TW202140567A - 嵌合抗原及t細胞受體以及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其包含本文所揭示之一或多種抗原結合模體。本發明之態樣係關於編碼包含一或多種抗原結合模體之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之聚核苷酸。本發明提供包含結合CD20之結合模體及視情況選用之結合CD19之結合模體的抗體及抗原結合系統，以及其產生及使用方法。本發明之抗體及抗原結合系統包含CAR，其包含抗CD20結合模體及抗CD19結合模體。本發明提供組合物，諸如為或包含本發明之抗CD20/抗CD19抗原結合系統之抗體及CAR，及包含其之細胞療法，適用於例如治療癌症。

Description

嵌合抗原及T細胞受體以及使用方法
人類癌症就其本質而言包含經歷遺傳或表觀遺傳轉化變為異常癌細胞之正常細胞。藉此，癌細胞開始表現不同於由正常細胞表現之蛋白質及其他抗原。此等異常腫瘤抗原可藉由身體的先天性免疫系統用於特異性靶向及殺滅癌細胞。然而，癌細胞採用各種機制來阻止免疫細胞(諸如T及B淋巴細胞)成功地靶向癌細胞。
當前療法T細胞療法依賴於經富集或經修飾人類T細胞而靶向及殺滅患者之癌細胞。為了增強T細胞靶向及殺滅特定癌細胞之能力，已研發出方法來工程改造表現構築體之T細胞，該等構築體將T細胞導向特定目標癌細胞。包含能夠與特定腫瘤抗原相互作用之結合域的嵌合抗原受體(CAR)及工程改造T細胞受體(TCR)允許T細胞靶向且殺滅表現特定腫瘤抗原之癌細胞。需要靶向及殺滅癌細胞之CAR及TCR。
在至少一個第一方面，本發明包含抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其包含抗CD20結合模體，其中該抗CD20結合模體包含選自由以下組成之群的任一個重鏈可變區(HCVR)的三個重鏈互補決定區(HCDR)的序列：SEQ ID NO:1、23、45、67、89、111、133、155、177及199，以及選自由以下組成之群的任一個輕鏈可變區(LCVR)的三個輕鏈CDR(LCDR)的序列：SEQ ID NO:12、34、56、78、100、122、144、166、188及210。在一些實施例中，抗CD20結合模體包含：第一域，其包含三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)，其中(i)該HCDR1具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NO:3-5、25-27、47-49、69-71、91-93、113-115、135-137、157-159、179-181及201-203；(ii)該HCDR2具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NO:6-8、28-30、50-52、72-74、94-96、116-118、138-140、160-162、182-184及204-206；(iii)該HCDR3具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NO:9-11、31-33、53-55、75-77、97-99、119-121、141-143、163-165、185-187及207-209；(iv)該LCDR1具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NO:14-16、36-38、58-60、80-82、102-104、124-126、146-148、168-170、190-192及212-214；(v)該LCDR2具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NO:17-19、39-41、61-63、83-85、105-107、127-129、149-151、171-173、193-195及215-217；以及(vi)該LCDR3具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NO:20-22、42-44、64-66、86-88、108-110、130-132、152-154、174-176、196-198及218-220。在一些實施例中，HCDR包含：(i)根據SEQ ID NO:3-5中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:6-8中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:9-11中之任一者之HCDR3；(ii)根據SEQ ID NO:25-27中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:28-30中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:31-33中之任一者之HCDR3；(iii)根據SEQ ID NO:47-49中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:50-52中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:53-55中之任一者之HCDR3；(iv)根據SEQ ID NO:69-71中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:72-74中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:75-77中之任一者之HCDR3；(v)根據SEQ ID NO:91-93中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:94-96中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:97-99中之任一者之HCDR3；(vi)根據SEQ ID NO:113-115中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:116-118中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:119-121中之任一者之HCDR3；(vii)根據SEQ ID NO:135-137中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:138-140中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:141-143中之任一者之HCDR3；(viii)根據SEQ ID NO:157-159中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:160-162中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:163-165中之任一者之HCDR3；(ix)根據SEQ ID NO:179-181中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:182-184中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:185-187中之任一者之HCDR3；或(x)根據SEQ ID NO:201-203中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:204-206中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:207-209中之任一者之HCDR3；並且LCDR包含：(i)根據SEQ ID NO:14-16中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:17-19中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:20-22中之任一者之LCDR3；(ii)根據SEQ ID NO:36-38中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:39-41中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:42-44中之任一者之LCDR3；(iii)根據SEQ ID NO:58-60中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:61-63中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:64-66中之任一者之LCDR3；(iv)根據SEQ ID NO:80-82中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:83-85中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:86-88中之任一者之LCDR3；(v)根據SEQ ID NO:102-104中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:105-107中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:108-110中之任一者之LCDR3；(vi)根據SEQ ID NO:124-126中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:127-129中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:130-132中之任一者之LCDR3；(vii)根據SEQ ID NO:146-148中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:149-151中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:152-154中之任一者之LCDR3；(viii)根據SEQ ID NO:168-170中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:171-173中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:174-176中之任一者之LCDR3；(ix)根據SEQ ID NO:190-192中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:193-195中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:196-198中之任一者之LCDR3；或(x)根據SEQ ID NO:212-214中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:215-217中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:218-220中之任一者之LCDR3。
在各種實施例中，本發明之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段包含第一域，其包含三個重鏈互補決定區(HCDR)；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中：HCDR及LCDR包含：(i)根據SEQ ID NO:3-5中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:6-8中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:9-11中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:14-16中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:17-19中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:20-22中之任一者之LCDR3；(ii)根據SEQ ID NO:25-27中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:28-30中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:31-33中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:36-38中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:39-41中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:42-44中之任一者之LCDR3；(iii)根據SEQ ID NO:47-49中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:50-52中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:53-55中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:58-60中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:61-63中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:64-66中之任一者之LCDR3；(iv)根據SEQ ID NO:69-71中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:72-74中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:75-77中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:80-82中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:83-85中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:86-88中之任一者之LCDR3；(v)根據SEQ ID NO:91-93中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:94-96中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:97-99中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:102-104中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:105-107中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:108-110中之任一者之LCDR3；(vi)根據SEQ ID NO:113-115中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:116-118中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:119-121中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:124-126中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:127-129中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:130-132中之任一者之LCDR3；(vii)根據SEQ ID NO:135-137中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:138-140中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:141-143中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:146-148中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:149-151中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:152-154中之任一者之LCDR3；(viii)根據SEQ ID NO:157-159中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:160-162中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:163-165中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:168-170中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:171-173中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:174-176中之任一者之LCDR3；(ix)根據SEQ ID NO:179-181中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:182-184中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:185-187中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:190-192中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:193-195中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:196-198中之任一者之LCDR3；或(x)根據SEQ ID NO:201-203中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:204-206中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:207-209中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:212-214中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:215-217中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:218-220中之任一者之LCDR3。在一些實施例中，該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變域，其包含三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含三個LCDR，其中：(i)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 177或SEQ ID NO: 199至少80%一致；及(ii)該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 188或SEQ ID NO: 210至少80%一致。在一些實施例中，該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變域，其包含三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含三個LCDR，其中：(i)該重鏈可變域與SEQ ID NO:1至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:12至少80%一致；(ii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:23至少80%一致；且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:34至少80%一致；(iii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:45至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:56至少80%一致；(iv)該重鏈可變域與SEQ ID NO:67至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:78至少80%一致；(v)該重鏈可變域與SEQ ID NO:89至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:100至少80%一致；(vi)該重鏈可變域與SEQ ID NO:111至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:122至少80%一致；(vii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:133至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:144至少80%一致；(viii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:155至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:166至少80%一致；(ix)該重鏈可變域與SEQ ID NO:177至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:188至少80%一致；或(x)該重鏈可變域與SEQ ID NO:199至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:210至少80%一致。
在包含三個HCDR及三個LCDR之本發明之一些實施例中，三個HCDR及三個LCDR構成單一多肽。在包含三個HCDR及三個LCDR之本發明之一些實施例中，三個HCDR構成第一多肽且三個LCDR構成第二多肽。在一些實施例中，該第一多肽為抗體重鏈且第二多肽為抗體輕鏈。
在一些實施例中，該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段進一步包含：(i)結合模體，其結合選自由以下組成之群的抗原：5T4、α胎蛋白、B細胞成熟抗原(BCMA)、B細胞受體、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、IgM、C型凝集素類分子1(CLL-1)、EGFRvIII、上皮腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2組合、HER2-HER3組合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1套膜醣蛋白gp41、HIV-1套膜醣蛋白gpl20、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、黑素瘤相關抗原、間皮素、MUC-1、突變的p53、突變的ras、前列腺特異性抗原、ROR1、VEGFR2、EphA3(EPH受體A3)、BAFFR(B細胞活化因子受體)及其組合；及/或(ii)結合模體，其結合為B細胞所特有之抗原，視情況其中該為B細胞所特有之抗原不為CD19或CD20。在一些實施例中，該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段進一步包含抗CD19結合模體。在一些實施例中，該抗CD19結合模體包含第一域，其包含三個HCDR；及第二域，其包含三個LCDR，其中：該抗CD19結合模體之該三個HCDR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；該抗CD19結合模體之該三個LCDR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3；及該抗CD19結合模體之HCDR及LCDR包含根據SEQ ID NO: 223-225中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:226-228中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 229-231中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 234-236中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237-239中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:240-242中之任一者之LCDR3。在一些實施例中，該抗CD19結合模體包含：第一重鏈可變域，其包含該抗CD19結合模體之該三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含該抗CD19結合模體之三個LCDR，其中該抗CD19結合模體之重鏈可變域與SEQ ID NO: 221至少80%一致，且該抗CD19結合模體之輕鏈可變域與SEQ ID NO: 232至少80%一致。在一些實施例中，該抗CD19結合模體之該三個HCDR及該抗CD19結合模體之該三個LCDR構成單一多肽。在一些實施例中，該抗CD20結合模體之該三個HCDR、該抗CD20結合模體之該三個LCDR、該抗CD19結合模體之該三個HCDR及該抗CD19結合模體之該三個LCDR一起構成單一多肽。
在各種實施例中，該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段為嵌合抗原受體或包含嵌合抗原受體。在一些實施例中，該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段為單一多肽，該單一多肽為嵌合抗原受體或包含嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體為雙特異性嵌合抗原受體。在一些實施例中，該嵌合抗原受體包含為4-1BB/CD137、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或T細胞受體之ζ鏈或其任何組合之跨膜域的跨膜域。在一些實施例中，(i)該抗CD20結合模體之該三個HCDR及該抗CD20結合模體之該三個LCDR存在於第一多肽中，並且(ii)該抗CD19結合模體之該三個HCDR及該抗CD19結合模體之該三個LCDR一起構成第二不同多肽。在一些實施例中，該第一多肽為第一嵌合抗原受體或包含第一嵌合抗原受體。在一些實施例中，該第二多肽為第二嵌合抗原受體或包含第二嵌合抗原受體。
在各種實施例中，本發明包含編碼本發明之至少一種多肽之核酸及/或包含此類核酸之載體。本發明進一步包含一種產生經工程改造之細胞之方法，該方法包含用編碼本發明之至少一種多肽之核酸轉染或轉導細胞。本文進一步提供一種細胞，其編碼或表現本文提供之抗原結合系統、抗體或抗原結合片段，視情況其中該細胞為免疫細胞，視情況其中該細胞為T細胞。
本發明進一步包含一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與細胞療法組合物，該細胞療法組合物包含一或多個編碼或包含本發明之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段的細胞。本文亦提供一種誘導個體之免疫反應或使個體針對癌症免疫之方法，該方法包含向該個體投與細胞療法組合物，該細胞療法組合物包含一或多個編碼或包含本發明之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段之細胞。在一些實施例中，細胞為CAR-T細胞。在各種實施例中，該癌症為急性淋巴母細胞白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、急性骨髓白血病、B細胞前淋巴細胞性白血病、B細胞急性淋巴白血病(「BALL」)、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML )、慢性骨髓白血病、慢性或急性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、毛細胞白血病、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、惡性淋巴增生病況、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、意義不明單株伽瑪球蛋白症(monoclonal gammapathy of undetermined significance，MGUS)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、漿細胞增生性病症(包括無症狀骨髓瘤(悶燃型多發性骨髓瘤或頑固性骨髓瘤))、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、漿細胞瘤(包括漿細胞惡病質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤及多發性漿細胞瘤)、POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群(Crow-Fukase syndrome)、高槻病(Takatsuki disease)及PEP症候群)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、T細胞急性淋巴白血病(「TALL」)、T細胞淋巴瘤、轉化型濾泡性淋巴瘤或華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、套細胞淋巴瘤(MCL)、轉化型濾泡性淋巴瘤(TFL)、原發性縱隔B細胞淋巴瘤(PMBCL)、多發性骨髓瘤、毛細胞淋巴瘤/白血病或其組合。在一些實施例中，該細胞療法為同種異體細胞療法或自體細胞療法。
本發明之至少一個態樣包括嵌合抗原受體，其包含抗CD20結合模體，該抗CD20結合模體包含三個選自由以下組成之群之重鏈可變區(HCVR)序列中之任一者內所含有的重鏈互補決定區(HCDR)：SEQ ID NO:1、23、45、67、89、111、133、155、177及199，以及三個選自由以下組成之群之輕鏈可變區(LCVR)序列中之任一者內所含有的輕鏈CDR(LCDR)：SEQ ID NO:12、34、56、78、100、122、144、166、188及210。在一些實施例中，第一域包含三個重鏈互補決定區(HCDR)且第二域包含三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中(i) HCDR1具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NO:3-5、25-27、47-49、69-71、91-93、113-115、135-137、157-159、179-181及201-203；(ii) HCDR2具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NOs: 6-8、28-30、50-52、72-74、94-96、116-118、138-140、160-162、182-184及204-206；(iii) HCDR3具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NOs: 9-11、31-33、53-55、75-77、97-99、119-121、141-143、163-165、185-187及207-209；(iv) LCDR1具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NOs: 14-16、36-38、58-60、80-82、102-104、124-126、146-148、168-170、190-192及212-214；(v) LCDR2具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NOs: 17-19、39-41、61-63、83-85、105-107、127-129、149-151、171-173、193-195及215-217；及(vi) LCDR3具有根據以下中之任一者之序列：SEQ ID NOs: 20-22、42-44、64-66、86-88、108-110、130-132、152-154、174-176、196-198及218-220。在一些實施例中，該HCDR包含：(i)根據SEQ ID NO:3-5中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:6-8中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:9-11中之任一者之HCDR3；(ii)根據SEQ ID NO:25-27中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:28-30中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:31-33中之任一者之HCDR3；(iii)根據SEQ ID NO:47-49中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:50-52中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:53-55中之任一者之HCDR3；(iv)根據SEQ ID NO:69-71中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:72-74中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:75-77中之任一者之HCDR3；(v)根據SEQ ID NO:91-93中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:94-96中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:97-99中之任一者之HCDR3；(vi)根據SEQ ID NO:113-115中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:116-118中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:119-121中之任一者之HCDR3；(vii)根據SEQ ID NO:135-137中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:138-140中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:141-143中之任一者之HCDR3；(viii)根據SEQ ID NO:157-159中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:160-162中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:163-165中之任一者之HCDR3；(ix)根據SEQ ID NO:179-181中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:182-184中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:185-187中之任一者之HCDR3；或(x)根據SEQ ID NO:201-203中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:204-206中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:207-209中之任一者之HCDR3；及該LCDRc包含：(i)根據SEQ ID NO:14-16中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:17-19中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:20-22中之任一者之LCDR3；(ii)根據SEQ ID NO:36-38中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:39-41中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:42-44中之任一者之LCDR3；(iii)根據SEQ ID NO:58-60中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:61-63中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:64-66中之任一者之LCDR3；(iv)根據SEQ ID NO:80-82中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:83-85中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:86-88中之任一者之LCDR3；(v)根據SEQ ID NO:102-104中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:105-107中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:108-110中之任一者之LCDR3；(vi)根據SEQ ID NO:124-126中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:127-129中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:130-132中之任一者之LCDR3；(vii)根據SEQ ID NO:146-148中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:149-151中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:152-154中之任一者之LCDR3；(viii)根據SEQ ID NO:168-170中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:171-173中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:174-176中之任一者之LCDR3；(ix)根據SEQ ID NO:190-192中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:193-195中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:196-198中之任一者之LCDR3；或(x)根據SEQ ID NO:212-214中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:215-217中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:218-220中之任一者之LCDR3。
在一些實施例中，該嵌合抗原受體包含：第一域，其包含三個重鏈互補決定區(HCDR)；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中：三個HCDR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；三個LCDR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3；且HCDR及LCDR包含：(i)根據SEQ ID NO:3-5中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:6-8中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:9-11中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:14-16中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:17-19中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:20-22中之任一者之LCDR3；(ii)根據SEQ ID NO:25-27中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:28-30中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:31-33中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:36-38中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:39-41中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:42-44中之任一者之LCDR3；(iii)根據SEQ ID NO:47-49中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:50-52中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:53-55中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:58-60中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:61-63中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:64-66中之任一者之LCDR3；(iv)根據SEQ ID NO:69-71中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:72-74中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:75-77中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:80-82中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:83-85中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:86-88中之任一者之LCDR3；(v)根據SEQ ID NO:91-93中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:94-96中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:97-99中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:102-104中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:105-107中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:108-110中之任一者之LCDR3；(vi)根據SEQ ID NO:113-115中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:116-118中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:119-121中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:124-126中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:127-129中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:130-132中之任一者之LCDR3；(vii)根據SEQ ID NO:135-137中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:138-140中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:141-143中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:146-148中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:149-151中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:152-154中之任一者之LCDR3；(viii)根據SEQ ID NO:157-159中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:160-162中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:163-165中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:168-170中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:171-173中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:174-176中之任一者之LCDR3；(ix)根據SEQ ID NO:179-181中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:182-184中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:185-187中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:190-192中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:193-195中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:196-198中之任一者之LCDR3；或(x)根據SEQ ID NO:201-203中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:204-206中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:207-209中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:212-214中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:215-217中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:218-220中之任一者之LCDR3。在各種實施例中，該嵌合抗原受體包含第一重鏈可變域，其包含三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含三個LCDR，其中：(i)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 177或SEQ ID NO: 199至少80%一致；及(ii)該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 188或SEQ ID NO: 210至少80%一致。在一些實施例中，該嵌合抗原受體包含第一重鏈可變域，其包含三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含三個LCDR，其中：(i)該重鏈可變域與SEQ ID NO:1至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:12至少80%一致；(ii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:23至少80%一致；且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:34至少80%一致；(iii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:45至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:56至少80%一致；(iv)該重鏈可變域與SEQ ID NO:67至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:78至少80%一致；(v)該重鏈可變域與SEQ ID NO:89至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:100至少80%一致；(vi)該重鏈可變域與SEQ ID NO:111至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:122至少80%一致；(vii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:133至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:144至少80%一致；(viii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:155至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:166至少80%一致；(ix)該重鏈可變域與SEQ ID NO:177至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:188至少80%一致；或(x)該重鏈可變域與SEQ ID NO:199至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:210至少80%一致。
在包含三個HCDR及三個LCDR之一些實施例中，三個HCDR及三個LCDR構成單一多肽。在包含三個HCDR及三個LCDR之一些實施例中，三個HCDR構成第一多肽且三個LCDR構成第二多肽。在一些實施例中，該第一多肽為抗體重鏈且該第二多肽為抗體輕鏈。在一些實施例中，該嵌合抗原受體進一步包含：(i)結合模體，其特異性結合選自由以下組成之群之抗原：5T4、α胎蛋白、B細胞成熟抗原(BCMA)、B細胞受體、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、IgM、C型凝集素類分子1(CLL-1)、EGFRvIII、上皮腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2組合、HER2-HER3組合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1套膜醣蛋白gp41、HIV-1套膜醣蛋白gpl20、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、黑素瘤相關抗原、間皮素、MUC-1、突變的p53、突變的ras、前列腺特異性抗原、ROR1、VEGFR2、EphA3(EPH受體A3)、BAFFR(B細胞活化因子受體)及其組合；及/或(ii)結合模體，其特異性結合為B細胞所特有之抗原，視情況其中該為B細胞所特有之抗原不為CD19或CD20。在一些實施例中，該嵌合抗原受體進一步包含抗CD19結合模體。
在一些實施例中，如技術方案40之嵌合抗原受體，其中該抗CD19結合模體包含第一域，其包含三個HCDR；及第二域，其包含三個LCDR，其中：該抗CD19結合模體之三個HCDR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3；該抗CD19結合模體之三個LCDR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3；且該抗CD19結合模體之HCDR及LCDR包含：根據SEQ ID NO: 223-225中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:226-228中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 229-231中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 234-236中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237-239中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:240-242中之任一者之LCDR3。在一些實施例中，該抗CD19結合模體包含：第一重鏈可變域，其包含該抗CD19結合模體之該三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含該抗CD19結合模體之三個LCDR，其中該抗CD19結合模體之重鏈可變域與SEQ ID NO: 221至少80%一致，且該抗CD19結合模體之輕鏈可變域與SEQ ID NO: 232至少80%一致。在一些實施例中，該抗CD19結合模體之該三個HCDR及該抗CD19結合模體之該三個LCDR構成單一多肽。
在一些實施例中，該抗CD20結合模體之該三個HCDR、該抗CD20結合模體之該三個LCDR、該抗CD19結合模體之該三個HCDR及該抗CD19結合模體之該三個LCDR一起構成單一多肽。在一些實施例中，該嵌合抗原受體包含為4-1BB/CD137、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或T細胞受體之ζ鏈或其任何組合之跨膜域的跨膜域。
在各種實施例中，本發明包含雙順反子嵌合抗原受體，其包含本發明之第一嵌合抗原受體及第二嵌合抗原受體，該第二嵌合抗原受體包含結合模體，其特異性結合選自由以下組成之群的抗原：5T4、α胎蛋白、B細胞成熟抗原(BCMA)、B細胞受體、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、IgM、C型凝集素類分子1(CLL-1)、EGFRvIII、上皮腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2組合、HER2-HER3組合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1套膜醣蛋白gp41、HIV-1套膜醣蛋白gpl20、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、黑素瘤相關抗原、間皮素、MUC-1、突變的p53、突變的ras、前列腺特異性抗原、ROR1、VEGFR2、EphA3(EPH受體A3)、BAFFR(B細胞活化因子受體)及其組合；及/或結合模體，其特異性結合為B細胞所特有之抗原，視情況其中該為B細胞所特有之抗原不為CD19或CD20。在一些實施例中，該第二嵌合抗原受體包含抗CD19結合模體。
本發明進一步提供編碼本發明之至少一種多肽之核酸及/或包含此類核酸之載體。本發明亦包含一種產生經工程改造之細胞之方法，該方法包含用本發明之核酸轉染或轉導細胞。在各種實施例中，本發明包含編碼或表現本文所提供之嵌合抗原受體之細胞，視情況其中該細胞為免疫細胞，視情況其中該細胞為T細胞。
本發明進一步提供一種治療有需要個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與細胞療法組合物，該細胞療法組合物包含一或多個編碼或包含本發明之嵌合抗原受體之細胞。本發明進一步提供一種誘導個體之免疫反應或使個體針對癌症免疫之方法，該方法包含向該個體投與細胞療法組合物，該細胞療法組合物包含一或多個編碼或包含本發明之嵌合抗原受體之細胞。在各種實施例中，細胞為CAR-T細胞。在各種實施例中，該癌症為急性淋巴母細胞白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、急性骨髓白血病、B細胞前淋巴細胞性白血病、B細胞急性淋巴白血病(「BALL」)、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML )、慢性骨髓白血病、慢性或急性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、毛細胞白血病、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、惡性淋巴增生病況、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、意義不明單株伽瑪球蛋白症(monoclonal gammapathy of undetermined significance，MGUS)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、漿細胞增生性病症(包括無症狀骨髓瘤(悶燃型多發性骨髓瘤或頑固性骨髓瘤))、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、漿細胞瘤(包括漿細胞惡病質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤及多發性漿細胞瘤)、POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群(Crow-Fukase syndrome)、高槻病(Takatsuki disease)及PEP症候群)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、T細胞急性淋巴白血病(「TALL」)、T細胞淋巴瘤、轉化型濾泡性淋巴瘤或華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、套細胞淋巴瘤(MCL)、轉化型濾泡性淋巴瘤(TFL)、原發性縱隔B細胞淋巴瘤(PMBCL)、多發性骨髓瘤、毛細胞淋巴瘤/白血病或其組合。在一些實施例中，細胞療法為同種異體細胞療法或自體細胞療法。
在至少一個態樣中，本發明包含嵌合抗原受體，其包含抗CD20結合模體及CD19結合模體，其中抗CD20結合模體包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、23、45、67、89、111、133、155、177、199、12、34、56、78、100、122、144、166、188及210。在一些實施例中，CD19結合模體包含選自由SEQ ID NO:221及232組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，抗CD20結合模體包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:1、23、45、67、89、111、133、155、177、199、12、34、56、78、100、122、144、166、188及210；其中CD19結合模體包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:221及232。在一些實施例中，抗CD20結合模體及CD19結合模體構成一種多肽。在一些實施例中，抗CD20結合模體及CD19結合模體構成不同多肽。
在至少一個態樣中，本發明包含編碼選自由以下組成之群之胺基酸序列的聚核苷酸：SEQ ID NO: 1、23、45、67、89、111、133、155、177、199、12、34、56、78、100、122、144、166、188及210。在至少一個態樣中，本發明包含一種包含嵌合抗原受體之醫藥組合物，該嵌合抗原受體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的抗CD20結合模體：SEQ ID NO: 1、23、45、67、89、111、133、155、177、199、12、34、56、78、100、122、144、166、188及210。在一些實施例中，組合物進一步包含CD19結合模體。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2018年12月12日申請之美國臨時申請案第62/778,893號之權益，該申請案特此以全文引用之方式併入。
本發明係關於新穎多肽，其包含新穎抗原結合分子及編碼該等新穎抗原結合分子之聚核苷酸。本發明之一些態樣係關於編碼包含本文所揭示之重鏈及輕鏈中之至少一者之嵌合抗原受體(CAR)的聚核苷酸(或其CDR)。本發明亦提供包含此類聚核苷酸之載體(例如病毒載體)及包含此類載體之組合物。本發明進一步提供編碼此類CAR或TCR之聚核苷酸及包含此類聚核苷酸之組合物。本發明另外提供包含此類聚核苷酸及/或經此類病毒載體轉導之經工程改造之細胞(例如T細胞)及包含此類經工程改造之細胞之組合物。本發明提供包括複數個經工程改造之T細胞的組合物(例如醫藥組合物)。本發明提供用於製造此類經工程改造之T細胞及組合物之方法及此類經工程改造之T細胞及組合物之用途(例如在治療黑色素瘤中)。並且，本發明提供一種誘導針對腫瘤之免疫性的方法，其包含向個體投與有效量之包含本發明之聚核苷酸、載體或多肽的細胞。本發明之其他態樣係關於包含CAR之細胞及其在T細胞療法中用於治療患有癌症之患者的用途。
本文所述之任何態樣或實施例可與如本文所揭示之任何其他態樣或實施例組合。儘管本發明已結合其實施方式加以描述，但前述描述意欲說明且不限制由隨附申請專利範圍之範疇定義的本發明之範疇。其他態樣、優勢及修改在以下申請專利範圍之範疇內。本文所提及之專利及科學文獻確立熟習此項技術者可獲得之知識。本文中所引用之所有美國專利及公開或未公開之美國專利申請案均以引用的方式併入。本文中所引用之所有公開之外國專利及專利申請案特此以引用的方式併入本文中。本文中所引用之所有其他公開之參考文獻、詞典、文獻、稿圖及科學文獻特此以引用的方式併入本文中。本發明之其他特徵及優勢將自以下包含實例之實施方式及申請專利範圍顯而易知。 定義
為了使本發明更易於理解，首先在下文中定義某些術語。以下術語及其他術語之額外定義闡述於本說明書通篇中。
除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。
除非明確陳述或自上下文顯而易見，否則如本文所用之術語「或」應理解為包括性的且涵蓋「或」與「及」兩者。
本文所使用之術語「及/或」應視為兩種指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之特定揭示內容。因此，諸如本文中之「A及/或B」之短語中所用之術語「及/或」意欲包括A及B；A或B；A(單獨)；及B(單獨)。同樣，諸如「A、B及/或C」之短語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
如本文所用，術語「例如」及「亦即」僅作為舉例使用，但不意欲限制，且不應視為僅提及說明書中明確列舉之彼等條目。
術語「或更多個」、「至少」、「大於」及其類似者(例如「至少一個」)應理解為，包括(但不限於)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或大於陳述值。亦包括任何更大的數目或其間的分數。
相反，術語「不超過」包括小於陳述值之各值。舉例而言，「不超過100個核苷酸」包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1及0個核苷酸。亦包括任何更小的數目或其間的分數。
術語「複數個」、「至少兩個」、「兩個或更多個」、「至少第二個」及其類似者應理解為包括但不限於至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000個或更多個。亦包括任何更大的數目或其間的分數。
貫穿本說明書，詞語「包含(comprising)」或諸如「包含(comprises/comprising)」之變型應理解為暗示包括所陳述之要素，整數或步驟，或要素、整數或步驟之群組，但不排除任何其他要素，整數或步驟，或要素、整數或步驟之群組。應瞭解每當本文中用語言「包含」描述態樣時，則亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」所描述之類似態樣。
除非特定陳述或自上下文顯而易見，否則如本文所用，術語「約」係指如一般熟習此項技術者所測定之特定值或組成之可接受誤差範圍內的值或組成，其將部分取決於值或組成之量測或測定方式，亦即測量系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含」可意謂根據此項技術中之實踐在一個或一個以上標準差內。「約」或「基本上包含」可意謂至多10% (亦即±10%)之範圍。因此，「約」可理解為在大於或小於所述值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或0.001%內。舉例而言，約5 mg可包括4.5 mg與5.5 mg之間的任何量。此外，尤其在生物系統或方法方面，該等術語可意謂值之至多一個數量級或至多5倍。當特定值或組成提供於本發明中時，除非另外說明，否則「約」或「基本上包含」之含義應假設為在特定值或組成之可接受誤差範圍內。
如本文所描述，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所敍述範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。
本文所使用之單位、前綴及符號使用其國際單位體系(Système International de Unites, SI))公認之形式提供。數值範圍包括限定該範圍之數值。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明相關領域之一般技術者通常所理解之含義相同之含義。舉例而言，Juo, 「The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology」, 第2版, (2001), CRC Press；「The Dictionary of Cell & Molecular Biology」第5版, (2013), Academic Press；及「The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology」, Cammack等人編, 第2版, (2006), Oxford University Press為熟習此項技術者提供本發明中所用之許多術語之通用辭典。
「投與」係指使用熟習此項技術者已知之各種方法及遞送系統中之任一者將藥劑物理引入至個體中。本文所揭示之調配物的例示性投與途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、脊柱或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。片語「非經腸投與」意謂通常藉由注射實現之除經腸及局部投與外之投與模式，且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注，以及活體內電穿孔。在一些實施例中，調配物經由非腸胃外途徑，較佳經口投與。其他非腸胃外途徑包括局部、表皮或黏膜投與途徑，例如鼻內、經陰道、經直腸、舌下或局部。投與亦可例如執行一次、複數次及/或經一或多個延長之週期。
術語「抗體」(Ab)包括但不限於特異性結合至抗原之糖蛋白免疫球蛋白。一般而言，並且抗體可包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈，或其抗原結合分子。各H鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域CL。VH及VL區可進一步再分成稱為互補決定區(CDR)的高變區，其穿插有稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，其自胺基端至羧基端按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。Ab之恆定區可調節免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)的結合。一般而言，人類抗體為大約150 kD四聚劑，其由兩個相同重(H)鏈多肽(各具有約50 kD)及兩個相同輕(L)鏈多肽(各具有約25 kD)構成，該等鏈多肽彼此締合為通常稱為「Y形」結構之物質。重鏈及輕鏈藉由單一二硫鍵彼此鍵聯或連接；兩個其他二硫鍵將重鏈鉸鏈區彼此連接，使得二聚體彼此連接且形成四聚體。天然產生之抗體亦經糖基化，例如在CH2域上經糖基化。
術語「人類抗體」意欲包含具有產生、組裝或衍生自人類免疫球蛋白序列之可變及恆定域序列或與其不可區分之序列的抗體。在一些實施例中，即使其胺基酸序列包含不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之殘基或元素(例如藉由活體外隨機或定點突變誘發引入或藉由活體內體細胞突變引入之變體)，抗體(或抗體組分)仍可視為「人類」。術語「人類化」意欲包含具有可變域之抗體，該可變域具有來源於非人類物種(例如小鼠)之可變域之序列，經修飾以更類似於人類生殖系編碼序列。在一些實施例中，「人類化」抗體包含一或多個實質上具有人類構架域之胺基酸序列的構架域及一或多個實質上具有非人類抗體之胺基酸序列的互補決定區。在一些實施例中，人類化抗體包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常至少一部分人類免疫球蛋白恆定域。在一些實施例中，人類化抗體可包含CH 1、鉸鏈、CH 2、CH 3及視情況存在之人類重鏈恆定域之CH 4區。
抗體可包括例如單株抗體、以重組方式產生之抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、經工程改造之抗體、人類化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體、抗體融合物(在本文中有時稱為「抗體結合物」)、異結合抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fvs (scFv)、駱駝化抗體、親及抗體、Fab片段、F(ab')2 片段、二硫鍵連接之Fvs (sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如抗抗Id抗體)、微型抗體、域抗體、合成抗體(在本文中有時稱為「抗體模擬物」)及以上任一者之抗原結合片段。在某些實施例中，本文中所描述之抗體係指多株抗體群體。抗體亦可包含例如Fab'片段、Fd'片段、Fd片段、經分離之CDR、單鏈Fv、多肽Fc融合體、單域抗體(例如鯊魚單域抗體，諸如IgNAR或其片段)、駱駝抗體、單鏈或串聯式雙功能抗體(TandAb®)、Anticalins®、Nanobodies®微型抗體、BiTE®s、錨蛋白重複蛋白質或DARPINs®、Avimers®、DART、TCR類抗體、Adnectins®、Affilins®、反式bodies®、Affibodies®、TrimerX®、微型蛋白質(MicroProteins)、Fynomers®、Centyrins®及KALBITOR®s。
免疫球蛋白可源自任一通常已知同型，包括但不限於IgA、分泌性IgA、IgG、IgE及IgM。IgG亞類亦為熟習此項技術者所熟知，且包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之Ab類別或子類(例如IgM或IgG1)。術語「抗體」包括例如天然產生與非天然產生之Ab、單株與多株Ab、嵌合與人類化Ab、人類或非人類Ab、完全合成Ab、及單鏈Ab。非人類Ab可藉由重組方法人類化以降低其在人中之免疫原性。若未明確陳述且除非上下文指示，否則術語「抗體」亦包括前述免疫球蛋白中之任一者之抗原結合片段或抗原結合部分，且包括單價及二價片段或部分、及單鏈Ab。
「抗原結合分子」、「抗原結合部分」或「抗體片段」係指包含自其中衍生分子之抗體之抗原結合部分(例如，CDR)的任何分子。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、dAb、直鏈抗體、scFv抗體以及由抗原結合分子形成之多特異性抗體。肽體(亦即，包含肽結合域之Fc融合分子)為適合的抗原結合分子之另一實例。在一些實施例中，抗原結合分子結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中，抗原結合分子結合至與過度增生性疾病有關之細胞上之抗原或結合至病毒性或細菌性抗原。在某些實施例中，抗原結合分子結合至BCMA、CLL-1或FLT3。在某些實施例中，抗原結合分子結合至CD19、CD20或兩者。在其他實施例中，抗原結合分子為特異性結合至抗原之抗體片段，包括其互補決定區(CDR)中之一或多者。在其他實施例中，抗原結合分子為單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，抗原結合分子包含高親及性多聚體或由高親及性多聚體組成。
在一些情況下，CDR與參考抗體(例如本發明之抗體)中所發現者及/或本發明中所提供之CDR的序列實質上一致。在一些實施例中，CDR與參考CDR(例如本發明中所提供之CDR)實質上一致，因為與參考CDR相比，CDR序列上一致或含有1、2、3、4或5個(例如1-5個)胺基酸取代。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上一致，其中其顯示與參考CDR之至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上一致，因為其顯示與參考CDR之至少96%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上一致，因為相比於參考CDR，CDR內之一個胺基酸缺失、添加或經取代，而CDR具有另外與參考CDR之胺基酸序列一致的胺基酸序列。在一些實施例中，CDR與參考CDR基本上實質上一致，因為相比於參考CDR，CDR內之2、3、4或5個(例如2-5個)胺基酸缺失、添加或經取代，而CDR具有另外與參考CDR一致之胺基酸序列。在各種實施例中，抗原結合片段結合與參考抗體相同之抗原。
抗原結合片段可藉由任何手段產生。舉例而言，在一些實施例中，可藉由完整抗體之片段化來以酶或以化學方式產生抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段可以重組方式產生(亦即藉由經工程改造之核酸序列之表現)。在一些實施例中，可完全或部分合成地產生抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段可具有至少約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190個或更多個胺基酸；在一些實施例中，至少約200個胺基酸(例如50-100、50-150、50-200或100-200個胺基酸)之長度。
術語「可變區」或「可變域」可互換地使用且在此項技術中常見。可變區通常係指抗體之一部分，一般係指輕鏈或重鏈之一部分，通常係指成熟重鏈中胺基端約110至120個胺基酸及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其序列在抗體間廣泛不同且用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列中之可變性集中於稱為互補決定區(CDR)之彼等區中，而可變域中更高度保守之區稱為構架區(FR)。在不希望受任何特定機制或理論束縛之情況下，咸信輕鏈及重鏈之CDR為引起抗體與抗原之相互作用及特異性的主要原因。在某些實施例中，可變區為人類可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及人類構架區(FR)。在特定實施例中，可變區為靈長類動物(例如非人類靈長類動物)可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及靈長類動物(例如非人類靈長類動物)構架區(FR)。
術語「VL」及「VL域」可互換使用以指代抗體或其抗原結合分子之輕鏈可變區。
術語「VH」及「VH域」可互換使用以指代抗體或其抗原結合分子之重鏈可變區。
通常使用多種CDR定義：Kabat編號、Chothia編號、AbM編號或接觸編號。AbM定義為由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用之兩種之間的折衷。接觸定義係基於可用複合晶體結構之分析。
表1. CDR編號
環 Kabat AbM Chothia 接觸
L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36
L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55
L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96
H1 H31--H35B (Kabat編號) H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B
H1 H31--H35 (Chothia編號) H26--H35 H26--H32 H30--H35
H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58
H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101
術語「Kabat編號」及類似術語在此項技術中公認且係指編號抗體或其抗原結合分子之重鏈及輕鏈可變區中之胺基酸殘基之系統。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統確定(參見例如Kabat EA及Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391，及Kabat EA等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, 美國健康與人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH公開案第91-3242號)。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置31至35處，其視情況在35之後可包括一或兩個額外胺基酸(在Kabat編號方案中稱為35A及35B)(CDR1)；胺基酸位置50至65處(CDR2)；及胺基酸位置95至102處(CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置24至34處(CDR1)、胺基酸位置50至56處(CDR2)及胺基酸位置89至97處(CDR3)。在一特定實施例中，本文所述抗體之CDR根據Kabat編號方案確定。
在某些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案確定，Chothia編號方案係指免疫球蛋白結構環之位置(參見例如Chothia C及Lesk AM, (1987), J. Mol. Biol., 196: 901-917；Al-Lazikani B等人, (1997), J. Mol. Biol., 273: 927-948；Chothia C等人, (1992), J. Mol. Biol., 227: 799-817；Tramontano A等人, (1990), J. Mol. Biol. 215(1): 175-82；以及美國專利第7,709,226號)。通常，當使用Kabat編號規約時，Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34處，Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56處，且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。在使用Kabat編號規約進行編號時，Chothia CDR-HI環末端在H32與H34之間變化，此視環的長度而定(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B處；若既不存在35A，亦不存在35B，則環末端位於32處；若僅存在35A，則環末端位於33處；若35A與35B皆存在，則環末端位於34處)。在一特定實施例中，本文所述抗體之CDR根據Chothia編號方案確定。
術語「恆定區」及「恆定域」可互換且具有此項技術中之常見含義。恆定區為抗體部分，例如不與抗體與抗原之結合直接有關但可展現各種效應功能(諸如與Fc受體之相互作用)之輕鏈及/或重鏈之羧基端部分。免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列一般比免疫球蛋白可變域更保守。
當提及抗體使用時，基於恆定域之胺基酸序列，術語「重鏈」可指任何獨特類型，例如α、δ、ε、γ及µ，其產生抗體之IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類別，分別包括IgG子類，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 及IgG4 。
當提及抗體使用時，基於恆定域之胺基酸序列，術語「輕鏈」可指任何獨特類型，例如κ或λ。輕鏈胺基酸序列為此項技術中所熟知的。在特定實施例中，輕鏈為人類輕鏈。
「結合親和力」通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的全部非共價相互作用之強度。除非另外指明，否則如本文中所使用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(KD )表示。親和力可以此項技術中已知之多種方式加以量測及/或表達，包括但不限於平衡解離常數(KD )及平衡締合常數(KA )。KD 由k離 /k合 之商計算，而KA 由k合 /k離 之商計算。k合 係指例如抗體與抗原之締合速率常數，且k離 係指例如抗體與抗原之解離。k合 及k離 可藉由一般熟習此項技術者已知之技術，諸如BIAcore® 或KinExA測定。
「保守性胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。此項技術中已限定具有側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。在某些實施例中，抗體或其抗原結合分子之CDR內或構架區內之一或多個胺基酸殘基可經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。一般而言，若兩個序列在對應位置中含有保守胺基酸取代，則一般將其視為「實質上類似」。舉例而言，某些胺基酸一般歸類為「疏水性」或「親水性」胺基酸，及/或歸類為具有「極性」或「非極性」側鏈。用一種胺基酸取代另一相同類型可視為保守取代。例示性胺基酸分類概述於下表2及3中： 表2
胺基酸 3字母 1字母 特性 特性 親水性指數
丙胺酸 Ala A 非極性 中性 1.8
精胺酸 Arg R 極性 陽性 -4.5
天冬醯胺 Asn N 極性 中性 -3.5
天冬胺酸 Asp D 極性 陰性 -3.5
半胱胺酸 Cys C 非極性 中性 2.5
麩胺酸 Glu E 極性 陰性 -3.5
麩醯胺酸 Gln Q 極性 中性 -3.5
甘胺酸 Gly G 非極性 中性 -0.4
組胺酸 His H 極性 陽性 -3.2
異白胺酸 Ile I 非極性 中性 4.5
白胺酸 Leu L 非極性 中性 3.8
離胺酸 Lys K 極性 陽性 -3.9
甲硫胺酸 Met M 非極性 中性 1.9
苯丙胺酸 Phe F 非極性 中性 2.8
脯胺酸 Pro P 非極性 中性 -1.6
絲胺酸 Ser S 極性 中性 -0.8
蘇胺酸 Thr T 極性 中性 -0.7
色胺酸 Trp W 非極性 中性 -0.9
酪胺酸 Tyr Y 極性 中性 -1.3
纈胺酸 Val V 非極性 中性 4.2
表3
多義胺基酸 3字母 1字母
天冬醯胺或天冬胺酸 Asx B
麩醯胺酸或麩胺酸 Glx Z
白胺酸或異白胺酸 Xle J
未指定或未知的胺基酸 Xaa X
術語「異源」意謂來自除天然產生之序列外之任何來源。舉例而言，作為具有SEQ ID NO:232之胺基酸序列之協同刺激蛋白質(例如對應人類協同刺激蛋白質)之一部分包括之異源序列為並非天然產生，亦即並不與野生型人類協同刺激蛋白質對準之胺基酸。舉例而言，異源核苷酸序列係指除野生型人類協同刺激蛋白質編碼序列之核苷酸序列外之核苷酸序列。
「抗原決定基」為此項技術中之術語且係指抗原中抗體可特異性結合之局部區。抗原決定基可為例如多肽之連續胺基酸(線性或連續抗原決定基)，或抗原決定基可例如由一或多個多肽之兩個或更多個非連續區聚集在一起得到(構形、非線性、不連續或非連續抗原決定基)。在某些實施例中，結合抗體之抗原決定基可藉由例如NMR光譜分析、X射線繞射結晶學研究、ELISA分析、耦接質譜分析之氫/氘交換(例如液相層析電噴霧質譜分析)、基於陣列之寡肽掃描分析及/或突變誘發定位(例如定點突變誘發定位)測定。對於X射線結晶學，結晶可使用此項技術中已知方法中之任一者實現(例如Giegé R等人, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(第4部分): 339-350；McPherson A(1990) Eur J Biochem 189: 1-23；Chayen NE(1997)結構5: 1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem Crystallogr 251: 6300-6303)。抗體:抗原晶體可使用熟知X射線繞射技術來加以研究，且可使用電腦軟體來加以優化，諸如X-PLOR(耶魯大學(Yale University), 1992, 由Molecular Simulations, Inc.分銷；參見例如Meth Enzymol (1985) 第114及115卷, Wyckoff HW等人編；U.S. 2004/0014194)及BUSTER(Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(第1部分): 37-60；Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, Carter CW編；Roversi P等人, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(第10部分): 1316-1323)。突變誘發定位研究可使用熟習此項技術者已知之任何方法來實現。關於突變誘發技術之描述，包括丙胺酸掃描突變誘發技術，參見例如Champe M等人, (1995)J Biol Chem 270: 1388-1394及Cunningham BC及Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085。
若抗原與第一結合分子、抗體或其抗原結合分子之間的相互作用阻斷、限制、抑制或以其他方式降低參考結合分子、參考抗體或其抗原結合分子與抗原相互作用之能力，則抗原結合分子、抗體或其抗原結合分子與參考抗體或其抗原結合分子「交叉競爭」。交叉競爭可為完全的，例如結合分子與抗原之結合完全阻斷參考結合分子結合抗原之能力，或其可為部分的，例如結合分子與抗原之結合降低參考結合分子結合抗原之能力。在某些實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子相同或重疊的抗原決定基。在其他實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子不同的抗原決定基。可使用許多類型之競爭性結合分析來確定一個抗原結合分子是否與另一抗原結合分子競爭，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(Stahli等人, 1983, Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Kirkland等人, 1986, J. Immunol. 137:3614-3619)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(Harlow及Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記之固相直接標記RIA (Morel等人, 1988, Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Cheung等人, 1990, Virology 176:546-552)；及直接標記之RIA (Moldenhauer等人, 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)。
術語「結合」一般係指兩個或更多個實體之間或之中的非共價締合。直接結合涉及實體或部分之間的物理接觸。「間接」結合涉及藉助於與一或多個中間實體物理接觸之物理相互作用。兩個或更多個實體之間的結合可在多種情形中之任一者下評估，例如其中相互作用之實體或部分在分離或更複雜系統之情形下進行研究(例如同時共價或以其他方式與載體實體締合及/或在生物系統(諸如細胞)中)。
術語「免疫特異性結合」、「免疫特異性識別」、「特異性結合」及「特異性識別」在抗體之情況下為類似術語，且係指結合至抗原(例如抗原決定基或免疫複合體)之分子，因為此類結合藉由熟習此項技術者所瞭解。舉例而言，如藉由例如免疫分析、BIACORE® 、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments，Boise，ID)或此項技術中已知之其他分析所測定，特異性結合至抗原之分子可一般以較低親和力結合至其他肽或多肽。在一特定實施例中，特異性結合至抗原之分子與該抗原結合之KA 為該分子結合至另一種抗原時之KA 的至少2對數級、2.5對數級、3對數級、4對數級或更大。相比於結合模體、抗體或抗原結合系統與非目標(亦即非目標)之實體之結合，結合可包含結合模體、抗體或抗原結合系統與結合模體、抗體或抗原結合系統之目標的較佳結合。在一些實施例中，相較於結合模體、抗體或抗原結合系統與非目標之結合，若結合模體、抗體或抗原結合系統與目標之間的結合大於2倍、大於5倍、大於10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或大於100倍，則結合模體、抗體或抗原結合系統選擇性結合目標。在一些實施例中，若結合親和力小於約10-5 M、小於約10-6 M、小於約10-7 M、小於約10-8 M或小於約10-9 M，則結合模體、抗體或抗原結合系統選擇性結合目標。
在另一實施例中，特異性結合抗原之分子以約1×10-7 M之解離常數(Kd )結合。在一些實施例中，當Kd 為約1×10-9 M至約5×10-9 M時，抗原結合分子以「高親和力」特異性結合抗原。在一些實施例中，當Kd 為1×10-10 M至約5×10-10 M時，抗原結合分子以「極高親和力」特異性結合抗原。在一個實施例中，抗原結合分子之Kd 為10-9 M。在一個實施例中，解離速率低於約1×10-5 。在其他實施例中，抗原結合分子以約1×10-7 M與約1×10-13 M之間的Kd 結合人類BCMA。在又一實施例中，抗原結合分子以約1×10-10 M至約5×10-10 M之Kd 結合人類BCMA。在一些實施例中，抗原結合分子以約1×10-7 M與約1×10-13 M之間的Kd 結合人類CD19、CD20或兩者。在又一實施例中，抗原結合分子以約1×10-10 M至約5×10-10 M之Kd 結合人類CD19、CD20或兩者。
在一特定實施例中，本文提供一種抗體或其抗原結合分子，其以比另一物種的目標抗原，例如非人類BCMA或非人類CLL-1更高的親和力結合目標人類抗原，例如人類BCMA或人類CLL-1。在一特定實施例中，本文提供一種抗體或其抗原結合分子，其以比另一物種的一或兩種目標抗原，例如非人類CD19、非人類CD20或兩者更高的親和力結合人類CD19、人類CD20或兩者。在某些實施例中，本文提供一種抗體或其抗原結合分子，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿子共振、或動力排除分析所量測，該抗體或其抗原結合分子與目標人類抗原(例如人類BCMA或人類CLL-1)結合之親和力比與另一物種之目標抗原結合之親和力高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更高。在某些實施例中，本文提供一種抗體或其抗原結合分子，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿子共振或動力排除分析所量測，該抗體或其抗原結合分子與人類CD19、人類CD20或兩者結合之親和力比與另一物種之一或兩種目標抗原結合之親和力高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更高。在一特定實施例中，結合至目標人類抗原之本文所述的抗體或其抗原結合分子與另一目標抗原物種之結合將為該抗體或其抗原結合分子與人類抗原之結合的小於10%、15%或20%，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿子共振或動力排除分析所量測。
「嵌合抗原受體」或「CAR」係指經工程改造以包含結合模體之分子及在抗原結合時活化免疫細胞(例如T細胞，諸如初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應子記憶T細胞或其組合)之方式。CAR亦稱為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。在一些實施例中，CAR包含結合模體、細胞外域、跨膜域、一或多個協同刺激域及胞內信號傳導域。已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體之T細胞可稱為CAR T細胞。「細胞外域」(或「ECD」)係指當多肽存在於細胞膜中時，應理解多肽之一部分滯留在胞外空間中之細胞膜外部。
「抗原」係指引起免疫反應或能夠與抗體或抗原結合分子結合之任何分子。該免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術者將容易瞭解，任何大分子，包括實際上所有蛋白質或肽均可充當抗原。抗原可內源性表現，亦即由基因組DNA表現，或可以重組方式表現。抗原可對某一組織，諸如癌細胞具有特異性，或其可廣泛表現。另外，較大分子之片段可充當抗原。在一個實施例中，抗原為腫瘤抗原。在一個特定實施例中，抗原為CD19或CD20之全部或片段。「目標」為由結合模體、抗原結合系統或結合劑(例如抗體)結合之任何分子。在一些實施例中，目標為本發明之抗原或抗原決定基。
術語「中和」係指結合至配位體且防止或降低該配位體之生物效應的抗原結合分子、scFv、抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體或其片段直接阻斷配位體上之結合位點，或以其他方式改變配位體經由間接手段結合之能力(諸如配位體中之結構性或高能變化)。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體或其片段阻止其所結合之蛋白質執行生物功能。
術語「自體」係指衍生自稍後將再引入至其之相同個體的任何物質。舉例而言，本文中所描述之經工程改造之自體細胞療法(eACT™)方法涉及自患者收集淋巴細胞，其接著經工程改造以表現例如CAR構築體，且接著投與回至相同患者。
術語「同種異體」係指源自一個個體之接著引入至相同物種之另一個體中的任何物質，例如同種異體T細胞移植。
術語「轉導」及「經轉導」係指藉以經由病毒載體將外源DNA引入至細胞中之方法(參見Jones等人, 「Genetics: principles and analysis,」 Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998))。在一些實施例中，載體為反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦巴爾病毒載體(Epstein Barr viral vector)、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體或其任何組合。
「轉化」係指將外源DNA引入宿主細胞中之任何方法。轉化可在天然或人工條件下使用各種方法來進行。轉化可使用將外來核酸序列插入原核或真核宿主細胞中之任何已知方法來達成。在一些實施例中，一些轉化方法係基於待轉化之宿主細胞及/或待插入之核酸來選擇。轉化方法可包含但不限於病毒感染、電穿孔及脂質體轉染。在一些實施例中，「轉化的」細胞為穩定轉化的，因為插入之DNA能夠作為自主複製質體或作為宿主染色體之一部分進行複製。在一些實施例中，轉化的細胞可表現引入之核酸。
術語「載體」係指經修飾以包含或併入所提供之核酸序列之接受者核酸分子。載體之一種類型為「質體」，其係指其他DNA可接合至其中之環狀雙股DNA分子。另一類型之載體為病毒載體，其中額外DNA片段可與病毒基因組接合。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體包含引導其可操作地連接之插入基因之表現的序列。此類載體可在本文中稱為「表現載體」。標準技術可用於對載體進行工程改造，例如如在Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))中所發現，出於任何目的以引用的方式併入本文中。
「癌症」係指表徵為異常細胞在體內不受控生長之廣泛各種疾病群。不受調控細胞分裂及生長導致形成侵入鄰近組織且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分的惡性腫瘤。「癌症」或「癌症組織」可包括腫瘤。可藉由本發明之方法治療之癌症之實例包括但不限於免疫系統之癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及其他白細胞惡性病。在一些實施例中，本發明之方法可用於減小源自例如以下各者之腫瘤的腫瘤大小：骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、多發性骨髓瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、轉化型濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL) (包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、兒童實體腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或尿管之癌症、腎盂之癌瘤、中樞神經系統(CNS)之贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、包括由石棉誘發之癌症的環境誘發之癌症、其他B細胞惡性腫瘤及該等癌症之組合。在一個特定實施例中，該癌症為多發性骨髓瘤。特定癌症可對化學或輻射療法有反應，或癌症可為難治癒的。難治癒之癌症係指手術干預不可改善之癌症，且癌症起初對化學或輻射療法無反應或癌症隨時間推移變得無反應。癌症進一步包括在全身療法之兩個或更多個線路之後的復發性或難治性大B細胞淋巴瘤，包括未另外說明之瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、在全身療法之兩個或更多個線路之後的原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、高級別B細胞淋巴瘤及由濾泡性淋巴瘤產生之DLBCL。
如本文中所用，「抗腫瘤效應」係指可呈現為腫瘤體積減小、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增生降低、轉移灶數目減少、總體或無進展存活期增加、預期壽命增加或與腫瘤相關聯之各種生理學症狀改善之生物效應。抗腫瘤效應亦可指預防腫瘤出現，例如疫苗。
如本文所用，「細胞介素」係指藉由一個細胞回應於與特異性抗原接觸而釋放之非抗體蛋白質，其中細胞介素與第二細胞相互作用以介導第二細胞中之反應。細胞介素可由細胞內源性表現或向個體投與。細胞介素可由免疫細胞釋放，包括傳播免疫反應之巨噬細胞、B細胞、T細胞及肥大細胞。細胞介素可在受體細胞中誘導各種反應。細胞介素可包括體內恆定細胞介素、趨化介素、促炎性細胞介素、效應子及急性期蛋白質。舉例而言，體內恆定細胞介素，包括介白素(IL)7及IL-15，促進免疫細胞存活及增殖，且促炎性細胞介素可促進發炎反應。體內恆定細胞介素之實例包括但不限於IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15及干擾素(IFN) γ。促炎性細胞介素之實例包括但不限於IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF)2、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、可溶性細胞間黏附分子1 (sICAM-1)、可溶性血管黏附分子1 (sVCAM-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PLGF)。效應子之實例包括但不限於顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配位體(sFasL)及穿孔蛋白。急性期蛋白質之實例包括但不限於C反應蛋白(CRP)及血清澱粉樣蛋白A (SAA)。
「趨化介素」為一種類型之細胞介素，其介導細胞趨化性或方向性移動。趨化介素之實例包括但不限於IL-8、IL-16、伊紅趨素、伊紅趨素-3、巨噬細胞來源之趨化介素(MDC或CCL22)、單核球趨化性蛋白質1 (MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬細胞發炎性蛋白質1α (MIP-1α、MIP-1a)、MIP-1β (MIP-1b)、γ誘導性蛋白質10 (IP-10)及胸腺及活化調節之趨化介素(TARC或CCL17)。
治療劑，例如經工程改造之CAR T細胞之「治療有效量」、「有效劑量」，「有效量」或「治療有效劑量」為單獨或與另一治療劑組合使用時保護個體免於疾病發作或由疾病症狀之嚴重強度降低，無疾病症狀週期之頻率及持續時間增長證明之促進疾病消退，或預防歸因於疾病病痛之損傷或殘疾之任何量。治療劑促進疾病消退之能力可使用熟習此項技術者已知的多種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類個體中評估、在預測人體內之功效的動物模型系統中評估或藉由在活體外分析中分析藥劑活性評估。
術語「淋巴細胞」包括自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。NK細胞為表示固有免疫系統之主要組分的一種類型之細胞毒性(cytotoxic/cell toxic)淋巴細胞。NK細胞抑制腫瘤及感染病毒之細胞。其經由細胞凋亡或計劃性細胞死亡之過程起作用。其稱為「自然殺手」，此係因為其並不需要活化以殺滅細胞。T細胞在細胞介導之免疫性(無抗體參與)中起主要作用。其T細胞受體(TCR)將其與其他淋巴細胞類型分化。胸腺(一種免疫系統之特定器官)主要負責T細胞之成熟。存在六種類型之T細胞，亦即：輔助T細胞(例如CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(亦稱為TC，細胞毒性T淋巴細胞、CTL、T-殺手細胞、細胞溶解T細胞、CD8+ T細胞或殺手T細胞)、記憶T細胞((i)幹細胞記憶TSCM 細胞，如原初細胞，為CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+ (L-選擇素)、CD27+、CD28+及IL-7Rα+，但其亦表現大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1，且展示記憶細胞特有之眾多功能性屬性)；(ii)中樞記憶TCM 細胞表現L-選擇素及CCR7，其分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，及(iii)效應子記憶TEM 細胞，然而，不會表現L-選擇素或CCR7，但產生效應子細胞介素，如IFNγ及IL-4)，調節性T細胞(T細胞、抑制T細胞或CD4+CD25+調節T細胞)、自然殺手T細胞(NKT)及γ δ T細胞。另一方面，B細胞在體液免疫中起主要作用(有抗體參與)。其製得抗體及抗原且執行抗原呈遞細胞(APC)之作用且在藉由抗原相互作用活化之後轉變成記憶B細胞。在哺乳動物中，不成熟B細胞在其名稱來源之骨髓中形成。
「連接子」(L)或「連接子域」或「連接子區」係指約1至100個胺基酸長之寡或多肽區，其將本發明之CAR之域/區中之任一者連接在一起。連接子可由可撓性殘基，如甘胺酸及絲胺酸構成，使得相鄰蛋白域相對於彼此自由移動。當需要確保兩個相鄰域不會在空間上彼此干擾時，可使用更長連接子。連接子可為可裂解或不可裂解的。可裂解連接子之實例包括2A連接子(例如T2A)、2A樣連接子或其功能等效物及其組合。在一些實施例中，連接子包括：小核糖核酸病毒2A樣連接子；豬捷申病毒屬(P2A)、病毒(T2A)之CHYSEL序列或其組合、變體及功能等效物。在其他實施例中，連接子序列可包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly.(2A) -Pro.(2B) 模體(SEQ ID NO: 314)，其引起在2A甘胺酸與2B脯胺酸之間裂解。其他連接子將對熟習此項技術者而言為顯而易見的，且可與本發明替代實施例結合使用。舉例而言，在一些實例中，連接子可用於聯接或連接不同抗原結合系統，諸如雙順反子CAR之兩個CAR。連接子可為將不同元素彼此連接之多元素藥劑之一部分。舉例而言，多肽包含兩個或更多個功能或域，在將其彼此連接之此類域之間可包含一連串胺基酸。在一些實施例中，包含連接子元件之多肽具有通式S1-L-S2之整體結構，其中S1及S2可相同或不同且表示藉由連接子彼此結合之兩個域。連接子可與本發明CAR之域/區中之任一者聯接或連接在一起。在一些實施例中，多肽連接子的長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個胺基酸(例如長度為1至10、1至20、1至30、1至40、1至50、1至60、1至70、1至80、1至90、1至100、10至20、10至30、10至40、10至50、10至60、10至70、10至80、10至90或10至100個胺基酸)。在一些實施例中，連接子之特徵在於其趨向於不採用剛性三維結構，並且實際上向多肽提供可撓性。
「單鏈可變片段」、「單鏈抗體可變片段」或「scFv」抗體係指包含藉由連接子肽連接之僅重鏈及輕鏈之可變區的抗體形式。
術語「經基因工程改造」或「經工程改造」係指修飾細胞基因組之方法，包括但不限於刪除編碼或非編碼區或其一部分或插入編碼區或其一部分。在一些實施例中，經修飾之細胞為淋巴細胞，例如T細胞，其可獲自患者抑或供體。細胞可經修飾以表現外源性構築體，諸如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其併入至細胞之基因組中。工程改造大體上包含由人手操縱。舉例而言，在一些實施例中，當兩個或更多個不以自然界中之順序連接在一起之序列經人工操控以在經工程改造之聚核苷酸中彼此直接聯接或連接時，該聚核苷酸可視為「經工程改造」。在藉由分子生物學技術操縱細胞之情形下，若已操控細胞或生物體使得其遺傳資訊改變(例如先前未存在之新遺傳物質，例如藉由轉化、體雜交、轉染、轉導或其他機制引入，或先前存在之遺傳物質例如藉由取代或缺失突變或藉由其他協定改變或移除)，則認為該細胞或生物體「經工程改造」。在一些實施例中，結合劑為修飾之淋巴細胞，例如T細胞，可獲自患者或供體。經工程改造之細胞可經修飾以表現外源構築體，諸如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其併入細胞的基因組中。經工程改造之聚核苷酸或結合劑之後代一般稱為「經工程改造」，儘管對先前實體進行實際操作。在一些實施例中，「經工程改造」係指已經設計且產生之實體。術語「經設計」係指結構為或由人工選擇之藥劑(i)；(ii)由需要人工之方法產生；及/或(iii)不同於天然物質及其他已知藥劑。「T細胞受體」或「TCR」係指存在於T細胞表面上之抗原識別分子。在正常T細胞發育期間，四種TCR基因中之每一者(α、β、γ及δ)可重排，產生高度多樣TCR蛋白質。
「免疫反應」係指免疫系統之細胞(例如，T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞及嗜中性球)及藉由此等細胞中之任一者或肝臟產生之可溶性大分子(包括Ab、細胞介素及補體)的作用，該等細胞中之任一者或肝臟導致選擇性靶向、結合至、損傷、破壞以下及/或自以下消除：具有入侵病原體、感染病原體之細胞或組織、癌或其他異常細胞或在自體免疫或病理性發炎的情況下，正常人類細胞或組織之脊椎動物的身體。
術語「免疫療法」係指藉由包含誘導、促進、抑制或以其他方式改良免疫反應之方法治療罹患疾病或處於感染或遭受疾病復發之風險中的個體。免疫療法之實例包括但不限於T細胞療法。T細胞療法可包括授受T細胞療法、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)免疫療法、自體細胞療法、經工程改造之自體細胞療法(eACT™)及同種異體T細胞移植。然而，熟習此項技術者將認識到，本文中所揭示之調節方法將增強任何移植T細胞療法之效果。T細胞療法之實例描述於美國專利公開案第2014/0154228號及第2002/0006409號、美國專利第5,728,388號及國際公開案第WO 2008/081035號中。
免疫療法之T細胞可來自此項技術中已知之任何來源。舉例而言，T細胞可在活體外自造血幹細胞群體分化，或T細胞可獲自個體。T細胞可獲自例如外周血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、肋膜積液、脾組織及腫瘤。另外，T細胞可來源於一或多個此項技術中可獲得之T細胞株。T細胞亦可使用熟習此項技術者已知之許多技術，諸如FICOLL™分離及/或血球分離術獲自自個體收集之血液單元。用於T細胞療法之分離T細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號中，該公開案以全文引用之方式併入本文中。
術語「經工程改造之自體細胞療法」(其可縮寫為「eACT™」，亦稱為授受細胞轉移)為一種藉以收集患者自身之T細胞且隨後對其進行基因改變以識別及靶向在一或多種特異性腫瘤細胞或惡性腫瘤之細胞表面上表現的一或多種抗原之方法。T細胞可經工程改造以表現例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。CAR陽性(+) T細胞經工程改造以表現對特定腫瘤抗原具有特異性之連接至包含至少一個協同刺激域及至少一個活化域之細胞內信號傳導部分的細胞外單鏈可變片段(scFv)。協同刺激域可源自天然存在之協同刺激域，例如具有SEQ ID NO:232之胺基酸序列或其變體，例如具有截短鉸鏈域(「THD」)之變體，且活化域可源自例如CD3-ζ。在某些實施例中，CAR經設計以具有兩個、三個、四個或更多個協同刺激域。CAR scFv可經設計以靶向例如CD19，其為由B細胞譜系中之細胞表現之跨膜蛋白，該等細胞包括所有正常B細胞及B細胞惡性疾病，包括但不限於NHL、CLL及非T細胞ALL。在一些實施例中，CAR經工程改造以使得協同刺激域表現為各別多肽鏈。實例CAR T細胞療法及構築體描述於美國專利公開案第2013/0287748號、第2014/0227237號、第2014/0099309號及第2014/0050708號中，且此等參考案以全文引用之方式併入。「授受細胞療法」或「ACT」涉及將具有抗腫瘤活性之免疫細胞轉移至個體，例如癌症患者中。在一些實施例中，ACT為涉及使用具有抗腫瘤活性之淋巴細胞(例如經工程改造之淋巴細胞)的治療方法。
「患者」包括罹患癌症(例如淋巴瘤或白血病)之任何人。術語「個體」及「患者」在本文中互換地使用。
術語「活體外」係指在人工環境中，例如在試管、反應容器、細胞培養物等中，而非在多細胞生物體內發生之事件。術語「活體外細胞」係指離體培養之任何細胞。特定言之，活體外細胞可包括T細胞。術語「活體內」係指事件發生在多細胞生物體內，諸如人類或非人類動物內。
「抗原特異性靶向區」(ASTR)係指靶向特異性抗原之CAR區域。本發明之CAR包含靶向至少兩種不同抗原之至少兩個靶向區。在一個實施例中，CAR包含靶向至少三種或更多種不同抗原之三個或更多個靶向區。CAR上之靶向區為細胞外的。在一些實施例中，抗原特異性靶向區包含抗體或其功能等效物或其片段或其衍生物，且靶向區中之每一者靶向不同抗原。靶向區可包含全長重鏈、Fab片段、單鏈Fv(scFv)片段、二價單鏈抗體或雙功能抗體，其中之每一者對靶抗原具有特異性。然而，存在許多替代方案，諸如連接的細胞介素(其使得識別帶有細胞介素受體之細胞)、親及抗體、來自天然存在之受體之配位體結合域、用於受體(例如在腫瘤細胞上)之可溶性蛋白/肽配位體、肽及疫苗以促使免疫反應，其可各自用於本發明之各種實施例。實際上，如熟習此項技術者將瞭解，結合具有高親和力之既定抗原之幾乎任何分子可用作抗原特異性靶向區。
「抗原呈現細胞」或「APC」係指處理及呈遞抗原至T細胞之細胞。例示性APC包含樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、某些活化上皮細胞及能夠TCR刺激及適當T細胞協同刺激之其他細胞類型。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基組成之化合物。蛋白質或肽含有至少兩個胺基酸，且不對可包含蛋白或肽的序列之胺基酸之最大數目加以限制。多肽包括包含藉由肽鍵彼此接合之兩個或更多個胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所用，該術語係指短鏈(其在此項技術中通常亦稱為例如肽、寡肽及寡聚物)及長鏈(其在此項技術中一般稱為蛋白質，其存在多種類型)兩者。「多肽」包括例如生物學上活性片段、實質上同源多肽、寡肽、均二聚體、雜二聚體、多肽變體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白以及其他物質。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
如本文所用，「刺激」係指藉由刺激分子與其同源配位體之結合誘導之主要反應，其中該結合介導信號轉導事件。「刺激分子」為T細胞上之分子，例如T細胞受體(TCR)/CD3複合物，其特異性結合抗原呈現細胞上存在之同源刺激配位體。「刺激配位體」為一種配位體，其若存在於抗原呈現細胞(例如APC、樹突狀細胞、B細胞及其類似物)上則可與T細胞上之刺激分子特異性結合，由此藉由T細胞介導主要反應，包括但不限於活化、起始免疫反應、增殖及其類似反應。刺激配位體包括但不限於抗CD3抗體(諸如OKT3)、負載有肽之MHC I類分子、超促效劑抗CD2抗體及超促效劑抗CD28抗體。
如本文所用，「協同刺激信號」係指與諸如TCR/CD3接合之主要信號組合之引起T細胞反應之信號，該T細胞反應為諸如但不限於關鍵分子之增殖及/或上調或下調。
如本文所用，「協同刺激配位體」包括特異性結合T細胞上之同源協同刺激分子之抗原呈現細胞上之分子。協同刺激配位體之結合提供介導T細胞反應之信號，該T細胞反應包括但不限於增殖、活化、分化及其類似反應。協同刺激配位體誘導除主要信號以外藉由刺激分子，例如藉由T細胞受體(TCR)/CD3複合物與負載有肽之主要組織相容複合物(MHC)分子結合提供之信號。協同刺激配位體可包括但不限於3/TR6、4-1BB配位體、結合鐸配位體受體之促效劑或抗體、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD30配位體、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒侵入介體(HVEM)、人類白血球抗原G (HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白樣轉錄物(ILT) 3、誘導性協同刺激配位體(ICOS-L)、細胞間黏著分子(ICAM)、特異性結合B7-H3之配位體、淋巴毒素β受體、I類MHC鏈相關蛋白質A (MICA)、I類MHC鏈相關蛋白質B (MICB)、OX40配位體、PD-L2或程序性死亡(PD) L1。協同刺激配位體包括但不限於特異性結合存在於T細胞上之協同刺激分子的抗體，諸如但不限於4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、特異性結合CD83之配位體、淋巴細胞功能相關抗原1 (LFA-1)、自然殺手細胞受體C (NKG2C)、OX40、PD-1或腫瘤壞死因子超家族成員14 (TNFSF14或LIGHT)。
「協同刺激分子」為T細胞上之同源結合搭配物，其與協同刺激配位體特異性結合，由此藉由T細胞介導協同刺激反應，諸如但不限於增殖。協同刺激分子包括但不限於，「協同刺激分子」為T細胞上之同源結合搭配物，其與協同刺激配位體特異性結合，由此藉由T細胞介導協同刺激反應，諸如但不限於增殖。協同刺激分子包括但不限於4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD 33、CD 45、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 (α；β；δ；ε；γ；ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配位體、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96 (Tactile)、CDl-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fc γ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Ig α (CD79a)、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、整聯蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT (腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴細胞功能相關之抗原-1 (LFA-1 (CDl la/CD18))、MHC I類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴細胞性活化分子、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、鐸配位受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其片段、截斷或組合。
術語「減少」及「降低」在本文中亦可互換使用且指示小於原始之任何變化。「減少」及「降低」為相對術語，需要在量測前及量測後之間比較。「減少」及「降低」包括完全耗盡。
術語「改良」、「提高」、「抑制」及「減少」指示相對於基線或其他參考量測值之值。在一些實施例中，適當的參考量測值可包含在其他方面類似的條件下(例如，在試劑或治療存在之前及/或之後)或在適當的可比參考試劑存在下)在某些系統中(例如，在單個個體中)的量測值。在一些實施例中，適當參考量測值可包含在可比系統中之量測值，已知或預期該相當系統在存在相關試劑或治療之情況下以可比方式反應。
個體之「治療(treatment/treating)」係指對個體進行之任何類型之干預或處理，或向個體投與活性劑，目標為逆轉、緩解、改善、抑制、減緩或防止症狀、併發症或病狀之發作、進展、發展、嚴重程度或復發，或與疾病相關聯之生物化學標誌。在一個實施例中，「治療(treatment/treating)」包括部分緩解。在另一實施例中，「治療(treatment/treating)」包括完全緩解。在一些實施例中，治療可為對不展現相關疾病、病症及/或病狀之徵象的個體及/或僅展現疾病、病症及/或病狀之早期徵象的個體進行的治療。在一些實施例中，此類治療可為對展現相關疾病、病症及/或病狀之一或多種已確定徵象的個體進行的治療。在一些實施例中，治療可為對已診斷為罹患相關疾病、病症及/或病狀之個體的治療。在一些實施例中，治療可為對已知具有一或多種在統計學上與相關疾病、病症及/或病狀發展風險增加相關的易感性因素之個體的治療。
術語「試劑」可以指任何包含或複數個分子或實體之類別的分子或實體，其中之任一者可以為例如多肽、核酸、醣、脂質、小分子、金屬、細胞或生物體(例如其部分或提取物)或其組分。在一些實施例中，試劑可以分離或純形式利用。在一些實施例中，試劑可以粗或不純形式使用。在一些實施例中，試劑可作為群體、集合或庫提供，例如其可經篩選以鑑別或表徵其中存在之成員。
若一個事件或實體之存在、程度及/或形式與另一事件或實體相關聯，則兩個事件或實體彼此「相關」。舉例而言，若實體(例如，多肽、基因標籤、代謝物、微生物等)之存在、含量及/或形式與疾病、病症或病狀之發生及/或對疾病、病症或病狀之易感性(例如，跨越相關群體)相關，則將該實體視為與該疾病、病症或病狀相關。舉例而言，若兩個或更多個實體直接或間接地相互作用，則該兩個或更多個實體為與彼此物理上「相關」，以使得該等實體彼此物理上接近及/或保持彼此物理上接近(例如，結合)。在其他實例中，物理上彼此相關之兩個或更多個實體彼此共價聯接或連接，但其非共價結合，例如藉助於氫鍵、凡得瓦爾力相互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁性及其組合。
術語「一致性」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。用於計算與兩個所提供之多肽序列之間的一致性百分比的方法為已知的。舉例而言，兩個核酸或多肽序列之一致性百分比的計算可例如藉由出於最佳比較目的比對兩個序列來進行(例如，可將空隙引入第一及第二核酸序列中之一個或兩個中以便最佳比對，且出於比較目的可忽略非一致序列)。隨後比較相應位置處之核苷酸或胺基酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之對應位置相同之殘基(例如核苷酸或胺基酸)佔據時，則在彼位置處分子具有一致性。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有的一致位置數目的函數,視情況考慮為了兩個序列的最佳比對而可能需要引入之間隙的數量及各間隙的長度。序列之比較或比對及兩個序列之間的一致性百分比的確定可使用數學算法完成，諸如BLAST(鹼基局部比對檢索工具)。在一些實施例中，若聚合物分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相同(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，則將其視為彼此「同源」。
為計算一致性百分比，通常以提供序列之間的最大匹配之方式比對所比較之序列。可用於測定一致性百分比之電腦程式之一個實例為GCG程式包，其包括GAP (Devereux等人, (1984) Nucl. Acid Res. 12:387；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)。使用電腦演算法GAP來比對欲測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。比對序列以獲得其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度」，如由演算法所測定)。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)。其他演算法亦可用於比較胺基酸或核酸序列，包含可用於商業電腦程式(諸如BLASTN)中之用於核苷酸序列之胺基酸或核酸序列及用於胺基酸序列之BLASTP、空隙BLAST及PSI-BLAST。例示性此類程式描述於以下：Altschul等人, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul等人, Methods in Enzymology; Altschul等人, “Gapped BLAST及PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs,” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis等人, Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998;及Misener等人, (編), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 第132卷), Humana Press, 1999。除識別類似序列以外，上文所提及之程式一般提供類似性程度之指示。在一些實施例中，相比於殘留物之相關片段(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，若兩個序列相對應的殘留物至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多類似及/或相同，則將兩個序列認為實質上類似。在一些實施例中，相關片段為完整序列。在一些實施例中，相關片段為至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或更多個殘留物。具有基本上序列相似性之序列可為彼此之同源物。
「組合療法」係指個體同時暴露於兩種或更多種治療方案(例如兩種或更多種治療部分)之彼等情況。在一些實施例中，兩種或更多種方案可同時投與；在一些實施例中，此類方案可依序投與(例如在投與第二方案之任何劑量之前投與第一方案之所有「劑量」)；在一些實施例中，此類試劑以重疊給藥方案投與。在一些實施例中，「投與」組合療法可涉及向接受呈組合形式之其他藥劑或儀器治療之個體投與一或多種藥劑或儀器治療。為了清楚起見，組合療法不需要個別試劑以單一組合物形式一起投與(或甚至必須同時)，儘管在一些實施例中，兩種或更多種試劑或其活性部分可一起以組合組合物形式或甚至以組合化合物形式(例如作為單一化學複合物或共價實體之一部分)投與。
「對應於」可用於經由與適當參考分子或組合物比較指明分子或組合物中之結構要素之位置/身分。舉例而言，在一些實施例中，聚合物中之單體殘基(例如多肽中之胺基酸殘基或聚核苷酸中之核酸殘基)可識別為「對應於」適當的參考聚合物中之殘基。舉例而言，出於簡化之目的，多肽中之殘基可使用典型編號系統基於參考相關多肽命名，使得「對應於」位置100處之殘基的胺基酸例如無需實際上為胺基酸鏈中之第100個胺基酸，限制條件為其對應於參考多肽中位置100處發現之殘基。可利用例如以識別根據本發明之多肽及/或核酸中之「對應」殘基的各種序列比對策略，包括軟體程式，諸如BLAST、CS-BLAST、CUSASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE。
術語「域」係指實體之一部分。在一些實施例中，「域」與實體之結構性及/或功能性特點相關聯，例如，以使得當域與其親本實體之其餘部分物理上分離時，其實質上或完全保留特定結構性及/或功能性特點。在一些實施例中，域可包含實體之一部分，該實體在與彼(親本)實體分離且與不同(受體)實體聯接或連接時，實質上保留及/或賦予受體實體例如在親本實體中表徵其之一或多種結構性及/或功能性特點。在一些實施例中，域為分子(例如小分子、碳水化合物、脂質、核酸或多肽)之一部分。在一些實施例中，域為多肽之區段；在一些此類實施例中，域之特徵為結構元件(例如胺基酸序列或序列模體、α-螺旋特徵、β-褶板特徵、捲曲螺旋特徵、無規捲曲特徵等)及/或特定功能性特點(例如結合活性、酶活性、摺疊活性、信號傳導活性等)。
術語「劑型」可用於指用於投與個體之活性劑(例如抗原結合系統或抗體)之物理離散單位。通常，各此類單位含有預定量之活性劑。在一些實施例中，此類量為適合於根據已確定當向相關群體投與時與所需或有益結果相關之給藥方案投與之單位劑量(或其整個部分)。向個體投與之治療性組合物或試劑之總量由一或多個醫療醫師確定且可涉及投與多於一種劑型。
術語「給藥方案」可用於指單獨地向個體投與之一或多個單位劑量集合。在一些實施例中，指定治療劑具有建議的給藥方案，其可涉及一或多個劑量。在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量，該等劑量中之每一者均在時間上與其他劑量分開。在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量且連續劑量彼此分開相等長度之時間段；在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量且連續劑量彼此分開至少兩種不同長度之時間段。在一些實施例中，給藥方案內之所有劑量具有相同單位劑量的量。在一些實施例中，給藥方案內之不同劑量具有不同量。在一些實施例中，給藥方案包含以第一給藥量進行第一次給藥，隨後以不同於第一給藥量之第二給藥量進行一或多次額外給藥。在一些實施例中，週期性調節給藥方案以獲得所需或有利結果。
「效應功能」係指抗體Fc區與Fc受體或配位體之相互作用的生物結果。效應功能包含但不限於抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)及補體介導之細胞毒性(CMC)。效應功能可為抗原結合依賴性、抗原結合非依賴性或兩者。ADCC係指抗體結合之靶細胞經免疫效應細胞溶解。不希望受任何理論束縛，ADCC一般理解為涉及具有Fc受體(FcR)之效應細胞，其識別且隨後殺滅經抗體塗佈之靶細胞(例如在其結合抗體之表面抗原上表現的細胞)。介導ADCC之效應細胞可包含免疫細胞，包含但不限於自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜鹼性球、嗜酸性球中之一或多者。
「效應細胞」係指表現一或多種Fc受體且介導一或多種效應功能之免疫系統的細胞。在一些實施例中，效應細胞可包含但不限於單核球、巨噬細胞、嗜鹼性球、樹突狀細胞、嗜酸性球、肥大細胞、血小板、大顆粒淋巴細胞、蘭格漢氏亞膠細胞(Langerhans' cell)、自然殺手(NK)細胞、T淋巴細胞及B淋巴細胞中之一或多者。效應細胞可具有包含但不限於人類、小鼠、大鼠、兔及猴之任何生物體。
術語「賦形劑」係指可包含於組合物中例如以提供或促成所需稠度或穩定化效應之試劑。在一些實施例中，適合的醫藥賦形劑可包含例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、丙三醇單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇及其類似賦形劑。
如本文所描述之材料或實體之「片段」或「部分」具有包含例如物理實體或抽象實體之整體之離散部分的結構。在一些實施例中，片段缺乏一或多個在整體中發現之部分。在一些實施例中，片段係由以下組成或包含以下：在整體中找到之特徵結構元素、域或部分。在一些實施例中，聚合物片段包含以下或由以下組成：如在整個聚合物中發現的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多個單體單元(例如殘基)。在一些實施例中，聚合物片段包含以下或由以下組成：如在整個聚合物(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)中發現的至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、25%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的單體單元(例如殘基)。在一些實施例中，整個材料或實體可稱作片段之「親本」。
術語「融合多肽」或「融合蛋白質」一般係指包含至少兩個片段之多肽。一般而言，若兩個片段為(1)在自然界中不包含於同一肽中，及/或(2)先前在單個多肽中不彼此聯接或連接，及/或(3)已經由人工操作彼此聯接或連接之部分，則將含有至少兩個此類片段之多肽視為融合多肽。
術語「基因產物」或「表現產物」一般係指由自基因轉錄之RNA編碼之基因(預處理及/或後處理)或多肽(修飾前及/或修飾後)轉錄的RNA。
術語「分離」係指(1)已在較早時間與其相關聯或與該物質將以其他方式相關聯之至少一些組分分離，及/或(2)存在於包含一或多種已知或未知污染物之有限或經限定量或濃度之組合物中的物質。在一些實施例中，經分離物質可與約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%(例如，85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)之其他非物質組分分離，其中該物質在較早時間為相關聯的，例如其中該物質先前或以其他方式相關聯的其他組分或污染物。在某些情況下，若物質存在於包含有限或減少量或濃度之相同或類似類型之分子的組合物中，則分離該物質。舉例而言，在某些情況下，若核酸、DNA或RNA物質存在於包含有限或減少量或濃度之非物質核酸、DNA或RNA分子的組合物中，則分離該核酸、DNA或RNA物質。舉例而言，在某些情況下，若多肽物質存在於包含有限或減少量或濃度之非物質多肽分子的組合物中，則將其分離。在某些實施例中，量可為例如相對於組合物中所需物質之量所量測之量。在某些實施例中，有限量可為不超過組合物中之物質之量的100%，例如不超過組合物中之物質之量的1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% (例如，85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)的量。在某些情況下，相對於所選擇物質，組合物為純的或基本上純的。在一些實施例中，經分離物質為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%(例如85%-90%、85%-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)純的。若物質基本上不含其他組分或污染物，則其為「純的」。在一些實施例中，在已與諸如一或多種載劑或賦形劑(例如緩衝劑、溶劑、水等)之某些其他組分組合之後，仍可將物質視為「分離的」或甚至「純的」；在此類實施例中，物質之分離或純度%在不包含此類載劑或賦形劑之情況下計算。
「核酸」係指核苷酸之任何聚合鏈。核酸可為DNA、RNA或其組合。在一些實施例中，核酸包含一或多個天然核酸殘基。在一些實施例中，核酸包含一或多種核酸類似物。在一些實施例中，核酸藉由以下中之一或多者製備：自天然來源分離、藉由基於互補模板之聚合進行酶合成(活體內或活體外)、在重組細胞或系統中複製及化學合成。在一些實施例中，核酸為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多個殘基長(例如20至100、20至500、20至1000、20至2000或20至5000或更多個殘基)。在一些實施例中，核酸部分或完全為單鏈；在一些實施例中，核酸部分或完全為雙鏈。在一些實施例中，核酸具有包含至少一個元件的核苷酸序列，該至少一個元件編碼或為編碼多肽之序列的補體。
「可操作地連接」係指所描述之組分處於准許其以其預期方式作用的關係中的並接。舉例而言，「可操作地連接」至功能元件之控制元件係以使得功能元件之表現及/或活性在與控制元件相容之條件下達成的方式相關聯。
術語「醫藥學上可接受」係指當向受體投與時，對其受體無害或任何有害影響不超過對其受體之益處的分子或組合物。關於用於調配如本文所揭示之組合物的載劑、稀釋劑或賦形劑，醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑必須與組合物之其他成分相容且對其受體無害，或任何有害影響不超過對受體之益處。術語「醫藥學上可接受之載劑」意謂涉及將藥劑自身體之一個部分攜帶或輸送至另一部分(例如，自一個器官至另一個器官)的醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑囊封材料。存在於醫藥組合物中之各載劑必須在與調配物之其他成分相容且對患者無害，或任何有害影響不超過對受體之益處之意義上為「可接受的」。可充當醫藥學上可接受之載劑之材料的一些實例包含：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及醋酸纖維素；粉末狀黃蓍；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可豆油及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如丙三醇、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原水；等滲生理食鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酸酐；及其他醫藥調配物中採用的對人體無害的相容的物質。
術語「醫藥組合物」指將活性劑與一或多種醫藥學上可接受之載劑一起調配之組合物。在一些實施例中，活性劑以適合於投與之單位劑量的量存在於治療方案中，該治療方案在向相關個體或群體投與時展示統計學上顯著之實現預定治療作用之概率。在一些實施例中，醫藥組合物可調配為用於以固體或液體形式投與，包含但不限於適用於以下形式：經口投與，例如灌藥(水性或非水性溶液或懸浮液)、錠劑(例如靶向經頰、舌下及全身吸收之彼等錠劑)、大丸劑、散劑、顆粒、用於向舌施用之糊劑；非經腸投與，例如藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射以例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放調配物投與；局部施用，例如以施用至皮膚、肺或口腔之乳膏、軟膏或控制釋放貼劑或噴霧形式施用；陰道內或直腸內，例如以子宮托、乳膏或泡沫；舌下；經眼；經皮；或經鼻、經肺及向其他黏膜表面。
術語「參考」描述相對於其進行比較之標準或對照。舉例而言，在一些實施例中，將所關注之藥劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值與作為藥劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值之參考或對照進行比較。在一些實施例中，參考或對照實質上與所關注之測試、量測或測定同時進行測試、量測及/或測定。在一些實施例中，參考或對照為視情況在有形介質中實施之歷史參考或對照。一般而言，在與評定下之彼等相當的條件或情形下測定或表徵參考或對照。當存在足夠相似性以證明對所選參考或對照的依賴及/或比較。
「調節T細胞」(「Treg」、「Treg細胞」或「Tregs」)係指CD4+淋巴細胞參與控制某些免疫活性之譜系，例如自體免疫、過敏及對感染之反應。調節T細胞可調節T細胞群體之活性，且其亦可影響某些先天免疫系統細胞類型。Treg可藉由生物標記CD4、CD25及Foxp3之表現以及CD127之較低表現來識別。天然產生Treg細胞通常構成約5-10%之外周CD4+ T淋巴細胞。然而，在腫瘤微環境內的TReg細胞(亦即腫瘤浸潤性Treg細胞)，TReg細胞可構成多達20-30%之總CD4+ T淋巴細胞群體。
術語「樣品」通常係指獲自或來源於所關注之來源之材料的等分試樣。在一些實施例中，所關注的來源為生物或環境來源。在一些實施例中，所關注的來源可包含細胞或生物體，諸如細胞群體、組織或動物(例如人類)。在一些實施例中，所關注的來源為生物組織或體液。在一些實施例中，生物組織或體液可包含羊膜液、水狀液、腹水、膽汁、骨髓、血液、母乳、腦脊髓液、耵聹、乳糜、幾丁質、精液、內淋巴、外泌液、糞便、胃酸、胃液、淋巴、黏液、心包液、外淋巴液、腹膜液、胸膜液、膿液、汗液、唾液、皮脂、精液、漿液、陰垢、痰、滑液、汗水、淚液、尿液、陰道分泌物、玻璃體液、嘔吐物及/或其組合或組分。在一些實施例中，生物流體可包含胞內流體、胞外流體、血管內流體(血漿)、間質液、淋巴流體及/或轉細胞流體。在一些實施例中，生物流體可包含植物分泌物。在一些實施例中，生物組織或樣品可例如藉由抽吸、切片檢查(例如細針或組織切片)、拭子(例如經口、經鼻、皮膚或陰道拭子)、刮擦、手術、洗滌或灌洗(例如肺泡、導管、經鼻、經眼、經口、子宮、陰道或其他洗滌或灌洗)獲得。在一些實施例中，生物樣品包含自個體獲得之細胞。在一些實施例中，樣品為直接獲自由任何適合之手段所關注之來源的「初級樣品」。在一些實施例中，如將自上下文清楚得知，術語「樣品」係指藉由處理(例如，藉由自其移除一或多種組分及/或藉由向其中添加一或多種試劑)初級樣品獲得之製劑。此類「經處理之樣品」可包含例如自樣品提取或藉由使初級樣品經受一或多種技術(諸如核酸之擴增或逆轉錄、某些組分之分離及/或純化等)獲得的核酸或蛋白質。
術語「癌症階段」係指癌症進展水準之定性或定量評定。在一些實施例中，用於確定癌症階段之準則可包含但不限於以下中之一或多者：癌症位於身體中何處、腫瘤尺寸、癌症是否已擴散至淋巴結、癌症是否已擴散至身體之一或多個不同部分等。在一些實施例中，癌症可使用稱作TNM系統分級，根據該系統，T係指主要腫瘤(通常稱為原發腫瘤)之大小及範圍；N係指具有癌症之鄰近淋巴結之數目；且M係指癌症是否已轉移。在一些實施例中，癌症可稱為階段0(異常細胞存在，未擴散至附近組織，亦稱為原位癌或CIS；CIS不為癌症，但可能變為癌症)、階段III(癌症存在；數目愈高，腫瘤愈大且愈多，其已擴散至附近組織)或階段IV(癌症已擴散至身體之遠端部分)。在一些實施例中，癌症可指派給選自由以下組成之群的階段：原位；局部化(癌症受限於其開始之地方，無其擴散之跡象)；局部(癌症已擴散至附近淋巴結、組織或器官)：遠端(癌症已擴散至身體之遠端部分)；及未知(不存在足夠資訊以確定階段)。
片語「治療劑」可指當向生物體投與時引發所需藥理學效果之任何藥劑。在一些實施例中，若藥劑在適合的群體中展現統計顯著效果，則將其視為治療劑。在一些實施例中，適合的群體可為模型生物體或人類個體之群體。在一些實施例中，適合的群體可根據生物標記之存在或不存在等由各種準則定義，諸如某一年齡組、性別、遺傳背景、先前存在之臨床病狀。在一些實施例中，治療劑為可用於緩解、改善、減輕、抑制、預防疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或減小其一或多種症狀或特徵之發生率的物質。在一些實施例中，治療劑為在可出售以向人類投與之前已經或需要由政府機構批准之藥劑。在一些實施例中，治療劑為醫學處方所需要以用於向人類投與之藥劑。
在以下分章節中更詳細地描述本發明之各種態樣。本發明提供抗原結合系統及包含至少一種抗CD20結合模體之結合劑。本發明尤其提供適用於治療癌症及/或用於引發或調節免疫反應之方法及組合物。在某些實施例中，本發明包含抗原結合系統及為雙靶向劑的結合劑，因為其包含抗CD20結合模體及針對第二抗原或抗原決定基之第二結合模體。在一些情況下，第二結合模體選擇性地結合CD19。在各種實施例中，一或多個結合模體為scFv。本文提供例示性結合模體胺基酸序列及編碼其之核酸序列。在一些實施例中，本發明之抗原結合系統為嵌合抗原受體。在一些實施例中，本發明之抗原結合系統為雙特異性或雙順反子嵌合抗原受體。在一些實施例中，本發明之結合劑為經工程改造之T細胞受體。
本發明之各種實施例提供編碼本文提供之結合模體或抗原結合系統，例如編碼抗CD20/抗CD19抗原結合系統，諸如雙特異性或雙順反子抗CD20/抗CD19嵌合抗原受體之載體的載體。本發明之各種實施例提供作為編碼或表現本文提供之抗原結合系統或結合模體之細胞的結合劑，例如經工程改造以編碼或表現抗CD20/抗CD19嵌合抗原受體，諸如雙特異性或雙順反子抗CD20/抗CD19嵌合抗原受體之T細胞。本發明提供結合劑，例如包含為經整合基因(例如所關注之核苷酸序列)遺傳修飾之免疫細胞的結合劑(例如包含此類核苷酸序列之組成性表現構築體及/或誘導型表現構築體)。在一些實施例中，本發明提供治療患有腫瘤之個體的方法，其包含向個體投與本文所述之結合劑療法及/或本文所述之蛋白質治療劑。在一些實施例中，方法進一步包含投與一或多種額外療法(例如第二結合劑(例如CAR-T細胞、CAR-NK細胞、TCR-T細胞、TIL細胞、同種異體NK細胞及自體NK細胞)、抗體-藥物結合物、抗體、雙特異性抗體、T細胞接合雙特異性抗體、經工程改造之抗體及/或本文所描述之多肽)。
本發明之其他特徵、目標及優勢在以下實施方式中顯而易見。然而，應理解，實施方式雖然指示本發明之實施例，但仍僅以說明而非限制之方式給出。
本發明之抗CD20結合模體可包含如本文所述之抗體中所發現的抗原結合序列。在一些情況下，本發明之抗CD20結合模體包含本文所述之抗原結合片段。除非另外指明，否則應瞭解，本發明中對CD20之參考係關於人類CD20。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含至少一個本文所提供之重鏈CDR(HCDR)，例如至少一個表4-13中之任一者中所揭示之HCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含兩個本文所提供之HCDR，例如至少兩個表4-13中之任一者中所揭示之HCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含三個本文所提供之HCDR，例如表4-13中之任一者中所揭示之三個HCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含至少一個本文提供之輕鏈CDR(LCDR)，例如至少一個表4-13中之任一者中所揭示之LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文提供之兩個LCDR，例如表4-13中之任一者中揭示之至少兩個LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文提供之三個LCDR，例如表4-13中之任一者中揭示之三個LCDR。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所提供之至少一個HCDR，例如表4-13中之任一者中所揭示之至少一個HCDR；及本文所提供之至少一個LCDR，例如表4-13中之任一者中所揭示之至少一個LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文中所提供之一個HCDR，例如表4-13中之任一者中所揭示之至少一個HCDR；及本文中所提供之一個LCDR，例如來源於表4-13之與HCDR相同之表中。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文提供之兩個HCDR，例如表4-13中之任一者中揭示之至少兩個HCDR；及本文提供之兩個LCDR，例如表4-13中之任一者中揭示之至少兩個LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含兩個本文所提供之HCDR，例如至少兩個表4-13中之任一者中所揭示之HCDR；及兩個本文所提供之LCDR，例如來源於表4-13之與HCDR相同之表。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文提供之三個HCDR，例如表4-13中之任一者中揭示之三個HCDR；及本文提供之三個LCDR，例如表4-13中之任一者中揭示之三個LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含三個本文提供之HCDR，例如表4-13中之任一者中所揭示之三個HCDR及來源於表4-13之與HCDR相同之表的三個LCDR。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含至少一個本文揭示之重鏈可變域之重鏈構架區(重鏈FR)，例如表4-13中之任一者中揭示之重鏈可變域之至少一個重鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之兩個重鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少兩個重鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之輕鏈可變域之至少一個輕鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之至少一個輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之輕鏈可變域之兩個輕鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之至少兩個輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之至少一個重鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少一個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之至少一個輕鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之至少一個輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之一個重鏈FR，例如揭示於表4-13中之任一者中之重鏈可變域之至少一個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之一個輕鏈FR，例如來源於表4-13之與重鏈FR相同之表中。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之兩個重鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少兩個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之兩個輕鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之至少兩個輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之兩個重鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少兩個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之兩個輕鏈FR，例如來源於表4-13之與重鏈FR相同之表中。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR，例如表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR，及來源於表4-13之與重鏈FR相同之表中之三個輕鏈FR。
表4-13中所提供之例示性抗體序列適用於包含例如四聚抗體、單特異性抗體、雙特異性抗體、抗原結合片段或結合模體之任何抗體型式。表4-13中所提供之重鏈可變域及輕鏈可變域及其部分可包含於結合模體中。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含一個、兩個或三個FR，該等FR一起或各自獨立地與表4-13中之任一者中所揭示之重鏈可變域之重鏈可變域之對應FR有至少75%一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%，例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含一個、兩個或三個FR，該等FR一起或各自獨立地與表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之輕鏈可變域之對應FR具有至少75%一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%)。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含至少一個重鏈可變域，其與表4-13中之任一者中所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含兩個重鏈可變域，其各自與表4-13中所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，該等重鏈可變域可相同或不同。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含至少一個輕鏈可變域，其與表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含兩個輕鏈可變域，其各自與表4-13中之任一者中所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，該等輕鏈可變域可相同或不同。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含至少一個重鏈可變域，其與表4-13中所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)；及至少一個輕鏈可變域，其與表4-13中所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。在某些實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含一個重鏈可變域，其與表4-13中所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)；及一個輕鏈可變域，其與表4-13中所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，其中重鏈可變域及輕鏈可變域視情況來源於表4-13之相同表中。
在各種實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含兩個重鏈可變域，其各自與表4-13中所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)；及兩個輕鏈可變域，其各自與表4-13中所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，其中在各種實施例中，(i)重鏈可變域中之每一者可相同或不同；(ii)輕鏈可變域中之每一者可相同或不同；(iii)至少一個重鏈可變域及至少一個輕鏈可變域可來源於表4-13之相同表中；或(iv)兩個重鏈可變域及兩個輕鏈可變域全都來源於表4-13之相同表中。表4-13中之每一者代表例示性抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域序列，其包含(i)例示性抗體之重鏈可變域；(ii)編碼重鏈可變域之DNA序列；(iii)根據IMGT、Kabat及Chothia編號之重鏈可變域的三個重鏈可變域CDR；(iv)例示性抗體之輕鏈可變域；(v)編碼輕鏈可變域之DNA序列；及(vi)根據IMGT、Kabat及Chothia編號之輕鏈可變域的三個輕鏈可變域CDR。各表中提供之資訊提供構架胺基酸序列，以及編碼各CDR胺基酸序列之核苷酸序列及編碼相應FR胺基酸序列之核苷酸序列。
在各種實施例中，結合模體可包含本發明之重鏈可變域(例如與表4-13中之任一者之重鏈可變域具有至少75%序列一致性，例如至少80%、85%、90%、95%、或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)；本發明之輕鏈可變域(例如與表4-13中之任一者之輕鏈可變域具有至少75%序列一致性，例如至少80%、85%、90%、95%、或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)；及連接子(例如根據SEQ ID NO:247之連接子及/或根據SEQ ID NO:307-313中之任一者之連接子；參見例如Whitlow等人, Protein Eng. 1993年11月;6(8):989-95.)。在各種實施例中，結合模體可包含前導序列；本發明之重鏈可變域(例如與表4-13中之任一者之重鏈可變域具有至少75%序列一致性，例如至少80%、85%、90%、95%、或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)；本發明之輕鏈可變域(例如與表4-13中之任一者之輕鏈可變域具有至少75%序列一致性，例如至少80%、85%、90%、95%、或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)；及連接子。若提供包含本發明之重鏈可變域及本發明之輕鏈可變域的結合模體之胺基酸或核苷酸序列，則鑒於本發明，連接兩個可變域之連接子將自序列顯而易見。若提供包含本發明之重鏈可變域及本發明之輕鏈可變域的結合模體之胺基酸或核苷酸序列，則鑒於本發明，前導序列將為顯而易見的。為避免疑問，本發明之重鏈可變域及輕鏈可變域可以任何位向，例如其中重鏈可變域在輕鏈可變域之C末端或其中重鏈可變域在輕鏈可變域之N末端的位向存在。在各種實施例中，結合模體可包含根據SEQ ID NO:247之連接子及/或鄰近於一或多種其他連接子的根據SEQ ID NO:307-313中之任一者之連接子。
在某些實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含結合模體，該結合模體包含本發明之重鏈可變域、本發明之輕鏈可變域及與SEQ ID NO:247具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)之連接子。在某些實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含結合模體，該結合模體包含根據SEQ ID NO:247之連接子及/或根據SEQ ID NO:307-313中之任一者之連接子。在某些實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含結合模體，該結合模體包含本發明之重鏈可變域、本發明之輕鏈可變域及與SEQ ID NO:245具有至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)之前導序列。在某些實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含結合模體，其包含根據SEQ ID NO:245之CSF2RA前導序列。在某些實施例中，本發明之抗CD20結合模體包含結合模體，該結合模體包含本發明之重鏈可變域、本發明之輕鏈可變域、本發明之連接子及本發明之前導序列。編碼抗CD19結合模體及其組分之例示性核苷酸序列發現於SEDQ ID NO:246及248中。在各種實施例中，本發明之結合模體具有根據表53之序列(SEQ ID NO:251-260)中之任一者的序列。
基於本文所提供之例示性抗體(諸如Ab1)的本發明之結合劑可以提供於任何片段或格式中，其包含根據所指示之例示性抗體之重鏈可變域及根據所指示之例示性抗體之輕鏈可變域。
表4：例示性抗體序列1(Ab1)
SEQ ID NO: 說明 序列
1 重鏈可變域 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGSWYSNWFDPWGQGTMVTVSS
2 VH (DNA) CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCGACCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGGTGGAGGAAGTTGGTACAGCAACTGGTTCGACCCATGGGGACAGGGTACAATGGTCACCGTCTCCTCA
3 CDRH1 IMGT (Prot) GGSFSGYY
4 CDRH1 Kabat (Prot) GYYWS
5 CDRH1 Chothia (Prot) GGSFSG
6 CDRH2 IMGT (Prot) IDHSGST
7 CDRH2 Kabat (Prot) EIDHSGSTNYNPSLKS
8 CDRH2 Chothia (Prot) DHSGS
9 CDRH3 IMGT (Prot) ARGGGSWYSNWFDP
10 CDRH3 Kabat (Prot) GGGSWYSNWFDP
11 CDRH3 Chothia (Prot) GGGSWYSNWFDP
12 輕鏈可變域 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQDRSLPPTFGGGTKVEIK
13 VL (DNA) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAGCAGGACCGAAGTCTCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
14 CDRL1 IMGT (Prot) RASQSISSWLA
15 CDRL1 Kabat (Prot) RASQSISSWLA
16 CDRL1 Chothia (Prot) RASQSISSWLA
17 CDRL2 IMGT (Prot) DASSLES
18 CDRL2 Kabat (Prot) DASSLES
19 CDRL2 Chothia (Prot) DASSLES
20 CDRL3 IMGT (Prot) QQDRSLPPT
21 CDRL3 Kabat (Prot) QQDRSLPPT
22 CDRL3 Chothia (Prot) QQDRSLPPT
表5：例示性抗體序列2(Ab2)
SEQ ID NO: 說明 序列
23 重鏈可變域 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGIHWNWIRQPPGKGLEWIGDIDTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLGQESATYLGMDVWGQGTTVTVSS
24 VH (DNA) CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTATCCACTGGAACTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGACATCGACACAAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGATTGGGACAGGAGTCAGCCACCTATCTCGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA
25 CDRH1 IMGT (Prot) GGSFSGIH
26 CDRH1 Kabat (Prot) GIHWN
27 CDRH1 Chothia (Prot) GGSFSG
28 CDRH2 IMGT (Prot) IDTSGST
29 CDRH2 Kabat (Prot) DIDTSGSTNYNPSLKS
30 CDRH2 Chothia (Prot) DTSGS
31 CDRH3 IMGT (Prot) ARLGQESATYLGMDV
32 CDRH3 Kabat (Prot) LGQESATYLGMDV
33 CDRH3 Chothia (Prot) LGQESATYLGMDV
34 輕鏈可變域 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLYTYPFTFGGGTKVEIK
35 VL (DNA) GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCTCTACACCTACCCTTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
36 CDRL1 IMGT (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
37 CDRL1 Kabat (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
38 CDRL1 Chothia (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
39 CDRL2 IMGT (Prot) WASTRES
40 CDRL2 Kabat (Prot) WASTRES
41 CDRL2 Chothia (Prot) WASTRES
42 CDRL3 IMGT (Prot) QQLYTYPFT
43 CDRL3 Kabat (Prot) QQLYTYPFT
44 CDRL3 Chothia (Prot) QQLYTYPFT
表6：例示性抗體序列3(Ab3)
SEQ ID NO: 說明 序列
45 重鏈可變域 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSS
46 VH (DNA) CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGAGACTGACTACAGCAGCGGAATGGGATACGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA
47 CDRH1 IMGT (Prot) GGSISSSSYY
48 CDRH1 Kabat (Prot) SSSYYWG
49 CDRH1 Chothia (Prot) GGSISSSS
50 CDRH2 IMGT (Prot) IYYSGST
51 CDRH2 Kabat (Prot) SIYYSGSTYYNPSLKS
52 CDRH2 Chothia (Prot) YYSGS
53 CDRH3 IMGT (Prot) ARETDYSSGMGYGMDV
54 CDRH3 Kabat (Prot) ETDYSSGMGYGMDV
55 CDRH3 Chothia (Prot) ETDYSSGMGYGMDV
56 輕鏈可變域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIK
57 VL (DNA) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAACAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGCCAGCAAAGCCTCGCCGACCCTTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
58 CDRL1 IMGT (Prot) RASQSINSYLN
59 CDRL1 Kabat (Prot) RASQSINSYLN
60 CDRL1 Chothia (Prot) RASQSINSYLN
61 CDRL2 IMGT (Prot) AASSLQS
62 CDRL2 Kabat (Prot) AASSLQS
63 CDRL2 Chothia (Prot) AASSLQS
64 CDRL3 IMGT (Prot) QQSLADPFT
65 CDRL3 Kabat (Prot) QQSLADPFT
66 CDRL3 Chothia (Prot) QQSLADPFT
表7：例示性抗體序列4 (Ab4)
SEQ ID NO: 說明 序列
67 重鏈可變域 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKEYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYSGHTYYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGPHYDDWSGFIIWFDPWGQGTLVTVSS
68 VH (DNA) CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTAAAGAATATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAGTGGTCACACATACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGGGCCTCACTACGACGACTGGAGCGGATTTATCATATGGTTCGACCCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA
69 CDRH1 IMGT (Prot) GYTFKEYG
70 CDRH1 Kabat (Prot) EYGIS
71 CDRH1 Chothia (Prot) GYTFKE
72 CDRH2 IMGT (Prot) ISAYSGHT
73 CDRH2 Kabat (Prot) WISAYSGHTYYAQKLQ
74 CDRH2 Chothia (Prot) SAYSG
75 CDRH3 IMGT (Prot) ARGPHYDDWSGFIIWFDP
76 CDRH3 Kabat (Prot) GPHYDDWSGFIIWFDP
77 CDRH3 Chothia (Prot) GPHYDDWSGFIIWFDP
78 輕鏈可變域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRFPPTFGQGTKVEIK
79 VL (DNA) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCTTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGGTTTCCTCCTACCTTTGGCCAAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
80 CDRL1 IMGT (Prot) RASQSISSYLN
81 CDRL1 Kabat (Prot) RASQSISSYLN
82 CDRL1 Chothia (Prot) RASQSISSYLN
83 CDRL2 IMGT (Prot) AASSLQS
84 CDRL2 Kabat (Prot) AASSLQS
85 CDRL2 Chothia (Prot) AASSLQS
86 CDRL3 IMGT (Prot) QQSYRFPPT
87 CDRL3 Kabat (Prot) QQSYRFPPT
88 CDRL3 Chothia (Prot) QQSYRFPPT
表8：例示性抗體序列5 (Ab5)
SEQ ID NO: 說明 序列
89 重鏈可變域 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSPDHYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYASGSTFYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSS
90 VH (DNA) CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTCCCGACCACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGTCCATCTACGCCAGTGGGAGCACCTTCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGAGACTGACTACAGCAGCGGAATGGGATACGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA
91 CDRH1 IMGT (Prot) GGSISSPDHY
92 CDRH1 Kabat (Prot) SPDHYWG
93 CDRH1 Chothia (Prot) GGSISSPD
94 CDRH2 IMGT (Prot) IYASGST
95 CDRH2 Kabat (Prot) SIYASGSTFYNPSLKS
96 CDRH2 Chothia (Prot) YASGS
97 CDRH3 IMGT (Prot) ARETDYSSGMGYGMDV
98 CDRH3 Kabat (Prot) ETDYSSGMGYGMDV
99 CDRH3 Chothia (Prot) ETDYSSGMGYGMDV
100 輕鏈可變域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIK
101 VL (DNA) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAACAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGCCAGCAAAGCCTCGCCGACCCTTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
102 CDRL1 IMGT (Prot) RASQSINSYLN
103 CDRL1 Kabat (Prot) RASQSINSYLN
104 CDRL1 Chothia (Prot) RASQSINSYLN
105 CDRL2 IMGT (Prot) AASSLQS
106 CDRL2 Kabat (Prot) AASSLQS
107 CDRL2 Chothia (Prot) AASSLQS
108 CDRL3 IMGT (Prot) QQSLADPFT
109 CDRL3 Kabat (Prot) QQSLADPFT
110 CDRL3 Chothia (Prot) QQSLADPFT
表9：例示性抗體序列6 (Ab6)
SEQ ID NO: 說明 序列
111 重鏈可變域 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLDTEGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYFNDQKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAVYYCARDTGYSRWYYGMDVWGQGTTVTVSS
112 VH (DNA) CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTGACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCGACACTGAAGGAGTGGGTGTGGGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACTCATTTATTTCAATGATCAAAAGCGCTACAGCCCATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCACCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTCCTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGACACGGGATACAGCCGATGGTACTACGGCATGGATGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA
113 CDRH1 IMGT (Prot) GFSLDTEGVG
114 CDRH1 Kabat (Prot) TEGVGVG
115 CDRH1 Chothia (Prot) GFSLDTEG
116 CDRH2 IMGT (Prot) IYFNDQK
117 CDRH2 Kabat (Prot) LIYFNDQKRYSPSLKS
118 CDRH2 Chothia (Prot) YFNDQ
119 CDRH3 IMGT (Prot) ARDTGYSRWYYGMDV
120 CDRH3 Kabat (Prot) DTGYSRWYYGMDV
121 CDRH3 Chothia (Prot) DTGYSRWYYGMDV
122 輕鏈可變域 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYAYPITFGGGTKVEIK
123 VL (DNA) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGGCATACGCCTACCCTATCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
124 CDRL1 IMGT (Prot) RASQGISSWLA
125 CDRL1 Kabat (Prot) RASQGISSWLA
126 CDRL1 Chothia (Prot) RASQGISSWLA
127 CDRL2 IMGT (Prot) AASSLQS
128 CDRL2 Kabat (Prot) AASSLQS
129 CDRL2 Chothia (Prot) AASSLQS
130 CDRL3 IMGT (Prot) QQAYAYPIT
131 CDRL3 Kabat (Prot) QQAYAYPIT
132 CDRL3 Chothia (Prot) QQAYAYPIT
表10：例示性抗體序列7 (Ab7)
SEQ ID NO: 說明 序列
133 重鏈可變域 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFEKYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIYHSGLTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVRYDSSDSYYYSYDYGMDVWGQGTTVTVSS
134 VH (DNA) CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCGAAAAATACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTACCATAGTGGACTCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGTCAGATACGACAGCAGCGACTCCTACTACTATAGCTACGATTATGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA
135 CDRH1 IMGT (Prot) GGSFEKYY
136 CDRH1 Kabat (Prot) KYYWS
137 CDRH1 Chothia (Prot) GGSFEK
138 CDRH2 IMGT (Prot) IYHSGLT
139 CDRH2 Kabat (Prot) EIYHSGLTNYNPSLKS
140 CDRH2 Chothia (Prot) YHSGL
141 CDRH3 IMGT (Prot) ARVRYDSSDSYYYSYDYGMDV
142 CDRH3 Kabat (Prot) VRYDSSDSYYYSYDYGMDV
143 CDRH3 Chothia (Prot) VRYDSSDSYYYSYDYGMDV
144 輕鏈可變域 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSYSFPWTFGGGTKVEIK
145 VL (DNA) GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTAGCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTCCTACTCCTTCCCTTGGACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
146 CDRL1 IMGT (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
147 CDRL1 Kabat (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
148 CDRL1 Chothia (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
149 CDRL2 IMGT (Prot) WASSRES
150 CDRL2 Kabat (Prot) WASSRES
151 CDRL2 Chothia (Prot) WASSRES
152 CDRL3 IMGT (Prot) QQSYSFPWT
153 CDRL3 Kabat (Prot) QQSYSFPWT
154 CDRL3 Chothia (Prot) QQSYSFPWT
表11：例示性抗體序列8 (Ab8)
SEQ ID NO: 說明 序列
155 重鏈可變域 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSRYVWSWIRQPPGKGLEWIGEIDSSGKTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVRYDSSDSYYYSYDYGMDVWGQGTTVTVSS
156 VH (DNA) CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTCGATACGTATGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCGACTCCAGTGGAAAAACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGTCAGATACGACAGCAGCGACTCCTACTACTATAGCTACGATTATGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA
157 CDRH1 IMGT (Prot) GGSFSRYV
158 CDRH1 Kabat (Prot) RYVWS
159 CDRH1 Chothia (Prot) GGSFSR
160 CDRH2 IMGT (Prot) IDSSGKT
161 CDRH2 Kabat (Prot) EIDSSGKTNYNPSLKS
162 CDRH2 Chothia (Prot) DSSGK
163 CDRH3 IMGT (Prot) ARVRYDSSDSYYYSYDYGMDV
164 CDRH3 Kabat (Prot) VRYDSSDSYYYSYDYGMDV
165 CDRH3 Chothia (Prot) VRYDSSDSYYYSYDYGMDV
166 輕鏈可變域 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSYSFPWTFGGGTKVEIK
167 VL (DNA) GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTAGCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTCCTACTCCTTCCCTTGGACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
168 CDRL1 IMGT (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
169 CDRL1 Kabat (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
170 CDRL1 Chothia (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
171 CDRL2 IMGT (Prot) WASSRES
172 CDRL2 Kabat (Prot) WASSRES
173 CDRL2 Chothia (Prot) WASSRES
174 CDRL3 IMGT (Prot) QQSYSFPWT
175 CDRL3 Kabat (Prot) QQSYSFPWT
176 CDRL3 Chothia (Prot) QQSYSFPWT
表12：例示性抗體序列9 (Ab9)
SEQ ID NO: 說明 序列
177 重鏈可變域 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYAWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHRGFTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVRYDSSDSYYYSYDYGMDVWGQGTTVTVSS
178 VH (DNA) CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCTCCGGTTACGCATGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCGACCATCGAGGATTCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGGGTCAGATACGACAGCAGCGACTCCTACTACTATAGCTACGATTATGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCA
179 CDRH1 IMGT (Prot) GGSFSGYA
180 CDRH1 Kabat (Prot) GYAWS
181 CDRH1 Chothia (Prot) GGSFSG
182 CDRH2 IMGT (Prot) IDHRGFT
183 CDRH2 Kabat (Prot) EIDHRGFTNYNPSLKS
184 CDRH2 Chothia (Prot) DHRGF
185 CDRH3 IMGT (Prot) ARVRYDSSDSYYYSYDYGMDV
186 CDRH3 Kabat (Prot) VRYDSSDSYYYSYDYGMDV
187 CDRH3 Chothia (Prot) VRYDSSDSYYYSYDYGMDV
188 輕鏈可變域 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSYSFPWTFGGGTKVEIK
189 VL (DNA) GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTAGCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTCCTACTCCTTCCCTTGGACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
190 CDRL1 IMGT (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
191 CDRL1 Kabat (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
192 CDRL1 Chothia (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
193 CDRL2 IMGT (Prot) WASSRES
194 CDRL2 Kabat (Prot) WASSRES
195 CDRL2 Chothia (Prot) WASSRES
196 CDRL3 IMGT (Prot) QQSYSFPWT
197 CDRL3 Kabat (Prot) QQSYSFPWT
198 CDRL3 Chothia (Prot) QQSYSFPWT
表13：例示性抗體序列10 (Ab10)
SEQ ID NO: 說明 序列
199 重鏈可變域 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFQKYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDTSGFTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVGRYSYGYYITAFDIWGQGTTVTVSS
200 VH (DNA) CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCCAAAAATACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCGACACCAGTGGATTCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGTGGGAAGGTACAGCTACGGATACTATATCACCGCATTCGACATATGGGGTCAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCA
201 CDRH1 IMGT (Prot) GGSFQKYY
202 CDRH1 Kabat (Prot) KYYWS
203 CDRH1 Chothia (Prot) GGSFQK
204 CDRH2 IMGT (Prot) IDTSGFT
205 CDRH2 Kabat (Prot) EIDTSGFTNYNPSLKS
206 CDRH2 Chothia (Prot) DTSGF
207 CDRH3 IMGT (Prot) ARVGRYSYGYYITAFDI
208 CDRH3 Kabat (Prot) VGRYSYGYYITAFDI
209 CDRH3 Chothia (Prot) VGRYSYGYYITAFDI
210 輕鏈可變域 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSFPFTFGGGTKVEIK
211 VL (DNA) GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCACTACTCCTTCCCTTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
212 CDRL1 IMGT (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
213 CDRL1 Kabat (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
214 CDRL1 Chothia (Prot) KSSQSVLYSSNNKNYLA
215 CDRL2 IMGT (Prot) WASTRES
216 CDRL2 Kabat (Prot) WASTRES
217 CDRL2 Chothia (Prot) WASTRES
218 CDRL3 IMGT (Prot) QQHYSFPFT
219 CDRL3 Kabat (Prot) QQHYSFPFT
220 CDRL3 Chothia (Prot) QQHYSFPFT
本發明包含抗體及抗原結合系統，其包含抗CD20結合模體及結合第二目標抗原或抗原決定基之第二結合模體，例如不為CD20(例如CD19)之抗原。雙靶向抗原結合系統包含雙特異性CAR及雙順反子CAR。許多抗原結合模體為已知的。在各種實施例中，第二靶抗原為CD19。本發明包含多種第二靶抗原，其包含但不限於5T4、α胎蛋白、B細胞成熟抗原(BCMA)、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD56、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、C型凝集素類分子1(CLL-1)、EGFRvIII、上皮腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2組合、HER2-HER3組合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1套膜醣蛋白gp41、HIV-1套膜醣蛋白gpl20、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、黑素瘤相關抗原、間皮素、MUC-1、突變的p53、突變的ras、前列腺特異性抗原、ROR1、VEGFR2或其組合。所以在各種實施例中，本發明之抗原結合系統或抗體可包含為抗CD20結合模體之第一結合模體及結合為以下之第二抗原的第二結合模體：5T4、α胎蛋白、B細胞成熟抗原(BCMA)、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD56、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、C型凝集素類分子1(CLL-1)、EGFRvIII、上皮腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2組合、HER2-HER3組合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1套膜醣蛋白gp41、HIV-1套膜醣蛋白gpl20、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、黑素瘤相關抗原、間皮素、MUC-1、突變的p53、突變的ras、前列腺特異性抗原、ROR1、VEGFR2、EphA3(EPH受體A3)、BAFFR(B細胞活化因子受體)或其組合。在一些實施例中，第二抗原為B細胞或其子組之特徵之抗原，視情況其中第二抗原不為CD19或CD20。靶向此等第二抗原之結合模體之實例為已知的及/或提供於本文中。
在一些情況下，在抗原結合系統(諸如雙特異性CAR)中，其包含抗CD20結合模體(例如包含本發明之重鏈可變域及/或輕鏈可變域)及抗CD19結合模體(例如包含本發明之重鏈可變域及/或輕鏈可變域)，抗CD20結合模體(或其重鏈可變域及/或輕鏈可變域)比抗CD19結合模體(或比其重鏈可變域及/或輕鏈可變域)更接近於嵌合抗原受體之C端。在一些情況下，在抗原結合系統(諸如雙特異性CAR)中，其包含抗CD20結合模體(例如包含本發明之重鏈可變域及/或輕鏈可變域)及抗CD19結合模體(例如包含本發明之重鏈可變域及/或輕鏈可變域)，抗CD20結合模體(或其重鏈可變域及/或輕鏈可變域)比抗CD19結合模體(或比其重鏈可變域及/或輕鏈可變域)更接近於藥劑之N端。
CD19 (亦稱為分化簇19、B-淋巴細胞抗原CD19、B淋巴細胞表面抗原B4、B4、CVID3、分化抗原CD19)為在人體內由CD19基因編碼之蛋白質。除非另外指明，否則應瞭解，本發明中對CD19之參考係關於人類CD19。其見於B細胞之表面上。由於CD19表現為B細胞之標誌，其可適用作例如識別B細胞及由B細胞產生之癌細胞，例如B細胞淋巴瘤之抗原。抗CD19抗體可結合例如周邊血液及脾中之B淋巴細胞、B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)細胞、前淋巴細胞性白血病(PLL)細胞、毛細胞白血病(HCL)細胞、共同急性淋巴母細胞白血病(CALL)細胞、前B急性淋巴母細胞白血病(前B-ALL)細胞及NULL-急性淋巴母細胞白血病(NULL-ALL)細胞上表現之CD19，以提供少許非限制性實例。包含抗原結合系統的例示性醫藥產品為醫藥產品YESCARTA®，該抗原結合系統包含抗CD19結合模體。YESCARTA®為在全身療法之兩個或更多個線路之後經指示用於治療患有復發性或難治性大B細胞淋巴瘤之成人患者的CD19導向經遺傳修飾之自體T細胞免疫療法，其包含未另列出之瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、原發性縱隔大型B細胞淋巴瘤、高級B細胞淋巴瘤及由濾泡性淋巴瘤產生之DLBCL(參見YESCARTA® FDA審批通過的藥品說明書，其關於與免疫療法相關的方法及組合物的全部內容以引用之方式併入本文中)。包含抗原結合系統的另一例示性醫藥產品為醫藥產品KYMRIAH®，該抗原結合系統包含抗CD19結合模體。KYMRIAH®為指示用於治療以下各者之CD19導向經基因修飾之自體T細胞免疫療法：(1)難以用B細胞前驅體急性淋巴母細胞白血病(ALL)治療或第二次或稍後復發之至多25歲的患者；及(2)在包含未另列出之瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、高分級B細胞淋巴瘤及由濾泡性淋巴瘤產生之DLBCL的兩種或更多種全身療法線路之後患有復發性或難治性(r/r)大B細胞淋巴瘤之成年患者(參見KYMRIAH® FDA審批通過的藥品說明書，其關於與免疫療法相關的方法及組合物的全部內容以引用之方式併入本文中)。
YESCARTA®及KYMRIAH®兩者均包含來源於抗人類CD19抗體之抗體結合域。認為許多抗CD19抗體結合CD19基因之外顯子4中所編碼之CD19的抗原決定基。其他抗CD19結合模體可以不同親和力識別CD19之不同抗原決定基或相同抗原決定基。抗原結合系統可包含來源於例如SJ25C1之抗原結合域。CD19抗體，純系SJ25C1來源於Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞與經NALM1及NALM16細胞免疫接種之BALB/c小鼠分離之脾細胞雜交。SJ25C1抗原結合域用於其他研究性CD19靶向嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法中。
本發明之抗CD19結合模體可包含如本文所述之抗體中所發現的抗原結合序列。在一些實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含本文所提供之抗原結合片段。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一個本文所提供之HCDR，例如至少一個表14中所揭示之HCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含兩個本文所提供之HCDR，例如至少兩個表14中所揭示之HCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含三個本文所提供之HCDR，例如三個表14中所揭示之HCDR。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一個本文所提供之LCDR，例如至少一個表14中所揭示之LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含兩個本文所提供之LCDR，例如至少兩個表14中揭示之LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含三個本文所提供之LCDR，例如三個表14中所揭示之LCDR。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一個本文所提供之HCDR，例如至少一個表14中所揭示之HCDR；及至少一個本文所提供之LCDR，例如至少一個表14中所揭示之LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含兩個本文所提供之HCDR，例如至少兩個表14中所揭示之HCDR；及兩個本文所提供之LCDR，例如至少兩個表14中所揭示之LCDR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含三個本文所提供之HCDR，例如三個表14中所揭示之HCDR；及三個本文提供之LCDR，例如三個表14中所揭示之LCDR。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一個本文所揭示之重鏈可變域之重鏈構架區(重鏈FR)，例如至少一個表14中所揭示之重鏈可變域之重鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之兩個重鏈FR，例如表14中所揭示之重鏈可變域之至少兩個重鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR，例如表14中所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一種本文所揭示之輕鏈可變域之輕鏈FR，例如至少一種表14中所揭示之輕鏈可變域之輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含本文所揭示之輕鏈可變域之兩個輕鏈FR，例如表14中所揭示之輕鏈可變域之至少兩個輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含本文所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR，例如表14中所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一個本文所揭示之重鏈可變域之重鏈FR，例如至少一個表14中所揭示之重鏈可變域之重鏈FR；及至少一個本文所揭示之輕鏈可變域之輕鏈FR，例如至少一個表14中所揭示之輕鏈可變域之輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之兩個重鏈FR，例如表14中所揭示之重鏈可變域之至少兩個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之兩個輕鏈FR，例如表14中所揭示之輕鏈可變域之至少兩個輕鏈FR。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含本文所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR，例如表14中所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR，例如表14中所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含一個、兩個或三個FR，該等FR一起或各自獨立地具有與表14中所揭示之重鏈可變域之重鏈可變域的對應FR至少75%一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含一個、兩個或三個FR，該等FR一起或各自獨立地具有與表14中所揭示之輕鏈可變域之輕鏈可變域的對應FR至少75%一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一個重鏈可變域，其具有與表14中所揭示之重鏈可變域至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含兩個重鏈可變域，其各自具有與表14中所揭示之重鏈可變域至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，該等重鏈可變域可相同或不同。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一個輕鏈可變域，其具有與表14中所揭示之輕鏈可變域至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含兩個輕鏈可變域，其各自具有與表14中所揭示之輕鏈可變域至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，該等輕鏈可變域可相同或不同。
在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含至少一個重鏈可變域，其具有與表14中所揭示之重鏈可變域至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%);及至少一個輕鏈可變域，其具有與表14中所揭示之輕鏈可變域至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)。 在各種實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含兩個重鏈可變域，其各自具有與表14中所揭示之重鏈可變域至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)；及兩個輕鏈可變域，其各自具有與表14中所揭示之輕鏈可變域至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)，其中在各種實施例中，(i)重鏈可變域中之各者可相同或不同；或(ii)輕鏈可變域中之各者可相同或不同。
在某些實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含結合模體，該結合模體包含本發明之重鏈可變域、本發明之輕鏈可變域及具有與SEQ ID NO:247至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)的連接子。在某些實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含結合模體，該結合模體包含根據SEQ ID NO:247之連接子及/或根據SEQ ID NO:307-313中之任一者之連接子。在某些實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含結合模體，其包含本發明之重鏈可變域、本發明之輕鏈可變域及具有與SEQ ID NO:245至少75%序列一致性(例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或100%一致性；例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)之前導序列。在某些實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含結合模體，其包含根據SEQ ID NO:245之CSF2RA前導序列。在某些實施例中，本發明之抗CD19結合模體包含結合模體，該結合模體包含本發明之重鏈可變域、本發明之輕鏈可變域、本發明之連接子及本發明之前導序列。在某些實施例中，結合模體具有SEQ ID NO:243中闡述之序列。編碼抗CD19結合模體及其組分之例示性核苷酸序列發現於SEQ ID NO:244、246及248中。在各種實施例中，結合模體可包含根據SEQ ID NO:247之連接子及/或鄰近於一或多種其他連接子的根據SEQ ID NO:307-313中之任一者之連接子。 表14：例示性抗CD19抗體序列(Ab11)
SEQ ID NO: 說明 序列
221 重鏈可變域 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDY GVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSET TYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDY WGQGTSVTVSS   
222 VH (DNA) GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA   
223 CDRH1 IMGT (Prot) GVSLPDYG
224 CDRH1 Kabat (Prot) DYGVS
225 CDRH1 Chothia (Prot) GVSLPDY
226 CDRH2 IMGT (Prot) IWGSETT
227 CDRH2 Kabat (Prot) VIWGSETTYYNSALKS
228 CDRH2 Chothia (Prot) WGSET
229 CDRH3 IMGT (Prot) AKHYYYGGSYAMDY
230 CDRH3 Kabat (Prot) HYYYGGSYAMDY
231 CDRH3 Chothia (Prot) HYYYGGSYAMDY
232 輕鏈可變域 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLN WYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYT FGGGTKLEIT   
233 VL (DNA) GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA   
234 CDRL1 IMGT (Prot) RASQDISKYLN
235 CDRL1 Kabat (Prot) RASQDISKYLN
236 CDRL1 Chothia (Prot) RASQDISKYLN
237 CDRL2 IMGT (Prot) HTSRLHS
238 CDRL2 Kabat (Prot) HTSRLHS
239 CDRL2 Chothia (Prot) HTSRLHS
240 CDRL3 IMGT (Prot) QQGNTLPYT
241 CDRL3 Kabat (Prot) QQGNTLPYT
242 CDRL3 Chothia (Prot) QQGNTLPYT
243 結合模體 (Prot) DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
244 結合模體 (DNA) gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
245 前導(CSF2RA) (Prot) MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
246 前導(CSF2RA) (DNA) atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca
247 連接子 (Prot) GSTSGSGKPGSGEGSTKG
248 連接子 (DNA) ggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggc
抗原結合系統包含例如雙特異性及雙順反子嵌合抗原受體(CAR)作為實例。本發明尤其提供靶向CD20及第二目標抗原(例如CD19)之抗原結合系統。在一些實施例中，本發明之抗原結合系統包含雙特異性抗原結合系統。在一些實施例中，本發明之抗原結合系統包含雙順反子抗原結合系統(例如包含第一CAR及第二CAR之系統，該第一及第二CAR表現於相同細胞中)。雙順反子CAR可包含結合不同目標且由單一載體編碼之兩個CAR。雙順反子CAR可包含第一CAR，其包含抗CD19結合模體；及第二CAR，其包含抗CD20結合模體。與各種CAR構架相關之結合模體為可互換的，且本發明實例中提供之特徵之組合為例示性的，非限制性的。在一些實施例中，雙順反子CAR之第一CAR及第二CAR(例如抗CD20 CAR及抗CD19 CAR)係由獨立基因編碼及/或表現為獨立mRNA分子。在一些實施例中，雙順反子CAR之第一CAR及第二CAR(例如抗CD20 CAR及抗CD19 CAR)係由單一基因編碼及/或一起在單一mRNA分子中表現，其中表現之蛋白質包含第一CAR、可裂解連接子域及第二CAR。雙順反子CAR之第一及第二CAR一般一起表現於例如CAR-T細胞之免疫細胞中，使得個體CAR-T細胞表現靶向目標抗原中之各者(例如CD20及CD19中之各者)之CAR。
在各種實施例中，雙順反子CAR載體利用核糖體跳躍序列或內部核糖體進入位點。編碼藉由核糖體跳躍序列間隔之兩個獨立CAR分子的單一載體可表現雙順反子CAR。在各種實施例中，雙順反子CAR包含第一CAR及第二CAR，其中第一CAR及第二CAR之序列僅在結合模體方面不同。在各種實施例中，雙順反子CAR包含第一CAR及第二CAR，其中第一CAR及第二CAR之序列僅在重鏈可變域序列及/或輕鏈可變域序列方面不同。因此，在一些實施例中，雙順反子CAR之第一CAR及第二CAR對於其任何或所有一或多種組分，例如相同或不同協同刺激域可具有相同或不同序列。舉例而言，雙順反子CAR之第一CAR及第二CAR中之一者或兩者可包含本文所提供之協同刺激域，諸如CD28、41BB、OX40或ICOS協同刺激域。
雙順反子CAR之CAR可包含結合模體、鉸鏈、跨膜域及包含協同刺激域及活化域之細胞內域。結合模體可為本發明之抗CD19或抗CD20結合模體。鉸鏈及跨膜域可為包含鉸鏈域及跨膜域之28T(CD28)域或CD8K域。協同刺激域可為CD28或41BB協同刺激域。活化域可為CD3z活化域。
在一些實施例中，第一結合模體及第二結合模體(例如不同的抗CD20及抗CD19結合模體)均包含於單一雙特異性CAR中。在此類雙特異性CAR中，CAR分子自身可經工程改造以識別超過一種抗原。在串聯雙特異性CAR中，第一及第二結合模體為細胞外的且可以近膜結合模體及遠膜結合模體為特徵。在一些實施例中，抗CD20結合模體為近膜，且抗CD19結合模體為遠膜。在其他實施例中，抗CD19結合模體為遠膜，且抗CD20結合模體為近膜。
嵌合抗原受體(CAR)為可引導或重新引導T細胞(例如，患者或供體T細胞)以靶向所選擇之抗原的經工程改造之受體。CAR可經工程改造以識別抗原，且當結合於彼抗原時，活化免疫細胞以攻擊及破壞攜有彼抗原之細胞。當此等抗原存在於腫瘤細胞上時，表現CAR之免疫細胞可靶向且殺滅腫瘤細胞。CAR通常包含介導抗原結合之細胞外結合模體(例如，抗CD20及/或抗CD19結合模體)、在抗原結合系統存在於細胞表面或細胞膜時涵括或理解為涵括細胞膜的跨膜域，及細胞內(或細胞質)信號傳導域。
根據至少一個非限制性觀點，已存在至少三「代」CAR組合物。在第一代CAR中，結合模體(例如單鏈片段可變、結合模體)經由視情況包含鉸鏈域及一或多個間隔子之跨膜域聯接或連接至信號傳導域(例如CD3ζ)。在第二代CAR中，協同刺激域(CM1，諸如CD28、4-1BB或OX40)與信號傳導域(例如CD3ζ)一起引入。在第三代CAR中，包含第二協同刺激域(CM2)。
TCR為由α鏈及β鏈構成之雜二聚體。TCR信號傳導需要補充產生免疫突觸之信號傳導蛋白質。另外，質膜處之TCR定位視CD3複合物而定，其表現於T細胞中。經工程改造之單鏈TCR可例如使用CAR構築體之跨膜及信號傳導域、已知之方法及構築體(例如sTCR及TCR-CAR分子，例如TCRβ鏈與CD28 TM及CD28及CD3ζ信號傳導模組之融合)產生。本發明之抗CD20及/或抗CD19抗原結合系統可包含結合CD20及/或CD19之一或多個抗原結合模體。在一些實施例中，抗原結合系統進一步包含協同刺激域及/或細胞外域(例如，「鉸鏈」或「間隔子」區)及/或跨膜域、及/或細胞內(信號傳導)域、及/或CD3-ζ或CD3-ε活化域。在一些實施例中，本發明之CD20及/或抗CD19抗原結合系統包含至少一個結合模體，其結合人類CD20、協同刺激域、細胞外域、跨膜域及CD3-ζ或CD3-ε活化域。
在一些實施例中，本發明之抗原結合系統可包含抗原結合系統，其包含以下中之一或多者或全部：前導肽(P)、結合模體(B)、協同刺激蛋白質細胞外域(E)、跨膜域(T)、協同刺激域(C)、第二協同刺激域(C')及活化域(A)。在一些情況下，抗原結合系統根據以下組態：B E T A。在一些情況下，抗原結合系統根據以下組態：P B E T A。在一些情況下，抗原結合系統係根據以下組態：B E T C A。在一些情況下，抗原結合系統根據以下組態：P B E T C A。在一些情況下，抗原結合系統根據以下組態：B E T C C' A。在一些情況下，抗原結合系統根據以下組態：P B E T C C' A。在一些實施例中，抗原結合系統包含VH及VL，視情況其中CAR根據以下組態：P-VH-VL-E-T-C-A或P-VL-VH-E-T-C-A。在一些實施例中，VH及VL藉由連接子(L)連接，視情況其中CAR根據以下自N端至C端組態：P-VH-L-VL-E-T-C-A或P-VH-L-VL-E-T-C-A。
一或多個抗原結合模體確定抗原結合系統之一或多個目標。抗原結合系統之結合模體可包含任何結合模體，例如本發明所提供之抗體，例如本發明之結合模體。在一些實施例中，結合模體可包含抗CD20結合模體及/或抗CD19結合模體。在一些實施例中，結合模體可包含抗CD20結合模體及/或抗CD19結合模體。
模體至少部分地用於嵌合抗原受體中，因為其可經工程改造以表現為單鏈以及其他CAR組分之一部分。參見例如美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Eshhar等人, Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136, Krause等人, J. Exp. Med., 第188卷,第4, 1998號(619-626)；Finney等人, Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797，關於CAR中之結合模體域，其中之每一者以引用之方式併入本文中。結合模體或scFv為包含重鏈可變域及輕鏈可變域之單鏈抗原結合片段，該重鏈可變域及輕鏈可變域聯接或連接在一起。參見例如美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Eshhar等人,Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136，關於結合模體域，其中之每一者以引用之方式併入本文中。當來源於親本抗體時，結合模體可保留親本抗體中之一些、保留全部或基本上保留靶標抗原之親本抗體的結合。
鉸鏈可為安置於結合模體與跨膜域之間的抗原結合系統之細胞外域。鉸鏈亦可稱為細胞外域或稱為「間隔子」。鉸鏈可促成受體表現、活性及/或穩定性。在一些實施例中，鉸鏈域位於結合模體與跨膜域之間。鉸鏈亦可提供接近靶向抗原之可撓性。鉸鏈包含免疫球蛋白類鉸鏈域。
在一些實施例中，本發明之抗原結合系統可包含作為免疫球蛋白類鉸鏈域、來自免疫球蛋白類鉸鏈域或來源於免疫球蛋白類鉸鏈域(例如包含其所有或片段)之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈域來自或來源於免疫球蛋白。在一些實施例中，鉸鏈域選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM之鉸鏈或其片段。
鉸鏈可來源於天然來源或來源於合成來源。在一些實施例中，本發明之抗原結合系統可包含為、來自或來源於以下(例如包含其所有或片段)之鉸鏈：CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8.α、CD8.β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位體受體或其片段或組合。在某些實施例中，CAR不包含CD28鉸鏈。
在一些實施例中，本發明之抗原結合系統可包含為、來自或來源於以下(例如包含其所有或片段)之鉸鏈：CD8 α。在一些實施例中，鉸鏈為、來自或來源於以下之鉸鏈：CD28。在一些實施例中，鉸鏈為、來自或來源於以下之鉸鏈：CD8 α之鉸鏈的片段或CD28之鉸鏈的片段，其中該片段為小於整體之任何片段。在一些實施例中，CD8 α之鉸鏈的片段或CD28之鉸鏈的片段包含胺基酸序列，其不包括CD8 α鉸鏈或CD28鉸鏈之N端或C端或兩者處之至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個胺基酸。例示性鉸鏈序列包含提供於表54(SEQ ID NO:261-269)中之彼等鉸鏈序列。
已知此等鉸鏈域之聚核苷酸及多肽序列。在一些實施例中，編碼鉸鏈域之聚核苷酸包含與已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)一致之核苷酸序列。在一些實施例中，鉸鏈域之多肽序列包含與已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)一致之多肽序列。
一般而言，(例如抗原結合系統之) 「跨膜域」係指當存在於細胞表面或細胞膜處之分子中(例如跨越一部分或所有細胞膜)時，具有存在於膜中之屬性的域。本發明之抗原結合系統之協同刺激域可進一步包含跨膜域及/或細胞內信號傳導域。不需要跨膜域中之每一胺基酸存在於膜中。舉例而言，在一些實施例中，跨膜域之特徵在於蛋白質之指定延伸段或部分實質上位於膜中。可使用多種算法分析胺基酸或核酸序列以預測蛋白質亞細胞定位(例如跨膜定位)。程式psort (PSORT.org)及Prosite (prosite.expasy.org)為此類程式之例示性。
包含於本文所述之抗原結合系統中之跨膜域類型不限於任何類型。在一些實施例中，選擇與結合模體及/或細胞內域天然相關之跨膜域。在一些情況下，跨膜域包含一或多個胺基酸之修飾(例如，缺失、插入及/或取代)，例如以避免此類域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域，以使與受體複合物之其他成份的相互作用降至最低。
跨膜域可來源於天然來源或合成來源。在來源為天然時，域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。例示性跨膜域可來源於(例如可包含以下之至少一個跨膜域)：T細胞受體之α鏈，β鏈或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD3 δ、CD3 γ、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD8 α、CD8β、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、TNFSFR25、CD154、4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD276 (B7-H3)、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96 (Tactile)、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fc γ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig α (CD79a)、IL-2R β、IL-2R γ、IL-7R α、誘導性T細胞協同刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83結合之配位體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴細胞功能締合的抗原-1 (LFA-1、CD1-1a/CD18)、MHC類別1分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳遞淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAMF4 (CD244、2B4)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、TNFSF14、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、剪斷或組合。在一些實施例中，跨膜域可為合成的(且可例如主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸)。在一些實施例中，在合成跨膜域之各端包含苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。在一些實施例中，跨膜域直接聯接或連接至細胞質域。在一些實施例中，短寡肽連接子或多肽連接子(例如長度在2個與10個胺基酸之間)可在跨膜域與細胞內域之間形成鍵聯。在一些實施例中，連接子為基於甘胺酸-絲胺酸二聯體。
本文所提供之跨膜域之聚核苷酸及多肽序列為已知的。在一些實施例中，編碼跨膜域之聚核苷酸包含與已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)一致之核苷酸序列。在一些實施例中，跨膜域之多肽序列包含與已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)一致之多肽序列。視情況，短間隔子可在CAR之任何或一些細胞外、跨膜及細胞內域之間形成鍵聯。
細胞內域(或細胞質域)包含一或多個信號傳導域，其在靶標抗原結合至結合模體之後引起及/或介導細胞內信號，例如活化一或多種免疫細胞效應功能(例如天然免疫細胞效應功能)。T細胞之效應功能例如可為細胞溶解活性或輔助活性，該等活性包含分泌細胞介素。在一些實施例中，細胞內域之信號傳導域介導T細胞活化、增殖、存活及/或其他T細胞功能。細胞內域可包含為活化域之信號傳導域。細胞內域可包含為協同刺激信號傳導域之信號傳導域。
已知可在抗原結合至免疫細胞後轉導信號之細胞內信號傳導域，其中之任一者可包含於本發明之抗原結合系統中。舉例而言，已知T細胞受體(TCR)之細胞質序列在TCR結合至抗原之後引發信號轉導(參見例如Brownlie等人，Nature Rev. Immunol. 13:257-269 (2013))。
在一些實施例中，信號傳導域及/或活化域包含基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。含有細胞質信號傳導序列之ITAM之實例包含來源於以下之序列：TCR ξ、FcR γ、FcR β、CD3 ξ、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d(參見例如Love等人, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a002485 (2010); Smith-Garvin等人, Annu. Rev. Immunol. 27:591-619 (2009))。
在某些實施例中，合適的信號傳導域包含但不限於4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 δ、CD3 ε、CD3 γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CDlla、CDllb、CDllc、CDlld、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fc γ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig α (CD79a)、IL-2R β、IL-2R γ、IL-7R α、誘導性T細胞協同刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83結合之配位體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、Ly108、淋巴細胞功能締合的抗原-1 (LFA-1、CD1-1a/CD18)、MHC類別1分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳遞淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAMF4 (CD244、2B4)、SLAMF6 (NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、TNFSF14、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、剪斷或組合。
CAR可包含協同刺激信號傳導域，例如以增加信號傳導效能。參見美國專利第7,741,465號及第6,319,494號，以及Krause等人及Finney等人(同前文獻), Song等人, Blood 119:696-706 (2012)；Kalos等人, Sci Transl. Med. 3:95 (2011)；Porter等人, N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011)及Gross等人, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)。經由單獨TCR產生的信號可能不足以讓T細胞完全活化且可二級或協同刺激信號可提高活化。因此，在一些實施例中，信號傳導域進一步包含一或多個活化一或多個免疫細胞效應功能(例如，本文所描述之原生免疫細胞效應功能)之額外信號傳導域(例如，協同刺激信號傳導域)。在一些實施例中，可使用此類協同刺激信號傳導域之一部分，只要該部分轉導效應功能信號即可。在一些實施例中，本文所述之細胞質域包含T細胞共受體之一或多個細胞質序列(或其片段)。此類T細胞輔受體之非限制性實例包含CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、MYD88、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83結合之配位體。例示性協同刺激蛋白質具有天然存在於T細胞上之協同刺激蛋白質之胺基酸序列，其協同刺激蛋白質之完整天然胺基酸序列描述於NCBI參考序列：NP_006130.1中。在某些情況下，CAR包含由根據SEQ ID NO: 270之序列編碼之41BB協同刺激域，如下文所示：
SEQ ID NO: 270 AGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
本文所提供之信號傳導域之聚核苷酸及多肽序列為已知的。在一些實施例中，編碼信號傳導域之聚核苷酸包含與已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)一致之核苷酸序列。在一些實施例中，信號傳導域之多肽序列包含與已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)一致之多肽序列。
在各種實施例中，需要調節(例如降低)抗原結合系統活性之機制，例如以使由抗原結合系統活性產生之不良事件降至最低或減少。亦可需要包含免疫細胞中之誘導性「打開」或「加速器」開關。適合技術包含使用誘導性卡斯蛋白酶9(美國申請案2011/0286980)或胸苷激酶，在細胞經本發明之CAR構築體轉導之前、之後或同時進行。引入自殺基因及/或「打開」開關之額外方法包含TALENS、鋅指、RNAi、siRNA、shRNA、反義技術及其他技術。
根據本發明，本文中可併入開-關或其他類型之控制開關技術。此等技術可包含使用二聚域及視情況存在之此類域二聚之活化劑，例如如Wu等人, Science 2014 350(6258)在某些細胞中利用FKBP/Rapalog系統所揭示，其內容以全文引用之方式併入本文中。其他二聚技術描述於例如Fegan等人Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336以及美國專利第5,830,462號、第5,834,266號、第5,869,337號及第6,165,787號，其中每一者之內容亦關於二聚技術以引用之方式併入本文中。額外二聚對可包含環孢靈A/親環蛋白、受體、雌激素/雌激素受體(視情況使用他莫昔芬(tamoxifen)、4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)或吲哚昔芬(endoxifen))、糖皮質激素/糖皮質激素受體、四環素/四環素受體及/或維生素D/維生素D受體。二聚技術之其他實例可見於例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US 2015/0266973、US 2016/0046700、美國專利第8,486,693號、US 2014/0171649及US 2012/0130076中，其內容進一步以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之抗原結合系統包含前導肽(在本文中亦稱為「信號肽」或「前導序列」)。在某些實施例中，前導肽包含與胺基酸序列MEWTWVFLFLLSVTAGVHS (SEQ ID NO:249)、MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO:250)或MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO:295)至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%(例如85-90%、85-95%、85-100%、90-95%、90-100%或95-100%)一致之胺基酸序列。
CAR之組分可使用用於等效組分之生物技術之常規技術交換或「調換」。為僅提供少許非限制性及部分實例，本發明之CAR可包含如本文所提供之結合模體以及本文所提供之鉸鏈及本文所提供之協同刺激域。在某些實例中，本發明之CAR可包含如本文所提供之前導序列以及如本文所提供之結合模體以及本文所提供之鉸鏈及本文所提供之協同刺激域。在各種實施例中，本發明提供根據SEQ ID NO:251-260中之任一者之結合模體與根據SEQ ID NO: 261-269中之任一者之鉸鏈組合(例如鄰近地融合)，視情況與根據SEQ ID NO:270之41BB協同刺激域進一步組合(例如鄰近地融合)。其少許非限制性實例提供於SEQ ID NO:271-290中。
雙順反子CAR可包含表現為單一多肽之第一CAR序列及第二CAR序列，該單一多肽包含在第一與第二CAR之間的可裂解連接子。例示性可裂解連接子為Furin-GSG-T2A(參見例如Chng等人MAbs. 2015 Mar-Apr; 7(2): 403-412，其關於可裂解連接子以引用之方式併入本文中；亦參見Guedan等人Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 Mar 15; 12: 145-156，其關於雙順反子CAR設計以引用之方式併入本文中)。為提供雙順反子CAR結構之僅一個非限制性實例，雙順反子CAR可包含(a)第一CAR，其包含(i)信號肽(例如CSF2RA信號肽)、(ii)抗CD19輕鏈可變域、(iii)連接子(例如G4S連接子或其複數個)；(iv)抗CD19重鏈可變域；(v)間隔子或鉸鏈(例如CD28T間隔子)、(vi)跨膜域(例如CD28跨膜域)、(vii)協同刺激域(例如CD28協同刺激域)、(viii)刺激(例如CD3z刺激域)；(b)可裂解連接子(例如弗林GSG-T2A連接子)；及(c)第二CAR，其包含(i)信號肽(例如CD8a信號肽)、(ii)本發明之抗CD20重鏈可變域、(iii)連接子(例如根據SEQ ID NO:247之連接子及/或根據SEQ ID NO:307-313中之任一者之連接子)、(iv)本發明之抗CD20輕鏈可變域、(v)間隔子或鉸鏈(例如CD8a間隔子)、(vi)跨膜域(例如CD8跨膜域)、(vii)協同刺激域(例如41bb協同刺激域)及(viii)刺激域(例如CD3z刺激域)。因此，非限制性地，例示性抗CD20/抗CD19雙順反子CAR可具有或包含SEQ ID NO:291及292中所闡述之核苷酸及胺基酸序列。
雙特異性CAR可為包含本發明之第一結合模體及為抗CD19結合模體之第二結合模體的單一多肽。在非限制性例示性實施例中，雙特異性CAR可包含(i)前導(例如CSF2RA信號肽)、(ii)本發明之抗CD20輕鏈可變域、(iii)連接子、(iv)抗CD20重鏈可變域、(v)連接子(例如截短連接子)、(vi)抗CD19輕鏈可變域、(vii)連接子、(viii)抗CD19重鏈可變域、(ix)細胞外域(例如CD28T鉸鏈或IgG4鉸鏈)、(x)跨膜域(例如CD28跨膜域)、(xi)細胞內區(例如CD28細胞內協同刺激域及/或41bb協同刺激域)及刺激域(例如CD3z刺激域)。因此，非限制性地，例示性抗CD20/抗CD19雙特異性CAR可具有或包含SEQ ID NO:293-306中所闡述之核苷酸及胺基酸序列。
已知各種CAR序列、組分及/或構架，其包含但不限於鉸鏈、間隔子、跨膜域、協同刺激域、刺激域、結合模體及各者之變體的序列，且若提供例如重鏈可變域序列或CDR序列及輕鏈可變域序列或CDR序列，則可容易構築具有所需結合及組分或架構之CAR。
本發明尤其提供結合CD20及第二目標抗原(例如CD19)之雙特異性抗體。雙特異性抗體包含具有結合第一目標抗原之第一結合模體及結合第二目標抗原之第二結合模體的抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體包含本發明之抗CD20結合模體及本發明之抗CD19結合模體。在一些實施例中，雙特異性抗體包含抗CD20結合模體，其包含本發明之抗CD20重鏈可變域及本發明之抗CD20輕鏈可變域；以及抗CD19結合模體，其包含抗CD19重鏈可變域及抗CD19輕鏈可變域。
本發明包含如下結合物，其中本發明之抗體與治療劑或可偵測部分相關。在各種實施例中，治療劑為如本文所提供之抗癌劑。在某些實施例中，所提供之結合物包含一或多個可偵測部分，亦即用一或多個此類部分「標記」。在一些此類實施例中，本發明結合物適用於診斷或成像應用，例如診斷或成像癌症。多種可偵測部分中之任一者可用於本文所述之經標記之抗體結合物中。適合的可偵測部分包含但不限於：各種配位體、放射性核種、螢光染料、化學發光劑(諸如辣木瓦酯、穩定之二氧雜環丁烷及其類似物)、生物發光劑、可光譜解析之無機螢光半導體奈米結晶(亦即量子點)、微米粒子、金屬奈米粒子(例如金、銀、銅、鉑等)、奈米簇；順磁性金屬離子、酶、比色標識(諸如染料、膠態金及類似者)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原及其中抗血清或單克隆抗體為可用之蛋白質。
本發明包含編碼本文提供之抗CD20結合模體及/或抗CD19結合模體之核酸。本發明包含編碼本文所提供抗體之核酸，其包含但不限於編碼結合模體(例如抗CD20結合模體及抗CD19結合模體)之核酸。本發明包含編碼本文所提供之抗原結合系統之核酸，其包含但不限於編碼生物科學及雙特異性嵌合抗原受體(例如結合CD20及CD19之雙順反子及雙特異性嵌合抗原受體)之核酸。SEQ ID NO:2之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:3-11中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:13之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:14-22中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:24之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25-33中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:35之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:36-44中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:46之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:47-55中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:57之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:58-66中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:68之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:69-77中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:79之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:80-88中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:90之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:91-99中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:101之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:102-110中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:112之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:113-121中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:123之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:122及SEQ ID NO:124-132中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:134之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:133及SEQ ID NO:135-143中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:145之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:144及SEQ ID NO:146-154中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:156之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:157-165中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:167之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:166及SEQ ID NO:168-176中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:178之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:177及SEQ ID NO:179-187中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:189之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:190-198中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:200之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:199及SEQ ID NO:201-209中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:211之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:212-220中之每一者之例示性核酸序列。本發明包含編碼本文所提供之抗CD19結合模體之核酸。SEQ ID NO:222之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:221及SEQ ID NO:223-231中之每一者之例示性核酸序列。SEQ ID NO:233之核酸序列包含且提供對應於及編碼SEQ ID NO:232及SEQ ID NO:234-242中之每一者之例示性核酸序列。
本發明包含載體，其包含本發明之核酸及/或編碼本發明之多肽的載體。在各種實施例中，本發明包含載體，其包含編碼本文提供之抗CD20結合模體及/或抗CD19結合模體之核酸。在各種實施例中，本發明包含載體，其包含編碼本文所提供之抗體之核酸，該抗體包含但不限於編碼結合模體分子(例如，抗CD20結合模體或抗CD19結合模體)之核酸。在各種實施例中，本發明包含載體，其包含編碼一或多種本文所提供之抗原結合系統之核酸，該抗原結合系統包含但不限於編碼生物科學或雙特異性嵌合抗原受體(例如，結合CD20及CD19之雙順反子及雙特異性嵌合抗原受體)之核酸。
任何載體可適用於本發明。在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，載體為反轉錄病毒載體、DNA載體、鼠類白血病病毒載體、SFG載體、質體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦巴爾病毒載體(Epstein Barr viral vector)、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關之載體(AAV)、豆狀病毒載體或其任何組合。適合之例示性載體包括例如pGAR、pBABE-puro、pBABE-neo largeTcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1 GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG (Puro IRES GFP空質體)、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRES螢光素酶、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP及pLXIN-Luc。
重組表現載體可為任何適合之重組表現載體。適合的載體包含設計成用於增殖及擴增或用於表現或用於兩者的載體，諸如質體及病毒。舉例而言，載體可選自pUC系列(Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md.)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, Calif.)、pET系列(Novagen, Madison, Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)及pEX系列(Clontech, Palo Alto, Calif.)。亦可使用噬菌體載體，諸如λGT10、λGT11、λZapII (Stratagene)、λEMBL4及λNM1149。適用於本發明之上下文中的植物表現載體之實例包含pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及pBIN19(Clontech)。適用於本發明之上下文之動物表現載體之實例包含pcDNA、pEUK-Cl、pMAM及pMAMneo(Clontech)。在一些實施例中，將雙順反子IRES載體(例如來自Clontech)用於包含編碼抗原結合系統之核酸及本文所述之誘導性表現構築體兩者。
在一些實施例中，重組表現載體為病毒載體。適合之病毒載體包含但不限於反轉錄病毒載體、α病毒、牛痘、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及家禽痘病毒載體，且較佳具有使免疫細胞(例如T細胞)轉型之天然或經工程改造之能力。
可使用描述於以下之標準重組DNA技術製備重組表現載體：例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001；及Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994。環狀或線性之表現載體的構築體可經製備以含有在原核或真核宿主細胞中起作用之複製系統。複製系統可來源於例如ColEl、2μ質體、λ、SV40、牛乳突狀瘤病毒及類似者。
重組表現載體可包含一或多個標記基因，其允許選擇經轉化或經轉染宿主。標記基因包含殺生物劑耐性(例如，對抗生素、重金屬等具有耐性)，營養缺陷型宿主中之互補以提供原營養及類似者。用於重組表現載體之適合的標記基因包含例如新黴素/G418耐性基因、嘌呤黴素耐性基因、潮黴素耐性基因、組胺醇耐性基因、四環素耐性基因及安比西林(ampicillin)耐性基因。
適用於本發明之上下文中之載體可為「裸」核酸載體(亦即，具有極少或不具有封裝其之蛋白質、糖及/或脂質之載體)或與其他分子複合之載體。可適合地與載體組合之其他分子包含但不限於病毒塗層、陽離子型脂質、脂質體、多元胺、金粒子及靶向部分，諸如靶向細胞分子之配位體、受體或抗體。
載體DNA可經由習知轉化、轉染或轉導技術引入至細胞，例如免疫細胞中。術語「轉化」及「轉染」涵蓋多種用於將外源核酸(例如DNA)引入細胞中之公認技術，諸如磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、脂質體轉染、基因槍、奈米粒子介導之傳遞或電穿孔。轉導包含例如藉由本文所揭示之載體將載體遞送至細胞的病毒，該病毒包含但不限於逆轉錄病毒、慢病毒及AAV。
本發明包含細胞，該等細胞包含、表現或經工程改造(例如，轉化或轉導)以包含或表現本發明之至少一種載體或核酸。在一些實施例中，方法包含用載體轉導細胞，該載體包含編碼至少一個抗原結合系統之聚核苷酸。本發明包含細胞，該等細胞包含至少一種編碼本發明之一或多種多肽之載體，或經轉化以包含至少一種編碼本發明之一或多種多肽之載體。本發明包含細胞，其包含至少一種編碼本發明提供之抗CD20結合模體及/或抗CD19結合模體之載體，或經轉化以包含至少一種編碼本發明提供之抗CD20結合模體及/或抗CD19結合模體之載體。本發明包含細胞，其包含至少一種編碼本文所提供之抗體的載體，或經轉化以包含至少一種編碼本文所提供之抗體的載體，該載體包含但不限於結合模體分子(例如抗CD20結合模體或抗CD19結合模體)。本發明包含細胞，其包含至少一種編碼本文所提供之一或多種抗原結合系統的載體，或經轉化以包含至少一種編碼本文所提供之一或多種抗原結合系統的載體，該載體包含但不限於雙順反子或雙特異性嵌合抗原受體(例如結合CD20及CD19之雙順反子或雙特異性嵌合抗原受體)。在一些實施例中，細胞與兩種載體共轉染或共轉導，各載體編碼不同CAR，兩種不同CAR一起為雙順反子CAR。藉由兩個不同載體編碼一起為雙順反子CAR之兩個不同CAR的細胞轉染或轉導可同時在單個細胞群體上、同時在兩個不同細胞群體上進行，其中各群體僅藉助於兩個載體中之一者轉導，或獨立地在兩個不同細胞群體上進行，兩個不同細胞群體各自僅藉助於兩個載體中之一者轉導。
本發明包含細胞，其包含一或多種本發明之多肽。本發明包含細胞，其包含(例如表現)本文提供之抗CD20結合模體及/或抗CD19結合模體。本發明包含細胞，其包含(例如表現)本文所提供之抗體，該抗體包含但不限於結合模體(例如抗CD20結合模體或抗CD19結合模體)。本發明包含細胞，其包含(例如表現)一或多種本文所提供之抗原結合系統，該抗原結合系統包含但不限於生物科學或雙特異性嵌合抗原受體(例如結合CD20及CD19之雙順反子及雙特異性嵌合抗原受體)。
在其他態樣中，本文提供包含本發明之聚核苷酸或載體之細胞。在一些實施例中，本發明係關於細胞，例如活體外細胞，其包含編碼CAR或TCR之聚核苷酸，該CAR或TCR包含本文所揭示之scfv中之一或兩者。在其他實施例中，本發明係關於細胞，例如活體外細胞，其包含由CAR或TCR編碼之多肽，該CAR或TCR包含本文所揭示之scfv之一或兩者。在一些實施例中，多肽包含以下闡述之胺基酸序列或其任何組合。 SEQ ID NO:232(抗CD19 scFv輕鏈)： DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT SEQ ID NO:221(抗CD19 scFv重鏈)： EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO:56(抗CD20輕鏈)： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:45(抗CD20重鏈)： QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:56(抗CD20 scFv 2輕鏈)： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:155(抗CD20 scFv 2重鏈)：QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSRYVWSWIRQPPGKGLEWIGEIDSSGKTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVRYDSSDSYYYSYDYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:144(抗CD20 scFv 3輕鏈)： DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSYSFPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:177(抗CD20 scFv 3重鏈)： QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYAWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHRGFTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVRYDSSDSYYYSYDYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:78(抗CD20 scFv 4輕鏈)： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRFPPTFGQGTKVEIK SEQ ID NO:67(抗CD20 scFv 4重鏈)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKEYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYSGHTYYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGPHYDDWSGFIIWFDPWGQGTLVTVSS
可使用任何細胞作為本發明之聚核苷酸、載體或多肽之宿主細胞。在一些實施例中，細胞可為原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或高級真核細胞，諸如哺乳動物細胞。適合的原核細胞包括但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科(Enterobactehaceae )，諸如埃希氏桿菌屬(Escherichia )，例如大腸桿菌、腸桿菌屬(Enterobacter )、歐文菌屬(Erwinia )、克雷伯氏菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門氏菌屬(Salmonella )，例如鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium )、沙雷菌屬(Serratia )，例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans )及志賀桿菌屬(Shigella )、桿菌(Bacilli )，諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis )及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis )、假單胞菌屬(Pseudomonas )，諸如綠膿桿菌(P. aeruginosa )及鏈黴菌(Streptomyces )。在一些實施例中，細胞為人類細胞。在一些實施例中，細胞為免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係選自由以下組成之群：T細胞、B細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、TCR表現細胞、自然殺手(NK)細胞、樹突狀細胞、粒細胞、先天性淋巴樣細胞、巨核細胞、單核球、巨噬細胞、血小板、胸腺細胞及骨髓細胞。在一個實施例中，免疫細胞為T細胞。在另一實施例中，免疫細胞為NK細胞。在某些實施例中，T細胞為腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、自體T細胞、經工程改造之自體T細胞(eACT™)、同種異體T細胞、異源T細胞或其任何組合。
嵌合抗原受體(CAR或CAR-Ts)及經工程改造之T細胞受體(TCR)可容易插入至免疫細胞(例如T細胞)中且由其表現，產生結合劑。在某些實施例中，細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)獲自供者個體。在一些實施例中，供者個體為罹患癌症或腫瘤之人類患者。在其他實施例中，供者個體為未罹患癌症或腫瘤之人類患者。在一些實施例中，經工程改造之細胞對個體為自體的。在一些實施例中，經工程改造之細胞對於個體為同種異體的。
本發明之細胞可經由此項技術中已知之任何來源獲得。舉例而言，T細胞可在活體外自造血幹細胞群體分化，或T細胞可獲自個體。T細胞可獲自例如周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積液、脾臟組織及腫瘤。另外，T細胞可來源於一或多個此項技術中可獲得之T細胞株。T細胞亦可使用熟習此項技術者已知之許多技術，諸如FICOLL™分離及/或血球分離術獲自自個體收集之血液單元。在某些實施例中，藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理。在一些實施例中，細胞用PBS洗滌。如應瞭解，可使用洗滌步驟，諸如藉由使用半自動流過式離心機，例如CobeTM 2991細胞處理器、Baxter CytoMateTM 或其類似物。在一些實施例中，使經洗滌細胞再懸浮於一或多種生物相容緩衝液或具有或不具有緩衝液之其他生理鹽水溶液中。在某些實施例中，移除血球分離術樣品之不合需要之組分。用於T細胞療法之分離T細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號中，該公開案以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，T細胞自PBMC藉由裂解紅細胞及消耗單核細胞，例如藉由使用經由PERCOLLTM 梯度之離心而分離。在一些實施例中，特定T細胞亞群(諸如CD4+ 、CD8+ 、CD28+ 、CD45RA+ 及CD45RO+ T細胞)藉由此項技術中已知之正向或負向選擇技術進一步分離。舉例而言，藉由負向選擇富集T細胞群體可使用針對負向選擇之細胞所特有之表面標記物的抗體之組合來實現。在一些實施例中，可使用經由負磁性免疫黏附或流式細胞測量術進行的細胞分選及/或選擇，其使用針對存在於經負向選擇之細胞上之細胞表面標記的單株抗體混合液。舉例而言，為藉由負向選擇富集CD4+ 細胞，單株抗體混合液通常包括CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20及HLA-DR之抗體。在某些實施例中，使用流式細胞測量術及細胞分選分離用於本發明中之相關細胞群體。
在一些實施例中，PBMC直接用於使用如本文所述之方法用免疫細胞(諸如CAR或TCR)遺傳修飾。在某些實施例中，在分離PBMC之後，進一步分離T淋巴細胞，且在遺傳修飾及/或擴增之前或之後，將細胞毒性與輔助T淋巴細胞分選為初始、記憶及效應T細胞亞群。
在一些實施例中，CD8+ 細胞藉由識別與此等類型之CD8+ 細胞中之各者相關聯之細胞表面抗原而進一步分選為原始、中樞記憶及效應細胞。在一些實施例中，中樞記憶T細胞之表型標記物之表現包括CCR7、CD3、CD28、CD45RO、CD62L及CD127，且對於顆粒酶B為陰性的。在一些實施例中，中樞記憶T細胞為CD8+ 、CD45RO+ 及CD62L+ T細胞。在一些實施例中，效應T細胞對於CCR7、CD28、CD62L及CD127為陰性的且對於顆粒酶B及穿孔蛋白為陽性的。在某些實施例中，CD4+ T細胞進一步分選成亞群。舉例而言，CD4+ T輔助細胞可藉由鑑別具有細胞表面抗原之細胞群而分選成初始、中樞記憶及效應細胞。
在一些實施例中，免疫細胞(例如T細胞)在使用已知方法分離之後遺傳修飾，或免疫細胞在遺傳修飾之前活體外活化及擴增(或在先驅細胞之情況下分化)。在另一實施例中，免疫細胞(例如T細胞)經本文所述之嵌合抗原受體遺傳修飾(例如經包含一或多種編碼CAR之核苷酸序列之病毒載體轉導)且接著活體外活化及/或擴增。用於活化及擴增T細胞之方法在此項技術中已知且描述於例如美國專利第6,905,874號、第6,867,041號、及第6,797,514號、及PCT公開案第WO 2012/079000號中，其內容以全文引用的方式併入本文中。一般而言，此類方法包括在具有諸如IL-2之適當細胞介素之培養基中使PBMC或分離之T細胞與一般連接於珠粒或其他表面之諸如抗CD3及抗CD28抗體之刺激劑及協同刺激劑接觸。連接於相同珠粒之抗CD3及抗CD28抗體充當「替代」抗原呈現細胞(APC)。一個實例為Dynabeads®系統，一種用於人類T細胞之生理性活化的CD3/CD28活化劑/刺激物系統。在其他實施例中，使用諸如美國專利第6,040,177號及第5,827,642號及PCT公開案第2012/129514號中所述之彼等方法之方法用飼養細胞及適當抗體及細胞介素將T細胞活化且刺激以增殖，其內容以全文引用的方式併入本文中。
在本發明之各種態樣中，包含、表現、編碼或轉化以編碼本發明之載體或多肽的細胞(例如本發明之抗CD20結合模體及/或抗CD20/抗CD19抗原結合系統)為結合劑。結合劑或結合劑群體可用作結合劑(一種組合物，其包含適用於治療，例如癌症之細胞)(例如用作其活性劑)。
本發明進一步包含用於例如藉由用本發明之載體或核酸轉化(例如轉導)細胞來產生如本文所揭示之抗體藥劑的方法及製程。在一些實施例中，用於產生如本文所揭示之抗體藥劑的方法或製程包含用編碼本文所提供之至少一個抗原結合系統之核酸(例如，存在於載體中之核酸)來轉化(例如轉導)細胞。一般而言，本文所描述之抗體藥劑可由免疫細胞產生，例如適用於授受細胞療法或能夠適用於授受細胞療法之細胞。在一些實施例中，結合劑選自由以下組成之群的細胞類型產生：TIL、T細胞、CD8+ 細胞、CD4+ 細胞、NK細胞、γ-δ T細胞、調節性T細胞或外周血液單核細胞。「腫瘤浸潤淋巴細胞」或TIL係指已離開血流且遷移至腫瘤中之白血球。淋巴細胞可分成包含B細胞、T細胞及自然殺手細胞之三個組。「T細胞」係指包含CD4+ 輔助細胞、CD8+ 細胞毒性T細胞及γ-δ T細胞之CD3+ 細胞。
在某些實施例中，結合劑係藉由用編碼本文所描述之抗原結合系統及/或表現構築體之核酸(例如，(i)第一重組表現載體，其包含編碼抗原結合系統之核酸；及第二重組表現載體，其包含誘導型表現構築體，(ii)單一重組表現載體，其包含編碼抗原結合系統之核酸及誘導型表現構築體兩者；或(iii)重組表現載體，其包含組成性表現構築體)遺傳修飾(例如，轉化)細胞(例如，免疫細胞)來產生。重組表現載體可包含任何類型之核苷酸，其包含但不限於DNA及RNA，其可為單鏈或雙鏈，部分由天然來源合成或獲得，且可含有天然、非天然或改變之核苷酸。重組表現載體可包含天然存在的或非天然存在的核苷酸間鍵或兩種類型之鍵。
在一些實施例中，方法包含用如本文所揭示之編碼抗原結合系統之聚核苷酸轉導細胞。在一些實施例中，方法包含用包含編碼抗原結合系統之聚核苷酸之載體轉導細胞。
在一些實施例中，用於T細胞療法中之供者T細胞獲自患者(例如對於自體T細胞療法)。在其他實施例中，用於T細胞療法中之供者T細胞獲自並非患者之個體。在例示性態樣中，個體可經歷白細胞去除術，其中將白細胞收集、增濃或離體耗盡以選擇及/或分離所關注細胞，例如T細胞。此等T細胞分離物可藉由方法擴展且處理，使得可引入一或多種本發明之CAR構築體，藉此產生本發明之CAR T細胞。
在一些實施例中，免疫細胞獲自個體且經本文所描述之誘導性表現構築體或組成性表現構築體(例如包含本文所描述之誘導性表現構築體或組成性表現構築體之表現載體)轉化(例如轉導)以獲得結合劑。因此，在一些實施例中，結合劑包含投與至獲得免疫細胞之相同個體中之自體細胞。在一些實施例中，免疫細胞獲自個體且經本文所描述之誘導性表現構築體或組成性表現構築體(例如包含本文所描述之誘導性表現構築體或組成性表現構築體之表現載體)轉化(例如轉導)，以獲得同種異體轉移至另一個體之結合劑。
在某些實施例中，T細胞獲自供者個體。在一些實施例中，供者個體為罹患癌症或腫瘤之人類患者。在其他實施例中，供者個體為未罹患癌症或腫瘤之人類患者。
本發明之各種組合物包含經工程改造之細胞群體，其可藉由任何手段產生。在一些實施例中，本發明提供經工程改造以表現如本文所述之抗原結合系統之人類細胞群體。在一些實施例中，此類群體包含結合劑。在一些實施例中，此類群體包含經培養的群體。在一些實施例中，此類群體為來自單一人類來源之經培養細胞群體，其可在一些實施例中接受經培養群體之投與。如本文所揭示，結合劑可包含任何單細胞或細胞群體，例如經工程改造之細胞群體，如本文所提供。
本發明之其他態樣係針對一種組合物，其包含本文所述之聚核苷酸、本文所述之載體、本文所述之多肽或本文所述之活體外細胞。在一些實施例中，組合物包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。在一些實施例中，組合物包含賦形劑。在一個實施例中，組合物包含編碼包含本文所描述之抗原結合分子之CAR或TCR之聚核苷酸。在另一實施例中，組合物包含CAR或TCR，其包含由本發明之聚核苷酸編碼之TCD。在另一實施例中，組合物包含T細胞，該T細胞包含CAR或TCR，該CAR或TCR包含本文所揭示之scfv中之一或兩者。
在其他實施例中，組合物經選擇以用於非經腸遞送、吸入或經由消化道(諸如經口)遞送。此類醫藥學上可接受之組合物之製備在熟習此項技術者的能力範圍內。在某些實施例中，緩衝劑用於將組合物維持在生理pH或略低之pH，通常在約5至約8之pH範圍內。在某些實施例中，當涵蓋非經腸投與時，組合物呈在醫藥學上可接受之媒劑中包含本文所描述之組合物、含或不含額外治療劑之無熱原非經腸可接受水溶液形式。在某些實施例中，用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中具有或不具有至少一種額外治療劑之本文所述之組合物調配為適當防腐之無菌等張溶液。在某些實施例中，製備涉及用聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體調配所需分子，該等聚合化合物提供產物之控制或持續釋放，隨後經由儲槽式注射劑遞送。在某些實施例中，可植入藥物遞送裝置用於引入所需分子。
在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含及/或遞送本發明中之一或多者，例如本發明之抗原結合系統、編碼其之核酸及/或包含及/或表現其之細胞或其群體。
在一些實施例中，本發明提供包含及/或遞送如本文所提供之一或多種細胞的醫藥組合物，例如編碼或表現本文所提供之多肽的結合劑，例如抗CD20/抗CD19 CAR(亦即，「結合劑醫藥組合物」)。結合劑醫藥組合物可包含一或複數個如本文所述之細胞與一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。此類組合物可包含緩衝液，諸如中性緩衝生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或聚葡萄糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。
本發明之結合劑醫藥組合物可經調配用於根據本文所闡述之任何實施例投與，其至少一個非限制性實例為靜脈內投與。組合物可經調配以用於靜脈內、瘤內、動脈內、肌肉內、腹膜內、鞘內、硬膜外及/或皮下投與途徑。較佳地，調配組合物以用於非經腸投與途徑。適於非經腸投與之組合物可為水性或非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及溶解物，例如使得組合物與預期受體之血液等張之溶解物。水性或非水性無菌懸浮液可含有一或多種懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。本發明之結合劑醫藥組合物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投與。
注射用無菌組合物可根據習知醫藥實踐使用注射用蒸餾水作為媒劑來調配。舉例而言，生理食鹽水或含有葡萄糖之等張溶液及其他補充劑(諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇及氯化鈉)可用作注射水溶液，視情況與適合的增溶劑(例如醇，諸如乙醇及多元醇，諸如丙二醇或聚乙二醇)及非離子界面活性劑(諸如聚山梨醇酯80™、HCO-50及其類似物)組合。
油性液體之非限制性實例包含芝麻油及大豆油，且其可與苯甲酸苯甲酯或苯甲醇組合作為增溶劑。可包含之其他物品為緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝液或乙酸鈉緩衝液；舒緩劑，諸如普魯卡因鹽酸鹽(procaine hydrochloride)；穩定劑，諸如苄醇或苯酚；及抗氧化劑。經調配之注射液可封裝於適合之安瓿中。
在一個實施例中，結合劑醫藥組合物實質上不含可偵測含量之污染物，例如內毒素、黴漿菌、複製勝任型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV配子、殘餘抗CD3/抗CD28塗佈之珠粒、小鼠抗體、合併之人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體封裝細胞或質體組分、細菌及真菌。在一個實施例中，細菌為選自由以下組成之群的至少一者：糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌、流行性嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。
在各種實施例中，本文所提供之細胞(例如結合劑，例如經工程改造之T細胞或經工程改造之NK細胞)可活化及/或自結合劑醫藥組合物擴增及/或以產生結合劑醫藥組合物。在一些實施例中，額外步驟可在向個體投與之前進行。舉例而言，結合劑可在向個體投與之前，在使免疫細胞與本文所述之誘導型表現構築體或組成性表現構築體(例如包含誘導型表現構築體或組成性表現構築體之表現載體)接觸(例如轉導或轉染)之後活體外擴增。活體外擴增可在向個體投與之前進行1天或更多天，例如2天或更多天、3天或更多天、4天或更多天、6天或更多天或8天或更多天。在一些實施例中，活體外擴增可在向個體投與之前進行21天或更短，例如18天或更短、16天或更短、14天或更短、10天或更短、7天或更短或5天或更短。舉例而言，活體外擴增可在向個體投與之前進行1-7天、2-10天、3-5天或8-14天。包含例如結合劑(例如經工程改造之T細胞或經工程改造之NK細胞)之結合劑醫藥組合物可調配用於以所需劑量投與，例如104 至109 個細胞/公斤體重(例如105 至106 個細胞/公斤體重)之劑量。本發明之某些實施例包含向個體投與如本文所描述之醫藥組合物的方法，諸如本文所描述之結合劑(例如本發明之經工程改造之細胞群體)、本文所描述之蛋白質治療劑、包含結合劑之組合物及/或包含蛋白質治療劑之組合物，例如當以適當給藥方案投與時有效治療個體之量。
在一些實施例中，結合劑對個體為自體的，且在自個體分離免疫細胞之前，個體可進行免疫未處理、免疫、患病或在另一條件下。在一些實施例中，在活體外擴增期間，結合劑可用抗原(例如TCR抗原)刺激。抗原刺激之擴增視情況可補充有在非特異性刺激淋巴細胞增殖之條件下之擴增，諸如抗CD3抗體、抗Tac抗體、抗CD28抗體或植物血球凝集素(PHA)。經擴增之結合劑可直接投與至個體中或可冷凍以供未來使用，亦即用於後續投與個體。
在一些實施例中，在輸注至癌症患者中之前用介白素-2(IL-2)離體處理結合劑，且在輸注之後用IL-2治療癌症患者。此外，在一些實施例中，癌症患者可在投與結合劑之前經歷預備淋巴細胞耗盡(免疫系統之暫時切除)。IL-2處理與製備型淋巴耗盡之組合可增強結合劑之持久性。在一些實施例中，結合劑經編碼細胞介素之核酸轉導或轉染，該核酸可經工程改造以提供細胞介素之組成型、可調節或可模板控制之表現。適合之細胞介素包含例如在收縮階段期間起增強T淋巴細胞之存活作用的細胞介素，其可促進記憶T淋巴細胞之形成及存活。
在某些實施例中，在投與另一治療劑(諸如癌症治療劑)之前、基本上同時或之後投與結合劑。癌症治療劑可為例如化學治療劑、生物劑或輻射治療。在一些實施例中，未向接受結合劑之個體投與足以引起免疫細胞耗盡之治療，諸如淋巴細胞耗盡化學療法或放射療法。
在一些實施例中，向個體投與之劑量可隨實施例、所用組合物、投與方法及所治療之位點及個體而變化。然而，劑量應足以提供治療反應。臨床醫師可確定向人類或其他個體投與之組合物之治療有效量以便治療或預防醫學病狀。治療有效所需之組合物之精確量可視許多因素而定，例如黏合劑之活性及投與途徑。
可向個體投與適合數目之結合劑細胞。雖然本文所述之單一結合劑細胞能夠擴增且提供治療益處，但在一些實施例中，投與102 或更多，例如103 或更多、104 或更多、105 或更多、或108 或更多個結合劑細胞。在一些實施例中，向個體投與本文所述之1012 或更少，例如1011 或更少、109 或更少、107 或更少，或105 或更少個結合劑細胞。在一些實施例中，投與本文所述之102 -105 、104 -107 、103 -109 或105 -1010 個結合劑細胞。可投與結合劑醫藥組合物，例如104 至109 個細胞/公斤體重(例如105 至106 個細胞/公斤體重)之劑量。結合劑醫藥組合物可以例如約2×106 個細胞/公斤、約3×106 個細胞/公斤、約4×106 個細胞/公斤、約5×106 個細胞/公斤、約6×106 個細胞/公斤、約7×106 個細胞/公斤、約8×106 個細胞/公斤、約9×106 個細胞/公斤、約1×107 個細胞/公斤、約2×107 個細胞/公斤、約3×107 個細胞/公斤、約4×107 個細胞/公斤、約5×107 個細胞/公斤、約6×107 個細胞/公斤、約7×107 個細胞/公斤、約8×107 個細胞/公斤或約9×107 個細胞/公斤之劑量投與。
本文所述之結合劑之劑量可一次性投與或以在適合時段內投與之一系列亞劑量投與至哺乳動物，例如按需要每日、每半週、每週、每兩週、每半月、每兩月、每半年或每年。包含有效量之結合劑的劑量單位可以單次日劑量投與，或每日總劑量可視需要以每日投與兩次、三次、四次或更多次分次劑量投與。
適合之投與手段可由醫療從業者選擇。投與途徑可為非經腸投與途徑，例如藉由注射、經鼻投與、經肺投與或經皮投與來投與。投與可藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射、皮下注射而為全身性或局部的。在一些實施例中，選擇組合物用於非經腸遞送、吸入或經由消化道(諸如經口)遞送。劑量及投與方法可視個體之體重、年齡、病狀及其類似因素而變化，且可適合地選擇。
在各種實施例中，本文所述之結合劑可併入醫藥組合物中。包含本發明之結合劑的醫藥組合物可藉由已知方法調配(諸如描述於Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,編Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985))。在各種情況下，包含本發明之結合劑的醫藥組合物可經調配以包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑之實例包含但不限於生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。包含本發明之結合劑的組合物可包含醫藥學上可接受之鹽，例如酸加成鹽或鹼加成鹽。
在各種實施例中，包含如本文所描述之結合劑(例如，注射用無菌調配物)的組合物可根據習知醫藥實踐使用注射用蒸餾水作為媒劑來調配。舉例而言，生理食鹽水或含有葡萄糖之等張溶液及其他補充劑(諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇及氯化鈉)可用作注射水溶液，視情況與適合的增溶劑(例如醇，諸如乙醇及多元醇，諸如丙二醇或聚乙二醇)及非離子界面活性劑(諸如聚山梨醇酯80™、HCO-50及其類似物)組合。如本文所揭示，包含結合劑之醫藥組合物可呈任何形式。此類形式包含例如，液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如，可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。
任何形式之選擇或用途可部分地視預期投與模式及治療性應用而定。舉例而言，包含意欲全身性或局部遞送之本發明之結合劑的組合物可呈可注射或可輸注溶液形式。因此，包含本發明之結合劑的組合物可經調配以藉由非經腸模式(例如靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射)投與。非經腸投與係指通常藉由注射實現之除經腸及局部投與外之投與模式，且包含但不限於靜脈內、鼻內、眼內、肺、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、肺內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外、腦內、顱內、頸動脈內及胸骨內注射及輸注。
投與途徑可為非經腸投與途徑，例如藉由注射、經鼻投與、經肺投與或經皮投與來投與。投與可藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射、皮下注射而為全身性或局部的。
在各種實施例中，包含本發明之結合劑的醫藥組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於在高濃度下穩定儲存之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將包含所需量之本發明之結合劑之組合物視需要與上文所列舉之成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌來製備。一般而言，分散液藉由將包含本發明之結合劑的組合物併入含有鹼性分散介質及來自以上所列舉成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，製備方法包含產生組合物之粉末的真空乾燥及冷凍乾燥，該組合物包含本發明之黏合劑加來自其先前經滅菌過濾之溶液的任何額外所需成分(參見下文)。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。包含本發明之結合劑的可注射組合物之延長吸收可藉由在包含本發明之結合劑的組合物中包含延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
包含本發明之結合劑的醫藥組合物可以包含於水中之無菌溶液或懸浮液或另一醫藥學上可接受之液體的可注射調配物形式非經腸投與。舉例而言，包含本發明之結合劑的醫藥組合物可藉由以下調配：適當地組合治療性分子與醫藥學上可接受之媒劑或介質，諸如無菌水及生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、調味劑賦形劑、稀釋劑、媒劑、防腐劑、結合劑，隨後以通常接受之醫藥實踐所需的單位劑型混合。醫藥製劑中所包含之活性成分之量使得提供指定範圍內之適合劑量。油性液體之非限制性實例包含芝麻油及大豆油，且其可與苯甲酸苯甲酯或苯甲醇組合作為增溶劑。可包含之其他物品為緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝液或乙酸鈉緩衝液；舒緩劑，諸如普魯卡因鹽酸鹽(procaine hydrochloride)；穩定劑，諸如苄醇或苯酚；及抗氧化劑。經調配之注射液可封裝於適合之安瓿中。
在一些實施例中，包含本發明之結合劑的組合物可調配用於在低於0℃ (例如，-20℃或-80℃)之溫度下儲存。在一些實施例中，包含本發明之結合劑的組合物可調配用於在2-8℃ (例如4℃)下儲存至多2年(例如一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、10個月、11個月、1年、11/2年或2年)。因此，在一些實施例中，包含本發明之結合劑之組合物在2-8℃ (例如4℃)下儲存至少1年時穩定。
在一些情況下，包含本發明之結合劑的醫藥組合物可調配為溶液。在一些實施例中，包含本發明之結合劑的組合物可例如調配為具有適合濃度且適用於在2-8℃ (例如4℃)下儲存之緩衝溶液。包含如本文所述之結合劑的醫藥組合物可調配於免疫脂質體組合物中。循環時間延長的脂質體揭示於例如美國專利第5,013,556號中。
在某些實施例中，包含本發明之結合劑的組合物可與將保護組合物免於快速釋放之載劑調配，諸如控制釋放調配物，包含植入物及微囊封遞送系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之許多方法為已知的。參見例如J. R. Robinson (1978) 「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, 」 Marcel Dekker, Inc., New York。
在一些實施例中，包含本發明之結合劑的組合物可以適於肺內投與(例如經由吸入器或噴霧器投與)至諸如人類之哺乳動物的組合物形式調配。用於調配此類組合物之方法為已知的。乾粉吸入器調配物及適合投與調配物之系統亦為已知的。經肺投與可為經口及/或經鼻。經肺遞送之醫藥裝置之實例包含定劑量吸入器、乾粉吸入器(DPI)及噴霧器。舉例而言，包含本發明之結合劑的組合物可藉助於乾粉吸入器投與至個體之肺。此等吸入器為將分散性及穩定性乾粉調配物遞送至肺的無推進劑裝置。乾粉吸入器為已知的且包含但不限於TURBOHALER® (AstraZeneca; London, England)、AIR®吸入器(ALKERMES®; Cambridge, Mass.)、ROTAHALER® (GlaxoSmithKline; London, England)及ECLIPSETM (Sanofi-Aventis; Paris, France)。亦參見例如PCT公開案第WO 04/026380號、第WO 04/024156號及第WO 01/78693號。DPI裝置已用於對諸如胰島素及生長激素之多肽的經肺投與。在一些實施例中，包含本發明之結合劑的組合物可藉由定劑量吸入器肺內投與。此等吸入器依賴於推進劑將離散劑量之分子遞送至肺。其他裝置及肺內投與方法闡述於例如美國專利申請公開案第20050271660號及第20090110679號中，其各者之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含本發明之結合劑的組合物可調配用於遞送至眼睛，例如呈醫藥學上可接受之溶液、懸浮液或軟膏形式。用於治療眼睛之製劑可呈無菌水溶液形式，其含有例如額外成分，諸如但不限於防腐劑、緩衝劑、張力劑、抗氧化劑及穩定劑、非離子濕潤劑或澄清劑及增黏劑。製劑可局部投與需要治療之個體(例如罹患AMD之個體)之眼睛，此藉由習知方法(例如呈滴劑形式)或藉由用含有一或多種組合物的治療性溶液沐浴眼睛達成。
在某些實施例中，用於將藥物引入眼睛之玻璃體腔中之多種裝置可為適當的，以便投與包含本發明之結合劑的組合物。舉例而言，美國公開案第2002/0026176號描述一種含藥塞，其可經由鞏膜插入，使得其伸入玻璃體腔中以將醫藥劑遞送至玻璃體腔中。在另一實例中，美國專利第5,443,505號描述一種引入脈絡膜上腔空間或無血管區域中的可植入裝置，用於將藥物持續釋放至眼睛內。美國專利第5,773,019號及第6,001,386號各自揭示可附接於眼睛之鞏膜表面的可植入藥物遞送裝置。用於遞送治療劑至眼睛之其他方法及裝置(例如，轉鞏膜貼片及經由隱形眼鏡遞送)描述於例如Ambati及Adamis (2002) Prog Retin Eye Res 21(2):145-151、Ranta及Urtti (2006) Adv Drug Delivery Rev 58(11):1164-1181、Barocas及Balachandran (2008) Expert Opin Drug Delivery 5(1):1-10(10)、Gulsen及Chauhan (2004) Invest Opthalmol Vis Sci 45:2342-2347、Kim等人(2007) Ophthalmic Res 39:244-254以及PCT公開案第WO 04/073551號，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在各種實施例中，皮下投與可藉助於裝置實現，該裝置諸如注射器、預填充注射器、自動注射器(例如拋棄式或可再用)、筆式注射器、貼片注射器、可穿戴式注射器、具有皮下輸液組之可走動式注射器輸液泵或用於與皮下注射之結合劑藥物組合的其他裝置。
本發明之注射系統可使用如美國專利第5,308,341號中所述的遞送筆。筆裝置常用於將胰島素自遞送至患有糖尿病之患者。此類裝置可包含至少一個注射針(例如長度為約5至8 mm之31號針)，一般預填充有一或多個治療單位劑量之治療溶液，且適用於以儘可能少之疼痛將溶液快速遞送至個體。一種藥物遞送筆包含可接受治療性或其他藥物劑量之小瓶的小瓶固持器。筆可為完全機械裝置或其可與電子電路組合以精確設定及/或指示注射至使用者中之藥物治療劑量。參見例如美國專利第6,192,891號。在一些實施例中，筆裝置之針為拋棄式的且套組包含一或多個拋棄式替代針。適用於遞送包含本發明之結合劑本發明所提供之任一種組合物的筆裝置亦描述於例如美國專利第6,277,099號、第6,200,296號及第6,146,361號中，其各者之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。基於微針之筆裝置描述於例如美國專利第7,556,615號，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。亦參見由Scandinavian Health Ltd製造之精密筆注入器(PPI)裝置，MOLLYTM 。
在一些實施例中，包含本發明之結合劑的組合物可以不依賴於經由血管系統將結合劑輸送至其預期目標組織或位點的局部投與方式遞送至個體。舉例而言，包含本發明之結合劑的組合物可藉由注射或植入包含本發明之黏合劑的組合物或藉由注射或植入含有包含本發明之結合劑的組合物之裝置來遞送。在某些實施例中，在局部投與目標組織或位點附近之後，包含本發明之結合劑或其一或多種組分之組合物可擴散至不為投與位點之既定目標組織或位點。
在一些實施例中，包括本發明之結合劑的組合物可局部投與關節，例如直接投與關節(例如至關節空間中)或關節附近。包含本發明之結合劑之組合物可局部投與至之關節內關節之實例包含例如髖、膝、肘、手腕、胸鎖、顳下頜、腕骨、跗骨、踝及罹患關節炎病狀之任何其他關節。包含本發明之結合劑的組合物亦可投與至囊，諸如肩峰囊、肱二頭肌橈骨囊、尺橈囊、三角肌囊、髕下囊、坐骨囊及任何其他囊。
在一些實施例中，包含本文所提供之本發明之結合劑的組合物以單位劑型存在，該單位劑型可適用於自投與。此類單位劑型可提供於容器內，一般例如小瓶、藥筒、預填充注射器或拋棄式筆。諸如美國專利第6,302,855號中所描述之劑量儀裝置之劑量儀亦可(例如)與如本文中所描述之注射系統一起使用。
醫藥溶液可包含治療有效量之包含本發明之結合劑的組合物。此類有效量可部分地基於所投與之包含本發明之結合劑的組合物之效應，或包含本發明之結合劑及一或多種額外活性劑(若使用超過一種藥劑)的組合物之組合效應容易地確定。包含本發明之結合劑之治療有效量的組合物亦可根據諸如以下之因素而變化：個體之疾病病況、年齡、性別及體重，及組合物(及一或多種額外活性劑)在個體中引發所需反應之能力，例如至少一種病狀參數之改善，例如補體介導之病症之至少一種症狀之改善。舉例而言，治療有效量之包含本發明之結合劑的組合物可抑制(減輕出現之嚴重程度或消除出現之嚴重程度)及/或預防病症及/或病症之症狀中之任一者。治療有效量亦為包含本發明之結合劑之組合物之治療有利效果超過其任何毒性或有害效果的量。
包含本發明之結合劑的組合物可以固定劑量或以毫克/公斤(mg/kg)劑量投與。在一些實施例中，亦可選擇劑量以減少或避免產生針對包含本發明之結合劑的組合物中之抗原結合分子中之一或多者的抗體或其他宿主免疫反應。儘管決不意欲為限制性的，結合劑(諸如包含本發明之結合劑的組合物)之例示性劑量包含例如1-1000 mg/kg、1-100 mg/kg、0.5-50 mg/kg、0.1-100 mg/kg、0.5-25 mg/kg、1-20 mg/kg及1-10 mg/kg。包含本發明之結合劑的組合物之例示性劑量包含但不限於)0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4 mg/kg、8 mg/kg或20 mg/kg。
包含本發明之結合劑之組合物中之任一者之適合的人類劑量可進一步在例如I期劑量遞增研究中評估。參見例如van Gurp等人(2008) Am J Transplantation 8(8):1711-1718、Hanouska等人(2007) Clin Cancer Res 13(2,部分1):523-531、及Hetherington等人(2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10): 3499-3500。
在各種實施例中，醫藥組合物可包含本發明之核酸，例如載體。調配包含本發明核酸之醫藥組合物的方法為已知的，例如在以下系列中之書籍中：Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, N.Y.)。舉例而言，用於非經腸、皮內或皮下施用之溶液或懸浮液可包含以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼(諸如，鹽酸或氫氧化鈉)來調節pH。非經腸製劑可封閉於例如安瓿、拋棄式注射器或超過一個由玻璃或塑膠製成之劑量小瓶中。
包含適合於注射之本發明之核酸的醫藥組合物可包含無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。對於靜脈內投藥，適合載劑可包含生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。
可考慮與有效治療用途相關之無菌性、穩定性、黏度及其他因素。舉例而言，一種維持流動性之方法包含使用諸如卵磷脂之包衣、維持所需粒度或使用界面活性劑。在一些情況下，組合物中將較佳包含等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)、氯化鈉。在一些情況下，可藉由在組合物中包含延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來延長對包含本發明之核酸之可注射組合物的吸收。
無菌可注射溶液可藉由併入諸如抗菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物)之成分中之一者或組合及/或藉由過濾滅菌來製備。在一些情況下，分散液係藉由將活性分子併入含有基本分散介質及抗細菌劑或抗真菌劑之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，製備方法包含自其先前經滅菌過濾之溶液真空乾燥及冷凍乾燥。
包含本發明之核酸的經口組合物可包含惰性稀釋劑或可食載劑。出於經口治療性投與之目的，本發明之核酸可與賦形劑合併且例如以錠劑、糖衣錠或膠囊(例如明膠膠囊)形式使用。包含本發明之核酸的經口組合物亦可使用適用作漱口劑之流體載劑製備。可包含醫藥學上相容之結合劑及/或佐劑材料作為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及其類似物可含有以下成分或具有類似性質之分子中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、Primogel®或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes®；滑動劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、柳酸甲酯或橙調味劑。
在一些實施例中，核酸可藉由適合於投與核酸試劑(諸如DNA疫苗)之任何方法投與。此等方法包含例如基因槍、生物注射器及皮膚貼片，以及無針方法，諸如美國專利第6,194,389號中所揭示之微粒DNA疫苗技術及如美國專利第6,168,587號中所揭示之哺乳經皮無針接種疫苗與粉末型痘苗。另外，鼻內遞送為可能的，如例如Hamajima等人, (1998) Clin. Immunol. Immunopathol. 88(2), 205-10. Liposomes (例如如美國專利第6,472,375號中所述)。在某些情況下，可使用微囊封。另外，可使用可生物降解之可靶向微粒遞送系統(例如，如美國專利第6,471,996號中所描述)。
包含本發明核酸之組合物可包含諸如佐劑、稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩衝劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、其混合物之組分或包括於包含核酸之治療組合物中之任何組分。核酸組合物可包含例如與醫藥投與相容之生理食鹽水、溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物、磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、水及乳液(諸如油/水或水/油乳液)及各種類型之濕潤劑。補充活性分子亦可併入本發明之包含本發明之核酸的組合物中。本發明之包含本發明之核酸的組合物可包含穩定劑及防腐劑及本文所述之載劑中之任一者，視情況存在之額外限制條件為其可接受用於活體內。對於額外載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 第15版(Mack Publ. Co., Easton (1975)及Williams & Williams, (1995),以及在「PHYSICIAN'S DESK REFERENCE,」 第52版, Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)中。
本文所描述之方法包含製造及使用包含本發明之核酸之醫藥組合物。包含本發明之核酸的醫藥組合物一般經調配以與其預期投與途徑相容。投藥途徑之實例包含非經腸，例如靜脈內、顱內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、經皮(局部)、經黏膜及直腸投與。
核酸組合物可包含緩衝劑或pH調節劑。緩衝劑可為由有機酸或鹼製備之鹽。本發明之緩衝劑包含有機酸鹽，諸如檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、葡萄糖酸鹽、碳酸鹽、酒石酸鹽、丁二酸鹽、乙酸鹽或鄰苯二甲酸鹽、Tris、緩血酸胺鹽酸鹽及磷酸鹽緩衝劑。其他載劑包含聚合賦形劑/添加劑(諸如聚乙烯吡咯啶酮)、聚蔗糖(聚合糖)、葡萄糖結合劑(例如環糊精，諸如2-羥丙基-正交-環糊精)、聚乙二醇、調味劑、抗微生物劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、界面活性劑(例如聚山梨醇酯，諸如TWEEN 20®及TWEEN 80®)、脂質(例如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)及螯合劑(例如EDTA)。
在本發明之核酸為載體之某些實施例中，本發明包含用於基因轉導及/或基因療法之組合物，例如包含病毒顆粒(例如AAV顆粒及/或反轉錄病毒顆粒，諸如慢病毒顆粒)之組合物。如參考病毒效價所用之術語「基因組粒子(gp)」或「基因組等效物」係指含有重組病毒基因組(例如重組AAV DNA基因組)之病毒粒子的數目，不論感染性或功能性如何。可量測載體製劑中基因組粒子之數目。如參考病毒效價所用之術語「感染單位(IU)」、「感染性粒子」或「複製單元」係指例如重組AAV載體粒子之感染及可複製能力重組病毒的數目，如藉由感染性中心分析(亦稱為複製中心分析)所量測。如關於病毒效價使用之術語「轉導單元(TU)」係指引起產生功能性轉殖基因產物之感染性重組載體粒子(例如，重組AAV載體粒子)之數目。
在一些實施例中，組合物包含例如每劑量2x106 至2x1012 、2x107 至2x1011 或2x108 至2x1011 個含DNA病毒粒子。在某些實施例中，單位劑型之載體之濃度或效價為：例如至少：(a) 1x1012 個粒子/毫升、2x1012 個粒子/毫升、3x1012 個粒子/毫升、4x1012 個粒子/毫升、5x1012 個粒子/毫升、6x1012 個粒子/毫升、7x1012 個粒子/毫升、8x1012 個粒子/毫升、9x1012 個粒子/毫升、10x1012 個粒子/毫升、15x1012 個粒子/毫升、20x1012 個粒子/毫升、25x1012 個粒子/毫升或50x1012 個粒子/毫升；(b) 1x109 TU/mL、2x109 TU/mL、3x109 TU/mL、4x109 TU/mL、5x109 TU/mL、6x109 TU/mL、7x109 TU/mL、8x109 TU/mL、9x109 TU/mL、10x109 TU/mL、15x109 TU/mL、20x109 TU/mL、25或50x109 TU/mL；或(c) 1x1010 IU/mL、2x1010 IU/mL、3x1010 IU/mL、4x1010 IU/mL、5x1010 IU/mL、6x1010 IU/mL、7x1010 IU/mL、8x1010 IU/mL、9x1010 IU/mL、10x1010 IU/mL、15x1010 IU/mL、20x1010 IU/mL、25x1010 IU/mL或50x1010 IU/mL。此類實施例並不限制本發明所涵蓋之單位劑量且並不限制可與包含本發明之核酸之各種組合物結合使用的劑量之各種量測。舉例而言，可根據每公斤個體之載體基因組(Vg/Kg)或Vg/劑量來量測及/或表示粒子劑量、濃度或量。量測及/或表現粒子劑量、濃度或量之較佳手段可視各種因素(例如投與途徑)而變化。
本發明提供用於同時靶向CD20及另一抗原，例如CD19之技術。在一些實施例中，本發明提供用於引發及/或調節免疫反應之技術。在一些實施例中，本發明提供用於治療癌症(例如以表面表現CD20之細胞為特徵之癌症)之技術。
本說明書包含使用本文所提供之結合劑醫藥組合物以治療或預防癌症。本發明之另一態樣係針對一種用於治療或預防惡性病之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之結合劑醫藥組合物，例如其中細胞包含至少一個本文所提供之抗原結合系統。本發明之包含投與醫藥學有效量之本發明之結合劑醫藥組合物的方法可用於治療個體之癌症、減小腫瘤之尺寸、殺滅腫瘤細胞、預防腫瘤細胞增殖、預防腫瘤生長、自患者消除腫瘤、預防腫瘤復發、預防腫瘤癌轉移、誘導患者緩解或其任何組合。在某些實施例中，本文所提供之方法誘導完全反應。在一些實施例中，本文所提供之方法誘導部分反應。在某些實施例中，結合劑醫藥組合物為、包含、包含作為活性劑或包含作為唯一活性劑之本文所提供之細胞，例如包含或表現本發明之至少一種CAR之細胞。在一些實施例中，結合劑醫藥組合物包含雙順反子CAR系統，其包含抗CD20 CAR及抗CD19 CAR，或結合劑醫藥組合物包含本發明之雙特異性抗C20/抗CD19 CAR。
在各種實施例中，本發明包含本文所提供之結合劑醫藥組合物之用途，其用於在個體中誘導針對癌症之免疫性或向個體提供針對癌症之免疫性。本發明進一步包含一種藉由向個體投與本文所提供之結合劑醫藥組合物來預防個體之癌症的方法。本發明進一步包含一種藉由向個體投與本文所提供之結合劑醫藥組合物來誘導個體之免疫反應的方法。在某些實施例中，結合劑醫藥組合物為、包含、包含作為活性劑或包含作為唯一活性劑之本文所提供之細胞，例如包含或表現本發明之至少一種CAR之細胞。在一些實施例中，結合劑醫藥組合物包含雙順反子CAR系統，其包含抗CD20 CAR及抗CD19 CAR，或結合劑醫藥組合物包含本發明之雙特異性抗C20/抗CD19 CAR。
在某些實施例中，一種治療有需要個體之癌症的方法包含向該個體投與本文所揭示之聚核苷酸、載體、抗體或抗原結合系統。在一個實施例中，該方法包含投與編碼抗原結合系統或抗體(例如抗原結合系統)之聚核苷酸。在另一實施例中，該方法包含投與包含編碼抗原結合系統或抗體之聚核苷酸的載體。在另一實施例中，該方法包含向個體投與抗原結合系統或抗體。
本發明之另一態樣係針對一種製造表現CAR或TCR之細胞之方法，其包含在適合條件下用本文所揭示之聚核苷酸轉導細胞。在一些實施例中，該方法包含用如本文所揭示之編碼CAR或TCR之聚核苷酸轉導細胞。在一些實施例中，該方法包含用包含編碼CAR或TCR之聚核苷酸之載體轉導細胞。在某些實施例中，本發明提供T細胞療法，其中結合劑醫藥組合物包含用載體轉染或轉導之T細胞，該載體包含編碼本發明之抗原結合劑(例如抗原結合系統)的聚核苷酸序列。在一些實施例中，用於T細胞療法中之供者T細胞獲自患者(例如對於自體T細胞療法)。在其他實施例中，用於T細胞療法中之供者T細胞獲自並非患者之個體。在一個實施例中，本發明之T細胞療法為自體細胞療法(eACTTM )。根據此實施例，該方法可包含自患者收集血細胞。經分離血細胞(例如T細胞)可隨後經工程改造以表現本發明之抗原結合系統。在某些實施例中，向患者投與結合劑。在一些實施例中，結合劑治療或意欲治療或患者之癌症。舉例而言，在一個實施例中，結合劑減小腫瘤尺寸。在各種實施例中，本發明之細胞可為自人類個體新鮮分離之細胞、自細胞培養物新鮮分離之細胞或已儲存(例如冷凍)之細胞。
本發明之另一態樣係針對一種誘導針對腫瘤之免疫性之方法，其包含向個體投與有效量之包含本文所述之聚核苷酸、本文所述之載體或本文所述之CAR或TCR的細胞。在一個實施例中，該方法包含向個體投與有效量之包含編碼本文所揭示之CAR或TCR之聚核苷酸的細胞。在另一實施例中，該方法包含向個體投與有效量之包含有包含編碼本文所揭示之CAR或TCR之聚核苷酸的載體之細胞。在另一實施例中，該方法包含向個體投與有效量之包含由本文所揭示之聚核苷酸編碼之CAR或TCR之細胞。
本發明之另一態樣係針對一種在個體中誘導免疫反應之方法，其包含投與有效量之本申請案之經工程改造之免疫細胞。在一些實施例中，免疫反應為T細胞介導之免疫反應。在一些實施例中，T細胞介導之免疫反應係針對一或多種目標細胞。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞包含CAR或TCR，其中CAR或TCR包含本發明中所述之THD。在一些實施例中，目標細胞為腫瘤細胞。
本發明之另一態樣係針對一種用於治療或預防惡性病之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之至少一種免疫細胞，其中免疫細胞包含至少一種CAR或TCR，且其中CAR或TCR包含本文所揭示之scfv中之一或兩者。
本發明之另一態樣係針對一種治療有需要個體之癌症的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之聚核苷酸、載體、CAR或TCR、細胞或組合物。在一個實施例中，該方法包含投與編碼CAR或TCR之聚核苷酸。在另一實施例中，該方法包含投與包含編碼CAR或TCR之聚核苷酸的載體。在另一實施例中，該方法包含投與由本文所揭示之由聚核苷酸編碼之CAR或TCR。在另一實施例中，該方法包含投與包含聚核苷酸之細胞，或包含聚核苷酸之載體，該聚核苷酸編碼CAR或TCR。
在一些實施例中，治療有需要之個體之癌症的方法包含T細胞療法。在一個實施例中，本發明之T細胞療法為經工程改造之自體細胞療法(eACT™)。根據此實施例，該方法可包括自患者收集血細胞。經分離之血細胞(例如T細胞)可隨後經工程改造以表現本發明之CAR或TCR。在一特定實施例中，向患者投與CAR T細胞或TCR T細胞。在一些實施例中，CAR T細胞或TCR T細胞治療患者之腫瘤或癌症。在一個實施例中，CAR T細胞或TCR T細胞減小腫瘤之尺寸或減輕癌症。
在一些實施例中，用於T細胞療法中之供者T細胞獲自患者(例如對於自體T細胞療法)。在其他實施例中，用於T細胞療法中之供者T細胞獲自並非患者之個體。
T細胞可以治療有效量投與。舉例而言，T細胞之治療有效量可為至少約104 個細胞、至少約105 個細胞、至少約106 個細胞、至少約107 個細胞、至少約108 個細胞、至少約109 個細胞或至少約1010 個細胞。在另一實施例中，T細胞之治療有效量為約104 個細胞、約105 個細胞、約106 個細胞、約107 個細胞或約108 個細胞。在一個特定實施例中，CAR T細胞或TCR T細胞之治療有效量為約2×106 個細胞/公斤、約3×106 個細胞/公斤、約4×106 個細胞/公斤、約5×106 個細胞/公斤、約6×106 個細胞/公斤、約7×106 個細胞/公斤、約8×106 個細胞/公斤、約9×106 個細胞/公斤、約1×107 個細胞/公斤、約2×107 個細胞/公斤、約3×107 個細胞/公斤、約4×107 個細胞/公斤、約5×107 個細胞/公斤、約6×107 個細胞/公斤、約7×107 個細胞/公斤、約8×107 個細胞/公斤、約9×107 個細胞/公斤。
本發明之方法可用於治療個體之癌症、減小腫瘤尺寸、殺滅腫瘤細胞、預防腫瘤細胞增殖、預防腫瘤生長、自患者消除腫瘤、預防腫瘤復發、預防腫瘤癌轉移、誘導患者之緩解或其任何組合。在某些實施例中，該等方法誘導完全響應。在其他實施例中，該等方法誘發部分反應。
在某些實施例中，癌症包含例如在細胞表面上表現CD19之細胞。在某些實施例中，癌症包含在例如細胞表面上表現CD20之細胞。在某些實施例中，癌症包含例如在細胞表面上各自單獨地表現CD19及CD20兩者之細胞。
可治療之癌症包括並未血管化、尚未實質上血管化或血管化之腫瘤。癌症亦可包括實體或非實體腫瘤。在一些實施例中，癌症為血液癌。在一些實施例中，癌症具有白血細胞。在其他實施例中，癌症具有漿細胞。在一些實施例中，癌症為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些實施例中，癌症為急性淋巴母細胞白血病(ALL) (包括非T細胞ALL)、急性淋巴性白血病(ALL)、及噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH)、B細胞前淋巴細胞性白血病、B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性或急性肉芽腫性疾病、慢性或急性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、毛細胞白血病、噬血細胞性症候群、巨噬細胞活化症候群(MAS)、霍奇金氏病、大細胞肉芽腫、白血球黏著缺乏症、惡性淋巴增生病、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤邊緣區淋巴瘤、意義不明單株伽瑪球蛋白症(MGUS)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群(MDS)、包括但不限於急性骨髓性白血病(AML)之骨髓疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、漿細胞增生性病症(例如，無症狀骨髓瘤(悶燃型多發性骨髓瘤或頑固性骨髓瘤)、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、漿細胞瘤(例如，漿細胞惡病質；孤立性骨髓瘤；孤立性漿細胞瘤；髓外漿細胞瘤；及多發性漿細胞瘤)、POEMS症候群(克羅-富克斯症候群；高槻病；PEP症候群)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、小細胞濾泡性淋巴瘤或大細胞濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、全身性澱粉樣輕鏈澱粉樣變性病、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、T細胞淋巴瘤、轉化型濾泡性淋巴瘤、華氏巨球蛋白血症或其組合。在一個實施例中，癌症為骨髓瘤。在一個特定實施例中，該癌症為多發性骨髓瘤。在一個實施例中，該癌症為白血病。在一個實施例中，該癌症為急性骨髓性白血病。
在各種情況下，使用本文所提供之結合劑醫藥組合物治療癌症之方法為自體細胞療法。在各種情況下，使用本文所提供之結合劑醫藥組合物治療癌症之方法為同種異體細胞療法。
使用本文所提供之結合劑醫藥組合物的某些方法包含自個體收集血細胞。經分離之個體血細胞(例如T細胞)可隨後經工程改造以表現例如本發明之抗原結合系統。在一些實施例中，向個體投與結合劑。在一些實施例中，結合劑治療個體之癌症。在一個實施例中，結合劑減小腫瘤尺寸。
在各種實施例中，本文所提供之適用於本發明之細胞療法可在治療過程中投與個體，該治療過程進一步包含投與一或多種額外治療劑或不為本文所提供之細胞療法的療法。在某些實施例中，本發明提供用於治療癌症之組合療法，該治療包含向接受及/或需要本文所提供之結合劑之個體投與抗癌劑。
在某些實施例中，本文提供之結合劑之投與可向先前已接受、安排接受或在包含額外抗癌療法之治療方案過程中的個體投與。在各種實施例中，與如本文所描述之本文所提供之結合劑組合投與之額外藥劑或療法可與本文所提供之結合劑同時、與本文所提供之結合劑在同一天或與本文所提供之結合劑在同一週投與。在各種實施例中，可投與如本文所描述之與本文所提供之結合劑組合投與之額外藥劑或療法，使得本文所提供之結合劑與額外藥劑或療法之投與在投與本文所提供之結合劑之前或之後一或多個小時、之前或之後一或多天、之前或之後一或多個星期、或之前或之後一或多個月間隔開。在各種實施例中，一或多種額外藥劑之投與頻率可與本文所提供之結合劑之投與頻率相同、類似或不同。
與本文所提供之結合劑組合使用的藥劑或療法可以單一治療性組合物或劑量與本文所提供之結合劑一起投與，同時作為本文所提供之結合劑以各別組合物形式或以在時間上不同於本文所提供之結合劑之投與的方式投與。當本文所提供之結合劑與額外藥劑組合使用時，本文所提供之結合劑可與額外藥劑一起共調配，或本文所提供之結合劑可與額外藥劑調配物分開調配。
在一些實施例中，方法進一步包含投與化學治療劑。在某些實施例中，所選化學治療劑為淋巴細胞耗乏(預適應)化學治療劑。有利預處理治療方案連同相關的有利生物標記描述於美國臨時專利申請案62/262,143及62/167,750中，其特此以引用之方式併入本文中。此等描述例如調理需要T細胞療法之患者之方法，其包含向該患者投與環磷醯胺之指定有利劑量(在200毫克/平方公尺/天與2000毫克/平方公尺/天之間)及氟達拉賓(fludarabine)之指定劑量(在20毫克/平方公尺/天與900毫克/平方公尺/天之間)。一個此類給藥方案涉及治療患者，包含在向患者投與治療有效量之經工程改造T細胞之前，每天向患者投與約500毫克/平方公尺/天之環磷醯胺及約60毫克/平方公尺/天之氟達拉賓，持續三天。在其他實施例中，投與各有效治療個體中之疾病或病狀之量的抗原結合分子、經轉導之(或以其他方式工程改造之)細胞(諸如CAR或TCR)及化學治療劑。
在某些實施例中，本文所揭示之包含表現CAR及/或TCR之免疫效應細胞的組合物可與多種化學治療劑一起投與。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN™)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺恢復；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、氧氮芥鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺藥，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲(hydroxyurea)；磨菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；PSK® ；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside，「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷類(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(TAXOLTM ，Bristol-Myers Squibb)及多西他賽(doxetaxel) (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C(mitomycin C)；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞賓(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷；道諾黴素；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylomithine，DMFO)；視黃酸衍生物，諸如Targretin™ (貝瑟羅汀)、Panretin™ (阿利維甲酸(alitretinoin))；ONTAK™ (迪夫托斯地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯波黴素(esperamicin)；卡培他濱；及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，本文所揭示之包含表現CAR及/或TCR之免疫效應細胞組合物可結合用以調節或抑制腫瘤上之激素作用之抗激素劑投與，該抗激素劑為諸如抗雌激素劑，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(法樂通(Fareston))；及抗雄激素劑，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。適當時亦投與化學治療劑之組合，包括但不限於CHOP，亦即環磷醯胺(Cytoxan®)、小紅莓(Doxorubicin) (羥基小紅莓)、長春新鹼(Vincristine) (Oncovin®)及潑尼松(Prednisone)。
在一些實施例中，化學治療劑在投與經工程改造之細胞或核酸的同時或之後一週內投與。在其他實施例中，在投與經工程改造之細胞或核酸之後1至4週或1週至1個月、1週至2個月、1週至3個月、1週至6個月、1週至9個月或1週至12個月投與化學治療劑。在一些實施例中，化學治療劑在投與細胞或核酸之前至少1個月投與。在一些實施例中，方法進一步包含投與兩種或更多種化學治療劑。
各種額外治療劑可與本文所描述之組合物一起使用。舉例而言，潛在適用的額外治療劑包括PD-1抑制劑，諸如納武單抗(OPDIVO®)、帕博利珠單抗(KEYTRUDA®)、帕博利珠單抗、皮立珠單抗(pidilizumab) (CureTech)及阿特珠單抗(Roche)。適用於與本發明組合之額外治療劑包括但不限於依魯替尼(ibrutinib，Imbruvica®)、奧伐木單抗(ofatumumab，Arzerra®)、利妥昔單抗(rituximab，Rituxan®)、貝伐單抗(bevacizumab，Avastin®)、曲妥珠單抗(trastuzumab，Herceptin®)、曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine，KADCYLA®)、伊馬替尼(imatinib，Gleevec®)、西妥昔單抗(cetuximab，Erbitux®)、帕尼單抗(panitumumab，Vectibix®)、卡托莫西單抗(catumaxomab)、異貝莫單抗(ibritumomab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、托西莫單抗(tositumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、來那替尼(neratinib)、阿西替尼(axitinib)、馬賽替尼(masitinib)、帕佐泮尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、妥賽蘭尼(toceranib)、來他替尼(lestaurtinib)、阿西替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、樂伐替尼(lenvatinib)、尼達尼布(nintedanib)、帕佐泮尼(pazopanib)、瑞戈非尼(regorafenib)、司馬沙尼(semaxanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替沃紮尼(tivozanib)、妥賽蘭尼(toceranib)、凡德他尼(vandetanib)、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊馬替尼(imatinib)、達沙替尼(dasatinib)、尼羅替尼(nilotinib)、普納替尼(ponatinib)、拉多替尼(radotinib)、伯舒替尼(bosutinib)、來他替尼(lestaurtinib)、盧佐替尼(ruxolitinib)、帕瑞替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、畢尼替尼(binimetinib)、艾樂替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克卓替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、脂肪肽(adipotide)、地尼白介素迪夫托斯(denileukin diftitox)、mTOR抑制劑(諸如依維莫司(Everolimus)及坦羅莫司(Temsirolimus))、豪豬抑制劑(諸如索尼蒂吉伯(sonidegib)及維莫德吉(vismodegib))、CDK抑制劑(諸如CDK抑制劑(帕泊昔布(帕泊昔布)))。
在其他實施例中，投與包含含有CAR及/或TCR之免疫的組合物與消炎劑。消炎劑或藥物可包括但不限於類固醇及糖皮質激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氫化可體松(hydrocortisone acetate)、氫化可體松、氫化可體松、甲基潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、曲安西龍(triamcinolone))；非類固醇消炎藥(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲胺喋呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺及黴酚酸酯(mycophenolate)。例示性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑及唾液酸化物(sialylate)。例示性鎮痛劑包括乙醯胺苯酚、羥考酮(oxycodone)、鹽酸丙氧芬(proporxyphene hydrochloride)之曲馬多(tramadol)。例示性糖皮質激素包括可體松(cortisone)、地塞米松、氫化可體松、甲基潑尼龍、潑尼龍或潑尼松。例示性生物反應修飾劑包括針對細胞表面標記物之分子(例如CD4、CD5等)、細胞介素抑制劑，諸如TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept，ENBREL® )、阿達木單抗(adalimumab，HUMIRA® )及英利昔單抗(infliximab，REMICADE® )、趨化介素抑制劑及黏附分子抑制劑。生物反應修飾劑包括單株抗體以及分子之重組形式。例示性DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環孢靈、甲胺喋呤、青黴胺(penicillamine)、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥基氯奎(hydroxychloroquine)、金製劑(經口(金諾芬(auranofin))及肌肉內)及二甲胺四環素(minocycline)。
在某些實施例中，本文中所述之組合物與細胞介素結合投與。「細胞介素」意指由一種細胞群體釋放的作為細胞間介體作用於另一細胞之蛋白質。細胞介素之實例為淋巴介質、單核球激素及傳統多肽激素。細胞介素中包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛類生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如濾泡刺激激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體激素(LH)；肝生長因子(HGF)；纖維母細胞生長因子(FGF)；促乳素；胎盤催乳激素；苗勒氏管抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子(NGF)，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II；紅血球生成素(EPO)；骨性誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF (M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF (GM-CSF)；及粒細胞-CSF (G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體(KL)。如本文所用，術語細胞介素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及天然序列細胞介素之生物活性等效物。在各種實施例中，本文所提供之用於本發明之結合劑可在進一步包含投與消炎劑之治療過程中投與個體。消炎劑可包含但不限於類固醇及糖皮質激素(包含倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氫皮質酮(hydrocortisone acetate)、氫皮質酮、氫皮質酮、甲基潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、曲安西龍(triamcinolone))；非類固醇消炎藥(NSAIDS)，包含阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲胺喋呤(methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺(cyclophosphamide)及黴酚酸酯(mycophenolate)。例示性NSAID包含布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑及唾液酸化物。例示性鎮痛劑包含乙醯胺苯酚、羥考酮(oxycodone)、鹽酸丙氧芬(proporxyphene hydrochloride)之曲馬多(tramadol)。例示性糖皮質激素包含可的松(cortisone)、地塞米松、氫皮質酮、甲基潑尼龍、潑尼龍或潑尼松。例示性生物反應修飾劑包含針對細胞表面標記物之分子(例如CD4、CD5等)、細胞介素抑制劑，諸如TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept，ENBREL® )、阿達木單抗(adalimumab，HUMIRA® )及英利昔單抗(infliximab，REMICADE® )、趨化介素抑制劑及黏附分子抑制劑。生物反應修飾劑包含單株抗體以及分子之重組形式。例示性DMARD包含硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環孢靈、甲胺喋呤、青黴胺(penicillamine)、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥基氯奎(hydroxychloroquine)、金製劑(經口(金諾芬(auranofin))及肌肉內)及二甲胺四環素(minocycline)。
在各種實施例中，本文所提供之用於本發明之結合劑可在進一步包含投與CHOP之治療過程中投與個體。CHOP由以下組成：(C)環磷醯胺，一種藉由與其結合及使得形成交聯而損害DNA之烷基化劑；(H)羥基小紅莓(亦稱為小紅莓或阿德力黴素(adriamycin))，一種藉由將其插入DNA鹼基之間而損害DNA之嵌入劑；(O)ncovin(長春新鹼)，其藉由結合至微管蛋白而防止細胞複製；及(P)潑尼松或(P)潑尼龍，其為皮質類固醇。 其他例示性實施例。本發明包含但不限於以下例示性實施例： 實施例1.      一種編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之經分離聚核苷酸，其包含(i)抗原結合分子、(ii)協同刺激域及(iii)活化域，其中該協同刺激域包含細胞外域、跨膜域及細胞內域，其中該細胞外域包含基本上由以下組成或由以下組成之抗原結合分子：(i)與SEQ ID NO:232、221、56、45、155、144、177、78及67中所述之構築體中之任一者之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列。 實施例2.      如實施例1之聚核苷酸，其中跨膜域為4-1BB/CD137、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或T細胞受體之ζ鏈或其任何組合之跨膜域。 實施例3.   如實施例1或2之聚核苷酸，其中細胞內域包含4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CDl la、CDl lb、CDl lc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、免疫球蛋白類蛋白質、誘導性T細胞協同刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、特異性結合CD83之配位體、LIGHT、LIGHT (腫瘤壞死因子總科成員14；TNFSF14)、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1 (CDl la/CD18)、MHC I類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其組合之信號傳導區。 實施例4.   如實施例1至3之聚核苷酸，其中至少一個抗原結合分子特異性結合選自由以下組成之群的抗原：5T4、α胎蛋白、B細胞成熟抗原(BCMA)、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD56、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、IgM、C型凝集素類分子1(CLL-1)、EGFRvIII、上皮腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2組合、HER2-HER3組合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1套膜醣蛋白gp41、HIV-1套膜醣蛋白gpl20、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、黑素瘤相關抗原、間皮素、MUC-1、突變的p53、突變的ras、前列腺特異性抗原、ROR1、VEGFR2或其組合。 實施例5.   如實施例1至4中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含SEQ ID NO 232、221、56、45、155、144、177、78及67中所闡述之胺基酸序列的多肽。 實施例6.   一種多肽，其由如實施例1至5中任一項之聚核苷酸編碼。 實施例7.   一種多肽，其包含如SEQ ID NO 232、221、56、45、155、144、177、78及67中所列之胺基酸序列。 實施例8.   一種載體，其包含如實施例1至5中任一項之聚核苷酸。 實施例9.   如實施例7之載體，其中該載體為腺病毒載體、腺病毒相關之載體、DNA載體、豆狀病毒載體、質體、反轉錄病毒載體或RNA載體或其任何組合。 實施例10. 一種細胞，其包含如實施例1至5中任一項之聚核苷酸、如技術方案6或7之多肽、如技術方案8或9之載體或其任何組合。 實施例11. 一種組合物，其包含如實施例1至5中任一項之聚核苷酸、如技術方案6或7之多肽、如技術方案8或9之載體、如技術方案10之細胞或其任何組合。 實施例12. 一種製造細胞之方法，該細胞包含如技術方案1至5中任一項之聚核苷酸、如實施例6或7之多肽、如技術方案8或9之載體或其任何組合。 實施例13. 一種誘導針對腫瘤之免疫性的方法，其包含向個體投與有效量之如技術方案1至5中任一項之聚核苷酸、如實施例6或7之多肽、如實施例8或9之載體、如實施例10之細胞、如實施例11之組合物或其任何組合。 實施例14. 一種如實施例1至5中任一項之聚核苷酸、如實施例6或7之多肽、如實施例8或9之載體、如實施例11之細胞或如實施例12之組合物的用途，其係用於製造用以治療有需要之個體之癌症的藥劑。 實施例15. 如實施例15之用途，其中該癌症為急性淋巴母細胞白血病(ALL) (包括非T細胞ALL)、急性骨髓性白血病、B細胞前淋巴細胞性白血病、B細胞急性淋巴白血病(「BALL」)、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓白血病、慢性或急性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、毛細胞白血病、霍奇金氏病、惡性淋巴增生病況、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、顯著性未確定之單株γ球蛋白症(MGUS)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、漿細胞增生性病症(包括無症狀骨髓瘤(悶燃型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、漿細胞瘤(包括漿細胞惡病質；孤立性骨髓瘤；孤立性漿細胞瘤；髓外漿細胞瘤；及多發性漿細胞瘤)、POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群(Crow-Fukase syndrome)；高槻病(Takatsuki disease)；及PEP症候群)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、全身性澱粉樣輕鏈澱粉樣變性、T細胞急性淋巴白血病(「TALL」)、T細胞淋巴瘤、轉化型濾泡性淋巴瘤或華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)或其組合。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各單獨的公開案、專利或專利申請案經特定及單獨地表明以引用的方式併入一般。然而，本文中參考文獻之引用不應視為承認此類參考文獻為本發明之先前技術。若以引用的方式併入之參考文獻中提供之定義或術語中之任一者與本文提供之術語及論述有一定程度不同，則以本發明術語及定義為準。在整個本申請案中所引用之所有參考文獻之內容以引用的方式明確併入本文中。 實例 實例1
本實例提供例示性產生之抗CD20重鏈可變域及輕鏈可變域以及其組合。例示性抗CD20重鏈可變域及抗CD20輕鏈可變域之CDR序列，及由此之HCDR及LCDR之例示性組合亦提供於以下表4-13中。表4-13包含編碼例示性可變域之例示性核酸序列(且因此亦提供編碼例示性可變域之經鑑別CDR之例示性核酸序列)。 為測定本發明之例示性重鏈可變域及輕鏈可變域之細胞結合，藉由流動式細胞測量術表徵以10 nM之濃度的經純化之IgG之細胞結合。將抗體與過度表現CD20之CHO-S細胞、Raji及Namalwa CD20+細胞株一起培育；且與EoL-1及CHO-S CD20細胞株一起培育。使用FITC-LC檢測IgG。計算各抗體之結合與陰性對照之比率。所選抗CD20抗體之例示性細胞結合提供於表15中。 表15
Ab CHO-CD20細胞結合FOB(背景之倍數) Raji細胞結合FON(陰性之倍數) Namalwa細胞結合FON(陰性之倍數) EOL-1細胞結合FON(陰性之倍數)
Ab1 813 266 12 1
Ab2 2790 101 3 1
Ab3 2002 316 16 1
Ab4 3617 479 19 1
Ab5 2480 185 17 1
Ab6 2525 13 2 1
Ab7 4083 549 11 1
Ab8 3831 562 10 1
Ab9 3618 562 11 1
Ab10 3159 186 4 1
實例2
本實例提供雙順反子及雙特異性CAR。雙順反子及雙特異性CAR包含兩個結合模體(分別在兩個CAR分子中或在單個CAR分子上)。第一結合模體結合CD20且第二結合模體結合CD19。結合CD19及/或適用於構築結合CD19之結合模體、抗體及抗原結合系統的抗體序列為已知的。本實例使用本文中稱為抗體Ab11之抗CD19結合劑之抗體序列，其闡述於表14中。
產生本實例之雙特異性CAR以包含以下域：第一結合模體、第二結合模體、鉸鏈、跨膜域及包含協同刺激域及活化域之細胞內域。在本實例中，各雙特異性CAR包含：第一結合模體，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域及該輕鏈可變域為來自實例1之一組單一例示性抗體序列的重鏈可變域及輕鏈可變域(亦即，兩者均來自表4-13之同一表，與Ab1-Ab10相對應)。因此，結合模體可藉由參考源抗體或來源表來鑑別，且係指具有如對應表中所陳述的該源抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域之結合模體。在本實例中，各雙特異性CAR包含第二結合模體，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域及該輕鏈可變域為抗體Ab11之重鏈可變域及輕鏈可變域(亦即SEQ ID NO:221及232)。本實例之雙特異性CAR包含28T(CD28)域，其包含鉸鏈域及跨膜域。本實例之雙特異性CAR包含CD28協同刺激域。本實例之雙特異性CAR包含CD3z活化域。
本實例包含四種雙順反子CAR，鑑別為Bic-2、Bic-8、Bic-9及Bic-14。四種雙順反子CAR中之每一者包含：第一CAR構築體，其包含抗CD20結合模體，該結合模體包含如以下表16中所闡述之實例1之重鏈可變域及輕鏈可變域對；及第二CAR構築體，其包含抗CD19結合模體。 表16：雙順反子CAR之抗CD20結合模體序列
CAR 結合模體 VH SEQ ID VL SEQ ID
雙特異性-2 Ab3 45 56
雙特異性-8 Ab8 155 166
雙特異性-9 Ab9 177 188
雙特異性-14 Ab4 67 78
實例3
藉由自來自健康供體之血球分離術材料進行陽性選擇，分離出CD4+ 及CD8+ T細胞，且將其用於產生抗CD20單價或抗CD20/抗CD19雙順反子CAR T細胞產物。T細胞用結合型抗CD3及可溶性CD28抗體活化且用編碼CAR構築體之慢病毒載體轉導。作為對照，未經轉導之(NTD) T細胞自相同供體T細胞平行產生。在收穫日(製造之第8-10天)，對CAR T細胞產物進行染色且藉由流式細胞術分析以評估轉導效率且用於共培養物分析中。監測具有編碼單價CAR之載體及編碼雙順反子CAR之載體的T細胞之轉導效率。
為測定編碼單價CAR之載體之T細胞轉導效率，在可固定活力染料存在下用一組抗體(抗CD3、抗CD4、抗CD8及抗連接子抗體)染色CAR-T產物，且藉由流動式細胞測量術分析，以評估活的CAR陽性細胞之百分比(參見WO/US2017/041534，其關於抗連接子抗體以引用之方式併入本文中)。抗連接子抗體為結合抗CD20 CAR之結合模體之重鏈與輕鏈之間的連接子之抗體且用於量測轉導效率。對照包含未轉導細胞(NTD)、經包含對照抗CD19結合劑之逆轉錄病毒轉導的細胞，及經對照抗CD20結合劑轉導的細胞(Ab12結合模體)。
為測定編碼雙順反子CAR之載體的T細胞轉導效率，在可固定活力染料存在下用一組抗體(包含抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗個體基因型及抗連接子抗體)染色CAR-T產物，且藉由流式細胞測量術分析，以評估活的CAR陽性細胞之百分比。抗個體基因型抗體結合Ab11抗CD19結合模體之結合模體。因此，抗個體基因型抗體結合抗CD19 CAR。其用於量測抗CD19 CAR之轉導效率。抗連接子抗體用於量測抗CD20 CAR之轉導效率。對照包含未轉導細胞(NTD)、經包含對照抗CD19結合劑之逆轉錄病毒轉導的細胞，及經對照抗CD20/抗CD19雙特異性CAR轉導之細胞(Ab13/Ab14雙特異性、Ab11/Ab12雙特異性)。 表17A：抗CD20單價CAR之轉導效率
結合模體# 轉導效率(CD20 CAR+%)
Ab3 65.6
Ab5 60.9
Ab6 70.7
Ab10 51.1
Ab7 52.8
Ab8 40.6
Ab9 33
Ab1 44.4
Ab4 62.6
Ab2 35.8
NTD 0.25
Ab11 47.8
Ab12 60.7
表17B：抗CD20/抗CD19雙順反子CAR之轉導效率
      轉導效率(%)
雙特異性結合模體# 抗CD20結合模體 % CD19 CAR+ % CD20 CAR+
雙特異性-2 Ab3 52.72 46.42
雙特異性-8 Ab8 50.2 45.57
雙特異性-9 Ab9 44.72 41.36
雙特異性-14 Ab4 40.28 37.04
NTD N/A 0.56 0.09
Ab11 N/A 59.52 69.3
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 56.77 60.99
Ab11/Ab12雙特異性 N/A 47.54 49.33
實例4
本實例尤其提供將CAR-T細胞與表現CAR-T靶抗原之細胞共同培養的例示性方法。為了促進追蹤培養物中之T細胞，根據製造商之說明書用CellTrace™紫色(CTV)試劑標記CAR-T細胞且隨後用R-10%培養基洗滌。為促進追蹤表現CAR-T靶抗原之細胞(「靶細胞」)，靶細胞經工程改造以表現螢光素酶。螢光素酶表現靶細胞包含Nalm6及Raji，兩者均表現CD19及CD20抗原。另外，製備不表現CD19或CD20之Nalm6及Raji細胞(基因剔除細胞或KO)。此等CD19KO及CD20KO細胞選自Nalm6及Raji親本細胞且分別表現CD20而非CD19或CD19而非CD20。產生CD19KO及CD20KO病毒株且用作在功能上評估表現雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR之細胞之各CAR之抗原結合的對照。
表現螢光素酶之靶細胞與CTV標記之CAR-T細胞一起以各種比率接種於R-10%培養基中(共培養第0天)。該比率可稱為效應子(CART)細胞與靶細胞(效應子:目標或E:T)之比率。向培養所需比率之細胞中，將CART細胞連續稀釋2至3倍，而每孔靶細胞之數目保持恆定為25,000個細胞。在37℃下培育共培養物16小時(h)或4天且如下文所述進行功能評估。 實例5
在此實例中，T細胞與靶細胞一起共培養，如實例4中所描述。相比於由單獨電鍍之靶細胞發射之信號，量測T細胞介導之細胞毒性隨共培養孔中之目標螢光素酶信號之降低而變化。在共培養起始之後第4天，將最終濃度為0.14 mg/mL之D-螢光素受質添加至共培養孔中，且將板在37℃下在暗處培育10分鐘。緊接在VarioSkan™ LUX或VarioSkan® Flash多模式微板讀取器中之後讀取發光信號。T細胞介導之細胞毒性如下計算：細胞毒性% = [1-(所關注之樣品/單獨目標對照物)之螢光素酶信號] *100。
對照包含未轉導之(NTD) T細胞(亦即不表現CAR之T細胞)作為陰性對照，經包含對照抗CD19結合劑之反轉錄病毒轉導之細胞、經對照抗CD20結合劑轉導之細胞、經對照抗CD20/抗CD19雙特異性CAR轉導之細胞(Ab13/Ab14雙特異性、Ab15/Ab16雙特異性)。 表18：在4天之後的共培養中之抗CD20 CAR-T之細胞毒性百分比(Nalm6野生型細胞)
      在各種E:T比率下之Nalm6 WT細胞
結合模體# Ab # 3比1 1比1 1比3
2 Ab3 92 91 92 72 73 77 64 62 53
3 Ab5 97 96 97 65 74 77 68 67 60
5 Ab6 12 21 23 -11 -10 -13 -12 -20 -22
6 Ab10 37 46 55 11 4 6 -4 -8 -8
7 Ab7 98 98 98 89 91 90 79 76 75
8 Ab8 99 99 99 86 91 93 89 86 90
9 Ab9 70 68 66 71 72 72 91 90 92
10 Ab1 23 23 27 7 4 5 -8 -6 -17
14 Ab4 100 100 100 52 70 68 65 70 70
16 Ab2 22 20 27 -13 -7 -13 -20 -23 -30
NTD N/A 17 20 24 -7 0 4 -4 -2 -18
Ab11 N/A 100 100 100 93 95 96 96 94 96
Ab12 N/A 100 100 100 82 90 88 83 86 83
結合模體# Ab # 1比9 1比27         
2 Ab3 19 21 20 13 4 2         
3 Ab5 21 18 22 21 12 7         
5 Ab6 -8 -12 -3 -9 -21 -21         
6 Ab10 -7 -8 -1 -2 -15 -18         
7 Ab7 32 34 40 28 24 21         
8 Ab8 66 63 59 63 58 59         
9 Ab9 88 84 78 99 100 99         
10 Ab1 -16 -9 3 -8 3 -9         
14 Ab4 36 37 40 65 64 59         
16 Ab2 -9 -8 0 -18 -4 -9         
NTD N/A 0 -2 1 -4 1 -3         
Ab11 N/A 73 65 68 84 79 76         
Ab12 N/A 45 43 41 58 62 56         
表19：在4天之後的共培養中之抗CD20 CAR-T之細胞毒性百分比(Raji野生型細胞)
      在各種E:T比率下之Raji WT細胞
結合模體# Ab # 3比1 1比1 1比3
2 Ab3 100 100 100 61 75 82 58 53 50
3 Ab5 100 100 100 61 55 59 55 60 57
5 Ab6 33 40 46 5 2 5 -7 -9 -8
6 Ab10 99 99 99 57 62 71 36 34 30
7 Ab7 100 100 100 65 70 78 55 44 43
8 Ab8 100 100 100 70 68 57 67 62 65
9 Ab9 100 100 100 63 60 63 73 72 61
10 Ab1 18 17 23 -15 -28 -25 -24 -12 -10
14 Ab4 100 100 100 17 -1 5 31 36 31
16 Ab2 60 63 69 2 -6 -6 -6 -2 -8
NTD N/A 29 24 27 -8 4 5 11 18 3
Ab11 N/A 100 100 100 47 42 43 61 64 58
Ab12 N/A 100 100 100 40 30 27 47 52 40
結合模體# Ab # 1比9 1比27         
2 Ab3 15 16 29 10 6 0         
3 Ab5 12 14 28 10 4 -6         
5 Ab6 2 2 8 -16 -15 -29         
6 Ab10 9 7 21 2 -3 -16         
7 Ab7 9 21 32 6 7 0         
8 Ab8 40 30 40 39 30 24         
9 Ab9 33 37 55 37 33 21         
10 Ab1 0 -1 7 -13 -10 1         
14 Ab4 6 19 28 24 35 26         
16 Ab2 15 13 12 11 7 2         
NTD N/A 9 16 13 0 12 7         
Ab11 N/A 10 18 29 40 40 31         
Ab12 N/A 12 22 29 25 26 15         
表20：在4天之後的共培養中之抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T之細胞毒性百分比(Nalm6野生型細胞)
      在各種E:T比率下之Nalm6 WT細胞
雙特異性結合模體# Ab # 3比1 1比1 1比3
雙特異性-2 Ab3 100.11 100.05 100.08 100.02 99.54 98.84
雙特異性-8 Ab8 100.2 100.18 100.19 100.13 100.06 99.54
雙特異性-9 Ab9 100.21 100.19 100.19 100.17 99.45 96.37
雙特異性-14 Ab4 100.21 100.18 100.17 100.13 99.86 99.69
NTD N/A 8.92 -12.24 -17.23 -29.28 -17.13 -30.68
Ab11 N/A 100.21 100.17 100.19 100.16 99.79 99.01
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 100.17 100.06 99.91 99.48 93.02 83.24
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 100.05 100.06 99.89 99.89 98.89 96.03
雙特異性結合模體# Ab # 1比9 1比27 1比81
雙特異性-2 Ab3 77.98 72.64 46.65 33.58 20.07 9.87
雙特異性-8 Ab8 97.6 87.64 67.03 51.79 28.36 12.92
雙特異性-9 Ab9 91.03 77.15 53.63 32.1 21.94 2.87
雙特異性-14 Ab4 99.5 99.49 84.68 76.42 48.83 38.37
NTD N/A -10.7 -19.68 -3.76 -11.49 0.02 -8.9
Ab11 N/A 89.83 87.75 55.83 43.85 22.23 0.48
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 77.28 50.19 22.73 11.85 11.58 -2.9
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 66.63 40.98 25.75 10.27 5.66 -9.98
表21：在4天之後的共培養中之抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T之細胞毒性百分比(Raji野生型細胞)
      在各種E:T比率下之Raji WT細胞
雙特異性結合模體# Ab # 3比1 1比1 1比3
雙特異性-2 Ab3 99.96 100.01 88.29 85.71 53.5 42.14
雙特異性-8 Ab8 100.02 100.05 70.5 74.72 53.41 56.52
雙特異性-9 Ab9 100.06 100.06 77.3 64.45 27.42 43.62
雙特異性-14 Ab4 100.09 100.11 99.58 99.47 78.71 90.26
NTD N/A 14.29 7.61 -20.48
Ab11 N/A 100.1 100.11 96.49 98.25 71.1 70.95
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 99.96 100.07 96.49 97.86 33.42 34.31
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 99.6 99.08 85.33 89.26 29.88 32.49
雙特異性結合模體# Ab # 1比9 1比27 1比81
雙特異性-2 Ab3 24.84 34.73 -14.98 -2.59 -25.65 3.89
雙特異性-8 Ab8 20.34 8.78 -1.02 4.33 -0.83 7.66
雙特異性-9 Ab9 18.64 18.79 -6.64 1.03 -11.66 -5.01
雙特異性-14 Ab4 40.22 30.49 14.88 15.82 -0.97 4.59
NTD N/A -6.05 -4.56 -8.23
Ab11 N/A 23.88 14.55 11.65 5.89 -8.43 -0.33
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 10.08 30.72 12.69 10.41 -7.6 -7.03
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 5.83 9.17 -8.37 8.85 -18.35 -7.06
表22：在4天之後的共培養中之抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T之細胞毒性百分比(Nalm6 CD19KO細胞)
      在各種E:T比率下之Nalm6 CD19KO細胞
雙特異性結合模體# Ab # 3比1 1比1 1比3
雙特異性-2 Ab3 41.94 47.16 22.68 21.26 -16.73 -4.21
雙特異性-8 Ab8 43.75 40.8 16.79 1.89 -22.77 -11.37
雙特異性-9 Ab9 43.71 39.92 0.98 -4.54 -17.33 -20.52
雙特異性-14 Ab4 75.1 74.88 39.07 26.69 10.6 31.47
NTD N/A -16.73 -5.35 -31.94 -30.48 -23.75 -36.72
Ab11 N/A 31.93 36.32 -8.57 -7.77 -26.58 -23.61
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 81.71 85.04 72.06 51.9 39.52 38.16
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 67.95 73.67 47.26 54.21 20 32.61
雙特異性結合模體# Ab # 1比9 1比27 1比81
雙特異性-2 Ab3 -22.58 -8.65 -26.2 -22.17 -11.82 -18.02
雙特異性-8 Ab8 -28.81 -21.81 -34.06 -28.68 -29.45 -20.23
雙特異性-9 Ab9 -26.39 -22.98 -41.15 -32.2 -34.02 -29.96
雙特異性-14 Ab4 2.6 4.87 -12.92 -12.22 -26.69 -10.49
NTD N/A -27.18 -14.79 -15.71 -22.76 -15.37 -17.73
Ab11 N/A -30.02 -24.23 -37.34 -25.77 -28.09 -15.96
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 7.05 7.22 -16.35 -23.2 -25.86 -25.63
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 9.13 -6.85 -22.84 -15.85 -33.56 -18.83
表23：在4天之後的共培養中之抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T之細胞毒性百分比(Nalm6 CD20KO細胞)
      在各種E:T比率下之Nalm6 CD20KO細胞
雙特異性結合模體# Ab # 3比1 1比1 1比3
雙特異性-2 Ab3 100.01 100.06 100.02 100.05 97.34 97.11
雙特異性-8 Ab8 100.14 100.17 100 100.12 95.96 94.9
雙特異性-9 Ab9 100.15 100.19 100.13 100.13 84.99 81.09
雙特異性-14 Ab4 100.15 100.2 100.11 100.13 99.31 99.01
NTD N/A 13.47 20.49 -5.54 4.54 -11.02 -3.62
Ab11 N/A 100.14 100.15 100.11 100.16 89.94 90.48
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 100.13 100.12 99.25 99.19 72.92 79.13
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 100.01 100.06 99.54 99.63 90.53 87.4
雙特異性結合模體# Ab # 1比9 1比27 1比81
雙特異性-2 Ab3 75.37 74.98 30.97 14.79 3.49 19.71
雙特異性-8 Ab8 59.25 71.18 16.46 24.12 3.67 9.64
雙特異性-9 Ab9 43.28 48.23 11.87 13.08 -0.46 5.06
雙特異性-14 Ab4 96.4 96.13 58.68 58.6 17.97 20.79
NTD N/A -6.55 2.96 -3.3 2.3 8.61 11
Ab11 N/A 82.02 74.55 12.37 7.52 -8.48 -1.93
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 38.53 30.15 -5.74 1.34 -18.63 -18.22
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 34.92 32.63 0.2 9.2 -5.64 1.78
表24：在4天之後的共培養中之抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T之細胞毒性百分比(Raji CD19KO細胞)
      在各種E:T比率下之Raji CD19KO細胞
雙特異性結合模體# Ab # 3比1 1比1 1比3
雙特異性-2 Ab3 100.02 100.1 91.85 89.69 55.92 52.39
雙特異性-8 Ab8 100.14 100.16 68.63 67.49 57.76 55.82
雙特異性-9 Ab9 100.09 100.16 91.11 83.72 33.32 45.71
雙特異性-14 Ab4 100.03 100.05 97.97 97.47 64.86 69.55
NTD N/A   40.71   15.06   3.97
Ab11 N/A 33.35 27.24 12.88 16.32 -8.36 3.73
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 100.03 100.01 76.44 82.17 56.77 55.08
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 99.84 99.92 92.45 90.15 42.9 52.01
雙特異性結合模體# Ab # 1比9 1比27 1比81
雙特異性-2 Ab3 24.24 44.1 -3.13 21.88 -7.78 15.73
雙特異性-8 Ab8 30.49 32.83 23.56 33.43 6.7 19.54
雙特異性-9 Ab9 20.8 32.03 12.07 17.72 -4.15 14.19
雙特異性-14 Ab4 47.46 54.56 33.42 36.33 9.45 22.34
NTD N/A   6.28   -1.56   -2.01
Ab11 N/A -15.98 0.93 -6.53 -6.94 -3.47 -2.64
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 26.72 35.95 11.49 25.38 20.53 19.5
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 33.11 35.35 12.34 22.23 -0.75 5.69
表25：在4天之後的共培養中之抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T之細胞毒性百分比(Raji CD20KO細胞)
      在各種E:T比率下之Raji CD20KO細胞
雙特異性結合模體# Ab # 3比1 1比1 1比3
雙特異性-2 Ab3 100.04 100.1 95 90.48 67.63 74.09
雙特異性-8 Ab8 100.15 100.18 84.19 84.25 81.09 80.16
雙特異性-9 Ab9 100.19 100.18 97.38 93.04 63.87 58.26
雙特異性-14 Ab4 100.18 100.19 98.61 97.05 85.53 82.29
NTD N/A   56.92   28.9   16.55
Ab11 N/A 100.19 100.16 99.93 99.39 81.15 76.78
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 99.24 99.36 86.31 86.76 77.15 75.46
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 99.16 99.74 87.16 79.93 67.07 67.48
雙特異性結合模體# Ab # 1比9 1比27 1比81
雙特異性-2 Ab3 60.58 60.16 31.83 46.37 0.15 39.97
雙特異性-8 Ab8 65.44 64.02 48.52 51.56 23.53 35.21
雙特異性-9 Ab9 49.76 54.83 25.93 30.53 20.54 23.32
雙特異性-14 Ab4 73.45 74 55.92 57.01 31.8 36.38
NTD N/A   8.06   -2.8   -5.43
Ab11 N/A 60.19 62.53 47.63 39.67 10.91 15.16
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 58.77 52.6 32.16 39.92 15.56 20.28
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 49.49 54.48 18.17 19.02 -3.47 -3.58
實例6
在此實例中，T細胞與靶細胞一起共培養，如實例4中所描述。在共培養16小時之後，收集上清液且根據製造商之說明書使用Meso Scale Discovery V-PLEX促炎性面板1人套組分析細胞介素含量。分析以1:1之E:T比率接種之T細胞產物與表現抗原之靶細胞的共培養物之上清液的干擾素γ(IFN-γ)、IL-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及藉由抗原接合介導之IL-10分泌之含量。所有樣品稀釋至在偵測範圍內。各細胞介素之含量以pg/mL報導且報導各分析之定量下限及定量上限。
對照包含未轉導之(NTD) T細胞(亦即不表現CAR之T細胞)作為陰性對照，經包含對照抗CD19結合劑之反轉錄病毒轉導之細胞、經對照抗CD20結合劑轉導之細胞、經對照雙特異性抗原結合系統轉導之細胞(Ab13/Ab14雙特異性)，及經雙特異性抗原結合系統轉導之細胞(Ab15/Ab16雙特異性)。 表26：抗CD20 CAR-T與Nalm6野生型細胞在16小時共培養中之細胞介素產生(pg/mL)
      在與Nalm6 WT共培養後之細胞介素(pg/mL)
結合模體# Ab # IL-10 IL-2
2 Ab3 2.886 2.251 3.438 110.474 86.758 70.6158
3 Ab5 4.305 4.194 3.125 163.198 174.192 167.524
5 Ab6 0.277 0.147 0.327 1.39082 1.08314 2.446
6 Ab10 0.769 0.772 0.832 2.70375 6.86764 4.13888
7 Ab7 3.170 4.423 6.179 209.604 272.439 233.01
8 Ab8 5.736 4.562 5.283 314.496 273.505 259.131
9 Ab9 7.970 8.754 6.446 455.254 445.985 408.829
10 Ab1 0.321 0.573 0.296 1.25038 2.8819 0.3113
14 Ab4 5.948 5.325 3.942 383.166 351.627 364.473
16 Ab2 0.276 0.312 0.191 1.52526 1.84837 0.5235
NTD N/A 0.157 0.348 0.451 4.83766 2.43654 5.10316
Ab11 N/A 19.959 13.241 16.798 860.093 843.101 690.879
Ab12 N/A 7.613 6.145 5.710 750.441 802.013 704.947
   LLOQ 1.360 1.78
   ULOQ 466.000 1876
結合模體# Ab # TNF-a IFN-g
2 Ab3 87.1829 70.8648 71.7046 5669.7 4265.89 4974.73
3 Ab5 154.755 143.572 142.014 9479.79 8824.55 9192.87
5 Ab6 1.1906 1.2789 1.53004 67.7508 61.6543 75.6417
6 Ab10 5.08074 6.14829 5.80572 172.603 188.02 229.674
7 Ab7 112.546 143.963 137.234 5556.7 7514.95 6939.41
8 Ab8 249.849 201.326 194.1 12452.8 12117.7 10956.6
9 Ab9 263.572 286.889 267.453 12689.3 12716.4 10847.6
10 Ab1 2.51653 2.46732 1.80637 134.553 103.288 90.2425
14 Ab4 314.402 240.486 251.363 17113.1 14123.9 13754.6
16 Ab2 2.05431 2.63529 2.19805 107.334 136.239 100.073
NTD N/A 1.72614 1.68826 1.3141 83.4983 106.559 77.1905
Ab11 N/A 392.426 395.229 347.665 38674.9 37969.3 32962.3
Ab12 N/A 381.969 387.54 307.418 20023.6 18118.9 15659.7
   LLOQ 1.38 149.4
   ULOQ 496 18760
表27：抗CD20 CAR-T與Raji野生型細胞在16小時共培養中之細胞介素產生(pg/mL)
      在與Raji WT共培養後之細胞介素(pg/mL)
結合模體# Ab # IL-10 IL-2
2 Ab3 4.22791 4.06553 4.09989 1470.48 1168.14 1572.25
3 Ab5 4.71127 4.54175 5.42819 1098.24 959.202 1242.67
5 Ab6 2.94802 3.02925 3.27569 48.5778 46.0853 36.4492
6 Ab10 4.12995 6.20356 4.34137 532.235 638.548 477.869
7 Ab7 6.22517 4.41875 5.68705 1632.41 1256.81 1629.67
8 Ab8 6.82197 5.50928 5.61023 1406.26 1167.16 1552.86
9 Ab9 8.0439 6.16812 8.28169 1493.89 1541.38 1341.7
10 Ab1 2.57139 2.58163 2.76773 1.61246 1.07776 2.95043
14 Ab4 3.83274 4.91531 4.91929 559.513 846.005 1004.86
16 Ab2 4.33862 4.97592 5.1657 44.1423 63.8978 75.554
NTD N/A 3.54859 3.26674 3.67311 4.17588 5.40813 2.67597
Ab11 N/A 8.76434 7.89571 10.5552 562.35 531.706 574.047
Ab12 N/A 5.66881 4.89856 4.90972 1309.6 1156.2 1335.23
   LLOQ 0.600 17.8
   ULOQ 466.000 18760
結合模體# Ab # TNF-a IFN-g
2 Ab3 355.825 330.247 415.31 34934.1 27937.3 40433.3
3 Ab5 299.426 287.003 372.212 35868.4 29774.6 42922.3
5 Ab6 49.2653 47.2393 44.2108 1325.8 2259.4 1672.66
6 Ab10 230.666 295.155 213.26 17114.2 24139.8 18852.1
7 Ab7 385.919 272.502 371.498 30569.3 21404.7 30464.6
8 Ab8 400.397 322.357 409.831 30576.4 23842.2 38718.6
9 Ab9 379.925 424.475 338.892 34630.1 39572.9 35143.5
10 Ab1 10.2538 11.2538 10.461 64.3593 84.505 87.5275
14 Ab4 189.652 276.922 313.618 15464.9 22870.4 26823.3
16 Ab2 76.1237 81.5253 92.838 1755.37 2782.59 3461.08
NTD N/A 8.11105 6.99595 7.40474 52.2049 42.1524 51.0898
Ab11 N/A 216.851 209.783 211.514 35496.6 33980.6 32858.6
Ab12 N/A 354.528 350.431 328.904 30852.3 26033 28850.7
   LLOQ 13.8 352
   ULOQ 4960 187600
表28：抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T與Nalm6野生型細胞在16小時共培養中之細胞介素產生(pg/mL)
      Nalm6 WT
雙特異性結合模體# Ab # IL-10 IL-2
雙特異性-2 Ab3 319.96 148.07 3841.67 997.02
雙特異性-8 Ab8 340.60 198.04 4787.34 2351.16
雙特異性-9 Ab9 339.47 228.56 4472.49 3070.04
雙特異性-14 Ab4 310.71 306.43 3456.34 2075.77
NTD N/A 22.11 26.07 47.13 57.14
Ab11 N/A 156.72 129.75 5898.60 5164.57
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 175.34 137.17 466.18 462.89
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 220.27 184.11 914.97 609.44
   LLOQ 13.60 17.80
   ULOQ 4660.00 18760.00
雙特異性結合模體# Ab # TNF-a IFN-g
雙特異性-2 Ab3 1162.13 547.11 31344.55 17704.04
雙特異性-8 Ab8 1326.76 943.35 41201.40 26645.47
雙特異性-9 Ab9 1297.88 1123.15 44205.89 30919.65
雙特異性-14 Ab4 1314.55 1092.37 41473.90 32712.72
NTD N/A 15.38 17.73 127.03 310.15
Ab11 N/A 1765.65 1481.87 50877.54 46996.98
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 716.26 700.12 33318.42 26294.09
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 845.64 801.45 44585.96 36507.97
   LLOQ 13.80 1494.00
   ULOQ 4960.00 187600.00
表29：抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T與Raji野生型細胞之16小時共同培養中之細胞介素產生(pg/mL)
      Raji WT
雙特異性結合模體# Ab # IL-10 IL-2
雙特異性-2 Ab3 249.61 302.79 5716.65 6324.53
雙特異性-8 Ab8 286.93 375.44 5657.78 6398.44
雙特異性-9 Ab9 199.97 364.30 5311.75 6221.35
雙特異性-14 Ab4 289.02 441.49 4524.40 5178.06
NTD N/A 20.08 31.64 52.78 68.18
Ab11 N/A 158.93 168.48 6913.98 6266.77
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 104.07 120.62 7388.26 7908.03
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 152.99 196.19 6620.35 7598.18
   LLOQ 13.60 17.80
   ULOQ 4660.00 18760.00
雙特異性結合模體# Ab # TNF-a IFN-g
雙特異性-2 Ab3 1276.98 1348.49 46275.13 39485.80
雙特異性-8 Ab8 1248.22 1538.31 44611.85 52535.86
雙特異性-9 Ab9 1329.21 1649.67 37559.20 49128.37
雙特異性-14 Ab4 1500.30 1815.74 50827.49 65974.91
NTD N/A 24.85 31.77 132.97 290.37
Ab11 N/A 1833.09 1748.65 43391.37 47478.31
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 2599.76 2726.70 84185.42 118333.60
Ab15/Ab16雙特異性 N/A 2270.58 2434.51 62974.89 85048.84
   LLOQ 13.80 1494.00
   ULOQ 4960.00 187600.00
表30：抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T與Nalm6 CD19KO細胞在16小時共同培養中之細胞介素產生(pg/mL)
      Nalm6 CD19KO
雙特異性結合模體# Ab # IL-10 IL-2
雙特異性-2 Ab3 20.85 21.32 415.03 397.66
雙特異性-8 Ab8 25.07 23.96 371.09 419.08
雙特異性-9 Ab9 17.46 16.68 315.63 308.79
雙特異性-14 Ab4 27.34 37.57 239.42 263.16
NTD N/A 12.07 12.33 13.90 5.93
Ab11 N/A 11.94 10.61 7.24 8.06
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 22.57 25.85 1373.50 1344.97
Ab11/Ab12雙特異性 N/A 19.22 27.92 758.03 769.46
   LLOQ 3.4 4.45
   ULOQ 1165 4690
雙特異性結合模體# Ab # TNF-a IFN-g
雙特異性-2 Ab3 317.89 371.73 33687.05 41534.70
雙特異性-8 Ab8 414.53 293.49 33669.96 46572.37
雙特異性-9 Ab9 386.27 293.61 41476.85 32400.90
雙特異性-14 Ab4 418.64 307.18 44847.72 41189.26
NTD N/A 21.43 30.02 2183.86 1360.11
Ab11 N/A 33.88 28.23 1707.39 2083.68
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 836.78 842.73 113383.20 130673.40
Ab11/Ab12雙特異性 N/A 720.37 614.86 98809.63 79846.05
   LLOQ 17.25 933.75
   ULOQ 13700 117250
表31：抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T與Nalm6 CD20KO細胞在16小時共培養中之細胞介素產生(pg/mL)
      Nalm6 CD20KO
雙特異性結合模體# Ab # IL-10 IL-2
雙特異性-2 Ab3 12.82183 8.967694 300.3656 255.746
雙特異性-8 Ab8 3.530049 4.734808 158.655 112.5326
雙特異性-9 Ab9 13.69715 12.26638 464.8549 435.2715
雙特異性-14 Ab4 27.21842 23.67642 238.8009 202.8983
NTD N/A 3.795072 3.924667 5.336147 10.97881
Ab11 N/A 13.97866 10.62249 170.2153 136.2659
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 5.964617 6.354307 192.2036 214.7087
Ab15/Ab16雙特異性 N/A   25.07804   389.0046
   LLOQ 1.36 1.78
   ULOQ 466 1876
雙特異性結合模體# Ab # TNF-a IFN-g
雙特異性-2 Ab3 208.4781 184.026 25169.65 20518.19
雙特異性-8 Ab8 173.3662 143.7201 17698.8 14222.19
雙特異性-9 Ab9 302.2407 268.2183 174.1232 143.1469
雙特異性-14 Ab4 295.3972 261.3406 46810.13 41911.35
NTD N/A 7.415782 7.415782 108.3741 3143.67
Ab11 N/A 448.6204 337.0853 81984.54 65671.96
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 182.4278 144.6086 23278.19 20362.21
Ab15/Ab16雙特異性 N/A   419.7012   81159.51
   LLOQ 13.8 1494
   ULOQ 4960 187600
實例7
T細胞與如實例4中所述之靶細胞共培養。在16小時共培養之後，採集以指定E:T比率接種抗原陽性靶細胞之T細胞產物，用一組抗體螢光團染色以識別T細胞(CD3、CD4、CD8)及4-1BB(活化標記物)，且藉由流式細胞測量術分析。可固定活力染料允許對活細胞進行分析。事件系統地選於活細胞(存活染料陰性)、淋巴細胞(藉由側散射[SSC]面積曲線使用正向散射[FSC]面積)、單細胞(藉由FSCC-高度曲線使用FSCC面積)及隨後於T細胞(CD3+ )上。隨後分析T細胞之活化水準(亦即4-1BB細胞之百分比)；基於由NTD對照T細胞表示之水準設定4-1BB閘控臨限值。
對照包含未轉導之(NTD) T細胞(亦即不表現CAR之T細胞)作為陰性對照，經包含對照抗CD19結合劑之反轉錄病毒轉導之細胞、經對照抗CD20結合劑轉導之細胞、經對照雙特異性抗原結合系統轉導之細胞(Ab13/Ab14雙特異性)，及經雙特異性抗原結合系統轉導之細胞。 表32：抗CD20 CAR-T細胞在與Nalm6野生型及Raji野生型細胞共培養16小時中之活化
      在與靶細胞共培養16小時之後的4-1BB%
結合模體# Ab # Nalm6 Raji
2 Ab3 32.54 36.85
3 Ab5 35.72 38.89
5 Ab6 8.99 16.81
6 Ab10 14.62 33.19
7 Ab7 36.28 35.65
8 Ab8 46.66 58.46
9 Ab9 56.88 61.44
10 Ab1 6.48 8.66
14 Ab4 39.49 36.66
16 Ab2 8.29 32.31
NTD N/A 5.6 6.08
Ab11 N/A 57.68 45.09
Ab12 N/A 50.26 40.1
表33：抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T細胞在與Nalm6野生型、Nalm6 CD20KO及Nalm6CD19KO細胞共培養16小時中之活化
      在與靶細胞共培養16小時之後的4-1BB%
雙特異性結合模體# Ab # Nalm6 WT Nalm6 CD19KO Nalm6 CD20KO
雙特異性-2 Ab3 31.93 33.75 42.84 31.46 28.57 22.82
雙特異性-8 Ab8 25.23 27.71 39.2 40.04 25.57 27.1
雙特異性-9 Ab9 24.35 32.54 25.95 26.99 18.87 21.66
雙特異性-14 Ab4 28.33 27.05 27.81 28.21 18.65 22.4
NTD N/A 1.31 1.51 5.01 6.1 2.66 2.23
Ab11 N/A 23.63 20.6 5.39 5.58 24.33 19.05
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 17.56 19.25 18.85 19.06 15.22 13.31
Ab11/Ab12雙特異性 N/A 25.89 22.71 22.24 22.93 19.82 15.46
實例8
T細胞與如實例4中所述之靶細胞共培養。T細胞產物之增殖能力藉由對響應於抗原表現靶細胞之CTV染料與NTD對照T細胞相比之細胞分裂驅動稀釋的流動式細胞量測分析來測定。在培養起始之後第4天，採集以3:1之E:T比率接種之具有抗原表現靶細胞之T細胞產物，在可固定活力染料存在下用一組抗體螢光團(CD3、CD4、CD8)染色以鑑定活的T細胞且藉由流式細胞測量術分析。報導增殖性細胞之百分比以及CTV信號之平均螢光強度(MFI)。CTV之MFI的降低與已經歷產物之細胞分裂次數成比例(亦即CTV MFI愈低，細胞已經歷之增殖愈多)。
對照包含未轉導之(NTD) T細胞(亦即不表現CAR之T細胞)作為陰性對照，經包含對照抗CD19結合劑之反轉錄病毒轉導之細胞、經對照抗CD20結合劑轉導之細胞、經對照雙特異性抗原結合系統轉導之細胞(Ab13/Ab14雙特異性)，及經Ab11/Ab12雙特異性抗原結合系統轉導之細胞。 表34：與Nalm6野生型及Raji野生型細胞共培養之四天中之抗CD20 CAR-T細胞之螢光
      Nalm6 WT Raji WT
結合模體# Ab # CTV MFI CTV MFI
2 Ab3 4902.56 3100.8
3 Ab5 3426.83 2640.14
5 Ab6 6396.87 3041.46
6 Ab10 5645.62 2177.05
7 Ab7 4698.94 2483.31
8 Ab8 4905.7 2068.97
9 Ab9 5039.64 2033.59
10 Ab1 10316.89 5653.56
14 Ab4 4640.49 2200.1
16 Ab2 9129.9 3097.49
NTD N/A 7739.37 4816.32
Ab11 N/A 3548.72 2113.72
Ab12 N/A 2909.96 2498.54
表34：與Nalm6野生型及Raji野生型細胞共培養之四天中之抗CD20 CAR-T細胞之增殖百分比
      Nalm6 WT Raji WT
結合模體# Ab # 增殖% 增殖%
2 Ab3 68.77 74.95
3 Ab5 81.21 78.35
5 Ab6 40.43 78.68
6 Ab10 52.31 87.53
7 Ab7 76.23 78.48
8 Ab8 76.6 84.79
9 Ab9 75.91 87.42
10 Ab1 33.94 53.61
14 Ab4 76.1 80.6
16 Ab2 38.16 85.05
NTD N/A 37.38 48.15
Ab11 N/A 74.96 86.98
Ab12 N/A 86.32 72.9
表35：在與Nalm6野生型、Nalm6 CD19KO、Raji野生型及Raji CD19KO細胞共培養之四天中的抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T細胞之螢光
      CellTrace紫色(MFI)
雙特異性結合模體# Ab # Nalm6 WT Nalm6 CD19KO
雙特異性-2 Ab3 1196.99 1191.69 1433.19 1433.24
雙特異性-8 Ab8 1266.27 1297.78 1503.07 1486.28
雙特異性-9 Ab9 1533.09 1503.48 1747.27 1815.87
雙特異性-14 Ab4 1242.68 1241.04 1421.57 1405.64
NTD N/A 2823.57 2775.76 2269.11 2500.3
Ab11 N/A 1307.52 1273.51 2392.63 2350.37
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 1434.19 1406.81 1409.42 1614.71
Ab11/Ab12雙特異性 N/A 1207.67 1358.15 1319.45 1448.75
雙特異性結合模體# Ab # Raji WT Raji CD19KO
雙特異性-2 Ab3 1166.68 1277.03 1227.25 1249.14
雙特異性-8 Ab8 1286.29 1426.14 1285.56 1271.65
雙特異性-9 Ab9 1613.51 1474.92 1453.13 1456.33
雙特異性-14 Ab4 1767.75 1820.79 1115.55 1113.95
NTD N/A 2150.62 2065.69 2050.38 2016.25
Ab11 N/A 1575.17 1438.12 2011.85 1793.87
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 1330.39 1708.95 1407.7 1628.62
Ab11/Ab12雙特異性 N/A 1636.56 1773.56 1347.75 1426.61
表36：在與Nalm6野生型、Nalm6 CD19KO、Raji野生型及Raji CD19KO細胞共培養之四天中的抗CD20/抗CD19雙順反子CAR-T細胞之增殖百分比
      增殖%
雙特異性結合模體# Ab # Nalm6 WT Nalm6 CD19KO
雙特異性-2 Ab3 91.59 92.65 87.03 87.51
雙特異性-8 Ab8 90.61 90.43 81.44 81.91
雙特異性-9 Ab9 86.97 86.6 78.09 79.86
雙特異性-14 Ab4 90.56 88.55 84.14 83.74
NTD N/A 32.78 35.81 55.57 50.62
Ab11 N/A 90.4 90.37 43.6 46.56
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 87.37 86.42 89.06 80.19
Ab11/Ab12雙特異性 N/A 91.92 89.53 89.29 86.6
雙特異性結合模體# Ab # Raji WT Raji CD19KO
雙特異性-2 Ab3 92.78 89.58 92.52 92.77
雙特異性-8 Ab8 84.65 87.63 88.89 90.11
雙特異性-9 Ab9 85.06 77.69 87.2 87.81
雙特異性-14 Ab4 83.43 88.9 91.96 91.38
NTD N/A 64.5 65.09 61.81 60.57
Ab11 N/A 92.01 88.46 57.51 56.55
Ab13/Ab14雙特異性 N/A 92.56 77.42 90.38 81.8
Ab11/Ab12雙特異性 N/A 89.16 87.23 91.48 88.6
實例9
本實例提供關於用於抗CD20抗原結合系統之鉸鏈的資料。本實例之CAR T細胞包含單價抗CD20 CAR。本實例在NSG小鼠中測試針對表現散播性螢光素酶之Raji人類B細胞淋巴瘤模型的CAR-T構築體。針對CAR-T持久性監測每週血液樣品。基於生物發光成像(BLI)及存活終點評估反應。在第7、13、20、27、34及41天抽取全血用於分析。在第5、12、19、26、33及47天進行BLI。在第55天終止研究。
此研究之CAR-T細胞展示於下表37中，向六隻小鼠投與表37之CAR-T細胞類型中之每一者。表37提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或群組。所有CAR-T細胞均以2E+07個細胞/毫升之劑量靜脈內投與(QDx1)。所有小鼠亦接受36 µg((Q12Hx2)QDx3)之人類IL-2劑量。人類IL-2促進CAR-T持久性及存活率。鑑別為表37之第4組、第5組及第7-10組之CAR T細胞之構築體包含41BB協同刺激域。鑑別為表37之第6組之CAR T細胞包含CD28協同刺激域。 表37：
1 PBS對照
2 模擬CAR-T細胞對照(未轉導之T細胞)
3 包含抗CD19對照CAR之CAR-T細胞
4 包含具有CD8鉸鏈之抗CD20 CAR(8k)及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
5 包含具有IgG4鉸鏈之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
6 包含具有28T(CD28)鉸鏈之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
7 包含具有28T(CD28)鉸鏈之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
8 包含具有G4sx1連接子之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
9 包含具有G4sx2連接子之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
10 包含具有G4sx3連接子之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
研究小鼠對所有CAR-T細胞處理具有良好耐受性。在各組內，監測許多度量值，包含治療相關之體重變化、治療相關之死亡、中值腫瘤生長延遲、相比於對照之中值腫瘤負荷(T/C%)、展示部分腫瘤消退之動物百分比(PR%)、展示完全腫瘤消退之動物百分比(CR%)、無腫瘤存活者之百分比(TFS%)及增加之壽命百分比。結果展示於下表38中，注意資料反映在第55天經由實驗終止之監測。
組 # 治療相關體重變化 (%) 治療相關之死亡 (%) 中值腫瘤生長延遲 ( 天 ) 中值 T/C%( 第 12 天 ) PR% CR% TFS% 增加之壽命 %
1 -6.5 0 0 100 0 0 0 0.0
2 -15.9 0 0.4 73.8 0 0 0 9.1
3 5.6 0 ＞37.3 2.5 0 83 83 ＞345.5
4 -6 0 ＞37.3 2.1 0 100 100 ＞345.5
5 5.5 0 ＞37.3 2.4 0 100 83 ＞345.5
6 -2.7 0 15.5 4.6 0 0 0 131.8
7 4 0 ＞37.3 2.4 0 100 33 ＞345.5
8 1.3 0 35.6 3.8 0 33 0 331.8
9 3 0 23.3 2.3 0 100 0 186.4
10 -3.1 0 18.3 2.8 0 67 17 200.0
表38 實例10
本實例提供與包含雙順反子CAR的CAR-T細胞之抗腫瘤功效相關之資料，該雙順反子CAR包含抗CD19 CAR及抗CD20 CAR，該抗CD20 CAR包含不同的抗CD20結合模體及/或鉸鏈。
針對表現散播性螢光素酶之Raji CD19KO B細胞淋巴瘤腫瘤在NSG小鼠中測試雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR-T細胞。針對CAR-T持久性監測每週血液樣品。基於生物發光成像(BLI)及存活終點評估反應。在第7、13、20、27、34及41天抽取全血用於分析。在第5、12、19、26、33、40及48天進行BLI。在第55天終止研究。如下表39之列5-14中所示之此研究的CAR-T細胞為包含如表39中所指示之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(包含28T(CD28)鉸鏈及CD28協同刺激域之Ab11 CAR)的雙順反子CAR-T細胞。表39提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或群組。向六個小鼠投與CAR-T細胞(不同之處在於四個小鼠接受未經轉導之T細胞(表39之列2))。所有CAR-T細胞均以1E+07個細胞/毫升(列2-7、9、11及13)或4E+06個(列8、10、12及14)之劑量靜脈內投與(QDx1)。所有小鼠亦接受36 µg((Q12Hx2)QDx3)之人類IL-2劑量。 表39
1 PBS對照
2 模擬CAR-T細胞對照(未轉導之T細胞)
3 包含抗CD20對照CAR(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之CAR-T細胞
4 包含抗CD20對照CAR之CAR-T細胞
5 包含抗CD20對照CAR(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)及抗CD19 CAR之CAR-T細胞
6 包含有包含結合模體#9(CD28鉸鏈、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
7 包含有包含結合模體#2(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
8 包含有包含結合模體#2(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
9 包含有包含結合模體#8(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
10 包含有包含結合模體#8(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
11 包含有包含結合模體#9(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
12 包含有包含結合模體#9(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
13 包含有包含結合模體#14(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
14 包含有包含結合模體#14(CD8鉸鏈(8k)、41BB協同刺激域)之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞
監測許多度量值，包含治療相關之體重變化、治療相關之死亡、中值腫瘤生長延遲、相比於對照之中值腫瘤負荷(T/C%)、展示部分腫瘤消退之動物百分比(PR%)、展示完全腫瘤消退之動物百分比(CR%)、無腫瘤存活者之百分比(TFS%)及增加之壽命百分比(ILS%)。結果展示於下表40中，注意資料反映在第55天經由實驗終止之監測。
研究小鼠對所有CAR-T細胞處理具有良好耐受性。所測試之所有CAR-T細胞處理均引發抗腫瘤反應。所有治療方案使得中值腫瘤生長延遲＞30.2天且壽命增加(ILS) ＞226.7%。除了用未經轉導之(NTD)細胞(24%)處理之外，所有治療方案均在0%之第19天產生中值T/C%。 表40
組 # 治療相關體重變化 (%) 治療相關之死亡 (%) 中值腫瘤生長延遲 ( 天 ) 中值 T/C%( 第 19 天 ) PR% CR% TFS% 增加之壽命 (ILS)%
1 -18.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0
2 -2.1 0.0 ＞30.2 23.8 0.0 0.0 0.0 ＞226.7
3 -5.2 0.0 ＞30.2 0.0 0.0 100.0 100.0 ＞226.7
4 1.1 16.7 ＞30.2 0.0 0.0 100.0 100.0 ＞226.7
5 -1.0 0.0 ＞30.2 0.0 16.7 66.7 66.7 ＞226.7
6 2.0 0.0 ＞30.2 0.0 50.0 50.0 16.7 ＞226.7
7 -4.4 0.0 ＞30.2 0.0 0.0 66.7 66.7 ＞226.7
8 -2.4 0.0 ＞30.2 0.0 0.0 100.0 33.3 ＞226.7
9 -3.0 0.0 ＞30.2 0.0 33.3 66.7 50.0 ＞226.7
10 2.5 0.0 ＞30.2 0.0 0.0 83.3 33.3 ＞226.7
11 -2.7 0.0 ＞30.2 0.0 0.0 100.0 50.0 ＞226.7
12 4.6 0.0 ＞30.2 0.0 0.0 66.7 33.3 ＞226.7
13 4.0 0.0 ＞30.2 0.0 16.7 83.3 66.7 ＞226.7
14 5.4 0.0 ＞30.2 0.0 0.0 100.0 66.7 ＞226.7
實例11
本實例提供與包含雙特異性CAR之CAR-T細胞之抗腫瘤功效相關之資料，該雙特異性CAR包含抗CD19結合模體及抗CD20結合模體。針對表現散播性螢光素酶之Raji B細胞淋巴瘤腫瘤在NSG小鼠中測試雙特異性抗CD20/抗CD19 CAR-T細胞。針對CAR-T持久性監測每週血液樣品。基於生物發光成像(BLI)及存活終點評估反應。在第7、13、20、27、32及41天抽取全血用於分析。在第5、12、19、26、33、40及47天進行BLI。在第54天終止研究。
如下表41之列4-8中所示之此研究之CAR-T細胞為包含抗CD19結合模體及抗CD20結合模體之雙特異性CAR-T細胞，其中抗CD19結合模體為Ab11。表41提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或群組。CAR-T細胞以一定劑量投與，且投與多個小鼠，展示於表41中。所有CAR-T細胞均靜脈內投與(QDx1)。所有小鼠亦接受36 µg((Q12Hx2)QDx3)之人類IL-2劑量。 表41
1 PBS對照(6隻小鼠)
2 模擬CAR-T細胞對照(未經轉導之T細胞) (1.5E+07個細胞；6隻小鼠)
3 包含抗CD19對照CAR之CAR-T細胞(1.2E+07個細胞；6隻小鼠)
4 單特異性抗CD19 CAR(1.5E+07個細胞；6隻小鼠)
5 包含有包含抗CD20結合模體#2之抗CD20/抗CD19雙特異性CAR之CAR-T細胞(1.5E+07個細胞；5隻小鼠)
6 包含有包含抗CD20結合模體#2之抗CD20/抗CD19雙特異性CAR之CAR-T細胞(1.0E+07個細胞；4隻小鼠)
7 包含有包含抗CD20結合模體#8之抗CD20/抗CD19雙特異性CAR之CAR-T細胞(7.0E+06個細胞；6隻小鼠)
8 包含有包含抗CD20結合模體#8之抗CD20/抗CD19雙特異性CAR之CAR-T細胞(1.5E+07個細胞；6隻小鼠)
監測許多度量值，包含治療相關之體重變化、治療相關之死亡、中值腫瘤生長延遲、相比於對照之中值腫瘤負荷(T/C%)、展示部分腫瘤消退之動物百分比(PR%)、展示完全腫瘤消退之動物百分比(CR%)、無腫瘤存活者之百分比(TFS%)及增加之壽命百分比(ILS%)。結果展示於下文表42中。觀測到抗腫瘤功效。 表42
組 # 治療相關體重變化 (%) 治療相關之死亡 (%) 中值腫瘤生長延遲 ( 天 ) 中值 T/C%( 第 12 天 ) PR% CR% TFS% 增加之壽命 (ILS)%
1 -10.2 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0
2 -15.7 0.0 1.3 58.7 0.0 0.0 0.0 21.7
3 -4.1 0.0 25.5 6.0 0.0 83.3 0.0 295.7
4 -8.8 0.0 7.2 13.2 0.0 0.0 0.0 73.9
5 -3.5 0.0 11.7 12.2 0.0 0.0 0.0 113.0
6 0.2 0.0 10.4 9.6 0.0 0.0 0.0 160.9
7 1.9 50.0 ＞25.5 5.4 0.0 100.0 0.0 195.7
8 1.3 17.0 15.0 7.1 0.0 0.0 0.0 126.1
實例12
本實例提供與以下各者相關之資料：(i)CAR-T細胞，其包含雙順反子CAR，該雙順反子CAR包含抗CD19 CAR及抗CD20 CAR；及(ii)雙特異性CAR，其包含抗CD19結合模體及抗CD20結合模體之。針對表現散播性螢光素酶之Raji B細胞淋巴瘤腫瘤在NSG小鼠中測試雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR-T細胞。針對CAR-T持久性監測每週血液樣品。基於生物發光成像(BLI)及存活終點評估反應。在第7、13、20、27、34及40天抽取全血用於分析。在第5、12、19、26、33及40天進行BLI。在第48天終止研究。
如下表43中所展示之此研究之CAR-T細胞為雙順反子或雙特異性CAR-T細胞，其包含抗CD20結合模體、抗CD19結合模體(Ab11)。表43提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或群組。CAR-T細胞以6.0E+06之劑量投與，其中之每一者向六隻小鼠投與CAR-T細胞類型。所有CAR-T細胞均靜脈內投與(QDx1)。所有小鼠亦腹膜內接受36 µg((Q12Hx2)QDx3)之人類IL-2劑量。 表43
1 PBS對照
2 模擬CAR-T細胞對照(未轉導之T細胞)(60.0E+06個細胞)
3 包含抗CD19對照CAR之CAR-T細胞(2.6E+06個細胞)
4 包含具有根據SEQ ID NO:247之連接子之抗CD19 CAR的CAR-T細胞
5 包含具有G4S連接子之抗CD19 CAR的CAR-T細胞
6 包含雙順反子CAR之CAR-T細胞，該雙順反子CAR包含結合模體#2
7 包含雙順反子CAR之CAR-T細胞，該雙順反子CAR包含結合模體#9
8 包含雙順反子CAR之CAR-T細胞，該雙順反子CAR包含結合模體#14
9 包含雙特異性CAR之CAR-T細胞，該雙特異性CAR包含結合模體#2
10 包含雙特異性CAR之CAR-T細胞，該雙順反子CAR包含結合模體#9
11 包含雙特異性CAR之CAR-T細胞，該雙順反子CAR包含結合模體#14
12 包含對照雙特異性抗CD20/抗CD19 CAR之CAR-T細胞
13 包含對照雙特異性抗CD20/抗CD19 CAR之CAR-T細胞
監測許多度量值，包含治療相關之體重變化、治療相關之死亡、中值腫瘤生長延遲、相比於對照之中值腫瘤負荷(T/C%)、展示部分腫瘤消退之動物百分比(PR%)、展示完全腫瘤消退之動物百分比(CR%)、無腫瘤存活者之百分比(TFS%)及增加之壽命百分比(ILS%)。結果展示於下表44中，注意資料反映在第48天經由實驗終止之監測。
所有處理均耐受。排除未經轉導之細胞及LG細胞之所有治療方案使得中值腫瘤生長延遲為至少21天，壽命延長(ILS)＞223%，中值T/C%在第12天為約0%，且許多使得部分及/或完全腫瘤消退。 表44
組 # 治療相關體重變化 (%) 治療相關之死亡 (%) 中值腫瘤生長延遲 ( 天 ) 中值 T/C%( 第 12 天 ) PR% CR% TFS% 增加之壽命 (ILS)%
1 -21.8 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0
2 -22.2 0.0 -0.1 108.3 0.0 0.0 0.0 0.0
3 -7 0.0 ＞28.5 0.1 50.0 33.3 0.0 ＞223.1
4 -6.8 0.0 ＞28.5 0.2 33.3 66.6 50.0 ＞223.1
5 -4.8 0.0 ＞28.5 0.3 67.0 33.3 0.0 ＞223.1
6 -5.8 0.0 ＞28.5 0.4 16.6 66.6 0.0 ＞223.1
7 -5.4 0.0 ＞28.5 0.6 50.0 16.6 0.0 ＞223.1
8 -3.3 0.0 ＞28.5 0.1 33.3 66.6 0.0 ＞223.1
9 -5.1 0.0 ＞28.5 0.7 16.6 0.0 0.0 ＞223.1
10 -4.6 0.0 25.2 0.5 0.0 0.0 0.0 ＞223.1
11 -4.4 0.0 ＞28.5 0.2 16.6 33.3 0.0 ＞223.1
12 -8.6 0.0 3.8 26.7 0.0 0.0 0.0 61.5
13 -3.3 0.0 20.8 3.2 16.6 0.0 0.0 ＞223.1
實例13
本實例提供與包含單價抗CD20 CAR之CAR-T細胞之抗腫瘤功效相關之資料。針對可逆的表現螢光素酶之Raji B細胞淋巴瘤腫瘤(CD19 WT)在NSG小鼠中測試抗CD20 CAR-T細胞。針對CAR-T持久性監測每週血液樣品。基於生物發光成像(BLI)及存活終點評估反應。在第5、12、21、28、33、40及47天進行BLI。在第55天終止研究。如下表45中所展示之此研究之CAR-T細胞以表45中所展示之小鼠之劑量及數目投與。表45提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或群組。所有CAR-T細胞均靜脈內投與(QDx1)。所有小鼠接受36 µg((Q12Hx2)QDx3)之人類IL-2劑量。 表45
1 PBS對照(6隻小鼠)
2 模擬CAR-T細胞對照(未經轉導之T細胞) (1.5E+07個細胞)(6隻小鼠)
3 包含抗CD19 CAR的CAR-T細胞(6.58E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(8.39E+06個細胞)(5隻小鼠)
4 包含抗CD19 CAR的CAR-T細胞(1.32E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(1.37E+07個細胞)(6隻小鼠)
5 包含抗CD20 CAR的CAR-T細胞(1.1E+07個細胞)+未經轉導之T細胞(4.1E+06個細胞)(5隻小鼠)
6 包含抗CD20 CAR的CAR-T細胞(2.2E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(1.3E+07個細胞)(5隻小鼠)
7 包含有包含結合模體#8之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(1.5E+07個細胞)(5隻小鼠)
8 包含有包含結合模體#8之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(3.0E+06個細胞)(5隻小鼠)
9 包含有包含結合模體#9之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(1.1E+07個細胞)(5隻小鼠)
10 包含有包含結合模體#9之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(1.3E+06個細胞)(4隻小鼠)
11 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(1.1E+07個細胞)+未經轉導的T細胞(4.0E+06個細胞)(6隻小鼠)
12 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(2.2E+06個細胞)+未經轉導的T細胞(1.3E+07個細胞)(5隻小鼠)
監測許多度量值，包含治療相關之體重變化、治療相關之死亡、中值腫瘤生長延遲、相比於對照之中值腫瘤負荷(T/C%)、展示部分腫瘤消退之動物百分比(PR%)、展示完全腫瘤消退之動物百分比(CR%)、無腫瘤存活者之百分比(TFS%)及增加之壽命百分比(ILS%)。結果展示於下文表46中。 表46
組 # 治療相關體重變化 (%) 增加之壽命 (%) 中值 TC% 第 12 天 腫瘤生長延遲 ( 天 ) CR% PR% TFS%
1 -17.1 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0
2 -23.6 27.3 61.7 0.9 0.0 0.0 0.0
3 -4.9 218.2 3.7 20.5 0.0 0.0 0.0
4 -9.4 118.2 26.6 4.1 0.0 0.0 0.0
5 -8.4 ＞290.9 36.3 ＞35.9 60.0 0.0 0.0
6 -10.3 ＞290.9 59.2 29.5 0.0 0.0 0.0
7 -8.7 ＞290.9 4.3 ＞35.9 0.0 0.0 0.0
8 -5.1 ＞290.9 42.7 5.7 0.0 0.0 0.0
9 -10.2 ＞290.9 3.3 ＞35.9 40.0 0.0 40.0
10 -11.2 263.6 58.0 4.4 0.0 0.0 0.0
11 -5.9 227.3 24.0 18.7 0.0 0.0 0.0
12 -10.0 254.5 50.7 2.9 0.0 0.0 0.0
實例14
本實例提供與包含雙順反子CAR的CAR-T細胞之抗腫瘤功效相關之資料，該雙順反子CAR包含抗CD19 CAR及抗CD20 CAR，及與包含單價抗CD20 CAR之CAR-T細胞之抗腫瘤功效相關之資料。針對表現散播性螢光素酶之Raji B細胞淋巴瘤腫瘤在NSG小鼠中測試CAR-T細胞。針對CAR-T持久性監測每週血液樣品。基於生物發光成像(BLI)及存活終點評估反應。在第5、12、19、26、33及40天進行BLI。
此研究之CAR-T細胞展示於下表47中。表47提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或群組。組1至10僅包含對照及單特異性CAR-T細胞，而組11至16包含雙順反子CAR-T細胞。雙順反子CAR-T細胞包含如表39中所指示之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(Ab11 CAR)。表47中所示之各條件包含6隻小鼠。所有CAR-T細胞均以指定劑量靜脈內投與(QDx1)。所有小鼠亦以36 µg((Q12Hx2) QDx3)之劑量接受腹膜內人類ILD-2。 表47
1 PBS對照
2 模擬CAR-T細胞對照(未轉導之T細胞)(9.0E+06個細胞)
3 模擬CAR-T細胞對照(未轉導之T細胞)(1.4E+07個細胞)
4 包含有包含Ab11結合模體之抗CD19對照CAR之CAR-T細胞(1.40E+07個細胞)
5 包含有包含Ab11結合模體之抗CD19對照CAR之CAR-T細胞(7.0E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(2.00E+06個細胞)
6 包含有包含Ab11結合模體之抗CD19對照CAR之CAR-T細胞(1.40E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(7.60E+06個細胞)
7 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(6.80E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(2.20E+06個細胞)
8 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(1.40E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(7.60E+06個細胞)
9 包含對照抗CD20 CAR之CAR-T細胞(7.0E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(2.00E+06個細胞)
10 包含對照抗CD20 CAR之CAR-T細胞(1.40E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(7.60E+06個細胞)
11 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(7.50E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(1.40E+06個細胞)
12 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(1.50E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(7.50E+06個細胞)
13 包含抗CD20 CAR對照及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(8.0E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(9.50E+06個細胞)
14 包含抗CD20 CAR對照及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(1.60E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(7.40E+06個細胞)
15 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(9.0E+06個細胞)
16 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(1.80E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(7.20E+06個細胞)
監測許多度量值，包含治療相關之體重變化、治療相關之死亡、中值腫瘤生長延遲、相比於對照之中值腫瘤負荷(T/C%)、展示部分腫瘤消退之動物百分比(PR%)、展示完全腫瘤消退之動物百分比(CR%)、無腫瘤存活者之百分比(TFS%)及增加之壽命百分比(ILS%)。結果展示於下表48中。研究小鼠對所有CAR-T細胞處理具有良好耐受性。 表48
組 # 治療相關體重變化 (%) 治療相關死亡 (%) 增加之壽命 (%) 中值 Δ T/Δ C第 12 天 (%) 腫瘤生長延遲 ( 天 ) CR% PR % TFS%
1 -16.5 0.0 00 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0
2 -23.9 0.0 28.0 67.3 0.9 0.0 0.0 0.0
3 -23.0 0.0 28.0 84.8 0.3 0.0 0.0 0.0
4 -10.8 0.0 ＞188.0 4.6 ＞28.3 33.3 0.0 0.0
5 -2.6 0.0 ＞188.0 5.6 ＞28.3 0.0 0.0 0.0
6 -4.2 0.0 164.0 6.9 20.4 0.0 0.0 0.0
7 -9.0 0.0 ＞188.0 4.9 ＞28.3 16.6 0.0 16.6
8 -4.4 0.0 ＞188.0 9.0 ＞28.3 0.0 0.0 0.0
9 -9.1 0.0 ＞188.0 4.5 ＞28.3 0.0 0.0 0.0
10 -0.5 0.0 188.0 9.0 24.5 0.0 0.0 0.0
11 -7.3 0.0 ＞188.0 4.8 ＞28.3 0.0 0.0 0.0
12 -2.9 0.0 ＞188.0 7.6 24.5 0.0 0.0 0.0
13 -4.6 0.0 ＞188.0 4.4 ＞28.3 0.0 0.0 0.0
14 -0.8 0.0 ＞188.0 7.2 ＞28.3 0.0 0.0 0.0
15 -6.2 0.0 ＞188.0 5.0 ＞28.3 0.0 0.0 0.0
16 -4.9 0.0 ＞188.0 5.0 ＞28.3 0.0 0.0 0.0
實例15
本實例提供與包含雙順反子CAR的CAR-T細胞之抗腫瘤功效相關之資料，該雙順反子CAR包含抗CD19 CAR及抗CD20 CAR，及與包含單價抗CD20 CAR之CAR-T細胞之抗腫瘤功效相關之資料。針對NSG小鼠中之表現螢光素酶之NALM6人類急性淋巴母細胞白血病模型測試CAR-T細胞。監測血液樣品之CAR-T持久性。基於生物發光成像(BLI)及存活終點評估反應。在第4、11、20、25、32及39天抽取全血用於分析。在第3、10、18、24、31、38及45天進行BLI。在第48天終止研究。
此研究之CAR-T細胞展示於下表49中。表49提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或群組。組1-8僅包含對照及單特異性CAR-T細胞，而組9-12包含雙順反子CAR-T細胞。雙順反子CAR-T細胞包含如表49中所指示之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(Ab11 CAR)。表49中所示之各條件包含6隻小鼠。所有CAR-T細胞均以指定劑量靜脈內投與(QDx1)。
表49
1 PBS對照
2 模擬CAR-T細胞對照(未轉導之T細胞)(1.1E+07個細胞)
3 包含有包含Ab11結合模體之抗CD19對照CAR之CAR-T細胞(9.70E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(8.90E+05個細胞)
4 包含有包含Ab11結合模體之抗CD19對照CAR之CAR-T細胞(1.90E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(8.70E+06個細胞)
5 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(6.50E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(4.10E+06個細胞)
6 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR之CAR-T細胞(1.30E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(9.30E+06個細胞)
7 包含對照抗CD20 CAR之CAR-T細胞(7.00E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(3.60E+06個細胞)
8 包含對照抗CD20 CAR之CAR-T細胞(1.40E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(9.20E+06個細胞)
9 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(1.10E+07個細胞)
10 包含有包含結合模體#14之抗CD20 CAR及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(2.10E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(8.50E+06個細胞)
11 包含抗CD20 CAR對照及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(8.4E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(2.30E+06個細胞)
12 包含抗CD20 CAR對照及抗CD19 CAR(雙順反子CAR)之CAR-T細胞(1.70E+06個細胞)+未經轉導之T細胞(9.00E+06個細胞)
監測許多度量值，包含治療相關之體重變化、治療相關之死亡、中值腫瘤生長延遲、相比於對照之中值腫瘤負荷(T/C%)、展示部分腫瘤消退之動物百分比(PR%)、展示完全腫瘤消退之動物百分比(CR%)、無腫瘤存活者之百分比(TFS%)及增加之壽命百分比(ILS%)。結果展示於下表50中。研究小鼠對所有CAR-T細胞處理具有耐受性。
組 # 治療相關體重變化 (%) 治療相關之死亡 ( %) 增加之壽命 (ILS%) 中值腫瘤生長延遲 ( 天 ) 中值 T/C %( 第 18 天 ) PR% CR% TFS%
1 2.8 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0
2 3.8 0.0 0.0 0.0 121.6 0.0 0.0 0.0
3 -2.2 0.0 ＞150.0 27.0 0.0 50.0 50.0 16.6
4 3.9 0.0 72.2 13.0 0.2 33.3 0.0 0.0
5 -8.7 0.0 ＞160.0 27.0 0.0 66.6 0.0 0.0
6 -2.2 0.0 86.1 15.5 13.5 0.0 0.0 0.0
7 -5.4 0.0 105.6 19.0 1.5 0 0.0 0.0
8 -2.4 0.0 97.2 17.5 39.4 0.0 0.0 0.0
9 -2.2 0.0 ＞160.0 27.0 0.0 83.3 16.6 16.6
10 -2.2 0.0 ＞150.0 27.0 0.1 100.0 0.0 0.0
11 6.5 0.0 ＞160.0 27.0 0.0 100.0 0.0 0.0
12 10.3 0.0 111.1 20.0 0.2 16.6 0.0 0.0
表50 實例16
本實例提供與用作CAR之組分之序列相關的資料。四種抗CD20結合模體與4個鉸鏈(CD8鉸鏈(8k)、截短CD28鉸鏈(28T)、具有G4S連接子之截短CD28鉸鏈、及IgG4鉸鏈(I4))組合測試。所有雙特異性及雙順反子CAR包含Ab11抗CD19結合模體。藉由自來自健康供體之血球分離術材料進行陽性選擇，分離出CD4+ 及CD8+ T細胞，且將其用於產生抗CD20單價或抗CD20/抗CD19雙順反子CAR T細胞產物。T細胞用結合型抗CD3及可溶性CD28抗體活化且用編碼CAR構築體之慢病毒載體轉導。作為對照，未經轉導之(NTD) T細胞自相同供體T細胞平行產生。在收穫日(製造之第8-10天)，對CAR T細胞產物進行染色且藉由流式細胞術分析以評估轉導效率且用於共培養物分析中。監測具有編碼單價CAR之載體及編碼雙順反子CAR之載體的T細胞之轉導效率。
為測定編碼單價CAR之載體之T細胞轉導效率，在可固定活力染料存在下用一組抗體(抗CD3、抗CD4、抗CD8及抗連接子)染色CAR-T產物且藉由流動式細胞測量術分析以評估活的CAR陽性細胞之百分比。抗連接子抗體為結合抗CD20 CAR之結合模體之重鏈與輕鏈之間的連接子之抗體且用於量測轉導效率。對照包含未轉導細胞(NTD)、經包含對照抗CD19結合劑之逆轉錄病毒轉導的細胞，及經對照抗CD20結合劑轉導的細胞(Ab12結合模體)。
為測定編碼雙順反子CAR之載體的T細胞轉導效率，在可固定活力染料存在下用一組抗體(包含抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗個體基因型及抗連接子)染色CAR-T產物且藉由流式細胞測量術分析以評估活的CAR陽性細胞之百分比。抗個體基因型抗體結合Ab11抗CD19結合模體之結合模體。因此，抗個體基因型抗體結合抗CD19 CAR。其用於量測抗CD19 CAR之轉導效率。抗連接子抗體用於量測抗CD20 CAR之轉導效率。對照包含未轉導細胞(NTD)、經包含對照抗CD19結合劑之逆轉錄病毒轉導的細胞，及經對照抗CD20/抗CD19雙特異性CAR轉導之細胞(Ab13/Ab14雙特異性、Ab11/Ab12雙特異性)。
為了促進追蹤培養物中之T細胞，根據製造商之說明書用CellTrace™紫色(CTV)試劑標記CAR-T細胞且隨後用R-10%培養基洗滌。為促進追蹤表現CAR-T靶抗原之細胞(「靶細胞」)，靶細胞經工程改造以表現螢光素酶。螢光素酶表現靶細胞包含Nalm6及Raji，兩者均表現CD19及CD20抗原。另外，製備不表現CD19或CD20之Nalm6及Raji細胞(基因剔除細胞或KO)。此等CD19KO及CD20KO細胞選自Nalm6及Raji親本細胞且分別表現CD20而非CD19或CD19而非CD20。產生CD19KO及CD20KO病毒株且用作在功能上評估表現雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR之細胞之各CAR之抗原結合的對照。
表現螢光素酶之靶細胞與CTV標記之CAR-T細胞一起以各種比率接種於R-10%培養基中(共培養第0天)。該比率可稱為效應子(CART)細胞與靶細胞(效應子:目標或E:T)之比率。向培養所需比率之細胞中，將CART細胞連續稀釋2至3倍，而每孔靶細胞之數目保持恆定為25,000個細胞。在37℃下培育共培養物16小時(h)或4天且如下文所述進行功能評估。
相比於由單獨電鍍之靶細胞發射之信號，量測T細胞介導之細胞毒性隨共培養孔中之目標螢光素酶信號之降低而變化。在共培養起始之後第4天，將最終濃度為0.14 mg/mL之D-螢光素受質添加至共培養孔中，且將板在37℃下在暗處培育10分鐘。緊接在VarioSkan™ LUX或VarioSkan® Flash多模式微板讀取器中之後讀取發光信號。T細胞介導之細胞毒性如下計算：細胞毒性% = [1-(所關注之樣品/單獨目標對照物)之螢光素酶信號] *100。
在共培養16小時之後量測細胞介素產生，此時收集上清液且根據製造商之說明書使用Meso Scale Discovery V-PLEX促炎性面板1人套組分析細胞介素水準。分析以1:1之E:T比率接種之T細胞產物與表現抗原之靶細胞的共培養物之上清液的干擾素γ(IFN-γ)、IL-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及藉由抗原接合介導之IL-10分泌之含量。所有樣品稀釋至在偵測範圍內。各細胞介素之含量以pg/mL報導且報導各分析之定量下限及定量上限。
為測定16小時共培養後之T細胞活化，以指定E:T比率接種T細胞產物與抗原陽性靶細胞，收集以一組抗體螢光團染色以鑑別T細胞(CD3、CD4、CD8)及4-1BB(一種活化標記物)，且藉由流式細胞測量術分析。可固定活力染料允許對活細胞進行分析。事件系統地選於活細胞(存活染料陰性)、淋巴細胞(藉由側散射[SSC]面積曲線使用正向散射[FSC]面積)、單細胞(藉由FSC-高度曲線使用FSC面積)及隨後於T細胞(CD3+ )上。隨後分析T細胞之活化水準(亦即4-1BB細胞之百分比)；基於由NTD對照T細胞表示之水準設定4-1BB閘控臨限值。
T細胞產物之增殖能力藉由對響應於抗原表現靶細胞之CTV染料與NTD對照T細胞相比之細胞分裂驅動稀釋的流動式細胞量測分析來測定。在培養起始之後第4天，採集以3:1之E:T比率接種之具有抗原表現靶細胞之T細胞產物，在可固定活力染料存在下用一組抗體螢光團(CD3、CD4、CD8)染色以鑑定活的T細胞且藉由流式細胞測量術分析。報導增殖性細胞之百分比以及CTV信號之平均螢光強度(MFI)。CTV之MFI的降低與已進行產物之細胞分裂回合的數目成比例。
用於此實例中之CAR-T細胞包含以下表51中鑑別之CAR。表51提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或群組。轉導效率展示於表52中。Nalm6 (CD19+、CD20low)、Nalm6CD19KO (CD19-、CD20+)、Raji (CD19+、CD20+)及Raji CD19KO (CD19-、CD20+)中之第4天細胞毒性展示於表53A-53D中。以1:3之E:T比率在Nalm6 CD19KO靶細胞中在共培養後14h之細胞激素產生展示於表54A-54D中，如以pg/mL(每個條件2次重複)形式所量測。在共培養16小時後藉由41BB之上調(41BB+活T細胞百分比)所量測之T細胞活化顯示於表55A-D中(每個條件2次重複)。在共培養後4d後T細胞之增殖顯示於表56中(增殖CD3+百分比，每個條件兩次重複)。 表51
   類型 (例如雙順反子對雙特異性)
1 未經轉導之對照
2 包含G4S連接子之單特異性抗CD19 CAR
3 包含G4S連接子之單特異性抗CD19 CAR
4 包含G4S連接子之單特異性抗CD19 CAR
5 包含CD8鉸鏈(8k)之單特異性抗CD20 CAR
6 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含CD8鉸鏈(8k)之抗CD20 CAR
7 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含IgG4鉸鏈之抗CD20 CAR
8 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR
9 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#2及CD8鉸鏈(8k)之抗CD20 CAR
10 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#8及CD8鉸鏈(8k)之抗CD20 CAR
11 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#9及CD8鉸鏈(8k)之抗CD20 CAR
12 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#14及CD8鉸鏈(8k)之抗CD20 CAR
13 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#2及CD28鉸鏈之抗CD20 CAR
14 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#8及CD28鉸鏈之抗CD20 CAR
15 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#9及CD28鉸鏈之抗CD20 CAR
16 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#14及CD28鉸鏈之抗CD20 CAR
17 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#2及具有G4S連接子之CD28鉸鏈之抗CD20 CAR
18 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#8及CD28鉸鏈之抗CD20 CAR
19 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#9及具有G4S連接子之CD28鉸鏈之抗CD20 CAR
20 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#14及具有G4S連接子之CD28鉸鏈之抗CD20 CAR
21 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#2及IgG4鉸鏈之抗CD20 CAR
22 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#8及IgG4鉸鏈之抗CD20 CAR
23 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#9及IgG4鉸鏈之抗CD20 CAR
24 雙順反子抗CD20/抗CD19 CAR，包含結合模體#14及IgG4鉸鏈之抗CD20 CAR
表52
組 1 2 5 6 7 8
CD19 CAR+活T細胞% 0.56 59.52 2.35 47.54 29.05 56.77
CD20 CAR+活T細胞% 0.09 69.3 75.76 49.33 40.13 60.99
組 9 10 11 12 13 14
CD19 CAR+活T細胞% 52.72 50.2 44.72 40.28 38.99 34.12
CD20 CAR+活T細胞% 46.42 45.57 41.36 37.04 37.15 34.7
組 15 16 17 18 19 20
CD19 CAR+活T細胞% 34.87 51.32 28.89 41.69 41.34 36.22
CD20 CAR+活T細胞% 33.78 47.97 28.87 41.82 41.95 35.14
組 21 22 23 24      
CD19 CAR+活T細胞% 37.07 30.62 32.18 39.93      
CD20 CAR+活T細胞% 38.69 41 41.23 46.43      
表53A
Nalm6 WT 組
E:T比率 1 2 3 4
1比243 30.2 21.9 -22.9 -11.5 -0.5 -12.1 -13.8 -11.7
1比81 -0.8 -7.5 -20.9 -16.4 -8.1 -10.2 -27.6 -11.9
1比27 -19.5 -37.2 -5.7 -17.2 -13.3 -15.9 -2.1 -13.2
1比9 -13.6 -20.2 14.9 -1.5 8.7 -5.9 13.4 1.2
1比3 -7.1 -28.9 100 100 100.1 100.1 100.1 100.1
3比1 16 4.6 100.4 100.1 100.5 100.1 100.5 100.1
E:T比率 5 6 7 8
1比243 -14.6 -12.6 -4 -10.2 -7.3 -11.6 -9.8 -9.9
1比81 5.2 -20.1 -6.2 -20.5 -5.7 -15 -2.2 -7
1比27 -8 -21.2 3.2 -10.9 6 -5.5 -8.1 -8.9
1比9 -1.8 0.6 19.4 16.1 19 1.7 18.7 11
1比3 100.1 99.9 100.1 100.1 100.1 100.1 100 99.9
3比1 100.5 100.1 100.5 100.1 100.5 100.1 100.4 100
E:T比率 9 10 11 12
1比243 43.6 48.1 -16 0.7 -8.3 -14.3 -3.1 -19.9
1比81 9.5 20.1 -7.5 -2.4 -10.7 -22.4 -10.2 -14.2
1比27 -8.2 0.9 -8.9 -1.6 -12.8 -9.7 3 -13
1比9 6.5 10.3 0.3 5 -2.3 -10.9 -0.4 -16.9
1比3 100 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1
3比1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1
E:T比率 13 14 15 16
1比243 -11.6 -21.9 -13.8 -21.2 -9 -16.6 -2.9 -12.6
1比81 -11 -31.6 -20.8 -25 -15.7 -20.6 -6.3 -8
1比27 -13.6 -10.1 -22.3 -4.6 -15.4 -11.1 0.9 3.2
1比9 -6.5 -20.4 -7.1 -7.5 -13.3 -17.6 14.1 17.3
1比3 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100 99.9
3比1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100 100
E:T比率 17 18 19 20
1比243 30.4 32.6 -1.9 -6.4 -2.2 -16 -18.5 -13
1比81 8.7 9.1 -8.1 -5.6 -20.8 -19.4 -31.6 -26.6
1比27 1.5 -3.7 -0.9 -6 -4.1 -7 -15.6 -10.9
1比9 6.5 0 -4.7 -1.4 -0.6 11.7 -22 -4.2
1比3 100.1 100 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100
3比1 100.1 100.5 100.1 100.5 100.1 100.5 100.1 100.5
E:T比率 21 22 23 24
1比243 -11.2 -12.1 -9.4 -32.5 -10.9 -29.1 -17.9 -19.8
1比81 -22.6 -17.9 -20.9 -26.9 -17.6 -24.6 -17.4 -19.2
1比27 -5.1 -8.3 6.1 -7.6 -2.2 -9.4 3.6 -2.6
1比9 -8.6 -2.4 0.4 14.4 22.5 -3.5 19.5 5.3
1比3 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100.1 100 99.9
3比1 100.1 100.5 100.1 100.5 100.1 100.5 100 100.4
表53B
Nalm6 CD19KO 組
E:T比率 1 2 3 4
1比243 -10.2 -10.7 -14.4 -14.8 -7.3 11 -15.8 -14.1
1比81 -8.7 -21.5 -5 -14.6 -5.8 -16.6 -7.8 -12.2
1比27 3.8 -18.2 -2.3 -13.6 -4.7 -21.8 -1 -18.8
1比9 -0.2 -11.2 -3.5 -10.3 -3.8 -13.7 -4.8 -3,6
1比3 39.2 30.5 33.6 19.8 33.2 24.5 33.9 26.7
3比1 56.2 41.9 39.4 32.6 43.8 40.7 38 32.9
E:T比率 5 6 7 8
1比243 -9 -15.4 -8.2 -13.9 -12.9 -11.9 -11.1 -9.2
1比81 6.3 -4.5 -1.9 -9.9 -3.6 -13.4 5.3 5.3
1比27 13.6 16.5 18.8 5.5 10 -0.6 23.1 19.3
1比9 40.5 33.2 45.3 44.7 35.7 20.2 59.2 46.4
1比3 100.1 99.9 100.3 100.1 99.8 99.7 100.1 99.8
3比1 100.9 101.1 101.1 101.2 101.1 101.2 101 101
E:T比率 9 10 11 12
1比243 -6 -8 -6 -11.4 -8.2 -7.6 -7.8 -4.3
1比81 4.4 10.8 -1.5 -0.1 2.3 0.3 8.5 10.4
1比27 -2.7 6.1 12 -5.9 4.5 21.5 38.2 21.7
1比9 32.2 34.6 17.6 14.1 17.3 11.4 30.8 22.7
1比3 100.2 100.8 100.1 100.9 100.2 100.8 100.1 100.8
3比1 101 101.4 101 101.4 101 101.5 101 101.4
E:T比率 13 14 15 16
1比243 -5.3 -7.2 -8.6 5.8 -5.3 18.7 -7.4 8.1
1比81 5 0.5 -2.5 9.6 -1.7 5.8 7.1 13
1比27 13.6 18.6 10.4 40.6 11.9 27.8 27.8 28.2
1比9 8.4 3.1 31.3 20.3 2.2 7.9 32.3 42.4
1比3 98.2 99.8 100.2 100.8 100.1 100.8 100 100.6
3比1 99.6 100.1 101.1 101.4 101.1 101.3 101 101.3
E:T比率 17 18 19 20
1比243 -1.9 -5 -8.5 -12.4 -9 -7.7 -12.7 -14.3
1比81 -5.9 -10.3 -10.6 -10.5 -4.8 -11 -11.2 -15.9
1比27 -5.6 -2.8 1.4 -0.4 16.1 14.8 -0.7 2.4
1比9 21.5 4.9 8.9 3.7 20.6 35.4 1.3 7
1比3 97 94.4 100.2 100 100.3 100.1 100.2 99.3
3比1 99.6 101.3 100.2 101.9 100.2 101.9 100.2 101.9
E:T比率 21 22 23 24
1比243 -5.8 0.2 -4.2 -9.4 7 -12.5 -2 -10.2
1比81 -0.5 -5.4 8.3 -4.3 4.1 -10.1 6.2 2.1
1比27 32.9 13.9 41.7 27.8 34.2 14.4 35.6 26.8
1比9 22.9 32.9 38.3 46 44.5 19.7 43.5 25.5
1比3 100.3 100.1 100.3 100.1 100.2 100 100.2 100
3比1 100.2 101.9 100.2 101.8 100.1 101.7 100 101.7
表53C
Raji WT 組
E:T比率 1 2 3 4
1比243 2.2 -33.8 -12.6 -23 -19.4 -30.3 -8.1 -22.8
1比81 16.3 -29.4 -2.5 -15 -2.8 -16.3 -6.4 -17.7
1比27 -9.2 -48.8 1.6 -33.1 -2 -29.4 2.7 -25.3
1比9 -6.5 -35.9 13.5 -9.7 14 -10.5 11.6 -5.5
1比3 8.9 -17.9 99.8 99.9 99.9 99.9 100.1 100
3比1 19.5 5.9 103.8 100.1 103.9 100.2 103.9 100.2
E:T比率 5 6 7 8
1比243 -11 -21.7 -7.9 -25.1 -6.5 -18.8 -5.1 -14.7
1比81 -4.6 -14.9 -0.5 -19.2 0.4 -2 -0.1 -0.1
1比27 -0.1 -14.1 8.6 -20.6 7.9 -6.6 10.4 -8.8
1比9 13.6 -2.6 16.5 5.1 22.2 -3.3 23.8 -0.5
1比3 100.2 99.9 100.1 100.1 100.1 100 99.9 99.8
3比1 104 100.2 103.9 100.2 103.9 100.1 103.8 100
E:T比率 9 10 11 12
1比243 -30.8 -24.1 -30.9 -12.5 -17.6 -14.4 -23.9 -6.8
1比81 -26.7 -15.7 -9.8 -14.6 -6.9 -6 -6.5 -13.2
1比27 -20.6 -22.8 -6.5 -3.3 -4.1 -4 0.3 2.3
1比9 -7.4 -15.1 -1.5 -14.6 -2.5 -12.8 9.3 -3.7
1比3 104.4 104.6 104.4 104.6 104.4 104.5 104.5 104.5
3比1 108 105.9 108.1 105.9 108.1 105.8 108.1 105.9
E:T比率 13 14 15 16
1比243 -28.5 -8.4 -17.4 -11.5 -11.1 -11 -9.9 -5.6
1比81 -11.4 -7.2 -16.4 -13.8 -9.9 -10.4 4.7 1.7
1比27 1 0.7 -1.6 5.2 6.9 -3.3 10.2 13.5
1比9 3.3 -12 7.7 -11 4 -2.3 14.4 9.9
1比3 104.4 104.6 104.4 104.5 104.4 104.5 104.3 104.4
3比1 108.1 105.9 108 105.9 108 105.8 107.8 105.7
E:T比率 17 18 19 20
1比243 -28.3 -21 -22.1 -16.4 -11.4 -11.8 -10.6 -11.1
1比81 -18.5 -22.7 -14.6 -26.2 -11.4 -34.7 -12.6 -28.9
1比27 -23 -21.7 -14.5 -26.5 8.2 -5.9 -5.3 -14.9
1比9 -9.5 -34.2 -11.2 -39.6 -6.9 -15.5 -17.8 -27.7
1比3 100 100.2 100 100.2 100.1 100.2 100.1 100.2
3比1 101.2 120.1 101.2 120.1 101.2 120.1 101.2 120.1
E:T比率 21 22 23 24
1比243 -7 -4.1 -9.6 -6.3 -8.1 -11.1 -7.5 -1.1
1比81 -5.8 -14.4 -2.6 -19.2 9 -19.9 19.2 -4.6
1比27 5.3 -6.3 -5.1 2.4 4.9 0.7 13.3 5.4
1比9 -6.7 -14.2 -7.4 -6.1 9.6 -16.6 15.3 -9
1比3 100.1 100.2 100.1 100.2 100.1 100.2 99.9 100.1
3比1 101.2 120.1 101.2 120.1 101.2 120.1 101 119.9
表53D
Raji CD19KO 組
E:T比率 1 2 3 4
1比243 51 55 36.7 26.2 -18.2 12.5 -44.9 0
1比81 -0.4 33.7 -85.1 3.4 -143.7 3 -190.3 9.3
1比27 15.3 -0.9 4.5 6.3 -0.5 2.7 4 1.1
1比9 -1.9 3.3 2.9 2 8.4 6.5 1.5 15.2
1比3 34.5 20.9 37.3 20.8 16.3 16 5.5 11.7
3比1 41.3 14.2 14.6 2.1 11.2 19.7 4.6 3.8
E:T比率 5 6 7 8
1比243 -15.1 -3.2 22.8 -1.4 -5.5 0.2 -85.7 -2.4
1比81 -217.9 3.3 -201.5 -2.2 -227.2 -0.9 -210.3 2.5
1比27 -0.6 7 11.8 3.4 1.9 -1.6 1.4 9.5
1比9 8.5 17 22.1 21.5 13.5 12.6 30.9 21
1比3 98.8 99.8 99.4 100.6 91.9 93.5 98.8 99.6
3比1 99.6 99.7 99.8 100.1 99.1 99.6 99.7 99.9
E:T比率 9 10 11 12
1比243 9 11.5 -2.9 10.2 -0.6 2.2 -2.4 17.6
1比81 10.3 17.5 6.6 9.6 8.1 8.5 -2.6 3.2
1比27 15.7 21.5 16 21.2 20.2 32 16.2 22
1比9 25.6 35 38.1 32.2 32.9 27.9 23.7 28.8
1比3 99.7 100.2 99.7 100 99.9 100 99.8 100.1
3比1 99.9 100.9 99.8 100.9 100 101 99.9 101
E:T比率 13 14 15 16
1比243 -1.8 9.8 -3 2.6 5.6 1.9 -7.7 14.5
1比81 -2.8 0.5 -0.4 -2.7 -6.3 -11.5 -3.3 -2.5
1比27 10.5 19.6 -0.8 11.7 -4.4 8.6 8.7 16.7
1比9 14.7 15.7 24.3 22.5 7.3 10.8 15 12.3
1比3 96.1 98.5 97.2 99.7 95.3 97 92.3 97.7
3比1 96.2 96.2 98.4 98.7 97.5 97.5 96.1 95.7
E:T比率 17 18 19 20
1比243 7.6 20.4 5.1 6.1 -0.1 8.8 4.6 11.8
1比81 9.7 13.2 11.1 11.8 8.9 13.2 3 6.8
1比27 18.1 10.1 29.9 18.7 24.4 21.3 13.8 15.8
1比9 44.9 19.3 37 26.8 33.6 32.3 24.1 16
1比3 87.9 84.7 99.7 99.1 98.7 97.5 93.8 92.5
3比1 95 96.5 99.7 100 99.7 99.9 96.1 95
E:T比率 21 22 23 24
1比243 -5.9 6.6 2.9 -9.9 2.7 -2.6 -4.3 -3.4
1比81 11.5 -5.2 10.7 -0.3 8 -3.2 7.3 0.4
1比27 26 20.7 21.9 16.7 22.1 14.1 31.7 20.6
1比9 18.6 28.9 21.2 25.8 32.1 9.2 28.7 19.7
1比3 100.4 100.2 100.4 100.1 100.4 100.2 100.2 100
3比1 100 100.1 100 100.1 100 100.1 99.8 100
表54A
Figure 02_image001
表54B
Figure 02_image003
表54C
Figure 02_image005
表54D
Figure 02_image007
表55A
Figure 02_image009
表55B
Figure 02_image011
表55C
Figure 02_image013
表55D
Figure 02_image015
表56
   Raji親本 Raji CD19KO Nalm6 CD19KO Nalm6親本
組 複本1 複本2 複本1 複本2 複本1 複本2 複本1 複本2
1 64.5 65.1 61.8 60.6 55.6 50.6 32.8 35.8
2 92 88.5 57.5 56.6 43.6 46.6 90.4 72.1
3 84.1 84.6 58.3 59.8 43.4 50.3 87.1 83.9
4 91.8 90.4 63.5 59.9 44.3 47.6 91 89.7
5 77 69.1 78.6 78.4 64.7 70.7 90 88.7
6 89.2 87.2 91.5 88.6 89.3 86.6 91.9 89.5
7 87.2 83 88.8 86.4 84 82 91.7 90.2
8 92.6 77.4 90.4 81.8 89.1 80.2 87.4 86.4
9 92.8 89.6 92.5 92.8 87 87.5 91.6 92.6
10 84.6 87.6 88.9 90.1 81.4 81.9 90.6 90.4
11 85.1 77.7 87.2 87.8 78.1 79.9 87 86.6
12 83.4 88.9 92 91.4 84.1 83.7 90.6 88.5
13 88 81.8 80.4 78.2 65.2 66.6 89.1 88.5
14 81 74.4 81.4 80.6 77.3 76.8 88.5 89.2
15 74.8 72.5 81 81 75.9 77.5 85.5 84.2
16 91.8 91.6 87.9 88.1 81.7 81.4 92.4 92.1
17 83.3 84.3 77.6 80.7 62.2 62.9 88.1 86.8
18 70.2 76.4 82 83.4 74.5 78.1 85.6 108
19 81.8 85.6 88.9 89.6 82.4 82.7 88 90.4
20 77.5 81.2 83.6 84.4 78.1 79.6 88.1 88.5
21 80.1 86.8 90.5 90.2 85.3 84.6 90.9 91.9
22 82.6 77.9 88.5 88.4 83.7 83.7 90.3 89.7
23 75.8 71.2 86.8 85.7 79.2 80.1 84.6 89.4
24 84.6 84.9 89.7 89.7 82.6 84.2 89.7 89.5
實例17
在抗CD20單價CAR中進行鉸鏈之比較。使用以上實例中所闡述之方法獲得呈現於此實例中之資料。用於此實例中之CAR-T細胞包含以下表57中鑑別之CAR。表57提供此實例之後續表中所提及之實驗條件或組。該實例利用在此實例中鑑別為結合模體A、結合模體B、結合模體C及結合模體D之四個抗CD20結合模體。所測試之鉸鏈包含截短CD28鉸鏈(28T)、CD8鉸鏈(8k)及IgG4鉸鏈(I4)。
轉導效率展示於表58中。Raji (CD19+, CD20高)、Raji CD20KO (CD19+, CD20-)、Namalwa (CD19+, CD20低)及Nalm6 (CD19+, CD20低)中之第4天細胞毒性展示於表59及60中。在1:1之E:T比率下共培養後14h之細胞介素產生展示於表61A-D中。在共培養16小時後藉由41BB之上調所量測之T細胞活化分別在表62及63中以E:T為1:1或1:4顯示。在共培養物之後4d處T細胞之增殖分別展示在表64及65中以E:T為1:1或1:4。 表57
   類型(例如雙順反子對雙特異性)
1 未經轉導之對照
2 包含scFv#A及CD28鉸鏈之單價抗CD20 CAR
3 包含結合模體#A及CD8鉸鏈之單價抗CD20 CAR
4 包含結合模體#A及IgG4鉸鏈之單價抗CD20 CAR
5 包含結合模體#B及CD28鉸鏈之單價抗CD20 CAR
6 包含結合模體#B及CD8鉸鏈之單價抗CD20 CAR
7 包含結合模體#B及IgG4鉸鏈之單價抗CD20 CAR
8 包含結合模體#C及CD28鉸鏈之單價抗CD20 CAR
9 包含結合模體#C及CD8鉸鏈之單價抗CD20 CAR
10 包含結合模體#C及IgG4鉸鏈之單價抗CD20 CAR
11 包含結合模體#D及CD28鉸鏈之單價抗CD20 CAR
12 包含結合模體#D及CD8鉸鏈之單價抗CD20 CAR
13 包含結合模體#D及IgG4鉸鏈之單價抗CD20 CAR
表58
組 轉導效率(CAR+%)
1 0.15
2 62.3
3 56.3
4 89.2
5 51.6
6 66.5
7 71.6
8 73.9
9 77.0
10 85.4
11 66.8
12 80.8
13 84.8
表59
Figure 02_image017
表60
Figure 02_image019
表61A
Figure 02_image021
表61B
Figure 02_image023
表61C
Figure 02_image025
表61D
Figure 02_image027
表62
Figure 02_image029
表63
Figure 02_image031
表64
Figure 02_image033
表65
Figure 02_image035
實例18 表66：例示性結合模體序列
SEQ ID NO 表之VH/VL： 序列
251 表4 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTGCAGCAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCAGCGGCTATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGAAAAGGATTAGAATGGATCGGCGAGATAGACCACAGCGGGAGCACAAACTACAACCCCAGCCTGAAATCGCGGGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGGCGGAGGCTCCTGGTACAGCAACTGGTTCGATCCTTGGGGCCAAGGCACCATGGTGACCGTTTCCAGCGGCTCTACAAGCGGCAGCGGGAAACCTGGTTCTGGAGAGGGCAGCACAAAGGGCGACATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCACCCTTAGCGCCTCTGTGGGAGATAGGGTTACCATTACCTGCAGGGCTTCCCAGAGCATCAGCAGCTGGCTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTCATCTATGACGCCTCCAGCCTGGAAAGCGGGGTTCCCTCCAGATTTAGCGGCTCAGGCTCCGGAACAGAGTTCACCCTTACCATCTCTAGCCTGCAACCCGACGACTTCGCTACTTATTACTGTCAACAAGACAGAAGCTTGCCCCCCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAG
252 表5 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTGCAGCAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCAGCGGCATCCACTGGAACTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGATCGGCGATATCGACACCAGCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCGAGGGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGACTGGGCCAGGAAAGCGCTACCTACCTTGGCATGGATGTGTGGGGGCAGGGCACCACCGTTACTGTTAGCTCTGGCTCAACAAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACAAAGGGCGACATTGTAATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTTAGCTTAGGCGAAAGGGCTACAATCAATTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTCGCATGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCTTCCACCAGAGAGAGCGGGGTTCCCGATAGATTCTCCGGCTCCGGTTCTGGAACAGATTTCACGCTCACAATCAGCAGCTTACAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTACTATTGTCAGCAGTTGTACACCTACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAG
253 表6 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGCTTCAGCTCCAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCAGCTCCAGCTATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTAGAATGGATCGGCTCGATATATTACTCCGGCAGCACCTACTATAACCCCAGCTTGAAGAGCCGGGTTACCATTTCTGTGGACACATCAAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGCATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGTTCCACCAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGATATACAGATGACACAGAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATCGTGTAACGATCACCTGCCGGGCCTCTCAGAGCATCAACTCCTACCTCAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAATTACTCATCTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCTCCGGTTCTGGAACAGATTTCACCCTCACTATCTCCAGCTTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACTTATTACTGTCAGCAGAGCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAG
254 表7 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGCTTGTGCAGAGCGGAGCTGAAGTTAAGAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGGTTAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACATTCAAGGAATATGGCATCTCCTGGGTTAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCTTAGAATGGATGGGCTGGATCTCCGCCTACTCCGGCCACACCTACTACGCCCAGAAGCTTCAGGGCAGGGTTACCATGACCACCGACACCAGCACCTCTACCGCCTATATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCGGACGACACAGCTGTGTATTACTGCGCCAGAGGCCCCCACTACGACGACTGGTCTGGATTTATCATCTGGTTCGACCCCTGGGGGCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTGGCTCCACCAGCGGAAGCGGCAAGCCAGGCTCAGGCGAAGGATCTACAAAAGGCGACATCCAAATGACACAGAGCCCCAGCAGCTTGAGCGCCTCCGTTGGCGACAGAGTTACAATCACCTGCAGGGCCTCTCAGAGCATCAGCAGCTATTTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTCATCTACGCTGCCAGCTCGCTCCAATCTGGCGTTCCTAGCAGATTTAGCGGCTCCGGCAGCGGCACAGACTTTACTCTTACCATTAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCTACCTACTATTGCCAGCAAAGCTACAGATTCCCTCCCACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTTGAGATCAAG
255 表8 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCTCTCCCGACCATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTGGAATGGATCGGCAGCATCTACGCCAGCGGCAGCACATTCTACAACCCCTCGCTCAAAAGCAGGGTTACTATTTCTGTGGACACAAGCAAAAATCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGGATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGCTCCACAAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGACATTCAAATGACCCAAAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATAGGGTTACCATTACCTGCAGGGCCAGCCAAAGCATCAACTCCTACCTAAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAACTACTCATTTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCAGCGGTTCTGGAACAGATTTCACTCTCACAATATCTTCGCTGCAGCCCGAGGATTTCGCTACCTACTATTGCCAGCAATCCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAG
256 表9 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGATCACATTAAAAGAGAGCGGACCTACACTGGTGAAGCCCACCCAAACGCTTACCCTCACCTGCACCTTTAGCGGGTTCAGCCTGGACACAGAGGGCGTTGGCGTTGGATGGATCAGGCAGCCTCCTGGCAAAGCCCTCGAATGGCTTGCCCTCATCTACTTCAACGACCAGAAGAGATACAGCCCCTCCTTAAAATCTCGGCTCACAATCACCAAAGACACAAGCAAAAATCAGGTTGTGCTCACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACCGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGACACCGGCTACAGCAGATGGTACTACGGGATGGACGTTTGGGGCCAAGGCACCACTGTGACCGTTTCCAGCGGCTCTACAAGCGGCAGCGGGAAACCTGGTTCTGGAGAGGGCAGCACAAAGGGCGACATCCAGATGACGCAATCCCCCAGCTCTGTGAGCGCCTCTGTGGGAGACAGAGTTACAATCACATGCCGGGCCTCCCAGGGCATCAGCTCTTGGCTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTCATCTATGCCGCCTCCTCCTTACAATCTGGAGTTCCCTCCAGGTTCAGCGGGAGCGGCTCAGGAACAGACTTCACCCTTACCATCTCTAGCCTGCAACCCGAGGACTTCGCTACTTATTACTGTCAGCAGGCCTACGCCTACCCCATCACATTCGGCGGAGGAACAAAGGTTGAGATCAAG
257 表10 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTGCAGCAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCGAGAAATACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCCGGCAAAGGCTTAGAATGGATCGGCGAGATTTATCACAGCGGGCTCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCTCGAGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGTTAGATACGACAGCAGCGACAGCTATTACTACAGCTATGACTACGGCATGGATGTGTGGGGGCAGGGCACCACCGTTACTGTCTCCTCTGGATCTACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGATCTGGCGAAGGAAGCACAAAGGGCGACATTGTGCTCACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCTGTGTCTTTAGGCGAAAGGGCTACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTTGCTTGGTATCAACAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCTAGCAGAGAGAGCGGGGTTCCCGATCGGTTTAGCGGCTCCGGCTCAGGAACCGATTTCACCCTCACTATCTCCAGCCTCCAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTACTATTGTCAGCAGAGCTATAGCTTCCCCTGGACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAG
258 表11 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAACAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCAGCCGCTATGTGTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGATCGGAGAGATAGACAGCAGCGGCAAGACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCACGCGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGTTAGATACGACAGCTCCGACAGCTATTACTACAGCTATGACTACGGCATGGATGTGTGGGGGCAGGGCACCACCGTTACAGTTAGCTCTGGAAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGATCTGGTGAAGGAAGCACAAAGGGCGACATTGTGCTCACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCTGTGTCTTTAGGCGAAAGGGCTACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTTGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCTAGCAGAGAGAGCGGGGTTCCCGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACTCTTACAATCAGCAGCTTACAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTACTATTGTCAGCAGAGCTATAGCTTCCCCTGGACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAG
259 表12 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAACAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCAGCGGCTACGCTTGGAGCTGGATTAGACAGCCTCCTGGCAAAGGACTAGAATGGATCGGAGAGATCGACCACAGAGGCTTCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCCAGAGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGGGTTAGATACGACAGCAGCGACAGCTATTACTACAGCTATGACTACGGCATGGATGTGTGGGGGCAGGGCACCACCGTTACGGTTAGCTCTGGATCTACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACAAAGGGCGACATTGTGCTCACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTTTCTTTAGGCGAAAGGGCTACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTTGCATGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCTAGCAGAGAGAGCGGGGTTCCCGATAGATTTTCGGGATCAGGCTCCGGCACCGATTTCACTCTTACGATCAGCAGCTTACAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTACTATTGTCAGCAGAGCTATAGCTTCCCCTGGACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAG
260 表13 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAACAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCCAGAAATACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCCGGCAAAGGCTTAGAATGGATCGGAGAGATAGACACCAGCGGCTTCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCTAGGGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGTTGGCAGATACAGCTACGGCTACTACATCACCGCCTTCGACATTTGGGGCCAAGGCACCACTGTGACCGTTTCCAGCGGAAGCACTAGCGGCAGCGGGAAACCTGGTTCTGGAGAGGGCTCAACCAAGGGCGACATCGTGATGACACAGAGCCCCGACTCTCTGGCTGTGTCCCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCTTCCACCAGAGAATCAGGCGTTCCAGACAGGTTCTCCGGCTCGGGTTCAGGCACAGACTTCACCCTTACCATCTCTTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCCGTTTACTACTGTCAGCAGCACTACAGCTTCCCTTTCACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAG
實例19 表67：例示性鉸鏈序列
SEQ ID NO 鉸鏈 序列
261 C8K GCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAAC
262 C28T GCTGCTGCATTGGATAATGAAAAATCGAACGGCACAATCATTCATGTGAAGGGCAAACACCTGTGTCCCAGCCCCTTGTTCCCAGGACCTAGCAAGCCTTTTTGGGTTCTCGTGGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCTTGCTACTCTCTACTTGTAACTGTCGCATTTATTATATTCTGGGTT
263 C28T1x GGAGGAGGAGGATCTCTGGATAACGAGAAAAGCAACGGGACCATCATTCATGTGAAGGGAAAACATCTGTGTCCCAGCCCCTTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCGTTTTGGGTTCTCGTGGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCTTGCTACTCTCTGCTTGTGACCGTTGCCTTCATTATCTTCTGGGTT
264 C28T2x GGAGGAGGAGGATCTGGTGGAGGAGGTTCTCTGGACAATGAGAAATCAAATGGAACGATCATCCATGTGAAGGGGAAGCACCTCTGCCCCTCTCCCCTGTTTCCTGGTCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTTTTGGTGGTCGTGGGCGGCGTTCTGGCTTGCTACAGCCTGTTAGTGACCGTTGCATTTATCATATTTTGGGTT
265 C28T2x_NC GGAGGAGGAGGATCTGGTGGAGGAGGTTCTCTGGACAATGAGAAATCGAATGGGACAATCATCCATGTGAAGGGGAAGCACCTGAGCCCCTCTCCCCTGTTTCCTGGTCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTTTTGGTGGTCGTGGGCGGCGTTCTGGCCGTTTACAGCCTGTTAGTGACCGTTGCTTTTATCATATTTTGGGTT
266 C28T2x_NG GGAGGAGGAGGATCTGGTGGAGGAGGTTCTCTGGACAATGAAAAGAGCAATGGCACAATCATCCATGTGAAGGGGAAGCACCTGAACGGCTCCGCCCTGTTTCCTGGTCCTAGCAAGCCATTTTGGGTTCTCGTGGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCCGTTTACAGCCTGTTAGTGACCGTTGCGTTCATAATCTTCTGGGTT
267 C28T3x GGAGGAGGAGGATCTGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGAGGCGGCTCTCTCGACAACGAAAAGAGCAATGGCACCATTATTCACGTTAAAGGCAAGCATCTGTGCCCCTCCCCCCTGTTCCCCGGACCTTCAAAACCTTTTTGGGTTCTCGTGGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCCTGCTATTCTTTGCTGGTAACTGTAGCCTTCATTATCTTCTGGGTT
268 I4 GAGAGCAAGTACGGACCTCCTTGTCCTCCATGTCCTGCTCCCGAGTTCGAGGGCGGACCTTCAGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAACCCAAGGATACTCTTATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTCACCTGTGTGGTGGTAGATGTTAGCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTCGACGGCGTCGAGGTACACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTCCAGTCCACCTATAGGGTCGTGAGCGTGCTTACCGTGCTGCACCAGGACTGGTTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTCCCCAGCAGCATCGAGAAGACCATTAGCAAGGCAAAGGGACAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACATTACCTCCTTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCGCTTACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATTGCAGTTGAATGGGAGTCAAACGGCCAGCCGGAGAACAATTACAAGACCACCCCCCCAGTCTTGGACAGCGACGGCTCTTTCTTCCTCTACTCGCGGCTTACTGTAGATAAAAGTCGTTGGCAGGAGGGAAACGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTCCATAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGCAAGATGTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGCGGAGTTCTTGCTTGCTACTCCCTGCTCGTGACCGTCGCTTTCATTATATTCTGGGTC
269 I1-2 GAGAGAAAGTGTTGTGTTGAGTGTCCTCCTTGTCCTCCCTGCCCTGCTCCCGAGTTACTTGGCGGACCTTCAGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGATACTCTCATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTCACCTGTGTGGTGGTAGATGTTAGCCACGAGGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTCGACGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGTGAAGAACAGTACCAGTCCACCTACAGAGTTGTGAGCGTGCTTACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTCCCCGCTCCCATCGAGAAGACAATCAGCAAGGCCAAGCCCTGTCCAGCCCCTGAGCTCTTAGGAGGACCTAGCGTTTTCCTTTTCCCTCCCAAGCCTAAGGACACTCTTATGATCTCCAGAACACCAGAGGTTACCTGCGTCGTGGTGGACGTGTCCCATGAGGACCCAGAAGTCAAATTCAATTGGTATGTAGATGGGGTCGAGGTCCACAACGCTAAGACAAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACTCTACCTACAGGGTCGTGTCCGTGCTCACAGTGCTGCATCAGGATTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAAGTGTCCAATAAGGCCCTTCCCGCCCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAATTCTGGGTGCTGGTGGTTGTGGGCGGCGTGCTTGCTTGTTACTCCCTGCTGGTCACTGTAGCTTTCATCATATTTTGGGTG
實例20 表68：編碼結合模體、鉸鏈及41BB協同刺激域之例示性核苷酸序列
SEQ ID NO 序列
271 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGCTTCAGCTCCAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCAGCTCCAGCTATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTAGAATGGATCGGCTCGATATATTACTCCGGCAGCACCTACTATAACCCCAGCTTGAAGAGCCGGGTTACCATTTCTGTGGACACATCAAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGCATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGTTCCACCAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGATATACAGATGACACAGAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATCGTGTAACGATCACCTGCCGGGCCTCTCAGAGCATCAACTCCTACCTCAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAATTACTCATCTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCTCCGGTTCTGGAACAGATTTCACCCTCACTATCTCCAGCTTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACTTATTACTGTCAGCAGAGCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
272 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCTCTCCCGACCATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTGGAATGGATCGGCAGCATCTACGCCAGCGGCAGCACATTCTACAACCCCTCGCTCAAAAGCAGGGTTACTATTTCTGTGGACACAAGCAAAAATCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGGATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGCTCCACAAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGACATTCAAATGACCCAAAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATAGGGTTACCATTACCTGCAGGGCCAGCCAAAGCATCAACTCCTACCTAAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAACTACTCATTTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCAGCGGTTCTGGAACAGATTTCACTCTCACAATATCTTCGCTGCAGCCCGAGGATTTCGCTACCTACTATTGCCAGCAATCCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
273 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGATCACATTAAAAGAGAGCGGACCTACACTGGTGAAGCCCACCCAAACGCTTACCCTCACCTGCACCTTTAGCGGGTTCAGCCTGGACACAGAGGGCGTTGGCGTTGGATGGATCAGGCAGCCTCCTGGCAAAGCCCTCGAATGGCTTGCCCTCATCTACTTCAACGACCAGAAGAGATACAGCCCCTCCTTAAAATCTCGGCTCACAATCACCAAAGACACAAGCAAAAATCAGGTTGTGCTCACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACCGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGACACCGGCTACAGCAGATGGTACTACGGGATGGACGTTTGGGGCCAAGGCACCACTGTGACCGTTTCCAGCGGCTCTACAAGCGGCAGCGGGAAACCTGGTTCTGGAGAGGGCAGCACAAAGGGCGACATCCAGATGACGCAATCCCCCAGCTCTGTGAGCGCCTCTGTGGGAGACAGAGTTACAATCACATGCCGGGCCTCCCAGGGCATCAGCTCTTGGCTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTCATCTATGCCGCCTCCTCCTTACAATCTGGAGTTCCCTCCAGGTTCAGCGGGAGCGGCTCAGGAACAGACTTCACCCTTACCATCTCTAGCCTGCAACCCGAGGACTTCGCTACTTATTACTGTCAGCAGGCCTACGCCTACCCCATCACATTCGGCGGAGGAACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
274 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAACAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCCAGAAATACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCCGGCAAAGGCTTAGAATGGATCGGAGAGATAGACACCAGCGGCTTCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCTAGGGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGTTGGCAGATACAGCTACGGCTACTACATCACCGCCTTCGACATTTGGGGCCAAGGCACCACTGTGACCGTTTCCAGCGGAAGCACTAGCGGCAGCGGGAAACCTGGTTCTGGAGAGGGCTCAACCAAGGGCGACATCGTGATGACACAGAGCCCCGACTCTCTGGCTGTGTCCCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCTTCCACCAGAGAATCAGGCGTTCCAGACAGGTTCTCCGGCTCGGGTTCAGGCACAGACTTCACCCTTACCATCTCTTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCCGTTTACTACTGTCAGCAGCACTACAGCTTCCCTTTCACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
275 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTGCAGCAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCGAGAAATACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCCGGCAAAGGCTTAGAATGGATCGGCGAGATTTATCACAGCGGGCTCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCTCGAGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGTTAGATACGACAGCAGCGACAGCTATTACTACAGCTATGACTACGGCATGGATGTGTGGGGGCAGGGCACCACCGTTACTGTCTCCTCTGGATCTACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGATCTGGCGAAGGAAGCACAAAGGGCGACATTGTGCTCACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCTGTGTCTTTAGGCGAAAGGGCTACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTTGCTTGGTATCAACAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCTAGCAGAGAGAGCGGGGTTCCCGATCGGTTTAGCGGCTCCGGCTCAGGAACCGATTTCACCCTCACTATCTCCAGCCTCCAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTACTATTGTCAGCAGAGCTATAGCTTCCCCTGGACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
276 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAACAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCAGCCGCTATGTGTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGATCGGAGAGATAGACAGCAGCGGCAAGACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCACGCGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGTTAGATACGACAGCTCCGACAGCTATTACTACAGCTATGACTACGGCATGGATGTGTGGGGGCAGGGCACCACCGTTACAGTTAGCTCTGGAAGCACCAGCGGCTCCGGCAAGCCTGGATCTGGTGAAGGAAGCACAAAGGGCGACATTGTGCTCACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCTGTGTCTTTAGGCGAAAGGGCTACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTTGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCTAGCAGAGAGAGCGGGGTTCCCGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACTCTTACAATCAGCAGCTTACAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTACTATTGTCAGCAGAGCTATAGCTTCCCCTGGACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
277 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAACAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCAGCGGCTACGCTTGGAGCTGGATTAGACAGCCTCCTGGCAAAGGACTAGAATGGATCGGAGAGATCGACCACAGAGGCTTCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCCAGAGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGGGTTAGATACGACAGCAGCGACAGCTATTACTACAGCTATGACTACGGCATGGATGTGTGGGGGCAGGGCACCACCGTTACGGTTAGCTCTGGATCTACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACAAAGGGCGACATTGTGCTCACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTTTCTTTAGGCGAAAGGGCTACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTTGCATGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCTAGCAGAGAGAGCGGGGTTCCCGATAGATTTTCGGGATCAGGCTCCGGCACCGATTTCACTCTTACGATCAGCAGCTTACAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTACTATTGTCAGCAGAGCTATAGCTTCCCCTGGACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
278 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTGCAGCAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCAGCGGCTATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGAAAAGGATTAGAATGGATCGGCGAGATAGACCACAGCGGGAGCACAAACTACAACCCCAGCCTGAAATCGCGGGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGGCGGAGGCTCCTGGTACAGCAACTGGTTCGATCCTTGGGGCCAAGGCACCATGGTGACCGTTTCCAGCGGCTCTACAAGCGGCAGCGGGAAACCTGGTTCTGGAGAGGGCAGCACAAAGGGCGACATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCACCCTTAGCGCCTCTGTGGGAGATAGGGTTACCATTACCTGCAGGGCTTCCCAGAGCATCAGCAGCTGGCTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTCATCTATGACGCCTCCAGCCTGGAAAGCGGGGTTCCCTCCAGATTTAGCGGCTCAGGCTCCGGAACAGAGTTCACCCTTACCATCTCTAGCCTGCAACCCGACGACTTCGCTACTTATTACTGTCAACAAGACAGAAGCTTGCCCCCCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
279 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGCTTGTGCAGAGCGGAGCTGAAGTTAAGAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGGTTAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACATTCAAGGAATATGGCATCTCCTGGGTTAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCTTAGAATGGATGGGCTGGATCTCCGCCTACTCCGGCCACACCTACTACGCCCAGAAGCTTCAGGGCAGGGTTACCATGACCACCGACACCAGCACCTCTACCGCCTATATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCGGACGACACAGCTGTGTATTACTGCGCCAGAGGCCCCCACTACGACGACTGGTCTGGATTTATCATCTGGTTCGACCCCTGGGGGCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTGGCTCCACCAGCGGAAGCGGCAAGCCAGGCTCAGGCGAAGGATCTACAAAAGGCGACATCCAAATGACACAGAGCCCCAGCAGCTTGAGCGCCTCCGTTGGCGACAGAGTTACAATCACCTGCAGGGCCTCTCAGAGCATCAGCAGCTATTTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTCATCTACGCTGCCAGCTCGCTCCAATCTGGCGTTCCTAGCAGATTTAGCGGCTCCGGCAGCGGCACAGACTTTACTCTTACCATTAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCTACCTACTATTGCCAGCAAAGCTACAGATTCCCTCCCACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
280 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTGCAGCAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCAGCGGCATCCACTGGAACTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGATCGGCGATATCGACACCAGCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCGAGGGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGACTGGGCCAGGAAAGCGCTACCTACCTTGGCATGGATGTGTGGGGGCAGGGCACCACCGTTACTGTTAGCTCTGGCTCAACAAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACAAAGGGCGACATTGTAATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTTAGCTTAGGCGAAAGGGCTACAATCAATTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTCGCATGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCTTCCACCAGAGAGAGCGGGGTTCCCGATAGATTCTCCGGCTCCGGTTCTGGAACAGATTTCACGCTCACAATCAGCAGCTTACAGGCCGAGGATGTGGCTGTCTACTATTGTCAGCAGTTGTACACCTACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
281 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGCTTCAGCTCCAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCAGCTCCAGCTATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTAGAATGGATCGGCTCGATATATTACTCCGGCAGCACCTACTATAACCCCAGCTTGAAGAGCCGGGTTACCATTTCTGTGGACACATCAAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGCATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGTTCCACCAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGATATACAGATGACACAGAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATCGTGTAACGATCACCTGCCGGGCCTCTCAGAGCATCAACTCCTACCTCAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAATTACTCATCTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCTCCGGTTCTGGAACAGATTTCACCCTCACTATCTCCAGCTTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACTTATTACTGTCAGCAGAGCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCTGCTGCATTGGATAATGAAAAATCGAACGGCACAATCATTCATGTGAAGGGCAAACACCTGTGTCCCAGCCCCTTGTTCCCAGGACCTAGCAAGCCTTTTTGGGTTCTCGTGGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCTTGCTACTCTCTACTTGTAACTGTCGCATTTATTATATTCTGGGTTAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
282 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCTCTCCCGACCATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTGGAATGGATCGGCAGCATCTACGCCAGCGGCAGCACATTCTACAACCCCTCGCTCAAAAGCAGGGTTACTATTTCTGTGGACACAAGCAAAAATCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGGATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGCTCCACAAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGACATTCAAATGACCCAAAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATAGGGTTACCATTACCTGCAGGGCCAGCCAAAGCATCAACTCCTACCTAAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAACTACTCATTTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCAGCGGTTCTGGAACAGATTTCACTCTCACAATATCTTCGCTGCAGCCCGAGGATTTCGCTACCTACTATTGCCAGCAATCCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCTGCTGCATTGGATAATGAAAAATCGAACGGCACAATCATTCATGTGAAGGGCAAACACCTGTGTCCCAGCCCCTTGTTCCCAGGACCTAGCAAGCCTTTTTGGGTTCTCGTGGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCTTGCTACTCTCTACTTGTAACTGTCGCATTTATTATATTCTGGGTTAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
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271 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGCTTCAGCTCCAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCAGCTCCAGCTATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTAGAATGGATCGGCTCGATATATTACTCCGGCAGCACCTACTATAACCCCAGCTTGAAGAGCCGGGTTACCATTTCTGTGGACACATCAAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGCATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGTTCCACCAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGATATACAGATGACACAGAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATCGTGTAACGATCACCTGCCGGGCCTCTCAGAGCATCAACTCCTACCTCAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAATTACTCATCTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCTCCGGTTCTGGAACAGATTTCACCCTCACTATCTCCAGCTTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACTTATTACTGTCAGCAGAGCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
272 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCTCTCCCGACCATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTGGAATGGATCGGCAGCATCTACGCCAGCGGCAGCACATTCTACAACCCCTCGCTCAAAAGCAGGGTTACTATTTCTGTGGACACAAGCAAAAATCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGGATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGCTCCACAAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGACATTCAAATGACCCAAAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATAGGGTTACCATTACCTGCAGGGCCAGCCAAAGCATCAACTCCTACCTAAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAACTACTCATTTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCAGCGGTTCTGGAACAGATTTCACTCTCACAATATCTTCGCTGCAGCCCGAGGATTTCGCTACCTACTATTGCCAGCAATCCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
273 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGATCACATTAAAAGAGAGCGGACCTACACTGGTGAAGCCCACCCAAACGCTTACCCTCACCTGCACCTTTAGCGGGTTCAGCCTGGACACAGAGGGCGTTGGCGTTGGATGGATCAGGCAGCCTCCTGGCAAAGCCCTCGAATGGCTTGCCCTCATCTACTTCAACGACCAGAAGAGATACAGCCCCTCCTTAAAATCTCGGCTCACAATCACCAAAGACACAAGCAAAAATCAGGTTGTGCTCACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACCGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGACACCGGCTACAGCAGATGGTACTACGGGATGGACGTTTGGGGCCAAGGCACCACTGTGACCGTTTCCAGCGGCTCTACAAGCGGCAGCGGGAAACCTGGTTCTGGAGAGGGCAGCACAAAGGGCGACATCCAGATGACGCAATCCCCCAGCTCTGTGAGCGCCTCTGTGGGAGACAGAGTTACAATCACATGCCGGGCCTCCCAGGGCATCAGCTCTTGGCTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTCATCTATGCCGCCTCCTCCTTACAATCTGGAGTTCCCTCCAGGTTCAGCGGGAGCGGCTCAGGAACAGACTTCACCCTTACCATCTCTAGCCTGCAACCCGAGGACTTCGCTACTTATTACTGTCAGCAGGCCTACGCCTACCCCATCACATTCGGCGGAGGAACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
274 ggtaccCCCGGgCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTTCAGTTACAACAATGGGGAGCTGGCCTGTTAAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTATGGCGGAAGCTTCCAGAAATACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCCGGCAAAGGCTTAGAATGGATCGGAGAGATAGACACCAGCGGCTTCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAATCTAGGGTTACAATCTCTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTTACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGTTGGCAGATACAGCTACGGCTACTACATCACCGCCTTCGACATTTGGGGCCAAGGCACCACTGTGACCGTTTCCAGCGGAAGCACTAGCGGCAGCGGGAAACCTGGTTCTGGAGAGGGCTCAACCAAGGGCGACATCGTGATGACACAGAGCCCCGACTCTCTGGCTGTGTCCCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTTCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCTTCCACCAGAGAATCAGGCGTTCCAGACAGGTTCTCCGGCTCGGGTTCAGGCACAGACTTCACCCTTACCATCTCTTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCCGTTTACTACTGTCAGCAGCACTACAGCTTCCCTTTCACATTCGGCGGAGGCACCAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGATTAATTAAatcgat
實例21 表69：SEQ ID NO:291及292中所闡述之例示性抗CD20/抗CD19雙順反子CAR核苷酸及胺基酸序列。
SEQ ID NO: 291 ATGCTGCTGCTGGTGACATCTCTGCTGCTTTGCGAGCTGCCCCACCCTGCCTTCCTGCTTATCCCCGACATTCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCTTAGGAGATAGAGTTACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAATACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACTGTGAAACTGCTTATTTACCACACCTCCAGACTGCACAGCGGCGTTCCCAGCAGATTCTCTGGCAGCGGATCTGGAACCGACTACAGCCTCACCATCTCCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCCTACACCTTCGGAGGAGGAACCAAGCTGGAGATCACCGGGGGAGGAGGCTCTGGAGGCGGCGGATCAGGAGGAGGGGGATCTGAGGTTAAGCTGCAGGAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCTCCTAGCCAATCTTTATCTGTGACCTGCACTGTGTCCGGCGTTAGCCTGCCCGATTATGGCGTTTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTTATCTGGGGCAGCGAGACCACATACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGACTTACGATTATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTTTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCTAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACAAGCGTTACCGTTAGCAGCGCTGCTGCACTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTTAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGACCTTCTAAGCCTTTCTGGGTTCTGGTGGTGGTCGGCGGCGTTTTAGCCTGTTACAGCCTTCTGGTGACTGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTTAGAAGCAAGAGAAGCAGACTGCTCCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCTGGCCCCACCAGAAAGCATTACCAGCCCTACGCTCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGGAGCAGAGTTAAATTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCCGCTTACCAACAGGGACAAAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTGGGGAGAAGAGAAGAATACGACGTTCTGGATAAGAGAAGGGGCAGAGATCCCGAAATGGGGGGCAAGCCCAGACGCAAGAACCCTCAGGAGGGGCTTTACAACGAACTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCGGAGATTGGGATGAAGGGGGAGAGAAGGCGGGGCAAGGGACACGATGGCTTATACCAGGGGCTGAGCACCGCCACCAAGGACACATACGACGCTCTTCATATGCAGGCTCTGCCCCCAAGAAGGGCTAAGAGATCTGGCTCTGGCGAGGGCAGAGGCAGCTTGCTTACATGTGGCGATGTGGAGGAGAACCCCGGGCCCATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGCTTCAGCTCCAAGAGAGCGGACCTGGCTTAGTGAAGCCCAGCGAAACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTTTCTGGCGGAAGCATCAGCAGCTCCAGCTATTACTGGGGATGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGTTTAGAATGGATCGGCTCGATATATTACTCCGGCAGCACCTACTATAACCCCAGCTTGAAGAGCCGGGTTACCATTTCTGTGGACACATCAAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGAGACAGACTACTCCAGCGGCATGGGCTACGGCATGGATGTGTGGGGACAAGGAACCACCGTTACTGTGAGCAGCGGTTCCACCAGCGGCTCAGGCAAGCCTGGCTCAGGAGAAGGAAGCACCAAGGGGGATATACAGATGACACAGAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTTGGCGATCGTGTAACGATCACCTGCCGGGCCTCTCAGAGCATCAACTCCTACCTCAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAATTACTCATCTACGCCGCCAGCAGCTTACAGAGCGGGGTTCCCTCTAGATTCTCCGGCTCCGGTTCTGGAACAGATTTCACCCTCACTATCTCCAGCTTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACTTATTACTGTCAGCAGAGCCTGGCCGACCCCTTCACATTCGGCGGAGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGA   
SEQ ID NO: 292 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAALDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIKAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
實例22 表70：例示性抗CD20/抗CD19雙特異性CAR及其組分
   SEQ ID NO: 序列
雙特異性CAR(nt序列) 293 ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAACAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGCCAGCAAAGCCTCGCCGACCCTTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAAGGGGGGGGTGGAAGTGGGAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCGGCAGTCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGAGACTGACTACAGCAGCGGAATGGGATACGGAATGGACGTATGGGGCCAGGGAACAACTGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGCGGCAGTGGGAAGCCTGGCAGCGATATTCAAATGACCCAGTCCCCGTCCTCCCTGAGTGCCTCCGTCGGTGACCGTGTTACGATTACCTGCCGTGCGAGCCAAGACATCTCTAAATACCTGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGATCAGGCACCGAAACTGCTGATCAAACATACCTCACGTCTGCACTCGGGTGTGCCGAGCCGCTTTAGTGGTTCCGGCTCAGGTACCGATTACACCCTGACGATCAGCTCTCTGCAGCCGGAAGACTTTGCCACGTATTACTGCCAGCAAGGTAATACCCTGCCGTATACGTTCGGCCAAGGTACCAAACTGGAAATCAAAGGGGGGGGTGGAAGTGGGGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGCAGTGAAGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAACCGGGTCGTTCCCTGCGTCTGTCATGTACGGCGAGTGGTGTCTCCCTGCCGGACTATGGCGTGTCCTGGATTCGTCAGCCGCCGGGTAAAGGCCTGGAATGGATTGGTGTCATCTGGGGCAGTGAAACCACGTATTACAACTCGGCCCTGAAAAGCCGTTTCACCATCTCTCGCGATAACAGTAAAAATACGCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGCGCGCGGAAGACACCGCCGTTTACTACTGCGCAAAACATTACTACTACGGTGGCAGCTATGCTATGGATTACTGGGGTCAAGGCACGCTGGTCACCGTTTCGTCAGCCGCTGCCCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGATGA   
雙特異性CAR (AA序列) 294 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIKGGGGSGKPGSGEGGSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGKPGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSAAALDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CSF2RA信號肽 295 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP   
Ab3 VL 296 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLADPFTFGGGTKVEIK
KL2連接子 297 GGGGSGKPGSGEGGS
Ab3 VH 298 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETDYSSGMGYGMDVWGQGTTVTVSS   
截短連接子 299 GGGGSGKPGS
抗CD19 VL 300 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK
G4S連接子 301 GGGGSGGGGSGGGGS   
抗CD19 VH 302 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
CD28T細胞外區 303 LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
CD28跨膜區 304 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV   
CD28細胞內區 305 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD3z 306 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
實例23 表71：例示性連接子
   SEQ ID NO: 序列
G4S (G4Sx1) 307 GGGGS
G4Sx2 308 GGGGSGGGGS
G4Sx3 309 GGGGSGGGGSGGGGS
G4Sx4 310 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
IgA 311 PSTPPTPSPSTPPTPSPS
PAPAP 312 PAPAP (視情況包含PAPAP之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個相鄰複本。)
EAAAK 313 EAAAK (視情況包含EAAAK之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個相鄰複本)
雖然已描述多種實施例，但顯而易見，本發明及實例可提供利用本文所描述之組合物及方法或由本文所描述之組合物及方法涵蓋之其他實施例。因此，應瞭解範疇應由以下定義：可根據本發明及隨附申請專利範圍而非藉由已借助於實例表示之實施例來理解。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
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Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
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Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
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Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
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Figure 12_A0101_SEQ_0047
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Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
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Figure 12_A0101_SEQ_0059
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Claims (29)

  1. 一種抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其包含抗CD20結合模體，其中該抗CD20結合模體包含選自由以下組成之群之重鏈可變區(HCVR)中之任一者的三個重鏈互補決定區(HCDR)的序列：SEQ ID NO:1、23、45、67、89、111、133、155、177及199；及選自由以下組成之群之輕鏈可變區(LCVR)之三個輕鏈CDR(LCDR)的序列：SEQ ID NO:12、34、56、78、100、122、144、166、188及210。
  2. 如請求項1之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD20結合模體包含第一域，其包含三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)，其中 (i)該HCDR1具有根據以下中之一者的序列：SEQ ID NO:3-5、25-27、47-49、69-71、91-93、113-115、135-137、157-159、179-181及201-203； (ii)該HCDR2具有根據以下中之一者的序列：SEQ ID NO:6-8、28-30、50-52、72-74、94-96、116-118、138-140、160-162、182-184及204-206； (iii)該HCDR3具有根據以下中之一者的序列：SEQ ID NO:9-11、31-33、53-55、75-77、97-99、119-121、141-143、163-165、185-187及207-209； (iv)該LCDR1具有根據以下中之一者的序列：SEQ ID NO:14-16、36-38、58-60、80-82、102-104、124-126、146-148、168-170、190-192及212-214； (v)該LCDR2具有根據以下中之一者的序列：SEQ ID NO:17-19、39-41、61-63、83-85、105-107、127-129、149-151、171-173、193-195及215-217；及 (vi)該LCDR3具有根據以下中之一者的序列：SEQ ID NO:20-22、42-44、64-66、86-88、108-110、130-132、152-154、174-176、196-198及218-220。
  3. 如請求項1或2之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該HCDR包含： (i)根據SEQ ID NO:3-5中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:6-8中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:9-11中之任一者之HCDR3； (ii)根據SEQ ID NO:25-27中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:28-30中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:31-33中之任一者之HCDR3； (iii)根據SEQ ID NO:47-49中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:50-52中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:53-55中之任一者之HCDR3； (iv)根據SEQ ID NO:69-71中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:72-74中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:75-77中之任一者之HCDR3； (v)根據SEQ ID NO:91-93中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:94-96中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:97-99中之任一者之HCDR3； (vi)根據SEQ ID NO:113-115中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:116-118中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:119-121中之任一者之HCDR3； (vii)根據SEQ ID NO:135-137中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:138-140中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:141-143中之任一者之HCDR3； (viii)根據SEQ ID NO:157-159中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:160-162中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:163-165中之任一者之HCDR3； (ix)根據SEQ ID NO:179-181中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:182-184中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:185-187中之任一者之HCDR3；或 (x)根據SEQ ID NO:201-203中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:204-206中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:207-209中之任一者之HCDR3；及 該LCDR包含： (i)根據SEQ ID NO:14-16中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:17-19中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:20-22中之任一者之LCDR3； (ii)根據SEQ ID NO:36-38中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:39-41中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:42-44中之任一者之LCDR3； (iii)根據SEQ ID NO:58-60中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:61-63中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:64-66中之任一者之LCDR3； (iv)根據SEQ ID NO:80-82中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:83-85中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:86-88中之任一者之LCDR3； (v)根據SEQ ID NO:102-104中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:105-107中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:108-110中之任一者之LCDR3； (vi)根據SEQ ID NO:124-126中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:127-129中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:130-132中之任一者之LCDR3； (vii)根據SEQ ID NO:146-148中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:149-151中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:152-154中之任一者之LCDR3； (viii)根據SEQ ID NO:168-170中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:171-173中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:174-176中之任一者之LCDR3； (ix)根據SEQ ID NO:190-192中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:193-195中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:196-198中之任一者之LCDR3；或 (x)根據SEQ ID NO:212-214中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:215-217中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:218-220中之任一者之LCDR3。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段包含第一域，其包含三個重鏈互補決定區(HCDR)；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中： 該等HCDR及LCDR包含： (i)根據SEQ ID NO:3-5中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:6-8中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:9-11中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:14-16中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:17-19中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:20-22中之任一者之LCDR3； (ii)根據SEQ ID NO:25-27中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:28-30中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:31-33中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:36-38中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:39-41中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:42-44中之任一者之LCDR3； (iii)根據SEQ ID NO:47-49中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:50-52中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:53-55中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:58-60中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:61-63中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:64-66中之任一者之LCDR3； (iv)根據SEQ ID NO:69-71中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:72-74中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:75-77中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:80-82中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:83-85中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:86-88中之任一者之LCDR3； (v)根據SEQ ID NO:91-93中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:94-96中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:97-99中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:102-104中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:105-107中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:108-110中之任一者之LCDR3； (vi)根據SEQ ID NO:113-115中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:116-118中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:119-121中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:124-126中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:127-129中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:130-132中之任一者之LCDR3； (vii)根據SEQ ID NO:135-137中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:138-140中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:141-143中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:146-148中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:149-151中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:152-154中之任一者之LCDR3； (viii)根據SEQ ID NO:157-159中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:160-162中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:163-165中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:168-170中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:171-173中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:174-176中之任一者之LCDR3； (ix)根據SEQ ID NO:179-181中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:182-184中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:185-187中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:190-192中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:193-195中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:196-198中之任一者之LCDR3；或 (x)根據SEQ ID NO:201-203中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:204-206中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO:207-209中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO:212-214中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO:215-217中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:218-220中之任一者之LCDR3。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變域，其包含三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含三個LCDR，其中： (i)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 177或SEQ ID NO: 199至少80%一致；及 (ii)該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 188或SEQ ID NO: 210至少80%一致。
  6. 如請求項5之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變域，其包含該三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含該三個LCDR，其中： (i)該重鏈可變域與SEQ ID NO:1至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:12至少80%一致； (ii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:23至少80%一致；且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:34至少80%一致； (iii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:45至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:56至少80%一致； (iv)該重鏈可變域與SEQ ID NO:67至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:78至少80%一致； (v)該重鏈可變域與SEQ ID NO:89至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:100至少80%一致； (vi)該重鏈可變域與SEQ ID NO:111至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:122至少80%一致； (vii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:133至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:144至少80%一致； (viii)該重鏈可變域與SEQ ID NO:155至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:166至少80%一致； (ix)該重鏈可變域與SEQ ID NO:177至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:188至少80%一致；或 (x)該重鏈可變域與SEQ ID NO:199至少80%一致，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO:210至少80%一致。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該三個HCDR及該三個LCDR構成單一多肽。
  8. 如請求項1至6中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該三個HCDR構成第一多肽且該三個LCDR構成第二多肽。
  9. 如請求項8之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該第一多肽為抗體重鏈且該第二多肽為抗體輕鏈。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段進一步包含： (i)結合模體，其特異性結合選自由以下組成之群的抗原：5T4、α胎蛋白、B細胞成熟抗原(BCMA)、B細胞受體、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、IgM、C型凝集素類分子1(CLL-1)、EGFRvIII、上皮腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2組合、HER2-HER3組合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1套膜醣蛋白gp41、HIV-1套膜醣蛋白gpl20、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、黑素瘤相關抗原、間皮素、MUC-1、突變的p53、突變的ras、前列腺特異性抗原、ROR1、VEGFR2、EphA3(EPH受體A3)、BAFFR(B細胞活化因子受體)及其組合；及/或 (ii)結合模體，其特異性結合為B細胞所特有之抗原，視情況其中該為B細胞所特有之抗原不為CD19或CD20。
  11. 如請求項1至9中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段進一步包含抗CD19結合模體。
  12. 如請求項11之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD19結合模體包含第一域，其包含三個HCDR；及第二域，其包含三個LCDR，其中： 該抗CD19結合模體之該三個HCDR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3； 該抗CD19結合模體之該三個LCDR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3；及 該抗CD19結合模體之HCDR及LCDR包含根據SEQ ID NO: 223-225中之任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO:226-228中之任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 229-231中之任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 234-236中之任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237-239中之任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO:240-242中之任一者之LCDR3。
  13. 如請求項12之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD19結合模體包含：第一重鏈可變域，其包含該抗CD19結合模體之該三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含該抗CD19結合模體之該三個LCDR，其中該抗CD19結合模體之重鏈可變域與SEQ ID NO: 221至少80%一致，且該抗CD19結合模體之輕鏈可變域與SEQ ID NO: 232至少80%一致。
  14. 如請求項12或13之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD19結合模體之該三個HCDR及該抗CD19結合模體之該三個LCDR構成單一多肽。
  15. 如請求項12至14中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗CD20結合模體之該三個HCDR、該抗CD20結合模體之該三個LCDR、該抗CD19結合模體之該三個HCDR及該抗CD19結合模體之該三個LCDR一起構成單一多肽。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段為嵌合抗原受體或包含嵌合抗原受體。
  17. 如請求項16之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該嵌合抗原受體包含為以下各者之跨膜域的跨膜域：4-1BB/CD137、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、CD3 ε、CD4、CD5、CD8 α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或T細胞受體之ζ鏈或其任何組合。
  18. 如請求項11至14中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中(i)該抗CD20結合模體之該三個HCDR及該抗CD20結合模體之該三個LCDR存在於第一多肽中，及(ii)該抗CD19結合模體之該三個HCDR及該抗CD19結合模體之該三個LCDR一起構成第二不同多肽。
  19. 如請求項18之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該第一多肽為第一嵌合抗原受體或包含第一嵌合抗原受體。
  20. 如請求項18或19之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，其中該第二多肽為第二嵌合抗原受體或包含第二嵌合抗原受體。
  21. 一種核酸，其編碼至少一種如請求項1至20中任一項之多肽。
  22. 一種載體，其包含如請求項21之核酸。
  23. 一種產生經工程改造之細胞之方法，該方法包含用如請求項21之核酸或如請求項22之載體轉染或轉導細胞。
  24. 一種細胞，其編碼或表現如請求項1至20中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段，視情況其中該細胞為免疫細胞，視情況其中該細胞為T細胞。
  25. 一種治療有需要之個體之癌症的方法一種一或多個編碼或包含如請求項1至20中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段之細胞的用途，其用於製造用以治療有需要之個體之癌症的細胞療法組合物。
  26. 一種誘導個體之免疫反應或使個體針對癌症免疫之方法一種一或多個編碼或包含如請求項1至20中任一項之抗原結合系統、抗體或其抗原結合片段之細胞的用途，其用於製造用以誘導個體之免疫反應或使個體針對癌症免疫的細胞療法組合物。
  27. 如請求項25或26之用途，其中該等細胞為CAR-T細胞。
  28. 如請求項25至27中任一項之用途，其中該癌症為急性淋巴母細胞白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、急性骨髓白血病、B細胞前淋巴細胞性白血病、B細胞急性淋巴白血病(「BALL」)、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓白血病、慢性或急性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、毛細胞白血病、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、惡性淋巴增生病況、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、意義不明單株伽瑪球蛋白症(monoclonal gammapathy of undetermined significance，MGUS)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、漿細胞增生性病症(包括無症狀骨髓瘤(悶燃型多發性骨髓瘤或頑固性骨髓瘤))、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、漿細胞瘤(包括漿細胞惡病質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤及多發性漿細胞瘤)、POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群(Crow-Fukase syndrome)、高槻病(Takatsuki disease)及PEP症候群)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、T細胞急性淋巴白血病(「TALL」)、T細胞淋巴瘤、轉化型濾泡性淋巴瘤或華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、套細胞淋巴瘤(MCL)、轉化型濾泡性淋巴瘤(TFL)、原發性縱隔B細胞淋巴瘤(PMBCL)、多發性骨髓瘤、毛細胞淋巴瘤/白血病或其組合。
  29. 如請求項25至28中任一項之用途，其中該細胞療法為同種異體細胞療法或自體細胞療法。
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