛋白的成熟區具有至少85%或90%同一性的成熟區。

在一些較佳實施方案中，本發明的IL-2突變蛋白包含，與選自SEQ ID NO：37-638(尤其是SEQ ID NO：469-553或554-638，較佳地SEQ ID NO：148或197，更佳地SEQ ID NO：489，513、516)之一的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%、99%的同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，該突變蛋白包含選自SEQ ID NO：37-638的胺基酸序列或由其組成。在一些較佳實施方案中，該突變蛋白包含選自SEQ ID NO：469-553或554-638，較佳地SEQ ID NO：148或197，更佳地SEQ ID NO：489，513、516的胺基酸序列或由其組成。

其它突變

除了上述“IL-2R β γ結合界面突變”、“B’C’環區突變”和“IL-2R α結合界面突變”，本發明的IL-2突變蛋白還可以在其它區域或位置上具有1個或多個突變，只要其保留本發明IL-2突變蛋白的上述一個或多個有益性質即可。例如，本發明IL-2突變蛋白還可以包含在位置125的取代，例如C125S、C125A、C125T、或C125V，以提供額外的優點，例如改善的表達或同質性或穩定性(參見例如，美國專利號4,518,584)。再例如，本發明IL-2突變蛋白還可以包含在位置3的取代，例如T3A，以去除IL2 N末端的O糖修飾。本領域技術人員知曉如何確定可以併入本發明IL-2突變蛋白中的額外突變。

IL-2突變蛋白與野生型蛋白之間的序列差異性可以用序列同一性表述，也可以用兩者之間差異胺基酸的數量來表達。在一個實施方案中，IL-2突變蛋白與野生型蛋白之間具有至少85%、86%、87%、88%、89%同一性，較佳90%以上同一性，較佳95%，但較佳不超過97%，更佳不超過96%同一性。在另一實施方案中，除了本發明的上述三種突變外，IL-2突變蛋白與野生型蛋白之間還可以具有不超過15個，例如1-10個，或1-5個突變，例如，0、1、2、3、4個突變。在一個實施方案中，該其餘突變可以是保守取代。

2.融合蛋白和IL-2-Fc二聚體蛋白

在一個方面，本發明還提供包含本發明IL-2突變蛋白的融合蛋白。在一個較佳的實施方案中，本發明IL-突變蛋白與可以賦予改善的藥物代謝動力學性質的另一多肽融合，例如清蛋白，更佳抗體Fc片段。

在一個實施方案中，本發明提供IL-2突變蛋白融合蛋白，其包含與抗體Fc片段融合的本發明IL-2突變蛋白。

用於本發明的Fc片段可以包含減小或去除效應子功能的突變。在 一個較佳的實施方案中，Fc片段具有減少的由Fc區介導的效應子功能，例如減少的或消除的ADCC或ADCP或CDC效應子功能。例如，在一些特別的實施方案中，用於本發明的Fc片段具有降低與Fc γ受體結合的L234A/L235A突變或L234A/L235E/G237A。

在再一較佳的實施方案中，Fc片段可以具有導致增加的血清半衰期的突變，例如改善Fc片段與FcRn結合的突變。

在一些實施方案中，與IL-2突變蛋白融合的Fc片段為人的IgG Fc，例如，人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、或人IgG4 Fc。在一個實施方案中，Fc片段包含胺基酸序列SEQ ID NO：12或與其具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性。

在一些實施方案中，IL-2突變蛋白藉由接頭與Fc融合。在一些實施方案中，可以選擇接頭以提高Fc融合蛋白對於CD25^- T細胞的激活作用。在一個實施方案中，接頭是GSGS，更較佳為(G4S)₂。

在再一方面，本發明也提供包含與Fc片段融合的本發明IL-2突變蛋白的二聚體分子。這樣的二聚體分子將分子量提高到60-80KDa，極大地減小了腎清除，而且藉由FcRn介導的體內循環回收，能進一步的延長IL2-Fc融合蛋白的半衰期。較佳地，該二聚體分子，相比於包含野生型IL-2-Fc融合蛋白的相應二聚體分子，具有以下特性之一項或多項：

-在哺乳動物細胞(例如CHO或HEK293細胞)中表達時，表達量和/或純度增加；

-降低或避免因IL-2導致的淋巴細胞過度激活和/或炎症因子釋放；

-更優的藥物代謝動力學性質，例如延遲的體內半衰期；

-體內施用時低毒性，例如低的心血管系統毒性(例如低的血管滲漏副作用)。

較佳地，本發明IL-2突變蛋白的二聚體分子在動物中施用時，表現出良好的抗腫瘤效果和耐受性。抗腫瘤效果可以藉由實施例中所述的荷瘤動物實驗中測定抑瘤率來確定。耐受性可以藉由實施例該檢測給藥後動物模型的體重及其體重變化情況來確定。

在一些實施方案中，本發明提供IL-2-Fc二聚體蛋白，其是同二聚體，其中第一單體和第二單體分別由自N端到C端包含：i)IL-2突變蛋白；ii)接頭；和iii)Fc片段。

在另一些實施方案中，本發明提供IL-2-Fc二聚體蛋白，其是異二聚體，包含：

a)第一單體，其中該第一單體自N端到C端包含：i)IL-2突變蛋白；ii)接頭；和iii)第一Fc片段；和

b)第二單體，其中該第二單體包含第二Fc片段。

在一些實施方案中，第一Fc片段和第二Fc片段分別包含促進第一單體與第二單體形成異二聚體的第一和第二異二聚化突變。在一些較佳實施方案中，第一和第二異二聚化突變包含Knob：Hole突變組合，例如突變組合T366W/S354C：Y349C/T366S/L368A/Y407V。

在一些較佳實施方案中，第一Fc片段上的第一異二聚體突變包含Knob突變，第二Fc片段的第二異二聚體突變包含Hole突變；或者，第一Fc片段上的第一異二聚體突變包含Hole突變，第二Fc片段的第二異二聚體突變包含Knob突變。

如本領域技術人員理解的，適用於本發明融合蛋白和二聚體分子的Fc片段可以是任何抗體Fc片段。在一個實施方案中，本發明的Fc片段是效應物功能沉默的。

在一個實施方案中，在一個或多個選自以下的特性上修飾Fc片段：Fc區的效應子功能和Fc區的補體激活功能。在一個實施方案中，該效應子功能或補體激活功能相對於相同同種型的野生型Fc區已經被降低或消除。在一個實施方案中，藉由選自以下的方法來降低或消除效應子功能：降低Fc區的糖基化、使用天然具有降低或消除的效應子功能的Fc同種型、和Fc區修飾。

在一個實施方案中，藉由降低Fc區的糖基化來降低或消除效應子功能。在一個實施方案中，藉由選自以下的方法來降低Fc區的糖基化：在不允許野生型糖基化的環境中生產本發明的融合蛋白或二聚體分子；除去Fc區上已經存在的碳水化合物基團；和修飾Fc區使得不發生野生型糖基化。在一個實施方案中，藉由修飾使得不發生野生型糖基化的方法來降低Fc區的糖基化，如在Fc區的位置297包含突變，使得該位置的野生型天冬醯胺殘基被另一個干擾該位置糖基化的胺基酸替代，例如N297A突變。

在一個實施方案中，藉由至少一個Fc區修飾來降低或消除效應子功能。在一個實施方案中，至少一個Fc區修飾選自：選自以下位置的、損害與一個或多個Fc受體的結合的Fc區點突變：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438和439；選自以下位置的損害C1q結合的Fc區點突變：270、322、329和321；以及CH1結構域的位置132的點突變。在一個實施方案中，該修飾是選 自以下位置的損害C1q結合的Fc區點突變：270、322、329和321。在另一個實施方案中，該修飾是消除一些Fc區。

如本領域技術人員理解的，為了促進本發明的異二聚體形成，本發明二聚體分子的Fc片段可以包含利於第一單體與第二單體二聚化的突變。較佳地，基於Knob-in-Hole技術，在第一單體和第二單體中引入相應的Knob突變和Hole突變。

因此，在一個實施方案中，本發明的二聚體分子包含：

i)任選具有突變P329G、L234A和L235A的、人IgG1亞類的同二聚Fc-區，或

ii)任選具有突變P329G、S228P和L235E的、人IgG4亞類的同二聚Fc-區，或

iii)異二聚Fc-區，其中

a)一個Fc-區多肽包含突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A和Y407V，或

b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或

c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和Y349C，

或

iv)人IgG4亞類的異二聚Fc-區，其中兩個Fc-區多肽都包含突變P329G、L234A和L235A，且

a)一個Fc-區多肽包含突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含突變 T366S、L368A和Y407V，或

b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或

c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和Y349C，

或

v)人IgG4亞類的異二聚Fc-區，其中兩個Fc-區多肽都包含突變P329G、S228P和L235E，且

a)一個Fc-區多肽包含突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A和Y407V，或

b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或

c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和Y349C。

在一些實施方案中，Fc區還包含其他利於異二聚體純化的突變。例如，可以將H435R突變(Eric J.Smith，Scientific Reports | 5：17943 | DOI：10.1038/srep17943)引入異二聚體的Fc區之一中(例如，帶Hole突變的Fc區)，以利於使用蛋白A純化異二聚體。在另一些實施方案中，對於包含鉸鏈區的異二聚體單體，也可以在鉸鏈區中引入突變，例如C220S，以利於異二聚體的形成。

如本領域技術人員明瞭的，適用於本發明融合蛋白和二聚體分子中連接IL-2突變蛋白和Fc片段的接頭可以是本領域已知的任何接頭。在一些實施方案中，接頭可以包含IgG1鉸鏈，或可以包含選自以下的接頭序列：(GS)n、 (GSGGS)n、(GGGGS)n及(GGGS)n，其中n是至少1的整數。較佳地，接頭包含(G4S)2，即GGGGSGGGGS。

因此，在一個較佳實施方案中，本發明二聚體中的每個單體均包含在C端藉由接頭(G4S)2連接SEQ ID NO：12胺基酸序列的、選自SEQ ID NO：37-638(尤其是SEQ ID NO：469-553或554-638，較佳地SEQ ID NO：489，513、516)的IL-2突變蛋白。在一些較佳實施方案中，二聚體分子的第一單體包含在C端藉由接頭(G4S)2連接SEQ ID NO：9胺基酸序列的、選自SEQ ID NO：37-638(尤其是SEQ ID NO：469-553或554-638，較佳地SEQ ID NO：489，513、516)的IL-2突變蛋白；且第二單體包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列。

3.免疫綴合物

本發明還提供免疫綴合物，其包含本發明的IL2突變蛋白和抗原結合分子。較佳地，抗原結合分子是免疫球蛋白分子，特別是IgG分子，或抗體或抗體片段，特別是Fab分子和scFv分子。在一些實施方案中，該抗原結合分子特異性結合腫瘤細胞上或腫瘤環境中呈現的抗原，例如選自以下的抗原：成纖維細胞活化蛋白(FAP)、生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纖連蛋白的外域B(Extra Domain B,EDB)、癌胚抗原(CEA)、和黑色素瘤有關的硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。由此，本發明免疫綴合物在施用於受試者體內後可以靶向腫瘤細胞或腫瘤環境，從而提供進一步的治療益處，例如以更低的劑量進行治療的可行性和由此帶來的低副作用；增強的抗腫瘤效應等。

在本發明的免疫綴合物中，本發明IL-2突變蛋白可以直接或藉由接頭與另一分子或抗原結合分子連接，且在一些實施方案中，在兩者之間包含蛋白水解切割位點。

4.多核苷酸、載體和宿主

本發明提供編碼以上任何IL-2突變蛋白或融合蛋白或二聚體分子或綴合物的核酸。可以採用本領域熟知的方法，藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼野生型IL-2的現有序列，產生編碼本發明突變蛋白的多核苷酸序列。此外，本發明的多核苷酸和核酸可以包含編碼分泌信號肽的區段，並與編碼本發明突變蛋白的區段可操作連接，從而可以指導本發明突變蛋白的分泌性表達。

本發明也提供包含本發明核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在較佳的實施方案中，本發明的表達載體是pYDO_017表達載體。

本發明也提供包含該核酸或該載體的宿主細胞。適用於複製並支持突變IL-2蛋白或融合物或二聚體或免疫綴合物表達的宿主細胞是本領域中公知的。可以用特定的表達載體轉染或轉導這類細胞，並且可以生長大量的含載體細胞以用於接種大規模發酵罐，從而獲得充足量的IL-2突變體或融合物或二聚體或免疫綴合物用於臨床應用。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)。可用的哺乳動物宿主細胞系的例子是由SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚胎腎系(293或293T細胞，如例如記載於Graham等，JGenVirol36,59(1977))、幼侖鼠腎細胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞，如例如記載於Mather,BiolReprod23,243-251(1980))、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、buffalo大鼠肝細胞(BRL3A)、人肺細胞 (W138)、人肝細胞(HepG2)、小鼠乳房腫瘤細胞(MMT060562)、TRI細胞(例如記載於Mather等，AnnalsN.Y.AcadSci383,44-68(1982))、MRC5細胞和FS4細胞。其它可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等，ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))；和骨髓瘤細胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。在一個實施方案中，宿主細胞是真核生物細胞，較佳為哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。

5.製備方法

再一方面，本發明提供製備本發明IL-2突變蛋白或融合物或二聚體或綴合物的方法，其中該方法包括，在適合IL-2突變蛋白或融合物或二聚體或綴合物表達的條件下，培養包含編碼該蛋白或融合物或二聚體或綴合物的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和任選地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該蛋白或融合物或二聚體或綴合物。

6.測定法

可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供IL-2突變蛋白進行鑑定、篩選、或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。

一方面，可以對本發明的IL-2突變蛋白，測試其與IL-2受體的結合活性。例如，可以藉由本領域已知的方法，諸如ELISA、Western印跡等，或本文實施例公開的例示性方法，來測定與人IL-2R α或β蛋白或IL-2R β γ或IL-2R α β γ的結合。例如，可以使用流式細胞術進行測定，其中使經轉染在細胞表面上表達突變蛋白的細胞例如酵母展示細胞，與標記的(例如生物素標記的)IL-2R α或β蛋白或IL-2R β γ或IL-2R α β γ複合物進行反應。備選地，突變蛋白與 受體的結合，包括結合動力學(例如K_D值)，可以使用IL-2-Fc融合物或二聚體分子形式，在ForteBio測定法中測定。

再一方面，可以藉由測定在受體結合下游發生的信號傳導和/或免疫激活效應，來間接測量IL-2突變蛋白結合IL-2受體的能力。

因此，在一些實施方案中，提供了用於鑑定具有生物學活性的突變IL-2蛋白的測定法。生物學活性可以包括，例如誘導具有IL-2受體的T和/或NK細胞和/或Treg細胞增殖的能力、誘導具有IL-2受體的T和/或NK細胞和/或Treg細胞中IL-2信號傳導的能力、降低的誘導T細胞中細胞凋亡的能力、誘導腫瘤消退和/或改善存活的能力、和降低的體內毒性性質，例如降低的血管通透性。本發明也提供體內和/或體外具有這類生物學活性的突變IL-2蛋白、其Fc融合物和包含其的二聚體分子。

本領域中公知多種方法可以用於測定IL-2的生物學活性。例如，用於測試本發明IL-2突變蛋白(例如以二聚體分子形式)刺激NK細胞生成IFN-γ的能力的合適測定法，可以包括如下步驟：將培養的NK細胞與本發明的突變IL-2蛋白溫育，並隨後藉由ELISA測量培養基中的IFN-γ濃度。IL-2信號傳導誘導數個信號傳導途徑，並且牽涉JAK(Janus激酶)和STAT(信號轉導物和轉錄的激活劑)信號傳導分子。

IL-2與受體β和γ亞基的相互作用導致受體以及JAK1和JAK3(分別與β和γ亞基結合)的磷酸化。然後，STAT5與磷酸化受體結合，並自身在非常重要的酪胺酸殘基上磷酸化。這導致STAT5從受體解離、STAT5二聚化以及STAT5二聚體移位至細胞核，在該處它們促進靶基因的轉錄。由此，可以例如藉由測量STAT5的磷酸化，評估突變體IL-2多肽經由IL-2受體誘導信號傳導的能力。 此方法的詳情已經披露在實施例中。例如，可以將PBMC用本發明的突變體IL-2多肽或融合物或二聚體或免疫綴合物處理，並藉由流式細胞術測定磷酸化STAT5的水平。

再者，可以在多種本領域中已知的動物腫瘤模型中評估突變的IL-2對腫瘤生長和存活的影響。例如，可以將癌症細胞系的異種移植物植入免疫缺陷型小鼠，並用本發明的突變體IL-2多肽或融合物或二聚體或免疫綴合物處理。可以基於腫瘤抑制率(例如，相對於同種型對照抗體計算)，檢測本發明的突變體IL-2多肽、融合物、二聚體分子和免疫綴合物的體內抗腫瘤效應。此外，可以基於動物的體重變化(例如，相對於給藥前，絕對體重的變化或體重變化百分比)來來測定本發明的突變體IL-2多肽、融合物、二聚體分子和免疫綴合物在體內的毒性。也可以基於死亡率、生命期觀察(不良作用的可見症狀，例如行為、體重、體溫)以及臨床和解剖病理學(例如測量血液化學值和/或組織病理學分析)來測定該體內毒性。

再一方面，可以藉由本領域已知的方法，表徵本發明突變蛋白的成藥性能，例如，表達量和產品的純度。對於表達量的測定，當突變蛋白自培養細胞中分泌表達到培養上清液中時，可以對離心收集的細胞培養液進行蛋白含量的測定。或者，可以在對收集的細胞培養液進行一個步驟的純化後，例如在一步親和層析純化後，進行測定。對於產品純度的測定，可以在對收穫的生產細胞的培養上清液實施一步親和層析純化後，進行純度確定，以檢測突變蛋白的純化性能。較佳地，本發明突變蛋白，按照此一步親和層析純化後，具有顯著優於野生型蛋白的純度，表明本發明突變蛋白具有更好的純化性能。純度確定方法可以是本領域已知的任何常規方法，包括但不限於SEC-HPLC法。

再一方面，可以藉由本領域已知的方法，表徵本發明突變蛋白、融合物和二聚體分子的藥物代謝動力學性質，例如半衰期。

7. IL-2蛋白改造方法

在一方面，本發明提供用於獲得具有改善性質的IL-2突變蛋白的方法和由此方法獲得的IL-2突變蛋白。

在一個實施方案中，本發明的方法包括如下步驟：

(1)在IL-2的B’C’環區藉由突變以縮短該環區序列，以及任選地在IL-2與IL-2R β γ結合界面引入一個或多個突變和/或在IL-2與IL-2Ra的結合界面引入一個或多個突變，

(2)在哺乳動物細胞(例如HEK293或者CHO細胞)中表達IL-2突變蛋白，例如以Fc融合物形式(例如FcLALA融合物)。

在再一實施方案中，本發明的方法包括如下步驟：

(1)在IL-2與IL-2R β γ結合界面引入一個或多個突變，以及任選地在IL-2的B’C’環區藉由突變以縮短該環區序列和/或在IL-2與IL-2Ra的結合界面引入一個或多個突變，較佳地在一個實施方案中，不在IL-2與IL-2Ra的結合界面引入突變；

(2)在哺乳動物細胞(例如HEK293或者CHO細胞)中表達IL-2突變蛋白，例如以Fc融合物形式(例如FcLALA融合物)。

在上述任何實施方案中，較佳地，該縮短的環區具有小於10、9、8、7、6或5個的胺基酸長度，且較佳7個胺基酸長度，

更佳地該B’C’環區突變包括：

(a)對B’C’環區的aa74至aa83的替代，例如替代為來自四螺旋短 鏈細胞因子IL家族成員的短B’C’環序列，如IL15的B’C’環序列，較佳地替代為序列GDASIH；或

(b)對B’C’環區的aa74至aa83的截短，例如自C端截短1、2、3或4個胺基酸；較佳地截短為序列(Q/G)SKN(F/I)H，更佳地，截短為選自以下的序列：

較佳地，該IL-2R β γ結合界面突變包括前面描述的IL-2R β γ結合界面突變；

較佳地，該IL-2R α結合界面突變包括前面描述的IL-2R α結合界面突變；

較佳地，該突變蛋白具有如下改善的性質：(i)改善的表達量和/或蛋白純度(例如，藉由SEC-HPLC檢測，一步親和層析後的純度)；和任選地(ii)弱化的IL2R β結合和/或(iii)改變的IL-2Ra結合。

在一個實施方案中，本發明的方法還包括步驟：在步驟(1)和(2)後，鑑定突變蛋白的如下性質：(i)表達量和/或純化後的蛋白純度(例如，藉由SEC-HPLC檢測，一步親和層析後的純度)；和任選地(ii)弱化的IL2R β結合，和/或(iii)改變的IL2R α結合。在再一實施方案中，本發明的方法還包括步驟：在步驟(1)和(2)後，鑑定突變蛋白的如下性質：(i)表達量和/或純化後的蛋白純度(例如，藉由 SEC-HPLC檢測，一步親和層析後的純度)；和(ii)弱化的IL2R β結合，且較佳地保持的IL2R α結合。

在一個實施方案中，該方法包括：在進行步驟(1)的突變組合之前，鑑定改善成藥性(例如表達量和/或產品穩定性和/或同質性，例如一步Fc親和層析純度)的IL-2突變。在一個較佳實施方案中，藉由將B’C’loop環替代為或截短為縮短的B’C’loop環，來改善突變蛋白的成藥性。

在一個實施方案中，該方法包括：在進行步驟(1)的突變組合之前，鑑定相對於野生型IL-2，賦予弱化的IL2R β結合和/或改變的IL-2Ra結合能力的IL-2R β γ結合界面突變和/或IL-2R α結合界面突變。

如本領域技術人員明瞭，可以將這些突變與賦予進一步改善成藥性或其它改良性質的突變組合，以獲得具有多重改良性質的IL-2突變蛋白。

在一個實施方案中，將(例如已知的)導致弱化的IL-2R β γ結合的IL-2R β γ結合界面突變，與(例如已知的)改善成藥性的B’C’環區突變，組合引入IL-2蛋白中，進行性質鑑定。在一個較佳實施方案中，該鑑定包括相對於野生型IL-2，弱化的IL-2R β γ結合和改善的成藥性(例如改善的表達和/或純度、和/或產品穩定性和/或同質性)，任選地基本不變的或弱化的或增強的IL-2R α結合親和力。

在一些實施方案中，用作突變模版的親本野生型IL-2蛋白較佳與SEQ ID NO：1具有至少85%，或至少90%或95%的同一性，更佳地為來源人的IL-2蛋白。

8.醫藥組成物和藥物製劑

本發明還包括包含IL-2突變蛋白或其融合物或二聚體分子或免疫 綴合物的組成物(包括醫藥組成物或藥物製劑)和包含編碼IL-2突變蛋白或其融合物或二聚體分子或免疫綴合物的多核苷酸的組成物。這些組成物還可以任選地包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。

9.組合產品

在一方面，本發明還提供了組合產品，其包含本發明的突變蛋白或其融合物或二聚體分子或免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑等)。本發明的組合產品可用於本發明的治療方法中。

在一些實施方案中，本發明提供組合產品，其中該其它治療劑為例如有效刺激免疫反應從而進一步增強、刺激或上調受試者的免疫反應的治療劑如抗體。

在一些實施方案中，該組合產品用於預防或治療癌症。在一些實施方案中，癌症為，例如胃腸道癌症，例如直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌。在一些實施方案中，該組合產品用於預防或治療感染，例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。

10.治療方法和用途

在本文中，術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，乳牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，受試者是人。

在本文中，術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減 輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。

在一方面中，本發明提供刺激受試者免疫系統的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的包含本發明IL-2突變蛋白或融合物或二聚體分子或免疫綴合物的醫藥組成物。

本發明的弱化IL-2-Fc分子可以有效避免對淋巴細胞的強激動造成的炎症因子的過度釋放，具有更加平穩長效的藥物代謝特性。因此，在一個實施方案中，可以用較低的單次給藥劑量來達到足夠高的人體藥物暴露量，以避免Cmax過高導致的藥物相關毒性。

因此，在一些實施方案中，本發明涉及在受試者中增強機體的免疫應答的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白、或其融合物或免疫綴合物。在一些實施方案，將本發明的IL-2突變蛋白或其融合物或免疫綴合物施用於攜帶腫瘤的受試者，刺激抗腫瘤免疫應答。在另一些實施方案中，將本發明的抗體或其抗原結合部分施用於攜帶感染的受試者，刺激抗感染免疫應答。

在另一方面中，本發明涉及治療受試者疾病，如癌症的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白、或其融合物或免疫綴合物。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。在一些實施方案中，癌症可以是例如胃腸道癌症，例如直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌。

在另一方面中，本發明涉及治療受試者感染性疾病，例如慢性感染的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白或其片段，或包含該抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體，或醫藥組成物。在 一個實施方案中，該感染是病毒感染。

在另一方面，本發明涉及在受試者中治療Treg調節相關疾病，該方法包括向該受試者施用有效量的本文所述的任何IL-2突變蛋白或其片段，或包含該抗體或片段的免疫綴合物、多特異性抗體，或醫藥組成物。在一個實施方案中，該疾病與IL-2介導的經由Treg細胞的免疫下調相關。在一個實施方案中，該疾病是自身免疫性疾病。

本發明的突變蛋白(以及包含其的醫藥組成物或其融合物或二聚體分子或免疫綴合物，和任選地另外的治療劑)可以藉由任何合適的方法給藥，包括腸胃外給藥、肺內給藥和鼻內給藥，並且，如果局部治療需要，病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程，包括，但不限於，單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。

為了預防或治療疾病，本發明突變蛋白的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對該抗體的應答，和主治醫師的判斷力。該抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。

再一方面，本發明也提供本發明IL-2突變蛋白、組合物、免疫綴合物、融合物、二聚體分子在製備用於前述方法(例如用於治療)的藥物中的用途。

描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。

實施例

實施例1：白細胞介素2的IL-2R α結合界面突變體設計和構建

白細胞介素2突變文庫設計和構建

突變文庫設計

根據白細胞介素2(Interleukin-2，簡稱IL-2)與其α受體CD25(簡稱IL-2R α)複合物的晶體結構(PDB：1Z92)(如圖1所示)，列出相互作用位點的IL-2殘基按表1突變。野生型IL-2(uniprot：P60568,aa21-153,C125S，簡稱IL-2^WT)作為突變文庫構建的模版。按照各位點原始胺基酸占50%比例，其餘50%比例由表1中“突變胺基酸”均分，設計並產生針對IL-2與IL-2R α的相互結合位點的基於酵母的IL-2^mutant展示文庫，文庫命名為IBYDL029(Innoventbio Yeast Display Library)。採用流式細胞術FACS，從文庫中篩選不與IL-2R α結合的IL-2突變體。

表1. IBYDL029文庫突變位點表

IL-2^WT的序列在本申請中顯示於SEQ ID NO：1中，在該序列的125位引入了C125S突變，以避免二硫化物橋接的IL-2二聚體形成。

根據已有文獻，IL-2突變體IL-2^3X與IL-2R α不結合，與IL-2R β結合力維持不變(Rodrigo Vazquez-Lombardi等，Nature Communications,8：15373,DOI：10.1038/ncomms15373)。將IL-2^3X展示於酵母表面，作為對照使用。IL-2^3X的序列示於SEQ ID NO：4中，該蛋白與IL-2^WT相同也包含C125S突變。

IL-2R α結合界面突變體鑑定

IL-2受體的表達和純化

載體構建

將IL-2受體IL-2R α(Uiprot：P01589,aa22-217)與IL-2R β(Uiprot：P14784,aa27-240)在序列的C末端接上avi標籤(GLNDIFEAQKIEWHE，該標籤肽可被BirA酶催化發生生物素化)和6個組胺酸標籤(HHHHHH)，分別構建到pTT5載體(Addgene)上。構建產生的受體序列示於SEQ ID NO：5和6。

IL-2受體β γ複合物是基於Knobs in holes的Fc異源二聚，IL-2R β的序列被構建到Fc-Knob的N端(SEQ ID NO：7)，IL-2R γ的序列被構建到Fc-Hole的N端(SEQ ID NO：8)，分別構建到pcDNA3.1載體上，然後在Expi293細胞中共轉表達。

質粒轉染

根據所需轉染體積傳代Expi293細胞(Invitrogen)，轉染前一天將 細胞密度調整至1.5×10⁶個細胞/ml。轉染當天細胞密度約為3×10⁶個細胞/ml。取終體積1/10(v/v)的Opti-MEM培養基(Gibco貨號：31985-070)作為轉染緩衝液，加入上述構建的表達質粒，混勻，用0.22μm的濾頭過濾備用。加合適的聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences，23966)到上一步的質粒中(質粒與PEI的質量比例為1：3)，混勻後室溫孵育10min，獲得DNA/PEI混合物。將DNA/PEI混合物輕柔倒入HEK293細胞並混勻，在37℃，8% CO2的條件下培養24h後，補加VPA(Sigma，貨號：P4543-100G)使終濃度至2mM及2%(v/v)Feed(1g/L Phytone Peptone+1g/L Difco Select Phytone)，繼續培養6天。

IL-2R α-His和IL-2R β-His蛋白的純化

純化前將收集的培養基4500rpm離心30min，棄掉細胞。再將上清使用0.22μl的濾器過濾。將純化使用的鎳管柱(5ml Histrap excel,GE,17-3712-06)用0.1M NaOH浸泡2h，然後用5-10倍管柱體積的超純水沖洗，去除鹼液。純化前用5倍管柱體積的結合緩衝液(20mM Tris pH 7.4,300mM NaCl)平衡純化管柱；將細胞上清藉由平衡後的管柱；用10倍管柱體積的沖洗緩衝液(20mM Tris 7.4,300mM NaCl,10mM imidazole)藉由管柱，去除非特異性結合的雜蛋白；然後用3-5倍管柱體積沖提液(20mM Tris 7.4,300mM NaCl,100mM imidazole)將目標蛋白沖提下來。將收集的蛋白超濾濃縮交換到PBS(Gibco，70011-044)中，然後用superdex200 increase(GE,10/300GL,10245605)進一步分離純化，收集單體的沖提峰，管柱的平衡和沖提緩衝液為PBS(Gibco，70011-044)。取100μg純化後的蛋白樣品，使用凝膠過濾色譜管柱SW3000(TOSOH貨號：18675)測定蛋白純度。

IL-2受體β γ蛋白的純化

細胞培養後，以13000rpm離心20min，收集上清，用預裝管柱Hitrap Mabselect Sure(GE,11-0034-95)純化上清液。操作如下：純化前用5倍管柱體積的平衡液(0.2M Tris,1.5M NaCl,pH7.2)平衡填料管柱；將收集的上清藉由管柱，再用10倍管柱體積的平衡液清洗填料管柱，去除非特異性結合蛋白；用5倍管柱體積的沖提緩衝液(1M sodium citrate，pH 3.5)沖洗填料，收集沖提液；將收集的蛋白超濾濃縮交換到PBS(Gibco，70011-044)中，然後用superdex200 increase(GE,10/300GL,10245605)進一步分離純化，收集單一的沖提峰，管柱的平衡和沖提緩衝液為PBS(Gibco，70011-044)。取100μg純化後的蛋白樣品，使用凝膠過濾色譜管柱SW3000(TOSOH貨號：18675)測定蛋白純度。

IL-2R α、IL-2R β和IL-2R β γ蛋白的生物素化標記

利用酶催化方法標記生物素，方法如下：分別取適量的如上表達和純化的IL-2R α、IL-2R β和IL-2R β γ蛋白溶液，加入1/10(m/m)質量的His-BirA蛋白(uniprot：P06709)，同時加入終濃度為2mM ATP(sigma貨號：A2383-10G)，5mM MgCl₂，0.5mM D-生物素(AVIDITY貨號：K0717)；30℃孵育1h，藉由Superdex200 increase(GE,10/300GL,10245605)純化，去除多餘的生物素和His-BirA；純化後的樣品藉由Fortebio的Streptavidin(SA)傳感器(PALL,18-5019)驗證，確認生物素標記成功。

IL-2 ^mutant -FC融合蛋白的表達及純化和鑑定

表達質粒的構建

從基於酵母的IL-2^mutant展示文庫IBYDL029，採用流式細胞術FACS，篩選與IL-2R α不結合的IL-2^mutant。將從文庫篩選獲得的IL-2^mutant序列藉由2個GGGGS與FcLALA連接，並構建到pCDNA3.1(Addgene)的載體上，用於表達IL-2^mutant-FC融合蛋白。

此外，作為對照，將IL-2^WT、IL-2^3X基因序列放入藉由2個GGGGS與FcLALA連接，並構建到pCDNA3.1，用於表達IL-2^WT-FC與IL-2^3X-FC融合蛋白。本實施例中使用的Fc是指帶有突變L234A和L235A的人IgG1的Fc(簡稱FcLALA，SEQ ID NO：12)。

IL-2與FC融合蛋白的表達及純化

使用化學轉染的方法將含有編碼融合蛋白基因的載體轉入HEK293細胞中。使用化學轉染試劑PEI，按廠商提供的方案瞬時轉染培養的HEK293細胞。首先在超淨工作臺中準備質粒DNA和轉染試劑，取3mL Opti-MEM培養基(Gibco貨號：31985-070)加入50ml離心管中，加入30μg對應質粒的DNA，利用0.22μm的濾頭過濾含有質粒的Opti-MEM培養基，隨後加入90μg PEI(1g/L)，靜置20min。將DNA/PEI混合物輕柔倒入27mL HEK293細胞並混勻，在37℃，8% CO₂的條件下培養20h後，補加VPA使終濃度至2mM及2%(v/v)Feed，繼續培養6天。

細胞培養後，以13000rpm離心20min，收集上清，用預裝管柱Hitrap Mabselect Sure純化上清液。操作如下：純化前用5倍管柱體積的平衡液(0.2M Tris,1.5M NaCl,pH7.2)平衡填料管柱；將收集的上清藉由管柱，再用10倍管柱體積的平衡液清洗填料管柱，去除非特異性結合蛋白；用5倍管柱體積的沖提緩衝液 (1M sodium citrate，pH 3.5)沖洗填料，收集沖提液；每1ml沖提液加入80μL Tris(2M Tris)，使用超濾濃縮管交換到PBS緩衝液中，並測定濃度。取100μg純化後蛋白，調整濃度至1mg/mL，使用凝膠過濾色譜管柱測定IL-2-Fc-二聚體蛋白純度。結果如表2所示。圖3顯示了表2中列出的本發明IL-2突變體的序列。

表2. IL-2-FC在293細胞中表達量和純度

IL-2 ^mutant -FC與其受體的親和力測定

採用生物膜干涉技術(ForteBio)測定法測定本發明IL-2^mutant-FC與其受體的平衡解離常數(K_D)。

ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs, 2013.5(2)：p.270-8)進行。簡言之，按如下方式測量候選IL-2^mutant-FC分別與IL-2R α，IL-2R β的親和力：傳感器在分析緩衝液中線下平衡20分鐘，然後線上檢測120秒建立基線；加載人生物素化標記的IL-2R α或IL-2R β至SA傳感器(PALL,18-5019)上進行ForteBio親和力測量；將已加載生物素化標記的IL-2R α或IL-2R β的傳感器置於含100nM IL-2^mutant-FC的溶液中直至平臺期，之後將傳感器轉移至分析緩衝液解離至少2分鐘，用於結合和解離速率測量。使用1：1結合模型進行動力學的分析。

在如以上測定法所述進行的實驗中，由HEK293-F表達的IL-2^mutant-FC與其受體的親和力K_D值如表3所示。作為對照，以相同方法測定的IL-2^WT-FC與IL-2^3X-FC融合蛋白的親和力K_D值也顯示在表3中。

表3. IL-2^mutant-FC與其受體的親和力K_D值

註：N.B：不結合

從親和力數據可知，從IBYDL029文庫獲得的上述突變體都滿足了阻斷IL-2R α的結合。

實施例2：IL-2嵌合和截短突變體的構建、篩選及鑑定

IL-2 B’C’loop嵌合體和截短體的設計

B’C’loop：IL-2的B helix與C helix的連接序列(圖2A)，包括A73-R83共11個胺基酸。

比較IL-2單體(PDB：1M47)和複合物的晶體結構(PDB：2ERJ)，我們發現在IL-2單體的晶體結構中B’C’loop是缺失的，這是由於B’C’loop在溶液中非常活躍，無法形成相對穩定的構象。

藉由對B’C’loop進行基因工程改造，增加B’C’loop的穩定性，從而增加IL-2的穩定性。因此我們比對了人IL15晶體結構(PDB：2Z3Q)，發現它的B’C’loop較短且穩定(圖2B)。因此我們設計了一個IL-2嵌合分子(L017)和4個截短體分子(L057~L060)(見表4)。

表4. IL-2 B’C’loop優化序列

表達質粒的構建

野生型IL-2(uniprot：P60568，aa21-153，C125S，簡稱IL-2^WT)，以及IL-2突變體IL-2^3X(R38D,K43E,E61R)、B’C’loop嵌合體和截短體，藉由GSGS連接序列與人IgG1的Fc(L234A，L235A，簡稱FcLALA，SEQ ID NO：12)連接，並構建到pTT5載體上，用以表達如下蛋白：

將B’C’loop嵌合體(Y017)或截短體(Y057)與文庫篩選得到的突變體Y30E1(K35E、T37E、R38E、F42A)組合，藉由2個GGGGS與FcLALA連接，並構建到pCDNA3.1的載體上，用於表達以下蛋白。其中，Y092具有嵌合B’C’loop環序列AGDASIH；Y144在Y092的基礎上增加了T3A胺基酸取代，以去除IL-2的N末端O糖修飾。

此外，也將IL-2^WT和IL-2^3X藉由2個GGGGS與FcLALA連接，並構建到pCDNA3.1的載體上，用以表達以下蛋白：

上述蛋白分子的具體序列信息見序列表。

融合蛋白的表達純化

上述蛋白分子分別在293細胞和CHO細胞中表達。在HEK293細胞中的表達按實施例1中用於IL-2-Fc融合蛋白表達的方法進行。在CHO細胞中的表達按如下進行。

根據所需細胞體積傳代ExpiCHO細胞(Invitrogen)，轉染前一天將細胞密度調整至3.5×10⁶個細胞/ml。轉染當天檢測細胞密度(約為8~10×10⁶個細胞/ml)，活力達到95%以上，用ExpiCHO^TM Expression Medium(Gibco貨號：A29100-01)將細胞密度調整至6 x10⁶個細胞/ml。取終體積8%(v/v)的OptiPRO^TM SFM(Gibco貨號：12309-019)作為轉染緩衝液，加入對應量(0.8μg/mL細胞)的質粒，混勻，用0.22μm濾膜過濾除菌，按照3.2μL/mL細胞比例加入ExpiFectamine^TM CHO Transfection Kit(Gibco，貨號：A29130)裡的reagent。將轉染試劑與質粒DNA形成的複合物室溫放置孵育1~5min，然後緩慢加到細胞中，在37℃，8% CO₂的條件 下培養18h後加入0.6%(v/v)的Enhancer和30%(v/v)的Feed，繼續培養6天。

在細胞培養後，細胞培養液以13000rpm離心20min，收集上清，用預裝管柱Hitrap Mabselect Sure(GE,11-0034-95)純化上清液。操作如下：純化前用5倍管柱體積的平衡液(20mM Tris,150mM NaCl,pH7.2)平衡填料管柱；將收集的上清藉由管柱，再用10倍管柱體積的平衡液清洗填料管柱，去除非特異性結合蛋白；用5倍管柱體積的沖提緩衝液(100mM sodium citrate，pH 3.5)沖洗填料，收集沖提液。每1ml沖提液加入80μL Tris(2M Tris)，使用超濾濃縮管(MILLIPORE，貨號：UFC901096)交換到PBS緩衝液(Gibco，貨號：70011-044)中，並測定濃度。取100μg純化後蛋白，調整濃度至1mg/mL，使用凝膠過濾色譜管柱SW3000(TOSOH貨號：18675)測定蛋白純度。

B’C’loop嵌合體(Y017)和截短體(Y057/058/059)的融合蛋白相比於野生型IL-2的融合蛋白(Y001)，在HEK293細胞中的表達量和一步親和層析純度都有很大的提高。結果見下表5。

表5. IL-2突變體在HEK293的表達量和純度

包含B’C’loop嵌合體(Y092和Y144)和截短體(Y089)以及進一步突變Y30E1的融合蛋白，相比於野生型IL-2的融合蛋白(Y045)，在CHO細胞中的表達量和一步親和層析純度上，也表現出有很大的提高。結果見下表6。

表6. IL-2突變體在CHO的表達量和純度

綜合上述數據可知：1)藉由酵母文庫篩選得到的Y30E1等點突變分子可以阻斷IL-2R α的結合；2)B’C’loop嵌合分子和截短分子增加了分子的表達量和純度；3)Y30E1與B’C’loop突變體的組合分子達到了既阻斷IL-2R α，又提高了分子的表達量和純度。

突變體的體外功能實驗

藉由檢測各IL-2^mutant-FC對原代人CD8⁺ T細胞p-STAT5信號的激活，檢查各突變體對CD25⁺細胞和CD25^-細胞的激活作用。具體步驟如下：

1.復甦PBMC細胞：

a)從液氮取出PBMC細胞(Allcells貨號：PB005F，100M裝)，迅速 置於37℃水浴鍋中，復甦PBMC細胞；

b)將細胞加入10mL已預熱的、含5%人AB血清(GemCell貨號：100-512)與1‰ DNA酶(STRMCELL貨號：07900)的X-VIVO15(Lonza貨號：04-418Q)培養基中，400G、25℃離心10分鐘(後續離心均為此條件)洗滌一次；

c)加入20mL培養基重新懸浮細胞，37℃二氧化碳培養箱靜置培養過夜。

2.純化人CD8⁺ T細胞：

a)吸取步驟1中懸浮細胞液，離心棄上清；

b)加入1mL Robosep緩衝液(STEMCELL貨號：20104)與100μL人AB血清及100μL人CD8⁺ T細胞純化試劑盒(Invitrogen貨號：11348D)中負性篩選抗體混合液重新懸浮細胞；

c)混勻後，4℃孵育20分鐘，每5分鐘搖晃一次；

d)孵育後，加入10mL Robosep緩衝液，離心洗滌兩次；

e)同時，取1mL磁性微球(人CD8⁺ T細胞純化試劑盒)，加入7mL Robosep緩衝液置於磁力架上1分鐘棄上清，預洗磁性微球；

f)各加入1mL Robosep緩衝液分別重新懸浮微球與細胞，混勻後室溫旋轉孵育30分鐘；

g)孵育後，加入6mL Robosep緩衝液，置於磁力架上1分鐘，收集上清；

h)收集液再次置於磁力架上1分鐘，收集上清；

i)離心棄上清，使用預熱的T培養基重新懸浮，調整密度至1×10⁶/mL；

j)取1/3細胞待後需刺激CD25表達，其餘細胞置於37℃二氧化碳培養箱靜置過夜培養。

3.刺激CD8⁺ T細胞表達CD25：

a)取1/3步驟2中純化後的CD8⁺ T細胞，加入抗人CD3/CD28抗體的磁性微球(GIBCO貨號：11131D)，細胞與微球的比例為3：1；

b)置於37℃二氧化碳培養箱靜置三天；

c)加入10mL培養基清洗2次；

d)加入培養基調整細胞密度至1×10⁶/mL，37℃二氧化碳培養箱中靜置培養2天。

4.檢測細胞純度與表達水平：

a)使用抗人CD8-PE抗體(Invitrogen貨號：12-0086-42)、抗人CD25-PE抗體(eBioscience貨號：12-0259-42)、同型對照抗體(BD貨號：556653)檢測細胞的CD8與CD25；

b)步驟2中細胞為CD8⁺CD25^-T細胞，步驟3中細胞為CD8⁺CD25⁺T細胞。

5.檢測各IL-2^mutant-FC對CD8⁺ CD25^- T細胞激活p-STAT5信號的EC₅₀：

a)取CD8⁺ CD25^-T細胞，以每孔1×10⁵細胞鋪96孔U底培養盤(Costar貨號：CLS3799-50EA)；

b)加入100μL各IL-2^mutant-FC、商品化IL-2(R&D貨號：202-IL-500)、IL-2^WT-FC、IL-2^3X-FC，最高濃度從266.7nM開始4倍梯度稀釋共12個梯度，37℃培養箱中孵育20分鐘；

c)加入55.5μL 4.2%甲醛溶液，室溫固定10分鐘；

d)離心棄上清，加入200μL冰甲醇(Fisher貨號：A452-4)重新懸浮細胞，4℃冰箱孵育30分鐘；

e)離心棄上清，用200μL染色緩衝液(BD貨號：554657)洗滌3次；

f)加入200μL含抗p-STAT5-AlexFlour647(BD貨號：562076，1：200稀釋)的破膜/固定緩衝液(BD貨號：51-2091KZ)，室溫避光孵育3小時；

g)使用染色緩衝液洗滌三次，100μL染色緩衝液重新懸浮細胞，進行流式細胞儀檢測；

h)以IL-2分子的濃度為橫坐標、AlexFlour647中間螢光度值為縱坐標，製作p-STAT5信號的EC₅₀值，結果下表7所示。

6.檢測各IL-2^mutant-FC對CD8⁺CD25⁺ T細胞激活p-STAT5信號的EC₅₀：

a)取CD8⁺ CD25⁺ T細胞，以每孔1×10⁵細胞鋪96孔U底培養盤；

b)同步驟5中b-h，製作p-STAT5信號的EC₅₀值，結果如表7所示。

表7. IL-2突變體激活CD25^+/- T細胞中p-STAT5信號的EC₅₀及其比值

實施例3：IL-2弱化突變體設計

IL-2弱化分子的設計

為了進一步改進IL-2突變體的藥物動力學(PK)和延長分子的半衰期，同時降低分子的毒性。根據分析IL-2複合物的晶體結構(圖4)(PDB：2ERJ)，選擇IL-2與IL-2R β接觸界面的胺基酸進行突變，以降低它們之間的親和力。

基於IL-2R α的結合界面胺基酸突變，IL-2 B’C’loop優化和IL-2R β γ結合界面胺基酸突變，並基於兩種format形式進行驗證，分子設計見表8。任選地，這些分子可以進一步包含T3A突變，以去除IL2 N末端的O糖修飾。

表8. IL-2突變體的設計

根據上述設計，具體構建了具有如下序列結構(從N端至C段)的IL-2^mutant，以用於表達產生Format 1分子：

-具有胺基酸序列SEQ ID Nos：37-638的IL-2突變序列；

-接頭序列GGGGSGGGGS；

-SEQ ID NO：12的Fc序列。

根據上述設計，具體構建了具有如下序列結構(從N端至C段)的IL-2^mutant-Fc.Knob和Fc.Hole，以用於表達產生Format 2分子：

(1)IL-2^mutant-Fc.Knob

-具有胺基酸序列SEQ ID Nos：37-638的IL-2突變序列；

-接頭序列GGGGSGGGGS；

-SEQ ID NO：9的Fc.Knob序列；和

(2)Fc.Hole

-SEQ ID NO：10的Fc.Hole序列。

IL-2弱化突變體的表達純化及其與受體的親和力測定

Format1是將IL-2突變體藉由2個G4S連接到IgG1FcLALA的N末端，構建二價的IL-2突變體分子。Format2是基於Knob in hole的IgG1FcLALA的異源二聚體，其中IL-2突變體分子藉由2個G4S連接到IgG1FcLALA-Knob的N末端，構建單價的IL-2突變體分子。所有的序列都構建到pcDNA3.1的載體上。

蛋白的表達純化：實驗方法同實施例2。

採用生物光干涉測量(ForteBio)測定法測定本發明上述IL-2突變體與其受體的平衡解離常數(KD)。

ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.Mabs,2013.5(2)：p.270-8)進行。測量候選分子分別與IL-2R α，IL-2R β和IL-2R β γ的親和力：傳感器在分析緩衝液中線下平衡20分鐘，然後線上檢測120秒建立基線；加載人生物素化標記的IL-2R α或IL-2R β或IL-2R β γ至SA傳感器(PALL,18-5019)上進行ForteBio親和測量；將已加載IL-2受體的傳感器置於含100nM IL-2突變體分子的溶液中直至平臺期，之後將傳感器轉移至分析緩衝液解離至少2分鐘用於結合和解離速率測量。使用1：1結合模型進行動力學的分析。

實驗結果見表9。相對於野生型(Y045)，IL-2突變體在表達量和純度都得到了提升，同時引入IL-2R β γ結合界面胺基酸突變使得與IL-2R β和IL-2R β γ的親和力得到了不同程度的降低。下表中分子的結構見圖6。

表9. IL-2突變體在HEK293表達及其與IL-2受體的親和力

註：“-”表示未檢測；“N.B.”表示不結合

實施例4：IL-2突變體體外功能實驗

IL-2突變體在人的T淋巴細胞中pSTAT5信號檢測

IL-2與T細胞表面IL-2 receptor結合，會激活人的T淋巴細胞JAK-STAT信號通路，其中STAT5磷酸化水平是評判該信號通路激活水平的重要指標。正常T淋巴細胞基本不表達IL-2R α。藉由檢測IL-2突變體分子對T淋巴細胞pSTAT5信號，來評估不同的IL-2突變體分子對人的T細胞激活活性的強弱。

實驗材料和方法：

實驗方法：

1. PBMC胞復甦

(1)、取液氮凍存PBMC細胞(All Cells，貨號PB004F-C，編號 LP191011A/LP190529)，37℃快速搖動融化。

(2)、將細胞緩慢加入10ml CTS培養基(Gibco，貨號A3021002，批號1989823，37℃預熱，並含有100ul DNA酶)。

(3)、離心300g/8min，去除上清。

(4)、用10ml CTS重新懸浮，轉移至T75培養瓶(NUNC，貨號156499)，37℃ 5%培養箱穩定過夜。

2. pSTAT5實驗

(1)、取PBMC過夜培養懸浮細胞，細胞鋪96孔U型盤(Cornning，貨號CLS3799-50EA)，細胞數量5x10⁵ cells/well。

(2)、分別將不同稀釋檢測抗體加入96孔U型盤，待檢測抗體與細胞37℃孵育30min。

(3)、400g/5min離心，去除上清。

(4)、按照200ul/孔，加入4%組織細胞固定液(Solarbio，貨號：P1110)，常溫離心400g/30min。

(5)、按照200ul/孔，加破膜液(BD，貨號：558050)，4℃靜置30min，離心400g/10min。

(6)、按照200ul/孔，加入perm/wash Buffer(BD，貨號558050，批號7271605)，細胞洗滌共兩次。

(7)、配置抗體染液，pSTAT5抗體(BD，貨號562076，批號9141872)量為3ul/100ul perm/wash Buffer/well；BV421 anti-human CD3抗體(Biolegend，貨號300434，批號：B271302)，FTIC anti-human CD4抗體(Biolegend，貨號300506，批號：B283935)和AF700 anti-human CD8a(Biolegend，貨號300924，批號：B253967)分別為 1ul/100ul perm/wash Buffer/well；室溫孵育1.5h，perm/wash Buffer洗滌2次。

(8)、150ul perm/wash Buffer/well重新懸浮，流式檢測。

實驗結果：

IL-2突變分子在正常T淋巴細胞(CD4+ T cells，CD8+ T cells)中pSTAT5功效檢測結果如圖7A、圖7B、圖7C、圖7D和圖7E。

CD4+和CD8+ T細胞的磷酸化水平代表了細胞的增殖能力和細胞的活性。從圖7和表10，可以看出藉由突變IL-2R β結合界面一個或多個胺基酸，使得IL-2突變體相對於IL-2R β結合界面未做突變的分子Y-144(format1)和2688(format2)，對T細胞的磷酸化水平得到不同程度的降低。

表10. IL-2突變體對CD4+或者CD8+T細胞的激活活性的下降倍數

IL-2突變體在活化T淋巴細胞中pSTAT5信號檢測

IL-2與T細胞表面IL-2受體結合，會激活T淋巴細胞JAK-STAT信號通路，其中STAT5磷酸化水平是評判該信號通路激活程度的重要指標。T淋巴細 胞被激活活化後，使T細胞表面的IL-2 R α(CD25)豐度得到顯著增加。

實驗方法：

1. PBMC細胞復甦

(1)、取液氮凍存PBMC細胞(All Cells，貨號PB004F-C，編號LP191011A)，37℃快速搖動融化。

(2)、將細胞緩慢加入10ml CTS培養基(Gibco，貨號A3021002，批號1989823，37℃預熱，並含有100ul DNA酶)。

(3)、離心300g/8min，去除上清。

(4)、用10ml CTS重新懸浮，轉移至T75培養瓶(NUNC，貨號156499)，37℃5%培養箱(Thermo，貨號3111)穩定過夜。

2. T淋巴細胞活化和靜息

(1)、取過夜培養PBMC中懸浮細胞，細胞計數，加入等細胞數量CD3/CD28 Beads(Invitrogen，貨號11131D，批號：00783216)活化刺激48h。

(2)、去除Beads和培養基洗滌活化細胞。

(3)、活化細胞轉至T75培養瓶，37℃ 5%靜息48h。

3. pSTAT5實驗

(1)、細胞鋪96孔U型盤(Cornning，貨號CLS3799-50EA)，細胞數量5x10⁵ cells/well。

(2)、分別將不同稀釋檢測抗體加入96孔U型盤，待檢測抗體與細胞37℃孵育30min。

(3)、400g/5min離心，去除上清。

(4)、按照200ul/孔，加入4%組織細胞固定液(Solarbio，貨號：P1110)， 常溫離心400g/30min。

(5)、按照200ul/孔，加破膜液(BD，貨號：558050)，4℃靜置30min，離心400g/10min。

(6)、按照200ul/孔，加入perm/wash Buffer(BD，貨號558050，批號7271605)，細胞洗滌共兩次。

(7)、配置抗體染液，pSTAT5抗體(BD，貨號562076，批號9141872)量為3ul/100ul perm/wash Buffer/well，BV421 anti-human CD3抗體(Biolegend，貨號300434，批號：B271302)，FTIC anti-human CD4抗體(Biolegend，貨號300506，批號：B283935)和AF700 anti-human CD8a(Biolegend，貨號300924，批號：B253967)分別為1ul/100ul perm/wash Buffer/well；室溫孵育1.5h，perm/wash Buffer洗滌2次。

(8)、150ul perm/wash Buffer/well重新懸浮，流式檢測。

實驗結果

IL-2突變分子在CD8⁺T細胞，CD4⁺CD25^-T細胞，NK細胞(CD3^- CD56⁺)和Treg細胞(CD3⁺CD4⁺CD25⁺)中pSTAT5功效檢測結果如圖8A-G和表11-12。從結果可以看出，本研究的IL-2突變體對淋巴細胞的pSTAT5活性都要弱於人的野生型IL-2(rhIL-2，R&D systems，貨號：202-IL)；同時相對於其他淋巴細胞，本研究的IL-2突變體分子對Treg細胞顯示出了極大的選擇性。

表11. rhIL-2和IL-2突變體對不同的淋巴細胞的pSTAT5的EC₅₀

表12. IL-2突變體對Treg細胞的選擇相對於其他淋巴細胞的倍數

實施例5：IL-2突變分子體內抗腫瘤藥效

為了證明IL-2突變分子的抗腫瘤體內藥效，我們採用MC38細胞接 種C57小鼠測定本發明的IL-2突變分子(Y144、2113、2162)的抗腫瘤藥效(分子2113和2162的結構見圖6)。實驗使用SPF等級的雌性C57小鼠(14-17g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號為NO.110011201109499961)。

將MC38細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞，以PBS(1×)分散MC38細胞，製備成細胞濃度為5×10⁶個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至C57小鼠右側腹部區域中來建立MC38荷瘤小鼠模型。

腫瘤細胞接種7天後檢測各隻小鼠腫瘤體積，進行分組(每組6隻小鼠)，給藥劑量和方式如表13、14所示，分別在接種後第7、14、21天給藥，每週2次監測小鼠腫瘤體積與體重，如圖9A和9B所示，監測至25天後結束。接種後第25天計算相對腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：TGI%=100% *(對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。腫瘤體積測定：採用游標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L*W²/2。採用電子天平測定體重。

表13. 實驗設計表(註：每隔7天給藥，共3次)

* h-IgG：購自Equitech-Bio，批號161206-0656，1g/瓶，用PBS配製成10mg/ml

腫瘤體積檢測見圖9A。在接種後第25天，與h-IgG對比，弱化IL-2分子2113(3mg/kg)、2162(3mg/kg)單藥抑制率分別為71.4%、33.8%。結果顯示，改造後IL2分子(2113、2162)具有抗腫瘤作用，且具有劑量效應。同時我們對小鼠體重進行檢測，結果如圖9B、9C所示，分子2113(1mg/kg)、2162(1mg/kg)、2162(3mg/kg)組小鼠體重無顯著差異。相較而言，在施用未進行弱化的分子Y144的組中，小鼠不耐受，在25天的監測期結束前死亡。

在另外一個MC38腫瘤模型中證明我們另外幾個IL-2突變分子(Y045、2478、2454)的抗腫瘤體內藥效(分子2478和2454的結構見圖6)。本實驗MC38荷瘤小鼠實驗使用SPF等級的雌性C57小鼠(14-17g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號為NO.110011201109499826)。實驗基本如前述進行。

腫瘤細胞接種7天後檢測各隻小鼠腫瘤體積，進行分組(每組7隻小鼠)，給藥劑量和方式如表14所示，分別在接種後第7、14、21天給藥，每週2-3次監測小鼠腫瘤體積與體重，如圖10A、10B所示，監測至25天後結束。接種後第25天計算相對腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：TGI%=100% *(對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。腫瘤體積測定：採用游標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L*W²/2。採用電子天平測定體重。

表14. 實驗設計表(註：每隔7天給藥，共3次)

* h-IgG：購自Equitech-Bio，批號161206-0656，1g/瓶，用PBS配製成10mg/ml

腫瘤抑制率結果如表15所示：在接種後第25天，與h-IgG對比，分子Y045(1mg/kg)、2478(1mg/kg)、2454(1mg/kg)、Y045(3mg/kg)、2478(3mg/kg)、2454(3mg/kg)單藥抑制率分別為5.3%、39.1%、15.6%、19.8%、52.6%、23.0%。結果顯示，未改造IL2分子(Y045)具有抗腫瘤作用，且具有劑量效應；改造後的弱化IL2分子(2478、2454)具有抗腫瘤作用，具有劑量效應，但藥效比未改造IL2分子(Y045)好。同時我們對小鼠體重進行檢測，結果如圖10B，10C所示小鼠體重無顯著差異。

表15. 第25天腫瘤抑制率

實施例6：IL-2突變體分子在自身免疫方面體內研究

為了證明IL-2弱化分子在自身免疫方面的潛力，我們採用C57小鼠於給藥前以及給藥後第3、7天採血測定本發明的IL-2弱化分子的對免疫細胞的影響。實驗使用SPF等級的雌性C57小鼠(14-17g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號為NO.110011201109500076)。

將30隻C57小鼠，進行隨機分組(每組6隻小鼠)，給藥劑量和方式如表16所示，單次給藥，每週2次監測小鼠體重，如圖11A，11B所示，監測至7天後結束。給藥前、給藥後第3、7天對小鼠進行採血，檢測血液中Treg、NK、CD4 T conv(CD4+Foxp3-)、CD8⁺ T細胞在CD45⁺ T淋巴細胞總數中的占比變化情況，如圖11c、11d、11e、11f所示。

所測分子2602為包含野生型IL-2^WT序列SEQ ID NO：1的Format 2型IL-2-Fc二聚體分子；弱化分子3079、3055和3082的結構見圖6，也均為Format 2型 IL-2-Fc二聚體分子。

從結果可以得出，本研究的IL-2突變分子弱化了對IL-2R β結合，從而導致了IL-2突變分子對促炎的NK細胞的增殖刺激弱於野生型的IL-2分子2602(IL-2^WT)，但仍然保持了對免疫抑制細胞Treg細胞的擴增，IL-2突變分子對Treg增殖幅度相似。並且IL-2突變分子對於CD4 T conv和CD8 T細胞並沒有產生明顯的增殖作用，這一結果提示，藉由對IL-2與IL-2R β結合位點的突變能夠大幅度提高其對Treg與其他免疫細胞的選擇性。

表16. 實驗設計表(註：SD：Single dose，單次給藥)

* h-IgG：購自Equitech-Bio，批號161206-0656，1g/瓶，用PBS配製成10mg/ml

序列表的描述

本發明構建的IL-2二聚體分子具體描述如下表。其中，”IL-2序列SEQ ID NO”欄給出了分子的IL-2部分的胺基酸序列；“IL-2部分注釋”欄，藉由“SEQ ID NO：”欄的胺基酸序列和“突變”欄中的突變，描述該分子的IL-2胺基酸序列由帶有該突變的該SEQ ID NO：胺基酸序列組成；“format1”表示分子為同二聚體，每個單體(從N端到C端)由所示IL-2胺基酸序列、接頭序列(G4S)2和SEQ ID NO：12順序連接形成；”format 2”表示分子為異二聚體，一個單體(從N端到C端)由所示IL-2胺基酸序列、接頭序列(G4S)2和SEQ ID NO：9順序連接形成，另一個單體由SEQ ID NO：10組成。

Claims (26)

1. 一種IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，與較佳人IL-2，更佳包含SEQ ID NO：1序列的IL-2的野生型IL-2相比，包含突變：

   (i)在IL-2與IL-2R α結合界面上，尤其是在選自位置35、37、38、41、42、43、45、61、68和72的至少一個位置上，具有改變或消除或降低對IL-2R α受體的結合親和力的突變；

   和/或

   (ii)縮短的B’C’環區(即，連接胺基酸殘基aa72和aa84的序列)，較佳地，該縮短的環區具有小於10、9、8、7、6、或5個的胺基酸長度，且較佳7個胺基酸長度；較佳地，該縮短的B’C’環區導致改善的蛋白表達量和/或純度，

   且包含突變：

   (iii)在IL-2與IL-2R β γ結合界面上，尤其是在選自位置12、15、16、19、20、84、87、88、91、92、95、126的至少一個位置上，具有弱化對IL-2R β γ受體的結合的突變；

   其中胺基酸位置根據SEQ ID NO：1編號，

   較佳地，該突變蛋白包含突變(i)和(iii)或包含突變(ii)和(iii)，或包含突變(i)、(ii)和(iii)，

   更佳地，該突變蛋白包含突變(ii)和(iii)但不包含突變(i)。
2. 如請求項1所述的IL-2突變蛋白，其中，該IL-2R β γ結合界面的突變(iii)包含選自以下的突變：

   L12R；L12K；L12E；L12Q；E15Q；E15R；E15A；E15S；H16N；H16T；H16Y；H16A；H16E；H16D；H16R；L19D；L19E；L19R；L19S；D20N；

   D20Q；D20E；D20A；D20R；D20S；D84N；D84E；D84Q；D84T；D84S；D84R；D84G；D84M；D84F；D84L；D84K；D84H；S87T；S87R；S87K；S87L；S87M；S87H；N88D；N88T；N88Q；N88R；N88E；N88K；N88H；N88M；N88S；N88L；V91I；V91L；V91D；V91E；V91N；V91Q；V91S；V91H；I92E；I92T；I92K；I92R；I92L；E95Q；E95G；E95D；E95N；Q126E；Q126D；Q126A；Q126S；D84N+E95Q；D84E+E95Q；D84T+E95Q；D84Q+E95Q；D84T+ H16T；D84N+ V91I；D84T+ Q126E；D84N+Q126E；H16T +D84Q；H16T+ V91I；

   較佳地，該IL-2R β γ結合界面的突變(iii)包含選自以下的突變：

   D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I；

   再佳地，該IL-2R β γ結合界面的突變(iii)包含

   - 選自以下的突變：D84N；E95Q；H16N；或

   - 選自以下的突變：D84Q；H16T+ V91I；或

   - 選自以下的突變：D84T；Q126E；D84N+V91I；D84N+E95Q；或

   - 選自以下的突變：N88D；N88R；D20N；D84N；D84N+ E95Q；D84T+ H16T；D84T+ Q126E；D84N+ Q126E；H16T+ D84Q；或

   -選自以下的突變：D84N或D84N+ E95Q；

   再佳地，該IL-2R β γ結合界面的突變(iii)包含N88D或D20N或N88R。
3. 如請求項1或2所述的IL-2突變蛋白，其中，該突變(i)包含突變組合K35E+T37E+R38E+F42A，或突變組合K35E+T37E+R38E，或突變F42A；

   較佳地，該突變(i)包含突變組合K35E+T37E+R38E+F42A。
4. 如請求項1至3中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中，該突變(ii)包括：

   (a)對B’C’環區的aa74至aa83的替代，例如替代為來自四螺旋短鏈細胞因子IL家族成員的短B’C’環序列，如IL15的B’C’環序列，較佳地替代為序列GDASIH；或

   (b)對B’C’環區的aa74至aa83的截短，例如自C端截短1、2、3或4個胺基酸；較佳地截短為序列(Q/G)SKN(F/I)H，更佳地，截短為選自以下的序列：

   
5. 如請求項1至4中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，包含：

   (i)突變組合K35E+T37E+R38E+F42A；

   (ii)B’C’環序列：AQSKNFH；或AGDASIH或SGDASIH；

   (iii)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

   D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

   更佳地，該IL-2R β γ結合界面突變：

   - 選自D84N；E95Q；H16N；或

   - 選自D84T；Q126E；D84N+V91I；D84N+E95Q；或

   - 選自N88D；N88R；D20N；D84N+ E95Q；D84T+ H16T；D84T+ Q126E；D84N+ Q126E；H16T+ D84Q；

   以及任選地，(iv)突變T3A。
6. 如請求項1至5中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，保持對IL-2R α受體的結合，且包含：

   (ii)B’C’環序列：AQSKNFH；或AGDASIH或SGDASIH，尤其是AGDASIH；

   (iii)選自以下的IL-2R β γ結合界面突變：

   D20N；D84E；D84N；D84N+E95Q；D84N+Q126E；D84N+V91I；D84Q；D84T；D84T+H16T；D84T+Q126E；E15Q；E95N；E95Q；H16N；H16N +D84N；H16T；H16T+D84Q；H16T+V91I；N88D；N88R；N88Q；N88T；Q126E；V91I

   更佳地，該IL-2R β γ結合界面突變選自：D20N或N88D或N88R；以及任選地，(iv)突變T3A。
7. 如請求項1至6中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，相對於野生型IL-2，還包含不超過0-5個胺基酸突變；較佳地該突變蛋白包含C125S或C125A突變。
8. 如請求項1至7中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白包含

   -與選自SEQ ID NO：37-638(尤其是SEQ ID NO：148或197或SEQ ID NO：489、513、516)的胺基酸序列具有至少90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或98%的同一性的胺基酸序列；

   -選自SEQ ID NO：37-638(尤其SEQ ID NO：148或197或SEQ ID NO：489、513、516)的胺基酸序列。
9. 如請求項1至8中任一項所述的IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白，與引入突變(iii)進行弱化前相比，具有降低的對IL-2R β γ受體的結合親和力，

   且該突變蛋白具有選自以下的至少一項或兩項特性：

   -與野生型IL-2相比，保持IL-2R α結合，或

   -與野生型IL-2相比，在哺乳動物細胞(例如293細胞或CHO細胞)中表達時，例如以Fc融合蛋白形式表達時，改善的表達量和/或易於純化至更高的純度(例如，一步親和層析後，藉由SEC-HPLC檢測，具有更高的純度)。
10. 一種IL-2突變蛋白的融合蛋白，其包含根據如請求項1至9中任一項所述的IL-2突變蛋白。
11. 如請求項10所述的融合蛋白，其中該IL-2突變蛋白與Fc抗體片段(例如人IgG1 Fc)融合，

    較佳地該IL-2突變蛋白藉由接頭與Fc融合，該接頭較佳為GSGS，更佳為(G4S)₂，

    較佳地該Fc片段包含降低或消除Fc與Fc γ R結合的突變，例如L234A+L235A，

    較佳地該Fc片段與SEQ ID NO：12至少85%，至少95%，至少96%或100%的同一性的胺基酸序列。
12. 如請求項11所述的融合蛋白，其中該Fc片段包含Knob突變，例如突變T366W和S354C；或該Fc片段包含Hole突變，例如突變Y349C、T366S、L368A、Y407V。
13. 一種IL-2-Fc二聚體蛋白，其包含如請求項11或12所述的IL-2突變蛋白的融合蛋白，

    較佳地，該二聚體蛋白，相比於包含野生型IL-2-Fc融合蛋白的相應二聚體蛋白，具有以下特性之一項或多項：

    -在哺乳動物細胞(例如CHO或HEK293細胞)中表達時，表達量和/或純度增加；

    -體內施用時低毒性，例如藉由測定施用後動物體重或體重變化來確定；

    -更佳的抗腫瘤功效。
14. 如請求項13所述的IL-2-Fc二聚體蛋白，其是同二聚體，其中第一單體和第二單體分別由自N端到C端包含：i)IL-2突變蛋白；ii)接頭；和iii)Fc片段，

    較佳地每個單體包含在C端藉由接頭(G4S)2連接SEQ ID NO：12胺基酸序列的、選自SEQ ID NO：37-638的IL-2突變蛋白。
15. 如請求項13所述的IL-2-Fc二聚體蛋白，其是異二聚體，包含：

    a)第一單體，其中該第一單體自N端到C端包含：i)IL-2突變蛋白；ii)接頭；和iii)第一Fc片段；和

    b)第二單體，其中該第二單體包含第二Fc片段以及任選地IgG1鉸鏈區；

    較佳地，第一Fc片段和第二Fc片段分別包含促進第一單體與第二單體形成異二聚體的第一和第二異二聚化突變，

    較佳地，第一和第二異二聚化突變包含Knob：Hole突變組合T366W/S354C：Y349C/T366S/L368A/Y407V；

    較佳地，第一Fc片段上的第一異二聚體突變包含Knob突變，第二Fc片段的第二異二聚體突變包含Hole突變；或者，第一Fc片段上的第一異二聚體突變包含Hole突變，第二Fc片段的第二異二聚體突變包含Knob突變；

    較佳地，第一單體包含在C端藉由接頭(G4S)2連接SEQ ID NO：9胺基酸序列的、選自SEQ ID NO：37-638的IL-2突變蛋白；且第二單體包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列。
16. 一種免疫綴合物，其包含如請求項1至9中任一項所述的IL-2突變蛋白和抗原結合分子，較佳地，抗原結合分子是免疫球蛋白分子，特別是IgG分子，或抗體、或抗體片段，特別是Fab分子和scFv分子。
17. 一種分離的多核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項所述的IL-2突變蛋白或如請求項10至12中任一項所述的融合蛋白或如請求項13至15中任一項所述的IL-2-Fc二聚體蛋白或如請求項16所述的免疫綴合物。
18. 一種表達載體，其包含如請求項17所述的多核苷酸。
19. 一種宿主細胞，其包含如請求項17所述的多核苷酸或如請求項18所述的載體，較佳該宿主細胞是哺乳動物細胞，特別是HEK293細胞或CHO細胞，和酵母。
20. 一種用於生產如請求項1至9中任一項所述的IL-2突變蛋白或如請求項10至12中任一項所述的融合蛋白或如請求項13至15中任一項所述的IL-2-Fc二聚體蛋白或如請求項16所述的免疫綴合物方法，包括，在適於表達該IL-2突變蛋白或融合蛋白或IL-2-Fc二聚體蛋白或免疫綴合物的條件下，培養如請求項19所述的宿主細胞。
21. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至9中任一項所述的IL-2突變蛋白或如請求項10至12中任一項所述的融合蛋白或如請求項13至15中任一項所述的IL-2-Fc二聚體蛋白或如請求項16所述的免疫綴合物和藥學可接受載體。
22. 一種治療受試者疾病的方法，該方法包括，向該受試者施用如請求項1至9中任一項所述的IL-2突變蛋白或如請求項10至12中任一項所述的融合蛋白或如請求項13至15中任一項所述的IL-2-Fc二聚體蛋白或如請求項16所述的免疫綴合物或如請求項21所述的醫藥組成物，較佳地，該疾病是癌症或自身免疫病。
23. 一種刺激受試者免疫系統的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的如請求項1至9中任一項所述的IL-2突變蛋白或如請求項10至12中任一盎所述的融合蛋白或如請求項13至15中任一項所述的IL-2-Fc二聚體蛋白或如請求項16所述的免疫綴合物或如請求項21所述的醫藥組成物。
24. 一種用於獲得IL-2突變蛋白的方法，其中該方法包括如下步驟：

    -在IL-2的B’C’環區藉由突變以縮短該環序列，以及任選地在IL-2與IL-2R β γ結合界面引入一個或多個突變和/或在IL-2與IL-2Ra的結合界面引入一個或多個突變，

    -在哺乳動物細胞(例如HEK293或者CHO細胞)中表達IL-2突變蛋白，例如以Fc融合物形式(例如FcLALA融合物)，

    或者該方法包括如下步驟：

    -在IL-2與IL-2R β γ結合界面引入一個或多個突變，以及任選地在IL-2的B’C’環區藉由突變以縮短該環序列和/或在IL-2與IL-2Ra的結合界面引入一個或多個突變，較佳地不在IL-2與IL-2Ra的結合界面引入突變，

    -在哺乳動物細胞(例如HEK293或者CHO細胞)中表達IL-2突變蛋白，例如以Fc融合物形式(例如FcLALA融合物)，

    較佳地，該縮短的環區具有小於10、9、8、7、6或5個的胺基酸長度，且較佳7個胺基酸長度，

    更佳地該B’C’環區突變包括：

    (a)對B’C’環區的aa74至aa83的替代，例如替代為來自四螺旋短鏈細胞因子IL家族成員的短B’C’環序列，如IL15的B’C’環序列，較佳地替代序列包括GDASIH；或

    (b)對B’C’環區的aa74至aa83的截短，例如自C端截短1、2、3或4個胺基酸；較佳地截短為序列(Q/G)SKN(F/I)H，更佳地，截短為選自以下的序列：

    

    

    較佳地，該IL-2R β γ結合界面突變包括如請求項1或2所述的IL-2R β γ結合界面突變；

    較佳地，該IL-2R α結合界面突變包括如請求項1或3所述的IL-2R α結合界面突變；

    較佳地，該突變蛋白具有如下改善的性質之一或其任何組合：(i)改善的表達量和/或蛋白純度(例如，藉由SEC-HPLC檢測，一步親和層析後的純度)；(ii)弱化的IL2R β結合和/或(iii)改變的IL-2Ra結合，較佳地具有(i)和(ii)的性質。
25. 一種IL-2蛋白B’C’環區改造方法，該方法包括：

    (a)對B’C’環區的aa74至aa83的替代，例如替代為來自四螺旋短鏈細胞因子IL家族成員的短B’C’環序列，如IL15的B’C’環序列，較佳地替代序列包括GDASIH；或

    (b)對B’C’環區的aa73至aa83的替代，例如替代為來自四螺旋短鏈細胞因子IL家族成員的短B’C’環序列，如IL15的B’C’環序列，較佳地替代序列包括AGDASIH；或

    (c)對B’C’環區的aa74至aa83的截短，例如自C端截短1、2、3或4個胺基酸；較佳地截短為序列(Q/G)S(K/A/D)N(F/I)H，更佳地，截短為選自以下的序列：

    

    
26. 一種IL-2蛋白，由如請求項25所述方法改造得到。

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