TW202114524A - 液化澱粉芽孢桿菌、液化澱粉芽孢桿菌之用途及其代謝產物之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種液化澱粉芽孢桿菌，其寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC 910926，其分類學名命名為(Bacillus amyloliquefaciens，N43)，其包括一16S rRNA，該16S rRNA至少包括部份核甘酸序列為SEQ ID NO:1。本發明另關於一種前述該液化澱粉芽孢桿菌之用途，其係用於抑制或殺死下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：水產病原菌、畜產病原菌及植物病原菌。本發明再關於一種前述該液化澱粉芽孢桿菌之代謝產物之用途，其係用於抑制或殺死下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：水產病原菌及畜產病原菌。
Description
本發明係有關於一種液化澱粉芽孢桿菌、液化澱粉芽孢桿菌之用途及其代謝產物之用途。
植、動物及水產等在生長的過程中，容易遭受到細菌或真菌的感染。然而，以往抑制植、動物及水產感染的方式，是如使用殺真菌劑、殺細菌劑等化學合成的藥劑，然而該些化學合成的藥劑不僅無法於水中分解，更會使細菌跟真菌產生抗藥性，且對一些生物而言具有毒素，如此會造成生物、人體及環境的污染及危害，存在亟待改善之缺弊。
因此，有必要提供一種新穎且具有進步性之液化澱粉芽孢桿菌、液化澱粉芽孢桿菌之用途及其代謝產物之用途，以解決上述之問題。
本發明之主要目的在於提供一種液化澱粉芽孢桿菌、液化澱粉芽孢桿菌之用途及其代謝產物之用途，其抑制或殺死水產病原菌、畜產病原菌或植物病原菌。
為達成上述目的，本發明提供一種液化澱粉芽孢桿菌，寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC 910926，其包括一16S rRNA，該16S rRNA至少包括部份核甘酸序列為SEQ ID NO:1。
為達成上述目的，本發明另提供一種液化澱粉芽孢桿之用途，其係用於抑制或殺死下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：水產病原菌、畜產病原菌及植物病原菌。
為達成上述目的，本發明再提供一種液化澱粉芽孢桿菌之代謝產物之用途，其係用於抑制或殺死下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae)、維羅納產氣單胞菌(Aeromonas veronii)、瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae) 、沙門氏菌、葡萄球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、梭狀桿菌(Clostridium perfringens)、豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)。
以下僅以實施例說明本發明可能之實施態樣，然並非用以限制本發明所欲保護之範疇，合先敘明。
本發明為一種液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC 910926，其分類學名命名為(Bacillus amyloliquefaciens，N43)，其包括一16S rRNA，該16S rRNA至少包括部份核甘酸序列為SEQ ID NO:1。所述該16S rRNA之部份核甘酸序列(SEQ ID NO:1)為N43特殊及重要的技術特徵。
液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)係由納豆食品篩選出來，並進一步培養。液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)為單一菌落型態，其培養方法：使用LB培養基/液(Luria-Bertani agar /broth)，於溫度37度培養24小時，即可觀察到菌落。
該液化澱粉芽孢桿菌(以下簡稱N43)包括下列組成群組至少一基因序列，該組成群組包括： ItuA、ItuB、ItuC、ItuD、bamA、bamB、bamC、bamD、bmyA、 bmyB、bacA、bacB、bacC、bacD、bacE、fenA、fenB、fenC、fenD、fenF、mycA、myB、mycC、sunA、sunT、pks2A、pks2B、pks2C、pks2D、pks2E、pks2F、pks2G、pks2H、pdhA、 mlnI、amyF、amyE、amyK、amyR、amyA、amyM、amyT、Sfp、eriB、dfnA、baeS及fosB之基因序列。
N43對下列組成群組至少一抗生素具有抗性，該組成群組包括：安莫西林(Amoxicillin)、黏桿菌素(Colistin)及泰妙素(Tiamulin)之抗生素。
>N43藥物敏感性試驗>
1. 製備指示菌液：取N43液化澱粉芽孢桿菌(N43，1×1011
CFU/g)的菌粉，調製為懸浮液做為指示菌液 (菌數1×1010
CFU/mL(每毫升樣品中含有的細菌菌落總數))。
2. 配製檢測培養皿：培養基(Nutrient agar)係經 122℃/20 min(分)滅菌後冷卻至 45-50℃，以 100.00 mL(毫升)培養基添加 100.00μL(微升)指示菌液之比例混合均勻後(使培養基中菌體濃度達到1×108
CFU/mL)，倒約 20.00 mL 於直徑 9.00 cm(公分) 之無菌塑膠培養皿 (內置 4 個外徑 8.00 mm(毫米) 滅菌之不鏽鋼圈)並於凝固後取出不鏽鋼使用而使無菌塑膠培養皿具有複數孔洞。
3. 檢測N43對抗生素的敏感性：取安莫西林(Amoxicillin)、黏桿菌素(Colistin)及泰妙素(Tiamulin)以超純水個別配置為1000ppm(百萬分點濃度)、500.00ppm、250.00ppm與100.00ppm濃度，再以無菌0.20μm(微米)過濾膜分別過濾後備用，取上述的各個濃度(1000.00ppm、500.00ppm、250.00ppm與100.00ppm)之安莫西林(Amoxicillin)、黏桿菌素(Colistin)及泰妙素(Tiamulin)的抗生素150.00μL注入製備好的檢測平板(取出不鏽鋼之無菌塑膠培養皿)中的其中一該孔洞中，溫度 37℃ 培養箱培養 24 hr，觀察是否有抑制圈的產生。
請參考圖1，其為試驗結果，顯示試驗劑量為100.00ppm~1000.00ppm的安莫西林(Amoxicillin)、黏桿菌素(Colistin)與泰妙素(Tiamulin)，對於N43並無明顯抑制作用，安莫西林(Amoxicillin)、黏桿菌素(Colistin)與泰妙素(Tiamulin)等為飼料中常用的抗生素，藉此N43可與上述抗生素搭配使用，以提升在腸道中的作用。進一步說明，圖1中各無菌塑膠培養皿上對應抑制圈的數字表示為試驗劑量濃度(左上為1000.00ppm、右上為500.00ppm、左下為100.00ppm、右下為250.00ppm)。
N43用於抑制或殺死下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：水產病原菌、畜產病原菌及植物病原菌，如下詳細說明。
該水產病原菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈威弧菌(Vibrio harveyi)、親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)及乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)，如此得以廣泛抑制或殺死海洋、淡水、半鹹水養殖等中常見的病原菌。
該畜產病原菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：沙門氏菌、葡萄球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、梭狀桿菌(Clostridium perfringens)、豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)。
>N43菌粉體外抑制水產病原菌效能測試>
1. 配置N43菌粉(受測N43菌液)：配製不同濃度之N43菌粉，分別為1.00 mg/mL(濃度)、5.00 mg/mL及10.00 mg/mL，並分別溶解於1X PBS緩衝溶液(0.01M的磷酸鹽緩衝液)中，得到1.00 mg/mL(毫克/毫升)、5.00 mg/mL及10.00 mg/mL之N43菌液並分別於28℃下進行活化(overnight)後備用。
2. 稀釋不同待測試之病原菌：將溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈威弧菌(Vibrio harveyi)、親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)及乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)等病原菌分別稀釋至約105
CFU /mL後，分別塗佈於適合該等病原菌生長之培養基上。
3. 於塗佈有上述病原菌的培養基上製造可容納約20 uL(微升)液體之凹槽(well)。另以1X PBS作為負對照組(Negative control)。
4. 各取20.00μL不同濃度(1 mg/mL、5 mg/mL及10 mg/mL)之N43菌液添加於已塗佈上述病原菌之培養基之凹槽中(步驟2)，於28℃下進行培養24小時至48小時，觀察抑菌環形成情形。每一受測N43菌液進行3重複。
表一、N43菌粉對不同水產病原菌之生長抑制測試
| 病原菌 | N43菌粉濃度(mg/mL) | |||
| 1 | 5 | 10 | ||
| V. alginolyticus G(-) 海水菌 |  | 1.2 | 1.8 | 抑菌環直徑(cm，公分) |
| V. parahaemolyticus G(-)海水菌 |  | 1.2 | 1.4 | 抑菌環直徑(cm，公分) |
| V. harveyi G(-) 海水菌 |  |  |  | 抑菌環直徑(cm，公分) |
| Aeromonas hydrophila G(-)半淡鹹水 | 2.0 |  | 2.0 | 抑菌環直徑(cm，公分) |
| S. iniae G(+) 淡水、半淡鹹水 | N.D. | 2.0 |  | 抑菌環直徑(cm，公分) |
| L. garvieae G(+) 淡水、半淡鹹水 |  |  |  | 抑菌環直徑(cm，公分) |
請參考圖2至圖4及表一可知，受測N43菌液對不同水產病原菌產生的抑菌環大小不同，以顯示受測N43菌液對水產病原菌不同程度的抑制效能，如下詳細說明。圖2至圖4依序顯示受測N43菌液對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈威弧菌(Vibrio harveyi)隨測試濃度升高，抑菌環透明區域較大，各圖中由左至右的濃度依序為1.00 mg/mL、5.00 mg/mL及10.00 mg/mL，如此受測N43菌液濃度愈高，抑菌效佳。
再請參考圖5及表一，受測N43菌液對親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)的生長抑制效能優於對弧菌屬(Vibrio spp.)的生長抑制效能，從初步測試結果顯示抑菌環大小未隨菌粉濃度改變而有明顯差異， 1.00 mg/mL濃度之受測N43菌液及10.00 mg/mL濃度之受測N43菌液分別的抑菌環大小皆為2.00 cm左右，表示在低濃度時受測N43菌液即可對親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)產生抑制效應。
請參考圖6至圖7及表一，顯示受測N43菌液分別對皆是革蘭氏陽性菌的瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)(如圖6)及乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)(如圖7)進行生長抑制測試，顯示瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)及乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)的生長分別有明顯的抑菌環透明環帶，且隨菌粉濃度增加而較大，因此受測N43菌液對瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)及乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)具明顯之生長抑制效能。
該液化澱粉芽孢桿菌之代謝產物(不含微生物)用於抑制或殺死下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae)、維羅納產氣單胞菌(Aeromonas veronii) 、沙門氏菌、葡萄球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、梭狀桿菌(Clostridium perfringens)及豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)，如此得以廣泛抑制或殺死淡水、半鹹水、畜產等中常見的病原菌。
> N43之代謝產物(不含微生物)體外抑制水產病原菌效能測試>
1. 配置除菌過濾液：取20.00 mg(毫克)的N43菌粉，並溶解於1 mL(毫升)逆滲透(RO)水中，於28℃下作用30分鐘後，以0.22μm(微米)濾膜進行過濾，取濾液進行後續抗菌測試。
2. 培養皿預先放入不鏽鋼環以形成凹槽。將親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae)及維羅納產氣單胞菌(Aeromonas veronii)等測試病原菌稀釋至約103
-106
CFU/mL後(稀釋倍數視菌種而定)並分別與20 mL已滅菌、未凝固之相對應數量之適當培養基混合均勻，倒入培養皿中(放置複數不鏽鋼環)，待培養基凝固後將該複數不鏽鋼環取出而形成複數凹槽。
3. 於上述含不同病原菌之各培養基之凹槽內分別加入150μL測試液(3 mg/mL)，測試液包括除菌過濾液(圖9至圖10上編號1至3，每一測試液進行3重複)、陽性對照(Positive control，廣效性抗生素：0.03 mg/mL氟甲磺氯黴素；圖9至圖10上編號F)、陰性對照(Negative control，包括培養基過濾液(圖9至圖10上編號M)及溶解N43菌粉的水)。於28℃下進行培養24小時至48小時，觀察抑菌環形成情形。
表二、N43之代謝產物對不同水產病原之生長抑制測試
| 病原菌 | 抑菌環大小(cm) | Positive control (cm) | |
| 產氣單胞菌屬(Aeromonas spp.) | 豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae G(-)) |  | 1.3 |
| 親水性產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila G(-)) |  | 1.3 | |
| 維羅納產氣單胞菌(Aeromonas veronii G(-)) |  | 1.3 | |
| 鏈球菌屬 | 瓶鼻海豚鏈球菌(S. iniae G(+)) |  | 1.0 |
請參考圖8至圖10及表二，N43之代謝產物對產氣單胞菌屬病原菌(Aeromonas spp.)包括親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)(如圖9)、豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae)(如圖8)及維羅納產氣單胞菌(Aeromonas veronii)(如圖10)的生長具有非常明顯的抑制效應，特別是對豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae)及親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)形成之抑菌環大小不亞於陽性對照(Positive control，廣效性抗生素)。請參考圖11及表二，為除菌過濾液對革蘭氏陽性菌的瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)進行生長抑制測試，測試顯示除菌過濾液對瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)生長具抑制效應，形成之抑菌環大小亦不亞於抗生素，因此N43之代謝產物可抑制水產病原菌，含有抑制水產病原菌之抗菌物質。
>N43抑制豬赤痢螺旋體抑菌試驗>
下述實驗所提及的培養基為血瓊脂基(Blood Agar，包含血液瓊脂基礎(Blood Agar Base)、脫纖維綿羊血、稀釋產品)；菌株為豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)田間分離共57株。
將N43及乳酸菌抑制蛋白分別以兩倍稀釋連續稀釋成8種不同濃度(稀釋濃度範圍62.50 mg/L至8,000 mg/L)。敏感性試驗如下：
1. 將畜牧場所分離且經鑑定過的豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)菌株依美國臨床和實驗室標準化單位(Clinical & Laboratory Standards Institute； CLSI, 2014)對厭氧菌規範之標準操作流程以瓊脂稀釋法進行最小濃度抑制試驗。
2. 於37°C厭氧環境下培養96小時候，進行判讀。
N43實驗結果：豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration:MIC）值分布範圍為1,000.00 ppm至62.50 ppm，其MIC50
及MIC90
皆為500.00ppm，如圖12。藉此，N43使用於豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)感染症時，應有良好的治療成效。
>N43之代謝物之畜產病原菌體外抑菌試驗>
下述實驗所提及的孔盤為U型底之96孔盤(96 well cell culture plate-U type)； 培養液：Mueller-Hinton II broth (MH II broth，BBLTM
)；病原菌菌株：豬源及雞源之沙門氏桿菌分別100株、大腸桿菌100株、葡萄球菌50株與梭狀桿菌29株。
1. 配置22.00 g/L濃度之培養液(MH II broth)，以121°C高溫高壓滅菌15分鐘。
2. 滅菌完成之培養液(MH II broth)培養液冷卻至室溫後，將100.00µL MH II broth 加入孔盤第二行至第十二行。
3. 孔盤第一行加入180.00µL培養液(MH II broth)後，再加入20.00µL十倍稀釋N43之過濾液(不含微生物)，均勻混合並吸取100.00µL至第二孔，依序每一行以前一行的濃度進行兩倍稀釋。
4. 分別將配置麥式標準濁度(0.5McFarland 0.5)為的上述該些病原菌菌株之細菌液(約1.5 x 108
CFU/mL)於孔盤各孔洞中加入5.00µL。
5. 將孔盤置入37.00℃恆溫培養箱，培養16小時至20小時後進行判讀。
請參考圖13至圖14，上述試驗結果根據最小抑制濃度實驗結果分析，N43之代謝物對革蘭氏陽性菌(葡萄球菌及梭狀桿菌)與革蘭氏陰性菌(沙門氏菌及大腸桿菌)都具有抑制性，而對葡萄球菌及梭狀桿菌具有較高的敏感性，尤其是對梭狀桿菌敏感性最佳。
>N43菌粉實際投予蛋雞之沙門氏菌試驗>
1. 採樣樣本：102年9月4號於實驗蛋雞場採集20隻蛋雞的糞便，作為投N43菌粉前之基礎對照組，於102年9月8日投予該批雞隻N43菌粉，且該N43菌已經過藥抗菌劑紙錠擴散法(Disk-diffusion)與藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration:MIC）實驗室試驗，確定可抑制沙門氏菌生長，於102年9月25日、102年10月2日及102年10月16日皆採集同一批雞，30隻蛋雞的糞便。
2. 沙門氏菌分離：將上述採集的糞便分別以約10.00g(克)置於連四硫基鹽肉湯 (Tetrathionate broth，TT)，於37°C培養箱培養18小時；再取100.00µL連四硫基鹽肉湯(Tetrathionate broth，TT)培養液加入氯化鎂孔雀綠肉湯（Rappaport-Vassiliadis R10 Broth；R10）置於42°C培養箱培養24小時；再利用無菌釣菌環沾取氯化鎂孔雀綠肉湯（Rappaport-Vassiliadis R10 Broth）接種至BPLS培養基(Brilliant-green phenol-red lactose sucrose agar)，於37°C培養箱培養24小時後，於培養基劃線區域可見背景為紅色之白色菌落生長。刮取BPLS培養基上之單一菌落接種至TSA培養基(Tryptic Soy Agar)進行純化，於37°C培養箱培養24小時。
3. 沙門氏菌鑑定：(a)、核酸萃取(Extraction of nucleic acid)：以無菌釣菌環刮取TSA培養基上之單一菌落並依細菌真菌基因組核酸純化試劑組(Genomic DNA Purification Kit；BioKit®
)所述步驟萃取核酸。(b)、聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)：將分離萃取之細菌核酸以針對沙門氏菌(Salmonella spp.)所設計之引子隊進行增幅，最後將產物保存於4°C，以備進行後續電泳分析，預期產物大小為243 bp。(c)、電泳分析(Electrophoresis analysis)：以2%瓊脂凝膠(Agarose gel)將沙門氏菌(Salmonella spp.)之聚合酶鏈鎖反應產物(PCR產物)以進行電泳再置於溴化乙錠(Ethidium bromide; EtBr)染色後，於紫外燈箱內觀察，結果顯示沙門氏桿菌陽性。結果如圖15至圖16所示，N43菌粉於投N43菌粉兩週後即將沙門氏菌分離率明顯的從45%下降至3%，且於停藥(投N43菌粉四週後)一週後(10月16日)之分離結果顯示藥物仍可持續作用。顯示N43菌粉可抑制沙門氏菌生長，已達減少雞隻腸內沙門氏菌數量，增進雞隻生長健康及產蛋之安全衛性，並且投N43菌粉前隻糞便外觀較為潮濕且軟而不成形，投N43菌粉後雞隻的糞便較為乾燥、成型且顆粒分明。在分離過程中可見氯化鎂孔雀綠肉湯（Rappaport-Vassiliadis R10 Broth）培養後之液體，從較混濁淡藍色轉為清澈之深藍色，表示雞隻腸內菌叢不只沙門氏菌連同其他害菌也減少。
上述該沙門氏菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella Typhimurium)、豬霍亂沙氏桿菌(Salmonella Choleraesuis)、德貝沙氏桿菌(Salmonella Derby)、沙門氏菌血清型(Salmonella Schwarzengrund)、利文斯通沙門菌(Salmonella Livingstone)、紐波特沙門氏菌(Salmonella Newport)、哈達爾沙門氏菌(Salmonella Hadar)、奧 爾 巴 尼 沙 門 氏 菌(Salmonella Albany)、波 茨 坦 沙 門 氏 菌(Salmonella Potsdam)。上述該葡萄球菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：蜂巢葡萄球菌/豬葡萄球菌 (Staphylococcus hyicus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、阿根提葡萄球菌 (Staphylococcus agnetis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、科氏葡萄球菌 (Staphylococcus cohnii)。
詳細地說，該植物病原菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：十字花科黑腐菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)、小白菜軟腐病菌(Pectobacterium carotovorum、木瓜炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penzig)、木瓜疫病菌(Phytophthora palmivora (Butler)Butler)、木瓜蒂腐病菌(Botryodiplodia theobromae Pat.(Papaya)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas campestris pv. oryzae)、水稻立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻熱病菌(Magnaporthe grisea)、甘藍黑斑病菌(Alternaria brassicae (Berk.)Sacc)、百合白絹病菌(Sclerotium rolfsii Saccardo)、百合灰黴病菌(Botrytis elliptica)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv. mangiferaindica)、芒果畸形病菌(Fusarium mangiferae)、玫瑰灰黴病菌(Botrytis cinerea)、柑桔青黴菌(Penicillium italicum)、洋蔥黃萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. Cepae)、洋蔥黑麴菌(Aspergillus niger)、紅龍果果腐病菌(Biporlaris sp.)、紅龍果濕腐病菌(Gilbertella persicaria)、胡麻葉枯菌(Bipolaris oryzae (breda de haan)shoemaker)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、荔枝鐮胞菌 (Fusarium solani)、甜柿炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides)、甜椒疫菌(Phytophthora capsici)、棗子炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioide)、番石柳黑星病菌 (Phyllosticta psidiicola)、番石榴立枯病菌 (Myxosporium psidii Sawada etKurosawa)、番石榴瘡痂病菌 (Pestalotio psispsidii)、番茄鐮胞菌 (Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici)、黃萎病菌 (Fusarium sp.)、葵百合立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani)、鳳梨青黴菌 (Penicillium spp.)、蓮霧果腐病菌 (Pestalotia euginac)、蓮霧果腐菌 (Pestalotiopsis eugeniae)、蓮霧炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)Sacc.)、蓮霧黑腐病菌 (Lasiodiplodia theobromae)、褐根病菌 (Phellinus noxius)、豌豆鐮胞菌 (Fusarium oxysporum f.sp. pisi)、檬果炭疽病菌 (Glomerella cingulata)、檬果炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)Sacc.)、檬果蒂腐病菌 (Botryodiplodia theobromae (Pat.)Mango)、檬果蒂腐菌(Botryodiplodia theobromae)、蘋果褐斑病菌(Alternaria mali)、蘭花鐮胞菌 (Fusarium solani)、菌性軟腐桿菌 (Erwinia chrysanthemi)、細菌性軟腐桿菌 (Erwinia carotovora subsp. carotovora)、十字花科黑腐菌 (Xanthomonas campestris pv. compestris)、水稻白葉枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)、仙人掌桿菌 (Bacillus cereus)、瓜類細菌性斑點菌 (Acidovorax avenae subsp.citrulli)、石竹科花卉細菌性萎凋菌 (Burholderia caryophylli)、芋頭細菌性軟腐 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)、青枯病菌 (Ralstonia solanacearum)、柑桔潰瘍病菌 (Xanthomonas axonopodis pv. citri)、茄科青枯病菌 (Ralstonia solanacearum)、茄科植物細菌性斑點菌(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)、茭白細菌性基腐菌 (Enterobactor cloaceae)、細菌性軟腐桿菌(Erwinia chrysanthemi)、番茄細菌性斑點病 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)、楊桃細菌性斑點菌 (Pseudomonas syringae)、蝴蝶蘭軟腐病菌 (Pectobacteriaum chrysanthemi)、蝴蝶蘭褐斑病菌 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae)、癌腫菌 (Agrobacterium tumefaciens)。
N43係用於動物飼料添加劑、促進植物生長劑、水產養殖的細菌病毒殺菌劑。
無
圖1為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)對抗生素的敏感性之分析圖。
圖2為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑制效能之分析圖。
圖3為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)對腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的抑制效能之分析圖。
圖4為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)對哈威弧菌(Vibrio harveyi)的抑制效能之分析圖。
圖5為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)對親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)的抑制效能之分析圖。
圖6為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)對瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)的抑制效能之分析圖。
圖7為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)對乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)的抑制效能之分析圖。
圖8為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)之代謝產物對豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae)的抑制效能之分析圖。
圖9為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)之代謝產物對親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)的抑制效能之分析圖。
圖10為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)之代謝產物對維羅納產氣單胞菌(Aeromonas veronii)的抑制效能之分析圖。
圖11為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)之代謝產物對瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)的抑制效能之分析圖。
圖12為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)及乳酸菌抑菌蛋白之試驗結果分析圖。
圖13及圖14為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)之代謝物對革蘭氏陰、陽性菌抑制之試驗結果分析圖。
圖15及圖16為本發明為本發明液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)實際投予之蛋雞沙門氏菌抑菌試驗結果分析圖。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所 2019/8/20 BCRC 910926
Claims (13)
- 一種液化澱粉芽孢桿菌，寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC 910926，其包括一16S rRNA，該16S rRNA至少包括部份核甘酸序列為SEQ ID NO:1。
- 如請求項1所述的液化澱粉芽孢桿菌，其包括下列組成群組至少一基因序列，該組成群組包括： ItuA、ItuB、ItuC、ItuD、bamA、bamB、bamC、bamD、bmyA、 bmyB、bacA、bacB、bacC、bacD、bacE、fenA、fenB、fenC、fenD、fenF、mycA、myB、mycC、sunA、sunT、pks2A、pks2B、pks2C、pks2D、pks2E、pks2F、pks2G、pks2H、pdhA、 mlnI、amyF、amyE、amyK、amyR、amyA、amyM、amyT、Sfp、eriB、dfnA、baeS及fosB之基因序列。
- 如請求項1所述的液化澱粉芽孢桿菌，其對下列組成群組至少一抗生素具有抗性，該組成群組包括：安莫西林(Amoxicillin)、黏桿菌素(Colistin)及泰妙素(Tiamulin)之抗生素。
- 一種如請求項1至3其中任一項所述之液化澱粉芽孢桿菌之用途，其係用於抑制或殺死下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：水產病原菌、畜產病原菌及植物病原菌。
- 如請求項4所述之液化澱粉芽孢桿菌之用途，其中該水產病原菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈威弧菌(Vibrio harveyi)、親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)。
- 如請求項4所述之液化澱粉芽孢桿菌之用途，其中該畜產病原菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：沙門氏菌、葡萄球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、梭狀桿菌(Clostridium perfringens)、豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)。
- 如請求項6所述之液化澱粉芽孢桿菌之用途，其中該沙門氏菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella Typhimurium)、豬霍亂沙氏桿菌(Salmonella Choleraesuis)、德貝沙氏桿菌(Salmonella Derby)、沙門氏菌血清型(Salmonella Schwarzengrund)、利文斯通沙門菌(Salmonella Livingstone)、紐波特沙門氏菌(Salmonella Newport)、哈達爾沙門氏菌(Salmonella Hadar)、奧 爾 巴 尼 沙 門 氏 菌(Salmonella Albany)、波 茨 坦 沙 門 氏 菌(Salmonella Potsdam)。
- 如請求項6所述之液化澱粉芽孢桿菌之用途，其中該葡萄球菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：蜂巢葡萄球菌/豬葡萄球菌 (Staphylococcus hyicus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、阿根提葡萄球菌 (Staphylococcus agnetis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、科氏葡萄球菌 (Staphylococcus cohnii)。
- 如請求項4所述之液化澱粉芽孢桿菌之用途，其中該植物病原菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：十字花科黑腐菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)、小白菜軟腐病菌(Pectobacterium carotovorum)、木瓜炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penzig)、木瓜疫病菌(Phytophthora palmivora Butler)、木瓜蒂腐病菌(Botryodiplodia theobromae Pat.)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas campestris pv. oryzae)、水稻立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻熱病菌(Magnaporthe grisea)、甘藍黑斑病菌(Alternaria brassicae (Berk.)Sacc)、百合白絹病菌(Sclerotium rolfsii Saccardo)、百合灰黴病菌(Botrytis elliptica)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv. mangiferaindica)、芒果畸形病菌(Fusarium mangiferae)、玫瑰灰黴病菌(Botrytis cinerea)、柑桔青黴菌(Penicillium italicum)、洋蔥黃萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. Cepae)、洋蔥黑麴菌(Aspergillus niger)、紅龍果果腐病菌(Biporlaris sp.)、紅龍果濕腐病菌(Gilbertella persicaria)、胡麻葉枯菌(Bipolaris oryzae (breda de haan)shoemaker)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、荔枝鐮胞菌 (Fusarium solani)、甜柿炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides)、甜椒疫菌(Phytophthora capsici)、棗子炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioide)、番石柳黑星病菌 (Phyllosticta psidiicola)、番石榴立枯病菌 (Myxosporium psidii Sawada etKurosawa)、番石榴瘡痂病菌 (Pestalotio psispsidii)、番茄鐮胞菌 (Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici)、黃萎病菌 (Fusarium sp.)、葵百合立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani)、鳳梨青黴菌 (Penicillium spp.)、蓮霧果腐病菌 (Pestalotia euginac)、蓮霧果腐菌 (Pestalotiopsis eugeniae)、蓮霧炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)Sacc.)、蓮霧黑腐病菌 (Lasiodiplodia theobromae)、褐根病菌 (Phellinus noxius)、豌豆鐮胞菌 (Fusarium oxysporum f.sp. pisi)、檬果炭疽病菌 (Glomerella cingulata)、檬果炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)Sacc.)、檬果蒂腐病菌 (Botryodiplodia theobromae (Pat.)Mango)、檬果蒂腐菌(Botryodiplodia theobromae)、蘋果褐斑病菌(Alternaria mali)、蘭花鐮胞菌 (Fusarium solani)、菌性軟腐桿菌 (Erwinia chrysanthemi)、細菌性軟腐桿菌 (Erwinia carotovora subsp. carotovora)、十字花科黑腐菌 (Xanthomonas campestris pv. compestris)、水稻白葉枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)、仙人掌桿菌 (Bacillus cereus)、瓜類細菌性斑點菌 (Acidovorax avenae subsp.citrulli)、石竹科花卉細菌性萎凋菌 (Burholderia caryophylli)、芋頭細菌性軟腐 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)、青枯病菌 (Ralstonia solanacearum)、柑桔潰瘍病菌 (Xanthomonas axonopodis pv. citri)、茄科青枯病菌 (Ralstonia solanacearum)、茄科植物細菌性斑點菌(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)、茭白細菌性基腐菌 (Enterobactor cloaceae)、細菌性軟腐桿菌(Erwinia chrysanthemi)、番茄細菌性斑點病 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)、楊桃細菌性斑點菌 (Pseudomonas syringae)、蝴蝶蘭軟腐病菌 (Pectobacteriaum chrysanthemi)、蝴蝶蘭褐斑病菌 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae)、癌腫菌 (Agrobacterium tumefaciens)。
- 如請求項9所述之液化澱粉芽孢桿菌之用途，其係用於動物飼料添加劑、促進植物生長劑；其中該水產病原菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈威弧菌(Vibrio harveyi)、親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)、豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae)及維羅納產氣單胞菌(Aeromonas veronii)；該畜產病原菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：沙門氏菌、葡萄球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、梭狀桿菌(Clostridium perfringens)、豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)；該沙門氏菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella Typhimurium)、豬霍亂沙氏桿菌(Salmonella Choleraesuis)、德貝沙氏桿菌(Salmonella Derby)、沙門氏菌血清型(Salmonella Schwarzengrund)、利文斯通沙門菌(Salmonella Livingstone)、紐波特沙門氏菌(Salmonella Newport)、哈達爾沙門氏菌(Salmonella Hadar)、奧 爾 巴 尼 沙 門 氏 菌(Salmonella Albany)、波 茨 坦 沙 門 氏 菌(Salmonella Potsdam)；該葡萄球菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：蜂巢葡萄球菌/豬葡萄球菌 (Staphylococcus hyicus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、阿根提葡萄球菌 (Staphylococcus agnetis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、科氏葡萄球菌 (Staphylococcus cohnii)。
- 一種如請求項1至3其中任一項所述之液化澱粉芽孢桿菌之代謝產物之用途，其係用於抑制或殺死下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：親水性產氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、豚鼠產氣單胞菌(Aeromonas cavieae)、維羅納產氣單胞菌(Aeromonas veronii)、瓶鼻海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、沙門氏菌、葡萄球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、梭狀桿菌(Clostridium perfringens)、豬赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)。
- 如請求項11所述之液化澱粉芽孢桿菌之代謝產物之用途，其中該沙門氏菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella Typhimurium)、豬霍亂沙氏桿菌(Salmonella Choleraesuis)、德貝沙氏桿菌(Salmonella Derby)、沙門氏菌血清型(Salmonella Schwarzengrund)、利文斯通沙門菌(Salmonella Livingstone)、紐波特沙門氏菌(Salmonella Newport)、哈達爾沙門氏菌(Salmonella Hadar)、奧 爾 巴 尼 沙 門 氏 菌(Salmonella Albany)、波 茨 坦 沙 門 氏 菌(Salmonella Potsdam)。
- 如請求項11所述之液化澱粉芽孢桿菌之代謝產物之用途，其中該葡萄球菌包括下列組成群組至少一病原菌，該組成群組包括：蜂巢葡萄球菌/豬葡萄球菌 (Staphylococcus hyicus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、阿根提葡萄球菌 (Staphylococcus agnetis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、科氏葡萄球菌 (Staphylococcus cohnii)。
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| CN113966747A (zh) * | 2021-06-30 | 2022-01-25 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种防治莲雾果实拟盘多毛孢果腐病及炭疽病的纳米银复合芽孢杆菌菌剂及其制作方法 |
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