TW202123958A

TW202123958A - 含有環形二肽、嘌呤核苷及／或胺基酸、及雞萃取物之組成物、產製彼之方法、及環形二肽、嘌呤核苷及／或胺基酸、及雞萃取物之用途

Info

Publication number: TW202123958A
Application number: TW109121867A
Authority: TW
Inventors: 中尾嘉宏; 善美楊; 佳壯林; 建勛顏
Original assignee: 日商三得利控股股份有限公司
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2021-07-01
Also published as: JP2023508934A; EP4081303A1; EP4081303A4; CN115066273A; AU2020412909A1; WO2021131106A1

Abstract

本發明旨在提供含有環形二肽、嘌呤核苷、胺基酸及/或彼等之一或多種鹽及雞萃取物之新穎組成物，該組成物具有抗發炎作用。本發明涉及一種含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物之組成物。

Description

含有環形二肽、嘌呤核苷及／或胺基酸、及雞萃取物之組成物、產製彼之方法、及環形二肽、嘌呤核苷及／或胺基酸、及雞萃取物之用途

本發明關於含有環形二肽、嘌呤核苷及/或胺基酸及雞萃取物之組成物、及產製彼之方法。本發明亦關於環形二肽、嘌呤核苷及/或胺基酸及雞萃取物於產製抗發炎組成物之用途。

發炎係一種現象，其中組織胺、激肽及類似物由受損細胞釋放，造成血管擴張、微血管通透性增加及巨噬細胞聚集在發炎部位，導致感染部位的血流增加、水腫、免疫細胞及抗體轉移、疼痛、發熱或類似現象。

近來，能夠抑制發炎相關蛋白質表現之組分受到研究以提供有效的發炎緩解。雖然已發展出具有各種機制抗發炎藥物，諸如非固醇類抗發炎藥(NSAID)及固醇類抗發炎藥(SAID)，這些藥物可能具有不良反應。因此，仍需要較為安全且具有抗發炎作用之組分。

例如，專利文獻1揭示一種抗發炎組成物，其含有作為有效成分之衍生自具有抗發炎活性之端粒酶的胜肽。 [引用清單] [專利文獻]

[PTL 1] JP2015-525768T

[技術問題]

本發明旨在提供含有環形二肽、嘌呤核苷、胺基酸及/或彼等之一或多種鹽及雞萃取物之新穎組成物。本發明亦旨在提供具有抗發炎作用之組成物。 [解決問題之手段]

本發明人發現使用選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物之組合增加抗發炎活性且完成本發明。

具體而言，本發明係定義如下。 (1)一種組成物，其含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物。 (2)如上述(1)之組成物，其中該選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者的總量係0.01至99重量%。 (3)如上述(1)或(2)之組成物，其中該組成物含有衍生自雞軟骨的水解化第II型膠原之組分，該組分具有藉由HPLC凝膠過濾所測定之小於1100之分子量及150至250之重量平均分子量。 (4)如上述(1)至(3)中任一項之組成物，其中該組成物含有雞軟骨的水解化第II型膠原。 (5)如上述(1)至(4)中任一項之組成物，其中該雞萃取物含有肌肽及/或甲肌肽及/或彼等之一或多種鹽。 (6)如上述(1)至(5)中任一項之組成物，其中該組成物係食物、飲料或藥物。 (7)如上述(1)至(6)中任一項之組成物，其中該組成物係用於減輕發炎。 (8)如上述(1)至(7)中任一項之組成物，其中該組成物抑制選自由活化正常T細胞表現及分泌調節因子(RANTES)、單核球趨化性蛋白質1 (MCP-1)、介白素6 (IL-6)、介白素8 (IL-8)、介白素9 (IL-9)及巨噬細胞發炎性蛋白質1 (MIP-1)所組成之群組的至少一種細胞介素的產生。 (9)如上述(1)至(8)中任一項之組成物，其中該組成物係用於預防或減輕發炎性病況或疾病。 (10)一種製造組成物之方法，其包括：將選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者與雞萃取物混合。 (11)如上述(10)之製造方法，其中該混合包括將雞軟骨的水解化第II型膠原與雞萃取物混合，該水解化第II型膠原含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者。 (12)如上述(10)或(11)之製造方法，其中該雞萃取物含有肌肽及/或甲肌肽及/或彼等之一或多種鹽。 (13)一種選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物於產製抗發炎組成物之用途。 [本發明之有利效應]

本發明可提供一種含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物之新穎組成物。本發明之組成物可用來作為食物或飲料組成物或醫藥組成物以減輕發炎及關節疼痛。環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸、彼等之鹽及雞萃取物可當作食物、飲料或類似物攝食，且就高度安全性而言亦為有利。

[本發明之詳細說明]

在本發明之實施態樣中，本發明之組成物含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物。

環(Ala-Hyp)及環(Pro-Gly)係環形二肽。在本文中，用語「環形二肽(cyclic dipeptide)」係指含有胺基酸作為結構單位且具有藉由將胺基酸N端之胺基及C端之羧基脫水縮合所產製之二酮哌嗪結構的化合物。在本文中，環形二肽之胺基酸的說明順序不受限制，只要胺基酸組成相同即可。例如，(環(Ala-Hyp))及(環(Hyp-Ala))表示相同環形二肽。鳥苷係嘌呤核苷，色胺酸係胺基酸。

環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸可藉由水解動物/植物蛋白質或類似物獲得或可人工合成。環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸較佳地係衍生自水解化第II型膠原；更佳的是衍生自雞軟骨的水解化第II型膠原；仍更佳的是含有於衍生自雞軟骨的水解化第II型膠原且具有藉由HPLC凝膠過濾所測定之小於1100之分子量及150至250之重量平均分子量之餾分中。在本文中，該「衍生自雞軟骨的水解化第II型膠原且具有藉由HPLC凝膠過濾所測定之小於1100之分子量及150至250之重量平均分子量之餾分」亦稱為「餾分6」。

環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸可在使用前經純化、可含有於餾分6之形式中(餾分6含有這些組分於組成物中)、或可含有於雞軟骨的水解化第II型膠原之形式中(雞軟骨的水解化第II型膠原含有餾分6於組成物中)。在一較佳實施態樣中，本發明之組成物含有餾分6或雞軟骨的水解化第II型膠原。本發明之組成物(其含有餾分6或雞軟骨的水解化第II型膠原)展現較高之抗發炎作用。

環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)及色胺酸可含有於本發明之組成物的無機酸或有機酸鹽或無機鹼或有機鹼鹽之形式中。該等酸或鹼可基於鹽之應用選擇。以食物、飲料及藥物應用而言，下列飲食或醫藥上可接受之鹽係較佳。無機酸鹽之實例包括鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、甲烷磺酸鹽及對甲苯磺酸鹽。有機酸鹽之實例包括二羧酸諸如草酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸及反丁烯二酸之鹽，及單羧酸諸如乙酸、丙酸及丁酸之鹽。無機鹼之實例包括鈉、鋰、鈣、鎂及鋁及氨之氫氧化物、碳酸鹽及重碳酸鹽。有機鹼鹽之實例包括單-、二-或三-烷基胺鹽，諸如甲胺、二甲胺及三乙胺之鹽、單-、二-或三-羥基烷基胺鹽、胍鹽及N-甲基葡萄糖胺鹽。本發明之組成物中之鳥苷可為磷酸化鳥苷。

＜雞軟骨的水解化第II型膠原＞較佳地，本發明之組成物含有雞軟骨的水解化第II型膠原。雞軟骨的水解化第II型膠原(以下之「雞軟骨的水解化第II型膠原」有時稱為「HCII」)可藉由酶或類似物水解第II型膠原獲得。第II型膠原可藉由已知方法自雞軟骨萃取。用於本發明之雞軟骨的水解化第II型膠原可藉由本領域通常使用之方法自軟骨製備。例如，水解化第II型膠原可藉由酶處理雞軟骨獲得。具體而言，水解化第II型膠原可藉由前處理步驟(1)其中雞軟骨係於液體中加熱，及步驟(2)其中前處理步驟後之雞軟骨係經酶處理製備。步驟(2)使用之酶不受限制，只要係該領域通常使用之酶即可。實例包括膠原酶、木瓜酶、鳳梨酶、獼猴桃鹼、無花果蛋白酶、組織蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、胰蛋白酶、蛋白酶、枯草溶菌素、胺基肽酶、內肽酶及外肽酶及藉由混合這些酶獲得之酶製劑。製備水解化第II型膠原之方法不限於酶處理方法。

雞軟骨的水解化第II型膠原可為藉由水解雞軟骨獲得之溶液、該溶液之濃縮物或乾燥粉末或該濃縮物或乾燥粉末之純化產物。雞軟骨的水解化第II型膠原之純化產物可藉由例如使藉由水解雞軟骨獲得之溶液進行超過濾、膜處理、液體分離作業或以樹脂或類似物處理餾分而獲得以增加純度。在使含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者的雞軟骨的水解化第II型膠原之純度增加之後，可藉由例如冷凍乾燥或噴霧乾燥使該純化產物形成粉末。

雞軟骨的水解化第II型膠原係通常含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)及/或彼等之一或多種鹽之胜肽混合物，且可被視為衍生自第II型膠原之膠原胜肽。雞軟骨的水解化第II型膠原之重量平均分子量較佳是100至20,000，更佳的是2,000至8,000，仍更佳的是3,000至7,000。分子量及重量平均分子量可藉由Eurofins HPAEC-PAD方法測量。

在一實施態樣中，藉由諸如凝膠過濾之方法基於分子量分餾雞軟骨的水解化第II型膠原所獲得之一個餾分或二個或超過二個餾分之組合可用於本發明之組成物。用於本發明之組成物之藉由分餾雞軟骨的水解化第II型膠原所獲得之餾分較佳係上述之餾分6。在本實施態樣中，餾分6及除餾分6以外之餾分可組合使用於組成物中。

＜雞萃取物＞用於本發明之雞萃取物(以下有時稱為「CE」)可為萃取物，該萃取物可藉由加熱液體中用來作為原料之雞肉獲得或可為商業產品。原料可含有骨、軟骨、腿或類似物，但原料較佳不含有頭或內臟。

雞萃取物(CE)商業產品之實例包括「白蘭氏雞精(BEC)(Suntory Beverage & Food Asia Pte Ltd製造)」、「Scotch^TM 雞精(Scotch Industrial (Thailand) Co., Ltd.製造)」、「Quaker雞精(Standard Foods Corporation (Taiwan) Co., Ltd.製造)」、「SWANSON^TM 清雞湯，Campbell Soup Company (NYSE:CPB)製造」、「滴雞精，Eu Yan Sang International Ltd. (Singapore)製造」、「烏雞滋補飲，Eu Yan Sang International Ltd. (Singapore)製造」、「熬雞精，Lao Xie Zhen Co. Ltd. (Taiwan)製造」。任何該等商業產品皆可使用，但白蘭氏雞精(BEC)係較佳。

當藉由熱水萃取生產用於本發明之雞萃取物時，雞萃取物可藉由此領域通常使用之方法生產。例如，常壓萃取及/或加壓萃取係使用在100℃或高於100℃、較佳地125℃或高於125℃之溫度下之液體實施，且所得萃取物係經膜處理或過濾，藉此可產生雞萃取物。具體而言，萃取物係藉由前處理步驟(3)其中雞肉係於液體中加熱，及步驟(4)其中在前處理後液體係經新鮮液體置換且將雞肉再次加熱獲得。步驟(3)及步驟(4)各者中之熱處理係較佳地於溶劑中實施。溶劑較佳地係例如水、乙醇或彼等之混合物。雞萃取物涵蓋藉由上述方法獲得之液體萃取物；該液體萃取物經稀釋之溶液、濃縮物或乾燥粉末；及彼等之經純化的產物。純化產物可藉由例如使雞萃取物液體進行超過濾、膜處理、液體分離作業或以樹脂或類似物處理餾分而獲得以增加純度。在使雞萃取物的純度增加之後，可藉由例如冷凍乾燥或噴霧乾燥使該純化產物形成粉末。

較佳地，用於本發明之雞萃取物含有肌肽及/或甲肌肽及/或彼等之一或多種鹽。肌肽係β-丙胺醯基・組胺酸，其係β-丙胺酸及組胺酸雙肽。甲肌肽係β-丙胺醯基・1-甲基組胺酸，其中組胺酸係經甲基化。肌肽鹽及甲肌肽鹽之實例包括與上述環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)及色胺酸相同之鹽。

當本發明之組成物含有例如肌肽及/或彼之鹽，組成物中肌肽及/或彼之鹽的量係較佳地0.00001重量%或超過0.00001重量%，更佳的是0.0001重量%或超過0.0001重量%，且就肌肽方面較佳地係10重量%或少於10重量%，更佳的是1重量%或少於1重量%。在一實施態樣中，例如，組成物中肌肽及/或彼之鹽的量就肌肽方面係較佳地0.00001至10重量%，更佳的是0.0001至1重量%。

當本發明之組成物含有例如甲肌肽及/或彼之鹽，組成物中甲肌肽及/或彼之鹽的量係較佳地0.00001重量%或超過0.00001重量%，更佳的是0.0001重量%或超過0.0001重量%，且就甲肌肽方面較佳地亦為10重量%或少於10重量%，更佳的是1重量%或少於1重量%。在一實施態樣中，例如，組成物中甲肌肽及/或彼之鹽的量就甲肌肽方面係較佳地0.00001至10重量%，更佳的是0.0001至1重量%。

肌肽、甲肌肽及彼等之鹽可藉由例如HPLC定量。更佳的是，本發明之食物或飲料組成物含有肌肽及/或彼之鹽及甲肌肽及/或彼之鹽。

較佳的是，肌肽、甲肌肽及彼等之鹽就肌肽及甲肌肽方面的總重量對環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽就游離形式方面的總重量之重量比(肌肽及甲肌肽加總/就游離形式方面加總)係1/15000至200/1。重量比更佳的是1/200至200/1，仍更佳的是1/50至50/1。

在「環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽就游離形式方面」之用語中，來自環(Ala-Hyp)鹽之游離形式係環(Ala-Hyp)，來自環(Pro-Gly)鹽之游離形式係環(Pro-Gly)，來自鳥苷鹽之游離形式係鳥苷，且來自色胺酸鹽之游離形式係色胺酸。

餾分6對肌肽、甲肌肽及彼等之鹽就肌肽及甲肌肽方面加總之重量比(餾分6/肌肽及甲肌肽加總)係較佳地1/100至10/1。重量比更佳的是1/100至5/1。

雞軟骨的水解化第II型膠原(就固體方面)對肌肽、甲肌肽及彼等之鹽就肌肽及甲肌肽方面加總之重量比(HCII/肌肽及甲肌肽加總)係較佳地10000/1至10/1。重量比更佳的是1000/1至100/1。

本發明之組成物中各組分的量不受限制，且可根據組成物的形式或類似物設定。在一實施態樣中，例如，本發明之組成物中環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽的總量係較佳地0.01重量%或超過0.01重量%，更佳的是0.1重量%或超過0.1重量%，且較佳地是99重量%或少於99重量%，更佳的是90重量%或少於90重量%。在一實施態樣中，例如，組成物中環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽的總量係較佳地0.01至99重量%，更佳的是0.1至90重量%。

在一實施態樣中，例如，本發明之組成物中餾分6的量係較佳地0.01重量%或超過0.01重量%，更佳的是0.1重量%或超過0.1重量%，且較佳地是99重量%或少於99重量%，更佳的是90重量%或少於90重量%。在一實施態樣中，例如，組成物中餾分6的量係較佳地0.01至99重量%，更佳的是0.1至90重量%。在本文中，餾分6的量含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽的量。

在一實施態樣中，例如，本發明之組成物中雞軟骨的水解化第II型膠原(就固體方面)的量係較佳地0.1重量%或超過0.1重量%，更佳的是0.5重量%或超過0.5重量%，且較佳地是99重量%或少於99重量%，更佳的是90重量%或少於90重量%。在一實施態樣中，例如，組成物中雞軟骨的水解化第II型膠原(就固體方面)的量係較佳地0.1至99重量%，更佳的是0.5至90重量%。在本文中，雞軟骨的水解化第II型膠原的量含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及餾分6的量。

在一實施態樣中，例如，本發明之組成物中雞萃取物(就固體方面)的量係較佳地0.1重量%或超過0.1重量%，更佳的是0.5重量%或超過0.5重量%，且較佳地是99重量%或少於99重量%，更佳的是90重量%或少於90重量%。在一實施態樣中，組成物中雞萃取物(就固體方面)的量係較佳地0.1至99重量%，更佳的是0.5至90重量%。在本文中，雞萃取物(就固體方面)的量含有肌肽及甲肌肽的量。

較佳地，本發明之組成物係用來作為食物、飲料或藥物。食物或飲料之實例包括一般食物或飲料、具有功能宣稱之食物、健康促進食物、特殊飲食需求食物、膳食補充劑、健康補充劑及一般補充劑。食物或飲料之形式不受限制。例如，其可能是固體食物或液體食物。飲料係較佳。藥物之形式不受限制。非限制性實例包括供體內投予之製劑，諸如膠囊、錠劑、粉末、顆粒劑及乾漿料；供體外投予之製劑，諸如軟膏、黏著皮膚貼片、點眼劑及栓劑；及注射劑。藥物係較佳地供體內投予之製劑(口服藥物)。

本發明之組成物可含有醫藥上或飲食上可接受之添加劑，諸如各種載劑、賦形劑、稀釋劑、酸化劑、抗氧化劑、穩定劑、保存劑、添味或遮蔽劑、乳化劑、色素、調味料、pH調整劑及營養增強劑。

本發明之組成物適用於治療性用途(醫學用途)及非治療性用途(非醫學用途)。「非治療性」係不包括醫學活動之概念，即不包括人的手術、治療或診斷方法之概念。

＜抗發炎組成物＞在一實施態樣中，本發明之組成物可用於減輕發炎。本發明之組成物可為抗發炎組成物。組成物可為一種含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物作為有效成分之抗發炎組成物。

為了達成本發明考慮之抗發炎效應，選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物係以如上述用於以上組成物之相同方式添加至組成物。可直接使用含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者之雞軟骨的水解化第II型膠原及雞萃取物，或可如上述添加彼等之濃縮物、乾燥粉末或純化產物，只要不損害本發明之效應即可。可使用如上述之相同添加劑。可使用如上述之相同添加劑。

較佳地，本發明之組成物係經口餵食(經口投予)。本發明之組成物的劑量(其亦可描述為「攝取」)不受限制。本發明之組成物的劑量可根據個體的體重及類似物合適地設定，只要可達成發炎減輕效應即可。

在一實施態樣中，當本發明之組成物係經口餵食或投予至人(成人)時，環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽就游離形式方面的總劑量係較佳地每60 kg體重每天0.01 mg或超過0.01 mg，更佳的是0.1 mg或超過0.1 mg，且較佳地2000 mg或少於2000 mg，更佳的是1000 mg或少於1000 mg。在一實施態樣中，人(成人)的環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽就游離形式方面的總劑量係較佳地每60 kg體重每天0.01至2000 mg，更佳的是0.1至1000 mg。

在一實施態樣中，當本發明之組成物係經口餵食或投予至人(成人)時，餾分6的劑量係較佳地每60 kg體重每天0.01 mg或超過0.01 mg，更佳的是0.1 mg或超過0.1 mg，且較佳地2000 mg或少於2000 mg，更佳的是1000 mg或少於1000 mg。在一實施態樣中，人(成人)的餾分6的劑量係較佳地每60 kg體重每天0.01至2000 mg，更佳的是0.1至1000 mg。在本文中，餾分6的劑量含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽的量。

在一實施態樣中，當本發明之組成物係經口餵食或投予至人(成人)時，雞軟骨的水解化第II型膠原(就固體方面)的劑量係較佳地每60 kg體重每天0.01 mg或超過0.01 mg，更佳的是0.1 mg或超過0.1 mg，且較佳地亦為4000 mg或少於4000 mg，更佳的是3000 mg或少於3000 mg。在一實施態樣中，人(成人)的雞軟骨的水解化第II型膠原(就固體方面)的劑量係較佳地每60 kg體重每天0.01至4000 mg，更佳的是0.1至3000 mg。在本文中，雞軟骨的水解化第II型膠原的劑量含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽的量或餾分6的量。

在一實施態樣中，當本發明之組成物係經口餵食或投予至人(成人)時，雞萃取物(就固體方面)的劑量係較佳地每60 kg體重每天0.1 mg或超過0.1 mg，更佳的是1 mg或超過1 mg，且較佳地亦為15000 mg或少於15000 mg，更佳的是13000 mg或少於13000 mg。在一實施態樣中，人(成人)的雞萃取物(就固體方面)的劑量係較佳地每60 kg體重每天0.1至15000 mg，更佳的是1至13000 mg。雞萃取物的劑量包括肌肽、甲肌肽及彼等之鹽的量。

在一實施態樣中，當本發明之組成物係經口餵食或投予至人(成人)時，肌肽、甲肌肽及彼等之鹽就肌肽及甲肌肽方面的總劑量係較佳地每60 kg體重每天0.001 mg或超過0.001 mg，更佳的是0.01 mg或超過0.01 mg，且較佳地亦為500 mg或少於500 mg，更佳的是400 mg或少於400 mg。在一實施態樣中，餵食人(成人)的肌肽、甲肌肽及彼等之鹽就肌肽及甲肌肽方面的總劑量係較佳地每60 kg體重每天0.001至500 mg，更佳的是0.01至400 mg。

在一實施態樣中，以上量的雞軟骨的水解化第II型膠原(其含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽)及以上量的雞萃取物係較佳地餵食或投予每天至少一次，例如每天一次或數次(例如二次或三次)。在一實施態樣中，較佳地，以上量的雞軟骨的水解化第II型膠原(其含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽)及以上量的雞萃取物係經口餵食或投予至人。在一實施態樣中，本發明之組成物可用以上量的雞軟骨的水解化第II型膠原(其含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽)及以上量的雞萃取物餵食或投予至人(每60 kg體重每天)。

在一實施態樣中，當餵食本發明之組成物以達成抗發炎效應時，較佳地餵食以上量的雞軟骨的水解化第II型膠原(其含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽)及以上量的雞萃取物。

本發明之組成物抑制細胞介素諸如活化正常T細胞表現及分泌調節因子(RANTES)、單核球趨化性蛋白質1 (MCP-1)、介白素6 (IL-6)、介白素8 (IL-8)、介白素9 (IL-9)及巨噬細胞發炎性蛋白質1 (MIP-1)的產生。本發明之組成物在抑制RANTES、MCP-1、IL-6、IL-8、IL-9及MIP-1β的產生上特別高度有效。藉由抑制以上細胞介素的產生可減輕活體的發炎。

本發明之組成物可用於預防或減輕發炎性病況或疾病。發炎性病況或疾病係例如由發炎造成的病況或疾病或伴隨發炎的病況或疾病。該等病況或疾病之實例包括膠原疾病諸如關節炎及類風濕性關節炎、發炎性腸疾病、骨關節炎、肌腱炎、坐骨神經痛、椎間盤突出、狹窄、脊髓病、背痛、小面關節痛、腕骨隧道症候群、跗骨隧道症候群、腰椎手術後疼痛症候群、AIDS、動脈硬化、氣喘、關節炎、糖尿病、肝炎、中風、失智症、肌肉耗損、病毒感染、皮膚老化包括光老化、癌症、老化、過敏性疾病、帕金森氏症、腦梗塞、白內障、癲癇、脊髓損傷、早產兒視網膜病變、腎病、胃潰瘍、胰臟炎、潰瘍性結腸炎、心肌梗塞、成人呼吸窘迫症候群、肺氣腫、血管炎、水腫、糖尿病併發症、UV損害、高山症、紫質症、燒燙傷、凍傷、接觸性皮膚炎、休克、多器官衰竭、DIC、疲勞、肌肉減少症(肌肉無力)、粒線體功能異常、阿茲海默症、乾癬性關節炎、關節黏連性脊椎炎、兒童特發性關節炎及全身性紅斑性狼瘡(狼瘡)。本發明之組成物較佳係用於預防或減輕這些疾病。具體而言，食物或飲料組成物較佳係用於預防或減輕諸如骨關節炎、類風濕性關節炎及乾癬性關節炎之疾病。在本文中，預防病況或疾病涵蓋預防疾病開始、延遲疾病開始、降低疾病發生率、降低疾病開始風險及類似者。減輕病況或疾病涵蓋個體從病況或疾病恢復、病況或疾病症狀減輕、病況或疾病症狀改善、延遲或預防病況或疾病進展及類似者。

本發明之組成物所餵食或投予之對象(亦可被稱為「個體」)不受限制。個體較佳係人或非人哺乳動物，更佳的是人。在一實施態樣中，個體可為需要或想要抑制發炎之個體。該等個體可為例如需要或想要預防或減輕發炎之個體或需要或想要預防或減輕發炎性病況或疾病之個體。在一實施態樣中，本發明中個體可為中年人或老年人。本發明之組成物亦可用於健康之人，例如為了預防可藉由減輕發炎而預防或減輕之病況。

本發明之組成物可經功能宣稱標示，說明效應係由減輕發炎展現。該等標籤亦稱為功能宣稱標籤，標籤之內容不受限制。該等標籤上之功能宣稱的實例包括「緩解關節疼痛」、「減輕關節疼痛」、「管理膝蓋病況」、「維持膝蓋健康」、「改善關節健康」、「改善關節活動力」及其他相當於上述之功能宣稱。在本發明之實施態樣中，本發明之組成物較佳地係標示上述功能宣稱之食物或飲料，且飲料係較佳。標籤可描述使用本發明之組成物以達成上述功能。標籤可添加至組成物本身或食物或飲料組成物的容器或包裝。

＜產製方法＞本發明亦關於一種製造組成物之方法，該方法包括：將選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者與雞萃取物混合。在混合中，環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽可直接與雞萃取物混合。然而，較佳的是將含有環(Ala-Hyp)及類似物之雞軟骨的水解化第II型膠原與雞萃取物混合以產生組成物。在此情況下，例如，藉由酶或類似物水解雞軟骨的第II型膠原所獲得之水解物可直接用於與雞萃取物混合。如上述，可添加衍生自雞軟骨的水解化第II型膠原且含有環(Ala-Hyp)及類似物之餾分6，或可添加雞軟骨的水解化第II型膠原之濃縮物、乾燥粉末或純化產物，只要不損害本發明之效應即可。

在本發明之產製方法中，添加原料之順序不受限制。例如，可先將環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽或含有這些組分之餾分6或雞軟骨的水解化第II型膠原放入容器中，隨後添加雞萃取物。替代地，可先將雞萃取物放入容器中，隨後添加環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽或含有這些組分之餾分6或雞軟骨的水解化第II型膠原。在本發明之產製方法中，雞軟骨的水解化第II型膠原之較佳實施態樣係如上述。雞萃取物之較佳實施態樣係如上述。在本發明之產製方法中，較佳的是，該雞萃取物含有肌肽及/或甲肌肽及/或彼等之一或多種鹽。

在本發明之產製方法中，市售雞萃取物或藉由熱水萃取產製之雞萃取物可與環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽或含有這些組分之餾分6或雞軟骨的水解化第II型膠原直接混合。然而，舉例來說，當雞萃取物係呈濃縮物、乾燥粉末或濃縮物或乾燥粉末之純化產物之形式時，該雞萃取物可經稀釋、溶解或類似者於液體諸如水、乙醇或水及乙醇之混合物中，接著與環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽或含有這些組分之餾分6或雞軟骨的水解化第II型膠原混合。當雞軟骨的水解化第II型膠原之餾分6(其含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽)係呈濃縮物、乾燥粉末或彼等之純化產物之形式時，該等產物在添加前可類似地經稀釋、溶解或類似者於液體或類似物中。替代地，該等產物可在不經提前稀釋、溶解或類似者下添加，接著與液體摻合以進行稀釋、溶解或類似者於液體中。

本發明之產製方法所產製之組成物除了環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽以及雞軟骨的水解化第II型膠原及雞萃取物之外可含有上述添加劑。

本發明亦關於一種選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物於產製抗發炎組成物之用途。抗發炎組成物之實例包括與上述含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽及雞萃取物之組成物類似之組成物。環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及/或彼等之一或多種鹽可以含有這些組分之餾分6或雞軟骨的水解化第II型膠原之形式使用。可使用如上述之相同雞萃取物及相同添加劑。 [實例]

以下參照實例更具體描述本發明。本發明並不限於這些實例。

下列實例及比較例使用的原料、試劑及類似物如下。＜雞軟骨的水解化第II型膠原的製備＞圖1顯示簡短描述HCII製備方法的流程圖。首先，將冷凍雞軟骨於40℃水中解凍並在40℃水中清洗(1小時)。接下來，將洗滌水丟棄，並將相當於雞軟骨3倍的新鮮水倒入1200L鍋中。將水加熱至酶處理的最佳工作溫度，並將洗滌過的雞軟骨浸入其中以實施酶處理數小時。在酶處理之後，將含有雞軟骨之鍋加熱至90℃或高於90℃，並使溫度保持在90℃或高於90℃達30分鐘，藉此使較早酶處理中使用的酶去活化。過濾所得混合物(液體及經酶處理之雞軟骨)。將所得液體濃縮。最後，將所得濃縮物在200℃下噴霧乾燥，藉此製備HCII粉末。

＜測量HCII粉末的分子量＞所獲得之HCII的分子量分布係藉由Eurofins HPAEC-PAD方法測量。下表1顯示所獲得之HCII的分子量分布。所獲得之HCII的重量平均分子量為4582，其係以本領域通常使用之方法計算獲得。

＜HCII餾分的分餾＞ (用於HCII分餾及生物活性物識別之材料及方法) (材料) 甲酸係購自Tokyo Chemical Industry Co. Ltd。超純水係獲自Merck Milli-Q水純化系統。

(製備型凝膠滲透層析法(GPC)) HCII之分餾係使用製備型VERITY 271 HPLC系統(Gilson)進行。將HCII溶解於超純水以製備10 mg/mL (w/v)溶液。在以14000 rpm離心5 min後，將1000 μL等分試樣注射至附接至保護管柱(SecurityGuard PREP匣C12 15 × 21.2 mm ID (Phenomenex))之製備型GPC管柱(BioSep 5 μm SEC-s2000 145Å LC管柱300 × 21.2 mm (Phenomenex))上，並經洗提液A(超純水:甲酸=100:0.1 (v/v))以5 mL/min之速率等度洗提30 min。在214 nm下觀察層析圖。使用GX系列分液收集器(Gilson)在8 min至28 min之間每0.5 min收集一次餾分，後續將所得之40個各別餾分匯合成7個餾分P1至P7(P1: 8.5至12.0 min，P2: 12.0至13.5 min，P3: 13.5至14.5 min，P4: 14.5至16.0 min，P5: 16.0至17.5 min，P6: 17.5至19.0 min，P7: 19.0至27.5 min)。將經匯合之餾分在冷凍乾燥器(ScanVac)中蒸發至乾且將經乾燥之樣本儲存在-20℃下直到進一步使用。

此外，表2顯示以上獲得之餾分的分子量。在表2中，「Mw」及「Mp」分別指示重量平均分子量及尖峰分子量。如表2所示，餾分6 (P6)係由分子量小於300之一般小分子構成。 HCII餾分的分子量係藉由HPLC凝膠過濾方法在下列條件下測量。儀器：Agilent 1100系列偵測：UV 214 nm 流速：1mL/min 動相：pH 6.8之等度0.1 mM磷酸鈉緩衝劑運行時間：20分鐘管柱：Biosep^TM 5μm SEC-s2000 145Å LC管柱300 x 7.8 mm

＜識別餾分P6的主要組分＞餾分P6之主要組分的分離係藉由Agilent HPLC, 1100系列上的Phenomenex, Luna^TM Omega 5 μm PS C18 100A 250 × 4.6 mm進行，經洗提液A(超純水:甲酸=100:0.1 (v/v))及洗提液B(乙腈:甲酸=100:0.1 (v/v))以下列線性梯度洗提：0至4.0 min：100%洗提液A；4.0至12.0 min：0至90%洗提液A；12.0至15.5 min：90至80%洗提液A；15.5至17.0 min：80至15%洗提液A；17.0至18.0 min：線性15%洗提液A；18.0至19.0 min：15至100%洗提液A；及19.0至21.0 min：100%洗提液A。注射體積係10 μL，流速為1 mL/min，且洗提液之UV吸光度係在214 nm下監測。以經裝備之分液收集器收集洗出液。接著將四個餾分冷凍乾燥且接著以純水重構，使其在具有Duo Spray Turbo V離子源及氣體產生器(Peak Scientific)之Agilent HPLC 1290系列偶合TripleTOF 5600 (AB Sciex)上進行LC-MS分析。也對一些餾分進行質子-NMR實驗(在Bruker ECA 400上執行)來加以表徵。餾分P6之主要組分的特性係由市售化學物質證實。餾分HCII之游離胺基酸係根據AOAC 999.13方法偵測及定量。

根據分析結果，餾分P6之主要組分係環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸。

＜環(Ala-Hyp)及環(Pro-Gly)之定量＞環(Ala-Hyp)係重構於超純水中且經注射至Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD 1.8 μm 2.1 × 50 mm管柱(Agilent) (裝有UHPLC Guard Zorbax Eclipse Plus C18 2.1 × 5 mm 1.8 μm (Agilent))上，且經洗提液A(超純水:甲酸=100:0.1 (v/v))及洗提液B(乙腈:甲酸=100:0.1 (v/v))以下列線性梯度洗提：0至0.5 min：100%洗提液A；0.5至7.5 min：100至65%洗提液A；7.5至10.0 min：65至0%洗提液A；11.0至13.0 min：0%洗提液A；13.0至13.1 min：0至100%洗提液A；及13.1至15.0 min：100%洗提液A。注射體積係10 μL，流速為300 μL/min，且洗提液之UV吸光度係在214 nm下監測。MS的碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)分別經最佳化為27.0 V及100 V。環(Ala-Hyp)係使用m/z為185.1/86.1且滯留時間為2.45 min之Q1/Q3離子轉移作為定量離子及定性離子偵測。藉由注入31.25 ng/mL、62.5 ng/mL、125 ng/mL或250 ng/mL的標準環(Ala-Hyp)至質譜儀來建構校正曲線。將餾分P6重構為100 μg/mL溶液作為工作溶液。環(Ala-Hyp)於餾分P6中的定量係藉由Sciex OS (AB Sciex)進行。

環(Pro-Gly)係重構於超純水中且經注射至Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD 1.8 μm 2.1 × 50 mm管柱(Agilent)(裝有UHPLC Guard Zorbax Eclipse Plus C18 2.1 × 5 mm 1.8 μm (Agilent))上，且經洗提液A(超純水:甲酸= 100:0.1 (v/v))及洗提液B(乙腈:甲酸=100:0.1 (v/v))以下列線性梯度洗提：0至0.5 min：100%洗提液A；0.5至7.5 min：100至65%洗提液A；7.5至10.0 min：65至0%洗提液A；11.0至13.0 min：0%洗提液A；13.0至13.1 min：0至100%洗提液A；及13.1至15.0 min：100%洗提液A。注射體積係10 μL，流速為300 μL/min，且洗提液之UV吸光度係在214 nm下監測。MS的碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)分別經最佳化為30.0 V及100 V。環(Pro-Gly)係使用m/z為70.1/127.1 Th且滯留時間為2.6 min之Q1/Q3離子轉移作為定量離子及定性離子偵測。藉由注入70 ng/mL、140 ng/mL、280 ng/mL或560 ng/mL的標準環(Pro-Gly)至質譜儀來建構校正曲線。將餾分P6重構為100 μg/mL溶液作為工作溶液。環(Pro-Gly)於餾分P6中的定量係藉由Sciex OS (AB Sciex)進行。

＜鳥苷之定量＞鳥苷係重構於超純水中且經注射至Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD 1.8 μm 2.1 × 50 mm管柱(Agilent)(裝有UHPLC Guard Zorbax Eclipse Plus C18 2.1 × 5 mm 1.8 μm (Agilent))上，且經洗提液A(超純水:甲酸=100:0.1 (v/v))及洗提液B(乙腈:甲酸=100:0.1 (v/v))以下列線性梯度洗提：0至0.5 min：100%洗提液A；0.5至10.5 min：100至0%洗提液A；10.5至14.0 min：0%洗提液A；14.0至16.1 min：0至100%洗提液A；及16.1至18.0 min：100%洗提液A。注射體積係10 μL，流速為300 μL/min，且洗提液之UV吸光度係在214 nm下監測。MS的碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)分別經最佳化為10.0 V及80 V。鳥苷係使用m/z為152.1/284.1Th且滯留時間為2.17 min之Q1/Q3離子轉移作為定量離子及定性離子偵測。藉由注入31.25 ng/mL、62.5 ng/mL、125 ng/mL或250 ng/mL的標準鳥苷至質譜儀來建構校正曲線。將P6重構為100 μg/mL溶液作為工作溶液。鳥苷於P6中的定量係藉由Sciex OS (AB Sciex)進行。

HCII含有0.23重量%的環(Ala-Hyp)、0.30重量%的環(Pro-Gly)、0.10重量%的鳥苷及0.132重量%的色胺酸(假設HCII之總重量為100重量%)。

＜肌肽及甲肌肽之定量＞雞萃取物之肌肽及甲肌肽的定量係在下列條件下藉由HPLC實施。肌肽標準原液係藉由將肌肽粉末添加及溶解於去離子水至2.50 mg/ml的肌肽濃度來製備。甲肌肽標準原液係藉由將L-甲肌肽硝酸鹽粉末添加及溶解於去離子水至3.96 mg/ml的L-甲肌肽濃度來製備。 L-甲肌肽的重量係藉由下式計算。 L-甲肌肽(g) = 0.792 × L-甲肌肽硝酸鹽(g) ＜HPLC分析條件＞裝置：裝有UV偵測器之高效液相層析系統(由Agilent生產之Agilent 1100)。管柱：Zorbax 300-SCX 4.6 mm ID × 250 mm (Agilent) 動相：50 mM磷酸二氫鉀流速：1.0 mL/min 流動通道：通道A(50 mM磷酸二氫鉀)、通道B(乙腈)、通道D(去離子水) UV偵測器波長：210 nm 樣本注射體積：10 μL

＜抗發炎活性評估方法＞在實例及比較例中，抑制發炎性標誌產生的效應係藉由下列方法評估。 (原料及試劑) 雞萃取物(CE)：白蘭氏雞精(Suntory Beverage & Food Asia Pte Ltd，1 ml之肌肽含量：0.94 mg/ml；1 ml之甲肌肽含量：1.9 mg/ml) 軟骨細胞培養基(CM)、胎牛血清(FBS)、軟骨細胞生長補充劑(CGS)及青黴素/鏈黴素(P/S)：ScienCell Research Laboratories IL-1β：R&D Systems 聚-L-離胺酸(PLL)塗佈96孔板(Corning)

＜細胞培養及前處理＞人軟骨細胞(HC-a, ScienCell Research Laboratories)係自人關節軟骨單離且維持於補充有5% FBS、1% CGS及1% P/S之CM中。將細胞以4000個細胞/孔之細胞密度接種於經PLL塗佈之96孔板且於含有5% CO₂ 之增濕氣體室在37℃下培育隔夜。軟骨細胞係經PBS洗滌一次，並經雞萃取物(CE)、HCII、自HCII分餾之餾分P6、餾分P6及CE之組合、含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸之P6化合物、P6化合物及CE之組合、環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸或CE及環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷或色胺酸中任一者之組合處理。在處理24小時後，藉由添加25 ng/m之IL-1β進一步處理軟骨細胞24小時。以1100g離心細胞5分鐘，接著使用上清液進行細胞介素分析。為了進行比較，製備未經CE、HCII、餾分P6、P6化合物、環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸前處理但經IL-1β處理之細胞(經IL-1β處理之細胞)。

(多工細胞介素分析) 使用Pro人細胞介素多工測定(Bio-Rad)分析培養基中之細胞介素。實施下列27工分析：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8 (CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、嗜酸性球趨化因子(CCL11)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、干擾素(IFN)-γ、單核球趨化性蛋白質1 (MCP-1; CCL2)、巨噬細胞發炎性蛋白質1α (MIP-1α; CCL3)、MIP-1β (CCL4)、活化正常T細胞表現及分泌調節因子(RANTES) (CCL5)、TNF-α及血管內皮生長因子(VEGF)。多工測定係根據製造商的說明進行且在MAGPIX平台的Luminex xPONENT上運行。使用Bio-Plex Manager版本6.0進行資料處理。細胞介素及趨化激素濃度係參照標準曲線計算。多工套組之敏感度＜5 pg/mL。

(統計分析) 統計分析係使用GraphPad Prism版本5.0 (GraphPad)進行。所有結果皆表現為平均值±標準差。統計分析係藉由變異數分析(ANOVA)及隨後的事後Tukey's多重比較檢定實施。當p＜0.05，資料被認為具有顯著性。

(比較例1)餾分P6對於抑制發炎性標誌產生的效應為了評估HCII及自HCII分餾之餾分P6對於人軟骨細胞所產生之發炎性標誌(RANTES、MCP-1、IL-6、IL-8、IL-9及MIP-1β)的影響，比較下列四種不同的條件：處理前細胞(未經處理之對照)、經IL-1β處理之細胞、經IL-1β+ HCII處理之細胞(比較例1)及經IL-1β+餾分P6處理之細胞(比較例1)。經HCII處理之細胞及經餾分P6處理之細胞係經HCII或餾分P6前處理。在前處理中，HCII濃度係5 mg/ml，且餾分P6濃度係5 mg/ml。如圖2所示，IL-1β 25 ng/mL誘導人軟骨細胞發炎導致所有發炎性標誌的量相較於未經處理之細胞(對照)顯著增加。經HCII或餾分P6前處理之細胞減少IL-1β所誘導之所有發炎性標誌的量。資料表示為平均值±SD(n=3)。*表示相較於IL-1β(經IL-1β處理之細胞)具有p＜0.05的顯著差異，**表示具有p＜0.01的顯著差異，且***表示具有p＜0.001的顯著差異(除非另以其他方式指示)。

(比較例2)環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸之組合(P6化合物)對於抑制發炎性標誌IL-6產生的效應為了評估含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸之P6化合物(這些組分之比例與HCII中相同)對於人軟骨細胞所產生之發炎性標誌IL-6的影響，比較下列五種不同的條件：處理前細胞(未經處理之對照)、經IL-1β處理之細胞、經IL-1β+HCII處理之細胞(比較例2)、經IL-1β+餾分P6處理之細胞(比較例2)及經IL-1β+P6化合物處理之細胞(比較例2)。經HCII處理之細胞、經餾分P6處理之細胞及經P6化合物處理之細胞係經HCII、餾分P6或P6化合物前處理。在前處理中，HCII濃度係5 mg/ml，餾分P6濃度係5 mg/ml，且P6化合物濃度係100 mg/ml。如圖3所示，IL-1β 25 ng/mL誘導人軟骨細胞發炎導致IL-6的量相較於未經處理之細胞(對照)顯著增加。經HCII、P6或P6化合物前處理之細胞減少IL-1β所誘導之發炎性標誌IL-6的量。資料表示為平均值±SD(n=3)。*表示相較於IL-1β具有p＜0.05的顯著差異，**表示具有p＜0.01的顯著差異，且***表示具有p＜0.001的顯著差異。

(比較例3)環(Pro-Gly)及環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸之組合(P6化合物)對於抑制發炎性標誌MCP-1 (MCAF)產生的效應為了評估含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸之P6化合物(這些組分之比例與HCII中相同)及環(Pro-Gly)(cPG)對於人軟骨細胞所產生之發炎性標誌MCP-1 (MCAF)的影響，比較下列六種不同的條件：處理前細胞(未經處理之對照)、經IL-1β處理之細胞、經IL-1β+HCII處理之細胞(比較例3)、經IL-1β+餾分P6處理之細胞(比較例3)、經IL-1β+P6化合物處理之細胞(比較例3)及經IL-1β+ cPG化合物處理之細胞(比較例3)。經HCII處理之細胞、經餾分P6處理之細胞、經P6化合物處理之細胞及經cPG處理之細胞係經HCII、餾分P6、P6化合物或cPG前處理。在前處理中，HCII濃度係5 mg/ml，餾分P6濃度係5 mg/ml，P6化合物濃度係100 mg/ml，且cPG濃度係50 mg/ml、100 mg/ml或250 mg/ml。如圖4所示，IL-1β 25 ng/mL誘導人軟骨細胞發炎導致MCP-1 (MCAF)的量相較於未經處理之細胞(對照)顯著增加。經HCII、P6、環(Pro-Gly)或P6化合物前處理之細胞減少IL-1β所誘導之發炎性標誌MCP-1 (MCAF)的量。資料表示為平均值±SD(n=3)。*表示相較於IL-1β具有p＜0.05的顯著差異，**表示具有p＜0.01的顯著差異，且***表示具有p＜0.001的顯著差異。

＜實例1＞ HCII及CE之組合的協同效應為了評估HCII及CE之組合對於抑制發炎性標誌MIP-1β產生的協同效應，以單獨HCII、單獨CE或HCII及CE之組合實施前處理。在前處理中，HCII濃度係0.5 mg/ml，且CE濃度係1.25 mg/ml。如5圖所示，HCII 0.5 mg/mL及CE 1.25 mg/mL之組合相較於單獨HCII或CE之處理提供減少發炎之協同效應。資料表示為平均值±SD(n=3)。*表示相較於IL-1β(經IL-1β處理之細胞)具有p＜0.05的顯著差異，**表示具有p＜0.01的顯著差異，且***表示具有p＜0.001的顯著差異(除非另以其他方式指示)。

＜實例2＞在抑制發炎性標誌MCP-1及MIP-1β產生方面HCII及CE之組合的協同效應及餾分P6及CE之組合的協同效應為了評估在抑制發炎性標誌MCP-1及MIP-1β產生方面HCII及CE之組合的協同效應及餾分P6及CE之組合的協同效應，如實例1以單獨IL-1β及HCII、單獨CE、單獨P6、HCII及CE之組合或P6及CE之組合實施前處理。在前處理中，HCII濃度係2.5 mg/mL或5 mg/mL，P6濃度係2.5 mg/ml或5 mg/mL，且CE濃度係6.25 mg/ml。圖6(a)及圖6(b)顯示結果。資料表示為平均值±SD (n=3)。*表示相較於IL-1β(經IL-1β處理之細胞)具有p＜ 0.05的顯著差異，**表示具有p＜0.01的顯著差異，且***表示具有p＜0.001的顯著差異(除非另以其他方式指示)。

＜實例3＞ HCII及CE之組合、P6化合物及CE之組合、環(Pro-Gly)及CE之組合、環(Ala-Hyp)及CE之組合、鳥苷及CE之組合及色胺酸及CE之組合對於抑制發炎性標誌產生的協同效應為了評估HCII及CE之組合、P6化合物及CE之組合、環(Pro-Gly) (cPG)及CE之組合、環(Ala-Hyp) (cAH)及CE之組合、鳥苷及CE之組合及色胺酸及CE之組合對於抑制發炎性標誌IL-6、IL-8、IL-9、MCP-1、MIP-1β及RANTES產生的協同效應，如實例1實施前處理。在前處理中，HCII濃度係2.5 mg/mL，P6化合物濃度係25 mg/ml、125 mg/ml或250 mg/mL，cPG濃度係25 mg/ml、125 mg/ml或250 mg/mL，cAH濃度係25 mg/ml、125 mg/ml或250 mg/mL，鳥苷濃度係25 mg/ml、125 mg/ml或250 mg/mL，色胺酸濃度係25 mg/ml、125 mg/ml或250 mg/mL，且CE濃度係6.25 mg/ml。圖7-1(a)、圖7-1(b)、圖7-2(c)、圖7-2(d)、圖7-3(e)及圖7-3(f)顯示結果。資料表示為平均值±SD(n=3)。*表示相較於IL-1β(經IL-1β處理之細胞)具有p＜0.05的顯著差異，**表示具有p＜0.01的顯著差異，且***表示具有p＜0.001的顯著差異(除非另以其他方式指示)。

＜實例4＞評估HCII及CE對於膝蓋疼痛之效應的隨機分組、雙盲、四組試探研究此試探研究係於單一中心進行，且為雙盲、隨機分組、安慰劑對照研究。

(受試者收案及隨機分組) 使用表3摘列之納入及排除標準總共選擇160位介於45至75歲之間的受試者。將受試者隨機分配至四組，即「安慰劑」、「葡萄糖胺」、「HCII」及「HCII及CE」。各組包括40位受試者。

[表 3]

標準	說明
納入	年齡45至75歲之男性及女性
篩選回診時身體質量指數範圍18.0至30.0 kg/m² (含)且體重至少40 kg之受試者
受試者同意在參與本研究時不參與另一個介入性研究，定義為本研究完成之前簽署知情同意書
經歷膝蓋疼痛≥ 3個月
在平坦表面走路、下樓及/或上樓時評估之WOMAC總疼痛分數≥ 6
受試者患有按照Kellgren-Lawrence分級系統第1至3級之輕度至中度膝蓋骨關節炎(OA)
經歷肌肉強度或身體表現喪失大於1年
在整個研究期間願意避免使用荷爾蒙療法及膳食補充劑，諸如鈣、維生素D、富含蛋白質、Ω-3、Ω-6、葡萄糖胺或軟骨素之補充劑
排除	基於臨床觀察之活動性病毒感染或細菌感染
具有類風濕性關節炎或任何其他發炎性關節炎病史之受試者
慢性醫學病況包括腎功能異常、精神異常或糖尿病(或HbA1c ＞ 6.5%)
中風或心肌梗塞、智能障礙或精神分裂症病史
痛風
Paget氏骨病或椎間盤突出
對蛋白質基底之食物或補充劑不耐或過敏之受試者
過去一年接受抗骨質疏鬆症療法
標靶膝蓋關節(篩選回診時最疼痛的膝蓋關節)在先前3個月期間接受關節內注射 (玻尿酸為6個月)
目前接受皮質類固醇療法
預期進行膝蓋關節鏡或關節造形術
緩解不到1年或仍進行中之危及生命病狀(諸如癌症)
沒有簽署知情同意書之精神或語言能力
雞肉過敏病史
懷孕或泌乳婦女
疑似或已知酒精濫用或成癮 (每週飲用≥ 14份酒精飲料；1份飲料：355mL啤酒或150mL紅酒)
患有計劃主持人認為不適合參與研究之任何其他病況或疾病的受試者
患有可能干擾膝蓋疼痛判別之活動性病狀或干擾依從性之任何病況的受試者

(研究性產品) 「安慰劑」組服用6.8g麥芽糊精及7 mg黃原膠之混合物。「葡萄糖胺」組服用1.5g葡萄糖胺鹽酸鹽。葡萄糖胺鹽酸鹽作為活性對照。「HCII」組服用白蘭氏膠原水解物(Suntory Beverage & Food Asia Pte Ltd)，這是一種水解化雞胸骨軟骨萃取物，由天然存在水解化第II型膠原基質(HCII)及低分子量硫酸軟骨素及玻尿酸(HA)構成。此產品包括含有環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸之HCII。每瓶體積68mL含有2g的HCII，提供天然存在的HCII組成物(66.5%)、去聚合化硫酸軟骨素(18%)及HA (11%)。胸骨軟骨未經表徵之組分佔剩餘4.5%。「HCII及CE」組服用70g白蘭氏雞精(BEC)(乾重：5至6g)及2g HCII於68 mL之混合物。所有測試產品係製備為玻璃瓶中之液體產品，熱量相同，外觀同一且味道及口感相等。參與者必須每天早上早餐後服用研究性產品一次。受試者可以持續使用被視為不影響研究結果的併用藥物或補充劑。允許使用止痛劑或止痛藥作為醫師處方的救援藥物。止痛藥的覆蓋天數比例(PDC)係基於止痛藥併用藥物部分之記錄計算且定義為止痛藥覆蓋天數除以回診之間間隔總天數之百分比。在整個研究持續時間期間禁止任何可能支持關節、骨及肌肉健康的治療或飲食補充劑包括荷爾蒙療法(生長激素、助孕素、雌激素或睪固酮)、鈣及維生素D、富含胺基酸、胜肽、蛋白質、Ω-3、Ω-6、葡萄糖胺或軟骨素之補充劑。

(程序) 研究係由篩選回診(基線回診之前28天)、隨後為基線回診(基線回診係第0天，篩選及基線回診可為同一天)及3次追蹤回診(第8、16及24週)組成。自第-28天至第0天篩選受試者以判定參與研究資格。測試產品的攝取係自基線回診之後一天開始進行連續168天(24週)。連續168天(24週)，受試者每天早上(餐後)服用一瓶測試產品。攝取順從性係記錄於日記卡上。膝蓋疼痛視覺類比量表(VAS)於第0天、第7天及第14天攝取後評分。在研究期間，建議受試者遵照訓練時程在家進行阻抗訓練(非強制性)一週二次、每次30分鐘。訓練係記錄於日記卡上。回診之前一週的食物飲食係使用食物問卷記錄。

(治療順從性) 關於攝取研究性產品的順從性藉由收集未使用產品及受試者記錄的每日消耗記錄檢查。順從性係藉由實際攝食的指定劑量除以回診之間天數的百分比定義。70%的消耗被視為順從。

(運動計畫) 鼓勵所有受試者遵照基線回診時提供的訓練手冊在家進行阻抗訓練30分鐘、一週二次。訓練計畫順從性係記錄於日記卡上且使用下式計算：

[算式1]

≧50%的順從率被視為順從。

(膝蓋疼痛視覺類比量表(VAS)) 視覺類比量表(VAS)係自0至100 mm評分，其中0指示無疼痛，100指示有史以來最嚴重的疼痛。在攝取後第0天、第7天及第14天，請受訪者在量表的連續線上劃一條直線來指出一個位置以表明所感受到的疼痛程度。

(耐受性及安全性) 在整個研究期間記錄自發性報告的不良事件。每次回診監測生命徵象。為了評估研究性產品的安全性，在研究期間的每次回診評估所有參與者的血清及尿液。

(統計分析) 根據事前統計分析計畫，實施按規程統計分析。將攝取順從率≧70%的隨機分組受試者包括在按規程分析中。安全性參數分析係基於服用至少28瓶研究產物的受試者實施。使用百分比報告二分變數，然而連續變數報告為平均值及SD。類別變數的比較係以卡方檢定實施，然而Kruskal-Wallis檢定係用於比較連續變數在組別之間的差異。重複測量變異數分析(ANOVA)係使用混合效應模型實施，該混合效應模型用於測試研究組之間連續主要及次要終點的平均變化差異，以攝取-回診交互作用作為固定效應因子。所有結果對應之p值如果低於0.05，則被認為具有統計顯著性。如果攝取-回診交互作用項具有顯著性，則實施治療組之間的事後、成對比較且調整報告p值。模型中包括預期會影響終點之變數作為因子。包括性別及性別*回診交互作用項作為關節健康分析之因子。此外，對進行阻抗訓練不到總訓練期間第10百分位數之受試者進行子群分析。由獨立統計學家使用SAS版本9.4 (Cary, USA)實施分析。

＜結果＞ (基線特徵及治療順從性) 總共收案160位受試者，151位受試者完成研究且包括於統計分析中(PP)。九位受試者在研究期間退出；不同組別之間退出的數量無顯著差異。沒有退出與攝取研究性產品或安慰劑所造成之任何不良反應相關。沒有注意到不良事件。血清生物化學標誌及尿分析沒有觀察到臨床顯著變化。整體而言，所有四組之間的順從率並無統計差異(表4)。為了評估資料的均質狀態，比較四組之間的所有參數。在基線時研究組之間並無統計顯著差異(表4)。

(膝蓋疼痛之VAS的變化) 在攝取14天後，進行不到總阻抗訓練期間第10百分位數之受試者的子群分析顯示，安慰劑組經歷第14天疼痛分數比起基線顯著增加200%，相較之下HCII+CE (p=0.047)組比起第0天增加42.9%(圖8，表5)。在表5中，「P值($)」是指組別之間的p值；「(a)」表示用於判定p值之方法((a)=單因子ANOVA)；「95%C.I.」表示95%信賴區間。在圖8中，各資料括弧中的二個數值係「平均值-標準差」及「平均值+標準差」。

(結論) 總結來說，HCII及CE的耐受良好且為骨關節炎疼痛病患提供快速及顯著的症狀緩解。相較於安慰劑，HCII及CE之組合僅14天即顯著減少進行極少量阻抗訓練之受試者的膝蓋關節疼痛。活體外研究暗示，作用機制可能是經由修改潛在病程，特別是抑制導致局部疼痛感的發炎。綜上所述，HCII及CE之組合可被視為管理OA症狀之現行醫學及飲食選項之安全且有效的補充劑。 [工業應用]

[圖1] 圖1係摘列雞軟骨的水解化第II型膠原之製備方法的流程圖。 [圖2] 圖2之圖表群中的各圖顯示餾分P6抑制發炎性標誌產生的效應，其中餾分P6係實例中藉由將雞軟骨的水解化第II型膠原(HCII)分餾所獲得之七個餾分中之一者。 [圖3] 圖3的圖表顯示HCII、餾分P6及P6化合物（環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸之組合）抑制IL-6產生之效應。 [圖4] 圖4的圖表顯示HCII、餾分P6、P6化合物（環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷及色胺酸之組合）及環(Pro-Gly) (cPG)抑制MCP-1產生之效應。 [圖5] 圖5的圖表顯示雞軟骨的水解化第II型膠原(HCII)及雞萃取物(CE)之組合抑制發炎性標誌MIP-1β產生之協同效應。 [圖6] 圖6(a)及(b)的圖表顯示在抑制發炎性標誌MCP-1及MIP-1β產生方面HCII、CE、餾分P6的效應、HCII及CE之組合的協同效應及餾分P6及CE之組合的協同效應。 [圖7-1] 圖7-1(a)及(b)的圖表顯示HCII及CE之組合、P6化合物及CE之組合、cPG及CE之組合、環(Ala-Hyp) (cAH)及CE之組合、鳥苷及CE之組合或色胺酸及CE之組合對於抑制發炎性標誌IL-6及IL-8產生的協同效應。 [圖7-2] 圖7-2(c)及(d)的圖表顯示HCII及CE之組合、P6化合物及CE之組合、cPG及CE之組合、cAH及CE之組合、鳥苷及CE之組合或色胺酸及CE之組合對於抑制發炎性標誌IL-9及MCP-1產生的協同效應。 [圖7-3] 圖7-3(e)及(f)的圖表顯示HCII及CE之組合、P6化合物及CE之組合、cPG及CE之組合、cAH及CE之組合、鳥苷及CE之組合或色胺酸及CE之組合對於抑制發炎性標誌MIP-1β及RANTES產生的協同效應。 [圖8] 圖8的圖表顯示在各治療組中進行不到總阻抗訓練期間第10百分位數之受試者(n=8)攝取14天雞軟骨的水解化第II型膠原(HCII)及HCII及雞萃取物(CE)之組合對於第7及14天VAS疼痛分數的效應。

Claims

一種組成物，其包含：選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者；及雞萃取物。
如請求項1之組成物，其中該選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者的總量係0.01至99重量%。
如請求項1或2之組成物，其中該組成物含有衍生自雞軟骨的水解化第II型膠原之組分，該組分具有藉由HPLC凝膠過濾所測定之小於1100之分子量及150至250之重量平均分子量。
如請求項1至3中任一項之組成物，其中該組成物含有雞軟骨的水解化第II型膠原。
如請求項1至4中任一項之組成物，其中該雞萃取物含有肌肽及/或甲肌肽及/或彼等之一或多種鹽。
如請求項1至5中任一項之組成物，其中該組成物係食物、飲料或藥物。
如請求項1至6中任一項之組成物，其中該組成物係用於減輕發炎。
如請求項1至7中任一項之組成物，其中該組成物抑制選自由活化正常T細胞表現及分泌調節因子(RANTES)、單核球趨化性蛋白質1 (MCP-1)、介白素6 (IL-6)、介白素8 (IL-8)、介白素9 (IL-9)及巨噬細胞發炎性蛋白質1 (MIP-1)所組成之群組的至少一種細胞介素的產生。
如請求項1至8中任一項之組成物，其中該組成物係用於預防或減輕發炎性病況或疾病。
一種製造組成物之方法，其包含：將選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者與雞萃取物混合。
如請求項10之方法，其中該混合包括將雞軟骨的水解化第II型膠原與雞萃取物混合，該水解化第II型膠原含有選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者。
如請求項10或11之方法，其中該雞萃取物含有肌肽及/或甲肌肽及/或彼等之一或多種鹽。
一種選自由環(Ala-Hyp)、環(Pro-Gly)、鳥苷、色胺酸及彼等之鹽所組成之群組中至少一者及雞萃取物於產製抗發炎組成物之用途。