定義
術語“糞便微生物群移植(FMT)”或“糞便移植”是指這樣的醫療程序，其中將含有獲自健康個體的活的糞便微生物(細菌、真菌、病毒等)的糞便物質轉移到受體的胃腸道中以修復已被多種醫學病況中的任何一種擾亂或破壞的健康腸微生物群。通常，首先將來自健康供體的糞便物質加工成適合移植的形式，這可以通過在下胃腸道中直接沉積，如通過結腸鏡或通過鼻腔插管或通過口服含有處理過的(例如，乾燥和冷凍的)糞便物質的封裝物質來進行。FMT被用於治療多種醫學病況，包括肥胖、代謝綜合徵、胃腸疾病(如炎性腸病(IBD)，包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD))、耐抗生素菌感染(如艱難梭菌感染(CDI)或由包括耐碳青黴烯的腸桿菌科(CRE)或耐萬古黴素的腸球菌(VRE)在內的耐多藥生物體引起的病況)，以及自閉症、抑鬱症、肥胖、糖尿病、脫髮、急性移植物抗宿主病(aGvHD)，並且還包括某些神經性病況，如多發性硬化症和帕金森氏病。
如本文中所用的術語“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指對靶生物過程如靶基因的RNA/蛋白表達、靶蛋白的生物學活性、細胞信號轉導、細胞增殖等的任何可檢測的負面影響。通常，抑制反映為當相比對照時，靶過程(例如，某些種類的微生物，例如，表1b、6b或10a中所示的細菌中的一種或多種；或表3b或7b中所示的真菌；或表8a中所示的病毒的生長或增殖)，或上述的下游參數中的任一個的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大的減少。“抑制”還包括100%的減少，即靶生物過程或信號的完全的清除或廢除。其他相關的術語如“抑制(suppressing)”、“抑制(suppression)”、“減少(reducing)”和“減少(reduction)”在本公開中以類似的形式使用，是指不同水平的減少(例如，相比對照水平至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的減少)，直至完全清除靶生物過程或信號。另一方面，術語如“激活(activate)”、“激活(activating)”、“激活(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促進(promote)”、“促進(promoting)”、“提高(enhance)”、“提高(enhancing)”或“提高(enhancement)”在本公開中用於包括靶過程或信號的不同水平的正變化(例如，相比對照水平，例表1a、4、6a、10b、11或15中所示的細菌，或表2、3a、5、7a或16中所示的真菌，或表8b中所示的病毒中的一種或多種的對照水平，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更大，如3、5、8、10、20倍的增加)。
術語“抗細菌劑/抗真菌劑/抗病毒劑”是指能夠分別抑制、壓抑或防止細菌、真菌或病毒，特別是表1b、3b、6b、7b、8a和10a中所示的那些的生長或增殖的任何物質。已知的具有抗細菌活性的試劑包括廣泛地抑制廣譜的細菌的增殖的各種抗生素以及能夠抑制特定細菌的增殖的諸如反應寡核苷酸、小抑制性RNA的試劑。術語“抗細菌劑/抗真菌劑/抗病毒劑”類似地定義為包括分別具有殺死幾乎所有細菌、真菌或病毒的廣譜活性的試劑，以及分別特異性地抑制靶細菌、真菌或病毒的增殖的試劑。
當在描述分別與所有細菌或真菌或病毒有關的特定細菌或真菌或病毒(例如，表1-11中任一個中所示的那些中的任一種)的上下文中使用，在相同的環境中出現時，“百分比相對豐度”是指以百分比形式表示的細菌或真菌或病毒在所有細菌或真菌或病毒的量中的相對量。例如，可以通過比較一個給定樣品中該物種特異性的DNA的量(例如，通過定量聚合酶鏈式反應確定的)與相同樣品中的所有真菌DNA的量(例如，通過基於內部轉錄間隔子2或ITS2序列的定量聚合酶鏈式反應(PCR)和測序確定的)，來確定一種特定真菌的百分比相對豐度。
當在描述糞便中特定細菌或真菌或病毒(例如，表1-11、15和16中所示的那些中的任一種)的存在的上下文中使用時，“絕對豐度”是指糞便樣品中的所有DNA的量中，分別來源於細菌或真菌或病毒的DNA的量。例如，可以通過比較一個給定樣品中該真菌特異性的DNA的量(例如，通過定量PCR確定的)與相同樣品中的所有糞便DNA的量來確定一種真菌的絕對豐度。
如本文中所用的糞便樣品的“總細菌/真菌/病毒載荷”分別是指糞便樣品中的所有DNA的量中，所有細菌/真菌/病毒DNA的量。例如，可以通過比較一個給定樣品中的真菌特異性的DNA的量(例如，通過定量PCR確定的18S rDNA)與相同樣品中的所有糞便DNA的量，來確定真菌的絕對豐度。
如本文中所用的術語“有效量”是指產生所需效應的物質的量(例如，對使用或給予物質(例如，抗細菌劑)的一種或多種有害細菌或真菌或病毒(例如，表1b、6b或10a中所示的細菌)的生長或增殖的抑制性或壓抑性效應。所述效應包括以任何可檢測的程度防止、抑制或延遲細菌/真菌/病毒增殖過程中的任何相關的生物過程。準確的量將取決於物質(活性劑)的性質、使用/給予的方式以及施用的目的，並且將由本領域技術人員使用已知的技術以及本文中描述的那些來確定。在另一情形下，當在旨在用於FMT的組合物中人為引入“有效量”的一種或多種有益細菌或真菌或病毒(例如，表1a、2、3a、4、5、6a、7a、8b、10b、11、15或16中列出的那些)時，其意指引入的相關細菌/真菌/病毒的量足以賦予FMT受體健康益處，如體重減輕、提高的對胰島素的敏感性、降低的血液膽固醇水平、耐藥細菌感染的抑制，和/或急性移植物抗宿主病(aGvHD)和GI道疾病如IBD的減輕。
如本文中所用的，術語“約”表示這樣的值範圍，即指定值的+/-10%。例如，“約10”表示9-11(10+/-1)的值範圍。
發明詳述 I. 引言
本發明提供了在方案進行之前評估有效FMT的可能性以及在為受體賦予某些健康益處方面提高FMT程序的效力的新的方法。在其研究中，本發明人發現受體的胃腸道和供體的糞便中的某些細菌、真菌和病毒的存在和相對豐度均與FMT的結果直接相關。例如，發現表1a、4、6a、10b、11或15中所示的細菌的存在(特別是在升高的水平下)，為FMT受體賦予了健康益處，而表1b、6b或10a中所示的細菌的存在(特別是在升高的水平下)，傾向於不利地影響FMT結果。類似地，已經鑒定了某些真菌和病毒的存在和相對豐度與所需的FMT結果相關。因此，潛在供體的糞便中的諸表1a、2、3a、4、5、6a、7a、8b、10b、11、15或16中所示的那些的一種或多種“有益的”細菌/真菌/病毒的檢測(特別是在升高的水平下)，另一方面，諸表1b、3b、6b、7b、8a、10a或16中所示的那些的一種或多種“有害的”細菌/真菌/病毒的檢測(特別是在升高的水平下)，可用於指導供體選擇，而FMT受體中的這些相關的細菌/真菌/病毒水平的分析可以確定對象是否直接準備好進行FMT，或者應當在FMT之前用抑制這樣的不需要的微生物的抗細菌/真菌/病毒劑處理以優化治療結果。
II. FMT 供體 / 受體選擇和準備
患有CDI，特別是復發性CDI的患者通常被認為是FMT治療的受體。除CDI以外，其他的疾病和病況，包括消化系統或神經系統的那些，如結腸炎、腸易激綜合徵(IBS)、克羅恩病、急性移植物抗宿主病(aGvHD)、由耐多藥細菌如CRE或VRE引起的感染、多發性硬化症、帕金森氏病、糖尿病和肥胖症，也適合進行FMT治療。
FMT中使用的糞便物質獲自健康供體，然後將其加工成適當的形式，以用於即將到來的FMT程序中的預期遞送方式。直到最近，FMT供體的一般標準一直很簡單，即供體為健康的個體，無任何已知的疾病或病症，特別是在消化道中，儘管通常優先考慮與受體同一家庭的成員。
本發明人在其研究中已發現受體的胃腸道或供體糞便(其在處理後被用於移植)中的一種或多種“有益的”細菌，表1a中所示的那些的升高的存在，在患者FMT治療後可以賦予顯著的健康益處，如受體中的體重減輕、提高的胰島素敏感性、降低的血液/血清/血漿膽固醇水平。相反，當在受體的GI道或在用於FMT的供體糞便中發現其他“有害的”細菌，表1b中所示的那些的升高的存在時，在FMT治療後不會賦予這樣的健康益處。類似地，用於FMT的受體的胃腸道或供體糞便中的一種或多種“有益的”真菌，表2或3a中所示的那些的升高的存在，在FMT治療後可以在患者中賦予相同的或相似的健康益處，而當在FMT之後受體的GI道或在用於FMT的供體糞便中發現“有害的”真菌，表3b中所示的那些的升高的存在時，不會獲得這樣的健康益處。
該啟示使得能夠初步篩選作為合適的FMT供體的個體，以及初步篩選作為成功的和有益的FMT治療的可能候選者的患者，特別是在治療肥胖症或代謝綜合徵，包括胰島素不敏感和/或II型糖尿病的情形下：如果候選供體的糞便含有最低或升高水平的表1a中所示的任何一種或多種細菌(例如，每種為大於總細菌的0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%)，則候選者被認為適合作為FMT供體，且其糞便可以直接取回用於處理及隨後用於FMT；另一方面，如果候選者的糞便樣品顯示無或僅低水平的這些有益細菌(例如，每種為不大於總細菌的0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%)，則候選者被認為不是直接合適的FMT供體，且其糞便物質不應在可能的應用之前不進行必要的調整的情況下而被採集以用於FMT。在處理用於FMT之前改善供體糞便物質的一種可能的方式是人為引入一種或多種有益細菌(例如，表1a中的那些)，以便增加這樣的細菌在用於FMT的糞便物質中的存在(例如，每種物種為大於總細菌的0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%)。
相反，發明人也已揭示出用於FMT的糞便物質中的某些不需要的或有害的細菌，包括表1b中所示的那些中的一種或多種的缺失或減少的存在，在FMT治療後傾向於在患者中產生顯著的健康益處，如受體中的體重減輕、提高的胰島素敏感性、降低的血液/血清/血漿膽固醇水平。因此，如果候選供體的糞便樣品已經測試並顯示含有減少的或檢測不到的表1b中所示的一種或多種細菌水平(例如，每種為不大於總細菌的0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%或0.5%)，則個體被認為是合適的供體，且其糞便樣品可以直接採集並處理用於FMT。另一方面，如果作為潛在供體的個體的糞便已經測試且發現其中含有表1b中所示的一種或多種細菌的大量存在(特別是以升高的水平) (例如，每種為大於總細菌的0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%或0.5%)，則其被認為不適合作為用於FMT的糞便物質的供體，因此其糞便樣品不應被採集以用於FMT。
理想地，從供體糞便物質製備的且旨在用於治療肥胖症或代謝綜合徵或II型糖尿病的FMT的所需的FMT組合物具有高水平的一種或多種有益細菌(例如，表1a中所示的那些)和低水平的一種或多種有害的細菌(例如，表1b中所示的那些)。因此，雖然可以對旨在用於FMT的組合物進行改善以分別解決有益細菌的水平不足和有害細菌的過量存在的問題，但一種可能的改善方式是增加一種或多種有益細菌(例如，表1a中所示的那些)的水平，例如，通過補充旨在用於FMT的轉移物質或通過在受體的GI道中直接引入足量的此類有益細菌，任選地在同時抑制一種或多種有害的細菌(例如，表1b中所示的那些)的水平，以將受體從FMT程序可能獲得的潛在健康益處最大化。
在有關FMT受體的範圍內，如果患者被提議接受針對肥胖症或代謝綜合徵或II型糖尿病的FMT治療，並且其糞便樣品顯示升高的表1b中所示的一種或多種有害的細菌水平(例如，每種為大於0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%或0.5%的總細菌)，則患者可被認為不適合立即接受FMT，因為治療可能具有減少的產生健康益處，如減少的體重、增加的胰島素敏感性、減少的血液膽固醇的機會。患者可以在開始FMT治療之前首先接受抗細菌劑處理以減少其胃腸道中的有害的細菌，特別是表1b中所示的那些的水平，其間患者將接受富集了一種或多種有益細菌(表1a中所示的那些)和/或具有抑制的一種或多種有害的細菌水平(例如，表1b中所示的那些)的供體糞便物質。另一方面，如果被提議接受FMT治療的患者不具有表1b中所示的任何一種或多種細菌的大量的存在，特別是升高的存在(例如，每種為不大於總細菌的0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%或0.5%)，則患者可以立即開始FMT治療，而無需進行其他的準備或預處理步驟。
另外，發明人還鑒定了用於針對肥胖症或代謝綜合徵或II型糖尿病的FMT治療的“有益的”和“有害的”真菌，這可以指導以與上述相同的方式選擇合適的FMT供體和受體：例如，從供體糞便物質製備的且旨在用於治療肥胖症或代謝綜合徵或II型糖尿病的FMT的所需的FMT組合物具有升高的一種或多種有益的真菌水平(例如，表2或3a中所示的那些，每種為不小於總真菌的0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、11%、12%、13%、14%或15%)和/或較低的一種或多種有害的細菌水平(例如，表3b中所示的那些，每種為不大於總真菌的0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%或3.5%)。此外，可以進行針對FMT供體/供體糞便物質或受體的準備，以操縱有益真菌的水平(引起增加)和/或有害的真菌的水平(引起減少)，以便將來自FMT程序的健康益處優化，這類似於上述的FMT之前有益和/或有害的細菌的操縱。
在用於抑制或根除耐多藥細菌如耐碳青黴烯的腸桿菌科(CRE)和耐萬古黴素的腸球菌(VRE)的FMT治療的情形下，發明人已鑒定了“有益的”細菌和真菌，當其在FMT供體糞便中以升高的水平存在時，允許程序實現提高的治療效力。這些細菌和真菌分別在表4和5中示出。從供體糞便物質製備的且旨在用於治療耐多藥細菌的FMT的所需的FMT組合物具有升高的一種或多種有益細菌或真菌水平(例如，表4、5、15或16中所示的那些，每種為不小於總細菌或總真菌的0.02%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%或3%)。此外，可以進行針對FMT供體/供體糞便物質或受體的準備以操縱有益細菌或真菌的水平(引起增加)，以便將來自FMT程序的效力和健康益處最大化，這類似於上述的FMT之前有益細菌的操縱，例如，通過在待用於FMT的轉移物質中或直接向受體的GI道人為引入添加的和有效量的表4、5、15或16的一種或多種“有益的”細菌和/或真菌。
在用於細胞或組織移植相關的病況如急性移植物抗宿主病(aGvHD)的FMT治療的情形下，發明人已鑒定了某些“有益的”細菌和真菌，當其在FMT治療之後在受體的糞便中以升高的水平存在時，與提高的治療性效力有關。這些細菌和真菌分別在表6a和7a中示出。另一方面，還鑒定了某些“有害的”細菌和真菌，參見表6b和7b。其在FMT治療之後在受體的糞便中以升高的水平存在，這與減少的或不足的治療性結果有關。因此，當選擇潛在的FMT供體時，對於相比平均水平(例如，大於總細菌或總真菌的0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、11%、12%、13%、14%或15%)或在另一潛在供體的糞便樣品中發現的相應水平，其糞便樣品含有升高的任何一種或多種“有益的”細菌和/或真菌(表6a或7a中所示的)水平的供體，其將被認為是更合適的供體。相反，合適的供體在其糞便樣品中還應具有較低水平的一種或多種或所有表6b或7b中所示的“有害的”細菌和/或真菌。此外，可以進行針對FMT供體/供體糞便物質或受體的準備，以操縱有益細菌或真菌的水平(引起增加)和/或有害的細菌或真菌的水平(引起減少)，以便將來自FMT程序的效力和健康益處最大化，這類似於上述的在FMT之前有益細菌的操縱，例如，通過在待用於FMT的轉移物質中或直接向受體的GI道人為引入添加的和有效量的表6a或7a的一種或多種“有益的”細菌和/或真菌。可以應用在FMT之後抑制，特別是特異性抑制受體的GI道中的一種或多種或所有表6b或7b中所示的有害的細菌和/或真菌的方式，以增加治療效力或益處。
在GI道病症或病況如炎性腸病(IBD)，特別是潰瘍性結腸炎(UC)的情形下，發明人已鑒定了某些細菌和病毒，其存在，特別是以升高的水平存在，與疾病的存在相關聯。這些細菌和病毒分別在表8a和10a中示出。另一方面，還鑒定了某些其他的細菌和病毒，分別參見表8b和10b，相比健康對比物，已在患有疾病的個體中觀察到其缺失或以降低的水平存在。因此，這些特定的細菌和病毒可用於指導為提供用於治療GI病症如IBD (其包括UC和CD)的物質的目的的FMT供體挑選：較低水平的表8a或10a中所示的一種或多種細菌和/或病毒傾向於指示候選者適合作為FMT供體。相反，較高水平的表8b或10b中所示的一種或多種細菌和/或病毒傾向於指示候選者適合作為FMT供體。此外，對於在其糞便樣品中的表8a或10a中所示的一種或多種細菌和/或病毒的水平低於在另一候選者的糞便樣品中發現的相應的水平的一個潛在供體，其將被認為是比第二候選者更合適的供體。另一方面，當一個潛在的供體在其糞便樣品中的表8b或10b中所示的一種或多種細菌和/或病毒的水平高於在另一候選者的糞便樣品中發現的相應的水平時，其將被認為是比第二候選者更合適的供體。例如，為引入另外的和有效量的表8b和10b中所示的一種或多種細菌和病毒，或為減少FMT物質和/或受體的GI道中的表8a和10a中所示的細菌和病毒的量，可以使用對FMT物質和/或受體的GI道中這些相關的細菌和/或病毒的進一步的操縱，以提高用於治療IBD，特別是UC的FMT治療策略的治療效應。
在GI道病症或病況如克羅恩病(CD) (其為另一種類型的炎性腸病(IBD))的FMT治療的情形下，發明人已鑒定了某些“有益的”細菌，當其在FMT供體糞便中以升高的水平存在時，允許程序實現提高的治療效力。這些細菌示出在表11中。從供體糞便物質製備的且旨在用於治療CD的FMT的所需的FMT組合物具有升高的一種或多種有益細菌水平(例如，表11中所示的那些，每種達到不小於總細菌的0.1%、0.2%或0.5%)。此外，可以進行針對FMT供體/供體糞便物質或受體的準備，以操縱一種或多種有益細菌的水平(引起增加)，以便將來自FMT程序的效力和健康益處最大化，這類似於上述的在FMT之前有益細菌的操縱，例如，通過在待用於FMT的轉移物質中或直接向受體的GI道人為引入添加的和有效量的表11的一種或多種“有益的”細菌。
在文獻中已報道了各種用於確定樣品中的所有細菌或真菌或病毒的水平的方法，例如，利用通常共有的16S rDNA細菌序列中的序列相似性的細菌多核苷酸序列擴增(例如，通過PCR)和測序。另一方面，可以通過對其獨特基因組序列的擴增和測序來確定任何給定細菌的水平。百分比豐度常被用作指示細菌在給定環境中的相對水平的參數。
III. 利用有益微生物的治療方法
本發明人的發現揭示了(1)個體的糞便或GI道或者來源於用於FMT的供體糞便的轉移物質中的某些“有益的”細菌(例如，表1a、4、6a、10、11或15中所示的那些)、“有益的”真菌(例如，表2、3a、5、7a或16中所示的那些)、“有益的”病毒(例如，表8b中所示的那些)，或者某些“有害的”細菌(例如，表1b、6b或10a中所示的那些)、“有害的”真菌(例如，表3b或7b中所示的那些)、“有害的”病毒(例如，表8a中所示的那些)，與(2)疾病的存在/不存在或通過FMT治療的方式向FMT受體賦予的顯著的健康益處，如體重減輕、提高的胰島素敏感性、降低的血液膽固醇水平、耐多藥細菌如CRE和VRE的抑制、某些病症如aGvHD、UC或CD的減輕的存在/缺失，之間存在著直接的相關性。該發現不僅允許設計初步的篩選過程來鑒定合適的供體和受體以獲得來自FMT程序的治療效力和/或健康益處，其還使得能夠進行不同的方法，通過在FMT之前調節(增加或降低)供體糞便物質和受體中的如這裡的表中所示的一種或多種有益的或有害的細菌、真菌或病毒的水平，來提高或優化FMT程序所賦予的潛在健康益處。
如上述章節中所論述的，當候選供體的糞便經測試且發現其中含有升高的諸表1b、3b、6b、7b、8a或10a中所示的那些的一種或多種有害的細菌或真菌或病毒水平(例如，每種物種分別為大於糞便樣品中的總細菌、總真菌或總病毒的0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%或3.5%)時，候選者被認為不適合作為FMT供體，且其糞便不應被採集以用於FMT而不進行預處理或改善，因為如果不進行改善，這樣的糞便物質不可能對FMT治療的受體產生健康益處，如體重減輕、增加的胰島素敏感性或降低的血液膽固醇、耐多藥細菌的清除、aGvHD、UC或CD的減輕。類似地，當提議的FMT供體其糞便經測試且發現其中含有不足的諸表1a、2、3a、4、5、6a、7a、8b、10b、11、15或16中所示的那些的一種或多種有益細菌或真菌或病毒水平(例如，每種為小於糞便樣品中的總細菌、總真菌或總病毒的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、11%、12%、13%、14%或15%)時，所提議的供體被認為是旨在賦予健康益處，如體重減輕、對胰島素反應敏感、降低的血液膽固醇水平、耐多藥細菌的清除和aGvHD、UC或CD的減輕的不合適的FMT供體，且其糞便物質不應被直接用於FMT，這是由於缺少賦予這樣的有益健康效應的前景，除非對糞便物質進行充分的改善。在預期缺少來自FMT治療的健康益處的這些情形下，可以基於本發明人的發現容易地進行改善，例如，可改善來自供體的糞便物質，以增加一種或多種有益細菌的水平(例如，通過引入額外量的此類細菌的方式將表1a、4、6a、10b、11或15中所示的一種或多種細菌的水平增加至大於總細菌的0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%、2%、2.5%、3%、3.5%或4%)，和/或降低一種或多種有害的細菌的水平(例如，通過使用此類細菌的特定抑制劑的方式將表1b、6b或10a中所示的一種或多種細菌的水平減少至小於總細菌的0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%或0.5%)。可以採用具有類似預期目標的預處理方案來準備不久將接受FMT治療的患者，以將其獲得諸如上文和本文中所述的那些的健康益處的可能性最大化。
首先，對於已被考慮接受FMT但由於在其糞便樣品中發現了升高的表1b、3b、6b、7b、8a或10a中所示的一種或多種有害的細菌或真菌或病毒水平(這指示減少的有益FMT結果機會)也已被認為是不合適的FMT受體的患者，可以在開始FMT之前採取措施來降低此類細菌或真菌或病毒的水平，以便可以獲得FMT程序的大得多的實現有益結果的機會。例如，通常或具體而言，在開始旨在用於治療肥胖症/患者體重操縱或用於治療代謝綜合徵或用於治療II型糖尿病的FMT程序之前，可以給予患者有效量的能夠抑制表1b中所示的細菌的生長或增殖的抗細菌劑，以便患者的消化道和糞便中的此類有害的細菌的水平被顯著降低(例如，每種為不大於總細菌的0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%或0.5%)。類似地，通常或具體而言，在開始旨在用於治療肥胖症/患者體重操縱或用於治療代謝綜合徵或用於治療II型糖尿病的FMT程序之前，可以給予患者有效量的能夠抑制表3b中所示的真菌的生長或增殖的抗真菌劑，以便患者的消化道和糞便中的此類有害的真菌的水平被顯著降低(例如，每種為不大於總真菌的0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%或1.5%)。
對於aGvHD的治療，通常或具體而言，在開始旨在用於治療aGvHD的FMT程序之前，可以給予患者有效量的能夠抑制表6b中所示的細菌的生長或增殖的抗細菌劑，以便患者的消化道和糞便中的此類有害的細菌的水平被顯著降低(例如，每種為不大於總細菌的0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%)。類似地，通常或具體而言，在開始旨在用於治療aGvHD的FMT程序之前，可以給予患者有效量的能夠抑制表7b中所示的真菌的生長或增殖的抗真菌劑，以便患者的消化道和糞便中的此類有害的真菌的水平被顯著降低(例如，每種為不大於總真菌的0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%)。
對於潰瘍性結腸炎(UC)的治療，通常或具體而言，在開始旨在用於治療UC的FMT程序之前，可以給予患者有效量的能夠抑制表8a中所示的病毒的生長或增殖的抗病毒劑，以便患者的消化道和糞便中的此類有害的細菌的水平被顯著降低(例如，每種為不大於總病毒的0.01%、0.02%、0.05%或0.1%)。類似地，通常或具體而言，在開始旨在用於治療UC的FMT程序之前，可以給予患者有效量的能夠抑制表10a中所示的細菌的生長或增殖的抗細菌劑，以便患者的消化道和糞便中的此類有害的細菌的水平被顯著降低(例如，每種為不大於總細菌的0.01%、0.02%、0.05%或0.1%)。
為此目的，在其FMT程序之前將至少兩次測定患者的有害的細菌或真菌或病毒的水平：一次在初始篩選階段，第二次在初始水平被認為對有益FMT結果而言太高之後以及在已給予患者抗細菌劑之後。一旦證實有害的細菌或真菌或病毒的水平降低至將允許令人滿意的FMT結果的水平或百分比，即表示患者已準備好接受FMT治療。
其次，對於由於在其糞便中低水平的諸表1a、2、3a、4、5、6a、7a、8b、10b、11、15或16中所示的那些的一種或多種有益細菌或真菌或病毒而已被認為不適合用作FMT供體的候選者，其可能作為供體是不合格的，而更偏向於糞便樣品顯示更有利的細菌、真菌或病毒特性的另一個體。在該替代選擇中，其糞便物質可能仍被使用，且預期的不令人滿意的FMT結果可以通過在供體糞便物質中補充有效量的有益細菌或真菌或病毒來進行補救。例如，可以在其被處理以用於治療肥胖症或代謝綜合徵或II型糖尿病的FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表1a中所示的一種或多種細菌，以便增加糞便物質中的細菌水平(例如，達到糞便物質中的總細菌的至少0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.2%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%或2%)。類似地，可以在其被處理以用於治療肥胖症或代謝綜合徵或II型糖尿病的FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表2或3a中所示的一種或多種真菌，以便增加糞便物質中的真菌水平(例如，達到糞便物質中的總真菌的至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%)。
在根除耐多藥細菌如CRE或VRE的情形下，可以在其被處理以用於FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表4或15中所示的一種或多種細菌，以便增加糞便物質中的細菌水平(例如，達到糞便物質中的總細菌的至少0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%或3%)。類似地，可以在其被處理以用於FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表5或16中所示的一種或多種真菌，以便增加糞便物質中的真菌水平(例如，達到糞便物質中的總真菌的至少0.01%、0.02%、0,05%或0.1%)。
在治療aGvHD的情形下，可以在其被處理以用於FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表6a中所示的一種或多種細菌，以便增加糞便物質中的細菌水平(例如，達到糞便物質中的總細菌的至少0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%或4%)。類似地，可以在其被處理以用於FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表7a中所示的一種或多種真菌，以便增加糞便物質中的真菌的水平(例如，達到糞便物質中的總真菌的至少0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、11%、12%、13%、14%或15%)。
在治療潰瘍性結腸炎(UC)的情形下，可以在其被處理以用於FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表10b中所示的一種或多種細菌，以便增加糞便物質中的細菌水平(例如，達到糞便物質中的總細菌的至少0.1%、0.2%或0.5%)。類似地，可以在其被處理以用於FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表8b中所示的一種或多種病毒，以便增加糞便物質中的病毒水平(例如，達到糞便物質中的總病毒的至少0.1%、0.2%或0.5%)。
在治療克羅恩病(CD)的情形下，可以在其被處理以用於FMT之前，從外部來源向供體糞便物質中引入表11中所示的一種或多種細菌，以便增加糞便物質中的細菌水平(例如，達到糞便物質中的總細菌的至少0.1%、0.2%或0.5%)。
相反，對於由於在其糞便中較高水平的諸表1b、3b、6b、7b、8a或10a中所示的那些的一種或多種有害細菌或真菌或病毒而已被認為不適合用作FMT供體的候選者，其作為供體可能是不合格的，而更偏向於糞便樣品顯示更有利的細菌特性的另一個體。在該替代選擇中，其糞便物質仍可以被使用，且預期的不令人滿意的FMT結果可通過用有效量的能夠分別抑制此類有害的細菌或真菌或病毒的生長或增殖的抗細菌劑或抗真菌劑或抗病毒劑處理候選供體或其糞便物質來補救，可以以與上文和本文中所述的工作基本上相同的方式給予，以抑制或清除受體的GI道中的不需要的細菌、真菌或病毒。任選地，可以通過人為添加諸表1a、2、3a、4、5、6a、7a、8b、10b、11、15或16中所示的那些的一種或多種有益細菌/真菌/病毒至達到大量水平(例如，每種分別為大於總細菌、真菌或病毒的0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、11%、12%、13%、14%或15%)，來進一步改善在處理後採自供體的糞便樣品。因為供體的身體，特別是胃腸道，含有大量的微生物集合，其中的許多對腸微生物群的健康和FMT的成功很重要，所以為此目的的有用的抗細菌劑/抗真菌劑/抗病毒劑優選不是分別殺死所有細菌、真菌或病毒的廣譜性的試劑。而是，其可以是較窄地和精確地靶向不需要的細菌、真菌或病毒的試劑，而不顯著地影響其他的細菌、真菌或病毒，包括密切相關的那些。儘管試劑可以具有任何化合物性質，但小多核苷酸(例如，siRNA、miRNA、miniRNA、lncRNA或反義DNA/RNA)在實現破壞所靶向的細菌、真菌或病毒的生命週期中的一種或多種關鍵基因的表達，以便僅特異性抑制靶標物種的增殖而不顯著影響其他密切相關的物種的特定任務方面可能是最有效的。
在完成FMT程序後不久，可以通過基於每天連續測試糞便樣品中的有益和有害的細菌、真菌或病毒的水平(直至FMT之後5天)來進一步監測受體，同時也監測治療的病況的臨床症狀以及預期的健康益處以評估FMT結果和受體中的相應的微生物水平：在治療肥胖症/患者體重操縱的情形下，可以結合實現的諸如體重減輕、胰島素敏感性提高和血液膽固醇降低的健康益處的觀察來監測表1a和1b中所示的細菌的水平和表2、3a和3b中所示的真菌的水平；在治療由耐多藥細菌如CRE或VRE引起的病況和根除此類有害細菌的情形下，可以結合實現的諸如相關症狀的減輕和CRE或VRE的抑制或清除的健康益處的觀察來監測表4或15中所示的細菌的水平以及表5或16中所示的真菌的水平；在治療aGvHD的情形下，可以結合實現的諸如aGvHD相關症狀的減輕的健康益處的觀察來監測表6a和6b中所示的細菌的水平以及表7a和7b中所示的真菌的水平；在治療潰瘍性結腸炎(UC)的情形下，可以結合實現的諸如UC相關症狀的減輕的健康益處的觀察來監測表10a和10b中所示的細菌的水平以及表8a和8b中所示的病毒的水平；並且在治療克羅恩病(CD)的情形下，可以結合實現的諸如CD相關症狀的減輕的健康益處的觀察來監測表11中所示的細菌的水平。
IV. 用於改善的 FMT 的試劑盒和組合物
本發明還提供了通過涉及FMT的各種治療性和/或預防性治療方案遞送的可用於提高治療效力和健康益處的新的試劑盒和組合物。例如，在用於治療需要FMT的患者(例如，用於肥胖症/體重控制、抑制或根除耐多藥細菌如CRE或VRE、減輕急性移植物抗宿主病，以及減輕IBD如UC或CD)的試劑盒中，第一組合物旨在用於移植到患者或FMT受體中，且第二組合物用於：(1)增加一種或多種有益的細菌(表1a、4、6a、10b、11或15中所示的那些)、真菌(表2、3a、5、7a或16中所示的那些)或表8b中所示的病毒的水平；或(2)降低一種或多種有害的細菌(表1b、6b或10a中所示的那些)、真菌(表3b或7b中所示的那些)或表8a中所示的病毒的水平—該組合物可能旨在添加至第一組合物中，或者其可能旨在給予至受體，例如，直接放置在GI道中。第一組合物包含來自供體的糞便物質，其已根據在FMT程序中的遞送方式被處理、配製和包裝為合適的形式，其可以為通過直接放置在受體的下胃腸道中(例如，濕的或半濕潤的形式)或通過口服(例如，冷凍乾燥封裝的)。在一些情形下，第二組合物可以包含足夠的或有效量的一種或多種有益的細菌(表1a、4、6a、10b、11或15中所示的那些)、真菌(表2、3a、5、7a或16中所示的那些)，或表8b中所示的病毒，以便可以在FMT之前將其添加至第一組合物中，目的是為了將實現治療效力和/或向受體賦予健康益處的前景優化。在其他情形下，第二組合物包含能夠抑制一種或多種有害的細菌(表1b、6b或10a中所示的那些)、真菌(表3b或7b中所示的那些)，或表8a中所示的病毒的生長/增殖的抗細菌劑或抗真菌劑或抗病毒劑，所述試劑可以為殺死細菌、真菌或病毒的廣譜試劑，或者有害的細菌或真菌或病毒的特異性抑制劑，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑，以便可以在程序之前不久給予FMT受體組合物，在程序期間同時給予組合物，或者在程序後立即給予組合物。組合物經配製以用於預期的遞送抗細菌劑、抗真菌劑或抗病毒劑的方法，例如，通過注射(靜脈內、腹膜內、肌內或皮下注射)或通過口服或通過局部放置(例如，栓劑)。第一和第二組合物通常單獨保存在試劑盒的兩個不同的容器中。在一些情形下，存在用於增加有益的細菌/真菌/病毒和用於抑制有害的細菌/真菌/病毒的組合物，並且其在單獨的容器中提供，作為試劑盒的第二和第三組分。通常，試劑盒將還包括印刷物質，其為試劑盒用戶提供詳細的說明，如提供給予受體第一和第二(以及任選地第三)組合物的時間表和劑量安排的信息。
在本發明的另一方面，可以設計用於FMT的具有增加的效力的替代組合物，其含有至少這兩種組分：(1)含有活的糞便微生物的供體糞便物質，和(2)抗細菌劑，其特異性地抑制一種或多種有害的細菌(例如，表1b、6b或10a中所示的那些)的生長或增殖，但對其他細菌，特別是表1a、4、6a、10b、11或15中所示的那些不顯示這樣的壓抑性或抑制性效應；或者抗真菌劑，其特異性地抑制一種或多種有害的真菌(例如，表3b或7b中所示的那些)的生長或增殖，但對其他真菌，特別是表2、3a、5、7a或16中所示的那些不顯示這樣的壓抑性或抑制性效應；或者抗病毒劑，其特異性地抑制一種或多種有害的病毒(例如，表8a中所示的那些)的生長或增殖，但對其他細菌，特別是表8b中所示的那些不顯示這樣的壓抑性或抑制性效應。
組分(2)優選不是廣譜性的殺細菌/真菌/病毒劑；而是，其應為分別特異性靶向有害的細菌/真菌/病毒(例如，表1b、3b、6b、7b、8a或10a中所示的那些)的抗細菌劑/抗真菌劑/抗病毒劑。例如，其可以具有短多核苷酸性質，例如，小抑制性RNA、微小RNA、小RNA、lncRNA或反義寡核苷酸，其能夠破壞靶向的有害的細菌/真菌/病毒的生命週期中的至少一個關鍵基因的表達，使得試劑能夠僅特異性靶向所述細菌/真菌/病毒，而不顯著影響其他密切相關的細菌/真菌/病毒。組分(2)在供體的糞便含有太高的一種或多種有害的細菌/真菌/病毒水平而不能允許令人滿意的FMT結果的情形下特別有用，因為其能夠局部地和特異性地抑制此類不需要的細菌/真菌/病毒的增殖，以便確保FMT成功，即使供體糞便物質的初始質量不太令人滿意。
實施例
以下實施例僅通過說明的方式而非通過限制的方式提供。本領域技術人員將容易認識到，可以改變或修改各種非關鍵參數以產生基本相同或相似的結果。
引言
本發明的目的是確定供體和受體糞便細菌、病毒組和真菌組是否以及如何影響FMT在各種人類病況中的效力。這些病況包括但不限於：肥胖症或營養不良、代謝性疾病、2型糖尿病、炎性腸病、腸易激綜合徵、耐抗生素感染和移植物抗宿主病。本發明的實際用途包括優化的供體選擇、FMT實施之前和FMT實施期間受體和供體中的供體/患者糞便細菌、病毒和真菌特性分析、實施FMT之前根據具體細菌、病毒組和真菌水平/豐度(包括且達到物種水平)對患者分級，以及隨後的在FMT治療之前對這些受體進行連續的抗真菌或抗細菌處理。已提供了確定的“有利的”細菌、病毒組和真菌標準集合以用於確立供體糞便、供體糞便庫及其衍生的產品，從而優化診斷和治療。
實施例 1 肥胖症和體重操縱 A. 肥胖症和體重操縱的實驗模型 背景
全世界範圍內，肥胖症的流行率正以驚人的速度增長。在中國，估計有超過1億人患有糖尿病。類似地，在過去的二十年中，中國超重和肥胖個體的患病率從3.7%增加到了19.0%，增長了四倍。目前，基於飲食和體育鍛煉的非藥物干預措施在產生持續的體重減輕方面取得了有限的長期成功。諸如減肥藥物或減肥手術之類的替代方法受到疾病、副作用、高昂的費用以及與手術相關的發病率的未完全解決的限制。現有的療法不足以降低肥胖症的發病率和死亡率。
最近，越來越多的證據表明，肥胖症與腸微生物群組成的變化有關，且肥胖微生物組從飲食中獲取能量的效率更高。另外，瘦型(lean)動物與肥胖動物之間的細菌組成也存在差異。因此，改變腸道微生物群的組成已成為一種減輕體重和提高胰島素敏感性的新的治療方法。在鼠類和人類研究中，擬桿菌門和厚壁菌門分類在微生物群中佔優(92.6%)，但與瘦型對比物相比，肥胖個體具有較低比例的擬桿菌門和較高水平的厚壁菌門。相比用“瘦型微生物群”進行的定殖，用“肥胖微生物群”對無菌小鼠進行定殖導致總體脂明顯更大的增加，這表明腸微生物群可作為肥胖症病理生理的另一貢獻因素。還可以通過從人類供體轉移糞便微生物群，在無菌的小鼠中誘導肥胖和瘦型表型。最後，動物研究暗示了因果關係，因為不良表型可以經糞便移植物轉移。這些數據已導致使用微生物群治療作為代謝綜合徵和肥胖症的潛在治療方法。
糞便微生物群移植(FMT)可以恢復腸內微生物生態，並已被證明是治療復發性艱難梭菌感染的一個突破。此外，正在進行臨床試驗以評估其在其他病況中的用途，包括炎性腸病、腸易激綜合徵、糖尿病，非酒精性脂肪性肝炎和肝性腦病。人類中的早期結果表明，當將來自瘦型供體的FMT移植到患有代謝綜合徵的對象中時，引起胰島素的敏感性的顯著提高以及腸微生物多樣性的增加，包括產丁酸鹽細菌菌株的顯著增加。該療法通常具有良好的耐受性且看上去很安全。FMT是否可以有效治療肥胖症還有待確定。另外，從供體到營養不良或體重過輕的個體的FMT可以操縱微生物群，導致預防或逆轉體重減輕。FMT在肥胖症和/或營養不良中的功效根據基於其微生物群特性(包括但不限於細菌、病毒組或真菌)的最優的/有利的供體的選擇而有所不同。供體和受體微生物株系之間的相容性也可能是成功的移植結果的原因。
方法
人類對象
糞便樣品獲自13名健康供體(3名女性、7名男性和3名未報告性別的參與者，年齡21-67歲，體質指數BMI 18.3-23.0)。13名健康供體包括健康的中國人個體。這些供體為D4、D8、D9，其為人類臨床試驗的FMT供體；以及供體1-9和供體19，其為隨機選擇的。
動物模型和人類至小鼠FMT
年齡和性別匹配的C57小鼠被餵食高脂飲食4週，以建立肥胖症模型。如果其體重超過對照的20%，則認為肥胖症模型建立成功。然後每週兩次給肥胖小鼠灌服來自13名健康人類供體的糞便或PBS (對照)。其飲食從高脂飲食變為正常飲食。每週兩次測量體重。第2次FMT之後進行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)和胰島素耐量試驗(ITT)。在研究結束時測量血漿葡萄糖水平和脂質特性，包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。
糞便DNA分離和宏基因組測序
使用DNeasy血液和組織試劑盒(QIAGEN)，根據廠商的方案提取採自13名供體的糞便樣品DNA，並進一步純化。通過首先根據廠商說明書(illumina)構建具有350bp的插入大小的配對末端文庫，並在NovaSeq Illumina測序儀上測序來進行宏基因組測序。利用MetaPhlan2，使用默認設置計算群落組成。在R程序包vegan(R package vegan)中計算細菌分類學概要、微生物多樣性的稀疏性分析、組成差異(通過未加權的UniFrac距離表示的差異度值)。
發現
當一起分析所有供體時，FMT組中的體重減輕百分比並不顯著高於PBS對照中的那些
將第二次FMT/PBS灌服後3天小鼠的體重與第一次FMT/PBS灌服之前小鼠的體重進行了比較。小鼠被分到FMT組(n=39)和PBS對照組(n=6)中。與基線相比，FMT組中的中值百分比體重減輕為13.17%(IQR: 6.08%-18.89%)，而PBS對照組中為11.36%(IQR: 8.43%-15.61%)。觀察到相比對照，通過FMT的傾向更高百分比體重減輕的趨勢，但不顯著。
通過FMT的體重減輕效應根據供體而不同
為了分析供體的影響，根據供體對小鼠分組。13個組的小鼠接受來自不同供體的FMT(每組包含3隻小鼠)，且1個對照組接受PBS (6隻小鼠)。11個組相比對照實現了更高百分比的體重減輕。接受來自供體M9的糞便的小鼠實現了最高量的體重減輕[平均百分比體重減輕19%；標準偏差(SD) 4.9%]。儘管FMT總體誘導了體重減輕，但效果根據供體而不同。因此選擇最佳供體是必需的。
人類至小鼠FMT與肥胖小鼠中提高的胰島素敏感性有關
在胰島素耐量試驗(ITT)中總共納入了60隻小鼠，54隻接受FMT，且6隻接受PBS。與PBS對照組相比，FMT組中的小鼠顯示顯著減小的ITT曲線下面積(AUC) (P＜0.05)，這表明提高的從血流清除葡萄糖的能力。這些數據表明FMT提高了肥胖小鼠中的胰島素敏感性。
相比接受PBS的那些，接受來自人類糞便的FMT的肥胖小鼠中的血液血清總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平顯著的降低
在第二次FMT/PBS灌服後測量了總共33隻小鼠(10個每組3隻小鼠的FMT組，每組接受來自10名不同的供體的FMT，以及1個3隻小鼠的對照組，接受PBS)中的血液血清TC和LDL水平。相比PBS對照組，所有FMT組均顯示顯著降低的TC和LDL水平，而與供體無關(p＜0.001)。
人類供體糞便的細菌特性顯示細菌組成和豐度的極大變化
13名供體之間的比較發現，細菌α多樣性(香農多樣性指數和辛普森多樣性指數)以及細菌在門水平上的相對豐度差異較大。
對於體重減輕“有利的”和“不利的”細菌
肥胖小鼠中的體重減輕比例顯示與22種細菌的顯著的相關性
從宏基因組測序結果計算特定細菌的相對豐度。為了鑒定與FMT對體重減輕的供體效應相關的特定細菌，將在接受來自13名不同的供體的第二次FMT的每組小鼠(n=3)中觀察到的特定細菌的相對豐度與平均百分比體重減輕進行關聯。發現5種細菌與平均百分比體重減輕具有顯著的正相關性，且發現17種細菌與平均百分比體重減輕具有顯著的負相關性。
選擇用於誘導體重減輕的“有利的”FMT供體的細菌標準
在替代性的分析中，將13名供體分類為“有利的”供體和“不利的”供體。“有利的供體”定義為相比13個小鼠組間的均值(13.17%)或中值(13.67%)百分比體重減輕，能夠誘導更多的體重減輕的供體，且餘下的定義為“不利的供體”。使用線性判別分析(LDA)效應量(LEfSe)分析來分析2個組之間的細菌相對豐度(線性判別分析效應量＞2，調整的p值＜0.05被認為顯著)。
本發明人鑒定了在“有利的”供體(對於體重減輕的有利的細菌)中過表達的13種細菌分類和在“不利的”供體(對於體重減輕不利的細菌)中過表達的7種細菌分類。
集合了上述鑒定的對於體重減輕“有利的”和“不利的”細菌及其相對豐度的概要顯示在表1a和表1b中。
B. 用於肥胖症和體重操縱的 FMT 的人類研究 方法
人類中的橫斷面研究
採集了來自23名肥胖對象和15名對照的糞便樣品，以比較其微生物特性。肥胖對象定義為具有的BMI ≥28kg/m
2
，而對照對象定義為具有的BMI≥18.5kg/m
2
且＜23kg/m
2
。
糞便微生物群移植(FMT)的隨機對照試驗
在橫斷面研究所招募的肥胖對象中，也招募了還患有2型糖尿病的12名對象，臨床試驗標題為“患有2型糖尿病的肥胖對象中的影響體重和血糖控制的糞便微生物群移植(FMT)的隨機的安慰劑對照研究(A randomised placebo-controlled study of fecal microbiota transplant (FMT) to impact body weight and glycemic control in obese subjects with type 2 diabetes mellitus)” (ClinicalTrials.gov上的參考號為：NCT03127696)。在該研究中，對象被隨機分到3個臂中：1) FMT連同生活方式改造計劃(LMP)，2)僅FMT，和3)假試驗連同LMP。主要結果定義為相比基線5%的體重減輕，其為在接受任何干預之前隨機化的體重。糞便樣品在基線處採集。在第0、4、8、12、16、20、24和52週測量體重。
FMT程序
來自一般人群、配偶或伴侶、一級親屬、其他親屬、朋友和對象瞭解或不瞭解的其他人的志願者被招募為供體以提供用於FMT的糞便。為了確保供體是健康的且適合糞便捐贈，首先利用問卷調查對供體進行篩選，然後進行糞便和血液測試以排除任何感染。另外，僅納入了BMI＜23 kg/m
2
的瘦型供體。在供體於威爾斯親王醫院(the Prince of Wales Hospital)提供糞便後不久，用無菌鹽水(0.9%)稀釋糞便。將該溶液混合並用過濾器過濾。然後將所得的上清液保存為冷凍的FMT溶液，以用於將來的FMT。對於隨機化的接受FMT的對象，使用來自單個供體的FMT溶液或來自多個供體的混合的糞便。對於隨機化的接受假試驗的對象，輸注生理鹽水。在程序過程中，經OGD在2-3分鐘內將100-200ml FMT溶液或無菌鹽水注入遠端十二指腸或空腸。
生活方式改造計劃(LMP)
由營養師在第0、1、2、4、6、8和12週診斷隨機分配到LMP的對象。營養師在他們的飲食習慣、體育活動方式和其他生活方式習慣方面為對象給予指導和糾正。在每次諮詢營養師之前，對象還記錄了他們7天的飲食史。
糞便DNA提取和宏基因組測序
使用Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication試劑盒，根據方案分離糞便DNA。通過末端配對、純化和PCR擴增的過程來構建DNA文庫。在DNA文庫構建之後，由中國北京的Novogene通過Illumina Novaseq 6000，利用配對末端150bp測序策略對DNA文庫進行測序。
讀取質量控制和預處理
通過Fastp對原始序列讀取進行質量篩選，並去除適配子。通過Kneaddata，利用默認參數(參考數據庫：GRCh38 p12)去除人宿主污染讀取。對於宏基因組數據表，通過歸入NCBI真菌Refseq數據庫(2018年9月20日下載)中，在Kraken2中處理乾淨讀取(clean reads)。使用Bracken來估計物種相對豐度表以用於下游分析。
統計分析
使用線性判別分析效應量(LEfSe)模型來鑒定具有不同組間相對豐度的物種。僅滿足＞2的LDA閾值的分類被認為是顯著的。對於通過LEfSe模型鑒定的物種，進行了替代性分析以通過Wilcoxon秩和檢驗驗證其組間相對豐度的差異。P值＜0.05被認為是統計上顯著的。
發現
對照中的甜菜生尾孢和納加哈薩克斯坦酵母的相對豐度明顯高於肥胖對象中的那些
在橫斷面研究中，比較了23名肥胖對象和15名對照[肥胖對象的中值年齡為52歲(IQR: 47-60歲)，且對照為57歲(IQR: 54-60歲)；60%的肥胖對象為男性，且69.6%的對照為女性]之間的糞便真菌群落。通過LEfSe分析，發現對照中的兩種真菌甜菜生尾孢和納加哈薩克斯坦酵母的相對豐度明顯高於肥胖對象中的那些。肥胖對象中的中值豐度為0.045 (IQR: 0.038-0.050)，且對照中的為0.056 (IQR: 0.045-0.063) (p=0.016)。肥胖對象中的中值豐度為0.004 (IQR: 0.003-0.006)，且對照中的為0.006 (IQR: 0.004-0.007) (p=0.044)。這2種真菌是對體重減輕有利的真菌(表2)。
接受FMT或LMP後實現體重減輕的對象和未實現體重減輕的對象之間的4種真菌的相對豐度存在顯著差異
來自隨機對照試驗，已達到16週隨訪的12名對象被納入分析中。為了鑒定能夠預測體重減輕的真菌，將對象分成“體重減輕”和“非體重減輕”組，且對其基線糞便真菌特性進行了比較。如果其在16週時的體重減輕相比基線為大於5%，則將對象分入“體重減輕”組；而如果其在16週時的體重減輕相比基線為小於5%，則將對象分入“非體重減輕”組。3例被分入“體重減輕”組(中值百分比體重減輕為5.3%)，且9例被分入“非體重減輕”組(中值百分比體重減輕為0.2%)。
通過LEfSe分析，發現“體重減輕”組中的1種真菌法夫駒形氏酵母(
Komagataella phaffii
)明顯高於“非體重減輕”組中的。該物種在基線糞便樣品中的較高相對豐度能夠預測成功的隨後的通過FMT或LMP干預的體重減輕。補充該“有利的物種”可以促進體重減輕(表3a)。
另一方面，LEFSe分析還顯示鑒定出了“非體重減輕”組中的3種真菌的相對豐度明顯高於“體重減輕”組中的。這些真菌是戴爾凱式有孢圓酵母(
Torulaspora delbrueckii
)、蚱蜢微孢子蟲(
Encephalitozoon romaleae
)和乳酸克魯維酵母(
Kluyveromyces lactis
)。基線糞便樣品中這些“不利的”物種的較高的相對豐度能夠預測對抗通過FMT或LMP的體重減輕(表3b)。
實施例 2 耐多藥生物體 ( 耐碳青黴烯的腸桿菌科 (CRE) 和耐萬古黴素的腸球菌 (VRE)) CRE 中的 FMT ：疾病和 FMT 結果的細菌和真菌決定因素 背景
耐多藥生物體(MDRO)對全球人群構成日益嚴重的公眾健康威脅。在世界範圍內，包括耐碳青黴烯的腸桿菌科(CRE)和耐萬古黴素的腸球菌(VRE)在內的各種MDRO的發病率已日益增多，並且在某些國家已經流行。例如，在鄰近香港的國家中，產肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella
pneumoniae)碳青黴烯酶(KPC)和產新德裡金屬-β-內醯胺酶(NDM)的腸桿菌科在中國流行且分佈廣泛，而產IMP的腸桿菌科則在臺灣和日本廣泛存在。來自醫院管理局的數據顯示，產碳青黴烯酶的腸桿菌科(CPE)病例數量從2012年的36例增加到2015年的134例。最近在香港一家三級醫院報道了VRE大爆發，涉及＞200例患者。在一些國家，MDRO的傳播不僅限於醫院環境，而且在人群中也很普遍。
大多數MDRO定殖和持續的主要場所是在胃腸道中。攜帶可以持續數月，在出院後一年，有多達40%的個體仍具有定殖。在醫院和長期護理機構中已經報告了MDRO暴發。約有10%的MDRO定殖的患者會發展出由相同生物體引起的臨床感染。這些MDRO引起的感染具有很高的發病率和高達50%的死亡率，部分是由於安全和有效的抗微生物療法的選擇有限。目前，MDRO傳播的控制主要是通過感染控制措施，並且尚無行之有效的MDRO腸道定殖根除療法。
越來越多的證據表明，腸道微生物群在控制腸道病原菌定殖和感染中起著重要作用。MDRO攜帶者中腸道微生物群的組成和多樣性與非攜帶者不同。腸道共生細菌例如通過誘導上皮細胞產生抗菌蛋白來幫助調節黏膜的先天免疫力。鞭毛蛋白已被證明可在小鼠中誘導產生RegIIIγ (一種抗微生物蛋白)，並減少VRE定殖。也已證明給予小鼠專性厭氧共生細菌可顯著減少VRE定殖。初步證據(主要來自軼事報告)表明，MDRO人類攜帶者中的糞便微生物群移植(FMT)在清除包括CRE和VRE在內的各種MDRO的腸道定殖方面是安全的和潛在有效的，即使在免疫力低下的患者中也是如此。
利用宏基因組測序，對健康對照和FMT受體的微生物特性進行評估，以鑒定與CRE定殖相關的微生物。還對FMT供體的微生物特性以及FMT之前和FMT之後受體的微生物特性進行了比較，以鑒定與CRE清除相關的物種。這些物種在為提高FMT效力的供體或微生物產品選擇以及用於FMT之後成功的CRE清除的預測標記物方面起著重要作用。
方法
根除CRE和VRE的FMT的人類臨床試驗
年齡≥18歲、具有相隔一週的兩次或更多次糞便或直腸拭子CRE或VRE陽性，並且在輸注FMT之前至少48小時未接受抗微生物治療的患者被招募至臨床試驗中。患有需要進行抗微生物治療的CRE或VRE活動性感染、懷孕、活動性胃腸道感染或炎症性病症、近期進行過腹部內手術、患有短腸綜合徵，或使用改變胃腸運動的藥物的患者被排除在外。CRE定義為存在對任何碳青黴烯類具有耐受性的任何腸桿菌科。VRE定義為存在對萬古黴素具有耐受性的腸球菌。在該研究中，患者接受2次利用冷凍供體糞便樣本的FMT。在2-3分鐘內，經OGD將100-200ml FMT溶液或無菌鹽水注入遠端十二指腸或空腸。在FMT之前和之後預先從患者採集糞便樣品。
無CRE或VRE的人類對象
2名無CRE或VRE的對象的糞便樣品被納入作為對照。
糞便DNA提取和宏基因組測序
通過末端配對、純化和PCR擴增的過程來構建DNA文庫。使用NexteraXT DNA文庫製備試劑盒(Illumina, California, USA)，根據廠商指導製備測序文庫。在NovoSeq PE150 (Novogene, Tianjin, China; 標準的2×150 bp運行)上進行測序，每個樣品產生12G原始數據。
讀取質量控制和預處理
通過Fastp對原始序列讀取進行質量篩選，並去除適配子。通過Kneaddata，利用默認參數(參考數據庫：GRCh38 p12)去除人宿主污染讀取。對於宏基因組數據表，通過歸入NCBI真菌Refseq數據庫(2018年9月20日下載)，在Kraken2中處理乾淨讀取。使用Bracken估計物種相對豐度表以用於下游分析。
統計分析
使用線性判別分析效應量(LEfSe)模型來鑒定具有不同組間相對豐度的物種。僅滿足＞2的線性判別分析(LDA)閾值的分類被認為是顯著的。
發現
用於根除耐碳青黴烯的腸桿菌科腸道定殖的糞便微生物群移植
招募至臨床試驗中的兩名患者在FMT之後成功清除了CRE。受體1 (女性，年齡90歲)間隔5天進行了2次FMT，即第0天和第5天。CRE在第11天測試為陰性，並保持陰性直至第一次FMT之後第5週。然後她發展出腳部潰瘍感染並在第一次FMT之後第6週至第19週接受了抗生素治療。受體1的CRE在第14週和第19週測試為陽性。在第22週，在完成4個療程的奧格門丁(Augmentin)後其再次測試為陰性。受體2 (男性，年齡70歲)連續兩天接受了兩次FMT，並且在第1、3、6週CRE隨訪測試的所有結果均為陰性。
在FMT之前和FMT之後採集了來自受體1和受體2的糞便樣品。兩名受體接受了來自同一供體的FMT。
在治療CRE中對選擇FMT供體“有利的”和“不利的”細菌
患有CRE的患者的細菌特性與健康對照具有顯著差異
在橫斷面研究中，比較了CRE組和健康對照組之間的糞便細菌特性。CRE組由來自接受FMT之前的受體1 (R1)和受體2 (R2)的糞便樣品組成，而健康對照組由來自FMT供體和招募至香港健康腸道微生物群調查(Hong Kong Health Gut Microbiota Survey)的2名其他的健康對照的糞便樣品組成。
在CRE組和對照組之間，宏基因組測序確定的40種物種的相對豐度的LEfSe分析存在顯著差異(LDA＞2)。這代表了對清除CRE“有利的”和“不利的”細菌。
FMT之前和FMT之後供體和CRE受體中的細菌特性
在前瞻性的先導試驗中，相比供體，在對象中，在FMT之前和之後兩名受體中的細菌α多樣性均一致性地更低。然而，R1的細菌α多樣性在FMT之後第18天顯示增加，且R2中的結果顯示在第3天和第8天的α多樣性水平相比第14天更大。比較了FMT之前和之後單種細菌的相對豐度(在受體1中，為第7天vs第18天；在受體2中，為第3天vs第18天)。對於受體2，在FMT之前有2個糞便樣品採集時間點。對於受體2，選擇了第3天，因為其為更接近FMT的時間點。將第18天選作兩名受體的FMT之後的時間點，因為到該時間細菌特性開始穩定。發明人鑒定了在受體1或受體2中具有增加的＞1.0的倍數變化的細菌。這些物種以非常低的水平出現，或者在FMT之前的糞便樣品中甚至檢測不到。從供體移植這些物種可能與CRE的清除有關。毛螺菌科細菌(Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA)在R1中於FMT之後顯示最大的增加，且在R2中顯示第二大的增加，倍數變化分別為1659.5和16.9。
以上鑒定的對CRE清除“有利的”細菌及其相對豐度的概要顯示在表4中。
FMT之前的和FMT之後的供體和CRE受體中的糞便真菌特性
在前瞻性的先導試驗中，FMT之後在R1和R2中真菌α多樣性的變化朝向相反的趨勢，表明FMT對真菌多樣性的影響在不同的患者中存在差異。分析了FMT之前和之後單種真菌的相對豐度。
儘管利用真菌的FMT的短期供體移植並不像細菌那樣明顯，但一些真菌的相對豐度卻顯示出明顯的變化。與FMT之前相比，FMT之後受體的真菌群落在結構上更類似於供體特性。下面列出了受體1或受體2中的倍數變化增加＞1.0的真菌。特別地，海倫腦炎微孢子蟲(
Encephalitozoon hellem
)在兩名受體中均顯示出最高的倍數變化，分別為在R1中增加9.31倍和在R2中增加81倍。FMT之後移植和增加這些真菌可能是成功的CRE去定殖(decolonization)的決定因素(表5)。
實施例 3 急性移植物抗宿主病 (AGVHD) aGvHD 中的 FMT ：疾病和 FMT 結果的細菌和真菌決定因素 背景
同種異體造血幹細胞移植(allo-HSCT)是血液學病症的最有希望的腫瘤免疫療法之一。急性移植物抗宿主病(aGvHD)是allo-HSCT的一種嚴重併發症，其發生在35%-45%的受體中，並與15%-25%的死亡率有關。特別地，下胃腸(GI)道受累會併發高死亡率。糖皮質激素被用作aGVHD的一線療法，但只有約一半的患者有反應，且二線治療尚未建立。aGvHD的一年生存率為小於30%。迄今為止，在患者生存方面，頑固性GvHD沒有令人滿意的改善。
越來越多的證據表明，腸微生物群組成的變化與GvHD的發生密切相關。多種因素促成了患有allo-HSCT的患者中的微生物群多樣性的減少，包括反復使用抗生素、給予化療和/或放療，以及改變營養模式。同種異體骨髓移植(BMT)導致整體多樣性的丟失和乳桿菌的擴增以及梭菌的丟失，這增加了隨後發生GVHD的風險。此外，在allo-HSCT後，在受體中觀察到腸球菌，並且其與GI-aGVHD的嚴重程度有關。也已報道改變的病毒與腸道GVHD有關聯。例如，觀察到了小雙核糖核酸病毒(picobirnavirus)與早期移植後GVHD5的不可預期的關聯。
越來越多的證據表明，改變的腸微生物群與幹細胞移植(SCT)中的急性移植物抗宿主病(aGvHD)有關。糞便微生物群移植(FMT)代表了aGVHD的一種有前途的治療方法。最近，幾個小案例系列已經指出了FMT可能作為難治性aGVHD的治療方法。在連續三名患有難治性GI-aGvHD的患者中，FMT可以改善胃腸道症狀，減少腹瀉並重構腸微生物群。在allo-HSCT後的患者中，給予FMT膠囊減少了aGvHD的發生並提高了生存率。
迄今為止，在HSCT受體中使用FMT的經驗有限。儘管必須進行更精心設計的臨床研究以確認FMT對aGVHD的安全性和有效性，但在一些患者中這種威脅生命的疾病需要立即注意。大多數研究集中在細菌多樣性的恢復上，而噬菌體和真菌在FMT效力中的作用鮮為人知。在本研究中，提供了第一例成功的使用FMT治療aGvHD (IV級)的青少年案例，並使用宏基因組表徵了FMT之後受體中的系列糞便細菌、病毒組和真菌特性，以研究改變的微生物組動力學與aGvHD治療之間的潛在關聯。
在一名患有對皮質類固醇和生物療法難治的嚴重威脅生命的4級腸aGVHD的小男孩中，重複的FMT (總共4次)恢復了微生物組的多樣性並引起疾病改善。這是FMT用於小兒GI-GVHD的第一例，其強調了恢復細菌、病毒和真菌多樣性及其穩定移植。鑒定了影響有利的FMT結果的潛在供體和受體細菌、真菌特性。
病例展示
一名患有具有單體型7的骨髓增生異常綜合徵的14歲男性，於2017年12月21日接受了HLA同胞同種異體造血幹細胞移植(allo-HSCT)。他在allo-HSCT後不久發展出了II期皮膚GvHD (皮疹25%-50%)、腸aGvHD (IV期，具有明顯的功能受損)，和總體IV級威脅生命的GvHD。他有腹瀉、嘔吐和腹痛。他在allo-HSCT之後77天接受了第一次FMT，隨後在第一次FMT之後的第5、13和25天再接受三次FMT。頭3次FMT來自單個供體D8，且第四次FMT來自不同的單個供體D4。在四次FMT的過程中，患者還接受了甲基強的松龍、環孢黴素A、英夫利昔單抗、魯索替尼、布地奈德(Entocort)、奧曲肽、抗生素、抗病毒藥和抗真菌藥。
在接受第一次FMT的前一天，患者具有的糞便量為465 ml，且排便為5次。在第一次FMT的第二天，糞便量減少到0，而排便減少到1次。第一次FMT之後的第5天，糞便量增加到293ml，伴有血液和水樣稠度，而排便增加到兩次。患者在第7天接受來自相同供體的第二次FMT。在第11天，糞便量減少到100ml，且排便減少到1次。糞便形態良好，且患者僅有輕微的腹部絞痛。此後直到第35天，糞便量維持在每天約100ml，且每天排便一次或零次。免疫抑制劑被慢慢停掉。直到第一次FMT之後第117天的最後一次隨訪，患者仍保持穩定。
FMT 程序
供體糞便獲自香港中文大學腸微生物群研究中心(the Center for Gut Microbiota Research)的糞便庫。
方法
來自供體和受體的糞便
在第0天、第5天、第13天和第25天給予患者FMT。從第0天至第25天(患者進行4次FMT時)每天採集受體中的臨床數據，然後每月採集直至第117天。對於該分析，通過宏基因組測序對1份FMT之前糞便樣品以及第1次、第2次、第3次和第4次FMT之後的分別3、4、6和8份糞便樣品進行細菌、病毒和真菌特性分析。
採集了來自用於FMT的2名FMT供體D4和D8的糞便樣品進行宏基因組測序。來自供體D8的糞便樣品採自2週內的5個不同的時間點。這些樣品標記為D8-26、D8-27、D8-28和D8-29。來自供體D4的糞便採自單個時間點並標記為D4。對所有這些樣品單獨進行細菌、病毒和真菌特性分析。在第1次和第2次FMT中，使用了在不同的日期採集的來自供體D8的糞便。用於4次FMT的糞便樣品的分配列出如下：
第1次FMT：D8-26和D8-27
第2次FMT：D8-28和D8-29
第3次FMT：D8-34
第4次FMT：D4
糞便DNA提取和宏基因組測序
使用Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication試劑盒，根據方案分離糞便DNA。通過末端配對、純化和PCR擴增的過程來構建DNA文庫。在DNA文庫構建之後，由中國北京的Novogene通過Illumina Novaseq 6000，利用配對末端150bp測序策略對文庫進行測序。細菌和真菌宏基因組測序產生10-12G原始數據。
讀取質量控制和預處理
通過Fastp對原始序列讀取進行質量篩選並去除適配子。通過Kneaddata，利用默認參數(參考數據庫：GRCh38 p12)去除人宿主污染物讀取。對於宏基因組數據表，在Humann2中處理乾淨讀取以用於細菌分析，並在Kraken2中處理以用於真菌和病毒分析。在R程序包vegan中計算細菌分類概要、微生物多樣性的稀疏性分析、組成差異(通過未加權的UniFrac距離表示的差異度值)。
用於檢測人糞便總DNA中的總真菌載荷的定量PCR
使用引物36：真菌-定量-F 5’-GGRAAACTCACCAGGT CCAG-3’;真菌-定量-R 5’-GSWCTATCCCCAKCACGA-3’，以及探針：5’-TGGTGCATGGCCGTT-3’，通過TaqMan qPCR分析(Premix Ex TaqTM, TaKaRa)提取的人糞便DNA，對人糞便中的總真菌載荷進行定量。
統計分析
使用線性判別分析效應量(LEfSe)模型來鑒定具有不同組間相對豐度的物種。僅滿足＞2的LDA閾值的分類被認為顯著。對於通過LEfSe模型鑒定的物種，進行了替代性的分析以通過Wilcoxon秩和檢驗驗證其組間相對豐度的差異。P值＜0.05被認為是統計上顯著的。
發現
FMT之後的細菌變化
FMT之後的患aGvHD的患者中的糞便細菌群落的α多樣性增加
使用香農和辛普森指數來預估FMT之後(在第1次、第2次、第3次和第4次FMT之後)的患aGvHD的受體和FMT供體(D4和D8)中的細菌群落的α多樣性。在接受第一次FMT之後，受體糞便中的α多樣性相比FMT之前顯著增加，並且在第2次、第3次和第4次FMT之後，α多樣性達到與供體D4和D8相似的水平。
FMT之後aGvHD患者中細菌群落結構的恢復
使用主成分分析(PCA)來研究FMT之前和FMT之後受體以及供體的糞便樣品之間的群落結構差異。在重複的FMT之後，糞便細菌群落逐漸接近供體的那些，這表明患者的細菌群落結構得到恢復且變得與供體的那些相似。
從供體轉移的7種細菌在FMT受體中成為優勢細菌
通過條形圖評估了FMT之後的患aGvHD的患者中的來自供體的細菌移植。傑氏棒桿菌(71.2%)在患者的腸細菌群落中佔優，且在第一次FMT之後下降至小於0.1%。在接受重複的FMT之後在患者中觀察到7種細菌的移植，且這些物種佔據患者細菌群落的較大比例。這些物種是：
Alistipes onderdonkii
、
Alistipes putredinis
、鮑氏梭菌、系結梭菌、共生梭菌、未分類埃格特菌(
Eggerthella unclassified
)、
Ruminococcus gnavu
。
當患者患有腹瀉或無腹瀉時4種細菌的相對豐度存在顯著差異
在FMT之前和FMT之後從患有aGvHD的患者採集了總共22份糞便樣品。為了鑒定在患者患有腹瀉或無腹瀉時具有不同的相對豐度的糞便細菌，根據患者在糞便採集當天是否患有或未患有腹瀉對這22份糞便樣品進行分類。腹瀉定義為每天有2次或更多次排便，而非腹瀉定義為每天有0或1次排便。使用LEfSe分析來鑒定相對豐度在來自“腹瀉”或“非腹瀉”組的糞便樣品之間存在顯著差異的細菌。腹瀉組中直腸真桿菌的相對豐度明顯更高，而非腹瀉組中
Alistipes putredinis
、
Alistipes onderdonkii
和哈撒韋梭菌的相對豐度明顯更高。“有利的”供體應當含有較高相對豐度的
Alistipes putredinis
、
Alistipes onderdonkii
和哈撒韋梭菌，以及較低相對豐度的直腸真桿菌。
aGvHD症狀與5種細菌顯著相關
為了鑒定與治療結果相關的特定細菌，通過線性回歸將特定細菌的相對豐度與包括排便次數、糞便量和嘔吐量在內的GvHD症狀進行關聯分析。發現一種細菌與排便次數和糞便量呈顯著正相關。“有利的”供體應含有較低的傑氏棒桿菌相對豐度或沒有該細菌。另一方面，4種細菌顯示與嘔吐症狀的顯著負相關性。“有利的”供體應含有較高的這些細菌的相對豐度(列出如下)：
Alistipes putredinis
；鮑氏梭菌；哈撒韋梭菌；系結梭菌。
集合上述鑒定的對治療aGvHD“有利的”和“不利的”細菌及其相對豐度的概要顯示在表6a和表6b中。
FMT之後的真菌變化
FMT之後aGvHD中的糞便真菌多樣性增加
使用香農和辛普森指數來預估FMT之後的患aGvHD的受體和FMT供體(供體4和供體8)中真菌群落的α多樣性。在接受第一次FMT之後，α多樣性相比FMT之前的那些顯著增加。在隨後的3次FMT之後，真菌的α多樣性繼續穩定增加，並達到與供體D4和D8相似的水平。
FMT之後aGvHD患者中的總真菌載荷增加
通過qPCR測量總真菌載荷。患者中的總真菌載荷在接受來自供體D8的FMT之後增加至與供體相似的水平，然後在幾天後再次下降並在接受第二次FMT之後保持低水平。在接受第三次FMT之後患者中的水平再次增加。在利用來自供體D4 (其相比供體D8具有略低的總真菌載荷)的糞便的第四次FMT之後總真菌載荷略微減少。
FMT之後2種真菌的相對豐度顯著降低，而12種從供體轉移的真菌在FMT受體中成為優勢真菌
通過條形圖評估了FMT之後的患GvHD的患者中來自供體的真菌移植。尖孢鐮刀菌(
Fusarium oxysporum
) (61.44%)和灰葡萄孢(
Botrytis cinereal
) (29.13%)在患者的腸真菌群落中佔優，且在第一次FMT之後顯著下降。這些被認為是“不利的”真菌。在接受重複的FMT之後12種物種移植到患者中，並佔據患者真菌群落的較大比例。這些物種是：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、
Eremothecium sinecaudum
、甜菜生尾孢、毒性鐮孢菌(
Fusarium venenatum
)、嗜熱毀絲黴菌(
Thermothelomyces thermophile
)、希金斯刺盤孢(
Colletotrichum higginsianu
)、擬輪生鐮刀菌(
Fusarium verticillioides
)、斯梭孢殼黴(
Thielavia terrestris
)、杜氏假絲酵母(
Candida dubliniensis
)、棉假囊酵母(
Eremothecium gossypii
)、假禾穀鐮刀菌(
Fusarium pseudograminearum
)和粗糙脈孢黴(
Neurospora crassa
)。這些被認為是“有利的”真菌。
aGvHD症狀與21種真菌顯著相關
為了鑒定與治療結果相關的特定真菌，通過線性回歸將特定真菌的相對豐度與包括排便次數、糞便量和嘔吐量在內的GvHD症狀進行關聯分析。發現兩種真菌顯示與排便次數和糞便量的顯著的正相關性。基於這些發現，“有利的”供體應含有較低的這兩種真菌即尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢(
Botrytis cinerea
)的相對豐度。另一方面，19種真菌顯示與至少一種症狀的顯著的負相關性。“有利的”供體應含有較高的這些真菌的相對豐度。
集合上述鑒定的對治療aGvHD“有利的”和“不利的”真菌及其相對豐度的概要顯示在表7a和表7b中。
實施例 4 炎性腸病病毒組 健康人群和潰瘍性結腸炎中的黏膜病毒組 背景
潰瘍性結腸炎(UC)──炎性腸病(IBD)的一種亞型，是一種影響到整個大腸的緩解後復發的炎症性疾病，其通常始於直腸並向上擴散。UC的發病率持續增加，尤其是在發展中國家以及新興工業化國家。儘管IBD的病因學尚不明確，但IBD被認為是由於遺傳易感個體中對腸微生物群的免疫反應加劇所致。已在人和小鼠中研究了IBD中的糞便病毒組改變，其特徵是來自有尾噬菌體目的噬菌體的大量繁殖。然而，尚不清楚健康或IBD中的黏膜病毒組組成及功能，同時，關於UC中的黏膜細菌改變的瞭解也很有限。為了開始解決這些難題，本發明人從健康個體和患有UC的患者的直腸富集了病毒樣顆粒(VLP)，進行超深度病毒組宏基因組測序和16S rDNA測序，以確定患有UC的對象相比健康對照中的黏膜病毒組、細菌組和病毒-細菌相互作用。本研究是迄今為止表徵健康和UC中的黏膜病毒組的第一項和最大的研究。
方法
研究對象
本研究在獲取知情同意書的情況下招募了來自香港的48名健康對象相對於63名患有UC的患者、來自北京的20名健康對象相對於20名患有UC的患者，以及來自浙江省象山縣的8名健康對象相對於8名患有UC的患者(均是中國人)。患者納入標準包括這樣的對象：≥18歲，經內窺鏡檢查、放射學和組織學確診患有UC。對照由接受息肉結腸鏡檢查或結直腸癌篩查或胃腸道症狀調查的個體，以及患者在當地醫院的朋友和配偶或伴侶，或有興趣參加本研究的任何個體組成。經內窺鏡採集來自研究對象的直腸活檢樣品，然後在-80℃下保存，以用於下游的黏膜病毒組和細菌分析。
病毒樣顆粒(VLP)富集和測序
使用根據先前描述的方法修改的方案從患有UC的患者和健康對象的直腸活檢富集病毒樣顆粒(VLP)。在cBot上擴增合格的文庫，以在流動池(TruSeq PE Cluster Kit V3-cBot-HS, Illumina)上產生簇。在HiSeq Xten System (TruSeq SBS KIT-HS V3, Illumina) (BGI, Shenzhen, China; 標準的2×150 bp運行)上對擴增的流動池進行配對末端測序，每個樣品產生2-6千萬條原始序列(5-8G原始數據)。
序列處理和質量控制
通過BGI開發的SOAPnuke (v 1.5.3) (網站：soap. genomics.org.cn/)，按如下方式對原始讀取進行篩選：(i)去除適配子，(ii)去除N鹼基超過讀取的3%的讀取，(iii)去除質量低於20的鹼基超過讀取的40%的讀取，(iv)去除所有雙聚物。利用默認參數和人參考序列GRCh38，通過DeconSeq (v 0.4.3)從質量修剪的數據集去除人類序列。
從頭重疊群(Contig)組裝和分類注釋
利用IDBA (v 1.1.1)，使用最大kmer長度120組裝重疊群，其中最大重疊群長度為1,000 bp。使用CD-HIT [23]以95%同一性水平對組裝的重疊群聚類，以產生獨特的重疊群聯合。
病毒組豐度數據分析
為了估計重疊群的豐度並計算序列多樣性，使用Bowtie2 (v 2.2.9)將所有讀取與所得的精選的重疊群進行比對。映射的序列計數、重疊群長度和總序列計數被用於將序列計數標準化，並表示每個樣品的對於重疊群的RPKM (每百萬每千鹼基的讀取)。這些值被用於產生不同分類水平上的病毒豐度表。
將病毒組豐度數據輸入R 3.2.3中。在R中的phyloseq進行多樣性、均勻度和豐富度計算。分別在R中使用cor和cor.test函數計算斯皮爾曼相關性及其顯著性。對於在α多樣性和分類豐度方面的病毒-細菌相關性，計算了斯皮爾曼相關性。使用corrplot R包生成個相關性圖。使用pheatmap R包生成熱圖。
非度量多維尺度分析
經基於所有對象之間的Bray-Curtis差異性的NMDS (非度量多維尺度分析)製圖，進行對照和UC之間的黏膜病毒群落結構的差異。
DESeq、隨機森林和LEfSe線性判別分析
為了比較UC患者和健康家庭對照在黏膜病毒組腸型之間的黏膜病毒組和細菌微生物組的結構以及病毒組功能上的差異，進行了差異分析。在R中，分別通過DEseq和randomForest包進行DESeq和隨機森林。在Huttenhower lab Galaxy服務器(網站：huttenhower. sph. harvard. edu/ galaxy/)上進行Lefse分析。還在R中進行了DB-RDA分析以描述藥物和健康對黏膜病毒組結構的影響。
病毒組功能分析
通過HUMANN2 v0.9.4對病毒組功能進行注釋。預測的功能通過基因本體論術語和Pfam蛋白質家族身份進行收縮，其中豐度值表示為RPK (每千鹼基的讀取)。為了確立樣品中功能的存在與否，使用＞10的嚴格的RPK閾值來定義為存在。
黏膜細菌DNA提取
利用Maxwell RSC組織DNA試劑盒(Promega, Madison, Wisconsin)，根據方案從直腸活檢樣品提取細菌DNA。
16S rRNA測序和質量控制
在Illumina Hiseq 2500平臺(V4區，2×250 bp)上對最終的糞便DNA樣品測序。按先前所述，在mothur (v 1.38.0)中執行質量控制和數據分析。去除了任何具有不明確鹼基的序列以及任何長度超過275 bp的序列，並使用NAST算法針對非冗餘Greengenes數據庫(v 13.8)進行比對。
16S rRNA測序數據分析
將所得序列針對Greengenes數據庫進行分類，並以最深度水平分類進行注釋，這通過樸素貝葉斯分類器的平均超過1,000次迭代的至少80%的偽自舉置信度得分來表示。
發現
UC中黏膜病毒組多樣性的改變
在香港，將63名患有UC的患者的直腸病毒組與48名健康對象的那些進行了比較。平均從富集的直腸VLP製備物獲得了56,632,558 ± 14,330,713條乾淨配對末端讀取。在目、屬和種水平上研究了健康和UC中的黏膜病毒組組成。
與健康個體相比，UC對象在黏膜中具有明顯更高的病毒豐度(曼-惠特尼檢驗，p=0.017)和降低的病毒多樣性、均勻度和豐富度(t檢驗，分別為p=0.013、0.020和0.029)。接下來研究了有尾噬菌體目噬菌體(Caudovirales bacteriophages)——佔優勢的黏膜病毒的改變，且發現在UC中的有尾噬菌體豐度也得到擴增(曼-惠特尼檢驗，p=0.003)，而有尾噬菌體目中的物種多樣性、均勻度和豐富度均下降(t檢驗，分別為p=0.009、0.017和0.018)。總之，這些發現表明患有UC的患者中的黏膜病毒組失調。
在UC患者中，炎症性黏膜中的總病毒和有尾噬菌體目噬菌體相比非炎症性黏膜富集得更多(曼-惠特尼檢驗，p=0.015和0.017)。相對於健康對照的那些比較UC患者的非炎症性黏膜的黏膜病毒組的α多樣性差異，發現炎症性黏膜中的總病毒和有尾噬菌體目噬菌體的多樣性、均勻度和豐富度的降低相對於健康對照的那些在統計上更為顯著。因此，其表明腸道炎症是UC中黏膜病毒組失調的重要貢獻因素。
健康群體和患有UC的患者之間不同的黏膜病毒組結構
在科水平上，微小噬菌體科(Microviridae) (單鏈DNA噬菌體)、肌尾噬菌體科(Mycoviridae)、短尾噬菌體科(Podoviridae) (來自有尾噬菌體目的雙鏈DNA噬菌體)和Penumoviridae (真核病毒)在UC中比在對照中更為豐富，而對照中的指環病毒科(Anelloviridae) (真核病毒)高於UC中。在屬水平上，Phix174微小病毒(Phix174microvirus)、P1病毒(P1virus)、λ病毒(Lambdavirus)、T4病毒(T4virus)、P22病毒(P22virus) (均為有尾噬菌體目噬菌體)和正肺病毒(Orthopneuovirus)在UC中富集，而巨大病毒海洋球石藻病毒(Coccolithovirus)、微小病毒(Minivirus)和脊椎動物感染病毒正痘病毒(Orthopoxvirus) (均為真核病毒)在對照中富集。與這些觀察結果相一致，相對於健康對象黏膜，UC黏膜中更多的有尾噬菌體目噬菌體的豐度得到擴增，包括埃希氏菌噬菌體(Escherichia phage)和腸道菌噬菌體(Enterobacteria phage)。總之，這些發現表明UC黏膜中的原核病毒，特別是有尾噬菌體目噬菌體的失調佔優勢，而健康對照中的一些真核病毒更為豐富，表明UC中細菌失調與噬菌體擴增之間存在關聯性，並且健康個體中的真核病毒感染與宿主免疫力成熟之間存在關聯性，這可以保護宿主免受自身免疫性疾病的侵害。
利用隨機森林，發明人對北京和象山人群中的黏膜病毒組進行了分類。所有對象均被分類為腸型1。對香港人群中的健康對照和UC之間的所有腸型1對象的差異分析鑒定了一組不同的病毒。然而，僅有兩種物種在驗證人群中可被重複，分別為：感染藻的費氏褐藻病毒(Feldmannia species virus)，相對於象山人群中的對照腸型1對象，其在UC腸型1對象中的存在明顯更高；以及假單胞菌病毒(Pseudomonas virus)，相對於北京人群中的UC腸型1對象，其在對照腸型1對象中的存在明顯更高。總之，其表明存在對黏膜病毒組結構的顯著的地理影響，這造成了不同人群之間的黏膜病毒組組成的較大變異。
UC中的黏膜病毒組的功能改變
接著比較了健康和UC之間的黏膜病毒組功能。儘管最豐富的功能的豐度在健康和UC之間無差異，但健康個體顯示更豐富的病毒組功能(根據GO和Pfam蛋白質功能)，而UC對象則顯示大量的功能廢止。儘管如此，仍確定了UC中的幾種分子功能比健康黏膜病毒組更為豐富，包括：轉錄的DNA模板負調控、β-內醯胺酶、穀氨醯胺醯胺轉移酶、糖水解酶、II/IV型分泌系統和多銅氧化酶，其均與細菌宿主的噬菌體裂解以及細菌功能有關。該結果表明，UC中富集的黏膜病毒功能與細菌適應性、致病性和抗生素抗性有關，並且UC黏膜中可能存在細菌與噬菌體之間的密集遺傳交換。
黏膜處的黏膜細菌組改變和病毒組與細菌組之間的跨界相互作用
進一步相比健康對照黏膜評估了UC黏膜中的細菌微生物組改變。細菌多樣性和豐富度顯著增加(t檢驗，分別為p=0.024和0.007)，表明UC患者黏膜中存在不同細菌的擴增。UC黏膜細菌組顯示相比對照在門、科和屬水平上的不同的結構。定量差異分析鑒定了許多在健康和UC黏膜之間不同的細菌分類。其中，相比對照，在UC中厚壁菌(門)、假單胞菌科、瘤胃球菌科、棲熱菌科、未分類的梭菌目、韋榮球菌科 (Vellonellaceae) (科)和糞球菌(屬)大量富集。
為了表徵黏膜中的細菌組和病毒組之間的關聯，評估了細菌組和病毒組的α多樣性(多樣性、均勻度和豐富度)之間的相關性。在對照中，存在顯著的界內α多樣性相關性。然而，在對照中觀察到的細菌界內α多樣性相關性的顯著性在UC中丟失，表明在UC中黏膜細菌微生物群的失衡狀態多於黏膜病毒群的失衡。
實施例 5 克羅恩病和黏附侵襲性大腸桿菌 (AIEC) 克羅恩病中的 FMT ： AIEC 的存在與 FMT 結果 背景
克羅恩病(CD)是兩種主要的炎性腸病(IBD)之一，是一種終生致殘性腸病。在香港，克羅恩病的發病率在過去十年中增長了7倍。引起克羅恩病的原因未知。儘管遺傳因素可能起作用，但有力的證據表明，腸內細菌可能是疾病發展的基礎。FMT目前正被探索作為IBD的潛在療法。然而，尚不清楚影響治療結果的機制和因素。黏附侵襲性大腸桿菌(AIEC)可以侵襲腸上皮並在IBD患者的黏膜上定殖。它們還可以在巨噬細胞內生存而不誘導細胞死亡，從而使它們潛伏在黏膜中並長期造成損害。由於FMT直接改變了腸腔的內容物，我們假設FMT可能無法根除上皮細胞內存在的AIEC細菌，並且巨噬細胞可能繼續引起炎症。因此，我們的研究的目的是確定AIEC菌株的存在是否會使FMT無效並惡化疾病的結果。
方法
研究對象
在香港招募了患有回腸克羅恩病(疾病位置為根據蒙特利爾分型的L1-回腸或L3-回腸結腸)的患者。患者年齡≥18歲，通過內窺鏡檢查、放射學和組織學(回腸或回腸結腸)確診為回腸克羅恩病。沒有IBD的對象被招募為對照。這些由≥18歲的個體(他們將接受息肉結腸鏡檢查或結腸直腸癌篩查，或者胃腸道症狀的調查)，以及患者在當地醫院的朋友和配偶或伴侶，或任何有興趣參加此研究的個體組成。使用標準化數據採集表格採集臨床數據，並在回腸結腸鏡檢查期間採集回腸活檢樣品。然後將活檢樣品保存在-80℃下以用於下游分析。如果對象在採集活檢樣品的3個月內服用了抗生素、益生菌或益生元，則將其排除在外。所有對象都同意參加。
黏膜大腸桿菌水平的定量和回腸黏膜上定殖的大腸桿菌菌株的分離
將活檢樣品解凍並稱重，以計算分離出的細菌相對於組織的重量。通過在PBS中輕輕搖動5分鐘來分離與黏膜表面腸黏膜黏附生物群相關的細菌。通過用Triton 1X和Ultra-Turrax處理活檢樣品來釋放內在的細菌。將分離出的細菌在37℃下培養過夜。第二天對菌落形成單位(CFU)計數，以定量與黏膜相關的大腸桿菌。通過將菌落形成單位的數量除以黏膜活檢樣品的重量來計算黏膜大腸桿菌水平。
對於每名患者，將在Drigalski培養基上分離的且對乳糖代謝呈陽性(大腸桿菌差異特徵)的來自黏膜相關大腸桿菌的48個細菌集落，在補充有15%甘油的Luria-Bertani培養基的96孔微孔板中進行培養並儲存在-80℃下。
AIEC陽性的確定
通過首先分離黏膜活檢樣品中的大腸桿菌菌株(按上文所述)，然後篩選分離菌株中的AIEC菌株的主要特徵，並基於AIEC的這些特徵進行分級，來確定代表AIEC存在的AIEC陽性。AIEC的主要特徵包括黏附、對腸上皮細胞的侵襲和巨噬細胞內的存活。將相對於初始接種物具有大於或等於0.1的侵襲指數，且具有於感染後24小時在巨噬細胞內生存和繁殖的能力(在巨噬細胞中的%生存大於100)的大腸桿菌菌株視為AIEC。
DSS結腸炎小鼠模型中的細菌給予和糞便微生物群移植
使用8-9週大的雄性C57B/L6野生型小鼠(n=50)構建急性DSS結腸炎小鼠模型，以研究FMT對AIEC感染的小鼠的影響。一組小鼠僅給予乾淨的飲用水，以作為對照(n=6)。44隻小鼠給予補充有2%DSS的飲用水。
在分離自CD患者的21種AIEC菌株中，選擇了一種具有最強的侵襲能力的菌株AIEC 62d用於動物實驗。從DSS處理的第一天開始，連續3天給小鼠灌服10
9
CFU劑量的該AIEC菌株(n=22)，或非致病性大腸桿菌菌株K12 (n=22)。
從健康小鼠採集糞便並用無菌PBS以1:10稀釋。沉降後，連續3天給每隻小鼠灌服200μl的上清液，以作為FMT處理。在第7天處死來自AIEC組和K12組(n=6，每組)的小鼠，以作為“FMT之前”組。然後從第7天開始連續3天給剩下的32隻小鼠灌服來自健康小鼠的糞便物質或無菌PBS (n=8，每組)。
小鼠中的糞便AIEC的定量
通過在含有氨苄青黴素(50µg/mL)和紅黴素(25µg/mL)的LB瓊脂板上接種PBS重懸的糞便來進行計數，因為AIEC菌株耐受這些抗生素，並且在未感染的小鼠中未發現這樣的耐受性細菌。在第二天，對集落形成單位(CFU)計數，並評估每mg糞便的CFU數量。
小鼠中的結腸炎嚴重程度的評估
每天測量小鼠的體重。兩天採集糞便樣品。在處死時測量結腸長度和組織學評分，以評估結腸炎的嚴重程度。測量從盲腸至直腸的結腸長度。按如下對H & E染色的結腸組織進行盲化的組織學評分。基於上皮損傷和侵潤至黏膜、黏膜下層和肌層/漿膜內的炎症的程度，為每個部分分配4個評分，使得每隻小鼠的總評分範圍為0-12。然後將對照組和DSS處理組的平均分數製成表格。
小鼠樣本的DNA提取和16s rRNA測序
提取近端結腸組織DNA以評估與黏膜相關的微生物群。來自在第7天處死的小鼠的糞便和組織被表徵為“FMT之前”，而在第14天收穫的糞便和組織被表徵為“FMT之後”。根據廠商說明書，使用Maxwell®16組織DNA純化試劑盒提取DNA。將提取的DNA送至Novogene(HK)有限公司進行文庫構建，並在Illumina PE250平臺上進行16s rRNA的V3-V4區的測序。
生物信息學分析
使用Mothur pipline進行原始數據至OUT表的轉換。通過97%相似性進行序列分類。
發現
AIEC陽性CD患者中存在的黏膜大腸桿菌水平比AIEC陰性CD患者和健康對照中的更高
已報導當相比健康對照時，CD患者黏膜中的大腸桿菌被過分代表(over-represented)。為了評估在合併AIEC的CD患者黏膜中大腸桿菌是否被進一步過分代表，測量了取自56名具有回腸受累的CD對象和24名健康對照的回腸黏膜中的總大腸桿菌載荷。
在我們檢測的所有對象中，37.5%(n=21)的CD患者和8.3%(n=2)的健康對照為AIEC陽性。AIEC陽性患者的總大腸桿菌載荷明顯高於AIEC陰性患者和健康對照(對數轉換後為p=0.0323和p＜0.001，Turkey’s多重比較檢驗)。
在FMT之後小鼠中的糞便AIEC水平僅瞬時降低
研究了FMT對感染了AIEC的DSS結腸炎小鼠中的AIEC水平的影響。在糞便樣品中評估了FMT之前和FMT之後小鼠中的AIEC載荷的變化。在FMT處理的AIEC小鼠中，在用FMT將小鼠處理連續3天後糞便AIEC載荷立即下降，但隨後逐漸上升。比較進行和未進行FMT的AIEC小鼠發現，AIEC感染後第9天和第12天FMT組中的糞便AIEC載荷顯著低於無FMT組中的那些。然而，在AIEC感染後第14天，FMT組和無FMT組之間的AIEC載荷差異變得顯著。這些數據表明僅FMT可能不足以根除小鼠中的AIEC。應合併特異性靶向AIEC的治療以根除持續性的AIEC感染。
FMT治療結腸炎的功效受到AIEC感染的損害
接著研究了AIEC對FMT治療結腸炎的功效的影響。比較了感染了AIEC的小鼠和感染了K12 (一種非致病性大腸桿菌菌株)的小鼠之間的FMT影響。通過體重、結腸長度和組織學評分評估結腸炎的嚴重程度。
對於體重，評估了FMT之後相比基線(第0天)的體重恢復百分比，在K12感染的小鼠中，以FMT處理的小鼠在第12天的體重恢復百分比高於無FMT的小鼠(99%vs 95%，p=0.0243，雙因素ANOVA)。另一方面，對於AIEC感染的小鼠，在第14天有或無FMT處理的小鼠的體重未顯示顯著的差異(p=0.98，雙因素ANOVA)。比較FMT之後第14天的體重恢復發現，K12感染的小鼠的體重恢復至初始體重的97%，而感染了AIEC的小鼠的體重僅恢復至91%(p=0.048，雙因素ANOVA)。
對於結腸長度，在感染了AIEC的小鼠中，FMT之前和FMT之後組間的結腸長度無顯著差異(p=0.88，Kruska-Wallis檢驗，利用多重比較)。相反，在FMT之後K12感染的小鼠的結腸長度顯著增加(FMT之前平均結腸長度±SEM 6.80±0.12mm vs FMT之後8.02±0.27mm，p=0.0042，非配對t檢驗)。
對於組織學評分，在FMT之後，AIEC感染的小鼠相比感染了K12的小鼠中的組織學評分的改善較少(2.0 vs 3.0，p=0.086，曼-惠特尼檢驗)，表明AIEC感染的小鼠中的結腸炎恢復較少。這些結果表明FMT改善了AIEC陰性(K12感染的)小鼠中的DSS誘導的結腸炎，但其功效在AIEC存在下受到損害。
儘管以FMT治療但AIEC感染的小鼠中缺乏有利的細菌
分析了FMT之前和FMT之後上述AIEC感染的和K12感染的小鼠的黏膜和糞便微生物群。小鼠腸道中存在的AIEC造成小鼠糞便微生物群的細菌多樣性減小。FMT治療增加了K12感染的小鼠但非AIEC感染的小鼠的α多樣性。LEfSe分析揭示了幾種成功移植K12小鼠但未能在AIEC感染的小鼠中定殖的分類。這些分類中的大多數屬厚壁菌科，這類似於IBD患者黏膜微生物群的特徵，表明AIEC是小鼠黏膜中失調的一個驅動因素。這些數據表明AIEC在IBD發病機理中的偶然作用。這些分類在表11中列出。
AIEC的存在可能會阻礙FMT效力。阻止潛在有益的共生生物的定殖可能是AIEC影響FMT功效的一種機制。
實施例 6 肥胖症 方法
FMT用於肥胖症和體重操縱的開放標記人類研究
在肥胖對象中進行了糞便微生物群移植的開放標記的臨床試驗(NCT03789461)。招募了年齡為18-75歲、具有≥28 kg/m
2
和＜45 kg/m
2
的體質指數(BMI)，且獲得了知情同意書的對象。在本研究期間，對象接受了密集的FMT，為期總共20天。在治療期間，對象每週接受5天的FMT (進行5天，和休息2天)。在同一時期，對象還接受了飲食和生活方式建議。
FMT ：
糞便獲自來自包括配偶或伴侶、一級親屬、其他親屬、朋友和受體瞭解或不瞭解的其他人在內的一般人群的志願者。在糞便捐贈之前，通過問卷調查和實驗室測試篩選志願者。進行了一系列針對傳染病的實驗室測試和訪談。在該研究中使用了來自合格供體的糞便。在接受FMT之前，對象接受了5天的抗生素，其由以下內容組成：每天3次的萬古黴素500mg；每天3次的甲硝唑500mg；以及每天3次的阿莫西林500mg，以增強來自FMT的微生物群的移植。然後對象接受了20天的FMT。在住院或門診中通過標準程序向患者輸注100-200ml的FMT溶液，包括食管-胃-十二指腸鏡(OGD)、乙狀結腸鏡或灌腸。
1. 經OGD：經OGD在2-3分鐘內向遠端十二指腸或空腸中輸注100-200ml的FMT溶液。輸注後，對象在離開前監測1小時。
2. 經乙狀結腸鏡：經乙狀結腸鏡在2-3分鐘內向遠端結腸輸注100-200ml的FMT溶液。輸注後，對象在離開前監測1小時。
3. 經灌腸：通過自我給藥或在研究小組的幫助下經灌腸給予100-150ml的FMT溶液。對象被指示保留灌腸劑20-30分鐘。在每次灌腸前給予4mg洛派丁胺，以增加FMT溶液的保留。
糞便DNA分離和宏基因組測序
使用DNeasy血液和組織試劑盒(QIAGEN)，根據廠商的方案提取採自供體的糞便樣品DNA，並進一步純化。通過首先根據廠商說明書(illumina)構建具有350bp的插入大小的配對末端文庫，並在NovaSeq Illumina測序儀上測序來進行宏基因組測序。利用MetaPhlan2，使用默認參數計算群落組成。在R程序包vegan中計算細菌分類概要、微生物多樣性的稀疏性分析、組成差異(通過未加權的UniFrac距離所指示的差異度值)。
發現
分析了達到第8週時肥胖對象的體重變化。5名連續的對象接受了來自3名不同的供體的FMT。通過宏基因組測序對這些供體的糞便細菌組進行特性分析。供體15和供體16具有2種和3種＞0.1的相對豐度的對體重減輕有利的物種(表12)；以及2種相對豐度≤0.01%的對體重減輕不利的物種(表13)。相反，供體8不具有供體15和供體16所具有的這些有利的細菌，並且2種不利的物種的相對豐度為＞0.01%(表12和表13)。基於這些特性，供體8被認為是對體重減輕不利的供體，而供體15和16被認為是對體重減輕有利的供體。在第8週，接受來自供體15和16的FMT的對象具有比供體8的受體更多的體重減輕(表14)。
實施例 7 肥胖症和脂質代謝 用於肥胖症和脂質代謝的實驗模型 細菌和培養基
華德薩特菌(
S utterella wadsworthensis
)培養條件
華德薩特菌(SW)獲自DSMZ，脂質培養基無葡萄糖，補充有不同組合的對應於2%蔗糖濃度的糖漿；乳酸鈉(Chempur Poland) 7.41 g/L；乙酸鈉(Chempur Poland) 7 g/L；和0.2%酵母提取物(BD Bioscences USA)。所有培養基的起始pH都是7.0。於37℃下，在由5.9%氧、7.2%二氧化碳、3.6%氫氣和83.3%氮氣組成的微需氧氣氛下孵育培養物。使用來自Mart® Microbiology b.v. (9200 JB Drachten, Netherlands)的Anoxomat®氣氛生成系統產生該氣氛。碎肉碳水化合物培養基(CM)購自BD。在厭氧條件(Coy Laboratory Products，75%N
2
，20%CO
2
，5%H
2
)下，於37℃在非震盪下培養培養物。每週評估板兩次，維持達1個月。通過16S rRNA基因測序和NCBI BLAST上的序列搜索來鑒定被認為是革蘭氏陰性的和氧氣敏感的(借助於室內空氣中失敗的亞克隆)任何細菌分離物。
腸道羅斯拜瑞氏菌(
Roseburia intestinalis
)培養條件
腸道羅斯拜瑞氏菌(RI)購自DSMZ保藏中心，製備了DSM-13018培養基，並使用無氧裝置進行厭氧維持。通過在37℃下，於7±5 ml等分的M2GSC培養基中培養16-18 h來定期維持分離物。底物利用和水解作用。培養基由(100 ml中) 1 g酪腖、0±2.5 g酵母提取物、0±4 g NaHCO
3
、0±1 g半胱氨酸、0±0.45 g K
2
HPO
4
、0±0.45 g KH
2
PO
4
、0±09 g NaCl、0±009 g MgSO
4
、0±009 g CaCl
2
、0±1 mg刃天青、1 mg氯化血紅素、1 μg生物素、1 μg鈷胺素、3 μg對氨基苯甲酸、5 μg葉酸和15 μg吡哆胺組成。
多酸光崗菌(
Mitsuokella multacida
)培養條件
多酸光崗菌(MM)作為甘油儲存物在-20℃下保持冷凍。將含有麥芽糖和葡萄糖(0.1%w/v)的L-10液體或固體(1%w/v瓊脂)培養基，或含有10%(v/v)瘤胃液、0.2%(w/v)葡萄糖、0.2%(w/v)纖維二糖和0.3%(v/v)澱粉[1]的改良Scott和Dehority培養基用於培養。在厭氧和靜止條件下，在由CO
2
/H
2
(90:10)組成的氣氛中，在37℃的溫度下，或者在39℃下，於100%CO
2
中，在含有5 ml培養基的亨蓋特管中培養培養物。
小鼠模型
從香港中文大學購買八週大的雄性C57BL/6小鼠(平均初始重量20 g)，並在實驗前使其適應動物設施環境兩週。在所有實驗中，均使用雄性小鼠。所有小鼠都保持在嚴格的24小時光照-黑暗週期下，光照時間為上午6點至下午6點。每個實驗組由每組兩個籠子組成，以控制籠效應(n=5隻/籠)。
小鼠分成5組，即SW組、MM組、RI組、培養基組和聯合(SW、MM和RI的組合)組。每5天給予小鼠1*10
9
劑量的3種單一的細菌或聯合(3種細菌的組合，且每種佔33.33%)。每5天測量體重。研究設計顯示在圖11中。
抗生素
對於抗生素處理，按先前所述，在其飲水中給予小鼠卡那黴素(0.4 mg/mL)、慶大黴素(0.035 mg/mL)、黏菌素(850 U/mL)、甲硝唑(0.215 mg/mL)和萬古黴素(0.045 mg/mL)的組合，為期兩週。
立即將樣品轉移到動物設施的亨蓋特厭氧培養管中，並通過口服灌餵將上清液和細菌給予小鼠。在預定日期，於黑暗階段開始時採集糞便，並立即將其快速冷凍並轉移以在80℃下儲存，直至進一步處理。
脂質特性
第6次給予後20天，通過頸脫位法處死小鼠以用於血液採集。在非肝素化的管中採集血液樣品並於4℃在1,600×g下離心10 min。使用購自南京建成生物工程研究所(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) (Nanjing, China)的試劑盒，通過Fisher Multiskan FC多功能檢測微孔板讀數儀測定血清TG (GPO-PAP測定；目錄號A110-1)、TC (GPO-PAP測定；目錄號A111-1)、LDL-C (目錄號A113-1)和HDL-C (目錄號A112-1)的水平。TG和TC的水平在510nm下測定，並表示為mmol/L。LDL-C和HDL-C的水平在546nm下測定並表示為mmol/L。
發現
給予華德薩特菌(SW)顯著降低了體重增加(p＜0.001；雙因素重複測量ANOVA)，而給予腸道羅斯拜瑞氏菌(RI)顯示體重增加減少的趨勢。在第15天後(在3次口服灌餵後)效應特別明顯(圖12)。計算了每隻小鼠在第20天和第45天相比第0天的體重增加百分比。相比給予培養基的那些，給予SW和RI的小鼠第20天和第45天的體重增加百分比明顯更低(圖13)。平均食物攝取計算為克食物攝取/小鼠•天。在給予聯合(SW、MM和RI的組合)、多酸光崗菌(MM)、RI和SW後，平均食物攝取顯示降低的趨勢，這與僅給予培養基相反，其顯示增加的趨勢。減少食物攝取的效應在RI和SW中最明顯(圖14)。平均食物效率計算為每隻小鼠的5天中的體重增加(克)/這5天中總的食物攝取(克)。相比給予培養基，給予聯合、MM、RI和SW的小鼠第15天之後的平均食物效率降低(圖15)。研究了對脂質代謝的影響。僅給予SW降低了LDL-C、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)。僅給予RI降低了LDL-C和TC。給予聯合降低了LDL-C和TC。所有結果均與第45天的給予培養基的對照進行比較(圖16)。
縮寫
sw：華德薩特菌；ri-腸道羅斯拜瑞氏菌；mm：多酸光崗菌；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；TG：甘油三酯；TC：總膽固醇；OGTT：口服葡萄糖耐量試驗；ITT：胰島素耐量試驗。
實施例 8 耐碳青黴烯的腸桿菌科 方法
FMT用於根除人類中的CRE的臨床試驗
年齡≥18歲、具有至少間隔一週的兩次或更多次糞便或直腸拭子CRE陽性，且在FMT輸注前至少48小時未接受抗微生物治療的患者被招募至臨床試驗(NCT03479710)中。患有需要進行抗微生物治療的CRE或VRE活動性感染、懷孕、活動性胃腸道感染或炎症性病症、近期接受過腹部內手術、患有短腸綜合徵或使用改變胃腸運動的藥物的患者被排除在外。CRE定義為存在對任何碳青黴烯類具有耐受性的任何腸桿菌科。總共招募了3名患有CRE的對象、供體和4名健康家庭成員對象，並獲得了基線的糞便樣品以用於微生物組分析。供體和受體的樣品採集時間線顯示在圖17中。
在本研究中，患者接受了利用冷凍的供體糞便樣品的2次FMT。在2-3分鐘內，經食管-胃-十二指腸鏡(OGD)向遠端十二指腸或空腸中輸注100ml的於0.9%無菌鹽水中的FMT溶液(原始糞便50 g)。在FMT之前和FMT之後預先從患者採集糞便樣品。對於這2次FMT，受體接受來自相同單一供體的FMT。
用於FMT輸注的糞便獲自招募至香港中文大學醫學院糞便生物庫(Stool Biobank for the Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong)的供體。供體為來自包括配偶或伴侶、一級親屬、其他親屬、朋友和潛在患者瞭解或不瞭解的其他人在內的一般人群的志願者。供體需要滿足一系列資格標準，並且通過了篩查包括CRE和耐萬古黴素的腸球菌(VRE)在內的傳染病的實驗室測試。
糞便DNA提取
將約100 mg糞便樣品用1 ml ddH
2
O預洗滌，並通過以13,000×g離心1分鐘來沉澱。將糞便沉澱重懸於補充有1.6 μl 2-巰基乙醇和500 U溶細胞酶(Sigma)的800 μL TE緩衝液(pH 7.5)中，並在37℃下孵育60 min。然後將樣品以13,000×g離心2 min，並棄去上清液。預處理後，隨後使用Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication試劑盒(Promega)，按照廠商說明書，從沉澱物中提取糞便DNA。簡言之，向糞便沉澱物中加入1ml CTAB緩衝液並渦旋30秒，然後將樣品在95℃下加熱5分鐘。之後，將樣品與珠以最大速度徹底渦旋15 min。然後將40µl蛋白酶K和20µl RNA酶A加入樣品中，並將混合物在70℃下孵育10分鐘。然後通過以13,000×g離心5分鐘來獲得上清液，然後將其加入到Maxwell® RSC機器中用於DNA提取。對提取的糞便DNA進行16S rDNA測序和宏基因組測序。
宏基因組測序和分析
將合格的糞便DNA切成片段，通過末端修復、向尾部添加A、純化和PCR擴增的過程來製備測序文庫。由北京基因組研究所(the Beijing Genomics Institute, BGI)，在Illumina Hiseqxten PE150平臺上對糞便DNA文庫進行深度測序，且產生了每個樣品平均4800 ± 530萬的讀取(12G數據)。
按如下方式通過Trimmomatic v0.36 18對原始序列進行篩選和質量修剪：1)利用4:8的質量滑動窗口進行修剪；2)修剪序列以從開始去除20個鹼基並從末端去除超過220的鹼基；3)去除小於150 bp長度的序列。然後通過Kneaddata (https://bitbucket.org/biobakery/kneaddata/wiki/ Home，參考數據庫：GRCh38 p12)，利用默認參數濾除人宿主污染讀取，以產生乾淨讀取。
在humann2 v0.11.1 19中執行細菌分類和功能特性分析，其過程包括：通過MetaPhlAn2，利用分枝特異性的標記物biomarker20進行分類鑒定；通過Bowtie2 21，利用ChocoPhlAn數據庫進行物種泛基因組(pangenomes)的注釋；利用DIAMOND 22，針對UniRef90通用蛋白質參考數據庫23進行未映射的讀取的翻譯搜索，通路採集(pathway collection)利用Metacyc數據庫24從產生的基因列表獲得。合併所有樣品的基因家族和通路豐度文件，然後標準化為相對豐度。
使用Kraken2 v2.0.7-beta從糞便DNA宏基因組數據集中確定了真菌的分類特性。利用Jellyfish程序，通過利用映射至具有精確的k-mer匹配的所有參考基因組的最低共有祖先的讀取中的每個k-mer對參考文庫中的獨特31-mer計數，從NCBI構建了完整的NCBI真菌和病毒RefSeq數據庫25。其後，通過修剪映射的基因組所屬的一般分類樹，將每次查詢分入具有匹配的k-mer的最高總匹配的分類中。
統計分析
將細菌、病毒、真菌的豐度數據輸入R 3.3.5中。使用phyloseq程序包進行豐富度、多樣性和稀疏性的計算。通過vegan R程序包計算基於微生物群落結構的Bray-Curtis相異性矩陣的主成分分析主座標分析(PCoA)。使用ggplot R程序包執行熱圖。
發現
瘤胃球菌(Ruminococcus sp_5_1_39BFAA)、
Collinsella tanakaei
和
Eubacterium sicaeum
的相對豐度在FMT之前檢測不到，且在FMT之後增加至與供體相似的水平或甚至更高(圖18)。LEfSe分析也表明相比FMT之前樣品，FMT之後樣品中的這些細菌顯著增加，其LDA得分＞2.0 (圖20)。這些代表了對CRE去定殖有利的細菌(表15)。
為了解答FMT是否影響腸微生物組的問題，進行了真菌富集的深度宏基因組測序，然後使用Kraken2將序列讀取與參考數據庫進行比對以鑒定真菌分類。在FMT之後患者腸道真菌群落的α多樣性顯示隨時間廣泛的波動(圖20a)，FMT之後樣品中的真菌群落顯示與來自其相應的供體的真菌群落的降低的差異性(圖20b)，表明受體中供體真菌的可能的移植或受體真菌群落向健康狀態的恢復。經LEfSe對FMT之前和FMT之後的糞便微生物組的進一步的判別分析顯示Xylonales、節擔菌(Wallemiales)、Ceraceosorales為FMT之後的糞便中差異富集的屬(圖20c，LDA效應量＞2，p＜0.05)。更詳細的物種水平特性分析揭示了FMT之後每名受體的分類差異，例如CRE患者移植了22種真菌，包括櫟迷孔菌(
Daedalea quercina
)、彩色豆馬勃(
Pisolithus tinctorius
)和落花生麯黴(
Aspergillus arachidicola
) (圖20d，表16)。雖然FMT之後轉移的微生物群主要由細菌組成，但也可能存在一些真菌移植，儘管是以較小的數量。
本申請中引用的所有專利、專利申請和其他出版物，包括GenBank登錄號和其他序列識別號，均通過引用整體併入本文中，用於所有目的。
