TW202104267A - 抗ｐｄ—１抗體和其用途 - Google Patents

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Abstract

本公開涉及所分離單克隆抗體或其抗原結合片段，所述所分離單克隆抗體或其抗原結合片段與PD-1特異性結合並且阻斷PD-1與PD-L1/PD-L2之間的相互作用。本公開還涉及作為嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體、衍生化抗體、單鏈抗體、融合蛋白的部分或雙特異性抗體的抗體。還提供了編碼所述抗體的核酸分子、雜交瘤以及用於表達抗體的方法。還提供了包括所述抗體的藥物組合物。本公開還提供了這些抗體的用於增強T細胞功能並且上調細胞介導的免疫應答以治療並預防各種疾病的用途。

Description

抗PD-1抗體和其用途
優先權要求
本申請要求於2019年4月19日提交的美國臨時申請第62/836,177號的權益。前述美國臨時申請的全部內容通過引用併入本文。 發明領域
本公開涉及抗PD-1(程序性細胞死亡1)抗體、抗原結合片段以及其用途。
發明背景
蛋白質程式性死亡1(PD-1或PDCD1)是CD28受體家族的抑制成員，所述CD28受體家族還包含CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B細胞、T細胞和髓樣細胞上表達(Agata等人，見上文；Okazaki等人 (2002) 《當前免疫學觀點(Curr.Opin.Immunol.)》14: 391779-82；Bennett等人 (2003) 《免疫學雜誌l(J Immunol l)》 70:711-8)。PD-1基因是55 kDa I型跨膜蛋白，所述55 kDa I型跨膜蛋白是Ig基因超家族的一部分(Agata等人 (1996) 《國際免疫學(Int Immunol)》 8:765-72)。PD-1含有膜近端免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和膜遠端基於酪氨酸的開關基序(ITSM)(Thomas, M. L.(1995) 《實驗醫學雜誌(J Exp Med)》 181:1953-6; Vivier, E和Daeron, M (1997) 《今日免疫學(Immunol Today)》 18:286-91)。雖然與CTLA-4在結構上類似，但PD-1缺少對於B7-1和B7-2結合至關重要的MYPPY基序。
T細胞接收正次級共刺激信號和負次級共刺激信號兩者。此類正信號和負信號的調節對於最大化宿主的保護性免疫應答，同時維持免疫耐受性並預防自身免疫性至關重要。負次級信號似乎對誘導T細胞耐受是必須的，而正信號則促進T細胞活化。儘管簡單的兩信號模型為原初淋巴細胞提供了有效的解釋，但宿主的免疫應答是動態過程，並且還可以向抗原暴露的T細胞提供共刺激信號。PD-1是在活化的B細胞、T細胞和骨髓細胞上表達的CD28家族的抑制成員(Agata等人，見上文；Okazaki等人 (2002) 《當前免疫學觀點》 14: 391779-82; Bennett等人 (2003) 《免疫學雜誌l》 70:711-8)並且提供負信號。
已經標識了PD-1的兩種配體PD-Ll和PD-L2。已顯示所述配體在與PD-1結合時下調T細胞活化(Freeman等人 (2000) 《實驗醫學雜誌》 192: 1027-34; Latchman等人 (2001) 《自然-免疫學(Nat Immunol)》 2:261-8; Carter等人 (2002) 《歐洲免疫學雜誌(Eur J Immunol)》 32:634-43)。PD-Ll和PD-L2兩者均為與PD-1結合但不與其它CD28家族成員結合的B7同源物。PD-Ll在多種人類癌症中是豐富的(Dong等人 (2002) 《自然-醫學(Nat. Med.)》 8:787-9)。PD-1與PD-Ll之間的相互作用導致腫瘤浸潤淋巴細胞減少，經過T細胞受體介導的增殖減少以及癌細胞的免疫逃避(Dong等人 (2003) 《分子醫學雜誌(J. Mal.Med.)》 81:281-7; Blank等人 (2005) 《癌症免疫學與免疫治療(Cancer Immunol.Immunother.54:307-314; Konishi等人 (2004) 《臨床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》 10:5094-100)。通過抑制PD-1與PD-Ll的局部相互作用可以逆轉免疫抑制，並且當PD-1與PD-L2的相互作用也被阻斷時，這種作用是加和的(Iwai等人 (2002) 《美國國家科學院院刊(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA)》 99:12293-7; Brown等人 (2003) 《免疫學雜誌》170: 1257-66)。
在本領域中需要中和/阻斷PD-1負信號並刺激免疫應答，並且可以應用於治療癌症和許多其它疾病的抗體或其抗原結合部分，包含嵌合抗體和人源化抗體。
發明概要
本公開提供了單克隆抗體或其抗原結合部分，所述單克隆抗體或其抗原結合部分與人PD-1特異性結合並中和人PD-1。小鼠中產生的單克隆抗體在人類中可以是免疫原性的。本公開還提供了根據所述小鼠抗體重新設計以降低人類中的免疫原性的人源化抗體。這些抗體在人類中具有改進的功效和安全性。
在一方面，本文提供了一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段與PD-1(程序性細胞死亡蛋白1)結合，所述抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區(VH)，所述VH包括互補決定區(CDR)1、2和3。在一些實施例中，所述VH CDR1區包括與所選VH CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，所述VH CDR2區包括與所選VH CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，並且所述VH CDR3區包括與所選VH CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列；以及輕鏈可變區(VL)，所述VL包括CDR1、2和3。在一些實施例中，所述VL CDR1區包括與所選VL CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，所述VL CDR2區包括與所選VL CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，並且所述VL CDR3區包括與所選VL CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
在一些實施例中，所述所選VH CDR1、2和3氨基酸序列以及所述所選VL CDR1、2和3氨基酸序列為以下之一： (1)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 8、9、10中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 5、6、7中列示； (2)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 22、23、24中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 19、20、21中列示； (3)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 74、75、76中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 71、72、73中列示； (4)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 34、35、36中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 31、32、33中列示； (5)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 54、55、56中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 51、52、53中列示； (6)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 64、65、66中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 61、62、63中列示； (7)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 44、45、46中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 41、42、43中列示。
在一些實施例中，所述VH包括具有分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3，並且所述VL包括具有分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列示的所氨基酸述序列的CDR1、2、3。
在一些實施例中，所述VH包括具有分別在SEQ ID NO: 22、23和24中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3，並且所述VL包括具有分別在SEQ ID NO: 19、20和21中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3。
在一些實施例中，所述VH包括具有分別在SEQ ID NO: 74、75和76中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3，並且所述VL包括具有分別在SEQ ID NO: 71、72和73中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3。
在一些實施例中，所述VH包括具有分別在SEQ ID NO: 34、35和36中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3，並且所述VL包括具有分別在SEQ ID NO: 31、32和33中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段與人PD-1特異性結合。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)。
在一方面，提供了一種核酸，其包括編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包括： (1)包括重鏈可變區(VH)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括互補決定區(CDR)1、2和3，所述互補決定區包括分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列示的氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時與PD-1結合； (2)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (3)包括重鏈可變區(VH)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 22、23和24中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時與PD-1結合； (4)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 19、20和21中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (5)包括重鏈可變區(VH)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 74、75和76中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時與PD-1結合； (6)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 71、72和73中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (7)包括VH的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 34、35和36中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的VL配對時與PD-1結合； (8)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 31、32和33中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (9)包括VH的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 54、55和56中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的VL配對時與PD-1結合； (10)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 51、52和53中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (11)包括VH的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 64、65和66中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的VL配對時與PD-1結合； (12)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 61、62和63中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (13)包括VH的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 44、45和46中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的VL配對時與PD-1結合； (14)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 41、42和43中列示的所述氨基酸序列，並且在一些實施例中，所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合。
在一些實施例中，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白重鏈或其片段包括VH，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列示的所述氨基酸序列。
在一些實施例中，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白輕鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白輕鏈或其片段包括VL，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列示的所述氨基酸序列。
在一些實施例中，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白重鏈或其片段包括VH，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 22、23和24中列示的所述氨基酸序列。
在一些實施例中，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白輕鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白輕鏈或其片段包括VL，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 19、20和21中列示的所述氨基酸序列。
在一些實施例中，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白重鏈或其片段包括VH，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 74、75和76中列示的所述氨基酸序列。
在一些實施例中，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白輕鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白輕鏈或其片段包括VL，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 71、72和73中列示的所述氨基酸序列。
在一些實施例中，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白重鏈或其片段包括VH，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 34、35和36中列示的所述氨基酸序列。
在一些實施例中，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白輕鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白輕鏈或其片段包括VL，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 31、32和33中列示的所述氨基酸序列。
在一些實施例中，所述VH當與VL配對時與人PD-1特異性結合，或者所述VL當與VH配對時與人PD-1特異性結合。
在一些實施例中，所述免疫球蛋白重鏈或所述其片段是人源化免疫球蛋白重鏈或其片段，並且所述免疫球蛋白輕鏈或所述其片段是人源化免疫球蛋白輕鏈或其片段。
在一些實施例中，所述核酸編碼單鏈可變片段(scFv)。
在一些實施例中，所述核酸是cDNA。
在一方面，本文提供了一種載體，所述載體包括如本文描述的所述核酸中的一種或多種。
在一方面，本文提供了一種載體，所述載體包括如本文描述的所述核酸中的兩種。在一些實施例中，所述載體編碼一起與PD-1結合的所述VL區和所述VH區。
在一方面，本文提供了一種載體對。在一些實施例中，每個載體包括如本文描述的所述核酸之一。在一些實施例中，所述載體對一起編碼一起與PD-1結合的所述VL區和所述VH區。
在一方面，本文提供了一種細胞，所述細胞包括如本文描述的所述載體或如本文描述的所述載體對。
在一些實施例中，所述細胞是CHO細胞。
在一方面，本文提供了一種細胞，所述細胞包括如本文描述的所述核酸中的一種或多種。
在一方面，本文提供了一種細胞，所述細胞包括如本文描述的所述核酸中的兩種。
在一些實施例中，所述兩種核酸一起編碼一起與PD-1結合的所述VL區和所述VH區。
在一方面，本文提供了一種產生抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括(a)在足以使所述細胞產生所述抗體或所述抗原結合片段的條件下培養如本文描述的所述細胞；以及(b)收集由所述細胞產生的所述抗體或所述抗原結合片段。
在一方面，本文提供了一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段與PD-1結合，所述抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH包括與所選VH序列至少90%相同的氨基酸序列，所述VL包括與所選VL序列至少90%相同的氨基酸序列。在一些實施例中，所述所選VH序列選自SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70，並且所述所選VL序列選自SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68。
在一些實施例中，所述VH包括SEQ ID NO: 4的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 2的序列。
在一些實施例中，所述VH包括SEQ ID NO: 18的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 16的序列。
在一些實施例中，所述VH包括SEQ ID NO: 70的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 68的序列。
在一些實施例中，所述VH包括SEQ ID NO: 30的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 28的序列。
在一些實施例中，所述VH包括SEQ ID NO: 50的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 48的序列。
在一些實施例中，所述VH包括SEQ ID NO: 60的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 58的序列。
在一些實施例中，所述VH包括SEQ ID NO: 40的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 38的序列。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段與人PD-1特異性結合。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)。
在一方面，本文提供了一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括如本文描述的所述抗體或其抗原結合片段的所述VH CDR1、2、3和所述VL CDR1、2、3。
在一方面，本文提供了一種抗體-藥物綴合物，其包括與治療劑共價結合的如本文描述的抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，所述治療劑是細胞毒性劑或細胞生長抑製劑。
在一方面，本文提供了一種治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包括如本文描述的所述抗體或其抗原結合片段或如本文描述的所述抗體-藥物綴合物。
在一些實施例中，所述受試者患有實體瘤或血液系統癌症(例如，淋巴瘤)。
在一些實施例中，所述癌症是黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、復發性或難治性經典霍奇金淋巴瘤、鱗狀細胞肺癌、腎細胞癌或皮膚鱗狀細胞癌。
在一些實施例中，所述癌症是尿路上皮癌、梅克爾細胞癌或間皮瘤。
在一方面，本文提供了一種降低腫瘤生長速率的方法，所述方法包括使免疫細胞與施予受試者的有效量的組合物接觸，所述組合物包括如本文描述的抗體或其抗原結合片段或如本文描述的所述抗體-藥物綴合物。
在一方面，本文提供了一種殺死腫瘤細胞的方法，所述方法包括使免疫細胞與施予受試者的有效量的組合物接觸，所述組合物包括如本文描述的所述抗體或其抗原結合片段或如本文描述的所述抗體-藥物綴合物。
在一方面，本文提供了一種治療感染性疾病或降低患有感染性疾病的風險的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包括如本文所描述的所述抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，本文提供了進一步包括向受試者施用疫苗的所述方法。
在一方面，本文提供了一種藥物組合物，其包括如本文描述的抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載劑。
在另一方面，本文提供了一種藥物組合物，其包括如本文描述的所述抗體藥物綴合物以及藥學上可接受的載劑。
在一些實施例中，所述抗體是IgG1抗體、IgG2抗體或IgG4抗體。在一些實施例中，所述抗體是人IgG1抗體。
在一個方面，一種所分離單克隆抗體或其抗原結合部分包括：(a)包括SEQ ID NO: 5的輕鏈可變結構域CDR1；(b)包括SEQ ID NO: 6的輕鏈可變結構域CDR2；以及(c)包括SEQ ID NO: 7的輕鏈可變結構域CDR3；(d)包括SEQ ID NO: 8的重鏈可變結構域CDR1；(e)包括SEQ ID NO: 9的重鏈可變結構域CDR2 ；(f)包括SEQ ID NO: 10的重鏈可變結構域CDR3。
在一方面，所述單克隆抗體或其抗原結合部分阻斷PD-1與PD-L1和PD-L2兩者的相互作用。因此，所述抗體或抗原結合部分可以刺激抗腫瘤免疫應答。
在又另一方面，本公開進一步提供了一種單克隆抗體或其抗原結合部分，所述單克隆抗體或其抗原結合部分包括：包括SEQ ID NO: 2的輕鏈可變結構域以及包括SEQ ID NO: 4的重鏈可變結構域。
本公開的所述抗體可以通過使免疫原性最小化的修飾被進一步工程化為適合於人類治療劑的形式。適合的抗體包含但不限於嵌合抗體和人源化抗體。所公開的抗體的親和力、穩定性和特異性還可以通過本領域的技術人員已知的技術進一步優化。其它形式可以包含寡聚化、藥物綴合以及所公開的抗體與其它功能性蛋白質的融合。
在又另一方面，人源化單克隆抗體或其抗原結合部分包括與SEQ ID NO: 2具有至少95%同一性的輕鏈可變結構域氨基酸序列和與SEQ ID NO: 4具有至少95%同一性的重鏈可變結構域氨基酸序列。
在又另一方面，本公開進一步提供了所分離單克隆抗體或其抗原結合部分，所述所分離單克隆抗體或其抗原結合部分包括(a)包括SEQ ID NO: 5的輕鏈可變結構域CDR1；(b)包括SEQ ID NO: 6的輕鏈可變結構域CDR2；(c)包括SEQ ID NO: 7的輕鏈可變結構域CDR3；以及與SEQ ID NO: 4具有至少95%同一性的重鏈可變結構域氨基酸序列。
在又另一方面，本公開進一步提供了所分離單克隆抗體或其抗原結合部分，所述所分離單克隆抗體或其抗原結合部分包括(a)包括SEQ ID NO: 8的重鏈可變結構域CDR1；(b)包括SEQ ID NO: 9的重鍊可變結構域CDR2；(c)包括SEQ ID NO: 10的重鏈可變結構域CDR3以及與SEQ ID NO: 2具有至少95%同一性的輕鏈可變結構域氨基酸序列。
本公開的抗體可以是，例如全長抗體，例如IgG1同種型、IgG2同種型、IgG3同種型或IgG4同種型。可替代地，所公開的抗體可以是抗體片段，如Fab片段、Fab'片段和F(ab')2片段、雙抗體、三抗體、四抗體、單鏈可變區片段(scFv)、二硫鍵穩定的可變區片段(dsFv)和半抗體。可替代地，所公開的抗體可以是雙特異性抗體。
在本公開的另一方面，一種所分離單克隆抗體或其抗原結合部分包括:包括SEQ ID NO: 11的輕鏈以及包括SEQ ID NO: 12的重鏈。在優選實施例中，所述所分離單克隆抗體包括具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的重鏈。
在本公開的另一方面，還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括所分離單克隆抗體或其抗原結合部分以及藥學上可接受的載劑。還提供了包括本公開的免疫綴合物和藥學上可接受的載劑的組合物。
在本公開的另一方面，還提供了所分離核酸分子和宿主細胞，所述所分離核酸分子編碼抗體或其抗原結合部分，所述宿主細胞包括編碼抗體或其抗原結合部分的核酸分子的序列。在優選實施例中，所述所分離核酸分子進一步包括編碼信號肽的序列。在優選實施例中，編碼抗體或其抗原結合部分的所分離核酸分子包括SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 3的核酸序列。在優選實施例中，所述宿主細胞是雜交瘤細胞。
本公開進一步提供了一種使用本公開的抗PD-1抗體刺激免疫應答的方法。例如，在一個實施例中，本公開提供了一種用於治療有需要的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用如本文所描述的有效量的抗體或抗原結合部分的步驟。
在另一方面，本公開提供了一種用於治療人類中的癌症的方法，所述方法包括以對於治療所述癌症有效的量向所述人類施用如本文所描述的抗體或抗原結合部分的步驟。
在另一方面，本公開提供了一種用於治療人類中的感染性疾病的方法，所述方法包括以下以對於治療所述感染性疾病有效的量向所述人類施用如本文所描述的所述抗體或抗原結合部分的步驟。
在一方面，與人PD-1特異性結合的抗體或部分阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用。
在一方面，本文提供了一種藥物組合物，其包括如本文所描述的所述抗體或其抗原結合部分以及藥學上可接受的載劑。
在一方面，本文提供了一種刺激受試者中的免疫應答的方法，所述方法包括以對於刺激所述受試者中的免疫應答有效的量向所述受試者施用如本文所描述的所述藥物組合物的步驟。
在一方面，本文提供了一種治療受試者中的感染性疾病的方法，所述方法包括以對於治療所述感染性疾病有效的量向所述受試者施用如本文所描述的所述藥物組合物的步驟。
在一方面，本文提供了一種治療受試者中的癌症的方法，所述方法包括以對於治療所述癌症有效的量向所述人施用如本文描述的所述藥物組合物的步驟。
在一些實施例中，如本文所描述的所述單克隆抗體或其抗原結合部分是Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、單鏈抗體或雙特異性抗體。
在一些實施例中，如本文所描述的所述單克隆抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
在一些實施例中，如本文所描述的所述單克隆抗體是免疫球蛋白G(IgG)分子、IgM分子、IgE分子、IgA分子或IgD分子或其衍生物。在一些實施例中，本文所描述的所述單克隆抗體是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其衍生物。
在一些實施例中，如本文所描述的所述單克隆抗體或其抗原結合部分阻斷PD-1與PD-L2之間的相互作用。
在一方面，本文提供了一種單克隆抗體，其包括：輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，以及重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
在一些實施例中，如本文所描述的所述單克隆抗體是免疫球蛋白G(IgG)分子、IgM分子、IgE分子、IgA分子或IgD分子或其衍生物。在一些實施例中，如本文所描述的所述單克隆抗體是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4或其衍生物。
在一些實施例中，如本文描述的所述單克隆抗體是嵌合抗體。
在一些實施例中，如本文所描述的所述單克隆抗體或其抗原結合部分包括與SEQ ID NO: 2具有至少95%同一性的輕鏈可變結構域氨基酸序列和與SEQ ID NO: 4具有至少95%同一性的重鏈可變結構域氨基酸序列。
在一方面，本文提供了一種所分離核酸分子，其編碼如本文所描述的所述抗體或其抗原結合部分。
在一方面，本文提供了一種宿主細胞，其包括如本文所描述的所述核酸分子的序列。
在一方面，本文提供了一種免疫綴合物，其包括如本文所描述的與治療劑連接的所述抗體或其抗原結合部分。
在一方面，本文提供了一種單克隆抗體或其抗原結合部分，所述單克隆抗體或其抗原結合部分包括：輕鏈，所述輕鏈包括SEQ ID NO: 11；以及重鏈，所述重鏈包括SEQ ID NO: 12。
在一方面，本文所描述的方法還可用於治療T細胞功能障礙，包含感染(例如，急性和慢性)和腫瘤免疫。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同的含義。本文描述了用於本發明的方法和材料；還可以使用本領域已知的其它適合的方法和材料。材料、方法、和實例僅是說明性的並且不意在是限制性的。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、資料庫條目、和其它參考均通過引用以其整體併入。在發生衝突的情況下，應以本說明書(包含定義)為準。
本發明的其它特徵和優點將通過以下詳細描述和附圖以及通過申請專利範圍變得顯而易見。
較佳實施例之詳細說明
本公開涉及與PD-1結合並阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用的所分離單克隆抗體。在某些實施例中，單克隆抗體或其抗原結合部分還阻斷PD-1與PD-L2之間的相互作用。在某些實施例中，本公開的抗體衍生自所標識重鏈和輕鏈種系序列和/或包括如CDR區等包括所標識氨基酸序列的所標識結構特徵，。本公開提供了所分離抗體、製備此類抗體的方法以及本公開的其抗原結合部分。本公開還涉及使用所述抗體，如單獨或與其它免疫刺激性抗體組合使用本公開的抗PD-1抗體來刺激免疫應答的方法。因此，還提供了使用本公開的抗PD-1抗體的例如，包含但不限於治療人體內的癌症的方法。
治療性小鼠抗體有時可以引起人抗小鼠抗體(HAMA)應答。在此情況下，治療性抗體可能會失去其功效。本公開還提供了降低HAMA應答並延長治療性功效的人源化抗體。
在一些實施例中，所述人源化抗體可以用於抗癌療法。在一些實施例中，所述人源化抗體可以用作獨立的治療劑。在一些實施例中，所述人源化抗體可以與細胞療法組合使用。在一些實施例中，本文所描述的人源化抗體可以進一步精製為單鏈可變片段(例如，scFv)。
如本文所使用的，術語「包括(comprising或comprises)」是參照對實施例來說有用但包含未指定元素(無論是否有用)的組合物、方法及其一種或多種相應組分而使用的。本領域的技術人員將理解，一般而言，本文中所使用的術語通常旨在是「開放性的」(術語(例如，術語」包含(including)「應當被解釋為」包含但不限於"，術語「具有」應當被解釋為「具有至少」，術語"包含(include)「應當被解釋為」包含但不限於「等)。
除非另有說明，否則在描述本申請的特定實施例的上下文中(特別是在申請專利範圍的上下文中)使用的術語「一個(a)」和「一種(an)」和「所述」以及類似的指示語可以被解釋為涵蓋單數和複數兩者。本文中對值的範圍的引用僅旨在充當一種單獨指代落入所述範圍內的每個單獨的值的簡化方法。除非本文另外指明，否則將每個單獨的值併入本說明書中，就好像每個單獨的值是在本文中單獨引用的一樣。除非本文中另外指明或明顯與上下文相矛盾，否則本文所述的所有方法均可以以任何合適的順序執行。相對於本文的某些實施例提供的任何和所有實例或示例性語言(例如，"如")的使用僅旨在更好地闡明本申請，並且不對以其它方式要求保護的本申請的範圍構成限制。縮寫「例如(e.g.)「源自拉丁文exempli gratia，並在本文中用於指示非限制性實例。因此，縮寫「例如(e.g.)「與術語」例如(for example)「同義。說明書中的任何語言都不應當被解釋為指示任何未要求保護的元素為實踐本申請所必需的。
如本文所使用的，術語"約"是指可測量的值，如量、持續時間等，並且涵蓋指定值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或±0.1%的變化。
如本文所使用的，術語表位，可以包含能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合的任何蛋白決定簇。表位決定簇通常由如氨基酸或糖側鏈等分子的化學活性表面基團組成，並且通常具有特異性三維結構特徵以及特異性電荷特性。當平衡解離常數≤1 μM，優選地≤100 nM並且最優選地≤10 nM時，據說抗體會特異性結合抗原。
如本文所使用的，術語「免疫應答」可以指代例如，淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和可溶性大分子的由上述細胞或肝臟產生(包含抗體、細胞因數和補體)的引起選擇性損害、破壞或從生物體中消除侵入性病原體、受病原體感染的細胞或組織、癌性細胞或者在自身免疫或病理炎症的情況下正常生物體細胞或組織的作用。
如本文所使用的，術語「抗原特異性T細胞應答」可以指代由T細胞作出的產生於用對所述T細胞具有特異性的抗原對所述T細胞的刺激的應答。由T細胞對抗原特異性刺激作出的應答的非限制性實例包含但不限於增殖和細胞因數產生(例如，IL-2的產生)。
如本文所使用的，術語「抗體」是指完整的免疫球蛋白，或是指具有Fc(可結晶片段)區或Fc區的FcRn結合片段的單克隆抗原結合片段或多克隆抗原結合片段(在本文中被稱為"Fc片段"或"Fc結構域")。抗原結合片段可以通過重組DNA技術，或通過完整抗體的酶促或化學切割產生。抗原結合片段尤其包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb和互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、單結構域抗體、嵌合抗體、雙抗體和含有免疫球蛋白的足以賦予多肽特異性抗原結合的一部分的多肽。Fc結構域包含兩條重鏈的有助於兩類或三類抗體的部分。Fc結構域可以通過重組DNA技術或通過酶促(例如，木瓜蛋白酶切割)或通過完整抗體的化學切割產生。
如本文所使用的，術語「抗體片段」或「抗原結合片段」是指包括完整抗體的僅一部分的，通常包含完整抗體的抗原結合位點並且因此保留結合抗原的能力的蛋白質片段。由本發明定義涵蓋的抗體片段的實例包含：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1結構域；(ii)Fab'片段，其是在CH1結構域的C末端處具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1結構域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1結構域以及位於CH1結構域的C末端處的一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體的單臂的VL和VH結構域；(vi)dAb片段(Ward等人，《自然(Nature)》341, 544-546 (1989))，其由VH結構域組成；(vii)所分離CDR區；(viii)F(ab')2片段，一種包含在鉸鏈區處由二硫橋連接的兩個Fab'片段的二價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如，單鏈Fv; scFv)(Bird等人，《科學(Science)》 242:423-426 (1988)；以及Huston等人，《美國國家科學院院刊(PNAS (USA))》 85:5879-5883 (1988))；(x)具有兩個抗原結合位點的"雙抗體"，其包括在相同多肽鏈中與輕鏈可變結構域(VL)連接的重鏈可變結構域(VH)(參見，例如，EP 404,097; WO 93/11161; 以及Hollinger等人，《美國國家科學院院刊》，90:6444-6448 (1993))；(xi)" 線性抗體"，其包括一對串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，《蛋白質工程(Protein Eng.)》 8(10):1057-1062 (1995)；以及美國專利第5,641,870號)。
如本文所使用的，「單鏈可變片段」、「單鏈抗體可變片段」或「scFv」“抗體是指通過連接子肽連接的包括僅重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區的抗體的形式。scFv能夠被表達為單鏈多肽。scFv保留了其所衍生的完整抗體的特異性。輕鏈和重鏈可以呈任何順序，例如，VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，只要保留了scFv對靶抗原的特異性即可。
如本文所使用的，「所分離抗體」可以指代基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，與PD-1蛋白特異性結合的所分離抗體可以基本上不含特異性結合除了PD-1蛋白以外的抗原的抗體)。然而，特異性結合人PD-1蛋白的所分離抗體對其它抗原(如來自其它物種的PD-1蛋白)可以具有交叉反應性。此外，所分離抗體可以基本上不含其它細胞物質和/或化學品。
可以選擇、克隆並進一步篩選抗PD-1抗體產生細胞，例如雜交瘤，以獲得所期望的特徵，包含強勁的生長、高抗體產生和所期望的抗體特徵。雜交瘤可以在同系動物和缺乏免疫系統的動物(例如，裸鼠)體內擴增或在體外在細胞培養物中擴增。選擇、克隆和擴增雜交瘤的方法是本領域的普通技術人員眾所周知的。
如本文所使用的，術語「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」可以指代單分子組合物的抗體分子的製劑。單克隆抗體組合物對特定表位顯示出單結合特異性和親和性。
如本文所使用的，術語"重組人抗體"可以指代所有通過重組方式製備、表達、產生或分離的人抗體，如(a)從對人免疫球蛋白基因而言是轉基因的或轉染色體的動物(例如，小鼠)或由其製備的雜交瘤(下文所描述的)中分離的抗體，((b)從被轉化以表達人抗體的宿主細胞中，例如，從轉染瘤中分離的抗體，(c)從重組、組合人抗體文庫中分離的抗體，以及(d)通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其它方式製備、表達、產生或分離的抗體。此類重組人抗體具有框架區和CDR區衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區。然而，在某些實施例中，此類重組人抗體可以經歷體外誘變(或者，當使用針對人Ig序列而轉基因的動物時，經歷體內體細胞誘變)，並且因此重組抗體的VH和VL區的氨基酸序列是儘管衍生自人種系VH和VL序列並與所述人種系VH和VL序列相關但可能並非天然存在於體內的人抗體種系庫內的序列。
如本文所使用的，術語「同種型」可以指代由重鏈恆定區基因編碼的抗體種類(例如，IgM或IgG1)。
"人源化抗體"具有通過一種或多種氨基酸取代、缺失和/或添加而與衍生自非人物種的抗體的序列不同的序列，使得與非人物種抗體相比，在將人源化抗體施用於人類受試者時，所述人源化抗體不太可能誘導抗抗體免疫應答和/或誘導較不太嚴重的抗抗體免疫應答。在一些實施例中，非人物種抗體的重鏈和/或輕鏈的框架結構域和恆定結構域中的某些氨基酸發生突變，從而產生人源化抗體。在一些實施例中，來自人抗體的一個或多個恆定結構域與非人物種的一個或多個可變結構域融合。在一些實施例中，非人抗體的一個或多個CDR序列中的一個或多個氨基酸殘基被改成降低在將非人抗體施用於人類受試者時所述非人類抗體的可能的免疫原性，其中經過改變的氨基酸殘基對於抗體與其抗原的免疫特異性結合不是關鍵性的，或者對氨基酸序列作出的改變是保守性改變，使得人源化抗體與抗原的結合並不比非人抗體與抗原的結合明顯更差。如何製備人源化抗體的實例可見於美國專利第6,054,297號、第5,886,152號和第5,877,293號中，所述美國專利通過引用整體併入本文。
如本文所使用的，術語「嵌合抗體」可以指代其中可變區序列可以衍生自一個物種並且恆定區序列可以衍生自另一個物種的抗體，如其中可變區序列可以衍生自小鼠抗體並且恆定區序列可以衍生自人抗體的抗體。
如本文所使用的，「特異性結合人PD-1」的抗體可以指代與人PD-1蛋白(並且可能來自一種或多種非人物種的PD-1蛋白)結合但與非PD-1蛋白基本上不結合的抗體。在一些實施例中，抗體以「高親和力」例如，以以下EC50與人PD-1蛋白結合：1 × 10-7 M或更小，更優選地5 × 10-8 M或更小，更優選地3 × 10-8 M或更小，更優選地1 × 10-8 M或更小，更優選地5 × 10-9 M或更小或甚至更優選地1 × 10-9 M或更小。短語「識別抗原的抗體」和「對抗原具有特異性的抗體」在本文中與術語與抗原特異性結合的抗體「可互換地使用。
如本文所使用的，術語"基本上不與蛋白質或細胞結合"可以意指其不能以高親和力與蛋白質或細胞結合或不以高親和力與蛋白質或細胞結合，即，以以下EC50與蛋白質或細胞結合：2 × 10-6 M或更大，更優選地1 × 10-5 M或更大，更優選地1 × 10-4 M或更大，更優選地1 × 10-3 M或更大，甚至更優選地1 × 10-2 M或更大。
如本文所使用的，術語對IgG抗體的"高親和力"可以指代對於靶抗原而言Kd為以下的抗體：1 × 10-6 M或更小，更優選地1 × 10-7 M或更小，甚至更優選地1 × 10-8 M或更小，甚至更優選地1 × 10-9 M或更小，甚至更優選地1 × 1010 M或更小。然而，"高親和力"結合對於其它抗體同種型可以有所不同。
如本文所使用的，術語「藥物調配物」是指呈允許其中所含有的活性成分的生物活性有效的形式並且不含有對將施用調配物的受試者產生不可接受的毒性的另外的組分的製劑。
如本文所使用的，術語「抑制」是指例如特定作用、功能或相互作用的任何減少。例如，與等參考狀態，如像野生型狀態或未應用試劑的狀態的對照相比，如果生物功能，如蛋白質的功能和/或一種蛋白質與另一種蛋白質的結合有所降低，則所述生物功能受到抑制。例如，與PD-1蛋白不與藥劑接觸時相比，如果結合、信號傳導和其它免疫作用由於與如抗PD-1抗體等藥劑接觸而降低，則PD-1蛋白與其配體中的一個或多個配體(如PD-L1和/或PD-L2)的結合，和/或所產生的PD-1信號傳導和免疫作用受到抑制或不足。此類抑制或不足可以如通過在特定時間和/或位置處應用藥劑誘導，或者如通過連續施用可以是組成性的。此類抑制或不足還可以是部分的或完全的，例如，與如像野生型狀態的對照等參考狀態相比，基本上沒有可測量的活性。基本上完全的抑制或不足被稱為阻斷。
如本文所使用的，術語"受試者"可以指代任何人或非人動物。受試者可以是男性或女性，並且可以處於任何合適的年齡，包含嬰兒受試者、少年受試者、青少年受試者、成人受試者和老年受試者。術語"非人動物"包含所有脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類、綿羊、犬、貓、奶牛、馬、雞、兔、小鼠、大鼠、兩棲動物以及爬行動物，但是優選的是哺乳動物，如非人靈長類、綿羊、犬、貓、奶牛和馬。PD-1 和免疫系統
免疫系統可以區分體內的正常細胞與那些被視為"外來"的細胞，這允許免疫系統攻擊外來細胞，而單獨留下正常細胞。此機制有時涉及被稱為免疫檢查點的蛋白質。免疫檢查點是免疫系統中的增強信號(共刺激分子)或減弱信號的分子。
檢查點抑製劑可以防止免疫系統攻擊正常組織，並且從而防止自身免疫性疾病。許多腫瘤細胞也表達檢查點抑製劑。這些腫瘤細胞通過共同選擇某些免疫檢查點通路來逃脫免疫監視，特別是在對腫瘤抗原具有特異性的T細胞中(Creelan、Benjamin C."肺癌中的免疫檢查點抑製劑的更新進展(Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer)"《癌症控制(Cancer Control)》 21.1 (2014): 80-89)。因為許多免疫檢查點是由配體-受體相互作用引發的，所以所述免疫檢查點可以很容易地被針對配體和/或其受體的抗體所阻斷。
PD-1(程序性細胞死亡1；PDCD1；或程式性死亡1)為免疫檢查點，並且通過促進淋巴結中的抗原特異性T細胞中的細胞凋亡(程序性細胞死亡)同時減少調節性T細胞(抗炎抑制性T細胞)中的細胞凋亡的雙重機制預防自身免疫。
PD-1主要在T細胞和原代B細胞的表面上表達；PD-1的兩個配體(PD-L1和PD-L2)在抗原呈遞細胞(APC)中廣泛表達。PD-1與其配體的相互作用在免疫應答的負調節中起重要作用。抑制PD-1與其配體之間的結合可以使腫瘤細胞暴露於免疫系統的殺傷作用中，並且因此可以達到殺傷腫瘤組織並治療癌症的作用。
PD-L1(CD274)在許多不同癌症的贅生性細胞上表達。通過在導致其抑制的T細胞上與PD-1結合，PD-L1表達成為腫瘤細胞可以通過其逃避免疫攻擊的主要機制。PD-L1過表達在概念上可以是由於2種機制引起的，即內在機制和適應性機制。PD-L1在癌細胞上的內在表達與這些贅生性細胞中的細胞/基因畸變有關。包含AKT和STAT通路的細胞信號傳導的活化使PD-L1表達增加。在原發性縱隔B細胞淋巴瘤中，MHC II類反式啟動因數(CIITA)與PD-L1或PD-L2的基因融合發生，導致這些蛋白質的過表達。PD-L1和PD-L2所位於的染色體9p23–24的擴增導致兩種蛋白質在經典霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)中的表達增加。適應性機制與誘導腫瘤微環境中的PD-L1表達有關。PD-L1可以響應干擾素γ在贅生性細胞上被誘導。在微衛星不穩定性結腸癌中，使PD-L1主要在腫瘤中的髓樣細胞上表達，所述髓樣細胞然後抑制細胞毒性T細胞功能。
使用PD-1阻斷以增強抗腫瘤免疫力源於慢性感染模型中的觀察，其中防止PD-1相互作用逆轉了T細胞耗竭。類似地，PD-1的阻斷防止了T細胞PD-1/腫瘤細胞PD-L1或T細胞PD-1/腫瘤細胞PD-L2相互作用，從而導致經過T細胞介導的抗腫瘤免疫力得以恢復。
對PD-1的詳細說明以及抗PD-1抗體用於治療癌症的用途在以下進行了描述：例如，Topalian、Suzanne L.等人「抗PD-1抗體在癌症中的安全性、活性和免疫相關性(Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer)"《新英格蘭醫學雜誌(New England Journal of Medicine)》 366.26 (2012): 24 43-2454; Hirano、Fumiya等人「單克隆抗體對B7-H1和PD-1的阻斷增強了癌症治療免疫力(Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity)"《癌症研究(Cancer research)》 65.3 (2005): 1089-1096; Raedler、Lisa A. "可瑞達(帕博利珠單抗)：首個批准用於經過先前治療的不可切除的或轉移性黑色素瘤的PD-1抑製劑(Keytruda (pembrolizumab): first PD-1 inhibitor approved for previously treated unresectable or metastatic melanoma)"美國衛生與藥物權益8(American health & drug benefits 8)《規範特徵(Spec Feature)》 (2015): 96; Kwok、Gerry等人"帕博利珠單抗(可瑞達)"(2016): 2777-2789; US 20170247454; US 9,834,606 B; 以及US 8,728,474；所述文獻中的每個均通過引用以其整體併入。
本公開提供了抗PD-1抗體、其抗原結合片段以及使用這些抗PD-1抗體和抗原結合片段抑制腫瘤生長並治療癌症的方法。抗 PD-1 抗體和抗原結合片段
本公開提供了與PD-1特異性結合的抗體和其抗原結合片段。本文所描述的抗體和抗原結合片段能夠與PD-1結合。在一些實施例中，這些抗體可以阻斷PD-1信號傳導通路，從而增加免疫應答。在一些實施例中，這些抗體可以引發補體依賴性的細胞毒性(CMC)或抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)。
本公開提供了例如小鼠抗PD-1抗體(例如，F02)和其嵌合抗體以及其人源化抗體(例如，H11、Ab8、Ab2、Ab5、Ab7、Ab4)。
F02和F02衍生的抗體或其抗原結合片段的CDR序列包含分別包括SEQ ID NO: 8、9、10或由SEQ ID NO: 8、9、10組成的VH CDR1、V CDR2和VH CDR3以及分別包括SEQ ID NO: 5、6、7或由SEQ ID NO: 5、6、7組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
H11和H11衍生的抗體或其抗原結合片段的CDR序列包含分別包括SEQ ID NO: 22、23、24或由SEQ ID NO: 22、23、24組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及分別包括SEQ ID NO: 19、20、21或由SEQ ID NO: 19、20、21組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
Ab8和Ab8衍生的抗體或其抗原結合片段的CDR序列包含分別包括SEQ ID NO: 74、75、76或由SEQ ID NO: 74、75、76組成的VH CDR1、VH CDRDR2和VH CDR3以及分別包括SEQ ID NO: 71、72、73或由SEQ ID NO: 71、72、73組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
Ab2和Ab2衍生的抗體或其抗原結合片段的CDR序列包含分別包括SEQ ID NO: 34、35、36或由SEQ ID NO: 34、35、36組成的VH CDR1、VH C DRDR2和VH CDR3以及分別包括SEQ ID NO: 31、32、33或由SEQ ID NO: 31、32、33組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
Ab5和Ab5衍生的抗體或其抗原結合片段的CDR序列包含分別包括SEQ ID NO: 54、55、56或由SEQ ID NO: 54、55、56組成的VH CDR1、VH CDRDR2和VH CDR3以及分別包括SEQ ID NO: 51、52、53或由SEQ ID NO: 51、52、53組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
Ab7和Ab7衍生的抗體或其抗原結合片段的CDR序列包含分別包括SEQ ID NO: 64、65、66或由SEQ ID NO: 64、65、66組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及分別包括SEQ ID NO: 61、62、63或由SEQ ID NO: 61、62、63組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
Ab8和Ab8衍生的抗體或其抗原結合片段的CDR序列包含分別包括SEQ ID NO: 44、45、46或由SEQ ID NO: 44、45、46組成的VH CDR1、VH CDRDR2和VH CDR3以及分別包括SEQ ID NO: 41、42、43或由SEQ ID NO: 41、42、43組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
F02抗體的重鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 4中。F02抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 2中。
H11抗體的重鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 18中。H11抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 16中。
Ab8抗體的重鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 70中。Ab8抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 68中。
Ab2抗體的重鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 30中。Ab2抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 28中。
Ab5抗體的重鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 50中。Ab5抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 48中。
Ab7抗體的重鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 60中。Ab7抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 58中。
Ab4抗體的重鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 40中。Ab4抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列被列示在SEQ ID NO: 38中。
還提供了人源化抗體的重鏈可變區和輕可變區的氨基酸序列。由於存在使小鼠抗體人源化的不同方式(例如，可以用不同的氨基酸取代修飾序列)，因此抗體的重鏈和輕鏈可以具有人源化序列中的多於一個版本。在一些實施例中，人源化重鏈可變區與SEQ ID NO: 4、18、70、30、50、60或40至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在一些實施例中，人源化輕鏈可變區與SEQ ID NO: 2、16、68、28、48、58或38至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。重鏈可變區序列可以與輕鏈可變區序列配對，並且所述重鏈可變區序列和所述輕鏈可變區序列一起與PD-1結合。
人源化百分比意指重鏈或輕鏈可變區序列相比於國際免疫遺傳學資訊系統(IMGT)資料庫中的人抗體序列的同一性百分比。頂部命中意指相比於其它物種，重鏈或輕鏈可變區序列更接近特定物種。例如，對人類的頂部命中意指相比於其它物種，序列更接近人類。對人類和食蟹猴(Macaca fascicularis )的頂部命中意指序列對人序列和食蟹猴序列具有相同的同一性百分比，並且相比於其它物種的序列，這些同一性百分比最高。在一些實施例中，人源化百分比大於80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%。關於如何確定人源化百分比和如何確定頂部命中的詳細描述是本領域已知的，並且在以下中進行了描述：例如，Jones等人「抗體非專有名稱的來龍去脈(The INNs and outs of antibody nonproprietary names)"《MAbs期刊》第8卷，第1期中。Taylor和Francis, 2016,其通過引用以其整體併入本文中。高人源化百分比通常具有各種優勢，例如，在人類中更安全並且更有效，對人類受試者而言耐受性更好和/或具有副作用的可能性更小。
此外，在一些實施例中，本文所描述的抗體或其抗原結合片段還可以含有選自以下的組的一個、兩個或三個重鏈可變區CDR:SEQ ID NO: 8-10、SE Q ID NO: 22-24、SEQ ID NO: 74-76、SEQ ID NO: 34-36、SEQ ID NO: 54-56、SEQ ID NO: 64-66和SE Q ID NO: 44-46；和/或選自以下的組的一個、兩個或三個輕鏈可變區CDR:SEQ ID NO: 5-7、SEQ ID NO: 19-21、SE Q ID NO: 71-73、SEQ ID NO: 31-33、SEQ ID NO: 51-53、SEQ ID NO: 61-63和SEQ ID No: 41-43。
在一些實施例中，所述抗體可以具有包括互補決定區(CDR)1、2和3的重鏈可變區(VH)，其中所述CDR1區包括與所選VH CDR1氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述CDR2區包括與所選VH CDR2氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，並且所述CDR3區包括與所選VH CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。在一些實施例中，所述抗體可以具有包括CDR1、2和3的輕鏈可變區(VL)，其中所述CDR1區包括與所選VL CDR1氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述CDR2區包括與所選VL CDR2氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，並且所述CDR3區包括與所選VL CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。所選VH CDR1、2和3氨基酸序列以及所選VL CDR1、2和3氨基酸序列被示出在圖 9 中。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域含有以下的CDR中的一個、兩個或三個：SEQ ID NO: 8的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 9的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 10的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域含有以下的CDR中的一個、兩個或三個：SEQ ID NO: 22的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 23的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 24的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域含有以下的CDR中的一個、兩個或三個:SEQ ID NO: 74的具有零種、一 種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 75的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 76的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域含有以下的CDR中的一個、兩個或三個:SEQ ID NO: 34的具有零種、一 種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 35的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 36的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域含有以下的CDR中的一個、兩個或三個:SEQ ID NO: 5的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 6的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 7的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域含有以下的CDR中的一個、兩個或三個:SEQ ID NO: 19的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 20的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 21的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域含有以下的CDR中的一個、兩個或三個:SEQ ID NO: 71的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 72的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 73的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域含有以下的CDR中的一個、兩個或三個：SEQ ID NO: 31的具有零種、一 種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 32的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的；SEQ ID NO: 33的具有零種、一種或兩種氨基酸插入、缺失或取代的。
插入、缺失和取代可以處於CDR序列內，或者在CDR序列的一個或兩個末端處。在一些實施例中，CDR基於Kabat編號方案而確定。
本公開還提供了與PD-1結合的抗體或其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段含有重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH包括與所選VH序列至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述VL包括與所選VL序列至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO: 4，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO: 18，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO: 70，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO: 30，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO: 50，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO: 60，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 58。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO: 40，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 38。
本公開還提供了核酸，所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈的多肽的多核苷酸。免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈包括CDR，或具有如圖 9 所示的序列。當多肽與對應多肽(例如，對應重鏈可變區或對應輕鏈可變區)配對時，所配對多肽與PD-1(例如，人PD-1)結合。
抗PD-1抗體和抗原結合片段還可以是抗體或抗體片段以及多特異性(例如，雙特異性)抗體或抗體片段的抗體變體(包含衍生物和綴合物)。本文提供的另外的抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、多特異性抗體(多聚體抗體，例如，雙特異性抗體)、人抗體、嵌合抗體(例如，人鼠嵌合體)、單鏈抗體、細胞內製造的抗體(即，胞內抗體)和其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段可以為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，類別(例IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是IgG抗體或其抗原結合片段。
抗體的片段適合用於所提供的方法，只要所述片段保留了全長抗體的所期望的親和力和特異性即可。因此，與PD-1結合的抗體的片段將保留與PD-1結合的能力。Fv片段是含有完整抗原識別和結合位點的抗體片段。此區由緊密締合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成，所述二聚體在性質上，例如在scFv中可以是共價的。正是在此構型中，每個可變結構域的三個CDR相互作用以限定VH-VL二聚體的表面上的抗原結合位點。共同地，這六個CDR或其子集賦予了抗體抗原結合特異性。然而，即使是單個可變結構域(或包括對抗原具有特異性的僅三個CDR的Fv的一半)也可以具有識別和結合抗原的能力，但是通常以比完整結合位點更低的親和力進行。單鏈Fv或(scFv)抗體片段包括抗體的VH和VL結構域(或區)，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。通常，scFv多肽進一步包括位於VH結構域與VL結構域之間的使scFv能夠形成對於抗原結合而言所期望的結構的多肽連接子。
本公開還提供了與如本文所描述的任何抗體或抗原結合片段交叉競爭的抗體或其抗原結合片段。交叉競爭測定是本領域已知的，並且在以下進行了描述：例如，Moore等人，「人免疫缺陷病毒1型gp120外膜糖蛋白的抗體交叉競爭分析(Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein)"《病毒學雜誌(Journal of virology)》 70.3 (1996): 1863-1872，所述文獻通過引用以其整體併入本文。在一方面，本公開還提供了與如與本文所描述的任何抗體或抗原結合片段相同的表位或區結合的抗體或其抗原結合片段。表位分箱測定是本領域已知的，並且在以下進行了描述，例如Estep等人「基於高通量解決方案對抗體-抗原親和力和表位分箱的測量(High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning)"《MAbs期刊》第5卷，第2期，泰勒-弗朗西斯出版集團(Taylor & Francis)，2013，所述文獻通過引用以其整體併入本文。
在一方面，本公開提供了一種所分離人PD-1結合單克隆抗體或其抗原結合部分，所述所分離人PD-1結合單克隆抗體或其抗原結合部分包括：(a)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；以及(b)重鏈可變區，所述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列；其中所述抗體或部分阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用以及PD-1與PD-L2之間的相互作用。
在另一方面，本公開提供了一種所分離單克隆抗體或其抗原結合部分，所述所分離單克隆抗體或其抗原結合部分包括：(a)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；以及(b)重鏈可變區，所述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列；其中所述抗體與PD-1特異性結合並且阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用。在一些實施例中，單克隆抗體或其抗原結合部分刺激抗腫瘤免疫應答。在一些實施例中，單克隆抗體可以是嵌合抗體。
在另一方面，本公開提供了包括克隆#11的重鏈和輕鏈CDRl、CDR2和CDR3的抗體。克隆#11的VL CDRl的氨基酸序列被示出在SEQ ID NO: 5中。克隆#11的VL CDR2的氨基酸序列被示出在SEQ ID NO: 6中。克隆#11的VL CDR3的氨基酸序列被示出在SEQ ID NO: 7中。克隆#11的VH CDRl的氨基酸序列被示出在SEQ ID NO: 8中。克隆#11的VH CDR2的氨基酸序列被示出在SEQ ID NO: 9中。克隆#11的VH CDR3的氨基酸序列被示出在SEQ ID NO: 10中。可以使用Kabat系統(Kabat等人 (1991) 《具有免疫學重要性的蛋白質的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》 第五版，美國衛生與公共事業部(U.S. Department of Health and Human Services)，NIH公開號91-3242)劃定CDR區。
在另一方面，本公開提供了編碼單克隆抗體克隆#11的輕鏈可變結構域(VL)和重鏈可變結構域(VH)的多核苷酸序列。所述VL多核苷酸序列被示出在SEQ ID NO: 1中。所述VH多核苷酸序列被示出在SEQ ID NO: 3中。
抗體可以通過與其重鏈可變結構域的隨機誘變組合或不與其重鏈可變結構域的隨機誘變組合的輕鏈置換(shuffling)以及針對PD-1進行淘選而成為親和力成熟的。可以用輕鏈置換優化本公開中提及的抗體的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以產生本公開的其它抗PD-1結合分子。
使用具有本文所公開的VH和/或VL序列中的一個或多個的抗體作為起始材料對經過修飾的抗體進行工程化可以進一步製備本公開的抗體，所述經過修飾的抗體可以具有與起始抗體不同的特性。可以通過修飾一個或兩個可變區(即，VH和/或VL)內，例如一個或多個CDR區內和/或一個或多個框架區內的一個或多個殘基對抗體進行工程化。另外地或可替代地，可以通過修飾一個或多個恆定區內的殘基對抗體進行工程化，例如以改變抗體的一種或多種效應功能。
在某些實施例中，可以使用CDR移植對抗體的可變區進行工程化。抗體主要通過位於六個重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。
因為CDR序列可以負責大多數抗體-抗原相互作用，所以有可能通過構建表達載體來表達類比特異性天然存在的抗體的性質的重組抗體，所述表達載體包含來自移植到來自具有不同性質的不同抗體的框架串列上的特異性天然存在的抗體的CDR序列(參見例如，Riechmann等人 (1998) 《自然》 332:323-327; Jones等人 (1986) 《自然》 321: 522-525; Queen等人 (1989) 《美國國家科學院院刊》。參見U.S.A. 86: 10029-10033；美國專利第5,225,539號；第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號和第6,180,370號)。
因此，本公開的另一個實施例涉及所分離單克隆抗體或其抗原結合部分，所述所分離單克隆抗體或其抗原結合部分包括輕鏈可變區和重鏈可變區，所述輕鏈可變區包括分別包括SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重鏈可變區包括分別包括SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。因此，此類抗體含有來自雜交瘤克隆#11的抗PD-1單克隆抗體的VH和VL CDR序列，並且可以含有與這些抗體不同的框架序列。
此類框架序列可以從包含種系抗體基因序列的公共DNA資料庫或所公開的參考文獻中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以見於「Vbase」人種系序列資料庫(可通過www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase在互連網上獲得)中以及以下文獻中：Kabat等人 (1991) 同上引用；Tomlinson等人 (1992) “「人種系VH序列的庫揭示了約五十組具有不同高變環的VH區段(The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops) " 《分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.)》 227:776-798；以及Cox等人 (1994) "人種系VH區段的目錄揭示了其使用中的強烈的傾向性(A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage)" 《歐洲免疫學雜誌(Eur. J. Immunol.)》24:827-836；所述文獻中的每個文獻的內容通過引用明確地併入本文。作為另一個實例，人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以見於GenBank資料庫中。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中發現的以下重鏈種系序列可在隨附的GenBank登錄號1-69 (NG_0010109, NT_024637 & BC070333)、3-33 (NG_0010109 & NT_024637)和3-7 (NG_0010109 &NT_024637)中獲得。作為另一個實例，在HCo12 HuMAb小鼠中發現的以下重鏈種系序列可在隨附的GenBank登錄號1-69 (NG_0010109, NT_024637 & BC070333)、5-51 (NG_0010109 & NT_024637)、4-34 (NG_0010109 & NT_024637)、3-30.3 (CAJ556644) & 3-23 (AJ406678)中獲得。
使用被稱為Gapped BLAST的序列相似性搜索方法(Altschul等人 (1997))之一將抗體蛋白質序列與所編製蛋白質序列資料庫進行比較，所述序列相似性搜索方法是本領域的技術人員眾所周知的。本公開的組合物和方法不限於本文所公開的示例性序列的變體，而是包含與本文所公開的示例性序列的序列同一性為至少90%、至少95%和至少99%的序列。抗體和抗原結合片段
本公開提供了衍生自本文所描述的抗PD-1抗體的各種抗體和其抗原結合片段。通常，抗體(也被稱為免疫球蛋白)由兩種類別的多肽鏈製成，即輕鏈和重鏈。本公開的抗體的非限制性實例可以是包括兩個重鏈和兩個輕鏈的完整的四個免疫球蛋白鏈抗體。抗體的重鏈可以是包含IgM、IgG、IgE、IgA或IgD的任何同種型或包含IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等的亞同種型。輕鏈可以是κ輕鏈或λ輕鏈。抗體可以包括輕鏈的兩個相同拷貝和重鏈的兩個相同拷貝。使用一個可變結構域(或可變區VH) 和多個恆定結構域(或恆定區)的重鍊通過其恒定結構域內的二硫鍵合彼此結合以形成抗體的「莖」。各自含有一個可變結構域(或可變區VL )和一個恆定結構域(或恆定區)的輕鏈各自通過二硫鍵合與一條重鏈結合。每個輕鏈的可變區與與其所結合的重鏈的可變區比對。輕鏈和重鏈兩者的可變區均含有夾置在更保守框架區(FR)之間的三個高變區。
這些高變區(被稱為互補決定區(CDR))形成包括抗體的抗原結合表面的環。四個框架區大量採用β-摺疊構象，並且CDR形成連接β-摺疊結構並且在一些情況下形成β-摺疊結構的一部分的環。每條鏈中的CDR通過框架區保持緊密靠近並與來自另一條鏈的CDR一起促進抗原結合區的形成。
用於通過分析抗體的氨基酸序列標識抗體的CDR區的方法是眾所周知的，並且CDR的多個定義是通常使用的。Kabat定義基於序列變異性，並且Chothia定義基於結構環區的位置。這些方法和定義在以下中進行描述：例如，Martin，「抗體可變結構域的蛋白質序列和結構分析(Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains)” 「抗體工程(Antibody engineering)》，施普林格出版社柏林海德堡(Springer Berlin Heidelberg), 2001,422-439; Abhinandan等人「Kabat的分析和改進以及抗體可變結構域的結構正確的編號(Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains)"，《分子免疫學(Molecular immunology)》 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T.和Kabat, E.A.(1970) 《實驗醫學雜誌》 132: 211-250; Martin等人，《酶學方法(Methods Enzymol.)》203:121-53 (1991); Morea等人，《生物物理化學(Biophys Chem.)》 68(1-3):9-16 (1997年10月); Morea等人，《分子生物學雜誌》 275(2):269-94 (1998年1月); Chothia等人，《自然》 342(6252):877-83 (1989年12月); Ponomarenko和Bourne，《BMC結構生物學(BMC Structural Biology)》 7:64 (2007)；所述文獻中的每個通過引用以其整體併入本文。除非另有說明，否則在本公開中使用Kabat定義。
CDR對於識別抗原的表位是重要的。如本文所使用的，「表位」是能夠由抗體的抗原結合結構域特異性結合的靶分子的最小部分。表位的最小大小可以為約三個、四個、五個、六個或七個氨基酸，但這些氨基酸不必位於抗原的一級結構的連續線性序列中，因為表位可能取決於基於抗原的二級結構和三級結構的抗原的三維構型。
在一些實施例中，抗體是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亞類(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，在其恆定區方面，尤其是在其鉸鏈和上部CH2結構域方面有所不同。IgG亞類的序列和差異是本領域已知的，並且在以下中進行了描述：例如，Vidarsson等人，"IgG亞類和同種異型：從結構到效應功能(IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions)"《免疫學前沿5(Frontiers in immunology 5)》 (2014); Irani等人"人IgG亞類的分子特性和其對設計針對感染性疾病的治療性單克隆抗體的意義(Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases)"《分子免疫學》 67.2 (2015): 171-182; Shakib、Farouk編，《人IgG亞類：結構、功能和調節的分子分析(The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation)》愛思唯爾(Elsevier)，2016；所述文獻中的每個通過引用以其整體併入本文。
抗體還可以是源自任何物種(例如人類、嚙齒動物、小鼠、駱駝科動物)的免疫球蛋白分子。本文所公開的抗體還包含但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體和包含與另一種多肽融合的免疫球蛋白結合結構域的嵌合抗體。術語'抗原結合結構域'或「抗原結合片段」是抗體的保留完整抗體的特異性結合活性的一部分，即，抗體的能夠與完整抗體的靶分子上的表位特異性結合的任何部分。其包含例如Fab、Fab'、F(ab')2和這些片段的變體。因此，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可以是例如scFv、Fv、Fd、dAb、雙特異性抗體、雙特異性scFv、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、由抗體片段形成的多特異性抗體以及包含作為抗體結合結構域或與抗體結合結構域同源的結合結構域的任何多肽。抗原結合結構域的非限制性實例包含，例如，完整抗體的重鏈和/或輕鏈CDR、完整抗體的重鏈和/或輕鏈可變區、完整抗體的全長重鏈或輕鏈或來自完整抗體的重鏈或輕鏈的單獨CDR。
還提供了適用於本文所描述的方法的抗體的片段。Fab片段含有輕鏈的可變結構域和恆定結構域以及重鏈的可變結構域和第一恆定結構域(CH1)。F(ab')2抗體片段包括通常在其羧基末端附近由其之間的鉸鏈半胱氨酸共價連接的Fab片段對。抗體片段的其它化學偶聯也是本領域已知的。
雙抗體是具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包括與同一條多肽鏈(VH和VL)中的VL連接的VH。通過使用太短以至於不允許在同一條鏈上的兩個結構域之間配對的連接子，結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合位點。
線性抗體包括與互補輕鏈多肽一起形成抗原結合區對的串聯的Fd區段對(VH-CH1-VH-CH1)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。
本公開的抗體和抗體片段可以在Fc區中修飾以提供期望的效應子功能或血清半衰期。
抗體的多聚化可以通過抗體的自然聚集或本領域已知的化學連接技術或重組連接技術完成。例如，某種百分比的經過純化的抗體製劑(例如，經過純化的IgG1 分子)自發地形成含有抗體同源二聚體和其它更高階抗體多聚體的蛋白質聚集體。
可替代地，抗體同源二聚體可以通過本領域已知的化學連接技術形成。例如，可以使用包含但不限於SMCC(琥珀酰亞胺基4-(馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯)和SATA(N-琥珀醯亞胺基S-乙醯硫基乙酸酯)的異源雙功能交聯劑形成抗體多聚體。用於形成抗體同源二聚體的示例性方案在Ghetie等人(《美國國家科學院院刊》94: 7509-7514, 1997)中進行了描述。抗體同源二聚體可以通過胃蛋白酶的消化而轉化為Fab'2 同源二聚體。形成抗體同源二聚體的另一種方式是通過使用在Zhao等人(《免疫學雜誌》25:396-404, 2002)中描述的自親型(autophilic)T15肽。
在一些實施例中，多特異性抗體是雙特異性抗體。可以通過對抗體分子對之間的介面進行工程化以最大化從重組細胞培養物中回收的異源二聚體的百分比來製備雙特異性抗體。例如，介面可以含有抗體恒定結構域的CH3結構域的至少一部分。在此方法中，用較大的側鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替換來自第一抗體分子的介面的一個或多個小氨基酸側鏈。通過用較小的氨基酸側鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)替換大的氨基酸側鏈，在第二抗體分子的介面上產生了與一條或多條大的側鏈相同或類似大小的補償性"腔"這提供了用於提高異源二聚體相比於如同源二聚體等不想要的最終產物的產率的機制。此方法在例如WO 96/27011中進行了描述，所述文獻通過引用以其整體併入。
雙特異性抗體包含交聯的抗體或「異源綴合」抗體。例如，異源綴合物中的抗體之一可以與抗生物素蛋白偶聯，並且另一個可以與生物素偶聯。異源綴合抗體還可以使用任何方便的交聯方法製備。適合的交聯劑和交聯技術在本領域中是眾所周知的，並且在美國專利第4,676,980號中進行了公開，所述美國專利通過引用以其整體併入本文。
用於從抗體片段產生雙特異性抗體的方法也是本領域已知的。例如，雙特異性抗體可以使用化學連接製備。Brennan等人(《科學》 229:81, 1985)描述了使完整抗體蛋白水解切割以產生F(ab')2 片段的程式。在二巰基絡合劑亞砷酸鈉存在的情況下還原這些片段以穩定鄰位二巰基並防止分子間二硫化物形成。然後將產生的Fab'片段轉化為硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。然後通過用巰基乙胺還原將Fab'TNB衍生物之一重新轉化為Fab'硫醇，並且與等摩爾量的另一種Fab『TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。
本文所描述的抗體或抗原結合片段中的任何抗體或抗原結合片段可以與穩定分子(例如，增加受試者或溶液中的抗體或其抗原結合片段的半衰期的分子)綴合。穩定分子的非限制性實例包含：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白質(例如，血清白蛋白，如人血清白蛋白)。穩定分子的綴合可以增加抗體或抗原結合片段的在體外(例如，在組織培養中或當以藥物組合物形式儲存時)或在體內(例如，在人體中)的半衰期或延長其生物活性。
在一些實施例中，本文所描述的抗體或抗原結合片段可以與治療劑綴合。包括抗體或其抗原結合片段的抗體-藥物綴合物可以與治療劑共價結合或非共價結合。在一些實施例中，治療劑是細胞毒性劑或細胞生長抑製劑(例如，細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、阿黴素(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素(dihydroxy anthracin)、登木素生物鹼(maytansinoids)(如DM-1和DM-4)、二酮(dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睾酮(dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、表柔比星(epirubicin)和環磷醯胺(cyclophosphamide)以及類似物)。
在一些實施例中，抗原結合片段可以形成嵌合抗原受體(CAR)的一部分。在一些實施例中，嵌合抗原受體是如本文所描述的單鏈可變片段(scFv)的與CD3-ζ跨膜結構域和內結構域融合的融合物。在一些實施例中，嵌合抗原受體還包括來自各種共刺激蛋白質受體(例如，CD28、41BB、ICOS)的細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括多個信號傳導結構域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以增加效力。因此，在一方面，本公開進一步提供了表達如本文所描述的嵌合抗原受體的細胞(例如，T細胞)。
在一些實施例中，scFV具有一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域。在一些實施例中，scFV具有兩個重鏈可變結構域和兩個輕鏈可變結構域。抗體特性
本文所描述的抗體或其抗原結合片段可以阻斷PD-1與PD-1配體(例如，PD-L1或PD-L2)之間的結合。在一些實施例中，通過與PD-1結合，抗體可以抑制PD-1信號傳導通路。在一些實施例中，抗體可以上調免疫應答。
在一些實施例中，如本文所描述的抗體或其抗原結合片段可以使免疫細胞(例如，T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、抗原呈遞細胞)的免疫應答、活性或數量增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。
在一些實施方案中，抗體(或其抗原結合片段)以小於0.1 s-1 、小於0.01 s-1 、小於0.001 s-1 、小於0.0001 s-1 或小於0.0000 1 s-1 的解離速率(koff)與PD-1(例如，人PD-1(SEQ ID NO: 77)、恆河猴PD-1(NP_001107830.1)、小鼠PD-1(NP_032824.1)和/或嵌合PD-1)特異性結合。在一些實施例中，解離速率(koff)大於0.01 s-1 、大於0.001 s-1 、大於0.0001 s-1 、大於0.00001 s-1 或大於0.000001 s-1 。
在一些實施例中，動力學締合速率(kon)大於1 × 102 /Ms、大於1 × 103 /Ms、大於1 × 104 /Ms、大於1 × 105 /Ms或大於1 × 106 /Ms。在一些實施例中，動力學締合速率(kon)小於1 × 105 /Ms、小於1 × 106 /Ms或小於1 × 107 /Ms。
親和力可以根據動力學速率常數的商(KD = koff/kon)推導。在一些實施例中，KD(Kd)小於1 × 10-6 M、小於1 × 10-7 M、小於1 × 10-8 M、小於1 × 10-9 M或小於1 × 10-10 M。在一些實施例中，KD小於50nM、30 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM或0.1 nM。在一些實施例中，KD大於1 × 10-7 M、大於1 × 10-8 M、大於1 × 10-9 M、大於1 × 10-10 M、大於1 × 10-11 M或大於1 × 10-12 M。
用於測量抗體對抗原的親和力的通用技術包含例如ELISA、RIA和表面等離子共振(SPR)。在一些實施例中，抗體與人PD-1(SEQ ID NO: 77)結合。在一些實施例中，抗體與猴PD-1(例如，來自食蟹猴的NP_001271065.1)、嵌合PD-1和/或小鼠PD-1(例如，NP_032824.1)結合。在一些實施例中，抗體不與猴PD-1、嵌合PD-1和/或小鼠PD-1結合。
在一些實施例中，如本文所描述的抗體或其抗原結合片段是PD-1拮抗劑。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段降低表達PD-1的靶細胞中的PD-1信號轉導。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可以增強APC(例如，DC細胞)功能，例如，誘導共刺激分子和MHC分子的表面表達、誘導促炎細胞因數的產生和/或增強T細胞觸發功能。
在一些實施例中，Fc區是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。在一些實施例中，所述抗體是人IgG1抗體。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段不具有功能性Fc區。例如，抗體或抗原結合片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和Fv片段。在一些實施例中，Fc區具有LALA突變(EU編號中為L234A和L235A突變)或LALA-PG突變(EU編號中為L234A、L235A、P329G突變)。
如本文所描述的抗體與PD-1的結合還可以使用本領域中充分確立的一種或多種技術評估。例如，在優選實施例中，可以通過ELISA測定對抗體進行測試，例如使用重組PD-1蛋白。仍其它適合的結合測定包含但不限於流式細胞術測定，在所述流式細胞術測定中抗體與表達人PD-1的細胞系反應，如已經被轉染以表達其細胞表面上的PD-1(例如，人PD-1)的HEK293T細胞。另外地或可替代地，抗體的結合，包含結合動力學(例如，KD值)可以在BIAcore結合測定等中進行測試。
優選地，本公開的抗體以5× 10-8 M或更小的EC50與PD-1蛋白結合，以2 × 10-8 M或更小的EC50與PD-1蛋白結合，以5 × 10-9 M或更小的EC50與PD-1蛋白結合，以4 × 10-9 M或更小的EC50與PD-1蛋白結合，以3 × 10-9 M或更小的EC50與PD-1蛋白結合，以2 × 10-9 M或更小的EC50與PD-1蛋白結合，以1 × 10-9 M或更小的EC50與PD-1蛋白結合。製備抗 PD-1 抗體的方法
可以將人PD-1的所分離片段用作免疫原以使用用於多克隆和單克隆抗體制備的標準技術產生抗體。可以通過多次注射(例如，皮下注射或腹膜內注射)抗原肽或蛋白質在動物中產生多克隆抗體。在一些實施例中，抗原肽或蛋白質與至少一種佐劑一起注射。在一些實施例中，抗原肽或蛋白質可以與在待免疫的物種中具有免疫原性的試劑綴合。可以向動物注射多於一次(例如，兩次、三次或四次)抗原肽或蛋白質。
可以將全長多肽或蛋白質用作免疫原，或者可替代地，可以將其抗原肽片段用作免疫原。蛋白質的抗原肽包括PD-1的氨基酸序列的至少8個(例如，至少10個、15個、20個或30個)氨基酸殘基，並且涵蓋蛋白質的表位，使得針對肽產生的抗體與蛋白質形成特異性免疫複合物。如上所述，人PD-1的全長序列是本領域已知的(SEQ ID NO: 77)。
免疫原通常用於通過使合適的受試者(例如，表達至少一個人免疫球蛋白基因座的人或轉基因動物)免疫來製備抗體。適當的免疫原性製劑可以含有例如經過重組表達的多肽或經過化學合成的多肽(例如，人PD-1的片段)。製劑可以進一步包含佐劑，如弗氏完全或不完全佐劑(Freund's complete or incomplete adjuvant)或類似免疫刺激劑。
如上所述，可以通過用PD-1多肽或其抗原肽(例如，PD-1的一部分)作為免疫原使適合的受試者免疫來製備多克隆抗體。可以通過標準技術，如利用使用固定化PD-1多肽或肽的酶聯免疫吸附測定(ELISA))隨時間推移監測經過免疫的受試者中的抗體滴度。如果需要，可以從哺乳動物中(例如，從血液中)分離抗體分子，並且通過眾所周知的技術(如蛋白G層析法的蛋白A)對其進行進一步純化以獲得IgG餾分。在免疫後的適當時間，例如，當特異性抗體滴度最高時，可以從受試者中獲得抗體產生細胞，並且通過以下標準技術將其用於製備單克隆抗體：最初由Kohle等人(《自然》 256:495-497, 1975)中描述的雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，《今日免疫學》 4:72, 1983)、EBV雜交瘤技術(Cole等人,《單克隆抗體與癌症治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》，Alan R. Liss公司(Alan R. Liss, Inc.)，第77-96頁，1985)或三體瘤技術。用於產生雜交瘤的技術是眾所周知的(通常參見，《當代免疫學指南(Current Protocols in Immunology)》，1994, Coligan等人(編輯)，約翰威利父子出版公司(John Wiley & Sons, Inc.)，紐約州紐約)。通過篩選雜交瘤培養物上清液中結合所關注的多肽或表位的抗體，例如，使用標準ELISA測定)對產生單克隆抗體的雜交瘤細胞進行檢測。
可以從產生此類抗體的任何來源中分離編碼抗PD-1抗體或其部分的重鏈或整個輕鏈的核酸分子。在各個實施例中，從分離自用PD-1免疫的動物的B細胞或從衍生自表達抗PD-1抗體的此類B細胞的永生化細胞分離核酸分子。分離編碼抗體的mRNA的方法是本領域眾所周知的。參見例如，Sambrook等人。所述mRNA可以用於產生cDNA，以用於抗體基因的聚合酶鏈反應(PCR)或cDNA克隆。在優選實施例中，從具有作為其融合配偶體之一的來自非人轉基因動物的人免疫球蛋白產生細胞的雜交瘤中分離核酸分子。在另一個實施例中，可以從非人非轉基因動物中分離核酸。從非人非轉基因動物中分離的核酸分子可以用於例如人源化抗體。
可以通過將適當的核苷酸改變引入到編碼本文所描述的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體或其抗原結合片段的DNA中，或通過肽合成製備本文所描述的抗體或抗原結合片段的變體。此類變體包含例如製成抗體的抗原結合位點或抗原結合結構域的氨基酸序列內的殘基的缺失、插入或取代。在此類變體的群體中，一些抗體或抗原結合片段對靶蛋白例如PD-1將具有增加的親和力。可以進行缺失、插入和/或組合的任何組合以獲得對靶具有增加的結合親和力的抗體或其抗原結合片段。引入到抗體或抗原結合片段中的氨基酸改變也可以改變抗體或抗原結合片段或將新的翻譯後修飾引入到抗體或抗原結合片段，如改變(例如，增加或減少)糖基化位點的數量、改變糖基化位點的類型(例如，改變氨基酸序列，使得由細胞中存在的酶連接不同的糖)或引入新的糖基化位點。
本文所公開的抗體可以源自任何動物物種，包含哺乳動物。天然抗體的非限制性實例包含源自人、靈長類動物(例如，猴和猿)、奶牛、豬、馬、綿羊、駱駝科動物(例如，駱駝和美洲駝)、雞、山羊和嚙齒動物(例如，大鼠、小鼠、倉鼠和兔)的抗體，所述嚙齒動物包含經過基因工程化以產生人抗體的轉基因齒動物。
人抗體和人源化抗體包含具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區(或具有與源自人種系免疫球蛋白序列的氨基酸序列相同的氨基酸序列)的抗體。人抗體可以包含例如CDR中的未由人種系免疫球蛋白序列(例如，通過體外隨機誘變或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)編碼的氨基酸殘基。
人源化抗體通常具有移植有非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗體具有從非人的來源引入到其的一個或多個氨基酸序列。這些非人氨基酸殘基通常被稱為「輸入(import)「殘基，所述輸入殘基通常取自」輸入「可變結構域。 通常，人抗體、人源化抗體或嵌合抗PD-1抗體的氨基酸序列變體將含有與原始抗體的輕鏈或重鏈中存在的序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性百分比的氨基酸序列。
關於原始序列的同一性或同源性通常是存在於候選序列內的與存在於人抗體、人源化抗體或嵌合抗PD-1抗體或片段內的序列相同的氨基酸殘基的在比對序列並在必要時引入空位以實現最大序列同一性百分比之後並且不考慮作為序列同一性的一部分的保守取代的百分比。
可以對抗PD-1抗體或抗原結合片段進行另外的修飾。例如，可以將一個或多個半胱氨酸殘基引入到Fc區，從而允許此區中的鏈間二硫鍵形成。由此產生的同源二聚體抗體在體外和/或體內可以具有任何增加的半衰期。還可以使用如在以下中描述的異源雙功能交聯劑製備在體外和/或體內具有增加的半衰期的同源二聚體抗體：Wolff等人(「單克隆抗體同源二聚體：裸鼠中的增強的抗腫瘤活性(Mo noclonal antibody homodimers: enhanced antitumor activity in nude mice)"《《癌症研究(Cancer research)》 53.11 (1993): 2560-2565)。可替代地，可以對具有雙Fc區的抗體進行工程化。
在一些實施例中，可以對抗PD-1抗體或其抗原結合片段進行共價修飾。這些共價修飾可以通過化學合成或酶促合成，或通過酶促切割或化學切割來進行。通過使抗體或片段的靶向氨基酸殘基與能夠與所選側鏈或N-末端殘基或C-末端殘基反應的有機衍生劑反應，將抗體或抗體片段的其它類型的共價修飾引入到分子中。
在一些實施例中，抗體變體被提供為具有缺少與Fc區(直接或間接)連接的岩藻糖的碳水化合物結構。例如，此類抗體組合物中的岩藻糖的量可以為1%到80%、1%到65%、5%到65%或20%到40%。岩藻糖的量是通過計算Asn297處的相對於如通過MALDI-TOF質譜法測量的與Asn 297連接的所有糖結構(例如，複雜、雜合和高甘露糖結構)的總和的糖鏈內的岩藻糖的平均量確定的，例如，如WO 2008/077546中所描述的。Asn297是指位於Fc區中約位置297處(Fc區殘基的EU編號；或Kabat編號中的位置314)的天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中的微小序列變化，Asn297還可以位於位置297的上游或下游約±3個氨基酸處，即，位置294與300之間。此類岩藻糖基化變體可以具有改進的ADCC功能。在一些實施例中，為了降低聚糖異質性，可以對抗體的Fc區進行進一步工程化，以用丙氨酸(N297A)替代位置297處的天冬醯胺。
在一些實施例中，為了通過避免Fab臂交換促進生產效率，對抗體的Fc區進行了進一步工程化，以用脯氨酸(S228P)替代IgG4的位置228(EU編號)處的絲氨酸。關於S228突變的詳細描述在以下中進行了描述，例如Silva等人「S228P突變防止如使用新型定量免疫測定和生理基質製備的組合所展示的體內和體外IgG4 Fab臂交換(The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation)"《生物化學雜誌(Journal of Biological Chemistry)》 290.9 (2015): 5462-5469，其通過引用以其整體併入。重組載體
本公開還提供了包含本文所公開的所分離多核苷酸(例如，編碼本文所公開的多肽的多核苷酸)的重組載體(例如，表達載體)、組合載體引入到其中(即，使得宿主細胞含有多核苷酸和/或包括多核苷酸的載體)的宿主細胞以及通過重組技術產生重組抗體多肽或其片段。
如本文所使用的，「載體」是在將載體引入到宿主細胞中時能夠將一種或多種所關注的多核苷酸遞送到宿主細胞的任何構建體。"表達載體「能夠在已引入表達載體的宿主細胞中遞送和表達一種或多種所關注的多核苷酸作為經過編碼的多肽。因此，在表達載體中，所關注的多核苷酸被定位成用於通過以下在載體中進行表達：在載體內或在所述宿主細胞的位於所關注的多核苷酸的整合位點處或附近或側翼的基因組中與如啟動子、增強子和/或聚-A尾等調節元件可操作地連接，使得將在引入有表達載體的宿主細胞中對所關注的多核苷酸進行翻譯。
可以通過本領域已知的方法將載體引入到宿主細胞中，例如電穿孔、化學轉染(例如，DEAE-葡聚糖)、轉化、轉染以及感染和/或轉導(例如，用重組病毒)。因此，載體的非限制性實例包含病毒載體(其可以用於產生重組病毒)、裸DNA或RNA、質粒、粘粒、噬菌體載體以及與陽離子縮合劑締合的DNA或RNA表達載體。
在一些實施方案中，本文所公開的多核苷酸(例如，編碼本文所公開的多肽的多核苷酸)是使用病毒表達系統(例如，牛痘或其它痘病毒、逆轉錄病毒或腺病毒)引入的，這可能涉及使用非病原性(缺陷型)、能夠進行複製的病毒，或者可以使用複製缺陷型病毒。在一些實施例中，使用慢病毒將核酸引入到細胞中。
為了進行表達，可以將包括本文所公開的抗體編碼多核苷酸或多肽編碼多核苷酸的DNA插入物與適當的啟動子(例如，異源啟動子)可操作地連接，所述啟動子如噬菌體λ PL啟動子、大腸桿菌(E. Coli)lac、trp和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉錄病毒LTR的啟動子，僅舉幾例。其它適合的啟動子是技術人員已知的。在一些實施例中，啟動子是巨細胞病毒(CMV)啟動子。表達構建體可以進一步含有轉錄起始、終止的位點，並且在轉錄區域中含有用於翻譯的核糖體結合位點。由構建體表達的成熟轉錄物的編碼部分可以包含起始於開始處的翻譯以及適當定位於待翻譯的多肽的末端處的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
如所指示的，表達載體可以包含至少一種可選擇標誌物。此類標誌物包含用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶抗性或新黴素抗性，以及用於在大腸桿菌和其它細菌中培養的四環素或氨苄青黴素抗性基因。適當的宿主的代表性實例包含但不限於細菌細胞，如大腸桿菌細胞、鏈黴菌細胞和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞；昆蟲細胞，如果蠅S2細胞和草地貪夜蛾(Spodoptera)Sf9細胞；動物細胞，如CHO、COS、人黑色素瘤(Bowes melanoma)和HK 293細胞；以及植物細胞。本文所描述的宿主細胞的適當培養基和條件是本領域已知的。
可以通過磷酸鈣轉染、經過DEAE-葡聚糖介導的轉染、經過陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其它方法實現將構建體引入到宿主細胞中。此類方法在許多標準實驗室手冊中進行描述了，如Davis等人，《分子生物學基礎方法(Basic Methods In Molecular Biology)》 (1986)，其通過引用以其整體併入本文。
可以通過將增強子序列插入到載體中提高由較高等真核生物進行的對編碼本公開的抗體的DNA的轉錄。增強子是DNA的，通常為約10到300 bp的起到增加給定宿主細胞類型中的啟動子的轉錄活性的作用的順式作用元件。增強子的實例包含位於鹼基對100到270處的複製起點的後側的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點的後側上的多瘤增強子和腺病毒增強子。
為了使經過翻譯的蛋白質分泌到內質網的腔、周質空間或細胞外環境中，可以將適當的分泌信號併入到所表達多肽中。所述信號對多肽可以是內源性的，或者其也可以是異源性信號。在一些實施例中，信號肽為SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79。
多肽(例如，抗體)可以以經過修飾的形式，如融合蛋白(例如，GST-融合物)或用組氨酸標籤表達，並且不僅可以包含分泌信號，而且還可以包含另外的異源性功能區。例如，可以將另外的氨基酸，特別是帶電荷的氨基酸的區添加到多肽的N-末端，以改進在純化期間或在隨後的處理和儲存期間在宿主細胞中的穩定性和持久性。同樣，可以將肽部分添加到多肽中以促進純化。可以在最終製備多肽之前將此類區去除。將肽部分添加到多肽以引起分泌或排泄、改進穩定性並促進純化(除其它外)是本領域的熟知和常規技術。
在一方面，本公開提供了與SEQ ID NO: 1、3、15、17、27、29、37、39、47、49、47、49、67或69至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的核酸。
本公開還提供了與如本文所描述的任何核苷酸序列至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的核酸序列，以及與如本文所描述的任何氨基酸序列至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、56%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的氨基酸序列。在一些實施例中，本公開涉及編碼本文所描述的任何肽的核苷酸序列，或由如本文所描述的任何核苷酸序列編碼的任何氨基酸序列。在一些實施例中，核酸序列少於10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、500個或600個核苷酸。在一些實施例中，氨基酸序列少於5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個或200個氨基酸殘基。
在一些實施例中，氨基酸序列(i)包括氨基酸序列；或(ii)由氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列是如本文所描述的序列中的任何序列。在一些實施例中，核酸序列(i)包括核酸序列；或(ii)由核酸序列組成，其中所述核酸序列是如本文所描述的序列中的任何序列。
為了確定兩個氨基酸序列、或兩個核酸序列的同一性百分比，將序列進行比對以用於最佳比較的目的(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列和第二氨基酸或核酸序列中的一個或兩個中引入空位以進行最佳比對，並且出於比較目的，可以忽略非同源序列)。然後將對應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸進行比較。當第一序列中的位置被與在第二序列中的對應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在所述位置處是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是由所述序列共用的相同位置的數量的考慮了空位的數量以及每個空位的長度的函數，需要引入所述函數以進行兩個序列的最佳比對。出於說明的目的，序列的比較以及兩個序列之間的同一性百分比的確定可以使用其中空位罰分為12、空位延伸罰分為4並且移碼空位罰分為5的Blossum 62評分矩陣來完成。治療方法
本公開的抗體、抗體組合物和方法具有許多體外和體內效用，所述效應涉及例如檢測PD-1或通過阻斷PD-1增強免疫應答。在優選實施例中，本公開的抗體是人抗體。例如，可以在體外或離體向培養中的細胞，或例如在體內向人類受試者施用這些分子，以增強各種情況下的免疫力。因此，在一方面，本公開內容提供了一種修飾受試者中的免疫應答的方法，所述方法包括向受試者施用本公開的抗體或其抗原結合部分，從而對受試者的免疫應答進行修飾。優選地，所述應答是增強的、經過刺激的或經過上調的。
如本文所使用的，術語"受試者"旨在包含人和非人動物。非人動物包含所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、犬、貓、奶牛、馬、雞、兩棲動物以及爬行動物，但是優選的是如非人靈長類動物、綿羊、犬、貓、奶牛和馬等哺乳動物。優選的受試者包含需要增加免疫應答的人類患者。所述方法特別適合用於治療患有可以通過增強經過T細胞介導的免疫應答治療的病症的人類患者。在特定實施例中，所述方法特別適合用於體內治療癌細胞。為了實現免疫的抗原特異性增強，可以將抗PD-I抗體與所關注的抗原一起施用。當PD-1的抗體與另一種試劑一起施用時，這兩者可以按順序或同時施用。
本公開進一步提供了用於檢測樣品中人PD-1抗原的存在或測量人PD-1抗原的量的方法，所述方法包括使樣品和對照樣品與人單克隆抗體或其抗原結合部分在允許抗體或其部分與人PD-1之間形成複合物的條件下接觸，所述單克隆抗體或其抗原結合部分與人PD-1特異性結合。然後檢測複合物的形成，其中樣品與對照樣品之間的差異複合物形成表明樣品中存在人PD-1抗原。
抗體對PD-1的阻斷可以增強對患者中的癌細胞的免疫應答。在一方面，本公開涉及在體內使用抗PD-I抗體治療受試者，使得癌性腫瘤的生長得以抑制。可以單獨使用抗PD-1抗體以抑制癌腫瘤的生長。可替代地，可以將抗PD-I抗體與其它免疫原性劑、標準癌症治療或其它抗體結合使用，如下所述。
因此，在一個實施例中，本公開提供了抑制受試者中的腫瘤細胞的生長的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的抗PD-1抗體或其抗原結合部分。優選地，抗體是人抗PD-1抗體(如本文所描述的人抗人PD-1抗體中的任何人抗人PD-1抗體)。另外地或可替代地，抗體可以是嵌合抗PD-1抗體或人源化抗PD-1抗體。
其生長可以使用本公開的抗體而得以抑制的優選癌症包含通常對免疫療法作出回應的癌症。用於治療的優選癌症的非限制性實例包含黑素瘤(例如，轉移性惡性黑素瘤)、腎癌(例如，透明細胞癌)、前列腺癌(例如，激素難治性前列腺腺癌)、乳腺癌、結腸癌和肺癌(例如，非-小細胞肺癌)。另外地，本公開包含其生長可以使用本公開的抗體而得以抑制的難治性或復發性惡性腫瘤。
可以使用本公開的方法治療的其它癌症的實例包含骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包含急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統腫瘤(CNS)、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管、脊髓軸腫瘤、腦乾膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發的癌症(包含由石棉誘發的癌症)以及所述癌症的組合。本公開還可用於治療轉移性癌症，尤其是表達PD-Ll的轉移性癌症(Iwai等人 (2005) 《國際免疫學》17:133-144)。
任選地，PD-1的抗體可以與免疫原性劑，如癌細胞、經過純化的腫瘤抗原(包含重組蛋白、肽和糖類分子)、細胞以及用編碼免疫刺激性細胞因數的基因轉染的細胞)組合(He等人 (2004) 《免疫學雜誌》173:4919-28))。可以使用的腫瘤疫苗的非限制性實例包含黑色素瘤抗原的肽，如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MARTI和/或酪氨酸酶的肽，或被轉染以表達細胞因數GM-CSF的腫瘤細胞(在下面進一步討論)。在人類中，一些腫瘤已經顯示出為免疫基因，如黑色素瘤。預計藉助於通過PD-1阻斷提高T細胞活化的閾值，可以期望活化宿主中的腫瘤應答。PD-1阻斷在與疫苗接種方案組合時可能是最有效的。已經設想了用於針對腫瘤進行疫苗接種的許多實驗策略(參見Rosenberg, S., 2000, 《癌症疫苗的開發(Development of Cancer Vaccines)》，ASCO教育冊(ASCO Educational Book) 春: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO教育冊 春: 300-302; Khayat, D.,2000, ASCO教育冊 春: 414-428; Poon, K.,2000, ASCO教育冊 春: 730-738；還參見Restifo, N.和Sznol, M., 《癌症疫苗(Cancer Vaccines)》，第61章，第3023-3043頁,De Vita, V.等人 (編輯)，1997,《癌症：腫瘤學原理和實踐(Cancer: Principles and Practice of Oncology)》第五版)。在這些策略中的一種策略中，使用自體腫瘤細胞或同種異體腫瘤細胞製備疫苗。這些細胞疫苗已經顯示出在對腫瘤細胞進行轉導以表達GM-CSF時是最有效的。已經顯示出GM-CSF是用於腫瘤疫苗接種的抗原呈遞的有效活化劑(Dranoff等人 (1993) 《美國國家科學院院刊》 90: 3539-43)。
PD-1阻斷還可以與標準癌症治療組合。PD-1阻斷可以與化學治療方案有效地組合。在這些情況下，可能減少所施用的化學治療劑的劑量(Mokyr, M.等人 (1998) 《癌症研究》 58: 5301-5304)。此組合的實例是抗PD-1抗體與達卡巴嗪組合，用於治療黑色素瘤。此組合的另一個實例是抗PD-1抗體與白介素2(IL-2)組合，用於治療黑色素瘤。PD-1阻斷與化療藥物的組合使用背後的科學原理是，細胞死亡作為大多數化學療法化合物的細胞毒性作用的結果應當引起腫瘤抗原的水準在抗原呈遞通路中提高。可能通過細胞死亡而引起與PD-1阻斷的協同作用的其它組合療法是放射、手術和激素剝奪。這些方案中的每個方案都在宿主中產生腫瘤抗原的來源。血管生成抑製劑也可以與PD-1阻斷組合。對血管生成的抑制引起腫瘤細胞死亡，所述腫瘤細胞死亡可以將腫瘤抗原饋送到宿主抗原呈遞通路中。
PD-1阻斷抗體也可以與將Fc α或Fc γ受體表達效應子細胞靶向到腫瘤細胞的雙特異性抗體組合使用(參見例如，美國專利第5,922,845號和第5,837,243號)。雙特異性抗體可以用於靶向兩種單獨的抗原。例如，已經使用了抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如，Her-2/neu)雙特異性抗體將巨噬細胞靶向到腫瘤的位點。這種靶向可以更加有效地活化腫瘤特異性應答。這些應答的T細胞臂將通過使用PD-1阻斷而得以增強。可替代地，可以通過使用與腫瘤抗原和樹突細胞特異性細胞表面標誌物結合的雙特異性抗體而將抗原直接遞送到DC。
腫瘤通過各種各樣的機制逃避宿主免疫監視。通過使由所述腫瘤所表達的、並且是免疫抑制性的蛋白質失活，可以克服許多這些機制。這些機制其中包含TGF-β(Kehrl, J.等人 (1986) 《實驗醫學雜誌》 163: 1037-1050)、IL-10(Howard, M.和O'Garra, A.(1992) 《今日免疫學》 13: 198-200)和Fas配體(Hahne, M.等人 (1996) 《科學》 274: 1363-1365)。這些實體中的每個實體的抗體可以與本公開的抗PD-1抗體組合使用，以抵消免疫抑製劑的影響並有利於由宿主作出的腫瘤免疫應答。
可以用於活化宿主免疫應答性的其它抗體可以與抗PD-1組合使用。這些抗體包含樹突細胞的表面上的活化DC功能和抗原呈遞的分子。抗CD40抗體能夠有效取替T細胞輔助活性(Ridge, J.等人 (1998) 《自然》 393:474-478),並且可以與PD-1抗體結合使用(Ito, N.等人 (2000) 《免疫生物學(Immunobiology)》 201 (5) 527-40)。活化如CTLA-4等T細胞共刺激分子(例如，美國專利第5,811,097號)、OX-40(Weinberg, A.等人 (2000) 《免疫學(Immunol)》 l64: 2160-2169)、4-lBB(Melero, I.等人 (1997) 《自然-醫學》 3: 682-685 (1997))和ICOS(Hutloff, A.等人 (1999) 《自然》 397: 262-266))還可能提高T細胞活化的水準。
骨髓移植當前正在被用於治療造血來源引起的各種腫瘤。儘管移植物抗宿主疾病是此治療的一種結果，但是可以從移植物抗腫瘤應答中得到治療益處。PD-1阻斷可以用來提高移植有供體的腫瘤特異性T細胞的有效性。還存在幾種實驗性治療方案，所述實驗性治療方案涉及對抗原特異性T細胞進行離體活化和擴增以及將這些細胞過繼轉移到接收者中，以作為針對腫瘤的抗原特異性T細胞(Greenberg, R.和Riddell, S.(1999) 《科學》 285: 546-51)。還可以使用這些方法活化對感染源(如CMV)的T細胞應答。可以預期在抗PD-1抗體存在的情況下下進行的離體活化會提高經過繼轉移的T細胞的頻率和活性。
在一方面，本公開提供了用於治療受試者中的癌症的方法、降低隨著時間的推移受試者中的腫瘤的體積增加的速率的方法、降低發生轉移的風險的方法或降低受試者中發生另外的轉移的風險的方法。在一些實施例中，治療可以停止、減緩、延遲或抑制癌症的進展。在一些實施例中，治療可以使受試者中的一種或多種癌症癥狀的數量、嚴重性和/或持續時間減少。
在一些實施例中，抗體的腫瘤生長抑制百分比(TGI%)大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。在一些實施例中，抗體的腫瘤生長抑制百分比小於60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。TGI%可以在治療開始後例如3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、2 22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天確定，或在治療開始後1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月確定。如本文所使用的，使用以下公式計算腫瘤生長抑制百分比(TGI%)： TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100 Ti是第i天時治療組中的平均腫瘤體積。T0是第零天時治療組中的平均腫瘤體積。Vi是第i天時對照組中的平均腫瘤體積。V0是第零天時對照組中的平均腫瘤體積。
在一些實施例中，如本文所描述的抗體或其抗原結合片段的腫瘤抑製作用與派姆單抗(Pembrolizumab)、納武單抗(Nivolumab)或西米普利單抗(Cemiplimab)相當。在一些實施例中，如本文所描述的抗體或其抗原結合片段的腫瘤抑製作用比派姆單抗、納武單抗或西米普利單抗多至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍或5倍。
在一方面，本公開的特徵在於方法，所述方法包含向有需要的受試者(例如，患有癌症或者被標識為或被診斷為患有癌症的受試者)施用本文所公開的治療有效量的抗體或其抗原結合片段，所述癌症例如，乳腺癌(例如，三陰性乳腺癌)、良性腫瘤癌、宮頸癌、子宮內膜癌、膠質瘤、頭頸癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、結腸直腸癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系統惡性腫瘤。在一些實施例中，癌症是不可切除的黑色素瘤或轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或轉移性激素難治性前列腺癌。在一些實施例中，所述受試者患有實體瘤。在一些實施例中，所述癌症是頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、腎細胞癌(RCC)、三陰性乳腺癌(TNBC)或結直腸癌。在一些實施例中，所述受試者患有霍奇金淋巴瘤。在一些實施例中，所述受試者患有三陰性乳腺癌(TNBC)、胃癌、尿路上皮癌、梅克爾細胞癌或頭頸癌。在一些實施例中，所述癌症是黑色素瘤、胰腺癌、間皮瘤、血液系統惡性腫瘤，尤其是非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病或晚期實體瘤。
在一些實施例中，本文所公開的組合物和方法可以用於治療有患癌症的風險的患者。患有癌症的患者可以用本領域已知的各種方法來標識。
在一方面，本公開提供了用於治療、預防或減少患有與異常免疫應答或不想要的免疫應答相關聯的病症，例如，自身免疫性病症的風險的方法。
如本文所使用的，「有效量」意指足以產生有益或所期望結果的量或劑量，所述有益或所期望結果包含停止、減慢、延緩或抑制疾病，例如，癌症的進展。有效量將根據例如要施用抗體、抗原結合片段、抗體編碼多核苷酸、包括多核苷酸的載體和/或其組合物的受試者的年齡和體重、癥狀的嚴重程度和施用的途徑而變化，並且因此施用可以根據個人情況而確定。
在一些實施例中，可以向受試者施用一種或多種另外的治療劑。在一些實施例中，另外的治療劑可以包括選自由以下組成的組的一種或多種治療劑：曲貝替定(Trabectedin)、納布紫杉醇(nab-paclitaxel)、特伯納尼(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕博西尼(Palbociclib)、依維莫司(everolimus)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)、IFL、瑞格拉非尼(regorafenib)、溶血素(Reolysin)、愛寧達(Alimta)、立克癌(Zykadia)、索坦(瑞格拉非尼(regorafenib)、溶血素(Reolysin)、愛寧達(Alimta)、立克癌(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、索坦(Zykadia)、Sutent)、替西羅莫司(temsirolimus)、阿昔替尼(axitinib)、依維莫司、索拉非尼(sorafenib)、帕唑帕尼(Votrient)、帕唑帕尼(Pazopanib)、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、長春氟寧(Vinflunine)、Hsp90抑製劑、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、長春花鹼、沙利度胺(Thalomid)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺、來那度胺(lenalidomide)、阿扎胞苷(azacytidine)、來那度胺、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)和恩扎滔林(enzastaurin)。
在一些實施例中，另外的治療劑可以包括選自由以下組成的組的一種或多種抗癌藥物(例如，化療藥物)：玻瑪西尼(Abemaciclib)、醋酸阿比特龍(Abiraterone Acetate)、白蛋白結合型紫杉醇(Abraxane)、阿卡替尼(Acalabrutinib)、雅美羅(Actemra)(托珠單抗(Tocilizumab))、雅詩力(Adcetris)(本妥昔單抗(Brentuximab Vedotin))、阿多曲妥珠單抗美坦新(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿黴素(Adriamycin)(鹽酸多柔比星(Doxorubicin Hydrochloride))、馬來酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、飛尼妥(Afinitor)(依維莫司)、奧康澤(Akynzeo)(奈妥吡坦(Netupitant)和鹽酸帕洛諾司瓊(Palonosetron Hydrochloride))、艾達樂(Aldara)(咪喹莫特(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、艾樂替尼(Alecensa)(艾樂替尼(Alectinib))、艾樂替尼(Alectinib)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、愛寧達(培美曲塞二鈉(Pemetrexed Disodium))、安列庫帕(Aliqopa)(鹽酸庫潘尼西(Copanlisib Hydrochloride))、愛克蘭(Alkeran)、阿樂喜(Aloxi)(鹽酸帕洛諾司瓊(Palonosetron Hydrochloride))、布吉他濱(Alunbrig)(布吉替尼(Brigatinib))、Ameluz(氨基乙醯丙酸鹽酸鹽(Aminolevulinic Acid Hydrochloride))、阿米福汀(Amifostine)、氨基乙醯丙酸鹽酸鹽(Aminolevulinic Acid Hydrochloride)、阿那曲唑(Anastrozole)、布地奈德( Buc)Apalutamide)、阿瑞匹坦( A)Aprepitant)、安然愛斯普(Aranesp)(阿法達貝泊汀(Darbepoetin Alfa))、阿可達(Aredia)(帕米膦酸二鈉(Pamidronate Disodium))、瑞寧得(Arimidex)(阿那曲唑(A)Anastrozole))、阿諾新(Aromasin)(依西美坦(Exemestane))、阿侖恩(Arranon)(奈拉濱(A)Nelarabine))、三氧化二砷(Arsenic Trioxide)、Arzerra(奧法木單抗(Ofatumumab))、菊歐文氏菌天冬醯胺酶(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、Asparlas(聚乙二醇化天冬醯胺酶(Calaspargase Pegol-mknl))、阿特朱單抗(Atezolizumab)、阿瓦斯丁(A)Avastin)(貝伐珠單抗(Bevacizumab))、阿維單抗(Avelumab)、軸突阿黴素(Axicabtagene Ciloleucel)、阿昔替尼(Axitinib)、阿扎胞苷(Azacitidine)、Azedra(碘胍胍I 131（Iobenguane I 131))、Bavencio(阿維單抗)、貝利司他(Beleodaq)(貝利司他(Belinostat))、貝利司他、鹽酸苯達莫司汀(Bendamustine Hydrochloride)、Bendeka(鹽酸苯達莫司汀(Bendamustine Hydrochloride))、Besponsa(奧英妥珠單抗(Inotuzumab Ozogamicin))、貝伐珠單抗、貝沙羅汀(Bexarotene)、比卡魯胺(Bicalutamide)、BiCNU(卡莫司汀(卡莫司汀)Carmustine))、比美替尼(Binimetinib)、硫酸博萊黴素(Bleomycin Sulfate)、博納吐單抗(Blinatumomab)、百利妥(Blincyto)(博納吐單抗(Blinatumomab))、硼替佐米(Bortezomib)、Bosulif(博舒替尼(Bosutinib))、博舒替尼、Braftovi(康奈非尼(Encorafenib))、本妥昔單抗、布加替尼(Brigatinib)、BuMel、白消安(Busulfan)、白舒非(Busulfex)(白消安)、卡巴他賽(Cabazitaxel)、卡比列維(Cablivi)(卡貝伐單抗-yhdp（Caplacizumab-yhdp))、卡博替尼(Cabometyx)(蘋果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate))、蘋果酸卡博替尼、聚乙二醇化天冬醯胺酶(Calaspargase Pegol-mknl)、Calquence(阿卡替尼(Acalabrutinib))、坎帕斯(Campath)(阿侖單抗(Alemtuzumab))、伊立替康(Camptosar)(鹽酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride))、卡培他濱(Capecitabine)、卡貝伐單抗-yhdp、查拉克(Carac)(氟脲嘧啶(Fluorouracil）-外用)、卡鉑(Carboplatin)、卡鉑-紫杉醇(CARBOPLATIN-TAXOL)、卡非佐米(Carfilzomib)、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀植入(卡莫司汀植入)Carmustine Implant)、康士得(Casodex)(比卡魯胺(T)Bicalutamide))、西米普利單抗(Cemiplimab）-rwlc、色瑞替尼(Ceritinib)、柔紅黴素(Cerubidine)(鹽酸柔紅黴素(Daunorubicin Hydrochloride))、希瑞適(Cervarix)(重組HPV二價疫苗)、西妥昔單抗(Cetuximab)、瘤可寧(Chlorambucil)、瘤可寧-潑尼松(CHLORAMBUCIL-PREDNISONE)、順鉑(Cisplatin)、克拉屈濱(C)Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、Clolar(氯法拉濱(Clofarabine))、考比替尼(Cobimetinib)、卡博替尼(Cometriq)(蘋果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate))、鹽酸庫潘尼西、Copiktra(杜韋利西布(G)Duvelisib))、可美淨(Cosmegen)(更生黴素(Dactinomycin))、可泰利(Cotellic)(考比替尼(Cobimetinib))、克唑替尼(Crizotinib)、環磷醯胺、欣銳澤(Cyramza)(雷莫蘆單抗(F)Ramucirumab))、阿糖孢苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂質體(Cytarabine Liposome)、賽德薩-U（Cytosar-U)(阿糖孢苷(Cytarabine))、達拉菲尼(Dabrafenib)、達卡巴嗪、達克金(Dacogen)(地西他濱(Decitabine))、達克替尼(Dacomitinib)、更生黴素(Dactinomycin)、達雷木單抗(Daratumumab)、阿法達貝泊汀、達拉他濱(Darzalex)(達雷木單抗(Da)Daratumumab))、達沙替尼(Dasatinib)、鹽酸柔紅黴素(Daunorubicin Hydrochloride)、鹽酸柔紅黴素和阿糖胞苷脂質體、Daurismo(馬來酸格拉吉布(G)Glasdegib Maleate))、地西他濱(Decitabine)、去纖苷鈉(Defibrotide Sodium)、去纖維鈉(Defitelio)(去纖苷鈉)、地加瑞克(Degarelix)、地尼白介素(Denileukin Diftitox)、狄諾塞麥(Denosumab)、阿糖胞苷(DepoCyt)(阿糖胞苷脂質體)、地塞米松(Dexamethasone)、鹽酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride)、達妥昔單抗(Dinutuximab)、多西他賽(Docetaxel)、多喜(Doxil)(鹽酸多柔比星脂質體(Doxorubicin Hydrochloride Liposome))、鹽酸多柔吡星(Doxorubicin Hydrochloride)、鹽酸多柔比星脂質體、Dox-SL(鹽酸多柔比星脂質體)、度伐利尤單抗(Durvalumab)、杜韋利西布、宜膚滌(Efudex)(氟脲嘧啶-外用)、癌立佳(Eligard)(醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、癌立克(Elitek)(拉布立酶(Rasburicase))、Ellence(鹽酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、艾洛珠單抗(Elotuzumab)、樂沙定(Eloxatin)(奧沙利鉑(Oxaliplatin))、伊屈潑帕乙醇胺(Eltrombopag Olamine)、Elzonris(塔格索夫-erzs（Tagraxofusp-erzs))、Emapalumab-lzsg、止敏吐(Emend)(阿瑞匹坦(A)Aprepitant))、Empliciti(艾洛珠單抗)、甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、康奈非尼(Encorafenib)、恩雜魯胺(Enzalutamide)、鹽酸表柔比星、阿法依泊汀(Epoetin Alfa)、怡潑津(Epogen)(阿法依泊汀)、愛必妥(Erbitux)(西妥昔單抗)、甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate)、愛維德(Erivedge)(維莫德吉(Vismodegib))、安森珂(Erleada)(阿帕他胺(Apalutamide))、鹽酸埃羅替尼(Erlotinib Hydrochloride)、Erwinaze(菊歐文氏菌天冬醯胺酶)、Ethyol(阿米福汀)、凡畢復(Etopophos)(磷酸依託泊甙(Etoposide Phosphate))、依託泊苷、磷酸依託泊甙、Evacet(鹽酸多柔比星脂質體)、依維莫司、易維特(Evista)(鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、優維寧(Evomela)(鹽酸美法侖(Melphalan Hydrochloride))、依西美坦(Exemestane)、5-FU(氟脲嘧啶(Fluorouracil))、法樂通(Fareston)(托瑞米芬(Toremifene))、Farydak(帕比司他( Pat)Panobinostat))、法洛德(Faslodex)(氟維司群(Fulvestrant))、弗隆(Femara)(來曲唑(Letrozole))、非格司亭(Filgrastim)、輔美康(Firmagon)(地加瑞克(Degarelix))、磷酸氟達拉濱(Fludarabine Phosphate)、氟脲嘧啶(氟脲嘧啶-外用)、氟脲嘧啶注射液、氟脲嘧啶-外用、氟他米特(Flutamide)、服瘤停(Folotyn)(普拉曲沙)、福他替尼二鈉鹽(Fostamatinib Disodifum)、氟維司群、Fusilev(亞葉酸鈣(Leucovorin Calcium))、加米芬(Gamifant)(依帕伐單抗-lzsg（Emapalumab-lzsg))、加德西(Gardasil)(重組HPV四價疫苗)、加德西9(重組HPV無價疫苗)、癌即瓦(Gazyva)(奧濱尤妥珠單抗(T)Obinutuzumab))、吉非替尼(Gefitinib)、鹽酸吉西他濱(Gemcitabine Hydrochloride)、吉西他濱(GEMCITABINE）-順鉑、吉西他濱-奧沙利鉑、吉妥珠單抗奧佐米星(Gemtuzumab Ozogamicin)、健擇(Gemzar)(鹽酸吉西他濱(Gemcitabine Hydrochloride))、吉泰瑞(Gilotrif)(馬來酸阿法替尼)、富馬酸吉列替尼（Gilteritinib Fumarate)、馬來酸格拉吉布、格列衛(Gleevec)(甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate))、格立得植入劑(Gliadel Wafer)(卡莫司汀植入膜劑(Carmustine Implant))、羧肽酶(Glucarpidase)、醋酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、格拉司瓊(Granisetron)、鹽酸格拉司瓊(Granisetron Hydrochloride)、Granix(非格司亭(Filgrastim))、賀樂維(Halaven)(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(鹽酸普萘洛爾(P)Propranolol Hydrochloride))、赫賽汀皮下注射劑(Herceptin Hylecta)(曲妥珠單抗(Trastuzumab)和透明質酸酶-oysk（Hyaluronidase-oysk))、赫塞汀(曲妥珠單抗)、HPV二價疫苗、重組HPV無價疫苗、重組HPV四價疫苗、重組和美新(Hycamtin)(鹽酸托泊替康(Topotecan Hydrochloride))、愛治(Hydrea)(羥基脲(Hydroxyurea))、羥基脲、地塞米松(Hyper-CVAD)、愛博新(Ibrance)(帕博西尼(Pai)Palbociclib))、替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)、依魯替尼(Ibrutinib)、英可欣(Iclusig)(鹽酸帕納替尼(Ponatinib Hydrochloride))、鹽酸伊達比星(Idarubicin Hydrochloride)、艾代拉裡斯(Idelalisib)、Idhifa(甲磺酸恩西地)、Ifex(異環磷醯胺(Ifosfamide))、異環磷醯胺、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)、億珂(5)Imbruvica)(依魯替尼(Ibrutinib))、英飛凡(Imfinzi)(度伐利尤單抗)、咪喹莫特(Imiquimod)、Imlygic（Talimogene Laherparepvec)、英立達(Inlyta)(阿昔替尼)、奧英妥珠單抗、干擾素(Interferon）α-2b、重組白介素-2(阿地白介素)、干擾素A(重組干擾素α-2b)、碘苄胍I 131、伊匹木單抗(Ipilimumab)、易瑞沙(Iressa)(吉非替尼(Gefitinib))、鹽酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride)、鹽酸伊立替康脂質體(Irinotecan Hydrochloride Liposome)、Istodax(羅米地辛(K)Romidepsin))、艾伏尼布(Ivosidenib)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、枸櫞酸艾沙佐米(Ixazomib Citrate)、易莎平(Ixempra)(伊沙匹隆(S)Ixabepilone))、捷恪衛(Jakafi)(磷酸魯索替尼(Ruxolitinib Phosphate))、去癌達(Jevtana)(卡巴他塞(卡巴)塞(Cabazitaxel))、賀癌寧(Kadcyla)(阿多曲妥珠單抗美坦新)、凱望斯(Kepivance)(帕利夫明(帕利夫)Palifermin))、可瑞達(Keytruda)(派姆單抗（Pembrolizumab))、擊癌利(Kisqali)(瑞博西尼(Ribociclib))、Kymriah（Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸蘭瑞肽(Lanreotide Acetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、硫酸拉羅替尼(Larotrectinib Sulfate)、樂除瘤(Lartruvo)(奧拉單抗(Olaratumab))、來那度胺、甲磺酸樂伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、樂衛瑪(Lenvima)(甲磺酸樂伐替尼)、來曲唑(Letrozole)、亞葉酸鈣、瘤可寧(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、Levulan Kerastik(氨基乙醯丙酸鹽酸鹽(Aminolevulinic Acid Hydrochloride))、Libtayo(西米普利單抗-rwlc)、LipoDox(鹽酸多柔比星脂質體)、洛莫司丁(Lomustine)、朗斯弗(Lonsurf)(三氟尿苷(Trifluridine)和地匹福林鹽酸鹽(Tipiracil Hydrochloride))、Lorbrena(蘿拉替尼(Lorlatinib))、蘿拉替尼、Lumoxiti(帕西妥莫單抗(Pat)Moxetumomab Pasudotox）-tdfk)、利普安(Lupron)(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(醋酸亮丙瑞林)、Lutathera(鎦(Lutetium）Lu 177-Dotatate)、鎦(Lu 177-Dotatate)、令癌莎(Lynparza)(奧拉帕尼(Olaparib))、Marqibo(硫酸長春新鹼脂質體(Vincristine Sulfate Liposome))、甲基苄肼(Matulane)(鹽酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride))、鹽酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、麥欣霓(Mekinist)(曲美替尼(Trametinib))、Mektovi(比美替尼(Binimetinib))、美法侖(Melphalan)、鹽酸美法侖(Melphalan Hydrochloride)、巰嘌呤(Mercaptopurine)、美司鈉(Mesna)、美司鈉(Mesnex)(美司鈉)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、溴化甲基納曲酮(Methylnaltrexone Bromide)、米哚妥林(Midostaurin)、絲裂黴素C（Mitomycin C)、鹽酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、莫格利珠單抗(Mogamulizumab）-kpkc、帕西妥莫單抗-tdfk、釋倍靈(Mozobil)(普樂沙福(P)Plerixafor))、Mustargen(鹽酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride))、馬勒蘭(Myleran)(白消安(Busulfan))、麥羅塔(Mylotarg)(吉妥珠單抗)、納米粒紫杉醇(Nanoparticle Paclitaxel)(紫杉醇白蛋白穩定的納米顆粒調配物)、諾維本(Navelbine)(酒石酸長春瑞濱（Vinorelbine Tartrate))、耐昔妥珠單抗(Necitumumab)、奈拉濱(A)Nelarabine)、馬來酸來那替尼(Neratinib Maleate)、來那替尼(Nerlynx)(馬來酸來那替尼)、奈妥吡坦(Netupitant)和鹽酸帕洛諾司瓊(Palonosetron Hydrochloride)、倍血添(Neulasta)(培非格司亭(Pegfilgrastim))、優保津(Neupogen)(非格司亭(Filgrastim))、蕾莎瓦(Nexavar)(甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib Tosylate))、Nilandron(尼魯米特(尼魯米特)Nilutamide))、尼羅替尼(Nilotinib)、尼魯米特、伊沙佐米(Ninlaro)(枸櫞酸艾沙佐米(Ixazomib Citrate))、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物(Niraparib Tosylate Monohydrate)、納武單抗、恩沛板(Nplate)(羅米司亭(Romiplostim))、奧濱尤妥珠單抗(Obinutuzumab)、Odomzo(索尼德吉(Y)Sonidegib))、奧法木單抗(Ofatumumab)、奧拉帕尼(Olaparib)、奧拉單抗、高三尖杉酯鹼(Omacetaxine Mepesuccinate)、昂卡司帕(Oncaspar)(培門冬酶(Pegaspargase))、鹽酸昂丹司瓊(Ondansetron Hydrochloride)、安能得(Onivyde)(鹽酸伊立替康脂質體)、昂塔克(Ontak)(地尼白介素(Denileukin Diftitox))、歐狄沃(Opdivo)(納武單抗)、奧斯替尼(Osimertinib)、奧沙利鉑、紫杉醇(Paclitaxel)、紫杉醇白蛋白穩定的納米顆粒調配物、帕博西尼(Palbociclib)、帕利夫明(Palifermin)、鹽酸帕洛諾司瓊(Palonosetron Hydrochloride)、鹽酸帕洛諾司瓊和奈妥吡坦、帕米膦酸二鈉(Pamidronate Disodium)、帕尼單抗(Panitumumab)、帕比司他(Panobinostat)、鹽酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride)、培門冬酶(Pegaspargase)、培非格司亭(Pegfilgrastim)、聚乙二醇干擾素α-2b（Peginterferon Alfa-2b)、PEG-干擾素(聚乙二醇干擾素α-2b)、派姆單抗、培美曲塞二鈉(Pemetrexed Disodium)、帕捷特(Pai)Perjeta)(帕妥珠單抗(Pertuzumab))、帕妥珠單抗、普樂沙福(Plerixafor)、泊馬度胺(Pomalidomide)、鉑美特(Pomalyst)(泊馬度胺)、鹽酸帕納替尼、搏癌莎(Portrazza)(耐昔妥珠單抗)、搏癌立(Poteligeo)(莫格利珠單抗-kpkc（Mogamulizumab-kpkc))、普拉曲沙、潑尼松、鹽酸丙卡巴肼、普羅克瑞(Procrit)(阿法依泊汀)、普留凈(Proleukin)(阿地白介素)、普羅利亞(Prolia)(狄諾塞麥)、艾曲波帕(S)Promacta)(艾曲波帕乙醇胺(Eltrombopag Olamine))、鹽酸普萘洛爾、普列威(Provenge)(西普魯塞(西普魯塞)Sipuleucel）-T)、巰基嘌呤(Purinethol)(巰嘌呤)、巰嘌呤(Purixan)(巰嘌呤)、二氯化鐳223（Radium 223 Dichloride)、鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、拉布立酶(Rasburicase)、拉夫珠單抗-cwvz（Ravulizumab-cwvz)、重組人乳頭瘤病毒(HPV)二價疫苗、重組人乳頭瘤病毒(HPV)無價疫苗、重組人乳頭瘤病毒(HPV)四價疫苗、重組干擾素α-2b、瑞戈非尼(Regorafenib)、樂立適(Relistor)(溴化甲基納曲酮(Methylnaltrexone Bromide))、樂泰克(Retacrit)(阿法依泊汀)、雷利米得(Revlimid)(來那度胺)、甲氨蝶呤(Rheumatrex)(甲氨蝶呤(Methotrexate))、瑞博西尼(Ribociclib)、瑞圖宣(Rituxan)(利妥昔單抗(Rituximab))、利妥昔單抗透明質酸酶(Rituxan Hycela)(利妥昔單抗和人類透明質酸酶(Rituximab and Hyaluronidase Human))、利妥昔單抗、利妥昔單抗和人類透明質酸酶、鹽酸羅拉吡坦(Rolapitant Hydrochloride)、羅米地辛、羅米司亭(Romiplostim)、紅比黴素(Rubidomycin)(鹽酸柔紅黴素)、蘆卡帕尼(Rubraca)(瑞卡帕布樟腦磺酸鹽(Rucaparib Camsylate))、瑞卡帕布樟腦磺酸鹽、磷酸魯索替尼、里達普(Rydapt)(米哚妥林)、貼固守(Sancuso)(格拉司瓊(C)Granisetron))、無菌滑石粉氣霧劑(Sclerosol Intrapleural Aerosol)(滑石(Talc))、司妥昔單抗(Siltuximab)、西普魯塞-T、索馬杜林(Somatuline Depot)(醋酸蘭瑞肽(Lanreotide Acetate))、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、施達賽(Sprycel)(達沙替尼)、無菌滑石粉(立體的立體)(滑石)、立體(滑石)、癌瑞格(Stivarga)(瑞戈非尼)、蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib Malate)、舒適通(Sustol)(格拉司瓊)、索坦(蘋果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干擾素α-2b)、斯爾萬(S)Sylvant)(司妥昔單抗)、Synribo(高三尖杉酯鹼(Omacetaxine Mepesuccinate))、泰博洛依(Tabloid)(硫鳥嘌呤(Thioguanine))、達拉菲尼(Tafinlar)(達拉菲尼(Dabrafenib))、塔格索夫-erzs（Tagraxofusp-erzs)、泰瑞沙(A)Tagrisso)(奧斯替尼)、甲苯磺酸他拉唑帕利(T)Talazoparib Tosylate)、Talimogene Laherparepvec、他唑帕尼(Talzenna)(甲苯磺酸他拉唑帕利)、枸櫞酸它莫西芬(Tamoxifen Citrate)、塔拉賓PFS（Tarabine PFS)(阿糖孢苷)、特羅凱(Tarceva)(鹽酸埃羅替尼)、塔革雷汀(Targretin)(貝沙羅汀)、達希納(Tasigna)(尼羅替尼)、Tavalisse(他替尼二鈉鹽)、泰素(Taxol)(紫杉醇)、泰素帝(Taxotere)(多西他賽(Docetaxel))、癌自禦(Tecentriq)(阿特朱單抗)、帝盟多(Temodar)(替莫唑胺(Temozolomide))、替莫唑胺、替西羅莫司、沙利度胺(Thalidomide)、沙利度胺(Thalidomide)(沙利度胺)、硫鳥嘌呤、噻替哌(Thiotepa)、替布索沃(Tibsovo)(艾伏尼布)、Tisagenlecleucel、托珠單抗、Tolak(氟脲嘧啶-外用)、鹽酸托泊替康、托瑞米芬(Toremifene)、馱瑞塞爾(Torisel)(替西羅莫司)、Totect(鹽酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride))、曲貝替定、曲美替尼、曲妥珠單抗、曲妥珠單抗和透明質酸酶-oysk（Hyaluronidase-oysk)、Treanda(鹽酸苯達莫司汀)、Trexall(甲氨蝶呤(Methotrexate))、三氟尿苷和地匹福林鹽酸鹽、Trisenox(三氧化二砷)、泰克博(Tykerb)(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Ultomiris(依庫珠單抗-cwvz（Ravulizumab-cwvz))、優尼圖希(Unituxin)(達妥昔單抗)、尿苷三乙酸酯(Uridine Triacetate)、戊柔比星(Valrubicin)、Valstar(戊柔比星)、凡德他尼(Vandetanib)、加值稅、Varubi(鹽酸羅拉吡坦)、維克替比(Vectibix)(帕尼單抗(Pai)Panitumumab))、VeIP、萬珂(Velcade)(硼替佐米)、維莫非尼(Vemurafenib)、維奈托克(Venclexta)(維奈托克(Venetoclax))、維奈托克(Venetoclax)、捷癌寧(Verzenio)(玻瑪西尼(Abemaciclib))、維達扎(Vidaza)(阿扎胞苷)、硫酸長春鹼(Vinblastine Sulfate)、硫酸長春新鹼、硫酸長春新鹼脂質體、酒石酸長春瑞濱、維莫德吉(Vismodegib)、Vistogard(尿苷三乙酸酯(Uridine Triacetate))、維泰凱(Vitrakvi)(硫酸拉羅替尼)、Vizimpro(達克替尼)、維拉莎(Voraxaze)(谷卡匹酶(Glucarpidase))、伏立諾他(Vorinostat)、帕唑帕尼(鹽酸帕唑帕尼)、Vyxeos(鹽酸柔紅黴素和阿糖胞苷脂質體)、截剋瘤(Xalkori)(克唑替尼)、希羅達(Xeloda)(卡培他濱)、癌骨瓦(Xgeva)(狄諾塞麥)、鐳治骨(Xofigo)(二氯化鐳223)、Xospata(富馬酸吉特替尼(Gilteritinib Fumarate))、安可坦(Xtandi)(恩雜魯胺)、益伏(Yervoy)(伊匹木單抗)、Yescarta(軸突阿黴素)、Yondelis(曲貝替定)、柔癌捕(Zaltrap)(阿柏西普(Ziv-Aflibercept))、Zarxio(非格司亭)、則樂(Zejula)(甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物)、澤波拉夫(Zelboraf)(維莫非尼)、澤娃靈(Zevalin)(替伊莫單抗)、辛卡德(Zinecard)(鹽酸右雷佐生)、阿柏西普、Zofran(鹽酸昂丹司瓊(Ondansetron Hydrochloride))、諾雷德(Zoladex)(醋酸戈舍瑞林)、唑來膦酸(Zoledronic Acid)、Zolinza(伏立諾他)、擇泰(Zometa)(唑來膦酸)、思得適錠(Zydelig)(艾代拉裡斯(Idelalisib))、立克癌(色瑞替尼)或澤珂(Zytiga)(醋酸阿比特龍)。這些抗癌藥物中的許多抗癌藥物，包含其劑量資訊，在美國國家癌症研究所的網站上進行了描述，其通過引用以其整體併入。
在一些實施例中，化學治療劑是5-氟脲嘧啶、博來黴素、卡培他濱、順鉑、環磷醯胺、達卡巴嗪、阿黴素、依託泊苷、亞葉酸(folinic acid)、甲氨蝶呤、奧沙利鉑、潑尼松龍、普卡巴嗪(procarbazine)、長春花鹼、長春瑞濱、多西他賽、表柔比星或氮芥(mustine)。
在一些實施例中，如本文所描述的方法可以使抗癌藥物(例如，化療藥物)的功效提高至少50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍或5倍(例如，如與以相同劑量向受試者施用僅抗癌藥物時的功效相比)。因為已經改善了抗癌藥物的功效，所以在一些實施例中，抗癌藥物(例如，化學治療劑)的治療有效劑量比抗癌藥物的典型劑量(例如，FDA批准的劑量)低約或低至少10%、20%、30%、40%或50%，從而使副作用最小化。另外，因為已經改善了抗癌藥物的功效，所以在一些實施例中，可以以較低頻率向受試者施用治療有效劑量的抗癌藥物。例如，在治療期期間，施用之間的間隔可以比FDA批准的抗癌藥物的治療計劃中的施用間隔增加約或增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍或5倍。在一些實施例中，施用的總數在治療期內可以減少。例如，施用的總數可以減少約或減少至少10%、20%、30%、40%或50%。在一些實施例中，由於改善的功效，治療期的長度可以比FDA批准的治療計劃的長度例如縮短約或縮短至少10%、20%、30%、40%或50%。
在一些實施例中，另外的治療劑可以是過繼性細胞療法。過繼性細胞療法包含將T細胞(一種類型的免疫細胞)給予患者以説明身體抵抗如癌症等疾病的免疫療法的一種類型。在癌症療法中，T細胞通常取自患者的自身血液或腫瘤組織，在實驗室中大量生長，並且然後歸還給患者以説明免疫系統抵抗癌症。在一些實施例中，過繼性細胞療法包含嵌合抗原受體T細胞(CAR T細胞)療法、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)療法、經過工程化的TCR療法或自然殺傷(NK)細胞療法。在一些實施例中，過繼性細胞療法可以被稱為過繼性細胞轉移、細胞過繼性免疫療法或T細胞轉移療法。
在一些實施例中，另外的治療劑可以包括選自由以下組成的組的一種或多種治療劑：佐劑、TLR激動劑、腫瘤壞死因數(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-17拮抗劑、HVEM拮抗劑、ICOS激動劑、治療靶向CX3CL1、治療靶向CXCL9、治療靶向CXCL10、治療靶向CCL5、LFA-1激動劑、ICAM1激動劑和選擇素激動劑。
在一些實施例中，向患者施用卡鉑、納布紫杉醇、紫杉醇、順鉑、培美曲塞、吉西他濱、FOLFOX或FOLFIRI。
在一些實施例中，另外的治療劑是抗OX40抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗LAG-3抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體或抗GITR抗體。治療感染性疾病
本公開還提供了治療已經暴露於毒素或病原體的患者的方法。因此，本公開的另一方面提供了一種治療受試者中的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用抗PD-1抗體或其抗原結合部分，使得針對所述感染性疾病對所述受試者進行治療。優選地，抗體是人抗人PD-1抗體(如本文所描述的人抗PD-1抗體中的任何人抗PD-1抗體)。另外地或可替代地，抗體可以是嵌合抗體或人源化抗體。
與上述用途類似，經過抗體介導的PD-1阻斷可以單獨使用，或者作為佐劑與疫苗組合使用，以刺激對病原體、毒素和自身抗原的免疫應答。可以使用此治療方法的病原體的實例包含，例如，目前不存在有效疫苗的病原體或常規疫苗對其不能完全有效的病原體。這些病原體包含但不限於HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、流行性感冒、皰疹、賈第蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。PD-1阻斷對於抵抗由如HIV等在感染的過程中呈現出突變抗原的病原體引起的所確立感染特別有用。在將抗人PD-1抗體施用於受試者時，這些新的表位可以被免疫系統識別，從而激發不會由負信號通過PD-1而被抑制的強烈的T細胞應答。
可通過本公開的方法治療的引起感染的病原性病毒的一些實例包含HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、皰疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSY-II和CMY、人類皰疹病毒第四型)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒。
可通過本公開的方法治療的引起感染的病原細菌的一些實例包含衣原體、立克次氏菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病和萊姆病細菌。
可通過本公開的方法治療的引起感染的病原真菌的一些實例包含假絲酵母(白色念珠菌、克柔假絲酵母、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌、曲黴菌(煙曲黴菌、黑麴黴等)、毛黴菌屬(毛黴菌、梨頭黴、如根黴)、申克氏孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和莢膜組織胞漿菌。
可通過本公開的方法治療的引起感染的病原性寄生蟲的一些實例包含痢疾內變形蟲(Entamoeba histolytica)、結腸小袋纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格裡變形蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、鞭毛蟲(Giardia Zambia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、田鼠巴貝蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏什利曼蟲(Leishmania donovani)、弓形蟲(Toxoplasma gondi)和巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，PD-1阻斷可以與如細胞因數治療(例如，干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2))或雙特異性抗體療法等其它形式的免疫療法組合，這提供了增強的腫瘤抗原的呈遞(參見例如，Bolliger (1993) 《美國國家科學院院刊》 90:6444-6448; Poljak (1994) 《結構(Structure)》 2:1121-1123)。
雙特異性抗體或抗原結合片段可以通過多種方法產生，包含融合雜交瘤或連接Fab'片段。參見例如，Songsivilai和Lachmarm，《臨床與實驗免疫學(Clin. Exp. Immunol.)》79: 315-321 (1990), Kostelny等人，《免疫學雜誌》148:1547-1553 (1992)。另外，雙特異性抗體可以形成為「diabodies」或或“「Janusins」“。在一些實施例中，雙特異性抗體與PD-1的兩個不同表位結合。在一些實施例中，雙特異性抗體具有來自雜交瘤克隆#11的單克隆抗體的第一重鏈和第一輕鏈，以及另外的抗體重鏈和輕鏈。在一些實施例中，另外的輕鏈和重鏈還來自以上經過標識的單克隆抗體之一，但是可以與第一重鏈和第一輕鏈不同。藥物調配物
在另一方面，本公開提供了一種組合物，例如，藥物組合物，所述組合物含有與藥學上可接受的載劑一起調配的本公開的單克隆抗體中的一種或組合或其一種或多種抗原結合部分。此類組合物可以包含本公開的抗體中的一種或組合(例如，兩種或更多種不同的)或免疫綴合物或雙特異性分子。例如，本公開的藥物組合物可以包括與靶抗原上的不同表位結合或具有互補活性的抗體(或免疫綴合物或雙特異性抗體)的組合。
本公開的藥物組合物還可以在組合療法中施用，即，與其它試劑組合。例如，組合療法可以包含與至少一種其它抗炎劑或免疫抑製劑組合的本公開的抗PD-1的抗體。可以用於組合療法的治療劑的實例在以下關於本公開的抗體的用途的部分中進行更詳細地描述。
"藥學上可接受的載劑"是指藥物調配物中除了活性成分以外的對受試者無毒的成分。藥學上可接受的載劑包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
本公開的藥物組合物可以包含一種或多種藥學上可接受的鹽。"藥學上可接受的鹽"是指保留母體化合物的所期望生物活性並且不賦予任何不期望的毒理效應的鹽(參見例如，Berge, S. M.等人 (1977) 《藥物科學雜誌(J. Pharm. Sci.)》 66:1-19)。此類鹽的實例包含酸加成鹽和鹼加成鹽。酸加成鹽包含源自無毒無機酸的鹽以及來自無毒有機酸的鹽，所述無毒無機酸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，所述無毒有機酸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族磺酸以及芳香族磺酸等。鹼加成鹽包含源自鹼土金屬的鹽以及來自無毒有機胺的鹽，所述鹼土金屬如鈉、鉀、鎂、鈣等，所述無毒有機胺如N,N'-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。
本公開的藥物組合物還可以包含藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包含：(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本公開的藥物組合物中可以採用的適合的水性和非水性載劑的實例包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其適合的混合物、植物油，如橄欖油和可注射的有機酯，如油酸乙酯。可以例如通過使用如卵磷脂等包衣材料，通過在分散液的情況下維持所需粒徑以及通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。
這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑以及分散劑。通過上述滅菌程式以及通過包含各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)兩者可以確保預防微生物的存在。可能還期望將等滲劑，如糖、氯化鈉等，包含在這些組合物中。另外，通過包含延遲吸收的藥劑(如單硬脂酸鋁以及明膠)可以實現可注射藥物形式的延長的吸收。
藥學上可接受的載劑包含無菌水溶液或分散液以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。此類介質和藥劑用於藥物活性物質的用途是本領域已知的。除了任何常規介質或藥劑與活性化合物不相容的情況之外，設想了其在本公開的藥物組合物中的用途。還可以將補充性活性化合物併入到組合物中。治療組合物通常在製造以及儲存條件下必須是無菌和穩定的。組合物可以調配為溶液、微乳液、脂質體，或適合於高藥物濃度的其它有序結構。載劑可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及其適合的混合物的溶劑或分散介質。可以例如通過使用如卵磷脂等包衣，通過在分散液的情況下保持所需粒徑以及通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，將優選的是在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。通過在組合物中包含延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可以實現可注射組合物的延長吸收。
無菌可注射溶液可以通過根據需要將所需量的活性化合物與以上列舉的成分中的一種或其組合併入適當溶劑中，隨後滅菌微濾來製備。通常，通過將活性化合物併入到無菌媒劑中來製備分散液，所述無菌媒劑含有基礎分散介質和來自以上列舉的那些的其它所需成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥(凍干)，所述方法從其先前經過無菌過濾的溶液中產生活性成分加上任何另外所期望的成分的粉末。
可以與載劑材料組合以產生單個劑型的活性成分的量將根據正在被治療的受試者和特定施用模式而變化。可以與載劑材料組合以產生單一劑型的活性成分的量通常是產生治療效果的組合物的量。通常，在百分之百中，此量的範圍將是活性成分的約0.01%到約99%，優選地約0.1%到約70%，最優選地活性成分與藥學上可接受的載劑的組合的約1%到約30%。
調整劑量方案以提供最佳的期望應答(例如，治療應答)。例如，可以施用單次大劑量，可以隨時間推移施用若干次分劑量，或可以按治療狀況的緊急情況所指出的成比例地減少或增加劑量。為了易於施用以及劑量的均一性，以劑量單位形式調配腸胃外組合物是特別有利的。如本文所使用的劑量單位是指適於作為用於待治療的受試者的單一劑量的物理上離散的單位；每個單位含有與所需藥物載劑相關聯的、經過計算以產生所期望治療效果的預定量的活性化合物。針對本公開的劑量單位形式的規格受制於並直接取決於：(a)活性化合物的獨特特性和待實現的特定治療效果，和(b)個體敏感性對複合用於治療的此類活性化合物造成的本領域固有限制。
為了施用抗體，劑量的範圍為宿主體重的約0.0001-100 mg/kg，並且更通常為0.01-5 mg/kg。例如，劑量可以為0.3 mg/kg體重、1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重或10 mg/kg體重或處於1-10 mg/kg的範圍內。示例性治療方案需要按以下施用:每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次或每三個月到每6個月一次。本公開的抗PD-I抗體的優選劑量方案包含通過靜脈內施用的1 mg/kg體重或3 mg/kg體重，其中所述抗體使用以下給藥方案之一給予：(i)每四週六個劑量，然後每三個月；(ii)每三周；(iii)3 mg/kg體重一次，然後每三周1 mg/kg體重。
在一些方法中，同時施用具有不同結合特異性的兩種或更多種單克隆抗體，在這種情況下，施用的每種抗體的劑量落如所指示的範圍內。抗體通常在多種場合施用。單次劑量之間的間隔可以是例如每周、每月、每三個月或每年。間隔如通過測量抗體對患者體內的靶抗原的血液水準所指示的也可以是不規律的。在一些方法中，調整劑量以實現約1-1000 μg/ml並且在一些方法中約25 -300 μg/ml的血漿抗體濃度。
可替代地，抗體可以作為緩釋調配物施用，在這種情況下要求較低頻率地施用。劑量和頻率根據抗體在患者中的半衰期而變化。通常，人抗體顯示出最長的半衰期，隨後是人源化抗體、嵌合抗體以及非人抗體。施用的劑量和頻率可以根據治療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性應用中，相對較低劑量在長時間段內以相對不頻繁的間隔施用。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要相對較短的間隔下相對高的劑量，直到疾病進展減少或終止，並且優選地直到患者顯示出疾病癥狀部分改善或完全改善。此後，可以對患者施用預防方案。
可以改變本公開的藥物組合物中的活性成分的實際劑量水準以獲得對於特定患者、組合物和施用模式有效實現期望治療應答，而對患者無毒性的活性成分的量。所選劑量水準將取決於各種藥代動力學因素，包含所採用的本公開的具體組合物或其酯、鹽或醯胺的活性；施用途徑；施用時間；所採用的具體化合物的吸收速率；治療持續時間；與所採用的具體組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料；所治療的患者的年齡、性別、體重、病症、一般健康情況以及以前病史；以及醫學領域中熟知的類似因素。
本公開的抗PD-1抗體的「治療有效劑量」優選地引起疾病症狀的嚴重性降低、無疾病癥狀期的頻率和持續時間增加或對由於疾病折磨造成的損傷或殘疾的預防。例如，對於腫瘤的治療，相對於未經過治療的受試者，"治療有效劑量「優選地抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%，更優選地至少約40%，甚至更優選地至少約60%，並且仍更優選地至少約80%。化合物抑制腫瘤生長的能力可以在預測人腫瘤的功效的動物模型系統中評估。可替代地，組合物的這種特性可以通過檢查化合物抑制的能力評估，這種通過測定進行的體外抑制是熟練的從業者已知的。治療有效量的治療化合物可以減小腫瘤大小或以其它方式減輕受試者的癥狀。本領域的普通技術人員將能夠基於如受試者的大小、受試者的癥狀的嚴重性以及所選擇的具體組合物或施用途徑等因素確定這種量。
在另一方面，如本文所描述的，本公開提供了包括抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體的藥物部件試劑盒。所述試劑盒還可以進一步包括用於治療過度增殖性疾病(如本文所描述的癌症)的說明書。在另一個實施例中，抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體可以以單位劑型共包裝。
在某些實施例中，同時施用具有不同結合特異性的兩種或更多種單克隆抗體(例如，抗PD-1和抗CTLA-4)，在這種情況下，施用的每種抗體的劑量落入所指示的範圍內。抗體可以以單次劑量的形式施用，或更通常地可以在多種場合下施用。單次劑量之間的間隔可以是例如每周、每月、每三個月或每年。間隔如通過測量抗體對患者體內的靶抗原的血液水準所指示的也可以是不規律的。在一些方法中，調整劑量以實現約1-1000 μg/ml並且在一些方法中約25 -300 μg/ml的血漿抗體濃度。
本公開的組合物可以使用本領域已知的多種方法中的一種或多種通過一種或多種施用途徑施用。如本領域技術人員將理解的，施用的途徑和/或模式將根據所期望的結果而變化。本公開的抗體的優選施用途徑包含靜脈內、肌內、皮內、腹膜內、皮下、脊髓或其它腸胃外施用途徑，例如通過注射或輸注。如本文所使用的，短語"腸胃外施用"意指除了腸內施用和局部施用之外的、通常通過注射進行的施用模式，並且包含但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外以及胸骨內注射和輸注。
可替代地，本公開的抗體可以通過非腸胃外途徑施用，如局部、表皮或粘膜施用途徑，例如經鼻施用、經口施用、經陰道施用、經直腸施用、經舌下施用或局部施用。
活性化合物可以用將保護化合物免於快速釋放的載劑來製備，所述載劑如控釋調配物，包含植入物、透皮貼劑和微膠囊化遞送系統。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用於製備此類調配物的許多方法是授予專利的或通常是本領域的技術人員已知的。參見例如，《緩釋以及控釋藥物遞送系統(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)》, J. R. Robinson編輯，馬塞爾德克爾出版公司(Marcel Dekker, Inc.)，紐約，1978。
治療組合物可以用本領域已知的醫學裝置施用。例如，在優選實施例中，本公開的治療組合物可以用無針皮下注射裝置施用，所述無針皮下注射裝置如在以下中公開的裝置：美國專利第5,399,163號；第5,383,851號；第5,312,335號；第5,064,413號；第4,941,880號；第4,790,824號；或第4,596,556號。可用於本公開的眾所周知的植入物和模組的實例包含：美國專利第4,487,603號，所述美國專利公開了用於以受控速率分配藥物的可植入微輸注泵；美國專利第4,486,194號，所述美國專利公開了用於通過皮膚施用藥物的治療裝置；美國專利第4,447,233號，所述美國專利公開了用於以精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，所述美國專利公開了用於連續藥物遞送的可變流量植入式輸注設備；美國專利第4,439,196號，所述美國專利公開了具有多腔室隔室的滲透藥物遞送系統；以及美國專利第4,475,196號，所述美國專利公開了滲透藥物遞送系統。這些專利通過引用併入本文。許多其它此類植入物、遞送系統以及模組是本領域的技術人員已知的。
在某些實施例中，可以調配本公開的人單克隆抗體以確保在體內的適當分佈。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高度親水化合物。為了確保本公開的治療化合物穿過BBB(如果期望的話)，可以在例如脂質體中調配所述化合物。關於製造脂質體的方法，參見例如，美國專利第4,522,811號；第5,374,548號；以及第5,399,331號。所述脂質體可以包括被選擇性地運輸到特定細胞或器官中，由此增強靶向藥物遞送的一個或多個部分(參見例如，V. V. Ranade (1989) 《臨床藥理學雜誌(J. Clin. Pharmacol.)》29:685)。示例性靶向部分包含葉酸或生物素(參見例如，Low等人的美國專利第5,416,016號)；甘露糖甙(Umezawa等人，(1988) 《生物化學與生物物理研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Commun.)》153:1038)；抗體(P. G. Bloeman等人 (1995) 《FEES快報(FEES Lett.)》357: 140；M. Owais等人 (1995) 《抗菌劑與化學療法(Antimicrob. Agents Chemother.)》39: 180)；表面活性蛋白A受體(Briscoe等人 (1995) 《美國生理學雜誌(Am. J. Physiol.)》1233:134)；p120(Schreier等人 (1994) 《生物化學雜誌》 269:9090)；還參見K. Keinanen、M. L. Laukkanen (l994) 《FEBS快報》346:123；J. J. Killion；I. J. Fidler (1994) 《免疫方法(Immunomethods)》 4:273。
本文還提供了含有本文所描述的抗體或抗原結合片段中的至少一種(例如，一種、兩種、三種或四種)的藥物組合物。本文所描述的任何抗體或抗原結合片段中的兩種或更多種(例如，兩種、三種或四種)可以以任何組合的形式存在於藥物組合物中。藥物組合物可以以本領域已知的任何方式調配。 藥物組合物可以與施用說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。本公開還提供了製造用於如本文所描述的各種用途的抗體或其抗原結合片段的方法。實體
本發明在以下實例中進一步描述，所述實例不限制申請專利範圍中所描述的本發明的範圍。實例 1. 產生小鼠抗 PD-1 抗體
進行實驗以產生針對人PD-1的小鼠抗體。用人PD-1使小鼠免疫。收集脾細胞。針對結合親和力對雜交瘤進行篩選。選擇雜交瘤(克隆#11)，以進行進一步實驗。通過測序(F02)確定抗體的序列。
用從所選雜交瘤(克隆#11)獲得的抗PD-1抗體進行蛋白質印跡分析(圖1)。從美國模式培養物保藏所(ATCC)購買HEK-293T細胞。用pCMV6-ENTRY對照(左泳道)或具有PDCD1 cDNA的pCMV6-ENTRY(奧傑公司(Origene)，目錄號RC210364；右泳道)將HEK-293T細胞轉染48小時並裂解。通過SDS-PAGE對當量的細胞裂解物(每泳道5 μg)進行分離，並用所述抗PD-1抗體(1:2000)對其進行免疫印跡。結果顯示抗PD-1抗體可以以高親和力與人PD-1結合。實例 2. 免疫螢光染色
對表達人PD-1的細胞進行了免疫螢光染色。通過用表達人PD-1的載體對HEK-293T細胞進行慢病毒轉導產生293T-PD-1細胞。在補充有10%胎牛血清(FBS)的達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)中對細胞進行培養。
圖2A示出了用小鼠單克隆抗體抗PD-1在經過RC210364穩定轉染的HEK293T細胞上的對PDCD1的免疫螢光染色。用Hoechst33342對細胞核進行了標記。作為陰性對照(1:100)對HEK293T細胞進行了相同的實驗(圖2B)。
圖3A示出了使用抗PD-1小鼠單克隆抗體對穩定表達PD1細胞的免疫細胞化學染色。圖3B示出了對作為陰性對照(1:900)的293T細胞進行的免疫細胞化學染色。
還使用抗PD-1抗體和非特異性對照抗體(1:50)對表達PD-1的細胞進行了流式細胞術分析(圖4)。
圖5示出了使用來自雜交瘤克隆#11(F02)的抗PD-1抗體或0.3 ug/ml PD1-Fc融合蛋白(TP700199)或兩者對穩定表達PD-L1(奧傑公司，目錄號RC213071)的細胞進行的並通過抗-Fc(人)IgG-FITC(1:50)檢測的流式細胞術分析。通過來自雜交瘤克隆#11的抗PD-1抗體完全阻斷了PD-L1與PD-1的結合。結果顯示，抗PD-1抗體可以有效阻斷PD-L1與PD-1的結合。
圖6示出了使用來自雜交瘤克隆#11的抗PD-1抗體或1 μg/ml PD1-Fc融合蛋白(TP700199)或兩者對經過PD-L2(RC224141)暫態轉染的HEK293T細胞進行的並通過抗-Fc(人)IgG-FITC(1:50)檢測的流式細胞術分析。通過來自雜交瘤克隆#11的抗PD-1抗體完全阻斷了PD-L2與PD-1的結合。結果顯示，抗PD-1抗體可以有效阻斷PD-L2與PD-1的結合。實例 3. 抗體的人源化
通常，將來自小鼠親本抗體的抗體特異性序列(CDR)移植到人供體序列上。根據利用廣泛的抗體資料庫計算每種組合的獨特人性評分的生物資訊學軟體選擇供體序列。將這些抗體克隆到表達載體中，並且轉染到細胞系中以進行重組蛋白表達。通過ELISA和基於細胞的結合測定在體外測試了對靶蛋白PD-1的抗體親和力。
抗體的人源化是通過CDR移植策略和表面重修策略實現的。此外，還使用了去免疫策略。利用了包含抗體建模和關鍵框架殘基標識的生物資訊學工具設計人源化重鏈和輕鏈。將具有最大人源化評分的那些抗體組合以獲得完整抗體。這些抗體中的許多抗體將具有可被原始抗體所包括的親和力。
將人源化VH和VL克隆到瞬時表達載體中。通過測序確認了最終的構建體。此外，將重鏈和輕鏈的候選對(包含用於對照的一個嵌合對)共轉染到CHO或HEK293細胞中以進行暫態表達。對所表達抗體進行純化，然後通過ELISA或基於細胞的結合測定測量其表位特異性和親和力。實例 4. 抗 PD1 對重組人 PD-1(rhPD-1) 的結合親和力
將100 μl包被緩衝液中的5 μg/ml的抗PD1抗體在4°C下在微孔中包被過夜。按照ELISA程式，將5倍連續稀釋的重組生物素化人PD-1添加到用抗PD1抗體預先包被的測定板上。然後用Sav-HRP試劑對所結合的人PD-1蛋白進行檢測。通過Prism 7分析結果，並且通過程式確定Kd值。
如圖7A-7G所示，可以利用通過ELISA確定的處於nM範圍內的Kd值將大多數抗PD1抗體與重組人PD-1結合。例如，h11的所估計Kd為0.29 nM，Ab7的所估計Kd為0.68 nM，並且Ab8的所估計Kd為0.32 nM。h11、Ab7和Ab8抗體表現出與原始小鼠克隆F02相當的Kd值。實例 5. 抗 PD1 對細胞表面上的人 PD-1(hPD-1) 的結合親和力
在4°C下用不同濃度的每種經過測試的抗PD1抗體對293T-PD-1細胞(0.03 × 106 /孔)進行溫育，持續60分鐘。然後用二級抗體(人源化抗體的APC抗Hu IgG Fc和F02的FITC抗小鼠IgG F(ab')2)將細胞染色30分鐘(1:50)，然後進行流式細胞術分析。通過Prism 7分析結果，並且通過程式確定Kd值。
如圖8A-8G所示，所有的抗PD1抗體都可以與在293T-PD-1細胞上表達的PD-1蛋白結合。通過流式細胞術確定的所有抗體的Kd值均處於nM範圍內。例如，h11的所估計Kd為0.55 nM，Ab2的所估計Kd為3.24 nM，Ab4的所估計Kd為41 nM，Ab5的所估計Kd為3.69 nM，Ab7的所估計Kd為2.3 nM，並且Ab8的所估計Kd為0.65 nM。其他實施例
應理解，雖然已經結合其具體描述對本發明進行了描述，但前面的描述旨在說明而非限制本發明的範圍，本發明的範圍由所附申請專利範圍的範圍限定。其他方面、優點以及修改都處於以下申請專利範圍的範圍內。
所參照的附圖中對示例性實施例進行了展示。意圖是，本文所公開的實施例和附圖被視為說明性的，而非限制性的。 圖1示出了用抗PD-1抗體(克隆#11)進行的蛋白質印跡分析。用pCMV6-ENTRY對照(左泳道)或pCMV6-ENTRY PDCD1(RC210364，右泳道)cDNA對HEK293T細胞進行轉染，持續48小時，然後對其進行裂解。通過SDS-PAGE對當量的細胞裂解物(每泳道5 μg)進行分離，並用抗PD-1抗體(1:2000)對其進行免疫印跡。 圖2A示出了對經過PDCD1(RC210364)-穩定轉染的HEK293T細胞進行的免疫螢光染色。通過小鼠單克隆抗PD-1抗體標記PD-1，並且用Hoechst33342標記細胞核。 圖2B示出了對作為陰性對照(1:100)的HEK293T細胞進行的免疫螢光染色。 圖3A示出了使用抗PD-1小鼠單克隆抗體(左)對穩定表達PD-1的細胞進行的免疫細胞化學染色。 圖3B示出了對作為陰性對照(1:900)的293T細胞進行的免疫細胞化學染色。 圖4示出了與非特異性陰性對照抗體(1:50)相比使用抗PD-1抗體(F02)對穩定表達PD-1的細胞進行的流式細胞術分析。 圖5示出了使用來自雜交瘤克隆#11(F02)的抗PD-1抗體或0.3 ug/ml PD1-Fc融合蛋白(TP700199)或兩者對穩定表達PD-L1(RC213071)的細胞進行的並通過抗-Fc(人)IgG-FITC(1:50)檢測的流式細胞術分析。通過來自雜交瘤克隆#11的抗PD-1抗體完全阻斷了PD-L1與PD-1的結合。 圖6示出了使用來自雜交瘤克隆#11(F02)的抗PD-1抗體或1 μg/ml PD1-Fc融合蛋白(TP700199)或兩者對經過PD-L2(RC224141)暫態轉染的HEK293T細胞進行的並通過抗-Fc(人)IgG-FITC(1:50)檢測的流式細胞術分析。通過來自雜交瘤克隆#11的抗PD-1抗體完全阻斷了PD-L2與PD-1的結合。 圖7A示出了F02抗PD-1抗體與重組人PD-1蛋白(rhPD-1)之間的結合曲線。通過ELISA測量確定了F02對rhPD-1的結合親和力。Kd值被確定為0.14 nM。 圖7B示出了h11抗PD-1抗體與rhPD-1之間的結合曲線。通過ELISA測量確定了h11對rhPD-1的結合親和力。Kd值被確定為0.29 nM。 圖7C示出了Ab2抗PD-1抗體與rhPD-1之間的結合曲線。 圖7D示出了Ab4抗PD-1抗體與rhPD-1之間的結合曲線。 圖7E示出了Ab5抗PD-1抗體與rhPD-1之間的結合曲線。 圖7F示出了Ab7抗PD-1抗體與rhPD-1之間的結合曲線。Kd值被確定為0.68 nM。 圖7G示出了Ab8抗PD-1抗體與rhPD-1之間的結合曲線。Kd值被確定為0.32 nM。 圖8A示出了F02抗PD-1抗體與細胞表面上的人PD-1蛋白(hPD-1)之間的結合曲線。通過流式細胞術評估確定了F02對細胞表面上的hPD-1的結合親和力。Kd值被確定為0.07 nM。 圖8B示出了h11抗PD-1抗體與細胞表面上的人PD-1蛋白(hPD-1)之間的結合曲線。通過流式細胞術評估確定了h11對細胞表面上的hPD-1的結合親和力。Kd值被確定為0.55 nM。 圖8C示出了Ab2抗PD-1抗體與細胞表面上的人PD-1蛋白(hPD-1)之間的結合曲線。Kd值被確定為3.24 nM。 圖8D示出了Ab4抗PD-1抗體與細胞表面上的人PD-1蛋白(hPD-1)之間的結合曲線。Kd值被確定為41 nM。 圖8E示出了Ab5抗PD-1抗體與細胞表面上的人PD-1蛋白(hPD-1)之間的結合曲線。Kd值被確定為3.69 nM。 圖8F示出了Ab7抗PD-1抗體與細胞表面上的人PD-1蛋白(hPD-1)之間的結合曲線。Kd值被確定為2.3 nM。 圖8G示出了Ab8抗PD-1抗體與細胞表面上的人PD-1蛋白(hPD-1)之間的結合曲線。Kd值被確定為0.65 nM。 圖9列出了本公開中描述的序列。
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(無)

Claims (56)

  1. 一種與程式性細胞死亡蛋白1(Programed Cell Death Protein 1; PD-1)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括： 重鏈可變區(VH)，所述VH包括互補決定區(CDR)1、2和3，其中所述VH CDR1區包括與所選VH CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，所述VH CDR2區包括與所選VH CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，並且所述VH CDR3區包括與所選VH CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列；以及 輕鏈可變區(VL)，所述VL包括CDR1、2和3，其中所述VL CDR1區包括與所選VL CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，所述V CDR2區包括與所選VL CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，並且所述VL CDR3區包括與所選VL CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列， 其中所述所選VH CDR1、2和3氨基酸序列以及所述所選VL CDR1、2和3氨基酸序列為以下之一： (1)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 8、9、10中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 5、6、7中列示； (2)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 22、23、24中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 19、20、21中列示； (3)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 74、75、76中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 71、72、73中列示； (4)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 34、35、36中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 31、32、33中列示； (5)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 54、55、56中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 51、52、53中列示； (6)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 64、65、66中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 61、62、63中列示； (7)所述所選VH CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 44、45、46中列示，並且所述所選VL CDR1、2、3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 41、42、43中列示。
  2. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括具有分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3，並且所述VL包括具有分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3。
  3. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括具有分別在SEQ ID NO: 22、23和24中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3，並且所述VL包括具有分別在SEQ ID NO: 19、20和21中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3。
  4. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括具有分別在SEQ ID NO: 74、75和76中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3，並且所述VL包括具有分別在SEQ ID NO: 71、72和73中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3。
  5. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括具有分別在SEQ ID NO: 34、35和36中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3，並且所述VL包括具有分別在SEQ ID NO: 31、32和33中列示的所述氨基酸序列的CDR1、2、3。
  6. 如請求項1到5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段與人PD-1特異性結合。
  7. 如請求項1到6中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是人源化抗體或其抗原結合片段。
  8. 如請求項1到7中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)。
  9. 一種核酸，其包括編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包括： (1)包括重鏈可變區(VH)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括互補決定區(CDR)1、2和3，所述互補決定區包括分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列示的氨基酸序列，並且其中所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時與PD-1結合； (2)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (3)包括重鏈可變區(VH)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 22、23和24中列示的所述述氨基酸序列，並且其中所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時與PD-1結合； (4)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 19、20和21中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (5)包括重鏈可變區(VH)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 74、75和76中列示的所述述氨基酸序列，並且其中所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時與PD-1結合； (6)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 71、72和73中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (7)包括VH的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 34、35和36中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的VL配對時與PD-1結合； (8)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 31、32和33中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (9)包括VH的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 54、55和56中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的VL配對時與PD-1結合； (10)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 51、52和53中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (11)包括VH的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 64、65和66中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的VL配對時與PD-1結合； (12)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 61、62和63中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合； (13)包括VH的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 44、45和46中列示的所述氨基酸序列，並且其中所述VH當與包括在SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68中列示的所述氨基酸序列的VL配對時與PD-1結合； (14)包括VL的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 41、42和43中列示的所 述氨基酸序列，並且其中所述VL當與包括在SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70中列示的所述氨基酸序列的VH配對時與PD-1結合。
  10. 如請求項9所述的核酸，其中所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白重鏈或其片段包括VH，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列示的所述氨基酸序列。
  11. 如請求項9所述的核酸，其中所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白輕鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白輕鏈或其片段包括VL，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列示的所述氨基酸序列。
  12. 如請求項9所述的核酸，其中所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白重鏈或其片段包括VH,所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 22、23和24中列示的所述氨基酸序列。
  13. 如請求項9所述的核酸，其中所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白輕鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白輕鏈或其片段包括VL，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 19、20和21中列示的所述氨基酸序列。
  14. 如請求項9所述的核酸，其中所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白重鏈或其片段包括VH，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 74、75和76中列示的所述氨基酸序列。
  15. 如請求項9所述的核酸，其中所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白輕鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白輕鏈或其片段包括VL，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 71、72和73中列示的所述氨基酸序列。
  16. 如請求項9所述的核酸，其中所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白重鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白重鏈或其片段包括VH，所述VH包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 34、35和36中列示的所述氨基酸序列。
  17. 如請求項9所述的核酸，其中所述核酸包括編碼包括免疫球蛋白輕鏈或其片段的多肽的多核苷酸，所述免疫球蛋白輕鏈或其片段包括VL，所述VL包括CDR1、2和3，所述CDR1、2和3包括分別在SEQ ID NO: 31、32和33中列示的所述氨基酸序列。
  18. 如請求項9到17中任一項所述的核酸，其中所述VH當與VL配對時與人PD-1特異性結合，或者所述VL當與VH配對時與人PD-1特異性結合。
  19. 如請求項9到18中任一項所述的核酸，其中所述免疫球蛋白重鏈或所述其片段是人源化免疫球蛋白重鏈或其片段，並且所述免疫球蛋白輕鏈或所述其片段是人源化免疫球蛋白輕鏈或其片段。
  20. 如請求項9到19中任一項所述的核酸，其中所述核酸編碼單鏈可變片段(scFv)。
  21. 如請求項9到20中任一項所述的核酸，其中所述核酸是cDNA。
  22. 一種載體，其包括如請求項9到21中任一項所述的核酸中的一種或多種。
  23. 一種載體，其包括如請求項9到21中任一項所述的核酸中的兩種，其中所述載體編碼一起與PD-1結合的所述VL區和所述VH區。
  24. 一種載體對，其中每個載體包括如請求項9到21中任一項所述的核酸之一，其中所述載體對一起編碼一起與PD-1結合的所述VL區和所述VH區。
  25. 一種細胞，其包括如請求項22或23所述的載體或如請求項24所述的載體對。
  26. 如請求項25所述的細胞，其中所述細胞是CHO細胞。
  27. 一種細胞，其包括如請求項9到21中任一項所述的核酸中的一種或多種。
  28. 一種細胞，其包括如請求項9到21中任一項所述的核酸中的兩種。
  29. 如請求項28所述的細胞，其中所述兩種核酸一起編碼一起與PD-1結合的所述VL區和所述VH區。
  30. 一種產生抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括 (a)在足以使如請求項25到29中任一項所述的細胞產生所述抗體或所述抗原結合片段的條件下培養所述細胞；和 (b)收集由所述細胞產生的所述抗體或所述抗原結合片段。
  31. 一種與PD-1結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括 重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH包括與所選VH序列至少90%相同的氨基酸序列，所述VL包括與所選VL序列至少90%相同的氨基酸序列，其中所述所選VH序列選自SEQ ID NO: 4、18、30、40、50、60或70，並且所述所選VL序列選自SEQ ID NO: 2、16、28、38、48、58或68。
  32. 如請求項31所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括SEQ ID NO: 4的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 2的序列。
  33. 如請求項31所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括SEQ ID NO: 18的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 16的序列。
  34. 如請求項31所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括SEQ ID NO: 70的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 68的序列。
  35. 如請求項31所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括SEQ ID NO: 30的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 28的序列。
  36. 如請求項31所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括SEQ ID NO: 50的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 48的序列。
  37. 如請求項31所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括SEQ ID NO: 60的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 58的序列。
  38. 如請求項31所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包括SEQ ID NO: 40的序列，並且所述VL包括SEQ ID NO: 38的序列。
  39. 如請求項31到38中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段與人PD-1特異性結合。
  40. 如請求項31到39中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是人源化抗體或其抗原結合片段。
  41. 如請求項31到40中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)。
  42. 一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括如請求項1到8和31到41中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的所述VH CDR1、2、3和所述VL CDR1、2、3。
  43. 一種抗體-藥物綴合物，其包括與治療劑共價結合的如請求項1到8和31到42中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  44. 如請求項43所述的抗體-藥物綴合物，其中所述治療劑是細胞毒性劑或細胞生長抑製劑。
  45. 一種治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包括如請求項1到8和31到42中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或如請求項43或44所述的抗體-藥物綴合物。
  46. 如請求項45所述的方法，其中所述受試者患有實體瘤或血液癌(例如，淋巴瘤)。
  47. 如請求項45所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、復發性或難治性經典霍奇金淋巴瘤(relapsed or refractory classical Hodgkin lymphoma)、鱗狀細胞肺癌、腎細胞癌或皮膚鱗狀細胞癌。
  48. 如請求項45所述的方法，其中所述癌症是尿路上皮癌、梅克爾細胞癌(merkel-cell carcinoma)或間皮瘤。
  49. 一種降低腫瘤生長速率的方法，所述方法包括 使免疫細胞與施予受試者的有效量的組合物接觸，所述組合物包括如請求項1到8和31到42中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或如請求項43或44所述的抗體-藥物綴合物。
  50. 一種殺死腫瘤細胞的方法，所述方法包括 使免疫細胞與施予受試者的有效量的組合物接觸，所述組合物包括如請求項1到8和31到42中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或如請求項43或44所述的抗體-藥物綴合物。
  51. 一種治療感染性疾病或降低患有感染性疾病的風險的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包括如請求項1到8和31到42中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  52. 如請求項51所述的方法，其進一步包括向所述受試者施用疫苗。
  53. 一種藥物組合物，其包括如請求項1到8和31到42中任一項所述的抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載劑。
  54. 一種藥物組合物，其包括如請求項43或44所述的抗體藥物綴合物以及藥學上可接受的載劑。
  55. 如請求項1到8和31到42中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是IgG1抗體、IgG2抗體或IgG4抗體。
  56. 如請求項1到8和31到42中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是人IgG1抗體。
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