TW202124421A - 嵌合正交受體蛋白及其使用方法 - Google Patents

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TW202124421A TW109131356A TW109131356A TW202124421A TW 202124421 A TW202124421 A TW 202124421A TW 109131356 A TW109131356 A TW 109131356A TW 109131356 A TW109131356 A TW 109131356A TW 202124421 A TW202124421 A TW 202124421A
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奇南 賈西亞
立仁 蘇
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Abstract

本發明提供了工程化正交嵌合受體/配體對及其使用方法。

Description

嵌合正交受體蛋白及其使用方法
本申請案揭露嵌合正交受體蛋白及其使用方法。 交叉引用
本申請案主張於2019年9月11日提交的編號為62/898,917的美國臨時專利申請案提交日期的優先權；該申請案的公開內容以引用方式全部併入本文。
以獨立或正交於天然配體影響的方式操縱受體來結合並應答經修飾的配體的能力是蛋白質工程中的一項重大挑戰。現已創建多個與類似天然相互作用正交的合成配體-直向同源受體對。本發明主要關注並介紹了對由正交配體啟動的細胞內訊號傳導通路的操縱。
正交配體和受體在第2018/0228842A號美國專利公開說明書和第US2019/021451號國際專利申請案中公開；其具體公開內容均以引用方式併入本文。
本發明提供了工程化嵌合正交受體及其使用方法。在嵌合正交受體中，衍生自第一受體的正交配體結合結構域(oLBD)可操作地連接至衍生自第二受體的細胞內結構域(ICD)。
該oLBD包含經修飾的受體細胞外結構域(ECD)，例如，CD122 IL-2受體的細胞外結構域。該ECD被修飾成包含改變其結合特異性的序列修飾，從而使經修飾的ECD與正交配體(即，適用於受體的經修飾的天然配體對應物)結合。正交對應配體與oLBD結合，便可透過受體的ICD啟動訊號傳導並使與配體的細胞外相互作用具有特異性。ICD將啟動訊號發送至訊號傳導通路的細胞質組分，並使這些細胞內相互作用具有訊號傳導特異性，例如，透過啟動特異性訊號轉導通路，例如，JAK、STAT等。該模組化方法可使正交細胞激素和oLBD對與各種不同的ICD結合使用，根據ICD啟動訊號傳導通路，並使工程化細胞具有靈活性，以得到預期應答。
正交配體與其對應的oLBD特異性結合。該oLBD與其內源性配體(包括與該正交配體的天然對應物)的結合力顯著降低。該正交配體與其內源性受體(包括與該正交受體的天然對應物)的結合力顯著降低。在一些實施例中，該正交配體對正交受體的親和力與天然配體對天然受體的親和力相當。
在一些實施例中，工程化嵌合正交受體包含衍生自第一受體的oLBD，該oLBD透過跨膜結構域可操作地連接至第二受體的ICD。在一些實施例中，該oLBD與衍生自第二受體的跨膜結構域融合。在其他實施例中，該跨膜結構域由衍生出oLBD的受體提供。在其他實施例中，該跨膜可以是衍生的人工胺基酸序列。在其他實施例中，該跨膜結構域衍生自第三跨膜蛋白。
在一些實施例中，該嵌合正交受體的ICD是衍生自受體(例如，衍生自細胞激素受體)的功能片段。在一些此等實施例中，該ICD是衍生自受體的功能片段，且基本上或完全是天然受體的ICD。在一些實施例中，相對於天然受體的ICD，該ICD包含一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，該嵌合受體的ICD包含一種或多種STAT訊號傳導蛋白的結合位點，例如 ，STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6等 。在一些實施例中，該嵌合受體的ICD包含一個或多個胺基酸殘基，例如，被細胞內激酶(例如，JAK激酶)磷酸化的酪胺酸殘基。
為了回應正交配體與嵌合正交受體的oLBD結合而啟動的細胞內訊號傳導通路使得因親本受體活化而啟動的訊號傳導通路表現出細胞內訊號傳導模式特徵，其中，嵌合受體衍生出ICD，以回應天然配體與該親本受體的結合。例如，為了回應正交配體與嵌合正交受體的結合，一種或多種STAT訊號傳導蛋白的活化特異性及/或模式可以與衍生出ICD的天然受體的活化情況基本相同。
在一些實施例中，該正交配體衍生自細胞激素蛋白，而該正交受體衍生自細胞激素受體。在一些實施例中，該正交細胞激素是一種正交IL-2蛋白。在一些實施例中，該正交配體衍生自人IL-2蛋白。在一些此等實施例中，該正交受體是一種正交IL-2受體β蛋白，也被稱為正交CD122蛋白。在一些實施例中，該嵌合正交受體的細胞外結構域衍生自人CD122。在一些實施例中，該嵌合正交受體的ECD包含序列辨識編號如下的多肽：(插入orthoCD122的編號)。在一些實施例中，該嵌合受體的ICD包含衍生自共用γ鏈受體(CD132)家族成員(CD122除外)的ICD的多肽序列。在一些實施例中，該嵌合正交受體的ICD包含一個共用γ鏈受體家族成員的ICD，該家族成員選自基本上由以下各項組成的群組：IL-4受體(IL4R、IL-4Rα、CD124)、IL-7受體(IL7R、IL-7Rα、CD127)、IL-9受體(IL-9R、CD129)、IL-15Rα(CD215)和IL-21受體(IL-21R、CD360)。在一些實施例中，該嵌合正交受體的ICD衍生自促紅細胞生成素受體(EpoR)的ICD。
在一些實施例中，本發明提供了工程化細胞，其中該工程化細胞已透過引入本發明的嵌合正交受體而加以修飾，該嵌合正交受體包含來自第一受體的oLBD，該第一受體透過跨膜結構域可操作地連接至衍生自第二受體的ICD。任何細胞均可用於此目的。在一些實施例中，該細胞是哺乳動物細胞。在一些實施例中，該細胞是人體細胞。在一些實施例中，該細胞是哺乳動物免疫細胞。在一些實施例中，該細胞是T細胞，包括但不限於幼稚CD8+ T細胞、細胞毒性CD8+ T細胞、幼稚CD4+ T細胞、輔助性T細胞，例如，TH 1、TH 2、TH 9、TH 11、TH 22、TFH ；調節性T細胞，例如，TR 1、天然TReg 、誘導性TReg ；記憶性T細胞，例如，中央記憶性T細胞、效應記憶性T細胞、NKT細胞、αβ T細胞、γδ T細胞以及此等T細胞的工程化變體，包括CART細胞；腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)等。在其他實施例中，該工程化細胞是幹細胞，包括但不限於造血幹細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞。在一些實施例中，該細胞通常在轉移至受試者體內之前，於體外 程式中進行基因修飾，以引入嵌合受體的編碼序列，透過基因工程改造來表現嵌合正交受體和工程化T細胞受體。工程化T細胞受體的示例包括但不限於嵌合抗原受體、工程化TCR等。在一些實施例中，本發明提供了一種製備細胞的方法，該細胞包含一種包含嵌合正交受體和工程化T細胞受體的細胞，該方法包含從受試者中分離出細胞，並向該分離細胞中引入編碼工程化T細胞受體、嵌合抗原受體等的核酸序列。在一些實施例中，本發明提供了一種表現嵌合正交受體的工程化細胞，該細胞(或細胞群)是獲取自受試者的細胞，已在體外進行了基因修飾以引入載體，該載體包含編碼本發明的嵌合正交受體的核酸和工程化T細胞受體，該工程化T細胞受體包括但不限於嵌合抗原受體(CAR)。表現嵌合正交受體的工程化細胞可以單位劑量形式提供以用於治療目的，而且相對於預期受者可以是同種異體的、自體的等 。
在一些實施例中，本發明提供了包含編碼本發明的嵌合正交受體的多核苷酸編碼序列的載體，其中該編碼序列與在所需細胞中可操作地連接至具有活性的啟動子以表現嵌合正交受體，其中具有活性的啟動子可以持續表現活性，也可以進行調節。各種載體是都本領域所熟知的，並且可用於該目的，例如 ，複製能力、複製缺陷或有條件地複製病毒載體、質粒載體、小環載體。在一些實施例中，該載體可以整合至靶細胞基因組中或者可以游離基因形式保留。
本發明提供的載體可以裝在試劑盒中提供，其任選地與正交配體或編碼結合並活化嵌合正交受體的正交配體的載體組合。在一些實施例中，含有正交配體的編碼序列的載體在靶細胞中與具有活性的高表現啟動子可操作地連接。在其他實施例中，本發明提供了一種試劑盒，其中提供了編碼正交嵌合受體的載體和正交配體的純化組合物，例如，以單位劑量形式包裝，以便施用於患者(例如，載藥注射器)。在另一些其他實施例中，本發明提供了一種試劑盒，其中提供了編碼嵌合正交受體的載體和編碼正交配體的載體，以便在細胞中表現嵌合正交受體，而且能夠表現擬由同一細胞(或其他細胞)分泌的正交配體，從而實現自分泌、內分泌或旁分泌配體/受體訊號傳導。
在一些實施例中，本發明提供了一種治療方法，該方法包含將治療有效量的工程化細胞群引入需要接受治療的受試者中，其中全部或部分細胞群已透過引入編碼本發明的嵌合正交受體的核酸序列而進行修飾。該細胞群可以體外 進行工程改造，而且相對於受試者可以是自體的或同種異體的。在一些實施例中，在施用工程化細胞後，使引入的細胞群與同源正交配體體內 接觸。在一些實施例中，工程化細胞是T細胞。在一些實施例中，工程化細胞是CAR T細胞。
為了能更容易地理解本發明，下文以及整個說明書中對某些術語和短語作出了定義。本文中提供的定義是非限制性的，並且應當依據本領域技術者在發明時將瞭解到的內容來閱讀。
在描述本發明的方法和組合物前，應當瞭解，本發明不僅限於文中所描述的特定方法和組合物，因為在實際實施中一定會存在差異。還應瞭解，本文中所使用的術語僅用於描述特定實施例，而無意限制本發明構思，本發明的範圍將僅由附屬申請專利範圍聲明限定。
在提供數值範圍的情況下，應當瞭解，本發明也特別公開了該範圍的上限與下限之間的各中間值，除非上下文另有明確規定，否則精確至下限單位的十分之一。介於該範圍內的任何規定值或中間值與該範圍內的任何其他規定值或中間值之間的各較小範圍都包含在本發明的範圍內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括在該範圍內或排除在外，且上下限中任一項、兩項均未或兩項均包括在該較小範圍內的各範圍也都包含在本發明的範圍內，需遵守該範圍內任何特別排除的限值的要求。在該範圍包括一個或兩個限值的情況下，排除了所包括限值中的任一項或兩項的範圍也包括在本發明的範圍內。
除非另有定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域技術者所普遍理解的含義相同。儘管與本文所描述的方法和材料類似或等同的方法和材料亦可用於本發明的實踐或測試中，但下文描述了一些潛在優選的方法和材料。本文提及的所有出版品均以引用方式併入本文，以公開和描述與所引用的出版品有關的方法及/或材料。應當瞭解，除非存在矛盾，否則本發明公開內容取代所併入出版品的任何公開內容。
還應注意的是，本文和附屬申請專利範圍聲明中所使用的單數形式「一個」和「該」等也包括其複數指示物，除非上下文另外明確指明。因此，例如，提及「一個細胞」包括複數個此等細胞，而且提及「該肽」包括提及一種或多種肽以及本領域技術者已知的其等同物，例如多肽，等等。
提供本文所討論的出版品僅針對其在本申請案提交日期之前公開的內容。本文中的任何內容均不得解釋為承認由於之前的發明使得本發明無權早於此類出版品。此外，所提供的出版日期可能與實際出版日期不同，可能需要單獨確認。定義。
術語「多肽」、「蛋白質」或「肽」係指任何胺基酸殘基鏈，無論其長度或轉譯後修飾(例如，糖基化或磷酸化)如何。
本文所用的針對多肽或DNA序列的術語「同一性」係指兩個分子之間的相對序列同一性。兩個胺基酸或兩個核苷酸序列之間的相似性是相同位置數目的直接函數，且經常表示為百分比(「同一性百分比」)。通常情況下，在確定兩個序列的同一性時，使該序列對齊，以獲得最高階匹配(最大同一性百分比)。可以採用已發佈的技術評估同一性，也可以利用廣泛使用的電腦程式評估同一性，例如，GCS套裝程式(Devereux等人，核酸研究，12：387，1984年)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，分子生物學雜誌，215：403，1990年)。序列同一性可利用序列分析軟體及其默認參數來測定，例如，位於威斯康辛大學生物技術中心(地址：1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)的Genetics Computer Group的序列分析套裝軟體。
本文所用的術語「蛋白變體」或「變體蛋白」或「變體多肽」等係指與參比蛋白的不同之處在於至少一個胺基酸修飾的蛋白。參比多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽，也可以是WT多肽的修飾形式。在一些實施例中，相對於參比親本多肽，該變體多肽包含至少一個胺基酸修飾。在一些實施例中，相對於參比親本多肽，該變體多肽包含約一至約十個胺基酸修飾。在一些實施例中，相對於參比親本多肽，該變體多肽包含約一至約五個胺基酸修飾。在一些實施例中，該變體多肽與參比蛋白的相同程度至少約為99%，或者相同程度至少約為98%、或者相同程度至少約為97%、或者相同程度至少約為95%、或者相同程度至少約為90%。舉例而言，變體蛋白與參比蛋白的相同程度可以是至少約為99%，與序列辨識編號如下的任何一種或多種物質的相同程度至少約為98%、相同程度至少約為97%、相同程度至少約為95%、相同程度至少約為90%：序列辨識編號：2；序列辨識編號：4；序列辨識編號：6；序列辨識編號：8；序列辨識編號：10；序列辨識編號：12；序列辨識編號：14；序列辨識編號：16；序列辨識編號：18；序列辨識編號：20；序列辨識編號：22；序列辨識編號：24；序列辨識編號：26；序列辨識編號：28。
本文所用的術語「野生型」或「WT」或「天然」係指自然界中存在的胺基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因變異。野生型多肽(例如，蛋白質、抗體、受體、免疫球蛋白、IgG等)的胺基酸序列或核苷酸序列未經人為幹預修飾。
術語「受者」、「個體」、「受試者」、「宿主」和「患者」在本文中可互換使用，是指患有疾病、病症或病況且需要接受診斷、治療或療法的任何哺乳動物受試者。用於治療目的的「哺乳動物」是指被歸類為哺乳動物的任何動物，包括人類、家養和農場動物以及動物園動物、運動項目用動物或寵物，例如，狗、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬等。在一些實施例中，哺乳動物為人。
本文所用的術語「治療有效量」是指足以預防、治療或控制病況、疾病或病症的症狀的治療劑的量。治療有效量可指足以延遲或最大限度減少疾病發作(例如，延遲或最大限度減少癌症擴散)的治療劑的量，或用於減少或增加目標受體的訊號傳導的量。治療有效量還可指在疾病治療或控制中表現出治療效果的治療劑的量。此外，關於本發明的治療劑的治療有效量係指單獨使用或與其他療法結合的治療劑的量，其在疾病治療或控制中表現出治療效果。
本文所用的術語「預防」係指預防受試者由於施用預防劑或治療劑而導致一種或多種症狀復發或發作。
本文所用的術語「組合」係指使用一種以上的預防劑及/或治療劑。術語「組合」的使用並未限制向患有病症的受試者施用預防劑及/或治療劑的順序。第一預防劑或治療劑可以在向患有病症的受試者施用第二預防劑或治療劑之前(例如，之前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)，同時(例如，以單獨製劑或共製劑形式同時施用；或者以單獨製劑施用，其中在多試劑方案中所示的第二試劑施用後約5分鐘內，向受試者施用提供的第一試劑)，或之後(例如，之後5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。多肽
配體和受體 。術語「正交配體」、「正交受體」或「正交配體/受體對」是指一個或一對透過胺基酸變異(包括取代)而加以修飾的基因工程蛋白，該變化使得正交配體優先結合正交受體(相對於天然(未經修飾的)受體)，且正交受體優先結合正交配體(相對於其天然(未經修飾的)受體)。
透過相對於天然蛋白的胺基酸序列變化來改造正交配體/受體對，從而(a)使天然配體或同源受體的親和力顯著降低；以及(b)與對應的工程改造(正交)配體或受體特異性結合。在結合正交配體時，該正交受體啟動訊號傳導，該訊號傳導透過天然細胞元件轉導，以提供模仿天然應答但對表現正交受體的工程化細胞具有特異性的生物活性。正交受體與其同源天然配體的結合力降低，而正交配體與其同源天然受體的結合力顯著降低。在一些實施例中，該正交配體為正交IL-2。在其他實施例中，該正交配體為IL-15或IL-7的正交變體。
用於改造正交細胞激素受體對的過程可以包含以下步驟：(a)使胺基酸變異併入天然受體中以破壞與天然細胞激素的結合；(b)在用於受體結合的接觸殘基處使胺基酸變異併入該天然細胞激素中；(c)選擇與直向同源受體結合的細胞激素直向同源物；(d)捨棄與天然受體結合的直向同源細胞激素，或執行步驟(c)和(d)；(e)選擇與直向同源細胞激素結合的受體直向同源物；(f)捨棄與天然細胞激素結合的直向同源受體。在優選實施例中，依據該細胞激素/受體複合物的結構相關知識來選擇用於定點誘變或易錯誘變的胺基酸位置。雖然其他展示和選擇方法也較為實用，但為方便起見，可以在選擇過程中採用酵母展示系統。
本文所用的「結合力顯著降低」係指可偵測到的結合力及/或活化較少或無結合力及/或活化，或者結合及/或活化水準不顯著，例如，用以描述正交配體相對於天然存在的配體與天然存在的受體的比較結合力和活性。舉例而言，該結合親和力可以透過競爭性結合實驗確定，該實驗在存在各種濃度的第二未標記配體的條件下測定受體與單一濃度的第一標記配體的結合力。相對於天然配體，正交配體的結合力顯著降低，前提是該正交配體與天然受體的結合力低於天然存在的配體結合水準的20%、或者低於該水準的約10%、或者低於該水準的約8%、或者低於該水準的約6%、或者低於該水準的約4%、或者低於該水準的約2%、或者低於該水準的約1%，或者低於該水準的約0.5%。類似地，相對於天然配體，正交受體的結合力顯著降低，前提是該天然配體與正交受體的結合力低於天然存在的受體結合水準的20%、或者低於該水準的約10%、或者低於該水準的約8%、或者低於該水準的約6%、或者低於該水準的約4%、或者低於該水準的約2%、或者低於該水準的約1%，或者低於該水準的約0.5%。
正交配體與一種或多種同源正交受體特異性結合。術語「特異性結合」係指一個分子與另一個分子結合的選擇性程度或親和度。在結合對的第一分子與第二分子的結合親和力相較於第一分子與樣品中其他組分的親和力至少高出2倍、至少高出10倍、至少高出20倍或至少高出100倍時，可以說該結合對的第一分子與結合對的第二分子特異性結合。可以採用本領域已知的技術來評估特異性結合或親和力測量結果，該技術包括但不限於競爭性ELISA、BIACORE®測定及/或KINEXA®測定。該正交配體與同源正交受體的親和力可能類似於天然配體與天然受體的親和力，在一些實施例中，其親和力至少為天然配體受體對親和力的約5%、至少為該親和力的約10%、至少為該親和力的約15%、至少為該親和力的約25%、至少為該親和力的約50%、至少為該親和力的約75%、至少為該親和力的約100%，也可以更高，例如，達到天然配體與天然受體的親和力的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更高。舉例而言，優先結合可以是優先比為5:1、10:1、20:1等的情況。
嵌合正交受體包含與細胞內結構域(ICD)可操作地連接的正交配體結合結構域(oLBD)，該細胞內結構域衍生自另一受體，而非衍生出oLBD的受體。在一些實施例中，該oLBD序列與衍生出ICD的蛋白的跨膜結構域融合。在其他實施例中，該跨膜結構域由衍生出oLBD的受體或衍生自第三蛋白等的人工序列提供。在一些實施例中，該嵌合受體的ICD基本上或完全是天然受體的ICD。在一些實施例中，相對於天然受體的ICD，該嵌合受體的ICD包含一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，該嵌合受體的ICD包含一種或多種STAT訊號傳導蛋白的結合位點，例如，STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6等。在一些實施例中，該嵌合受體的ICD包含一個胺基酸殘基，例如，被JAK激酶磷酸化的酪胺酸殘基。
透過使正交配體與嵌合受體結合而啟動的細胞內訊號傳導通路可以反映出該受體的ICD活化的訊號特徵模式，其中，該嵌合受體衍生出細胞內結構域。例如，已選定的STAT蛋白的活化模式可以與天然受體(其與其天然配體衍生出ICD)的活化產生的活化模式基本相似。
可以衍生出ICD的示例性人細胞激素受體包括但不限於CD121α；CD121β；IL-18Rα；IL-18Rβ；CD122 (與除CD122配體結合結構域以外的配體結合結構域結合)；CD124；CD213；CD127；IL-9R；CD21α1；CD213α2；IL-15Rα；CDw131；CDw125；CD131；CD126；CD130；IL-11Rα；CD114；CD212；LIFR；OSMR；CDw210；IL-20Rα、IL-20Rβ；IL-14R；CD4；CDw217；CD118；CD119；CD40；LTβR；CD120α；CD120β；CD137(4-1BB)；BCMA、TACI；CD27；CD30；CD95(Fas)；GITR；LTβR；HVEM；OX40；BCMA、TACI；TRAILR1-4；Apo3；RANK、OPG；TGF-βR1；TGF-βR2；TGF-βR3；EpoR；TpoR；Flt-3；CD117；CD115；CD136；等等。
在一些實施例中，該嵌合受體的ICD衍生自與共用γ鏈(CD132)相關聯的除CD122以外的受體的ICD。在一些實施例中，該ICD是選自IL-4受體(CD124)、IL-7受體(IL-7R)、IL-9受體(CD129)、IL-15Rα、IL-21受體(IL-21R)的受體的ICD。在一些實施例中，存在於嵌合受體中的ICD是促紅細胞生成素受體(EpoR)的ICD。
在一些具體實施例中，oLBD與IL-7R的跨膜結構域(TMD)和ICD可操作地連接，其嵌合受體的示例是序列辨識編號：4和序列辨識編號：18。序列辨識編號：6和序列辨識編號：20提供了多個示例，其中TMD和部分ICD由CD122提供。人IL-7R的參考序列可透過GenbankNP_002176獲得。相對於參考序列，該跨膜結構域包含胺基酸殘基240-264以及來自殘基265-459的ICD。本發明的構建體可以包含，例如，IL-7R參考序列的TMD和ICD，其範圍是約殘基223，約殘基225、230、235、240至約殘基459，而且在一些實施例中，其包含末端胺基酸和在殘基455處實現JAK磷酸化的靶向酪胺酸。
在一些具體實施例中，oLBD與IL-9R的跨膜結構域(TMD)和ICD可操作地連接，其嵌合受體的示例是序列辨識編號：8和序列辨識編號：22。人IL-9R的參考序列可透過GenbankNP_002177獲得。相對於參考序列，該跨膜結構域包含胺基酸殘基271-291以及來自殘基292-521的ICD。本發明的構建體可以包含，例如，該參考序列的TMD和ICD，其範圍是約殘基255，約殘基257、260、265、270、271至約殘基521。
在一些具體實施例中，oLBD與IL-21R的跨膜結構域(TMD)和ICD可操作地連接，其示例是序列辨識編號：10和序列辨識編號：24。人IL-21R的參考序列可透過GenbankNP_068570獲得。相對於參考序列，該跨膜結構域包含胺基酸殘基233-253以及來自殘基254-538的ICD。本發明的構建體可以包含，例如，該參考序列的TMD和ICD，其範圍是約殘基225，約殘基230，約殘基233至約殘基538。
在一些具體實施例中，oLBD與促紅細胞生成素受體(EpoR)的跨膜結構域(TMD)和ICD可操作地連接，其示例是序列辨識編號：12和序列辨識編號：26。人IL-21R的參考序列可透過GenbankNP_000112獲得。相對於參考序列，該跨膜結構域包含胺基酸殘基251-273以及來自殘基274-508的ICD。本發明的構建體可以包含，例如，該參考序列的TMD和ICD，其範圍是約殘基240、約殘基245、約殘基250、約殘基251至約殘基508。本發明表明，許多酪胺酸殘基對於磷酸化和STAT蛋白結合而言較為重要，包括殘基454、456、468、489和504，其可以包括在ICD序列中。
在一些具體實施例中，oLBD與IL-4Rα的跨膜結構域(TMD)和ICD可操作地連接。人IL-4Rα的參考序列可透過GenbankNP_000409獲得。相對於參考序列，該跨膜結構域包含胺基酸殘基233-256以及來自殘基257-825的ICD。本發明的構建體可以包含，例如，該參考序列的TMD和ICD，其範圍是約殘基240、約殘基245、約殘基250、約殘基255、約殘基257至約殘基825。
如上所述，該嵌合受體的跨膜結構域(TMD)可以是衍生出ICD的同一受體蛋白的TMD序列。或者，該跨膜結構域可以包含在真核細胞膜中具有熱力學穩定性的多肽序列，其長度足以跨膜且通常由非極性胺基酸組成。該跨膜跨度結構域可以衍生自天然存在的跨膜蛋白的跨膜結構域，也可以是合成的。在設計合成跨膜結構域時，優選有利於形成α-螺旋結構的胺基酸。跨膜結構域通常由約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23或24個胺基酸組成，該胺基酸有利於形成具有α-螺旋二級結構的胺基酸結構體。具有有利α-螺旋構象的胺基酸是本領域所熟知的胺基酸。請參閱以下出版品，例如 ，Pace等人 ，(1998年)生物物理雜誌，75：422-427。在α螺旋構象方面特別有利的胺基酸包括甲硫胺酸、丙胺酸、亮胺酸、穀胺酸和賴胺酸。
在一些實施例中，使oLBD併入嵌合受體的受體是IL-2受體的鏈，包括但不限於選自白介素2受體β (IL-2Rβ；也被稱為CD122)和白介素2受體γ(IL-2Rγ；也被稱為CD132；也被稱為「共用γ鏈」)的多肽。在一些具體實施例中，該正交受體包含CD122 oLBD。
在一些實施例中，該oLBD是CD122的序列變體。人蛋白的示例性oLBD是序列辨識編號：16，其始於胺基酸殘基1，包括直至殘基224的序列。該配體結合結構域可進一步包含直至殘基240的胺基酸序列，該殘基是跨膜結構域的起點或其一部分。例如，配體結合結構域可以包含序列辨識編號：16下始於1-224、1-225、1-226、1-227、1-228、1-229、1-230、1-231、1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-237、1-238、1-239、1-240等的殘基或由其組成。或者，正交變體可以衍生自天然蛋白質序列，例如，Genbank登錄號NP_000869，包含涵蓋殘基1-224、1-225、1-226、1-227、1-228、1-229、1-230、1-231、1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-237、1-238、1-239、1-240等的序列或由其組成。例如，目的取代或刪除位置包括但不限於人CD122(hCD122)R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136、Q214。
小鼠蛋白的示例性oLBD是序列辨識編號：2，其始於胺基酸殘基1，包括直至位於殘基224處的細胞激素結合基序的序列。該配體結合結構域可進一步包含直至殘基240的胺基酸序列，該殘基是跨膜結構域的起點或其一部分。例如，配體結合結構域可以包含序列辨識編號：2下始於1-224、1-225、1-226、1-227、1-228、1-229、1-230、1-231、1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-237、1-238、1-239、1-240等的殘基或由其組成。或者，正交變體可以衍生自天然蛋白質序列，例如，Genbank登錄號NP_032394，包含涵蓋殘基1-224、1-225、1-226、1-227、1-228、1-229、1-230、1-231、1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-237、1-238、1-239、1-240等的序列或由其組成。目的取代或刪除位置包括但不限於小鼠CD122(mCD122)R42、F67、Q71、S72、T74、S75、V76、S133、H134、Y135、I136、E137和R215。
在一些實施例中，CD122在選自Q71、T74、H134、Y135(小鼠蛋白)或Q70、T73、H133、Y134(人蛋白)的一個或位置組合處被取代。在一些實施例中，該嵌合受體包含CD122的ECD，其包含在mCD122 H134和Y135或hCD122 H133和Y134處的胺基酸取代。在一些實施例中，該胺基酸取代是酸性胺基酸，例如，天冬胺酸及/或穀胺酸。特定胺基酸取代包括但不限於mCD122取代Q71Y；T74D；T74Y；H134D、H134E；H134K；Y135F；Y135E；Y135R；hCD122變異Q70Y；T73D；T73Y；H133D、H133E；H133K；Y134F；Y134E；Y134R。在一些實施例中，該嵌合正交受體包含衍生自人CD122的oLBD，其包含在H133和Y134處的胺基酸取代。在一些實施例中，該嵌合正交受體包含衍生自人CD122的oLBD，其包含在H133D和Y134F處的胺基酸取代。在oLBD是正交CD122蛋白的實施例中，該正交細胞激素可以是天然IL-2Rβ的活化顯著降低的正交IL-2多肽。
白介素2(IL-2)是一種主要由活化CD4+ T細胞產生的多能性細胞激素，其在產生正常免疫應答中起關鍵作用。人IL-2被合成為含153個胺基酸的前體多肽，轉譯後從中去除位於n-末端的20個胺基酸訊號肽，以產生成熟的分泌的IL-2。天然存在的成熟人IL-2(hIL-2)以133個胺基酸序列的形式出現，詳情請見以下出版品：Fujita等人，PNAS USA，80，7437-7441(1983年)。人IL-2的胺基酸序列請參見Genbank(登錄定位符：NP_000577.2)。
舉例而言，可以採用CTLL-2小鼠細胞毒性T細胞在細胞增殖測定中測定IL-2活性，詳情請見以下出版品：Gearing, A.J.H.和C.B.Bird(1987年)，淋巴激素和幹擾素，實用方法；Clemens, M.J.等人，(編)：IRL Press，295。重組人IL-2的參考比活性約為2.1 × 104 IU/μg，其已根據重組人IL-2 WHO國際標準(NIBSC代碼：86/500)進行校準。在可比性測定中，正交人IL-2的活性可以低於人IL-2多肽WHO國際標準(NIBSC代碼：86/500)規定活性的20%，或者低於該規定活性的約10%、或者低於該規定活性的約8%、或者低於該規定活性的約6%、或者低於該規定活性的約4%、或者低於該規定活性的約2%、或者低於該規定活性的約1%、或者低於該規定活性的約0.5%。
正交人IL-2蛋白配體的示例性序列可以作為序列辨識編號：34提供。正交小鼠IL-2配體的示例性序列可以作為序列辨識編號：30提供。或者，正交蛋白可以基於天然人蛋白(refseqNP_000577.2)或天然小鼠蛋白(NP_032392)設計。在一些實施例中，在正交配體是IL2的變體時，以下一個或多個胺基酸殘基被除天然蛋白以外的胺基酸取代，或在該位置被刪除：對於小鼠IL-2(mIL-2)，H27、L28、E29、Q30、M33、D34、Q36、E37、R41、N103中任一項；對於人IL-2(hIL-2)，Q13、L14、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、G27、R81、N88中任一項。在一些此等實施例中，用於胺基酸取代的位點組選自(對於mIL-2)E29、Q30、M33、D34、Q36和E37中的一項或多項；(對於hIL-2)E15、H16、L19、D20、Q22、M23、R81中的一項或多項。
在一些實施例中，該正交配體是鼠IL2變體，其包含選自以下各項的一個或多個胺基酸取代：[H27W]、[L28M、L28W]、[E29D、E29T、E29A]、[Q30N]、[M33V、M33I、M33A]、[D34L、D34M]、[Q36S、Q36T、Q36E、Q36K、Q36E]、[E37A、E37W、E37H、E37Y、E37F、E37A、E37Y]、[R41K、R41S]、[N103E、N103Q]。在一些實施例中，該正交配體是人IL2變體，其包含選自以下各項的一個或多個胺基酸取代：[Q13W]、[L14M、L14W]、[E15D、E15T、E15A、E15S]、[H16N、H16Q]、[L19V、L19I、L19A]、[D20L、D20M]、[Q22S、Q22T、Q22E、Q22K、Q22E]、[M23A、M23W、M23H、M23Y、M23F、M23Q、M23Y]、[G27K、G27S]、[R81D、R81Y]、[N88E、N88Q]、[T51I]。在一些實施例中，該正交配體是鼠IL2變體，其包含選自以下任一取代組的一組胺基酸取代：[Q30N、M33V、D34N、Q36T、E37H、R41K]；[E29D、Q30N、M33V、D34L、Q36T、E37H]；[E29D、Q30N、M33V、D34L、Q36T、E37A]和[E29D、Q30N、M33V、D34L、Q36K、E37A]或其保守變體。在一些實施例中，該正交配體是人IL2變體，其包含選自以下任一取代組的一組胺基酸取代：[H16N、L19V、20N、Q22T、M23H、G27K]；[E15D、H16N、L19V、D20L、Q22T、M23H]；[E15D、H16N、L19V、D20L、Q22T、M23A]和[E15D、H16N、L19V、D20L、Q22K、M23A]；或其保守變體。
在一些實施例中，該正交配體是人IL2變體，其包含選自以下一項或多項的胺基酸取代：[E15S、E15T、E15Q、E15H]；[H16Q]；[L19V、L19I]；[D20T、D20S、D20M、D20L]；[Q22K、Q22N]；[M23L、M23S、M23V、M23T]。在一些其中正交配體是人IL2變體的實施例中，該正交hIL-2的共有突變組是[E15S、H16Q、L19V、D20T/S/M；Q22K；M23L/S]。在一些實施例中，正交hIL-2的共有突變組是[E15S、H16Q、L19V、D20L、M23 Q/A]和任選的Q22K。
在一些實施例中，該正交配體是人IL2變體，其包含選自以下任一取代組的一組胺基酸取代：[E15S；H16Q；L19V、D20T/S；Q22K、M23L/S]；[E15S；H16Q；L19I；D20S；Q22K；M23L]；[E15S；L19V；D20M；Q22K；M23S]；[E15T；H16Q；L19V；D20S；M23S]；[E15Q；L19V；D20M；Q22K；M23S]；[E15Q；H16Q；L19V；D20T；Q22K；M23V]；[E15H；H16Q；L19I；D20S；Q22K；M23L]；[E15H；H16Q；L19I；D20L；Q22K；M23T]；[L19V；D20M；Q22N；M23S]；[E15S、H16Q、L19V、D20L、M23Q、R81D、T51I]、[E15S、H16Q、L19V、D20L、M23Q、R81Y]、[E15S、H16Q、L19V、D20L、Q22K、M23A]和[E15S、H16Q、L19V、D20L、M23A]。在一些實施例中，該正交配體是人IL2變體，其包含取代E15S、H16Q、L19V、D20L、Q22K、M23A。
在一些實施例中，正交配體蛋白可與其他分子共軛，以提供所需的藥理特性，例如，延長的半衰期。在一個實施例中，正交配體與IgG、白蛋白(包括人血清白蛋白)或其他分子的Fc結構域融合以延長其半衰期，例如 ，透過本領域中已知的聚乙二醇化、糖基化等來實現。在一些實施例中，該正交配體與聚乙二醇分子共軛或「聚乙二醇化」。與該正交配體共軛的PEG包括但不限於分子量在5kDa至80kDa之間的PEG。在一些實施例中，PEG的分子量約為5kDa；在一些實施例中，PEG的分子量約為10kDa；在一些實施例中，PEG的分子量約為20kDa；在一些實施例中，PEG的分子量約為30kDa；在一些實施例中，PEG的分子量約為40kDa；在一些實施例中，PEG的分子量約為50kDa；在一些實施例中，PEG的分子量約為60kDa；在一些實施例中，PEG的分子量約為70kDa；在一些實施例中，PEG的分子量約為80kDa。在一些實施例中，PEG的平均分子量範圍是約5kDa至約80kDa、約5kDa至約60kDa、約5kDa至約40kDa、約5kDa至約20kDa。與多肽序列共軛的PEG可以是直鏈狀的或分支狀的。PEG可以直接與正交多肽配體連接或透過連接基分子連接。實現生物化合物聚二乙醇化所必需的過程和化學反應是本領域所熟知的。
除延長血清半衰期外，Fc融合還可以使融合伴侶在體內 具有其他Fc受體介導的特性。「Fc區」可以是與透過用木瓜蛋白酶消化IgG而產生的IgG C末端結構域同源的天然存在的或合成的多肽。該正交配體可以融合至整個Fc區，或融合至保留延長其作為其一部分的嵌合多肽的循環半衰期的能力的較小部分。此外，全長或片段化Fc區可以是野生型分子的變體。也就是說，它們可以含有可能會或可能不會影響多肽功能的突變。例如，請參閱以下出版品：Wang X，Mathieu M，Brezski RJ，IgG Fc改造以調節抗體效應子功能，Protein Cell，2018年；9(1)：63-73。doi：10.1007/s13238-017-0473-8。
在其他實施例中，正交配體可以包含作為抗原標籤的多肽，例如，FLAG序列。如本文所述，FLAG序列由生物素化、高度特異性抗FLAG抗體識別(另見以下出版品：Blanaret等人 ，Science 256：1014，1992年；LeClair等人，美國國家科學院院報，89：8145，1992年)。在一些實施例中，該嵌合多肽進一步包含C末端c-myc表位標籤。配體也可與本領域中所熟知的HIS標籤合成，以便純化。
在一些實施例中，該正交配體(例如，正交IL-2)可被乙醯化。在一些實施例中，乙醯化可以利用本領域中所熟知的方法在N-末端進行，例如，透過與N-末端乙醯轉移酶(例如乙醯輔酶A)發生酶促反應。在一些實施例中，該正交配體可以在一個或多個賴胺酸殘基處被乙醯化，例如，透過與賴胺酸乙醯轉移酶發生酶促反應。請參閱以下出版品，例如，Choudhary等人，(2009年)，科學，325(5942)：834-840。
正交細胞激素配體和正交嵌合受體可在多肽的其他位置(例如，與正交工程改造有關的位置以外的位置)包括保守性修飾和取代。此等保守性取代包括以下出版品中所述的取代：Dayhoff，蛋白質序列和結構圖譜5 (1978年)；以及Argos，EMBO J.，8：779-785(1989年)。例如，屬於以下任一組的胺基酸表示保守性變異：第I組：ALA、PRO、GLY、GIN、ASN、SER、THR；第II組：CYS、SER、TYR、THR；第III組：VAL、ILE、LEU、MET、ALA、PHE；第IV組：LYS、ARG、HIS；第V組：PHE、TYR、TRP、HIS；以及第VI組：ASP、GLU。在每種實例中，可以評估其他修飾的引入情況，使生物體(施用了經修飾的多肽)中經修飾的多肽的抗原性增強量降至最低。核酸及其表現
在本發明的方法中，正交蛋白可以透過重組方法產生。可以將編碼正交嵌合受體或配體的核酸序列併入表現載體中，該表現載體與併入待改造細胞中的一種或多種表現控制序列(例如，啟動子、增強子)可操作地相關聯。編碼正交配體或嵌合正交受體的核酸序列可以在工程改造過程中從計劃的各種來源處獲得。示例性核酸編碼序列作為序列辨識編號：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35提供，其可以作為ssDNA、dsDNA、DNA:RNA混合物、ssRNA、dsRNA或其類似物提供。
如本文所述，該正交嵌合受體或配體及其變體可透過將合適的核苷酸變異引入編碼序列來製備。該變體包含本文所述的殘基插入、取代及/或刪除。實施任何插入、取代及/或指定刪除組合，以得到最終構建體，前提是最終構建體具有如本文所定義的所需生物活性。
為了實現重組蛋白的表現，將編碼正交蛋白的核酸插入可複製載體中進行表現。現有許多此等載體。載體組分通常包括但不限於以下一種或多種：複製起點、內部核糖體進入位點(IRES)、一種或多種標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。載體包括病毒載體、質粒載體、整合載體等。
用於表現正交受體的表現載體可以是病毒載體或非病毒載體。質粒是非病毒載體的示例。為了促進靶細胞的轉染，可以在促進非病毒載體攝取的條件下，將靶細胞直接曝露於非病毒載體中。促進哺乳動物細胞對外來核酸的攝取的條件示例是本領域所熟知的，包括但不限於化學裝置(例如，Lipofectamine®，Thermo-Fisher Scientific)、高鹽分、電穿孔和磁場(電穿孔)。例如，請參閱以下出版品：Novickij等人，(2016年)，科學報告第6卷，文章編號：33537，脈衝電磁場輔助的體外電穿孔。在一個實施例中，可以在非病毒遞送體系中提供非病毒載體。非病毒遞送體系通常是絡合物，以促進核酸承載物轉導靶細胞，其中核酸與諸如陽離子脂質(DOTAP、DOTMA)、表面活性劑、生物製劑(明膠、殼聚糖)、金屬(金、磁鐵)和合成聚合物(PLG、PEI、PAMAM)的試劑絡合。非病毒遞送體系的許多實施例是本領域所熟知的，包括脂質載體體系(Lee等人，(1997年)Crit Rev TherDrug Carrier Syst.14：173-206)；聚合物包覆脂質體(Marin等人 ，於1993年5月25日發佈的第5,213,804號美國專利；Woodle等人 ，於1991年5月7日發佈的第5,013,556號美國專利)；陽離子脂質體(Epandet等人 ，於1994年2月1日發佈的第5,283,185號美國專利；Jessee，J. A.，於1996年11月26日發佈的第5,578,475號美國專利；Rose等人 ，於1994年1月18日發佈的第5,279,833號美國專利；Gebeyehu等人， 於1994年8月2日發佈的第5,334,761號美國專利)。
在另一實施例中，表現載體可以是病毒載體。採用病毒載體體系時，優選逆轉錄病毒，例如，慢病毒表現載體。特別是，該病毒載體是γ逆轉錄病毒((Pule，等人， (2008年)自然醫學，14(11)：1264-1270)、自滅活慢病毒載體(June，等人， (2009年)自然免疫學評論，9 (10)：704-716)和逆轉錄病毒載體，詳見以下出版品：Naldini等人， (1996年)，科學，272：263-267；Naldini等人， (1996年)美國國家科學院院報第93卷，第11382-11388頁；Dull等人， (1998年)病毒學雜誌，72(11)：8463-8471；Milone等人(2009年)17(8)：1453-1464；Kingsman等人， 於2000年8月1日發佈的第6,096,538號美國專利；以及Kingsman等人， 於2005年8月2日發佈的第6,924,123號美國專利。在一個實施例中，該表現載體是可從Oxford Biomedica獲得的Lentivector®慢病毒載體。
目的病毒載體還包括逆轉錄病毒載體(例如，衍生自MoMLV、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等的載體)、腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體(例如，源自Ad5病毒的載體)、基於SV40的載體、基於單純皰疹病毒(HSV)的載體等。
用表現載體轉導細胞可以採用本領域所熟知的技術完成，包括但不限於使宿主T細胞與病毒載體共溫育、電穿孔及/或化學增強遞送。
正交蛋白也可以作為融合多肽採用異源多肽(例如，在成熟蛋白質或多肽的N-末端具有特定切割位點的訊號序列或其他多肽)生產。通常情況下，該訊號序列可以是載體組分，也可以是插入該載體中的編碼序列的一部分。優選選定的異源訊號序列是由宿主細胞識別和處理(即，由訊號肽酶切割)的異源訊號序列。在哺乳動物細胞表現中，可以使用天然訊號序列，其他哺乳動物訊號序列可能合適，例如，來自相同或相關物種的分泌型多肽的訊號序列，以及病毒分泌前導序列，例如，單純皰疹gD訊號。
表現載體可以含有選擇基因，也被稱為選擇標記。該基因編碼在選擇性培養基中生長的轉化宿主細胞的存活或生長所必需的蛋白質。未用含有選擇基因的載體轉化的宿主細胞在培養基中無法存活。典型選擇基因編碼以下蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如，胺苄青黴素、新黴素、甲胺蝶呤或四環素)的抗性；(b)補充營養缺陷型缺陷；或(c)供應無法從複合培養基中獲得的關鍵養分。
表現載體將含有由宿主生物體識別且與正交蛋白編碼序列可操作地連接的啟動子。啟動子是位於結構基因起始密碼子上游(5')(通常在約100至1000 bp內)的非轉譯序列，其控制其可操作地連接的特定核酸序列的轉錄和轉譯。該啟動子通常分為兩類：誘導型和組成型。誘導型啟動子是為了回應培養條件的某一變化(例如，存在或不存在某一營養物或溫度變化)來使在其控制下自DNA進行的轉錄水準增加的啟動子。許多由多種潛在宿主細胞識別的啟動子是本領域所熟知的。
舉例而言，從哺乳動物宿主細胞中的載體進行的轉錄可透過以下來源的啟動子加以控制：獲取自病毒基因組，例如，多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒(例如鼠幹細胞病毒)、B型肝炎病毒以及最優選的猿猴病毒40(SV40)；獲取自異源哺乳動物啟動子，例如，肌動蛋白啟動子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白啟動子；獲取自熱休克啟動子，前提是該啟動子與宿主細胞體系相容。為方便起見，SV40病毒的早期和晚期啟動子可作為也含有SV40病毒複製起點的SV40限制片段來獲取。用於本發明實施中的啟動子示例包括CMV、EF-1、hPGK和RPBSA啟動子。
高等真核生物的轉錄通常透過將增強子序列插入載體中來提高。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10至300 bp，其作用於啟動子以提高其轉錄。增強子相對不依賴於定向和位置，其見於轉錄單元的5'和3'端、內含子內以及編碼序列內。現在已知許多增強子序列來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。示例包括位於複製起點後側的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位於複製起點後側的多瘤增強子和腺病毒增強子。可剪接增強子，使其於編碼序列的5'或3'位置處併入表現載體中，但優選於啟動子的5'位點處併入。
用於真核宿主細胞中的表現載體還將含有終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。該序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA的5'和3'(偶爾)非轉譯區中獲得。含有一種或多種以上所列組分的合適載體採用標準技術構建。
用於在本文所述的載體中克隆或表現DNA的合適寄主細胞是上述原核生物、酵母或高等真核生物細胞。有用的哺乳動物宿主細胞系的示例是小鼠L細胞(L-M[TK-]，ATCC編號：CRL-2648)、由SV40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(進行亞克隆以在懸浮培養物中生長的293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO)；小鼠塞爾托利細胞(TM4)；猴腎細胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL 34)；buffalo大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞；MRC 5細胞；FS4細胞；以及人肝癌細胞系(Hep G2)。
可用上述表現載體轉染宿主細胞(包括工程化T細胞)。可在常規營養培養基中培養細胞，該營養培養基被改良為適合於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列的基因。可在各種培養基中培養哺乳動物宿主細胞。諸如Ham's F10(Sigma)、最低必需培養基((MEM)，Sigma)、RPMI1640(Sigma)和杜爾貝科氏改良依格爾氏培養基((DMEM)，Sigma)的可在市場上購得的培養基適用於培養宿主細胞。必要時，這些培養基中的任一種都可補充有激素及/或其他生長因數(例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因數)、鹽類(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素以及葡萄糖或等效能量來源。還可包括本領域技術者已知的適當濃度的任何其他必需補充劑。諸如溫度、pH等培養條件是先前適用於選擇用以表現的宿主細胞的條件，且對於熟知本領域的普通技術者而言是顯而易見的。
在核酸放置成與另一核酸序列呈功能性關係時，該核酸是「可操作地連接」的。例如，如果訊號序列的DNA表現為參與多肽分泌的前蛋白，則其與多肽的DNA可操作地連接；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則其與編碼序列可操作地連接；或如果核糖體結合位點被定位以便於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。通常情況下，「可操作地連接」係指所連接的DNA序列是連續的，且對於分泌前導序列，其是連續的並且處於同一蛋白質編碼開放閱讀框中。但是，增強子不必是連續的或在閱讀框架中。 工程化細胞
在一些實施例中，本發明提供了工程化細胞，其中該細胞已透過引入表現載體而加以修飾，該表現載體包含編碼本發明的嵌合受體的核酸序列，而該嵌合受體包含來自第一受體的正交配體結合結構域，該第一受體透過跨膜結構域可操作地連接至衍生自第二受體的細胞內結構域(ICD)。任何細胞均可用於此目的。在一些實施例中，該細胞是T細胞，包括但不限於幼稚CD8+ T細胞、細胞毒性CD8+ T細胞、幼稚CD4+ T細胞、輔助性T細胞，例如，TH 1、TH 2、TH 9、TH 11、TH 22、TFH ；調節性T細胞，例如，TR 1、天然TReg 、誘導性TReg ；記憶性T細胞，例如，中央記憶性T細胞、效應記憶性T細胞、NKT細胞、γδ T細胞以及此等T細胞的工程化變體，包括CART細胞；等等。在其他實施例中，該工程化細胞是幹細胞，例如，造血幹細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞。在一些實施例中，該細胞通常在轉移至受試者體內之前，於體外 程式中進行基因修飾，以引入嵌合受體的編碼序列，該工程化細胞可以單位劑量形式提供以用於治療目的，而且相對於預期受者可以是同種異體的、自體的或異種異體的等。
可用於與本文所述的構建體一起進行工程改造的T細胞包括幼稚T細胞、中央記憶性T細胞、效應記憶性T細胞或其組合。如上所述的用於工程改造的T細胞可以從受試者或供者中收集，而且可以透過富集所需細胞的技術從細胞混合物中分離出來，也可以在不分離的情況下進行工程改造和培養。合適的溶液可用於分散或懸浮細胞。該溶液通常係為一平衡鹽類溶液，例如 正常的生理鹽水、PBS、漢克平衡鹽緩衝液等 ，方便補充胎牛血清或其他天然因數，與一可接受的緩衝液在低濃度(大致上係從5-25 mM起)下合併。合適的緩衝液包括HEPES、磷酸鹽緩衝液、乳酸緩衝液等 。用於親和分離的技術可包括磁性分離、使用抗體包被的磁珠、親和色譜分析、與單克隆抗體結合或與單克隆抗體聯合使用的細胞毒性劑(例如 ，補體和細胞毒素)，以及「淘選」附接至固體基質(例如 ，板)的抗體，或其他合適的技術。提供精確分離的技術包括螢光活化細胞分選術，其可具有不同程度的複雜性，例如多個顏色通道、低角度和鈍光散射偵測通道、阻抗通道等 。可透過採用與死細胞相關的染料(例如 ，碘化丙啶)來針對死細胞進行細胞選擇。可採用任何不過分損害所選細胞存活力的技術。親和試劑可為上述細胞表面分子的特異性受體或配體。除抗體試劑外，可使用肽-MHC抗原和T細胞受體對；肽配體和受體；效應子和受體分子等。
可以收集分離的細胞，而後置於任何適當的可維持細胞存活力的培養基中，該培養基通常在收集管的底部具有血清緩衝墊。各種培養基均可在市場上購得並且可以根據細胞的性質加以使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、伊斯科夫培養基(Iscove's medium)等 ，經常補充有胎牛血清(FCS)。收集的和任選富集的細胞群可立即用於基因改造，或者可在液氮溫度下冷凍並儲存，解凍並且能夠重新使用。細胞通常儲存在10% DMSO、50% FCS、40% RPMI 1640培養基中。
在一些實施例中，工程化細胞包含免疫細胞的複雜混合物，例如，從需要接受治療的個體中分離出的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。請參閱以下出版品，例如，Yang和Rosenberg(2016年)，免疫學進展，130：279-94，針對癌症的過繼性T細胞療法；Feldman等人(2015年)，腫瘤學研討，42(4)：626-39，過繼性細胞療法--腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞受體和嵌合抗原受體；臨床試驗NCT01174121，利用腫瘤浸潤淋巴細胞免疫療法治療轉移性癌症患者；Tran等人，(2014年)科學，344(6184)641-645，採用基於突變特異性CD4+ T細胞的癌症免疫療法治療上皮癌患者。
在一些實施例中，工程化T細胞相對於接受治療的個體是同種異體的，例如，請參閱臨床試驗NCT03121625；NCT03016377；NCT02476734；NCT02746952；NCT02808442。相關綜述請參閱以下出版品：Graham等人，(2018年)細胞，7(10)E155。在一些實施例中，同種異體工程化T細胞是完全HLA匹配的。
可以對同種異體T細胞進行基因修飾，以減少移植物抗宿主疾病。例如，工程化細胞可以是透過基因編輯技術實現的TCRαβ受體敲除細胞。TCRαβ是異質二聚體，若要表現它，則α和β鏈都必須存在。單個基因編碼α鏈(TRAC)，但是有2個基因編碼β鏈，因此，為此已刪除了TRAC基因座。已採用許多不同的方法來完成此等刪除，例如，CRISPR/Cas9；巨核酸酶；工程化I-CreI歸位元內切酶等。請參閱以下出版品，例如，Eyquem等人，(2017年)自然，543：113-117，其中TRAC編碼序列被CAR編碼序列取代；以及Georgiadis等人，(2018年)分子療法，26：1215-1227，其透過成簇的規律間隔的短回文重複序列(CRISPR)/Cas9)將CAR表現與TRAC破壞聯繫起來，而未將CAR直接併入TRAC位點。另一種防止GVHD的策略是修飾T細胞，以表現TCRαβ訊號傳導抑制劑，例如，使用CD3ζ的截短形式作為TCR抑制分子。
用於本發明實施中的T細胞的製備方式如下：用包含編碼正交嵌合受體的核酸序列的表現載體轉化分離的T細胞；任選地與編碼下述CAR多肽的核酸序列結合。可以在單獨的表現載體上分別提供編碼CAR和正交嵌合受體的核酸序列，各核酸序列與一個或多個表現控制元件可操作地連接，以實現CAR和正交受體在靶細胞(載體轉染至其中)中的表現。或者，可以在單個載體上分別提供編碼CAR和正交受體的核酸序列，各核酸序列在一個或多個表現控制元件的控制下實現相關核酸序列的表現。或者，兩個核酸序列均可以受單個啟動子控制，該啟動子具有促進該載體中兩個序列共表現的幹預(例如，T2A或IRES元件)或下游控制元件。
體外 T細胞活化可透過本領域所熟知的程式來實現，包括基於細胞的T細胞活化、基於抗體的活化或利用各種基於磁珠的活化試劑實現的活化。基於細胞的T細胞活化可透過使T細胞曝露於抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)或人工抗原呈遞細胞(例如經輻照的K562細胞實現。採用可溶性抗CD3單克隆抗體和可溶性抗CD28抗體對T細胞表面CD3分子進行基於抗體的活化也支援T細胞活化。
T細胞可透過培養與表面接觸的細胞來擴增，從而提供刺激CD3 TCR複合物相關訊號的試劑(例如，抗CD3抗體)以及刺激T細胞表面共刺激分子的試劑(例如 ，激動性抗CD28抗體)。基於磁珠的T細胞活化在製備用於臨床用途的T細胞方面已獲得本領域認可。基於磁珠的T細胞活化可以利用在市場上購得的T細胞活化試劑來實現，該試劑包括但不限於Invitrogen® CTS Dynabeads® CD3/28(Life Technologies, Inc.，加利福尼亞州卡爾斯巴德)或Miltenyi MACS® GMP ExpActTreg磁珠或Miltenyi MACS GMP TransActTM CD3/28磁珠(MiltenyiBiotec, Inc.)適用於T細胞培養的條件是本領域所熟知的。Lin等人，(2009年)細胞療法，11(7)：912-922；Smith等人 ，(2015年)臨床與轉化免疫學，4：e31，於2015年1月16日在線上發佈。將靶細胞置於維持生長所必需的條件下，例如，合適的溫度(例如，37℃)和大氣(例如，空氣加5% CO2 )。
工程化細胞可以透過任何合適的施用途徑(通常是血管內施用，即使其可透過其他途徑引入)，利用任何生理學上可接受的介質輸注到受試者體內，其中該細胞可以定位適合的生長部位。通常情況下，至少施用1 × 106 個細胞/千克，至少施用1 × 107 個細胞/千克、至少施用1 × 108 個細胞/千克、至少施用1 × 109 個細胞/千克、至少施用1 × 1010 個細胞/千克或以上，這通常受到收集期間獲得的T細胞數目限制。
在一個實施例中，表現正交嵌合受體的T細胞是經修飾的T細胞，其可表面表現嵌合抗原受體(「CART」細胞)。本文所用的術語「嵌合抗原受體T細胞」和「CART細胞」可互換使用，是指已重組修飾以表現嵌合抗原受體的T細胞。本文所用的術語「嵌合抗原受體」和「CAR」可互換使用，是指包含以下在序列中以從胺基到羧基末端的方式排列的多個功能結構域的多肽：(a)抗原結合結構域(ABD)；(b)跨膜結構域(TM)；以及(c)一個或多個細胞質訊號傳導結構域(CSD)，其中前述結構域可以任選地透過一個或多個間隔結構域連接。CAR還可以進一步包含訊號肽序列，其通常在CAR於細胞表面進行轉譯後處理和呈遞期間被去除。用於本發明實施中的CAR根據本領域所熟知的原理製備。請參閱以下出版品，例如 ，Eshhaar等人 ，於2010年6月22日發佈的第7,741,465 B1號美國專利；Sadelain等人 (2013年)，癌症發現，3(4)：388-398；Jensen和Riddell(2015年)，免疫學最新觀點，33：9-15；Gross等人 ，(1989年)PNAS(美國)，86(24)：10024-10028；Curran等人 ，(2012年)基因醫學雜誌，14(6)：405-15。可加以修飾以併入本發明的正交受體的市售CAR T細胞產物的示例包括axicabtageneciloleucel(商品名為Yescarta®，可從Gilead Pharmaceutical購得)和tisagenlecleucel(商品名為Kymriah®，可從Novartis購得)。
本文所用的術語抗原結合結構域(ABD)是指與在靶細胞表面上表現的抗原特異性結合的多肽。ABD可以是與靶細胞表面表現的一種或多種抗原特異性結合的任何多肽。在某些實施例中，該靶細胞抗原是腫瘤抗原。可以被CAR靶向的腫瘤抗原的非限制性示例包括一種或多種選自由諸如以下各項組成的群組的抗原，該群組包括但不限於CD19、CD20、CD30、HER2、IL-11Ra、PSCA、NCAM、NY-ESO-1、MUC1,CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、間皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配體、葉酸受體(FRa)、GD2、PSMA、BCMA和Wnt1抗原。
在一個實施例中，ABD是單鏈Fv(ScFv)。ScFv是一種多肽，由透過肽連接基共價連接的抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區組成(Bird等人 ，(1988年)科學，242：423-426；Huston等人 ，(1988年)PNAS(美國)，85：5879-5883；S-z Hu等人， (1996年)癌症研究，56，3055-3061。基於單克隆抗體序列的ScFv的產生是本領域所熟知的。請參閱以下出版品，例如 ，蛋白質方案手冊，John M. Walker(編)，(2002年)Humana Press，第150節「單鏈抗體的細菌表現、純化和表徵 」，Kipriyanov, S。用於製備scFv的抗體可以進行優化，以透過本領域所熟知的技術(例如，噬菌體展示和定向進化)選擇具有特定所需特徵的分子。在一些實施例中，ABD包含抗CD19 scFv(請參閱，例如，Cooper等人 ，於2017年7月11日發佈的第9,701,758號美國專利，特別是其中描述的scFv FMC63)、抗PSA scFv、抗PSMA scFv(請參閱，例如 ，Han等人(2016年)腫瘤靶標，7(37)：59471-59481)、抗BCMA scFv(請參閱，例如，Brogdon等人，scFv抗原結合結構域，於2019年1月8日發佈的第10,174,095號美國專利)、抗HER2 scFv、抗CEA scFv、抗EGFRscFv、抗EGFRvIIIscFv、抗NY-ESO-1scFv、抗MAGE scFv、抗5T4scFv 或抗Wnt1scFv。在另一實施例中，ABD是單結構域抗體(也被稱為VHH)，其是透過用靶細胞衍生的抗原，特別是腫瘤抗原免疫駱駝科動物(例如，駱駝或美洲駝)而獲得的。請參閱以下出版品，例如 ，Muyldermans, S，(2001年)分子生物科技評論，74：277-302。或者，ABD可以透過生成肽庫並分離具有所需靶細胞抗原結合特性的化合物來完全合成產生，該過程基本上根據本發明的內容或以下出版品執行：Wigler等人 ，於1999年11月12日發佈的第6303313 B1號美國專利；Knappik等人 ，於2004年2月24日發佈的第6,696,248B1號美國專利；Binz等人 ，(2005年)自然生物科技，23：1257-1268；以及Bradbury等人 ，(2011年)自然生物科技，29：245-254。
ABD可能對一種以上的靶抗原具有親和力。例如，本發明的ABD可包含嵌合雙特異性結合成員，即 ，能提供與第一靶細胞表現的抗原和第二靶細胞表現的抗原的特異性結合。嵌合雙特異性結合成員的非限制性示例包括雙特異性抗體、雙特異性共軛的單克隆抗體(mab)2 、雙特異性抗體片段(例如，F(ab)2 、雙特異性scFv、雙特異性雙抗體、單鏈雙特異性雙抗體等)、雙特異性T細胞銜接子(BiTE)、雙特異性共軛的單結構域抗體、micabodies及其突變體等。嵌合雙特異性結合成員的非限制性示例還包括以下出版品中所述的嵌合雙特異性試劑：Kontermann (2012年)，MAbs ，4(2)：182-197；Stamova等人，(2012年)抗體 ，1(2)，172-198；Farhadfar等人(2016年)，白血病研究 ，49：13-21；Benjamin等人，血液學治療進展 ，(2016年)7(3)：142-56；Kiefer等人，免疫學評論 ，(2016年)270(1)：178-92；Fan等人(2015年)，血液學與腫瘤學雜誌 ，8：130；May等人，(2016年)美國衛生系統藥學雜誌 ，73(1)：e6-e13。在一些實施例中，嵌合雙特異性結合成員是二價單鏈多肽。請參閱以下出版品，例如 ，Thirion等人 ，(1996年)歐洲癌症預防雜誌，5(6)：507-511；DeKruif和Logenberg(1996年)，生物化學雜誌，271(13) 7630-7634；以及Kay等人，於2015年11月5日公開的公開號為2015/0315566的美國專利申請案。在一些實例中，嵌合雙特異性結合成員可以是雙特異性T細胞銜接子(BiTE)。BiTE通常透過以下方式製備，即，融合使抗原與特異性結合成員(例如，scFv)結合的特異性結合成員(例如，scFv)與對T細胞分子(例如CD3)具有特異性的第二結合結構域。在一些實例中，嵌合雙特異性結合成員可以是CAR T細胞接合子。本文所用的「CAR T細胞接合子」是指表現的雙特異性多肽，其與CAR的抗原識別結構域結合並使CAR重定向至第二抗原。通常情況下，CAR T細胞接合子具有結合區域，該區域對於其針對的CAR上的一個表位以及針對一個結合伴侶(結合時，轉導活化CAR的結合訊號)的第二個表位具有特異性。實用的CAR T細胞接合子包括但不限於諸如以下出版中所述的接合子：Kim等人，(2015年)美國化學學會會誌，137(8)：2832-5；Ma等人，(2016年)美國國家科學院院報，113(4)：E450-8；以及Cao等人，(2016年)應用化學國際版，55(26)：7520-4。
在一些實施例中，連接基多肽分子任選地在抗原結合結構域與跨膜結構域之間併入CAR中，以促進抗原結合。Moritz和Groner(1995年)基因療法，2(8)539-546。在一個實施例中，連接基是來自免疫球蛋白的鉸鏈區，例如，來自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4中任一項的鉸鏈，尤其是人蛋白序列。備選方案包括免疫球蛋白的CH2CH3區和CD3的一部分。在其中ABD是scFv的實例中，可以採用IgG鉸鏈。在一些實施例中，連接基包含胺基酸序列(G4 S)n ，其中n為1、2、3、4、5等，而且在一些實施例中，n為3。
用於本發明實施中的CAR進一步包含跨膜(TM)結構域，其將ABD(或連接基，如採用)與CAR的細胞內細胞質結構域連接。跨膜結構域由在真核細胞膜中具有熱力學穩定性的任何多肽序列組成。該跨膜跨度結構域可以衍生自天然存在的跨膜蛋白的跨膜結構域，也可以是合成的。在設計合成跨膜結構域時，優選有利於形成α-螺旋結構的胺基酸。可用於構建CAR的跨膜結構域由約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23或24個胺基酸組成，該胺基酸有利於形成具有α-螺旋二級結構的胺基酸結構體。具有有利α-螺旋構象的胺基酸是本領域所熟知的胺基酸。請參閱以下出版品，例如 ，Pace等人 ，(1998年)生物物理雜誌，75：422-427。在α螺旋構象方面特別有利的胺基酸包括甲硫胺酸、丙胺酸、亮胺酸、穀胺酸和賴胺酸。在一些實施例中，CAR跨膜結構域可以衍生自跨膜結構域，該跨膜結構域來自I型跨膜蛋白，例如CD3ζ、CD4、CD8、CD28等。
CAR多肽的細胞質結構域包含一個或多個細胞內訊號結構域。在一個實施例中，細胞內訊號結構域包含T細胞受體(TCR)和共受體(其在抗原受體結合後啟動訊號轉導)及其功能性衍生物和亞片段的細胞質序列。細胞質訊號傳導結構域(例如衍生自T細胞受體ζ鏈的結構域)被用作CAR的一部分，以便在嵌合受體與靶抗原結合後產生T淋巴細胞增殖和效應子功能的刺激訊號。細胞質訊號傳導結構域的示例包括但不限於CD27的細胞質結構域、CD28的細胞質結構域S、CD137(也被稱為4-1BB和TNFRSF9)的細胞質結構域、CD278(也被稱為ICOS)的細胞質結構域、PI3激酶的p110α、β或δ催化亞基、人CD3 ζ-鏈、CD134(也被稱為OX40和TNFRSF4)的細胞質結構域、FcεR1γ和β鏈、MB1(Igα)鏈、B29(Igβ)鏈等)、CD3多肽(δ、Δ和ε)、syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其他參與T細胞轉導的分子(例如CD2、CD5和CD28)。
在一些實施例中，CAR還可以提供共刺激域。術語「共刺激結構域」是指CAR的訊號傳導內結構域，其提供了二級非特異性活化機制，透過該機制可傳播初級特異性刺激。該共刺激結構域是指增強記憶細胞的增殖、存活或發展的CAR部分。共刺激的示例包括在透過T細胞受體的抗原特異性訊號傳導後的抗原非特異性T細胞共刺激和在透過B細胞受體的訊號傳導後的抗原非特異性B細胞共刺激。共刺激，例如，以下出版品中所述的T細胞共刺激和所涉及的因數：Chen和Flies，(2013年)自然免疫學評論，13(4)：227-42。在本發明的一些實施例中，該CSD包含TNFR超家族成員中的一個或多個成員、CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其組合。
CAR通常以第一、第二、第三或第四代稱呼。術語第一代CAR係指其中該細胞質結構域僅透過單一訊號傳導結構域(例如源自IgE FcεRI的高親和力受體或CD3ζ鏈的訊號傳導結構域)發送來自抗原結合的訊號的CAR。該單一訊號傳導結構域含有一或三個用於抗原依賴性T細胞活化的免疫受體酪胺酸活化基序[ITAM]。基於ITAM的活化訊號賦予T細胞在回應抗原結合時裂解該腫瘤靶細胞以及分泌細胞激素的能力。第二代CAR包括除了CD3ζ. 結構域外的共刺激訊號。重合遞送該已遞送共刺激訊號可增強由經CAR轉導的T細胞誘導的持久性、細胞激素分泌和抗腫瘤活性。相對於該CD3ζ結構域，該共刺激結構域通常接近膜。第三代CAR包括三重訊號傳導結構域，包含，例如CD28、CD3ζ、OX40或4-1BB訊號傳導區。第四代CAR或「防護型」CAR T細胞進一步經基因修飾以表現或阻斷分子及/或受體，從而增強免疫活性。
可併入本發明的CAR中的示例性細胞內訊號傳導結構域包括(胺基至羧基)：CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；CD28-CD3ζ；CD28-OX40-CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；41BB-CD-28--CD3ζ和41BB-CD3ζ。
術語CAR包括CAR變體，該CAR變體包括但不限於分裂CAR、啟動鈕CAR、雙特異性或串聯CAR、抑制性CAR(iCAR)和經誘導的多能幹細胞(iPS)CAR-T細胞。
術語「分裂CAR」係指一種CAR，其中該CAR的細胞外部分、ABD和細胞質訊號傳導結構域係存在於二個分開的分子上。CAR變體也包括啟動鈕CAR，其為有條件活化的CAR，例如包含分裂CAR，其中該分裂CAR的二個部分的有條件異二聚體化係以藥理學方式控制。CAR分子及其衍生物(即，CAR變體)詳情請見以下出版品，例如，編號為US2014/016527、US1996/017060、US2013/063083的PCT申請案；Fedorov等人，科學轉化醫學 (2013年)，5(215)：215ra172；Glienke等人，藥理學前沿 (2015年)，6：21；Kakarla和Gottschalk 52，癌症雜誌 (2014年)，20(2)：151-5；Riddell等人，癌症雜誌 (2014年)，20(2)：141-4；Pegram等人，癌症雜誌 (2014年)，20(2)：127-33；Cheadle等人，免疫學評論 (2014年)，257(1)：91-106；Barrett等人，醫學年鑒 (2014年)，65：333-47；Sadelain等人，癌症發現 (2013年)，3(4)：388-98；Cartellieri等人，生物醫學與生物科技雜誌 (2010年)，956304；其公開內容以引用方式全部併入本文。
術語「雙特異性或串聯CAR」係指包括可擴大或抑制初級CAR的活性的二級CAR結合結構域的CAR。在一個實施例中，該ABD可包含多個(2、3、4或更多個)結合結構域，例如，多個scFv、抗體、VHH及其組合，每個結合結構域與靶細胞上的表面表現分子特異性結合。在一個實施例中，該CAR的細胞外ABD結構域包含串聯雙功能性構建體，該串聯雙功能構建體包含與CD19結合的scFv，該CD19與結合CD20的scFv可操作地連接。
術語「抑制性嵌合抗原受體」或「iCAR」在本文中可互換使用，係指一種CAR，其中結合iCAR係使用靶向以停止活性CAR活化的雙抗原，其透過接合配備二級CAR結合結構域的抑制性訊號傳導結構域的第二抑制受體，使得初級CAR活化受抑制而停止活性CAR活化。抑制性CAR(iCAR)旨在透過抑制性受體訊號傳導模塊活化來調節CAR T細胞活性。此方法結合二種CAR的活性，其中之一產生優勢負訊號，限制被活化受體所活化的CAR T細胞的反應。當與僅由正常組織表現的特定抗原結合時，iCAR可停止中和活化劑CAR的反應。這樣，iCARs-T細胞可區分癌細胞和健康細胞，並以抗原選擇性方式可逆地阻斷經轉導的T細胞的功能。iCAR中的CTLA-4或PD-1細胞內結構域觸發T淋巴細胞上的抑制訊號，導致產生較少的細胞激素、較無效的靶細胞裂解且導致淋巴細胞運動性改變。
術語「串聯CAR」或「TanCAR」係指透過二種嵌合受體的結合來介導雙特異性T細胞活化的CAR，該嵌合受體旨在於回應二種不同的腫瘤相關抗原獨立結合時遞送刺激性或共刺激性訊號。 多肽製劑
重組產生的正交配體(例如，用於與包含正交嵌合受體的工程化細胞結合使用)可以分泌型多肽形式從細胞培養基中回收，雖然其亦可從宿主細胞的溶胞產物中回收。蛋白酶抑制劑(例如，苯甲基磺醯氟(PMSF))亦可用於抑制純化期間的蛋白水解降解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。各種純化步驟是本領域所熟知的，且可加以利用，例如親和色層分析法。也可以採用尺寸選擇步驟，例如，利用凝膠過濾色譜法(也被稱為尺寸排阻色譜法或分子篩色譜法)以根據蛋白質的大小來分離蛋白質。
該正交細胞激素組成物可使用本領域中已知的方法濃縮、過濾、滲析等 。在治療應用方面，可將正交配體施用於哺乳動物，該哺乳動物包含經工程改造以表現合適的經工程改造的正交嵌合受體(正交配體與此特異性結合)。正交配體的施用可以大丸藥形式藉由靜脈內注射或藉由連續輸注一段時間進行。替代的施用途徑包括肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑。該正交配體還可適當地藉由腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內或病灶周圍途徑施用或施用於淋巴，以發揮局部和全身治療效果。
此等劑型涵蓋本身具有無毒性和非治療性的生理學上可接受的載體。此等載體的示例包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、緩衝物質(例如磷酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(例如硫酸魚精蛋白)、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素基物質和PEG。用於局部或基於凝膠形式的多肽的載體包括多醣，例如，羧甲基纖維素鈉或甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、PEG和木蠟醇。對於所有施用，適合使用常規儲庫形式。此等形式包括，例如，微膠囊、納米膠囊、脂質體、膏藥、吸入形式、鼻噴霧劑、舌下片劑和緩釋製劑。通常將多肽以約0.1 μg/ml至100 μg/ml的濃度配製並納入此等載劑中。
如果正交配體是「基本上純質」的，則它們可以是重量比至少為約60%(乾重)的目的多肽，例如，含有該直向同源IL-2胺基酸序列的多肽。例如，該多肽可以是重量比至少為約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%的目的多肽。純度可藉由任何合適的標準方法測定，例如柱色譜法、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析。
在本發明的另一實施例中，本發明提供了一種包含可用於治療上述病症的材料的製品。該製品包括容器和標籤。合適的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和試管。該容器可以由多種材料製成，例如玻璃或塑膠。該容器裝有可有效治療該病症的組合物，且可具有無菌入口(例如，該容器可以是靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。該組合物中的活性劑是正交細胞激素。該容器上或與容器相關的標籤指明該組合物係用於治療所選病症。該製品可與可容納，例如藥學上可接受的緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液)的其他容器一起提供。該製品可進一步包括其他從商業和使用者角度而言必要的材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和具有使用說明的藥品說明書。治療性細胞製劑及其使用
本發明提供了用於增強細胞應答的方法和組合物，增強方式如下：透過引入本發明的正交嵌合受體來對取自受者或供者的細胞進行工程改造；使工程化細胞與特異性結合至oLBD且活化嵌合受體(產生細胞內訊號)的同源正交配體接觸來刺激正交嵌合受體。如上所述，該標的方法包括獲取靶細胞的步驟，例如，T細胞、造血幹細胞等，該靶細胞可從生物樣品中分離出來，也可在體外利用祖細胞來源衍生。該細胞係使用包含編碼該正交受體的序列的表現載體轉導或轉染，該步驟可在任何合適的培養基中進行。在一些實施例中，細胞群獲取自受試者且進行體外遺傳修飾以引入核酸(例如，載體)，該核酸包含編碼嵌合受體的核酸序列，該嵌合受體與在分離細胞中起作用的一個或多個表現控制序列可操作地連接。而後，將經基因修飾的細胞重新引入獲取其的受試者中。在一些實施例中，本發明提供了一種自體TIL細胞治療方法，該方法從患有腫瘤疾病的受試者中分離出一些腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，一部分(例如，超過10%，任選地超過20%、任選地超過30%、任選地超過40%、任選地超過50%、任選地超過60%、任選地超過70%、任選地超過80%或任選地超過90%)分離的TIL透過將包含編碼嵌合正交受體的核酸序列的核酸(例如載體)引入所述分離的TIL中進行體外基因修飾，而後將經基因修飾的TIL重新引入從中獲取細胞的受試者中。在一些實施例中，本發明提供了一種自體TIL細胞治療方法，該方法從患有腫瘤疾病的受試者中分離出一些腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，活化TIL，其中一部分(例如，超過10%，任選地超過20%、任選地超過30%、任選地超過40%、任選地超過50%、任選地超過60%、任選地超過70%、任選地超過80%或任選地超過90%)分離的TIL透過將包含編碼嵌合正交受體的核酸序列的核酸(例如載體)引入所述分離的TIL中進行體外基因修飾，而後將經基因修飾的TIL重新引入從中獲取細胞的受試者中。在一些實施例中，細胞獲取自第一受試者且進行體外遺傳修飾，以引入核酸，該核酸包含嵌合受體的編碼序列，而後將經基因修飾的細胞重新引入非獲取其的受試者中(同種異體細胞移植)。在一些實施例中，本發明提供了一種細胞。
在一些實施例中，本發明提供了一種治療方法，該方法包含將工程化細胞群引入需要接受治療的受者中，其中該細胞群已透過引入包含編碼正交嵌合受體的序列的載體而進行修飾。該細胞群可以體外進行工程改造，而且相對於受者通常可以是自體的或同種異體的。在一些實施例中，在施用工程化細胞後，使引入的細胞群與同源正交細胞激素體內 接觸。
在不受理論束縛的情況下，表現正交嵌合受體的細胞被對其具有低親和力的正交配體選擇性地活化，因此導致來自非直系同源受體的細胞內訊號傳導活性較低。細胞內訊號傳導通路的相應活化的特異性由TM和ICD決定。在一些實施例中，被啟動的訊號傳導通路基本上與衍生出ICD的受體啟動的訊號傳導通路相似，例如，在特定JAK/STAT蛋白的活性方面。細胞激素或生長因數的細胞外結合誘導受體相關Janus激酶(JAK)活化，其透過其SH2結構域，使促進二聚化的STAT蛋白中的特定酪胺酸殘基磷酸化。而後，磷酸化二聚體被主動轉運至細胞核處。在二聚化STAT蛋白到達細胞核處後，它便會與細胞激素誘導型基因的啟動子區域中一個被稱為γ活化位點(GAS)的共有DNA識別基序結合，並啟動轉錄。該STAT蛋白可以被核磷酸酶去磷酸化，從而使STAT失活，且隨後透過輸出蛋白-RanGTP複合物轉運出細胞核。已鑒定出以下七個哺乳動物STAT家族成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5(STAT5A和STAT5B)和STAT6。STAT1同源二聚體參與II型幹擾素訊號傳導，並與GAS(幹擾素-γ啟動序列)啟動子結合以誘導ISG(幹擾素刺激基因)表現。在I型幹擾素訊號傳導中，STAT1-STAT2異質二聚體與IRF9 (幹擾素應答因數9)結合，形成ISGF3(幹擾素刺激基因因數3)，其與ISRE(幹擾素刺激應答因數)啟動子結合以誘導ISG表現。
在工程化細胞是T細胞的情況下，增強免疫應答可以表現為T細胞對存在於受體中的靶細胞的溶細胞應答增加，例如，消除腫瘤細胞和感染細胞；自體免疫疾病的症狀減輕；等等。
在細胞與正交配體體外 接觸的情況下，將細胞激素以足以啟動來自受體的訊號傳導的劑量和時間添加至工程化細胞中，這可以利用天然細胞機制實現，例如，輔助蛋白，共受體等。可以使用任何合適的培養基。如此活化的細胞可用於任何預期目的，包括與確定抗原特異性、細胞激素譜分析等有關的實驗目的，以及用於體內遞送。
在體內 接觸的情況下，在正交配體(例如IL-2)施用時或施用之前，將有效劑量的工程化細胞(包括但不限於經修飾以表現正交嵌合受體的CAR T細胞)輸注至受者體內，且允許在其天然環境中接觸細胞，例如，在淋巴結等 部位。劑量和頻率可能因試劑、施用方式、細胞激素的性質等而異。熟知本領域技術者應當理解，此類指導方針將針對各種情況進行調整。對於局部施用(例如，鼻內、吸入等)或全身施用，劑量也可以發生變化。胃腸外輸注包括肌肉內、靜脈內(推注或緩慢輸注)、動脈內、腹膜內、鞘內、腫瘤內、皮下施用等 。
工程化T細胞可以適於治療用途(例如人體給藥)的藥物組合物形式提供。包含此類細胞的治療製劑可經冷凍或製備用於與生理學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑(雷氏藥學大全，第16版，Osol, A.編(1980年))一起以水溶液形式施用。該細胞將以符合良好醫學實踐的方式配製、給藥及施用。在此情形下的考慮因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、各個患者的臨床病況、病症的病因、藥劑遞送部位、施用方法、施用排程和醫學從業者已知的其他因素。
通常施用至少約104 個工程化細胞/千克，至少約105 個工程化細胞/千克；至少約106 個工程化細胞/千克；至少約107 個工程化細胞/千克；至少約108 個工程化細胞/千克或更多。例如，用於實施本發明的細胞的典型施用範圍是每個療程在約1 × 105 至5 × 108 個活細胞/千克(受試者體重)的範圍內。因此，根據體重進行調整，施用於人類受試者的活細胞的典型範圍為每個療程約1 × 106 至約1 × 1013 個活細胞，或約5 × 106 至約5 × 1012 個活細胞，或約1 × 107 至約1 × 1012 個活細胞，或約5 × 107 至約1 × 1012 個活細胞，或約1 × 108 至約1 × 1012 個活細胞，或約5 × 108 至約1 × 1012 個活細胞，或約1 × 109 至約1 × 1012 個活細胞。在一個實施例中，每個療程的細胞劑量範圍為2.5-5 × 109 個活細胞。
療程可以是單一劑量或在一段期間內多個劑量。在一些實施例中，該細胞以單劑量施用。在一些實施例中，該細胞是在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120或180天的期間內，以二個或更多個分次劑量施用。在此等分次給藥方案中，每次施用的工程化細胞的量可以是相同的，也可以不同水準提供。監測細胞施用的本領域技術者(例如醫師)可在考慮該受試者對治療的反應(包括治療的不利影響)以及上文所討論的調節後提供在一段期間內實施的多日給藥方案。
例如，在目前的CAR T細胞療法的臨床實踐中，CAR T細胞通常與淋巴細胞清除(例如藉由施用阿崙單抗(單株抗CD52)、嘌呤類似物等進行)組合施用，以在宿主免疫恢復之前促進CAR T細胞擴增。在一些實施例中，該CAR T細胞可經過修飾以抵抗阿崙單抗(在市場上購得，商品名為Campath®和Lemtrada®)。在本發明的一方面，目前與CAR T療法結合使用的淋巴細胞清除可藉由表現本發明的正交配體的CAR T來予以避免或減少。如上所述，通常採用淋巴細胞清除來使CAR T細胞擴增。但是，淋巴細胞清除也與CAR T細胞療法的主要副作用有關。因為該正交配體提供選擇性擴增特定T細胞群的方式，所以可減少在施用表現正交配體的CAR T前對淋巴細胞清除的需求。本發明能夠實行CAR T細胞療法，無需在施用表現該正交配體的CAR T之前清除淋巴細胞或可減少淋巴細胞清除。
在一個實施例中，本發明提供治療患有可藉由CAR T細胞療法治療的疾病、病症或病況(例如癌症)的受試者的方法，該方法是在施用正交配體之前不進行淋巴細胞清除的情況下，施用表現正交嵌合受體的CAR T。在一個實施例中，本發明提供治療哺乳動物受試者的方法，該哺乳動物受試者罹患與存有異常細胞群相關的疾病、病症或病況(例如腫瘤)，該異常細胞群的特徵在於表現一種或多種表面抗原(例如腫瘤抗原)，該治療方法包含下述步驟：(a)從該個體取得包含T細胞的生物樣品；(b)富集該生物樣品中的T細胞；(c)以一個或多個表現載體轉染T細胞，該表現載體包含編碼CAR的核酸序列和編碼正交受體的核酸序列，該CAR的抗原靶向結構域能夠與至少一種存在於該異常細胞群上的抗原結合；(d)在體外擴增該表現正交嵌合受體的CAR T細胞群；(e)將藥學上有效量的表現正交嵌合受體的CAR T細胞適用於哺乳動物；以及(f)使用與表現在CAR T細胞上的正交嵌合受體選擇性結合的配體來調節該表現正交嵌合受體的CAR T細胞的生長。在一個實施例中，在開始CAR T細胞療法之前，前述方法係與哺乳動物淋巴細胞清除或免疫抑制結合。在另一實施例中，前述方法係在無淋巴細胞清除及/或免疫抑制的情況下於哺乳動物中實施。
優選製劑取決於預期施用方式和治療應用。根據所需製劑，該組合物也可包括藥學上可接受的無毒載體或稀釋劑，該無毒載體或稀釋劑被定義為通常用於配製施用於動物或人類的藥物組合物的溶媒。該稀釋劑係經過選擇以不影響該組合物的生物活性。等稀釋劑的示例是蒸餾水、磷酸鹽緩衝的生理鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液和漢克氏溶液。此外，藥物組合物或製劑也可包括其他載體、佐劑或無毒性、非治療性、非免疫原性穩定劑等。
在另一些其他實施例中，藥物組合物也可包括大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白質、多醣，例如殼聚醣、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如膠乳官能化SepharoseTM 、瓊脂糖、纖維素等)、聚胺基酸、胺基酸共聚物和脂質聚集體(例如油滴或脂質體)。
可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所使用的劑量和濃度下對受者無毒，且包括緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲苄基氯化銨；六甲基氯化銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽的抗衡離子，例如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子性表面活性劑，例如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
本發明還提供了用於該方法的試劑盒。標的試劑盒包括編碼正交嵌合受體的表現載體，或包含該表現載體的細胞。試劑盒可進一步包含同源正交配體。在一些實施例中，該組分以液體或固體形式的劑型(例如治療有效劑型)裝於任何合適的包裝(例如棒狀包裝、劑量包裝等)中提供。本發明也可提供用於選擇或在體外內衍生細胞的試劑，例如生長因數、分化劑、組織培養試劑等。
除上述成分外，標的試劑盒還可包括(在某些實施例中)用於實踐標的方法的說明書。這些說明可以多種形式呈現於試劑盒中。此等說明可存在的其中一種方式為列印在合適的介質或底物上的資訊，如試劑盒包裝中、包裝插入物中印有訊息的一張或數張紙等。此等說明的另一種存在方式為將訊息錄於電腦可讀取的介質中，如記憶碟、光碟(CD)、隨身碟等。此等說明可存在的另一種方式為可經由網際網路用於存取已移除站點上的資訊的網站位址。治療方法
在一些實施例中，標的組合物、方法和試劑盒用於增強T細胞介導的免疫應答。在一些實施例中，免疫應答涉及需要刪除或調節靶細胞(例如癌細胞、感染細胞)的病況、調節免疫細胞(包括但不限於涉及自體免疫疾病的免疫細胞、涉及移植的免疫細胞)、不良炎症反應、促進紅細胞生成、促進血小板生成等。免疫病況可能包括但不限於自體免疫疾病、移植物抗宿主病、造血骨髓移植、過繼細胞治療、腫瘤浸潤細胞(TIL)治療、炎症、移植物排異等。
在一些實施例中，該病況是癌症。本文所用的術語「癌症」(或「癌性」)、「過度增殖」和「贅生性」是指具有自發或不受調節的生長能力(例如，表現出快速增殖性細胞生長特徵的異常狀態或症狀)的細胞。過度增殖和贅生性疾病狀態可以被歸類為病理學的(即，表徵或構成疾病狀態)，或者其可被歸類為非病理學的(例如，偏離正常但與疾病狀態不相關)。該術語旨在包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，而與組織病理學類型或侵襲階段無關。「病理性過度增生」細胞出現在特徵為惡性腫瘤生長的疾病狀態中。非病理性過度增殖細胞的示例包括與傷口修復相關的細胞增殖。術語「癌症」或「腫瘤」用於指各種器官系統的惡性腫瘤，包括影響肺、乳腺、甲狀腺、淋巴腺和淋巴組織、胃腸道器官和泌尿生殖道者，以及腺癌，其通常被認為包括下列惡性腫瘤，例如：大多數結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌及/或睪丸腫瘤、非小細胞肺癌、小腸癌和食道癌。
術語「癌」是本領域所熟知的，並且是指上皮或內分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統癌瘤、胃腸系統癌瘤、泌尿生殖系統癌瘤、睪丸癌瘤、乳腺癌瘤、前列腺癌瘤、內分泌系統癌瘤和黑色素瘤。「腺癌」是指源自腺組織或其中腫瘤細胞形成可識別的腺體結構的癌瘤。
腫瘤細胞的示例包括但不限於AML、ALL、CML、腎上腺皮質癌、肛門癌、再生不良性貧血、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨轉移、腦癌、中樞神經系統(CNS)癌、周圍神經系統(PNS)癌、乳癌、子宮頸癌、兒童期非何傑金氏淋巴瘤、結腸癌和直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏腫瘤家族(例如尤文氏肉瘤)、眼癌、膽囊癌、胃腸道類癌、胃腸道間質瘤、妊娠滋養細胞疾病、何傑金氏淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌和下嚥癌、肝癌、肺癌、肺類癌腫瘤、非何傑金氏淋巴瘤、男性乳癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、腦下垂體瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、黑色素瘤皮膚癌、非黑色素瘤皮膚癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮癌(例如子宮肉瘤)、移行細胞癌瘤、陰道癌、外陰癌、間皮瘤、鱗狀細胞或表皮樣癌瘤、支氣管腺瘤、絨毛膜癌瘤、頭頸癌、畸胎瘤或瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症。其中該癌細胞表現出與非癌細胞相比較CD47表現增加的任何癌症為適合藉由標的方法和組合物治療的癌症。
本發明的組合物和方法可以與其他治療劑組合。例如，在待治療的疾病、病症或病況為贅生性疾病(例如癌症)時，本發明的方法可與常規化療劑或其他生物性抗癌藥物組合，例如檢查點抑制劑(例如PD1或PDL1抑制劑)或治療性單株抗體(例如Avastin®、Herceptin®)。
本領域中鑑定為可用於治療贅生性疾病的化學藥劑的示例包括但不限於必除癌(abitrexate)、阿黴素(adriamycin)、氟尿嘧啶(adrucil)、安吖啶(amsacrine)、天門冬醯胺酶、蒽環類、阿紮胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、比努(bicnu)、百時美(blenoxane)、白消安(busulfan)、博來黴素(bleomycin)、坎托沙(camptosar)、喜樹鹼(camptothecin)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、塞路比汀(cerubidine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑、克拉屈濱(cladribine)、柯美井(cosmegen)、阿糖胞苷(cytarabine)、塞托沙(cytosar)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、塞托烷(cytoxan)、更生黴素(dactinomycin)、多西紫杉醇(docetaxel)、阿黴素(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、伊蘭斯(ellence)、艾斯帕(elspar)、表阿黴素(epirubicin)、依託泊苷(etoposide)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟達拉(fludara)、吉西他濱(gemcitabine)、健擇(gemzar)、海卡汀(hycamtin)、羥基尿、愛治(hydrea)、伊達黴素(idamycin)、依達比星(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊非克司(ifex)、伊立替康(irinotecan)、蘭威斯(lanvis)、瘤克寧(leukeran)、瘤他汀(leustatin)、慕妥崙(matulane)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、巰嘌呤(mertotopurine)、甲胺蝶呤(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、自力黴素(mutamycin)、麥樂崙(myleran)、麥洛沙(mylosar)、納維平(navelbine)、尼潘(nipent)、諾蒽醌(novantrone)、安可維(oncovin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、伯爾定(paraplatin)、噴司他丁(pentostatin)、普拉丁諾(platinol)、普卡黴素(plicamycin)、甲基苄肼(procarbazine)、嘌呤醇(purinethol)、雷替曲塞(ralitrexed)、泰索帝(taxotere)、紫杉醇、替尼泊苷(teniposide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、托沐德(tomudex)、托泊替康(topotecan)、維路比辛(valrubicin)、長春花鹼(velban)、滅必治(vepesid)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春新鹼(vincristine)、長春瑞濱(vinorelbine)、VP-16和衛猛(vumon)。
可組合施用的標靶治療劑可包括但不限於酪胺酸激酶抑制劑，例如伊馬替尼甲磺酸鹽(Imatinib mesylate)(Gleevec，也被稱為STI-571)、吉非替尼(Gefitinib) (Iressa，也被稱為ZD1839)、埃羅替尼(Erlotinib)(以Tarceva銷售)、索拉非尼(Sorafenib)(Nexavar)、舒尼替尼(Sunitinib)(Sutent)、達沙替尼(Dasatinib)(Sprycel)、拉帕替尼(Lapatinib)(Tykerb)、尼羅替尼(Nilotinib)(Tasigna)和波替柔米(Bortezomib)(Velcade)、Jakafi(ruxolitinib)；Janus激酶抑制劑，例如託法替尼(tofacitinib)；ALK抑制劑，例如克唑替尼(crizotinib)；Bcl-2抑制劑，例如歐托克雷(obatoclax)、文克塔(venclexta)和棉酚(gossypol)；FLT3抑制劑，例如米杜托林(midostaurin)(Rydapt)、IDH抑制劑，例如AG-221、PARP抑制劑，例如因帕利(Iniparib)和歐帕利(Olaparib)；PI3K抑制劑，例如呱立福辛(perifosine)；VEGF受體2抑制劑，例如阿帕替尼(Apatinib)；AN-152(AEZS-108)，連接[D-Lys(6)]-LHRH的阿黴素；Braf抑制劑，例如維沐非尼(vemurafenib)、達布非尼(dabrafenib)和LGX818；MEK抑制劑，例如托美替尼(trametinib)；CDK抑制劑，例如PD-0332991和LEE011；Hsp90抑制劑，例如沙利黴素(salinomycin)；及/或小分子藥物共軛物，例如文塔氟利(Vintafolide)；絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑，例如譚洛莫司(Temsirolimus)(Torisel)、依維莫司(Everolimus) (Afinitor)、維羅非尼(Vemurafenib)(Zelboraf)、曲美替尼(Trametinib)(Mekinist)和達拉非尼(Dabrafenib)(Tafinlar)。
本領域中鑑定為可用於治療贅生性疾病的生物劑的示例包括但不限於細胞激素或細胞激素拮抗劑，例如IL-12、INFα或抗表皮生長因數受體、放射療法、伊立替康；四氫葉酸抗代謝物，例如培美曲塞(pemetrexed)；針對腫瘤抗原的抗體、單株抗體和毒素的複合物、T細胞佐劑、骨髓移植物或抗原呈遞細胞(例如樹突細胞療法)、抗腫瘤疫苗、具有複製能力的病毒、訊號轉導抑制劑(例如Gleevec®或Herceptin®)或用於實現加成或協同抑制腫瘤生長的免疫調節劑、環氧合酶-2(COX-2)抑制劑、類固醇、TNF拮抗劑(例如Remicade®和Enbrel®)、幹擾素-β1a (Avonex®)和幹擾素-β1b(Betaseron®)以及如本領域技術熟習的臨床醫師所輕易理解的已知化療治療方案中實行的前述一項或多項的組合。
可與工程化細胞組合施用的腫瘤特異性單株抗體可包括但不限於利妥昔單抗(以MabThera®或Rituxan®銷售)、阿崙珠單抗(Alemtuzumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、易普利姆瑪(Ipilimumab)(Yervoy®)等。
在一些實施例中，本發明的組合物和方法可以與免疫檢查點療法組合。免疫檢查點療法的示例包括PD1與PDL1及/或PDL2結合的抑制劑。PD1與PDL1及/或PDL2結合的抑制劑是本領域所熟知的。幹擾PD1與PDL1及/或PDL2結合的市售單克隆抗體的示例包括納武利尤單抗(Opdivo®，BMS-936558，MDX1106，可從紐澤西州普林斯頓BristolMyers Squibb處購得)、派姆單抗(Keytruda®MK-3475，蘭布魯珠單抗，可從紐澤西州凱尼爾Merck and Company處購得)和阿特珠單抗(Tecentriq®，加州南舊金山Genentech/Roche)。PD1抑制抗體的其他示例包括但不限於度伐單抗(MEDI4736，Medimmune/AstraZeneca)、普利珠單抗(CT-011，CureTech)、PDR001(Novartis)、BMS-936559(MDX1105，BristolMyers Squibb)和阿維魯單抗(MSB0010718C, Merck Serono/Pfizer)和SHR-1210 (Incyte)。其他抗體PD1途徑抑制劑請見以下出版品：於2012年7月10日發佈的第8,217,149號美國專利(Genentech, Inc)；於2012年5月1日發佈的第8,168,757號美國專利(Merck Sharp and Dohme Corp.)；於2011年8月30日發佈的第8,008,449號美國專利(Medarex)；於2011年5月17日發佈的第7,943,743號美國專利(Medarex, Inc)。此外，小分子PD1與PDL1及/或PDL2結合的抑制劑是本領域所熟知的。請參閱以下出版品，例如，Sasikumar等人 ，WO2016142833A1和Sasikumar等人，WO2016142886A2，BMS-1166和BMS-1001(Skalniak等人(2017年)腫瘤靶標，8(42)：72167-72181)。
在其他實施例中，本發明的方法用於治療感染。本文所用的術語「感染」是指生物體(即受試者)的至少一個細胞被致病原感染(例如受試者具有細胞內病原體感染，例如慢性細胞內病原體感染)的任何狀態。本文所用的術語「致病原」是指引起該受感染的生物體的至少一個細胞中CD47表現增加的外來生物實體(即病原體)。例如，致病原包括但不限於細菌、病毒、原生動物和真菌。特別關注細胞內病原體。傳染病是由致病原引起的疾病。在某些情況下，某些致病原不會引起可識別的症狀或疾病，但有可能在條件改變的情況下引起症狀或疾病。標的方法可用於治療慢性病原體感染，例如，包括但不限於病毒感染，例如逆轉錄病毒、慢病毒、肝脫氧核糖核酸病毒、皰疹病毒、痘病毒、人乳頭瘤病毒等；細胞內細菌感染，例如分枝桿菌、衣原體、埃裡希氏體、立克次氏體、布魯氏菌、軍團菌、法蘭西斯菌、李斯特菌、柯克斯氏菌、奈瑟氏菌、沙門氏菌、耶氏桿菌屬、幽門螺桿菌等；以及細胞內原生動物病原體，例如瘧原蟲屬、錐蟲屬、賈第蟲屬、弓形蟲屬、利甚曼原蟲屬等。
治療可與其他活性劑聯合使用。抗生素的類別包括青黴素類，例如 青黴素G、青黴素V、甲氧西林、苯唑西林、羧苄青黴素、萘夫西林、胺苄青黴素等 ；青黴素與β-內醯胺酶抑制劑的組合、頭孢菌素類，例如 頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢呋辛、拉氧頭孢等 ；碳青黴烯類；單醯胺菌素類；胺基糖苷類；四環素類；大環內酯類；林可黴素類；多黏菌素類；磺胺類；喹諾酮類；氯黴素；甲硝唑；大觀黴素；甲氧苄啶；萬古黴素等 。也可包括細胞激素，例如 幹擾素γ、腫瘤壞死因子α、介白素12等。抗病毒劑，例如 阿昔洛韋、更昔洛韋等亦可用於治療。
在其他實施例中，對調節性T細胞進行工程改造以用於治療自體免疫疾病。炎性疾病和與炎症相關的疾病的範圍很廣且包括自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎(RA)、系統性紅斑性狼瘡(SLE)、多發性硬化症(MS)和自體免疫性肝炎；胰島素依賴性糖尿病、退化性疾病，例如骨關節炎(OA)、阿玆海默氏病(AD)和黃斑變性。
許多(若非大多數)自體免疫和炎性疾病涉及多種類型的T細胞，例如TH1、TH2、TH17等。自體免疫疾病的特徵在於T和B淋巴細胞異常靶向導致體內器官、組織或細胞類型(例如胰臟、腦、甲狀腺或胃腸道)損傷及/或功能障礙的自身蛋白質、自身多肽、自身肽及/或其他自身分子而引起疾病的臨床表現。自體免疫疾病包括影響特定組織的疾病和可影響多種組織的疾病，此可部分取決於該反應是否針對限定於特定組織的抗原還是廣泛分佈於體內的抗原。
現已對本發明作出了充分描述，對於本領域普通技術者而言顯而易見的是，在不脫離本發明的精神或範圍的情況下可以進行各種變更和修改。 示例1材料和方法
蛋白質生產。 將正交IL2克隆至昆蟲表現載體pAcGP67-A中，並使用如前所述的BaculoGold™桿狀病毒表現系統(BD Biosciences)在粉紋夜蛾(High Five™)細胞(Invitrogen)中表現(Sockolosky等人，科學(2018年)359 (6379)：1037-1042)。
哺乳動物表現載體。 將編碼全長小鼠正交Rb和正交Rb-ICD嵌合受體的cDNA PCR克隆至pMSCV-IRES-YFP逆轉錄病毒載體中。
細胞培養和逆轉錄病毒生產。 將HEK293T細胞保存在補充有10%胎牛血清(FBS)、1% L-麩胺醯胺(L-glu)以及1%青黴素和鏈黴素(P/S)的DMEM中。為了生產逆轉錄病毒，使用X-tremeGene™ HP(Roche)，以比例為1.5:1 pMSCV逆轉錄病毒載體和pCL-Eco包裝載體轉染HEK293T細胞。轉染後24h，除去培養基並補充含有5% FBS的DMEM，再培養24h。收集培養基(RV supe)，使用0.45μm過濾器澄清化，在液氮中快速冷凍並儲存在-80℃。補充培養基(DMEM/5% FBS)，再將細胞另外培養24小時，收集病毒並按上述條件儲存。
原代小鼠 T 細胞的分離和逆轉錄病毒轉導。 收集來自C57BL/6J小鼠脾臟和淋巴結的細胞，處理成單一細胞懸液，並活化補充有100 IU/ml mIL2 T的細胞培養基(RPMI-1640，10% FBS，HEPES，1% Pen/Strep，Glutamax，β-巰基乙醇，丙酮酸鈉和NEAA)中的板固定抗CD3(145-2C11，2.5 mg/ml)和可溶性抗CD28(37.51，5ug/ml)。活化後24h，將細胞重懸於含有上清液和100 IU/ml mIL2的病毒上清液(RV supe)中，並在32℃下以2700 rpm的轉速旋轉處理90'。然後去除RV supe，並用含有mIL2的T細胞培養基補充細胞。轉導後24h，收穫細胞並在含有mIL2的T細胞培養基中擴增24h。然後更換培養基，讓細胞在無mIL2的T細胞培養基中靜置24h，然後再用於體外訊號傳導或增殖測定。
體外 磷酸化訊號傳導分析。 將RV轉導的活化/靜止的原代小鼠T細胞以每孔1 × 105 個細胞的密度平板接種在超低結合力的96孔圓底板(裝有100 μL溫暖培養基)中(目錄號：7007；Costar)。在37℃下加入100 μL連續稀釋的o182溶液，以刺激細胞，持續20'，然後在室溫下透過1.5%多聚甲醛(PFA)固定(並攪拌)10'來終止反應。然後，將細胞置於冰上，用100%冰冷甲醇透化至少45'，或在-80℃下儲存過夜。用FACS緩衝液洗滌固定的透化細胞3次，然後用在FACS緩衝液中以1:100的比例稀釋並在4℃下溫育1h的抗STAT5 pY694-Alexa647、抗STAT3 pY705-Alexa647(BD Biosciences)或抗STAT1 pY701-Alexa647 (Cell Signaling)偵測細胞內磷酸化STAT蛋白。洗滌細胞，然後將該細胞置於配備有高通量自動進樣器(Beckman Coulter)的CytoFLEX上進行分析。資料表示平均螢光強度(MFI)，並使用Prism 8(GraphPad)將點擬合至S形劑量反應曲線上。所有資料均以平均值(n=2/3)± SEM表示。
體外 原代小鼠 T 細胞增殖測定。 根據製造商方案(Molecular Probes)，用CellTracer Violet標記RV轉導的活化/靜止的原代小鼠T細胞，然後以每孔1 × 105 個細胞的密度將其置於超低結合力的96孔圓底板(裝有連續稀釋的o182)中培養。72h後，將細胞置於CytoFLEX(Beckman Coulter)上進行分析。
動物 。C57BL/6J(目錄號：000664)小鼠購自Jackson實驗室，並根據經批准的方案飼養在斯坦福大學動物設施中。結果
如圖1A所示，設計了嵌合蛋白。鼠正交IL-2Rb(mIL2Rb)嵌合蛋白包括一個包含moRb的細胞外結構域和鼠IL-7受體(序列辨識序號：4)的跨膜和細胞內結構域的嵌合體，以及一個包含鼠正交IL-2Rβ和IL-7受體末端(序列辨識序號：6)的細胞外、跨膜和部分細胞內結構域的嵌合體。具有STAT5訊號蛋白結合位點的C-末端包括一個酪胺酸靶殘基(pY)，以便實現磷酸化。
分離來自BL6小鼠的T細胞，透過與抗CD3/抗CD28包被磁珠接觸來活化，並用編碼所示嵌合蛋白的重組逆轉錄病毒載體進行轉導，該逆轉錄病毒構建體包含IRES序列和黃色螢光蛋白(YFP)。已轉導細胞用鼠正交IL2 (系列辨識編號：30)刺激15分鐘，然後固定在多聚甲醛(PFA)中，經甲醇(MeOH)透化並用抗pSTAT5-A647抗體染色。在CytoFLEX®流式細胞儀(Beckman Coulter Life Sciences，印第安那州印第安那波利斯)上分析樣品，同時對YFP+細胞進行門控，並用Prism®軟體(GraphPad Software，美國加利福尼亞州聖地亞哥)繪製資料。SEM，n=3。圖1B所示的資料表明STAT5的磷酸化情況發生改變，其根據受體的細胞內結構域而變化。
為了回應鼠正交IL2配體曝露，評估重組修飾為表現嵌合融合受體的T細胞母細胞中的STAT5、STAT3和STAT1訊號轉導，該受體包含鼠正交IL2細胞外結構域以及IL2受體β亞單位(moRb-IL2Rb)、IL7受體(moRb-IL7)、IL21受體(moRb-IL21)和IL9受體(moRb-IL9)的跨膜和細胞內訊號傳導結構域。分離來自BL6小鼠的T細胞，活化抗CD3/抗CD28並用如下所示的moRb IRES YFP 逆轉錄病毒(RV)轉導：moRb(系列辨識編號：2)、moRb-IL-7R(系列辨識編號：4)、moRb-IL21R(系列辨識編號：10)、mRb-IL-9R(系列辨識編號：8)。已轉導細胞用正交IL2(系列辨識編號：30)刺激20'，然後固定在PFA中，經MeOH透化並用抗pSTAT5-A647抗體、抗pSTAT3-A647抗體或抗pSTAT1-A647抗體染色。在CytoFLEX®流式細胞儀上分析樣品，同時對YFP+細胞進行門控，並藉助Prism®軟體繪製資料。相關資料顯示，該融合受體能使STAT1、3和5表現出磷酸化細胞內訊號傳導特徵(即，該受體的磷酸化模式特徵)，其中衍生出細胞內結構域，同時保留了相同的IL-2正交細胞外受體結構域。該資料如圖2所示。
用正交IL2刺激透過編碼嵌合受體的載體轉導的T細胞母細胞，該嵌合受體包含鼠正交IL-1的細胞外結構域以及促紅細胞生成素(EPO)受體(oRb-EpoR)的跨膜和細胞內訊號傳導結構域，這表明該融合受體能夠在細胞內進行訊號傳導並活化pSTAT5(已活化EPO受體的訊號特徵)。簡而言之，分離來自BL6小鼠的T細胞，活化抗CD3/抗CD28並用所示的包含IRES雙順反子表現盒的逆轉錄病毒表現載體轉導，第一個順反子包含編碼moRb-EpoR融合受體(系列辨識編號：12)或moRb-EpoR-YF融合受體(系列辨識編號：14)的核酸序列，在每種情況下，第二順反子包含編碼YFP的核酸序列。已轉導細胞用正交IL2刺激20分鐘，然後固定在PFA中，經甲MeOH透化並用抗pSTAT5-A647染色。在CytoFLEX®流式細胞儀上分析樣品，同時對YFP+細胞進行門控，並藉助Prism®軟體繪製資料。圖3中提供的資料表明，在對融合受體的ECD進行正交IL2刺激後，STAT5磷酸化程度(EPO受體的訊號特徵)增加。
生成資料，以表明正交IL-2能誘導用編碼嵌合受體的重組逆轉錄病毒轉導的T細胞增殖。簡而言之，分離來自BL6小鼠的T細胞，活化抗CD3/抗CD28並用如下所示的逆轉錄病毒轉導：moRb(系列辨識編號：2)、moRb-EpoR(系列辨識編號：12)或moRb-EpoR(YF)(系列辨識編號：14)。在第0天用CellTrace™ Violet(CTV，Thermo Fisher Scientific)標記細胞，並用所示濃度的正交IL2(系列辨識編號：30)溫育。在第3天，在CytoFLEX®流式細胞儀上分析樣品，對存活的YFP+細胞進行門控。圖4提供了透過實驗中4次平行測定得到的代表性資料。相關資料表明，正交IL2劑量依賴性使T細胞增殖增加。引用的蛋白質序列 本發明引用了以下蛋白質序列： A. 小鼠正交IL-2Rβ受體序列： 1. 序列辨識編號：1：小鼠正交IL2Rβ(moRb)編碼序列： ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGGAGCCTGTCCCTCTACGTCTTCCTCCTGCTCCTGGCTACACCTTGGGCATCTGCAGCAGTGAAAAACTGTTCCCATCTTGAATGCTTCTACAACTCAAGAGCCAATGTCTCTTGCATGTGGAGCCATGAAGAGGCTCTGAATGTCACAACCTGCCACGTCCATGCCAAGTCGAACCTGCGACACTGGAACAAAACCTGTGAGCTAACTCTTGTGAGGCAGGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGGTCGTTCCCAGAGTCCCAGTCACTGACCTCCGTGGACCTCCTTGACATAAATGTGGTGTGCTGGGAAGAGAAGGGTTGGCGTAGGGTAAAGACCTGCGACTTCCATCCCTTTGACAACCTTCGCCTGGTGGCCCCTCATTCCCTCCAAGTTCTGCACATTGATACCCAGAGATGTAACATAAGCTGGAAGGTCTCCCAGGTCTCTGACTTCATTGAACCATACTTGGAATTTGAGGCCCGTAGACGTCTTCTGGGCCACAGCTGGGAGGATGCATCCGTATTAAGCCTCAAGCAGAGACAGCAGTGGCTCTTCTTGGAGATGCTGATCCCTAGTACCTCATATGAGGTCCAGGTGAGGGTCAAAGCTCAACGAAACAATACCGGGACCTGGAGTCCCTGGAGCCAGCCCCTGACCTTTCGGACAAGGCCAGCAGATCCCATGAAGGAGATCCTCCCCATGTCATGGCTCAGATACCTTCTGCTGGTCCTTGGTTGTTTTTCTGGCTTCTTCTCCTGCGTCTACATTTTGGTCAAGTGCCGGTACCTTGGGCCATGGCTGAAGACAGTTCTCAAGTGCCACATCCCAGATCCTTCTGAGTTCTTCTCCCAGCTGAGCTCCCAGCATGGGGGAGACCTTCAGAAATGGCTCTCCTCGCCTGTCCCCTTGTCCTTCTTCAGCCCCAGTGGCCCTGCCCCTGAGATCTCTCCGCTGGAAGTGCTCGACGGAGATTCCAAGGCCGTGCAGCTGCTCCTGTTACAGAAGGACTCTGCCCCTTTACCCTCGCCCAGCGGCCACTCACAGGCCAGCTGCTTCACCAACCAGGGCTACTTCTTCTTCCATCTGCCCAATGCCTTGGAGATCGAATCCTGCCAGGTGTACTTCACCTATGACCCCTGTGTGGAAGAGGAGGTGGAGGAGGATGGGTCAAGGCTGCCCGAGGGATCTCCCCACCCACCTCTGCTGCCTCTGGCTGGAGAACAGGATGACTACTGTGCCTTCCCGCCCAGGGATGACCTGCTGCTCTTCTCCCCGAGCCTCAGCACCCCCAACACTGCCTATGGGGGCAGCAGAGCCCCTGAAGAAAGATCTCCACTCTCCCTGCATGAGGGACTTCCCTCCCTAGCATCCCGTGACCTGATGGGCTTACAGCGCCCTCTGGAGCGGATGCCGGAAGGTGATGGAGAGGGGCTGTCTGCCAATAGCTCTGGGGAGCAGGCCAGTGTCCCAGAAGGCAACCTTCATGGGCAAGATCAGGACAGAGGCCAGGGCCCCATCCTGACCCTGAACACCGATGCCTATCTGTCTCTTCAAGAACTACAGGCCCAAGATTCAGTCCACCTAATATGA(SEQ ID NO:1) 2. 序列辨識編號：2--小鼠正交IL-2Rβ蛋白質序列： MATIALPWSLSLYVFLLLLATPWASAAVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSDFIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPADPMKEILPMSWLRYLLLVLGCFSGFFSCVYILVKCRYLGPWLKTVLKCHIPDPSEFFSQLSSQHGGDLQKWLSSPVPLSFFSPSGPAPEISPLEVLDGDSKAVQLLLLQKDSAPLPSPSGHSQASCFTNQGYFFFHLPNALEIESCQVYFTYDPCVEEEVEEDGSRLPEGSPHPPLLPLAGEQDDYCAFPPRDDLLLFSPSLSTPNTAYGGSRAPEERSPLSLHEGLPSLASRDLMGLQRPLERMPEGDGEGLSANSSGEQASVPEGNLHGQDQDRGQGPILTLNTDAYLSLQELQAQDSVHLI(SEQ ID NO:2) 上述小鼠正交IL-2Rβ受體(序列辨識編號：2)衍生自野生型突變IL-2Rβ受體，但含有相對於野生型突變IL2Rβ蛋白的胺基酸取代H134D和Y135F。 3. 序列辨識編號：3小鼠正交IL-2Rβ/IL-7受體嵌合編碼序列 ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGGAGCCTGTCCCTCTACGTCTTCCTCCTGCTCCTGGCTACACCTTGGGCATCTGCAGCAGTGAAAAACTGTTCCCATCTTGAATGCTTCTACAACTCAAGAGCCAATGTCTCTTGCATGTGGAGCCATGAAGAGGCTCTGAATGTCACAACCTGCCACGTCCATGCCAAGTCGAACCTGCGACACTGGAACAAAACCTGTGAGCTAACTCTTGTGAGGCAGGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGGTCGTTCCCAGAGTCCCAGTCACTGACCTCCGTGGACCTCCTTGACATAAATGTGGTGTGCTGGGAAGAGAAGGGTTGGCGTAGGGTAAAGACCTGCGACTTCCATCCCTTTGACAACCTTCGCCTGGTGGCCCCTCATTCCCTCCAAGTTCTGCACATTGATACCCAGAGATGTAACATAAGCTGGAAGGTCTCCCAGGTCTCTGACTTCATTGAACCATACTTGGAATTTGAGGCCCGTAGACGTCTTCTGGGCCACAGCTGGGAGGATGCATCCGTATTAAGCCTCAAGCAGAGACAGCAGTGGCTCTTCTTGGAGATGCTGATCCCTAGTACCTCATATGAGGTCCAGGTGAGGGTCAAAGCTCAACGAAACAATACCGGGACCTGGAGTCCCTGGAGCCAGCCCCTGACCTTTCGGACAAGGCCAGCAAAGAATCAAGGAGGATGGGATCCTGTCTTGCCAAGTGTCACCATTCTGAGTTTGTTCTCTGTGTTTTTGTTGGTCATCTTAGCCCATGTGCTATGGAAAAAAAGGATTAAACCTGTCGTATGGCCTAGTCTCCCCGATCATAAGAAAACTCTGGAACAACTATGTAAGAAGCCAAAAACGAGTCTGAATGTGAGTTTCAATCCCGAAAGTTTCCTGGACTGCCAGATTCATGAGGTGAAAGGCGTTGAAGCCAGGGACGAGGTGGAAAGTTTTCTGCCCAATGATCTTCCTGCACAGCCAGAGGAGTTGGAGACACAGGGACACAGAGCCGCTGTACACAGTGCAAACCGCTCGCCTGAGACTTCAGTCAGCCCACCAGAAACAGTTAGAAGAGAGTCACCCTTAAGATGCCTGGCTAGAAATCTGAGTACCTGCAATGCCCCTCCACTCCTTTCCTCTAGGTCCCCTGACTACAGAGATGGTGACAGAAATAGGCCTCCTGTGTATCAAGACTTGCTGCCAAACTCTGGAAACACAAATGTCCCTGTCCCTGTCCCTCAACCATTGCCTTTCCAGTCGGGAATCCTGATACCAGTTTCTCAGAGACAGCCCATCTCCACTTCCTCAGTACTGAATCAAGAAGAAGCGTATGTCACCATGTCTAGTTTTTACCAAAACAAATGA(SEQ ID NO:3) 4. 序列辨識編號：4小鼠正交IL-2Rβ/IL-7受體嵌合蛋白質序列： MATIALPWSLSLYVFLLLLATPWASAAVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSDFIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPAKNQGGWDPVLPSVTILSLFSVFLLVILAHVLWKKRIKPVVWPSLPDHKKTLEQLCKKPKTSLNVSFNPESFLDCQIHEVKGVEARDEVESFLPNDLPAQPEELETQGHRAAVHSANRSPETSVSPPETVRRESPLRCLARNLSTCNAPPLLSSRSPDYRDGDRNRPPVYQDLLPNSGNTNVPVPVPQPLPFQSGILIPVSQRQPISTSSVLNQEEAYVTMSSFYQNK (SEQ ID NO: 4) 該IL-2Rβ/IL-7正交嵌合受體(序列辨識編號：4)的殘基1-235衍生自正交IL-2Rβ(序列辨識編號：2)，而殘基236-462(帶下劃線)獲取自突變型IL-7R蛋白。 5. 序列辨識編號：5小鼠正交IL2Rb-IL7R末端(moRb-IL7Rtail)編碼序列 ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGGAGCCTGTCCCTCTACGTCTTCCTCCTGCTCCTGGCTACACCTTGGGCATCTGCAGCAGTGAAAAACTGTTCCCATCTTGAATGCTTCTACAACTCAAGAGCCAATGTCTCTTGCATGTGGAGCCATGAAGAGGCTCTGAATGTCACAACCTGCCACGTCCATGCCAAGTCGAACCTGCGACACTGGAACAAAACCTGTGAGCTAACTCTTGTGAGGCAGGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGGTCGTTCCCAGAGTCCCAGTCACTGACCTCCGTGGACCTCCTTGACATAAATGTGGTGTGCTGGGAAGAGAAGGGTTGGCGTAGGGTAAAGACCTGCGACTTCCATCCCTTTGACAACCTTCGCCTGGTGGCCCCTCATTCCCTCCAAGTTCTGCACATTGATACCCAGAGATGTAACATAAGCTGGAAGGTCTCCCAGGTCTCTGACTTCATTGAACCATACTTGGAATTTGAGGCCCGTAGACGTCTTCTGGGCCACAGCTGGGAGGATGCATCCGTATTAAGCCTCAAGCAGAGACAGCAGTGGCTCTTCTTGGAGATGCTGATCCCTAGTACCTCATATGAGGTCCAGGTGAGGGTCAAAGCTCAACGAAACAATACCGGGACCTGGAGTCCCTGGAGCCAGCCCCTGACCTTTCGGACAAGGCCAGCAGATCCCATGAAGGAGATCCTCCCCATGTCATGGCTCAGATACCTTCTGCTGGTCCTTGGTTGTTTTTCTGGCTTCTTCTCCTGCGTCTACATTTTGGTCAAGTGCCGGTACCTTGGGCCATGGCTGAAGACAGTTCTCAAGTGCCACATCCCAGATCCTTCTGAGTTCTTCTCCCAGCTGAGCTCCCAGCATGGGGGAGACCTTCAGAAATGGCTCTCCTCGCCTGTCCCCTTGTCCTTCTTCAGCCCCAGTGGCCCTGCCCCTGAGATCTCTCCGCTGGAAGTGCTCGACGGAGATTCCAAGGCCGTGCAGCTGCTCCTGTTACAGAAGGACTCTGCCCCTTTACCCTCGCCCAGCGGCCACTCACAGGCCAGCTGCTTCACCAACCAGGGCTACTTCTTCTTCCATCTGCCCAATGCCTTGGAGATCGAATCCTGCCAGGTGTACTTCACCTATGACCCCTGTGTGGAAGAGGAGGTGGAGGAGGATGGGTCAAGGCTGCCCGAGGGATCTCCCCACCCACCTCTGCTGCCTCTGGCTGGAGAACAGGATGACTACTGTGCCTTCCCGCCCAGGGATGACCTGCTGCTCTTCTCCCCGAGCCTCAGCACCCCCAACACTGCCTATGGGGGCAGCAGAGCCCCTGAAGAAAGATCTCCACTCTCCCTGCATGAGGGACTTCCCTCCCTAGCATCCCGTGACCTGATGGGCTTACAGCGCCCTCTGGAGCGGATGCCGGAAGGTGATGGAGAGGGGCTGTCTGCCAATAGCTCTGGGGAGCAGGCCAGTGTCCCAGAAGGCAACCTTCATGGGCAAGATCAGGACAGAGGCCAGGGCCCCATCCTGACCCTGAATCAAGAAGAAGCGTATGTCACCATGTCTAGTTTTTACCAAAACAAATGA(SEQ ID NO: 5) 6. 序列辨識編號：6小鼠正交IL2Rb-IL7R末端(moRb-IL7Rtail)蛋白質序列： MATIALPWSLSLYVFLLLLATPWASAAVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSDFIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPADPMKEILPMSWLRYLLLVLGCFSGFFSCVYILVKCRYLGPWLKTVLKCHIPDPSEFFSQLSSQHGGDLQKWLSSPVPLSFFSPSGPAPEISPLEVLDGDSKAVQLLLLQKDSAPLPSPSGHSQASCFTNQGYFFFHLPNALEIESCQVYFTYDPCVEEEVEEDGSRLPEGSPHPPLLPLAGEQDDYCAFPPRDDLLLFSPSLSTPNTAYGGSRAPEERSPLSLHEGLPSLASRDLMGLQRPLERMPEGDGEGLSANSSGEQASVPEGNLHGQDQDRGQGPILTLNQEEAYVTMSSFYQNK (SEQ ID NO: 6) 該moRb-IL7Rtail嵌合正交受體(序列辨識編號：6)的殘基1-520衍生自正交IL-2Rβ(序列辨識編號：2)，而moRb -IL7Rtail(序列辨識編號：6)的殘基521-535(帶下劃線)衍生自小鼠IL-7R蛋白。 7. 序列辨識編號：7小鼠正交IL2Rβ-IL9R嵌合體(moRb-IL9R)編碼序列 ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGGAGCCTGTCCCTCTACGTCTTCCTCCTGCTCCTGGCTACACCTTGGGCATCTGCAGCAGTGAAAAACTGTTCCCATCTTGAATGCTTCTACAACTCAAGAGCCAATGTCTCTTGCATGTGGAGCCATGAAGAGGCTCTGAATGTCACAACCTGCCACGTCCATGCCAAGTCGAACCTGCGACACTGGAACAAAACCTGTGAGCTAACTCTTGTGAGGCAGGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGGTCGTTCCCAGAGTCCCAGTCACTGACCTCCGTGGACCTCCTTGACATAAATGTGGTGTGCTGGGAAGAGAAGGGTTGGCGTAGGGTAAAGACCTGCGACTTCCATCCCTTTGACAACCTTCGCCTGGTGGCCCCTCATTCCCTCCAAGTTCTGCACATTGATACCCAGAGATGTAACATAAGCTGGAAGGTCTCCCAGGTCTCTGACTTCATTGAACCATACTTGGAATTTGAGGCCCGTAGACGTCTTCTGGGCCACAGCTGGGAGGATGCATCCGTATTAAGCCTCAAGCAGAGACAGCAGTGGCTCTTCTTGGAGATGCTGATCCCTAGTACCTCATATGAGGTCCAGGTGAGGGTCAAAGCTCAACGAAACAATACCGGGACCTGGAGTCCCTGGAGCCAGCCCCTGACCTTTCGGACAAGGCCAGCACAGAGGAGACAGGGCCTCCTGGTCCCACGCTGGCAATGGTCAGCCAGCATCCTTGTAGTTGTGCCCATCTTTCTTCTGCTGACTGGCTTTGTCCACCTTCTGTTCAAGCTGTCACCCAGGCTGAAGAGAATCTTTTACCAGAACATTCCATCTCCCGAGGCGTTCTTCCATCCTCTCTACAGTGTGTACCATGGGGACTTCCAGAGTTGGACAGGGGCCCGCAGAGCCGGACCACAAGCAAGACAGAATGGTGTCAGTACTTCATCAGCAGGCTCAGAGTCCAGCATCTGGGAGGCCGTCGCCACACTCACCTATAGCCCGGCATGCCCTGTGCAGTTTGCCTGCCTGAAGTGGGAGGCCACAGCCCCGGGCTTCCCAGGGCTCCCAGGCTCAGAGCATGTGCTGCCGGCAGGGTGTCTGGAGTTGGAAGGACAGCCATCTGCCTACCTGCCCCAGGAGGACTGGGCCCCACTGGGCTCTGCCAGGCCCCCTCCTCCAGACTCAGACAGCGGCAGCAGCGACTATTGCATGTTGGACTGCTGTGAGGAATGCCACCTCTCAGCCTTCCCAGGACACACCGAGAGTCCTGAGCTCACGCTAGCTCAGCCTGTGGCCCTTCCTGTGTCCAGCAGGGCCTGA (SEQ ID NO: 7) 8. 序列辨識編號：8小鼠正交IL2Rβ-IL9R嵌合體(moRb-IL9R)蛋白質序列： MATIALPWSLSLYVFLLLLATPWASAAVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSDFIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPAQRRQGLLVPRWQWSASILVVVPIFLLLTGFVHLLFKLSPRLKRIFYQNIPSPEAFFHPLYSVYHGDFQSWTGARRAGPQARQNGVSTSSAGSESSIWEAVATLTYSPACPVQFACLKWEATAPGFPGLPGSEHVLPAGCLELEGQPSAYLPQEDWAPLGSARPPPPDSDSGSSDYCMLDCCEECHLSAFPGHTESPELTLAQPVALPVSSRA (SEQ ID NO:8) moRb-IL9R嵌合正交受體(序列辨識編號：8)的殘基1-235衍生自正交IL-2Rβ(序列辨識編號：2)，而moRb-IL9R (序列辨識編號：8)的殘基236-447(帶下劃線)衍生自小鼠IL-9R。 9. 序列辨識編號：9小鼠正交IL2Rβ-IL21R嵌合體(moRb-IL21R)編碼序列 ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGGAGCCTGTCCCTCTACGTCTTCCTCCTGCTCCTGGCTACACCTTGGGCATCTGCAGCAGTGAAAAACTGTTCCCATCTTGAATGCTTCTACAACTCAAGAGCCAATGTCTCTTGCATGTGGAGCCATGAAGAGGCTCTGAATGTCACAACCTGCCACGTCCATGCCAAGTCGAACCTGCGACACTGGAACAAAACCTGTGAGCTAACTCTTGTGAGGCAGGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGGTCGTTCCCAGAGTCCCAGTCACTGACCTCCGTGGACCTCCTTGACATAAATGTGGTGTGCTGGGAAGAGAAGGGTTGGCGTAGGGTAAAGACCTGCGACTTCCATCCCTTTGACAACCTTCGCCTGGTGGCCCCTCATTCCCTCCAAGTTCTGCACATTGATACCCAGAGATGTAACATAAGCTGGAAGGTCTCCCAGGTCTCTGACTTCATTGAACCATACTTGGAATTTGAGGCCCGTAGACGTCTTCTGGGCCACAGCTGGGAGGATGCATCCGTATTAAGCCTCAAGCAGAGACAGCAGTGGCTCTTCTTGGAGATGCTGATCCCTAGTACCTCATATGAGGTCCAGGTGAGGGTCAAAGCTCAACGAAACAATACCGGGACCTGGAGTCCCTGGAGCCAGCCCCTGACCTTTCGGACAAGACCTGCTGGCGAACCTGAAGCTGGATGGGACCCTCATATGTTGCTGCTGCTGGCCGTGCTGATCATCGTGCTGGTGTTCATGGGCCTGAAGATCCATCTGCCTTGGAGACTGTGGAAGAAAATCTGGGCCCCTGTGCCTACTCCTGAGAGCTTCTTCCAGCCACTGTACAGAGAGCACAGCGGCAACTTCAAGAAATGGGTCAACACCCCTTTCACCGCCAGCAGTATCGAGCTGGTGCCTCAGAGCAGCACCACAACATCTGCCCTGCACCTGTCTCTGTACCCCGCCAAAGAGAAGAAGTTCCCTGGCCTGCCTGGACTGGAAGAACAGCTGGAATGTGACGGCATGAGCGAGCCTGGCCACTGGTGTATCATTCCTCTGGCTGCTGGACAGGCCGTGTCCGCCTATAGCGAGGAAAGAGACAGACCCTACGGCCTGGTGTCCATCGACACAGTGACAGTGGGAGATGCCGAGGGCCTGTGTGTGTGGCCTTGTAGCTGTGAAGATGACGGCTACCCTGCCATGAACCTGGATGCCGGAAGAGAGAGCGGCCCTAACTCTGAGGATCTGCTGCTCGTGACCGATCCTGCCTTCCTGTCTTGCGGCTGTGTGTCTGGATCTGGCCTGAGACTCGGAGGCTCTCCTGGAAGCCTGCTGGATAGACTGAGACTGAGCTTCGCCAAAGAAGGCGACTGGACCGCCGATCCTACTTGGAGAACAGGATCTCCTGGCGGCGGAAGCGAATCTGAAGCAGGTTCTCCACCTGGCCTGGACATGGACACATTCGACTCTGGCTTCGCCGGCAGCGATTGTGGAAGCCCTGTGGAAACAGACGAGGGCCCACCTAGAAGCTACCTGAGACAGTGGGTCGTGCGGACACCTCCTCCAGTTGATTCTGGCGCCCAGTCCTCTTGA(SEQ ID NO:9) 10. 序列辨識編號：10小鼠正交IL2Rβ-IL21R嵌合體(moRb-IL21R)蛋白質序列： MATIALPWSLSLYVFLLLLATPWASAAVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSDFIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPAGEPEAGWDPHMLLLLAVLIIVLVFMGLKIHLPWRLWKKIWAPVPTPESFFQPLYREHSGNFKKWVNTPFTASSIELVPQSSTTTSALHLSLYPAKEKKFPGLPGLEEQLECDGMSEPGHWCIIPLAAGQAVSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVGDAEGLCVWPCSCEDDGYPAMNLDAGRESGPNSEDLLLVTDPAFLSCGCVSGSGLRLGGSPGSLLDRLRLSFAKEGDWTADPTWRTGSPGGGSESEAGSPPGLDMDTFDSGFAGSDCGSPVETDEGPPRSYLRQWVVRTPPPVDSGAQSS (SEQ ID NO:10) moRb-IL21R嵌合正交受體(序列辨識編號：10)的殘基1-235衍生自IL-2Rβ(序列辨識編號：2)，而moRb-IL21R嵌合正交受體的殘基236-537(帶下劃線)衍生自小鼠IL-21R。 11. 序列辨識編號：11小鼠正交IL2Rβ-EpoR(moRb-EpoR)編碼序列： ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGGAGCCTGTCCCTCTACGTCTTCCTCCTGCTCCTGGCTACACCTTGGGCATCTGCAGCAGTGAAAAACTGTTCCCATCTTGAATGCTTCTACAACTCAAGAGCCAATGTCTCTTGCATGTGGAGCCATGAAGAGGCTCTGAATGTCACAACCTGCCACGTCCATGCCAAGTCGAACCTGCGACACTGGAACAAAACCTGTGAGCTAACTCTTGTGAGGCAGGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGGTCGTTCCCAGAGTCCCAGTCACTGACCTCCGTGGACCTCCTTGACATAAATGTGGTGTGCTGGGAAGAGAAGGGTTGGCGTAGGGTAAAGACCTGCGACTTCCATCCCTTTGACAACCTTCGCCTGGTGGCCCCTCATTCCCTCCAAGTTCTGCACATTGATACCCAGAGATGTAACATAAGCTGGAAGGTCTCCCAGGTCTCTGACTTCATTGAACCATACTTGGAATTTGAGGCCCGTAGACGTCTTCTGGGCCACAGCTGGGAGGATGCATCCGTATTAAGCCTCAAGCAGAGACAGCAGTGGCTCTTCTTGGAGATGCTGATCCCTAGTACCTCATATGAGGTCCAGGTGAGGGTCAAAGCTCAACGAAACAATACCGGGACCTGGAGTCCCTGGAGCCAGCCCCTGACCTTTCGGACAAGGCCAGCAAGCGATCTGGACCCTCTGATCCTGACACTGAGCCTGATCCTGGTGCTGATCTCCCTGCTGCTGACAGTGCTGGCCCTGCTGAGCCACAGAAGAACCCTGCAGCAGAAGATCTGGCCTGGCATCCCATCTCCAGAGAGCGAGTTCGAGGGCCTGTTCACCACACACAAGGGCAACTTCCAGCTGTGGCTGCTGCAGCGAGATGGCTGTCTTTGGTGGTCCCCTGGCAGCAGCTTTCCTGAGGATCCACCAGCTCACCTGGAAGTGCTGAGCGAGCCTAGATGGGCTGTTACACAGGCTGGCGATCCTGGCGCCGATGATGAAGGACCTCTGCTGGAACCTGTGGGCTCTGAACATGCCCAGGACACCTATCTGGTGCTGGACAAGTGGCTGCTCCCCAGAACACCCTGTAGCGAGAATCTGTCTGGCCCTGGCGGATCCGTGGATCCCGTGACAATGGATGAGGCCAGCGAGACAAGCAGCTGCCCTTCTGATCTGGCCAGCAAGCCTAGACCTGAGGGCACAAGCCCTAGCAGCTTCGAGTACACCATTCTGGACCCCAGCAGCCAGCTGCTGTGTCCTAGAGCACTGCCTCCAGAGCTGCCTCCTACACCTCCTCACCTGAAGTACCTGTACCTGGTGGTGTCCGACAGCGGCATCAGCACCGATTATAGCTCTGGTGGCTCTCAGGGCGTGCACGGCGATAGTTCTGATGGCCCTTACTCTCACCCCTACGAAAACAGCCTGGTGCCTGACAGCGAACCTCTGCACCCTGGATACGTGGCCTGTAGCTAA (SEQ ID NO:11) 12. 序列辨識編號：12小鼠正交IL2Rβ-EpoR(moRb-EpoR)蛋白質序列： MATIALPWSLSLYVFLLLLATPWASAAVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSDFIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPASDLDPLILTLSLILVLISLLLTVLALLSHRRTLQQKIWPGIPSPESEFEGLFTTHKGNFQLWLLQRDGCLWWSPGSSFPEDPPAHLEVLSEPRWAVTQAGDPGADDEGPLLEPVGSEHAQDTYLVLDKWLLPRTPCSENLSGPGGSVDPVTMDEASETSSCPSDLASKPRPEGTSPSSFEYTILDPSSQLLCPRALPPELPPTPPHLKYLYLVVSDSGISTDYSSGGSQGVHGDSSDGPYSHPYENSLVPDSEPLHPGYVACS (SEQ ID NO:11) moRb-EpoR嵌合正交受體(序列辨識編號：11)的殘基1-235衍生自正交IL-2Rβ(序列辨識編號：2)，而moRb-EpoR(序列辨識編號：11)的殘基236-498(帶下劃線)衍生自小鼠EpoR。 13. 序列辨識編號：13小鼠正交IL2Rb-EpoR(ITIM YF) (moRb-EpoR(YF)編碼序列 ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGGAGCCTGTCCCTCTACGTCTTCCTCCTGCTCCTGGCTACACCTTGGGCATCTGCAGCAGTGAAAAACTGTTCCCATCTTGAATGCTTCTACAACTCAAGAGCCAATGTCTCTTGCATGTGGAGCCATGAAGAGGCTCTGAATGTCACAACCTGCCACGTCCATGCCAAGTCGAACCTGCGACACTGGAACAAAACCTGTGAGCTAACTCTTGTGAGGCAGGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGGTCGTTCCCAGAGTCCCAGTCACTGACCTCCGTGGACCTCCTTGACATAAATGTGGTGTGCTGGGAAGAGAAGGGTTGGCGTAGGGTAAAGACCTGCGACTTCCATCCCTTTGACAACCTTCGCCTGGTGGCCCCTCATTCCCTCCAAGTTCTGCACATTGATACCCAGAGATGTAACATAAGCTGGAAGGTCTCCCAGGTCTCTGACTTCATTGAACCATACTTGGAATTTGAGGCCCGTAGACGTCTTCTGGGCCACAGCTGGGAGGATGCATCCGTATTAAGCCTCAAGCAGAGACAGCAGTGGCTCTTCTTGGAGATGCTGATCCCTAGTACCTCATATGAGGTCCAGGTGAGGGTCAAAGCTCAACGAAACAATACCGGGACCTGGAGTCCCTGGAGCCAGCCCCTGACCTTTCGGACAAGGCCAGCAAGCGATCTGGACCCTCTGATCCTGACACTGAGCCTGATCCTGGTGCTGATCTCCCTGCTGCTGACAGTGCTGGCTCTGCTGAGCCACAGAAGAACCCTGCAGCAGAAGATCTGGCCTGGCATCCCATCTCCAGAGAGCGAGTTCGAGGGCCTGTTCACCACACACAAGGGCAACTTCCAGCTGTGGCTGCTGCAGCGAGATGGCTGTCTTTGGTGGTCCCCTGGCTCTAGCTTTCCTGAGGACCCTCCTGCTCACCTGGAAGTGCTGTCTGAGCCTAGATGGGCCGTTACACAGGCTGGCGATCCAGGCGCTGATGATGAAGGACCTCTGCTGGAACCTGTGGGCTCTGAGCACGCTCAGGACACCTATCTGGTGCTGGACAAGTGGCTGCTCCCCAGAACACCTTGCTCCGAGAACCTTTCTGGCCCTGGCGGATCTGTGGACCCTGTGACAATGGACGAGGCCAGCGAGACAAGCAGCTGTCCTTCTGACCTGGCCAGCAAGCCTAGACCTGAGGGCACAAGCCCTAGCAGCTTCGAGTACACCATTCTGGACCCCAGCAGCCAGCTGCTGTGTCCTAGAGCACTGCCTCCAGAGCTGCCTCCTACACCTCCTCACCTGAAGTTTCTGTTTCTGGTGGTGTCCGACAGCGGCATCAGCACCGATTATAGCTCTGGTGGCTCTCAGGGCGTGCACGGCGATAGTTCTGATGGCCCTTACTCTCACCCCTACGAAAACAGCCTGGTGCCTGACAGCGAGCCTCTGCACCCTGGATATGTGGCCTGTAGCTGA 14. 序列辨識編號：14小鼠正交IL2Rb-EpoR(ITIM YF) (moRb-EpoR(YF)蛋白質序列 MATIALPWSLSLYVFLLLLATPWASAAVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSDFIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPASDLDPLILTLSLILVLISLLLTVLALLSHRRTLQQKIWPGIPSPESEFEGLFTTHKGNFQLWLLQRDGCLWWSPGSSFPEDPPAHLEVLSEPRWAVTQAGDPGADDEGPLLEPVGSEHAQDTYLVLDKWLLPRTPCSENLSGPGGSVDPVTMDEASETSSCPSDLASKPRPEGTSPSSFEYTILDPSSQLLCPRALPPELPPTPPHLKF LF LVVSDSGISTDYSSGGSQGVHGDSSDGPYSHPYENSLVPDSEPLHPGYVACS (SEQ ID NO:14) 該moRb-EpoR(YF)嵌合正交受體(序列辨識編號：14)的殘基1-235衍生自小鼠正交IL-2Rβ(序列辨識編號：2)，而moRb-EpoR(YF(序列辨識編號：14)的殘基236-498(帶下劃線)衍生自具有兩個Phe(「F」)殘基取代(用粗體標示)的小鼠EpoR。B. 正交 Rb(hoRb) 受體序列 1. 序列辨識編號：15人正交IL2Rb(hoRb)編碼序列 ATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCgACTtCTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAGCCCTTGGGAAGGACACCATTCCGTGGCTCGGCCACCTCCTCGTGGGTCTCAGCGGGGCTTTTGGCTTCATCATCTTAGTGTACTTGCTGATCAACTGCAGGAACACCGGGCCATGGCTGAAGAAGGTCCTGAAGTGTAACACCCCAGACCCCTCGAAGTTCTTTTCCCAGCTGAGCTCAGAGCATGGAGGAGACGTCCAGAAGTGGCTCTCTTCGCCCTTCCCCTCATCGTCCTTCAGCCCTGGCGGCCTGGCACCTGAGATCTCGCCACTAGAAGTGCTGGAGAGGGACAAGGTGACGCAGCTGCTCCTGCAGCAGGACAAGGTGCCTGAGCCCGCATCCTTAAGCAGCAACCACTCGCTGACCAGCTGCTTCACCAACCAGGGTTACTTCTTCTTCCACCTCCCGGATGCCTTGGAGATAGAGGCCTGCCAGGTGTACTTTACTTACGACCCCTACTCAGAGGAAGACCCTGATGAGGGTGTGGCCGGGGCACCCACAGGGTCTTCCCCCCAACCCCTGCAGCCTCTGTCAGGGGAGGACGACGCCTACTGCACCTTCCCCTCCAGGGATGACCTGCTGCTCTTCTCCCCCAGTCTCCTCGGTGGCCCCAGCCCCCCAAGCACTGCCCCTGGGGGCAGTGGGGCCGGTGAAGAGAGGATGCCCCCTTCTTTGCAAGAAAGAGTCCCCAGAGACTGGGACCCCCAGCCCCTGGGGCCTCCCACCCCAGGAGTCCCAGACCTGGTGGATTTTCAGCCACCCCCTGAGCTGGTGCTGCGAGAGGCTGGGGAGGAGGTCCCTGACGCTGGCCCCAGGGAGGGAGTCAGTTTCCCCTGGTCCAGGCCTCCTGGGCAGGGGGAGTTCAGGGCCCTTAATGCTCGCCTGCCCCTGAACACTGATGCCTACTTGTCCCTCCAAGAACTCCAGGGTCAGGACCCAACTCACTTGGTGTAG(SEQ ID NO: 15) 2. 序列辨識編號：16人正交IL2Rb(hoRb)蛋白質序列： MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV(SEQ ID NO: 16) 該hoRb正交受體蛋白(序列辨識編號：16)對應於野生型人IL2Rβ(hCD122)蛋白，但含有相對於野生型hCD122蛋白的胺基酸取代H133D和Y134F。 3. 序列辨識編號：17人正交IL2Rb-IL7(hoRb-IL7R)編碼序列 ATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCgACTtCTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAAATAATAGCTCAGGGGAGATGGATCCTATCTTACTAACCATCAGCATTTTGAGTTTTTTCTCTGTCGCTCTGTTGGTCATCTTGGCCTGTGTGTTATGGAAAAAAAGGATTAAGCCTATCGTATGGCCCAGTCTCCCCGATCATAAGAAGACTCTGGAACATCTTTGTAAGAAACCAAGAAAAAATTTAAATGTGAGTTTCAATCCTGAAAGTTTCCTGGACTGCCAGATTCATAGGGTGGATGACATTCAAGCTAGAGATGAAGTGGAAGGTTTTCTGCAAGATACGTTTCCTCAGCAACTAGAAGAATCTGAGAAGCAGAGGCTTGGAGGGGATGTGCAGAGCCCCAACTGCCCATCTGAGGATGTAGTCATCACTCCAGAAAGCTTTGGAAGAGATTCATCCCTCACATGCCTGGCTGGGAATGTCAGTGCATGTGACGCCCCTATTCTCTCCTCTTCCAGGTCCCTAGACTGCAGGGAGAGTGGCAAGAATGGGCCTCATGTGTACCAGGACCTCCTGCTTAGCCTTGGGACTACAAACAGCACGCTGCCCCCTCCATTTTCTCTCCAATCTGGAATCCTGACATTGAACCCAGTTGCTCAGGGTCAGCCCATTCTTACTTCCCTGGGATCAAATCAAGAAGAAGCATATGTCACCATGTCCAGCTTCTACCAAAACCAGTGA (SEQ ID NO:17) 4. 序列辨識編號：18人正交IL2Rb-IL7(hoRb-IL7R)蛋白質序列： MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPANNSSGEMDPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO:18) 該hoRb-IL7R嵌合正交受體(序列辨識編號：18)的殘基1-234衍生自人正交IL-2Rβ(序列辨識編號：16)，且該 hoRb-IL7R嵌合正交受體的殘基235-462(帶下劃線)衍生自人IL-7R。 5. 序列辨識編號：19人正交IL2Rb-IL7Rtail(hoRb-IL7Rtail)編碼序列： ATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCgACTtCTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAGCCCTTGGGAAGGACACCATTCCGTGGCTCGGCCACCTCCTCGTGGGTCTCAGCGGGGCTTTTGGCTTCATCATCTTAGTGTACTTGCTGATCAACTGCAGGAACACCGGGCCATGGCTGAAGAAGGTCCTGAAGTGTAACACCCCAGACCCCTCGAAGTTCTTTTCCCAGCTGAGCTCAGAGCATGGAGGAGACGTCCAGAAGTGGCTCTCTTCGCCCTTCCCCTCATCGTCCTTCAGCCCTGGCGGCCTGGCACCTGAGATCTCGCCACTAGAAGTGCTGGAGAGGGACAAGGTGACGCAGCTGCTCCTGCAGCAGGACAAGGTGCCTGAGCCCGCATCCTTAAGCAGCAACCACTCGCTGACCAGCTGCTTCACCAACCAGGGTTACTTCTTCTTCCACCTCCCGGATGCCTTGGAGATAGAGGCCTGCCAGGTGTACTTTACTTACGACCCCTACTCAGAGGAAGACCCTGATGAGGGTGTGGCCGGGGCACCCACAGGGTCTTCCCCCCAACCCCTGCAGCCTCTGTCAGGGGAGGACGACGCCTACTGCACCTTCCCCTCCAGGGATGACCTGCTGCTCTTCTCCCCCAGTCTCCTCGGTGGCCCCAGCCCCCCAAGCACTGCCCCTGGGGGCAGTGGGGCCGGTGAAGAGAGGATGCCCCCTTCTTTGCAAGAAAGAGTCCCCAGAGACTGGGACCCCCAGCCCCTGGGGCCTCCCACCCCAGGAGTCCCAGACCTGGTGGATTTTCAGCCACCCCCTGAGCTGGTGCTGCGAGAGGCTGGGGAGGAGGTCCCTGACGCTGGCCCCAGGGAGGGAGTCAGTTTCCCCTGGTCCAGGCCTCCTGGGCAGGGGGAGTTCAGGGCCCTTAATGCTCGCCTGCCCCTGAACCAAGAAGAAGCATATGTCACCATGTCCAGCTTCTACCAAAACCAGTGA(SEQ ID NO:19) 6. 序列辨識編號：20人正交IL2Rb-IL7Rtail(hoRb-IL7Rtail)蛋白質序列： MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO:20) 該hoRb-IL7Rtail嵌合正交受體(序列辨識編號：20)的殘基1-532衍生自人正交IL-2Rβ(序列辨識編號：16)，且該hoRb-IL7Rtail(序列辨識編號：20)的殘基533-547(帶下劃線)衍生自人IL-7R。 7. 序列辨識編號：21人正交IL2Rb-IL9R (hoRb-IL9R)編碼序列： ATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCgACTtCTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCACAGAGACAAGGCCCTCTGATCCCACCCTGGGGGTGGCCAGGCAACACCCTTGTTGCTGTGTCCATCTTTCTCCTGCTGACTGGCCCGACCTACCTCCTGTTCAAGCTGTCGCCCAGGGTGAAGAGAATCTTCTACCAGAACGTGCCCTCTCCAGCGATGTTCTTCCAGCCCCTCTACAGTGTACACAATGGGAACTTCCAGACTTGGATGGGGGCCCACGGGGCCGGTGTGCTGTTGAGCCAGGACTGTGCTGGCACCCCACAGGGAGCCTTGGAGCCCTGCGTCCAGGAGGCCACTGCACTGCTCACTTGTGGCCCAGCGCGTCCTTGGAAATCTGTGGCCCTGGAGGAGGAACAGGAGGGCCCTGGGACCAGGCTCCCGGGGAACCTGAGCTCAGAGGATGTGCTGCCAGCAGGGTGTACGGAGTGGAGGGTACAGACGCTTGCCTATCTGCCACAGGAGGACTGGGCCCCCACGTCCCTGACTAGGCCGGCTCCCCCAGACTCAGAGGGCAGCAGGAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAACAACAACTACTGTGCCTTGGGCTGCTATGGGGGATGGCACCTCTCAGCCCTCCCAGGAAACACACAGAGCTCTGGGCCCATCCCAGCCCTGGCCTGTGGCCTTTCTTGTGACCATCAGGGCCTGGAGACCCAGCAAGGAGTTGCCTGGGTGCTGGCTGGTCACTGCCAGAGGCCTGGGCTGCATGAGGACCTCCAGGGCATGTTGCTCCCTTCTGTCCTCAGCAAGGCTCGGTCCTGGACATTCTA 8. 序列辨識編號：22人正交IL2Rb-IL9R(hoRb-IL9R)蛋白質序列： MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAQRQGPLIPPWGWPGNTLVAVSIFLLLTGPTYLLFKLSPRVKRIFYQNVPSPAMFFQPLYSVHNGNFQTWMGAHGAGVLLSQDCAGTPQGALEPCVQEATALLTCGPARPWKSVALEEEQEGPGTRLPGNLSSEDVLPAGCTEWRVQTLAYLPQEDWAPTSLTRPAPPDSEGSRSSSSSSSSNNNNYCALGCYGGWHLSALPGNTQSSGPIPALACGLSCDHQGLETQQGVAWVLAGHCQRPGLHEDLQGMLLPSVLSKARSWTF 該嵌合正交受體hoRb-IL9R(序列辨識編號：22)的殘基1-234衍生自人正交IL-2Rβ(序列辨識編號：16)，且hoRb-IL9R的殘基235-498(帶下劃線)衍生自人IL-9R。 9. 序列辨識編號：23人正交IL2Rb-IL21R(hoRb-IL21R)編碼序列 ATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCgACTtCTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAGAGGAGTTAAAGGAAGGCTGGAACCCTCACCTGCTGCTTCTCCTCCTGCTTGTCATAGTCTTCATTCCTGCCTTCTGGAGCCTGAAGACCCATCCATTGTGGAGGCTATGGAAGAAGATATGGGCCGTCCCCAGCCCTGAGCGGTTCTTCATGCCCCTGTACAAGGGCTGCAGCGGAGACTTCAAGAAATGGGTGGGTGCACCCTTCACTGGCTCCAGCCTGGAGCTGGGACCCTGGAGCCCAGAGGTGCCCTCCACCCTGGAGGTGTACAGCTGCCACCCACCACGGAGCCCGGCCAAGAGGCTGCAGCTCACGGAGCTACAAGAACCAGCAGAGCTGGTGGAGTCTGACGGTGTGCCCAAGCCCAGCTTCTGGCCGACAGCCCAGAACTCGGGGGGCTCAGCTTACAGTGAGGAGAGGGATCGGCCATACGGCCTGGTGTCCATTGACACAGTGACTGTGCTAGATGCAGAGGGGCCATGCACCTGGCCCTGCAGCTGTGAGGATGACGGCTACCCAGCCCTGGACCTGGATGCTGGCCTGGAGCCCAGCCCAGGCCTAGAGGACCCACTCTTGGATGCAGGGACCACAGTCCTGTCCTGTGGCTGTGTCTCAGCTGGCAGCCCTGGGCTAGGAGGGCCCCTGGGAAGCCTCCTGGACAGACTAAAGCCACCCCTTGCAGATGGGGAGGACTGGGCTGGGGGACTGCCCTGGGGTGGCCGGTCACCTGGAGGGGTCTCAGAGAGTGAGGCGGGCTCACCCCTGGCCGGCCTGGATATGGACACGTTTGACAGTGGCTTTGTGGGCTCTGACTGCAGCAGCCCTGTGGAGTGTGACTTCACCAGCCCCGGGGACGAAGGACCCCCCCGGAGCTACCTCCGCCAGTGGGTGGTCATTCCTCCGCCACTTTCGAGCCCTGGACCCCAGGCCAGCTAA(SEQ ID NO:23) 10. 序列辨識編號：24人正交IL2Rb-IL21R(hoRb-IL21R)蛋白質序列： MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAEELKEGWNPHLLLLLLLVIVFIPAFWSLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS (SEQ ID NO:24) 該hoRb-IL21R嵌合正交受體(序列辨識編號：24)的殘基1-234衍生自人正交IL-2Rβ(序列辨識編號：16)，且hoRb-IL21R的殘基235-545(帶下劃線)衍生自人IL-21R 11. 序列辨識編號：25人正交IL2Rb-EpoR(hoRb-EpoR)編碼序列 ATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCgACTtCTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAAGCGACCTGGACCCCCTCATCCTGACGCTCTCCCTCATCCTCGTGGTCATCCTGGTGCTGCTGACCGTGCTCGCGCTGCTCTCCCACCGCCGGGCTCTGAAGCAGAAGATCTGGCCTGGCATCCCGAGCCCAGAGAGCGAGTTTGAAGGCCTCTTCACCACCCACAAGGGTAACTTCCAGCTGTGGCTGTACCAGAATGATGGCTGCCTGTGGTGGAGCCCCTGCACCCCCTTCACGGAGGACCCACCTGCTTCCCTGGAAGTCCTCTCAGAGCGCTGCTGGGGGACGATGCAGGCAGTGGAGCCGGGGACAGATGATGAGGGCCCCCTGCTGGAGCCAGTGGGCAGTGAGCATGCCCAGGATACCTATCTGGTGCTGGACAAATGGTTGCTGCCCCGGAACCCGCCCAGTGAGGACCTCCCAGGGCCTGGTGGCAGTGTGGACATAGTGGCCATGGATGAAGGCTCAGAAGCATCCTCCTGCTCATCTGCTTTGGCCTCGAAGCCCAGCCCAGAGGGAGCCTCTGCTGCCAGCTTTGAGTACACTATCCTGGACCCCAGCTCCCAGCTCTTGCGTCCATGGACACTGTGCCCTGAGCTGCCCCCTACCCCACCCCACCTAAAGTACCTGTACCTTGTGGTATCTGACTCTGGCATCTCAACTGACTACAGCTCAGGGGACTCCCAGGGAGCCCAAGGGGGCTTATCCGATGGCCCCTACTCCAACCCTTATGAGAACAGCCTTATCCCAGCCGCTGAGCCTCTGCCCCCCAGCTATGTGGCTTGCTCTTAG(SEQ ID NO:25) 12. 序列辨識編號：26人正交IL2Rb-EpoR(hoRb-EpoR)蛋白質序列 MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPASDLDPLILTLSLILVVILVLLTVLALLSHRRALKQKIWPGIPSPESEFEGLFTTHKGNFQLWLYQNDGCLWWSPCTPFTEDPPASLEVLSERCWGTMQAVEPGTDDEGPLLEPVGSEHAQDTYLVLDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIVAMDEGSEASSCSSALASKPSPEGASAASFEYTILDPSSQLLRPWTLCPELPPTPPHLKYLYLVVSDSGISTDYSSGDSQGAQGGLSDGPYSNPYENSLIPAAEPLPPSYVACS (SEQ ID NO:26) 該hoRb-EpoR嵌合正交受體(序列辨識編號：26)的殘基1-234衍生自人正交IL-2Rβ(序列辨識編號：16)，且hoRb-EpoR的殘基235-497(帶下劃線)衍生自人EpoR。 13. 序列辨識編號：27人正交IL2Rb-EpoR(ITIMYF) (hoRb-EpoR(YF)編碼序列： ATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCgACTtCTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAAGCGACCTGGACCCCCTCATCCTGACGCTCTCCCTCATCCTCGTGGTCATCCTGGTGCTGCTGACCGTGCTCGCGCTGCTCTCCCACCGCCGGGCTCTGAAGCAGAAGATCTGGCCTGGCATCCCGAGCCCAGAGAGCGAGTTTGAAGGCCTCTTCACCACCCACAAGGGTAACTTCCAGCTGTGGCTGTACCAGAATGATGGCTGCCTGTGGTGGAGCCCCTGCACCCCCTTCACGGAGGACCCACCTGCTTCCCTGGAAGTCCTCTCAGAGCGCTGCTGGGGGACGATGCAGGCAGTGGAGCCGGGGACAGATGATGAGGGCCCCCTGCTGGAGCCAGTGGGCAGTGAGCATGCCCAGGATACCTATCTGGTGCTGGACAAATGGTTGCTGCCCCGGAACCCGCCCAGTGAGGACCTCCCAGGGCCTGGTGGCAGTGTGGACATAGTGGCCATGGATGAAGGCTCAGAAGCATCCTCCTGCTCATCTGCTTTGGCCTCGAAGCCCAGCCCAGAGGGAGCCTCTGCTGCCAGCTTTGAGTACACTATCCTGGACCCCAGCTCCCAGCTCTTGCGTCCATGGACACTGTGCCCTGAGCTGCCCCCTACCCCACCCCACCTAAAGTTCCTGTTCCTTGTGGTATCTGACTCTGGCATCTCAACTGACTACAGCTCAGGGGACTCCCAGGGAGCCCAAGGGGGCTTATCCGATGGCCCCTACTCCAACCCTTATGAGAACAGCCTTATCCCAGCCGCTGAGCCTCTGCCCCCCAGCTATGTGGCTTGCTCTTAG(SEQ ID NO:27) 14. 序列辨識編號：28人正交IL2Rb-EpoR(ITIM YF) (hoRb-EpoR(YF)蛋白質序列 MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPASDLDPLILTLSLILVVILVLLTVLALLSHRRALKQKIWPGIPSPESEFEGLFTTHKGNFQLWLYQNDGCLWWSPCTPFTEDPPASLEVLSERCWGTMQAVEPGTDDEGPLLEPVGSEHAQDTYLVLDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIVAMDEGSEASSCSSALASKPSPEGASAASFEYTILDPSSQLLRPWTLCPELPPTPPHLKF LF LVVSDSGISTDYSSGDSQGAQGGLSDGPYSNPYENSLIPAAEPLPPSYVACS (SEQ ID NO:28) 該hoRb-EpoR(YF)嵌合正交受體(序列辨識編號：28)的殘基1-234衍生自人正交IL-2Rβ(序列辨識編號：16)，且hoRb-EpoR的殘基235-497(帶下劃線)衍生自具有取代殘基(用粗體標示)的人EpoR。C. 正交配體 1. 序列辨識編號：29小鼠正交IL2(3A10)(moIL2)編碼序列 ATGTACAGCATGCAGCTCGCATCCTGTGTCACATTGACACTTGTGCTCCTTGTCAACAGCGCACCCACTTCAAGCTCCACTTCAAGCTCTACAGCGGAAGCACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCACCTGGACAACCTGTTGGTGCTGCTAAAGGCCCTCCTGAGCAGGATGGAGAATTACAGGAACCTGAAACTCCCCAGGATGCTCACCTTCAAATTTTACTTGCCCAAGCAGGCCACAGAATTGAAAGATCTTCAGTGCCTAGAAGATGAACTTGGACCTCTGCGGCATGTTCTGGATTTGACTCAAAGCAAAAGCTTTCAATTGGAAGATGCTGAGAATTTCATCAGCAATATCAGAGTAACTGTTGTAAAACTAAAGGGCTCTGACAACACATTTGAGTGCCAATTCGATGATGAGTCAGCAACTGTGGTGGACTTTCTGAGGAGATGGATAGCCTTCTGTCAAAGCATCATCTCAACAAGCCCTCAATAA(SEQ ID NO:29) 2. 序列辨識編號：30小鼠正交IL2(3A10)(moIL2)編碼序列： MYSMQLASCVTLTLVLLVNSAPTSSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLDNLLVLLKALLSRMENYRNLKLPRMLTFKFYLPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDLTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQ (SEQ ID NO:24) 3A10/moIL2(序列辨識編號：30)是鼠IL2的變體，其含有相對於野生型鼠IL2的[E29D、Q30N、M33V、D34L、Q36K、E37A]胺基酸取代。 3. 序列辨識編號：31MSA-小鼠正交IL2(3A10)-6xHis (MSA-moIL2)編碼序列 ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACACACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGGATCCAGGGGTGTGTTTCGCCGAGAAGCACACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGTTGTGTGCCATTCCAAACCTCCGTGAAAACTATGGTGAACTGGCTGACTGCTGTACAAAACAAGAGCCCGAAAGAAACGAATGTTTCCTGCAACACAAAGATGACAACCCCAGCCTGCCACCATTTGAAAGGCCAGAGGCTGAGGCCATGTGCACCTCCTTTAAGGAAAACCCAACCACCTTTATGGGACACTATTTGCATGAAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCAGAACTTCTTTACTATGCTGAGCAGTACAATGAGATTCTGACCCAGTGTTGTGCAGAGGCTGACAAGGAAAGCTGCCTGACCCCGAAGCTTGATGGTGTGAAGGAGAAAGCATTGGTCTCATCTGTCCGTCAGAGAATGAAGTGCTCCAGTATGCAGAAGTTTGGAGAGAGAGCTTTTAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTCTGAGCCAGACATTCCCCAATGCTGACTTTGCAGAAATCACCAAATTGGCAACAGACCTGACCAAAGTCAACAAGGAGTGCTGCCATGGTGACCTGCTGGAATGCGCAGATGACAGGGCGGAACTTGCCAAGTACATGTGTGAAAACCAGGCGACTATCTCCAGCAAACTGCAGACTTGCTGCGATAAACCACTGTTGAAGAAAGCCCACTGTCTTAGTGAGGTGGAGCATGACACCATGCCTGCTGATCTGCCTGCCATTGCTGCTGATTTTGTTGAGGACCAGGAAGTGTGCAAGAACTATGCTGAGGCCAAGGATGTCTTCCTGGGCACGTTCTTGTATGAATATTCAAGAAGACACCCTGATTACTCTGTATCCCTGTTGCTGAGACTTGCTAAGAAATATGAAGCCACTCTGGAAAAGTGCTGCGCTGAAGCCAATCCTCCCGCATGCTACGGCACAGTGCTTGCTGAATTTCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTGGTCAAAACCAACTGTGATCTTTACGAGAAGCTTGGAGAATATGGATTCCAAAATGCCATTCTAGTTCGCTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACCCCAACTCTCGTGGAGGCTGCAAGAAACCTAGGAAGAGTGGGCACCAAGTGTTGTACACTTCCTGAAGATCAGAGACTGCCTTGTGTGGAAGACTATCTGTCTGCAATCCTGAACCGTGTGTGTCTGCTGCATGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCATGTTACCAAGTGCTGTAGTGGATCCCTGGTGGAAAGGCGGCCATGCTTCTCTGCTCTGACAGTTGATGAAACATATGTCCCCAAAGAGTTTAAAGCTGAGACCTTCACCTTCCACTCTGATATCTGCACACTTCCAGAGAAGGAGAAGCAGATTAAGAAACAAACGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGGTCCAAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCGGCGGTGGCGGTTCAGCACCCACTTCAAGCTCCACTTCAAGCTCTACAGCGGAAGCACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCACCTGGATAATCTGTTGGTGCTGCTAAAGGCGCTCCTGAGCAGGATGGAGAATTACAGGAACCTGAAACTCCCCAGGATGCTCACCTTCAAATTTTACTTGCCCAAGCAGGCCACAGAATTGAAAGATCTTCAGTGCCTAGAAGATGAACTTGGACCTCTGCGGCATGTTCTGGATTTGACTCAAAGCAAAAGCTTTCAATTGGAAGATGCTGAGAATTTCATCAGCAATATCAGAGTAACTGTTGTAAAACTAAAGGGCTCTGACAACACATTTGAGTGCCAATTCGATGATGAGTCAGCAACTGTGGTGGACTTTCTGAGGAGATGGATAGCCTTCTGTCAAAGCATCATCTCAACAAGCCCTCAAGCGGCCGCGCATCATCACCACCATCACCACCATTAA(SEQ ID NO:31) 4. 序列辨識編號：32MSA-小鼠正交IL2(3A10)-6xHis (MSA-moIL2)蛋白質序列 MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAGSRGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALAGGGGSAPTSSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLDNLLVLLKALLSRMENYRNLKLPRMLTFKFYLPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDLTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQAAAHHHHHHHH (SEQ ID NO:32) 該MSA-moIL2蛋白(序列辨識編號：32)是突變型IL2的變體，其含有相對於野生型小鼠IL2的以下胺基酸取代：[E29D、Q30N、M33V、D34L、Q36K、E37A]，且添加Ala-Ala-Ala-His6 多肽標籤至人IL2序列(帶下劃線)的C-末端。 5. 序列辨識編號：33人正交IL2(SQVLKA)(hoIL2)編碼序列 ATGTATAGGATGCAGTTGCTCAGTTGTATAGCACTGTCCCTTGCGCTGGTTACGAACAGCGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGagccaaTTACTTgTGctgTTAaAGgcGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACTGCGGCCGCCCACCATCACCATCACCATTAG(SEQ ID NO:33) 6. 序列辨識編號：34人正交IL2(SQVLKA)(hoIL2)蛋白質序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNSGS APTSSSTKKTQLQLSQLLVLLKAILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:34) SQVLKA(序列辨識編號：34)是衍生自人IL2的變體，其含有相對於野生型人IL2的[E15S、H16Q、L19V、D20L、Q22K、M23A]胺基酸取代。 7. 序列辨識編號：35MSA-人正交IL2-6xHis(MSA-hoIL2)(桿狀病毒載體)編碼序列 ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACACACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGGATCCAGGGGTGTGTTTCGCCGAGAAGCACACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGTTGTGTGCCATTCCAAACCTCCGTGAAAACTATGGTGAACTGGCTGACTGCTGTACAAAACAAGAGCCCGAAAGAAACGAATGTTTCCTGCAACACAAAGATGACAACCCCAGCCTGCCACCATTTGAAAGGCCAGAGGCTGAGGCCATGTGCACCTCCTTTAAGGAAAACCCAACCACCTTTATGGGACACTATTTGCATGAAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCAGAACTTCTTTACTATGCTGAGCAGTACAATGAGATTCTGACCCAGTGTTGTGCAGAGGCTGACAAGGAAAGCTGCCTGACCCCGAAGCTTGATGGTGTGAAGGAGAAAGCATTGGTCTCATCTGTCCGTCAGAGAATGAAGTGCTCCAGTATGCAGAAGTTTGGAGAGAGAGCTTTTAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTCTGAGCCAGACATTCCCCAATGCTGACTTTGCAGAAATCACCAAATTGGCAACAGACCTGACCAAAGTCAACAAGGAGTGCTGCCATGGTGACCTGCTGGAATGCGCAGATGACAGGGCGGAACTTGCCAAGTACATGTGTGAAAACCAGGCGACTATCTCCAGCAAACTGCAGACTTGCTGCGATAAACCACTGTTGAAGAAAGCCCACTGTCTTAGTGAGGTGGAGCATGACACCATGCCTGCTGATCTGCCTGCCATTGCTGCTGATTTTGTTGAGGACCAGGAAGTGTGCAAGAACTATGCTGAGGCCAAGGATGTCTTCCTGGGCACGTTCTTGTATGAATATTCAAGAAGACACCCTGATTACTCTGTATCCCTGTTGCTGAGACTTGCTAAGAAATATGAAGCCACTCTGGAAAAGTGCTGCGCTGAAGCCAATCCTCCCGCATGCTACGGCACAGTGCTTGCTGAATTTCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTGGTCAAAACCAACTGTGATCTTTACGAGAAGCTTGGAGAATATGGATTCCAAAATGCCATTCTAGTTCGCTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACCCCAACTCTCGTGGAGGCTGCAAGAAACCTAGGAAGAGTGGGCACCAAGTGTTGTACACTTCCTGAAGATCAGAGACTGCCTTGTGTGGAAGACTATCTGTCTGCAATCCTGAACCGTGTGTGTCTGCTGCATGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCATGTTACCAAGTGCTGTAGTGGATCCCTGGTGGAAAGGCGGCCATGCTTCTCTGCTCTGACAGTTGATGAAACATATGTCCCCAAAGAGTTTAAAGCTGAGACCTTCACCTTCCACTCTGATATCTGCACACTTCCAGAGAAGGAGAAGCAGATTAAGAAACAAACGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGGTCCAAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCGGCGGTGGCGGTTCAcccgggGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGagcCAaTTACTTgTGctgTTAaAGgcGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACTGCGGCCGCGCATCATCACCACCATCACCACCATTAA(SEQ ID NO: 35) 8. 序列辨識編號：36MSA-人正交orthoIL2-6xHis (MSA-hoIL2)蛋白質序列 MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAGSRGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALAGGGGSPGAPTSSSTKKTQLQLSQLLVLLKAILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTAAAHHHHHHHH (SEQ ID NO:36) MSA-hoIL2(序列辨識編號：36)是衍生自野生型人IL2的多肽，且含有相對於野生型人IL2的以下胺基酸取代：[E15S、H16Q、L19V、D20L、Q22K、M23]，且添加Ala-Ala-Ala-His6 多肽標籤至人IL2序列(帶下劃線)的C-末端。
結合圖示閱讀以下詳細說明，可獲得對本發明最全面的理解。需要強調的是，根據慣例，圖示的各種特徵未按比例繪製。相反，為了清楚起見，可任意擴大或縮小各種特徵的尺寸。
[圖1]小圖A提供了IL2-IL2R複合物的晶體結構示意圖和鼠正交IL-2Rβ(mIL2Rb)嵌合蛋白的示意圖，其舉例說明瞭本發明的一實施例，特別是舉例說明瞭(a)鼠正交IL-2Rβ和IL2Rb跨膜和細胞內結構域(「moRb(全長)」，系列辨識編號：2)；(b)一種嵌合正交受體，其包含鼠正交IL-2Rβ的細胞外結構域(moRB ECD)以及鼠IL-7受體mil7ICD (系列辨識編號：4)的跨膜(TM)和細胞內結構域；以及(c)一種嵌合正交受體，其包含鼠正交IL-2Rβ和「mIL-7RpYtail」(系列辨識編號：6)的細胞外、跨膜和序列部分係胞內結構域。此外，還提供了嵌合受體的部分蛋白質序列，其舉例說明瞭C-末端和STAT5訊號傳導蛋白結合位點(矩形內)，該結合位點包括用於磷酸化的酪胺酸靶殘基(pY)。圖1小圖B提供了實驗資料，其中從BL6小鼠中分離出的T細胞透過與抗CD3/抗CD28包被磁珠接觸來活化，並用編碼所示嵌合或野生型受體的重組逆轉錄病毒載體進行轉導，該逆轉錄病毒構建體包含IRES序列和黃色螢光蛋白(YFP)。已轉導細胞用鼠正交IL2(系列辨識編號：30)刺激15分鐘，然後固定在多聚甲醛(PFA)中，經甲醇(MeOH)透化並用抗pSTAT5-A647抗體染色。在CytoFLEX®流式細胞儀(Beckman Coulter Life Sciences，印第安那州印第安那波利斯)上分析樣品，同時對YFP+細胞進行門控，並用Prism®軟體(GraphPad Software，美國加利福尼亞州聖地亞哥)繪製資料。SEM，n=3。所提供的資料表明STAT5的磷酸化情況發生改變，其根據受體的細胞內結構域而變化。
[圖2]提供了由實驗產生的資料圖示，可用以評估重組修飾為表現受體的T細胞母細胞中的STAT5、STAT3和STAT1訊號轉導，該受體包含鼠正交IL2細胞外結構域和IL2受體β亞單位(moRb-IL2Rb，系列辨識編號：2)跨膜和細胞內訊號傳導結構域、IL7受體跨膜和細胞內結構域(moRb-IL7，系列辨識編號：4)、IL21受體跨膜和細胞內結構域(moRb-IL21，系列辨識編號：10)以及IL9受體跨膜和細胞內結構域(moRb-IL9，系列辨識編號：8)，以回應鼠正交IL2配體(系列辨識編號：30)曝露。分離來自BL6小鼠的T細胞，活化抗CD3/抗CD28並用如下所示的moRb IRES YFP 逆轉錄病毒(RV)轉導：moRb(系列辨識編號：2)、moRb-IL-7R(系列辨識編號：4)、moRb-IL21R (系列辨識編號：10)、mRb-IL-9R(系列辨識編號：8)。已轉導細胞用正交IL2(系列辨識編號：30)刺激20'，然後固定在PFA中，經MeOH透化並用抗pSTAT5-A647抗體、抗pSTAT3-A647抗體或抗pSTAT1-A647抗體染色。在CytoFLEX®流式細胞儀上分析樣品，同時對YFP+細胞進行門控，並藉助Prism®軟體繪製資料。相關資料顯示，該融合受體能使STAT1、3和5表現出磷酸化細胞內訊號傳導特徵(即，該受體的磷酸化模式特徵)，其中衍生出細胞內結構域，同時保留了相同的IL-2正交細胞外受體結構域。
[圖3]提供了對用編碼嵌合受體的載體轉導的T細胞母細胞進行正交IL2(系列辨識編號：30)刺激而產生的資料，該嵌合受體包含鼠正交IL-2的細胞外結構域以及促紅細胞生成素(EPO)受體(moRb-EpoR)的跨膜和細胞內訊號傳導結構域，這表明該融合受體能夠在細胞內進行訊號傳導並活化pSTAT5(已活化EPO受體的訊號特徵)。簡而言之，分離來自BL6小鼠的T細胞，活化抗CD3/抗CD28並用所示的包含IRES雙順反子表現盒的逆轉錄病毒表現載體轉導，第一個順反子包含編碼moRb-EpoR融合受體(系列辨識編號：12)或moRb-EpoR-YF融合受體(系列辨識編號：14)的核酸序列，在每種情況下，第二順反子包含編碼YFP的核酸序列。已轉導細胞用鼠正交IL2刺激20分鐘，然後固定在PFA中，經甲MeOH透化並用抗pSTAT5-A647染色。在CytoFLEX®流式細胞儀上分析樣品，同時對YFP+細胞進行門控，並藉助Prism®軟體繪製資料。圖3中提供的資料表明，在對融合受體的ECD進行正交IL2刺激後，STAT5磷酸化程度(EPO受體的訊號特徵)增加。
[圖4]係由實驗生成的資料圖示，其表明正交IL-2能誘導用編碼嵌合受體的重組逆轉錄病毒轉導的T細胞增殖。簡而言之，分離來自BL6小鼠的T細胞，活化抗CD3/抗CD28並用如下所示的逆轉錄病毒轉導：moRb(系列辨識編號：2)、moRb-EpoR(系列辨識編號：12)或moRb-EpoR(YF)(系列辨識編號：14)。在第0天用CellTrace™ Violet (CTV，Thermo Fisher Scientific)標記細胞，並用所示濃度的正交IL2(系列辨識編號：30)溫育。在第3天，在CytoFLEX®流式細胞儀上分析樣品，對存活的YFP+細胞進行門控。該圖提供了透過實驗中4次平行測定得到的代表性資料。相關資料表明，正交IL2劑量依賴性使T細胞增殖增加。
[圖5]提供了已轉導的人PBMC的實驗結果，其中編碼受體的核酸序列包含與正交hIL2配體接觸的人正交IL2Rb(hoRb)受體的ECD，這表明該正交嵌合受體賦予該受體不同的STAT活化特性，其中衍生出ICD，以回應用hoIL2配體活化hoRb ECD的情況。如本文更詳細的描述所示，將人正交IL2Rb-ICD嵌合受體克隆至pMSCV-IRES-YFP逆轉錄病毒(RV)質粒中。RV上清液按照標準方案在HEK293T細胞中產生，並用於轉導抗CD3/28活化的人外周血單核細胞(PBMC)。小圖A提供了平均螢光強度(MFI，y軸)的圖示，表明了在表現正交受體和兩種嵌合正交受體的PBMC中誘導磷酸化STAT5(上部小圖)、磷酸化STAT3 (中部小圖)和磷酸化STAT1(下部小圖)的情況，該正交受體包含可操作地連接至CD122的細胞內結構域(hoRb/2Rb)的正交IL2Rb序列ECD(hoRb)，而該嵌合正交受體包含可操作地連接至hIL7R(hoRb/7R)和hIL9R(hoRb/9R)的細胞內結構域)的正交IL2Rb序列ECD(hoRb)，以回應不同濃度(X軸)的人正交IL2配體的刺激(持續20分鐘)，該配體與hoRb ECD (hIL2 SQVLKA)結合，然後固定在PFA中，用MeOH透化，並進行pSTAT磷酸化染色和FACS分析。小圖B提供了相對STAT活化表的匯總。如這些資料所示，該正交配體與嵌合受體的ECD結合，使得該衍生出細胞內結構域的受體表現出細胞內訊號特徵。
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Claims (33)

  1. 一種正交嵌合受體多肽，包含： (a) 一種正交受體的正交配體結合結構域(oLBD)，其(i)與其天然配體的結合力顯著降低；以及(ii)相對於天然蛋白序列包含至少一個胺基酸取代； (b) 第二受體的細胞內結構域(ICD)，其與一種或多種JAK/STAT蛋白結合，且並非正交受體；以及 (c) 可操作地連接oLBD和ICD的跨膜結構域(TMD)。
  2. 根據請求項1的正交嵌合受體，其中該TMD和該ICD均衍生自該第二受體。
  3. 根據請求項1或2的正交嵌合受體多肽，其中該第二受體是細胞激素受體。
  4. 根據請求項3的正交嵌合受體多肽，其中該第二受體選自CD121α；CDw121β；IL-18Rα；IL-18Rβ；CD122；CD25；CD124；CD213；CD127；IL-9R；CD21α1；CD213α2；IL-15Rα；CD131；CD125；CD131；CD126；CD130；IL-11Rα；CD114；CD212；LIFR；OSMR；CD210；IL-20Rα、IL-20Rβ；IL-14R；CD4；CD217；CD118；CD119；CD40；LTβR；CD120α；CD120β；CD137(4-1BB)；BCMA、TACI；CD27；CD30；CD95(Fas)；GITR；LTβR；HVEM；OX40；BCMA、TACI；TRAILR1-4；Apo3；RANK、OPG；TGF-βR1；TGF-βR2；TGF-βR3；EpoR；TpoR；Flt-3；CD117；CD115；CDw136。
  5. 根據請求項3的正交嵌合受體多肽，其中該第二受體是與共用γ鏈(CD132)相關聯的受體。
  6. 根據請求項5的正交嵌合受體多肽，其中該第二受體選自IL-4受體(IL-4R)、IL-7受體(IL-7R)、IL-9受體(IL-9R)、IL-15Rα、IL-21受體(IL-21Rα)。
  7. 根據請求項3的正交嵌合受體多肽，其中該第二受體是促紅細胞生成素受體(EpoR)。
  8. 根據請求項1至7中任一項的正交嵌合受體多肽，其中該oLBD是CD122配體結合結構域的正交變體。
  9. 根據請求項8的正交嵌合受體多肽，其中該CD122受體是在一個或多個選自以下各項的殘基處加以修飾的人CD122：R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136、Q214。
  10. 根據請求項9的正交嵌合受體多肽，其中該CD122受體在H133和Y134處包含胺基酸取代。
  11. 根據請求項8的正交嵌合受體多肽，其中該CD122受體是在一個或多個選自以下各項的殘基處加以修飾的CD122：R42、F67、Q71、S72、T74、S75、V76、S133、H134、Y135、I136、E137、R215。
  12. 根據請求項1的正交嵌合受體多肽，其包含相對於以下任一序列辨識編號，序列同一性至少為75%的胺基酸序列：4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、26、28。
  13. 根據請求項1的正交嵌合受體多肽，其包含相對於以下任一序列辨識編號，序列同一性至少為95%的胺基酸序列：4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、26、28。
  14. 一種用於選擇性活化細胞中受體的系統，該系統包含： (a) 根據請求項1-13中任一項的正交嵌合受體；以及 (b) 工程化正交配體。
  15. 根據請求項14的系統，其中該正交嵌合受體由哺乳動物細胞表現。
  16. 根據請求項15的系統，其中該細胞是免疫細胞或幹細胞。
  17. 根據請求項16的系統，其中該免疫細胞是T細胞。
  18. 根據請求項17的系統，其中該T細胞是CAR T細胞。
  19. 根據請求項14-18中任一項的系統，其中該正交配體是IL-2。
  20. 根據請求項19的系統，其中該直系同源IL-2是在一個或多個選自以下各項的殘基處加以修飾的人IL-2：Q13、L14、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、G27和N88。
  21. 根據請求項19的系統，其中該人IL-2在一個或多個選自以下各項的殘基處加以修飾：E15、H16、L19、D20、Q22和M23。
  22. 根據請求項19的系統，其中該直系同源IL-2是小鼠IL-2，其在一個或多個選自以下各項的殘基處加以修飾：H27、L28、E29、Q30、M33、D34、Q36、E37、R41和N103。
  23. 根據請求項19的系統，其中該小鼠IL-2在一個或多個選自以下各項的殘基處加以修飾：E29、Q30、M33、D34、Q36和E37。
  24. 一種編碼根據請求項1-13中任一項的直系同源嵌合受體的核酸。
  25. 一種表現載體，其包含根據請求項24的核酸。
  26. 一種細胞，其經過基因工程改造以包含根據請求項25的載體。
  27. 一種治療個體的方法，該方法包含引入一種免疫效應細胞來表現根據請求項1-13中任一項的正交嵌合受體，並透過與直系同源配體接觸來選擇性活化該細胞。
  28. 根據請求項27的方法，其中該免疫效應細胞是T細胞。
  29. 根據請求項28的方法，其中該T細胞是CAR T細胞。
  30. 根據請求項27-29中任一項的方法，其中該個體接受癌症治療。
  31. 根據請求項27-29中任一項的方法，其中該個體接受自體免疫疾病治療。
  32. 根據請求項27-29中任一項的方法，其中該個體接受感染疾病治療。
  33. 一種試劑盒，包含根據請求項14的系統。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023520572A (ja) * 2020-04-06 2023-05-17 シンセカイン インコーポレイテッド オルソゴナルな受容体を発現するようにゲノムが改変されたヒト免疫細胞
US12012441B2 (en) 2020-10-26 2024-06-18 Neptune Biosciences Llc Engineered human IL-21 cytokines and methods for using the same
WO2023044461A2 (en) * 2021-09-17 2023-03-23 Parker Institute For Cancer Immunotherapy Switch receptors using il-9 signaling domains
WO2024015723A1 (en) * 2022-07-11 2024-01-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Tunable cytokine receptor signaling domains

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020090680A1 (en) * 1999-05-18 2002-07-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel IL-9/IL-2 receptor-like molecules and uses thereof
CA2597584A1 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Apollo Life Sciences Limited Molecules and chimeric molecules thereof
GB201514875D0 (en) * 2015-08-20 2015-10-07 Autolus Ltd Receptor
AU2016318773A1 (en) * 2015-09-09 2018-04-12 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Genetic engineering of macrophages for immunotherapy
WO2017044464A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biologically relevant orthogonal cytokine/receptor pairs
WO2017184901A1 (en) * 2016-04-20 2017-10-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunomodulatory il2r fusion proteins and uses thereof
AU2017362484B2 (en) * 2016-11-17 2021-12-16 2Seventy Bio, Inc. TGFβ signal convertor
SG11201908929VA (en) * 2017-03-31 2019-10-30 Univ Leland Stanford Junior Synthekine compositions and methods of use

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