TW202102668A - 用於生產膠原蛋白7組合物之系統及方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供產生包含重組膠原蛋白7及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物之生產系統及宿主細胞。該等宿主細胞經基因工程改造以穩定地表現rCol7及其功能變體。該膠原蛋白7組合物可用於恢復有需要之個體中之膠原蛋白7含量，且用於預防皮膚病狀、防止皮膚病狀進展、緩解及延遲皮膚病狀的發作，例如與失養型水皰性表皮鬆解(dystrophic epidermolysis bullosa；DEB))。

Description

用於生產膠原蛋白7組合物之系統及方法

本發明係關於用於產生包含重組人類膠原蛋白7及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物的生產系統、經工程改造之宿主細胞及方法。 序列表之引用

本申請案與電子格式之序列表一起申請。序列表以2020年3月23日創建的名稱為SEQLST_21181008TW.txt之文件提供，其大小為215,366個位元組。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入本文中。

膠原蛋白7 (VII型膠原蛋白)為表皮基底膜帶(basement membrane zone；BMZ)中發現之重要皮膚組分，該表皮基底膜帶為位於皮膚之表皮層與底層真皮層之間的二層膜。由膠原蛋白7組成之錨定原纖維將表皮基底膜連接至乳頭狀真皮，將皮膚之表皮及真皮層固持在一起，從而提供結構及穩定性。

膠原蛋白7為由三種相同α鏈多肽組成之均三聚體。膠原蛋白7 α鏈多肽由COL7A1 基因編碼且主要由角質細胞及纖維母細胞表現及合成。膠原蛋白7之更改與若干種皮膚病症，諸如大皰性表皮鬆解(epidermolysis bullosa；EB)及由針對膠原蛋白7蛋白質之自體抗體引起之自體免疫疾病，諸如獲得性大皰性表皮鬆解(epidermolysis bullosa acquisita；EBA)、大皰性類天疱瘡(bullous pemphigoid)、瘢痕性類天疱瘡(cicatricial pemphigoid)、副腫瘤性天疱瘡、尋常天疱瘡(pemphigus vulgaris)、兒童慢性大皰性疾病(chronic bullous disease of childhood；CBDC)及全身性硬化症有關。

COL7A1 基因之突變可導致形成已知為失養型水皰性表皮鬆解(dystrophic epidermolysis bullosa；DEB)之EB，該失養型水皰性表皮鬆解係表現有極其脆弱及不可治癒起泡皮膚、變形肢體、食道狹窄、許多其他併發症及早死之罕見兒童疾病。基於遺傳模式，DEB可分類為常染色體顯性DEB (DDEB)或隱性DEB (RDEB)；後者導致最嚴重形式之DEB。在美國，所有類型之DEB之發病率經估算為6.5個/百萬新生兒，而較嚴重之常染色體隱性形式影響約1個/百萬新生兒。

與膠原蛋白7缺乏相關之皮膚病症的其他常見症狀包括皮膚風疹爆發(蕁麻疹)、皮膚上之大泡(起泡) (包括表皮及表皮下起泡兩者)、慢性皮膚創傷、黏膜(包括口腔或直腸黏膜、結膜、鼻咽(nasoharynx)、喉及食道)之嚴重及腐蝕性病變以及皮膚之疼痛及疤痕。

對此等嚴重皮膚病狀及病症(例如，DEB)之治療策略集中於恢復功能性膠原蛋白7。例示性策略包括膠原蛋白7之體表及/或局部投與、靶向COL7A1 基因之基因療法、細胞療法(諸如移植成纖維細胞以用於表現膠原蛋白7)及膠原蛋白7代替療法(諸如藉由全身性投與膠原蛋白7蛋白質)。

本發明提供用於產生膠原蛋白7組合物以供恢復個體之功能性膠原蛋白7的生產系統、經工程改造之宿主細胞及方法。在一些實施例中，膠原蛋白7組合物可用於治療皮膚病狀，諸如由膠原蛋白7缺乏及/或皮膚之基底膜帶(BMZ)中之其他缺陷引起的皮膚病狀。

本發明提供用於產生包含人類重組膠原蛋白7 (rCol7)及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物之生產系統，其中生產系統包含經修飾以用於表現人類rCol7及/或其功能變體之宿主細胞。較佳地，生產系統之經工程改造之宿主細胞經轉化以表現人類rCol7或其功能變體及至少一種可增加rCol7及/或其功能變體於宿主細胞中之表現的蛋白質，該蛋白質包括脯胺酸酶(亦已知為脯胺酸水解酶)、由α多肽(次單元A)及β多肽(次單元B)組成之脯胺醯基4-羥化酶、C1GALT1特異性伴隨蛋白1 (COMSC)及/或熱休克蛋白(heat shock protein；HSP) (例如，HSP 47)。較佳地，宿主細胞經工程改造以表現人類脯胺醯基4-羥化酶，其僅包含α及β多肽兩者(例如，hP4HA1及hP4HB)；或與HSP 47組合以增加rCol7之表現。

在一些實施例中，生產系統可包含複數個同源性經工程改造之宿主細胞，其衍生自表現人類rCol7或其功能變體之單一細胞純系。在其他實施例中，生產系統可包含複數個異質性經工程改造之宿主細胞，其衍生自表現人類rCol7及/或其功能變體之超過一種細胞純系。

在一些實施例中，經工程改造之宿主細胞包含至少一種編碼人類rCol7或其功能變體之第一外源性聚核苷酸及至少一種編碼可增加rCol7或其功能變體表現之蛋白質的外源性聚核苷酸，諸如脯胺酸酶(PEPD)、脯胺醯基4-羥化酶(P4H)、C1GALT1特異性伴隨蛋白1 (COMSC)及熱休克蛋白47 (HSP 47)。在一些實施例中，經工程改造之宿主細胞可進一步包含編碼rCol7或其功能變體之第二聚核苷酸。編碼rCol7及其功能變體之第一及第二聚核苷酸可包含相同核酸序列或不同核酸序列。在一些實施例中，編碼rCol7之聚核苷酸包含經密碼子最佳化之核酸序列。

在一個較佳實施例中，經工程改造之宿主細胞包含至少一種編碼rCol7或其功能變體之第一外源性聚核苷酸、編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A) (P4HA)之外源性聚核苷酸及編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B) (P4HB)之外源性聚核苷酸。視情況，經工程改造之宿主細胞可進一步包含編碼rCol7或其功能變體之第二外源性聚核苷酸。在一些實例中，第一rCol7編碼聚核苷酸及第二rCol7編碼聚核苷酸可具有相同核酸序列。在其他實例中，兩種rCol7編碼聚核苷酸具有不同核酸序列。

在一些實施例中，經工程改造之宿主細胞包含編碼rCol7或其功能變體之一種第一外源性聚核苷酸及一種第二外源性聚核苷酸、編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)之外源性聚核苷酸、編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之外源性聚核苷酸以及編碼HSP 47之外源性聚核苷酸。

在一些實施例中，經工程改造之宿主細胞用包含編碼rCol7或其功能變體之聚核苷酸的表現載體及至少一種包含編碼可增加rCol7或其功能變體表現之蛋白質之聚核苷酸的表現載體轉化，其中該蛋白質可為脯胺酸酶(PEPD)、脯胺醯基4-羥化酶(P4H)、C1GALT1特異性伴隨蛋白1 (COMSC)或熱休克蛋白47 (HSP 47)。

在一個較佳實施例中，經工程改造之宿主細胞用包含編碼人類rCol7或其功能變體之第一聚核苷酸的表現載體、包含編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)之聚核苷酸的表現載體及包含編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之聚核苷酸的表現載體轉化。視情況，經工程改造之宿主細胞用包含編碼人類rCol7或其功能變體之第二聚核苷酸之表現載體進一步轉化。在一些實例中，此等經工程改造之宿主細胞用表現編碼HSP 47之聚核苷酸之載體進一步轉化。

在一些實施例中，經工程改造之宿主細胞用包含編碼rCol7或其功能變體之聚核苷酸的表現載體轉化，其中相同表現載體包含編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)之聚核苷酸及編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之聚核苷酸。

在一些實施例中，經工程改造之宿主細胞用包含編碼rCol7或其功能變體之聚核苷酸的表現載體轉化，其中相同表現載體包含編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)之聚核苷酸及編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之聚核苷酸以及編碼HSP 47之聚核苷酸。

在一些實施例中，經工程改造之宿主細胞為哺乳動物細胞，例如人類、小鼠、大鼠或中國倉鼠細胞(Chinese hamster cell；CHO)。在一個較佳實施例中，細胞為衍生自CHO細胞株之哺乳動物細胞。

可在無血清之蛋白質生產條件下培養經工程改造之宿主細胞。蛋白質生產條件可包含添加一或多種試劑，諸如營養物及/或可選試劑。

在本發明之另一態樣中，提供用於產生膠原蛋白7組合物之方法，該等方法包含(1)向哺乳動物細胞中引入至少一種編碼rCol7或其功能變體之外源性聚核苷酸、編碼脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)的外源性聚核苷酸及編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之外源性聚核苷酸；(2)藉由分離表現可選標記物之彼等轉化體來選擇該等哺乳動物細胞之穩定單株轉化體，該可選標記物處於足以允許其在選擇試劑之存在下生長時存活之含量；(3)在允許表現rCol7或其功能變體之生長條件下培養轉化體及產生蛋白質組合物之其他多肽；及(4)收穫細胞培養基且純化蛋白質組合物。

在一些實施例中，方法進一步包含向步驟(1)之哺乳動物細胞中引入編碼HSP 47之外源性聚核苷酸。

在一些實施例中，生長條件為無血清的且包含添加一或多種試劑，諸如營養物及/或可選試劑。

本發明之另一態樣係關於包含人類rCol7及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物及其醫藥組合物或調配物，該等醫藥組合物或調配物包含膠原蛋白7組合物及至少一種醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組合物或調配物適合於向有需要之個體全身性投與。個體可帶有缺陷之COL7A1 基因。在一些實例中，個體可診斷患有RDEB。

在一些實施例中，由本生產系統產生之膠原蛋白7組合物可包含包含SEQ ID NO.: 1之多肽的天然存在之人類膠原蛋白7蛋白質、其功能變體或天然存在之膠原蛋白7蛋白質及其功能變體之組合。

在一些實施例中，由本生產系統、宿主細胞及方法產生之膠原蛋白7組合物可用於將有需要之個體中之膠原蛋白7恢復至功能性含量。

在又一態樣中，本發明提供用於預防、緩解及抑制個體之皮膚病狀之進展之方法；該等方法包含向個體投與包含含有rCol7及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物的醫藥組合物。在一些實施例中，病狀為與COL7A1 基因之突變相關之皮膚病狀，諸如RDEB。

相關揭示之參考

本申請案主張2019年3月27日申請之美國臨時申請案序列號：62/824,671之優先權，其內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明之一或多個實施例之細節闡述於下文隨附說明書中。雖然類似或等效於本文中所描述之彼等材料及方法之任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但現在描述較佳之材料及方法。本發明之其他特徵、目標及優勢根據說明書將顯而易見。在描述中，除非上下文另外明確指示，否則單數形式亦包括複數形式。除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。在有衝突之情況下，將以本說明書為準。

本發明係關於用於產生膠原蛋白7組合物之生產系統、經工程改造之宿主細胞及方法。膠原蛋白7組合物可包含人類rCol7及/或其功能變體。較佳地，生產系統包含用於表現人類重組膠原蛋白7 (rCol7)及/或其功能變體之經基因工程改造之宿主細胞。宿主細胞可經基因修飾以包含編碼重組膠原蛋白7及/或其功能變體之聚核苷酸。宿主細胞可用一或多種包含編碼重組膠原蛋白7或其功能變體之聚核苷酸之表現載體轉化。根據本發明，宿主細胞經進一步轉化以表現一或多種可增加宿主細胞中之rCol7表現之蛋白質。此等蛋白質可包括脯胺醯基4-羥化酶、脯胺酸酶、伴隨蛋白及/或熱休克蛋白，例如HSP 47。

本發明提供包含rCol7 (例如，人類rCol7)及其功能變體之膠原蛋白7組合物，其可由本發明之生產系統及宿主細胞產生。此外，提供包含本發明之膠原蛋白7組合物之醫藥組合物及/或調配物。

本發明進一步提供用於產生細胞表現系統之載體及方法，該等細胞表現系統用於產生膠原蛋白7組合物。在本發明之另一態樣中，提供用包含rCol7及其功能變體之醫藥組合物及/或調配物抑制、緩解或預防有需要之個體之皮膚病狀之進展的方法。 定義

為方便起見，此處收集說明書、實例及申請專利範圍中所採用之某些術語。除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。以下術語及片語意欲具有如此處所定義之含義。

如本文中所使用，「膠原蛋白7」 (亦被稱作C7、Col7、VII型膠原蛋白及膠原蛋白VII)係指由三種由COL7A1 基因編碼之相同α鏈多肽組成之膠原蛋白。各α鏈多肽由2,944個胺基酸組成，包括藉由大全域胺基端非膠原性NC1域(殘基17-1253)及較小羧基端非膠原性NC2域(殘基2784-2944)側接的中心膠原性三螺旋片段(TH) (成熟肽中之殘基1254-2783)。人類膠原蛋白7之全長α鏈多肽包含SEQ ID NO.: 1之胺基酸序列(參考編號：NP_000085)，其由SEQ ID NO.: 2之核酸序列(參考編號：NM_000094)編碼。

膠原蛋白7為錨定原纖維之主要成分，該等錨定原纖維充當包括皮膚、口腔黏膜及子宮頸之若干組織之上皮與間質層之間的界面處之連接複合物(Chung等人,Dermatol. Clin. , 2010, 28(1):93-105)。皮膚中之錨定原纖維位於真皮-表皮基底膜帶(BMZ)處之基膜(basal lamina)下方，從而確保表皮BMZ與真皮之間的締合且有助於皮膚之完整性(Varki等人J Med Genet 2007, 44:181-192)。膠原蛋白7蛋白質形成二硫鍵穩定化二聚合聚集體之非交錯陣列(Burgenson等人,Ann N Y Acad Sci ., 1985, 460: 47-57)。應注意，如本文中所使用之術語「膠原蛋白7」涵蓋其功能變體，即使在不存在明確敍述之情況下。

如本文中所使用，術語「多肽」係指經由肽鍵連接在一起之胺基酸之連續鏈。術語用於指任何長度之胺基酸鏈，但一般熟習此項技術者應理解，該術語不限於冗長鏈且可指包含經由肽鍵連接在一起之兩個胺基酸之最小鏈。如熟習此項技術者所已知，多肽可經處理及/或修飾。如本文中所使用之「蛋白質」係指用作離散單元之一或多個多肽。在一些情況下，術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用。如本文中所使用之術語「胺基酸」係指通常用於形成蛋白質及多肽之二十種天然存在的胺基酸或彼等胺基酸之類似物或衍生物中之任一者。「重組蛋白」或「重組多肽」係指利用經分離之核酸分子或重組核酸分子表現之蛋白質或多肽分子。「經分離」蛋白質或核酸分子係指自其自然環境移除之蛋白質。若所關注之蛋白質或核酸分子按重量比重量計為至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%純度，則經分離蛋白質或核酸分子可「至少具有」一定純度。

如本文中所使用，術語「變體」或「功能變體」意謂野生型膠原蛋白7蛋白質之基本上維持野生型膠原蛋白7之生物功能或活性之任何衍生物。

膠原蛋白7之功能變體可包括維持膠原蛋白7之生物功能，諸如在人類皮膚之表皮與真皮層之間形成錨定原纖維之能力的多肽。膠原蛋白7變體可與野生型膠原蛋白7具有實質一致性。膠原蛋白7變體包括(但不限於)膠原蛋白7多肽，其相對於野生型膠原蛋白7經化學修飾及/或含有相對於野生型膠原蛋白7之一或多種胺基酸序列更改。在一些實施例中，膠原蛋白7之變體可包括與人類膠原蛋白7 (野生型)之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的多肽。作為一非限制性實例，膠原蛋白7變體可包含與SEQ ID NO.: 1之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之多肽。

膠原蛋白7蛋白質之變體亦可包括具有來自野生型膠原蛋白7之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO.: 1)之胺基酸修飾(例如缺失、添加或取代，諸如保守性取代)及/或胺基酸殘基之其他化學修飾的多肽。在一些實施例中，膠原蛋白7之變體與人類膠原蛋白7相差約1-50個胺基酸殘基、或約1-30個胺基酸殘基、或約1-20個胺基酸殘基或約1-10個胺基酸殘基。膠原蛋白7之變體可與人類膠原蛋白7相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸殘基。作為一非限制性實例，變體可與SEQ ID NO.: 1之胺基酸序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸殘基。「保守性胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。胺基酸殘基之化學修飾包括(但不限於)糖基化、磷酸化、醯胺化、豆蔻醯化、羥基化、磷酸泛醯巰基乙胺連接(phosphopantetheine attachment)、甲基化及異戊烯化。

根據本發明，膠原蛋白7之功能變體亦可包括膠原蛋白7之「功能片段」，其係指比全長蛋白質更短之多肽但維持其生物功能(諸如在人類皮膚之表皮與真皮層之間形成錨定原纖維的能力及結合膠原蛋白4及層黏連蛋白332之能力)之人類膠原蛋白7多肽的一部分。人類膠原蛋白7之功能片段可不包括整個膠原蛋白7之2,944個胺基酸殘基。舉例而言，功能片段可包括膠原蛋白7之NC1域及/或NC2域之全部或一部分，例如功能片段可為不具有中心膠原性螺旋域之全部或一部分的膠原蛋白7。

如本文中所使用，術語「膠原蛋白7組合物」係指包含複數個重組膠原蛋白7 α多肽、複數個膠原蛋白7等效多肽或複數個功能變體及其片段之組合物。替代地，膠原蛋白7組合物可包含複數個重組膠原蛋白7 α多肽、複數個膠原蛋白7等效多肽以及複數個功能變體及其片段之混合物。在一些實例中，膠原蛋白7組合物包含具有SEQ ID NO.: 1之胺基酸序列之膠原蛋白7 α多肽。膠原蛋白7組合物可由本表現系統及經工程改造以表現rCol7及/或其功能變體之宿主細胞產生。可自宿主細胞之培養基純化膠原蛋白7組合物。

如本文中所使用，術語「聚核苷酸」及「核酸分子」可互換使用且係指藉由5'與3'碳原子之間的磷酸二酯鍵接合在一起之核苷酸之聚合物。聚核苷酸可包括(但不限於) RNA (核糖核酸分子) (例如，mRNA)及DNA (去氧核糖核酸分子) (例如，來自真核mRNA之cDNA、來自真核(例如，哺乳動物) DNA之基因組DNA序列及甚至合成DNA序列)。術語亦捕獲包括DNA或RNA之已知鹼基類似物中之任一者的序列。如本文中用於描述核酸分子之術語「重組」意謂基因組、cDNA、半合成或合成來源之聚核苷酸，其藉助於其來源或操作而：(1)不與本質上與其相關之聚核苷酸之全部或一部分相關；及/或(2)連接至除本質上相關之聚核苷酸外的聚核苷酸。如相對於蛋白質或多肽使用之術語「重組」意謂藉由表現重組聚核苷酸而產生之多肽。根據本發明，編碼膠原蛋白7之聚核苷酸可包含SEQ ID NO.: 2之核酸序列。序列可為經密碼子最佳化之核酸序列，且在一個實施例中，此密碼子最佳化可用來增加甘胺酸含量。

術語「實質上一致」係指當例如使用下文所描述之方法進行最佳比對時，與第二核酸或胺基酸序列共有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸或胺基酸序列。「實質一致性」可用於指序列之多種類型及長度，諸如全長序列、功能域、編碼及/或調節序列、外顯子、內含子、啟動子及基因組序列。兩個多肽或核酸序列之間的序列一致性百分比以此項技術中之技術內之多種方式，例如使用公開可用的電腦軟體，諸如鹼基局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST) (Altschul, S. F., W. Gish等人J Mol Biol. , 1990, 215:403-10)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign (DNASTAR)來測定。另外，熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括用於在所比較序列之長度上達成最大比對所需的任何演算法。應理解，出於測定序列一致性之目的，當將DNA序列與RNA序列比較時，胸腺嘧啶核苷酸等效於尿嘧啶核苷酸。保守性取代通常包括以下群組中之一者內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。

聚核苷酸可包括約30至約200,000個核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至1,000、30至1,500、30至3,000、30至5,000、30至7,000、30至10,000、30至25,000、30至50,000、30至70,000、100至250、100至500、100至1,000、100至1,500、100至3,000、100至5,000、100至7,000、100至10,000、100至25,000、100至50,000、100至70,000、100至100,000、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至3,000、500至5,000、500至7,000、500至10,000、500至25,000、500至50,000、500至70,000、500至100,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至3,000、1,000至5,000、1,000至7,000、1,000至10,000、1,000至25,000、1,000至50,000、1,000至70,000、1,000至100,000、1,500至3,000、1,500至5,000、1,500至7,000、1,500至10,000、1,500至25,000、1,500至50,000、1,500至70,000、1,500至100,000、2,000至3,000、2,000至5,000、2,000至7,000、2,000至10,000、2,000至25,000、2,000至50,000、2,000至70,000、2,000至100,000、5,000至15,000及5,000至20,000個核苷酸)。

編碼多肽之聚核苷酸可經化學修飾。如本文中所使用，術語「修飾」可包括核苷鹼基之任何化學修飾。聚核苷酸可包含至少一個經化學修飾之核苷、胞嘧啶核苷修飾、鳥苷修飾及/或胸苷修飾。聚核苷酸可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個經化學修飾之核苷。

如本文中所使用，術語「載體」意謂病毒或非病毒、原核或真核之去氧核糖核酸、核糖核酸或核酸類似物，其能夠攜帶另一核酸分子，例如編碼重組膠原蛋白7或其功能變體之聚核苷酸。載體可將核酸分子攜帶至細胞(被稱作「宿主細胞」)中，使得轉錄或表現核酸分子之全部或一部分。載體以衍生自不同病毒、細菌或哺乳動物基因之元件之複合形式頻繁組裝。載體含有多種編碼及非編碼序列，包括對可選標記物(例如，抗生素抗性基因)編碼之序列、促進其在細菌中繁殖之序列或僅在某些細胞類型中表現之一或多個轉錄單元。舉例而言，哺乳動物表現載體通常含有促進載體在細菌中繁殖之原核序列及僅在真核細胞中表現之一或多個真核轉錄單元兩者。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可取決於諸如待轉化之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素。用於本文中之適合載體亦可含有編碼宿主細胞在特定條件下生長及存活所必需之產物，從而幫助選擇已將載體引入其中之宿主細胞的可選標記物基因。典型的選擇基因可包括(但不限於)編碼對抗生素、藥物或毒素(例如，四環素、氨苄西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)等)賦予抗性之蛋白質之基因。表現載體可為細菌質體、噬菌體、酵母質體、植物病毒或哺乳動物細胞病毒，諸如腺病毒、逆轉錄病毒或此項技術中已知之任何其他媒劑。適合之載體包括例如質體、噬菌粒、黏質體及病毒載體。

熟習此項技術者已知之標準方法可用於建構含有本文中所描述之核酸序列之重組表現載體。此等方法包括(但不限於)活體外重組技術、合成技術及活體內重組/基因重組。方法之選擇取決於特定核苷酸片段之性質且可由熟習此項技術者確定。

如本文中所使用，術語「轉化」及「轉染」涵蓋藉由此項技術中已知之多種技術將核酸(例如載體)引入至細胞中。轉化及轉染技術包括(但不限於)磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、脂染胺(lipofectamine)、電穿孔、顯微注射及病毒介導之轉染。熟習此項技術者應具有基於宿主細胞/載體組合之適合轉化及轉染方法的知識。對於長期、高產率之重組蛋白生產，穩定表現重組蛋白可為較佳的。穩定表現重組蛋白之宿主細胞可經工程改造。在一些實例中，術語「超轉染(supertransfection)」用於指代使用多個外源性聚核苷酸及載體，諸如2、3、4、5或更多個外源性聚核苷酸及載體之細胞轉染。

如本文中所使用，術語「宿主細胞」係指能夠表現外源性蛋白質，諸如由表現載體編碼之蛋白質的任何活細胞。宿主細胞可為其中可引入重組表現載體之原核或真核細胞。術語「宿主細胞」不僅係指特定個體細胞，而且係指特定個體細胞之後代或潛在後代。由於某些修飾可能因突變或環境影響而在後代中發生，此等後代可能實際上不與親本細胞相同，但仍包括於如本文中所使用之術語之範疇內。例示性宿主細胞可衍生自酵母、真菌、昆蟲或哺乳動物系統，但不限於此選擇。適合之宿主細胞可包括原代或經轉化細胞株，包括(但不限於)纖維母細胞、角質細胞、CHO、HEK293、C127、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK等。其他適合之宿主細胞為熟習此項技術者所已知。宿主細胞可能夠調節包括載體中所包括之編碼序列之經轉化核酸序列的表現且以特定方式修飾並且處理載體序列中編碼之基因產物。包括(但不限於)糖基化、磷酸化及蛋白質產物處理之修飾可能對蛋白質之功能具有重要性。

如本文中所使用，術語「生產系統」或「表現系統」係指可產生所關注之多肽或蛋白質之系統。生產系統可包含可表現所關注之多肽或蛋白質，例如膠原蛋白7之細胞。在本發明之上下文中，生產系統包含經工程改造以表現rCol7及/或其功能變體之宿主細胞。生產系統可進一步包含適合於經工程改造以表現rCol7及/或其功能變體之宿主細胞生長之反應器。如本文中所使用之生產反應器係指用於產生所關注之多肽或蛋白質(亦即rCol7)之最終生物反應器。反應器可為任何大小。作為非限制性實例，反應器可為至少500 mL、至少1公升且可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、2,500、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000公升或更大或其間的任何體積。大規模細胞培養物生產反應器之體積通常為至少20公升、或至少50公升、或至少100公升、或至少200公升、或至少300公升、或至少400公升或至少500公升，或可為1000、2500、3,000、4,000、5000、6,000、7,000、8,000、10,000、12,000公升或更大或其間的任何體積。反應器可由適合於在本發明之培養條件下固持懸浮於培養基中之細胞培養物的任何材料組成，該材料包括玻璃、塑膠或金屬。生產反應器之條件通常在細胞培養時段期間受到控制以確保細胞密度及存活率。此等條件包括(但不限於) pH、溫度、濕度及CO₂ 供應。如本文中所使用，術語「細胞密度」係指存在於既定體積之培養基中之細胞數目。如本文中所使用之術語「細胞存活率」係指培養物中之細胞在一系列既定之培養條件或實驗變化下存活的能力。如本文中所使用之術語亦係指在特定時間存活之細胞相對於當時培養物中之細胞總數目(活的及死亡的)之比例。

如本文中所使用，術語「生物反應器」用於指代用於培養表現膠原蛋白7組合物之宿主細胞之反應器。生物反應器可為傳統非拋棄式反應器或拋棄式生物反應器。

如本文中所使用，待治療之「患者」或「個體」可意謂人類或非人類哺乳動物。在本發明之上下文中，術語「患者」或「個體」係指任何個體，較佳地哺乳動物且更佳地罹患皮膚病症，諸如大皰性表皮鬆解(例如，失養型水皰性表皮鬆解)之人類。

如本文中所使用，術語「疾病」或「病症」係指由多種原因(諸如自體免疫缺陷、基因缺陷或環境應激)造成且藉由一組可鑑別之病徵或症狀表徵之生物體之部分、器官或系統的病理性病狀。「皮膚病」或「皮膚病症」意謂皮膚之臨床病狀，諸如影響個體之皮膚之病狀，例如大皰性病症、發炎性皮膚病狀或皮膚癌。大皰性(起泡)病症為一組異質病症，其特徵為主要在皮膚及黏膜上之較高流體填充之起泡病變(大泡)。大泡之大小可變且起泡疾病之特定症狀及嚴重程度在人與人之間，甚至在患有相同病症之個體中不同。例示性起泡病症包括(但不限於)獲得性大皰性表皮鬆解(EBA)及先天性大皰性表皮鬆解(EB)，諸如營養不良型EB。EB包括一組遺傳性結締組織疾病，其在皮膚及黏膜上引起由基因缺陷造成之水皰。失養型水皰性表皮鬆解(DEB)主要由編碼膠原蛋白7蛋白質之COL7A1 基因內之突變引起。迄今為止，已報導約400種COL7A1 之突變(van den Akker等人,Hum Mutat . 2011, 32(10):1100-1107)。DEB具有兩種遺傳模式：常染色體顯性(DDEB)及常染色體隱性(RDEB)。DDEB涉及膠原蛋白7表現減少，其通常由膠原蛋白α₁ (VII)鏈之膠原性域內之甘胺酸取代引起。RDEB通常為嚴重的且主要由於COL7A1 基因中之提前終止密碼子(premature termination codon；PTC)而導致膠原蛋白7表現缺失或明顯減少所引起。

如本文中所使用，「治療」患者或「治療」或「待治療」係指向個體投與醫藥組合物，使得逆轉、治癒、緩解或減少疾病之至少一種症狀。「治療」個體中之EB，例如DEB (DDEB及RREB)或EB之治療或治療EB係指向患有EB的個體投與醫藥組合物(例如包含rCol7及其功能變體之膠原蛋白7組合物)，使得逆轉、治癒、緩解或減少EB疾病之至少一種症狀。可靶向治療之EB疾病之症狀包括(但不限於)起泡；病變(例如，直腸、肛門、尿道病變及/或黏膜病變及/或鱗狀上皮組織之病變)；胃腸道之病變；攣縮，例如屈曲攣縮(例如，四肢之屈曲攣縮)；手或足之假併指(pseudosyndactyly)；癌瘤(例如，鱗狀細胞癌)；大泡形成；指甲及/或牙齒變形；收縮食道；眼病症、貧血、營養不良；繼發性皮膚感染；敗血症；聲音嘶啞；尿道狹窄；包莖(phimosis)；角膜疤痕；吸收障礙；及發育不良(failure to thrive)。

如本文中所使用，術語「預防(preventing/prevent/prevention)」意謂例如在不必要病狀(例如，宿主動物之疾病或其他非所要狀態)之臨床表現之前投與組合物，使得其保護宿主免於罹患非所要病狀，例如預防疾病之至少一種症狀。「預防」疾病亦可被稱作「防治」或「防治性治療」。在本發明之上下文中，可預防與EB相關之一或多個症狀，例如疤痕。患有EB個體之疤痕可引起以下症狀中之一或多者：攣縮，例如屈曲攣縮(例如，四肢之屈曲攣縮)；手或足之假併指；癌瘤(例如，鱗狀細胞癌)；直腸病變；黏膜病變；大泡形成；人工創傷後之大泡形成；指甲或牙齒變形；收縮性食道；眼病症、貧血、營養不良；繼發性皮膚感染；敗血症；聲音嘶啞；尿道狹窄；包莖；角膜疤痕；吸收障礙；及發育不良。

如本文中所使用，術語「治療有效量」係指以必需之劑量且持續必需之時間段有效達成所需治療結果之量。組合物之治療有效量取決於諸如個體之疾病狀態或年齡、性別及體重之因素而變化。治療有效量亦為其中治療有益效應超過組合物之任何毒性或有害效應的量。在本發明之上下文中，當作為任何界定治療方案之一部分投與時，有效量之rCol7產生統計上可量測之改善結果，如由與併發症相關之至少一個臨床參數所證明。

本發明之組合物可與另一試劑或療法組合投與。如本文中所使用，術語「組合」係指使用兩種或更多種試劑或療法以治療相同患者，其中試劑或療法之使用或作用在時間上重疊。在本發明之上下文中，包含rCol7或其功能變體之醫藥組合物可與預防及治療皮膚病症(諸如DEB)之一或多種試劑組合使用。試劑或療法可同時投與(例如，呈向患者投與之單一調配物形式或呈同時投與之兩種單獨調配物形式)或以任何順序依序投與。在一些實施例中，一種試劑或療法之遞送在第二者之遞送開始時仍存在，使得就投與而言存在重疊。此有時在本文中被稱作「同步」或「同時遞送」。在其他實施例中，一種試劑或療法之遞送在另一者之遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，治療由於組合投與而更有效。舉例而言，與不存在第一治療之情況下投與第二治療或在第一治療之情況下發現類似情形時所發現相比，第二治療更有效，例如用較少之第二治療即發現等效效果，或第二治療更大程度地減輕症狀。在一些實施例中，遞送使得症狀減輕，或與病症有關之其他參數大於不存在另一治療之情況下遞送一種治療所觀測到的參數。兩種治療之效果可部分相加，完全相加或大於相加。傳遞可使得所遞送之第一治療之效果在遞送第二治療時仍可偵測。

如本文中所使用，術語「醫藥學上可接受」係指與調配物之另一成分相容且對其接受者無害。 用於產生膠原蛋白7組合物之生產系統及細胞

在本發明之一個態樣中，提供用於製備包含人類rCol7及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物的生產系統，其中生產系統包含用於表現人類rCol7及/或其功能變體之宿主細胞。宿主細胞經基因修飾以表現rCol7，且在一些實施例中經進一步基因工程改造以表現至少一種可增加宿主細胞中之rCol7表現之蛋白質。蛋白質可包括(但不限於)脯胺酸酶(亦已知為肽酶D、脯胺酸二肽酶及L-脯胺酸水解酶，PEPD)或其功能變體、脯胺醯基4-羥化酶(亦已知為原膠原-脯胺酸及2-側氧基戊二酸酯4-二加氧酶，P4H)或其功能變體、C1GALT1特異性伴隨蛋白1 (亦已知為核心1 β3-半乳糖苷基轉移酶特異性分子伴隨蛋白、β 1,3-半乳糖苷基轉移酶2及COSMC)或其功能變體、離胺醯基羥化酶(lysyl hydroxylase；LH)或其功能變體、糖基轉移酶(glycosyl-transferase；GTF)或其功能變體及熱休克蛋白或其功能變體(例如，HSP 47)。較佳地，用於增加rCol7於宿主細胞中之表現之蛋白質為人類脯胺醯基4-羥化酶(hP4H)，其包含人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A) (例如hP4HA1)或其功能變體及人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B) (亦即，hP4HB)或其功能變體；及HSP 47或其功能變體。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞經轉化或經轉染以表現rCol7 α鏈多肽及至少一種可增加宿主細胞中之rCol7表現之蛋白質，該蛋白質選自脯胺酸酶(PEPD)、脯胺醯基4-羥化酶(P4H)、離胺醯基羥化酶(LH)、糖基轉移酶(GTF)、C1GALT1特異性伴隨蛋白1 (COSMC)或熱休克蛋白HSP 47或其功能變體。較佳地，宿主細胞用包含人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A) (例如hP4HA1)及人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B) (亦即，hP4HB)的人類P4H及/或HSP 47轉化。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞經基因工程改造以產生人類rCol7及/或其功能變體。人類rCol7可包含由SEQ ID NO.: 1呈現之胺基酸序列。rCol7亦可具有與SEQ ID NO.: 1之胺基酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的胺基酸序列。人類膠原蛋白7之功能變體可與展示為SEQ ID NO.: 1之序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸差異。人類膠原蛋白7之功能變體可包含具有SEQ ID NO.: 1之胺基酸序列的一部分之片段。

在一些實施例中，rCol7可由包含藉由SEQ ID NO.: 2呈現之核酸序列之聚核苷酸編碼。在一些實施例中，編碼rCol7或其功能變體之聚核苷酸可包含與SEQ ID NO.: 2之核酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的核酸序列。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞可經基因工程改造以進一步表現脯胺酸酶(PEPD)。脯胺酸酶為由PEPD 基因編碼之細胞溶質亞胺二肽酶，其可水解具有C端脯胺酸或羥脯胺酸殘基之二肽或三肽。此酶在循環來自亞胺二肽(主要衍生自膠原蛋白之降解產物)之脯胺酸以用於重新合成膠原蛋白及含有蛋白質之其他脯胺酸中發揮重要作用。此酶可促進一些宿主細胞中之重組膠原蛋白之合成。在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞可經修飾以表現脯胺酸酶或其功能變體。脯胺酸酶可為哺乳動物脯胺酸酶或其功能變體，例如人類脯胺酸酶、小鼠脯胺酸酶、大鼠脯胺酸酶或倉鼠脯胺酸酶。作為一非限制性實例，脯胺酸酶為包含SEQ ID NO.: 3之胺基酸序列之人類脯胺酸酶。脯胺酸酶之功能變體可具有與SEQ ID NO.: 3之胺基酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，脯胺酸酶可由包含藉由SEQ ID NO.: 4呈現之核酸序列之聚核苷酸編碼。編碼脯胺酸酶或其功能變體之聚核苷酸可包含與SEQ ID NO.: 4之核酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的核酸序列。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞可經基因工程改造以進一步表現脯胺醯基4-羥化酶(P4H)。脯胺醯基4-羥化酶為參與前原膠原中之脯胺醯基殘基之羥基化(用於將原膠原處理成成熟膠原蛋白之重要步驟)的酶。在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞可經修飾以表現脯胺醯基4-羥化酶或其功能變體。脯胺醯基4-羥化酶可為哺乳動物脯胺醯基4-羥化酶或其功能變體，例如人類脯胺醯基4-羥化酶、小鼠脯胺醯基4-羥化酶、大鼠脯胺醯基4-羥化酶或倉鼠脯胺醯基4-羥化酶。哺乳動物脯胺醯基4-羥化酶為α2β2四聚體，其由兩種相同α (alpha；α)多肽(次單元A)及兩種β (beta；β)多肽(次單元B)組成。α多肽(P4Hα或P4HA)含有肽基質結合域及酶活性位點。α多肽可為α多肽I (α-1、P4Hα(I)、次單元A1或P4HA1)或其同功異構物；α多肽II (α-2、P4Hα(II)、次單元A2或P4HA2)或其同功異構物；或α多肽III (α-3、P4Hα(III)、次單元A3或P4HA3)或其同功異構物。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞經工程改造以表現人類脯胺醯基4-羥化酶，其包含兩種α多肽(次單元A)及兩種β多肽(次單元B)或其功能變體。人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽可為α多肽1、α多肽2或α多肽3或其同功異構物或功能變體。α多肽1 (α-1)可包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO.: 5、7及9。α多肽2 (α-2)可包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO.: 11及13。α多肽3 (α-3)可包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO.:15及17。β多肽可包含SEQ ID NO.: 19之胺基酸序列。在一些實施例中，α多肽1可由包含選自由以下組成之群之核酸序列的聚核苷酸編碼：SEQ ID NO.: 6、8及10。α多肽2可由包含選自由以下組成之群之核酸序列的聚核苷酸編碼：SEQ ID NO.: 12及14。α多肽3可由包含選自由以下組成之群之核酸序列的聚核苷酸編碼：SEQ ID NO.: 16及18。β多肽可由包含藉由SEQ ID NO.: 20呈現之核酸序列之聚核苷酸編碼。

脯胺醯基4-羥化酶之α-1多肽(次單元A1)之功能變體可具有與如SEQ ID NO.: 5、7及9所給出的胺基酸序列中之任一者至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致之胺基酸序列。脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之功能變體可具有與SEQ ID NO.: 19之胺基酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的胺基酸序列。

作為一非限制性實例，本生產系統之宿主細胞經工程改造以表現由以下組成之人類脯胺醯基4-羥化酶：兩種α-1多肽(次單元A1)，其各自包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO.: 5、7及9；及兩種β多肽(次單元B)，其各自包含SEQ ID NO.: 19之胺基酸序列。

在一些實施例中，脯胺醯基4-羥化酶之α-1多肽(次單元A1)可由包含選自由以下組成之群之核酸序列的聚核苷酸編碼：SEQ ID NO.: 6、8及10。在一些實施例中，編碼α-1多肽或其功能變體之聚核苷酸可包含與如SEQ ID NO.: 6、8或10所給出的核酸序列中之任一者至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致之核酸序列。在一些實施例中，脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)可由包含藉由SEQ ID NO.: 20呈現之核酸序列之聚核苷酸編碼。在一些實施例中，編碼β多肽或其功能變體之聚核苷酸可包含與SEQ ID NO.: 20之核酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的核酸序列。

C1GALT1特異性伴隨蛋白1 (COMSC)充當膠原蛋白摺疊、穩定性及活性之分子伴隨蛋白。在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞可經修飾以表現C1GALT1特異性伴隨蛋白1或其功能變體。C1GALT1特異性伴隨蛋白1可具有哺乳動物來源，諸如(但不限於)人類、小鼠、大鼠或倉鼠。作為一非限制性實例，宿主細胞經修飾以表現包含SEQ ID NO.: 21之胺基酸序列之人類C1GALT1特異性伴隨蛋白1。C1GALT1特異性伴隨蛋白1之功能變體可具有與SEQ ID NO.: 21之胺基酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，C1GALT1特異性伴隨蛋白1多肽可由包含藉由SEQ ID NO.: 22呈現之核酸序列之聚核苷酸編碼。在一些實施例中，編碼C1GALT1特異性伴隨蛋白1多肽或其功能變體之聚核苷酸可包含與SEQ ID NO.: 22之核酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的核酸序列。

熱休克蛋白47 (亦稱絲胺酸蛋白酶抑因子H1 (Serpin H1)及膠原結合蛋白(colligin))為獨特之膠原蛋白特異性分子伴隨蛋白(由Nagata等人,Trends Biochem Sci ., 1996, 21:22-26綜述)，其特異性地結合至膠原性肽以用於促進膠原蛋白蛋白質摺疊、組裝及胞內運輸。在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞可經修飾以表現HSP 47或其功能變體。HSP 47可具有哺乳動物來源，諸如(但不限於)人類、小鼠、大鼠或倉鼠。作為一非限制性實例，宿主細胞經修飾以表現包含SEQ ID NO.: 23之胺基酸序列之人類HSP 47。HSP 47之功能變體可具有與SEQ ID NO.: 23之胺基酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，HSP 47多肽可由包含藉由SEQ ID NO.: 24呈現之核酸序列之聚核苷酸編碼。在一些實施例中，編碼HSP 47或其功能變體之聚核苷酸可包含與SEQ ID NO.: 24之核酸序列至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%或至少約99%一致的核酸序列。前述序列經概括於下文表1中。表 1 ：參考序列

多肽	蛋白質參考編號：	SEQ ID NO.:	聚核苷酸參考編號：	SEQ ID NO.:
膠原蛋白7	NP_000085	1	NM_000094	2
脯胺酸酶	NP_000276	3	NM_000285	4
脯胺醯基羥化酶之α多肽I (次單元A1、α-1)，同功異構物1	NP_000908	5	NM_000917	6
脯胺醯基羥化酶之α多肽I (次單元A1、α-1)，同功異構物2	NP_001017962	7	NM_001017962	8
脯胺醯基羥化酶之α多肽I (次單元A1、α-1)，同功異構物3	NP_001136068	9	NM_001142596	10
脯胺醯基羥化酶之α多肽II (次單元A2、α-2)，同功異構物1	NP_001136071	11	NM_001142599	12
脯胺醯基羥化酶之α多肽II (次單元A2、α-2)，同功異構物2	NP_001136070	13	NM_001142598	14
脯胺醯基羥化酶之α多肽III (次單元A3、α-3)，同功異構物1	NP_878907	15	NM_182904	16
脯胺醯基羥化酶之α多肽III (次單元A3、α-3)，同功異構物2	NP_001275677	17	NM_001288748	18
脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)	NP_000909	19	NM_000918	20
伴隨蛋白(COMSC)	NP_001011551	21	NM_001011551	22
熱休克蛋白47 (HSP47)	NP_001226.2	23	NM_001235.3	24

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞經修飾以表現人類rCol7及可增加rCol7表現之hP4H之α及β多肽，其中α多肽(P4HA)可為α多肽I、α多肽II或α多肽III或其同功異構物。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞經修飾以表現人類rCol7、hP4H之α及β多肽及人類HSP 47。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞經基因修飾以包含至少一種編碼rCol7之第一外源性聚核苷酸及至少一種編碼可增加rCol7於宿主細胞中之表現之蛋白質的外源性聚核苷酸，其中蛋白質可包括(但不限於)脯胺酸酶、包含α多肽(次單元A)及β多肽(次單元B)之脯胺醯基4-羥化酶、離胺醯基羥化酶、糖基轉移酶、C1GALT1特異性伴隨蛋白1、熱休克蛋白(例如HSP 47)及其功能變體。視情況，宿主細胞可經進一步修飾以包含編碼rCol7或其功能變體之第二外源性聚核苷酸。

在一些實施例中，編碼rCol7或其功能變體之外源性聚核苷酸可包含至少一種修飾，諸如密碼子最佳化。在一些實施例中，編碼rCol7之外源性聚核苷酸可包含序列中最佳化之甘胺酸密碼子。

在一個較佳實施例中，生產系統之宿主細胞經基因工程改造以包含至少一種編碼人類rCol7之第一外源性聚核苷酸、編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)之外源性聚核苷酸及編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之外源性聚核苷酸。α多肽可為α多肽I (α-1/次單元A1)或其同功異構物；或α多肽II (α-2/次單元A2)或其同功異構物；α多肽III (α-3/次單元A3)或其同功異構物。在一個較佳實例中，α多肽為α多肽I (α-1/次單元A1)或其同功異構物或功能變體。

在一些實施例中，生產系統之宿主細胞經基因工程改造以包含至少一種編碼人類rCol7之第一外源性聚核苷酸、編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)之外源性聚核苷酸及編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之外源性聚核苷酸以及編碼HSP 47之外源性聚核苷酸。

視情況，宿主細胞可進一步包含編碼rCol7或其功能變體之第二外源性聚核苷酸。在一些實例中，編碼rCol7之第一聚核苷酸及編碼rCol7之第二聚核苷酸可具有相同核酸序列。在其他實例中，編碼rCol7之兩種聚核苷酸具有不同核酸序列。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞經基因工程改造以包含編碼人類rCol7且具有SEQ ID NO.: 25之核酸序列的第一外源性聚核苷酸、具有SEQ ID NO.: 28之核酸序列的編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽1的外源性聚核苷酸及具有SEQ ID NO.: 30之核酸序列的編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽的外源性聚核苷酸。在一個較佳實施例中，用於表現rCol7之第一外源性聚核苷酸包含SEQ ID NO.: 26之核酸序列；編碼脯胺醯基4-羥化酶之α多肽1之外源性聚核苷酸包含SEQ ID. NO.: 29之核酸序列；且編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽之外源性聚核苷酸包含SEQ ID NO.: 31之核酸序列。

在一些實施例中，生產系統之宿主細胞經第二外源性聚核苷酸進一步修飾，該第二外源性聚核苷酸編碼人類rCol7且具有SEQ ID NO.: 25之核酸序列。用於表現rCol7之第二外源性聚核苷酸可包含與用於表現rCol7或其功能變體的第一外源性聚核苷酸相同之核酸序列或不同之核酸序列。在一個實例中，用於表現rCol7之第二外源性聚核苷酸包含SEQ ID NO.: 27之核酸序列。

在一些實施例中，宿主細胞經編碼rCol7之兩種聚核苷酸修飾，其中兩種聚核苷酸具有SEQ ID NO.: 26及SEQ ID NO.: 27之核酸序列。

在一些實施例中，宿主細胞經進一步基因工程改造以包含編碼人類HSP 47之外源性聚核苷酸，其中聚核苷酸序列包含SEQ ID NO.: 32之核酸序列。

本發明之宿主細胞可進一步經基因修飾以包含用於表現脯胺酸酶之外源性聚核苷酸或用於表現C1GALT1特異性伴隨蛋白1之外源性聚核苷酸。

在其他實施例中，生產系統之宿主細胞可用一或多個載體轉染，該等載體各自包含一或多個編碼rCol7及/或其功能變體之聚核苷酸序列。

在一些實施例中，生產系統之宿主細胞經基因修飾以包含：包含編碼rCol7或其功能變體之聚核苷酸的表現載體；及至少一種包含編碼可增加宿主細胞中之rCol7表現的蛋白質之聚核苷酸的表現載體，該蛋白質諸如脯胺酸酶、脯胺醯基4-羥化酶、離胺醯基羥化酶、糖基轉移酶、C1GALT1特異性伴隨蛋白1、熱休克蛋白(例如，HSP 47)或其功能變體。

在一個較佳實施例中，宿主細胞經基因工程改造以包含：包含編碼人類rCol7或其功能變體之第一聚核苷酸的第一表現載體；包含編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)或其功能變體之聚核苷酸的表現載體；及包含編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)或其功能變體之聚核苷酸的表現載體。視情況，宿主細胞經進一步修飾以包含包括編碼人類rCol7或其功能變體之第二聚核苷酸的第二表現載體。編碼人類rCol7或其功能變體之兩種聚核苷酸可包含相同編碼核酸序列。替代地，編碼人類rCol7或其功能變體之兩種聚核苷酸可包含不同編碼核酸序列。第一及第二rCol7表現載體可包含不同選擇標記基因，例如兩種不同抗生素抗性標記物。選擇抗生素可包括(但不限於)卡那黴素(kanamycin)、觀黴素(spectinomycin)、鏈黴素、氨苄西林、卡本西林(carbenicillin)、博萊黴素(bleomycin)、紅黴素(erythromycin)、多黏菌素B (polymyxin B)、四環素及氯胺苯醇(Chloramphenicol)。

在其他實施例中，本生產系統之宿主細胞可經基因修飾以包含：包含編碼人類rCol7或其功能變體之第一聚核苷酸的表現載體；及包含編碼hP4H之α多肽(次單元A)之聚核苷酸及編碼hP4H之β多肽(次單元B)或其功能變體之聚核苷酸的表現載體。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞可經基因修飾以包含：包含編碼人類rCol7或其功能變體之第一聚核苷酸的表現載體；及包含編碼hP4H之α多肽(次單元A)或其功能變體之聚核苷酸及編碼hP4H之β多肽(次單元B)或其功能變體之聚核苷酸的表現載體；及包含編碼人類HSP 47之聚核苷酸的表現載體。

作為一非限制性實例，本生產系統之宿主細胞可經基因工程改造以包含：包含編碼人類rCol7之聚核苷酸序列且具有SEQ ID NO.: 25之核酸序列的第一表現載體；包含編碼脯胺醯基4-羥化酶之α多肽1 (次單元A1)之聚核苷酸序列且具有SEQ ID NO.: 28之核酸序列的表現載體；及包含編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)之聚核苷酸序列且具有SEQ ID NO.: 30之核酸序列的表現載體；以及包含編碼HSP 47之聚核苷酸序列且具有SEQ ID NO.: 24之核酸序列的表現載體。

宿主細胞可進一步包含第二表現載體，其編碼人類rCol7之聚核苷酸序列，具有SEQ ID NO.: 25之核酸序列。

在一個較佳實施例中，本生產系統之宿主細胞包含：包含SEQ ID NO.: 26之聚核苷酸序列之第一膠原蛋白7表現載體；包含SEQ ID NO.: 27之聚核苷酸序列之第二膠原蛋白7表現載體；用於表現人類脯胺醯基4-羥化酶之α-1多肽之表現載體，其包含SEQ ID NO.: 29之聚核苷酸序列；及用於表現人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽之表現載體，其包含SEQ ID NO.: 31之聚核苷酸序列。經工程改造細胞可進一步包含用於表現HSP 47之表現載體，其包含SEQ ID NO.: 32之聚核苷酸序列。

在一些實施例中，本生產系統之宿主細胞可經工程改造以包含包括編碼人類rCol7或其功能變體之聚核苷酸的表現載體，其中相同表現載體進一步包含編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽(次單元A)或其功能變體之聚核苷酸及編碼人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)或其功能變體之聚核苷酸。在一些實例中，相同表現載體可進一步包含編碼人類HSP 47之聚核苷酸。

在一些實施例中，生產系統可包含複數個同源性經工程改造之宿主細胞，其衍生自表現人類rCol7或其功能變體之單一細胞純系。在其他實施例中，生產系統可包含複數個異質性經工程改造之宿主細胞，其衍生自表現人類rCol7及/或其功能變體之超過一種細胞純系。

本生產系統之宿主細胞可為能夠表現所關注之外源性多肽或蛋白質(例如rCol7)之任何細胞。本發明之宿主細胞可為真核細胞，諸如無脊椎動物(昆蟲)細胞或脊椎動物細胞，例如有爪蟾蜍卵母細胞(Xenopus laevis oocyte)或哺乳動物細胞。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞，包括(但不限於)纖維母細胞、C127、VERO、HeLa、MDCK、CHO、COS、BHK、HEK293細胞及/或衍生自此等哺乳動物宿主細胞之任何細胞。宿主細胞可為原代細胞或經轉化細胞株。在一個實施例中，用於產生膠原蛋白7組合物之表現系統包含哺乳動物CHO細胞或衍生自CHO細胞之細胞。表 2 ：表現構築體

構築體名稱	經編碼之多肽	SEQ ID NO.:
載體中之膠原蛋白7A序列	膠原蛋白7之α鏈	25
Puro_BT+_SLX-3631_膠原蛋白7A	膠原蛋白7之α鏈	26
Hygro_BT+_SLX-3631_膠原蛋白7A	膠原蛋白7之α鏈	27
載體中之hP4HA1序列	脯胺醯基羥化酶之α多肽I	28
pBSK_ITR_CGAPD_hP4HA1_X29_ITR	脯胺醯基羥化酶之α多肽I	29
載體之hP4HB序列	脯胺醯基羥化酶之β多肽	30
pBSK_ITR_CGAPD_hP4HB_X29_ITR	脯胺醯基羥化酶之β多肽	31
載體中之HSP 47序列	HSP 47	32

宿主細胞可藉由此項技術中已知之任何方法修飾。在一個實施例中，宿主細胞係藉由用於轉染哺乳動物細胞之已知方法，包括(但不限於)試劑介導之方法(例如，脂質、磷酸鈣、陽離子聚合物、DEAE-聚葡萄糖、經活化之樹枝狀聚合物(dendrimer)及磁珠)、電穿孔、顯微注射、雷射作用及病毒介導之方法修飾。經轉化宿主細胞可為經由若干輪選擇過程所選擇之穩定細胞純系。

在一些實施例中，本發明之生產系統進一步包含可為適合於用於表現rCol7及/或其功能變體之宿主細胞培養物生長之任何容器的生產反應器。

在一些實施例中，本發明之生產系統可產生用作生物醫藥之重組膠原蛋白7蛋白質。特定言之，宿主細胞穩定用於產生包含rCol7及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物。舉例而言，膠原蛋白7組合物由以大於0.5毫克/公升培養物、或大於1毫克/公升培養物、或大於5毫克/公升培養物、或大於10毫克/公升培養物、或大於20毫克/公升培養物或大於50毫克/公升培養物之量的經工程改造之宿主細胞產生。如本文中所使用之術語「培養物」、「細胞培養物」及「哺乳動物細胞培養物」係指懸浮於適合於細胞群體存活及/或生長之條件下之培養基中之哺乳動物細胞群體。

生產反應器可為任何大小。大規模細胞培養物生產反應器之體積通常為至少50公升、或至少100公升、或至少200公升、或至少300公升、或至少400公升或至少500公升，或可為1000、2,500、3,000、4,000、5000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,000公升或更大或兩者之間的任何體積。培養物體積可為至少500 mL、至少1公升且可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,500、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000公升或更大或兩者之間的任何體積。生產反應器之條件可在細胞培養時段期間控制以確保適當之細胞密度及存活率。此等條件包括(但不限於) pH、溫度、濕度及CO₂ 供應。

在一些實施例中，本發明之生產系統可產生呈大於1毫克/公升培養物、或大於5毫克/公升培養物、或大於10毫克/公升培養物、或大於20毫克/公升培養物或大於50毫克/公升培養物之量的膠原蛋白7組合物，例如足夠高之含量以使得其可經純化。

用於產生膠原蛋白7組合物之生產系統之宿主細胞可使用熟習此項技術者所已知之標準細胞培養程序及材料來培養。在一些實施例中，將宿主細胞培養於無血清培養基中。舉例而言，無血清培養基可為無動物來源之SFM2培養基。在一些實施例中，培養基可進一步包含至少一種補充劑(包括L-麩醯胺酸、胸苷及次黃嘌呤)、其他營養物，諸如脂質、胺基酸、維生素及/或生長因子(例如，由GE Healthcare提供之HyClone Cell Boost 5補充劑)。

在一些實施例中，用於培養本生產系統之宿主細胞之方法可包括用於保持宿主細胞之存活率之方法。需要最大細胞存活率。此等方法可用來使活細胞密度之減小降至最低及/或維持較高細胞存活率。

在一些實施例中，細胞培養方法涉及雙重選擇積極表現重組膠原蛋白7及/或其功能變體之細胞。

在本發明之另一態樣中，提供一種用於產生膠原蛋白7組合物之方法，該方法包含：i)提供編碼rCol7或其功能變體之聚核苷酸；ii)提供編碼α多肽1之聚核苷酸及編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之聚核苷酸；iii)提供編碼熱休克蛋白47之聚核苷酸；iv)提供包含用於產生rCol7或其功能變體、脯胺醯基4-羥化酶之α多肽1及β多肽或其功能變體及HSP47之宿主細胞的細胞表現系統；v)藉由在(iv)之細胞表現系統之宿主細胞中共表現(i)、(ii)及(iii)之聚核苷酸來產生膠原蛋白7組合物；及vi)收集且純化所產生之膠原蛋白7組合物。

在一些實施例中，用於產生膠原蛋白7組合物之方法可包含步驟：i)提供用於表現rCol7或其功能變體之載體，該載體包含編碼rCol7或其功能變體之聚核苷酸；ii)提供用於表現脯胺醯基4-羥化酶之α多肽1 (次單元A1)或其功能變體之載體，該載體包含編碼脯胺醯基4-羥化酶之α多肽1或其功能變體之聚核苷酸；iii)提供用於表現脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(次單元B)或其功能變體之載體，該載體包含編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之聚核苷酸；iv)提供用於表現HSP 47之載體，該載體包含編碼HSP 47或其功能變體之聚核苷酸；v)提供包含用於產生rCol7或其功能變體、脯胺醯基4-羥化酶之α多肽1及β多肽或其功能變體及HSP 47或其功能變體之宿主細胞的細胞表現系統；vi)藉由在(v)之細胞表現系統之宿主細胞中共表現(i)、(ii)、(iii)及(iv)之載體來產生膠原蛋白7組合物；及vii)收集且純化所產生之膠原蛋白7組合物。

在一些實施例中，製備膠原蛋白7組合物之本方法進一步包含：i)將經基因修飾以表現rCol7或其功能變體之宿主細胞培養於無血清培養基中；及ii)自宿主細胞培養物回收rCol7或其功能變體。

經重組產生之膠原蛋白7組合物可藉由此項技術中已知之任何方法自培養基回收，該等方法包括(但不限於)藉由離心或過濾自培養基分離宿主細胞、病毒不活化、藉助於鹽(例如硫酸銨)沈澱上清液或濾液之蛋白質組分及移除宿主細胞核酸內含物。視情況，可進一步純化膠原蛋白7組合物。純化可使用此項技術中已知之任何方法，包括(但不限於)親和性層析法、HPLC、離子交換層析法、疏水性相互作用層析法、尺寸排阻層析法、蛋白A層析法、蛋白G層析法或其類似方法來達成。

在一些實施例中，下游純化製程可經設計以提供足夠且有效之病毒清除。在一些實例中，製程可包括多個專用於病毒不活化或移除之單元操作。此等單元操作可持續且有效。同時，此等單元操作對產物品質不具有任何有害影響或不導致顯著產率損失。下游純化可移除製程中引入之任何化學品，諸如在專用病毒清除單元操作中添加之彼等化學品。

下游製程亦可包括可與最終超濾及滲濾步驟摻和之濃縮步驟。超濾(Ultrafiltration；UF)為自流體分離極小粒子及所溶解分子之製程。超濾通常用於自緩衝液組分分離蛋白質以用於緩衝液交換、去鹽或濃縮且移除糖、無水溶劑及低分子量之材料。UF/DF步驟可使用高效能膜超濾，諸如聚醚碸超濾膜來形成。

在本發明之另一態樣中，提供由本生產系統、宿主細胞及方法產生之膠原蛋白7組合物。使用本系統製備之膠原蛋白7組合物經恰當地修飾且在功能上與天然存在之膠原蛋白7蛋白質不可區分。舉例而言，由本生產系統製備之膠原蛋白7組合物可併入至皮膚之表層與真皮之間的基底膜帶(BMZ)內之錨定原纖維中。由本生產系統製備之膠原蛋白7組合物可結合至層黏連蛋白332及其他膠原蛋白7結合搭配物。膠原蛋白7組合物可保持野生型人類膠原蛋白7蛋白質之功能及/或活性之20-100%、50-100%、50-90%，或至少20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、85%、80%、90%、95%或100%。

在一個實施例中，膠原蛋白7組合物可由如本文別處所描述之包含用於產生rCol7或功能變體之活體外細胞表現系統的方法獲得。

膠原蛋白7組合物可包含複數個經重組表現之膠原蛋白7 α鏈多肽、或複數個膠原蛋白7 α鏈多肽之功能變體、或複數個功能上等效之膠原蛋白7 α鏈多肽或其混合物。作為一非限制性實例，由本細胞表現系統製備之膠原蛋白7組合物可包含複數個包含野生型膠原蛋白7多肽之經重組表現的膠原蛋白7 α鏈多肽及複數個功能上等效之膠原蛋白7 α鏈多肽，例如包含一或多個胺基酸取代之多肽(例如，D1033Y)的混合物。 醫藥組合物及調配物

在本發明之一個態樣中，包含由本表現系統及宿主細胞產生之人類rCol7或其功能變體的膠原蛋白7組合物可調配為醫藥組合物。醫藥組合物可進一步包含至少一種醫藥學上可接受之載劑。醫藥調配物及組合物經解釋為向個體投與治療有效量的本發明之膠原蛋白7組合物，以便預防、緩解及/或減輕皮膚病狀之症狀，諸如與DEB有關之皮膚症狀，例如皮膚創傷。醫藥組合物可採取適合於預期投藥模式及治療應用之任何可接受之醫藥調配物形式。

醫藥組合物可調配為用於非經腸、皮內或皮下應用之溶液或懸浮液。醫藥組合物可經調配以便適合於注射。可注射調配物可為無菌的，包括(但不限於)無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。醫藥組合物可經調配用於經口投藥且可呈錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠、散劑及其類似者之形式。醫藥組合物可經調配用於體表投藥，諸如乳膏、水凝膠及其類似者。

其他調配物形式包括(但不限於)液體、半固體或固體給藥形式、水凝膠、乳膏、液體溶液(例如，可注射液體溶液)、分散液或懸浮液、散劑及脂質體。

醫藥調配物在製造及儲存條件下為穩定的，且將保護以抵抗諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。微生物污染之預防可藉由多種抗細菌及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似者。

在一些實施例中，醫藥組合物包括重組膠原蛋白7及/或其功能變體及/或其混合物之活性藥物成分，該等範圍範圍介於0.1mg/mL至200 mg/mL、或1 mg/mL至200 mg/mL、或1 mg/mL至10 mg/mL、或10 mg/mL至200 mg/mL、或10 mg/mL至100 mg/mL或10 mg/mL至50 mg/mL。在一個實施例中，本發明之調配物中所包括之膠原蛋白7組合物具有既定濃縮，包括例如至少約0.1 mg/mL、至少約1 mg/mL、至少約2 mg/mL、至少約5 mg/mL、至少約10 mg/mL、至少約15 mg/mL、至少約20 mg/mL、至少約25 mg/mL、至少約30 mg/mL、至少約40 mg/mL、至少約50 mg/mL、至少約75 mg/mL、至少約100 mg/ml、至少約125 mg/mL、至少約150 mg/mL、至少約175 mg/mL、至少約200 mg/mL、或大於約200 mg/mL、或大於約300 mg/mL、或大於約400 mg/mL或大於約500 mg/mL的濃度。

醫藥組合物包含在儲存後基本上保持物理及/或化學穩定性及/或生物活性之膠原蛋白7組合物。可使用此項技術中可用之任何分析技術來評估蛋白質之穩定性。舉例而言，膠原蛋白7之穩定性可根據單體蛋白質於溶液中之百分比來測定，其中經降解(例如，經分段)及/或經聚集蛋白質之百分比較低。舉例而言，包含穩定之膠原蛋白7蛋白質之醫藥組合物可包括約60%至99%單體蛋白質或約70%至80%單體蛋白質。在一些實例中，包含穩定之膠原蛋白7蛋白質之醫藥組合物可包括至少95%單體蛋白質、或至少90%單體蛋白質、或至少85%單體蛋白質、或至少80%單體蛋白質、或至少75%單體蛋白質、或至少70%單體蛋白質或至少65%單體蛋白質。替代地，本發明之醫藥組合物可包括不超過5%聚集體及/或所降解蛋白質。

在一些實施例中，膠原蛋白7組合物包含天然存在之膠原蛋白7及其至少一種功能變體之混合物。在一些實施例中，使用本生產系統所產生且純化膠原蛋白7組合物，本生產系統包含經基因工程改造以表現重組膠原蛋白7及/或其功能變體之宿主細胞。

在一些實施例中，醫藥組合物包含至少一種醫藥學上可接受之載劑，例如賦形劑、界面活性劑、緩衝系統、使膠原蛋白7組合物穩定之穩定劑、張力調節劑、抗氧化劑、低溫保護劑、膨化劑、凍乾保護劑(lyroprotectant)、鹼性組分或酸性組分及其類似者。

如本文中所使用，術語「賦形劑」係指可添加至例如醫藥調配物中以提供所需稠度，改良穩定性及溶解度及/或調整滲透壓度及/或調整符合醫藥組合物之用法目的之其他特徵的試劑。常用賦形劑之實例包括(但不限於)糖、多元醇、胺基酸、界面活性劑及聚合物。在一些實例中，賦形劑可為離子賦形劑或非離子賦形劑。離子賦形劑在某些調配物條件(諸如pH)下具有淨電荷。離子賦形劑之實例包括(但不限於)組胺酸、精胺酸及氯化鈉。非離子賦形劑在某些調配物條件(諸如pH)下不具有淨電荷。非離子賦形劑之實例包括(但不限於)糖(例如，蔗糖)、糖醇(例如，甘露醇)及非離子界面活性劑(例如，聚山梨醇酯80)。

如本文中所使用，術語「穩定劑」係指改良或另外增強穩定性之賦形劑。穩定劑包括(但不限於) α-類脂酸、α-生育酚、抗壞血酸棕櫚酸酯、苯甲醇、生物素、亞硫酸氫鹽、硼、丁基化羥基大茴香醚(butylated hydroxyanisole；BHA)、丁基化羥基甲苯(butylated hydroxytoluene；BHT)、抗壞血酸及其酯、類胡蘿蔔素、檸檬酸鈣、乙醯基-L-肉鹼(acetyl-L-camitine)、螯合劑、軟骨素、鉻、檸檬酸、輔酶Q-10、半胱胺酸、半胱胺酸鹽酸鹽、3-去氫莽草酸(DHS)、EDTA (乙二胺四乙酸；乙二胺四乙酸二鈉(edetate disodium))、硫酸亞鐵、葉酸、反丁烯二酸、沒食子酸烷基酯、大蒜、葡糖胺、葡萄籽萃取物、古古爾(gugul)、鎂、蘋果酸、偏亞硫酸氫鹽、N-乙醯基半胱胺酸、菸酸、菸醯胺(nicotinomide)、蕁麻根、鳥胺酸、沒食子酸丙酯、碧蘿芷(pycnogenol)、鋸棕櫚(saw palmetto)、硒、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、酒石酸、硫代硫酸鹽、硫代甘油、硫代山梨糖醇、生育酚及其酯(例如生育酚乙酸酯、生育酚丁二酸酯、生育三烯酚(tocotrienal)、d-α-生育酚乙酸酯)、維生素A、B、C、D或E及其酯(例如維生素E醋酸酯)、鋅及其組合。

如本文中所使用，術語「界面活性劑」可指可保護膠原蛋白7蛋白質免受任何界面誘導之應激的試劑。界面活性劑之實例可包括(但不限於)聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)，聚氧化乙烯烷基醚，諸如Tween 20、Tween 80之泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙姆188、泊洛沙姆407。可保護膠原蛋白7組合物之其他化合物可包括糖，諸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖及乳糖；聚合物，諸如葡聚糖、羥乙基澱粉及聚乙二醇；及胺基酸，諸如甘胺酸、精胺酸(例如，L-精胺酸)、白胺酸及絲胺酸。

在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包含緩衝液系統、酸性組分或鹼性組分。緩衝液可為(但不限於)磷酸鹽緩衝液(例如，PBS)、乙酸鹽緩衝液或Tris緩衝液。酸性組分之實例包括磷酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸、草酸、丁二酸、酒石酸、乳酸、蘋果酸、乙醇酸及反丁烯二酸。鹼性組分之實例包括氫氧化鉀(KOH)及氫氧化鈉(NaOH)。酸性組分及鹼性組分用於調整調配物之pH。

如本文中所使用，術語「抗氧化劑」係指抑制氧化且因此用於預防因氧化製程導致之製劑劣化的試劑。抗氧化劑之實例可包括(但不限於)丙酮、硫酸氫鈉、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、檸檬酸、丁基化羥基大茴香醚、丁基化羥基甲苯、氫亞磷酸(hydrophosphorous acid)、單硫代甘油、沒食子酸丙酯、甲硫胺酸、抗壞血酸鈉、檸檬酸鈉、硫化鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、甲醛合次硫酸氫鈉(sodium formaldehyde sulfoxylate)、硫代乙醇酸、偏亞硫酸氫鈉、EDTA (乙二胺四乙酸鹽)、噴替酸鹽(pentetate)及一般熟習此項技術者已知之其他抗氧化劑。

其他醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，諸如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第20版, Gennaro編, Lippincott Williams & Wilkins (2000)中所描述之彼等亦可包括於本文中所描述之膠原蛋白7調配物中，其限制條件為其並不有害地影響調配物之所需特徵。

在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包含一或多種用於皮膚治療之活性劑。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物具有經降低之免疫原性。

在本發明之一個態樣中，包含膠原蛋白7組合物之醫藥組合物可調配為液體溶液，例如為液體水溶液。如本文中所使用之術語「水性」係指基於水之蛋白質調配物，但可視情況含有額外溶劑，例如少量之水混溶性溶劑。作為一非限制性實例，醫藥組合物為穩定液體溶液。

在一些實施例中，包含膠原蛋白7組合物之醫藥調配物為可注射的。若需要，則本方法之可注射膠原蛋白7組合物可進一步含有稀釋劑、助溶劑、pH調節劑、緩衝液、含硫還原劑、抗氧化劑、防腐劑或其類似者。用於本可注射組合物中之緩衝液可包括通常用作注射劑緩衝液之酸及其鹽或與鹼或其鹽混合之溶液，諸如磷酸、乙酸、鹽酸、鄰苯二甲酸、硼酸、檸檬酸、碳酸、丁二酸及其鹽，較佳地磷酸鹽緩衝液(磷酸一氫鈉-磷酸二氫鈉系統)及/或檸檬酸鹽緩衝液及/或乙酸鹽緩衝液。基於可注射組合物之總量，用於可注射膠原蛋白7組合物中之緩衝液濃度可為0-300 mM、或0至100 mM、或10至200 mM或30至250 mM，較佳地0-100 mM。本調配物及可注射組合物之pH可為6.5-7.4，較佳地6.8-7.2。

在一些實施例中，本發明之調配物適合於任何用途，諸如活體外及/或活體內使用。調配物可適合於經由任何投藥模式投與個體，包括(但不限於)皮下、靜脈內、吸入、皮內、經皮、腹膜內及肌肉內投與。本發明之調配物可用於治療個體之皮膚病(例如，RDEB)。

在一些實施例中，包含膠原蛋白7組合物之醫藥調配物尤其非常適合於單次劑量調配物或多次劑量調配物。多次劑量調配物為具有超過一次劑量之治療性膠原蛋白7組合物之調配物。醫療提供者及/或患者可投與來自多次劑量調配物之單次劑量，從而將將來投與之調配物之剩餘部分儲存於一或多個後續劑量中。本文中所揭示之多次劑量調配物之劑量數目可為約2至約50，較佳地約2至約40且更佳地約2至約25。亦涵蓋至少5、至少10及至少20次之劑量。特定劑量包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50次劑量之調配物。 投藥及給藥

根據本發明，包含由本生產系統產生之膠原蛋白7組合物的醫藥組合物及調配物可藉由此項技術中已知之任何適當途徑向有需要之個體投與，該途徑包括(但不限於)經口、非經腸(包括動脈內、靜脈內、皮下、腹膜內及肌肉內)注射或輸注、氣管(噴霧劑)、經鼻、直腸、氣管內、經肺(例如藉由吸入或吹入散劑或噴霧劑(包括利用噴霧器)、皮下(例如經由植入裝置)、顱內(例如，腦實質內)、表皮、局部(包括真皮、經皮、經黏膜、經頰、舌下及眼內)、經陰道、經黏膜、支氣管及經眼投藥。本發明之醫藥組合物及/或調配物可藉由超過一個途徑投與，此取決於是否需要局部或全身性治療及/或待治療之皮膚區域。若需要，可同時使用超過一個途徑。

在一些實施例中，投藥途徑可為局部的，諸如皮膚或眼之局部區域。在其他實施例中，投藥途徑可為全身性的，例如注射或輸注。

根據本發明之醫藥組合物通常以單位劑型調配以便於投藥及劑量之均一性。然而，應理解，本發明之組合物的總日用量可由主治醫師在合理醫學判斷範疇內決定。熟悉此項技術者應瞭解，某些因素可影響有效地治療個體所需之劑量及時序，包括(但不限於)疾病或病症之嚴重程度、先前治療、個體之一般健康及/或年齡以及其他所存在之疾病。此外，用治療有效量之組合物治療個體可包括單次治療或一系列治療。本發明所涵蓋之個別醫藥組合物之有效劑量及活體內半衰期的估算可使用習知方法或基於活體內測試使用適當動物模型來進行。舉例而言，在一些實施例中，適當劑量或量為足以將疾病嚴重程度指數評分降低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%或更大之劑量或量。

本文中所描述之調配物及劑量經設計以最大化疾病及病症之治療中之臨床功效，同時降低有害副作用或使其降至最低。

在一些實施例中，以治療有效量及/或根據與特定所需結果(例如，預防及/或治療大皰性表皮鬆解)相關之給藥方案投與本組合物。舉例而言，在一些實施例中，膠原蛋白7組合物之治療有效劑量可為介於每公斤個體體重0.1 mg至1,000 mg (例如約1 mg至1,000 mg、10 mg至1,000 mg、20 mg至1,000 mg、30 mg至1,000 mg、40 mg至1,000 mg、50 mg至1,000 mg、60 mg至1,000 mg、70 mg至1,000 mg、80 mg至1,000 mg、90 mg至1,000 mg、100 mg至1,000 mg、200 mg至1,000 mg、10 mg至900 mg、10 mg至800 mg、10 mg至700 mg、10 mg至600 mg、10 mg至500 mg、100 mg至1,000 mg、100 mg至900 mg、100 mg至800 mg、100 mg至700 mg、100 mg至600 mg、100 mg至500 mg、100 mg至400 mg、100 mg至300 mg、200 mg至900 mg)範圍內之量。在其他實施例中，治療有效劑量可為例如約0.001 mg/kg至500 mg/kg、例如約0.001 mg/kg至400 mg/kg、約0.001 mg/kg至300 mg/kg、約0.001 mg/kg至200 mg/kg、約0.001 mg/kg至100 mg/kg、約0.001 mg/kg至90 mg/kg、約0.001 mg/kg至80 mg/kg、約0.001 mg/kg至70 mg/kg、約0.001 mg/kg至60 mg/kg、約0.001 mg/kg至50 mg/kg、約0.001 mg/kg至40 mg/kg、約0.001 mg/kg至30 mg/kg、約0.001 mg/kg至25 mg/kg、約0.001 mg/kg至20 mg/kg、約0.001 mg/kg至15 mg/kg、約0.001 mg/kg至10 mg/kg。

總劑量可以呈連續劑量或其組合形式之單次劑量、多次劑量、重複劑量投與。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物可以單次日劑量投與，或總日劑量可以每日兩次、三次或四次之分次劑量投與。

單次劑量對任何特定表現型或症狀之效果可為持久的，以使得後續劑量以不超過3、4或5日時間間隔、或以不超過1、2、3或4週時間間隔、或以不超過1、2、3或4個月時間間隔投與。

在一些實施例中，包含由本生產系統產生之膠原蛋白7組合物之醫藥組合物及調配物可投與其壽命剩餘部分需要之患者。針對各投藥之投與時序間隔及劑量可根據患者之病狀(例如，皮膚病狀)來調整。在一個實例中，可長期投與醫藥組合物及調配物。長期投藥可包括在一段時間內(例如個體之壽命期間)投與超過一次劑量之試劑。膠原蛋白7組合物之濃度可在整個治療過程中維持在治療或預防地有效含量。

在一些實施例中，長期投藥之時間段可包括(但不限於)至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少6個月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少25年、至少30年、至少35年、至少40年、至少45年、至少50年、至少55年、至少60年、至少65年、至少70年、至少75年、至少80年、至少85年、至少90年或至少100年或1個月與100年之間的任何時間段。

舉例而言，給藥時序可包括每日一次、或每週一次、或每隔一週一次、或每月一次、或每隔一月一次、或每三個月一次、或每6個月一次、或每12個月一次、或每18個月一次、或每24個月一次、或每兩年一次或每5年一次。可每週兩次、每月兩次、或每隔一月兩次、或每三個月兩次、或每6個月兩次、或每12個月兩次、或每18個月兩次或每24個月兩次投與醫藥組合物。

作為一非限制性實例，長期投藥可包括一起提供有效量以緩解與EB，特定言之DEB (例如，DDEB及RREB)相關之至少一種症狀的一系列劑量。長期投藥可包括組合地提供有效量以治療、預防、防止EB，特定言之DEB (諸如DDEB或RDEB)之進展或延緩其發作的一系列劑量。可針對個體定製給藥時序，該給藥時序取決於若干因素，包括EB之類型(諸如DEB、DDEB或RDEB)，EB有關症狀之存在，患者之年齡、體重、一般健康、性別及飲食；投藥時間、投藥途徑及所採用之特定組合物之分泌速率；治療持續時間；與膠原蛋白7組合物組合或同時使用之藥物；及此項技術中熟知之類似因素。 rCol7組合物之應用

根據本發明，由本生產系統產生之膠原蛋白7組合物及其醫藥組合物或調配物可用於替換個體中，特定言之個體之皮膚中之膠原蛋白7物質。膠原蛋白7可隨後定位至皮膚之BMZ且形成錨定原纖維。膠原蛋白 7 含量之恢復

在本發明之一個態樣中，由本發明之宿主細胞及生產系統產生之膠原蛋白7組合物及其醫藥組合物及調配物可用於藉由將膠原蛋白7功能恢復至個體中野生型膠原蛋白7之正常功能性含量的20%至100%、30%至100%、40%至100%、50%至100%、60%至100%、70%至100%、80%至100%、90%至100%、30%至90%、40%至90%、50至90%、60-90%或70%至90%之範圍內來將有需要之個體中之膠原蛋白7恢復至功能性含量。

在一些實施例中，膠原蛋白7組合物可恢復皮膚之錨定原纖維，從而將皮膚之表皮層及真皮層固持在一起。治療用途

在本發明之一個態樣中，可利用包含膠原蛋白7組合物之醫藥組合物及調配物以治療皮膚病狀，例如與大皰性表皮鬆解(EB)相關之皮膚症狀。用於治療患有皮膚病症之個體的方法包含向患有皮膚病症之個體投與包含膠原蛋白7組合物之醫藥調配物，其中將組合物向個體全身性投與(例如，注射或輸注)。膠原蛋白7組合物可預防、緩解或抑制病症之皮膚症狀，例如皮膚創傷、起泡及疤痕等之進展。

皮膚病症可為由基因突變引起之遺傳病症，諸如大皰性表皮鬆解(EB)。大皰性表皮鬆解為一組遺傳性基因病狀，其中皮膚極脆弱且可由於缺少將皮膚之表皮及真皮層固持在一起之錨定蛋白質而容易起泡。水皰及皮膚糜爛自發地且回應於較小損傷或摩擦，諸如摩擦、擦傷或輕微創傷而形成。此外，作為慢性皮膚損傷之併發症，罹患EB之患者患有皮膚之惡性病(癌症)之風險增加。已在EB疾病中鑑別超過300種錨定蛋白質之突變。EB疾病可包括(但不限於)單純性大皰性表皮鬆解、接合性大皰性表皮鬆解、失養型水皰性表皮鬆解、大皰性表皮鬆解(致死性皮膚棘層鬆解(lethal acantholytic))及獲得性大皰性表皮鬆解。由編碼VII型膠原蛋白(膠原蛋白7)之COL7A1 基因之突變引起的失養型水皰性表皮鬆解(DEB) (顯性或隱性DEB)為大皰性表皮鬆解之最常見形式之一。此病狀之症狀在受影響個體中廣泛地變化。在輕度情況下，起泡可主要影響手、足、膝蓋及肘部。此病狀之嚴重情況涉及可導致視覺喪失、外貌損傷及其他嚴重醫學問題之分佈廣泛的起泡及疤痕。

在一些實施例中，包含膠原蛋白7組合物之醫藥組合物及調配物可用於預防、防止與DEB，包括顯性DEB (DDEB)及隱性DEB (RDEB)相關之一或多個症狀之進展或延緩其發作。與EB相關之症狀可包括(但不限於)皮膚病狀，諸如薄且乾燥之皮膚、開放性創傷(例如，慢性及非癒合性創傷)、起泡(輕度或重度)、疤痕、由慢性創傷引起之感染(繼發性皮膚感染)或皮膚癌(例如，鱗狀細胞癌)；收縮食道，諸如食道之慢性疤痕、蹼(webbing)及梗阻；攣縮，諸如屈曲攣縮(例如，四肢之屈曲攣縮)；手或足之假併指；尿道病變(例如，尿道狹窄)；黏膜病變；鱗狀上皮組織之病變；胃腸道之病變，諸如直腸或肛門病變；大泡形成，諸如人工創傷後大泡形成；指甲或牙齒變形；眼病症，諸如瞼炎及角膜疤痕；貧血、營養不良；敗血症；聲音嘶啞；包莖；吸收障礙；過敏及免疫缺乏症(例如，哮喘、過敏、濕疹或鼻炎症狀之增加頻率)；及發育不良。

在一些實施例中，相較於未經治療患者，用本發明之醫藥組合物治療可導致與DEB相關之一或多個症狀在20%至100%、或30%至100%、或35%至100%、或40%至100%、或45%至100%、或50%至100%、或55%至100%、或60%至100%、或65%至100%、或70%至100%、或75%至100%、或80%至100%、或85%至100%或90%至100%範圍內之改善。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物及調配物可用於治療其他皮膚病，包括(但不限於)非癒合性創傷、由皮膚癌造成之皮膚創傷、因糖尿病(諸如II型糖尿病)之皮膚創傷、衰老個體之慢性皮膚創傷、開放性創傷、因過敏性反應之皮膚創傷、手術創傷、由損傷引起之創傷、因個體之受限制移動導致之創傷、與器官移植相關之創傷及其他諸如暴露於日光、風、熱及冷等之損傷。

皮膚癌可包括(但不限於)光化性角化症(actinic keratosis)、非典型痣、基底細胞癌、黑素瘤(例如，淺表擴散性黑素瘤(superficial spreading melanoma)、結節性黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤(lentigo maligna melanoma)、肢端雀斑痣性黑色素瘤(acral lentiginous melanoma))、梅克爾細胞癌(merkel cell carcinoma)、鱗狀細胞癌、皮膚纖維肉瘤、皮膚淋巴瘤及非典型纖維黃色瘤(atypical fibroxanthoma)。

衰老個體之創傷可為慢性的及非癒合的。年齡有關病症可包括皮膚癌、糖尿病及其他病症。

過敏性反應可引起介於輕度至重度範圍內之明顯皮膚反應。因長期過敏性反應之常見症狀可包括濕疹。組合療法

在一些實施例中，本發明涵蓋將包含膠原蛋白7組合物之醫藥組合物與作為組合療法之一部分的一或多種額外試劑一起投與。本發明之膠原蛋白7組合物可在一或多種額外療法之前投與、與其同時投與或在其之後投與。在一個實施例中，預期用於治療大皰性表皮鬆解或改善與EB相關之臨床病狀的任何已知療法或治療劑可與本膠原蛋白7組合物一起使用。

例示性額外試劑及療法可包括(但不限於)抗生素、鎮痛劑、類鴉片(opioid)、抗病毒劑、抗炎劑、口服類固醇、營養補充劑或幫助管理疼痛及發癢之外用乳膏。

抗生素可包括(但不限於)阿克尼洛斯(Aknilox)、安必素(Ambisome)、阿莫西林(Amoxycillin)、氨苄西林、奧格門汀(Augmentin)、莫西沙星(Avelox)、阿奇黴素(Azithromycin)、百多邦(Bactroban)、必妥碘(Betadine)、裨乃膚(Betnovate)、磺胺醋醯潑尼松龍(Blephamide)、科賽斯(cancidas)、頭孢克洛(Cefaclor)、頭孢羥胺苄(Cefadroxil)、頭孢地尼(Cefdinir)、頭孢吡肟(Cefepime)、頭孢克斯(Cefix)、頭孢克肟(Cefixime)、頭孢西丁(Cefoxitin)、頭孢泊肟(Cefpodoxime)、頭孢丙烯(Cefprozil)、頭孢呋辛(Cefuroxime)、施複捷(Cefzil)、頭孢氨苄(Cephalexin)、頭孢唑林(Cephazolin)、頭孢他啶(Ceptaz)、氯胺苯醇、氯己定(Chlorhexidine)、氯黴素(Chloromycetin)、氯斯格(Chlorsig)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、克拉黴素(Clarithromycin)、克林達格爾(Clindagel)、克林達黴素(Clindamycin)、克林達特克(Clindatech)、氯唑西林(Cloxacillin)、克利斯汀(Colistin)、增效磺胺甲基異噁唑(Co-trimoxazole)、地美環素(Demeclocycline)、雙氯青黴素(Diclocil)、雙氯西林(Dicloxacillin)、多西環素(Doxycycline)、羥氨苄頭孢菌素(Duricef)、紅黴素、甲硝噠唑醇(Flagyl alcohol)、甲硝噠唑劑量、甲硝噠唑妊娠、甲硝噠唑副作用、甲硝噠唑治療、磺胺嘧啶銀(Flamazine)、氧氟沙星(Floxin)、新黴素B (Framycetin)、立思汀(Fucidin)、呋喃呾啶(Furadantin)、夫西地酸(Fusidic)、加替沙星(Gatifloxacin)、吉米沙星(Gemifloxacin)、依洛宋(Ilosone)、碘、左氟沙星(Levaquin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、羅黴樂(loceryl)、洛美沙星(Lomefloxacin)、美西肯(Maxaquin)、美福仙(Mefoxin)、美羅培南(Meronem)、米諾環素(Minocycline)、莫西沙星(Moxifloxacin)、乙胺丁醇(Myambutol)、抑黴菌素(Mycostatin)、新孢黴素(Neosporin)、乙基西梭黴素(Netromycin)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)、諾氟沙星(Norfloxacin)、諾利特(Norilet)、氧氟沙星(Ofloxacin)、頭孢地尼(Omnicef)、奧帕莫斯(Ospamox)、土黴素(Oxytetracycline)、帕瑞新(Paraxin)、青黴素、紐莫法(Pneumovax)、阿羅多黏(Polyfax)、聚維酮(Povidone)、利福定(Rifadin)、利福平(Rifampin)、利福昔明(Rifaximin)、衛非寧(Rifinah)、利米坦(Rimactane)、羅氏芬(Rocephin)、羅紅黴素(Roxithromycin)、環絲胺酸(Seromycin)、沙弗黴素(Soframycin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、司達非斯(Staphlex)、替考拉寧(Targocid)、四環素、四阿黴素(Tetradox)、亞甲離胺酸四環素(Tetralysal)、妥布黴素(tobramycin)、乙硫異菸胺(Trecator)、替加環素(Tygacil)、萬古黴素(Vancocin)、頭孢拉定(Velosef)、強力黴素(Vibramycin)、昔服申(Xifaxan)、撒共姆(Zagam)、齊特洛克(Zitrotek)、佐德姆(Zoderm)、加替沙星(Zymar)及利奈唑胺(Zyvox)。

抗病毒劑可包括(但不限於)阿巴卡韋(Abacavir)、阿西洛韋(Aciclovir)、阿昔洛韋(Acyclovir)、阿丹弗(Adefovir)、金剛胺(Amantadine)、安普那韋(Amprenavir)、安普利近(Ampligen)、阿比朵爾(Arbidol)、阿紮那韋(Atazanavir)、立普妥(Atripla)、波普瑞韋(Boceprevir)、西多福韋(Cidofovir)、可比韋(Combivir)、達盧那韋(Darunavir)、地拉韋啶(Delavirdine)、去羥肌苷(Didanosine)、多可沙諾(Docosanol)、依度尿苷(Edoxudine)、依法韋侖(Efavirenz)、恩曲他濱(Emtricitabine)、恩夫韋地(Enfuvirtide)、因提弗(Entecavir)、泛昔洛韋(Famciclovir)、福米韋生(Fomivirsen)、夫沙那韋(Fosamprenavir)、膦甲酸(Foscarnet)、膦乙醇(Fosfonet)、更昔洛韋(Ganciclovir)、伊巴他濱(Ibacitabine)、異丙肌苷(Imunovir)、碘苷(Idoxuridine)、咪喹莫特(Imiquimod)、茚地那韋(Indinavir)、肌苷(Inosine)、整合酶抑制劑、干擾素III型、干擾素II型、干擾素I型、干擾素、拉米夫定(Lamivudine)、咯匹那韋(Lopinavir)、洛韋胺(Loviride)、馬拉維若(Maraviroc)、嗎啉脒胍(Moroxydine)、美替沙腙(Methisazone)、奈非那韋(Nelfinavir)、奈韋拉平(Nevirapine)、多吉美(Nexavir)、核苷類似物、奧司他韋(Oseltamivir)、聚乙二醇化干擾素α-2a、噴昔洛韋(Penciclovir)、帕拉米韋(Peramivir)、普可那利(Pleconaril)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、蛋白酶抑制劑、雷特格韋(Raltegravir)、逆轉錄酶抑制劑、利巴韋林(Ribavirin)、金剛乙胺(Rimantadine)、利托那韋(Ritonavir)、普拉咪定(Pyramidine)、沙奎那韋(Saquinavir)、司他夫定(Stavudine)、茶樹油、替諾福韋(Tenofovir)、替諾福韋二吡呋酯(Tenofovir disoproxil)、替拉那韋(Tipranavir)、曲氟尿苷(Trifluridine)、曲利志韋(Trizivir)、曲金剛胺(Tromantadine)、特魯瓦達(Truvada)、伐昔洛韋(Valaciclovir)、纈更昔洛韋(Valganciclovir)、維克維若(Vicriviroc)、阿糖腺苷(Vidarabine)、偉拉咪定(Viramidine)、紮西他濱(Zalcitabine)、紮那米韋(Zanamivir)及齊多夫定(Zidovudine)。

抗炎劑可包括(但不限於)布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、阿司匹林(Aspirin)、雙氯芬酸(Diclofenac)、吲哚美辛(Indomethacin)、酮洛芬(Ketoprofen)、吡羅昔康(Piroxicam)、美洛昔康(Meloxicam)、舒林酸(Sulindac)及類固醇。

營養補充劑可包括(但不限於)鐵、鈣、維生素D、硒、肉鹼及鋅。

其他組合療法可包括(但不限於)校正異常運動之手術(例如校正手指或腳趾融合或關節之異常彎曲之手術)、食道擴張以改善進食能力之手術、植皮(skin graft)、基因療法、基於細胞的療法(例如，移植經工程改造以表現膠原蛋白7或功能變體之纖維母細胞)、骨髓移植、其他蛋白質代替療法及/或其組合。 等效物及範疇

熟習此項技術者將使用不超過常規實驗鑑別或能夠確定根據本文中所描述之本發明之特定實施例的許多等效物。本發明之範疇不意欲受限於以上描述，而係如隨附申請專利範圍中所闡述。

在申請專利範圍中，除非相反地指示或以其他方式自上下文顯而易見，否則諸如「一(a/an)」及「該」之冠詞可意謂一個(種)或超過一個(種)。除非相反地指示或以其他方式自上下文顯而易見，否則若一個、超過一個或所有群成員存在於、用於既定產物或製程中或以其他方式與既定產物或製程有關，則在該群的一或多個成員之間包括「或」的申請專利範圍或描述視為滿足。本發明包括其中群組中恰好一個成員存在於、用於既定產物或製程中或以其他方式與既定產物或製程有關的實施例。本發明包括其中超過一個或全部群組成員存在於、用於既定產物或製程中或以其他方式與既定產物或製程有關的實施例。

亦應注意，術語「包含」意欲為開放的且准許但不要求包括額外要素或步驟。當本文中使用術語「包含」時，亦因此涵蓋且揭示術語「由…組成」。

當給出範圍時，包括端點。此外，應理解，除非另外指示或以其他方式自上下文及一般熟習此項技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明之不同實施例中採用所陳述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確規定，否則達至該範圍下限之單位的十分之一。

另外，應理解，屬於先前技術內之本發明之任何特定實施例可明確地自申請專利範圍中之任一或多項排除。由於認為此等實施例為一般熟習此項技術者所已知，因此即使未在本文中明確地闡述排除亦可將其排除。出於任何原因，無論是否與先前技術之存在有關，本發明之組合物之任何特定實施例(例如任何抗生素、治療或活性成分；任何產生方法；任何使用方法；等)可自任何一或多個申請專利範圍中排除。

應理解，已使用之字語係描述性而非限制性之字語，且在不脫離本發明在其較廣泛態樣中之真實範疇及精神的情況下，在隨附申請專利範圍之範圍內作出改變。

儘管已相對於若干個所描述實施例以一定長度及一些特殊性描述了本發明，但並非意指本發明應受限於任何此等細節或實施例或任何特定實施例，而應參考隨附申請專利範圍進行解釋，以便考慮到先前技術提供對此等申請專利範圍之儘可能最廣泛的解釋，且因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。 實例  實例1：多肽表現構築體

遵循標準分子技術構築用於表現膠原蛋白7 α鏈多肽及增加膠原蛋白7於細胞中之表現之其他多肽的質體構築體。產生此等表現構築體之詳細方法描述於下文中。膠原蛋白 7 表現構築體

具有抗嘌呤黴素基因(Puro-) (pSVpuro-C+_EF1α(KOZAK-ext9) EGFP_BGHpA＞X-S*29)或抗潮黴素基因(Hygro-) (pSVhygro-C+_EF1α(KOZAK-ext9)EGFP_BGHpA＞X_29)之GFP表現質體用限制酶HindIII及Xbal消化。所得之兩個DNA片段接著藉由電泳分離且將來自各構築體之載體片段自凝膠中剪切出，轉移至1.5 mL微管中並且使用標準技術純化。9114 bp Puro載體帶及9552 bp Hygro載體帶分別自puro構築體及hygro構築體回收。

編碼膠原蛋白7 α鏈(膠原蛋白7A)之聚核苷酸藉由用HindIII及Xbal剪切質體而自基因技術質體(GeneArt plasmid) 11AAER3P_膠原蛋白7A_pMA切除。所得之兩個DNA片段藉由電泳分離且將對應於膠原蛋白7 α鏈(SEQ ID NO.: 25)之8870bp帶回收並且使用標準技術純化。

將所純化之8870bp膠原蛋白7A片段與9114 bp載體片段組裝以產生Puro_BT+_SLX-3631_膠原蛋白7A (SEQ ID NO.: 26)或與9552 bp載體片段組裝以產生Hygro_BT+_SLX-3631_膠原蛋白7A (SEQ ID NO.: 27)。遵循製造商說明書，藉由使用呈10 µL最終體積之LigaFast Rapid DNA接合系統(Promega，目錄號：M8221)將所純化載體片段(9114 bp Puro載體片段或9552 bp Hygro載體片段)與8870 bp膠原蛋白7A片段在室溫下接合5 min來製備構築體。接合混合物接著用於按照製造商說明書轉化50 μL勝任型DH5 α細胞(Invitrogen，目錄號：18265-017)。

藉由限制性酶切分析(restriction analysis)確認膠原蛋白7A表現質體之完整性及結構。將一種細菌純系在具有100 μg/mL氨苄西林之150 mL LB培養基中擴增且萃取蛋白質。使用PvuI-HF (NEB，目錄號：R3150L)將膠原蛋白7A構築體在37℃下線性化隔夜且用限制酶消化。將經消化之DNA定量且藉由電泳分離。如所預期，存在構築體Puro_BT+_SLX-3631_膠原蛋白7A (SEQ ID NO.: 26)之三種帶(15426個bp、1512 bp及1046 bp)且如所預期，存在構築體Hygro_BT+_SLX-3631_膠原蛋白7A (SEQ ID NO.: 27)之三種帶(15864 bp、1512 bp及1046 bp)。脯胺醯基 4- 羥化酶表現構築體

為產生hP4HA1構築體，GFP表現質體pBSK_ITR_CGAPD_EGFP_X29_ITR由HindIII消化以切除GFP序列。如上文所描述純化經消化之DNA。將所純化DNA使用DNA聚合酶(Roche)填充且使用標準技術純化，接著用Fsel消化。

來自HindIII/Fsel雙重消化之兩個DNA帶藉由電泳分離。將對應於載體之8584 bp帶回收且使用標準技術純化。

人類脯胺醯基4-羥化酶之α多肽I (hP4HAl_NM_000917)藉由PCR使用所填充之正向引子hP4HA1_Fw_HindIII(TACCGCCACCATGATCTGGTATATA TTAATTATAGGAATTCTGCT；SEQ ID NO.: 33)、反向引子hP4HA1_Rv_Fsel (TCATGGCCGGCCGCCCCGACTTATCATTCCAA TTCTGACAACGTACAA；SEQ ID NO.: 34)及人類正常組織之cDNA (Biochain Institute，編號：B110179)作為模板來擴增。將對應於人類P4HA1之1638 bp帶回收且使用標準技術純化。所純化之1638 bp PCR產物用Fsel消化且經進一步純化。

將1632 bp hP4HA1片段(SEQ ID NO. 28)與8584 bp載體片段組裝以產生pBSK_ITR_CGAPD_hP4HAl_X29_ITR (SEQ ID NO.: 29)。使所純化之hP4HA1及載體片段接合。全部接合混合物用於遵循製造商說明書轉化50 µL勝任型DH5 α細胞。藉由如上文所描述之限制性酶切分析檢查新產生之質體之完整性及結構。

將hP4HA1構築體pBSK_ITR_CGAPD_hP4HAl_ X29_ITR之樣品用PvuI-HF線性化且藉由用Xbol及Xbal消化來進一步驗證。將經消化之DNA定量且藉由電泳分離。如所預期，存在兩個片段(8780 bp及1440 bp)。

為產生hP4HB構築體，GFP表現質體pBSK_ITR_CGAPD_EGFP_X29_ITR用HindIII及Xbal消化。將對應於載體之8603 bp片段回收且如上文所描述進行純化。

人類脯胺醯基4-羥化酶之β多肽(hP4HB_NM_000918)藉由PCR使用正向引子hP4HB_Fw_HindIII (TCCCMGCTTACCG CCACCATGCTGCGCCGCGCTCT；SEQ ID NO.: 35)、反向引子hP4HB_Rv_Xbal (CTAGTCTAGATTATCACAGTTCATCTTTCACA GCTTTCTGA；SEQ ID NO.: 36)及人類正常組織之cDNA作為模板來擴增。將1559 bp PCR片段純化且藉由HindIII及Xbal消化。

將所得之1545 bp hP4HB片段(SEQ ID NO.: 30)與8603 bp載體片段組裝以產生pBSK_ITR_CGAPD_hP4HB_X29_ITR (SEQ ID NO.: 31)。將所純化之hP4HB及載體片段接合且用於轉化50 µL勝任型DH5 α細胞。藉由如上文所描述之限制性酶切分析檢查新產生之質體之完整性及結構。

將hP4HB構築體pBSK_ITR_CGAPD_hP4HB_X29_ITR之樣品用PvuI-HF線性化且藉由用Xbal及HindIII-HF消化來驗證。將經消化之DNA定量且藉由電泳分離。如所預期，存在兩個片段(8603 bp及1545 bp)。HSP47 、 hPEPD 及 COMSC 表現構築體

類似方法用於產生表現HSP 47之構築體。消化GFP表現質體pBSK_ITR_BT+_EGFP_X29_ITR。將對應於載體之片段回收且使用標準技術純化。將編碼人類HSP 47之核酸序列(SEQ ID NO.: 32)插入至載體片段以產生HSP 47表現構築體(pBSK ITRBT+SHSP47 X29 IT)。藉由如先前所描述之限制性酶切分析檢查質體之完整性及結構且最後定量質體。

人類脯胺酸酶編碼序列hPEPD (NM_000285)藉由PCR使用正向引子hPEPD_Fw_HindIII (TCCCAAGCTTACCGCCACCA TGGCGGCGGCCACCGGA；SEQ ID NO.: 37)、反向引子hPEPD_Rv_Xbal (CTAGTCTAGATTATCACTTGGGGCCAGAGAAGGGGGT；SEQ ID NO.: 38)及人類正常組織之cDNA作為模板來擴增。將1514 bp PCR產物純化且藉由HindIII及Xbal消化。將經回收之1500 bp hPEPD片段與8930 bp載體片段組裝以產生pBSK_ITR_BT+_hPEPD_X29_ITR。將所純化之hPEPD及載體片段接合在一起且用於轉化50 µL勝任型DH5 α細胞。藉由如先前所描述之限制性酶切分析檢查新產生之質體的完整性及結構且最後定量質體。

人類CIGALT1特異性伴隨蛋白1編碼序列(NM_001011551)藉由PCR使用所填充之正向引子COSMC_Fw_HindIII (TACCGCCACCATGCTTTCTGAAAGCAGCTCCTT；SEQ ID NO. 39)、反向引子COSMC_Rv_Xbal (CTAGTCTAGATTAGTCATTGTCAGAACC ATTTGGAGGT；SEQ ID NO.: 40)及人類正常組織之cDNA作為模板來擴增。將977 bp PCR產物純化且藉由Xbal消化。將經回收之968 bp hCOSMC片段與8930 bp載體片段(使用HindIII自pBSK_ITR_BT+_EGFP_X29_ITR質體剪切)組裝以產生pBSK_ITR_BT+_hCOSMC_X29_ITR。將所純化之hCOSMC及載體片段以10 µL之最終體積接合，接著用於轉化50 µL勝任型DH5 α細胞。藉由如先前所描述之限制性酶切分析檢查新產生之質體之完整性及結構。 實例2：生產用於產生重組膠原蛋白7之細胞株宿主細胞株及細胞培養物

將衍生自野生型CHO-K1細胞株(ATCC，目錄號：CCL-61)之無血清培養細胞庫(工作細胞庫，WCB)在無血清條件下培養且維持於補充有8 mM L麩醯胺酸(PAA，目錄號：M411-004)及l× HT補充劑(次黃嘌呤/胸苷補充劑) (Invitrogen，目錄號：41065)之SFM4CHO培養基(HyClone，目錄號：SH30548)中。藉由將5% CB5 (HyClone^TM ，Cell Boost^TM 補充劑(HyClone，目錄號：SH30865))添加至WCB之培養基中來產生研究細胞庫(research cell bank；RCB)以用於轉染。以2×10⁵ 個細胞/毫升之密度常規地接種細胞。測試且核准可轉染性及單細胞塗覆能力。此等備用於轉染之無血清懸浮液細胞培養物被稱作CHO-M細胞。

將CHO-M宿主細胞常規地培養於補充有8 mM L-麩醯胺酸、1×HT補充劑及5% CB5之SFM4CHO培養基中。將細胞在攪動(120 rpm，25 mm衝程)下維持於在37℃及5% CO₂ 下之含濕氣培養箱中。在轉染之前，補充有8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5之SFM4CHO培養基藉由將2 mL塗覆至6孔盤之一個孔中來預溫熱且在37℃、5% CO₂ 下培育。表現構築體 / 質體製備

如實例1中所詳細描述來製得構築體。將所有質體定量且藉由測序來進一步驗證。轉染 ( 池 #B1)

SGE Tech 1轉染系統用於細胞轉染(SELEXIS Inc.，USA)。將膠原蛋白7表現質體(攜帶抗嘌呤黴素卡匣)及脯胺醯基-4-羥化酶次單元A1及B (P4HA1及P4HB)之兩個質體按以下共轉染至CHO-M細胞(表3)中。GFP表現質體用作對照。表 3 ：用於SGEtech I轉染之質體

質體	量 ( 微克 / 轉移 )	DNA 濃度(ng/µL)	比率
Puro BT+ SLX3631 Col7A，Pvul，17984 bp	1.233	1838	5
pBSK ITR CGAPD hP4HAl X29 ITR，10220bp	0.139	4675	1
pBSK ITR CGAPD hP4HB X29 ITR，10148 bp	0.138	3176	1

在轉染程序之前即刻製備CHO-M細胞以最大化細胞存活率(96.0%存活率)及轉染效率。將細胞(5.l×10⁵ 個細胞/微孔(microporation))離心(400×g、5 min、室溫)且用無菌l× PBS洗滌。將細胞集結粒輕輕地再懸浮於再懸浮緩衝液R (MicroPorator Kit，MPK-1096)中達至1.7×l0⁷ c/mL之濃度。將100 µL體積之細胞懸浮液(每微孔)立即轉移至DNA管且小心地混合。細胞-DNA混合物藉由MicroPorator移液管(NanoEnTek Inc.，Korea)抽取且置放於移液管台中。在微孔(1130 V、20 ms及3次脈衝)後，將細胞轉移至預先製備之6孔盤且在37℃及5% CO₂ 下於靜態、含濕氣培育箱中培育隔夜。轉染效率藉由並聯使用GFP表現載體來控制(第二天進行之顯微檢測展示50-70%之間的正常轉染效率)。

在SGEtech I轉染後六(6)天，將細胞轉移至自旋管中且在含有抗生素之培養基(具有8 mM L-麩醯胺酸、l× HT、5% CB5及5 µg/mL嘌呤黴素(Sigma，目錄號：P-9620)之SFM4CHO培養基)中選擇。培養經轉染細胞且使用具有8 mM L-麩醯胺酸、l× HT、5% CB5及2.5 µg/mL嘌呤黴素之SFM4CHO培養基傳代。一個經轉染細胞池(池#B1)用於下一轉染。池 #B1 之超級轉染

來自SGEtech I轉染之池#B1之細胞接著用展示於表4中之質體另外轉染(作為超級轉染)。對於超級轉染，利用攜帶抗潮黴素之載體。將細胞(5.l×10⁵ 個細胞/轉染)與4.5 µg線性化DNA樣品合併於無菌反應管中。使用相同轉染方案(1130 V、20 ms及3次脈衝)。轉染效率藉由使用GFP表現載體來控制(正常轉染效率在50-70%之間)。表 4 ：用於池#B1之超級轉染之質體

質體	量 ( 微克 / 轉移 )	DNA 濃度 (ng/µL)	比率
Hygro BT+ SLX3631 Col7A，Pvul，18422 bp	1.228	3533	5
pBSK ITR CGAPD hP4HAl X29 ITR，10220 bp	0.136	4675	1
pBSK ITR CGAPD hP4HB X29 ITR，10148 bp	0.135	3176	1

在超級轉染之後，將細胞擴增至5 mL自旋管中。在補充有8 mM L-麩醯胺酸、l× HT及5% CB5之SFM4CHO培養基(包括2.5 g/mL嘌呤黴素)中培養十天之後，藉由將250 µg/mL潮黴素(Invivogen，目錄號：ant-hm-5)添加至培養基來啟動雙重選擇。在儲備之前，執行六次後續傳代(subsequent passage)。一個經轉染細胞池(池#B1STB)用於下一轉染。池 #B1STB 之超級轉染

池#B1STB之細胞用表現脯胺醯基4-羥化酶A及B次單元之載體(表5)及哺乳動物表現載體U5-PB再次轉染。對於各微孔，除GFP對照以外，在無菌反應管中製備3.4×10⁵ 個細胞及3 µg線性化DNA。使用相同轉染方案(1130 V；20 ms；3次脈衝)。表 5 ：用於池#B1STB之超級轉染之質體

質體	量 (微克 / 轉移 )	DNA 濃度 (ng/µL)	比率
U5_PB，6120 bp	0.693	2027	1
pBSK ITR CGAPD hP4HAl X29 ITR，10220 bp	1.158	4675	1
pBSK ITR CGAPD hP4HB X29 ITR，10148 bp	1.149	3176	1

在超級轉染II後十三天，將細胞擴增至5 mL自旋管中之補充有8 mM L-麩醯胺酸、1×HT及5% CB5而不含抗生素之SFM4CHO培養基中。在第14天，將250 µg/mL潮黴素及2.5 µg/mL嘌呤黴素添加至培養基中。

在14次後續傳代之後，將經轉染細胞冷凍保存。將一個經轉染細胞池(池#B1STBSTb)在包括250 µg/mL潮黴素及2.5 µg/mL嘌呤黴素之SFM4CHO培養基中進一步培養另外八代以用於另一超級轉染。池 #B1STBSTb 之超級轉染

來自池#B1STBSTb之細胞用針對hHSP47之表現載體(表6)進一步轉染。對於各微孔，除GFP對照以外，在無菌反應管中製備3.4×10⁵ 個細胞及3 µg線性化DNA樣品。使用相同轉染方案(1130 V；20 ms；3次脈衝)。表 6 ：用於池#B1STBSTb之超級轉染之質體

質體	量 ( 微克 / 轉移 )	DNA 濃度 (ng/µL)
U5_PB，6120 bp	0.500	2027
pBSK ITR BT+ SHSP47 X29 ITR，10205 bp	2.500	3629

在超級轉染III後九天，執行培養基交換且將200 µg/mL 2-磷酸基-L-抗壞血酸(Sigma，目錄號：49752)添加至已補充有8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5但無抗生素之SFM4CHO培養基。五天之後，將細胞擴增至5 mL自旋管中之補充有8 mM L-麩醯胺酸、l× HT及5% CB5之SFM4CHO培養基(包括250 µg/mL潮黴素及2.5 µg/mL嘌呤黴素)中。在包括250 µg/mL潮黴素及2.5 µg/mL嘌呤黴素之培養基中執行七次後續傳代以用於進一步分析。

進一步培養且擴增一個經轉染細胞池(池#B1STBSTbSTh2)。 實例3.篩檢單株細胞株3.1 篩檢池 #B1STBSTb

將池#B1STBSTb之細胞以100個細胞/毫升之濃度培養於半固體培養基(2× SFM4CHO培養基及包括8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5之甲基纖維素(CloneMatrix^TM ，Genetix，目錄號：K8510))中11天。挑選一百一十一種候選物且將其轉移至96孔盤中之補充有8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5之SFM4CHO培養基中。在7天內，候選物由斑點墨法(dot-blot)篩檢。進一步挑選18種超級轉染候選物且將其轉移至24孔盤。在另一7天內，24孔上清液由斑點墨法分析且將12種超級轉染候選物轉移至6孔盤中。

7天之後，將12種最高表現(基於斑點墨法)之超級轉染候選物全部擴增以在自旋管(5 mL工作體積)中懸浮培養且在5次後續傳代之後，擴增至搖瓶(20 mL工作體積)中之補充有8 mM L-麩醯胺酸、1×HT及5% CB5之SFM4CHO培養基中。在不添加抗生素之情況下執行所有此等擴增以供選擇。

儲備候選物，且比較在32℃下分批培養之各候選物之效能。細胞數目及存活率展示於表7中。藉由西方墨點測試蛋白質表現。圖1展示B1STBSTb第一輪候選物之第6天培養物之西方墨點的凝膠影像。表 7 ：在32℃下之池B1STBSTb候選物結果

純系候選物編號	細胞濃度 (c/mL) 第 3 天	存活率 (%) 第 3 天	細胞濃度 (c/mL) 第 6 天	存活率 (%) 第 6 天
B1STBSTb-cp01	8.39E+05	96.9	3.43E+06	96.3
B1STBSTb-cp03	1.47E+06	98.2	6.78E+06	97.3
B1STBSTb-cp16	1.19E+0 6	97.8	4.85E+06	96.0
B1STBSTb-cp17	1.00E+06	96.9	1.35E+05	3.4
B1STBSTb-cp18	7.61E+06	96.5	1.17E+07	96.0

將候選物純系B1STBSTb-cp03進一步培養並且遵循相同製程來選擇且選擇來自B1STBSTb-cp03之5個純系(表8)。圖2A及圖2B分別展示在32℃及37℃下來自第二輪選擇之純系之第6天培養物的西方墨點之凝膠影像。表 8 ：來自第二輪篩檢之細胞候選物(32℃及37℃)

純系候選物編號	32 ℃	37 ℃
細胞濃度 (c/mL) 第 6 天	存活率 (%) 第 6 天	細胞濃度 (c/mL) 第 6 天	存活率 (%) 第 6 天
B1STBSTbcp03-cp02	4.16E+06	90.43	1.06E+07	91.61
B1STBSTbcp03-cp03	2.22E+06	87.29	4.55E+06	86.05
B1STBSTbcp03-cp05	4.48E+06	95.34	9.80E+06	95.97
B1STBSTbcp03-cp07	6.18E+06	95.59	1.30E+07	94.90
B1STBSTbcp03-cp10	4.85E+06	93.09	1.23E+07	95.91

3.2 篩檢 池 #B1STBSTbSTh2

將池#B1STBSTbSTh2之細胞以100個細胞/毫升之濃度培養於半固體培養基(2× SFM4CHO培養基及包括8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5之甲基纖維素)中。挑選二十九種超級轉染候選物純系且將其轉移至96孔盤中之補充有8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5而不含用於選擇之抗生素之SFM4CHO培養基中。

在3天內，將29種生長之超級轉染候選物全部轉移至6孔盤(1 mL細胞懸浮液 + 2 mL新鮮生長培養基)。五天之後，藉由西方墨點分析6孔上清液且將3種展示最高表現之超級轉染候選物經擴增以在自旋管(5 mL工作體積)中懸浮培養。在不選擇之情況下，在補充有8 mM L-麩醯胺酸、1×HT及5% CB5之SFM4CHO培養基(外加200 µg/mL 2-磷酸基-L-抗壞血酸以用於第四代)中五次後續傳代之後，藉由自旋管上清液(5 mL工作溶液)之西方墨點篩檢細胞。接著將兩種顯示最高表現之超級轉染候選物擴增以在搖瓶(20mL工作體積)中之補充有8mM L-麩醯胺酸、1×HT及5% CB5而不含抗生素之SFM4CHO培養基中懸浮培養。

儲備兩種候選物B1STBSTbSTh2-cp13及B1STBSTbSTh2-cp15且比較在32℃及37℃下分批培養之效能。細胞數目及存活率展示於表8中。圖3為在32℃及37℃下B1STBSTbSTh2cp13及B1STBSTbSTh2cp15之第5天培養物之西方墨點的凝膠影像。表 9 ： B1STBSTbSTh2第一輪候選物結果

	32℃	37℃
純系候選物編號	細胞濃度 (c/mL) 第 5 天	存活率 (%) 第 5 天	細胞濃度 (c/mL) 第 5 天	存活率 (%) 第 5 天
B1STBSTbSTh2cp13	2.89E+06	96.9	5.58E+06	86.0
B1STBSTbSTh2cp15	3.60E+06	97.7	5.18E+06	89.3

將候選物純系B1STBSTbSTh2cp13及B1STBSTbSTh2cp15在半固體培養基(2× SFM4CHO培養基及包括8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5之甲基纖維素)中進一步培養且篩檢(在無抗生素選擇的情況下)。12天之後，使用ClonePix細胞菌落挑選器系統篩檢經塗覆菌落。挑選來自B1STBSTbSTh2cp13之32個純系及來自B1STBSTbSTh2cp15之30個純系，且將其轉移至96孔盤並且稍後轉移至6孔盤中之補充有8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5而不含用於選擇之抗生素的SFM4CHO培養基中。三(3)天之後，將所有經挑選細胞純系擴增至自旋管(5 mL工作體積)中。基於藉由西方墨點對自旋管上清液之分析，具有最大表現之來自BlSTBSTbSTh2cp13之3個純系及來自BlSTBSTbSTh2cp15之4個純系經選擇且擴增至搖瓶(20 mL工作體積)中之補充有8 mM L-麩醯胺酸、1× HT及5% CB5的SFM4CHO培養基(不含用於選擇之抗生素)中。

儲備所有細胞株(列於表10中)且比較在32℃及37℃下分批培養之此等細胞之效能。細胞數目及存活率展示於表10中。圖2A及圖2B分別展示在32℃及37℃下來自第二輪選擇之純系之第6天培養物的西方墨點之凝膠影像。表 10 ：來自第二輪篩檢之細胞候選物(32℃及37℃)

純系候選物編號	32 ℃	37 ℃
細胞濃度 (c/mL) 第 6 天	存活率 (%) 第 6 天	細胞濃度 (c/mL) 第 6 天	存活率 (%) 第 6 天
B1STBSTbSTh2cp13-cp01	3.03E+06	92.07	3.69E+06	83.15
B1STBSTbSTh2cp13-cp03	1.32E+06	90.90	4.12E+06	84.11
B1STBSTbSTh2cp13-cp10	1.64E+06	88.78	2.93E+06	73.91
B1STBSTbSTh2cp15-cp01	1.98E+06	93.26	3.75E+06	86.00
B1STBSTbSTh2cp15-cp07	2.19E+06	91.79	4.57E+06	90.80
B1STBSTbSTh2cp15-cp08	2.50E+06	87.18	4.70E+06	88.49
B1STBSTbSTh2cp15-cp09	2.52E+06	92.58	5.36E+06	92.53

將所有細胞株使用10% DMSO (Sigma，目錄號：D-2650)、45%經調節培養基及45%補充有8 mM L-麩醯胺酸、1×HT及5% CB5之新鮮SFM4CHO培養基冷凍保存，在-80℃下以6×10⁶ 個細胞/小瓶儲存於低溫箱(Nunc)中24小時且接著轉移至具有限制進入之液氮系統。

根據製造商之方案(Heipha，Caso-Bouillon TSB，編號：3080r)，使用無菌性之Veno® Gem支原體偵測套組(Minerva Biolabs，目錄號：11-1100)來測試且確認冷凍細胞是否缺失支原體(mycoplasma)。

以指定時間間隔監測細胞穩定性，包括解凍時之存活率、細胞生長及cDNA測序以及解凍後之功能性測試。 實例4：驗證用於rCol7產生之細胞純系#B1STBSTbcp03 (MCB)

由細胞純系#B1STBSTbcp03 (亦被稱作MCB細胞)產生之膠原蛋白7遵循ICH (人用藥品註冊技術要求國際協調會(International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use))安全性指南進行廣泛地測試。藉由南方墨點及rCol7 cDNA測序分析rCol7與MCB之一致性。所預期之8.9 kb rCol7片段存在於MCB中，但不存在於宿主CHO細胞中，從而確認MCB中存在rCol7編碼區(圖4)。藉由測序分析確認自rCol7 MCB分離之cDNA之核苷酸序列編碼rCol7。

測序結果展示在來自MCB之rCol7之核苷酸位置3097 (自ATG起始密碼子計數)之序列異質性。在3097之核苷酸殘基為天然G核苷酸(如同GenBank寄存編號NM_000094；SEQ ID NO.: 2)及在此位置觀測到之主導性核苷酸之T核苷酸的混合物(20.2% G及79.8% T)，從而導致異質rCol7多肽在膠原蛋白7多肽之密碼子1033處具有胺基酸殘基天冬胺酸(D) (由GAC編碼)及酪胺酸(Y) (由TAC編碼)。由於兩種rCol7表現構築體(Puro_BT+SLX3631_Col7A及Hygro_BT+SLX3631_Col7A)之核苷酸序列經確認以正確地編碼在位置1033之天冬胺酸(D)，因此推斷在導致MCB產生之細胞株產生製程期間引入所觀測之異質性。

此等結果指示MCB為雙株的或攜帶G3097或T3097重組膠原蛋白7序列之兩個相關純系之混合物。G:T序列之比率，且因此兩種純系之比率為大約1:4。由於核酸序列異質性，由rCol7 MCB產生之重組人類膠原蛋白7組合物亦為異質的，其包含D1033及Y1033之混合物，其中Y1033變體包含大約80%至90%之材料。

執行進一步評價以測試由MCB產生之rCol7材料之功能性。D1033Y異質性對rCol7結構及功能之潛在影響經由分子建模技術之組合來評價。結果確認所預期之物理化學特性(例如，分子量、脯胺酸羥基化、一級及二級結構)。藉由建立同源性模型(電子雜交(in silico ))，在位置1033之異質性不可能影響膠原蛋白VII之纖維結合蛋白III型重複序列9 (FNIII域FNIII R9)的β夾層摺疊。

為評價在位置1033之異質性對膠原蛋白7功能性之影響，針對MCB衍生之rCol7組合物(例如，MCB rCol7)量測若干重要屬性且與參考膠原蛋白7 (來自人類纖維母細胞)進行比較。此等分析包括在還原條件下利用西方墨點之一致性評估、藉由尺寸排阻HPLC (SE-HPLC)對多聚合狀態之評價、利用肽映射LC/MS之羥脯胺酸佔有率、經由差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry；DSC)對域完整性之生物物理評估、經由層黏連蛋白332結合分析之結合搭配物親和力評估及經由IncuCyte創傷癒合方法對創傷癒合之評估。

採用差示掃描量熱法(DSC)以評估MCB rCOL7之域完整性。DSC分析獲得參考膠原蛋白7及當前MCB衍生之rCol7組合物之可比結果，其中觀測到非常類似之域/子域熱轉變。在兩種材料中，膠原蛋白7之膠原性域在大約45℃下經歷最早熱轉變(Tm)，且非膠原性域(NC1)熔融轉變在大約68℃之溫度下發生。認為兩種材料內之中間熱轉變係膠原性域之子域，其中兩種材料中之類似轉變為49℃至50℃。

西方墨點分析指示就所觀測之主要條帶圖案(圖5)而言，rCol7產物一致性在參考膠原蛋白7與當前MCB衍生之rCol7組合物之間係相當的。

MCB rCol7樣品經改性、還原且半胱胺酸經由使用碘乙酸烷基化且接著在37℃下用胰蛋白酶消化14小時。經消化蛋白質藉由N糖苷肽酶(PNGase) F去糖基化。使用肽映射LC/MS分析肽混合物。結果指示rCol7一級序列之完整性。羥脯胺酸於MCB rCol7中之含量藉由在T724指示肽(VVGAPGVPGAPGER)內觀測到之羥脯胺酸之百分比來估算(Bulleid等人,The EMBO Journal , 1997, 第16 (22)卷: 6694-6701)。肽映射LC/MS結果指示羥脯胺酸佔有率在T274指示肽內之類似含量。

殘基1033位於膠原蛋白7之第九個纖維結合蛋白III型樣重複序列中，該重複序列已映射於層黏連蛋白332結合位點內(Chen等人,J Invest Dermatol ., 1999, 第112(2)卷: 177-183)。測定層黏連蛋白332結合親和力與MCB衍生之rCol7中之Y1033變體百分比之間的潛在相關性之評估指示參考膠原蛋白7及MCB rCol7之結合特徵，諸如最大結合含量及解離常數(Kd)為類似的(圖6)。因此，在胺基酸位置1033處存在之異質性似乎並不影響MCB衍生之rCol7組合物之層黏連蛋白332結合。

亦利用纖維結合蛋白(不存在於BMZ中之膠原蛋白7之額外結合搭配物)進行結合評估。

執行參考膠原蛋白7及MCB rCol7之活體外創傷癒合生物分析。測試結果在此等材料之間為類似的，從而指示在位置1033處存在之異質性並不有害地影響由此分析量測之生物功能(圖7)。

綜合而言，參考膠原蛋白7及MCB衍生之rCol7組合物之物理化學及功能性測試證實多種重要屬性上之類似性，從而指示對酪胺酸而非膠原蛋白7中在位置1033之天冬胺酸不具有顯著影響。 實例5：驗證純系#B1STBSTbSThcp13-01及#B1STBSTbSThcp13-03

細胞純系#B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03來源於兩輪符合工業標準以確保較高機率之單株性(亦即，單細胞來源)之選殖。自兩個純系分離之基因組DNA (gDNA)及cDNA之DNA序列分析確認存在符合野生型膠原蛋白7序列之單個核酸序列。此結果確認兩個細胞純系為單株的(亦即，衍生自單細胞祖細胞)且rCol7轉基因編碼如參考序列中所定義之兩個純系之原生膠原蛋白7 (人類膠原蛋白7，GenBank寄存編號NM_000094；SEQ ID NO.: 2)。南方墨點分析確認存在rCol7之8.9 Kb片段，從而指示rCol7編碼序列在兩個純系中為完整的(圖8)。一年之後，來自細胞庫之經培養細胞展示與參考Col7序列沒有差異。完整轉基因序列及轉錄物(mRNA)存在於兩個純系中。

如由以下穩定性測試所指示，來自兩個純系之細胞為穩定的。在不存在或存在選擇之情況下，將細胞培養至少30代。藉由膠原蛋白7之胞內染色及ELISA測試來測試膠原蛋白7產生(表11及圖9)。在不存在選擇之情況下，生產力下降(表11)，而在存在選擇之情況下生產力維持至少30代(表11)。膠原蛋白7之胞內染色確認不存在所觀測之額外亞群，從而指示兩個細胞株為穩定的(圖9)。表 11 ：用於細胞生產力之ELISA

比生產力( 皮克/ 細胞/ 天)
代數	B1STBSTbSThcp13-01	B1STBSTbSThcp13-03
0	1.1	1.5±0.1
30 (+)選擇	1.2±0.1	1.5±0.1
30 (-)選擇	0.9±0.1	0.8±0.1

藉由測序進一步確定，在來自B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03之rCol7組合物中未發現可偵測突變肽。藉由DSC映射，來自B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03之rCol7材料之生物物理特徵具有相同的展開溫度曲線(35℃至55℃)。 實例6：製程規模放大之細胞培養條件及生產力

成功的製程規模放大取決於測定、量測且監測關鍵的與規模無關之製程參數，隨後適當地設計並且操作設備以大規模傳遞彼等相同參數。將包括針對細胞擴增之細胞培養基之生物反應器條件最佳化以用於製程規模放大。使用基底細胞培養基，具有細胞強化5 (cell boost 5)、100XHT及抗壞血酸之CD OptiCHO™培養基(Thermo Fisher)。將細胞生長以30E6 vc/mL維持於10公升基於CD OptiCHO™培養基之培養物中，且純系B1STBSTbSThcp13-01之存活率歷經25天之培養始終高於85%。藉由ELISA，純系篩檢資料展示兩個純系B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03之生產力高於純系#B1STBSTbcp03 (表12)。純系B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03之宿主細胞蛋白質(Host cellular protein；HCP)定量亦高於MCB純系之彼宿主細胞蛋白質定量(圖10)。表 12 ： 膠原蛋白7生產力

培養基	純系	10 L 生物反應器生產力
CD CHO	MCB (B1STBSTbcp03)	12.5毫克/公升/天
OptiCHO	MCB (B1STBSTbcp03)	15毫克/公升/天
OptiCHO	B1STBSTbSThcp13-01	34毫克/公升/天
OptiCHO	B1STBSTbSThcp13-03	32毫克/公升/天

出於可擴展性挑戰，測試三個候選物純系。將細胞培養於400SW生物反應器中以用於製程規模放大。對於B1STBSTbcp03及B1STBSTbSThcp13-01，氧更新速率(oxygen update rate；OUR)分別為1.59E-10 (mmol O2/hr*vc)及3.09E-10 (mmol O2/hr*vc)。B1STBSTbSThcp13-03純系具有少於20%之生物質量及多於20%之O2流動速率。在入口處觀測到堆積，且兩個B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03純系在峰部處具有類似血球容積比(packed cell volume) (20-25%)。B1STBSTbcp03細胞具有均勻之保壓曲線(packing profile)及約20%之血球容積比(峰值)。初步資料支撐B1STBSTbSThcp13-01對於製程規模放大為較佳的。 實例7：使用製程規模縮小之下游純化製程以用於評估

為了遞送快速、高效及可靠之生產製程，使用規模縮小的實驗室模型測試下游純化製程。在重組治療性膠原蛋白7蛋白質之純化中，評價且最佳化下游製程以用於增加蛋白質純度及產率。製程包括以下步驟：

1.收集細胞培養材料(UPB)；在此研究中，使用來自各純系之混合且彙集之培養材料；

2.使用UV-C及化學品(例如，Triton)使病毒在細胞培養材料(UPB)中不活化；

3.經由Capto^TM 核心流式層析法(core flow chromatography)及瓊脂糖層析法過濾所處理之UPB；

4.病毒過濾；

5.使用膜材料執行最終超濾(UF)及滲濾(DF)。在此測試研究中，使用兩級100KD UF/DF (例如，100KD C-篩檢PES (聚醚碸)膜)。替代地，使用單級UF/DF (例如，30KD A-篩檢PES膜)。

6.經由0.2 µm膜過濾最終產物。表 13 ： 下游純化產率

產率	Eng 輪次	GMP1	GMP 2	GMP 3	B1STBST bcp03	B1STBSTbSThc p13-01	B1STBSTbSThc p13-03
規模縮小之輪次編號	RDD 230	RDD 223A	RDD 223B	RDD 228	RDD229C	RDD229A	RDD229B
總生物反應器HCP (ng/mL)	4,430,647	6,850,255	6,763,275	5,722,765	2,096,560 ~ 7,514,280	13,343,216	14,981,835
UPB效價(ng/mL)	88,000	59,990	87,000	72,000	143,419	208,000	134,000
UPB HCP (ng/mL)	40,104	52,555	49,243	37,825	170,160	339,140	406,110
UPB rC7:HCP	2.19	1.14	1.77	1.90	0.84	0.61	0.33
HCP ppm	455,727	876,063	566,011	525,347	1,186,454	1,630,481	3,030,672
最終UF/DF步驟產率	22%	54%	48%	61%	77%	70%	40%
總體製程	20%	12%	27%	18%	35%	24%	35%

與ENG (88,000 ng/mL)及GMP相比，來自純系B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03之UPB具有顯著較高之效價(針對純系13-01之208,000 ng/mL及針對純系13-03之134,000 ng/mL) (表13)。類似地，與ENG及GMP相比，來自細胞純系之HCP顯著較高。各純系中藥物物質之HCP含量為相當的且低於規格。

使用單級30KD UF/DF或兩級100KD UF/DF製程，測試下游純化產率為相當的。對於全部三個純系，當前下游製程具有相當的產率，但B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbcp03具有較高之最終UF/DF產率(表13)。

如表14中所展示來評價來自規模縮小製程之藥物物質品質屬性。來自細胞純系之藥物物質之其他屬性，諸如外觀、生物負荷、內毒素、滲透壓度及Ph與參考標準相當。來自按規模輪次及400SW生物反應器之分析結果為類似的(資料未展示)。表 14 ：來自規模縮小製程之藥物物質品質屬性

藥物物質屬性	B1STBSTbcp03 (10 L 規模縮小 UPB)	B1STBSTbSThcp13-01 (10 L 規模縮小 UPB)	B1STBSTbSThcp13-03 (10 L 規模縮小 )
Solo VPE之蛋白質濃度(A280)	0.77	0.49	0.43
HCP (ng/mg)	900	592	1281
SE-HPLC之大小(HMW：≤25.0%)	8.2	4.4	5.1
SE-HPLC之大小(主峰：≥40.0%)	74.2	78.6	62.7
SE-HPLC之大小(LMW：報導結果)	17.6	17.0	32.2
纖維結合蛋白結合之效能	＞ 100%	56%	81%
IncuCyte創傷癒合之效能	90%	116%	113%
產物異質性：在位置1033之Y% (肽映射)	/	＜ LOD	＜ LOD
羥基化：T274指示劑之佔有率% (肽映射)	/	78.4	81.8
羥基化：T274指示劑之三重佔有% (肽映射)	/	47.1	52.9
藥物物質中之rCol7含量(CHO Col 7比rCol7之平均%)	/	1.18	1.38

藉由ELISA對兩個純系#B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03量測來自生物反應器及UPB之較高總HCP。儘管藉由MS方法對來自B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03細胞株之藥物物質量測所增加之CHO C7含量(表15)，但利用ELISA方法，藥物物質中之HCP含量在三個細胞純系之規模縮小輪次之間為相當的(表14)。表 15 ：來自細胞株之藥物物質中之CHO Col7含量

藥物物質	Col 7 對照 ( 纖維母細胞)	B1STBSTbcp03 (PUR034M01)	GMP1 (RDD223A)	B1STBSTbcp03 (10L)	B1STBSTbSThcp13-01	B1STBSTbSThcp13-03
平均值 (CHO Col7比rCol7%)	0	1.67	0.10	/	1.18	1.38

此等結果表明#B1STBSTbSThcp13-01之生產力可為＞20毫克/公升/天。由細胞純系產生之rCol7含有天然膠原蛋白7 (圖11)。藉由測序重組蛋白未發現來自B1STBSTbSThcp13-01及B1STBSTbSThcp13-03之rCol7之可偵測突變多肽。細胞株為穩定的且適合於規模放大細胞培養。總體下游純化產率及藥物物質屬性與標準參考材料相當。來自B1STBSTbSThcp13-01細胞株之藥物物質之其他功能(例如，利用IncuCyte創傷癒合分析及纖維結合蛋白結合之效能)與參考標準相當(表14)。在以下實例中論述詳細結果。 實例8：來自所選單株宿主細胞之rCol7序列驗證

自經工程改造之重組宿主細胞純系提取總RNA內含物且遵循標準程序進行定量。亦分析RNA提取物之品質。目標轉錄物(序列經歷序列驗證)使用RT-PCR (逆轉錄酶介導之PCR)及RACE-PCR (cDNA末端快速擴增-PCR)來富集。

擴增產物(擴增子)經建構以產生各擴增子之DNA庫。使各DNA庫經獨特地條碼化以用於取樣追蹤及鑑別。在完成DNA庫建構(Agilent 2100生物分析儀高靈敏度DNA套組)後，評估各DNA庫之DNA片段長度之平均值。

最終DNA庫使用SYBR-QPCR (基於SYBR Green之定量聚合酶鏈反應)定量且分析以測定DNA濃度。將最終DNA庫改性、稀釋、組合在一起，且藉由下一代測序(Next Generation Sequencing；NGS) (Illumina ® MiSeq® NGS平台)來測序。

序列資料藉由映射及比對針對參考rCol7序列(SEQ ID NO.: 25；rCol7構築體中之膠原蛋白7插入)之RT-PCT及RACE-PCR資料集來分析。

初步RACE-PCR映射資料指示大約80%之讀取群體映射至參考基因組且在100%類似性下比對獲得100%參考覆蓋率，其中未偵測到可報導變體。

圖1為來自B1STBSTb細胞純系第一輪候選物之第6天培養物之細胞之西方墨點的凝膠影像(在32℃下)。

圖2A為來自在32℃下第二輪選擇之細胞純系之第6天培養物的細胞之西方墨點之凝膠影像。

圖2B為來自在37℃下第二輪選擇之細胞純系之第6天培養物的細胞之西方墨點之凝膠影像。

圖3為來自在32℃及37℃下B1STBSTbSTh2cp13及B1STBSTbSTh2cp15細胞純系之第5天培養物的細胞之西方墨點之凝膠影像。

圖4為來自細胞純系B1STBSTbcp03 (主細胞庫(Master Cell Bank；MCB))之rCol7之南方墨點分析的代表性影像，以用於確認一致性。來自rCol7 MCB (色帶2)及未經轉染之CHO細胞(色帶3)之基因組DNA用HindIII/XbaI酶消化且使用rCol7編碼序列雜交探針藉由南方墨點法(Southern blotting)分析。雜交帶之預期大小為8.9 kb。色帶1：HindIII大小標記物。

圖5為參考膠原蛋白7 (色帶2)及MCB衍生之rCol7組合物(色帶3)之西方墨點分析的影像。色帶1：分子量階梯。

圖6展示層黏連蛋白332結合Kd對比於Y1033於參考膠原蛋白7以及若干種MCB衍生之rCol7組合物中之百分比分數的曲線。分析指示層黏連蛋白332結合反應與rCol7Y1033含量不具有相關性。

圖7為使用具有參考膠原蛋白7之角質細胞及MCB衍生之rCol7組合物的創傷癒合分析。在分析中亦包括BSA對照樣品。

圖8表明完整轉基因轉錄物存在於純系B1STBSTbSThcp13-cp01 (13-01)及B1STBSTbSThcp13-cp03 (13-03)兩者中。轉錄物使用對膠原蛋白7之NC1及TH3區域具有特異性之探針來印跡。

圖9描繪膠原蛋白7於純系B1STBSTbSThcp13-cp01及B1STBSTbSThcp13-cp03中之胞內染色。

圖10表明細胞純系B1STBSTbSThcp13-cp01及B1STBSTbSThcp13-cp03之HCP定量。

圖11表明rCol7組合物與細胞純系B1STBSTbSThcp13-cp01 (色帶8)及B1STBSTbSThcp13-cp03 (色帶7)之SDS-PAGE一致性。色帶1為MW標準品且色帶2至6為分析對照。

Claims (44)

1. 一種用於產生膠原蛋白7組合物之生產系統，其包含經修飾以表現人類重組膠原蛋白7 (rCol7)及/或其功能變體之宿主細胞， 其中該等宿主細胞經修飾以表現： (a)人類膠原蛋白7 α鏈多肽及/或其功能變體， (b)脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體，及 (c)脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體， 且其中該膠原蛋白7組合物包含人類rCol7、人類膠原蛋白7之功能變體或其組合。
2. 如請求項1之生產系統，其中該等宿主細胞經修飾以包含： (a)至少一種編碼重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之第一外源性聚核苷酸； (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸；及 (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸。
3. 如請求項2之生產系統，其中該等宿主細胞經進一步修飾以包含： (d)編碼重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之第二外源性聚核苷酸，其中該第二外源性聚核苷酸包含： (i)與編碼重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第一外源性聚核苷酸之核酸序列相同的核酸序列；或 (ii)與編碼重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第一外源性聚核苷酸之核酸序列不同的核酸序列。
4. 如請求項3之生產系統，其中該第一外源性聚核苷酸及該第二外源性聚核苷酸包含不同選擇標記物。
5. 如請求項3之生產系統，其中該等宿主細胞經修飾以包含： (a)編碼該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第一外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 25之核酸序列， (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 28之核酸序列， (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該β多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 30之核酸序列，及 (d)編碼該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第二外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 25之核酸序列。
6. 如請求項3之生產系統，其中該等宿主細胞經修飾以包含： (a)編碼該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第一外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 26之核酸序列， (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 29之核酸序列， (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該β多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 31之核酸序列，及 (d)編碼該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第二外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 27之核酸序列。
7. 如請求項1之生產系統，其中經修飾宿主細胞經修飾以包含： (a)用於表現重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之第一載體； (b)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體之載體；及 (c)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之載體。
8. 如請求項7之生產系統，其中該等宿主細胞經進一步修飾以包含： (d)用於表現重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之第二載體。
9. 如請求項8之生產系統，其中該等宿主細胞經修飾以包含： (a)用於表現該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第一載體，其包含SEQ ID NO.: 26之核酸序列， (b)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體之該載體，其包含SEQ ID NO.: 29之核酸序列， (c)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之該載體，其包含SEQ ID NO.: 31之核酸序列，及 (d)用於表現重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第二載體，其包含SEQ ID NO.: 27之核酸序列。
10. 如請求項1之生產系統，其中脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽為α-1、α-2或α-3多肽。
11. 如請求項10之生產系統，其中脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽為該α-1多肽。
12. 如請求項1至11中任一項之生產系統，其中該等宿主細胞為選自由以下組成之群之哺乳動物細胞：纖維母細胞、角質細胞、CHO細胞、HEK293細胞、C127細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞及MDCK細胞；或其後代。
13. 如請求項12之生產系統，其中該等經修飾宿主細胞係培養在無血清培養基中。
14. 一種用於產生膠原蛋白7組合物之生產系統，其包含經修飾以表現人類重組膠原蛋白7 (rCol7)及/或其功能變體之宿主細胞， 其中該等宿主細胞經修飾以表現： (a)人類膠原蛋白7 α鏈多肽及/或其功能變體， (b)脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體， (c)脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體，及 (d)熱休克蛋白47或其功能變體， 且其中該膠原蛋白7組合物包含人類rCol7、人類膠原蛋白7之功能變體或其組合。
15. 如請求項14之生產系統，其中該等宿主細胞經修飾以包含： (a)至少一種編碼重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸； (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸； (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸；及 (d)編碼熱休克蛋白47或其功能變體之外源性聚核苷酸。
16. 如請求項15之生產系統，其中該等宿主細胞經修飾以包含： (a)編碼該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 25之核酸序列， (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 28之核酸序列， (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該β多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 30之核酸序列，及 (d)編碼熱休克蛋白47或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 32之核酸序列。
17. 如請求項14之生產系統，其中該等經修飾之宿主細胞經修飾以包含： (a)用於表現該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之載體； (b)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽或其功能變體之載體； (c)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之該β多肽或其功能變體之載體，及 (d)用於表現該熱休克蛋白47或其功能變體之載體。
18. 如請求項17之生產系統，其中該等宿主細胞經修飾以包含： (a)用於表現該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該載體，其包含SEQ ID NO.: 26或SEQ ID NO.: 27之核酸序列， (b)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽或其功能變體之該載體，其包含SEQ ID NO.: 29之核酸序列， (c)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之該β多肽或其功能變體之該載體，其包含SEQ ID NO.: 31之核酸序列，及 (d)用於表現該熱休克蛋白47或其功能變體之該載體，其包含SEQ ID NO.: 32核酸序列。
19. 一種用於產生包含人類rCol7及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞經轉化以表現： (a)人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體； (b)脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體，其中脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽為α-1、α-2或α-3多肽；及 (c)脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體。
20. 如請求項19之經修飾宿主細胞，其中脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽為α-1多肽或其功能變體。
21. 如請求項20之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞經修飾以包含： (a)至少一種編碼重組人類膠原蛋白7或其功能變體之第一外源性聚核苷酸； (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之α-1多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸；及 (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸。
22. 如請求項21之經修飾宿主細胞，其進一步包含 (d)編碼重組人類膠原蛋白7或其功能變體之第二外源性聚核苷酸，其中該第二外源性聚核苷酸包含： (i)與編碼重組人類膠原蛋白7或其功能變體之該第一聚核苷酸之核苷酸序列相同的核苷酸序列；或 (ii)與編碼重組人類膠原蛋白7或其功能變體之該第一聚核苷酸之核苷酸序列不同的核苷酸序列。
23. 如請求項22之經修飾宿主細胞，其中該第一外源性聚核苷酸及該第二外源性聚核苷酸包含不同選擇標記物。
24. 如請求項22之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞經修飾以包含： (a)編碼該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第一外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 26之核酸序列， (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 29之核酸序列， (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該β多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 31之核酸序列，及 (d)編碼該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第二外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 27之核酸序列。
25. 如請求項19之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞包含： (a)用於表現重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之第一載體； (b)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體之載體，其中該α多肽為α-1、α-2或α-3多肽；及 (c)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之載體， 其中該脯胺醯基4-羥化酶增加重組人類膠原蛋白7之表現。
26. 如請求項25之經修飾宿主細胞，其中脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽為α-1多肽或其功能變體。
27. 如請求項26之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞進一步包含： (d)用於表現重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之第二載體。
28. 如請求項27之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞包含： (a)用於表現該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第一載體，其包含SEQ ID NO.: 26之核酸序列， (b)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體之該載體，其包含SEQ ID NO.: 29之核酸序列， (c)用於表現脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之該載體，其包含SEQ ID NO.: 31之核酸序列，及 (d)用於表現重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該第二載體，其包含SEQ ID NO.: 27之核酸序列。
29. 如請求項19至28中任一項之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞為選自由以下組成之群之哺乳動物細胞或其後代：纖維母細胞、角質細胞、CHO細胞、HEK293細胞、C127細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞及MDCK細胞。
30. 如請求項29之經修飾宿主細胞，其中該細胞為CHO細胞或CHO細胞之後代。
31. 一種用於產生包含人類rCol7及/或其功能變體之膠原蛋白7組合物之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞經轉化以表現： (a)人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體； (b)脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體，其中脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽為α-1、α-2或α-3多肽； (c)脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體；及 (d)熱休克蛋白47或其功能變體。
32. 如請求項31之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞經修飾以包含： (a)至少一種編碼重組人類膠原蛋白7或其功能變體之外源性聚核苷酸； (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之α-1多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸； (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體之外源性聚核苷酸；及 (d)編碼熱休克蛋白47之外源性聚核苷酸。
33. 如請求項32之經修飾宿主細胞，其中該宿主細胞經修飾以包含： (a)編碼該重組人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 25之核酸序列， (b)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 28之核酸序列， (c)編碼脯胺醯基4-羥化酶之該β多肽或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 30之核酸序列，及 (d)編碼熱休克蛋白47或其功能變體之該外源性聚核苷酸，其包含SEQ ID NO.: 32之核酸序列。
34. 一種人類膠原蛋白7組合物，其中該膠原蛋白7組合物由包含表現以下之經修飾宿主細胞之生產系統產生： (a)人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體， (b)脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體，其中脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽為α-1、α-2或α-3多肽，及 (c)脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體， 其中該脯胺醯基4-羥化酶增加該等宿主細胞中之膠原蛋白7表現。
35. 如請求項34之膠原蛋白7組合物，其中該等經修飾宿主細胞進一步表現： (d)熱休克蛋白47或其功能變體。
36. 一種包含人類膠原蛋白7組合物及至少一種醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物，其中該膠原蛋白7組合物包含由包含表現以下之經修飾宿主細胞的生產系統產生之人類rCol7： (a)人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體， (b)脯胺醯基4-羥化酶之α多肽或其功能變體，其中脯胺醯基4-羥化酶之該α多肽為α-1、α-2或α-3多肽，及 (c)脯胺醯基4-羥化酶之β多肽或其功能變體， 其中該脯胺醯基4-羥化酶增加該等宿主細胞中之膠原蛋白7表現。
37. 如請求項36之醫藥組合物，其中該等經修飾宿主細胞進一步表現： (d)熱休克蛋白47或其功能變體。
38. 一種用於產生人類膠原蛋白7組合物之方法，其包含： (a)將宿主細胞培養於無血清培養基中，其中該等宿主細胞經修飾以表現， (i)人類膠原蛋白7 α鏈多肽或其功能變體； (ii)脯胺醯基4-羥化酶或其功能變體，其中該脯胺醯基4-羥化酶包含α脯胺醯基4-羥化酶多肽及β脯胺醯基4-羥化酶多肽，及 (iii)熱休克蛋白47或其功能變體；及 (b)收集該培養基，及 (c)純化該人類膠原蛋白7組合物。
39. 一種包含人類rCol7之醫藥組合物的用途，其用於製造用於預防個體皮膚病狀、防止皮膚病狀之進展、改善皮膚病狀及/或延緩皮膚病狀發作之藥劑， 其中rCol7係經工程改造以表現以下之細胞產生：人類膠原蛋白7 α鏈多肽及/或其功能變體，及脯胺醯基4-羥化酶或其功能變體；該脯胺醯基-4-羥化酶由α羥化酶多肽及β羥化酶多肽組成。
40. 如請求項39之用途，其中rCol7係經工程改造以表現以下之細胞產生：(a)人類膠原蛋白7 α鏈多肽及/或其功能變體；(b)脯胺醯基4-羥化酶或其功能變體；該脯胺醯基-4-羥化酶由α羥化酶多肽及β羥化酶多肽組成；及(c)熱休克蛋白47或其功能變體。
41. 如請求項39或40之用途，其中該個體經診斷患有失養型水皰性表皮鬆解(dystrophic epidermolysis bullosa)。
42. 如請求項41之用途，其中診斷患有DEB之個體之該皮膚病狀包括敏感及乾燥之皮膚、開放性皮膚創傷、慢性及非癒合性創傷、起泡(輕度或重度)、疤痕及由慢性創傷引起之皮膚感染。
43. 如請求項42之用途，其中該藥劑用於經由靜脈內注射投與。
44. 如請求項42之用途，其中該藥劑用於藉由局部施用投與至皮膚創傷之位點。

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