TW202031285A - 用於nash之化合物 - Google Patents

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湯瑪斯 克魯斯
多特 霍爾斯特
伊莉莎白 道格拉斯 蓋爾斯蓋德
珍妮 路易斯 艾格喬魯 諾林
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Abstract

本發明係有關用於預防及/或治療NASH之化合物。本發明進一步有關於一種向有需要的個體投予本發明之化合物而預防及/或治療NASH之方法。本發明之該等化合物已顯示出可有效降低相對肝臟重量（佔總體重的百分比）、脂肪變性、肝臟發炎及肝臟纖維化。

Description

用於NASH之化合物
本發明係有關用於預防及/或治療非酒精性脂肪性肝炎(NASH)之化合物。 ［序列表之引用併入］ 序列表
本發明係與一電子形式之序列表一起提交。序列表之全部內容特此以引用之方式併入。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是西方國家及美國最常見的慢性肝病，其中有30%的成年人口患有NAFLD。肥胖症係與NAFLD的風險增加相關，該風險隨BMI升高而增加。再者，患有第2型糖尿病的患者的風險上升達70%至75%。非酒精性脂肪肝(NAFL)的定義為沒有發炎或纖維化的單純脂肪變性，如果不加以治療，其可發展為NASH。大約20%至30%的單純脂肪變性患者發展為NASH，其定義為出現帶有不同纖維化程度的脂肪變性、小葉發炎、肝細胞腫脹變性，其在肝臟中可發展為纖維性結瘢組織，最終導致肝硬化及肝細胞癌(HCC)。大約10%的NASH患者會發展為肝硬化，這使NASH在美國成為第三大最常見的肝移植病因，並預計在2030年成為主要的肝移植病因。
NASH的發展：單純脂肪變性是發展NASH的先決條件且被視為是「第一擊」。肥胖症及胰島素抗性在肝臟脂肪變性的發展中扮演重要角色。肝臟的胰島素抗性有利於肝臟內生性脂質合成，且脂肪組織（尤其是內臟脂肪）中的胰島素抗性會導致游離脂肪酸(FFA)從脂肪組織流向肝臟的流量增加。脂肪肝發展為NASH的原因尚未完全了解，但可能涉及遺傳因素及環境因素。這類因素包含糖尿病、脂毒性、氧化壓力、促炎細胞介素及腸道微生物菌群（內毒血症），並被提出在NASH的發展中扮演著關鍵角色。這些因素被認為是造成「第二擊」的原因。促炎性微環境導致肝臟星狀細胞的活化，其特徵為類維生素A耗盡以及纖維化。晚期肝纖維化會導致正常肝結構的廣泛畸變及肝功能喪失（肝硬化及肝細胞癌）。
診斷及當前治療選項：NASH的早期階段是無症狀的。然而，若其發展為代償不全肝硬化，肝永久性受損，則會出現症狀。症狀包含疲勞、原因不明的體重減輕、腹痛、腫脹、淤血及血便。在這一點上，肝衰竭、肝細胞癌及與肝臟有關的死亡的風險顯著增加。再者，脂肪肝發展為NASH會增加心血管疾病及死亡率的風險。在臨床上，NASH的診斷需要通過生物檢體（包含是否出現腫脹、小葉發炎及脂肪變性）進行組織學確認，並且臨床上應排除每天消耗＞20 g乙醇。目前，沒有任何生物標記或掃描可以可靠地做為診斷工具，肝臟組織學是區分NASH與脂肪肝的唯一方法。肝臟生物檢體被認為是診斷及治療結果的黃金標準。鑒於肝臟的再生能力，若在結瘢太晚期之前開始相關的治療，則認為NAFL及NASH皆為可逆的。迄今為止，當到了肝病末期時，除肝臟移植之外，沒有針對NAFLD或NASH的特異性療法。
於一些態樣中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物係選自以下所組成之群：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。
於一些態樣中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物係選自以下所組成之群：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。
本發明之該等化合物可有用於治療NASH。本發明之該等化合物可有用於預防及/或延緩NASH。本發明之該等化合物可有用於預防、延緩及/或降低肝臟損傷、肝臟發炎及/或肝臟纖維化。
本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物係選自以下所組成之群：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。
本發明進一步有關於一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物係選自以下所組成之群：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物為
Figure 02_image001
。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物為
Figure 02_image003
。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中所述用途係預防及/或延緩相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇的增加。該相對肝臟重量的定義為肝臟重量佔總體重的百分比。於一些實施例中，所述用途係降低相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中所述用途係預防、延緩及/或降低脂肪變性的任何組織病理學症狀。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中所述用途係預防、延緩及/或降低肝臟發炎。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中所述用途係預防、延緩及/或降低肝纖維化。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物係以包括有1 mg/ml至10 mg/ml化合物之醫藥組成物形式投予。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物的劑量係於0.01 mg至10 mg的範圍內。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物係每週皮下注射一次。於一些實施例中，該化合物係經投予至少12個月。
於一些實施例中，本發明係有關一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物係以治療有效量向有需要的個體投予。於一些實施例中，該個體是肥胖的且/或有糖尿病。於一些實施例中，該個體患有過重、肥胖症、高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性異常及/或第1型糖尿病。
BMI（身體質量指數）係根據身高及體重的體脂肪量度。計算公式為BMI =(以公斤為單位的體重)/(以公尺為單位的身高)2 。於一些實施例中，本發明係有關一種供預防及/或治療NASH之化合物用途，其中該化合物係以治療有效量向有需要的個體投予，其中該個體的BMI至少為25 kg/m2 。於一些實施例中，該個體的BMI至少為30 kg/m2 。於一些實施例中，該個體的BMI係介於30 kg/m2 至50 kg/m2 。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物為
Figure 02_image001
。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物為
Figure 02_image003
。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該方法係預防及/或延緩相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇的增加。於一些實施例中，該方法係降低相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該方法係預防、延緩及/或降低脂肪變性的任何組織病理學症狀。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該方法係預防、延緩及/或降低肝臟發炎。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該方法係預防、延緩及/或降低肝纖維化。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物係以包括有1 mg/ml至10 mg/ml化合物之醫藥組成物形式投予。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物的劑量係於0.01 mg至10 mg的範圍內。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物係每週皮下注射一次。於一些實施例中，該化合物係經投予至少12個月。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物係以治療有效量向有需要的個體投予。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該個體是肥胖的且/或有糖尿病。於一些實施例中，該個體患有過重、肥胖症、高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性異常及/或第1型糖尿病。
於一些實施例中，本發明係有關一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該個體的BMI至少為25 kg/m2 。於一些實施例中，該個體的BMI至少為30 kg/m2 。於一些實施例中，該個體的BMI係介於30 kg/m2 至50 kg/m2 。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物係選自以下所組成之群：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物為
Figure 02_image001
。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物為
Figure 02_image003
。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中所述用途係預防及/或延緩相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇的增加。於一些實施例中，所述用途係降低相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低脂肪變性的任何組織病理學症狀。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低肝臟發炎。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低肝纖維化。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物係以包括有1 mg/ml至10 mg/ml化合物之醫藥組成物形式投予。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物的劑量係於0.01 mg至10 mg的範圍內。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物係每週皮下注射一次。於一些實施例中，該化合物係經投予至少12個月。
於一些實施例中，本發明係有關一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物係以治療有效量向有需要的個體投予。於一些實施例中，該個體是肥胖的且/或有糖尿病。於一些實施例中，該個體患有過重、肥胖症、高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性異常及/或第1型糖尿病。於一些實施例中，該個體的BMI至少為25 kg/m2 。於一些實施例中，該個體的BMI至少為30 kg/m2 。於一些實施例中，該個體的BMI係介於30 kg/m2 至50 kg/m2 。 個體及亞群
該待投予根據本發明之化合物的個體可以是人類，諸如成年人。於一些實施例中，所述個體為成人。
於一些實施例中，該待投予根據本發明之化合物的個體係患有過重、肥胖症、高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性異常及/或第1型糖尿病，且/或BMI至少為25 kg/m2 ，或至少為30 kg/m2 ，或介於30 kg/m2 至50 kg/m2 。 本發明之化合物
於本發明之一實施例中，該化合物為Nε28 -[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(2S)-2-[[(2S)-4-羧基-2-[[(2S)-2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]-3-羧基丙醯基]胺基]丁醯基]胺基]-3-羧基丙醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]-[Aib2,Leu10,Glu15,Lys17,Arg20,Glu21,Leu27,Lys28]-升糖素醯胺。該化合物包括SEQ ID NO: 1給定的胺基酸序列，且為一種C末端醯胺。此化合物可以如專利案WO2014/170496之實施例54中所述般製備。
Figure 02_image001
化合物A。
於本發明之一實施例中，該化合物為Nε28 -[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]-[Acb2,Leu10,Leu16,Arg20,Leu27,Lys28]-升糖素醯胺。該化合物包括SEQ ID NO: 2給定的胺基酸序列，且為一種C末端醯胺。此化合物可以如專利案WO2014/170496之實施例45中所述般製備。
Figure 02_image003
化合物B。 受體的結合及活化
受體促效劑可以定義為與受體結合且引發天然配位體之典型反應的肽。因此，例如「GLP-1受體促效劑」可以定義為一種能夠結合至GLP-1受體且能夠使其完全或部分活化之化合物。如本文所用之術語「升糖素受體促效劑」係指能夠結合至升糖素受體且能夠使其完全或部分活化之任何化合物。GLP-1/升糖素受體共促效劑可以定義為一種能夠活化GLP-1受體及升糖素受體二者之肽。術語「GLP-1活性」係指結合至GLP-1受體且啟動一訊息傳導路徑導致本領域中已知的促胰島素作用或其他生理作用之能力。
於本發明的一些實施例中，該等化合物為GLP-1受體促效劑。於一些實施例中，該等化合物為升糖素受體促效劑。於一些實施例中，該等化合物為GLP-1/升糖素受體共促效劑。於一些實施例中，該等化合物具有GLP-1活性。 生物活性 – 活體外親和力及效價
在一實施例中，親和力係指活體外結合親和力，即在GLP-1受體結合親和力測定及升糖素受體結合親和力測定中的表現，更特別指的是結合人類GLP-1受體及人類升糖素受體的能力。人類GLP-1受體的結合親和力可以在一結合測定法中測量，例如在表現人類GLP-1受體之穩定轉染的BHK細胞株中進行測量。經放射性標記的GLP-1係與該受體結合，且可以受一化合物競爭性置換。放射性配位體的結合可以在閃爍近接測定(SPA)珠粒的存在下進行判定，所述珠粒係結合至細胞膜並在放射性接近珠粒時，其產生光且經測量做為活體外結合親和力的量度。這類測定的一個非限制性實例係描述於實例1中。人類升糖素受體的結合親和力可以在結合親和力測定中進行測量，例如在表現人類升糖素受體之穩定轉染的BHK細胞株中測量。經放射性標記的升糖素係與該受體結合，且可以受一化合物競爭性置換。放射性配位體的結合可以在閃爍近接測定(SPA)珠粒的存在下進行判定，所述珠粒係結合至細胞膜並在放射性接近珠粒時，其產生光且經測量做為體活外結合親和力的量度。
術語半最大抑制濃度(IC50 )通常是指該競爭化合物取代掉放射性配位體結合的50%特異性結合之濃度，參考劑量反應曲線，其對應於基線與最大值之間的一半。IC50 係作為化合物的結合親和力的量度，且代表當觀察到其最大結合度的50%時的濃度。
本發明該等化合物之活體外結合度可以如上所述進行判定，且判定該等化合物的IC50 值。IC50 值越低，結合親和力越佳。
該等化合物對GLP-1受體及升糖素受體的親和力（即IC50 ）可以通過本文實例1中所述的測定法進行判定。
於本發明的一些實施例中，使用本文實例1之方法判定，該等化合物對GLP-1受體的活體外結合親和力係對應於100 nM或低於100 nM、或者低於10 nM、或者低於5 nM、或者低於3 nM的IC50 。
於本發明的一些實施例中，使用本文實例1之方法判定，該等化合物對升糖素受體的活體外結合親和力係對應於100 nM或低於100 nM、或者低於50 nM、或者低於10 nM、或者低於5 nM、或者低於3 nM的IC50 。
於本發明的一些實施例中，使用本文實例1之方法判定，該等化合物對GLP-1受體及升糖素受體的活體外結合親和力係對應於100 nM或低於100 nM、或者低於10 nM、或者低於5 nM、或者低於3 nM的IC50 。 醫藥組成物
本發明之化合物可以以醫藥組成物的形式施用。該醫藥組成物可包括濃度為0.01 mg/ml至100 mg/ml之本發明化合物。於一些實施例中，該醫藥組成物包括0.01 mg/ml至50 mg/ml、或0.01 mg/ml至20 mg/ml、或0.01 mg/ml至10 mg/ml之本發明化合物。於一些實施例中，該醫藥組成物包括0.1 mg/ml至20 mg/ml之本發明化合物。
本文所述之醫藥組成物可進一步包括一或多種醫藥學上可接受的賦形劑，例如選自以下所組成之群的賦形劑：緩衝系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑及介面活性劑。於一些實施例中，該醫藥組成物包括一或多種醫藥學上可接受的賦形劑，諸如一或多種選自以下所組成之群的賦形劑：緩衝液、等張劑及防腐劑。用各種賦形劑調配醫藥活性成分為本領域中已知的，參見(例如)Remington: The Science and Practice of Pharmacy（例如第19版(1995)及任何後續版本）。術語「賦形劑」係廣泛地指除活性治療成分（例如本發明之該等化合物）之外的任何成分。該賦形劑可以是惰性物質、非活性物質及/或非藥物活性物質。
於一些實施例中，該醫藥組成物包括磷酸鹽緩衝液，諸如磷酸鈉緩衝液（例如磷酸氫二鈉）。於一些實施例中，該醫藥組成物包括等張劑，諸如丙二醇。於一些實施例中，該醫藥組成物包括防腐劑，諸如苯酚。
該醫藥組成物可以是溶液或懸浮液的形式。於一些實施例中，該醫藥組成物為水性組成物，諸如水溶液或水懸浮液。術語「水性組成物」的定義為包括有至少50 %w/w的水之組成物。同樣地，術語「水溶液」的定義為包括有至少50 %w/w的水的溶液，而術語「水性懸浮液」的定義為包含至少50％w/w的水的懸浮液。水性組成物可以包括至少50% w/w的水，或至少60%、70%、80%或甚至至少90% w/w的水。於一些實施例中，該醫藥組成物的pH在7.0-9.0，諸如7.0-8.5的範圍內。 施用方案
本發明之化合物可以以治療有效量進行投予，諸如對於預防及/或治療NASH在治療上有效之數量。本發明該等化合物之治療有效量可由醫生評估。本發明該等化合物之劑量可以在0.01 mg至10 mg、或者0.5至7 mg、或者2至6 mg的範圍內。
本發明之化合物可以每週一次或更頻繁地施用，諸如每天一次。於一些實施例中，本發明之化合物係於一天中的任何時間施用。於一些實施例中，本發明之化合物係經皮下注射。於一些實施例中，本發明之化合物的劑量是在0.5至7.0 mg，諸如2.0至6.0 mg的範圍內。於一些實施例中，本發明之化合物的每週劑量係選自0.5、1、2、3、4、5、6及7 mg。
於一些實施例中，如本文所用之關於本發明化合物的術語「慢性治療」係指以提供治療效果的量及頻率施用。於一些實施例中，如本文所用之關於本發明化合物的術語「慢性治療」係指很長一段時間施用化合物，諸如至少一年，或者至少五年。
除非另有指明，本文的範圍係包含其終點。於一些實施例中，術語「一」係指「一或多個」。於一些實施例中，除非在說明書中另有指明，以單數形式表示的術語亦包含複數的情況。本文中之術語「約」係指所指之數值的±10%，且包含該數值。 本發明之非限制性實施例
本發明之非限制性實施例包含： 1.   一種供使用於預防及/或治療NASH之化合物，其中該化合物係選自以下所組成之群：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。 2.   一種供預防及/或治療NASH之化合物用途，其中該化合物為
Figure 02_image001
。 3.   一種供預防及/或治療NASH之化合物用途，其中該化合物為
Figure 02_image003
。 4.   如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中所述用途係預防及/或延緩相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇的增加。 5.   如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中所述用途係降低相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。 6.   如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低脂肪變性的任何組織病理學症狀。 7.   如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低肝臟發炎。 8.   如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低肝纖維化。 9.   如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中該化合物為GLP-1/升糖素受體共促效劑。 10. 如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中該化合物係以包括有1 mg/ml至10 mg/ml化合物之醫藥組成物形式投予。 11. 如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中該化合物的劑量係於0.01 mg至10 mg的範圍內。 12. 如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中該化合物係每週皮下注射一次。 13. 如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中該化合物係經投予至少12個月。 14. 如前述實施例中任一者所述之化合物用途，其中該化合物係以治療有效量向有需要的個體投予。 15. 如實施例14所述之化合物用途，其中該個體是肥胖的且/或有糖尿病。 16. 如實施例14所述之化合物用途，其中該個體患有過重、肥胖症、高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性異常及/或第1型糖尿病。 17. 如實施例14至16中任一者所述之化合物用途，其中該個體的BMI至少為25 kg/m2 。 18. 如實施例14至16中任一者所述之化合物用途，其中該個體的BMI至少為30 kg/m2 。 19. 如實施例14至16中任一者所述之化合物用途，其中該個體的BMI係介於30 kg/m2 至50 kg/m2 。 20. 一種供使用於預防及/或治療NASH之醫藥組成物，其中該醫藥組成物包括選自以下所組成之群的化合物：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。 21. 如實施例20所述之醫藥組成物用途，其中該醫藥組成物包括1 mg/ml至10 mg/ml之所述化合物。 22. 如實施例20或21中任一者所述之化合物用途，其中該醫藥組成物更包括一或多種醫藥學上可接受的賦形劑。 23. 一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物係選自以下所組成之群：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。 24. 一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物為：
Figure 02_image001
。 25. 一種向有需要的個體投予一化合物而預防及/或治療NASH之方法，其中該化合物為：
Figure 02_image003
。 26. 如實施例23至25中之任一者所述之方法，其中該方法係預防及/或延緩相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇的增加。 27. 如實施例23至26中之任一者所述之方法，其中該方法係降低相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。 28. 如實施例23至27中之任一者所述之方法，其中該方法係降低相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。 29. 如實施例23至28中之任一者所述之方法，其中該方法係預防、延緩及/或降低肝臟發炎。 30. 如實施例23至29中之任一者所述之方法，其中該方法係預防、延緩及/或降低肝纖維化。 31. 如實施例23至30中之任一者所述之方法，其中該化合物為GLP-1/升糖素受體共促效劑。 32. 如實施例23至31中之任一者所述之方法，其中該化合物係以包括有1 mg/ml至10 mg/ml化合物之醫藥組成物形式投予。 33. 如實施例23至32中之任一者所述之方法，其中該化合物的劑量係於0.01 mg至10 mg的範圍內。 34. 如實施例23至33中之任一者所述之方法，其中該化合物係每週皮下注射一次。 35. 如實施例23至34中之任一者所述之方法，其中該化合物係經投予至少12個月。 36. 如實施例23至35中之任一者所述之方法，其中該化合物係以治療有效量向有需要的個體投予。 37. 如實施例23至36中之任一者所述之方法，其中該個體是肥胖的且/或有糖尿病。 38. 如實施例23至37中之任一者所述之方法，其中該個體患有過重、肥胖症、高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性異常及/或第1型糖尿病。 39. 如實施例23至38中之任一者所述之方法，其中該個體的BMI至少為25 kg/m2 。 40. 如實施例23至38中之任一者所述之方法，其中該個體的BMI至少為30 kg/m2 。 41. 如實施例23至38中之任一者所述之方法，其中該個體的BMI係介於30 kg/m2 至50 kg/m2 。 42. 一種向有需要的個體投予一醫藥組成物而預防及/或治療NASH之方法，其中該醫藥組成物包括選自以下所組成之群的化合物：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。 43. 如實施例42所述之方法，其中該醫藥組成物包括1 mg/ml至10 mg/ml之所述化合物。 44. 如實施例42或43中之任一者所述之方法，其中該醫藥組成物更包括一或多種醫藥學上可接受的賦形劑。 45. 一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物係選自以下所組成之群：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
。 46. 如實施例45之用途，其中該化合物為
Figure 02_image001
。 47. 如實施例45之用途，其中該化合物為
Figure 02_image003
。 48. 如實施例45至47中之任一者所述之用途，其中該用途係預防及/或延緩相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇的增加。 49. 如實施例45至48中之任一者所述之用途，其中該用途係降低相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。 50. 如實施例45至49中之任一者所述之用途，其中該用途係降低相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。 51. 如實施例45至50中之任一者所述之用途，其中該用途係預防、延緩及/或降低肝臟發炎。 52. 如實施例45至51中之任一者所述之用途，其中該用途係預防、延緩及/或降低肝纖維化。 53. 如實施例45至52中之任一者所述之用途，其中該化合物為GLP-1/升糖素受體共促效劑。 54. 如實施例45至53中之任一者所述之用途，其中該化合物係以包括有1 mg/ml至10 mg/ml化合物之醫藥組成物形式投予。 55. 如實施例45至54中之任一者所述之用途，其中該化合物的劑量係於0.01 mg至10 mg的範圍內。 56. 如實施例45至55中之任一者所述之用途，其中該化合物係每週皮下注射一次。 57. 如實施例45至56中之任一者所述之用途，其中該化合物係經投予至少12個月。 58. 如實施例45至57中之任一者所述之用途，其中該化合物係以治療有效量向有需要的個體投予。 59. 如實施例58所述之用途，其中該個體是肥胖的且/或有糖尿病。 60. 如實施例58至59中之任一者所述之用途，其中該個體患有過重、肥胖症、高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性異常及/或第1型糖尿病。 61. 如實施例58至60中之任一者所述之用途，其中該個體的BMI至少為25 kg/m2 。 62. 如實施例58至60中之任一者所述之用途，其中該個體的BMI至少為30 kg/m2 。 63. 如實施例58至60中之任一者所述之用途，其中該個體的BMI係介於30 kg/m2 至50 kg/m2 。 實例
縮寫列表 ALT: 丙胺酸轉移酶 ANOVA: 倉鼠嬰腎 BHK: 倉鼠嬰腎 BW: 體重 CD11b: 分化簇11b CD45: 分化簇45 Col: 膠原蛋白 Col III: 膠原蛋白III Col1A1: 第I型膠原蛋白α1 Col3A1: 第III型膠原蛋白α1 HE: 蘇木素及曙紅 IC50 : 半最大抑制濃度 NASH: 非酒精性脂性肝炎 PFA: 三聚甲醛 RNA: 核糖核酸 ROI: 感興趣區域 SC: 皮下 SEM: 平均值標準差 SMA: 平滑肌肌動蛋白 SPA: 閃爍近接測定 SR: 天狼星紅 STAR: 剪接轉錄物比對參考 VIS: Visiopharm積分系統 WGA: 小麥胚芽凝素 WM: 體重匹配 動物實驗的一般方法  動物、圈養及飲食
所有的動物實驗均按照Gubra生物倫理準則進行，該準則完全符合國際公認的實驗動物護理及使用原則。所描述的實驗已獲得丹麥動物研究委員會所頒發的Jacob Jelsing (2013-15-2934-00784)的個人許可。
5週齡之C57BL/6雄性小鼠係購自法國JanVier公司。在適應及飲食誘導期間，在12:12光暗循環下（光照開啓自3 AM至3 PM）於受控溫度條件下(22±1°C; 50±10%相對濕度)將小鼠以每籠十隻分組圈養於定製箱櫃中。在飲食誘導期間，小鼠隨意取用AMLN飲食(D09100301, Research Diet, USA)（40%脂肪(18%反式脂肪)、40%碳水化合物(20%果糖)及2%膽固醇）或正規嚙齒動物食物（食物載體組）(Altromin公司1324，Brogaarden，丹麥)及自來水。在研究期間，小鼠隨意取用AMLN飲食或正規囓齒動物食物（食物載體組）和及來水，但體重匹配組除外，該組的食物被限制為將體重降低到與接受化合物A或化合物B之動物相同的程度。動物在預活組織檢查之前保持該飲食34週，且在研究期間維持該飲食。在手術後恢復期間及研究期間，將所有動物單獨圈養。 研究分配、層次分組、隨機化及基線監測
於飲食誘導期間，斷斷續續地監測體重。在飲食誘導34週之後（研究開始前3週），獲得肝臟生物檢體以進行肝臟纖維化及脂肪變性進展的組織學評估。研究開始的6天前(-6)，僅將脂肪變性等級3級且纖維化等級≥1的動物納入研究中，並根據1)纖維化、2)脂肪變性及3)體重將其隨機區組至治療組中。 預活組織檢查程序
預活組織檢查：研究開始前三週採取預活組織檢查。用含異氟烷(2-3%)之100%氧氣將小鼠麻醉。在中綫上製造小腹部切口且暴露肝臟之左側葉。自該葉之遠端部分切下錐狀楔狀肝臟組織(約50 mg)，且固定在10%中性福馬林緩衝液（4%三聚甲醛(PFA)）中以用於組織學分析。立即使用雙極電凝(ERBE VIO 100電手術單元)對肝臟之切割表面進行電凝。將肝臟放回腹腔並縫合腹壁，並且用釘書機閉合皮膚。對於手術後恢復，在手術當天及手術後第1天及第2天使小鼠經皮下注射(SC)接受卡洛芬(5mg/ml, 0.01 ml/10g)。手術後，監測體重且每天評估動物的總體健康狀況及體重。
預處理的生物檢體係如組織學中關於脂肪變性評分之石蠟包埋、切片、蘇木素及曙紅(HE)染色，以及關於纖維化評分之天狼星紅染色(SR)進行處理。生物檢體係根據Kleiner評分（非酒精性脂肪肝疾病的組織學評分系統設計與驗證，Kleiner等人，Hepatology 41; 2005）對脂肪變性（HE染色玻片）及纖維化（SR染色玻片）進行評分。 鑑識
用植入式微晶片(Pet ID Microchip公司, E-vet)對動物進行獨有的鑑識，在到達時於輕度CO2 麻醉下將其植入所有小鼠中。使用連接至運行HM02Lab軟體(Ellegaard Systems公司, Faaborg，丹麥)之筆記型電腦的WS-1秤重站(MBrose ApS公司, Faaborg，丹麥)識別動物。HM02Lab軟體將體重與ID匹配，並直接根據體重計算劑量。 體重
在基線及每天給藥後監測體重。在整個研究期間，向動物提供隨意的食物及水，但體重匹配組除外，該組的食物被限制為將體重降低到與接受化合物A或化合物B之動物相同的程度。 化合物及給藥
從第0天直至第55天（包含第55天）每天對動物給藥一次，總共接受56劑。動物接受2 nmol/kg的化合物A平均劑量及3.4 nmol/kg的化合物B平均劑量。動物係於8:00-9:00 AM之間經受治療。對於SC給藥，注射部位分別從下背部及腹股溝區的左側輪流到右側。
化合物A及化合物B係由Novo Nordisk公司交付並使用Novo Nordisk公司的諾芯管(Penfill)投予。 被排除的動物
在研究期間，出於人道終點而將兩隻動物終止。研究中沒有包含被排除的動物的數據。該等動物的排除導致了非酒精性脂肪性肝炎(NASH)載體組及體重匹配載體組中的n=12降至n=11。健康的食物載體組或化合物處理組中沒有動物被排除。 終止及屍檢
動物係以非空腹狀態終止於研究第56天。在終止前約20至24小時投予最後一次藥物劑量。將動物置於麻醉（異氟醚）下，打開腹腔且獲得心臟血液以收集終末血漿。在屍檢時，收集整個肝臟並秤重。將左側葉固定在4% PFA中以進行組織切片。將內葉分成數片且在液氮中快速冷凍以用於生物化學分析且隨後固定在RNA中以用於基因表現分析。 組織切片
固定、包埋和切片：在4% PFA中過夜固定後，在自動化Miles Scientific Tissue-TEK VIP組織處理機中將肝臟生物檢體用石蠟處理，隨後包埋在石蠟塊中（每個石蠟塊5個生物檢體）。在Microm HM340E顯微切片機(Thermo Scientific公司)上將該等石蠟塊切割出3 µm的切片。對於所有的染色，將包埋在石蠟中的切片於二甲苯中進行脫蠟並且在一系列梯度的乙醇中進行再水合。
為了評估肝臟脂肪變性，將切片用HE染色：將切片在邁爾(Mayer’s)蘇木素（目錄號S3309, Dako）中培養5分鐘，在流動的自來水中洗滌5分鐘，接著在曙紅Y溶液（目錄號HT110280 2.5L, Sigma-Aldrich公司）中染色15秒。對載玻片水合，用Pertex進行封片，並使其在掃描前乾燥。最後在Aperio Scanscope AT載玻片掃描器中，將所有載玻片在20倍物鏡下數位化，以用於脂肪變性的組織病理學評分。
為了評估肝臟纖維化，將切片用於SR染色：將另一切片用於SR染色。簡言之，將石蠟包埋的切片在二甲苯中進行脫蠟並且在一系列梯度乙醇中進行再水合。將載玻片在魏格特氏(Weigert’s)鐵蘇木素（目錄號TH107, Sigma Aldrich公司）中培養10分鐘，在流動的自來水中洗滌5分鐘，在天狼星紅（目錄號365548, Sigma Aldrich公司）中染色15分鐘，且在酸化的水中洗滌兩次。藉由劇烈搖動載玻片來去除剩餘的水。此後，將載玻片以三次更換100%乙醇進行水合，在二甲苯中進行清除，並且用Pertex進行封片，並如上所述使其在掃描前乾燥。
免疫組織化學：在自動化Benchmark Ultra平台(Ventana Medical Systems, Roche公司)上針對CD11b、CD45、SMA及膠原蛋白III (Col III)蛋白將該等切片進行免疫染色。簡言之，使該等切片脫蠟並在95o C使用CC1 pH8,4 (Roche公司)使其經受熱誘導抗原修復16分鐘以用於CD11b、CD45及SMA免疫染色。對於Col III免疫染色，在37o C使用Prot.1 (Roche公司)進行蛋白酶介導的抗原修復8分鐘。在37o C施用0.5 µg/ml的單株兔子抗CD11b抗體（目錄號ab133357, Abcam公司）、5.0 µg/ml的單株大鼠抗CD45抗體（目錄號550539, BD Bioscience公司）、4.0 µg/ml的單株兔子抗SMA抗體（目錄號ab124964, Abcam公司）以及8.0 µg/ml的多株山羊抗膠原蛋白III抗體（目錄號1330-01, SouthernBioTech公司）持續一小時。對於CD11b及SMA免疫染色，以HRP-共軛的OmniMab抗兔子抗體(Ventana公司)偵測抗體的結合，對於CD45及Col III免疫染色，則以HRP-共軛的OmniMab抗山羊抗體(Ventana公司)偵測抗體的結合。對於CD45免疫染色，施以山羊抗大鼠IgG（目錄號112-005-167, Jackson ImmunoResearch公司）做為抗CD45染色的二級連接抗體。以Purple色原體(Ventana公司)使抗體的結合顯像。以蘇木精將細胞核複染，以PerTex覆蓋玻片。在經以相同濃度用作對應的初級抗體之同型對照抗體單株兔子IgG [DAE1]（目錄號3900S, Cell Signaling Tech.公司）、單株大鼠IgG2beta（目錄號MAB0061, R&D公司）、及多株山羊IgG（目錄號005-000-003, Jackson ImmunoResearch公司）進行染色的陰性對照玻片上並未觀察到免疫反應。預活組織檢查及後活組織檢查係以相同的運作方式進行染色，以使得可直接比較。
通過Visiopharm積分系統(VIS)之CD45、CD11b、SMA及Col III免疫組織化學的形態定量：簡言之，所有切片係使用Nanozoomer 2.0 HT系統(Hamamatsu公司, Glostrup，丹麥)在20x下進行掃描。接著，使用採集模組將經掃描的圖像輸入VIS。在經掃描的免疫染色影像上使用Visiopharm積分系統(版本4.2.2.0，Visiopharm公司，Hørsholm，丹麥)執行自動化影像分析。檢查100%的免疫染色組織切片。分析的第一個步驟包含自動組織切片，以界定組織及非組織邊界，藉以界定感興趣區域(ROI)。使用Visiomorph DP模組執行組織偵測，即R、G及B波段以5x5平均做為預處理步驟，以非監督式K平均集群法（3組）做分割，隨後執行一後處理步驟以在組織周圍生成ROI。在此ROI內，對於CD11b、CD45、SMA及Col III的分析係先後以預處理步驟Contrast Red-Green及閾值分析在20x放大率下執行。用蘇木素進行類似的分析以檢測細胞核。執行若干後處理步驟以對細胞核進行算數（閉鎖、按面積變化、填充孔、分隔目標物、按面積變化、施加計數框）。在每個組織切片中計算相對於細胞核數目的CD11b、CD45、SMA及Col III染色面積。藉由批次處理分析生成所有數據，並將數據擷取到excel試算表中。 統計
數據係呈現為平均值±平均值標準差(SEM)。使用鄧尼特檢定之多重比較進行單向變異數分析(ANOVA)。使用費雪精確檢定與邦弗朗尼校正進行非參數分析。*p＜ 0.05、**p＜ 0.01或***p＜ 0.001的結果被認為是具顯著性的。所有的統計分析係以GraphPad Prism 7 (GraphPad軟體，CA USA)進行。
實例1：GLP-1及升糖素受體的結合 目的：此測定之目的為測試本發明該等化合物之活體外的受體結合活性（即親和力）。受體的結合分別為用於該人類GLP-1受體或人類升糖素受體之化合物的親和力量度。 測試化合物
使用在此研究中之該等化合物係列於表1中。不同批的化合物顯示出近似的受體親和力及效價。該等化合物係儲存在乾燥深色之受控區域中，並保持冷藏在4°C。於使用於測定中時，將該等化合物溶解於80% DMSO/20%水之中，之後進一步稀釋於所述測定緩衝液中。於所有測定中之DMSO的最終濃度係保持在最大值0.3%。 cDNA及質體
人類GLP-1受體cDNA係獲自B. Thorens（Thorens B.所著之“Expression cloning of the pancreatic beta cell receptor for the gluco-incretin hormone glucagon-like peptide 1” (Proc Natl Acad Sci USA 89:8641-8645,1992)）。人類升糖素受體cDNA係獲自L. Jelinek（Lok S所著之“The human glucagon receptor encoding gene: structure, cDNA sequence and chromosomal localization” (Gene. 1994 Mar 25;140(2):203-9)）。該等cDNA係選殖到哺乳動物表現載體的CMV啟動子下游以在倉鼠嬰腎(BHK)細胞中表現。所有的載體序列係藉定序驗證，且所有的質體係使用QIAGEN Plasmid Midi套組純化。 重組細胞株的來源
用於受體結合親和力及效價測定之細胞株係依序先用pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]質體穩定轉染BHK (野生型)細胞株，隨後用編碼升糖素受體或GLP-1受體之質體進行第二次轉染。將細胞培養在含有選擇標記物潮黴素及遺傳黴素(G418)之培養基中。隨後，基於升糖素受體或GLP-1受體的可比較表現程度選擇單個殖株。 受體結合測定
用測定緩衝液（補充有5 mM EGTA、5 mM MgCl2 及0.005% Tween 20之50 mM HEPES, pH 7.4）稀釋以分別達到1%或20%血漿之最終濃度，在細胞膜上執行結合測定。該等化合物之受體結合親和力係使用獲自PerkinElmer公司之小麥胚芽凝素(WGA)閃爍近接測定(SPA)珠粒(RPNQ0001)藉由其取代[125 I]-升糖素或[125 I]-GLP-1(7-36)-NH2 之能力進行測量。穩定表現升糖素或GLP-1受體的細胞係生長在5% CO2 下之DMEM、10% FCS、0.5 mg/ml遺傳黴素(G418)及0.3 mg/ml潮黴素之中。細胞膜的製備係由在80%時收穫的細胞匯合製作，之後在pH 7.4之20 mM HEPES及0.1 mM EDTA緩衝液中洗滌及均質化(ULTRA-TURRAX公司, IKA，德國)。隨後判定蛋白濃度，且將細胞膜儲存在-80°C直至使用。細胞膜結合測定係於96孔OptiPlate (Perkin Elmer公司, USA)中以總體積200 μl執行。測試化合物係溶解於80% DMSO中且進一步稀釋於測定緩衝液中。將50 μl的稀釋血漿添加到測定孔盤的各孔中，隨後添加測試化合物(25 μl)、細胞膜(50 μl, 0.06 mg/ml)、SPA珠粒(20 mg/ml於測定緩衝液中)及放射性配位體(每孔60,000 cpm，Novo Nordisk A/S公司)。將測定孔盤培養在30°C下2小時，以1500 rpm離心10分鐘並在TopCount NXT儀器(PerkinElmer公司, USA)中進行讀數。 計算
將來自TopCount儀器的資料傳送至GraphPad Prism軟體。該軟體將該等重複實驗的值平均並進行非線性回歸。通過該軟體計算IC50 值並以nM為單位報告。資料係顯示於表1中。
化合物 人類 GLP1 R SPA 結合 0% HSA IC50 (nM) 人類 GCG R SPA 結合 0% HSA IC50 (nM)
化合物 A 0.3 1.4
化合物 B 1.6 0.8
表1 本發明之該等化合物的IC50 數值。 表1中的結果顯示本發明之該等化合物在活體外能夠結合人類GLP-1受體及人類升糖素受體。
實例2：體重及體重變化 目的：此實驗之目的為測量不同治療組在治療期間的總體重變化。
動物實驗係如「動物實驗的一般方法」部分中所述進行。動物體重係如「體重」小節所述測量。體重及體重變化係顯示於圖1中。數據係以平均值± SEM表示。NASH組的n=11-12，食物載體組的n=10。
圖1中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物當與NASH載體組相比時的絕對及相對體重降低。體重匹配(WM)組具有與化合物處理組相當的絕對及相對體重。
實例3：相對肝臟重量 目的：此實驗之目的為在治療56天後測量不同治療組的相對肝臟重量佔體重的百分比。
動物實驗係如「動物實驗的一般方法」部分中所述進行。動物肝臟重量係如「終止及屍檢」小節所述測量。相對肝臟重量佔體重的百分比係顯示於圖2中。數據係以平均值± SEM表示（NASH組的n=11-12，食物載體組的n=10）。使用鄧尼特多重比較檢定進行單向ANOVA（所有直條與NASH載體對比）且當與NASH載體相比時***表示p＜ 0.001。
圖2中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物當與NASH載體組相比時其相對肝臟重量顯著降低。WM組在與NASH載體組相比時其相對肝臟重量也顯著降低。通常觀察到總體重較低的動物的相對肝臟重量降低。
實例4：血漿丙胺酸轉移酶量 目的：此實驗之目的為測量血漿丙胺酸轉移酶(ALT)的量。ALT通常受限在肝細胞中，但如果肝臟受損或發炎，ALT可被釋放到血液中。這導致血漿ALT的量上升。 血漿丙胺酸轉移酶量
動物實驗係如「動物實驗的一般方法」部分中所述進行。血液係如「終止及屍檢」小節所述收集。將100 µl血液收集到鋰鹽-肝素採血管中。將血漿分離且分析之前將樣本儲存在4°C一天。使用自動分析儀Cobas C-111與市售套組(Roche Diagnostics公司，德國)，根據製造商的說明書以單值測定方式測量所有的參數。數據係顯示於圖3。數據係以平均值± SEM表示（NASH組的n=11-12，食物載體組的n=10）。使用鄧尼特多重比較檢定進行單向ANOVA（所有直條與NASH載體對比）且當與NASH載體相比時***表示p＜ 0.001。
圖3中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物當與NASH載體組相比時其血漿ALT顯著減少。WM組在與NASH載體組相比時其血漿ALT也顯著減少，但所觀察到的效果係大於以化合物A或B治療的組，這指出該等化合物之與體重無關的效果。
實例5：脂肪變性的組織病理學症狀 目的：此實驗之目的為測量脂肪變性的組織病理學評分。 使用蘇木素及曙紅(HE)之肝臟脂肪變性評估
動物實驗係如「動物實驗的一般方法」部分中所述進行。組織樣本係如「組織切片」小節所述製備及HE染色。 脂肪變性的組織病理學評
藉由使用Kleiner及其同僚概述之臨床準則(Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease, Kleiner等人, Hepatology 41; 2005)對用HE染色的肝切片進行脂肪變性階段的評估（參見以上描述）。
特徵 程度 評分
脂肪變性 ＜5% 5-33% ＞33-66% ＞66% 0 1 2 3
數據係顯示於圖4。與研究前相比，各組在研究後之脂肪變性評分更高（惡化）、相同或更低（改善）的動物數量係以長條的高度表示。使用費雪精確檢定與邦弗朗尼校正，且***表示p＜0.001。
圖4中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物在與研究前相比時脂肪變性評分顯著較低（改善）。對於重量匹配載體組則未觀察到相同程度的同樣有益效果，這表明該等化合物的效果與體重無關。
實例6：肝臟三酸甘油酯及肝臟膽固醇 目的：此實驗之目的為測量肝臟中的三酸甘油酯及膽固醇量。 肝臟末期三酸甘油酯及膽固醇含量
動物實驗係如「動物實驗的一般方法」部分中所述進行。肝臟均質物中的三酸甘油酯及總膽固醇含量係使用自動分析儀Cobas C-111與市售套組(Roche Diagnostics公司，德國)，根據製造商的說明書以單值測定方式測量。數據係顯示於圖5。肝臟三酸甘油酯量及肝臟總膽固醇係以(mg/g肝臟)給定。使用鄧尼特多重比較檢定進行單向ANOVA（所有群組與NASH載體對比）且當與NASH載體相比時***表示p＜ 0.001。
圖5中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物當與NASH載體治療組相比時其肝臟三酸甘油酯量顯著降低且總肝膽固醇顯著降低。WM組的肝臟三酸甘油酯量顯著降低，但所觀察到的效果係大於以化合物A或B治療的組。WM組在與NASH載體組相比時其總肝膽固醇顯著增加。這些結果指出對於肝臟三酸甘油酯及肝臟總膽固醇的效果是化合物A及化合物B特有的。
實例7：肝臟發炎 目的：此實驗之目的為測量發炎標記物CD11b及CD45。 CD11b及CD45的免疫組織化學：
動物實驗係如「動物實驗的一般方法」部分中所述進行。組織樣本係如「組織切片」小節所述製備，通過形態測定法進行免疫組織化學與分析。CD11b及CD45免疫組織化學的形態定量結果係顯示於圖6。治療8週（56天）後收集的組織肝臟樣本係經免疫染色供發炎標記物之用。A）CD45：泛白血球標記物。B）CD11b：浸潤性單核球、發炎性巨噬細胞及嗜中性球之標記物。數據係呈現為經切片的生物檢體的細胞核數量中之經染色區域的平均值+/- SEM (µm2 /細胞)。每組動物的n=10-12。使用鄧尼特多重比較檢定進行單向ANOVA（所有群組與NASH載體相比較）。*表示p＜0.05，而**表示p＜0.01。
圖6中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物當與NASH載體組相比時其通過免疫組織化學在肝臟中所測得的發炎標記物CD11b及CD45的量顯著減少。WM組通過免疫組織化學在肝臟中所測得的發炎標記物CD11b及CD45的量也顯著減少。
實例8：肝纖維化 目的：此測定之目的為測量纖維化、平滑肌肌動蛋白(SMA)及Col III的標記物。 SMA及Col III的免疫組織化學：
動物實驗係如「動物實驗的一般方法」部分中所述進行。組織樣本係如「組織切片」小節所述製備，通過形態測定法進行免疫組織化學與分析。
SMA的數據係顯示於圖7A中。將代表治療8週（56天）後的染色組織切片（後活組織檢查）之經掃描玻片使用VIS軟體通過數位影像分析進行分析。在每個組織切片中的SMA免疫染色區域係以相對於在同一組織切片中所偵測到的細胞數來表示。數據係以平均值+/- SEM呈現。使用鄧尼特多重比較檢定進行單向ANOVA（所有群組與NASH載體對比）。*表示p＜ 0.05，**表示p＜0.01而***表示p＜0.001。Col III的數據係顯示於圖7B。治療8週（56天）後收集的組織學肝臟樣本係經免疫染色以檢測纖維化的標記物。Col III：纖維化的主要組成部分。數據係呈現為經切片的生物檢體的細胞核數量中之經染色區域的平均值+/- SEM (µm2/細胞)。每組動物的n=10-12。使用鄧尼特多重比較檢定進行單向ANOVA（所有群組與NASH載體對比）。***表示p＜ 0.001。
圖7A中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物當與NASH載體組相比時其通過免疫組織化學在肝臟中所測得的纖維化標記物SMA的發生率顯著減少。對於重量匹配對照組則未觀察到相同的效果，這表明該等化合物的效果與體重無關。
圖7B中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物當與NASH載體組相比時其通過免疫組織化學在肝臟中所測得的纖維化標記物Col III的發生率顯著減少。對於重量匹配對照組則未觀察到相同的效果。
實例9：肝纖維化 目的：此實驗之目的為測量第I型膠原蛋白α1 (Col1A1)及第III型膠原蛋白α1 (Col3A1)的表現量以做為肝臟纖維化的指標。 RNA定序
動物實驗係如「動物實驗的一般方法」部分中所述進行。使用MP FastPrep系統進行組織的溶解。簡言之，如由供應商所建議，將15-20 mg肝臟生物檢體均質化並且用於NucleoSpin Plus RNA管柱(Macherey-Nagel公司)上進行RNA萃取。使用NanoDrop 2000分光光度計(ThermoScientific公司)評估RNA的量。將經純化的RNA儲存在-80o C。
使用NeoPrep (Illumina公司)來生成定序資料庫，並將其在NextSeq 500 (Illumina公司)上進行定序。使用剪接轉錄物比對參考(Spliced Transcripts Alignment to a Reference (STAR))軟體將定序資料與從Ensembl資料庫獲得的動物物種基因組進行比對。對於生物資訊學分析，使用標準RNA定序品質控制參數來評估數據的品質。為了評估組間及組內變異性，進行主成分分析及階層式分群。使用了R-程式edgeR來識別有表現差異的基因。數據係顯示於圖9。對於各種處理，顯示了在進行多重檢定校正後之與載體相比的倍數變化與數值，其中**p＜ 0.01而***p＜ 0.001。
圖9中的結果顯示以本發明該等化合物治療的動物當與NASH載體組相比時其Col1A1及Col3A1的表現量顯著減少。這說明了纖維化降低。對於重量匹配載體組則未觀察到相同的效果，這表明該等化合物的效果與體重無關。
儘管已在本文中說明及描述本發明之某些特徵，但本領域中具有通常知識者現將想到多種修改、取代、變化及等效物。因此，應瞭解所附申請專利範圍係意欲涵蓋落入本發明之真正精神的所有如此類修飾及變化。
無
[圖1]顯示第0至56天之以公克為單位的動物體重(A)以及第0至56天之以百分比表示之動物體重變化(B)。 [圖2]顯示在治療8週（56天）後之相對動物肝臟重量佔動物體重的百分比。 [圖3]顯示在治療8週（56天）後之血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)的量。 [圖4]顯示在治療8週（56天）之前與之後的脂肪變性階段的組織病理學評分。 [圖5]顯示在治療8週（56天）後之肝臟三酸甘油酯（mg/g肝臟）的量(A)及肝臟總膽固醇（mg/g肝臟）(B)。 [圖6]顯示在治療8週（56天）後藉由CD45 (A)及CD11b (B)免疫組織化學染色的形態分析所判定的肝臟發炎情況。 [圖7]顯示在治療8週（56天）後藉由平滑肌肌動蛋白(SMA) (A)及膠原蛋白III (Col III) (B)的免疫組織化學染色的形態分析所判定的肝纖維化情形。 [圖8]顯示在治療8週（56天）後之第I型膠原蛋白α1 (Col1A1)及第III型膠原蛋白α1 (Col3A1)的基因表現量。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (15)

  1. 一種用於製造供預防及/或治療NASH之藥物的化合物的用途，其中該化合物係選自以下所組成之群：
    Figure 03_image001
    及
    Figure 03_image003
    。
  2. 如請求項1所述的用途，其中該化合物為
    Figure 03_image001
    。
  3. 如請求項1所述的用途，其中該化合物為
    Figure 03_image003
    。
  4. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中所述用途係預防及/或延緩相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇的增加。
  5. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中所述用途係降低所述相對肝臟重量、血漿丙胺酸胺基轉移酶量、肝臟三酸甘油酯含量及/或肝臟膽固醇。
  6. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低脂肪變性的任何組織病理學症狀。
  7. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低肝臟發炎。
  8. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中所述用途係預防、延緩及/或降低肝纖維化。
  9. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中該化合物係以包括有1 mg/ml至10 mg/ml化合物之醫藥組成物形式投予。
  10. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中該化合物的劑量係於0.01 mg至10 mg的範圍內。
  11. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中該化合物係每週皮下注射一次。
  12. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中該化合物係經投予至少12個月。
  13. 如前述請求項中任一項所述的用途，其中該化合物係以治療有效量向有需要的個體投予。
  14. 如請求項13所述的用途，其中該個體係患有過重、肥胖症、高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性異常及/或第1型糖尿病。
  15. 如請求項13或14中任一項所述的用途，其中該個體的BMI為至少25 kg/m2 、或者至少30 kg/m2 、或者介於30 kg/m2 至50 kg/m2 。
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