TW202141038A - 一種通過檢測或調節一組體內脂質種類以診斷和治療哮喘的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種透過使用一組體內脂質種類以診斷哮喘的方法，其中該體內脂質種類包含LPE 22:6、LPE 20:4、SM 16:0、PE 16:0/22:6、PE 18:0/22:6、PE 18:0/20:4、PE 18:0/18:2、與磷脂膽鹼(PC) 18:0/18:2，該方法係包含將該組體內脂質種類的一截斷比率值(cutoff ratio value)與受試者的體內脂質種類比率進行比較。本發明亦提供一種治療哮喘的方法，包含給予有需要的患者一有效劑量的LEP22:6抑制性調節劑、牛血清白蛋白或人類血清白蛋白。

Description

一種通過檢測或調節一組體內脂質種類以診斷和治療哮喘的方法
本發明係關於一種透過使用一組體內脂質種類以診斷哮喘的方法，較特別地，本發明係關於一種透過將一組體內脂質種類的截斷比率值與受試者體內脂質種類的比率值進行比較以診斷哮喘的方。此外，本發明亦關於一種治療哮喘的方法，其包含給予患有哮喘的個體一有效劑量的LEP 22:6抑制性調節劑、牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
哮喘的病徵包含間歇性的可逆性呼吸道阻塞、持續性的肺臟發炎與呼吸道的過度反應，但由於哮喘有表現型上的異質性，因此目前哮喘的病因與其分子基礎仍不完全。而且，大部分成人哮喘係透過整合臨床策略與選擇各種任意臨床變量來確認其哮喘表現型的特徵，此外，也評估各種炎症與分子標記，及其與不同表現型群的關係。然而，目前就所觀察到的表現型和分子異質性的潛在機制仍尚不清楚，且如何精準的診斷哮喘也仍是一項挑戰，此也導致分辨其機制的複雜性，因為哮喘與慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)或其組合有著共同的呼吸道阻塞問題。因此，亟需開發出可改善哮喘的診斷和治療的疾病特異性標記。
近來，有許多細胞和動物研究提出了幾種合理的環境影響機制，其一致的指出汙染物對活性含氧物(reactive oxygen species，ROS)產生的直接影響，此為造成發炎反應與組織重塑相關機制的匯聚點，此外，增加的氧化壓力反應還會強化多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)及其代謝物(包括，早期脂質過氧化產物Nε-(hexanoyl)-lysine (HEL))的過氧化作用。由於氧化壓力反應增加而導致的結果係與暴露於環境因子有關，因此一系列的酶反應過程會釋放出磷脂質(phospholipid，PL)，並增強了神經鞘脂質(shpingolipid，SL)的代謝，產生具有生物活性的脂質代謝物與關鍵的訊息傳遞介質。磷脂是重新合成的(de novo)，並受到其中包含參與溶血磷脂類與游離脂肪酸生成的磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)，以及溶血磷脂醯基轉移酶(lysophospholipid acyltransferases，LPLATs)之Lands週期重塑過程的調控。然而，磷脂於生理和病理條件下，對於膜恆定的功能與調控仍然定義不清。近來，評估從哮喘患者或慢性阻塞性肺病(COPD)患者所取得的各種生物樣本中特定數目的脂質種類(包括LPA與LPC)的作用，其結果顯示這些脂質在疾病的表現中，具有特定的潛在調節活性。
因此，對上、下游脂質代謝途徑進行全面性的研究，可能揭露出用以描述哮喘特徵，並將哮喘與其他阻塞性呼吸道疾病區別的標記。於本發明中，探討了體內脂質種類的標記，並評估其與哮喘的關係。於是，本發明提供一種透過病例對照設計(case-control design)分析體內磷脂質種類的脂質體學的方法，以檢測是否有任何脂質代謝途徑可揭示得以描述哮喘特徵，並區分哮喘和與其他阻塞性呼吸道疾病的標記。本發明係利用LC-MS/MS與分階段方法，於取自患有哮喘、慢性阻塞性肺病、哮喘-慢性阻塞性肺病重疊症候群(asthma-COPD overlap syndrome，ACOS)，以及正常健康對照組之受試者的血漿樣品，檢測其中的48種磷脂質。結果，於患有哮喘的成人中，有一組8種脂質種類可將哮喘從對照組和其他兩種呼吸道疾病中區分出來，其中LPE22.6還具有可引發肥大細胞反應的生物活性。
於一方面，本發明係提供一種透過檢測一組體內脂質種類以診斷哮喘的方法，其包含：從一受試者收集一生物樣本以確定受試者的體內脂質組成；自該組體內脂質種類的接受者操作特徵(receiver operating characteristic，ROC)曲線中選定一截斷比率值；及將該截斷比率值與受試者的體內脂質比率值進行比較以做診斷。於一實施例中，該生物樣本包括但不限於血漿、血清、痰液、支氣管肺泡灌洗液與呼出氣的冷凝液；於一較佳實施例中，若受試者的體內脂質比率值高於該截斷比率值，則該受試者即可診斷為哮喘患者。
於本發明的一實施例中，該組體內脂質的種類包含水解磷脂醯乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine，LPE) 22:6、LPE20:4、磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE) 18:0/22:6、PE18:0/20:4、PE16:0/22:6、PE18:0/18:2、磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine，PC) 18:0/18:2與神經磷脂(sphingomyelin，SM) 16:0，用於從慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘-慢性阻塞性肺病重疊症候群(ACOS)中區分出哮喘患者。於一較佳實施例中，該組體內脂質種類係包含LPE22:6、LPE20:4、SM16:0與PE16:0/22:6，用於區分哮喘、ACOS與COPD。
於本發明的一實施例中，LPE22:6相對於PE16:0/22:6的截斷比率值為0.028；於本發明的另一實施例中，LPE22:6相對於PE18:0/22:6的截斷比率值為0.03。
另一方面，LPE22:6 (LPE22:6-sn2)可於源自骨髓的肥大細胞(bone marrow-derived mast cell，BMMC)中，誘導去顆粒作用(degranulation)與LTC4的釋放，且LPE22:6的濃度與體內的IL-13、TGF-β濃度，以及與尿液中的氧化標記-HEL濃度呈現正相關。
因此，本發明進一步提供一種治療哮喘的方法，係包含給予有需要的患者一有效劑量的治療劑，其中該治療劑為LPE 22:6抑制性調節劑或一可標靶脂質之生產、代謝與活性的藥劑。
於本發明的一實施例中，該LPE 22:6抑制性調節劑為一用於抑制LPE 22:6之誘發肥大細胞反應與發炎細胞反應等功能的結抗劑；於本發明的另一實施例中，該可標靶脂質之生產、代謝與活性的藥劑包含天然、合成、化學和/或生物物質。
於本發明的另一實施例中，該治療劑為牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)；於本發明的又另一實施例中，該治療劑為人類血清蛋白白蛋白(human serum albumin，HSA)。
於以下實施例中將進一步舉例說明本發明的其他特徵與優點，此些實施例僅用作範例，並非用於限制本發明的範圍。
除非另外定義，否則本文中所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域具通常知識者所知用語的相同含意。
實施例
於以下實施例中將進一步說明與描述本發明的其他特徵與優點，本文中所敘述的實施例僅用於說明，而非用於限制本發明。
實施本發明時須採用包括細胞生物學與細胞培養等常規技術，此皆屬於本領域的通常技術範圍，因此，此類技術皆已於先前技術中充分闡述。
受試者族群
依照既定方案，受試者族群將包括8個醫療中心門診部的成年哮喘患者，於各醫院內簽署知情同意書的所有符合條件的受試者皆納入本次試驗，從2011年至2015年間，年齡大於/等於18歲的患者皆可入選，欲受測的患者須符合以下條件：(1)至少年滿18歲；(2)經醫師診斷為哮喘。醫師對哮喘與其嚴重度的判定皆是根據2008年的全球哮喘創議組織(Global Initiative for Asthma，GINA)公布的指引。所有受試者均接受肺功能檢測(pulmonary function test，PFT)，其包含非侵入氣管的肺功能量計，所有的肺功能檢測皆參照美國胸腔學會(American Thoracic Society)的指引進行，且胸腔科醫師也是參照GINA指引進行哮喘的診斷，而如全球慢性阻塞性肺病倡議組織(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD)的指引中所教示。COPD的診斷則是於使用氣管擴張劑後，若肺功能量計的第一秒吐氣量(forced expiratory volume in 1 second，FEV1)/用力肺活量(forced vital capacity，FVC)小於0.7，則表示出現持續性的氣管阻塞。另外，根據GINA與GOLD所聯合發布的文件(可見於www.ginasthma.org/local/uploads/files/ACOS_2015.pdf)，將患有持續性氣管受阻與其他和哮喘、COPD相似症狀的患者診斷為ACOS。同時，正常的受試者也參與了試驗，主要是從志願者與進行年度健康檢查且沒有呼吸道疾病的人群中挑選而得，正常的受試者也同樣接受PFT檢測，以驗證是否患有呼吸道疾病。於此試驗中，排除所有患有如糖尿病、高血脂或可能干擾脂質代謝的肝功能異常等合併症的患者與正常受試者。
哮喘的嚴重程度分級，係根據欲達到良好的哮喘控制所需的治療強度來做劃分。如GINA指引所述，嚴重的哮喘患者需要高強度的治療以維持良好的控制，例如GINA分階治療Step 4 (嚴重)或Step 5(非常嚴重)，或是儘管已提供高強度治療仍無法達到良好的控制。於本發明中，將哮喘進一步分成四類：需要GINA Step 1-2治療以維持良好控制的哮喘患者為輕度哮喘、GINA Step 3治療為中度、GINA Step 4為嚴重、而GINA Step 5則為非常嚴重。患有嚴重哮喘(step 4)的患者，通常會接受兩種以上的組合控制療法(combination controller therapy) (ICS、LABA、白三烯素抑制劑、長效緩釋型茶鹼)，而治療階段Step 5的哮喘患者除了上述治療階段Step 4的治療外，還需接受口服皮質類固醇或抗-IgE抗體。另外，亦使用哮喘控制測試(asthma control test，ACT)評估患者的控制情況，該測試是一種由患者填寫的經驗證問卷，共包含五項參數，旨在評估哮喘症狀(日間與夜間)、急救藥物的使用以及哮喘對日常生活的影響，分數範圍從5(哮喘控制不佳)至25(完全控制哮喘)，若分數等於或小於19，即被認為“控制不佳”。肺功能係以肺部系統肺量計(Hoechberg，德國)來進行檢測。於基線時，FEV1與FVC皆以預測值的百分比呈現，而FEV1/FVC僅以比率呈現。支氣管擴張劑反應(bronchodilator response，BDR)則係以相對於基線時的FEV1為基準所增加的百分比方式呈現，以顯示為FEV1的絕對變化。
進行問卷調查，以評估人口統計資料、吸菸習慣、職業、哮喘症狀、病史、藥物史、生活環境、臨床檢查與肺功能測試。因哮喘發作的年齡為自行報告，為確保其準確性，會要求患者描述於童年或青春期期間，所經歷的呼吸困難、喘氣、咳嗽情形，在不確定的情況下，最初期的呼吸道症狀時間點將被採計為哮喘症狀發作的年齡；同時，也會關切所有患者的吸菸狀況，並將其分為三組：吸菸者、於初診前已戒菸至少1個月的戒菸者、終生無吸菸者。患者若具有自我報告過敏原(花粉、黴菌、灰塵、動物、豆類、海鮮、牛奶和雞蛋)、過敏性鼻炎和/或異位性皮膚炎中的其中一種，將被判定為異位性。參與年度健康檢查且肺功能正常、無哮喘史的非哮喘志願者，也會被採計進行比較。
數據分析
主要係使用兩組樣本t檢定(two sample t-test)、卡方檢定(Chi-square test)、Cohen’s D 效應值(Cohen’s D effect size)等方法比對哮喘患者與對照組之間的人口統計學變數(樣本採集的年齡、性別、身體質量指數、異位性情況、吸菸習慣、在家與工作場所中的被動吸菸)與生物監測數據，若檢測值低於檢測極限，則以檢測極限值的一半作為檢測數據。且為了更輕易的全盤理解，係選用雷達圖來呈現每組的均值。於區分哮喘患者與正常對照組時，係採用雙樣本t-檢定，並加以偽發現率(false discovery rate，FDR)調整。首先，將體內脂質的數值轉換為Z分數(Z-scores)；生成接受者操作特徵(receiver operating characteristic，ROC)曲線與其曲線下面積(area under curve，AUC)，以區分哮喘與COPD和ACOS；進一步以包含性別分布、年齡、身體質量指數、吸菸習慣、工作場所被動吸菸狀況與宗教焚香習慣等協變量進行邏輯回歸分析，計算出經調整的AUC值；另外，以Spearman排序相關係數(Spearman rank correlation coefficients，rS)，評估脂質代謝物(LPE22:6)與細胞激素IL-13、TGF-β及氧化壓力標記(HEL)之間的相關性。以上所有分析皆以SAS統計軟體(9.4版本，SAS Institutes Inc., 卡瑞市，美國北卡羅萊納州)進行操作，若p值小於0.05即視為具顯著性。
實施例一、分析受試者的體內脂質種類
樣本收集與萃取血漿中的脂質
於醫師的門診處收集受試者的血液樣本，係通過靜脈穿刺抽取周邊全血(20 mL)並存放於含有肝素的採血管中。透過密度梯度離心(Lymphoprep，奧斯陸，挪威)的方式，於3000 rpm下離心10分鐘以分離出血漿，接著立即將血將樣本等分並冷凍於-80℃的冰箱中。於萃取脂質前，先於每30 µL的血漿中等分加入15 µL的PLIS，並充分混合，接著使用Folch 等人的方法萃取血漿中的脂質。為了進一步分析神經醯胺與溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid，LPA)，將100 µL的血漿與10 µL的CerlS和LPAIS混合，並使用相同的方法進行萃取；完成萃取後，將含有脂質的有機層轉移至新的樣品瓶中，並以溫和的氮氣流將溶劑完全蒸發，再於裝有脂質的樣品瓶中填充氮氣，密封後存於-80℃以待分析。在進行LC-MS/MS分析前，必須先將脂質沉澱物溶於1.5 mL的流動相A中並徹底混合。
液相層析串聯質譜儀 (Liquid chromatography-tandem mass spectrometry ， LC-MS/MS)
使用LC-MS/MS方法分析血漿中的磷脂質，並同時進行樣品的品質管控的測量。欲製備脂質的內標準溶液時，先製備一含有二豆蔻醯磷酯醯膽鹼(Dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、Dimethyl-2-(dimethylphosphino)ethylphosphine (DMPE)、二棕櫚醯磷酯醯肌醇、 (dipalmitoylphosphatidylinositol，DPPI)、SM 12:0、溶血磷脂醯膽鹼(lysophosphatidylcholine，LPC) 14:0與LPE 14:0的甲醇溶液，做為分析主要的血漿磷脂質(plasma phospholipids，PLs)的內標準(internal standard，IS)溶液(PLIS)。每15 µL的PLIS溶液中包含3.3 µg的DMPC、3.1 µg的DMPE、1.2 µg的LPE 14:0、1.8 µg的LPC 14:0、1.6 µg的SM 12:0與2 µg的DPPI。並製備第二種的Cer 17:0 (10 ng/µL)甲醇溶液與第三種的LPA 14:0 (0.5 ng/µL) 甲醇溶液，做為用於分析血漿中的神經醯胺與LPA之神經醯胺與LPA的內標準(CerIS、LPAIS)，。另外，於所有的IS溶液中皆添加1% (v/v)的10% 二丁基羥基甲苯(methanolic butylated hydroxytoluene)，以預防脂質氧化。
所用的色層分析法是從已知的親水性作用液相層析(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILC)改良而來，以便適用於脂質的LC-MS/MS分析。流動相以0.2 ml/分鐘的速度輸送，並以Ascentis®Express HILIC管柱(2.7 µm；2.1 x 150 mm，目錄號：53946-U，Supelco)進行層析分離，而層析的流出物會再被引流至一配備有雙離子漏斗(dual ion-funnels) (AmaZon X 離子阱質譜儀；Bruker Daltonik)之質譜儀的電噴灑離子源。由於質譜儀操作上的限制，會以兩種不同的多重反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)進行相同的色層分析法來分析同一血漿脂質樣品，以全面性檢視於所有脂質類別中檢測到的脂質種類。以下，將進一步敘述有關LC-MS/MS系統與監測的脂質類別和種類，以及用於識別與定量脂質類別與種類的特別的質譜儀標準的詳細資訊。
LC-MS/MS系統係由Waters 2695型的分離模組與Bruker AmaZon X 離子阱質譜儀組成，所採用的色層分析法係由已知的方法改良而來，其中係使用親水性作用液相層析(HILC)管柱(Supelco Ascentis®Express HILIC管柱，2.7 µm；2.1 x 150 mm，目錄號：53946-U)分離脂質。流動相A係由85% (v/v) 的乙腈(acetonitrile，ACN)、10%的甲醇(MeOH)與5%的水所組成，而流動相B則係由65% 的乙腈、10%的甲醇與25%的水所組成，且兩種流動相均含有0.04% (v/v)的甲酸與1 mM的甲酸銨。為了沖提出主要的脂質，流動相輸送的速度為0.2 mL/分鐘。於沖提的過程中， 0-6分鐘內，以90%的流動相A沖提，接著於6-10分鐘內以線性的方式降低至70%，然後於10-16分鐘內，再線性降至50%，於16-20分鐘內保持於50%，20-20.1分鐘內再回到90%，接著維持於90%直至結束，整個色層分析過程約為30分鐘。
另外，亦使用相同的HILIC沖提神經醯胺(Cer)與LPA，所用的流動相A的組成與上述的流動相A相同，而流動相B則由6.5% 的乙腈、1%的甲醇與95%的水所組成，兩種流動相中的甲酸與甲酸銨的濃度也與上述相同，且沖提過程中的流速也維持在0.2 mL/分鐘。於沖提開始時，以90%的流動相A沖提，接著於0-2分鐘內以線性的方式降低至70%，於2-3分鐘時急遽線性的方式下降至50%，於3-4分鐘內保持於50%，接著在4-4.1分鐘再降至20%，並於4.1-10分鐘內皆保持於20%，最後，於10-10.1分鐘內回復到90%，並保持於90%直至結束，上述用於沖提神經醯胺與LPA的色層分析流程共耗時23分鐘。
色層分析管柱的流出液會被導引至質譜儀的電灑針(electrospray needle)，並於負離子的模式下游離，以避免因系統性的鹼金屬陽離子而導致含膽鹼的脂質前驅物訊號產生偏差。然而，對於磷脂酰乙醇胺(PE)、水解磷脂酰乙醇胺(LPE)類中之脂質的檢測，流出液會在其各自的色層分析片段於陽離子模式下游離。質譜儀皆在多重反應監測(MRM)模式下進行，於運行LC-MS/MS期間，當離子阱捕獲100,000個離子或經過200毫秒的捕獲時間時，質譜儀會執行一次分析掃描，透過此設定，可隨著色層分析峰值的沖提而平均的收集到至少10個數據點，以確保收集到足夠數量的數據點以維持色層分析的真實度。各種監測的脂質種類的MS/MS質量分離窗口(mass isolation window)係設定為12C m/z ±1 Da；首先，透過直接輸注每個脂質種類各自的內標準(IS)溶液(以注射磊以2 µL/分鐘的速度輸送1 µg/mL)，來確定每個脂質種類的游離電壓與碰撞電壓，於必要時可分別進行微調，且為了獲得可靠的定量結果並克服離子阱質譜儀固有的操作侷限性，係使用兩種不同的MS/MS方法(MS/MS方法1與2)對同一個PL樣品分析兩次，以全面性的包含除了欲監測的Cer與水解磷酸脂(LPA)外的其他主要PL種類；此外，將使用另外兩種不同的MS/MS方法(MS/MS方法3與4) 監測Cer與LPA。
為了區分與定量特定種類的脂質，係採用Xia與Jemal的MS/MS片段化方案分析含有膽鹼的脂質種類，例如磷脂醯膽鹼(PC)、溶血磷脂醯膽鹼(LPC)與神經磷脂(SM)，並以流動相沖提主要的脂質類別，甲酸酯加成離子(即[M+45]-)是該些含膽鹼的脂質唯一可檢測的前驅物離子。為了確認與定量所述的血漿磷脂質，係選定[M-15]- (即[M+甲酸酯-60]-)片段離子作為定量用片段離子，並以脂肪醯片段離子確認前驅物的脂肪醯組成；而為了確認磷酸肌醇(phosphoinositide，PI)，使用源自磷酸肌醇頭部基團的m/z 241片段離子作為確認用片段離子，而缺失sn-2部分的磷酸肌醇前驅物則用來定量；磷脂醯乙醇胺(PE)與水解磷脂醯乙醇胺(LPE) 的確認與定量，則是基於在陽離子模式時前驅物離子的141 DA中性脫失(neutral loss)，且可透過失去其各自的脂肪醯部分的前驅物離子片段或於陰離子模式下進行其他LC-MS/MS分析，進一步驗證這些含有乙醇胺的磷脂質(PL)的脂肪醯組成。Cer類別的確認與定量，則是透過前驅物的MS3串聯質譜儀而完成。選擇來自初始MS/MS反應的[M-H2 O]+產物離子作為MS3確認用的前驅物，以監測作為神經醯胺標記片段的m/z 264.5片段離子；並以m/z 153.2產物離子作為水解磷酸脂(LPA)的標記，用於確認與定量LPA類別。每個脂質種類的量係由其定量片段與其各自的內標準(IS)於萃取離子層析圖(extracted ion chromatograph，EIC)下的面積的比值決定，並進行多次的LC-MS/MS試驗以確保血漿樣本中的IS量足以使監測的脂質種類及其各自的IS之間的峰值面積比落於1:10至10:1的範圍內，且透過同時進行每批血漿樣品的品質控管分析以監測分析的品質。
實施例二、評估一組可描述哮喘特徵的八種脂質
為了確認哮喘的分子特徵，遂進行脂質體學的分析，其中從總共1163位當前患有哮喘的受試者與1493位對照組受試者中，系統性地選擇了一部分的哮喘受試者(N=365)與對照組(N=235)，採樣率分別為31%與16%。於此數據集中，經雙樣本t-檢定(two sample t-test)、卡方檢定(Chi-square test)、Cohen’s D 效應值(Cohen’s D effect size)方法進行人口統計學上的比較，結果顯示於異位性受試者與肺功能的部分皆有顯著性差異，其數值約於0.0045 (=0.05/11，Bonferroni 多重比對調整)。 表1、365名哮喘患者與235名對照組之間的人口統計學比較
  哮喘(n=365) 正常對照(n=235) P 值* Cohen’s D 標準&
性別, N (%)
男性 149 (40.82) 111 (47.23) 0.12 0.13
女性 216 (59.18) 124 (52.77)    
年齡 (平均值±標準差) 55.96 (±14.79) 53.6 (±13.6) 0.05 0.16
身體質量指數 (平均值±標準差) 25.11 (±4.13) 24.27 (±3.42) 0.01 0.20
吸菸習慣, N (%)
從未吸菸 282 (77.53) 181 (77.02) 0.15 0.01
曾吸過菸 56 (15.34) 28 (11.91)   0.10
吸菸 26 (7.12) 26 (11.06)   0.15
來自家庭的二手菸, N (%) 227 (62.19) 158 (67.24) 0.21 0.10
來自工作的二手菸, N (%) 150 (41.1) 78 (33.19) 0.05 0.16
過敏性鼻炎, N (%) 241 (66.03) 46 (19.57) ＜0.001 0.98
異位性皮膚炎, N (%) 12 (3.29) 7 (2.98) 0.83 0.02
FVC%  (平均值±標準差) 86.28 (±18.46) 85.46 (±14.83) 0.55 0.04
FVE1% (平均值±標準差) 78.15 (±21.5) 87.62 (±14.99) ＜0.001 0.44
FVE1/ FVC %  (平均值±標準差) 73.83 (±11.9) 85.09 (±9.74) 0.0009 0.95
*雙樣本t-檢定與卡方檢定。& Cohen’s D 效應值；數值大於0.2即視為有差異。
透過病例對照研究，採用分階段的方法來評估體內的磷脂質(PL)與神經鞘脂質(SL)的組成。於發現階段(discovery phase)，最初共篩選了一組含48種體內磷脂質與神經鞘脂質種類，其中18種可顯著性的區分哮喘(N=35)與對照組(N=30)，包括溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、水解磷脂醯乙醇胺(LPE)、神經磷脂(SM)，其經偽發現率(false discovery rate，FDR)調整的p值小於0.0001(數據未顯示)。；其中，共有8種脂質種類，包含LPE22:6、 LPE20:4、PE18:0/22:6、PE18:0/20:4、PE16:0/22:6、PE18:0/18:2、PC18:0/18:2、SM16:0，顯示在分析額外94位哮喘患者與100位對照組的驗證階段中呈現顯著性差異。值得注意的是，透過Z分數分析，顯示哮喘患者對比於對照組，該8種脂質組成差異的模式各不相同，於哮喘患者中，可見LPE22:6、 LPE20:4、SM16:0、PC18:0/18:2的表現較正常受試者更為突出；另一方面，正常受試者的PE18:0/22:6、PE18:0/20:4、PE16:0/22:6、PE18:0/18:2的表現較哮喘患者更為明顯(如圖1A所示)。
由於哮喘、COPD與ACOS具有共同的臨床特徵，因此，將納入49位COPD患者與52位ACOS患者的血漿樣品以進行比較。Z分數分析顯示，該8種重點分析的脂質種類可顯著性的將哮喘從COPD與ACOS中區分出來(圖1B)，其中包括7種脂質種類，包含LPE 22:6、LPE 20:4、SM 16:0、PE 18:0/22:6、PE 18:0/20:4、PC 18:0/18:2、PE 16:0/22:6，可區別哮喘與COPD；而3種脂質種類，包含SM 16:0、PC 18:0/18:2、PE 18:0/18:2，可區別哮喘與ACOS；此外，比較COPD與ACOS時，亦可見五種脂質種類呈現顯著性差異，包含LPE 22:6、LPE 20:4、PC 18:0/18:2、PE 18:0/22:6、PE 18:0/20:4。
藉由分階段的方法，該組含8種體內脂質種類顯示其可能作為描述哮喘特徵及區別哮喘與對照組的候選分子。透過整合體內脂質的特徵(為一種新的內表型形式)，以鑑別患有哮喘的患者的表現型的子集合(phenotypic subset)，亦證實了脂質代謝會對哮喘產生影響。此外，於受試者群體中發現的磷脂質和神經鞘脂質的組成特徵，也進一步顯示成人哮喘患者中存在著選擇性的脂質體學重組。
實施例三、計算 8 種主要分析脂質種類的接受者操作特徵 (ROC) 曲線及其曲線下面積 (AUC) ，以用於從對照組、 ACOS 、 COPD 中區分出哮喘患者
以體內脂質的數據集產生ROC曲線，並計算每個脂質種類的AUC值。每種脂質總類的AUC皆根據其性別分布、平均年齡、身體質量指數、吸菸習慣、工作場所的被動吸菸、宗教焚香習慣，決定是否會對其進行調整。調整過的AUC結果顯示，LPE 22:6、LPE 20:4、SM 16:0、PE 16:0/22:6可從對照組、ACOS、COPD中區分出哮喘患者(分別為圖2A、2B、2C)，同時，也可區別ACOS與COPD(圖2D)。
於未經調整的ROC分析中，選定截斷值後，以三種不同的群體比較(group-wise comparison)計算其判別值。表2中總結了從對照組、COPD、ACOS中區分出哮喘時，所用的截斷值與其靈敏性與特異性。結果顯示，於區分哮喘與對照組時，LPE 22:6與LPE 20:4的截斷值顯示出高度靈敏性(分別為100%與97.87%)與特異性(分別為99%與100%)；於區別哮喘與COPD時，7種磷脂質種類(包含LPE 22:6、LPE 20:4、SM 16:0、PE 18:0/22:6、PE 18:0/20:4、PC 18:0/18:2、PE 16:0/22:6)的截斷值，也顯示了高度靈敏性(範圍落於80.85%-100%)與特異性(範圍落於86.17%-100%)；於區分哮喘與ACOS時，3種脂質種類(包含SM 16:0、PC 18:0/18:2、PE 18:0/18:2)的截斷值具有最高的鑑別能力，顯示高度靈敏性(範圍落於86.15%-97.87%)與特異性(範圍落於89.36%-100%)；此外，用於區別COPD與ACOS的5種脂質種類(包含LPE 22:6、LPE 20:4、PC 18:0/18:2、PE 18:0/22:6、PE 18:0/20:4)的截斷值，具有最高的靈敏性(範圍落於98.08%-100%)與特異性(範圍落於94.23%-100%)。這些結果顯示，這8種重點分析的脂質用於作為區分哮喘與COPD或ACOS，與區別ACOS和COPD的鑑別標記而言，具有很大的潛力。 表2、從8種重點分析磷脂質的ROC曲線中挑選其截斷值，並以ROC分析評估其靈敏性與特異性
  磷脂質種類 哮喘 vs. 對照組 哮喘vs. COPD 哮喘vs. ACOS COPD vs. ACOS
截斷值 (µM) 靈敏性 特異性 截斷值(µM) 靈敏性 特異性 截斷值(µM) 靈敏性 特異性 截斷值(µM) 靈敏性 特異性
LPE 22:6 4.05 100 99 4.05 100 97.96 5.68 69.23 60.64 3.12 98.08 95.92
LPE 20:4 4.60 97.87 100 7.37 92.55 91.84 15 88.46 53.19 10.1 100 65.92
SM 16:0 321.43 82 71 182.13 100 100 256.23 97.87 100 100.88 83.67 69.23
PC 18:0/18:2 299.90 40.42 81 206.04 80.85 87.76 443.75 96.15 89.36 431.76 100 100
PE 18:0/22:6 146.79 57 77.66 178.65 97.96 86.17 72.8 68.09 73.08 132 100 94.23
PE 18:0/20:4 50.83 82 47.87 127.71 89.8 87.23 32.64 79.79 86.54 74 100 100
PE 16:0/22:6 71.35 89 64.89 163.81 83.67 91.49 77.99 32.98 82.69 106.63 89.8 94.23
PE 18:0/18:2 10.16 81 59.57 15.29 91.84 79.79 20.08 96.15 90.43 30.21 65.38 83.67
較特別的，與對照組相比之下，哮喘患者的LPE22:6/(PE18:0/22:6)或LPE22:6/(PE16:0/22:6)的比率有顯著性的增加，表示哮喘患者體內的Lands週期失衡。於後續的89位受試者的盲性驗證中，其中共包含哮喘患者(N=35)、非哮喘個體(N=30)與新診斷為哮喘的患者(N=24)，在檢測與標記樣品的脂質水平時，係採取盲性的方式，而結果分析則為非盲性。根據LPE22:6比PE16:0/22:6的截斷比率值0.028，共有32個樣品的比率值低於該截斷比率值，其中29個來自對照組、1個來自新診斷為哮喘的患者(#83)以及2個來自確診哮喘患者(#56、#58)，總體而言，其靈敏性與特異性分別為97%與96%(圖3)。同樣的，LPE22:6比PE18:0/22:6的截斷比率值0.023也具有高靈敏性(96%)與特異性(95%；圖3)，其中新診斷為哮喘的患者(#83)的比率值為0.01，而健康受試者(#14) 的比率值為0.03，然而有趣的是，該名健康受試者(#14)的FEV1的預期值為81%，給予支氣管擴張劑後則為88%，其LPE22:6/(PE16:0/22:6)與LPE22:6/(PE18:0/22:6)的比率分別為0.028、0.03。
實施例 4 、 LPE22:6 可觸發肥大細胞反應
為了探討LPE22:6對於調節細胞功能的潛在影響，係以小鼠骨髓來源的肥大細胞做為模型，結果顯示，在肥大細胞中可發現其顯著性的釋放β-己糖胺酶(β-hexosaminidase，一種預先形成的顆粒介質)與白三烯C4 (leukotriene C4，LTC4，一種脂質介質) (分別可見於圖4A、4B中)，並伴隨著來自細胞內所儲存的鈣流入上升，而非鈣離子移動(圖4C)。
另一方面，透過給予牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)或人類血清白蛋白(human serum albumin，HSA)，可減輕因LPE22:6所導致的膜擾動(圖5A)。細胞於含有或不含BSA(1%或4%)或HSA(1%)的情況下處理10分鐘，接著於含有FM1-43(一種可優先插入鬆散的膜的螢光染劑)的存在下，以50 µM的LPE 22:6刺激1分鐘。最後結果顯示，添加BSA可以抑制因LPE22:6所導致的膜擾動，但是氧化態的HAS則無法抑制LPE22:6(圖5B)。
此外，透過給予BSA可顯著性的降低因LPE22:6所引發的鈣離子移動(圖5C)與去顆粒作用(圖5D)，且其呈現濃度依賴性。此等結果皆表示，透過白蛋白干預LPE22:6對細胞反應所產生的影響，可作為一種減輕其脂毒性的方法。
另外，LPE22:6的濃度也與血漿中的IL-13和TGF-β濃度(如圖6A、6B，分別為r=0.287、p=0.029與r=0.302、p=0.021)、尿中的氧化性標記HEL(如圖6C，Spearman相關性，r=0.25、p=0.001)呈現正相關。
綜合以上結果，一組包含LPE 22:6、LPE 20:4、SM 16:0、PE 16:0/22:6、PE 18:0/22:6、PE 18:0/20:4、PE 18:0/18:2與磷脂膽鹼(PC)18:0/18:2的體內脂質種類，可用於從COPD患者與ACOS患者中區別出哮喘患者；除此之外，對該組脂質所進行的接受者操作特徵分析顯示，其各自的截斷值可用於從COPD患者與ACOS患者中區分出哮喘患者；另外，溶血磷脂醯乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine，LPE)類別中的LPE22:6較為特別，其與哮喘患者體內的氧化壓力標記Ne-(hexanoyl)-lysine (HEL)、IL-13、TGF-β1濃度具有相關性，並可誘發肥大細胞的去顆粒作用與LTC4釋放，但可藉由給予血清白蛋白逆轉肥大細胞的反應。因此，本發明所提供的一組血漿磷脂質類可用作為描述哮喘特徵的標記，並有效用於將哮喘患者與其他阻塞性氣管疾病區分開來。
無
圖1A-1B為雷達圖，係顯示哮喘、對照組、ACOS與COPD患者的一組8種的體內脂質組成的變化。圖1A為含有z分數的雷達圖，顯示哮喘患者與對照組相比之下，脂質種類組成的差異；圖1B為含有z分數的雷達圖，顯示哮喘、COPD、ACOS患者與對照組相比之下，脂質種類組成的差異。
圖2A-2D為曲線圖，係顯示對照組、哮喘、ACOS與COPD患者中8種重點分析的體內脂質種類的接受者操作特徵(ROC)曲線。圖2A為94位哮喘患者與100位對照的曲線圖，其中的曲線下面積(area under curve，AUC)值係已根據年齡與宗教焚香習慣進行調整；圖2B為94位哮喘患者與49位COPD患者的曲線圖，其中的曲線下面積值係已根據性別、年齡、BMI、吸菸習慣、工作中的被動吸菸與宗教焚香習慣進行調整；圖2C為94位哮喘患者與52位ACOS患者的曲線圖，其中的曲線下面積值係已根據性別、年齡與吸菸習慣進行調整；圖2D為52位ACOS患者與49位COPD患者的曲線圖，其中的曲線下面積值係已根據性別、年齡、BMI、吸菸習慣與宗教焚香習慣進行調整。於所有圖表中，對於此8種重點分析的脂質評估之P值皆小於0.0001。
圖3為長條圖，係顯示89位受試者中(標號1-89)的LPE22:6/(PE18:0/22:6)與LPE22:6/(PE16:0/22:6)比率的盲性測試。針對由醫師診斷的哮喘患者(N=35)、非哮喘個體(N=30)與新診斷為哮喘的受試者(新病例，N=24)進行體內脂質組成的測量，其結果係以非盲性的方式分析。其中LPE22:6相對於PE16:0/22:6的截斷比率值為0.028，LEP22:6相對於PE18:0/22:6的截斷比率值為0.023。*：健康受試者(#14)，具有LPE22:6/(PE18:0/22:6)、LPE22:6/(PE16:0/22:6)比率值分別為0.03與0.028；%：沒有哮喘病史的新哮喘案例，其LPE22:6/(PE18:0/22:6)、LPE22:6/(PE16:0/22:6)比率值分別為0.01與0.024；&：患有哮喘的受試者#56與#58，具有LPE22:6/(PE18:0/22:6) 比率值分別為0.029與0.028，而LPE22:6/( PE16:0/22:6)比率值分別為0.023與0.018。
圖4A-4C係顯示LPE22:6(LPE22:6-sn2)可誘發小鼠(C57BL/6)源自骨髓的肥大細胞(bone marrow-derived mast cell，BMMC)反應。於圖4A與4B中，LPE22:6-sn2誘發BMMC產生去顆粒作用和LTC4釋放。先分別以10、20、50µM的LPE22:6-sn2處理細胞30分鐘，再透過測量β-己糖胺酶 (β-hexosaminidase)檢測去顆粒作用，並以ELISA測量LTC4的濃度，其中*表示相較於空白對照組時p＜0.05、**表示相較於空白對照組時p＜0.01。如圖4C所示，LPE22:6-sn2會誘發鈣離子流入BMMC。先將BMMC與Ca2+ 指示劑、Fluo-3-AM與Fura red-AM共培養，再於無鈣離子的Tyrode’s緩衝液中以10、20、50µM的LPE22:6-sn2(溶於0.2%的BSA-PBS)於最初的3分鐘刺激細胞，後續以含有鈣離子的Tyrode’s緩衝液沖洗，並培養於其中，實驗數據係為三次獨立實驗之數據。
圖5A-5D係顯示給予牛或人類血清白蛋白(BSA或HSA)可抑制LPE22:6對BMMC所產生的功能性影響。BSA可抑制LPE22:6所導致的膜擾動(membrane perturbation) ，且呈濃度依賴性(圖5A)。此外，HAS也可抑制LPE22:6所導致的膜擾動，但是氧化態的HAS則無法抑制LPE22:6的作用(圖5B)；再者，給予BSA後可顯著性的減少因LPE22:6所導致的鈣離子移動(calcium mobilization)(圖5C)與去顆粒作用(圖5D)，且呈濃度依賴性。***表示與空白對照相比，p＜0.001；###表示與LPE22:6相比，p＜0.001，實驗數據係為三次獨立實驗之數據。
圖6A-6C係顯示哮喘患者體內LPE22:6的濃度與IL-13、TGF-β及HEL濃度之間的線性迴歸分析的相關性。
無

Claims (9)

  1. 一種使用一組體內脂質種類於活體外鑑別哮喘的方法，包含： 從一受試者上收集一生物樣本，以評估受試者的體內脂質分布； 將一從該組體內脂質種類的接受者操作特徵(ROC)曲線選出的截斷比率值應用於該受試者的體內脂質比率值；及 比較該截斷比率值與該體內脂質比率值以鑑別受試者是否為哮喘。
  2. 如請求項1所述的方法，其中該生物樣本包含血漿、血清、痰液、支氣管肺泡灌洗液與呼出氣的冷凝液。
  3. 如請求項1所述的方法，其中該組體內脂質種類包含溶血磷脂醯乙醇胺(LPE) 22:6、LPE20:4、磷脂醯乙醇胺(PE) 18:0/22:6、PE18:0/20:4、PE16:0/22:6、PE18:0/18:2、磷脂膽鹼(PC) 18:0/18:2與神經鞘脂(SM) 16:0，用於區分哮喘患者與ACOS和COPD患者。
  4. 如請求項3所述的方法，其中該組體內脂質種類包含LPE22:6、LPE20:4、SM16:0、PE16:0/22:6，用於區分哮喘患者、ACOS患者與COPD患者。
  5. 如請求項1所述的方法，其中該截斷比率值為LPE22:6比PE16:0/22:6的0.028。
  6. 如請求項1所述的方法，其中該截斷比率值為LPE22:6比PE18:0/22:6的0.03。
  7. 一種包含LPE22:6抑制性調節劑、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或係針對脂質種類的生產、代謝和活性的藥劑之組合物用於製備治療哮喘的一藥品的用途。
  8. 如請求項7所述的用途，其中該LPE22:6抑制調節劑為一抑制LPE22:6在誘發肥大細胞與細胞發炎反應之作用的拮抗劑。
  9. 如請求項7所述的用途，其中該針對脂質種類的生產、代謝和活性的藥劑包含天然、合成、化學或生物物質。
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