JP2024521185A - Ｈｌａ－ｇ陽性癌を標的とするキメラ抗原受容体 - Google Patents

Ｈｌａ－ｇ陽性癌を標的とするキメラ抗原受容体 Download PDF

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Abstract

【課題】 ＨＬＡ－Ｇ発現細胞の標的化に関連する方法および組成物を提供する。【解決手段】 本開示の実施形態には、特定の操作された受容体を用いたＨＬＡ－Ｇ発現細胞の標的化に関連する方法および組成物が含まれる。特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、特定のキメラ抗原受容体構築物を用いてＨＬＡ－Ｇと結合するように特異的に操作される。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲを発現するベクターは、特定の自殺遺伝子および／または１つ以上の特定のサイトカインも発現する。【選択図】 なし

Description

本出願は、２０２１年５月２６日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６３／１９３，５１５の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学、および癌医学を含む医学の分野を含む。
養子癌免疫療法のためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の遺伝子再プログラミングは、１）事前に感作を必要としない生得的な抗腫瘍監視、２）移植片対宿主反応性を伴わない同種有効性、および３）標的腫瘍の直接的な細胞媒介性細胞毒性および細胞溶解などの臨床的に関連する用途および利点を有する。ヒトＮＫ細胞の発達と自己寛容性、同種反応性、エフェクター機能の獲得は、免許取得、較正、武装の適応的過程である。分子レベルでは、特異的な活性化レセプターと抑制性レセプターが、細胞外シグナルを凝集し、バランスをとり、異なるエフェクター機能に統合することで、ＮＫ細胞の機能を指示している。ＮＫ細胞の機能活性と外来刺激に対する応答性は、継続的な教育の「レオスタット」モデルに従っており、したがって再プログラミングが可能である。ＮＫ細胞のエフェクター機能を方向づけるための遺伝子改変は、腫瘍細胞を殺す細胞傷害能力を利用する効果的な方法である。
ＨＬＡ－Ｇは非古典的なＨＬＡクラスＩ分子であり、健康な成人では胎盤にのみ発現する。ＨＬＡ－ＧはＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞上のレセプターと相互作用し、それらの機能を阻害し、母体と胎児の間に免疫寛容状態を作り出す。ＨＬＡ－Ｇは多くの血液腫瘍や固形腫瘍で過剰発現している。がん細胞は、ＨＬＡ－Ｇを異常発現し、ＮＫ細胞上の阻害受容体ＫＩＲ２ＤＬ４、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、および白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）と係合することにより、免疫監視から逃れる。
本開示は、特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ陽性腫瘍を含む癌を標的とする細胞療法のための、ヒトＮＫ細胞を含む細胞の遺伝子工学に関する方法および組成物に関する。
本開示の実施形態は、ＨＬＡ－Ｇ（例えば、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｇ、ＨＬＡ Ｇ抗原、またはＭＨＣクラスＩ抗原Ｇとしても知られている）を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、操作された細胞受容体に関連する方法および組成物を包含する。特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇを標的とする操作された受容体は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドの形態であり、かつ／または免疫細胞を含むあらゆる種類の細胞の表面上に含まれる。特定の場合には、細胞は免疫細胞であり、特定の実施形態において、免疫細胞は、あらゆる源由来のＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、樹状細胞等である。一部の実施形態において、免疫細胞はＮＫ細胞である。特定の実施形態において、臍帯血（ＣＢ－ＮＫ）由来の再プログラム化ＮＫ細胞が、ＨＬＡ－Ｇ分子を発現する癌を標的とするために包含される。
ＨＬＡ－Ｇは、乳癌、結腸直腸癌、子宮頚癌、食道癌、ユーイング癌、胃癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、および甲状腺癌を含む多数の癌上で発現されるため、少なくとも部分的に、開示される方法および組成物の態様のための標的抗原として利用される。加えて、ＨＬＡ－Ｇ過剰発現は癌免疫回避に関与し、そしてＨＬＡ－Ｇは免疫チェックポイントと考えることができる。ゆえに、その標的化を用いて、腫瘍免疫回避のこの重要な機構を克服することができる。
本開示は、いくつかの新規なＣＡＲ分子を含み、これは具体的な場合には、ヒトＨＬＡ－Ｇを標的とするｓｃＦｖ（例えば、Ｇ２３３、２６－２Ｈ１１、ＭＥＭ－Ｇ／１、ＭＥＭ－Ｇ／９、ＭＥＭ－Ｇ／１１、ＭＥＭ－Ｇ／１３、１Ｂ８、５Ｅ６Ｈ７、１－２Ｃ３、１６Ｇ１、５Ａ６Ｇ７、８７Ｇ、または３Ｃ／Ｇ４等の抗体クローン由来のｓｃＦｖが挙げられる）の、またはＫＩＲ２ＤＬ４、ＬＩＬＲＢ１、もしくはＬＩＬＲＢ２由来の細胞外ドメインの、１つ以上の活性化シグナル伝達エンドドメインとの融合を含み、場合によっては、ＣＤ３ζを単独で、または共刺激もしくはアダプターシグナル伝達ドメイン（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ－４０、ＣＤ２７、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および／または２Ｂ４由来）と組み合わせて組み込こむことを含む。特定の場合には、同種異系ＣＢ－ＮＫ細胞は、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲを発現するようにレトロウイルスにより形質導入される。特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ分子を包含する本開示の免疫細胞はまた、その生存および増殖を支持する１つ以上のタンパク質を発現する。特定の場合には、免疫細胞は、細胞の拡大および持続を促進する１つ以上のサイトカインを発現するように操作される。具体的な場合には、１つ以上のサイトカインは、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、および／またはＩＬ－２３である。特定の態様において、ＣＡＲをコードするベクターが、サイトカインもコードしており、各々が最終的に別々のポリペプチドとして産生される。他の態様において、ＣＡＲおよびサイトカインは、別々のベクター上にコードされる。
本開示の特定の実施形態は、レシピエント個体に対して同種異系であり、あらゆる種類のＨＬＡ－Ｇ陽性細胞を標的とし、かつＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１８等の１つ以上のサイトカインを発現するように形質導入されていてもされていなくてもよい、少なくともＮＫ細胞を含む既製の免疫細胞の使用を可能にする。
本開示の特定の実施形態において、免疫細胞における１つ以上の内因性遺伝子の発現が修飾されており、例えば、発現は、発現が部分的または完全に引き下げられ得る。修飾は、あらゆる手段によって生じ得るが、特定の実施形態において、１つ以上の遺伝子の発現が、例えば発現レベルが引き下げられることによって修飾されており、これは、少なくともＣＲＩＳＰＲが挙げられる適切なあらゆる手段によって生じ得る。単なる例として、内因性遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＴＬＡ－４、ＴＤＡＧ８、ＣＤ３８、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。
本開示の実施形態は、抗ＨＬＡ－Ｇキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、そしてまた１つ以上のサイトカインをコードし得るポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＫＩＲ２ＤＬ４細胞内ドメインではない細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＬ４タンパク質の細胞外ドメインのすべてを含む。これ以外にも、ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＬ４タンパク質の細胞外ドメインのＨＬＡ－Ｇ結合部分を含む。特定の実施形態において、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは、配列番号９を含む。特定の態様において、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは、配列番号７によってコードされる。一部の実施形態において、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは、配列番号１０を含む。場合によっては、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは、コドン最適化ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインである。特定の態様において、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは、配列番号８によってコードされる。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞内ドメインの一部、例えば活性化シグナルを媒介することができるＫＩＲ２ＤＬ４細胞内ドメインの一部を含む。
本開示の追加の実施形態は、抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲをコードし、そしてまた１つ以上のサイトカインをコードし得るポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＬＩＬＲＢ１細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインではない細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＬＩＬＲＢ１タンパク質の細胞外ドメインの全てを含む。これ以外にも、ＣＡＲは、ＬＩＬＲＢ１タンパク質の細胞外ドメインのＨＬＡ－Ｇ結合部分を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞内ドメインの一部、例えば活性化シグナルを媒介することができるＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインの一部を含む。本開示の更なる実施形態は、抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ＣＡＲは、ＬＩＬＲＢ２細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、ＬＩＬＲＢ２細胞内ドメインではない細胞内ドメインとを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＬＩＬＲＢ２タンパク質の細胞外ドメインの全てを含む。これ以外にも、ＣＡＲは、ＬＩＬＲＢ２タンパク質の細胞外ドメインのＨＬＡ－Ｇ結合部分を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞内ドメインの一部、例えば活性化シグナルを媒介することができるＬＩＬＲＢ２細胞内ドメインの一部を含む。
あらゆる膜貫通ドメインが、例えば、ＣＤ２８、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、またはそれらのあらゆる組合せ由来の膜貫通ドメインであり得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１２を含み得る。特定の場合には、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１１によってコードされる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１４を含み得る。特定の場合には、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１３によってコードされる。
あらゆる細胞内ドメインが、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、２Ｂ４、ＤＮＡＭ、ＣＳ１、ＣＤ４８、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、もしくはＮＫｐ８０、またはそれらのあらゆる組合せ由来の細胞内ドメインであり得る。一部の実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインである。ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインは、配列番号１６または配列番号１８を含み得る。具体的な場合には、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインは、配列番号１５または配列番号１７によってコードされる。一部の実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメインである。ＣＤ２８細胞内ドメインは、配列番号２４を含み得る。特定の場合には、ＣＤ２８細胞内ドメインは、配列番号２３によってコードされる。ＣＡＲは、２つ以上または３つ以上の細胞内ドメインを含み得る。特定の態様において、２つ以上の細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン、ならびにＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、４－１ＢＢ、ＮＫＧ２Ｄ、および２Ｂ４細胞内ドメインから選択される追加の細胞内ドメインを含む。特定の場合には、２つ以上の細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインおよびＣＤ２８細胞内ドメインを含む。
一部の実施形態において、ＣＡＲはさらに、シグナルペプチドを含む。特定の態様において、シグナルペプチドは、ＣＤ８、ＣＤ２７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＳＣＦ－Ｒ）、Ｉｇ重鎖、ＫＩＲ（例えばＫＩＲ２ＤＬ４）、ＣＤ３、またはＣＤ４に由来する。一部の実施形態において、シグナルペプチドはＣＤ８シグナルペプチドである。ＣＤ８シグナルペプチドは、配列番号６を含み得る。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号５によってコードされる。特定の態様において、ＣＡＲはシグナルペプチドを含まない。
特定の実施形態において、本開示のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドはさらに、目的の追加のポリペプチドをコードする。目的の追加のポリペプチドをコードする配列、およびＣＡＲをコードする配列は、Ｅ２Ａ要素等の２Ａ要素によってポリヌクレオチド上で分離され得る。特定の態様において、治療用タンパク質、ならびに／または細胞の活性、拡大、および／もしくは持続性を増強するタンパク質等の目的の１つ以上のポリペプチドが利用される。一部の実施形態において、目的の追加のポリペプチドは、増殖、拡大、および／または代謝適応度を増強する自殺遺伝子、サイトカイン、および／またはヒトもしくはウイルスタンパク質である。特定の実施形態において、目的の追加のポリペプチドは、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、またはＩＬ－７である。特定の実施形態において、サイトカインはＩＬ－１５である。
本開示の態様は、配列番号２と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含むＣＡＲをコードするポリペプチドに関する。一部の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２を含む。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１を含む。
本開示の追加の態様は、配列番号４と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含むＣＡＲをコードするポリペプチドに関する。一部の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号４を含む。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、
８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３を含む。
また、本明細書中で提示されるのは、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターである。本明細書中で企図されるベクターとして、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）および非ウイルスベクター（例えばプラスミド）が挙げられる。
本開示の実施形態は、本明細書中に包含されるあらゆるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含むあらゆる種類の免疫細胞を含む。特定の実施形態において、免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＭＳＣ、樹状細胞、またはそれらの混合物である。免疫細胞がＮＫ細胞である場合、ＮＫ細胞は、臍帯血（プールされた臍帯血単位を含む）、末梢血、人工多能性幹細胞、骨髄、および／または細胞株に由来し得る。特定の態様において、ＮＫ細胞株は、ＮＫ－９２細胞株、腫瘍に由来する別のＮＫ細胞株、または健康なＮＫ細胞もしくは前駆細胞である。
特定の実施形態において、免疫細胞は、ＮＫ細胞、例えば臍帯血に、例えば臍帯血単核細胞に由来するものである。ＮＫ細胞は、特定の場合には、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞であり得る。ＮＫ細胞は、１つ以上の外因的に提供されるサイトカイン、例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、またはそれらの組合せを発現し得る。特定の実施形態は、本開示のあらゆる種類の免疫細胞の集団を含み、細胞は、あらゆる種類の適切な培地または適切な担体中に存在し得る。
例えば、特定の抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲを発現する細胞を、癌を寛解させるか、もしくは予防する、癌のリスクを引き下げる、癌の重症度を引き下げる、転移もしくはそのリスクを予防する、または癌の発症を遅延させる治療有効量にて投与することによって、あらゆる種類の癌を処置または予防する方法が、本明細書に包含される。
一部の実施形態において、開示されるのは、本開示のあらゆるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（例えば、本開示のＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ）を有する有効量の細胞を個体に投与することを含む、個体においてあらゆる種類のＨＬＡ－Ｇ陽性細胞を死滅させる方法である。特定の実施形態において、細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、または樹状細胞である。ＮＫ細胞は、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、骨髄、または細胞株に由来し得る。ＮＫ細胞は、臍帯血単核細胞に由来し得る。場合によっては、ＨＬＡ－Ｇ陽性細胞は、例えば造血癌または固形腫瘍に由来する、癌細胞である。細胞は、ヒトであってもなくてもよい個体に対して、同種異系であっても自己由来であってもよい。細胞は、注射によって、静脈内、動脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病変内、頭蓋内、経皮的、皮下、局所的に、灌流によって、腫瘍微小環境内に、またはそれらを組み合わせて個体に投与され得る。
本方法の特定の実施形態において、細胞は、個体に１回以上投与され得る。個体への細胞の投与間の期間は、１～２４時間、１～７日、１～４週、１～１２ヶ月、または１年以上であり得る。方法はさらに、有効量の追加の療法、例えば、外科手術、放射線、遺伝子療法、免疫療法、および／またはホルモン療法を個体に施す工程を含み得る。追加の療法は、場合によっては、１つ以上の抗体または抗体ベースの剤を含み得る。本方法の一部の態様において、本方法はさらに、個体においてＨＬＡ－Ｇ陽性細胞を特定する工程を含み得る。
本出願の全体を通して、用語「約」は、値が測定方法または定量方法についての誤差の固有の変動を含むことを示すのに用いられる。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて用いられる場合の文言「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」、および「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」の意味とも一致する。
フレーズ「および／または」は、「および」または「または」を意味する。例示すると、Ａ、Ｂ、および／またはＣは、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢの組合せ、ＡおよびＣの組合せ、ＢおよびＣの組合せ、またはＡ、Ｂ、およびＣの組合せを含む。言い換えれば、「および／または」は、包括的なものとして機能する。
文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇのあらゆる形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」等のｈａｖｉｎｇのあらゆる形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」等のｉｎｃｌｕｄｉｎｇのあらゆる形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」等のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇのあらゆる形態）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法工程を排除しない。
組成物およびその使用方法は、本明細書の全体を通して開示される成分または工程のいずれかを「含む」、「から本質的になる」、または「からなる」ことができる。開示される成分または工程のいずれか「から本質的になる」組成物および方法は、特許請求の範囲を、特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない特定の材料または工程に制限する。
本明細書中で論じられるあらゆる実施形態は、本発明のあらゆる方法または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。
上記は、以下の発明の詳細な説明がよりよく理解され得るように、本開示の特徴および技術的利点をかなり広く概説している。特許請求の範囲の主題を形成する追加の特徴および利点を、本明細書中で以降に説明する。開示される概念および特定の実施形態は、本設計の同じ目的を実行するために他の構造を修正または設計するための基礎として容易に利用され得ることが当業者によって理解されるべきである。また、そのような等価の構成は、添付の特許請求の範囲に示される精神および範囲から逸脱しないことが当業者によって理解されるべきである。更なる目的および利点と共に、構成および操作方法の双方に関して、本明細書中で開示される設計の特徴であると考えられる新規の特徴は、添付の図面に関連して考慮される場合、以下の説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、各図は、例示および説明のみを目的として提供されており、本開示の制限の定義として意図されないことが明確に理解されるべきである。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
乳癌（ＭＤＡＭＢ２３１およびＢＣＸ０１０）、急性骨髄性白血病（ＯＣＩ－３）、多発性骨髄腫（ＭＭ１）、および膠芽腫細胞（ＧＣＳ２６７、ＧＣＳ２０、ＧＣＳ８－１１）が挙げられる、フローサイトメトリによって測定される種々の癌細胞型におけるＨＬＡ－Ｇの発現を示す。
本開示の抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ（ＫＩＲ２ＤＬ４ ＣＡＲ）を形質導入したＣＢ－ＮＫ細胞の発現を示す。ＫＩＲＤ２ＤＬ４ ＣＡＲピークは、一番右である。
本開示のＫＩＲ２ＬＤ４ ＣＡＲ ＮＫ細胞（ＣＤ８－ＫＩＲ２ＤＬ４－ＴＭＤ－３ＺおよびＣＤ８－ＫＩＲ２ＤＬ４－ＣＤ２８－３Ｚ）または非形質導入対照ＮＫ細胞（ＮＴ）と共に培養したＯＣＩ－ＡＭＬ１３細胞の細胞内サイトカイン染色の結果を示す。対照と比較して、ＫＩＲ２ＬＤ４ ＣＡＲ ＮＫ細胞では、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、およびＣＤ１０７ａ発現の増大が観察された。
本開示のＫＩＲ２ＬＤ４ ＣＡＲ ＮＫ細胞（ＣＤ８－ＫＩＲ２ＤＬ４－ＴＭＤ－３ＺおよびＣＤ８－ＫＩＲ２ＤＬ４－ＣＤ２８－３Ｚ）または非形質導入対照ＮＫ細胞（ＮＴ）と共に培養したＯＣＩ－ＡＭＬ１３細胞からの測定された５１Ｃｒ放出を示す。対照と比較して、ＫＩＲ２ＬＤ４ ＣＡＲ ＮＫ細胞では、Ｃｒ放出の増大が観察された（一番下の線）。
ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ構築物の一例についてのＨＥＫ２９３Ｔ細胞形質移入効率を示す。
ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ ＮＫ細胞についての形質導入効率を示す。
ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ細胞がＯＣＩ－ＡＭＬ ３細胞を効率的に死滅させることを実証する。
ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ ＮＫ細胞がＧＳＣ２０スフェロイドを効率的に死滅させることを示す。
ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ ＮＫ細胞が、腫瘍標的に応答してＴＮＦ－αを放出することを示す。
本開示の種々の実施形態が、本明細書中で示され、かつ説明されているが、そのような実施形態は、単なる例として提供されていることは、当業者であれば明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を生じさせることができる。本明細書中に記載される本開示の実施形態に対する種々の代替形態が使用され得ることを理解されたい。
I.定義の例
長年にわたる特許法の慣例に従い、本明細書において、特許請求の範囲を含め、comprisingという単語と組み合わせて使用される場合、「a」および「an」という単語は、「1つ以上」を表す。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の1つまたは複数の要素、方法ステップ、および／または方法から構成されるか、またはこれらから本質的に構成され得る。本明細書に記載される任意の方法または組成物が、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実施され得、異なる実施形態が組み合わされ得ることが企図される。
本明細書全体を通して、文脈上別段必要とされない限り、「comprise」、「comprises」および「comprising」という語は、記載されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を排除することを意味しないと理解される。「からなる」とは、「～からなる」という語句の後に続くものを含むこと、およびそれらに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という表現は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在しない可能性があることを示す。「から本質的になる」とは、その語句の後に列挙された要素を含むことを意味し、列挙された要素について開示で指定された活性または作用を妨げないか、またはそれに寄与しない他の要素に限定される。 従って、「本質的にからなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意であり、列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「１つの実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加の実施形態」、または「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。 したがって、本明細書を通じて様々な場所に前述の語句が現れるが、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
本明細書で使用される場合、「または」および「および／または」という用語は、複数の構成要素を組み合わせて、または互いに排他的に説明するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、およびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指すことができる。ｘ、ｙ、またはｚが実施形態から特に除外され得ることが特に企図される。
本出願を通じて、用語「約」は、値を決定するために採用される装置または方法についての誤差の標準偏差を値が含むことを示すために、細胞および分子生物学の領域におけるその平明かつ通常の意味に従って使用される。
本明細書で使用される「操作された」という用語は、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクターなどを含む、人の手によって生成された実体を指す。少なくともいくつかの場合において、操作された実体は合成されたものであり、天然には存在しない要素、または本開示において利用される方法で構成された要素を含む。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、分子または生物学的物質または細胞物質が他の物質から実質的に遊離していることを指す。一態様において、用語「単離された」は、天然源に存在するような、それぞれ他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官から分離された、ＤＮＡもしくはＲＮＡのような核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官を指す。また、「単離された」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって産生された場合には細胞材料、ウイルス材料、培養培地、または化学合成された場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然の状態では見出されない核酸断片を含むことを意味する。用語「単離された」はまた、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すために使用され、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。用語「単離された」はまた、本明細書において、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すために使用され、培養された細胞または組織および操作された細胞または組織の両方を包含することを意味する。
本明細書で使用される「予防する」、及び「予防する」、「予防する」等の類似の語は、疾患又は状態、例えば癌の発生又は再発の可能性を予防し、抑制し、又は低減するためのアプローチを示す。また、疾患または病態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患または病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」および同様の語は、疾患または状態の発症または再発の前に、疾患または状態の強度、影響、症状および／または負担を軽減することも含む。
本明細書で使用される「試料」という用語は、一般に生物学的試料を指す。試料は、個体の組織又は細胞から採取することができる。いくつかの例では、試料は、組織生検、血液（例えば、全血）、血漿、細胞外液、乾燥血斑、培養細胞、廃棄組織からなる、またはそれらに由来する。試料は、採取前に採取源から分離されていてもよい。非限定的な例としては、血液、脳脊髄液、胸水、羊水、リンパ液、唾液、尿、便、涙、汗、または粘膜排泄物、および採取前に一次供給源から分離された他の体液が挙げられる。いくつかの例では、試料は、試料調製中にその一次供給源（細胞、組織、血液などの体液、環境試料など）から分離される。試料は、その一次供給源から精製または濃縮されてもされなくてもよい。場合によっては、一次供給源はさらなる処理の前にホモジナイズされる。試料は、バフィーコート、脂質、または粒子状物質を除去するために、濾過または遠心分離される場合がある。サンプルはまた、核酸について精製または濃縮されるかもしれないし、ＲＮａｓｅで処理されるかもしれない。試料は、無傷、断片化、または部分的に分解された組織または細胞を含んでもよい。
本明細書で使用される「被験体」という用語は、一般に、処理または分析中の生物学的試料を有する個体であって、特定の場合には、癌を有するか、または癌を有する疑いがある個体を指す。対象は、哺乳動物、例えばヒト、実験動物（例えば、霊長類、ラット、マウス、ウサギ）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、七面鳥、ニワトリ）、家庭用ペット（例えば、イヌ、ネコ、げっ歯類）、ウマ、およびトランスジェニック非ヒト動物を含む、方法または材料の対象である任意の生物または動物対象であり得る。対象は、例えば、良性もしくは悪性の新生物、または癌などの疾患（病状と称される場合がある）を有するか、または有する疑いのある患者であり得る。対象者は、治療中又は治療を受けたことがある。被験者が無症状の場合もある。対象者は、健康な個人であるが、癌の予防を希望している場合もある。「個体」という用語は、少なくとも場合によっては互換的に使用される。本明細書で使用される「対象」または「個人」は、医療施設に収容されていてもいなくてもよく、医療施設の外来患者として治療されていてもよい。個人は、インターネットを介して１つ以上の医療用組成物の投与を受けてもよい。個体は、ヒトまたは非ヒト動物の任意の年齢を含んでよく、したがって、成人および少年（すなわち、子供）および乳児の両方を含み、胎内の個体も含む。この用語が医学的治療の必要性を意味することは意図されておらず、したがって、個体は、臨床的であれ基礎科学研究の支援であれ、自発的であれ非自発的であれ、実験に参加することができる。
本明細書で使用される「治療」または「処置」は、疾患または病理学的状態の症状または病理学的状態に対する任意の有益なまたは望ましい効果を含み、治療される疾患または状態、例えば癌の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最小限の減少さえも含み得る。治療は、任意に、疾患または病態の症状の軽減もしくは改善、または疾患または病態の進行の遅延のいずれかを含むことができる。「治療」は、必ずしも疾患もしくは状態、またはそれらに関連する症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。
本開示は、特にＨＬＡ－Ｇ陽性癌細胞を標的とする養子細胞療法を利用する、ＨＬＡ－Ｇ陽性癌の治療法を対象とする方法および組成物に関する。特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ陽性癌を標的とする、あらゆる種類の遺伝子操作された哺乳動物免疫細胞（少なくともヒトＮＫ細胞が挙げられる）が生成される。本開示は、ＨＬＡ－Ｇに対するあらゆる種類の遺伝子操作された受容体（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられる）を包含する。特定の態様において、ＣＡＲで使用されるＨＬＡ－Ｇ標的化細胞外ドメイン（ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインが挙げられる）を発現し、場合によっては、細胞の生存および増殖を支援するためのＩＬ－１５等の１つ以上のサイトカインも発現するレトロウイルス構築物が挙げられる、いくつかの新規の発現構築物が提供される。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＬ４の細胞外ドメイン（ＨＬＡ－Ｇに対する天然のリガンド）、およびＫＩＲ２ＤＬ４に由来しない１つ以上の追加のドメイン（例えば、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン）の融合物である。
ＩＩ．遺伝子操作された受容体
本開示の免疫細胞は、ＨＬＡ－Ｇを標的とする１つ以上の抗原結合受容体、例えば操作されたＣＡＲまたはこれ以外にも操作されたＴＣＲを発現するように遺伝子操作され得る。例えば、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ｇに対する抗原特異性を有するＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現するように修飾された免疫細胞であり得る。他のＣＡＲおよび／またはＴＣＲは、ＨＬＡ－Ｇ抗原受容体発現細胞と同じ細胞によって発現され得、そして異なる抗原に向けられ得る。一部の態様において、免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を用いるＣＡＲまたはＴＣＲのノックインによってＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲまたはＨＬＡ－Ｇ特異的ＴＣＲを発現するように操作されている。
細胞の適切な修飾方法が、当該技術において知られている。例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ参照。例えば、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００８およびＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９に記載されている形質導入技術を用いて、細胞は、癌抗原に対する抗原特異性を有するＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように形質導入され得る。
一部の態様において、細胞は、１つ以上の抗原標的化受容体（その少なくとも１つがＨＬＡ－Ｇに対するものである）をコードする、遺伝子操作を介して導入された１つ以上の核酸、およびそのような核酸の遺伝子操作された産物を含む。一部の実施形態において、核酸は異種である、すなわち、細胞または細胞から得られる試料において、通常存在せず、例えば、例えば操作されることとなる細胞および／またはそのような細胞が由来する生物において通常見出されない、別の生物または細胞から得られるものである。一部の実施形態において、核酸は、天然に存在せず、例えば、天然に見出されない核酸（例えばキメラ）である。
ＣＡＲおよび組換えＴＣＲが挙げられる例示的な抗原受容体、ならびに当該受容体を操作して細胞中に導入する方法として、例えば、国際公開第２０００／１４２５７号、国際公開第２０１３／１２６７２６号、国際公開第２０１２／１２９５１４号、国際公開第２０１４／０３１６８７号、国際公開第２０１３／１６６３２１号、国際公開第２０１３／０７１１５４号、国際公開第２０１３／１２３０６１号、米国特許出願公開第２００２／１３１９６０号明細書、米国特許出願公開第２０１３／２８７７４８号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１４９３３７号明細書、米国特許第６，４５１，９９５号明細書、米国特許第７，４４６，１９０号明細書、米国特許第８，２５２，５９２号明細書、米国特許第８，３３９，６４５号、米国特許第８，３９８，２８２号明細書、米国特許第７，４４６，１７９号明細書、米国特許第６，４１０，３１９号明細書、米国特許第７，０７０，９９５号明細書、米国特許第７，２６５，２０９号明細書、米国特許第７，３５４，７６２号明細書、米国特許第７，４４６，１９１号明細書、米国特許第８，３２４，３５３号明細書、および米国特許第８，４７９，１１８号明細書、ならびに欧州特許出願公開第２５３７４１６号明細書に記載されているもの、ならびに／またはＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２によって記載されているものが挙げられる。一部の態様において、遺伝子操作された抗原受容体として、米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載されているＣＡＲ、および国際公開第２０１４／０５５６６８号に記載されているものが挙げられる。
Ａ．キメラ抗原受容体
特定の実施形態において、ａ）１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、およびｃ）ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合することが挙げられる、ＨＬＡ－Ｇを標的とする少なくとも１つの抗原結合領域を含む細胞外ドメインを少なくとも含むＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲが利用される。一部の実施形態において、抗原結合領域は、抗体またはその機能的断片である。他の場合には、ＣＡＲの抗原結合領域は、抗体またはその機能的断片ではない（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＬＩＬＲＢ１、またはＬＩＬＲＢ２等のＨＬＡ－Ｇに対するリガンド）。一部の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合領域は、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインまたはその抗原結合部分である。一部の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合領域は、ＬＩＬＲＢ１細胞外ドメインまたはその抗原結合部分である。一部の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合領域は、ＬＩＬＲＢ２細胞外ドメインまたはその抗原結合部分である。一部の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲはＨＬＡ－Ｇのみに結合するが、他の場合では、単一ポリペプチドとしてのＣＡＲは、２つ以上の抗原結合ドメインを含むことによって二重特異性であり、その一方はＨＬＡ－Ｇに結合し、他方は別の非同一抗原に結合する。
一部の実施形態において、操作された抗原受容体として、活性化もしくは刺激ＣＡＲ、または共刺激ＣＡＲが挙げられるＣＡＲが挙げられる（国際公開第２０１４／０５５６６８号参照）。ＣＡＲは一般に、一部の態様においてリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して、１つ以上の細胞内シグナル伝達構成要素に連結される細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は、典型的には、天然抗原受容体を介したシグナル、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介したシグナル、および／または共刺激受容体単独を介したシグナルを模倣するか、またはこれに近似する。
キメラ構築物は、裸のＤＮＡとして、または適切なベクター内にあって免疫細胞中に導入され得ると考えられる。裸のＤＮＡを用いるエレクトロポレーションによって細胞を安定して形質移入する方法が、当該技術において知られている。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号明細書参照。裸のＤＮＡは、一般に、発現に適した向きにプラスミド発現ベクター内に含有される、キメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。
これ以外にも、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を用いて、キメラＣＡＲ構築物を免疫細胞中に導入することができる。本開示の方法に従って用いるのに適したベクターは、免疫細胞において非複製性である。細胞内に維持されるウイルスのコピー数が、細胞の生存率を維持するほど十分に低い、ウイルスに基づく多数のベクター、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、またはＢＰＶに基づくベクターが知られている。
本開示の特定の実施形態は、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、場合によっては免疫原性（ｈＣＡＲ）を引き下げるためにヒト化されたＣＡＲが挙げられる、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸が挙げられる核酸の使用に関する。特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲは、１つ以上の抗原間の共有空間を含むエピトープを認識し得る。特定の実施形態において、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはそれらの抗原結合断片を含み得る。別の実施形態において、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えばサイトカイン）に由来する。
ヒトＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ核酸は、ヒト患者のための細胞免疫療法を強化するのに用いられるヒト遺伝子であり得ると考えられる。特定の実施形態において、本開示は、全長ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ ｃＤＮＡまたはコード領域を含む。抗原結合領域またはドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖の断片、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１０９，３０４号明細書に記載されるものを含み得る。また、断片は、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであり得る。より具体的な実施形態において、断片は、ヒト細胞内での発現のためのヒトコドン使用頻度に最適化された配列によってコードされるＨＬＡ－Ｇ特異的ｓｃＦｖである。
構成は、ダイアボディまたはマルチマー等の多量体であり得る。マルチマーは、軽鎖および重鎖の可変部分の、ダイアボディへの交差対合によって形成される可能性が最も高い。構築物のヒンジ部分は、完全に欠失されることから、第１のシステインが維持されること、セリン置換ではなくプロリンになること、第１のシステインまで切断されることまで、多数の選択肢を有し得る。Ｆｃ部分は欠失され得る。安定かつ／または二量体化するあらゆるタンパク質が、この目的を果たし得る。Ｆｃドメインの１つのみ、例えばヒト免疫グロブリン由来のＣＨ２またはＣＨ３ドメインのいずれかを用いることができる。二量体化を向上させるように修飾されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を用いることもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分のみを用いることもできる。ＣＤ８アルファの一部を用いることもできる。
一部の実施形態において、疾患細胞型上で発現されるＨＬＡ－Ｇ等のＨＬＡ－Ｇに対する特異性を有するＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲが構築される。ゆえに、ＣＡＲは、典型的には、その細胞外部分に、１つ以上のＨＬＡ－Ｇ結合分子、例えば、１つ以上の抗原結合断片、ドメイン、抗体可変ドメイン、および／またはあらゆる種類の抗体分子を含む。ヒトＨＬＡ－Ｇ核酸の例が、受託番号ＮＭ＿００２１２７でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにある。ヒトＨＬＡ－Ｇポリペプチドの例が、受託番号ＮＰ＿００２１１８でＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）にある。当業者であれば、少なくともポリペプチドの知識および日常的な実施に基づいて、ＨＬＡ－Ｇに対するｓｃＦｖを含む抗体を生成することができるが、多数の抗ＨＬＡ－Ｇ ｓｃＦｖおよびモノクローナル抗体が、当該技術において既に存在する。一部の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ特異的ｓｃＦｖは、１つ以上の抗体クローン由来のｓｃＦＶである。
一部の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）等の抗体分子の抗原結合部分を含む。特定の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、Ｇ２３３、２６－２Ｈ１１、ＭＥＭ－Ｇ／１、ＭＥＭ－Ｇ／９、ＭＥＭ－Ｇ／１１、ＭＥＭ－Ｇ／１３、１Ｂ８、５Ｅ６Ｈ７、１－２Ｃ３、１６Ｇ１、５Ａ６Ｇ７、８７Ｇ、または３Ｃ／Ｇ４であるか、またはそれらに由来する。また、抗体は、ＨＬＡ－Ｇに対してデノボで生成されるものであってもよく、ｓｃＦｖ配列は、そのようなデノボ抗体から得られ得るか、または誘導され得る。
特定の実施形態において、抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ｇに対するリガンドであるか、またはこれを含む細胞外ドメインを含む。特定の実施形態において、抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲ２、またはそれらの断片もしくは模倣物由来の細胞外ドメインを含む。一部の実施形態において、抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインまたはその抗原結合部分を含む。一部の実施形態において、抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲは、配列番号４を含む細胞外ドメインを含む。
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から得ることもできるし、（例えばＰＣＲを介して）合成することもできるし、それらの組合せであってもよい。ゲノムＤＮＡのサイズおよびイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはその組合せを用いることが望ましい場合がある。というのも、イントロンがｍＲＮＡを安定させることがわかっているからである。また、ｍＲＮＡを安定させるために内因性または外因性の非コード領域を用いることがさらに有利である場合がある。
一部の態様において、抗原特異的結合または認識構成要素が、１つ以上の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲ内のドメインの１つと天然に結合する膜貫通ドメインが用いられる。一部の例において、膜貫通ドメインは、そのようなドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるように、アミノ酸置換によって選択または修飾される。一部の実施形態における膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来する。源が天然である場合、一部の態様におけるドメインは、あらゆる膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域として、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＫＩＲ２ＤＬ４等のＫＩＲ、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７等に由来するものが挙げられる（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含む）。これ以外にも、一部の実施形態における膜貫通ドメインは、合成である。一部の態様において、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリン等の疎水性残基を主に含む。一部の態様において、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端にて見出される。
一部の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメインおよび１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン等の他の共刺激受容体をコードする配列を含む。ＣＤ３ζおよび／またはＦｃεＲＩγによって開始され得るような一次Ｔ細胞活性化シグナルに加えて、キメラ受容体の、標的抗原との結合後の免疫エフェクタ細胞増殖およびエフェクタ機能用の追加の刺激シグナルが利用され得る。例えば、インビボ持続性を向上させ、かつ養子免疫療法の治療的成功を向上させるのに役立ち得る、細胞の活性化の増強のためのヒト共刺激受容体の一部または全部が利用され得る。例として、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、（ＣＤ２７８）、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＡＭ－１、および／または活性化シグナルを誘導することができるＫＩＲ２ＤＬ４細胞質ドメインの一部等の分子由来の共刺激ドメインが挙げられるが、代替の特定の実施形態において、列挙されるこれらのいずれか１つが、ＣＡＲでの使用から除外され得る。
特定の実施形態において、ＮＫ細胞等の免疫細胞を遺伝子修飾するための本明細書中で開示されるプラットフォーム技術は、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えばヌクレオフェクタ）を用いる非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメインを介してシグナル伝達するＣＡＲ（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３－ζ、または他の組合せ）、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ認識ドメインを細胞表面に連結する可変長の細胞外ドメインを有するＣＡＲ、および場合によっては、（ｉｖ）ＣＡＲ＋免疫細胞をロバストかつ数値的に拡大させることができるようなＫ５６２由来の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
Ｂ．特定のＣＡＲ実施形態の例
特定の実施形態において、特定のＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ分子が、本明細書中に包含される。場合によっては、ＣＡＲのＨＬＡ－Ｇ結合ドメインはｓｃＦｖであり、そしてＨＬＡ－Ｇに結合するあらゆるｓｃＦｖが、本明細書中で利用され得る。場合によっては、ＣＡＲのＨＬＡ－Ｇ結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｇのリガンド（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＬＩＬＲＢ１、またはＬＩＬＲＢ２）由来の結合ドメインであり、ＨＬＡ－Ｇに結合するあらゆるドメインが、本明細書で利用され得る。抗ＨＬＡ－Ｇ ｓｃＦｖがＣＡＲの細胞外ドメインに利用される場合、ｓｃＦｖの可変重鎖および可変軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、あらゆる順序であり得る。例えば、可変重鎖は、可変軽鎖のＮ末端側にあり得、またはその逆も同じである。ＣＡＲ内のＨＬＡ－Ｇに結合するｓｃＦｖおよび／またはリガンドは、コドン最適化されていてもされていなくてもよい。特定の実施形態において、ベクターは、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲをコードし、そしてまた１つ以上の他の分子をコードする。例えば、ベクターは、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲをコードし得、そしてまた、別の目的のタンパク質、例えば、別の操作された抗原受容体、自殺遺伝子、および／または特定のサイトカインをコードしてよい。
同じ分子上で、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲは、１つ以上の抗原特異的細胞外ドメイン、特異的ヒンジ、特異的膜貫通ドメイン、１つ以上の特異的共刺激ドメイン、および１つ以上の特異的活性化シグナルを含んでよい。例えば２つの異なる抗原（そのうちの１つがＨＬＡ－Ｇである）を標的とするのに、複数の抗原特異的細胞外ドメインが利用される場合、２つの抗原特異的細胞外ドメイン間にリンカーが存在し得る。
特定のＣＡＲ分子の特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、４－１ＢＢ、ＮＫＧ２Ｄ、または他の共刺激ドメイン（本明細書中で細胞質内ドメインと称され得る）を利用してよい。場合によっては、ＣＤ３ゼータは、いかなる共刺激ドメインもなしに利用される。特定のＣＡＲ分子の特定の実施形態において、ＣＡＲは、例えば、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、４－１ＢＢ、２Ｂ４、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８、またはＣＤ２８から、適切なあらゆる膜貫通ドメインを利用してよい。
特定の実施形態において、操作された特定のＨＬＡ－Ｇ特異的受容体をコードする配列を含む発現構築物が存在する。特定の実施形態において、あらゆるＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲは、以下のうちの１つを含み得る：（ａ）ＣＤ８シグナルペプチド、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン；または（ｂ）ＣＤ８シグナルペプチド、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン。
具体的な配列の実施形態の例を、以下に提供する。
１．抗原特異的細胞外ドメイン
特定の実施形態において、抗原特異的細胞外ドメインは、ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体のＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインおよび／または抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合領域を含む。具体的な配列の実施形態の例を、以下に提供する。
具体的な実施形態において、KIR2DL4細胞外ドメインヌクレオチド配列は、以下のように利用される。：
TGGGCACACGTGGGTGGTCAGGACAAGCCCTTCTGCTCTGCCTGGCCCAGCGCTGTGGTGCCTCAAGGAGGACACGTGACTCTTCGGTGTCACTATCGTCGTGGGTTCAACATCTTCACGCTGTACAAGAAAGATGGGGTCCCTGTCCCTGAGCTCTACAACAGAATATTCTGGAACAGTTTCCTCATTAGCCCTGTGACCCCAGCACACGCAGGGACCTACAGATGTCGAGGTTTTCACCCGCACTCCCCCACTGAGTGGTCGGCACCCAGCAACCCCCTGGTGATCATGGTCACAGGTCTATATGAGAAACCTTCGCTTACAGCCCGGCTGGGCCCCACGGTTCGCGCAGGAGAGAACGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCAGAGCTCCTTTGACATCTACCATCTATCCAGGGAGGGGGAAGCCCATGAACTTAGGCTCCCTGCAGTGCCCAGCATCAATGGAACATTCCAGGCCGACTTCCCTCTGGGTCCTGCCACCCACGGAGAGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCATGGATCTCCCTACGAGTGGTCAGACCCGAGTGACCCACTGCCTGTTTCTGTCACAGGAAACCCTTCTAGTAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTTCAAAACTGGTATCGCCAGACACCTGCAT (配列番号:7)
本開示に包含される任意のポリヌクレオチドは、配列番号：７、または配列番号：７と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくはそれ以上の％で同一である配列を含み得る。
特定の実施形態では、コドン最適化ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインヌクレオチド配列が、以下のように利用される。：
TGGGCTCACGTTGGCGGCCAGGATAAGCCTTTTTGTTCTGCCTGGCCTAGCGCCGTGGTTCCTCAAGGTGGACACGTGACCCTGCGGTGTCACTACAGACGGGGCTTCAACATCTTCACCCTGTACAAGAAAGACGGCGTGCCCGTGCCTGAGCTGTACAACAGAATCTTCTGGAACAGCTTCCTGATCAGCCCCGTGACACCAGCTCACGCCGGCACATACAGATGCAGAGGCTTTCACCCTCACAGCCCCACAGAGTGGTCCGCTCCATCTAACCCTCTGGTCATCATGGTCACCGGCCTGTACGAGAAGCCTAGCCTGACAGCTAGACTGGGCCCTACAGTTAGAGCCGGCGAGAATGTGACCCTGTCCTGTAGCAGCCAGAGCAGCTTCGACATCTACCACCTGTCTAGAGAGGGCGAAGCCCACGAACTGAGACTGCCTGCCGTGCCTAGCATCAATGGCACCTTCCAGGCCGATTTTCCACTGGGACCTGCCACACACGGCGAGACTTACAGATGCTTTGGCAGCTTCCACGGCAGCCCTTACGAGTGGTCTGATCCTAGCGATCCTCTGCCTGTGTCCGTGACAGGCAATCCTAGCAGCAGCTGGCCTTCTCCAACCGAGCCTAGCTTTAAGACCGGAATCGCCCGGCATCTGCAC (配列番号:8)
本開示に包含される任意のポリヌクレオチドは、配列番号：８、または配列番号：８と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくはそれ以上％同一である配列を含み得る。
KIR2DL4細胞外ドメインアミノ酸配列の例は以下の通りである。:
WAHVGGQDKPFCSAWPSAVVPQGGHVTLRCHYRRGFNIFTLYKKDGVPVPELYNRIFWNSFLISPVTPAHAGTYRCRGFHPHSPTEWSAPSNPLVIMVTGLYEKPSLTARLGPTVRAGENVTLSCSSQSSFDIYHLSREGEAHELRLPAVPSINGTFQADFPLGPATHGETYRCFGSFHGSPYEWSDPSDPLPVSVTGNPSSSWPSPTEPSFKTGIARHLH (配列番号:9)
本開示に包含される任意のポリペプチドは、配列番号:9、または配列番号:9と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、もしくはそれ以上％同一である配列を含み得る。
KIR2DL4細胞外ドメインアミノ酸配列の追加の例は以下の通りである。:
WAHVGGQDKPFCSAWPSAVVPQGGHVTLRCHYRRGFNIFTLYKKDGVPVPELYNRIFWNSFLISPVTPAHAGTYRCRGFHPHSPTEWSAPSNPLVIMVTGLYEKPSLTARPGPTVRAGENVTLSCSSQSSFDIYHLSREGEAHELRLPAVPSINGTFQADFPLGPATHGETYRCFGSFHGSPYEWSDPSDPLPVSVTGNPSSSWPSPTEPSFKTGIARHLH (配列番号:10)
本開示に包含される任意のポリペプチドは、配列番号:9、または配列番号:9と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、もしくはそれ以上％同一である配列を含み得る。
具体例において、ＣＡＲ分子中に利用されるＫＩＲ２ＤＬ４の領域は、以下のアミノ酸を含むか、以下からなるか、または以下から本質的になる。
配列表の配列番号９又は１０（配列番号：９又は配列番号：１０）の１－５０，１－５１，１－５２，１－５３，１－５４，１－５５，１－５６，１－５７，１－５８，１－５９，１－６０，１－６１，１－６２，１－６３，１－６４，１－６５，１－６６，１－６７，１－６８，１－６９，１－７０，１－７１，１－７２，１－７３，１－７４，１－７５，１－７６，１－７７，１－７８，１－７９，１－８０，１－８１，１－８２，１－８３，１－８４，１－８５，１－８６，１－８７，１－８８，１－８９，１－９０，１－９１，１－９２，１－９３，１－９４，１－９５，１－９６，１－９７，１－９８，１－９９，１－１００，１－１０１，１－１０２，１－１０３，１－１０４，１－１０５，１－１０６，１－１０７，１－１０８，１－１０９，１－１１０，１－１１１，１－１１２，１－１１３，１－１１４，１－１１５，１－１１６，１－１１７，１－１１８，１－１１９，１－１２０，１－１２１，１－１２２，１－１２３，１－１２４，１－１２５，１－１２６，１－１２７，１－１２８，１－１２９，１－１３０，１－１３１，１－１３２，１－１３３，１－１３４，１－１３５，１－１３６，１－１３７，１－１３８，１－１３９，１－１４０，１－１４１，１－１４２，１－１４３，１－１４４，１－１４５，１－１４６，１－１４７，１－１４８，１－１４９，１－１５０，１－１５１，１－１５２，１－１５３，１－１５４，１－１５５，１－１５６，１－１５７，１－１５８，１－１５９，１－１６０，１－１６１，１－１６２，１－１６３，１－１６４，１－１６５，１－１６６，１－１６７，１－１６８，１－１６９，１－１７０，１－１７１，１－１７２，１－１７３，１－１７４，１－１７５，１－１７６，１－１７７，１－１７８，１－１７９，１－１８０，１－１８１，１－１８２，１－１８３，１－１８４，１－１８５，１－１８６，１－１８７，１－１８８，１－１８９，１－１９０，１－１９１，１－１９２，１－１９３，１－１９４，１－１９５，１－１９６，１－１９７，１－１９８，１－１９９，１－２００，１－２０１，１－２０２，１－２０３，１－２０４，１－２０５，１－２０６，１－２０７，１－２０８，１－２０９，１－２１０，１－２１１，１－２１２，１－２１３，１－２１４，１－２１５，１－２１６，１－２１７，１－２１８，１－２１９，１－２２０，又はすべて（１－２２１）；特定の実施形態において、これらの範囲のそのようなアミノ酸は連続している。 いくつかの実施形態において、配列番号:9または配列番号:10の領域は、N末端から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上のアミノ酸のような、N末端での切断を有するものが利用される。 特定の態様において、そのN末端で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上のアミノ酸の切断があり、C末端で切断がある。
LILRB1の細胞外ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである。:
GHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGV (配列番号:48)
LILRB2の細胞外ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである：
QTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKNGQFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRVTLQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPNRRWSHRCYGYDYDRFVLYKEGERDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSECSAPSDPLDILITGQIRGTPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAGAADAPLRLRSIHEYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSGPSMGSSPPPTGPISTPAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGV (配列番号:49)
具体的な実施形態において、抗原特異的細胞外ドメインは、ｓｃＦｖであってもなくてもよいＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合領域を含む。
特定の実施形態において、抗原特異的細胞外ドメインは、ＭＥＭ－Ｇ１１のＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体の抗体を含む。このような場合、ＭＥＭ－Ｇ／１１配列は、可変領域および定常領域を含む以下の軽鎖配列を含む。:
DIVLTQSPASLDVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQSPKLLIYLASNRESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(配列番号:50)。ここで、定常領域には下線が引かれている。具体的な実施形態において、このような軽鎖配列は、RASKSVSTSGYSYMH（配列番号:51）のCDR1；LASNRES（配列番号:52）のCDR2；およびQHSREFPT（配列番号:53）のCDR3を含み得る。
MEM-G／11可変軽鎖配列は、以下を含む。
DIVLTQSPASLDVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQSPKLLIYLASNRESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPTFGAGTKLELK (配列番号:54).
具体的な態様において、MEM-G/11可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチドは、以下を含む。:
Gatattgtgctgacccagagcccggcgagcctggatgtgagcctgggccagcgcgcgaccattagctgccgcgcgagcaaaagcgtgagcaccagcggctatagctatatgcattggtatcagcagaaaccgggccagagcccgaaactgctgatttatctggcgagcaaccgcgaaagcggcgtgccggcgcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaacattcatccggtggaagaagaagatgcggcgacctattattgccagcatagccgcgaatttccgacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaa (配列番号:55)
具体的な態様において、MEM-G／11配列は、可変領域および定常領域を含む以下の重鎖配列を含み得る:
KVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCSASGFPFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDDDYTYYPDSMKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCSRGIYYGSSPFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (配列番号:56)
ここで、定常領域には下線が引かれている。具体的な実施形態において、このような重鎖配列は、GFPFSDY（配列番号:57）のCDR1；SDDDDY（配列番号:58）のCDR2；およびGIYYGSSPFAY（配列番号:59）のCDR3を含んでなり得る。
MEM-G/11可変重鎖配列は、以下を含み得る:
KVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCSASGFPFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDDDYTYYPDSMKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCSRGIYYGSSPFAYWGQGTLVTVSA (配列番号:60).具体的な態様において、MEM-G/11可変重鎖配列をコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る:
Aaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgaaaccgggcggcagcctgaaactgagctgcagcgcgagcggctttccgtttagcgattattatatgtattgggtgcgccagaccccggaaaaacgcctggaatgggtggcgaccattagcgatgatgatgattatacctattatccggatagcatgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaacctgtatctgcagatgagcagcctgaaaagcgaagataccgcgatgtattattgcagccgcggcatttattatggcagcagcccgtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcg (配列番号:61).
具体的な実施形態では、抗原特異的細胞外ドメインは、87GクローンのHLA-Gモノクローナル抗体の抗体からなる。 このような場合、配列は、可変領域および定常領域を含む以下の軽鎖配列から構成され得る。
ETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEDNILRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMPLTFGGGTRLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(配列番号:62), ここで、定常領域には下線が引かれている。 特定の実施形態において、このような軽鎖配列は、ITSTDIDDDMN（配列番号:63）のCDR1；EDNILRP（配列番号:64）のCDR2；およびLQSDNMPLT（配列番号:65）のCDR3を含んでなることができる。
８７Ｇ可変軽鎖配列は、以下を含み得る。
ETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEDNILRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMPLTFGGGTRLEIK (配列番号:66). 87G可変軽鎖配列をコードし得るポリヌクレオチドは、以下を含む：
Gaaaccaccgtgacccagagcccggcgagcctgagcgtggcgaccggcgaaaaagtgaccattcgctgcattaccagcaccgatattgatgatgatatgaactggtatcagcagaaaccgggcgaaccgccgaaactgctgattagcgaagataacattctgcgcccgggcgtgccgagccgctttagcagcagcggctatggcaccgattttgtgtttaccattgaaaacaccctgagcgaagatgtggcggattattattgcctgcagagcgataacatgccgctgacctttggcggcggcacccgcctggaaattaaa (配列番号:67).
具体的な例では、配列は可変領域と定常領域を含む以下の重鎖配列からなることがある：
EVKLVESGGSLVQPGGSLKLSCAASGFSFSSYTMSWVRQTPKKRLEWVAYVSNGAGTTYYPDSLKGRFTISRDNAKNTLHLLMTSLKSEDTAIYYCARHYYGSYHFDYWGQGTTLIVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLGK (配列番号:68)、ここで、定常領域には下線が引かれている。具体的な実施形態において、このような重鎖配列は、GFSFSSY（配列番号:69）のCDR1；SNGAGT（配列番号:70）のCDR2；およびHYYGSYHFDY（配列番号:71）のCDR3を含んでなり得る。
いくつかの実施形態において、87G可変重鎖配列は、以下を含む。
EVKLVESGGSLVQPGGSLKLSCAASGFSFSSYTMSWVRQTPKKRLEWVAYVSNGAGTTYYPDSLKGRFTISRDNAKNTLHLLMTSLKSEDTAIYYCARHYYGSYHFDYWGQGTTLIVSS (配列番号:72)。 特定の態様において、87G可変重鎖配列をコードするポリヌクレオチドは、以下を含む:
Gaagtgaaactggtggaaagcggcggcagcctggtgcagccgggcggcagcctgaaactgagctgcgcggcgagcggctttagctttagcagctataccatgagctgggtgcgccagaccccgaaaaaacgcctggaatgggtggcgtatgtgagcaacggcgcgggcaccacctattatccggatagcctgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaccctgcatctgctgatgaccagcctgaaaagcgaagataccgcgatttattattgcgcgcgccattattatggcagctatcattttgattattggggccagggcaccaccctgattgtgagcagc (配列番号:73)
本開示に包含される任意のポリヌクレオチドは、配列番号:55、61、67、もしくは73、または配列番号:55、61、67、もしくは73とそれぞれ少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、もしくはそれ以上％同一である配列を含み得る。
本開示に包含される任意のポリペプチドは、配列番号:50-54、56-60、62-66、または68-72、あるいは配列番号:50-54、56-60、62-66、または68-72とそれぞれ少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、またはそれ以上％同一である配列を含み得る。
２．膜貫通ドメイン
任意の適切な膜貫通ドメインが、本開示のＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲにおいて利用され得る。例としては、少なくとも、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４由来の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体ａまたはｂ鎖由来の膜貫通ドメイン、ＣＤ３ゼータ鎖由来の膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ由来の膜貫通ドメイン、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせが挙げられる。具体的には、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２８、ＣＤ８、またはＮＫＧ２Ｄ由来の膜貫通ドメインが利用される。いくつかの実施形態において、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）由来の膜貫通ドメインが利用され、例えば、阻害性ＫＩＲ由来の膜貫通ドメイン（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３）、または活性化ＫＩＲ（例えば、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１）からの膜貫通ドメインが利用される。特定の膜貫通ドメイン配列の例を以下に示す。：
ＣＤ２８膜貫通ドメインの塩基配列：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG (配列番号:11)
ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (配列番号:12)
ＣＤ８膜貫通ドメインの塩基配列:
accacaacaccagcacctagacctccaactccagctcctacaatcgccagccagcctctgtctctgaggcctgaagcttgtagacctgctgctggcggagccgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgatatctacatctgggcccctctggctggaacatgtggcgtgctgctgctgagcctcgtgatcaca (配列番号:13)
ＣＤ８膜貫通ドメインアミノ酸配列:
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (配列番号:14)
4-1BB 膜貫通ドメイン塩基配列:
ATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTT (配列番号:25)
4-1BB 膜貫通ドメイン アミノ酸配列:
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV (配列番号:26)
DAP10 膜貫通ドメイン 塩基配列:
CTCCTGGCAGGCCTCGTGGCTGCTGATGCGGTGGCATCGCTGCTCATCGTGGGGGCGGTGTTC (配列番号:27)
DAP10 膜貫通ドメインアミノ酸配列:
LLAGLVAADAVASLLIVGAVF (配列番号:28)
DAP12 膜貫通ドメイン塩基配列:
GGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGCTCATTGCCCTGGCCGTG (配列番号:29)
DAP12 膜貫通ドメイン アミノ酸配列:
GVLAGIVMGDLVLTVLIALAV (配列番号:30)
NKG2D 膜貫通ドメイン 塩基配列:
GCGGTGATGATTATTTTTCGCATTGGCATGGCGGTGGCGATTTTTTGCTGCTTTTTTTTTCCG (配列番号:31)
NKG2D 膜貫通ドメイン アミノ酸配列:
AVMIIFRIGMAVAIFCCFFFP (配列番号:32)
本開示に包含される任意のポリヌクレオチドは、配列番号:11、13、25、27、29、もしくは31、または配列番号:11、13、25、27、29、もしくは31と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、もしくはそれ以上％同一である配列からなり得る。本開示に包含される任意のポリペプチドは、配列番号:12、14、16、28、30、もしくは32、または配列番号:12、14、16、28、30、もしくは32と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、もしくはそれ以上同一である配列を含み得る。
３．細胞内ドメイン
１つまたは複数の細胞内ドメイン（適切な場合には、本明細書においてシグナル活性化ドメインまたはコスティミュレイトリードメインとも呼ばれ得る）は、本開示の特定の抗ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲにおいて利用されても利用されなくてもよい。具体例としては、ＣＤ３ゼータ、４－１ＢＢ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ－４０、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｂ７－１／ＣＤ８０、ＣＤ２８、２Ｂ４、４－１ＢＢＬ、Ｂ７－２／ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７－Ｈ２、ＰＤ－ｌ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ４、ＰＤＣＤ６、ＢＴＬＡ、またはそれらの組み合わせからの細胞内ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞内ドメインではない。
本開示のＣＡＲにおいて使用され得る特定の細胞内ドメインの例を以下に示す。：
CD3ゼータ 細胞内ドメイン塩基配列の例:
acgcgtaagaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaaaagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcgga (配列番号:15)
CD3ゼータ細胞内ドメインアミノ酸配列の例:
TRKKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRG (配列番号:16)
CD3ゼータ細胞内ドメイン 塩基配列の例:
AAACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGA (配列番号:17)
CD3ゼータ細胞内ドメインアミノ酸配列の例:
KRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRG (配列番号:18)
4-1BB 細胞内ドメイン 塩基配列:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (配列番号:33)
4-1BB 細胞内ドメイン アミノ酸配列:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (配列番号:34)
DAP10細胞内ドメイン塩基配列:
CTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGC (配列番号:35)
DAP10細胞内ドメインアミノ酸配列:
LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG (配列番号:36)
DAP12細胞内ドメイン塩基配列:
TACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAA (配列番号:37)
DAP12細胞内ドメインアミノ酸配列:
YFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK (配列番号:38)
NKG2D 細胞内ドメイン 塩基配列:
AGCGCGAACGAACGCTGCAAAAGCAAAGTGGTGCCGTGCCGCCAGAAACAGTGGCGCACCAGCTTTGATAGCAAAAAACTGGATCTGAACTATAACCATTTTGAAAGCATGGAATGGAGCCATCGCAGCCGCCGCGGCCGCATTTGGGGCATG (配列番号:39)
NKG2D 細胞内ドメイン アミノ酸配列:
SANERCKSKVVPCRQKQWRTSFDSKKLDLNYNHFESMEWSHRSRRGRIWGM (配列番号:40)
本開示に含まれるポリヌクレオチドは以下を含み得る。
配列番号:15, 17, 33, 35, 37, or 39 または配列番号:15、17、33、35、37、または39と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、またはそれ以上％同一である配列を含む。本開示に包含される任意のポリペプチドは、以下を含み得る。配列番号:16, 18, 34, 36, 38, または40、あるいは配列番号:16、18、34、36、38、または40と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、またはそれ以上％同一である配列。
４．ヒンジ
ＣＡＲのいくつかの実施形態では、１つ以上の細胞外抗原結合ドメインと貫通ドメインとの間にヒンジ領域が存在する。具体的な実施形態において、ヒンジは、例えば、１０～２０、１０～１５、１１～２０、１１～１５、１２～２０、１２～１５、または１５～２０アミノ酸のような特定の長さを有する。ヒンジは任意の適切なヒンジであってよく、場合によってはＩｇＧ、またはＣＤ２８由来のヒンジを含む。具体的な実施形態では、ヒンジは、ＩｇＧ ＦｃのＣＨ２－ＣＨ３ドメインとＣＨ１ドメインとを連結する小さな可撓性ポリペプチドである。例えば、様々なＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１～４、修飾されていてもいなくてもよい）のＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ（一部または全部）を利用することができる。しかしながら、場合によっては、ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ全体が利用されるのではなく、ヒンジの一部が利用される（ＣＨ３単体またはＣＨ３の一部単体など）。特定の実施態様において、ＩｇＧ１由来のＣＨ２－ＣＨ３ヒンジが利用され、場合によってはＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ全体が利用され（２２９アミノ酸全て）、ＣＨ３ヒンジ（１１９アミノ酸）だけが利用され、または短いヒンジ（１２アミノ酸）が利用される。
特定の場合には、ＣＡＲの効率を最適化するために、スペーサーおよび／またはヒンジの同一性または長さを変更することができる。例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋら（２０１４）及びＪｏｎｎａｌａｇａｄｄａら（２０１５）を参照されたい。特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲは、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ＋ＣＨ３を利用するか、又はＣＤ８ａストークを利用する。
したがって、具体的な実施形態において、利用されるＩｇＧヒンジ領域は、典型的にはＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、場合によっては、ＣＡＲはＩｇＧ ＦｃのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＧ Ｆｃドメインの使用は、ＣＡＲに柔軟性を与えることができ、免疫原性が低く、抗Ｆｃ試薬を用いたＣＡＲ発現の検出を容易にし、異なるスペーサー長に対応するために１つ以上のＣＨ２またはＣＨ３モジュールを除去することを可能にする。しかしながら、一実施形態では、ＦｃγＲ結合を回避するための特定のスペーサーの変異は、例えば可溶性および細胞表面Ｆｃガンマレセプターの結合を回避するために、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の生着および抗腫瘍効力を改善し、なおかつ抗原特異的溶解を媒介する活性を維持する可能性がある。例えば、ＣＨ２領域を修飾したＩｇＧ４－Ｆｃスペーサーを用いることができる。例えば、ＣＨ２領域は、点変異および／または欠失を含む、変異されていてもよい。特定の改変は、ＣＨ２領域内の２つの部位（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で実証されており、かつ／またはＣＨ２欠失を組み込んでいる（Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ ｅｔ ａｌ，２０１５）。具体的な実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（長さ２２９ａａ）又はヒンジドメインのみ（長さ１２ａａ）を採用することができる（Ｈｕｄｅｃｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
特定の実施形態において、ヒンジは、ＩｇＧ、ＣＤ２８、ＣＤ－８α、４－１ＢＢ、０Ｘ４０、ＣＤ３ゼータ、Ｔ細胞受容体ａ鎖またはｂ鎖からのものである、ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、またはＣＤ１５４である。
利用され得るヒンジの特定の配列の例には、少なくとも以下が含まれる：
IgG Hinge 塩基配列:
GTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATT (配列番号:41)
IgG Hinge アミノ酸配列:
TVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL (配列番号:42)
CD28 Hinge 塩基配列:
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC (配列番号:43)
CD28 Hinge アミノ酸配列:
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (配列番号:44)
本開示に包含される任意のポリヌクレオチドは、配列番号：４１もしくは４３、または配列番号：４１もしくは４３と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくはそれ以上％同一である配列を含み得る。本開示に包含される任意のポリペプチドは、配列番号：４２もしくは４４、または配列番号：４２もしくは４４と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくはそれ以上％同一である配列を含み得る。
５．その他のタンパク質
いくつかの実施形態では、1つ以上の他のタンパク質が、本開示の抗HLA-G CARとともに利用される。１つまたは複数の他のタンパク質は、CAR自体および／またはCARを発現する任意の種類の細胞の効力を促進することを含む、任意の理由で利用され得る。場合によっては、他のタンパク質は、他のタンパク質（複数可）がCARまたは細胞の活性に直接的または間接的に影響を及ぼすか否かにかかわらず、治療としてCARを発現する細胞を受ける個体の治療を容易にする。場合によっては、他のタンパク質は、自殺遺伝子、1つ以上のサイトカイン、またはその両方である。特定の実施形態では、1つ以上の他のタンパク質はベクターから産生され、最終的に2つの別々のポリペプチドとして産生される。例えば、抗HLA-G CARおよび他のタンパク質（複数可）は、例えば、2A配列またはIRESによって分離され得る。
特定の実施形態では、IL-15のようなサイトカインが、抗HLA-G CARと共に利用される。
IL-15塩基配列の一例は以下の通りである：
IL-15 塩基配列:
GCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGACAATT (配列番号:21)
IL-15 アミノ酸配列:
ISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (配列番号:22)
同じベクター中のCARおよび別のタンパク質が、2つの異なるポリペプチドに産生されることが意図される場合には、特定の2A配列が利用され得る。
一例では、E2A 塩基配列は以下のように利用される：
CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCC (配列番号:19)
E2A アミノ酸配列は、以下を利用し得る:
QCTNYALLKLAGDVESNPGP (配列番号:20)
他の2Aの例は、以下を利用し得る。:
T2A: EGRGSLLTCGDVEENPGP (配列番号:45)
P2A: ATNFSLLKQAGDVEENPGP (配列番号:46)
F2A: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (配列番号:47)
本開示はまた、任意のタイプの免疫エフェクター細胞における発現を含む、特定のCAR分子を包含する。
一例では、CD8シグナルペプチド、KIR2DL4細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、およびCD3ゼータ細胞内ドメインを含む抗HLA-G CARが利用される。ベクターにおいて、CARは、2A配列によってCARから分離され得るようなIL-15と共に発現され得る。具体的な例では、このようなCARおよびIL-15構築物は、以下の塩基配列を有することができる：
CD8SP-KIR2DL4EC_CD28 TMD-CD3ゼータ_IL15
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCTGGGCACACGTGGGTGGTCAGGACAAGCCCTTCTGCTCTGCCTGGCCCAGCGCTGTGGTGCCTCAAGGAGGACACGTGACTCTTCGGTGTCACTATCGTCGTGGGTTCAACATCTTCACGCTGTACAAGAAAGATGGGGTCCCTGTCCCTGAGCTCTACAACAGAATATTCTGGAACAGTTTCCTCATTAGCCCTGTGACCCCAGCACACGCAGGGACCTACAGATGTCGAGGTTTTCACCCGCACTCCCCCACTGAGTGGTCGGCACCCAGCAACCCCCTGGTGATCATGGTCACAGGTCTATATGAGAAACCTTCGCTTACAGCCCGGCTGGGCCCCACGGTTCGCGCAGGAGAGAACGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCAGAGCTCCTTTGACATCTACCATCTATCCAGGGAGGGGGAAGCCCATGAACTTAGGCTCCCTGCAGTGCCCAGCATCAATGGAACATTCCAGGCCGACTTCCCTCTGGGTCCTGCCACCCACGGAGAGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCATGGATCTCCCTACGAGTGGTCAGACCCGAGTGACCCACTGCCTGTTTCTGTCACAGGAAACCCTTCTAGTAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTTCAAAACTGGTATCGCCAGACACCTGCATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGACGCGTAAGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGC (配列番号:1)
CD8SP-KIR2DL4EC_CD28 TMD-CD3ゼータ_IL15に対応するアミノ酸配列は以下の通りである:
MALPVTALLLPLALLLHAARPWAHVGGQDKPFCSAWPSAVVPQGGHVTLRCHYRRGFNIFTLYKKDGVPVPELYNRIFWNSFLISPVTPAHAGTYRCRGFHPHSPTEWSAPSNPLVIMVTGLYEKPSLTARLGPTVRAGENVTLSCSSQSSFDIYHLSREGEAHELRLPAVPSINGTFQADFPLGPATHGETYRCFGSFHGSPYEWSDPSDPLPVSVTGNPSSSWPSPTEPSFKTGIARHLHFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVTRKKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (配列番号:2)
一例では、CD8シグナルペプチド、コドン最適化KIR2DL4細胞外ドメイン、CD8 膜貫通ドメイン、CD3 ゼータ細胞内ドメイン、およびCD28コスティミュレイトリードメインを含む抗HLA-G CARが利用される。ベクターにおいて、CARは、2A配列によってCARから分離され得るようなIL-15と共に発現され得る。具体例では、このようなCARおよびIL-15構築物は、以下の塩基配列を有することができる：
CD8SPcoKIR2L4_EC_CD8tmd28Z15
ATGGGGATGGCATTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTTGGGCTCACGTTGGCGGCCAGGATAAGCCTTTTTGTTCTGCCTGGCCTAGCGCCGTGGTTCCTCAAGGTGGACACGTGACCCTGCGGTGTCACTACAGACGGGGCTTCAACATCTTCACCCTGTACAAGAAAGACGGCGTGCCCGTGCCTGAGCTGTACAACAGAATCTTCTGGAACAGCTTCCTGATCAGCCCCGTGACACCAGCTCACGCCGGCACATACAGATGCAGAGGCTTTCACCCTCACAGCCCCACAGAGTGGTCCGCTCCATCTAACCCTCTGGTCATCATGGTCACCGGCCTGTACGAGAAGCCTAGCCTGACAGCTAGACTGGGCCCTACAGTTAGAGCCGGCGAGAATGTGACCCTGTCCTGTAGCAGCCAGAGCAGCTTCGACATCTACCACCTGTCTAGAGAGGGCGAAGCCCACGAACTGAGACTGCCTGCCGTGCCTAGCATCAATGGCACCTTCCAGGCCGATTTTCCACTGGGACCTGCCACACACGGCGAGACTTACAGATGCTTTGGCAGCTTCCACGGCAGCCCTTACGAGTGGTCTGATCCTAGCGATCCTCTGCCTGTGTCCGTGACAGGCAATCCTAGCAGCAGCTGGCCTTCTCCAACCGAGCCTAGCTTTAAGACCGGAATCGCCCGGCATCTGCACACCACAACACCAGCACCTAGACCTCCAACTCCAGCTCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCTGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGAACATGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTCGTGATCACAAAACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (配列番号:3)
CD8SPcoKIR2L4_EC_CD8tmd28Z15に対応するアミノ酸配列は以下の通りである。:
MGMALPVTALLLPLALLLHAARPWAHVGGQDKPFCSAWPSAVVPQGGHVTLRCHYRRGFNIFTLYKKDGVPVPELYNRIFWNSFLISPVTPAHAGTYRCRGFHPHSPTEWSAPSNPLVIMVTGLYEKPSLTARLGPTVRAGENVTLSCSSQSSFDIYHLSREGEAHELRLPAVPSINGTFQADFPLGPATHGETYRCFGSFHGSPYEWSDPSDPLPVSVTGNPSSSWPSPTEPSFKTGIARHLHTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (配列番号:4)
いくつかの実施形態では、抗HLA-G抗体を利用する特定のCARが採用される。特定の態様において、CARをコードする構築物は、誘導性カスパーゼ9、MEM-G/11抗体（可変重鎖が可変軽鎖のN末端にある）、CD28ヒンジ、CD28コスティミュレイトリードメイン、およびCD3ゼータを含むCARを含み、発現構築物はIL-15も発現する。別個のポリペプチドは2A配列で分離されていてもよい。このような構築物の例示的な配列は以下の通りである：
iC9MEMVHVL28HingeCD28CD3ZIL15
ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGCGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGATCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTTCGCGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGAGaaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgaaaccgggcggcagcctgaaactgagctgcagcgcgagcggctttccgtttagcgattattatatgtattgggtgcgccagaccccggaaaaacgcctggaatgggtggcgaccattagcgatgatgatgattatacctattatccggatagcatgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaacctgtatctgcagatgagcagcctgaaaagcgaagataccgcgatgtattattgcagccgcggcatttattatggcagcagcccgtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgTTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGgatattgtgctgacccagagcccggcgagcctggatgtgagcctgggccagcgcgcgaccattagctgccgcgcgagcaaaagcgtgagcaccagcggctatagctatatgcattggtatcagcagaaaccgggccagagcccgaaactgctgatttatctggcgagcaaccgcgaaagcggcgtgccggcgcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaacattcatccggtggaagaagaagatgcggcgacctattattgccagcatagccgcgaatttccgacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaaCaCGTACGccCCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (配列番号:74)
iC9MEMVHVL28HingeCD28CD3ZIL15のポリペプチドの例としては、以下のものを挙げることができる：
MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMEFGLSWLFLVAILKGVQCSREKVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCSASGFPFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDDDYTYYPDSMKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCSRGIYYGSSPFAYWGQGTLVTVSALEIKGSTSGSGKPGSGEGSTDIVLTQSPASLDVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQSPKLLIYLASNRESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPTFGAGTKLELKHVRPIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS* (配列番号:75)
具体的な例では、CARをコードする構築物は、誘導性カスパーゼ9、MEM-G/11抗体（可変重鎖が可変軽鎖のN末端にある）、CD28ヒンジ、DAP10コスティミュレイトリードメイン、およびCD3ゼータを含むCARを含み、発現構築物はIL-15も発現する。別個のポリペプチドは2A配列で分離されていてもよい。このような構築物の例示的な配列は以下の通りである：
iC9MEMVHVL28HingeDAP10CD3ZIL15
ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGCGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGATCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTTCGCGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGAGaaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgaaaccgggcggcagcctgaaactgagctgcagcgcgagcggctttccgtttagcgattattatatgtattgggtgcgccagaccccggaaaaacgcctggaatgggtggcgaccattagcgatgatgatgattatacctattatccggatagcatgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaacctgtatctgcagatgagcagcctgaaaagcgaagataccgcgatgtattattgcagccgcggcatttattatggcagcagcccgtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcgTTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGgatattgtgctgacccagagcccggcgagcctggatgtgagcctgggccagcgcgcgaccattagctgccgcgcgagcaaaagcgtgagcaccagcggctatagctatatgcattggtatcagcagaaaccgggccagagcccgaaactgctgatttatctggcgagcaaccgcgaaagcggcgtgccggcgcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaacattcatccggtggaagaagaagatgcggcgacctattattgccagcatagccgcgaatttccgacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaaCCGTACGCCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGCTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCCGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (配列番号:76).
iC9MEMVHVL28HingeDAP10CD3ZIL15によってコードされるポリペプチドの例は以下であり得る:
MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMEFGLSWLFLVAILKGVQCSREKVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCSASGFPFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDDDYTYYPDSMKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCSRGIYYGSSPFAYWGQGTLVTVSALEIKGSTSGSGKPGSGEGSTDIVLTQSPASLDVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQSPKLLIYLASNRESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPTFGAGTKLELKPYAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS* (配列番号:77)
具体的な例では、CARをコードする構築物は、誘導性カスパーゼ9、87G抗体（可変重鎖が可変軽鎖のN末端）からなるCAR、CD28ヒンジ、CD28コスティミュレイトリードメイン、およびCD3ゼータからなり、発現構築物はIL-15も発現する。 別個のポリペプチドは2A配列で分離されていてもよい。このような構築物の例示的な配列は以下の通りである：
iC9-87GVHVL28HingeCD28CD3ZIL15
ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGCGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGATCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTTCGCGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGAGgaagtgaaactggtggaaagcggcggcagcctggtgcagccgggcggcagcctgaaactgagctgcgcggcgagcggctttagctttagcagctataccatgagctgggtgcgccagaccccgaaaaaacgcctggaatgggtggcgtatgtgagcaacggcgcgggcaccacctattatccggatagcctgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaccctgcatctgctgatgaccagcctgaaaagcgaagataccgcgatttattattgcgcgcgccattattatggcagctatcattttgattattggggccagggcaccaccctgattgtgagcagcTTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGgaaaccaccgtgacccagagcccggcgagcctgagcgtggcgaccggcgaaaaagtgaccattcgctgcattaccagcaccgatattgatgatgatatgaactggtatcagcagaaaccgggcgaaccgccgaaactgctgattagcgaagataacattctgcgcccgggcgtgccgagccgctttagcagcagcggctatggcaccgattttgtgtttaccattgaaaacaccctgagcgaagatgtggcggattattattgcctgcagagcgataacatgccgctgacctttggcggcggcacccgcctggaaattaaaCaCGTACGccCCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCACGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (配列番号:78)
iC9-87GVHVL28HingeCD28CD3ZIL15によってコードされるポリペプチドの一例は、以下を含み得る:
MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMEFGLSWLFLVAILKGVQCSREEVKLVESGGSLVQPGGSLKLSCAASGFSFSSYTMSWVRQTPKKRLEWVAYVSNGAGTTYYPDSLKGRFTISRDNAKNTLHLLMTSLKSEDTAIYYCARHYYGSYHFDYWGQGTTLIVSSLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEDNILRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMPLTFGGGTRLEIKHVRPIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS* (配列番号:79)
具体的な例では、CARをコードする構築物は、誘導性カスパーゼ9、87G抗体（可変重鎖が可変軽鎖のN末端にある）、CD28ヒンジ、DAP10コスティミュレイトリードメイン、およびCD3ゼータを含むCARを含み、発現構築物はIL-15も発現する。 別個のポリペプチドは2A配列で分離されていてもよい。このような構築物の例示的な配列は以下の通りである：
iC9-87GVHVL28HingeDAP10CD3ZIL15
ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGCGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGATCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTTCGCGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGAGgaagtgaaactggtggaaagcggcggcagcctggtgcagccgggcggcagcctgaaactgagctgcgcggcgagcggctttagctttagcagctataccatgagctgggtgcgccagaccccgaaaaaacgcctggaatgggtggcgtatgtgagcaacggcgcgggcaccacctattatccggatagcctgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaccctgcatctgctgatgaccagcctgaaaagcgaagataccgcgatttattattgcgcgcgccattattatggcagctatcattttgattattggggccagggcaccaccctgattgtgagcagcTTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGgaaaccaccgtgacccagagcccggcgagcctgagcgtggcgaccggcgaaaaagtgaccattcgctgcattaccagcaccgatattgatgatgatatgaactggtatcagcagaaaccgggcgaaccgccgaaactgctgattagcgaagataacattctgcgcccgggcgtgccgagccgctttagcagcagcggctatggcaccgattttgtgtttaccattgaaaacaccctgagcgaagatgtggcggattattattgcctgcagagcgataacatgccgctgacctttggcggcggcacccgcctggaaattaaaCCGTACGCCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGCTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCCGCGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (配列番号:80).
iC9-87GVHVL28HingeDAP10CD3ZIL15によってコードされるポリペプチドの例は以下を含み得る:
MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRAEGRGSLLTCGDVEENPGPMEFGLSWLFLVAILKGVQCSREEVKLVESGGSLVQPGGSLKLSCAASGFSFSSYTMSWVRQTPKKRLEWVAYVSNGAGTTYYPDSLKGRFTISRDNAKNTLHLLMTSLKSEDTAIYYCARHYYGSYHFDYWGQGTTLIVSSLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEDNILRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMPLTFGGGTRLEIKPYAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS* (配列番号:81).
Ｃ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
一部の実施形態において、遺伝子操作されたＨＬＡ－Ｇ標的化抗原受容体は、組換えＴＣＲおよび／もしくは天然に存在するＴ細胞からクローニングされたＴＣＲ、またはそれらの１つ以上の部分を含む。「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変α鎖およびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られている）または可変γ鎖およびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても知られている）を含有し、かつＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子を指す。一部の実施形態において、ＴＣＲはαβ形態である。
典型的には、αβおよびγδ形態で存在するＴＣＲは、一般に構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は、異なる解剖学的位置または機能を有し得る。ＴＣＲは、細胞の表面上で、または可溶性の形態で見出され得る。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上で見出され、そこで一般に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識を担う。一部の実施形態において、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または短い細胞質尾部を含有し得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ，１９９７参照）。例えば、一部の態様において、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質尾部を有し得る。一部の実施形態において、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と関連する。特に明記しない限り、用語「ＴＣＲ」は、その機能的ＴＣＲ断片を包含すると理解されるべきである。当該用語はまた、αβ形態またはγδ形態のＴＣＲを含む、インタクトＴＣＲまたは全長ＴＣＲを包含する。
ゆえに、本明細書における目的のために、ＴＣＲへの言及は、あらゆるＴＣＲまたは機能的断片、例えばＭＨＣ分子に結合した特定の抗原性ペプチド、すなわち、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分を含む。互換的に用いられ得るＴＣＲの「抗原結合部分」または「抗原結合断片」は、ＴＣＲの構造ドメインの一部を含有するが、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合する分子を指す。場合によっては、抗原結合部分は、例えば、一般に各鎖が３つの相補性決定領域を含有する場合、特定のＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えばＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖を含有する。
一部の実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは結合して、ループ、または免疫グロブリンに類似する相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する。これにより、抗原認識が付与され、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性が決定され、そしてペプチド特異性が決定される。典型的には、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって分離されている（例えば、Ｊｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３参照）。一部の実施形態において、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識を担う主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１は、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することも示されており、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。一部の実施形態において、β鎖の可変領域は、更なる超可変性（ＨＶ４）領域を含有し得る。
一部の実施形態において、ＴＣＲ鎖は、定常ドメインを含有する。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えば、α鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメイン、Ｎ末端の可変ドメイン（例えば、ＶａまたはＶｐ；典型的には、Ｋａｂａｔナンバリング（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ’’，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，５ｔｈ ｅｄ．）に基づくアミノ酸１～１１６）、および細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣａ、典型的にはＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２５９、β鎖定常ドメインまたはＣｐ、典型的にはＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２９５）を含有し得る。例えば、場合によっては、２本の鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近位定常ドメイン、およびＣＤＲを含有する２つの膜遠位可変ドメインを含有する。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成して２本の鎖間を連結する短い連結配列を含有する。一部の実施形態において、ＴＣＲは、ＴＣＲが定常ドメイン内に２つのジスルフィド結合を含有するように、α鎖およびβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有し得る。
一部の実施形態において、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含有し得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、正に帯電している。場合によっては、ＴＣＲ鎖は、細胞質尾部を含有する。場合によっては、この構造は、ＴＣＲがＣＤ３等の他の分子と結合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するＴＣＲは、タンパク質を細胞膜内に固定して、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと結合し得る。
一般に、ＣＤ３は、哺乳動物において３本の異なる鎖（γ、δ、およびε）およびζ鎖を有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２本のＣＤ３ε鎖、およびＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含有し得る。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、このことは、これらの鎖が正に帯電したＴ細胞受容体鎖と結合するのを可能にする特徴である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の細胞内尾部はそれぞれ、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られている単一の保存モチーフを含有するが、各ＣＤ３ζ鎖は３つを有する。一般に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する。これらのアクセサリ分子は、負に帯電した膜貫通領域を有しており、ＴＣＲからのシグナルを細胞中に伝達する役割を果たす。ＣＤ３鎖およびζ鎖は、ＴＣＲと共に、Ｔ細胞受容体複合体として知られているものを形成する。
一部の実施形態において、ＴＣＲは、２本の鎖αおよびβ（または任意選択でγおよびδ）のヘテロ二量体であり得るか、または単鎖ＴＣＲ構築物であり得る。一部の実施形態において、ＴＣＲは、ジスルフィド結合等によって連結された２つの別個の鎖（αおよびβ鎖またはγおよびδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。一部の実施形態において、標的抗原（例えば癌抗原）に対するＴＣＲが特定されて、細胞中に導入される。一部の実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸は、公的に入手可能なＴＣＲ ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅等によって、種々の源から得られ得る。一部の実施形態において、ＴＣＲは、生物学的源から、例えば、Ｔ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマ、または他の公的に利用可能な源等由来の細胞から得られる。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、インビボ単離細胞から得られ得る。一部の実施形態において、高親和性Ｔ細胞クローンが患者から単離されて、ＴＣＲが単離され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。一部の実施形態において、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、またはＨＬＡ）により操作されたトランスジェニックマウスにおいて生成された。例えば、腫瘍抗原（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５参照）参照。一部の実施形態において、ファージディスプレイを用いて、標的抗原（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８およびＬｉ，２００５参照）に対するＴＣＲを単離する。一部の実施形態において、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識から合成的に生成され得る。
ＩＩＩ．サイトカイン
１つ以上のサイトカインが、遺伝子操作された１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化受容体、例えばＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲと共に利用さてもよい。場合によっては、１つ以上のサイトカインが、操作された受容体と同じベクター分子上に存在するが、他の場合には、別個のベクター分子上に存在する。特定の実施形態において、１つ以上のサイトカインが、操作された受容体と同じベクターから共発現される。１つ以上のサイトカインが、ＨＬＡ－Ｇ特異的受容体とは別個のポリペプチドとして生成され得る。一例として、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）が利用される。ＩＬ－１５が使用され得る。なぜなら、例えば、組織に制限されており、かつ病的条件下でのみ血清中で、または全身的に何らかのレベルにて観察されるからである。ＩＬ－１５は、養子療法に望ましいいくつかの属性を有する。ＩＬ－１５は、ナチュラルキラー細胞の発生および細胞増殖を誘導し、腫瘍内在細胞の機能的抑制の緩和を介して、確立された腫瘍の根絶を促進し、かつ活性化誘導細胞死を阻害する恒常性サイトカインである。ＩＬ－１５に加えて、他のサイトカインが想定される。これらとして、サイトカイン、ケモカイン、ならびにヒト用途に用いられる細胞の活性化および増殖に寄与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。一例として、１つ以上のサイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、またはそれらの組合せである。ＩＬ－１５を発現するＮＫ細胞が利用され得、そして継続的な支援サイトカインシグナル伝達が可能であり、これは、注入後の生存に有用である。
特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、１つ以上の外因的に提供されるサイトカインを発現する。サイトカインは、ＮＫ細胞に外因的に提供され得る。なぜなら、細胞内の発現ベクターから発現され、かつ／または細胞の培養培地中に提供されるからである。代わりの場合には、細胞中の内因性サイトカインは、サイトカインのプロモータ部位での遺伝子組換え等の内因性サイトカインの発現の調節操作によって上方制御される。サイトカインが発現構築物上で細胞に提供される場合、サイトカインは、自殺遺伝子と同じベクターからコードされ得る。サイトカインは、自殺遺伝子とは別個のポリペプチド分子として、そして細胞の操作された受容体とは別個のポリペプチドとして発現され得る。一部の実施形態において、本開示は、特にＮＫ細胞における、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲベクターの、ＩＬ－１５との共利用に関する。
ＩＶ．自殺遺伝子
特定の実施形態において、自殺遺伝子は、あらゆる種類の細胞療法と共に利用されて、その使用を制御し、かつ所望の事象および／または時間での細胞療法の終了を可能にする。自殺遺伝子は、必要に応じて形質導入細胞の死を誘発する目的で、形質導入細胞に使用される。本開示によって包含されるベクターを有するように修飾された本開示のＨＬＡ－Ｇ標的化細胞は、１つ以上の自殺遺伝子を含み得る。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる用語「自殺遺伝子」は、プロドラッグまたは他の剤の投与により、その宿主細胞を死滅させる化合物への遺伝子産物の移行をもたらす遺伝子として定義される。他の実施形態において、自殺遺伝子は、所望の場合、自殺遺伝子産物を標的とする剤（抗体等）によって標的とされる遺伝子産物をコードする。
用いられ得る自殺遺伝子／プロドラッグの組合せの例として、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）およびガンシクロビル、アシクロビル、またはＦＩＡＵ；酸化還元酵素およびシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼおよび５－フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジラート（ｔｈｙｍｉｄｉｌａｔｅ）キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）およびＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナーゼおよびシトシンアラビノシドがある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、いわゆる、プロドラッグ６－メチルプリンデオキシリボシドを毒性プリン６－メチルプリンに変換する自殺遺伝子が用いられ得る。プロドラッグ療法に用いられる自殺遺伝子の他の例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子およびＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子がある。
また、例示的な自殺遺伝子として、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３、または誘導性カスパーゼ９が挙げられる。一実施形態において、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖ３）の切断型バージョンが、セツキシマブによって除去され得る自殺抗原として用いられ得る。本開示に用いられ得る、当該技術において知られている更なる自殺遺伝子として、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン－α、γ－リアーゼ（ＭＥＴ）、およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が挙げられる。
特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲをコードするベクター、または本明細書中で包含されるＮＫ細胞内のあらゆるベクターが、１つ以上の自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲと同じベクター上にあってもなくてもよい。自殺遺伝子がＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲと同じベクター上に存在する場合、自殺遺伝子およびＣＡＲは、例えば、ＩＲＥＳまたは２Ａ要素によって分離され得る。
Ｖ．ベクター
ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが挙げられる適切なあらゆるベクターによってレシピエント免疫細胞に送達され得る。ウイルスベクターの例として、少なくともレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターの例として、少なくともプラスミド、トランスポゾン、脂質、ナノ粒子等が挙げられる。
免疫細胞が、ＨＬＡ－Ｇ標的化受容体をコードするベクターにより形質導入され、そしてまた、自殺遺伝子および／またはサイトカインおよび／または任意選択の治療用遺伝子産物等の別の遺伝子の、細胞中への形質導入を必要とする場合、ＨＬＡ－Ｇ標的化受容体、自殺遺伝子、サイトカイン、および任意選択の治療用遺伝子は、同じベクターに含まれても含まれなくてもよい。場合によっては、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子、サイトカイン、および任意選択の治療用遺伝子は、同じウイルスベクター分子等の同じベクター分子から発現される。そのような場合、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子、サイトカイン、および任意選択の治療用遺伝子の発現は、同じ調節要素によって調節されてもされなくてもよい。ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子、サイトカイン、および任意選択の治療用遺伝子は、同じベクター上にある場合、別個のポリペプチドとして発現されてもされなくてもよい。これらは、別個のポリペプチドとして発現される場合、例えば、２Ａ要素またはＩＲＥＳ要素によってベクター上で分離され得る（または双方の種類が、１回以上、同じベクター上で用いられ得る）。
Ａ．一般的な実施形態
当業者であれば、本開示の抗原受容体の発現のための標準的な組換え技術（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６参照）によってベクターを構築するのに十分な知識があろう。
１．調節要素
本開示において有用なベクターに含まれる発現カセットは、特に、タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモータ、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を（５’から３’方向に）含有する。真核細胞におけるタンパク質コード遺伝子の転写を制御するプロモータおよびエンハンサは、多数の遺伝要素で構成され得る。細胞機構は、各要素によって伝達される調節情報を集めて組み込むことができ、異なる遺伝子が、転写調節の異なる、多くの場合複雑なパターンを進化させることを可能にする。本開示に関連して用いられるプロモータとして、例えば、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、および組織特異的プロモータが挙げられる。ベクターが癌治療の生成に利用される場合、プロモータは、低酸素の条件下で有効であり得る。
２．プロモータ／エンハンサ
本明細書中で提供される発現構築物は、抗原受容体および他のシストロン遺伝子産物の発現を駆動するためのプロモータを含む。プロモータは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位を配置するように機能する配列を含む。この最もよく知られている例が、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモータ、例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子用のプロモータ、およびＳＶ４０後期遺伝子用のプロモータにおいて、開始部位自体を覆う別個の要素が、開始の場所を固定するのに役立つ。追加のプロモータ要素が、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これは、開始部位の上流の領域内に位置決めされているが、いくつかのプロモータは、開始部位の下流にも機能的要素を含有することが示されている。コード配列をプロモータの「制御下」に置くために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端が、選択されたプロモータの「下流」（すなわち３’側）に配置される。「上流」プロモータは、ＤＮＡの転写を刺激して、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
プロモータ要素間の間隔は高頻度で、要素が互いに対して反転または移動した場合にプロモータ機能が保存されるほどフレキシブルである。ｔｋプロモータにおいて、例えば、プロモータ要素間の間隔は、活性が落ち始める前の５０ｂｐまで広げることができる。プロモータに応じて、個々の要素は、転写を活性化するように協働的に、または独立して機能し得るようである。プロモータは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサ」と併用されてもされなくてもよい。
プロモータは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置決めされた５’非コード配列を単離することによって得られ得るように、核酸配列と本来関連しているものであり得る。そのようなプロモータは、「内因性」と称され得る。同様に、エンハンサは、核酸配列と天然に結合して、当該配列の下流または上流のいずれかに位置決めされるものであり得る。これ以外にも、特定の利点が、コード核酸セグメントを、組換えまたは異種プロモータ（その天然環境において、核酸配列と通常関連しないプロモータを指す）の制御下に配置することによって得られることとなる。また、組換えまたは異種エンハンサは、その天然環境において核酸配列と通常関連しないエンハンサを指す。そのようなプロモータまたはエンハンサとして、他の遺伝子のプロモータまたはエンハンサ、ならびに他のあらゆるウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモータまたはエンハンサ、ならびに「天然に存在」しない、すなわち、異なる転写調節領域の異なる要素、および／または発現を変更する変異を含有するプロモータまたはエンハンサが挙げられ得る。例えば、組換えＤＮＡ構築に最も一般的に用いられるプロモータとして、β－ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、およびトリプトファン（ｔｒｐ－）プロモータ系が挙げられる。プロモータおよびエンハンサの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書中で開示される組成物と関連して、ＰＣＲ（商標）が挙げられる組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて生成され得る。さらに、ミトコンドリア、葉緑体等の非核オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指示する制御配列も同様に使用することができると考えられる。
当然のことながら、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官、または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモータおよび／またはエンハンサを使用することが重要であろう。分子生物学の当業者であれば、一般に、タンパク質発現のためのプロモータ、エンハンサ、および細胞型の組合せの使用を知っている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９参照）。使用されるプロモータは、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生産において有利である等、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するのに適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性、かつ／または有用であり得る。プロモータは、異種または内因性であり得る。
加えて、あらゆるプロモータ／エンハンサの組合せ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂｉ．ｃｈ／のワールド・ワイド・ウェブを介した、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢに従う）を用いて発現を駆動することもできる。Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６細胞質発現系の使用が、別の可能な実施形態である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部として、または追加の遺伝子発現構築物として提供されるならば、特定の細菌プロモータからの細胞質転写を支持することができる。
プロモータの非限定的な例として、初期または後期ウイルスプロモータ、例えばＳＶ４０初期または後期プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモータ、真核細胞プロモータ、例えば、ベータアクチンプロモータ、ＧＡＤＰＨプロモータ、メタロチオネインプロモータ、および連結された応答要素プロモータ、例えば、サイクリックＡＭＰ応答要素プロモータ（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモータ（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモータ（ＴＰＡ）、および最小ＴＡＴＡボックス付近の応答要素プロモータ（ｔｒｅ）が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモータ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、受託番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３～３４１に記載されるヒト成長ホルモン最小プロモータ）またはマウス乳腺腫瘍プロモータ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ番号ＡＴＣＣ ４５００７から入手可能）を用いることも可能である。特定の実施形態において、プロモータは、ＣＭＶ ＩＥ、デクチン－１、デクチン－２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ ＭＬＰ、ベータ－アクチン、ＭＨＣクラスＩ、またはＭＨＣクラスＩＩプロモータである。しかしながら、治療用遺伝子の発現を駆動するのに有用な他のあらゆるプロモータが、本開示の実施に使用可能である。
特定の態様において、本開示の方法はまた、エンハンサ配列、すなわち、プロモータの活性を増大させ、かつシスで、そしてその向きに拘わらず、比較的長い距離（標的プロモータから最大数キロベース離れている）にわたってすら作用する潜在性を有する核酸配列に関する。しかしながら、エンハンサ機能は、必ずしもそのような長い距離に限定されない。というのも、所与のプロモータに近接して機能する場合もあるからである。
３．開始シグナルおよび連結された発現
また、特定の開始シグナルが、コード配列の効率的な翻訳のために、本開示において提供される発現構築物に用いられ得る。当該シグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供する必要がある場合がある。当業者であれば、これを決定して、必要なシグナルを提供することが容易にできよう。挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサ要素を含めることによって増強され得る。
特定の実施形態において、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素が、多遺伝子またはポリシストロン性メッセージをもたらすのに用いられる。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回して、内部部位にて翻訳を開始することができる。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳ要素、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳが記載されている。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結され得る。それぞれがＩＲＥＳによって分離されてポリシストロン性メッセージをもたらす、多数のオープンリーディングフレームが、一緒に転写され得る。ＩＲＥＳ要素のおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためのリボソームにアクセス可能である。多遺伝子が、単一のプロモータ／エンハンサを用いて効率的に発現されて、単一のメッセージを転写することができる。
本明細書中の他の箇所で詳述するように、特定の２Ａ配列要素を用いて、本開示中で提供される構築物中での遺伝子の連結発現または共発現をもたらすことができる。例えば、切断配列を用いて、オープンリーディングフレームを連結して単一シストロンを形成することによって、遺伝子を共発現させることができる。例示的な切断配列として、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）またはＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）または「２Ａ様」配列（例えば、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）またはブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）がある。特定の実施形態において、単一のベクターでは、多数の２Ａ配列は同一ではないが、代替の実施形態において、同じベクターは、２つ以上の同じ２Ａ配列を利用する。２Ａ配列の例が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００６５７７９号明細書に記載されている。
４．複製起点
ベクターを宿主細胞内で増殖させるために、ベクターは、１つ以上の複製起点部位（しばしば「ｏｒｉ」と称される）、例えば、上記のＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、または複製が開始される特定の核酸配列である、プログラミングにおける機能が類似するか、または高い、遺伝子操作されたｏｒｉＰを含有してよい。これ以外にも、上記の他の染色体外で複製するウイルスの複製起点、または自己複製配列（ＡＲＳ）が使用され得る。
５．選択およびスクリーニング可能マーカー
一部の実施形態において、本開示のＨＬＡ－Ｇ標的化受容体構築物を含むＮＫ細胞は、発現ベクター内にマーカーを含めることによって、インビトロまたはインビボで特定され得る。そのようなマーカーは、発現ベクターを含有する細胞の容易な特定を可能にする、細胞に特定可能な変化を付与することとなる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在が選択を可能にするものであり、陰性選択マーカーは、その存在が選択を妨げるものである。陽性選択マーカーの例として、薬物耐性マーカーがある。
通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニングおよび特定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基礎が比色分析であるＧＦＰ等のスクリーニング可能マーカーが挙げられる他の種類のマーカーも考えられる。これ以外にも、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等の陰性選択マーカーとしてのスクリーニング可能酵素が利用され得る。また、当業者であれば、おそらくＦＡＣＳ分析と組み合わせて、免疫学的マーカーを使用する方法を知っているであろう。用いられるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要ではないと考えられている。選択マーカーおよびスクリーニング可能マーカーの更なる例が、当業者に周知である。
Ｂ．マルチシストロン性ベクター
特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ標的化受容体、任意選択の自殺遺伝子、任意選択のサイトカイン、および／または任意選択の治療用遺伝子は、マルチシストロン性ベクターから発現される（本明細書中で用いられる用語「シストロン」は、遺伝子産物が生成され得る核酸配列を指す）。特定の実施形態において、マルチシストロン性ベクターは、ＨＬＡ－Ｇ標的化受容体、自殺遺伝子、ならびに少なくとも１つのサイトカインおよび／もしくは操作された受容体、例えばＴ細胞受容体、ならびに／または追加の非ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲをコードする。場合により、マルチシストロン性ベクターは、少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ、少なくとも１つのＴＮＦ－アルファ変異体、および少なくとも１つのサイトカインをコードする。サイトカインは、ヒトもしくはマウス等、またはあらゆる種の特定の種類のサイトカインであり得る。特定の場合には、サイトカインは、ＩＬ１５、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１８、および／またはＩＬ２１である。
特定の実施形態において、本開示は、多数のシストロンを実質的に同一のレベルで発現する能力を有するポリシストロン性ベクターを利用するフレキシブルなモジュール系（本明細書中で用いられる用語「モジュール」は、例えば標準的な組換え技術を用いることによる、シストロン全体の、またはシストロンの構成要素のそれぞれの除去および置換等によって、その互換性を可能にするシストロンまたはシストロンの構成要素を指す）を提供する。当該系は、多遺伝子の組合せ発現（過剰発現が挙げられる）を可能にする細胞工学に用いられ得る。特定の実施形態において、ベクターによって発現される遺伝子の１つ以上が、１つ、２つ、またはそれを超える抗原受容体を含む。多遺伝子は、ＣＡＲ、ＴＣＲ、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング受容体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子変異、デコイ受容体、サイトカイン受容体、キメラサイトカイン受容体等を含み得るが、これらに限定されない。ベクターはさらに、以下を含み得る：（１）１つ以上のレポーター、例えば、細胞アッセイおよび動物イメージング等のための蛍光もしくは酵素レポーター；（２）１つ以上のサイトカインもしくは他のシグナル伝達分子；および／または（３）自殺遺伝子。
特定の場合には、ベクターは、２Ａ切断部位等のあらゆる種類の切断部位によって分離された少なくとも４つのシストロンを含み得る。ベクターは、ｐＵＣ１９骨格内にｐｓｉパッケージング配列を有する、３’および５’ＬＴＲを含むモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶまたはＭＭＬＶ）ベースであってもなくてもよい。ベクターは、３つ以上の２Ａ切断部位を有する４つ以上のシストロン、および遺伝子交換のための多数のＯＲＦを含み得る。当該系は、一部の実施形態において、サブクローニングによる迅速な組込みのための制限部位の側面に位置する多遺伝子（７つ以上）のコンビナトリアル過剰発現を可能にし、そしてまた、少なくとも３つの２Ａ自己切断部位を含む。ゆえに、当該系は、多数のＣＡＲ、ＴＣＲ、シグナル伝達分子、サイトカイン、サイトカイン受容体、および／またはホーミング受容体の発現を可能にする。また、当該系は、限定されないが、レンチウイルス、アデノウイルスＡＡＶ、および非ウイルスプラスミドが挙げられる他のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターに使用され得る。
また、系のモジュール性は、ポリシストロン性発現ベクター内の４つのシストロンのそれぞれへの遺伝子の効率的なサブクローニング、および迅速な試験等のための遺伝子の交換を可能にする。ポリシストロン性発現ベクター内に戦略的に位置決めされた制限部位は、遺伝子を効率的に交換することを可能にする。
本開示の実施形態は、例えば、ベクターのモジュール使用を促進するために同一性および位置が特異的に選択される１つ以上の制限酵素部位を利用すること等による、１つ以上のシストロン（または１つ以上のシストロンの構成要素）の除去および置換を可能にすることによって、ベクターの少なくとも一部がモジュールであるポリシストロン性ベクターを利用する系を包含する。また、ベクターは、多数のシストロンが単一のポリペプチドに翻訳されて、別個のポリペプチドにプロセシングされることによって、ベクターが実質的に等モル濃度で別個の遺伝子産物を発現する利点を付与する実施形態を有する。
本開示のベクターは、モジュラリティがベクターの１つ以上のシストロンを変えることができるように、かつ／または１つ以上の特定のシストロンの１つ以上の構成要素を変えることができるように構成されている。ベクターは、１つ以上のシストロンの末端の側面に位置し、かつ／または特定のシストロンの１つ以上の構成要素の末端の側面に位置する、固有の制限酵素部位を利用するように設計され得る。
本開示の実施形態は、それぞれが１つ以上の制限酵素部位の側面に位置する少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのシストロンを含むポリシストロン性ベクターを含み、少なくとも１つのシストロンは、少なくとも１つの抗原受容体をコードする。場合によっては、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるシストロンが単一のポリペプチドに翻訳されて、別々のポリペプチドに切断されるが、他の場合では、多数のシストロンが単一のポリペプチドに翻訳されて、別々のポリペプチドに切断される。ベクター上の隣接するシストロンが、２Ａ自己切断部位等の自己切断部位によって分離され得る。場合によっては、各シストロンは、ベクターから別個のポリペプチドを発現する。特定の場合には、ベクター上の隣接するシストロンが、ＩＲＥＳ要素によって分離されている。
特定の実施形態において、本開示は、例えば、１つ、２つ、またはそれを超える抗原受容体を含み得る多数のシストロンの、過剰発現が挙げられるコンビナトリアル発現を可能にする細胞工学用の系を提供する。特定の実施形態において、本明細書中に記載されるポリシストロニックベクターの使用により、ベクターは、同じｍＲＮＡから等モルレベルの多遺伝子産物を生成することが可能となる。多遺伝子は、ＣＡＲ、ＴＣＲ、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング受容体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子変異、デコイ受容体、サイトカイン受容体、キメラサイトカイン受容体等を含み得るが、これらに限定されない。ベクターは、細胞アッセイおよび動物イメージング等のための１つ以上の蛍光または酵素レポーターをさらに含み得る。また、ベクターは、ベクターを有する細胞がもはや必要とされない場合の、またはこれが提供される宿主にとって有害となる場合の、当該細胞の終結のための自殺遺伝子産物を含み得る。
特定の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター）または非ウイルスベクターである。ベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ、および／またはｐｓｉパッケージング要素を含み得る。特定の場合には、ｐｓｉパッケージングは、５’ＬＴＲと抗原受容体コード配列との間に組み込まれる。ベクターは、ｐＵＣ１９配列を含んでも含まなくてもよい。ベクターの一部の態様において、少なくとも１つのシストロンは、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２、またはＩＬ－２）、ケモカイン、サイトカイン受容体、および／またはホーミング受容体をコードする。
２Ａ切断部位がベクターに利用される場合、２Ａ切断部位は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、および／またはＦ２Ａ部位を含み得る。
制限酵素部位は、いかなる種類のものであってもよく、その認識部位に任意の数の塩基、例えば４～８塩基を含んでもよい；認識部位内の塩基数は、少なくとも４、５、６、７、８、またはそれを超えてもよい。切断された場合の部位は、平滑切断末端または粘着末端を生成し得る。制限酵素は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、またはＩＶ型のものであり得る。制限酵素部位は、利用可能なデータベース、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩｎｔＥｎｚ）またはＢＲＥＮＤＡ（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）から得ることができる。
例示的なベクターは、環状であってよく、慣例により、位置１（円の上部の１２時の位置、残りの配列は時計回りの方向にある）が５’ＬＴＲの出発点に設定される。
自己切断性２Ａペプチドが利用される実施形態において、２Ａペプチドは、真核細胞における翻訳中にポリペプチドの「切断」を媒介する１８～２２アミノ酸（ａａ）長のウイルスオリゴペプチドであり得る。呼称「２Ａ」は、ウイルスゲノムの特定の領域を指し、様々なウイルス２Ａが一般的に、それらが由来するウイルスの後に命名されている。最初に発見された２ＡはＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス）であり、その後、Ｅ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス）、Ｐ２Ａ（ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ）、およびＴ２Ａ（トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ）も特定された。２Ａ媒介「自己切断」の機構は、２ＡのＣ末端でのグリシル－プロリルペプチド結合の形成をスキップするリボソームスキッピングであることが発見された。
特定の場合には、ベクターはγ－レトロウイルス移入ベクターであり得る。レトロウイルス移入ベクターは、ｐＵＣ１９プラスミド（ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩの制限酵素部位間の大きな断片（２．６３ｋｂ））等のプラスミドに基づく骨格を含み得る。骨格は、５’ＬＴＲ、ｐｓｉパッケージング配列、および３’ＬＴＲを含むモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のウイルス構成要素を有し得る。ＬＴＲは、レトロウイルスプロウイルスの両側に見出される長い末端反復配列であり、移入ベクターの場合、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲおよび関連する構成要素等の目的の遺伝的カーゴを囲っている。また、ヌクレオカプシドによるパッケージング用の標的部位であるｐｓｉパッケージング配列は、シスで組み込まれて、５’ＬＴＲとＣＡＲコード配列との間に挟まれている。ゆえに、トランスファベクターの例の基本構造は、ｐＵＣ１９配列－５’ＬＴＲ－ｐｓｉパッケージング配列－目的の遺伝的カーゴ－３’ＬＴＲ－ｐＵＣ１９配列のように構成され得る。また、当該系は、限定されないが、レンチウイルス、アデノウイルスＡＡＶ、および非ウイルスプラスミドが挙げられる他のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターに使用され得る。
ＶＩ．細胞
本開示は、ＨＬＡ－Ｇ標的化受容体をコードし、かつ少なくとも１つのサイトカインおよび／または少なくとも１つの自殺遺伝子をもコードし得る少なくとも１つのベクターを有するあらゆる種類の免疫細胞または幹細胞を包含する。場合によっては、様々なベクターが、自殺遺伝子および／またはサイトカインをコードするのと対比して、ＣＡＲをコードする。ＮＫ細胞が挙げられる免疫細胞は、臍帯血（複数の源からプールされた臍帯血が挙げられる）、末梢血、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄、またはそれらの混合物に由来し得る。ＮＫ細胞は、例えば、以下に限定されないが、ＮＫ－９２細胞等の細胞株に由来し得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞等の臍帯血単核細胞であり得る。
本開示は、従来のＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＮＫ ＴおよびインバリアントＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、またはそれらの混合物が挙げられる、あらゆる種類の免疫細胞または他の細胞を包含する。
場合によっては、細胞は、適切なあらゆる比率が挙げられる有効量のユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ）の存在下で拡大した。細胞は、ＵＡＰＣと、１０：１～１：１０；９：１～１：９；８：１～１：８；７：１～１：７；６：１～１：６；５：１～１：５；４：１～１：４；３：１～１：３；２：１～１：２；または１：１の比率（例えば１：２の比率が挙げられる）にて培養され得る。場合によっては、ＮＫ細胞を、例えば１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～５００、３００～４００、または４００～５００Ｕ／ｍＬの濃度でのＩＬ－２の存在下で、拡大させた。
ベクターによる遺伝子修飾の後に、ＮＫ細胞は、直ちに注入されてもよいし、保存されてもよい。特定の態様において、遺伝子修飾後、細胞中への遺伝子導入後の約１、２、３、４、５日以内に、またはそれを超えて、細胞をバルク集団としてエクスビボで数日間、数週間、または数ヶ月間増殖させることができる。更なる態様において、トランスフェクタントがクローニングされて（クローンは、単一の組み込まれたか、またはエピソームによって維持された発現カセットまたはプラスミドの存在を示す）、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲの発現がエクスビボで拡大する。拡大のために選択されたクローンは、ＨＬＡ－Ｇ発現標的細胞を特異的に認識して溶解する能力を実証する。組換え免疫細胞は、ＩＬ－２、または共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３等）による刺激によって拡大させることができる。組換え免疫細胞は、人工抗原提示細胞による刺激によって拡大し得る。更なる態様において、遺伝子修飾細胞は、凍結保存され得る。
本開示の実施形態は、本明細書中に包含される１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲおよび１つ以上の自殺遺伝子を発現する細胞を包含する。ＮＫ細胞は、特定の実施形態において、１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲおよび１つ以上の操作された、分泌不能な膜結合ＴＮＦ－アルファ変異体ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態において、１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲおよびＴＮＦ－アルファ変異体ポリペプチドを発現することに加えて、細胞はまた、１つ以上の治療用遺伝子産物をコードする核酸を含む。
細胞は、個体から直接得られてもよいし、保管所または他の貯蔵施設から得られてもよい。治療法としての細胞は、治療法として細胞が提供される個体に対して自己由来であっても同種異系であってもよい。
細胞は、医学的症状について治療を必要とする個体に由来し得、そしてＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ、任意選択の自殺遺伝子、任意選択のサイトカイン、および任意選択の治療用遺伝子産物を（例えば、養子細胞療法のための形質導入および拡大のための標準的な技術を用いて）発現させる操作の後に、最初に供給された個体に戻され得る。場合によっては、細胞は、個体または別の個体に後に用いるために保存される。
免疫細胞は、細胞の集団内に含まれ得、当該集団は、大部分が、１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化受容体および／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインで形質導入されていてよい。細胞集団は、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の、１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化受容体および／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを形質導入した免疫細胞を含み得る。１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化受容体および／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインは、別個のポリペプチドであり得る。
免疫細胞は、特定の目的に関してモジュールであるという意図のために、１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化受容体および／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインと共に生成され得る。例えば、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを発現する（またはその後の形質導入のために変異体をコードする核酸が分配されている）細胞が、例えば商業的流通用に生成され得、ユーザは、意図される目的に応じて、１つ以上の他の目的の遺伝子（治療用遺伝子が挙げられる）を発現するように細胞を修飾することができる。例えば、ＨＬＡ－Ｇ陽性癌が挙げられるＨＬＡ－Ｇ陽性細胞の処置に関心がある個体が、自殺遺伝子発現細胞（または異種サイトカイン発現細胞）を得るか、または生成して、ＨＬＡ－Ｇ特異的ｓｃＦｖを含む受容体を発現するように修飾することができ、またはその逆も同じである。
特定の実施形態において、ＮＫ細胞が利用されて、１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを発現する、形質導入されたＮＫ細胞のゲノムが修飾され得る。ゲノムは、あらゆる様式で修飾され得るが、特定の実施形態において、ゲノムは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集によって修飾される。細胞のゲノムは、あらゆる目的について細胞の有効性を増強するように修飾され得る。
ＶＩＩ．ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ細胞の遺伝子編集
特定の実施形態において、少なくとも、操作されたＨＬＡ－Ｇ特異的受容体を含む細胞は、細胞内での１つ以上の内因性遺伝子の発現を修飾するように遺伝子編集されている。特定の場合には、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の発現の阻害（ノックアウトと称され得る）が挙げられる、１つ以上の内因性遺伝子の発現レベルの引下げがあるように修飾されている。そのような細胞は、拡大させてもさせなくてもよい。
特定の場合には、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ細胞の１つ以上の内因性遺伝子が修飾されて、例えば、発現が破壊されて、発現が部分的または完全に引き下げられる。特定の場合には、１つ以上の遺伝子が、本開示のプロセスを用いてノックダウンまたはノックアウトされる。特定の場合には、多遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされ、これは、それらの生成における同じ工程において起こっても起こらなくてもよい。ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ細胞において編集される遺伝子は、いかなる種類のものであってもよいが、特定の実施形態において、当該遺伝子は、遺伝子産物が、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ細胞（一例として、臍帯血に由来するもの等のＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ ＮＫ細胞が挙げられる）の活性および／または増殖を阻害する遺伝子である。特定の場合には、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ細胞内で編集される遺伝子は、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ細胞が腫瘍微小環境においてより効果的に作用することを可能にする。特定の場合には、遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７、およびＣＤ３８の１つ以上である。特定の実施形態において、ＴＧＦＢＲ２、ＣＩＳＨ、および／またはＣＤ３８遺伝子は、ＨＬＡ－Ｇ特異的ＣＡＲ細胞においてノックアウトまたはノックダウンされる。
一部の実施形態において、遺伝子編集は、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて実行され、例えばＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した変更である。例えば、変更は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて実行され得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９の代わりにＣｐＦ１が利用される。一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（「直接反復」、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてｔｒａｃｒＲＮＡプロセスド部分直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサ」とも称される）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物が挙げられる、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか、またはＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性を指示する転写物および他の要素を指す。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、およびヌクレアーゼ機能性（例えば２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の要素が、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来し得、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）等の、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物に由来する。
一部の態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡ、および固定ｔｒａｃｒＲＮＡの融合物が挙げられる）が細胞中に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位が、相補的塩基対合を用いて、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位、例えば遺伝子に標的化する。標的部位は、典型的にはＮＧＧまたはＮＡＧ等のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ５’側の位置に基づいて選択され得る。この点において、ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１、または１０ヌクレオチドを、標的ＤＮＡ配列に対応するように修飾することによって、所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位にてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素を特徴とする。典型的には、「標的配列」は、一般に、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列であって、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する配列を指す。ハイブリダイゼーションを引き起こして、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があるならば、完全な相補性は必ずしも必要とされない。
ＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書中で論じられるように、標的部位にて二本鎖切断（ＤＳＢ）を、続いて破壊または変更を誘導することができる。他の実施形態において、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントが用いられて、標的部位にて一本鎖にニックを入れる。対になったニッカーゼは、例えば特異性を向上させるのに用いられ得、それぞれ、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入されるように、一対の異なるｇＲＮＡ標的化配列によって導かれる。他の実施形態において、触媒的に不活性なＣａｓ９は、遺伝子発現に影響を及ぼすように、転写リプレッサまたは活性化因子等の異種エフェクタドメインに融合される。
標的配列は、あらゆるポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞の核または細胞質内、例えば細胞の細胞小器官内に位置決めされ得る。一般に、標的配列を含む標的遺伝子座中への組換えに用いられ得る配列または鋳型が、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。一部の態様において、外因性鋳型ポリヌクレオチドが、編集鋳型と称される場合がある。一部の態様において、組換えは相同組換えである。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列にハイブリダイズされて、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成されるガイド配列を含む）は、標的配列内またはその近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれを超える塩基対以内）で一方または双方の鎖の切断をもたらす。また、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれを超えるヌクレオチド）の全部または一部を含み得るか、またはそれからなり得るが、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全部または一部とのハイブリダイゼーションによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するのに十分な、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対する相補性（最適にアラインメントされたときのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性等）を有する。
ＣＲＩＳＰＲ系の要素の発現が１つ以上の標的部位にてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するように、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の要素の発現を駆動する１つ以上のベクターが細胞中に導入され得る。また、構成要素は、タンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列がそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節要素に作動可能に連結され得る。これ以外にも、同じまたは異なる調節要素から発現される要素の２つ以上が、単一のベクター内で、第１のベクター内に含まれないＣＲＩＳＰＲ系のあらゆる構成要素を提供する１つ以上の追加のベクターと組み合わされ得る。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列等の１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含み得る。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列要素の上流および／または下流に位置決めされている。多数の異なるガイド配列が用いられる場合、単一の発現構築物が用いられて、ＣＲＩＳＰＲ活性を、細胞内の多数の異なる、対応する標的配列に標的化し得る。
ベクターは、Ｃａｓタンパク質等のＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節要素を含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、それらのホモログ、またはそれらの修飾バージョンが挙げられる。これらの酵素は知られている。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース内に見出され得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来）であってよい。場合によっては、Ｃａｓ９の代わりにＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）がエンドヌクレアーゼとして用いられてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内かつ／または標的配列の相補体内等の標的配列の位置での一方または双方の鎖の切断を指示し得る。ベクターは、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または双方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし得る。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９のＲｕｖＣＩ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）が、Ｃａｓ９を、双方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼが、ＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的とするガイド配列、例えば２つのガイド配列と組み合わせて用いられ得る。この組合せは、双方の鎖にニックを入れて、ＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘導するのに用いられるのを可能にする。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列が、真核細胞等の特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類が挙げられるがこれらに限定されない哺乳動物等の特定の生物のものであり得るか、またはそれらに由来し得る。一般に、コドン最適化とは、目的の宿主細胞における発現を、ネイティブアミノ酸配列を維持しながら、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドンを、当該宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に、または最も頻繁に用いられるコドンで置換することによって増強するために核酸配列を修飾するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて、特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、これは、とりわけ、翻訳されることとなるコドンの特性、および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に用いられるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有するあらゆるポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれを超える。
最適なアラインメントは、配列をアラインするのに適したあらゆるアルゴリズムの使用により決定することができ、その非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにて入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにて入手可能）が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、追加のあらゆるタンパク質配列、および任意選択で２つのあらゆるドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例として、限定されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例として、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例として、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物が挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡ分子または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９５０２号明細書に記載されている。
ＶＩＩＩ．処置方法
種々の実施形態において、その表面上で内因性ＨＬＡ－Ｇを発現する疾患細胞または他の細胞が、医学的症状を有する個体において医学的症状を向上させるために、あるいは個体において医学的症状のリスクを引き下げるか、または重症度および／もしくは発症を遅延させるために標的とされる。特定の場合には、内因性ＨＬＡ－Ｇを発現する癌細胞が、癌細胞を死滅させる目的で標的とされる。
本明細書中で企図されるＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ構築物、核酸配列、ベクター、免疫細胞等、および／またはそれらを含む医薬組成物が、腫瘍性疾患等の癌性疾患の予防、処置、または寛解に用いられる。特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、例えば、ＨＬＡ－Ｇを発現し、かつ固形腫瘍であってもなくてもよい癌が挙げられる癌の予防、寛解、および／または処置に特に有用であり得る。
ＨＬＡ－Ｇ標的化受容体が利用される免疫細胞は、特定の実施形態において、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、またはＮＫＴもしくはインバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）、あるいは哺乳動物用の細胞療法のために操作されたインバリアントＮＫＴ細胞であり得る。細胞がＮＫ細胞である場合、ＮＫ細胞療法は、いかなる種類のものであってもよく、ＮＫ細胞は、いかなる種類のものであってもよい。特定の実施形態において、細胞は、１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲおよび／または１つ以上の自殺遺伝子および／または１つ以上のサイトカインを発現するように操作されたＮＫ細胞である。特定の実施形態において、細胞は、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲを形質導入したＮＫ細胞である。
特定の実施形態において、本開示は、部分的には、標準的なベクターおよび／または遺伝子送達系を用いて単独で、またはあらゆる組合せで、そして少なくとも一部の態様において、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に投与され得るＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ発現細胞、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ構築物、ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ核酸分子、およびＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲベクターを企図する。特定の実施形態において、投与後、核酸分子またはベクターは、対象のゲノム中に安定して組み込まれ得る。
特定の実施形態において、特定の細胞または組織に特異的であり、かつＮＫ細胞内で持続するウイルスベクターが用いられ得る。適切な医薬担体および賦形剤が、当該技術において周知である。本開示に従って調製される組成物は、上記の特定された疾患の予防もしくは処置または遅延のために用いられ得る。
さらに、本開示は、腫瘍性疾患の予防、処置、または寛解のための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書中で企図されるような、かつ／または本明細書中で企図されるようなプロセスによって生成されるＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ、核酸配列、ベクターを発現する有効量の細胞を投与する工程を含む方法に関する。
例示的なＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ細胞の組成物の投与の可能な適応症は、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌、神経膠芽腫、腎癌、膵臓癌、または肺癌が挙げられる腫瘍性疾患が挙げられる癌性疾患である。ＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ細胞の組成物の投与のための例示的な適応症は、ＨＬＡ－Ｇを発現するあらゆる悪性腫瘍が挙げられる癌性疾患である。本開示の組成物の投与は、例えば、微小残存病変、早期癌、進行癌、ならびに／または転移癌および／もしくは難治性癌が挙げられる、全てのステージ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ）および種類の癌に有用である。
本開示はさらに、他の化合物、例えば、二重特異性抗体構築物、標的毒素、または免疫細胞を介して作用する他の化合物との同時投与プロトコルを包含する。本発明の化合物の同時投与のための臨床レジメンは、他の成分の投与と同時、前、または後の同時投与を包含し得る。特定の併用療法として、化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法、または他の種類の免疫療法が挙げられる。
実施形態は、本明細書中で定義されるＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ構築物、本明細書中で定義される核酸配列、本明細書中で定義されるベクター、および／または本明細書中で定義される宿主細胞（免疫細胞等）を含むキットに関する。また、本開示のキットは、単独で、または医学的処置もしくは介入を必要とする個体に投与されることとなる更なる薬剤と組み合わせて、本明細書中で先に記載されるような医薬組成物を含むことが企図される。
Ａ．医薬組成物
また、本明細書中で提供されるのは、形質導入されたＮＫ細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物および製剤である。形質導入された細胞は、個体への移入に適した培地、および／または個体への移入前を含む凍結保存等の保存に適した培地中に含まれ得る。
本明細書中に記載される医薬組成物および製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する活性成分（細胞等）を、１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって調製され得る。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度にて、レシピエントに対して非毒性であり、以下に限定されないが：リン酸、クエン酸、および他の有機酸等のバッファ；アスコルビン酸およびメチオニンが挙げられる酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンが挙げられる他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書中の例示的な薬学的に許容される担体としてさらに、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０が挙げられる特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法が、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
Ｂ．併用療法
特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つの追加の療法と組み合わせた免疫細胞集団（ＮＫ細胞集団が挙げられる）を包含する。追加の療法として、放射線療法、外科手術（例えば、乳腺腫瘤摘出術および乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、ホルモン療法、腫瘍溶解性ウイルス、または前述の組合せがあり得る。追加の療法は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。
一部の実施形態において、追加の療法は、小分子酵素阻害剤または抗転移剤の投与である。一部の実施形態において、追加の療法は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生および／または重症度を軽減することが意図される剤、例えば嘔吐抑制剤、その他）の投与である。一部の実施形態において、追加の療法は放射線療法である。一部の実施形態において、追加の療法は外科手術である。一部の実施形態において、追加の療法は、放射線療法および外科手術の組合せである。一部の実施形態において、追加の療法はガンマ線照射である。一部の実施形態において、追加の療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、および／または化学予防剤である。追加の療法は、当該技術において知られている１つ以上の化学療法剤であり得る。
特定の実施形態において、本開示の本発明の細胞療法に加えて、個体は、外科手術、放射線、免疫療法（本開示の細胞療法以外）、ホルモン療法、遺伝子療法、化学療法等のうちの１つ以上が挙げられる、癌用の特定の追加の療法が施されていてもよく、施されてもよく、かつ／または施されることとなる。
免疫細胞療法は、追加の癌治療に対して前、間、後に、または種々の組合せで施され得る。施用は、同時～数分～数日～数週に及ぶ間隔であり得る。免疫細胞療法が、追加の治療剤とは別に患者に施される実施形態において、当業者であれば、一般に、２つの化合物が、有利に組み合わされた効果を患者に対してなお発揮することができるように、重要な期間が各送達時間の間に失効しないことを確実にするであろう。そのような場合、互いに約１２～２４または７２時間以内、より具体的には互いに約６～１２時間以内に抗体療法および抗癌療法が患者に施され得ると考えられる。一部の状況では、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６、または７）～数週（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過する場合、処置期間を大きく延長することが望ましい場合がある。
種々の組合せを使用することができる。以下の例では、免疫細胞療法は「Ａ」であり、抗癌療法は「Ｂ」である。
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
本実施形態のあらゆる化合物または細胞療法を患者に施すには、もしあれば剤の毒性を考慮して、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従うこととなる。したがって、一部の実施形態において、併用療法に起因する毒性を監視する工程が存在する。
１．化学療法
多種多様な化学療法剤が、本実施形態に従って用いられ得る。用語「化学療法」は、癌を処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の処置の際に投与される化合物または組成物を意味するのに用いられる。当該剤または薬物は、細胞内の活性様式によって、例えば、細胞周期に影響を及ぼすか、そしてどの段階で影響を及ぼすかで分類される。これ以外にも、剤は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡ中にインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。
化学療法剤の例として、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロメラミンが挙げられる）；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンが挙げられる）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体が挙げられる）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１が挙げられる）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロフォスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマＩＩ（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｇａｍｍａＩＩ）およびカリケアマイシンオメガＩＩ（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｏｍｅｇａＩＩ））；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡが挙げられる）；ビスホスホナート、例えばクロドロナート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジインアンチビオティッククロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラルマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンが挙げられる）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラルナイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）、例えば、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクォン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ－２トキシン、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えばＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、ならびに先のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広く用いられてきた他の因子として、γ線、Ｘ線、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の指向性送達として一般に知られているものが挙げられる。また、マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号明細書および米国特許第４，８７０，２８７号明細書）、およびＵＶ照射等の他の形態のＤＮＡ損傷因子が企図される。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週）の５０～２００レントゲンの１日線量から、２０００～６０００レントゲンの単回線量に及ぶ。放射性同位体の線量範囲は、広く変動し、同位体の半減期、放たれる放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みによって決まる。
３．免疫療法
当業者であれば、ＣＡＲの追加の免疫療法が、単独で、または実施形態の方法と併用され得、もしくは組み合わせて用いられ得ることを理解するであろう。本明細書に包含されるあらゆる抗体が、二重特異性抗体または多重特異性抗体が挙げられる、ＣＡＲ以外の治療分子に使用され得る。癌処置の文脈において、免疫療法は、一般に、癌細胞を標的として破壊するための免疫エフェクタ細胞または剤および分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））がそのような例である。免疫エフェクタは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で、療法のエフェクタとして機能し得るか、または他の細胞を動員して細胞死に実際に影響を及ぼし得る。また、抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素、その他）にコンジュゲートされて、標的化剤として機能し得る。これ以外にも、エフェクタは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。種々のエフェクタ細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
抗体－薬物コンジュゲートは、癌治療薬の開発への画期的なアプローチとして出現した。癌は、世界における主要な死因の１つである。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞死滅薬物に共有結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を、高度に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせて、抗原レベルが富化された腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装」ＭＡｂをもたらす。また、薬物の標的送達は、正常組織における曝露を最小限に抑えて、毒性の低下および治療指数の改善をもたらす。ＦＤＡによる２０１１年のＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）および２０１３年のＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ－ＤＭ１）という２つのＡＤＣ薬物の承認は、当該アプローチを検証した。現在、癌処置のための臨床試験の種々の段階において、３０を超えるＡＤＣ薬物候補が存在する（Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。抗体工学およびリンカー－ペイロード最適化がますます成熟してきているので、新しいＡＤＣの発見および開発は、このアプローチおよび標的化ＭＡｂの生成に適した新しい標的の同定および検証にますます依存している。ＡＤＣ標的についての２つの基準は、腫瘍細胞における発現の上方制御／高いレベル、およびロバストな内在化である。
免疫療法の一態様において、腫瘍細胞は、標的化に適した、すなわち他の細胞の大部分に存在しない何らかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはいずれも、本実施形態の文脈における標的化に適し得る。一般的な腫瘍マーカーとして、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂ、およびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替的な態様は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせるものである。また、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮ等のサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８等のケモカイン、およびＦＬＴ３リガンド等の増殖因子が挙げられる免疫刺激分子が存在する。
現在調査中または使用中の免疫療法の例として、免疫アジュバント、例えば、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号明細書および米国特許第５，７３９，１６９号明細書；Ｈｕｉ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、ならびにＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、およびｐ５３（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｔｉｎ－Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号明細書および米国特許第５，８４６，９４５号明細書）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号明細書）がある。１つ以上の抗癌療法が、本明細書中に記載される抗体療法と共に使用され得ることが企図される。
一部の実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば共刺激分子）を強くするか、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る阻害性免疫チェックポイントとして、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られている）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても知られている）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサ（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸および／またはＣＴＬＡ－４を標的とする。
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子等の薬物、リガンドもしくは受容体の組換え形態であり得るか、または特に、ヒト抗体（例えば、国際公開第２０１５／０１６７１８号；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２－６４，２０１２；双方とも参照により本明細書に組み込まれる）等の抗体である。免疫チェックポイントタンパク質またはその類似体の知られている阻害剤が用いられ得、特にキメラ化、ヒト化、またはヒト形態の抗体が用いられ得る。当業者が知っている代替的かつ／または同等の名称が、本開示において言及される特定の抗体に用いられ得る。そのような代替的かつ／または同等の名称は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ラムブロリズマブは、ＭＫ－３４７５およびペンブロリズマブという代替的かつ同等の名称でも知られていることが知られている。
一部の実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１の、そのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態において、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１の、その結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態において、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２の、その結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ２結合パートナーはＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体が、米国特許第８，７３５，５５３号明細書、米国特許第８，３５４，５０９号明細書、および米国特許第８，００８，４４９号明細書に記載されており、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中で提供される方法に用いられる他のＰＤ－１軸アンタゴニストが、米国特許出願公開第２０１４／０２９４８９８号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０２２０２１号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／０００８３６９号明細書（全て、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、当該技術において知られている。
一部の実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。一部の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびＣＴ－０１１からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。一部の実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＡＭＰ－２２４である。ニボルマブは、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られており、国際公開第２００６／１２１１６８号に記載される抗ＰＤ－１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ ３４７５、ラムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、およびＳＣＨ－９００４７５としても知られており、国際公開第２００９／１１４３３５号に記載される抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１は、ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても知られており、国際公開第２００９／１０１６１１号に記載される抗ＰＤ－１抗体である。ＡＭＰ－２２４は、Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られており、国際公開第２０１０／０２７８２７号および国際公開第２０１１／０６６３４２号に記載されるＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。
本明細書中で提供される方法において標的とされ得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られている細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合した場合に、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上に発現されて、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８に類似しており、双方の分子は、抗原提示細胞上のそれぞれＢ７－１およびＢ７－２とも呼ばれるＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ４は阻害シグナルをＴ細胞に伝達するが、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。また、細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞において見出され、その機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を介したＴ細胞活性化は、Ｂ７分子の阻害性受容体であるＣＴＬＡ－４の発現の増大をもたらす。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
本方法での使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（またはそれに由来するＶＨおよび／またはＶＬドメイン）は、当該技術において周知の方法を用いて生成され得る。これ以外にも、当該技術において認識されている抗ＣＴＬＡ－４抗体が用いられ得る。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号明細書、国際公開第０１／１４４２４号、国際公開第９８／４２７５２号、国際公開第００／３７５０４号（ＣＰ６７５，２０６号明細書、トレメリムマブとしても知られている；以前はチシリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号明細書；Ｈｕｒｗｉｔゼータｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（抗体ＣＰ－６７５２０６）；およびＭｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：５３０１－５３０４に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体が、本明細書中で開示される方法に用いられ得る。前述の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。また、ＣＴＬＡ－４への結合について、これらの当該技術において認識されている抗体のいずれかと競合する抗体が用いられ得る。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、国際公開第２００１／０１４４２４号、国際公開第２０００／０３７５０４号、および米国特許第８，０１７，１１４号明細書（全て、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られている）またはその抗原結合断片およびバリアント（例えば、国際公開第０１／１４４２４号参照）である。他の実施形態において、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖のＣＤＲまたはＶＲを含む。したがって、一実施形態において、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態において、抗体は、上記の抗体と同じ、ＣＴＬＡ－４上のエピトープとの結合について競合し、かつ／またはこれに結合する。別の実施形態において、抗体は、上述の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、または９９％の可変領域同一性）を有する。
ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子として、米国特許第５，８４４，９０５号明細書、米国特許第５，８８５，７９６号明細書、ならびに国際公開第１９９５／００１９９４号および国際公開第１９９８／０４２７５２号（全て、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなＣＴＬＡ－４リガンドおよび受容体、ならびに米国特許第８，３２９，８６７号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなイムノアドヘシンが挙げられる。
４．外科手術
癌を患う人のおよそ６０％が、予防的な、診断的な、または病期分類する（ｓｔａｇｉｎｇ）根治目的の手術および緩和手術が挙げられる何らかの種類の外科手術を受けることとなる。根治目的の手術として、癌性組織の全てまたは一部が物理的に除去、切除、かつ／または破壊される切除が挙げられ、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法等の他の療法と組み合わせて用いられ得る。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、外科手術による処置として、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡下手術（Ｍｏｈｓ手術）が挙げられる。
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部を切除すると、体内に空洞が形成され得る。処置は、追加の抗癌療法による領域の灌流、直接注射、または局所施用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎、または１、２、３、４、および５週毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月毎に繰り返され得る。これらの処置は、同様に、投与量を変えるものであってもよい。
５．その他の薬剤
他の薬剤が、本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いられて、処置の治療有効性を向上させることができると考えられる。これらの追加の剤として、細胞表面受容体およびＧＡＰ接合部の上方制御に影響を及ぼす剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導因子に対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる剤、または他の生物学的剤が挙げられる。ＧＡＰ接合部の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増大が、隣接する過剰増殖性細胞集団に及ぼす抗過剰増殖効果を増大させるであろう。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤または分化剤が、本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いられて、処置の抗過剰増殖効果を向上させることができる。細胞接着の阻害剤が、本実施形態の有効性を向上させると考えられる。細胞接着阻害剤の例として、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンがある。さらに、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる他の剤、例えば抗体ｃ２２５が、本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いられて、処置効力を向上させることができると考えられる。
ＩＸ．タンパク質
本明細書中で用いられる「タンパク質」または「ポリペプチド」は、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む分子を指す。本明細書中で用いられる用語「野生型」は、生物において天然に生じる分子の内因性バージョンを指す。一部の実施形態において、野生型バージョンのタンパク質またはポリペプチドが使用される。しかしながら、本開示の多くの実施形態において、修飾タンパク質またはポリペプチドが、免疫応答を生じさせるのに使用される。上記の用語は、互換的に用いられ得る。「修飾タンパク質」または「修飾ポリペプチド」または「バリアント」は、その化学構造、特にそのアミノ酸配列が野生型タンパク質またはポリペプチドに対して変化しているタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態において、修飾／バリアントタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つの修飾された活性または機能を有する（タンパク質またはポリペプチドが、多数の活性または機能を有し得ることを認識する）。修飾／バリアントタンパク質またはポリペプチドは、１つの活性または機能に関して変更され得るが、他の点では、免疫原性等の野生型の活性または機能を保持し得ることが特に企図される。
タンパク質が本明細書で具体的に言及される場合、一般に、天然（野生型）もしくは組換え（修飾）タンパク質、または任意選択で、任意のシグナル配列が除去されているタンパク質を指す。タンパク質は、天然の生物から直接単離されてもよいし、組換えＤＮＡ／外因性発現方法によって生成されてもよいし、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）または他のインビトロ方法によって生成されてもよい。特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体またはその断片）をコードする核酸配列を組み込んだ単離核酸セグメントおよび組換えベクターが存在する。用語「組換え」は、ポリペプチド、または特定のポリペプチドの名称と共に用いられ得、これは一般に、インビトロで操作されたか、またはそのような分子の複製産物である核酸分子から生成されるポリペプチドを指す。
特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチド（野生型または改変型）のサイズは、以下を含み得るが、これらに限定されない。
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 アミノ酸残基以上、およびそこから誘導可能な任意の範囲、または本明細書に記載または参照される対応するアミノ酸配列の誘導体である。ポリペプチドは、切断によって変異され、対応する野生型よりも短くされ、また、特定の機能（例えば、標的化または局在化のため、免疫原性の増強のため、精製の目的のためなど）を有する異種タンパク質またはポリペプチド配列を融合または結合させることによって改変され得ることが企図される。本明細書で使用される場合、用語「ドメイン」は、タンパク質またはポリペプチドの任意の別個の機能的または構造的単位を指し、一般に、当業者に認識可能な構造または機能を有するアミノ酸の配列を指す。
本開示のポリペプチド、タンパク質、またはこのようなポリペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る。
配列番号１～８１のいずれかと、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 又は 50 (またはその誘導可能な範囲）以上の変異アミノ酸または核酸置換であるか、
または少なくとも 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 又は 100% (またはそこから派生する範囲）と、類似、同一、または相同であるか
最大で、3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000 あるいはそれ以上の連続するアミノ酸又は核酸又はその誘導される範囲。
いくつかの実施形態において、タンパク質、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドは、以下を含み得る。
配列番号１～８１の配列のいずれかの 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, 又は 1000(またはその誘導可能な範囲）の連続するアミノ酸またはヌクレオチド。
いくつかの実施形態において、ポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドは、少なくとも、多くとも、または正確に、以下を含み得る。
配列表の配列番号１～８１のいずれかの配列と
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, 又は 1000 (またはその誘導可能な範囲）連続するアミノ酸またはヌクレオチドであって、配列番号:1～81のそれぞれ、少なくとも、多くとも、または正確に60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 又は 100% (またはその誘導可能な範囲）は、配列番号S:1-81のいずれか1つと類似、同一、または相同である。
ある態様では、配列番号１～４９のいずれかのうち、以下の位置で始まる核酸分子またはポリペプチドであって、
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, 又は 1000
そして、配列番号１～８１のいずれかの配列の少なくとも、あるいは最大で、又は正確に、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, 又は 1000 (またはその誘導可能な範囲）の連続するアミノ酸またはヌクレオチドを含む。
様々な遺伝子のヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は、以前に開示されており、そして公知のコンピュータ化されたデータベースにおいて見出され得る。２つの一般的に使用されるデータベースは、National Center for Biotechnology InformationのGenbankおよびGenPeptデータベース（ワールドワイドウェブ上のncbi.nlm.nih.gov/）およびThe Universal Protein Resource（UniProt；ワールドワイドウェブ上のuniprot.org）である。これらの遺伝子のコード領域は、本明細書中に開示される技術、または当業者に公知であろう技術を用いて増幅および／または発現され得る。
本開示の組成物において、1mlあたり約0.001mg～約10mgの総ポリペプチド、ペプチド、および／またはタンパク質が存在することが企図される。組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約、または多くとも約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0. 8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml以上（またはそこから派生する任意の範囲）。
Ｘ．本開示のキット
本明細書中に記載されるあらゆる組成物が、キット内に含まれ得る。非限定的な例において、細胞、細胞を生成するための試薬、ベクター、ならびにベクターおよび／またはその構成要素を生成するための試薬がキット内に含まれ得る。特定の実施形態において、ＮＫ細胞がキットに含まれてもよく、これは、ＨＬＡ－Ｇ標的化受容体、任意選択のサイトカイン、または任意選択の自殺遺伝子を発現してもしなくてもよい。そのようなキットは、細胞の操作のための１つ以上の試薬を有していても有していなくてもよい。そのような試薬として、例えば、小分子、タンパク質、核酸、抗体、バッファ、プライマー、ヌクレオチド、塩、および／またはそれらの組合せが挙げられる。１つ以上のＨＬＡ－Ｇ標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子産物、および／またはサイトカインをコードするヌクレオチドがキット内に含まれ得る。サイトカイン、またはモノクローナル抗体が挙げられる抗体等のタンパク質がキット内に含まれ得る。操作されたＣＡＲ受容体の構成要素をコードするヌクレオチドが、当該構成要素を生成するための試薬を含めて、キット内に含められ得る。
特定の態様において、キットは、本開示のＮＫ細胞療法および別の癌治療も含む。場合によっては、キットは、細胞療法の実施形態に加えて、例えば、化学療法、ホルモン療法、および／または免疫療法等の第２の癌治療も含む。キットは、個体の特定の癌に合わせて調整され得、かつ個体に対するそれぞれの第２の癌治療を含み得る。
キットは、本開示の適切に等分された組成物を含み得る。キットの構成要素は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージされ得る。キットの容器手段として、一般に、その中に構成要素が配置され得、好ましくは適切に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段が挙げられる。キット内に複数の構成要素が存在する場合、キットはまた、一般に、追加の構成要素が別々に配置され得る第２、第３、または他の追加の容器を含有し得る。しかしながら、構成要素の種々の組合せがバイアル内に含まれ得る。本発明のキットはまた、典型的には、組成物および他のあらゆる試薬容器を商業的販売のために密閉して収容するための手段を含む。そのような容器として、所望のバイアルが保持される射出またはブロー成形プラスチック容器が挙げられ得る。
ＸＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らによって発見された技術が、本発明の実施において十分に機能することを表すので、その実施のための特定の様式を構成すると考えることができることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様な、または類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。
実施例１
ＨＬＡ－Ｇ標的化キメラ抗原受容体
サイトカインＩＬ－１５の生成に加えて、ＨＬＡ－Ｇ標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の生成用の発現構築物を作製した。発現構築物は、以下の通りであった。
臍帯血由来ナチュラルキラー（ＣＢ－ＮＫ）細胞に、異なる構築物を形質導入して、ＣＡＲ発現を確認した（図２）。ＣＡＲの活性を、ＨＬＡ－Ｇ陽性ＡＭＬ細胞株ＯＣＩ－ＡＭＬ１３に対して試験した。ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびＣＤ１０７ａの細胞内サイトカイン染色（図３）および５１Ｃｒ放出アッセイ（図４）によって、活性を確認した。
図５において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ヒトＨＬＡ－Ｇに対するＭＥＭ－Ｇ／１１クローンおよび８７Ｇクローンモノクローナル抗体にそれぞれ由来する２つのＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ構築物、ＭＧ構築物およびＧＧ構築物を形質移入した。Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ６４７親和性精製Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体で染色すると、双方の構築物が、ＨＥＫ２９３Ｔ膜上での陽性発現を示した。臍帯血由来のＮＫ細胞に、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ構築物（ＭＧ）を形質導入した（２つの実験－ＭＧ１およびＭＧ２２）か、または形質導入しなかった（ＮＴ）。ウイルス形質導入効率を、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７親和性精製Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体によるＩｇＧヒンジ部分の染色を介してチェックした。双方とも、ＮＴと比較して、陽性染色を示した（図６）。図７において、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ ＮＫ細胞および非形質導入（ＮＴ）ＮＫ細胞を、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と１：１（Ｅ：Ｔ）の比で２２時間共培養して、Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステムにより画像化した。図７は、経時的な腫瘍標的の平均蛍光強度の減少を表すグラフを提供する。一番上の線は、形質導入されていない細胞である；ＭＧ１の線は、期間の終わりの一番下の線である。ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ ＮＫ細胞は、ＮＴ－ＮＫ細胞と比較して、より効率的に死滅させる。図８Ａおよび図８Ｂにおいて、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ（ＭＧクローン）発現ＮＫ細胞および非形質導入（ＮＴ）ＮＫ細胞を、ＧＳＣ２０スフェロイドと４：１（Ｅ：Ｔ）の比で７３時間共培養して、Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステムにより画像化した。図８Ａは、ＮＴ－ＮＫ細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲを形質導入したＣＢ－ＮＫ細胞（ＭＧ１およびＭＧ２－２リピート）と共培養したｍＣｈｅｒｒｙを経時的に発現するＧＳＣ２０スフェロイドの平均蛍光強度の減少を表すグラフを提供する。ＣＢ３１ ＮＴ（４：１）の線は、一番上の線である。図８Ｂは、ＮＴ－ＮＫおよびＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ構築物と共培養したＧＳＣ２０スフェロイドの代表的な画像を提供する。ＨＬＡ－Ｇ ＣＡＲ構築物（ＭＧ）発現ＮＫ細胞および非形質導入（ＮＴ）ＮＫ細胞を、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞またはＧＳＣ－２０細胞と１：１および２：１（Ｅ：Ｔ）の比で４時間共培養して、ＣＤ５６、ＣＤ３、およびＴＮＦ－αについて染色した。ＭＧ構築物を有する細胞は、ＮＴと比較して、ＴＮＦ－αの有意な分泌を示す。
本明細書中で開示かつ特許請求される方法は全て、本開示に照らして、過度の実験をすることなく構成かつ実行することができる。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法、および方法の工程または工程の順序に変形を加えることは、当業者に明らかであろう。より詳細には、化学的にも生理学的にも関連する特定の剤を、本明細書中に記載される剤に置き換えてもよいが、同じまたは同様の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に明らかな、そのような全ての類似の置換および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念にあると見なされる。

Claims (110)

  1. 抗ＨＬＡ－Ｇキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＣＡＲは、
    （ａ）ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体のＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインまたは抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合領域、
    （ｂ）膜貫通ドメイン、および
    （ｃ）ＫＩＲ２ＤＬ４細胞内ドメインではない細胞内ドメイン
    を含む、ポリヌクレオチド。
  2. 前記ＣＡＲは、前記ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは配列番号９を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは、配列番号７によってコードされる、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは配列番号１０を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは、コドン最適化ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメインは、配列番号８によってコードされる、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の前記抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合領域を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  9. ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の前記抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合領域は、Ｇ２３３、２６－２Ｈ１１、ＭＥＭ－Ｇ／１、ＭＥＭ－Ｇ／９、ＭＥＭ－Ｇ／１１、ＭＥＭ－Ｇ／１３、１Ｂ８、５Ｅ６Ｈ７、１－２Ｃ３、１６Ｇ１、５Ａ６Ｇ７、８７Ｇ、および３Ｃ／Ｇ４からなる群から選択される抗体クローン由来のｓｃＦｖを含む、請求項１または８に記載のポリヌクレオチド。
  10. ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の前記抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合領域は、ＭＥＭ－Ｇ／１１または８７Ｇ由来のｓｃＦｖを含む、請求項１、８、または９に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記ＣＡＲは、配列番号５５、６１、６７、および７３のうちの１つ以上を含む配列によってコードされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記ＣＡＲは、配列番号５０～５４、５６～６０、６２～６６、および６８～７２のうちの１つ以上を含む配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  13. 配列番号７４、７６、７８、または８０のうちの１つ以上の配列を含む発現構築物としてさらに定義される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  14. 配列番号７５、７７、７９、または８１のうちの１つ以上の配列をコードする発現構築物としてさらに定義される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、または任意の阻害性もしくは活性化ＫＩＲ由来の膜貫通ドメインである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記膜貫通ドメインは配列番号１２を含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記膜貫通ドメインは、配列番号１１によってコードされる、請求項１５または１６に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記膜貫通ドメインは配列番号１４を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記膜貫通ドメインは、配列番号１３によってコードされる、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  22. 前記細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、２Ｂ４、ＤＮＡＭ、ＣＳ１、ＣＤ４８、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、またはＮＫｐ８０由来の細胞内ドメインである、請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  23. 前記細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  24. 前記細胞内ドメインは配列番号１６を含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記細胞内ドメインは、配列番号１５によってコードされる、請求項２３または２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記細胞内ドメインは配列番号１８を含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記細胞内ドメインは、配列番号１７によってコードされる、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
  28. 前記細胞内ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメインである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記細胞内ドメインは配列番号２４を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記細胞内ドメインは、配列番号２３によってコードされる、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記ＣＡＲは、２つ以上の細胞内ドメインを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記２つ以上の細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン、ならびにＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、４－１ＢＢ、ＮＫＧ２Ｄ、および２Ｂ４細胞内ドメインから選択される追加の細胞内ドメインを含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記２つ以上の細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインおよびＣＤ２８細胞内ドメインを含む、請求項３１または３２に記載のポリヌクレオチド。
  34. シグナルペプチドをさらに含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 前記シグナルペプチドは、ＣＤ８、ＣＤ２７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＳＣＦ－Ｒ）、Ｉｇ重鎖、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ＣＤ３、またはＣＤ４由来のシグナルペプチドである、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
  36. 前記シグナルペプチドはＣＤ８シグナルペプチドである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
  37. 前記シグナルペプチドは配列番号６を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記シグナルペプチドは、配列番号５によってコードされる、請求項３６または３７に記載のポリヌクレオチド。
  39. 前記ＣＡＲは、
    （ａ）ＣＤ８シグナルペプチド、ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン；または
    （ｂ）ＣＤ８シグナルペプチド、コドン最適化ＫＩＲ２ＤＬ４細胞外ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン
    を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  40. 目的の追加のポリペプチドをさらにコードする、請求項１～３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  41. 目的の前記追加のポリペプチドをコードする配列、および前記ＣＡＲをコードする配列は、２Ａ要素によって前記ポリヌクレオチド上で分離されている、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  42. 前記２Ａ要素はＥ２Ａ要素である、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
  43. 前記Ｅ２Ａ要素は配列番号２０を含む、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
  44. 前記Ｅ２Ａ要素は、配列番号１９によってコードされる、請求項４２または４３に記載のポリヌクレオチド。
  45. 目的の前記追加のポリペプチドは、治療用タンパク質、または細胞の活性、拡大、および／もしくは持続性を増強するタンパク質である、請求項４０～４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  46. 目的の前記追加のポリペプチドは、増殖、拡大、および／または代謝適応度を増強する自殺遺伝子、サイトカイン、またはヒトもしくはウイルスタンパク質である、請求項４０～４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  47. 目的の前記追加のポリペプチドはサイトカインである、請求項４０～４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  48. 前記サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、またはＩＬ－７である、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記サイトカインはＩＬ－１５である、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記サイトカインは配列番号２２を含む、請求項４９に記載のポリヌクレオチド。
  51. 前記サイトカインは、配列番号２１によってコードされる、請求項４９または５０に記載のポリヌクレオチド。
  52. 配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列をコードする、請求項１～５１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  53. 配列番号２のポリペプチドをコードする、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。
  54. 配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５２または５３に記載のポリヌクレオチド。
  55. 配列番号１を含む、請求項５４に記載のポリヌクレオチド。
  56. 配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列をコードする、請求項１～５５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  57. 配列番号４をコードする、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
  58. 配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５６または５７に記載のポリヌクレオチド。
  59. 配列番号３を含む、請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
  60. 請求項１～５９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  61. ウイルスベクターである、請求項６０に記載のベクター。
  62. 前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項６１に記載のベクター。
  63. 非ウイルスベクターである、請求項６０に記載のベクター。
  64. 前記非ウイルスベクターはプラスミドである、請求項６３に記載のベクター。
  65. 請求項１～５２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６０～６４のいずれか一項に記載のベクターを含む免疫細胞。
  66. 前記免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、間葉系間質細胞、または樹状細胞である、請求項６５に記載の免疫細胞。
  67. ＮＫ細胞である、請求項６６に記載の免疫細胞。
  68. 前記ＮＫ細胞は、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、骨髄、または細胞株に由来する、請求項６７に記載の免疫細胞。
  69. 前記ＮＫ細胞は細胞株に由来し、前記ＮＫ細胞株はＮＫ－９２である、請求項６８に記載の免疫細胞。
  70. 前記ＮＫ細胞は、臍帯血単核細胞に由来する、請求項６８に記載の免疫細胞。
  71. 前記ＮＫ細胞はＣＤ５６＋ＮＫ細胞である、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  72. 前記ＮＫ細胞は組換えサイトカインを発現する、請求項６７～７１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  73. 前記サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、またはＩＬ－２３である、請求項７２に記載の免疫細胞。
  74. 前記サイトカインはＩＬ－１５である、請求項７３に記載の免疫細胞。
  75. 前記免疫細胞内での１つ以上の内因性遺伝子の発現が修飾されている、請求項６５～７４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  76. 前記１つ以上の遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＴＬＡ－４、ＴＤＡＧ８、ＣＤ３８、またはそれらの組合せを含む、請求項７５に記載の免疫細胞。
  77. 請求項６５～７６のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む免疫細胞の集団。
  78. 個体においてＨＬＡ－Ｇ陽性細胞を死滅させる方法であって、請求項１～５９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する有効量の細胞を前記個体に投与することを含む、方法。
  79. 前記ポリヌクレオチドを有する前記細胞は免疫細胞である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの混合物である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記免疫細胞はＮＫ細胞を含み、前記ＮＫ細胞は、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、骨髄、細胞株、またはそれらの混合物に由来する、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記ＮＫ細胞は、臍帯血単核細胞に由来する、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記免疫細胞は、前記個体に対して同種異系である、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記免疫細胞は、前記個体に対して自己由来である、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記個体はヒトである、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記個体は癌を有する、請求項７８～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記個体は、乳癌、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、または膠芽腫を有する、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ポリヌクレオチドを有する前記細胞を、前記個体に１回以上投与する、請求項７８～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記ポリヌクレオチドを有する前記細胞の、前記個体への投与間の期間は、１～２４時間、１～７日、１～４週、１～１２ヶ月、または１年以上である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記個体に有効量の追加の療法を施す工程をさらに含む、請求項７８～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記追加の療法は、外科手術、放射線、遺伝子療法、免疫療法、またはホルモン療法を含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ポリヌクレオチドを有する前記細胞は、注射によって、静脈内、動脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病変内、頭蓋内、経皮的、皮下、局所的に、灌流によって、腫瘍微小環境内に、またはそれらを組み合わせて前記個体に投与される、請求項７８～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記個体においてＨＬＡ－Ｇ陽性癌を特定することをさらに含む、請求項７８～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記ポリヌクレオチドを有する前記細胞を生成することをさらに含む、請求項７８～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 物質の組成物として、配列番号１、配列番号３、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、または配列番号８０を含むポリヌクレオチド。
  96. 物質の組成物として、配列番号２、配列番号４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、または配列番号８１を含むポリペプチド。
  97. 抗体部分が、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６７、または配列番号７３によってコードされる、抗体－薬物コンジュゲート。
  98. 抗体部分が、配列番号５０～５４、５６～６０、６２～６６、および６８～７２のうちの１つ以上を含む配列を含む、抗体－薬物コンジュゲート。
  99. 前記抗体は、毒素、化学療法薬、放射性核種、小分子、および／またはリシンＡ鎖にコンジュゲートされている、請求項９７または９８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  100. 前記毒素は、コレラ毒素および／または百日咳毒素である、請求項９９に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  101. ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体を含む二重特異性または多重特異性抗体。
  102. 前記ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合領域が、Ｇ２３３、２６－２Ｈ１１、ＭＥＭ－Ｇ／１、ＭＥＭ－Ｇ／９、ＭＥＭ－Ｇ／１１、ＭＥＭ－Ｇ／１３、１Ｂ８、５Ｅ６Ｈ７、１－２Ｃ３、１６Ｇ１、５Ａ６Ｇ７、８７Ｇ、および３Ｃ／Ｇ４からなる群から選択される抗体クローン由来のｓｃＦｖを含む、請求項１０１に記載の抗体。
  103. 前記ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の一部または全部が、配列番号５５、６１、６７、もしくは７３によってコードされるか、または配列番号５５、６１、６７、もしくは７３と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％、もしくはそれを超えて同一である配列である、請求項１０１または１０２に記載の抗体。
  104. 前記ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体は、配列番号５０～５４、５６～６０、６２～６６、もしくは６８～７２、または配列番号５０～５４、５６～６０、６２～６６、もしくは６８～７２と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％、もしくはそれを超えて同一である配列を含む、請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の抗体。
  105. ＣＤ３特異的抗体を含む、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の抗体。
  106. 請求項９７～１００のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲートを含み、かつ／または請求項１０１～１０５のいずれか一項に記載の抗体を含む細胞。
  107. 前記細胞は免疫エフェクタ細胞である、請求項１０６に記載の複数の細胞。
  108. 前記免疫エフェクタ細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、樹状細胞、またはそれらの混合物である、請求項１０７に記載の複数。
  109. 薬学的に許容される賦形剤に含まれる、請求項１０７または１０８に記載の複数。
  110. 個体において癌を処置または予防する方法であって、請求項１０７～１０９のいずれか一項に記載の細胞の有効量を前記個体に送達する工程を含む方法。

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