TW202124447A - 工程化自然殺手細胞以靶向ｂｃｍａ陽性腫瘤之方法 - Google Patents

Abstract

本發明之實施例包括關於藉由特異性工程化以結合BCMA抗原之NK細胞靶向表現BCMA之細胞的方法及組合物。在特定實施例中，經操縱以表現靶向BCMA之嵌合抗原受體(CAR)之NK細胞用於靶向表現BCMA之癌症。在某些實施例中，表現該等靶向BCMA之CAR之載體亦表現特定自殺基因及/或特定細胞介素。

Description

工程化自然殺手細胞以靶向BCMA陽性腫瘤之方法

本發明之實施例至少包括細胞生物學、分子生物學、免疫學及醫學(包括癌症醫學)之領域。

用於過繼性癌症免疫療法之自然殺手(NK)細胞之基因再程式化具有臨床相關之應用及益處，諸如1)預先不需要敏化之先天性抗腫瘤監視；2)同種異體功效，無移植物抗宿主反應性；及3)目標腫瘤之直接細胞介導之細胞毒性及細胞溶解。人類NK細胞發育及自體耐受性、同種異體反應性及效應功能之獲得係一個許可、校準及武裝之應變性過程。在分子層面，特異性活化及抑制受體係藉由聚集、平衡及整合細胞外信號將NK細胞功能引導為不同的效應功能。NK細胞之功能活性及對外源性刺激之反應性遵循連續教育之『變阻器(rheostat)』模型且因此能夠再程式化。基因修飾NK細胞以再引導其效應功能係一種利用其細胞毒性能力來殺滅腫瘤細胞之有效方法。

本發明提供一種有效治療癌症之技術中長期需要之解決方案。

本發明係關於與癌症相關之方法及組合物，其中經由B細胞成熟抗原(BCMA)靶向癌細胞將為有效的。在特定實施例中，本發明係關於與治療BCMA陽性癌症相關之方法及組合物，且在至少某些情況下，經由使用自然殺手(NK)細胞靶向BCMA陽性癌症。

本發明提供用於治療患有BCMA陽性癌症(例如B細胞惡性病、多發性骨髓瘤、頭頸癌、肺癌、甲狀腺癌或乳癌)之癌症患者之方法及組合物，包括經由表現BCMA之癌細胞消融。

在特定實施例中，本發明所揭示之方法及組合物使得可使用現成NK細胞，其在特定實施例中亦經轉導以表現一或多種細胞介素，諸如IL-15、IL-12、IL-18、IL-2及/或IL-21。

本文涵蓋對包括人類NK細胞之哺乳動物NK細胞進行基因工程化以靶向任何種類之BCMA陽性腫瘤(至少包括骨髓瘤)的方法。本發明涵蓋靶向BCMA之嵌合抗原受體(CAR)構築體之多個實例，其可在多發性骨髓瘤癌細胞以及其他B細胞惡性病及其他癌症(至少包括肺癌及乳癌)上表現。在特定實施例中，本發明提供表現針對BCMA之單鏈可變片段(scFv)之多種表現構築體(包括反轉錄病毒構築體)，且在一些實施例中，該等構築體包括細胞介素(諸如IL-15 (作為一個實例))以支持NK細胞存活及增殖。在特定實施例中，細胞介素並非CAR分子之一部分。在本發明所提供之一系列活體外研究中，表明抗BCMA.CAR/IL-15轉導臍帶血(CB)-NK細胞對骨髓瘤細胞株之活性。

在特定實施例中，攜有一或多種編碼靶向BCMA之CAR之載體的本發明之NK細胞亦具有編碼自殺基因之載體。編碼CAR之載體亦可或可不編碼自殺基因(且可或可不編碼細胞介素)。在特定實施例中，自殺基因為突變TNFα，包括不可分泌且藉由人工工程化之突變TNFα。

經特定考慮，關於本發明之一個實施例所論述的任何限定條件亦可應用於本發明之任何其他實施例。此外，本發明之任何組合物可用於本發明之任何方法，且本發明之任何方法可用於產生或利用本發明之任何組合物。實例中所闡述之實施例之態樣亦為可在不同實例中之其他處或本申請案中之其他處(諸如發明內容、實施方式、申請專利範圍及圖式簡單說明中)所論述之實施例之上下文中實施的實施例。

前文已相當廣泛地概述了本發明之特徵及技術優勢，以便可較好地理解如下之詳細描述。下文將描述另外特徵及優勢，其形成本文中之申請專利範圍之標的。熟習此項技術者應瞭解，所揭示之概念及特定實施例可易於用作修改或設計用於實現本發明設計之相同目的之其他結構的基礎。熟習此項技術者亦應意識到，此類等效構造並未脫離如所附申請專利範圍中所闡述之精神及範疇。當結合附圖考慮時，將由以下描述較好地理解咸信表徵本文中所揭示之設計的關於組織及操作方法兩者之新穎特徵，以及其他目標及優勢。然而，應明確地理解，諸圖中之每一者係僅出於說明及描述之目的而提供並且並非意欲作為本發明之限制的定義。

本申請案主張2019年9月18日申請之美國臨時專利申請案第62/902,237號之優先權，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

以下申請案以全文引用之方式併入本文中：PCT/US2019/018989；2018年11月19日申請之美國臨時專利申請案第62/769,405號；2018年11月30日申請之美國臨時專利申請案第62/773,372號；2019年1月11日申請之美國臨時專利申請案第62/791,464號；2018年11月19日申請之美國臨時專利申請案第62/769,414號；2019年11月30日申請之美國臨時專利申請案第62/773,394號；及2019年1月11日申請之美國臨時專利申請案第62/791,491號。雖然本文中已經顯示及描述各種實施例，熟習此項技術者將顯而易知此等實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者可以想到諸多變化、變更及取代而不背離本發明。應瞭解，可以採用本文所描述之本發明實施例的多種替代方案。1. 定義之實例

與長期以來的專利法慣例一致，當在本說明書中與字組包含共同使用時，包括申請專利範圍，字組「一(a)」及「一(an)」指代「一或多種」。本發明之一些實施例可由以下組成或基本上由以下組成：一或多個本發明之要素、方法步驟及/或方法。經考慮，本文所描述之任何方法或組合物可相對於本文所描述之任何其他方法或組合物來實施且可合併不同的實施例。

在本發明通篇中，除非上下文另有要求，否則字組「包含(comprise/comprises/comprising)」應理解為意味著包括所陳述步驟或要素或步驟或要素組，但不排除任何其他步驟或要素或其他步驟或要素組。「由…組成」意欲包括且限於在片語「由…組成」中間的任何事物。因此，片語「由……組成」指示所列要素為所需或必選的，且不可存在其他要素。「基本上由……組成」意欲包括該片語中間所列之任何要素，且限於不干擾或促成所列要素在本揭示案中所指定之活性或作用的其他要素。因此，片語「基本上由…組成」指示所列舉之要素為所需或必選的，但沒有其他要素為視情況選用的且視其是否影響所列舉要素之活性或作用而定，可存在或可不存在。

本說明書通篇中，提及「一個實施例」、「實施例」、「特定實施例」、「相關實施例」、「某一實施例」、「另外實施例」或「另一實施例」或其組合意謂結合實施例描述的特定特點、結構或特徵包括於本發明的至少一個實施例中。因此，在本說明書通篇各處出現上述片語未必皆指代相同實施例。另外，可在一或多個實施例中以任何適合的方式組合特定特徵、結構或特性。

如本文所用，術語「或」及「及/或」用以描述組合之或不包括彼此之多個組分。舉例而言，「x、y及/或z」可指單獨「x」、單獨「y」、單獨「z」、「x、y及z」、「(x及y)或z」、「x或(y及z)」或「x或y或z」。經特定考慮，x、y或z可特定地自實施例排除。

本申請案通篇中，術語「約」係根據其在細胞及分子生物學領域中之簡單及一般含義使用，以指示值包括用於測定值之裝置或方法之誤差標準差。

如本文所用，術語「工程化」係指由人工產生之實體，包括細胞、核酸、多肽、載體等。在至少一些情況下，工程化之實體為合成的且包含非天然存在或以用於本發明之方式組態之元件。在特定實施例中，經由重組核酸技術使載體工程化，且經由經工程化載體之轉染或轉導而使細胞工程化。

如本文所用，「預防(prevent)」及類似詞(諸如「prevented/preventing」等)指示一種用於預防、抑制或降低疾病或病況(例如癌症)發生或復發之可能性的方法。其亦指延遲疾病或病況之發作或復發，或延遲疾病或病況之症狀之復發。如本文所用，「預防」及類似詞亦包括在疾病或病況發作或復發之前降低疾病或病況之強度、作用、症狀及/或負荷。

如本文所用，術語「樣品」一般係指生物樣品。樣品可由來自個體之組織或細胞獲得。在一些實例中，樣品可包含或來源於組織切片、血液(例如全血)、血漿、胞外流體、乾燥血斑、經培養細胞、丟棄組織。樣品在收集之前可已與來源分離。非限制性實例包括收集之前自主要來源分離之血液、血清、血漿、大腦脊髓液、胸膜液、羊膜液、淋巴液、唾液、尿液、大便、淚液、汗液、骨髓或黏膜排泄物及其他體液。在一些實例中，在樣品製備期間樣品自其主要來源(細胞、組織、體液(諸如血液)、環境樣品等)分離。樣品可以或可以不自其主要來源純化或以其他方式富集。在一些情況下，在進一步處理之前使主要來源均質化。可過濾或離心樣品以移除白血球層、脂質或顆粒物質。樣品亦可經純化或富集核酸，或可用RNase處理。樣品可含有完整、片段化或部分降解之組織或細胞。

如本文所用，術語「個體」一般係指具有正在進行處理或分析之生物樣品且在特定情況下患有或疑似患有癌症的個體。個體可為作為方法或材料之對象的任何生物體或動物個體，包括哺乳動物(例如人類)、實驗室動物(例如，靈長類動物、大鼠、小鼠、兔)、家畜(例如，母牛、綿羊、山羊、豬、火雞及雞)、家養寵物(例如，狗、貓及嚙齒動物)、馬及轉殖基因非人類動物。個體可為患者，例如患有或疑似患有疾病(可稱為醫學病況)(諸如良性或惡性贅瘤或癌症)。個體可正在經受或已經受治療。個體可無症狀。個體可為健康個體，但希望對其預防癌症。在至少一些情況下，術語「個體」可互換使用。如本文所使用，「個體(subject/individual)」可或可不安置於醫療機構中且可作為醫療機構之門診患者進行治療。個體可經由網際網路接受一或多種醫療組合物。個體可包含任何年齡之人類或非人類動物且因此包括成人及青少年(即兒童)及嬰兒且包括未出生的個體。不意欲術語暗示對醫學治療之需求，因此，個體可自願地或非自願地參與實驗，無論為臨床或支持基礎科學研究。

如本文中所使用，「治療(treatment)」或「治療(treating)」包括對疾病或病理病況之症狀或病理學的任何有益或所需作用，且可包括甚至最少減少所治療之疾病或病況(例如癌症)之一或多種可量測標記物。治療可涉及視情況減少或改善疾病或病況之症狀，或延緩疾病或病況之進展。「治療」不一定表示完全根除或治癒疾病或病況或其相關症狀。

本發明涵蓋靶向BCMA之細胞，包括經操縱以表現靶向BCMA之CAR之NK細胞，且視情況其中該等NK細胞表現自殺基因(諸如不可分泌之突變TNFα)及視情況一或多種細胞介素。在特定實施例中，NK細胞表現靶向BCMA之CAR、突變不可分泌之TNFα，及至少一種細胞介素。

熟習此項技術者應認知BCMA亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員17 (TNFRSF17)；CD269；TNFRSF13A；及TNF受體超家族成員17。I.   CAR 實施例之實例

在特定實施例中，本發明涉及NK細胞(例如臍帶血(CB)衍生之NK細胞)再程式化以靶向表現BCMA之癌細胞。本發明提供多種新穎CAR構築體，合併有不同BCMA scFv異源性地融合至包含CD247 (亦稱為CD3ζ)及CD28之細胞質部分的信號傳導域。在替代實施例中，利用除CD28以外的其他協同刺激域。在特定實施例中，scFv為來源於對人類BCMA抗原具有特異性之鼠類抗體之重鏈(V_H )及輕鏈(V_L )的可變片段之融合物。在特定實施例中，scFv已經密碼子優化。在特定實施例中，載體亦攜載細胞介素基因(例如IL-15)，以產生人類介白素。作為一個實例，IL-15有助於NK細胞存活及維持。因此修飾且在一個實施例中之細胞在本文中可稱為CAR.BCMA. CD28.CD3z-IL15 CB-NK。A. 靶向 BCMA 之 CAR 之一般實施例

本發明提供攜有編碼至少一個CAR之載體的細胞(特定言之，NK細胞)，且CAR可為例如第一代、第二代或第三代或後代。CAR可或可不對兩種或更多種不同抗原具有雙特異性，該等抗原中之一為BCMA。CAR可包含一或多個協同刺激域。各協同刺激域可包含例如TNFR超家族之成員CD28、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或例如其組合中之任何一或多者之協同刺激域。在特定實施例中，CAR包含CD3ζ。在某些實施例中，CAR不具有一或多個特定協同刺激域；例如CAR可能不具有4-1BB。

在特定實施例中，CAR包含DAP12作為協同刺激域，且在某些態樣中CAR多肽包含特定DAP12胺基酸序列或由特定DAP12核酸序列編碼。實例如下：

DAP12胺基酸序列之一實例：

DAP12核酸序列之一實例：

在特定實施例中，CAR包含至少CD28作為協同刺激域，且在某些態樣中靶向BCMA之CAR多肽包含特定CD28胺基酸序列或由特定CD28核酸序列編碼。實例如下：

CD28胺基酸序列之一實例，其包括CD28跨膜域及CD28胞內域(但無CD8a或CD3z序列)：

CD28核酸序列之一實例：

在特定實施例中，CAR多肽包含連接抗原結合域與跨膜域之細胞外間隔域(亦可稱為鉸鏈)。細胞外間隔域可包括但不限於抗體或其片段或衍生物之Fc片段、抗體或其片段或衍生物之鉸鏈區、抗體之CH2區、CH3區抗體、人工間隔序列或其組合。細胞外間隔域之實例包括但不限於CD8-α鉸鏈、CD28鉸鏈、由多肽(諸如Gly3)構成之人工間隔子或IgG (諸如人類IgG1或IgG4)之CH1、CH2及/或CH3域。在特定情況下，細胞外間隔域可包含(i) IgG4之鉸鏈、CH2及CH3區，(ii) IgG4之鉸鏈區，(iii) IgG4之鉸鏈及CH2，(iv) CD8-α之鉸鏈區，(v) CD28之鉸鏈區，(vi) IgG1之鉸鏈、CH2及CH3區，(vii) IgG1之鉸鏈區，或(viii) IgG1之鉸鏈及CH2或其組合。

在特定實施例中，鉸鏈來自IgG1，且在某些態樣中，CAR多肽包含特定IgG1鉸鏈胺基酸序列或由特定IgG1鉸鏈核酸序列編碼。實例如下：

IgG1鉸鏈胺基酸序列：

IgG1鉸鏈核酸序列：

可利用連接VH及VL鏈之特定連接子。連接子胺基酸序列之一個實例如下：G G G G S G G G G S G G G G S G G G G S (SEQ ID NO:68)。

連接子核酸序列之一個實例如下：

IgG1鉸鏈胺基酸序列之一個實例如下(且可僅在選殖假影方面與SEQ ID NO:50不同)：

IgG1鉸鏈核酸序列之一個實例如下(且可在選殖假影方面與SEQ ID NO:6不同)：

CD28協同刺激域胺基酸序列之一個實例如下：

CD28協同刺激域核酸序列之一個實例如下：

CD8a信號肽胺基酸序列之一實例如下：

CD8a信號肽核酸序列之一實例如下：

GMCSF-R信號肽胺基酸序列之一個實例如下：

GMCSF-R信號肽核酸序列之一個實例如下：

CD3ζ胺基酸序列之一個實例如下：

CD3ζ核酸序列之一個實例如下：

IL-15胺基酸序列之一個實例如下：

IL-15核酸序列之一個實例如下：

B. CAR 構築體之特定實例

在本文所涵蓋之CAR構築體之特定實例中，CAR之多個元件及/或載體本身存在特定(但可互換)選擇。

圖1示出包括靶向BCMA之CAR之特定載體構築體的一個實例。此載體包括具有粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子受體信號傳導肽(GMCSFRsp)作為CAR之一部分的靶向BCMA之CAR，其包括由任何種類之連接子分隔之C11D5.3抗體(作為一個實例)之VH鏈及VL鏈的密碼子優化(共)型式。在此實施例中，VL鏈在5ʹ至3ʹ方向上在VH鏈上游。除CD3ζ之外，圖1中之特定CAR亦使用IgG1之CH2CH3域作為鉸鏈且使用CD28作為協同刺激域。載體包含細胞介素(諸如IL-15)，且該細胞介素利用將其與CAR分隔之2A元件而變為分隔多肽。

在靶向BCMA之CAR之一些實施例中，表現CAR之載體亦可表現一或多種自殺基因。作為一個實例， TNFα突變體可用作自殺基因。在本文諸圖中之載體之實例中，利用之TNFα突變體為del Ala-1至Val 13 (14aa del) CKI mut 5 aa突變體(參見本文中其他地方；SEQ ID NO:37)，但亦可利用任何其他自殺基因(包括其他突變TNFα)。

圖2中示出靶向BCMA之CAR之一個實例，且載體涵蓋TNFα突變體及採用C12A3.2抗體之密碼子優化型式之靶向BCMA之CAR之一實例。在特定實施例中，可在載體中提供TNFα突變體-2A-GMCSFRspcoC12A3.2 BCMAVLVH28Z-2A-IL15且其包括(1)在處理2A元件後變為與(2) BCMA CAR分隔之多肽的TNFα突變體自殺基因，該BCMA CAR包括粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子受體信號傳導肽(GMCSFRsp)及co C12A3.2抗體；且在處理2A元件後，該自殺基因亦變為與(3)細胞介素分隔之多肽。在此特定實施例中，插入2A序列之性質允許最終產生與TNFα突變體、靶向BCMA之CAR及細胞介素分隔之多肽。在圖2中，在此特定實例中，C12A3.2之VL鏈在5ʹ至3ʹ之方向上在VH鏈之上游。此特異性CAR亦利用CD28及CD3ζ。

某些構築體在一些情況下利用自殺基因，包括TNFα突變體。在利用TNFα突變體之載體構築體之任何特定實例中，作為自殺基因之TNFα突變體之一個實例的核苷酸序列之一實例如下(且此自殺基因及任何其他者可用於其他特定構築體中)：

利用coC11D5.3抗體代替co C12A3.2抗體之BCMA CAR之核苷酸序列之一實例如下(且可稱為(GMCSFRspcoC11D5.3 BCMAVLVH))：

利用C11D5.3抗體之BCMA CAR之多肽序列(GMCSFRspcoC11D5.3 BCMAVLVH)如下：

利用密碼子優化C12A3.2抗體(參見圖2)之BCMA CAR之一個實例之核苷酸序列(GMCSFRspcoC12A3.2 BCMAVLVH)如下：

利用密碼子優化C12A3.2抗體(參見圖2)之BCMA CAR之多肽(GMCSFRspcoC12A3.2 BCMAVLVH)如下：

在載體構築體之一些實例中，利用來自CD8a之信號肽代替來自GMCSFR之信號肽。在圖3中之載體之實例中，將CD8a信號肽與經由連接子連接至C11D5.3 BCMA VH鏈之C11D5.3 BCMA VL鏈(且在此實例中VL鏈在5ʹ至3ʹ之方向上在VH鏈之上游)、IgG1鉸鏈、CD28及CD3ζ一起利用，隨後利用IL-15 (藉由2A元件分隔)。在此類情況下，可利用或可不利用包括突變TNFα之自殺基因。

CD8spC11D53VLVH之核苷酸序列之一實例如下：

CD8spC11D53VLVH之多肽序列之一實例如下：

利用TNFα突變體及C12A3.2抗體之表現構築體之一個實例例示於圖4中。在該實例中，藉由2A元件將TNFα突變體與靶向BCMA之CAR分隔，該靶向BCMA之CAR包括GMCSF-R信號肽、在C12A3.2 VH鏈上游但經由連接子連接至C12A3.2 VH鏈之C12A3.2 VL鏈，且該CAR亦包括IgG1鉸鏈、CD28及CD3ζ。另一2A元件使靶向BCMA之CAR與IL-15分隔。

表現TNFαmut-CD8spC12A3.2.BCMAVLVH之核苷酸序列之一實例如下：

TNFαmut-CD8spC12A3.2.BCMAVLVH之多肽序列之一實例如下：

圖5提供載體之一實例，其包含表現包括Ig重鏈信號肽及密碼子優化A7D12.2VH及A7D12.2VL之IgHspCOA7D12.2VHVL之表現構築體，且其亦包括IgG1鉸鏈、CD28及CD3ζ。在此實例中，對於IgHspCOA7D12.2VHVL，VH元件在5ʹ至3ʹ方向上在VL元件之上游。載體亦包括將IL-15與CAR分隔之2A元件。自殺基因可或可不包括於載體中，且當使用自殺基因時，2A元件可為或可不為將CAR與自殺基因分隔之元件。

IgHspCOA7D12.2VHVL之核苷酸序列之一實例如下：

IgHspCOA7D12.2VHVL之多肽序列之一實例如下：

圖6提供包括表現IgHspCOA7D12.2VLVH之表現構築體的載體之一個實例。在此實例中，對於IgHspCOA7D12.2VLVH，VL元件在5ʹ至3ʹ方向上在VH元件之上游。編碼IgHspCOA7D12.2VLVH之聚核苷酸之一實例如下：

IgHspCOA7D12.2VLVH之多肽之一實例如下：

圖7提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之一個實例，其中A7D12.2 VL鏈連接在A7D12.2 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上且亦包括Ig重鏈信號肽。

編碼IgHSP.BCMAScFvA7D12.2VL-Linker-VH之表現構築體之聚核苷酸之一實例如下：

IgHSP.BCMAScFvA7D12.2VL-Linker-VH之多肽之一實例如下：

圖8示出編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之一實例，其中A7D12.2 VH鏈連接在A7D12.2 VL鏈及IgG1鉸鏈之5ʹ至3ʹ方向上。CAR利用Ig重鏈信號肽及CD28協同刺激域。

編碼IgHSPA7D12VHVLIg28之表現構築體之聚核苷酸之一實例如下：

IgHSPA7D12VHVLIg28之多肽之一實例如下：

圖9提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中密碼子優化A7D12.2 VL連接在A7D12.2 VH之5ʹ至3ʹ方向上且該CAR利用Ig重鏈信號肽、IgG1鉸鏈及CD28協同刺激域。

編碼IgHSPCOA7D12VHVLIg28之表現構築體之聚核苷酸之一實例如下：

IgHSPCOA7D12VHVLIg28之多肽之一實例如下：

圖10為編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中C11D5.3 VL鏈連接在C11D5.3 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上，其中CAR利用GMCSF-R信號肽。

編碼GMCSFSP-BCMAC11D5.3VLVH之表現構築體之聚核苷酸之一實例如下：

GMCSFSP-BCMAC11D5.3VLVH之多肽之一實例如下：

圖11展示編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之質體圖之圖式，該CAR利用連接在密碼子優化C12A3.2 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上之密碼子優化(CO) C12A3.2 VL鏈，其中CAR合併CD8信號肽、IgG1鉸鏈、CD28及CD3ζ。載體亦編碼特定TNFα突變體、delAla-1至Val13 (14aa del) CKI突變5aa mut且編碼IL15。藉由2A肽序列使IL15及TNFα突變體與CAR分隔。

編碼TNFαmut-CD8spC12A3.2.BCMAVLVH之表現構築體之聚核苷酸之一實例如下：

TNFαmut-CD8spC12A3.2.BCMAVLVH之多肽之一實例如下：

圖12提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中密碼子優化A7D12.2 VL連接在A7D12.2 VH之5ʹ至3ʹ方向上且該CAR利用Ig重鏈信號肽、IgG1鉸鏈及CD28協同刺激域。

編碼IgHSPCOA7D12VLVHIg28之表現構築體之聚核苷酸之一實例如下：

IgHSPCOA7D12VLVHIg28之多肽之一實例如下：

圖13提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中密碼子優化A7D12.2 VH連接在A7D12.2 VL之5ʹ至3ʹ方向上且在此情況下該CAR採用Ig重鏈信號肽、IgG1鉸鏈及CD28協同刺激域。

IgHSPCoA7D12VHVLIg28核酸序列之一實例如下：

IgHSPCoA7D12VHVLIg28多肽序列之一實例如下：

編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之一實例，該靶向BCMA之CAR利用CD8信號肽、連接在VH重鏈之5ʹ至3ʹ方向上之C11D5.3 VL鏈，其中該CAR亦使用IgG1鉸鏈。圖14說明其中將TNFα突變體及IL15與CAR序列分隔以產生分隔之多肽的表現構築體之型式。

CD8spC11D5.3VLVHIgG128zIL15表現構築體聚核苷酸之一實例如下：

CD8spC11D5.3VLVHIgG1表現構築體多肽之一實例如下：

圖15提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之一實例，該CAR具有GMCSF-R信號肽及連接在C11D5.3 VL鏈之5ʹ至3ʹ方向上之C11D5.3 VH鏈。

GMCSFSPcoC11D5.3VHVLIgG28聚核苷酸之一實例如下：

GMCSFSPcoC11D5.3VHVLIgG28多肽之一實例如下：

圖16提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中該CAR包括CD8信號肽、C11D5.3 scFv之VL及VH鏈及CD28協同刺激域。構築體亦編碼藉由2A序列與CAR分隔之TNFα突變體及IL15。

TNFαCD8spC11D5.3BCMAVLVH28ZIL15聚核苷酸之一實例如下：

TNFαCD8spC11D5.3BCMAVLVH28ZIL15多肽之一實例如下：

可利用之特定構築體具有某些元件之特定組合。在本發明中，利用以下BCMA1、BCMA2、BCMA3、BCMA4及BCMA5之構築體。其元件在下文指示：

BCMA1 IgSPCOA7D12VLVH28Z15：Ig重鏈信號肽；密碼子優化A7D12輕鏈，其為密碼子優化A7D12重鏈之5ʹ；CD28協同刺激域；CD3ζ鏈及IL-15

BCMA2 CD8SPC11D53VLVH28Z15：CD8信號肽；非密碼子優化C11D5.3輕鏈，其為非密碼子優化C11D5.3重鏈之5'；IgG1鉸鏈；CD28協同刺激域；CD3ζ胞內域及IL-15

BCMA3 COGSPC11D53VLVHZIL15：GMSCF信號肽；密碼子優化C11D5.3輕鏈，其為密碼子優化C11D5.3重鏈之5ʹ；CD28協同刺激域；CD3ζ及IL-15

BCMA4 IgSPA7D12VHVL28Z15：Ig重鏈信號肽；非密碼子優化A7D12重鏈，其為非密碼子優化A7D12輕鏈之5ʹ；CD28協同刺激域；CD3ζ及IL-15

BCMA5 IgSPA7D12VLVH28Z15：Ig重鏈信號肽；非密碼子優化A7D12輕鏈，其為非密碼子優化A7D12重鏈之5ʹ；CD28協同刺激域；CD3ζ及IL-15構築體元件之特定實例

靶向BCMA之scFv序列之某些實例的實施例提供於下，包括其對應VH鏈、VL鏈及對應CDR序列。A7D12.2 scFv 序列

A7D12.2 VL胺基酸序列之一個實例如下：

A7D12.2 VL核酸序列之一個實例如下：

A7D12.2 VL CDR1胺基酸序列之一個實例如下：

A7D12.2 VL CDR1核酸序列之一個實例如下：

A7D12.2 VL CDR2胺基酸序列之一個實例如下：

A7D12.2 VL CDR2核酸序列之一個實例如下：

A7D12.2 VL CDR3胺基酸序列之一個實例如下：

A7D12.2 VL CDR3核酸序列之一個實例如下：

A7D12.2 VH胺基酸序列之一實例如下：

A7D12.2 VH核酸序列之一實例如下：

A7D12.2 VH CDR1胺基酸序列之一實例如下：

A7D12.2 VH CDR1核酸序列之一實例如下：

A7D12.2 VH CDR2胺基酸序列之一實例如下：

A7D12.2 VH CDR2核酸序列之一實例如下：

A7D12.2 VH CDR3胺基酸序列之一實例如下：

A7D12.2 VH CDR3核酸序列之一實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VH胺基酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VH核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VH CDR1胺基酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VH CDR1核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VH CDR2胺基酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VH CDR2核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VH CDR3胺基酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VH CDR3核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VL胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VL核酸序列之一實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VL CDR1胺基酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VL CDR1核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VL CDR2胺基酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VL CDR2核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VL CDR3胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化A7D12.2 VL CDR3核酸序列之一實例如下：

C11D5.3 scFv 序列

C11D5.3 VL鏈胺基酸序列之一實例如下：

C11D5.3 VL鏈核酸序列之一實例如下：

C11D5.3 VL鏈CDR1胺基酸序列之一實例如下：

C11D5.3 VL鏈CDR1核酸序列之一實例如下：

C11D5.3 VL鏈CDR2胺基酸序列之一實例如下：

C11D5.3 VL鏈CDR2核酸序列之一實例如下：

C11D5.3 VL鏈CDR3胺基酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VL鏈CDR3核酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VH鏈胺基酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VH鏈核酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VH鏈CDR1胺基酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VH鏈CDR1核酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VH鏈CDR2胺基酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VH鏈CDR2核酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VH鏈CDR3胺基酸序列之一個實例如下：

C11D5.3 VH鏈CDR3核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VL鏈胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VL鏈核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VL鏈CDR1胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VL鏈CDR1核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VL鏈CDR2胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VL鏈CDR2核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VL鏈CDR3胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VL鏈CDR3核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VH鏈胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VH鏈核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VH鏈CDR1胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VH鏈CDR1核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VH鏈CDR2胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VH鏈CDR2核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VH鏈CDR3胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C11D5.3 VH鏈CDR3核酸序列之一實例如下：

C12A3.2 scFv 序列

密碼子優化C12A3.2 VL鏈胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VL鏈核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VL CDR1胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VL CDR1核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VL CDR2胺基酸序列之一個實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VL CDR2核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VL CDR3胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VL CDR3核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VH鏈胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VH鏈核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VH CDR1胺基酸序列之一個實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VH CDR1核酸序列之一個實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VH CDR2胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VH CDR2核酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VH CDR3胺基酸序列之一實例如下：

密碼子優化C12A3.2 VH CDR3核酸序列之一實例如下：

II.自殺基因

在特定實施例中，自殺基因與任何種類之細胞療法結合使用以控制其使用，且允許細胞療法在所要事件及/或時間時終止。出於在需要時引起經轉導細胞死亡之目的，在經轉導細胞中採用自殺基因。本發明之已經修飾以攜有本發明所涵蓋之載體的細胞可包含一或多種自殺基因。在一些實施例中，如本文所用之術語「自殺基因」定義為在投與前藥或其他藥劑後實現基因產物轉變成殺滅其宿主細胞之化合物的基因。在其他實施例中，自殺基因編碼基因產物，當需要時，該基因產物由靶向自殺基因產物之藥劑(諸如抗體)靶向。

可使用之自殺基因/前藥組合之實例為單純疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)及更昔洛韋(ganciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)或FIAU；氧化還原酶及環己醯亞胺；胞嘧啶脫胺酶及5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)及AZT；以及去氧胞苷激酶及胞嘧啶阿拉伯糖苷。可使用大腸桿菌(E . coli )嘌呤核苷磷酸化酶，即所謂的自殺基因，其將前藥6-甲基嘌呤去氧核糖苷轉化為有毒嘌呤6-甲基嘌呤。與前藥療法一起使用之自殺基因之其他實例為大腸桿菌胞嘧啶脫胺酶基因及HSV胸苷激酶基因。

例示性自殺基因亦包括CD20、CD52、EGFRv3或誘導性凋亡蛋白酶9。在一個實施例中，截短型式之EGFR變異體III (EGFRv3)可用作可藉由西妥昔單抗(Cetuximab)消融之自殺抗原。可用於本發明中之此項技術中已知之其他自殺基因包括：嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、細胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基還原酶(NTR)、鳥嘌呤核糖基轉移酶(XGRTP)、醣苷酶、甲硫胺酸-α,γ-解離酶(MET)及胸苷磷酸化酶(TP)。

在特定實施例中，編碼靶向BCMA之CAR之載體或本文所涵蓋之NK細胞中之任何載體包括一或多種自殺基因。自殺基因可或可不在與靶向BCMA之CAR相同之載體上。在自殺基因存在於與靶向BCMA之CAR相同之載體上的情況下，可例如藉由IRES或2A元件分隔自殺基因與CAR。

在特定實施例中，自殺基因為腫瘤壞死因子(TNF)-α突變體，其不可由自然界中裂解TNF之標準酶，諸如TNF-α-轉化酶(亦稱為TACE)裂解。因此，在特定實施例中，TNF-α突變體為膜結合及不可分泌的。可藉由一或多種結合突變體(包括至少一種抗體)之藥劑靶向本發明中使用之TNF-α突變體，從而使得在藥劑結合至細胞表面上之TNF-α突變體後，細胞死亡。本發明之實施例允許將TNF-α突變體用作表現其之細胞的標記物。

可靶向表現不可裂解TNF-α突變體之細胞以用於選擇性缺失，包括例如使用當前臨床中之經FDA批准之TNF-α抗體，諸如依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)或阿達路單抗(adalilumab)。突變TNF-α多肽可與細胞中之一或多種治療性轉基因，諸如編碼TCR或CAR (包括靶向BCMA之TCR及/或CAR)之基因共表現。另外，表現TNF-α突變體之細胞具有針對腫瘤目標之優良活性，其由膜結合TNF-α蛋白質之生物活性介導。

關於野生型，TNF-α具有26 kD跨膜形式及17 kD分泌組分。Perez等人(1990)中所描述之一些突變可用於本發明中。在特定實施例中，本發明之TNF-α突變體之實例至少包括以下關於17 kD TNF之各者：(1) Val1之缺失及Prol12之缺失；(2) Val13之缺失；(3) Val1之缺失及Val13之缺失；(4) Val1至Prol12且包括Prol12之缺失及Val13之缺失(缺失13aa)；(5) Ala-3至Val 13且包括Val 13之缺失(缺失14 aa))。在特定實施例中，TNF-α突變體包含以下位置處之各別胺基酸之缺失：-3、-2、-1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，或其組合。特定組合包括以下位置處之缺失：-3至13且包括13；-3至12且包括12；-3至11且包括11；-3至10且包括10；-3至9且包括9；-3至8且包括8；-3至7且包括7；-3至6且包括6；-3至5且包括5；-3至4且包括4；-3至3且包括3；-3至2且包括2；-3至1且包括1；-3至-1且包括-1；-3至-2且包括-2；-2至13且包括13；-2至12且包括12；-2至11且包括11；-2至10且包括10；-2至9且包括9；-2至8且包括8；-2至7且包括7；-2至6且包括6；-2至5且包括5；-2至4且包括4；-2至3且包括3；-2至2且包括2；-2至1且包括1；-2至-1且包括-1；-1至13且包括13；-1至12且包括12；-1至11且包括11；-1至10且包括10；-1至9且包括9；-1至8且包括8；-1至7且包括7；-1至6且包括6；-1至5且包括5；-1至4且包括4；-1至3且包括3；-1至2且包括2；-1至1且包括1；1至13且包括13；1至12且包括12；1至11且包括11；1至10且包括10；1至9且包括9；1至8且包括8；1至7且包括7；1至6且包括6；1至5且包括5；1至4且包括4；1至3且包括3；1至2且包括2等等。

TNF-α突變體可藉由任何適合之方法產生，但在特定實施例中其係藉由定點突變誘發產生。在一些情況下，TNF-α突變體可具有除使得蛋白質不可裂解之突變以外的突變。在特定情況下，除Val1、Pro12及/或Val13或其之間區域處之缺失外，TNF-α突變體可具有1、2、3或更多個突變。除使得突變不可分泌之突變以外的突變可為胺基酸取代、缺失、添加、倒位等中之一或多者。在其中另外突變為胺基酸取代之情況下，取代例如可為或可不為對保守胺基酸之取代。在一些情況下，1、2、3、4、5或更多個另外胺基酸可存在於蛋白質之N末端及/或C末端上。在一些情況下，TNF-α突變體具有(1)一或多個使得突變不可分泌之突變；(2)一或多個防止突變體之由外而內信號傳導之突變；及/或(3)一或多個干擾突變體與TNF受體1及/或TNF受體2結合之突變。

在特定實施例中，TNF-α突變體多肽包含相對於SEQ ID NO:30之以下缺失：胺基酸殘基1及胺基酸殘基12；胺基酸殘基1及胺基酸殘基13；胺基酸殘基1-12；胺基酸殘基1-13或胺基酸殘基-1至13。

TNF-α delVal1 delProl12胺基酸序列：

TNF-α突變體-delVal1 del Prol12核酸序列

TNFα突變體-del Val1至Val13胺基酸序列(缺失13aa)

TNFα突變體-del Val1至Prol12 delVal13 (缺失13aa)核酸序列

TNF-α delVal1 delVal13胺基酸序列：

TNF-α delVal1 delVal13核酸序列：

TNF-α delAla-3至Val 13核酸序列：

TNF-α delAla-3至Val 13胺基酸序列：

除防止由外而內信號傳導之CIK模體突變及干擾TNF-α與TNF受體1及TNF受體2之結合的其他突變之一實例以外，本發明之實施例包括具有del Ala-3至Val13核酸序列之TNF-α突變

由SEQ ID NO:28編碼之具有del Ala-3至Val13胺基酸序列之TNF-α突變體

在特定實施例中，TNF-α突變體可包含Ala-3至Val13之缺失，但不亦包含CIK模體突變及干擾與TNF受體1及/或TNF受體2之結合的突變。

TNF野生型，26 kD型式之胺基酸序列：

TNF野生型，17 kD型式之胺基酸序列

TNF-α突變體不具有細胞內TNF信號傳導或TNF受體結合能力

不具有胞內TNF信號傳導或TNF-受體結合能力突變體之此等TNF-α突變體在細胞質信號傳導域中及/或在TNF-受體結合區中具有突變，且因此不發揮任何生物活性，因為其分別缺乏反向信號傳導能力及/或結合TNF-受體之能力。此允許構築體中之TNF-α成為TNF抑制劑之目標，同時不發揮生物活性。

在本發明之一些實施例中，TNF-α突變體不具有TNF-α之細胞質內域之一部分或全部，使得TNF-α突變體不能發揮細胞內信號傳導(反向信號傳導)。不可分泌TNF-α突變體可或可不亦突變成不具有細胞質內域之一部分或全部。

TNF-α之任何態樣可經突變，無論突變是否將使得TNF-α不可分泌。作為一實例且關於TNF-α之結構，可以使TNF-α之以下區域中之任一者突變。細胞質內域包含MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFL (SEQ ID NO:32)。酪蛋白激酶I (CKI)位點為STES (SEQ ID NO:33)。跨膜域為FSFLIVAGATTLFCLLHFGVI (SEQ ID NO:34)。SPPL2b切割位點為SL/LI。連接子包含GPQREEFPRDLSLISPLAQA (SEQ ID NO:35)。TACE切割位點為VRSSSRTPSDKPV (SEQ ID NO:36)。P01375係指蛋白質之UniProt編號。

分別用於核酸及胺基酸之del Ala-1至del13 CKI模體(突變序列加下劃線)之TNF-α突變體之特定實例如下：

核酸及胺基酸之具有在細胞質內序列中在M-71K處之突變及在Y87H處之另一突變的TNF-α突變體之一個實例(突變序列加下劃線)分別如下：

核酸及胺基酸之具有在S95F及C-28F處之突變的TNF-α突變體之一個實例(突變序列加下劃線)分別如下：

核酸及胺基酸之具有在S133I及S147Y處之突變的TNF-α突變體之一個實例(突變序列加下劃線)分別如下：

核酸及胺基酸之具有在Asp143Tyr處之突變及在位置-1處之Ala之缺失的TNF-α突變體之一個實例(突變序列加下劃線且藉由刪除線示出所缺失序列)分別如下：

不具有所缺失序列之SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:46之型式分別如下(其中突變序列仍加下劃線)。

具有CIK模體突變與以上提及之突變之組合的TNF-α突變體之一個實例如下，其中突變加下劃線：

具有CKI突變(5aamut)及delAla-1至Val13 (14aa del)之TNFα突變體之一個實例如下： delAla-1至Val13 (14aa del) CKI mut 5amut

在特定實施例中，在遞送有效量之一或多種結合至表現TNF-α突變體之靶向BCMA CAR之細胞的藥劑後，消除大部分表現TNF-α突變體之細胞。在特定實施例中，在個體中消除超過50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之表現TNF-α突變體之細胞。在識別需要消除細胞之後，可繼續向個體遞送一或多種藥劑直至一或多種症狀不再存在或直至已消除足夠數目之細胞為止。個體中之細胞數目可使用TNF-α突變體作為標記物來監測。

本發明之方法之實施例可包含向有需要之個體提供有效量之細胞療法的第一步驟，其中細胞包含一或多種不可分泌TNF-α突變體；及使用一或多種TNF-α突變體作為自殺基因消除細胞(藉由任何機制直接或間接經由細胞死亡)之第二步驟。第二步驟可在個體出現至少一個不良事件時發起，且該不良事件可藉由任何手段識別，包括在可或可並非自細胞療法開始持續之常規監測後。可在檢查及/或測試後偵測到一或多種不良事件。在其中個體患有細胞介素釋放症候群(其亦可稱為細胞介素風暴)之情況下，個體例如可能出現升高之一或多種發炎性細胞介素(僅作為實例：干擾素-γ、粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子、IL-10、IL-6及TNF-α)；發熱；疲乏；低血壓；低氧症、心動過速；噁心；毛細血管滲漏；心臟/腎/肝功能障礙；或其組合。在其中個體具有神經毒性之情況下，個體可能出現意識模糊、譫妄、發育不全及/或癲癇。在一些情況下，測試個體之與細胞介素釋放症候群之發作及/或嚴重程度相關之標記物，諸如C反應蛋白、IL-6、TNF-α及/或鐵蛋白。

在另外實施例中，舉例而言，在細胞介素釋放症候群或神經毒性期間投與結合不可分泌TNF-α之一或多種藥劑具有中和促成療法毒性之高含量之可溶性TNF-α的附加益處。可溶性TNF-α在細胞介素釋放症候群期間以高含量釋放且為CAR T細胞療法之毒性介體。在此類情況下，本文所涵蓋之TNF-α抗體之投藥具有雙重有益作用，亦即表現TNF-α突變體之細胞之選擇性缺失以及中和引起毒性之可溶性TNF-α。因此，本發明之實施例涵蓋消除或降低接受或已接受過繼性細胞療法(其中細胞表現不可分泌TNF-α突變體)之個體中的細胞介素釋放症候群之嚴重程度的方法，其包含提供有效量之結合不可分泌TNF-α突變體之藥劑的步驟，該藥劑在個體中引起(a)消除細胞療法之細胞中之至少一些；及(b)降低可溶性TNF-α之含量。

本發明之實施例包括減少已接受或正接受使用表現不可分泌TNF-α突變體之細胞的細胞療法之個體中的細胞介素釋放症候群之影響的方法，其包含提供有效量之一或多種結合突變體以在個體中引起以下之藥劑的步驟：(a)消除細胞療法之細胞中之至少一些；及(b)降低可溶性TNF-α之含量。

當需要使用TNF-α自殺基因時，向個體提供有效量之一或多種能夠抑制(諸如藉由直接結合)細胞表面上之TNF-α突變體之抑制劑。在一些實施例中，可全身性及/或局部向個體提供抑制劑。抑制劑可為多肽(諸如抗體)、核酸、小分子(例如黃嘌呤衍生物)、肽，或其組合。在特定實施例中，抗體係經FDA批准。當抑制劑為抗體時，在至少一些情況下抑制劑可為單株抗體。當採用抗體之混合物時，混合物中之一或多種抗體可為單株抗體。小分子TNF-α抑制劑之實例包括諸如美國專利第5,118,500號中所描述之小分子，該專利以全文引用之方式併入本文中。多肽TNF-α抑制劑之實例包括多肽，諸如美國專利第6,143,866號中所描述之多肽，該專利以全文引用之方式併入本文中。

在特定實施例中，至少一種抗體用於靶向TNF-α突變體以觸發其作為自殺基因之活性。舉例而言，抗體之實例至少包括阿達木單抗(Adalimumab)、阿達木單抗-atto、聚乙二醇化賽妥珠單抗(Certolizumab pegol)、依那西普、依那西普-szzs、戈利木單抗(Golimumab)、英利昔單抗、英利昔單抗-dyyb，或其混合物。

本發明之實施例包括降低個體之細胞療法的毒性風險之方法，其藉由修飾細胞療法之細胞以表現不可分泌之TNF-α突變體。在特定實施例中，該細胞療法係用於癌症，且其可包含靶向包括癌症抗原之抗原的工程化受體。

在特定實施例中，除本發明之本發明NK細胞療法以外，可已向個體提供、可向個體提供及/或可將向個體提供用於醫學病況之另外療法。在醫學病況為癌症之情況下，可向個體提供手術、放射、免疫療法(除本發明之細胞療法以外)、激素療法、基因療法、化學療法等中之一或多者。III. 細胞介素

一或多種細胞介素可自載體共表現為與抗原受體分開之多肽。舉例而言，介白素-15 (IL-15)為組織限定的，且僅在病理條件下觀測到在血清中或全身的任何含量。IL-15具有過繼性療法所要之若干屬性。IL-15為恆穩細胞介素，其誘導自然殺手細胞之發育及細胞增殖、經由緩解腫瘤駐留細胞之功能性抑制來促進已形成腫瘤之根除，以及抑制活化誘導之細胞死亡(AICD)。除IL-15之外，亦設想其他細胞介素。此等細胞介素包括(但不限於)促成用於人類應用之細胞之活化及增殖的細胞介素、趨化因子及其他分子。表現IL-15之NK細胞能夠持續支持細胞介素信號傳導，其適用於該等細胞在輸注後存活。

在特定實施例中，NK細胞表現一或多種外源提供之細胞介素。作為一個實例，細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21或其組合。細胞介素可以外源方式提供至NK細胞，因為其係由細胞內之表現載體表現。在替代情況下，細胞中之內源性細胞介素在操縱內源性細胞介素之表現(諸如細胞介素之啟動子位點處之基因重組)後上調。在細胞介素提供於細胞之表現構築體上之情況下，細胞介素可由與TNF-α突變體基因相同之載體編碼。細胞介素可與TNF-α突變體一樣表現為分隔之多肽分子形式且表現為與細胞之工程化受體分隔之多肽。在一些實施例中，本發明涉及CAR及/或TCR載體與IL-15之共利用。IV. 載體

靶向BCMA之CAR可藉由任何適合之載體，包括藉由病毒載體或非病毒載體遞送至受體NK細胞。病毒載體之實例至少包括反轉錄病毒、豆狀病毒、腺病毒或腺相關病毒載體。非病毒載體之實例至少包括質體、轉座子、脂質、奈米粒子等。

在NK細胞用編碼靶向BCMA之CAR之載體轉導且亦需要將另一或多個基因(諸如自殺基因及/或細胞介素及/或視情況存在之治療性基因產物)轉導至細胞中之情況下，靶向BCMA之CAR、自殺基因、細胞介素及視情況存在之治療性基因可包含或可不包含於相同載體上或與相同載體一起。在一些情況下，靶向BCMA之CAR、自殺基因、細胞介素及視情況存在之治療性基因自相同載體分子(諸如相同病毒載體分子)表現。在此類情況下，靶向BCMA之CAR、自殺基因、細胞介素及視情況存在之治療性基因之表現可藉由或可不藉由相同調節元件調節。當靶向BCMA之CAR、自殺基因、細胞介素及視情況選用之治療性基因在同一載體上時，其可表現為或可不表現為分隔多肽。在其表現為分隔多肽之情況下，其可藉由例如2A元件或IRES元件在載體上分隔(或可在同一載體上使用該兩種一次或超過一次)。A. 一般實施例

熟習此項技術者將有充分的能力經由用於表現本發明之抗原受體之標準重組技術來構築載體(參見例如Sambrook等人, 2001及Ausubel等人, 1996，兩者均以引用的方式併入本文中)。 1.調節元件

包括於適用於本發明之載體中的表現卡匣尤其含有(在5'至3'方向上)可操作地連接於蛋白質編碼序列之真核細胞轉錄啟動子、包括介入序列之剪接信號及轉錄終止/聚腺苷酸化序列。控制真核細胞中編碼蛋白質之基因之轉錄的啟動子及強化子可由多個基因元件構成。細胞機制能夠聚集且整合由各元件傳達之調節資訊，從而不同基因演進出不同的、通常複雜的轉錄調節模式。舉例而言，在本發明之上下文中所使用之啟動子包括組成性、誘導性及組織特異性啟動子。在其中載體用於產生癌症療法之情況下，啟動子可在低氧條件下有效。 2.啟動子/強化子

本文所提供之表現構築體包含驅動抗原受體及其他順反子基因產物之表現的啟動子。啟動子一般包含用於定位RNA合成之起始位點的序列。此啟動子之最佳已知實例為TATA盒，但在不具有TATA盒之一些啟動子(諸如哺乳動物末端去氧核苷酸轉移酶基因之啟動子及SV40晚期基因之啟動子)中，上覆於起始位點本身之離散元件有助於固定起始位置。另外啟動子元件調節轉錄起始頻率。通常，此等元件位於起始位點上游之區域中，但已展示多個啟動子亦含有起始位點下游之功能元件。為「在啟動子控制下」引入編碼序列，將轉錄閱讀框架之轉錄起始位點之5'端定位於所選啟動子之「下游」(亦即3'端)。「上游」啟動子刺激DNA之轉錄且促進經編碼RNA之表現。

啟動子元件之間的間距通常為靈活的，使得當元件倒置或相對於彼此移動時保留啟動子功能。在例如tk啟動子中，啟動子元件之間的間距可在活性開始下降之前增加至相隔50 bp。視啟動子而定，個別元件似乎可協同或獨立地發揮活化轉錄功能。啟動子可或可不與「強化子」結合使用，該強化子係指涉及核酸序列之轉錄活化的順式作用調節序列。

啟動子可為與核酸序列天然相關之一種啟動子，如可由分離位於編碼鏈段及/或外顯子上游之5'端非編碼序列而獲得。此類啟動子可稱為「內源性」的。類似地，強化子可為與核酸序列天然相關，位於彼序列下游或上游之一種強化子。或者，某些優勢將藉由將編碼核酸鏈段定位於重組或異源啟動子控制下來獲得，該重組或異源啟動子係指在其天然環境中通常不與核酸序列相關之啟動子。重組或異源強化子亦指在其天然環境中通常不與核酸序列相關之強化子。此類啟動子或強化子可包括其他基因之啟動子或強化子，及自任何其他病毒或原核或真核細胞分離之啟動子或強化子，及非「天然存在」之啟動子或強化子，亦即其含有不同轉錄調節區之不同元件，及/或改變表現之突變。舉例而言，最常用於重組DNA構築之啟動子包括β-內醯胺酶(青黴素酶)、乳糖及色胺酸(trp-)啟動子系統。除以合成方式產生啟動子及強化子之核酸序列以外，可結合本文所揭示之組合物使用重組選殖及/或核酸擴增技術(包括PCR™)產生序列。此外經考慮，亦可採用引導非核細胞器(諸如粒線體、葉綠體及其類似物)內之序列之轉錄及/或表現的控制序列。

當然，採用有效引導DNA鏈段在選擇用於表現之細胞器、細胞類型、組織、器官或生物體中之表現的啟動子及/或強化子將為至關重要的。熟習分子生物學技術者一般知曉使用啟動子、強化子及細胞類型組合進行蛋白質表現(參見例如Sambrook等人 1989，其以引用的方式併入本文中)。所採用之啟動子可為組成性的、組織特異性的、誘導性的及/或適用於在適當條件下引導所引入之DNA鏈段的高表現量，諸如在重組蛋白及/或肽的大規模產生方面為有利的。啟動子可為異源或內源性的。

另外，任何啟動子/強化子組合(按照例如真核細胞啟動子資料庫(Eukaryotic Promoter Data Base；EPDB)，經由epd.isb-sib.ch/處之全球資訊網)亦可用於驅動表現。另一可能實施例為使用T3、T7或SP6細胞質表現系統。若提供適當細菌聚合酶作為遞送複合物之一部分或作為另外基因表現構築體，則真核細胞可支持自某些細菌啟動子進行之細胞質轉錄。

啟動子之非限制性實例包括早期或晚期病毒啟動子，諸如SV40早期或晚期啟動子、細胞巨大病毒(CMV)極早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)早期啟動子；真核細胞啟動子，諸如β肌動蛋白啟動子、GADPH啟動子、金屬硫蛋白啟動子；及串聯反應元件啟動子，諸如環狀AMP反應元件啟動子(cre)、血清反應元件啟動子(sre)、佛波醇啟動子(TPA)及靠近最小TATA盒之反應元件啟動子(tre)。亦可使用人類生長激素啟動子序列(例如GenBank®，寄存編號X05244，核苷酸283-341處所描述之人類生長激素最小啟動子)或小鼠乳房腫瘤啟動子(可購自ATCC，目錄號ATCC 45007)。在某些實施例中，啟動子為CMV IE、凝集素-1 (dectin-1)、凝集素-2、人類CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌動蛋白、MHC I類或MHC II類啟動子，然而適用於驅動治療性基因表現之任何其他啟動子亦可適用於實踐本發明。

在某些態樣中，本發明之方法亦涉及強化子序列，亦即增加啟動子活性且具有以順式方式起作用之潛能的核酸序列，且不考慮其定向，甚至跨越相對較長之距離(與目標啟動子相距多達數千鹼基)。然而，強化子功能不一定受限於此類較長距離，因為其等在非常接近特定啟動子處亦起作用。 3.起始信號及連接表現

特定起始信號亦可用於本發明中所提供之表現構築體中以便有效轉譯編碼序列。此等信號包括ATG起始密碼子或相鄰序列。可能需要提供包括ATG起始密碼子之外源性轉譯控制信號。一般熟習此項技術者將容易地能夠判定此情形且提供必需信號。熟知起始密碼子必須在所需編碼序列之閱讀框架「框內」，以確保整個插入物之轉譯。外源性轉譯控制信號及起始密碼子可為天然或合成的。表現效率可藉由包括適當的轉錄強化子元件來增強。

在某些實施例中，使用內部核糖體入口位點(IRES)元件之用途產生多基因或多順反子訊息。IRES元件能夠繞過5'甲基化封端依賴性轉譯之核糖體掃描模型且在內部位點開始轉譯。已描述來自小核糖核酸病毒家族(脊髓灰質炎及腦心肌炎)之兩個成員的IRES元件以及來自哺乳動物訊息之IRES。IRES元件可連接至異源開放閱讀框架。多個開放閱讀框架可轉錄在一起，各自藉由IRES分隔，產生多順反子訊息。藉助於IRES元件，各開放閱讀框架可接近核糖體以便有效轉譯。可使用單一啟動子/強化子轉錄單一訊息來有效表現多個基因。

如本文中其他地方所詳述，某些2A序列元件可用於在本發明中所提供之構築體中產生基因之連接表現或共表現。舉例而言，裂解序列可用於藉由連接開放閱讀框架以形成單一順反子來共表現基因。例示性裂解序列為馬鼻炎A病毒(E2A)或F2A (口蹄疫病毒2A)或「2A樣」序列(例如明脈扁刺蛾病毒2A (Thosea asigna virus 2A)；T2A)或豬鐵士古病毒-1 (porcine teschovirus-1，P2A)。在特定實施例中，在單一載體中，多個2A序列不一致，但在替代實施例中，相同載體利用相同2A序列中之兩者或更多者。2A序列之實例提供於US 2011/0065779中，其以全文引用之方式併入本文中。 4.複製起點

為了在宿主細胞中繁殖載體，其可含有一或多個複製位點起點(通常稱為「ori」)，例如，對應於如上文所描述之EBV之oriP，或在程式化中具有類似或較高功能的經基因工程化之oriP的核酸序列，該核酸序列為複製起始之特定核酸序列。或者，可採用如上文所描述之其他超染色體複製病毒或自主複製序列(ARS)之複製起點。 5.選擇及可篩選標記物

在一些實施例中，可藉由在表現載體中包括標記物而活體外或活體內鑑別包含本發明之構築體之NK細胞。此類標記物將賦予細胞可鑑別之變化，允許容易地鑑別含有表現載體之細胞。一般而言，選擇標記物為一種賦予允許選擇之特性的標記物。陽性選擇標記物為其中標記物之存在允許其選擇之一種標記物，而陰性選擇標記物為其中其存在防止其選擇之一種標記物。陽性選擇標記物之一實例為抗藥性標記物。

通常，包括藥物選擇標記物有助於選殖及鑑別轉化子，例如賦予新黴素、嘌呤黴素、潮黴素、DHFR、GPT、吉歐黴素(zeocin)及組胺醇抗性之基因為適用的選擇標記物。除了賦予允許基於條件之實施區分轉化子之表型的標記物之外，亦考慮其他類型之標記物，包括基於比色分析之可篩選標記物，諸如GFP。替代地，可利用可篩選酶作為陰性選擇標記物，諸如單純疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)。熟習此項技術者亦將知曉如何使用免疫標記物，可能結合FACS分析。不認為所用標記物很重要，只要其能夠與編碼基因產物之核酸同時表現即可。選擇及可篩選標記物之其他實例為熟習此項技術者所熟知的。B. 多順反子載體

在特定實施例中，靶向BCMA之CAR、自殺基因、細胞介素及/或視情況存在之治療性基因自多順反子載體表現(如本文所用，術語「順反子」係指可產生基因產物之核酸序列)。在特定實施例中，多順反子載體編碼靶向BCMA之CAR、TNF-α突變體及至少一種細胞介素、及/或工程化之受體(諸如T細胞受體)及/或另一種非靶向BCMA之CAR。在一些情況下，多順反子載體編碼至少一種靶向BCMA之CAR、至少一種TNF-α突變體及至少一種細胞介素。細胞介素可為特定類型之細胞介素，諸如人類或小鼠或任何物種。在特定情況下，細胞介素為IL15、IL12、IL2、IL18及/或IL21。

在某些實施例中，本發明利用具有在實質上一致水準下表現多個順反子之能力的多順反子載體來提供可撓性模組化系統(如本文所使用之術語「模組」係指順反子或順反子之組分，其實現其可互換性(諸如藉由使用標準重組技術分別藉由移除及替換整個順反子或順反子之組分))。該系統可用於細胞工程化，從而允許多個基因之組合表現(包括過度表現)。在特定實施例中，由載體表現之基因中之一或多者包括一個、兩個或更多個抗原受體。多個基因可包含但不限於：CAR、TCR、細胞介素、趨化因子、導向受體、CRISPR/Cas9介導之基因突變、誘餌受體、細胞介素受體、嵌合細胞介素受體等。載體可進一步包含：(1)一或多個報導子，例如螢光或酶報導子，諸如用於細胞分析及動物成像；(2)一或多種細胞介素或其他信號傳導分子；及/或(3)自殺基因。

在特定情況下，載體可包含藉由任何種類之裂解位點(諸如2A裂解位點)分隔的至少4個順反子。載體可或可不基於莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV或MMLV)，包括具有pUC19主鏈中之psi封裝序列的3'及5' LTR。載體可包含具有三個或更多個2A裂解位點及多個ORF之4個或更多個順反子以用於基因調換。在一些實施例中，系統允許由一或多個限制位點側接之多個基因(7個或更多)之組合過度表現以便經由次選殖快速整合，且系統亦包括至少三個2A自裂解位點。因此，系統允許表現多種CAR、TCR、信號傳導分子、細胞介素、細胞介素受體及/或導向受體。此系統亦可應用於其他病毒及非病毒載體，包括但不限於豆狀病毒、腺病毒AAV以及非病毒質體。

系統之模組化性質亦允許將基因有效次選殖至多順反子表現載體中之4個順反子中之每一者及調換基因，諸如用於快速測試。位於多順反子表現載體中關鍵位置之限制位點允許高效調換基因。

本發明之實施例涵蓋利用多順反子載體之系統，其中載體之至少一部分為模組化的，例如藉由允許移除及置換一或多個順反子(或一或多個順反子之一或多個組分)，諸如藉由利用一或多個特異性選擇其身分及位置以促進載體之模組化使用的限制酶位點。載體亦具有其中多個順反子被轉譯為單一多肽且加工成分隔之多肽，由此賦予載體以實質上等莫耳濃度表現分隔之基因產物的優勢之實施例。

本發明之載體經組態以模組化以便能夠改變載體之一或多個順反子及/或改變一或多個特定順反子之一或多個組分。載體可經設計以利用側接一或多個順反子之末端及/或側接特定順反子之一或多個組分之末端的特有限制酶位點。

本發明之實施例包括多順反子載體，其包含各自由一或多個限制酶位點側接之至少兩個、至少三個或至少四個順反子，其中至少一個順反子編碼至少一種抗原受體。在一些情況下，兩個、三個、四個或更多個順反子被轉譯成單一多肽且裂解成分隔之多肽，而在其他情況下，多個順反子被轉譯成單一多肽且裂解成分隔之多肽。載體上之相鄰順反子可藉由自裂解位點(諸如2A自裂解位點)分隔。在一些情況下，順反子中之每一者表現與載體分隔之多肽。在特定情況下，載體上之相鄰順反子係藉由IRES元件分隔。

在某些實施例中，本發明提供一種用於細胞工程化之系統，其允許可包括例如一種、兩種或更多種抗原受體之多個順反子組合表現，包括過度表現。在特定實施例中，使用如本文所描述之多順反子載體允許載體由相同mRNA產生等莫耳量之多種基因產物。多個基因可包含但不限於：CAR、TCR、細胞介素、趨化因子、導向受體、CRISPR/Cas9介導之基因突變、誘餌受體、細胞介素受體、嵌合細胞介素受體等。載體可進一步包含一或多個螢光或酶報導子，諸如用於細胞分析及動物成像。載體亦可包含自殺基因產物，以用於在提供有攜有載體之細胞的宿主不再需要其或其對宿主變得有害時終止攜帶載體之細胞。

在本發明之特定實施例中，載體上之順反子中之至少一者包含兩個或更多個模組化組分，其中順反子內之模組化組分中之每一者係由一或多個限制酶位點側接。舉例而言，順反子可包含三個、四個或五個模組化組分。在至少一些情況下，順反子編碼具有由相應模組化組分編碼之受體之不同部分的抗原受體。順反子之第一模組化組分可編碼受體之抗原結合域。另外，順反子之第二模組化組分可編碼受體之鉸鏈區。另外，順反子之第三模組化組分可編碼受體之跨膜域。另外，順反子之第四模組化組分可編碼第一協同刺激域。另外，順反子之第五模組化組分可編碼第二協同刺激域。另外，順反子之第六模組化組分可編碼信號傳導域。

在本發明之特定態樣中，載體上之兩個不同順反子各自編碼不同抗原受體。兩種抗原受體均可由包含兩個或更多個模組化組分之順反子，包括包含兩個或更多個模組化組分的獨立順反子編碼。抗原受體可為例如嵌合抗原受體(CAR)及/或T細胞受體(TCR)。

在特定實施例中，載體為病毒載體(例如反轉錄病毒載體、豆狀病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體)或非病毒載體。載體可包含莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV) 5' LTR，3' LTR及/或psi封裝元件。在特定情況下，psi封裝併入於5' LTR與抗原受體編碼序列之間。載體可或可不包含pUC19序列。在載體之一些態樣中，至少一種順反子編碼細胞介素(例如介白素15(IL-15)、IL-7、IL-21或IL-2)、趨化因子、細胞介素受體及/或導向受體。

當2A裂解位點用於載體中時，2A裂解位點可包含P2A、T2A、E2A及/或F2A位點。

除編碼靶向BCMA之CAR之一個順反子之外，載體之任何順反子可構成自殺基因。載體之任何順反子可編碼報導基因。在特定實施例中，第一順反子編碼自殺基因，第二順反子編碼靶向BCMA之CAR，第三順反子編碼報導基因，且第四順反子編碼細胞介素。在某些實施例中，第一順反子編碼自殺基因，第二順反子編碼靶向BCMA之CAR，第三順反子編碼第二CAR或另一抗原受體，且第四順反子編碼細胞介素。在特定實施例中，靶向BCMA之CAR及/或另一受體之不同部分係由相應模組化組分編碼，且第二順反子之第一組分編碼抗原結合域，第二組分編碼鉸鏈及/或跨膜域，第三組分編碼協同刺激域，且第四組分編碼信號傳導域。

本發明之方法及組合物涵蓋單一載體上之順反子之任何適合次序。

在特定實施例中，載體之多個順反子係經一或多個提供基因自相應多個順反子至單一轉錄物之表現的元件分隔。隨後轉譯單一轉錄物以產生多蛋白質多肽，其經加工(例如藉由裂解)以使得蛋白質變成分隔之蛋白質分子。例示性元件為編碼自裂解肽，諸如2A肽裂解序列之位點。其他裂解位點包括弗林蛋白酶裂解位點(furin cleavage site)或菸草蝕刻病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)裂解位點。在其他情況下，載體之順反子係藉由一或多個提供分隔之順反子之不同轉譯的元件(諸如IRES序列)分隔。在一些情況下，載體利用兩種類型之元件之組合。

相關基因負荷可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個包含可自載體表現之至少一個ORF的順反子。本發明之實施例包括處於其中相關基因負荷可能當前未容納於載體中，但載體仍保留存在時表現及/或進一步加工順反子所需的一或多個結構或管家元件(諸如一或多個啟動子、多個2A序列等)之狀態下的載體。載體可具有多個順反子，其能夠轉譯成單一多肽且加工成分隔之多肽(諸如藉由使用相鄰順反子之間的2A自裂解位點)。在替代實施例中，多個順反子均表現為分隔之多肽(諸如藉由使用相鄰順反子之間的IRES元件)。

在特定情況下，載體中相關基因負荷之結構可如下： 順反子1-2A-順反子2-2A-順反子3-2A-順反子4，

其中在特定實施例中，順反子1、順反子2、順反子3及順反子4為不同基因。在至少一些情況下，載體內之2A序列可一致或可不一致。

在特定實施例中，順反子中之至少一者編碼自殺基因。在一些實施例中，順反子中之至少一者編碼細胞介素。在某些實施例中，至少一個順反子編碼靶向BCMA之CAR。順反子可或可不編碼報導基因。在某些實施例中，至少兩個順反子編碼兩種不同抗原受體(例如CAR及/或TCR)。順反子可或可不編碼報導基因。

在相關基因負荷之特定組態中，單一載體可包含編碼靶向BCMA之CAR之順反子及編碼與靶向BCMA之CAR受體不同之第二抗原受體之順反子。在特定實施例中，第一抗原受體編碼靶向BCMA之CAR且第二抗原受體編碼TCR，或反之亦然。在特定實施例中，包含分別編碼靶向BCMA之CAR及第二抗原受體之分隔之順反子的載體亦包含編碼細胞介素或趨化因子之第三順反子及編碼自殺基因之第四順反子。然而，自殺基因及/或細胞介素(或趨化因子)可不存在於載體上。

在特定實施例中，至少一個順反子包含呈模組化的多個組分本身。舉例而言，一個順反子可編碼多組分基因產物，諸如具有多個部分之抗原受體；在特定情況下，抗原受體係由單一順反子編碼，由此最終產生單一多肽。編碼多個組分之順反子可具有由1、2、3、4、5個或更多個限制酶消化位點(包括包含順反子之載體特有的1、2、3、4、5個或更多個限制酶消化位點)分隔的多個組分(圖1A及圖1B)。在特定實施例中，具有多個組分之順反子編碼具有多個相應部分(各自為受體提供特有功能)之抗原受體。在特定實施例中，多組分順反子之組分之每一者或大部分係藉由一或多個載體特有的限制酶消化位點分隔，從而在需要時允許分隔之組分有互換性。

作為說明，多組分順反子之一個實例的模組性係經組態如下，其中存在一或多個特有限制酶位點，如各X所表示： 組分1--X₁ -組分2---X₂ -組分3---X₃ -組分4---X₄ -組分5---X₅ -等。

在特定實施例中，多組分順反子之各組分對應於經編碼抗原受體，諸如靶向BCMA之CAR之不同部分。在說明性實施例中，組分1可編碼受體之BCMA抗原結合域；組分2可編碼受體之鉸鏈域；組分3可編碼受體之跨膜域；組分4可編碼受體之協同刺激域，且組分5可編碼受體之信號傳導域。在特定實施例中，靶向BCMA之CAR可包含一或多個協同刺激域，其各自藉由特有限制酶消化位點分隔以便受體內之一或多個協同刺激域有互換性。

在特定實施例中，存在具有四個分隔之順反子的多順反子載體，其中相鄰順反子係藉由2A裂解位點分隔，但在特定實施例中，替代2A裂解位點，存在直接或間接引起分隔之多肽由順反子產生的元件(諸如IRES序列)。舉例而言，四個分隔之順反子可藉由三個2A肽裂解位點分隔，且各順反子具有側接順反子之各端的限制位點(X₁ 、X₂ 等)以實現特定順反子諸如與另一順反子或其他類型之序列的互換性，且此係在使用標準重組技術後出現。在特定實施例中，側接順反子中之每一者的一或多個限制酶位點對於載體為特有的，以允許易於重組，但在替代性實施例中，限制酶位點對於載體並非特有。

在特定實施例中，載體藉由實現特定順反子內(包括在特定順反子之多個組分內)之互換性提供特有的第二層級模組化。特定順反子之多個組分可藉由一或多個限制酶位點(包括載體特有的彼等限制酶位點)分隔，以實現順反子內之一或多個組分的互換性。作為一實例，順反子2可包含五個分隔之組分，但每個順反子亦可存在2、3、4、5、6個或更多個組分。作為一實例，載體可包括具有各自由特有酶限制位點X₉ 、X₁₀ 、X₁₁ 、X₁₂ 、X₁₃ 及X₁₄ 分隔，以允許標準重組以使不同組分1、2、3、4及/或5交換之五個組分的順反子2。在一些情況下，在不同組分之間可存在多個限制酶位點(其為特有的，但替代地，亦為一或多個並非特有的)且在多個限制酶位點之間可存在序列(但替代地亦可不存在)。在某些實施例中，出於可互換之目的設計由順反子編碼之所有組分。在特定情況下，順反子之一或多個組分設計成可互換的，而順反子之一或多個其他組分可不設計成可互換的。

在特定實施例中，順反子編碼具有多種組分之靶向BCMA之CAR分子。舉例而言，順反子2可包含編碼具有由組分1、組分2、組分3等表示之分隔之組分的靶向BCMA之CAR分子的序列。CAR分子可包含2、3、4、5、6、7、8個或更多個可互換組分。在特定實例中，組分1編碼BCMA scFv；組分2編碼鉸鏈；組分3編碼跨膜域；組分4編碼協同刺激域(但亦可存在編碼由限制位點側接以供交換之第二或更多個協同刺激域的組分4ʹ)；且組分5編碼信號傳導域。在特定實例中，組分1編碼BCMA scFv；組分2編碼IgG1鉸鏈及/或跨膜域；組分3編碼CD28；且組分4編碼CD3ζ。

熟習此項技術者在載體設計方面應認識到，各種順反子及組分必須經組態使得其在必要時保持在框架中。

在特定實例中，順反子1編碼自殺基因；順反子2編碼靶向BCMA之CAR；順反子3編碼報導基因；順反子4編碼細胞介素；順反子2之組分1編碼scFv；順反子2之組分2編碼IgG1鉸鏈；順反子2之組分3編碼CD28；且組分4編碼CD3ζ。

限制酶位點可呈任何種類且在其識別位點處可包括任何數目之鹼基，諸如4個與8個鹼基之間；識別位點中之鹼基數可為至少4個、5個、6個、7個、8個或更多個。切割時位點可產生鈍切口或黏端。限制酶可屬於例如I型、II型、III型或IV型。限制酶位點可由可用資料庫，諸如整合相關酶資料庫(Integrated relational Enzyme database，IntEnz)或全面酶資訊系統(The Comprehensive Enzyme Information System；BRENDA)獲得。

例示性載體可為圓形且依據慣例，其中將位置1 (圓圈頂部之12點鐘位置，其餘序列沿順時針方向)設定在5' LTR之起點。

在其中利用自裂解2A肽之實施例中，2A肽可為在真核細胞中轉譯期間介導多肽之「裂解」的長為18-22個胺基酸(aa)之病毒寡肽。名稱「2A」係指病毒基因體之特定區域且不同病毒2A一般以其衍生自之病毒命名。第一個發現之2A為F2A (口蹄疫病毒)，其後亦鑑別出E2A (馬鼻炎A病毒)、P2A (豬鐵士古病毒-1 2A (porcine teschovirus-1 2A))及T2A (明脈扁刺蛾病毒2A (thosea asigna virus 2A))。發現2A-介導之「自裂解」之機制為核糖體跳過2A之C端處的甘胺醯基-脯胺醯基肽鍵之形成。高度保守序列GDVEXNPGP (SEQ ID NO:51)係由不同2A在C端共用，且適用於產生位阻及核糖體跳躍。成功跳躍及重新開始轉譯產生兩種「裂解」蛋白質。2A序列之實例如下： T2A: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEQ ID NO:52) P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEQ ID NO:53) E2A: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO:54) F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO:55)

在特定情況下，載體可為γ-反轉錄病毒轉移載體。反轉錄病毒轉移載體可包含基於質體，諸如pUC19質體(HindIII與EcoRI限制酶位點之間的大片段(2.63 kb))之主鏈。主鏈可攜帶來自莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV)之病毒組分，包括5' LTR、psi封裝序列及3' LTR。LTR為發現於反轉錄病毒原病毒之任一側上之長末端重複序列，且在轉移載體之情況下，囊括相關基因負荷，諸如靶向BCMA之CAR及相關組分。psi封裝序列(其為藉由核衣殼封裝之目標位點)亦以順式併入，包夾於5' LTR與CAR編碼序列之間。因此，轉移載體之一實例之基本結構可如此組態：pUC19序列-5' LTR-psi封裝序列-相關基因負荷-3' LTR-pUC19序列。此系統亦可應用於其他病毒及非病毒載體，包括但不限於豆狀病毒、腺病毒AAV以及非病毒質體。V. 細胞

本發明涵蓋攜有編碼靶向BCMA之CAR且亦可編碼至少一種細胞介素及至少一種自殺基因之載體的任何種類之免疫細胞或幹細胞。在一些情況下，相對於編碼自殺基因及/或細胞介素，不同載體編碼CAR。NK細胞可來源於臍帶血、外周血、誘導性多能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)或骨髓。NK細胞可來源於細胞株，諸如但不限於NK-92細胞。NK細胞可為臍帶血單核細胞，諸如CD56+ NK細胞。

本發明涵蓋任何種類之免疫細胞，包括習知T細胞、NK細胞、γ-δ T細胞、NKT及不變之NK T細胞、調節T細胞、巨噬細胞、B細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞或其混合物。

在一些情況下，細胞已在有效量之通用抗原呈現細胞(UAPC)存在下擴增，包括以任何適合之比率。可以10:1至1:10；9:1至1:9；8:1至1:8；7:1至1:7；6:1至1:6；5:1至1:5；4:1至1:4；3:1至1:3；2:1至1:2或1:1之比率(包括以1:2之比率)用UAPC培養細胞。在一些情況下，NK細胞在IL-2存在下，諸如以10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、100-500、100-400、100-300、100-200、200-500、200-400、200-300、300-500、300-400或400-500 U/mL之濃度擴增。

在用載體進行基因修飾之後，可立即輸注NK細胞或可儲存NK細胞。在某些態樣中，在基因修飾之後，細胞可在基因轉移至細胞中後約1、2、3、4、5天或更多天內以大細胞群形式離體繁殖數天、數週或數月。在另一態樣中，選殖轉染物且對證明存在單一整合或以游離方式維持之表現卡匣或質體，及靶向BCMA之CAR之表現的純系進行離體擴增。選用於擴增之純系證明特異性識別及溶解表現BCMA之目標細胞的能力。重組免疫細胞可藉由用IL-2或結合共同γ鏈之其他細胞介素(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-21及其他)刺激來擴增。重組免疫細胞可藉由用人工抗原呈現細胞刺激來擴增。在另一態樣中，經基因修飾之細胞可冷凍保存。

本發明之實施例涵蓋表現如本文所涵蓋之一或多種靶向BCMA之CAR及一或多種TNF-α突變體之細胞。在特定實施例中，NK細胞包含重組核酸，其編碼一或多種靶向BCMA之CAR及一或多種工程化之不可分泌、膜結合TNF-α突變體多肽。在特定實施例中，除表現一或多種靶向BCMA之CAR及TNF-α突變體多肽之外，細胞亦包含編碼一或多種治療性基因產物之核酸。

細胞可直接由個體獲得或可由儲藏所或其他儲存機構獲得。作為療法之細胞相對於細胞作為療法提供之個體可為自體或同種異體的。

細胞可來自需要用於治療醫學病況之療法之個體，且在其操縱以表現靶向BCMA之CAR、視情況存在之TNF-α突變體及視情況存在之治療性基因產物(例如使用用於過繼性細胞療法之轉導及擴增的標準技術)之後，其可提供回至最初所來自之個體。在一些情況下，儲存細胞以便隨後用於個體或另一個體。

攜有可能需要藉由自殺基因(諸如TNF-α自殺基因)消除的靶向BCMA之CAR之NK細胞可為任何種類。細胞可包含於細胞群中，且該細胞群大部分可經一或多種靶向BCMA之CAR及/或一或多種TNF-α突變體自殺基因及/或一或多種細胞介素轉導。細胞群可包含51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100% NK細胞，其經一或多種靶向BCMA之CAR及/或一或多種TNF-α突變體自殺基因及/或一或多種細胞介素轉導。一或多種靶向BCMA之CAR及/或一或多種TNF-α突變體自殺基因及/或一或多種細胞介素可為分隔之多肽。

可用一或多種靶向BCMA之CAR及/或一或多種TNF-α突變體自殺基因及/或一或多種細胞介素產生NK細胞以意欲根據特定目的而模組化。舉例而言，可生成細胞，包括用於市售分配，表現靶向BCMA之CAR及/或一或多種TNF-α突變體自殺基因及/或一或多種細胞介素(或藉由編碼用於後續轉導之突變體之核酸來分配)，且使用者可對其進行修飾以表現一或多個其他相關基因(包括治療性基因)，此取決於預期目的。舉例而言，治療BCMA陽性癌症相關之個體可獲得或生成表現TNF-α突變體之細胞且對其進行修飾以表現包含BCMA特異性scFv之CAR，或反之亦然。

在特定實施例中，可修飾表現一或多種靶向BCMA之CAR及/或一或多種TNF-α突變體自殺基因及/或一或多種細胞介素的經轉導之NK細胞之基因體。基因體可以任何方式修飾，但在特定實施例中，基因體係例如藉由CRISPR基因編輯修飾。細胞之基因體可經修飾以出於任何目的增強細胞之有效性。可在細胞中進行修飾之基因之特定實例包括以下：ADAM13/TACE之基因敲除、增加表現TNF-α突變體之細胞對腫瘤微環境之抗性(諸如TGF-β受體1或2、IDO、檢查點分子，諸如PD1、TIGIT、KLRG1、TIM3等)。VI. 治療方法

在各種實施例中，如本文中所考慮之靶向BCMA之CAR構築體、核酸序列、載體、宿主細胞等及/或包含其之醫藥組合物用於預防、治療或改善癌性疾病(諸如腫瘤性疾病)。在特定實施例中，本發明之醫藥組合物可特別適用於預防、改善及/或治療癌症，包括例如表現BCMA且可為或可不為例如實體腫瘤之癌症。

在特定實施例中，其中利用靶向BCMA之CAR之NK細胞可為NK、T細胞或經工程化以用於哺乳動物之細胞療法之誘導NKT細胞。在細胞為NK細胞之此類情況下，NK細胞療法可為任何種類且NK細胞可為任何種類。在特定實施例中，細胞為經工程化以表現一或多種靶向BCMA之CAR及/或一或多種TNF-α突變體自殺基因及/或一或多種細胞介素之NK細胞。在特定實施例中，細胞為經靶向BCMA之CAR轉導之NK細胞。

在特定實施例中，本發明部分地涵蓋表現BCMA CAR之細胞、靶向BCMA之CAR構築體、靶向BCMA之CAR核酸分子及靶向BCMA之CAR載體，其可單獨或使用標準載體及/或基因遞送系統以任何組合投與，且在至少一些態樣中，連同醫藥學上可接受之載劑或賦形劑一起投與。在某些實施例中，在投與之後，核酸分子或載體可穩定整合至個體之基因體中。

在特定實施例中，可使用對某些細胞或組織具有特異性且存留於NK細胞中之病毒載體。適合之醫藥載劑及賦形劑為此項技術中所熟知。根據本發明製備之組合物可用於預防或治療或延遲上文所鑑別之疾病。

此外，本發明係關於一種用於預防、治療或改善腫瘤性疾病之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之表現靶向BCMA之CAR、核酸序列、載體之細胞(如本文所考慮及/或藉由如本文所考慮之方法產生)的步驟。

投與例示性靶向BCMA之CAR細胞之組合物的可能適應症為癌性疾病，包括腫瘤性疾病，例如包括B細胞惡性病、多發性骨髓瘤、乳癌或肺癌。投與靶向BCMA之CAR細胞之組合物的例示性適應症為癌性疾病，包括表現BCMA之任何惡性病。投與本發明之組合物適用於所有階段及類型之癌症，包括例如微小殘留病、早期癌症、晚期癌症及/或轉移性癌症及/或難治癒之癌症。

本發明進一步涵蓋與經由免疫細胞起作用之其他化合物(例如雙特異性抗體構築體、靶向毒素或其他化合物) 之共投藥方案。共投與本發明化合物之臨床療法可涵蓋同時共投與、在投與其他組分之前或之後共投與。特定組合療法包括化學療法、放射、手術、激素療法或其他類型之免疫療法。

實施例係關於一種套組，其包含如本文所定義之靶向BCMA之CAR構築體、如本文所定義之核酸序列、如本文所定義之載體及/或如本文所定義之宿主。亦經考慮，本發明之套組包含單獨的或與待向需要醫學治療或干預之個體投與之其他藥劑組合的如上文所描述之醫藥組合物。A. 醫藥組合物

本文亦提供包含經轉導之NK細胞及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物及調配物。經轉導細胞可包含於適於轉移至個體之培養基及/或適於保存(諸如低溫保存)(包括在轉移至個體之前)之培養基中。

如本文所描述之醫藥組合物及調配物可以凍乾調配物或水性溶液形式藉由混合具有所要純度之活性成分(諸如細胞)與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)第22版，2012)來製備。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒性，且包括但不限於：緩衝液，諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁基或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX^® ，Baxter International公司)。某些例示性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法描述於US專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種另外的葡萄糖胺聚糖酶，諸如軟骨素酶組合。B. 組合療法

在某些實施例中，本發明實施例之組合物及方法涉及與至少一種另外療法組合之免疫細胞群。其他療法可為放射療法、手術(例如乳房腫瘤切除術及乳房切除術)、化學療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法、激素療法或前述各者之組合。另外療法可呈佐劑或新輔助療法形式。

在一些實施例中，其他療法為投與小分子酶抑制劑或抗轉移性藥劑。在一些實施例中，其他療法為投與副作用限制性藥劑(例如意欲減少治療副作用之出現及/或嚴重程度的藥劑，諸如抗噁心劑等)。在一些實施例中，另一種療法為放射療法。在一些實施例中，另外療法為手術。在一些實施例中，其他療法為放射療法與手術之組合。在一些實施例中，其他療法為γ輻射。在一些實施例中，其他療法係靶向PBK/AKT/mTOR路徑、HSP90抑制劑、微管蛋白抑制劑、細胞凋亡抑制劑及/或化學預防劑之療法。另外療法可為此項技術中已知之化學治療劑中之一或多者。

免疫細胞療法相對於其他癌症療法，諸如免疫檢查點療法可在其之前、期間、之後或以各種組合投與。投藥可以在同時至數分鐘至數天至數週範圍內之時間間隔進行。在其中免疫細胞療法與另外治療劑分別提供於患者之實施例中，吾人將通常確保在各遞送之時間段之間未停用大量時間，使得兩種化合物將仍能夠對患者發揮有利的組合效果。在此類情況下，經考慮，吾人可向患者提供彼此約12至24或72小時內及更尤其彼此約6-12小時內之抗體療法及抗癌療法。在一些情況下，可能需要顯著地延長治療時間段，其中在各別投藥之間會流逝若干天(2、3、4、5、6或7)至若干週(1、2、3、4、5、6、7或8)。

可採用各種組合。在下文實例中，免疫細胞療法為「A」且抗癌療法為「B」：

考慮到藥劑之毒性(若存在)，向患者投與本發明實施例之任何化合物或細胞療法將遵循用於投與此類化合物之一般方案。因此，在一些實施例中，存在監測可歸因於組合療法之毒性的步驟。1. 化學療法

可根據本發明實施例使用各種化學治療劑。術語「化學療法」係指使用藥物治療癌症。「化學治療劑」用於表示在癌症治療中投與之化合物或組合物。此等藥劑或藥物藉由其在細胞內之活性模式分類，例如其是否且在哪一階段影響細胞週期。替代地，藥劑可基於其直接交聯DNA、插入DNA中或藉由影響核酸合成來誘導染色體及有絲分裂失常之能力表徵。

化學治療劑之實例包括：烷基化劑，諸如噻替派及環磷醯胺；磺酸烷基酯，諸如白消安(白消安)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基蜜胺，其包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲三聚氰胺(trimethylolomelamine)；多聚乙醯(尤其係布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；克瑞托欣(cryptophycin) (尤其克瑞托欣1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡黴素(duocarmycin) (包括其合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；盤克斯塔叮(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷醯胺、雌莫司汀、異環磷醯胺、甲基二(氯乙基)胺、甲基二(氯乙基)胺氧化物鹽酸鹽、美法侖、新恩比興(novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)及尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素鉏及卡奇黴素(ωI1))；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相關色素蛋白烯二炔抗生素發色團，阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、安麴黴素(anthramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素、放線菌素C、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(包括N-嗎啉基-小紅莓、氰基-N-嗎啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓及去氧小紅莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin) (諸如絲裂黴素C)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)及左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)及曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤及硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睪內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；亞胺醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；磨菇多糖；氯尼達明(lonidainine)；類美登素，諸如美登素及安絲菌素(ansamitocins)；米托胍腙；米托蒽醌；莫比達摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他汀；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼；PSK多醣複合物；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecenes)(尤其T-2毒素、弗納庫林(verracurin) A、桿孢菌素(roridin) A及胺癸叮(anguidine))；尿烷；長春地辛；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西他賽吉西他濱(docetaxel gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑配位錯合物，諸如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼；長春瑞賓(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (例如CPT-11)；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、普卡黴素(plicomycin)、吉西他濱(gemcitabien)、溫諾平(navelbine)、法呢基蛋白質轉移酶抑制劑(farnesyl-protein tansferase inhibitor)、反鉑(transplatinum)及以上中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸及衍生物。 2. 放射療法

引起DNA損傷且已廣泛使用之其他因素包括通常稱為γ射線、X射線及/或將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之因素。亦考慮DNA損傷因素之其他形式，諸如微波、質子束照射(美國專利5,760,395及4,870,287)及UV照射。最可能的係，所有此等因素均對DNA、DNA之前驅體、DNA之複製及修復以及染色體之組裝及維持造成大範圍的損傷。X射線之劑量範圍在延長之時間段(3至4週)期間介於50至200倫琴日劑量至2000至6000倫琴之單次劑量範圍內。放射性同位素之劑量範圍變化極大，且視同位素之半衰期、所發射之放射之強度及類型以及贅生性細胞之攝取而定。3. 免疫療法

熟練技術人員應瞭解，其他免疫療法可與實施例之方法組合或結合。在癌症治療之情形下，免疫治療劑一般依賴於使用免疫效應細胞及分子以靶向及破壞癌細胞。利妥昔單抗(RITUXAN®)係此類實例。免疫效應子可為例如對腫瘤細胞表面上之某一標記物具有特異性之抗體。單獨抗體可充當療法之效應子或其可募集其他細胞以實際上影響細胞殺滅。抗體亦可結合於藥物或毒素(化學治療劑、放射性核種、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)且用作靶向劑。或者，效應子可為攜帶直接或間接與腫瘤細胞目標相互作用之表面分子的淋巴細胞。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。

抗體-藥物結合物已作為癌症治療劑之研發之突破性方法出現。癌症係世界上死亡主要原因中之一者。抗體-藥物結合物(ADC)包含共價連接至細胞殺滅藥物之單株抗體(MAb)。此方法將MAb針對其抗原目標之高特異性與高效力細胞毒性藥物相結合，產生將有效負載(藥物)遞送至具有富集含量之抗原之腫瘤細胞的「武裝」MAb。藥物之靶向遞送亦使其在正常組織中之暴露降至最低，使得毒性降低且提高治療指數。FDA對兩種ADC藥物，2011年之ADCETRIS® (貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))及2013年之KADCYLA® (曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)或T-DM1)的批准已證實該方法。當前在癌症治療之臨床試驗之各個階段存在超過30種ADC候選藥物(Leal等人，2014)。隨著抗體工程化及連接子-有效負載最佳化變得愈來愈成熟，新型ADC之發現及發展愈來愈取決於適合於此方法之新目標之鑑別及驗證及靶向MAb之產生。ADC目標之兩個標準係腫瘤細胞中之表現上調/高表現量及穩固內化。

在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須帶有一些適合於靶向，亦即不存在於大部分其他細胞上之標記物。存在許多腫瘤標記物且此等標記物中之任一者可適用於在本發明實施例之情形下靶向。常見腫瘤標記物包括CD20、癌胚抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、層黏連蛋白受體、erb B及p155。免疫療法之一替代態樣為組合抗癌作用與免疫刺激作用。亦存在免疫刺激分子，其包括：細胞介素，諸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趨化因子，諸如MIP-1、MCP-1、IL-8；及生長因子，諸如FLT3配位體。

目前所研究或在使用中之免疫療法之實例係免疫佐劑，例如牛分支桿菌(Mycobacterium bovis)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯及芳族化合物(美國專利5,801,005及5,739,169；Hui及Hashimoto, 1998；Christodoulides等人, 1998)；細胞介素療法，例如干擾素α、β及γ、IL-1、GM-CSF及TNF (Bukowski等人, 1998；Davidson等人, 1998；Hellstrand等人, 1998)；基因療法，例如TNF、IL-1、IL-2及p53 (Qin等人, 1998；Austin-Ward及Villaseca, 1998；美國專利5,830,880及5,846,945)；以及單株抗體，例如抗CD20、抗神經節苷脂GM2及抗p185 (Hollander, 2012；Hanibuchi等人, 1998；美國專利5,824,311)。經考慮，一或多種抗癌療法可與本文所描述之抗體療法一起採用。

在一些實施例中，免疫療法可為免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點增強信號(例如共刺激分子)或減弱信號。可由免疫檢查點阻斷靶向之抑制性免疫檢查點包括腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3 (亦稱為CD276)、B及T淋巴細胞衰減子(BTLA)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4，亦稱為CD152)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、殺手細胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴細胞活化基因-3 (LAG3)、程式性死亡1 (PD-1)、T細胞免疫球蛋白域及黏蛋白域3 (TIM-3)及T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)。詳言之，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1軸及/或CTLA-4。

免疫檢查點抑制劑可為諸如小分子之藥物、配位體或受體之重組形式，或詳言之，抗體，諸如人類抗體(例如國際專利公開案WO2015016718；Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012；二者均以引用之方式併入本文中)。可使用已知的免疫檢查點蛋白抑制劑或其類似物，尤其可使用抗體之嵌合、人類化或人類形式。如熟習此項技術者將知曉，替代名稱及/或等效名稱可用於本發明中提及之某些抗體。此類替代名稱及/或等效名稱在本發明之上下文中為可互換的。舉例而言，已知蘭利珠單抗(lambrolizumab)亦以替代名稱及等效名稱MK-3475及派立珠單抗(pembrolizumab)已知。

在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抑制PD-1與其配位體結合搭配物結合之分子。在一特定態樣中，PD-1配位體結合搭配物為PDL1及/或PDL2。在另一實施例中，PDL1結合拮抗劑為抑制PDL1與其結合搭配物結合之分子。在一特定態樣中，PDL1結合搭配物為PD-1及/或B7-1。在另一實施例中，PDL2結合拮抗劑為抑制PDL2與其結合搭配物結合之分子。在一特定態樣中，PDL2結合搭配物為PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白質或寡肽。例示性抗體描述於美國專利第US8735553號、第US8354509號及第US8008449號中，其皆以引用之方式併入本文中。用於本文所提供之方法之其他PD-1軸拮抗劑為此項技術中已知，諸如描述於美國專利申請案第US20140294898號、第US2014022021號及第US20110008369號中，其皆以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抗PD-1抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)。在一些實施例中，抗PD-1抗體係選自由以下組成之群：納武單抗(nivolumab)、派立珠單抗及CT-011。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為免疫黏附素(例如包含融合至恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)之PDL1或PDL2之細胞外或PD-1結合部分的免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為AMP- 224.納武單抗，亦稱為MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO^® ，其為WO2006/121168中所描述之抗PD-1抗體。派立珠單抗為WO2009/114335中所描述之抗PD-1抗體，亦稱為MK-3475、Merck 3475、拉立珠單抗、KEYTRUDA^® 及SCH-900475。CT-011為WO2009/101611中所描述之抗PD-1抗體，亦稱為hBAT或hBAT-1。AMP-224為WO2010/027827及WO2011/066342中描述之PDL2-Fc融合可溶受體，亦稱為B7-DCIg。

可在本文中提供之方法中靶向之其他免疫檢查點為細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4)，亦稱為CD152。人類CTLA-4之完整cDNA序列具有GenBank寄存編號L15006。CTLA-4係發現於T細胞之表面上且在結合於抗原呈現細胞之表面上之CD80或CD86時充當「關閉」開關。CTLA4為表現於輔助T細胞之表面上之免疫球蛋白超家族的成員且將抑制信號傳遞至T細胞。CTLA4類似於T細胞共刺激蛋白CD28，且兩種分子均結合至抗原呈現細胞上之亦分別稱為B7-1及B7-2的CD80及CD86。CTLA4將抑制信號傳遞至T細胞，而CD28傳遞刺激信號。胞內CTLA4亦發現於調節性T細胞中且對其功能可為至關重要的。經由T細胞受體及CD28進行之T細胞活化引起B7分子之抑制性受體CTLA-4之表現增加。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白質或寡肽。

適用於本發明方法之抗人類CTLA-4抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知之方法產生。可替代地，可使用此項技術公認之抗CTLA-4抗體。舉例而言，以下中所揭示之抗CTLA-4抗體可用於本文所揭示之方法：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504 (CP675,206，亦稱為曲美單抗(tremelimumab)；以前稱為替西單抗(ticilimumab))、美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145): 摘要編號2505 (抗體CP-675206)；以及Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304。前述公開案中之每一者之教示內容以引用之方式併入本文中。亦可使用與此等此項技術中公認的抗體中之任一者競爭結合至CTLA-4之抗體。舉例而言，人類化CTLA-4抗體描述於國際專利申請案第WO2001014424號、第WO2000037504號及美國專利第8,017,114號中；其皆以引用之方式併入本文中。

例示性抗CTLA-4抗體係伊匹單抗(ipilimumab) (亦稱為10D1、MDX-010、MDX-101及Yervoy®)或其抗原結合片段及變異體(參見例如WO 01/14424)。在其他實施例中，抗體包含伊匹單抗之重鏈及輕鏈CDR或VR。因此，在一個實施例中，抗體包含伊匹單抗之VH區之CDR1、CDR2及CDR3域，及伊匹單抗之VL區之CDR1、CDR2及CDR3域。在另一實施例中，抗體與與上文所提及之抗體相同之CTLA-4上的抗原決定基競爭結合及/或結合於與上文所提及之抗體相同之CTLA-4上的抗原決定基。在另一實施例中，抗體與上文所提及之抗體具有至少約90%可變區胺基酸序列一致性(例如與伊匹單抗有至少約90%、95%或99%可變區一致性)。

用於調節CTLA-4之其他分子包括諸如描述於美國專利第US5844905號、第US5885796號及國際專利申請案第WO1995001994號及第WO1998042752號中之CTLA-4配位體及受體；所有文獻皆以引用之方式併入本文中，及諸如描述於美國專利第US8329867號中之免疫黏附素，該專利以引用之方式併入本文中。4. 手術

約60%患有癌症者將經歷特定類型之手術，其包括預防性、診斷性或分期、治癒性及緩解性手術。治癒性手術包括切除術，其中物理移除、切除及/或破壞所有或一部分癌症組織，且可與其他療法結合使用，諸如本發明實施例之治療、化學療法、放射線療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法。腫瘤切除術係指物理移除腫瘤之至少部分。除腫瘤切除術以外，手術治療包括雷射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制手術(莫氏手術(Mohs' surgery))。

在切除癌細胞、組織或腫瘤的一部分或所有後，可能在體內形成空腔。治療可藉由用另外抗癌療法對該區域進行灌注、直接注射或局部施用而實現。可例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、或每1週、2週、3週、4週及5週或每1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、或12個月重複此類治療。此等治療亦可具有改變劑量。5. 其他藥劑

經考慮，其他藥劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療之治療功效。此等另外藥劑包括影響細胞表面受體及間隙連接(GAP junction)之上調之藥劑、細胞生長抑制劑及分化劑、細胞黏附抑制劑、提高過度增殖細胞對細胞凋亡誘導物之敏感性的藥劑或其他生物藥劑。藉由升高間隙連接之數目增加細胞間信號傳導將增加對相鄰過度增殖細胞群之抗過度增殖作用。在其他實施例中，細胞生長抑制劑或分化劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療之抗過度增殖功效。細胞黏附抑制劑亦經考慮以改善本發明實施例之功效。細胞黏附抑制劑之實例為局部黏著斑激酶(FAK)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。進一步考慮增加過度增殖性細胞對細胞凋亡之敏感性的其他藥劑，諸如抗體c225可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療功效。I. 本發明之套組

本文所描述之組合物中之任一者可包含於套組中。在一非限制性實例中，細胞、產生細胞之試劑、載體及/或產生載體之試劑及其組分可包含於套組中。在某些實施例中，NK細胞可包含於套組中。此類套組可或可不具有用於操縱細胞之一或多種試劑。此類試劑包括例如小分子、蛋白質、核酸、抗體、緩衝劑、引子、核苷酸、鹽及/或其組合。編碼靶向一或多種靶向BCMA之CAR、自殺基因產物及/或細胞介素之核苷酸可包括於套組中。諸如細胞介素或抗體(包括單株抗體)之蛋白質可包括於套組中。編碼工程化之CAR受體之組分的核苷酸可包括於套組中，包括生成其之試劑。

在特定態樣中，套組包含本發明之NK細胞療法以及另一癌症療法。例如在一些情況下，除細胞療法實施例外，套組亦包括第二癌症療法，諸如化學療法、激素療法及/或免疫療法。一或多種套組可針對個體之特定癌症定製且包含用於個體之各別第二癌症療法。

套組可包含經適當等分之本發明組合物。該等套組之組分可封裝於水性介質中或以凍乾形式封裝。套組之容器構件一般將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器構件，可將組分置放，且較佳適當等分於該等容器構件中。在套組中存在多於一種組分之情況下，套組亦可一般含有第二、第三或其他另外容器，其中可分開置放另外組分。然而，組分之各種組合亦可包含於小瓶中。本發明之套組通常亦將包括一種以密閉方式含有組合物及任何其他試劑容器以用於商售之構件。此類容器可包括其中保留有所需小瓶的注射模製或吹塑模製塑膠容器。 VII.實例

包括以下實例以說明本發明之某些非限制性態樣。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術表示本發明人所發現之在所揭示之主題之實踐中起良好作用的技術。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不背離所揭示之主題之精神及範疇的情況下，可對所揭示之特定實施例作出多種改變且仍獲得相同或類似結果。 實例1 NK細胞中之靶向BCMA之嵌合抗原受體

用CAR BCMA構築體(BCMA1-BCMA5)中之每一者轉導臍帶血衍生NK細胞，且測試該等細胞針對MM1.S骨髓瘤目標之細胞毒性。與未經轉導之離體擴增NK細胞相比，所有5種構築體在提高NK細胞針對MM1.S目標之細胞毒性方面效用均相同(圖17A及圖17B)。使用標準⁵¹ 鉻分析進行分析。 實例2 T細胞中之靶向BCMA之嵌合抗原受體

用BCMA CAR構築體1-5中之每一者轉導T細胞，且測試該等細胞針對MM1.S骨髓瘤目標之細胞毒性。與未經轉導之擴增T細胞相比，攜有BCMA CAR構築體中之每一者的T細胞針對MM1.S目標發揮優良細胞毒性(圖18)。使用標準⁵¹ 鉻分析進行分析。 實例3 NK細胞中之靶向BCMA之嵌合抗原受體

本發明實例涉及攜帶靶向BCMA之CAR分子之NK細胞的特徵及活性。作為研究之一部分，已證實多發性骨髓瘤細胞株具有BCMA之表面表現(圖19)。

藉由鉻分析，與對照NT NK細胞相比，觀測到所有BCMA CAR NK細胞針對MM1S、H929及RPMI 8226均有優良的活體外細胞毒性。其中所用之構築體如下：BCMA1為IgSPCOA7D12VLVH28Z15；BCMA2為CD8SPC11D53VLVH15；BCMA3為COGSPC11D53VLVHZIL15；BCMA4為IgSPA7D12VHVL28Z15；且BCMA5為IgSPA7D12VLVH28Z15 (圖20)。圖21表明藉由MM1S細胞株中之CRISPR缺失使BCMA沉默來消除CAR BCMA NK細胞之增強殺滅，表明CAR BCMA NK細胞之殺滅具有特異性。

如圖22中所示，與對照NT NK細胞相比，BCMA CAR NK細胞顯示更顯著之脫粒(如CD107a所表示)且產生更高量之針對MM1S及H929腫瘤細胞之IFN-γ及NF-α。

圖23說明表徵BCMA CAR NK細胞影響攜帶MM1S腫瘤之小鼠之存活的能力之活體內研究之一實例。

圖24表徵具有各種BCMA CAR構築體之NK細胞之轉導效率。

在MM1S小鼠模型中，評定BCMA CAR NK細胞抗腫瘤活性，且在與單獨腫瘤或NT NK細胞相比時，在用BCMA CAR NK細胞處理之所有動物中均觀測到較低腫瘤負荷(圖25)。

在圖26中，在MM1S小鼠模型中評定BCMA CAR NK細胞之抗腫瘤活性。當與單獨腫瘤或NT NK細胞相比時，在用BCMA CAR NK細胞處理之所有動物中均觀測到延長之存活期。在此研究中，BCMA2 (C11D5.3 scFv；VL-VH)及BCMA5 (A7D12；VL-VH)構築體引起之存活率大於其他CAR構築體。

本發明實例展示出與NT NK細胞相比，BCMA CAR NK細胞針對多發性骨髓瘤目標(MM1S及NIH929)具有優良細胞毒性，且BCMA CAR NK細胞在活體內發揮增強之抗腫瘤活性及延長之存活期。

儘管已詳細地描述本發明及其優勢，但應理解，在不脫離如由所附申請專利範圍所界定的設計之精神及範疇的情況下，可在本文中進行各種改變、替代及更改。此外，本申請案之範疇並不意欲限於說明書中所描述之過程、機器、製造、物質組成、手段、方法及步驟之特定實施例。如一般熟習此項技術者將易於由本發明瞭解，根據本發明可利用當前存在或日後將開發之過程、機器、製造、物質組成、手段、方法或步驟，其與本文中所描述之相應實施例相比表現實質上相同的功能或達成實質上相同的結果。因此，所附申請專利範圍意欲在其範疇內包括此類過程、機器、製造、物質組成、手段、方法或步驟。

為了更完整理解本發明，現參考以下結合附圖所作的描述。

圖1為利用密碼子優化(共) C11D5.3 scFv VL及VH鏈及粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子受體(GMCSFR)信號肽編碼靶向BCMA之嵌合抗原受體(CAR)的載體之圖式。連接子連接VH及VL鏈。

圖2示出包含在編碼CAR之序列之5ʹ末端處由2A元件分隔之TNF-α突變體自殺基因的載體，且亦藉由另一2A元件使CAR與IL-15在編碼CAR之序列之3ʹ末端處分隔。BMCA靶向CAR包括密碼子優化C12A3.2 scFv VH及VL鏈、IgG1鉸鏈、CD28協同刺激域及CD3ζ。

圖3例示編碼靶向BCMA之CAR之載體，其包括CD8α信號肽、C11D5.3 scFV VL及VH鏈、IgG1鉸鏈及CD28協同刺激域及CD3ζ。藉由2A元件使CAR與IL15分隔。

圖4為編碼靶向BCMA之CAR之載體之圖式，其採用密碼子優化C12A3.2 scFv VH及VL鏈、IgG1連接子、CD28協同刺激域及CD3ζ。亦藉由2A元件使CAR與IL15分隔。

圖5展示編碼密碼子優化靶向BCMA之CAR之載體，其中除IgG1鉸鏈、CD28協同刺激域及CD3ζ之外，抗體之A7D12.2 VH鏈在自A7D12.2 VL鏈之5ʹ至3ʹ方向上在上游。CAR亦包括Ig重鏈信號肽且藉由2A元件與IL15分隔。

圖6展示編碼靶向BCMA之CAR之載體，其中除IgG1鉸鏈、CD28協同刺激域及CD3ζ之外，抗體之密碼子優化A7D12.2 VL鏈在自A7D12.2 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上在上游。CAR亦包括Ig重鏈信號肽且藉由2A元件與IL15分隔。

圖7提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之一個實例，其中A7D12.2 VL鏈連接在A7D12.2 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上且亦包括Ig重鏈信號肽。

圖8示出編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之一實例，其中A7D12.2 VH鏈連接在A7D12.2 VL鏈及IgG1鉸鏈之5ʹ至3ʹ方向上。CAR利用Ig重鏈信號肽及CD28協同刺激域。

圖9提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中密碼子優化A7D12.2 VH鏈連接在密碼子優化A7D12.2 VL鏈之5ʹ至3ʹ方向上，且利用Ig重鏈信號肽、IgG1鉸鏈及CD28協同刺激域。

圖10為編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中C11D5.3 VL鏈連接在C11D5.3 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上，其中CAR利用GMCSF-R信號肽。

圖11展示編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之質體圖之圖式，該CAR利用連接在密碼子優化C12A3.2 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上之密碼子優化(CO) C12A3.2 VL鏈，其中CAR合併CD8信號肽、IgG1鉸鏈、CD28及CD3ζ。載體亦編碼特定TNFα突變體、delAla-1至Val13 (14aa del) CKI突變5aa mut且編碼IL15。藉由2A肽序列使IL15及TNFα突變體與CAR分隔。

圖12提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中密碼子優化A7D12.2 VL連接在A7D12.2 VH之5ʹ至3ʹ方向上且該CAR利用Ig重鏈信號肽、IgG1鉸鏈及CD28協同刺激域。

圖13展示編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中除IgG1鉸鏈及CD28之外，Ig重鏈信號肽、密碼子優化A7D12.2 VH鏈連接在密碼子優化A7D12.2 VL鏈之5ʹ至3ʹ方向上。示出VH及VL之CDR序列。

圖14示出編碼靶向BCMA之CAR的表現載體，其中C11D5.3 VL鏈連接在C11D5.3 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上且亦包括CD8a信號肽及IgG1鉸鏈。

圖15提供編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中C11D5.3 VH鏈連接在C11D5.3 VL鏈之5ʹ至3ʹ方向上，其中CAR採用GMCSF-R信號肽。示出對應之VH及VL鏈之CDR。

圖16展示編碼靶向BCMA之CAR的表現載體之圖式，其中C11D5.3 VL鏈連接在C11D5.3 VH鏈之5ʹ至3ʹ方向上，且其中CAR採用IgG1鉸鏈、CD28及CD3z。示出對應之VH及VL鏈之CDR。構築體亦編碼TNFα突變體及IL15，其各自藉由2A肽序列與CAR序列分隔。

圖17A-圖17B指示用5種不同BCMA構築體轉導之NK細胞對骨髓瘤細胞株MM1S之細胞毒性。BCMA1為IgSPCOA7D12VLVH28Z15 (包含以下之構築體：Ig重鏈信號肽；密碼子優化A7D12輕鏈，其為密碼子優化A7D12重鏈之5'；CD28協同刺激域；CD3ζ鏈及IL-15)；BCMA2為CD8SPC11D5.3VLVH15 (包含以下之構築體：CD8信號肽；為11D5.3重鏈之5'的11D5.3 scFv輕鏈；CD28協同刺激域；CD3ζ鏈及IL-15)；BCMA3為COGSPC11D5.3VLVHZIL15 (包含以下之構築體：GM-CSF信號肽；密碼子優化11D5.3輕鏈，其為密碼子優化11D5.3重鏈之5'；CD28協同刺激域；CD3ζ鏈及IL-15)；BCMA4為IgSPA7D12VHVL28Z15 (包含以下之構築體：Ig重鏈信號肽；A7D12重鏈，其為A7D12輕鏈之5'；CD28協同刺激域；CD3ζ鏈及IL-15)；且BCMA5為IgSPA7D12VLVH28Z15 (包含以下之構築體：Ig重鏈信號肽；A7D12輕鏈，其為A7D12重鏈之5'；CD28協同刺激域；CD3ζ鏈及IL-15)。

圖18表明用五種不同BCMA構築體轉導之T細胞對骨髓瘤細胞株MM1.S之細胞毒性(與對照相比)。在條形圖組中自左至右：BCMA1為IgSPCOA7D12VLVH28Z15；BCMA2為CD8SPC11D51VLVH15；BCMA3為COGSPC11D51VLVHZIL15；BCMA4為IgSPA7D12VHVL28Z15；且BCMA5為IgSPA7D12VLVH28Z15。對照為「空」病毒。當產生病毒時，無目標質體，僅有兩種輔助質體。

圖19表明多發性骨髓瘤細胞株(MM1S、H929及RPMI 8226)上之BCMA表面表現。

圖20展示BCMA CAR NK細胞對多發性骨髓瘤目標(MM1S、H929、RPMI 8226)之細胞毒性之鉻分析。BCMA1-5為與圖18中所用構築體相同之構築體，且對照為未經轉導之(NT)細胞。

圖21表明藉由MM1S中之CRISPR缺失使BCMA沉默來消除CAR BCMA NK細胞之增強殺滅。

圖22展示當與MM1S或H929目標共同培養時，藉由BCMA CAR NK細胞產生特定效應細胞介素。

圖23示出BCMA小鼠實驗計劃之一實例以表徵BCMA CAR NK細胞控制活體內MM1S腫瘤之能力。

圖24展示各種構築體BCMA-1至BCMA-5之BCMA轉導效率。

圖25表明基於生物發光影像之FFluc-MM1S小鼠模型中BCMA CAR NK細胞抗腫瘤活性。

圖26展示MM1S小鼠模型中之BCMA CAR NK細胞抗腫瘤活性隨存活率而變化。

Claims (57)

1. 一種表現構築體，其包含編碼靶向B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合抗原受體(CAR)且編碼以下中之一者或兩者的序列： (a)自殺基因；及 (b)細胞介素。
2. 如請求項1之表現構築體，其中該CAR包含信號傳導肽。
3. 如請求項2之表現構築體，其中該信號傳導肽來自CD8α、Ig重鏈、粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子受體，或衍生自一或多種其他表面受體之信號肽。
4. 如請求項1至3中任一項之表現構築體，其中該靶向BCMA之CAR包含具有重鏈及輕鏈之scFv，且其中編碼該CAR之序列中之重鏈在5ʹ至3ʹ方向上在該輕鏈之上游。
5. 如請求項1至3中任一項之表現構築體，其中該靶向BCMA之CAR包含具有重鏈及輕鏈之scFv，且其中編碼該CAR之序列中之重鏈在5ʹ至3ʹ方向上在該輕鏈之下游。
6. 如請求項1至5中任一項之表現構築體，其中該靶向BCMA之CAR包含密碼子最佳化之scFv。
7. 如請求項1至6中任一項之表現構築體，其中該靶向BCMA之CAR包含C11D5.3 scFv、A7D12.2 scFv、CA12A3.2 scFv、C13F12.1 scFv、人類化C11D5.3 scFv、人類化A7D12.2 scFv、人類化CA12A3.2，或人類化C13F12.1 scFv。
8. 如請求項1至7中任一項之表現構築體，其中該靶向BCMA之CAR包含一或多個協同刺激域。
9. 如請求項8之表現構築體，其中該協同刺激域係選自由以下組成之群：CD28、CD27、OX-40 (CD134)、DAP10、DAP12、4-1BB (CD137)、CD40L、2B4、DNAM、CS1、CD48、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80，及其組合。
10. 如請求項1至9中任一項之表現構築體，其中該CAR包含CD3ζ
11. 如請求項1至10中任一項之表現構築體，其中該CAR在該scFv與跨膜域之間包含鉸鏈。
12. 如請求項11之表現構築體，其中該鉸鏈為CD8-α鉸鏈、CD28鉸鏈，該鉸鏈包含由Gly3構成之人工間隔子，或該鉸鏈包含IgG之CH1、CH2及/或CH3域。
13. 如請求項1至12中任一項之表現構築體，其中該細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21，或其組合。
14. 如請求項1至13中任一項之表現構築體，其中該自殺基因為突變TNF-α、誘導性凋亡蛋白酶9、HSV-胸苷激酶、CD19、CD20、CD52或EGFRv3。
15. 如請求項14之表現構築體，其中該自殺基因為突變TNF-α。
16. 如請求項14或15之表現構築體，其中該突變TNF-α為工程化之不可分泌之突變TNF-α。
17. 如請求項14、15或16之表現構築體，其中該TNF-α突變體包含以下之缺失： 胺基酸殘基1及胺基酸殘基12； 胺基酸殘基1及胺基酸殘基13； 胺基酸殘基1至12； 胺基酸殘基1至13；或 胺基酸殘基-1至13。
18. 一種免疫細胞，其包含如請求項1至17中任一項之表現構築體。
19. 如請求項18之免疫細胞，其中該免疫細胞為自然殺手(NK)細胞、T細胞、γ-δ T細胞、巨噬細胞，或不變之(invariant) NKT (iNKT)細胞。
20. 如請求項18或19之免疫細胞，其中該免疫細胞為NK細胞。
21. 如請求項20之免疫細胞，其中該NK細胞係來源於臍帶血、外周血、誘導性多能幹細胞、造血幹細胞、骨髓，或來源於細胞株。
22. 如請求項21之免疫細胞，其中該NK細胞株為NK-92細胞株，或來源於腫瘤或健康NK細胞或祖細胞之另一NK細胞株。
23. 如請求項19至22中任一項之免疫細胞，其中該NK細胞為臍帶血單核細胞。
24. 如請求項19至23中任一項之免疫細胞，其中該NK細胞為CD56+ NK細胞。
25. 如請求項19至24中任一項之免疫細胞，其中該NK細胞在有效量之通用抗原呈現細胞(UAPC)存在下擴增。
26. 如請求項25之免疫細胞，其中NK細胞與UAPC以10:1至1:10之比率培養。
27. 如請求項25或26之免疫細胞，其中NK細胞與UAPC以1:2之比率培養。
28. 如請求項25至27中任一項之免疫細胞，其中該等NK細胞在IL-2存在下擴增。
29. 如請求項28之免疫細胞，其中該IL-2以10-500 U/mL之濃度存在。
30. 如請求項19至29中任一項之免疫細胞，其中該等NK細胞表現一或多種外源提供之細胞介素。
31. 如請求項30之免疫細胞，其中該細胞介素為IL-15、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21，或其組合。
32. 一種如請求項18至31中任一項之免疫細胞的複數，該等細胞存在於適合培養基中。
33. 如請求項32之複數，其中該等免疫細胞為NK細胞。
34. 一種治療個體之BCMA陽性癌症之方法，其包含向該個體投與有效量之攜有如請求項1至17中任一項之表現載體的細胞的步驟。
35. 如請求項34之方法，其中該等細胞為NK細胞、T細胞或iNKT細胞。
36. 如請求項35之方法，其中該等NK細胞來源於臍帶血、外周血、誘導性多能幹細胞、骨髓，或來源於細胞株。
37. 如請求項36之方法，其中該細胞株為NK-92細胞株，或來源於腫瘤或健康NK細胞或祖細胞之另一NK細胞株。
38. 如請求項35至37中任一項之方法，其中該等NK細胞來源於臍帶血單核細胞。
39. 如請求項35至38中任一項之方法，其中該等NK細胞為CD56+ NK細胞。
40. 如請求項35至39中任一項之方法，其中該等NK細胞在有效量之通用抗原呈現細胞(UAPC)存在下擴增。
41. 如請求項40之方法，其中NK細胞與UAPC以10:1至1:10之比率培養。
42. 如請求項40或41之方法，其中NK細胞與UAPC以1:2之比率培養。
43. 如請求項35至42中任一項之方法，其中該等NK細胞在IL-2存在下擴增。
44. 如請求項43之方法，其中該IL-2以10-500 U/mL之濃度存在。
45. 如請求項34至44中任一項之方法，其中該個體患有B細胞惡性病、多發性骨髓瘤、肺癌、乳癌、甲狀腺癌、頭頸癌，或其組合。
46. 如請求項34至45中任一項之方法，其中該等細胞對於該個體為同種異體的。
47. 如請求項34至45中任一項之方法，其中該等細胞對於該個體為自體的。
48. 如請求項34至47中任一項之方法，其中該個體為人類。
49. 如請求項34至48中任一項之方法，其中向該個體投與該等細胞一次或超過一次。
50. 如請求項49之方法，其中向該個體投與該等細胞之間的持續時間為數小時、數天、數週或數月。
51. 如請求項34至50中任一項之方法，其進一步包含向該個體提供有效量之另外療法的步驟。
52. 如請求項51之方法，其中該另外療法包含手術、放射、基因療法、免疫療法或激素療法。
53. 如請求項51或52之方法，其中該另外療法包含一或多種抗體。
54. 如請求項34至53中任一項之方法，其中該等細胞投與該個體藉由注射、靜脈內、動脈內、腹膜內、氣管內、瘤內、肌肉內、內窺鏡、病灶內、經皮、皮下、局部、藉由灌注於腫瘤微環境中，或其組合。
55. 如請求項34至54中任一項之方法，其進一步包含鑑別該個體中之BCMA陽性細胞之步驟。
56. 如請求項55之方法，其中該鑑別步驟利用抗體。
57. 一種物質組成，其為以下之序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、 SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157或SEQ ID NO:158。

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