TW202106710A - 貝伐單抗的眼藥組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種貝伐單抗的眼藥組合物，其在單次使用的預填充注射器中是安全無毒的，並且在有效日期內給藥是有效的。其特徵在於，在產品的有效期限2年內適於玻璃體內使用的眼藥溶液，其能對內毒素程度顯著降低且聚集程度低的不可目視顆粒物的數量進行控制。

Description

貝伐單抗的眼藥組合物
本發明關於生物技術及藥物釋放領域。特別地，本發明關於貝伐單抗的眼藥組合物及包含組合物的裝置。
貝伐單抗（Bevacizumab）是一種重組人源化單株抗體，其包含人抗體框架區和鼠抗體的互補決定區，該鼠抗體與人血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）結合並抑制其生物學活性。貝伐單抗已獲許可治療各種癌症，包括轉移性大腸直腸癌（mCRC）、非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）、轉移性乳癌（MBC）、轉移性腎細胞癌（mRCC）、神經膠質母細胞瘤和晚期子宮頸癌。在這些適應症中，貝伐單抗已證明對患者的安全性和生存率有效。此外，它還被用作治療濕性老年性黃斑點退化（wAMD）、脈絡膜新血管形成（CNV）、糖尿病性黃斑水腫（DME）、視網膜靜脈阻塞（RVO）和新生血管性青光眼（NVG）的藥品仿單標示外使用的藥物。或者，另一種單株抗體，蘭尼單抗（Ranibizumab），一種經美國食品藥品管理局批准用於治療濕性老年性黃斑點退化、脈絡膜新血管形成、糖尿病性黃斑水腫等的藥物也正在市場上。儘管貝伐單抗和蘭尼單抗之間的療效和安全性似乎沒有差異，但多項研究證明，如果使用貝伐單抗代替蘭尼單抗，則存在巨大的成本優勢。
由於貝伐單抗已被批准用於癌症，因此有100 mg或400 mg的小瓶裝，旨在根據體重為個體提供完整劑量。當將貝伐單抗用於濕性老年性黃斑點退化時，眼科醫生通常會從小藥瓶中多次重複注射相當小的劑量，每次劑量低至1.25 mg（多劑量使用）。任何用於玻璃體內給藥的藥物都需要製備於並保持在無菌環境中。當在給藥前在裝置中抽取重構溶液將注射液準備在小瓶中時，會存在污染的風險。受污染的藥物使患者處於進一步感染的危險中，例如感染性眼內炎、α溶血性鏈球菌感染。在全球某些地區，醫生會從原始藥瓶中吸出所需的藥物，並且連續許多患者使用同一藥瓶，事實證明這種做法對患者的安全性並不佳，因為從同一藥瓶中穿刺的次數不斷增加，增加了患者污染和感染的機會。此外，由於醫務人員或護理人員的人為失誤，劑量可能會不準確。
在某些國家，調製藥局會從原始藥瓶中重新包裝多個注射器。將藥物從可用的小瓶中重新包裝成較小的劑量的需求，增加了污染傳播的可能性，尤其是因為在這樣的操作過程中很難保持無菌條件，並且沒有辦法檢查調製藥局是否在操作時遵循了這樣的程序。美國食品藥品監督管理局已在一些情況下記錄並發布了有關這些調製藥局使用無菌技術和劑量控制的警告通知，但這種做法仍很普遍。此外，由於無菌問題和美國的擔憂，一些調製藥局還召回了貝伐單抗重新包裝的注射器。美國食品藥品監督管理局現在警告醫療和護理人員不要將重新包裝的貝伐單抗注射液用於眼內使用。除此之外，貝伐單抗被製成用於靜脈內給藥，因此粒度分佈的標準至關重要。如果顆粒不受控制，則會在敏感器官（如眼睛）中產生刺激及/或發炎。據報導，對於這種重新包裝的可注射眼用溶液，其粒度分佈超出了美國藥典所設定的限制，並且通常在不同的調製藥局中沒有標準化和統一。
除安全性問題外，藥物本身可能具有與產品等分試樣、處理及分配有關的各種功效。變質也可能取決於所用的特定包裝，並且重新包裝的貝伐單抗穩定性降低可能與儲存時間有關。除了這些更改可能帶來的安全隱患外，藥物的功效也可能會受到影響。同樣，重新包裝的貝伐單抗的儲存穩定性也是一個主要問題，印度藥品管制總局發布了有關重新包裝貝伐單抗的指南，建議在指定條件下使用重新包裝的貝伐單抗注射器不多於14天，以防止劣化及變性。但是，沒有有效的機制來確定在儲存期間重建及/或變性或劣化後的期限。用於給藥的包裝產品的進一步重構是複雜且繁瑣的過程，並且可能並不總是形成均質的溶液。此外，有報導稱，隨著全球供應鏈變得越來越複雜，假冒的癌思停（Avastin）在國際上也被追查，事實證明，這越來越具有挑戰性。
通過實施嚴格的監管準則，可以減少與將貝伐單抗調製為小劑量用於玻璃體內使用和假冒貝伐單抗有關的某些問題，但是諸如細菌內毒素測試（BET）和顆粒物測試（PMT）限制之類的現有技術的問題需要特定的技術解決方案和製造控制以消除現有技術的問題並提供眼藥玻璃體內注射可接受的產品。
與玻璃體內注射貝伐單抗相關的不良事件的報導越來越多，包括眼內無菌炎症、感染性眼內炎和眼內壓升高的發生率。與貝伐單抗玻璃體內給藥有關的某些報導的不良事件可能與貝伐單抗的生產方式有關，或者由於重新包裝到塑料注射器中而導致藥物品質下降。除此之外，用於玻璃體內注射的針頭和注射器產生的矽滴使情況變得最糟。
以下列出與現有技術產品的產品品質有關的問題： 貝伐單抗目前僅符合靜脈內品質標準，而不符合關於不可目視顆粒物和內毒素程度的更嚴格的眼藥標準。 在玻璃體內注射的情況下，不可目視顆粒物及/或矽油的存在事關嚴重（在眼內積聚，導致潛在的嚴重眼內炎症）。 從微生物學和理化的角度來看，沒有資料可以考慮重新包裝後產品的品質。也沒有考慮溶液與主包裝的兼容性。 重新包裝的貝伐單抗的有效期限的設置，以及對全球大部分地區安全性和品質的影響並沒有檢查過。
因此，迫切需要貝伐單抗的眼藥組合物，所述組合物應為安全無毒並且對於有效期限長的單次施用有效。
本發明的一個目的是提供貝伐單抗的眼藥組合物，其在有效期限內具有可控的顆粒物、細菌內毒素、聚集體，製備組合物的方法和組合物的給藥裝置，裝置對於單次給藥是安全、無毒且有效的。
本發明揭露了貝伐單抗的眼藥組合物，其以單次使用的預填充注射器的形式給藥。本發明的眼藥組合物在其2年的有效期限內能控制細菌內毒素、顆粒物和聚集體的限制。本發明還提供了獲得活性成分的方法，所述活性成分是貝伐單抗，其細菌內毒素和顆粒物的量可忽略不計或為零，並且本發明的組合物在配製時在其有效期限內具有非常低的聚集體，細菌內毒素及顆粒物質含量，並且適合玻璃體內使用。本發明還提供了一種裝置，例如預填充的注射器或藥盒，其包含貝伐單抗的眼藥組合物。
貝伐單抗的眼藥組合物，在有效期限內安全無毒且有效，其特徵在於，在產品的有效期限內，其能對內毒素程度降低且聚集程度低的不可目視顆粒物的數量進行控制。
本發明的眼藥組合物優選為溶液。眼藥溶液可以作為預填充注射器的單獨可注射單元存在。
本發明的眼藥組合物可以控制顆粒物。顆粒物是由溶液中無意間存在的，由組合物的任何成分衍生的可移動的未溶解顆粒、雜質和任何不穩定性（氣泡除外）組成，其中用於玻璃體內注射的不可目視顆粒物包括： （i）每ml 1至50個直徑≥10μm的顆粒； （ii）每ml 0至5個直徑≥25μm的顆粒；以及 （iii）每ml 0至2個直徑≥50μm的顆粒。
由於內毒素的多樣性和潛在的有害生物活性，重組療法中這些分子的存在引起了極大關注。維持生物製品生產過程中的無菌性以及嚴格的設備準備規程，有助於確保產品的內毒素程度低至可接受的範圍。從文獻中還可以看出，在眼睛的前後半部中，後半部（玻璃體內注射部位）對內毒素更為敏感，並且由於較高的黏度和較低的玻璃體液流量，內毒素在後半部中的停留時間更多，導致玻璃體細胞反應的恢復緩慢。根據患者的敏感性，即使最低程度的內毒素也可能導致眼內炎症。貝伐單抗的玻璃體內注射每月進行一次，且濕性老年性黃斑點退化的話一年中需要7至8次注射。為了避免頻繁的玻璃體內注射使內毒素在眼睛中累積，必須將內毒素保持在盡可能低的程度。在已經報導的幾個例子中，揭露了眼內注射貝伐單抗後出現無菌性眼內炎及眼內壓升高的結果。儘管關於眼內炎症的病因學有幾種理論，但其原因仍然未知。商業上生產的免疫球蛋白產物通常會產生內毒素，這些內毒素應在這些無菌反應中起主要作用。
最近，有一些關於玻璃體內注射貝伐單抗後產生類毒性前半部症候群（TASS-like）培養陰性無菌性眼內炎的報導。這可能是由於儲藏錯誤導致的與產品分解相關的內毒素。隨著玻璃體內注射貝伐單抗數量的上升，這種情況的例子肯定會增加，因此有必要尋找一種明智的方式來處理這樣的問題。目前對無菌性眼內炎的病因了解甚少。然而，有許多可能的解釋。例如，作為經濟有效的方法，將市售的貝伐單抗小瓶分成等份的習知做法可能會增加細菌內毒素污染的風險。現有技術中給藥後的貝伐單抗組合物含有痕量的內毒素，其程度被認為對於靜脈內使用是安全的，但仍然能夠在玻璃體內引起炎症反應。在注射後眼內炎中，在調製期間發生的額外藥物操作也是關鍵。由於在美國報導了幾次傳染性眼內炎的暴發，對貝伐單抗用於玻璃體內注射的重新包裝的關注正在增加。
本發明的眼藥組合物將內毒素濃度的程度控制在0.001至0.4 EU/mg的範圍內，優選在0.001至0.2 EU/mg的範圍內，更優選在0.001至0.16 EU/mg的範圍內。
本發明的眼藥組合物在規定的有效期限內可以是無聚集體的，或者可以在2至3年內的聚集體的範圍為0.1至5%，更優選為0.1至4%，最優選為0.1至3.5%，優選2至2.5年，最優選2年。
本發明的眼藥組合物即使在短期內冷鏈被間歇地打斷（例如在運輸過程中），也可以在有效期限內維持細菌內毒素、顆粒物和聚集體的限制。在所述情況下，本發明的產品在穩定性和功效方面具有優異的耐受性。
本發明的眼藥組合物在單元之間沒有劑量變化，因為它們可以通過自動化預填充到確定的劑量。此外，在規定的有效期限之前，個別單位的劑量保持不變。
本發明的貝伐單抗的眼藥組合物包括： a. 細菌內毒素測試（BET）在0.001至0.4 EU/mg的範圍內，優選在0.001至0.2 EU/mg的範圍內，更優選在0.001至0.16 EU/mg的範圍內； b. 其中顆粒物為： （i）每ml 1至50個直徑≥10μm的顆粒； （ii）每ml 0至5個直徑≥25μm的顆粒；以及 （iii）每ml 0至2個直徑≥50μm的顆粒； c. 其中組合物在2至3年內的聚集體的範圍為0.1至5%，更優選為0.1至4%，最優選為0.1至3.5%，優選2至2.5年，最優選2年。
在另一個實施方案中，提供了一種製備組合物的方法，該組合物在有效期限內能控制不可目視顆粒物的數量，內毒素程度低並且基本或完全不含矽油，包括以下步驟： i. 藉由連續發酵法在中國倉鼠卵巢細胞中培養貝伐單抗的細胞； ii. 對從中國倉鼠卵巢細胞培養中獲得的無細胞收成物進行基於吸附的深度過濾，以進一步澄清； iii. 使用單程切向流過濾濃縮步驟ii的樣品，以獲得濃縮的收成物； iv. 使步驟iii的濃縮收成物經蛋白A層析以捕獲貝伐單抗並獲得含有部分純化的貝伐單抗的洗脫液； v. 使步驟iv的洗脫液進行低pH病毒去活以獲得病毒去活樣品； vi. 使步驟v的病毒去活的樣品經進一步的陽離子交換層析以進一步純化，以獲得主要包含高度純化的貝伐單抗的洗脫液； vii. 將步驟vi的洗脫液進行陰離子交換層析以除去痕量雜質，例如宿主細胞蛋白（HCP）、宿主細胞DNA（HCD）、內毒素； viii. 對步驟vii的洗脫液進行病毒減少過濾並完全去除病毒； ix. 濃縮和透析步驟viii的樣品以獲得貝伐單抗；以及 x. 配製從步驟ix獲得的樣品以得到本發明的貝伐單抗的組合物。
低病毒去活可以在pH 3.0至5.0的範圍內，優選在3.0至4.0的範圍內，最優選在pH 3.5至4.0的範圍內進行。
洗脫液的陽離子交換層析可以藉由使用選自SO3 -磺酸基異丁基、SO3 -磺酸基乙基、磺酸基丙基、羧甲基等所組成的群組的基質或固定相進行，優選使用的層析基質或固定相是磺酸鹽。
洗脫液的陰離子交換層析可以藉由使用選自二乙胺基乙基、季胺、聚季銨鹽、N-苯甲基-N-甲基乙醇胺等所組成的群組的基質或固定相進行，優選使用的層析基質或固定相是季胺。
透析可以在TFF-II透析緩衝液的存在下進行。
本說明書所述的方法產生具有所欲內毒素效果的產品和組合物。例如，內毒素程度可按以下順序降低：（見表A） 表A：基於本發明的方法的內毒素程度
步驟 每個步驟後的內毒素程度
單程切向流過濾 不多於10 EU/mg
蛋白A層析 不多於10 EU/mg
陽離子交換層析 不多於5 EU/mg
陰離子交換層析 少於0.5 EU/mg
過程結束時 少於0.16 EU/mg
根據上表A，本發明的方法使得藉由凝膠凝結法測定的內毒素含量降低了幾倍。在對收成物進行純化之前，內毒素的含量很高。在經蛋白A親和力純化後，內毒素含量不多於10 EU/mg，通常是非常高於可接受的範圍。另外，也使用陰離子交換層析從活性貝伐單抗中分離和去除內毒素。
在陰離子交換層析步驟結束時，蛋白質中的內毒素含量小於0.5 EU/mg。在本發明的方法中使用陰離子交換層析能夠將藥物產品的關鍵質量屬性（例如細菌內毒素測試、生物負荷、聚集體和顆粒物測試）控制在較窄的範圍內。
去除內毒素是下游過程純化中最困難的步驟之一。為了能夠達到本發明的貝伐單抗的內毒素限制，獲得內毒素濃度小於0.4 EU/mg，優選小於0.2 EU/mg，更優選小於0.16 EU/mg的眼藥組合物。此外，過程必須包含： (i) 使用無菌溶液和設備以盡量減少微生物的引入， (ii) 在純化過程中使用0.22微米過濾器進行過濾， (iii) 在低溫下工作以使得微生物的生長最小化， (iv) 在純化過程中添加抑菌劑， (v) 高品質原料， (vi) 正交純化步驟， (vii) 對容器、色譜柱和處理設備進行嚴格的原位清洗（CIP）程序。
如本文公開的本發明的方法是新穎的，並且產生具有期望參數的產物。方法必須按照本文所述的順序進行，以得到具有所需性質的產物。經過大量的實驗、試驗及試誤，使過程得以發展。
本發明的方法提供了貝伐單抗的眼藥組合物： a. 其中細菌內毒素測試（BET）的限制在0.001至0.4 EU/mg的範圍內，優選在0.001至0.2 EU/mg的範圍內，更優選在0.001至0.16 EU/mg的範圍內； b. 其中顆粒物是： （i）每ml 1至50個直徑≥10μm的顆粒； （ii）每ml 0至5個直徑≥25μm的顆粒；以及 （iii）每ml 0至2個直徑≥50μm的顆粒； c. 其中組合物在2至3年內的聚集體的範圍為0.1至5%，更優選為0.1至4%，最優選為0.1至3.5%，優選2至2.5年，最優選2年。
在另一個實施方案中，本發明公開了一種眼藥組合物，包括貝伐單抗、緩衝劑、穩定劑及表面活性劑。
貝伐單抗在組合物中的濃度可以在24 mg/ml至26 mg/ml的範圍內，優選在25 mg/ml至26 mg/ml的範圍內，更優選地25 mg/ml。
存在於組合物中的緩衝劑可以選自包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、組胺酸、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、甘胺酸等的群組，更優選磷酸鹽緩衝劑。緩衝劑的濃度可優選在40 mM至60 mM的範圍內，更優選在50 mM至60 mM的範圍內。緩衝劑的pH可優選在6.0至7.0的範圍內，更優選6.1至6.3。
穩定劑可以是醣類。醣類可以是單醣、二醣、三醣、多醣、糖醇、還原糖、非還原糖等。本文中的醣類實例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、聚葡萄糖、甘油、聚葡萄糖、赤藻糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳酮糖、麥芽酮糖、葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異麥芽糖等。優選的醣類可以是非還原性二糖，例如海藻糖。
組合物中醣類的量可以在40 mg/mL至70 mg/mL的範圍內，優選地可以在45 mg/mL至65 mg/mL的範圍內，更優選地在50 mg/mL至60 mg/mL的範圍內。
組合物中存在的表面活性劑是指表面的活性劑，優選非離子表面活性劑。本文中的表面活性劑的實例包括聚山梨醇酯（例如，聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80）。本文優選的表面活性劑是聚山梨醇酯20。
組合物中表面活性劑的量可以在0.2 mg/mL至0.6 mg/mL的範圍內，優選在0.3 mg/mL至0.5 mg/mL的範圍內，更優選在0.35 mg/mL至0.45 mg/mL的範圍內。
本發明的組合物在產品的有效期限內是均勻溶液和穩定溶液，因此是協同組合物。
在另一個實施方案中，本發明的眼藥組合物可以以預定劑量以小瓶、藥筒或筆或預填充注射器的形式施用，優選預填充注射器，優選單次使用預填充注射器的形式施用，其填充量為140 mL至200 mL，劑量為50 mL。組合物基本上或完全不含矽油。
注射器的主體可以由選自包括聚合物或玻璃，或塗在任何表面上的標記；熱塑性材料；聚烯烴，例如環烯烴聚合物，環烯烴共聚物或聚丙烯；聚酯，例如聚對苯二甲酸乙二酯；聚碳酸酯或其任何組合或共聚物的群組的材料組成。
預填充注射器的柱塞可以由選自包括氯丁基、溴丁基或其他鹵代烷基橡膠的群組的任何合適的材料組成。柱塞可以任選地塗覆有選自包括矽、含氟聚合物、聚對二甲苯等的群組的材料。可以利用這樣的塗層來最小化在儲存期間或運輸期間在裝置的不同部分之間或在裝置與藥物之間可能引起的任何相互作用及/或摩擦。柱塞的尖端可以是平坦的或凸形的。可能存在柱塞環，用於柱塞和管壁的緊密密封。塞子可以被矽化或塗覆有溴、氯、氟或相關聚合物。
注射器可以任選地被塗覆。內部塗層或內層，選自包括黏結塗層、阻隔塗層、pH保護塗層或潤滑性塗層的群組，優選為潤滑性塗層，用選自由矽油、含氟聚合物、聚對二甲苯和相關化合物所組成的群組的潤滑劑在0.1 mg至0.4 mg矽油範圍內進行潤滑。低矽化硼矽酸鹽玻璃注射器筒可以用矽水包油乳液進行噴塗，然後可以進行熱固定（即「烘烤的矽樹脂」）或交聯。可以利用這種塗層及/或分層來最小化在儲存期間或運輸期間在裝置的不同部分之間或裝置與藥物之間可能引起的任何相互作用及/或摩擦。優選地，預填充的注射器可以完全不含矽油或缺乏矽油。
本發明的預定劑型，例如預填充注射器，可以用選自包括氮氣、氬氣、氦氣的群組的惰性氣體填充，優選氮氣。預先填充的藥物注射器可以具有140 mL至200 mL的填充體積和50 mL的劑量的標稱最大值。
本發明的組合物可以作為預填充注射器施用。可以將本發明的組合物填充在用於玻璃體內注射的預填充注射器中。為了減少將矽油小滴注入眼睛的可能性，本發明的預填充注射器可包括基本上或完全沒有矽油的筒身。預填充的注射器可以包括含矽油的內部塗層，這種內部塗層可以具有0.1 mg至0.4 mg的矽油。在替代方案中，預填充的注射器可以在內部塗覆有黏結塗層或內層、阻隔塗層或內層、pH保護塗層或內層、以及任選地潤滑性塗層，優選地，塗層可以是含氟聚合物、聚對二甲苯和相關化合物。在一實施例中，預填充的注射器可以完全不含矽油。低矽化硼矽酸鹽玻璃注射器筒可以用矽水包油乳液進行噴塗，然後可以進行熱固定（即「烘烤的矽樹脂」）或交聯。可以利用這種塗層及/或分層來最小化在儲存期間或運輸期間在裝置的不同部分之間或裝置與藥物之間可能引起的任何相互作用及/或摩擦。
在本發明中，內含物和容器之間的相互作用被最小化，並且對於保持功效，特別是對於在整個有效期限為2年的長期保存/使用中保持穩定性至關重要。申請人已進行了數項研究並做出了努力，以在這方面充分解決現有技術的問題。
在另一個實施方案中，本發明的眼藥組合物可以用於治療眼部疾病。眼部疾病可選自以下群組，包括與年齡相關的濕性老年性黃斑點退化、脈絡膜新血管形成、視網膜血管瘤增生、病理性近視、血管狀痕、貝斯特氏症、成人卵黃樣營養不良、中央漿液性脈絡膜視網膜病變、點狀內脈絡膜病變、多灶性脈絡膜炎、疑似眼組織漿蟲感染、脈絡膜骨瘤、弓蟲病、眼色素層炎、假性腦腫瘤、乳突周圍自發性視網膜新血管形成、增生性糖尿病性視網膜病變、鐮狀細胞性視網膜病變、早產兒視網膜病變、Eales疾病、黃斑水腫、糖尿病性視網膜病變、中心性視網膜靜脈阻塞、分支性視網膜靜脈阻塞、偽晶狀體、葡萄膜炎、閉塞性脈管炎、視網膜色素變性、新生血管性青光眼、中心性視網膜靜脈阻塞、分支性視網膜靜脈阻塞、增生性糖尿病性視網膜病變、中心性視網膜動脈阻塞、眼部缺血性症候群、輻射誘發、放射線視神經病變、放射線視網膜病變、脈絡膜轉移的乳癌、黑色素瘤相關的新血管形成、大動脈瘤、血管增生性腫瘤、柯氏症、鄰近乳頭毛細血管瘤、自發性黃斑部毛細管擴張症、多發息肉性脈絡膜血管病變、中央漿液性脈絡膜視網膜病變、非動脈前段缺血性視神經病變、皰疹性角膜新生血管、疤痕性類天疱瘡性角膜新生血管、後囊新生血管、角膜移植排斥反應新生血管、乾眼相關的角膜新生血管、修復濾過泡、青光眼濾過手術的輔助，優選為與年齡相關的濕性老年性黃斑點退化。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種試劑盒，其包括可施用形式的本發明的眼藥組合物，例如預填充注射器、小瓶或藥筒，優選為預填充注射器。試劑盒可包括包裝在氣泡包裝中的預填充注射器，所述氣泡包裝本身在內部可為無菌的。在一個實施例中，根據本發明的注射器可以在進行滅菌處理例如末端滅菌之前被放置在這種氣泡包裝內。氣泡包裝可以由合適的熱塑性材料形成，例如玻璃、聚烯烴、環狀烯烴聚合物或環狀烯烴共聚物、聚丙烯或聚酯或其任何組合或共聚物。試劑盒還可包括用於本發明的眼藥組合物的施用的針頭。
針頭可以是29至33號×½英寸的針頭中的任何一種，儘管也可以使用31號、32號、33號或34號針頭。試劑盒還可能包括產品說明書，其中包括使用說明。
本發明公開了在預填充注射器中包括眼藥組合物的試劑盒，其包括預填充注射器、規格在29至34號範圍內的針頭、氣泡包裝的使用說明。
組合物在2-10℃，優選2-8℃的溫度下至少穩定2年。本發明的眼藥組合物穩定至少兩年，並且不僅保持安全的易用性，而且在其兩年的有效期限內具有低的不可目視顆粒物、細菌內毒素測試和聚集體。
本發明的眼藥組合物具有以下優點，但是優點可以不限於以下列出的那些： 與從小瓶中調配的其他現有注射器相比，產品具有很高的穩定性。 包括本文所述在限制內的細菌內毒素測試。 包括預定劑量，從而減少劑量錯誤，並確保在單次給藥後將劑型處理掉，避免多次使用，從而防止多次使用和源於多次使用的感染。 可能具有較少的注入前和注入後效果。 與現有技術產品的14天到最長6個月不等的有效期限（在印度為14天，美國食品藥品管理局建議重新包裝後僅限制5天）相比，有效期限為2年。
本發明的組合物具有每ml 1至50個直徑≥10μm的顆粒；每ml 0至5個直徑≥25μm的顆粒；以及每ml 0至2個直徑≥50μm的顆粒。
包括在本發明的預填充注射器中的眼藥級貝伐單抗在規定的有效期限內在2至8℃的溫度下是穩定的。
與現有技術的重新包裝或複合的組合物不同，本發明的組合物在上市時經歷所有規定的品質檢查。
降低醫院就診次數，減少藥物浪費，減少醫院和工業廢物，並消除微生物污染的風險。
以下通過實施例說明本發明。這些實施例僅用於說明目的，不應解釋為限制本發明的目的。
實施例1：貝伐單抗的純化方法
含有貝伐單抗單株抗體的無細胞收成物，是從中國倉鼠卵巢細胞中基於灌注技術的生物反應器獲得的。收成物用0.2 µm過濾器過濾，並進行基於吸附的深度過濾，以澄清收成物。藉由使用單程TFF模組將過濾後的收成物濃縮以達到貝伐單抗的濃度。使用0.2 µm過濾器過濾從TFF-I步驟獲得的「濃縮收成物」，並將其置於裝有Mab Select Sure LX樹脂（GE Healthcare）的親和色譜柱上。藉由以150 cm/h的流速通過5倍柱體積（column volumes，CVs）的平衡緩衝液1（equilibration buffer-1，EB-1，磷酸鹽緩衝液：20mM，NaCl：150mM，pH 7.1±0.2），用平衡緩衝液1平衡色譜柱。將樣品以150 cm/h的線性流速上樣到色譜柱上，然後以約150 cm/h的流速通過5倍柱體積的平衡緩衝液1。隨後以150 cm/h的流速加入5倍柱體積的洗滌緩衝液1（wash buffer-1，WB-1，乙酸鈉：40mM，pH 6.0）。藉由約5倍柱體積的洗脫緩衝液1（elution buffer-1，EUB-1，乙酸鈉：30mM，pH 3.5）洗脫結合的靶蛋白，並基於280nm處的吸光度收集。分析洗脫液（E-1）的蛋白質含量、聚醣、宿主細胞蛋白、電荷變異體、聚集體和內毒素含量。在此步驟中，洗脫液的內毒素含量不多於10EU / mg，聚集體含量不多於5%。在下一步驟中，將洗脫液置於低pH去活步驟，其中洗脫液在室溫下於pH 3.7連續溫和攪拌下孵育60分鐘。病毒去活後，將溶液用陽離子交換層析平衡緩衝液2（EB-2，乙酸鈉：50mM，NaCl：80mM，pH 5.3）稀釋，然後使用0.2 µm過濾器過濾。在下一步驟中，將陽離子交換柱（Capto S ImpAct，GE Healthcare）用5倍柱體積的平衡緩衝液3（EB-3，乙酸鈉：50mM，NaCl：80mM，pH 5.3）平衡，流速為250 cm/h。將樣品以250 cm/h的流速上樣到色譜柱上，然後以流速為250 cm/h的3倍柱體積洗滌緩衝液2（WB-2，乙酸鈉：50mM，NaCl：80mM，pH 5.3）洗脫。使用平衡緩衝液3和洗脫緩衝液2（EUB-2，乙酸鈉：50mM，NaCl：500mM，pH 5.3）以250 cm/h的流速通過1.5倍柱體積中0-15%緩衝液的線性梯度，然後在20倍柱體積中進行15-25%緩衝液的線性梯度運行，並根據UV 280收集餾分。分析洗脫液（E-2）的蛋白質數量、電荷變異體、聚集體和內毒素含量。此步驟後，洗脫液的內毒素含量為不多於5 EU/mg。
下一步驟，將基於洗脫液電荷變異體的分析結果的陽離子交換層析洗脫餾分合併，並使用陰離子交換層析平衡緩衝液（EB-4，Tris：20mM，pH 8.0）稀釋，然後使用0.2 µm過濾器過濾。在下一步中，將陰離子交換柱（Capto Q，GE Healthcare）用10倍柱體積的平衡緩衝液4（EB-4，Tris：20mM，pH 8.0）平衡，流速為250 cm/h。將樣品以250 cm/h的流速上樣到色譜柱上，然後以250 cm/h的流速加入2倍柱體積的洗滌緩衝液3（WB-3，EB-4，Tris：20mM，pH 8.0）。用5倍柱體積的再生緩衝液（Tris：20mM，NaCl：1M，pH 8.0）對色譜柱進行再生，並收集流通量（flow through，FT）進行進一步分析，稱為「陰離子交換層析流通量」。分析了蛋白質數量、聚醣、宿主細胞蛋白、電荷變異體、聚集體和內毒素含量。在此步驟中，內毒素含量不多於0.5 EU/mg，聚集體含量不多於3%。此外，使用串聯的預過濾器和奈米過濾器在1.5±0.5 Bar的壓差下過濾「陰離子交換層析流通量」，濃縮奈米濾液並用透析緩衝液（PB：51mM，海藻糖二水合物：20 mg / ml，pH 6.0± 0.2）透析。透析後的樣品中摻入海藻糖二水合物，以使最終濃度達到60 mg/ml，並添加5%的聚山梨醇酯20，以使最終濃度達到0.04%，並進一步稀釋以達到指定的貝伐單抗濃度，以生產貝伐單抗原料藥。對原料藥進行了全面的分析表徵，包括但不限於蛋白質數量、聚醣、宿主細胞蛋白、電荷變異體、聚集體、內毒素含量、顆粒物以及體外和體內受體結合測定。在原料藥上，內毒素含量小於0.16 EU/mg，聚集體含量為0.8%，以及不可目視顆粒物限制如下，處於本發明規定的範圍內。 （i）每ml ≥10μm的顆粒不多於50個； （ii）每ml ≥25μm的顆粒不多於5個； （iii）每ml ≥50μm的顆粒不多於2個。
下表1中提供了本發明關於達到限制內毒素、減少聚集體和減少宿主細胞蛋白的能力。 表1：本發明方法的有效性
方法步驟 每個步驟後的內毒素程度 每個步驟後的聚集體程度 每個步驟後的宿主細胞蛋白程度
單程切向流過濾 不多於10 EU/mg NA NA
蛋白A層析 不多於10 EU/mg 不多於5% 不多於5000 ppm
陽離子交換層析 不多於5 EU/mg 不多於5% 不多於200 ppm
陰離子交換層析 少於0.5 EU/mg 少於3% 不多於100 ppm
貝伐單抗原料藥 少於0.16 EU/mg 0.8% 1 ppm
實施例2：根據本發明的組合物
如實施例1中獲得的貝伐單抗。本發明的組合物可以使用表2中揭露的以下各種成分配製。 表2：本發明的示例性眼藥組合物
  組合物1 組合物2 組合物3
貝伐單抗 貝伐單抗 貝伐單抗 貝伐單抗
醣類 蔗糖 海藻糖 海藻糖
緩衝劑 醋酸鹽緩衝液 組胺酸緩衝液 磷酸鹽緩衝液
表面活性劑 聚山梨醇酯20 聚山梨醇酯20 聚山梨醇酯20
如下進行組合物3的進一步實驗。表3給出了一些示例性實施例。 表3：本發明的眼藥組合物
  組合物31 組合物32 組合物33
貝伐單抗 25 mg/mL 25 mg/mL 25 mg/mL
海藻糖 50 mg/mL 70 mg/mL 60 mg/mL
磷酸鹽緩衝液 55 mM 45 mM 51 mM
聚山梨醇酯 0.02% 0.03% 0.04%
pH 6.2 6.2 6.2
在下文中進一步分析了本發明的組合物33，其結果在以下實施例中給出。
實施例3：預填充注射器中本發明組合物的分析表徵
使用單次使用的預填充注射器來填充貝伐單抗的眼藥組合物，其以溶液形式存在。對無惡化存活期中的三批貝伐單抗進行了廣泛表徵，以通過適當的技術測定其理化性質、生物學活性、免疫化學性質、純度和雜質。產品特性符合下表4中所示的驗收標準： 表4：貝伐單抗在無惡化存活期中的分析表徵
編號 測試 藥物產品的驗收標準 3批的平均值 標準差
1. pH 6.0-6.4 6.13 0.06
2. 蛋白濃度 (mg/mL) 25 ± 0.5 mg/mL 25.17 0.12
3. 肽圖分析 樣品溶液的肽圖譜在定性上與參考標準溶液相似 符合 -
4. 聚集體 (%) 不多於2 % 0.85 0.24
5. 醣含量(%) 不含半乳糖的所有低聚醣總和：不少於70.0％ 84.13 2.64
6. 電荷變異體 (%) 酸性不多於45 % 鹼性不多於5 % 14.43 0.83 2.26 0.12
7. pI 從樣品溶液獲得的主峰的pI與從標準溶液獲得的相應峰的pI相差不多於±0.2 pI單位 符合 -
8. 低分子量雜質 (%) 不多於5 % 2.03 0.32
9. 非糖基化重鏈雜質 (%) 不多於2.0% 0.77 0.12
10. 結合效價 (%) 陳述效價的80%-120% 103.83 6.85
11. 中和效價 (%) 陳述效價的80%-120% 103.67 6.11
12. ≥10µm的不可目視顆粒 每mL中不多於50個 22 7.64
13. ≥25µm的不可目視顆粒 每mL中不多於5個 1 0
實施例4：單次使用無惡化存活期中本發明組合物的穩定性研究
單次使用無惡化存活期的貝伐單抗（眼科用藥）在5℃±3℃下進行了24個月的長期穩定性研究。在無惡化存活期中條件為25 mg/ml的貝伐單抗、磷酸鹽緩衝液、聚山梨醇酯20及海藻糖二水合物，pH 6.2。在完整的穩定性程序中，未檢測到蛋白質濃度和pH的顯著變化。藥物產品24個月穩定性研究的數據廣泛分析了其理化性質、生物學活性、免疫化學性質、純度和雜質，並顯示產品在5℃±3℃下可穩定24個月（表5）。 表5：眼科用藥貝伐單抗在5℃±3℃下連續24個月的長期穩定性研究
測試 有效期限結束時的規範 初期 3個月 6個月 9個月 12個月 24個月
外觀 無色至淺棕色透明液體，無可見顆粒 符合 符合 符合 符合 符合 符合
pH 6.0-6.4 6.10 6.23 6.03 6.11 6.18 6.35
蛋白濃度 (mg/mL) 25.5 ± 0.5 mg/mL 25.10 25.07 25.23 25.15 25.20 25.37
SDS-PAGE 在非還原條件下，應在150kD處觀察到主要譜帶；在還原條件下，應在50kD及25kD處 符合 符合 符合 符合 符合 符合
%結合效價(ELISA) 陳述效價的80%-125% 100.6 95.9 99.7 111.8 112.5 100.7
血管內皮生長因子中和效價 陳述效價的80%-125% 108.1 105.4 104.1 97.3 108.7 93.6
%非糖基化重鏈雜質 不多於2.0 % 0.70 0.73 0.78 0.70 0.70 0.61
%聚集體 不多於3.0 % 0.81 1.32 1.47 1.93 2.01 2.64
%不含半乳糖的寡糖 不含半乳糖的所有低聚醣總和：不少於70.0％ 85.90 85.49 80.08 85.87 83.32 83.81
≥10µm的顆粒 每mL中不多於50個 46 44 23 16 11 8
≥25µm的顆粒 每mL中不多於5個 1 1 1 1 1 1
產品特性在整個過程中均符合驗收標準，表明產品在5℃±3℃的溫度下可穩定保持24個月。
在現有技術中，發現從小瓶重新包裝貝伐單抗（Avastin® ）到注射器中在較長的持續時間內是不穩定的。有報告分析了重新包裝到塑膠注射器（聚丙烯和聚碳酸酯）中進行玻璃體內注射的調製貝伐單抗的品質長達3或6個月。在這些研究中，報告了免疫球蛋白G（IgG）含量的變化、矽油微滴的存在、不可目視顆粒的增加和蛋白質的聚集。還觀察到，來自不同供應商的重新包裝的貝伐單抗顯示出不同的產品品質。在現有技術之一中，在調製貝伐單抗的6個月穩定時間內觀察到抗血管內皮生長因子活性的15.9%降解。
由於與穩定性相關的問題，美國食品藥品監督管理局擬定指南草案，建議將預填充的Avastin® 無惡化存活期的有效期限限制為5天。在印度，印度藥品管制總局（DCGI）起草了調製程序指南，並提到不應在14天以上使用這些注射器。因此，貝伐單抗在重新包裝的注射器中的長期穩定性及具有所需品質是一個關鍵問題，並且與眼睛炎症相關。本發明克服了這些限制，並藉由在有效期限內滿足本文中設定的所有驗收標準，提供了貝伐單抗的長期儲存。
與現有技術文獻相比，本發明的組合物在2年的整個有效期限內具有大於10μm和大於25μm的粒度。本發明的眼藥組合物在2至8℃的溫度下穩定至少兩年，並且在有效期限內安全無毒且有效。
實施例5：本發明組合物的毒性研究
單次使用裝有眼科用藥貝伐單抗的預填充注射器，對兔子眼睛進行了玻璃體內重複劑量（4週）毒性研究，並有4週恢復期。此研究是在良好實驗室規範的設施中進行的，以評估貝伐單抗對眼睛的毒性。在無惡化存活期中條件為25 mg/ml貝伐單抗、51 mM PB、0.04%聚山梨醇酯20和60 mg/ml海藻糖二水合物，pH 6.2。產品在有效期限內符合眼藥組合物的所有參數。
在用於眼部疾病的治療過程中，貝伐單抗被直接注射到玻璃體中，所述玻璃體包括眼睛的一個特殊區域。在研究期間，每兩週一次，共四週，即在第1天、第15天和第29天，藉由玻璃體內注射將測試產品貝伐單抗或載體（稀釋劑）對照樣品施用於每隻兔子的兩隻眼睛。
在研究期間觀察兔子的死亡率和局部和全身毒性的跡象，然後將兔子犧牲並進行完整的屍檢。在載體對照和高劑量程度下，對各性別的另外三隻兔子的同時恢復組進行了相似的治療，但是在停止治療期後，進一步觀察了28天的毒性逆轉/延遲毒性（如果有的話）。
這項研究提供了有關標的器官的訊息、累積的可能性、毒性作用的可逆性、對接觸無影響程度的估計，這些訊息用於建立人體接觸的安全標準。在毒性研究中選擇了三種程度的劑量。研究中對兔子使用的劑量程度是貝伐單抗的人類等效劑量（HED）的倍數，即每隻眼睛1.25 mg、2.50 mg或3.75 mg，分別是人類絕對治療劑量的1倍、2倍和3倍，且注射體積為50μL。
基於研究的結果，得出的結論是，該產品在以每隻眼3.75 mg或最高劑量程度治療的兔子中，不會引起任何不利或其他的全身性作用。在玻璃體內注射每隻眼1.25 mg、2.50 mg或3.75 mg劑量程度的兔眼中，眼科用藥的貝伐單抗具有良好的耐受性；並且沒有發現觀察到的本發明的眼藥組合物在兔子中的不良反應程度在每隻眼睛大於3.75mg。因此，在玻璃體內臨床研究中，發現藥物對於玻璃體內途徑是安全的。
具體地，本發明提供了具有明顯降低的內毒素程度和顆粒物程度的藥物組合物，其適合玻璃體內使用。本發明還關於降低某些組合物（例如藥物組合物）中可用於眼內遞送的顆粒物測試程度和內毒素程度的方法。
實施例6：本發明的組合物與現有技術組合物的比較
將如前述實施例中所述製備的本發明的組合物與市場上可買到並正在施予患者的當前組合物進行比較。
A. 不可目視顆粒物的比較：
根據USP 789方法通過光遮蔽顆粒計數對不可目視顆粒物進行了測試。使用合適體積的無顆粒玻璃瓶進行測試。將來自10個無惡化存活期的樣品（約1毫升）從一個玻璃瓶中取出。此外，將樣品用無顆粒的水稀釋以獲得25 ml的最終體積。將樣品的內含物緩慢地連續倒轉20次，在不引入氣泡的同時將所有容器集中在無顆粒的容器中。在分析之前，將樣品容器放置至少15分鐘以去除氣泡。去除四份不少於5 mL的物質，並計數大於等於10μm、25μm和50μm的顆粒數。在不考慮在第一部分中獲得的結果之後呈現剩餘結果。
來自五家英國調製藥店（S1-S5）的重新包裝貝伐單抗的不可目視顆粒物，並與本發明的眼藥組合物進行了比較（Eye (2013) 27,1090-1097）。結果示於圖2a和2b。從圖2a和2b可以清楚地看到，本發明的顆粒尺寸在本發明所設定的範圍內，因此發生眼睛炎症的可能性非常低。
B. 本發明的組合物與現有技術的儲存穩定性的比較：
將重新包裝的貝伐單抗的儲存穩定性與本發明的眼藥組合物以及經重構的貝伐單抗的儲存穩定性進行比較，結果示於下表6中。 表6：現有技術組合物與本發明組合物的儲存穩定性的比較
編號 研究文獻 研究的穩定期
1 Quality of bevacizumab compounded for intravitreal administration. Eye. 2013;27(9):1090-7. 14天
2 Storage stability of bevacizumab in polycarbonate and polypropylene syringes.  Eye. 2015;29(6):820-7. 6個月
3 Silicone Oil Microdroplets and Protein Aggregates in Repackaged Bevacizumab and Ranibizumab: Effects of Long-term Storage and Product Mishandling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011;52(2): 1023–1034. 3個月
4 Long-term stability of bevacizumab repackaged in 1 mL polypropylene syringes for intravitreal administration. Retina. 2010;30(6):887-92. 3個月
5 Quantification, Microbial Contamination, Physico-chemical Stability of Repackaged Bevacizumab Stored Under Different Conditions. Curr Pharm Biotechnol. 2014;15(2):113-9. 3個月
6 Six-month stability of bevacizumab (AVASTIN) binding to Vascular endothelial growth factor after withdrawl into a syringe and refrigeration or freezing. Retina. 2006;26(5):519-22. 6個月
7 本發明的眼藥組合物 24個月
在本發明中，發現本發明的組合物可穩定兩年，這與如上所述的現有技術的組合物顯著不同，從而帶來了經濟上的優勢和運輸上的優勢。
C. 本發明貝伐單抗濃度與現有技術組合物的比較：
在「Retina2006;26(5):519-22」的研究中，顯示了貝伐單抗的降解被撤回到塑膠結核菌素注射器中，此注射器在大多數國家中通常用於調製藥物。此藥物在4℃下保存六個月。降解模式如下表7所示： 表7：現有技術組合物的組合物穩定性
調製貝伐單抗的穩定時間點 貝伐單抗平均濃度 (mg/mL) 貝伐單抗的降解(%)
0天 25.1 0.0
1週 24.7 1.6
1個月 23.1 8.0
3個月 22.9 8.8
6個月 21.1 15.9
在6個月時，在現有技術的調製貝伐單抗中觀察到15.9%的降解。
在本發明中，在兩年的時間內未觀察到蛋白質的降解，這也藉由在兩年內的穩定期的%結合效價（ELISA）和%血管內皮生長因子中和效價測定來證明（參見表8）。 表8：本發明的組合物
測試 規範 初期 3個月 6個月 9個月 12個月 18個月 24個月
*平均%結合效價(ELISA) 陳述效力的80%-125% 106.05 96.3 102.75 106.75 106.55 104.15 99.75
*平均%血管內皮生長因子中和效價 陳述效力的80%-125% 107.15 106.2 97.9 100.9 104.45 101.85 95.55
*平均值是從兩個含眼科用藥的貝伐單抗的無惡化存活期穩定批次中計算得出的。
因此，如本發明所公開的組合物，用本發明的方法獲得的調製貝伐單抗，以及本發明所公開的預填充注射器單獨地具有所需的產品特性、穩定性和功效。
本發明的組合物、用於製備組合物的方法以及包括組合物的裝置（例如預填充注射器）是在大量的人類努力和實驗之後實現的，並且具有其固有的優點。
無
圖1為獲得本發明的眼藥組合物的示意圖，所述組合物相對於不可目視顆粒物的數量、低細胞內毒素程度在產品的有效期限內進行控制。 圖2a及圖2b為本發明樣品與現有技術中其他樣品相比的不可目視粒度。

Claims (14)

  1. 一種貝伐單抗的眼藥組合物， a. 其中細菌內毒素測試在0.001至0.4 EU/mg的範圍內，優選在0.001至0.2 EU/mg的範圍內，更優選在0.001至0.16 EU/mg的範圍內； b. 其中顆粒物為： （i）每ml 1至50個直徑≥10μm的顆粒； （ii）每ml 0至5個直徑≥25μm的顆粒；以及 （iii）每ml 0至2個直徑≥50μm的顆粒； c. 其中該組合物在2至3年內的聚集體的範圍為0.1至5%，更優選為0.1至4%，最優選為0.1至3.5%，優選2至2.5年，最優選2年。
  2. 一種如請求項1所述的眼藥組合物的製備方法，包括以下步驟： i. 藉由連續發酵法在中國倉鼠卵巢細胞中培養貝伐單抗的細胞； ii. 對從中國倉鼠卵巢細胞培養中獲得的無細胞收成物進行基於吸附的深度過濾，以進一步澄清； iii. 使用單程切向流過濾濃縮步驟ii的樣品，以獲得濃縮的收成物； iv. 使步驟iii的濃縮收成物經蛋白A層析以捕獲貝伐單抗並獲得含有部分純化的貝伐單抗的洗脫液； v. 使步驟iv的洗脫液進行低pH病毒去活以獲得病毒去活樣品； vi. 使步驟v的病毒去活的樣品經進一步的陽離子交換層析以進一步純化，以獲得主要包含高度純化的貝伐單抗的洗脫液； vii. 將步驟vi的洗脫液進行陰離子交換層析以除去痕量雜質，例如宿主細胞蛋白、宿主細胞DNA、內毒素； viii. 對步驟vii的洗脫液進行病毒減少過濾並完全去除病毒； ix. 濃縮和透析步驟viii的樣品以獲得貝伐單抗；以及 x. 配製從步驟ix獲得的樣品以得到本發明的貝伐單抗的組合物。
  3. 如請求項2所述之製備方法，其中低病毒去活是在pH 3.0至5.0的範圍內進行，優選在pH 3.0至4.0的範圍內，最優選在pH 3.5至4.0的範圍內。
  4. 如請求項2所述之製備方法，其中陽離子交換層析的固定相是選自由SO3 -磺酸基異丁基、SO3 -磺酸基乙基、磺酸基丙基、羧甲基所組成的群組，優選為磺酸鹽，陰離子交換層析的固定相是選自由二乙胺基乙基、季胺、聚季銨鹽、N-苯甲基-N-甲基乙醇胺所組成的群組，優選地，季胺及透析在TFF-II透析緩衝液的存在下進行。
  5. 一種經由如請求項2所述之製備方法所製備的眼藥組合物， a. 其中細菌內毒素測試在0.001至0.4 EU/mg的範圍內，優選在0.001至0.2 EU/mg的範圍內，更優選在0.001至0.16 EU/mg的範圍內； b. 其中顆粒物為： （i）每ml 1至50個直徑≥10μm的顆粒； （ii）每ml 0至5個直徑≥25μm的顆粒；以及 （iii）每ml 0至2個直徑≥50μm的顆粒； c. 其中該組合物在2至3年內的聚集體的範圍為0.1至5%，更優選為0.1至4%，最優選為0.1至3.5%，優選2至2.5年，最優選2年。
  6. 如請求項1所述之眼藥組合物，包括貝伐單抗、一緩衝劑、一穩定劑及一表面活性劑。
  7. 如請求項6所述之眼藥組合物，其中貝伐單抗在該組合物中的濃度為24 mg/ml至26 mg/ml的範圍內，優選在25 mg/ml至26 mg/ml的範圍內，更優選地25 mg/ml。
  8. 如請求項6所述之眼藥組合物，其中該緩衝劑可以選自由磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、組胺酸、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、甘胺酸所組成的群組，更優選為磷酸鹽緩衝劑，且該緩衝劑的濃度為在40 mM至60 mM的範圍內，更優選在50 mM至60 mM的範圍內，該緩衝劑的pH為在6.0至7.0的範圍內，更優選6.1至6.3。
  9. 如請求項6所述之眼藥組合物，其中該穩定劑為醣類，其選自單醣、二醣、三醣、多醣、糖醇、還原糖、非還原糖，醣類優選為葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、聚葡萄糖、甘油、聚葡萄糖、赤藻糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳酮糖、麥芽酮糖、葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異麥芽糖，更優選為海藻糖，且在40 mg/mL至70 mg/mL的範圍內，優選地在45 mg/mL至65 mg/mL的範圍內，更優選地在50 mg/mL至60 mg/mL的範圍內。
  10. 如請求項6所述之眼藥組合物，其中該表面活性劑為選自由非離子表面活性劑所組成的群組，優選為聚山梨醇酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，更優選為聚山梨醇酯20，且在0.2 mg/mL至0.6 mg/mL的範圍內，優選在0.3 mg/mL至0.5 mg/mL的範圍內，更優選在0.35 mg/mL至0.45 mg/mL的範圍內。
  11. 如請求項1所述之眼藥組合物，其中以預定劑量以小瓶、藥筒或筆或預填充注射器的形式施用，優選預填充注射器，優選單次使用預填充注射器的形式施用，其填充量為140 mL至200 mL，劑量為50 mL。
  12. 如請求項11所述之預填充注射器，其中所述注射是在玻璃體內施用。
  13. 一種如請求項1、5至11所述之眼科組合物及如請求項12所述之預填充注射器的用途，其用於眼部疾病，選自由與年齡相關的濕性老年性黃斑點退化、脈絡膜新血管形成、視網膜血管瘤增生、病理性近視、血管狀痕、貝斯特氏症、成人卵黃樣營養不良、中央漿液性脈絡膜視網膜病變、點狀內脈絡膜病變、多灶性脈絡膜炎、疑似眼組織漿蟲感染、脈絡膜骨瘤、弓蟲病、眼色素層炎、假性腦腫瘤、乳突周圍自發性視網膜新血管形成、增生性糖尿病性視網膜病變、鐮狀細胞性視網膜病變、早產兒視網膜病變、Eales疾病、黃斑水腫、糖尿病性視網膜病變、中心性視網膜靜脈阻塞、分支性視網膜靜脈阻塞、偽晶狀體、葡萄膜炎、閉塞性脈管炎、視網膜色素變性、新生血管性青光眼、中心性視網膜靜脈阻塞、分支性視網膜靜脈阻塞、增生性糖尿病性視網膜病變、中心性視網膜動脈阻塞、眼部缺血性症候群、輻射誘發、放射線視神經病變、放射線視網膜病變、脈絡膜轉移的乳癌、黑色素瘤相關的新血管形成、大動脈瘤、血管增生性腫瘤、柯氏症、鄰近乳頭毛細血管瘤、自發性黃斑部毛細管擴張症、多發息肉性脈絡膜血管病變、中央漿液性脈絡膜視網膜病變、非動脈前段缺血性視神經病變、皰疹性角膜新生血管、疤痕性類天疱瘡性角膜新生血管、後囊新生血管、角膜移植排斥反應新生血管、乾眼相關的角膜新生血管、修復濾過泡、青光眼濾過手術的輔助所組成的群組，優選為與年齡相關的濕性老年性黃斑點退化。
  14. 一種試劑盒，包括如請求項12及13所述之預填充注射器中的如請求項1、5至11及13所述之眼科組合物，該試劑盒更包括一預填充注射器、規格在29至34號範圍內的一針頭、一氣泡包裝的使用說明。
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