TW202006140A - 治療斯特格（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ）氏症之組成物和方法 - Google Patents

治療斯特格（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ）氏症之組成物和方法 Download PDF

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Abstract

本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之腺相關病毒(AAV)載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列；其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3597的毗連核苷酸之序列；其中該第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3806至6926的毗連核苷酸之序列；其中該第一核酸序列及該第二核酸序列各包含彼此重疊之序列區；且其中該序列重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。本揭露亦提供AAV載體系統於預防或治療疾病之用途。

Description

治療斯特格（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ）氏症之組成物和方法
本揭露關於在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之腺相關病毒(AAV)載體系統及AAV載體。本揭露之AAV載體系統及AAV載體可用於預防或治療與視網膜細胞降解相關之疾病諸如斯特格(Stargardt)氏症。
斯特格氏症係視網膜的遺傳疾病，可透過破壞眼睛的光感測性感光受體細胞導致眼盲。該疾病通常在兒童期呈現，導致年輕人的眼盲。
斯特格氏症最常見的形式係與編碼蛋白質ATP結合卡匣亞家族A成員4(ABCA4)之基因的突變有關的隱性病症。在斯特格氏症中，ABCA4 基因的突變導致視網膜細胞中缺乏功能性ABCA4蛋白質。此進而導致雙類視色素副產物的形成及累積，在視網膜色素上皮(RPE)細胞中產生脂褐質毒性顆粒。此造成RPE細胞的降解及最終破壞，導致喪失感光受體細胞，造成進行性視力喪失及最終眼盲。
長久以來，針對斯特格氏症之潛在病因提供有效治療的需求仍未被滿足。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之AAV載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列；其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3597的毗連核苷酸之序列；其中該第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3806至6926的毗連核苷酸之序列；其中該第一核酸序列及該第二核酸序列各包含彼此重疊之序列區；且其中該序列重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。
序列重疊區的長度可介於20與550個核苷酸之間；較佳地長度介於50與250個核苷酸之間；更佳的是長度介於175與225個核苷酸之間；及最佳的是長度介於195與215個核苷酸之間。
序列重疊區亦可包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約50個毗連核苷酸；較佳地至少約75個毗連核苷酸；更佳的是至少約100個毗連核苷酸；甚至更佳的是至少約150個毗連核苷酸；及最佳的是至少約200個毗連核苷酸。
在一些實施例中，第一核酸序列包含由SEQ ID NO：1之核苷酸105至3597組成的毗連核苷酸之序列。在一些實施例中，第二核酸序列包含由SEQ ID NO：1之核苷酸3806至6926組成的毗連核苷酸之序列。
在一些實施例中，第一核酸序列包含由SEQ ID NO：2之核苷酸105至3597組成的毗連核苷酸之序列。在一些實施例中，第二核酸序列包含由SEQ ID NO：2之核苷酸3806至6926組成的毗連核苷酸之序列。
在一些實施例中，序列重疊區包含由SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805組成之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。在一些實施例中，序列重疊區包含由SEQ ID NO：2之核苷酸3598至3805組成之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。
在一些實施例中，序列重疊區包含由SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805組成之核酸序列的至少約50個毗連核苷酸；較佳地至少約75個毗連核苷酸；更佳的是至少約100個毗連核苷酸；甚至更佳的是至少約150個毗連核苷酸；及最佳的是至少約200個毗連核苷酸。在一些實施例中，序列重疊區包含由SEQ ID NO：2之核苷酸3598至3805組成之核酸序列的至少約50個毗連核苷酸；較佳地至少約75個毗連核苷酸；更佳的是至少約100個毗連核苷酸；甚至更佳的是至少約150個毗連核苷酸；及最佳的是至少約200個毗連核苷酸。
在一些實施例中，第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列；及第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列。
在一些實施例中，第一核酸序列包含由SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805組成的毗連核苷酸之序列；及第二核酸序列包含由SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926組成的毗連核苷酸之序列。
在一些實施例中，第一核酸序列包含由SEQ ID NO：2之核苷酸105至3805組成的毗連核苷酸之序列；及第二核酸序列包含由SEQ ID NO：2之核苷酸3598至6926組成的毗連核苷酸之序列。
第一AAV載體可包含可操作地連接ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分的GRK1啟動子。
第一核酸序列可包含位於ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分上游的非轉譯區(UTR)。
第二核酸序列可包含轉錄後反應元件(PRE)；較佳地土撥鼠肝炎病毒轉錄後反應元件(WPRE)。
第二核酸序列可包含牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之方法，該方法包含下列步驟：使用如上定義之第一AAV載體及第二AAV載體轉導目標細胞以使功能性ABCA4蛋白質在目標細胞中表現。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之5'端部分，其中該ABCA4 CDS之5'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列組成。在一些實施例中，此AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列。在一些實施例中，ABCA4 CDS之5'端部分由SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805組成。在一些實施例中，ABCA4 CDS之5'端部分由SEQ ID NO：2之核苷酸105至3805組成。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，其中該ABCA4 CDS之3'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列組成。在一實施例中，此AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列。在一實施例中，ABCA4 CDS之3'端部分由SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926組成。在一實施例中，ABCA4 CDS之3'端部分由SEQ ID NO：2之核苷酸3598至6926組成。
本揭露提供包含如上定義之第一核酸序列之核酸。
本揭露提供包含如上定義之第二核酸序列之核酸。
本揭露提供包含SEQ ID NO：9之核酸序列之核酸及包含SEQ ID NO：10之核酸序列之核酸。
本揭露提供套組，該套組包含如上述之AAV載體系統或如上述之上游AAV載體及下游AAV載體。
本揭露提供套組，該套組包含如上述之包含第一核酸序列之核酸及包含第二核酸序列之核酸或如上述之包含SEQ ID NO：9之核酸序列之核酸及包含SEQ ID NO：10之核酸序列之核酸。
本揭露提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如上述之AAV載體系統及醫藥上可接受之賦形劑。
本揭露提供用於預防或治療特徵為視網膜細胞降解之疾病的如上述之AAV載體系統、如上述之套組或如上述之醫藥組成物；較佳地用於預防或治療斯特格氏症。
本揭露提供一種預防或治療特徵為視網膜細胞降解之疾病諸如斯特格氏症的方法，該方法包含向有此需要之個體投予有效量的如上述之AAV載體系統、如上述之套組或如上述之醫藥組成物。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之AAV載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列；其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該第一核酸序列包含與SEQ ID NO：1之核苷酸105至3597具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)序列同一性之序列；其中該第二核酸序列包含與SEQ ID NO：1之核苷酸3806至6926具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)序列同一性之序列；其中該第一核酸序列及該第二核酸序列各包含彼此重疊之序列區；且其中該序列重疊區包含與SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)序列同一性之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之AAV載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列，其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該ABCA4 CDS之5'端部分由與SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)序列同一性之序列組成，且其中該ABCA4 CDS之3'端部分由與SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)序列同一性之序列組成。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之5'端部分，其中該ABCA4 CDS之5'端部分由與SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)序列同一性之序列組成。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，其中該ABCA4 CDS之3'端部分由與SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)序列同一性之序列組成。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之AAV載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列；其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該第一核酸序列包含與SEQ ID NO：2之核苷酸105至3597具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之序列；其中該第二核酸序列包含與SEQ ID NO：2之核苷酸3806至6926具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之序列；其中該第一核酸序列及該第二核酸序列各包含彼此重疊之序列區；且其中該序列重疊區包含與SEQ ID NO：2之核苷酸3598至3805具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之AAV載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列，其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該ABCA4 CDS之5'端部分由與SEQ ID NO：2之核苷酸105至3805具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之序列組成，且其中該ABCA4 CDS之3'端部分由與SEQ ID NO：2之核苷酸3598至6926具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之序列組成。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之5'端部分，其中該ABCA4 CDS之5'端部分由與SEQ ID NO：2之核苷酸105至3805具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之序列組成。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，其中該ABCA4 CDS之3'端部分由與SEQ ID NO：2之核苷酸3598至6926具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之序列組成。
本揭露提供包含與SEQ ID NO：9具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之核酸序列的核酸，及包含與SEQ ID NO：10具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)序列同一性之核酸序列的核酸。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之腺相關病毒(AAV)載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列；其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3597的毗連核苷酸之序列；其中該第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3806至6926的毗連核苷酸之序列；其中該第一核酸序列及該第二核酸序列各包含彼此重疊之序列區；且其中該序列重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。在AAV載體系統之一些實施例中，序列重疊區的長度係介於20與550個核苷酸之間；較佳地長度係介於50與250個核苷酸之間；較佳地長度係介於175與225個核苷酸之間；或較佳地長度係介於195與215個核苷酸之間。在AAV載體系統之一些實施例中，序列重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約50個毗連核苷酸；較佳地至少約75個毗連核苷酸；較佳地至少約100個毗連核苷酸；較佳地至少約150個毗連核苷酸；較佳地至少約200個毗連核苷酸；或較佳地所有208個毗連核苷酸。
在本揭露之AAV載體系統之一些實施例中，第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列；且其中第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列。
在本揭露之AAV載體系統之一些實施例中，第一核酸序列包含可操作地連接ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分的CBA啟動子。在一些實施例中，第一核酸序列進一步包含編碼內含子之序列。在一些實施例中，第一核酸序列進一步包含編碼外顯子之序列在一些實施例中，第一核酸序列進一步包含編碼內含子及外顯子之序列(IntEx)。
在本揭露之AAV載體系統之一些實施例中，第一核酸序列包含位於ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分上游的非轉譯區(UTR)。在一些實施例中，UTR包含編碼增強子之序列。在一些實施例中，編碼增強子之序列包含單離自或衍生自巨細胞病毒(CMV)之序列(CMV增強子)。在一些實施例中，編碼增強子之序列不包含單離自或衍生自巨細胞病毒(CMV)之序列(CMV增強子)。
在一些實施例中，第一核酸序列進一步包含編碼內含子及外顯子之序列(IntEx)及UTR，其中該UTR不包含單離自或衍生自巨細胞病毒(CMV)之序列(CMV增強子)。
在本揭露之AAV載體系統之一些實施例中，第二核酸序列包含轉錄後反應元件(PRE)；較佳地土撥鼠肝炎病毒轉錄後反應元件(WPRE)。
在本揭露之AAV載體系統之一些實施例中，第二核酸序列包含牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
在本揭露之AAV載體系統之一些實施例中，第一核酸序列或第二核酸序列進一步包含編碼5'反向末端重複(ITR)之序列及編碼3'ITR之序列。在一些實施例中，編碼5'ITR之序列包含單離自或衍生自血清型2 AAV(AAV2)之野生型序列。在一些實施例中，編碼5'ITR之序列包含SEQ ID NO：27之序列或其刪除變體。在一些實施例中，編碼3'ITR之序列包含單離自或衍生自AAV2之野生型序列。在一些實施例中，編碼3'ITR之序列包含SEQ ID NO：30之序列或其刪除變體。在一些實施例中，刪除變體包含下列或由下列組成：10、20、30、40、50、70、80、90、100、110、120、130、140、144個核苷酸或介於之間的任何數量之核苷酸。在一些實施例中，刪除變體包含一或多個刪除。在一些實施例中，刪除變體包含至少二個刪除。在一些實施例中，至少二個刪除係不毗連。在一些實施例中，一或多個刪除包含截短5'或3'端之ITR。在一些實施例中，刪除變體包含刪除SEQ ID NO：27之核苷酸中任一者。在一些實施例中，刪除變體包含刪除SEQ ID NO：27中任2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140個或介於之間的任何數量的核苷酸。在一些實施例中，刪除變體包含刪除SEQ ID NO：30之核苷酸中任一者。在一些實施例中，刪除變體包含刪除SEQ ID NO：30中任2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140個或介於之間的任何數量的核苷酸。
在本揭露之AAV載體系統之一些實施例中，第一核酸序列或第二核酸序列進一步包含編碼5'反向末端重複(ITR)之序列及編碼3'ITR之序列。在一些實施例中，編碼5'ITR之序列包含單離自或衍生自血清型2 AAV(AAV2)之野生型序列。在一些實施例中，編碼5'ITR之序列包含下列序列：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
。在一些實施例中，編碼3'ITR之序列包含單離自或衍生自AAV2之野生型序列。在一些實施例中，編碼3'ITR之序列包含下列序列：
Figure 02_image005
在本揭露之AAV載體系統之一些實施例中，第一核酸序列或第二核酸序列進一步包含編碼5'反向末端重複(ITR)之序列及編碼3'ITR之序列。在一些實施例中，編碼5'ITR之序列包含單離自或衍生自血清型2AAV(AAV2)之野生型序列。在一些實施例中，編碼5'ITR之序列包含下列序列：
Figure 02_image007
Figure 02_image009
。在一些實施例中，編碼3'ITR之序列包含單離自或衍生自AAV2之野生型序列。在一些實施例中，編碼3'ITR之序列包含下列序列：
Figure 02_image011
本揭露提供一種細胞，其包含本揭露之AAV載體。
本揭露提供一種細胞，其包含編碼本揭露之AAV載體的核苷酸。
本揭露提供一種細胞，其包含本揭露之組成物。
在本揭露之細胞之一些實施例中，細胞係視網膜細胞。在一些實施例中，細胞係神經元細胞。在一些實施例中，細胞係感光受體細胞。在一些實施例中，細胞係視網膜色素上皮(RPE)之六角形細胞。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之方法，該方法包含下列步驟：使用本揭露之第一AAV載體及第二AAV載體轉導目標細胞以使功能性ABCA4蛋白質在目標細胞中表現。
本揭露提供一種核酸序列，該核酸序列包含ABCA4 CDS之5'端部分，其中該ABCA4 CDS之5'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列組成。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，其中該ABCA4 CDS之3'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列組成。
本揭露提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含本揭露之AAV載體或AAV載體系統及醫藥上可接受之賦形劑。
本揭露提供用於基因療法之本揭露之核酸、載體、AAV載體、組成物、AAV載體系統或醫藥組成物。
本揭露提用於預防或治療特徵為視網膜細胞降解之疾病的本揭露之核酸、載體、AAV載體、組成物、AAV載體系統或醫藥組成物。
本揭露提供用於預防或治療斯特格氏症之本揭露之核酸、載體、AAV載體、組成物、AAV載體系統或醫藥組成物。
本揭露提供一種預防或治療特徵為視網膜細胞降解之疾病的方法，該方法包含向有此需要之個體投予有效量的本揭露之核酸、載體、AAV載體、組成物、AAV載體系統或醫藥組成物。
本揭露提供一種預防或治療斯特格氏症的方法，該方法包含向有此需要之個體投予有效量的本揭露之核酸、載體、AAV載體、組成物、AAV載體系統或醫藥組成物。
斯特格氏症係視網膜的遺傳疾病，可透過破壞眼睛的光感測性感光受體細胞導致眼盲。該疾病通常在兒童期呈現，導致年輕人的眼盲。在兒童期及青少年期發展斯特格氏症可導致患者在二十歲出頭嚴重的視力喪失。斯特格氏症係遺傳性幼年型黃斑營養不良最常見的形式。斯特格氏症係在10,000人中影響大約1人的孤兒疾病。在美國、法國、德國、義大利、西班牙及英國有65,000名斯特格氏症患者。
斯特格氏症最常見的形式係與編碼蛋白質ATP結合卡匣亞家族A成員4(ABCA4)之基因的突變有關的隱性病症。ABCA4係大型、跨膜蛋白質，其在視網膜細胞中發揮再循環光敏感性色素的作用。ABCA4跨膜蛋白質在清除視覺循環的毒性副產物上扮演關鍵角色。在斯特格氏症中，ABCA4 基因的突變導致視網膜細胞中缺乏功能性ABCA4蛋白質。此進而導致雙類視色素副產物的形成及累積，在視網膜色素上皮(RPE)細胞中產生脂褐質毒性顆粒。此造成RPE細胞的降解及最終破壞，導致喪失感光受體細胞，造成進行性視力喪失及最終眼盲。功能性ABCA4不存在導致感光受體退化。進行性感光受體退化導致眼盲。
在發展本揭露之組成物及方法之前，並無治療選擇。在發展本揭露之組成物及方法之前，針對斯特格氏症之潛在病因提供有效治療的需求長久以來未被滿足。
基因療法係斯特格氏症有希望之治療。基因療法之目標在於藉由使用載體導入功能性ABCA4 基因至受影響感光受體細胞中來矯正造成疾病之缺乏，因而恢復ABCA4功能。
本揭露提供用於視網膜基因療法之衍生自腺相關病毒(AAV)之載體。AAV係小型病毒，其呈現非常低的免疫原性且並不與任何已知人疾病相關。缺乏相關發炎性反應表示當注射AAV至眼睛時不造成視網膜傷害。
AAV殼體之大小可限制可包裝在其內的DNA之量。AAV基因體的大小係大約4.7千鹼基(kb)，對於一些AAV載體及血清型而言，AAV中之DNA包裝的對應大小上限可為大約5 kb。因此，限制因子包括可編碼之AAV轉殖基因的大小限制在5kb以下。斯特格氏症係最盛行的隱性遺傳眼盲形式且係由ABCA4之突變造成。
ABCA4 基因之編碼序列的大小為大約6.8 kb(具有用於基因表現之其他基因元件)。因此，具有其他基因元件之ABCA4 基因之編碼序列的大小似乎大於標準AAV載體之大小上限。
本文描述一些克服此AAV載體之大小上限且表現大型基因諸如ABCA4 之方案。這些方案包括「特大」載體方案及「雙」載體方案。「特大」載體
已進行一些嘗試迫使顯著大於天然4.7 kb基因體之基因進入AAV載體，在轉導目標細胞上取得一些成功。舉例來說，Allocca et al.(J. Clin. Invest. vol.118, No. 5, May 2008)製備包裝鼠ABCA4 及人MYO7A 基因的特大AAV載體且顯示在轉導小鼠視網膜細胞之後的蛋白質表現。然而，雖然Allocca et al.提議某些AAV殼體可容納至多8.9 kb，後續研究發現「特大」方案事實上並未克服包裝大小上限，而是導致轉殖基因以隨機方式截短，提供各自包含轉殖基因之片段的異質性AAV載體族群(Dong et al., Molecular Therapy, vol. 18, No. 1, Jan 2010)。咸信在給定族群中一比例的特大載體包裝特大轉殖基因之夠大片段，以使介於片段之間的重疊區存在，允許在轉導目標細胞之後再組裝為全長基因。然而，此方法不可預測且無效率、缺乏包裝對照及後續重組失敗，明顯無法提供一致、可偵測的成功。「雙」載體
較成功的方案係製備雙載體系統，其中將大於大約5 kb限制的轉殖基因大約對半分割為二個定義序列的分開載體：含有轉殖基因5'部分的「上游」載體及含有轉殖基因3'部分的「下游」載體。藉由上游及下游載體轉導目標細胞，允許使用多種細胞內機制自二個片段再組裝為全長轉殖基因。
在所謂「分子間剪接(trans-splicing)」的雙載體方案中，剪接供體信號係放置於上游轉殖基因片段3'端及剪接受體信號放置於下游轉殖基因片段5'端。在雙載體轉導目標細胞時，存在AAV基因體之反向末端重複(ITR)序列媒介轉殖基因片段的頭對尾串聯及轉錄物分子間剪接導致產生全長mRNA序列，允許全長蛋白質表現。
替代雙載體系統使用「重疊」方案。在重疊雙載體系統中，在上游編碼序列部分3'端之部分的編碼序列與下游編碼序列部分5'的同源序列重疊。AAV包裝線性單股DNA(ssDNA)。在重疊雙載體方案中，雙股轉殖基因被分割成5'部分(同義，上游)及3'部分(反義，下游)，其中5'部分的3'端與3'部分的5'端重疊。5'部分及3'部分各由AAV載體(上游及下游載體)編碼，彼等各以ssDNA被包殼於AAV病毒粒子中。在上游AAV粒子及下游AAV粒子轉導細胞時，感染細胞或其核包含上游AAV載體及下游AAV載體。當該相同的感染細胞包含互補上游AAV載體及下游AAV載體(各具有另一者可雜交之單股序列)時，編碼5'部分及3'部分之互補ssDNA可產製全長轉殖基因。
在不希望被任何特定理論束縛的情形下，全長轉殖基因(例如ABCA4)可自重疊雙載體系統藉由第二股合成及隨後同源重組來產製。在上游AAV粒子及下游粒子轉導細胞時，對應ssDNA上游AAV載體及下游AAV載體係釋放至細胞或其核中，且包含轉殖基因之5'(上游)部分及轉殖基因之3'(下游)部分的dsDNA係自ssDNA各者藉由第二股合成產製。dsDNA接著在編碼序列之上游與下游部分之間的重疊區進行同源重組，此允許再產生全長轉殖基因，該全長轉殖基因可轉錄對應mRNA及表現全長蛋白質。例如，WO 2014/170480描述編碼人ABCA4蛋白質之雙AAV載體系統(其內容整體納入本文中)。
在本揭露之組成物及方法之一些實施例中，第一AAV載體包含ABCA4編碼序列之5'部分。在一些實施例中，第二AAV載體包含ABCA4編碼序列之3'部分。在一些實施例中，5'端部分及3'端部分重疊至少約20個核苷酸。在一些實施例中，第一AAV載體及第二AAV載體各包含單股DNA(ssDNA)。在一些實施例中，第一AAV載體包含ABCA4編碼序列之序列及/或與ABCA4編碼序列互補之序列。在一些實施例中，第二AAV載體包含ABCA4編碼序列之序列及/或與ABCA4編碼序列互補之序列。在一些實施例中，第一AAV載體包含5'ABCA4編碼序列之序列及與3'ABCA4編碼序列之部分互補之序列。在一些實施例中，第二AAV載體包含3'ABCA4編碼序列之序列及與5'ABCA4編碼序列之部分互補之序列。在一些實施例中，第一AAV載體及第二AAV載體進行第二股合成以產製第一dsDNA AAV載體及第二dsDNA AAV載體。在一些實施例中，第一dsDNA AAV載體及第二dsDNA AAV載體透過同源重組產製全長ABCA4轉殖基因。
在不希望被任何特定理論束縛的情形下，全長轉殖基因亦可自重疊雙載體系統透過單股黏合及第二股合成來產製。在上游AAV載體及下游AAV載體轉導細胞時，其中上游AAV載體及下游AAV載體各包含ssDNA，且其中上游AAV載體包含編碼轉殖基因5'部分之序列及下游AAV載體包含編碼轉殖基因3'部分之序列，互補上游及下游載體係釋放至細胞或其核中。在一些實施例中，上游AAV載體包含編碼轉殖基因5'部分之序列及與轉殖基因3'部分互補之序列。在一些實施例中，上游AAV載體包含編碼轉殖基因5'部分之同義序列及與轉殖基因3'部分互補之序列。在一些實施例中，上游AAV載體包含編碼轉殖基因5'部分之反義序列及與轉殖基因3'部分互補之序列。在一些實施例中，下游AAV載體包含編碼轉殖基因3'部分之序列及與轉殖基因5'部分互補之序列。在一些實施例中，下游AAV載體包含編碼轉殖基因3'部分之反義序列及與轉殖基因5'部分互補之序列。在一些實施例中，下游AAV載體包含編碼轉殖基因3'部分之同義序列及與轉殖基因5'部分互補之序列。在一些實施例中，上游及下游載體在互補(重疊)區雜交。在雜交之後，全長轉殖基因係藉由第二股合成產製。
在本揭露之組成物及方法一些實施例中，第一AAV載體包含ABCA4編碼序列之5'部分，第二AAV載體包含ABCA4編碼序列之3'部分且該5'部分及該3'部分重疊至少20個毗連核苷酸。在一些實施例中，第一AAV載體及第二AAV載體各包含單股DNA(ssDNA)。在一些實施例中，第一AAV載體包含ABCA4編碼序列之序列且第二AAV載體包含與ABCA4編碼序列互補之序列。在一些實施例中，第二AAV載體包含ABCA4編碼序列之序列且第一AAV載體包含與ABCA4編碼序列互補之序列在一些實施例中，第一AAV載體及第二AAV載體在互補重疊區黏合以藉由後續第二股合成產製全長dsDNA ABCA4轉殖基因。在一些實施例中，全長dsDNA ABCA4轉殖基因係經體外或體內(在細胞中或在個體中)產製。
本揭露藉由提供如請求項描述之腺相關病毒(AAV)載體系統來處理上述現有技術中的問題。
雙載體方案增加AAV基因療法的容量，但實質上亦可減少目標蛋白質之水準以致不足以達成治療效應。在雙載體系統之一些實施例中，雙載體之重組療效取決於正股與負股(同義股與反義股)之間的DNA重疊長度。ABCA4編碼序列之大小允許探討正股與負股之間的各種重疊長度，以識別用於治療由大型基因突變造成的病症之最佳雙載體策略區。這些策略可導致產生足夠的目標蛋白質以提供治療效應。在斯特格小鼠模型中，治療效應可輕易評估，因為目標蛋白質ABCA4在視網膜感光受體細胞中有大量需求且其不存在誘導雙類視色素化合物之累積，進而導致790nm自體螢光增加。重疊雙載體系統之治療潛力可藉由在治療之後觀察此雙類視色素累積及後續790nm自體螢光水準的減少而在體內驗證。
有利的是，本揭露之AAV載體系統在轉導細胞中提供意外高水準的全長ABCA4蛋白質表現，且ABCA4之非所要截短型片段的產生有限。藉由最佳化重組，全長ABCA4蛋白質在Abca4-/-小鼠之感光受體外節中表現且量足以減少雙類視色素形成並矯正視網膜造影上的自體螢光表型。這些觀察支持治療斯特格氏症之AAV基因療法雙載體方案。
ABCA4基因突變所導致的斯特格氏症係最常見的遺傳性黃斑營養不良(每8,000至10,000人中影響1人且係由ABCA4 基因突變所導致)。ABCA4 突變造成斯特格氏症及其他錐狀細胞及錐-桿細胞營養不良。ABCA4 基因突變所導致的斯特格氏症係已開發國家中最常見的兒童眼盲原因。該疾病通常在兒童期呈現且隨著患者年齡增長進行性惡化，因此在任何時間點治療性介入可預防或延緩進一步視力喪失。此疾病為進行性且通常在兒童期但在視力發育期之後出現症狀，因而提供足夠的治療性介入機會以預防或延緩進一步視力喪失。
ABCA4自感光受體外節盤清除毒性代謝物。功能性ABCA4不存在導致感光受體退化。感光受體外節盤包含光感測蛋白質視紫質及跨膜蛋白質ABCA4。ABCA4控制某些毒性視覺循環副產物的輸出。視色素包含視蛋白及發色團，例如類視色素，諸如11-順式視網醛。在視覺循環(有時稱為類視色素循環)中，類視色素經漂白且在感光受體與視網膜色素上皮(RPE)之間再循環。在光轉導期間活化視紫質時，11-順式視網醛係經異構化為全反式視網醛且自視蛋白解離。全反式視網醛經運送至RPE且經儲存或轉換回11-順式視網醛並運送回感光受體以完成視覺循環。
ABCA4之突變防止類視色素自感光受體細胞盤外膜運輸至視網膜色素上皮(RPE)，導致非所欲之類視色素衍生物累積在感光受體外節中。由於感光受體外節持續產製，當老舊盤變得終末時，它們會被RPE吞噬。在攜帶突變、非功能性ABCA4之感光受體細胞中，保留在盤膜中之雙類視色素在RPE細胞中累積，發生進一步生化過程導致形成毒性化合物A2E(脂褐質之關鍵元件)。ABCA4突變係與感光受體及RPE中之毒素累積相關。例示性毒素包括但不限於全反式視網醛、雙類視色素及脂褐質。
缺乏功能性ABCA4防止游離視網醛自感光受體細胞盤外膜腔側運輸至細胞質側，導致類視色素二聚體(雙類視色素)形成增加或放大形成。當視網膜色素上皮(RPE)每天吞噬感光受體細胞的遠端外節時，類視色素衍生物被進一步處理，導致累積雙類視色素。類視色素衍生物係經處理但不可溶且累積。此累積的結果導致RPE細胞功能異常及最終死亡，且後續透過退化及後續死亡繼發性喪失上覆感光受體。本發明人已在色素化Abca4 -/- 小鼠模型中表徵眼底變化且記載氘化維生素A對於眼底螢光及雙類視色素累積的正面效應。在本揭露中，本發明人顯示使用重疊AAV雙載體系統遞送ABCA4至Abca4 -/- 小鼠模型的感光受體減少毒性雙類視色素的累積，該效應在斯特格氏症患者中可預防RPE細胞死亡及該RPE細胞所支持之感光受體細胞的退化及死亡。
在本揭露之組成物及方法之一些實施例中，本揭露之AAV雙載體系統產製為在個體眼睛之一或多種細胞中之全長ABCA4轉殖基因。在一些實施例中，個體患有斯特格氏症。在一些實施例中，一或多種細胞包含感光受體細胞。在一些實施例中，一或多種細胞包含RPE細胞。在一些實施例中，一或多種細胞包含RPE細胞、感光受體細胞或彼等之組合。
在本揭露之組成物及方法之一些實施例中，在個體眼睛之一或多種細胞中表現ABCA4轉殖基因延緩感光受體細胞之退化。在一些實施例中，一或多種細胞包含RPE細胞、感光受體細胞或彼等之組合。在一些實施例中，在個體眼睛之一或多種細胞中表現ABCA4轉殖基因預防感光受體細胞之死亡。在一些實施例中，在個體眼睛之一或多種細胞中表現ABCA4轉殖基因預防感光受體細胞之退化。在一些實施例中，在個體眼睛之一或多種細胞中表現ABCA4轉殖基因恢復感光受體細胞為健康或存活感光受體細胞。
在一些實施例中，在個體眼睛之一或多種細胞中表現ABCA4轉殖基因預防RPE細胞之死亡。在一些實施例中，在個體眼睛之一或多種細胞中表現ABCA4轉殖基因預防RPE細胞之死亡及感光受體細胞之退化。
病毒載體係衍生自野生型病毒，使用重組核酸技術修飾該野生型病毒以併入非天然核酸序列(或轉殖基因)至病毒基因體中。病毒靶向及感染特定細胞之能力係用於遞送轉殖基因至目標細胞，導致基因表現及產生經編碼的基因產物。
本揭露關於衍生自腺相關病毒(AAV)之載體。
腺相關病毒(AAV)載體之潛在限制因子係可編碼之DNA轉殖基因的大小限制在5kb以下。
斯特格氏症係最盛行的隱性遺傳眼盲形式且係由ABCA4 (其編碼序列長度為6.8kb)之突變造成。雙載體方案增加AAV基因療法的容量，但所產製之目標蛋白質之水準是否足以達成治療效應是問題所在。此外，雙載體通常產生非所要之截短型蛋白質。在本申請案中，我們描述最佳化重疊AAV雙載體系統以遞送人ABCA4 之6.8kb編碼序列的系統性方案，ABCA4中的突變造成斯特格氏症，是年輕人中最常見的隱性遺傳眼盲形式。本揭露之資料顯示最佳化重疊雙載體策略，以將全長ABCA4以能達成治療效應之水準遞送至Abca4 -/- 小鼠的感光受體外節，同時將截短型蛋白質形式減少至不可偵測水準。
在重疊雙載體轉導之後產製全長ABCA4蛋白質的體外及體內評估及改善係藉由識別最佳重疊區且包括上游轉殖基因之5'非轉譯區及下游轉殖基因之土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件來達成。截短型ABCA4係透過下游轉殖基因中特定序列選擇減少。最佳化重疊雙載體系統在Abca4 -/- 小鼠之感光受體外節中產製功能性ABCA4蛋白質，導致治療效應。此係藉由在注射後3個月治療眼之雙類視色素及A2E水準減少及在注射後6個月脂褐質及黑色素相關自體螢光來定量。這些觀察支持在未來治療斯特格氏症之臨床試驗中，使用AAV基因療法之雙載體方案。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之腺相關病毒(AAV)載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列；其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3597的毗連核苷酸之序列；其中該第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3806至6926的毗連核苷酸之序列；其中該第一核酸序列及該第二核酸序列各包含彼此重疊之序列區；且其中該序列重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。
AAV載體一般係所屬技術領域中廣知，且技藝人士熟悉所屬技術領域中之通常知識所適合用於製備AAV載體之常規技術。技藝人士之知識包括適合用於將受關注之核酸序列併入AAV載體之基因體中的技術。
使用用語「AAV載體系統」以包括意圖使第一及第二AAV載體以互補方式合作作用之事實。
本揭露之AAV載體系統之第一及第二AAV載體一起編碼整個ABCA4轉殖基因。因此，編碼ABCA4轉殖基因在目標細胞中之表現需要使用第一(上游)及第二(下游)載體兩者轉導目標細胞。
本揭露之AAV載體系統之AAV載體可呈AAV粒子(亦稱為病毒粒子)之形式。AAV粒子包含圍繞核酸核心之蛋白質外殼(殼體)，該核酸核心係AAV基因體。本揭露亦涵蓋編碼本文所述之AAV載體系統之AAV載體基因體的核酸序列。
SEQ ID NO：1係人ABCA4核酸序列，其對應NCBI參考序列NM_000350.2。SEQ ID NO：1與NCBI參考序列NM_000350.2相同。ABCA4編碼序列橫跨SEQ ID NO：1之核苷酸105至6926。
第一AAV載體包含第一核酸序列，該第一核酸序列包含ABCA4 CDS之5'端部分。ABCA4 CDS之5'端部分係ABCA4 CDS之包括其5'端之部分。因為其僅是CDS的一部分，ABCA4 CDS之5'端部分不是全長(即並非完整的)ABCA4 CDS。因此，第一核酸序列(及因此該第一AAV載體)不包含全長ABCA4 CDS。
第二AAV載體包含第二核酸序列，該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分。ABCA4 CDS之3'端部分係ABCA4 CDS之包括其3'端之部分。因為其僅是CDS的一部分，ABCA4 CDS之3'端部分不是全長(即並非完整的)ABCA4 CDS。因此，第二核酸序列(及因此該第二AAV載體)不包含全長ABCA4 CDS。
5'端部分及3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS(具有如以下討論之序列重疊區)。因此，全長ABCA4 CDS係含有在本揭露之AAV載體系統中，分割成第一及第二AAV載體且在使用第一及第二AAV載體轉導目標細胞之後可在目標細胞中再組裝。
如上述之第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3597的毗連核苷酸之序列。ABCA4 CDS始於SEQ ID NO：1之核苷酸105。
如上述之第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3806至6926的毗連核苷酸之序列。
為了涵蓋整個ABCA4 CDS，第一及第二核酸序列各自進一步包含至少一部分對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之ABCA4 CDS，使得當第一及第二核酸序列對齊時，涵蓋完整對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之ABCA4 CDS。因此，當對齊時，第一及第二核酸序列一起涵蓋整個ABCA4 CDS。
另外，第一及第二核酸序列包含序列重疊區，允許整個ABCA4 CDS重新建構為在本揭露之第一及第二AAV載體轉導之目標細胞內的全長轉殖基因之一部分。
當第一及第二核酸序列彼此對齊時，第一核酸序列之3'端的區域與第二核酸序列之5'端的對應區域重疊。因此，第一及第二核酸序列皆包含形成序列重疊區之ABCA4 CDS之部分。
在一些實施例中，介於第一與第二核酸序列之間的重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之ABCA4 CDS部分的至少約20個毗連核苷酸。
在一些實施例中，重疊區可在該20個毗連核苷酸上游及/或下游延長。因此，重疊區的長度可超過20個核苷酸。
重疊區可包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598之位置上游的核苷酸。選擇性地或另外地，重疊區可包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3805之位置下游的核苷酸。
替代地，核酸序列重疊區可含有在對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之ABCA4 CDS部分以內。
因此，在一實施例中，核酸序列重疊區的長度係介於20與550個核苷酸之間；較佳地長度係介於50與250個核苷酸之間；較佳地長度係介於175與225個核苷酸之間；較佳地長度係介於195與215個核苷酸之間。
在一實施例中，核酸序列重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約50個毗連核苷酸；較佳地至少約75個毗連核苷酸；較佳地至少約100個毗連核苷酸；較佳地至少約150個毗連核苷酸；較佳地至少約200個毗連核苷酸；較佳地所有208個毗連核苷酸。
在某些較佳實施例中，核酸序列重疊區開始於對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598處的核苷酸。用語「開始(commences)」是指核酸序列重疊區以5'至3'的方向始於對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598處的核苷酸。因此，在一較佳實施例中，核酸序列重疊區之最5'的核苷酸對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598。
在某些較佳實施例中，第一核酸序列與第二核酸序列載體之間的核酸序列重疊區對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805。
建構包含如上述之核酸序列重疊區之雙AAV載體可減少非所要截短型ABCA4肽的轉譯水準。
當轉譯僅自衍生自下游載體之mRNA轉錄物起始時，雙AAV載體系統可出現轉譯截短型ABCA4肽的問題。就此而言，AAV ITR諸如AAV2 5'ITR可具有啟動子活性；此合併下游載體中存在有WPRE及bGH聚腺苷酸化序列(如以下討論)可導致自非重組下游載體產製穩定mRNA轉錄物。野生型ABCA4 CDS在其下游部分攜帶多個符合讀框AUG密碼子，其無法在不改變胺基酸序列的情形下被其他密碼子取代。此產生自穩定轉錄物發生轉譯的可能性，導致截短型ABCA4肽的存在。
在本揭露之某些較佳實施例中，其中核酸序列重疊區開始於對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598處的核苷酸，為了鼓勵轉譯機轉自不符讀框位點起始非重組僅下游轉錄物的轉譯，重疊區之開始序列在較弱情境中符合讀框的AUG密碼子之前包括在(關於潛在Kozak一致序列)良好情境中不符讀框的AUG(開始)密碼子。在本揭露之某些特別較佳實施例中，在符合讀框的AUG之前總共有四個在各種情境中的不符讀框的AUG密碼子。所有這些在10個胺基酸以內轉譯成終止密碼子，因此預防非所要截短型ABCA4肽的轉譯。
在某些較佳實施例中，第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列且第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列，因此涵蓋如上所述之核酸序列重疊區。
因此，在某些較佳實施例中，ABCA4 CDS之5'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列組成，且ABCA4 CDS之3'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列組成。
在某些較佳實施例中，ABCA4 CDS之5'端部分由SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805組成，且ABCA4 CDS之3'端部分由SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926組成。
因此在某些較佳實施例中，本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之AAV載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列，其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該ABCA4 CDS之5'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列組成，且其中該ABCA4 CDS之3'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列組成。
在某些較佳實施例中，本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之AAV載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列，其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS；其中該ABCA4 CDS之5'端部分由SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805組成，且其中該ABCA4 CDS之3'端部分由SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926組成。
根據用語「由 組成」，在其中ABCA4 CDS之5'端部分及ABCA4 CDS之3'端部分由如上述之毗連核苷酸之特定序列組成的實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列各自不包含任何額外ABCA4 CDS。
在某些實施例中，第一AAV載體及第二AAV載體中各者包含5'及3'反向末端重複(ITR)。
在某些實施例中，天然衍生性血清型、單離株或分支AAV的AAV基因體包含至少一個反向末端重複序列(ITR)。ITR序列順式作用以提供功能性複製起點且允許用於自細胞之基因體整合及切除載體。咸信AAV ITR有助於在AAV感染細胞之核中形成串聯體，例如在藉由宿主細胞DNA聚合酶之作用將單股載體DNA轉化成雙股DNA之後。此類附加型串聯體的形成可用來在宿主細胞生命期間保護載體建構體，藉此允許延長轉殖基因在體內的表現。
因此，在一些實施例中，ITR係AAV ITR(即衍生自在AAV基因體中發現的ITR序列之ITR序列)。
本揭露之AAV載體系統之第一及第二AAV載體一起包含完整功能性ABCA4轉殖基因在兩種載體轉導後的目標細胞中再組裝所需的所有組分。技藝人士知曉經常用於確保轉殖基因在病毒載體轉導細胞中表現的額外基因元件。這些可稱為表現控制序列。因此，本揭露之AAV病毒載體系統之AAV載體可包含可操作地連接編碼ABCA4轉殖基因之核苷酸序列之表現控制序列(例如包含啟動子序列)。
5'表現控制序列組分可位於病毒載體系統之第一(「上游」)AAV載體，而3'表現控制序列可位於病毒載體系統之第二(「下游」)AAV載體。
因此在一些實施例中，第一AAV載體可包含可操作地連接ABCA4 CDS之5'端部分的啟動子。啟動子之本質上必需位於ABCA4 CDS之5'，因此其位置係在第一AAV載體中。
可使用任何合適啟動子，其選擇可由技藝人士輕易作出。啟動子序列可具有組成性活性(即在任何宿主細胞背景中作業)或替代地僅在特定宿主細胞環境中具活性，因此允許轉殖基因在特定細胞類型中靶向性表現(例如組織特異性啟動子)。啟動子可顯示因應另一因子存在(例如存在宿主細胞中之因子)之誘導性表現。在該些投予載體之療法的實施例中，啟動子在目標細胞背景中應具功能性。
在一些實施例中，為了允許轉殖基因僅在視網膜細胞族群中表現，啟動子顯示視網膜細胞特異性表現。因此，來自啟動子之表現可為視網膜細胞特異性，例如侷限於僅神經感覺性視網膜及視網膜色素上皮之細胞。
適用於本揭露之例示性啟動子係雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子，可選地與巨細胞病毒(CMV)增強子元件組合。另一用於本揭露之例示性啟動子係雜交CBA/CAG啟動子，例如用於rAVE表現卡匣之啟動子(GeneDetect.com)。
基於誘導視網膜特異性基因表現之人序列的啟動子實例包括桿狀及錐狀細胞之視紫質激酶、僅錐狀細胞之PR2.1及視網膜色素上皮之RPE65。
基因表現可使用GRK1啟動子達成。因此，在某些實施例中，啟動子係人視紫質激酶(GRK1)啟動子。
在一些實施例中，本揭露之GRK1啟動子序列的長度包含199個核苷酸或由199個核苷酸組成且包含GRK1基因之核苷酸-112至+87或由GRK1基因之核苷酸 -112至+87組成。在某些較佳實施例中，啟動子包含下列或由下列組成：SEQ ID NO：5之核酸序列或其與SEQ ID NO：5具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%)序列同一性之變體。
可在本揭露之上游及下游載體中包括元件以增加ABCA4蛋白質之表現。例如，在載體(諸如本揭露之上游載體)中包括內含子可增加受到關注之RNA或蛋白質自該載體的表現內含子係基因內的核苷酸序列，在RNA成熟期間，內含子藉由RNA剪接移除。內含子的長度可自數十個鹼基對至數百萬鹼基不等。然而，剪接體內含子(即藉由真核剪接體剪接之內含子)可包含在內含子5'端之剪接供體(SD)位點、在內含子中靠近3'端的分支位點及在3'端的剪接受體(SA)位點。這些內含子元件促進適當內含子剪接。SD位點可包含在內含子5'端之一致GU且在內含子3'端之SA位點可以「AG」終止在SA位點上游，內含子通常含有富含嘧啶區，該區介於分支點腺嘌呤核苷酸與SA之間。在不希望被任何特定理論束縛的情形下，內含子的存在可影響RNA轉錄速率、核輸出或RNA轉錄物穩定性。另外，內含子的存在亦可增加mRNA轉譯效率，產生更多受到關注之蛋白質(例如ABCA4)。圖33及34描述二種用於ABCA4雙載體之例示性內含子(及伴隨之外顯子)：IntEx及RBG SA/SD。然而，本揭露涵蓋在本揭露之建構體中使用任何加強基因表現且促進真核細胞中之剪接的內含子。
在本揭露之載體之一些實施例中，內含子IntEx或SA/SD(包括RBD SA/SD)可為數種功能為增加蛋白質自載體表現之元件中的一種。例如，啟動子及可選地增強子可影響不只是基因表現的細胞或組織特異性，但也包括自載體轉錄之mRNA的水準。啟動子係起始RNA轉錄之DNA區域。取決於啟動子之特定序列元件，啟動子可具有不同的強度及組織特異性。增強子係藉由影響啟動子招募RNA聚合酶及起始轉錄之能力來調節自啟動子轉錄之DNA序列。因此，在載體中的啟動子的選擇及可選地增強子之包括及/或增強子本身的選擇可顯著影響載體所編碼之基因的表現。例示性啟動子諸如視紫質激酶啟動子或雞β肌動蛋白啟動子可選地與CMV增強子組合，如圖33及34所示。在一些實施例中，本揭露之載體包含例示性啟動子，諸如視紫質激酶啟動子或雞β肌動蛋白啟動子，但排除使用增強子元件。在一些實施例中，本揭露之載體包含例示性啟動子，諸如雞β肌動蛋白啟動子，但排除使用增強子元件，諸如CMV增強子元件。在一些實施例中，本揭露之載體包含例示性啟動子，諸如視紫質激酶啟動子或雞β肌動蛋白啟動子，但排除使用增強子元件，但包括內含子IntEx或SD/SA。在一些實施例中，本揭露之載體包含例示性啟動子，諸如雞β肌動蛋白啟動子，但排除使用增強子元件，諸如CMV增強子元件，但包括內含子IntEx或SD/SA。
mRNA轉錄物本身之非編碼序列中的元件亦可影響載體所編碼之序列的蛋白質水準。在不希望被任何特定理論限制的情形下，mRNA非轉譯區(UTR)中之序列元件可影響mRNA穩定性，進而影響蛋白質轉譯水準。例示性序列元件係轉錄後調節元件(PRE)(例如土撥鼠肝炎PRE(WPRE))，其增加mRNA穩定性。例示性啟動子、增強子、PRE及這些元件在本揭露之載體中的安排係如圖33及34所示。
在本揭露之第一AAV載體之一些實施例中，啟動子可與內含子及外顯子序列可操作地連接。在本揭露之第一AAV載體之一些實施例中，核酸序列可包含啟動子、內含子及外顯子序列。內含子及外顯子序列可在啟動子序列下游。內含子及外顯子序列可位於啟動子序列與上游ABCA4核酸序列(US-ABCA4)之間。內含子及外顯子的存在可增加蛋白質表現水準。在一些實施例中，內含子係位於啟動子與外顯子之間。在一些實施例中，包括該些其中內含子係位於啟動子與外顯子之間的實施例，外顯子係位於US-ABCA4序列的5'。在一些實施例中，啟動子包含單離自或衍生自脊椎動物基因之啟動子。在一些實施例中，啟動子係GRK1啟動子或雞β肌動蛋白(CBA)啟動子。
外顯子可包含編碼序列、非編碼序列或兩者之組合。在一些實施例中，外顯子包含非編碼序列。在一些實施例中，外顯子係單離自或衍生自哺乳動物基因。在實施例中，哺乳動物係兔(家兔(Oryctolagus cuniculus ))。在一些實施例中，哺乳動物基因包含兔β球蛋白基因或其部分。在一些實施例中，外顯子包含下列或由下列組成：與下列核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性之核酸序列：
Figure 02_image013
在一些實施例中，外顯子包含下列或由下列組成：與下列核酸序列具有100%同一性之核酸序列：
Figure 02_image015
內含子可包含剪接供體位點、剪接受體位點或分支點。內含子可包含剪接供體位點、剪接受體位點及分支點。例示性剪接受體位點包含在內含子5'端之核苷酸「GT」(前-mRNA中之「GU」)。例示性剪接受體位點包含在內含子3'端之「AG」。在一些實施例中，分支點包含在內含子3'端上游介於20與40個核苷酸之間(終點包括在內)的腺苷酸(A)。內含子可包含人工或非天然存在序列。替代地，內含子可單離自或衍生自脊椎動物基因。內含子可包含編碼二個序列之融合之序列，該二個序列中各者可單離自或衍生自脊椎動物基因。在一些實施例中，內含子核酸序列或其部分所衍生自之脊椎動物基因包含雞(原雞(Gallus gallus ))基因。在一些實施例中，雞基因包含雞β肌動蛋白基因。在一些實施例中，內含子核酸序列或其部分所衍生自之脊椎動物基因包含兔(家兔(Oryctolagus cuniculus ))基因。在一些實施例中，兔基因包含兔β球蛋白基因或其部分。在一些實施例中，內含子包含下列或由下列組成：與下列核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性之核酸序列：
Figure 02_image017
在一些實施例中，內含子包含下列或由下列組成：與下列核酸序列具有100%同一性之核酸序列：
Figure 02_image019
在第一(或上游)AAV載體之一些實施例中，啟動子包含雜交啟動子(巨細胞病毒(CMV)增強子與雞β肌動蛋白(CBA)啟動子)。在一些實施例中，CMV增強子序列包含下列或由下列組成：與下列核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少介於之間的任何百分比同一性之核酸序列：
Figure 02_image021
在一些實施例中，編碼第一(或上游)AAV載體之序列包含編碼CBA啟動子(不含CMV增強子元件)之序列、編碼內含子之序列及編碼外顯子之序列。在一些實施例中，CBA啟動子序列包含下列或由下列組成：與下列核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少介於之間的任何百分比同一性之核酸序列：
Figure 02_image023
在一些實施例中，CBA啟動子序列包含下列或由下列組成：與下列核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少介於之間的任何百分比同一性之核酸序列：
Figure 02_image025
在一些實施例中，編碼內含子之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：SEQ ID NO：13。在一些實施例中，編碼外顯子之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：SEQ ID NO：14。
第一AAV載體可包含位於啟動子與上游ABCA4核酸序列之間的非轉譯區(UTR)(即5'UTR)。
可使用任何合適UTR序列，其選擇可由技藝人士輕易作出。
UTR可包含下列元件一或多者或由下列元件一或多者組成：雞β-肌動蛋白(CBA)內含子1或其部分、家兔β-球蛋白(RBG)內含子2或其部分及家兔β-球蛋白外顯子3或其部分。
UTR可包含Kozak一致序列。可使用任何合適的Kozak一致序列。
在某些較佳實施例中，UTR包含SEQ ID NO：6表明之核酸序列或其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%)序列同一性之變體或部分。
SEQ ID NO：6之UTR的長度係186個核苷酸且包括雞β-肌動蛋白(CBA)內含子1片段(具有預測的剪接供體位點)、家兔β-球蛋白(RBG)內含子2片段(包括預測的分支點及剪接受體位點)及其後緊接Kozak一致序列之家兔β-球蛋白外顯子3片段。
如上述之UTR的存在(特別是SEQ ID NO：6所表明的UTR序列或其具有至少90%序列同一性之變體)可增加ABCA4轉殖基因的轉譯產率。
本揭露之AAV載體系統之第二(「下游」) AAV載體可包含轉錄後反應元件(亦稱為轉錄後調節元件)或PRE。可使用任何合適PRE，其選擇可由技藝人士輕易作出。在某些實施例中，合適PRE的存在可增強ABCA4轉殖基因的表現。
在某些較佳實施例中，PRE係土撥鼠肝炎病毒PRE(WPRE)。在某些特別較佳實施例中，WPRE具有如SEQ ID NO：7所表明之序列或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
第二AAV載體可包含位於下游ABCA4核酸序列3'之聚腺苷酸化序列。可使用任何合適聚腺苷酸化序列，其選擇可由技藝人士輕易作出。 在某些較佳實施例中，聚腺苷酸化序列係牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化序列。在特別較佳實施例中，bGH聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO：8所表明之序列或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。在某些實施例中，編碼聚腺苷酸化序列之序列包含下列或由下列組成：與下列核酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少介於之間的任何百分比同一性之核酸序列：
Figure 02_image027
在本揭露之AAV載體系統之某些較佳實施例中，第一AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列，且第二AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列。
在本揭露之AAV載體系統之某些較佳實施例中，第一AAV載體包含SEQ ID NO：3之核酸序列，且第二AAV載體包含SEQ ID NO：4之核酸序列。
本揭露之AAV載體系統可適合在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質。
本揭露提供一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之方法，該方法包含下列步驟：使用如上描述之第一AAV載體及第二AAV載體轉導目標細胞以使功能性ABCA4蛋白質在目標細胞中表現。
人ABCA4蛋白質之表現需要將該目標細胞用第一AAV載體及第二AAV載體轉導。在某些實施例中，目標細胞可用第一AAV載體及第二AAV載體以任何順序(第一AAV載體之後接著第二AAV載體、或第二AAV載體之後接著第一AAV載體)或同時轉導。
使用AAV載體轉導目標細胞之方法係所屬技術領域中已知且將為技藝人士所熟知。
目標細胞可為眼睛細胞，較佳地視網膜細胞(例如神經元感光受體細胞、桿狀細胞、錐狀細胞或視網膜色素上皮細胞)。
本揭露亦提供如上定義之第一AAV載體。亦提供如上定義之第二AAV載體。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之5'端部分，其中該ABCA4 CDS之5'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列組成。在某些實施例中，此AAV載體不包含除該毗連核苷酸之序列以外之任何額外的ABCA4 CDS。
第一AAV載體可包含：5'及3'ITR，較佳地AAV ITR；啟動子，例如GRK1啟動子；及/或UTR；該等元件係如上關於本揭露之AAV載體系統所述。
在一些實施例中，第一AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列。
在一些實施例中，第一AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
在一些實施例中，第一AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列，前提是在對應SEQ ID NO：1之核苷酸1640位置處之核苷酸係G，或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
在一些實施例中，第一AAV載體包含SEQ ID NO：3之核酸序列。
在一些實施例中，第一AAV載體包含SEQ ID NO：3之核酸序列或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
在一些實施例中，第一AAV載體包含SEQ ID NO：3之核酸序列，前提是在對應SEQ ID NO：1之核苷酸1640位置處之核苷酸係G，或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
本揭露提供一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，其中該ABCA4 CDS之3'端部分由對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列組成。在一些實施例中，此AAV載體不包含除該毗連核苷酸之序列以外之任何額外的ABCA4 CDS。
第二載體可包含：5'及3'ITR，較佳地AAV ITR；PRE，較佳地WPRE；及/或聚腺苷酸化序列，較佳地bGH聚腺苷酸化序列；該等元件係如上關於本揭露之AAV載體系統所述。
在一些實施例中，第二AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列。
在一些實施例中，第二AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
在一些實施例中，第二AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列，前提是在對應SEQ ID NO：1之核苷酸5279位置處之核苷酸係G且在對應SEQ ID NO：1之核苷酸6173位置處之核苷酸係T，或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
在一些實施例中，第二AAV載體包含SEQ ID NO：4之核酸序列。
在一些實施例中，第二AAV載體包含SEQ ID NO：4之核酸序列或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、 99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
在一些實施例中，第二AAV載體包含SEQ ID NO：4之核酸序列，前提是在對應SEQ ID NO：1之核苷酸5279位置處之核苷酸係G且在對應SEQ ID NO：1之核苷酸6173位置處之核苷酸係T，或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
本揭露亦提供核酸，該核酸包含上述之核酸序列。本揭露亦提供AAV載體基因體，該AAV載體基因體可衍生自如上述之AAV載體。
亦提供套組，該套組包含如上述之第一AAV載體及第二AAV載體。AAV載體可以AAV粒子之形式提供於套組中。
進一步提供一種套組，該套組包含如上述之包含第一核酸序列之核酸及包含第二核酸序列之核酸。
本揭露亦提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如上述之AAV載體系統及醫藥上可接受之賦形劑。
本揭露之AAV載體系統、本揭露之套組及本揭露之醫藥組成物可用於基因療法。例如，本揭露之AAV載體系統、本揭露之套組及本揭露之醫藥組成物可用於預防或治療疾病。
在一些實施例中，使用本揭露之組成物及方法預防或治療疾病包含向目標細胞投予第一AAV載體及第二AAV載體以提供ABCA4蛋白質之表現。
在一些實施例中，待預防或治療之疾病的特徵是視網膜細胞降解。此類疾病之實例係斯特格氏症。在一些實施例中，本揭露之第一及第二AAV載體可向患者眼睛(例如眼睛的視網膜組織)投予以使功能性ABCA4蛋白質表現以補償疾病中存在的突變。
本揭露之AAV載體可經調配為醫藥組成物或藥劑。
本揭露之AAV載體系統實例包含第一AAV載體及第二AAV載體；其中第一AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列；且第二AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列。
本揭露之進一步例示性AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體；其中第一AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體；且第二AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列或其具有至少90%(例如至少90、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9%)序列同一性之變體。
在一些實施例中，本揭露之方法及用途亦可在其中使用SEQ ID NO：2作為代替SEQ ID NO：1之參考序列時執行。
就此而言，SEQ ID NO：2係與SEQ ID NO：1相同，例外為下列突變：核苷酸1640 G＞T、核苷酸5279 G＞A、核苷酸6173 T＞C。這些突變不改變編碼胺基酸序列，因此由SEQ ID NO：2編碼之ABCA4蛋白質係與由SEQ ID NO：1編碼之ABCA4蛋白質相同。
因此，在本揭露之替代實施例中，上述指涉SEQ ID NO：1可置換為指涉SEQ ID NO：2。 序列對應
如本文中所使用，用語「對應(corresponding to)」在關於給定核酸序列中之核苷酸使用時，藉由指涉特定SEQ ID NO來定義核苷酸位置。然而，當此類指涉出現時，將能理解本揭露並不限於該指涉之特定SEQ ID NO所示之確切序列，而是包括其變體序列。對應SEQ ID NO：1中核苷酸位置之核苷酸可藉由序列排比輕易判定，諸如使用序列排比程式，該等程式之使用係所屬技術領域中廣知的。就此而言，技藝人士可輕易理解基因密碼之簡併特性是指編碼給定多肽之核酸序列中可存在變化而不變更編碼多肽之胺基酸序列。因此，識別其他ABCA4編碼序列中之核苷酸位置被考慮(即在技藝人士認為對應例如SEQ ID NO：1識別位置的位置處之核苷酸)。
舉例來說，SEQ ID NO：2係與SEQ ID NO：1相同，例外為上述之三個特定突變(這三個突變不改變編碼ABCA4多肽之胺基酸序列)。在此情況中，技藝人士因此將考慮SEQ ID NO：2中給定核苷酸位置對應SEQ ID NO：1中等效編號之核苷酸位置。 AAV載體
本揭露之病毒載體包含腺相關病毒(AAV)載體。本揭露之AAV載體可呈成熟AAV粒子或病毒粒子之形式，即被AAV蛋白質殼體圍繞之核酸。
AAV載體可包含AAV基因體或其衍生物。
AAV基因體係多核苷酸序列，在一些實施例中，其可編碼產生AAV粒子之功能。這些功能包括例如在宿主細胞中AAV複製及包裝循環中作業之功能，包括將AAV基因體包殼成為AAV粒子。天然存在AAV係複製缺陷型且依賴反式輔助功能的提供以完成複製及包裝循環。因此，本揭露之載體之AAV基因體可為複製缺陷型。
AAV基因體可呈正鏈或負鏈之單股形式，或替代地呈雙股形式。在一些實施例中，使用雙股形式允許在目標細胞中省略DNA複製步驟，因此可加速轉殖基因表現。
在一些實施例中，本揭露之載體之AAV基因體可呈單股形式。
AAV基因體可來自任何天然衍生性血清型、單離株或分支AAV。因此，AAV基因體可為天然存在AAV之完整基因體。如技藝人士已知，存在天然中之AAV可根據各種生物系統分類。
AAV係以彼等之血清型指涉。血清型對應AAV之變體亞種，由於變體亞種表現殼體表面抗原之特性而具有獨特反應性，因此可用來與其他變體亞種區別。具有特定AAV血清型之病毒無法有效率地與任何其他AAV血清型特異性中和抗體交叉反應。
AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAV11，亦包括最近自靈長動物腦部識別之重組血清型，諸如Rec2及Rec3。任何這些AAV血清型皆可用於本揭露。因此，在本揭露之一實施例中，本揭露之AAV載體可衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rec2或Rec3 AAV。
AAV血清型回顧文獻可見Choi et al.(2005)Curr. Gene Ther.5：299-310及Wu et al.(2006) Molecular Therapy 14：316-27。AAV基因體之序列或AAV基因體之元件序列包括ITR序列、rep或cap基因可衍生自下列AAV全基因體序列編號：腺相關病毒1 NC_002077、AF063497；腺相關病毒2 NC_001401；腺相關病毒3 NC_001729；腺相關病毒3B NC_001863；腺相關病毒4 NC_001829；腺相關病毒5 Y18065、AF085716；腺相關病毒6 NC_001862；禽AAV ATCC VR-865 AY186198、AY629583、NC_004828；禽AAV株DA-1 NC_006263、AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。
AAV亦可用分支或殖株之用語指涉。此係指例如天然衍生性AAV之親源關係，或係指可追蹤至相同祖先的AAV親源關係群且包括其所有後代。此外，AAV可指涉特定單離株，即在天然中發現之特定AAV基因單離株。用語基因單離株描述一個AAV族群，該族群與其他天然存在AAV發生受限的基因混合，藉此定義在基因層級上可辨識之獨特族群。
技藝人士可根據他們的普通知識選擇用於本揭露之適當的AAV血清型、分支、殖株或單離株。例如，AAV5殼體已顯示可有效轉導靈長動物錐狀細胞感光受體，其證據為成功矯正遺傳性色視覺缺陷(Mancuso et al.(2009)Nature 461：784-7)。
AAV血清型可決定AAV病毒的組織感染特異性(或趨性)。因此，在一些較佳實施例中，用於本揭露之向患者投予之AAV的AAV血清型係該些對於眼內之目標細胞具有天然趨性或高感染效率的血清型。在一實施例中，用於本揭露之AAV血清型係該些感染神經感覺性視網膜、視網膜色素上皮及/或脈絡膜之細胞的血清型。
在一些實施例中，天然衍生性血清型、單離株或分支AAV的AAV基因體包含至少一個反向末端重複序列(ITR)。ITR序列可順式作用以提供功能性複製起點且允許用於自細胞之基因體整合及切除載體。AAV基因體亦可包含包裝基因，諸如編碼包裝AAV粒子之功能的rep及/或cap基因。rep基因編碼蛋白質Rep78、Rep68、Rep52及Rep40或彼等之變體中一或多者。cap基因編碼殼體蛋白質諸如VP1、VP2及VP3或彼等之變體中一或多者。這些蛋白質可構成AAV粒子的殼體。殼體變體係如下討論。
在一些實施例中，啟動子可為可操作地連接各個包裝基因。此類啟動子之具體實例包括p5、p19及p40啟動子(Laughlin et al.(1979)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76：5567-5571)。例如，p5及p19啟動子可用於表現rep基因，而p40啟動子可用於表現cap基因。
在一些實施例中，用於本揭露之載體中的AAV基因體因此可為天然存在AAV之完整基因體。例如，包含完整AAV基因體之載體可用於體外製備AAV載體。在一些實施例中，此類載體原則上可向患者投予。在一些較佳實施例中，為達向患者投予之目的，AAV基因體將為衍生物。此類衍生係所屬技術領域中已知且本揭露涵蓋使用AAV基因體之任何已知衍生物及可藉由施用所屬技術領域中已知之技術來產製之衍生物。AAV基因體及AAV殼體之衍生係於Coura and Nardi(2007)Virology Journal 4：99及Choi et al. and Wu et al.(見上)中回顧。
AAV基因體之衍生物包括任何截短型或經修飾形式的AAV基因體，其允許轉殖基因自本揭露之載體在體內表現。在一些實施例中，有可能截短AAV基因體以包括最小病毒序列但仍保留上述功能。此可能導致AAV基因體的安全性，例如減少載體與野生型病毒重組的風險，且亦避免因病毒基因蛋白質存在目標細胞中而引發細胞性免疫反應。
AAV基因體之衍生物可包括至少一個反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，AAV基因體之衍生物可包括超過一個ITR，諸如二個ITR或更多。ITR中一或多者可衍生自具有不同血清型之AAV基因體或可為嵌合性或突變型ITR。例示性突變型ITR係具有trs(末端解鏈位點)刪除之ITR。此刪除允許基因體持續複製以產製含有編碼及互補序列的單股基因體，即自我互補型AAV基因體。此允許省略在目標細胞中的DNA複製，因此能夠加速轉殖基因表現。
包括一或多個ITR可能有助於本揭露之載體在宿主細胞之核中形成串聯體，例如在藉由宿主細胞DNA聚合酶之作用將單股載體DNA轉化成雙股DNA之後。此類附加型串聯體的形成在宿主細胞生命期間保護載體建構體，藉此允許延長轉殖基因在體內的表現。
在一些較佳實施例中，ITR元件將為衍生物中唯一自天然AAV基因體保留的序列。因此，衍生物可能不包括天然基因體之rep及/或cap基因及天然基因體之任何其他序列。此亦可能減少載體整合至宿主細胞基因體的可能性。此外，減少AAV基因體的大小允許增加在載體內併入除轉殖基因以外的其他序列元件(諸如調節元件)的彈性。
下列部分可自本揭露之衍生物移除：一個反向末端重複(ITR)序列、複製(rep)及殼體(cap)基因。然而，在一些實施例中，衍生物可額外包括AAV基因體之一或多個rep及/或cap基因或其他病毒序列。天然存在AAV以高頻率整合至人染色體19的特定位點，且顯示可忽略的隨機整合頻率，因此在載體中保留整合能力在治療場域中可能是可耐受的。
當衍生物包含殼體蛋白質(即VP1、VP2及/或VP3)時，衍生物可為一或多種天然存在AAV的嵌合性、替換性(shuffled)或殼體經修飾的衍生物。本揭露涵蓋在相同載體內提供來自不同血清型、分支、殖株或單離株AAV的殼體蛋白質序列(即假型載體)。
可選擇嵌合性、替換性或殼體經修飾的衍生物以提供一或多種病毒載體功能。例如，這些衍生物相較於包含天然存在AAV基因體(諸如AAV2之基因體)之AAV載體可顯示增加基因遞送效率、降低免疫原性(體液性或細胞性)、改變趨性範圍及/或改善對特定細胞類型之靶向。增加基因遞送效率可藉由下列致效：改善在細胞表面之受體或共受體的結合、改善內化作用、改善細胞內及至核中的移動、改善脫去病毒粒子外殼及改善單股基因體轉化成雙股形式。增加效率亦可關於改變趨性範圍或靶向特定細胞族群，以使載體劑量不因投予至不需要的組織而稀釋。
嵌合性殼體蛋白質包括該些藉由天然存在AAV血清型之二或更多個殼體編碼序列之間的重組所產製者。此可藉由例如標誌救援方案執行，其中一個血清型的非感染性殼體序列係與不同血清型之殼體序列共轉染，並使用引導式選擇以選擇具有所欲性質的殼體序列。不同血清型之殼體序列可藉由在細胞內同源重組改變以產生新穎的嵌合性殼體蛋白質。
本揭露之嵌合性殼體蛋白質亦包括該些藉由工程改造殼體蛋白質序列以在二或更多個殼體蛋白質之間例如在二或更多個不同血清型之殼體蛋白質之間轉移特定殼體蛋白質結構域、表面環或特定胺基酸殘基所產製者。
替換性或嵌合性殼體蛋白質亦可藉由DNA洗牌或易錯PCR產製。雜交AAV殼體基因可藉由隨機碎斷相關AAV基因之序列(例如該些編碼多個不同血清型之殼體蛋白質之序列)，接著後續在自引子聚合酶反應中再組裝片段來產生，此亦可能造成序列同源區交叉。可篩選以此方式藉由將數種血清型之殼體基因洗牌所產生之雜交AAV基因庫以識別具有所欲功能性之病毒殖株。類似地，可使用易錯PCR以隨機突變AAV殼體基因以產生多樣變體庫，其接著可進行所欲性質之選擇。
殼體基因之序列亦可經基因修飾以導入關於天然野生型序列之特定刪除、取代或插入。例如，殼體基因可藉由在殼體編碼序列之開放閱讀框內或在殼體編碼序列之N端及/或C端插入非相關蛋白質或肽之序列來修飾。
非相關蛋白質或肽可為作為特定細胞類型之配體的蛋白質或肽，藉此授予改善的與目標細胞之結合或改善載體對特定細胞族群之靶向特異性。非相關蛋白質亦可為協助病毒粒子在作為產生過程之一部分的純化之蛋白質，即表位或親和性標籤。可選擇插入位點，以使病毒粒子的其他功能例如內化作用、病毒粒子移動不受干擾。技藝人士可基於他們的普通知識識別合適的插入位點。特定位點係揭示於Choi et al.(見上)。
本揭露額外涵蓋提供不同於天然AAV基因體之順序及組態的AAV基因體之序列。本揭露亦涵蓋用來自另一病毒之序列或用來自超過一種病毒之序列所構成之嵌合基因置換一或多個AAV序列或基因。此類嵌合基因可由來自不同病毒種之二或更多種相關病毒蛋白質之序列構成。
本揭露之AAV載體包括轉殼體形式，其中具有一種血清型之ITR的AAV基因體或衍生物係包裝於不同血清型之殼體中。本揭露之AAV載體亦包括鑲嵌形式，其中來自二或更多種不同血清型之未經修飾的殼體蛋白質之混合物構成病毒殼體。AAV載體亦可包括帶有吸附至殼體表面之配體的經化學修飾的形式。例如，此類配體可包括靶向特定細胞表面受體之抗體。
因此，舉例來說，本揭露之AAV載體可包括該些具有AAV2基因體及AAV2殼體蛋白質(AAV2/2)、該些具有AAV2基因體及AAV5殼體蛋白質(AAV2/5)及該些具有AAV2基因體及AAV8殼體蛋白質(AAV2/8)之AAV載體。
本揭露之AAV載體可包含突變AAV殼體蛋白質。在一實施例中，本揭露之AAV載體包含突變型AAV8殼體蛋白質。在一些實施例中，突變型AAV8殼體蛋白質係AAV8 Y733F殼體蛋白質。在一些實施例中，AAV8 Y733F突變型殼體蛋白質包含與SEQ ID NO：12具有至少95%同一性之胺基酸序列，且以苯丙胺酸取代SEQ ID NO：12位置733之酪胺酸。在一些實施例中，AAV8 Y733F突變型殼體蛋白質包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列，且以苯丙胺酸取代SEQ ID NO：12位置733之酪胺酸。 投予方法
本揭露之病毒載體可藉由視網膜下、直接視網膜、脈絡膜上或玻璃體內注射向個體之眼睛投予。
技藝人士熟悉且能夠執行個體視網膜下、直接視網膜、脈絡膜上或玻璃體內注射。視網膜下注射
視網膜下注射係注射至視網膜下空間，即在神經感覺性視網膜之下。在視網膜下注射期間，注射材料係經引導至感光受體細胞層與視網膜色素上皮(RPE)層之間並在兩層之間產生空間。
當注射透過小視網膜造孔術進行時，可產生視網膜剝離。藉由注射材料所產製之剝離、抬起的視網膜層稱為「泡(bleb)」。
藉由視網膜下注射產生的孔洞可夠小，使得注射溶液在投予後不顯著回流至玻璃體腔。當注射藥劑時此類回流會造成問題，因為藥劑的效應會被引導離開目標區。較佳地，注射在神經感覺性視網膜產生自黏性進入點，即一旦注射針頭移除後，藉由針頭產生的孔洞重新密合，使得非常少或實質上無注射材料透過該孔洞釋放。
為了促進此過程，專科視網膜下注射針頭可自商業途徑獲得(例如DORC 41G鐵氟龍視網膜下注射針頭，Dutch Ophthalmic Research Center International BV, Zuidland, The Netherlands)。這些是設計用於進行視網膜下注射之針頭。
在一些實施例中，視網膜下注射包含以Hamilton注射器及34號規針頭(ESS labs, UK)經由後極至上方視網膜的鞏膜隧道方案。選擇性地或另外地，視網膜下注射可包含在使用WPI注射器及斜面35G針頭系統(World Precision Instruments, UK)進行視網膜下注射之前，以33G針頭執行前室腔液穿刺術。
動物個體可藉由例如含有氯胺酮(80mg/kg)及甲苯噻嗪(10mg/kg)之腹膜內注射麻醉且用托吡卡胺眼藥水(Mydriaticum 1%, Bausch & Lomb, Uk)及去羥腎上腺素眼藥水(去羥腎上腺素鹽酸鹽2.5%，Bausch & Lomb, UK)完全擴張瞳孔。丙氧間卡因眼藥水(丙氧間卡因鹽酸鹽0.5%，Bausch & Lomb, UK)亦可在視網膜下注射之前施用。注射後，可施用氯黴素眼藥水(氯黴素0.5%，Bausch & Lomb, Uk)，用阿替美唑(2mg/kg)逆轉麻醉及施用卡波姆凝膠(Viscotears, Novartis, UK)以預防白內障形成。
除非在注射期間發生視網膜傷害，只要使用夠小的針頭，注射材料維持侷限在介於經剝離的神經感覺性視網膜與RPE之間局部視網膜剝離之處(即不回流至玻璃體腔)。事實上，泡在短時段內持續存在指示注射材料可能有少量溢漏至玻璃體。當注射材料吸收後，泡可在較長時段內消失。
眼睛例如視網膜的觀測可在手術前使用例如光學同調斷層掃描進行。二步驟視網膜下注射
在一些實施例中，本揭露之AAV載體可藉由使用二步驟方法正確及安全地遞送，其中局部視網膜剝離係藉由視網膜下注射第一溶液產生。第一溶液不包含載體。接著使用第二視網膜下注射以遞送包含載體之藥劑至藉由第一視網膜下注射所產生之泡的視網膜下液體中。由於遞送藥劑之注射不是用來剝離視網膜，因此在此第二步驟中可注射特定溶液體積。
本揭露之AAV載體可藉由下列遞送： (a)以至少部分剝離視網膜之有效量藉由視網膜下注射投予溶液至個體以形成視網膜下泡，其中該溶液不包含載體；及 (b)藉由視網膜下注射投予藥劑組成物至步驟(a)所形成之泡中，其中該藥劑包含載體。
步驟(a)中為了至少部分剝離視網膜所注射之溶液體積可為例如約10至1000 µL，例如約50至1000、100至1000、250至1000、500至1000、10至500、50至500、100至500、250至500 µL。體積可為例如約10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000 µL。
步驟(b)中注射之藥劑組成物體積可為例如約10至500 µL，例如約50至500、100至500、200至500、300至500、400至500、50至250、100至250、200至250或50至150 µL。體積可為例如約10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500 µL。在一些較佳實施例中，步驟(b)中注射之藥劑組成物體積係100 µL。較大體積可增加拉伸視網膜之風險，但較小體積可能難以看見。
不包含藥劑之溶液(即步驟(a)之「第一溶液」)可如下述類似於包含藥劑之溶液調配。不包含藥劑之例示性溶液係平衡鹽水溶液(BSS)、TMN 200或pH及滲透壓匹配視網膜下空間的類似緩衝劑溶液。在手術期間觀測視網膜
在一些實施例中，例如在末期視網膜退化期間，視網膜難以識別因為其很薄、透明且坐落在中斷及重度色素上皮上因此難以被看見。使用藍色生體染料(例如Brilliant Peel® , Geuder；MembraneBlue-Dual® , Dorc)可促進識別由視網膜剝離程序(即本揭露之二步驟視網膜下注射方法中的步驟(a))所製造的視網膜孔洞，使得藥劑可透過相同孔洞投予，不引起回流至玻璃體腔的風險。
使用藍色生體染料亦可識別任何有增厚內限膜或視網膜前膜的視網膜區域，因為經過這些結構注射會阻擾乾淨進入視網膜下空間。另外，這些結構在立即術後期收縮可導致拉伸視網膜進入孔洞，可導致藥劑回流至玻璃體腔。脈絡膜上注射
本揭露之載體或組成物可經由脈絡膜上注射投予。任何脈絡膜上注射手段被設想為本揭露之載體或組成物的潛在遞送系統。脈絡膜上注射係注射至脈絡膜上空間，其係介於脈絡膜與鞏膜之間的空間。注射至脈絡膜上空間因此係遞送組成物至靠近眼結構諸如視網膜、視網膜色素上皮(RPE)或黃斑部的潛在投予途徑。在一些實施例中，注射至脈絡膜上空間係使用微針頭、微鈍針或微導管在眼前方部分進行。眼前方部分可包含下列或由下列組成：眼赤道之前的區域。載體組成物或AAV病毒粒子可自注射部位經由脈絡膜上途徑向後擴散。在一些實施例中，眼後方的脈絡膜上空間係使用導管系統直接注射。在此實施例中，脈絡膜上空間可經由平坦部中的切口插入導管。在一些實施例中，經由脈絡膜上途徑之注射或輸注穿過脈絡膜、Bruch氏膜及/或RPE層以遞送本揭露之載體或組成物至視網膜下空間。在一些實施例中，包括該些其中本揭露之載體或組成物係經由脈絡膜上途徑遞送至視網膜下空間的實施例，一或多個注射係注射至鞏膜、平坦部、脈絡膜、Bruch氏膜及RPE層中至少一者。在一些實施例中，包括該些其中本揭露之載體或組成物係脈絡膜上途徑遞送至視網膜下空間的實施例，二步驟程序係用於在遞送本揭露之載體或組成物之前在脈絡膜上或視網膜下空間產生泡。 醫藥組成物及注射溶液
本揭露之AAV載體及AAV載體系統可調配成醫藥組成物。除了藥劑以外，這些組成物可包含醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、緩衝劑、穩定劑或其他該領域所廣為週知之材料。此類材料應為無毒，且應不干擾活性成分之療效。載劑或其他材料之精確特性可由技藝人士根據投予途徑例如視網膜下、直接視網膜、脈絡膜上或玻璃體內注射判定。
醫藥組成物可呈液體形式。液體醫藥組成物包括液體載劑諸如水、石油、動物油、蔬菜油、礦物油或合成油。可包括生理鹽水溶液、氯化鎂、葡萄糖或其他糖溶液或甘醇諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
以注射至罹病部位而言，活性成分可呈水性溶液之形式，該水性溶液係不含致熱原且具有適當之pH、等張性及穩定性。技藝人士能夠使用例如等張媒劑諸如氯化鈉注射液、Ringer氏注射液或乳酸Ringer氏注射液或TMN 200製備合適溶液。可視需要包括保存劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。
緩衝劑對於本揭露之病毒載體及載體粒子在儲存及通過AAV基因療法之注射裝置之後的穩定性及生物相容性可具有效應。在一些實施例中，本揭露之病毒載體及載體粒子可用TMN 200緩衝劑稀釋以維持生物相容性及穩定性。TMN 200緩衝劑包含20 mM Tris(pH調整至8.0)、1 mM MgCl2 及200 mM NaCl且pH為8。
判定物理病毒基因體力價包含部分的病毒載體或病毒粒子表徵。在一些實施例中，判定物理病毒基因體力價包含確保病毒載體及病毒粒子在基因療法期間之效力及安全性的步驟。在一些實施例中，判定AAV力價之方法包含定量PCR(qPCR)。有不同變數可影響結果，諸如用來作為標準品之DNA的構形或在樣本製備期間的酶催化性消化。待測量之病毒載體或粒子製劑的力價可與使用質體產製之標準稀釋曲線比較。在一些實施例中，在標準曲線中使用的質體DNA係呈超螺旋構形。在一些實施例中，在標準曲線中使用的質體DNA係呈線性構形。線性化質體可藉由例如以Hind III限制酶消化、以洋菜糖凝膠電泳觀測且使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen)依照廠商說明純化製備。其他在用於產製標準曲線之質體內切割的限制酶亦可為適當。在一些實施例中，相較於使用線性化質體，使用超螺旋質體作為標準品增加AAV載體的力價。
為了自經純化的AAV載體萃取DNA以定量AAV基因體力價，可使用二種酶催化性方法。在一些實施例中，AAV載體可用DNA酶I單獨消化。在一些實施例中，AAV載體可用DNA酶I及額外蛋白酶K處理雙重消化。接著可使用對轉殖基因序列具特異性之引子及Taqman探針，以CFX Connect即時PCR偵測系統(BioRad)執行QPCR。
為達延緩釋放，藥劑可包括於經調配用於緩釋之醫藥組成物中，諸如根據所屬技術領域中已知之方法自生物可相容聚合物形成之微膠囊中或脂質體載劑系統中。 治療方法
應理解的是在本文中所有指涉之治療包括治癒性、姑息性及預防性治療；雖然在本揭露之情境中指涉預防係與預防性治療相關。治療亦可包括停止疾病嚴重性的進展。
設想所有哺乳動物包括人的治療。然而，人治療及獸醫治療皆在本揭露之範疇內。 變體、衍生物、類似物、同源物及片段
除了在本文中提及之蛋白質及核苷酸之外，本揭露亦涵蓋變體、衍生物、類似物、同源物及彼等之片段的使用。在本揭露之情境中，任何給定序列之變體係其中殘基(不論是胺基酸殘基或是核酸殘基)的特定序列經修飾以使該問題多肽或多核苷酸實質上保留其功能之序列。變體序列可藉由例如添加、刪除、取代、修飾、置換及/或變化存在於天然存在蛋白質中至少一個殘基獲得。
如本文中所使用之關於本揭露之蛋白質或多肽的用語「衍生物」包括序列之一個(或多個)胺基酸殘基的任何取代、變化、修飾、置換、刪除及/或添加，只要所得之蛋白質或多肽實質上保留至少一個其內源性功能。
如本文中所使用之關於多肽或多核苷酸的用語「類似物」包括任何擬似物，即具有其所擬似之多肽或多核苷酸的至少一個內源性功能之化學化合物。
可進行胺基酸取代例如自1、2或3個至10、20或更多個取代，只要該經修飾的序列實質上保留必要活性或能力。胺基酸取代可包括使用非天然存在之類似物。本揭露所使用之蛋白質亦可具有胺基酸殘基的刪除、插入或取代，其產生靜默變更且導致功能性等效蛋白質。
只要保留內源性功能，計畫性胺基酸取代可根據殘基在極性、帶電性、可溶性、疏水性、親水性及/或兩親性上之類似性加以進行。舉例來說，帶負電之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸；帶正電之胺基酸包括離胺酸及精胺酸；且具有類似親水性數值之不帶電極性頭部基團之胺基酸包括天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸。
可根據例如下表進行保守性取代。第二欄中同一格之胺基酸可彼此取代，且較佳地第三欄中同一行之胺基酸可彼此取代：
Figure 02_image029
如本文中所使用之用語「同源物」是指與野生型胺基酸序列及野生型核苷酸序列具有某些同源性之實體。用語「同源性」可等同於「同一性」。
同源序列可包括與個體序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性之胺基酸序列，較佳地具有至少95%或97%或99%同一性。例如，同源物將包含與個體胺基酸序列相同之活性位點等。雖然同源性亦可就類似性方面考慮(即具有類似化學性質/功能之胺基酸殘基)，在本揭露之情境中同源性亦可就序列同一性方面表示。
同源序列可包括與個體序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性之核苷酸序列，較佳地具有至少95%或97%或99%同一性。雖然同源性亦可就類似性方面考慮，在本揭露之情境中同源性亦可就序列同一性方面表示。
指涉一序列與在本文中詳述之SEQ ID NO中任一者具有百分比同一性係指該序列與所指涉之SEQ ID NO的全長具有所述百分比同一性。
同源性比較可用眼或以輕易可得之序列比較程式協助進行。這些自商業途徑獲得之電腦程式可計算二或更多個序列之間的百分比同源性或同一性。
可計算毗連序列之百分比同源性，即將一序列對齊另一序列且將一序列中之各胺基酸與另一序列中的對應胺基酸直接比較，一次比對一個殘基。這稱為「無缺口(ungapped)」排比。此類無缺口排比僅可在相對較少數量之殘基執行。
雖然這是一個非常簡單且一致的方法，但其無法考慮到例如，在一原本相同的序列對，核苷酸序列中之一個插入或刪除可造成其後之密碼子比對失敗(out of alignment)，因此當執行整體排比時可能導致百分比同源性大幅減少。因此，大部分序列比較方法係設計用來產生考慮到可能的插入及刪除而不會不當地對整體同源性分數進行罰分的最佳排比。此係藉由在序列排比中插入「缺口」達成，以試著最大化局部同源性。
然而，這些較複雜的方法分配「缺口罰分」給各個發生在排比中的缺口，因此對於相同數量的相同胺基酸而言，具有盡可能少缺口之序列排比反映出二個比較序列之間的較高相關性，因而將會比具有許多缺口的序列排比達成較高分數。可使用「仿射(affine)缺口成本」，其對缺口的存在收取相對高成本且對缺口中各後續殘基採取較小罰分。這是最常使用的缺口得分系統。高缺口罰分當然會產生具有較少缺口的最佳化排比。大部分排比程式允許修改缺口罰分。然而，當使用此類軟體進行序列比較時，最好使用預設值。例如當使用GCG Wisconsin Bestfit套裝軟體時，胺基酸序列的預設缺口罰分係一缺口-12及各延長-4。
因此計算最大百分比同源性首先包含產生考慮到缺口罰分的最佳排比。適合執行此類排比之電腦程式係GCG Wisconsin Bestfit套裝軟體(University of Wisconsin, U.S.A.；Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Res. 12：387)。其他可執行序列比較之軟體實例包括但不限於BLAST套裝軟體(見Ausubel et al.(1999)ibid-Ch. 18)、FASTA(Atschul et al.(1990)J. Mol. Biol. 403-410)及GENEWORKS套裝比較工具。BLAST及FASTA皆可進行離線及線上搜尋(見Ausubel et al.(1999)ibid, pages 7-58 to 7-60)。然而，對一些應用而言，可使用GCG Bestfit程式。另一稱為BLAST 2 Sequences之工具亦可用於比較蛋白質及核苷酸序列(見FEMS Microbiol.Lett.(1999)174：247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177：187-8)。雖然最終百分比同源性可就同一性方面測量，排比過程本身可不基於全有全無成對比較。相反地，可使用按比例計算(scaled)之類似性得分矩陣，其基於化學類似性或演化距離分配分數給各成對比較。此類矩陣之實例係BLOSUM62矩陣，其係BLAST套裝程式之預設矩陣。GCG Wisconsin程式可使用公共預設值或若有供應之客制化符號比較表(詳細資訊請見使用者手冊)。一些應用使用GCG套裝軟體的公共預設值，或其他軟體的預設矩陣諸如BLOSUM62。
一旦軟體產生最佳排比，就可能計算出百分比同源性，較佳地序列同一性百分比。軟體可將此當作序列比較的一部分進行並產製數值結果。
「片段」也是變體且該用語可指多肽或多核苷酸在功能上或例如在測定中受到關注之一選定區域。「片段」因此係指胺基酸核酸序列，其係全長多肽或多核苷酸的一部分。
此類變體可使用標準重組DNA技術製備，諸如定點突變。若要進行插入，可製作編碼該插入與對應插入位點任一側之天然存在序列的5'及3'側接區之合成DNA。側接區將含有對應天然存在序列中之位點的方便限制位點，使得序列可利用適當酶切割且該合成的DNA與該切割物接合。接著根據本揭露表現DNA以製備經編碼的蛋白質。這些方法僅為所屬技術領域中已知用於操縱DNA序列的許多標準技術之說明示範，亦可使用其他已知技術。 密碼子最佳化
本揭露涵蓋本文所述之核酸序列的密碼子最佳化變體。
密碼子最佳化利用基因密碼的多餘性，使核苷酸序列能夠被改變，但同時維持編碼蛋白質的相同胺基酸序列。
可進行密碼子最佳化以促進編碼蛋白質表現增加或降低。此可藉由訂製適合特定細胞類型之核苷酸序列的密碼子使用致效，因此利用對應該細胞類型中特定tRNA的相對豐度偏差之細胞性密碼子偏差。藉由改變核苷酸序列中之密碼子以使該密碼子係經訂製以符合對應tRNA之相對豐度，可能增加表現。相反地，藉由選擇所對應之tRNA已知在特定細胞類型中係罕見之密碼子，有可能降低該密碼子的表現。核酸序列密碼子最佳化之方法係所屬技術領域中已知且將為技藝人士所熟知。 近黑暗敏捷性迷宮
本揭露之個體的基線或改善視力可藉由使該個體通過特徵為光線低或黑暗條件且包括一或多個該個體應避開的障礙物之封閉區來測量。該個體可能需要可選地藉由本揭露之治療方法提供之本揭露之組成物。個體可接受本揭露之組成物，可選地藉由本揭露之治療方法以一或多個劑量及/或程序/注射提供於一眼或雙眼。封閉區可在室內或室外。封閉區之特徵為光線水準受到控制，從概括日光的水準到模擬完全黑暗的水準不等。在此範圍內，封閉區之受到控制的光線水準可較佳地設定為概括為天然黃昏或傍晚的光線水準，在此光線水準下，本揭露之個體在接受本揭露之組成物之前可具有降低視力。在投予本揭露之組成物之後，個體在所有光線水準下可具有改善視力，但改善較佳地係在降低光線水準下測量，包括該些概括天然黃昏或傍晚的光線水準(室內或室外)。
在封閉區之一些實施例中，一或多個障礙物係以一或多個指定途徑及/或路線安排在封閉區內。個體成功通過封閉區可包括穿過指定途徑及避免穿過非指定途徑。個體成功通過封閉區可包括穿過任何途徑，包括指定途徑，同時避免接觸位於途徑內或靠近途徑的一或多個障礙物個體成功或改善通過封閉區可包括以降低之從指定開始位置穿過途徑到指定結束位置所需的時間(例如相較於具有正常視力的健康個體或相較於個體先前之穿過)穿過任何途徑，包括指定途徑，同時避免接觸位於途徑內或靠近途徑的一或多個障礙物在一些實施例中，封閉區可包含至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個途徑或指定途徑。指定途徑與非指定途徑的差異可藉由實驗者識別指定途徑為含有預期開始位置及預期結束位置。
在封閉區之一些實施例中，一或多個障礙物不固定在本揭露之表面。在一些實施例中，一或多個障礙物固定在本揭露之表面。在一些實施例中，一或多個障礙物固定在封閉區之內部表面，包括但不限於封閉區的地板、牆壁及天花板。在一些實施例中，一或多個障礙物包含固體物件。在一些實施例中，一或多個障礙物包含液體物件(例如「水災」)。在一些實施例中，一或多個障礙物包含沿著至少一個途徑或靠近途徑呈任何組合或序列之待個體繞過的物件；待個體踩踏之物件；藉由走過或站上而待平衡之物件；具有上坡、下坡或彼等之組合之物件；待碰觸之物件(例如，以判定個體看見及/或判斷深度知覺的能力)；及藉由走過或站在其下以穿過之物件(例如包括彎曲一或多個方向以避免該物件)。在封閉區之一些實施例中，個體必須以指定順序遭遇一或多個障礙物。
在某些實施例中，個體的基線或改善視力可藉由使該個體通過特徵為光線低或黑暗條件且包括一或多個該個體應避開的障礙物之路線或封閉區來測量，其中該路線或封閉區存在於設施中。在具體實施例中，該設施包括模組化光照系統及一系列不同移動路線的地板配置。在某些實施例中，一個房間配備有所有移動路線及一組光照設備。例如，在移動測試期間一次可設定單一路線，且相同房間/光照設備可用於與使用中的路線(地板配置)無關之移動測試。在具體實施例中，提供用於測試之不同的移動路線係設計為不同難度，較難路線之特色為低對比途徑及難以看見障礙物，而較簡單路線之特色為高對比途徑及容易看見障礙物。
在封閉區之一些實施例中，個體可在投予本揭露之組成物之前測試以例如建立正確性及/或速度的基線測量或診斷個體為患有視網膜疾病或具有發展視網膜疾病之風險在一些實施例中，個體可在投予本揭露之組成物之後測試以判定相較於基線測量之變更或與健康個體的分數比較(例如用於監測/測試組成物改善視力之療效)。 適應性光學雷射掃描眼底鏡 (AOSLO)
本揭露之個體的視網膜細胞存活性基線或改善測量可藉由一或多種AOSLO技術測量。雷射掃描眼底鏡(SLO)可用於觀看個體眼睛之一層清楚的視網膜。較佳地，將適應性光學(AO)併入SLO(AOSLO)以矯正單獨SLO中一般由前眼結構造成之人為產物影像，該前眼結構包括但不限於角膜及眼睛水晶體。單獨使用SLO產生之人為產物降低所得影像之解析度。適應性光學允許視網膜層之單細胞解析度並偵測來自正常或完整視網膜細胞(例如正常或完整感光受體細胞)之方向性背向散射光線(波導光)。
在本揭露之使用AOSLO技術之一些實施例中，完整細胞產生波導及/或可偵測信號。在一些實施例中，非完整細胞不產生波導及/或可偵測信號。
AOSLO可用於造影及較佳地評估個體之視網膜或其部分。在一些實施例中，個體的一或兩個視網膜皆使用AOSLO技術造影。在一些實施例中，個體的一或兩個視網膜皆在投予本揭露之組成物之前使用AOSLO技術造影(例如判定基線測量以在治療之後進行後續比較及/或判定視網膜疾病之存在及/或嚴重性)。在一些實施例中，個體的一或兩個視網膜皆在投予本揭露之組成物之後使用AOSLO技術造影(例如判定組成物的療效及/或監測個體在投予後因治療所導致的改善)。
在本揭露之一些實施例中，視網膜係藉由共焦或非共焦(分離式偵測器)AOSLO造影以評估一或多種視網膜細胞的密度。在一些實施例中，一或多種視網膜細胞包括但不限於感光受體細胞。在一些實施例中，一或多種視網膜細胞包括但不限於錐狀感光受體細胞。在一些實施例中，一或多種視網膜細胞包括但不限於桿狀感光受體細胞。在一些實施例中，密度係測量為每毫米的細胞數量。在一些實施例中，密度係測量為每毫米的活細胞或存活細胞數量。在一些實施例中，密度係測量為每毫米的完整細胞數量(包含本揭露之AAV粒子或轉殖基因序列之細胞)。在一些實施例中，密度係測量為每毫米的反應性細胞數量。在一些實施例中，反應性細胞係功能性細胞。
在一些實施例中，AOSLO可用於捕捉在個體之視網膜內的感光受體細胞鑲嵌影像。在一些實施例中，鑲嵌包括完整細胞、非完整細胞或彼等之組合。在一些實施例中，鑲嵌包含代表完整視網膜、內節、外節或彼等之部分的複合或蒙太奇影像。在一些實施例中，鑲嵌影像包含一部分包含或接觸本揭露之組成物的視網膜。在一些實施例中，鑲嵌影像包含與一部分包含或接觸本揭露之組成物的視網膜鄰接之一部分的視網膜。在一些實施例中，鑲嵌影像包含治療區及未治療區，其中治療區包含或接觸本揭露之組成物且未治療區不包含或不接觸本揭露之組成物。
在一些實施例中，AOSLO可單獨使用或與光學同調斷層掃描(OCT)組合使用以直接觀測個體的視網膜、視網膜之部分或視網膜細胞。在一些實施例中，適應性光學可與OCT組合使用(AO-OCT)以直接觀測個體的視網膜、視網膜之部分或視網膜細胞。
在本揭露之一些實施例中，外節或內節係藉由共焦或非共焦(分離式偵測器)AOSLO造影以評估其中的細胞密度或外節、內節或彼等之組合的完整性程度。在一些實施例中，AOSLO可用於偵測內節、外節或彼等之組合的直徑。
例示性AOSLO系統顯示於圖57。
AOSLO及各種技術的額外說明可至少描述於Georgiou et al.Br J Opthalmol 2017；0：1-8；Scoles et al.Invest Opthalmol Vis Sci . 2014；55：4244-4251及Tanna et al.Invest Opthalmol Vis Sci . 2017；58：3608-3615。序列
SEQ ID NO：1
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Figure 02_image033
Figure 02_image035
SEQ ID NO：2
Figure 02_image037
Figure 02_image039
Figure 02_image041
SEQ ID NO：3
Figure 02_image043
Figure 02_image045
Figure 02_image047
SEQ ID NO：4
Figure 02_image049
Figure 02_image051
SEQ ID NO：5
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SEQ ID NO：6
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SEQ ID NO：7
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SEQ ID NO：8
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SEQ ID NO：9
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Figure 02_image063
SEQ ID NO：10
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SEQ ID NO：11
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SEQ ID NO：12
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SEQ ID NO：13
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SEQ ID NO：14
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SEQ ID NO：15
Figure 02_image081
SEQ ID NO：16
Figure 02_image083
SEQ ID NO：24
Figure 02_image085
SEQ ID NO：25
Figure 02_image087
SEQ ID NO：40
Figure 02_image089
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Figure 02_image093
Figure 02_image095
SEQ ID NO：46
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Figure 02_image099
Figure 02_image101
Figure 02_image103
SEQ ID NO：53
Figure 02_image105
Figure 02_image107
Figure 02_image109
Figure 02_image111
SEQ ID NO：59
Figure 02_image113
Figure 02_image115
Figure 02_image117
Figure 02_image119
SEQ ID NO：65
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SEQ ID NO：70
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實例 實例 1 ：製備上游及下游 AAV 載體
產製包含三個質體之給定AAV載體：pTransgene、pRepCap及pHelper。pTransgene含有如下詳述之上游或下游ABCA4轉殖基因(證實ITR完整性)。pRepCap含有AAV基因體之rep 及cap 基因。rep 基因係來自AAV2基因體，然而cap 基因取決於血清型需求而異。pHelper含有成功AAV產製所需之必要腺病毒基因。將質體與聚乙烯亞胺(PEI)複合得到三重轉染混合物，將該三重轉染混合物施加至HEK293T細胞，並使用標準PEI規程轉染HEK293T細胞以遞送必要質體：pRepCap、pHelper(pDeltaAdF6)pTransgene。HEK293T細胞係生長於HYPERFlasks(SLS, UK)中，並使用標準PEI規程轉染以遞送總共500µg之必要質體：pRepCap、pHelper (pDeltaAdF6)及pTransgene轉染後三天收集細胞，將細胞溶解，並藉由碘克沙醇梯度超離心單離AAV族群，隨後在Amicon Ultra-15 100K過濾器單位(MerckMillipore, UK)中純化。轉染後三天，收集並溶解細胞。溶解物用Benzonase處理並在施用至包含15%、25%、40%及60%相的碘克沙醇梯度之前澄清。將梯度以59,000rpm離心1小時30分鐘，接著抽取40%流份。此AAV相接著使用Amicon Ultra-15 100K過濾器單位純化及濃縮。在此步驟之後，獲得100至200μl在PBS中之經純化的AAV。最終製劑收集於PBS中。使用SDS-PAGE分析證實各製劑之良好純化，並使用靶向ABCA4編碼序列上游 (FW 5'GCACCTTGGCCGTATTTGGACAG, REV 5'TGAGTCAGACAGGCCGATGT)或下游 (FW 5'TGGCGCAGATCGTGCT, REV 5'ACAGAAGGAGTCTTCCA) 部分之引子判定qPCR力價。引子組經證實具有95至105%效率。實例 2 - 例示性 AAV 載體之結構及選殖
腺相關病毒(AAV)係目前用於視網膜基因療法之首選載體，因為其具有擴散通過視網膜結構內之各種細胞層的能力、低免疫原性、對感光受體細胞之優異趨性及在多種臨床前模型中獲得廣泛的概念驗證。人臨床試驗已顯示AAV載體在視網膜的安全性及療效，且在過去十年已報告多種病況之基因療法試驗，目前有更多正在進行中。對於一些病症諸如斯特格氏症而言，治療性基因太大而無法裝入可包裝在單一AAV殼體中之轉殖基因之內。因此這些病症的基因療法替代係非常有趣的挑戰。有鑑於AAV之限制包裝容量，其治療「大型基因」疾病的潛力起初似乎受限，但最近的研究指示使用二或更多個AAV粒子遞送超過3.5kb大小之基因的AAV基因療法有明確的可能性。
存在不同的AAV雙載體系統：1.片段化AAV(fAAV)；2.分子間剪接(trans -splicing)雙載體；3.重疊雙載體；及4.雜交雙載體。然而，fAAV及分子間剪接方法的不可預測性可能升高主管機關的疑慮。原始的雙載體方案使用片段化轉殖基因，現已因為關於隨機截短及重組的疑慮而不受青睞。替代的雜交及重疊雙載體系統依賴二個轉殖基因之間的同源重疊區。重疊方案是這些策略當中探討最少者，但其為最簡單的雙載體設計。依賴二個轉殖基因之間的同源重疊區之雙載體策略可精準預測及複製。
雜交及重疊雙載體系統皆依賴二個轉殖基因之間的同源重疊區。已顯示重疊區可影響轉殖基因重整的成功。先前研究建議重疊方案的成功依賴同源重組(HR)，其中有涉及DNA修復機制的不同形式，且透過這些子途徑其中之一，可重組二個(在正股及負股上的)重疊雙載體轉殖基因。這些分子機制的有效性可為組織依賴性。以斯特格氏症而言，目標細胞係終末分化的感光受體，且在小鼠桿狀感光受體細胞中，非同源性末端接合(NHEJ)及同源重組(HR)皆為活性機制。如果不斷發生較大轉殖基因的正確重整，則為涉及同源重組(HR)途徑的指標。透過系統性載體設計變化評估不同重疊區、編碼序列的密碼子最佳化及包括非轉譯基因元件(圖30)，我們達成我們的目標蛋白質之治療性水準並減少截短型蛋白質形式的產生，解決雙載體策略中的已知問題。重疊雙載體系統的系統性設計變化達成目標蛋白質ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4(ABCA4)的治療性水準並減少截短型蛋白質形式的產生，解決雙載體策略中的已知不良反應。
在正常的重組AAV場景中，雙股轉殖基因係藉由招募對應正及負單股DNA(ssDNA)轉殖基因形式的單股黏合(SSA)或藉由第二股合成形成。二個重疊轉殖基因之間的重組機制因此可藉由相對轉殖基因互補區域的SSA發生(圖2)。所得結構將模擬需要HR DNA修復RAD51非依賴性機制的狀況，雖然RAD50依賴性機制理論上也有可能，如fAAV方案所涉及者。
本揭露提供藉由探索例如當利用雙重疊載體遞送時不同的重疊區長度來增加ABCA4蛋白質水準之組成物及方法。此外，本揭露的目的在於透過使用密碼子最佳化編碼序列及包括非轉譯區(UTR)增加成功重組轉殖基因的表現。密碼子最佳化可增加給定編碼序列的轉譯速率且最近的臨床前研究指示其在基因療法轉殖基因的潛在優點。5'UTR結構(特別是介於啟動子與編碼序列之間的可剪接內含子)可增強轉殖基因的表現。剪接mRNA相較於非透過剪接產製之相同mRNA可具有增強的轉譯效率，且先前在轉殖基因之5'UTR中添加兔β-球蛋白(RBG)基因的內含子2導致蛋白質表現增加500倍。包括含有可剪接內含子/外顯子元件之5'UTR與3'UTR土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)之組合的結果係經評估。WPRE先前在臨床前研究中顯示增加轉錄物穩定性及增強轉殖基因表現。
有各種元件可增強重疊雙載體系統成功用於治療斯特格氏症。ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4(ABCA4)之突變防止類視色素自感光受體細胞盤外膜運輸至視網膜色素上皮(RPE)，導致非所欲之類視色素衍生物累積在感光受體外節中。由於感光受體外節持續產製，當老舊盤變得終末時，它們會被RPE吞噬。在攜帶突變、非功能性ABCA4之感光受體細胞中，保留在盤膜中之雙類視色素在RPE細胞中累積，發生進一步生化過程導致形成毒性化合物A2E(脂褐質之關鍵元件)。此累積之結果可為RPE細胞死亡及依賴RPE細胞生存之感光受體細胞的後續退化及死亡。先前已在色素化Abca4 -/- 小鼠模型中表徵眼底變化，且氘化維生素A對於眼底螢光及雙類視色素累積具有正面效應。因此此小鼠係評估對人病況而言重要治療效應的適當模型。遞送功能性ABCA4至Abca4 -/- 小鼠感光受體外節至將減少雙類視色素/A2E/脂褐質累積之療效水準，可在斯特格氏症患者中預防RPE細胞死亡及RPE細胞所支持之感光受體細胞退化。
以下描述重疊雙AAV載體系統之實施例，其利用目標細胞之內源性DNA修復途徑以重構用於基因療法之功能性、大型ABCA4轉殖基因。
ABCA4 編碼序列NM_000350係用來作為WT形式，例外為下列不影響胺基酸序列的核苷酸變更：1,536 G＞T；5,175 G＞A；6,069 T＞C(根據ABCA4編碼序列SEQ ID NO：11在本文中編號)。此ABCA4 編碼序列的密碼子最佳化係藉由GenScript(Piscataway, NJ, US)執行及產製。將WT及COABCA4 全長編碼序列(6,822個核苷酸)插入含有AAV2 ITR之質體以產製CAG.ABCA4.pA及CAG.coABCA4.pA。用於雙載體體外比較之上游轉殖基因在ABCA4 編碼序列片段之前含有僅使用CMV.CBA增強子/啟動子元件之縮短版本的CAG。這些建構體係藉由PCR擴增CAG之CMV.CBA元件並將彼等附接至所欲ABCA4 編碼序列片段(見表2)之後使用SwaI限制位點將整個片段選殖至介於AAV2 ITR之間產製。用於體內實驗之上游轉殖基因係以相同方式製備，例外為在接合(插入)至AAV質體之前，GRK1 啟動子係藉由PCR擴增且附接至所欲ABCA4 編碼序列片段。為了最佳化上游轉殖基因，CAG內含子/外顯子區域之176個核苷酸係藉由PCR技術擴增且附接至GRK1 啟動子端。此擴增子接著使用PCR附接至所欲ABCA4 編碼序列且使用SwaI插入ITR之間。體外及體內用途之下游轉殖基因相同，所欲之ABCA4 編碼序列片段(見表2)係藉由PCR擴增且附接至WPRE及牛生長激素polyA信號，之後使用SwaI限制位點插入含有ITR之質體中。上游載體
此載體含有ABCA4 CDS之啟動子、非轉譯區(UTR)及上游區段，且轉殖基因之各端具有AAV2 ITR(圖1)。ABCA4 係表現於視網膜之感光受體細胞中且因此併入人視紫質激酶(GRK1 )啟動子元件。上游載體中含有之特定GRK1 啟動子序列係如Khani et al.(Investigative Ophthalmology and Visual Science, 48(9), 3954–3961, 2007)所述，包含GRK1 基因之核苷酸-112至+87且用於靶向感光受體細胞之基因療法臨床前研究。
199個核苷酸之GRK1 啟動子之後接著長度186個核苷酸之非轉譯區(UTR)。此核苷酸序列係選自REP1臨床試驗載體(MacLaren et al., 2014)中含有之大型UTR(443個核苷酸)。具體而言，選定序列包括雞β- 肌動蛋白(CBA)內含子1片段(具有預測的剪接供體位點)、家兔β- 球蛋白(RBG)內含子2片段(包括預測的分支點及剪接受體位點)及其後緊接Kozak一致序列之家兔β- 球蛋白外顯子3片段，該Kozak一致序列引導至ABCA4 CDS。此UTR片段被添加至原始GRK1 啟動子元件以增加轉譯產率(Rafiq et al., 1997；Chatterjee et al., 2009)。GRK1 啟動子本身在感光受體細胞中顯示非常良好的基因表現能力。
雙載體注射Abca4-/- 視網膜之比較顯示相較於單獨GRK1 啟動子元件，較多ABCA4蛋白質係自上游載體攜帶GRK1 .5'UTR元件之眼睛產製(圖3)。
在判定同時改善重組效率且限制tABCA4產生之人ABCA4 編碼序列內之最佳重疊序列之後，雙載體系統係經最佳化以進一步增加成功重組轉殖基因的全長ABCA4表現水準。體內評估之原始轉殖基因設計包括在上游轉殖基因中之GRK1 啟動子元件與一部分ABCA4 編碼序列及在下游轉殖基因中之ABCA4 編碼序列、WPRE及polyA信號。雖然GRK1 啟動子在小鼠感光受體細胞中驅動良好表現，各種元件可改善產率。在轉殖基因內包括內含子已顯示改善轉譯產率且以雙載體系統為例，此可導致達成誘發治療效應所需之目標蛋白質水準。為了探討含有可剪接元件之5'UTR序列之影響，插入類似AAV2/2 CAG載體中使用之內含子的來自5'UTR之區域。
5'UTR之效應可見圖11。將176個核苷酸插入GRK1 啟動子與上游轉殖基因變體B之Kozak一致序列之間。選定序列含有具有預測的剪接供體位點之雞(原雞(Gallus gallus ))β-肌動蛋白(CBA)內含子1片段；包括預測的分支點及剪接受體位點之兔(家兔(Oryctolagus cuniculus ))β-球蛋白(RBG)內含子2片段；及其後緊接Kozak一致序列及人ABCA4 編碼序列之兔(家兔(Oryctolagus cuniculus ))β-球蛋白外顯子3片段。此額外特徵之影響係在體內測試，比較在用四種上游轉殖基因中具有及不具有5'UTR之雙載體變體治療之後所達成之ABCA4表現：重疊B(B)、重疊B不具有WPRE(Bx)、重疊C(C)及重疊D(D)。在注射後6週藉由西方墨點轉漬法偵測之ABCA4蛋白質受到重疊區及上游轉殖基因中包括5'UTR的影響(圖11)。圖11顯示在用四種上游轉殖基因中具有及不具有5'UTR之雙載體變體視網膜下注射Abca4-/- 眼睛之後的ABCA4偵測比較。顯示包括在各轉殖基因中ABCA4 cDNA序列之核苷酸。每樣本全長ABCA4蛋白質之偵測係標準化至GAPDH且呈現為超過未治療陰性對照組樣本的水準。在圖11A中，注射AAV2/8 Y733F變體之Abca4-/- 眼係於注射後6週評估且評估上游轉殖基因中5'UTR對ABCA4水準的效應(二因子ANOVA，n=3(Bx/5'D)、5(B/C)、6(5'Bx/D)、7(5'B/5'C)，5'UTR影響p=0.03，重疊影響p=0.005，交互作用ns)。在圖11B中，相較於接受2E+9總基因體拷貝數之眼，在接受視網膜下注射2E+10總基因體拷貝數之最佳化雙載體變體5'C的Abca4-/- 眼偵測到較多全長ABCA4(不成對無母數Mann Whitney檢定，n=9 & 17，*p=0.01)。
收集神經視網膜進行mRNA萃取且後續橫跨重疊區之RT-PCR及定序分析證實自重組轉殖基因產製之ABCA4 轉錄物不攜帶突變(圖32A)。進一步RT-PCR證實包括在最佳化雙載體系統(5'C)中之內含子自mRNA轉錄物被成功剪接(圖32B)。橫跨重疊區之RT-PCR分析證實來自重組轉殖基因之mRNAABCA4 轉錄物存在且具有正確序列(圖4)。進行進一步RT-PCR以證實注射最佳化雙載體系統之眼的5'UTR剪接(圖5)。預測選擇用於上游轉殖基因中之5'UTR序列係可剪接元件且為了證實此，將來自注射雙載體變體C或變體5'C之四個Abca4 -/- 眼的彙集cDNA使用與GRK1 轉錄起始位點(TSS)下游結合之前置引子及在ABCA4 編碼序列內結合之反置引子擴增。評估5'UTR剪接之例示性引子包含FW 5'CCACTCCTAAGCGTCCTC及REV 5'CAGGGATTGTTCACATTGC。來自變體C注射眼之cDNA產製單一擴增子，其定序證實完全符合自GRK1 TSS至ABCA4 編碼序列之參考序列。來自注射最佳化雙載體變體5'C之眼的cDNA擴增產製三個產物。定序判定這些為三種剪接變化：一種為未剪接形式，其中5'UTR完整地在TSS與ABCA4 編碼序列之間，第二種產物代表部分剪接形式；最後一種擴增產物展現完全移除5'UTR並匹配來自變體C注射眼之cDNA序列。
上游載體中在Kozak一致序列之後係ABCA4 CDS核苷酸1至3,701(NCBI參考檔案NM_000350中105至3,805)。ABCA4 CDS之最後208個核苷酸形成下游載體中含有之CDS的前208個核苷酸且作為重疊區。上游載體中含有之編碼序列片段匹配參考序列NM_000350，例外為核苷酸1,536(NM_000350 1,640)之鹼基變更G＞T。此係密碼子的第三鹼基且不導致胺基酸序列變更。ABCA4 CDS係在外顯子25內截短且下游為3'ITR。下游載體
此載體含有ABCA4 CDS之下游區段、土撥鼠肝炎病毒轉錄後反應元件(WPRE)及牛生長激素聚腺苷酸化信號(bGH polyA)，且轉殖基因各端為AAV2 ITR(圖1及圖2)。ABCA4 CDS始於5'ITR下游之位置3,494(NM_000350 3,598)且繼續至6,822(NM_000350 6,926)之終止密碼子。ABCA4 CDS之前208個核苷酸與上游載體中含有之最後208個ABCA4 CDS核苷酸相同且作為轉殖基因之間的重疊區。下游載體中含有之編碼序列片段匹配參考序列NM_000350，例外為核苷酸5,175(NM_000350 5,279)之鹼基變更G＞A及6,069(NM_000350 6,173)T＞C。這些變更皆發生在密碼子的第三鹼基且不導致胺基酸序列變更。
限制位點HindIII分開ABCA4 CDS終止密碼子與WPRE。此元件的長度係593個核苷酸且符合REP1臨床試驗載體中含有之X抗原去活化WPRE。接著SphI限制位點分開WPRE與bGH polyA信號，該bGH polyA信號之長度係269個核苷酸且符合存在REP1臨床試驗載體中之bGH polyA信號。3'ITR接著位於polyA信號下游。
AAV2 5'ITR已知具有啟動子活性且連同下游轉殖基因內之WPRE及bGH polyA信號，將自非重組下游載體產製穩定轉錄物。下游轉殖基因中含有之野生型ABCA4 CDS攜帶多個符合讀框AUG密碼子，其無法在不改變胺基酸序列的情形下被其他密碼子取代。此產生自穩定轉錄物發生轉譯的可能性，導致可藉由西方墨點轉漬法偵測截短型ABCA4肽的存在(圖8A)。所選重疊區的開始序列係經小心選擇，以在較弱情境中符合讀框的AUG密碼子之前包括在(關於潛在Kozak一致序列)良好情境中不符讀框的AUG密碼子(圖12A)，這是為了鼓勵轉譯機轉自不符讀框位點起始。在符合讀框的AUG之前總共有四個在各種情境中的不符讀框的AUG密碼子。所有這些將轉譯至10個胺基酸以內的終止密碼子。這些不符讀框AUG密碼子的存在可預防自非重組下游轉殖基因轉譯截短型ABCA4蛋白質。
在雙重疊載體之一些實施例中，WPRE的存在或不存在影響雙重疊載體的蛋白質表現。具有重疊區B之載體的蛋白質表現顯示於圖6。在經AAV2/8 Y733F雙載體變體B轉導之HEK293T細胞中偵測全長ABCA4蛋白質。具有WPRE之雙載體變體B比起不具有WPRE之雙載體變體B(Bx)產製較多ABCA4(不成對雙尾參數t檢定，n=3，*p=0.01，F(2,2)=17.06)。誤差槓表示SEM。實例 3 - 評估重疊區
在識別用於重組之最佳載體及ABCA4序列之後，評估改變正股與負股之間重疊鹼基對長度之效應。
表 2 ：轉殖基因資訊(表2中核苷酸編號係相對於ABCA4 CDS，SEQ ID NO：11)。
Figure 02_image133
表2含有用於測試雙載體組合之轉殖基因詳細資訊，編號相對於ABCA4編碼序列(SEQ ID NO：11)。最終列含有最佳化重疊雙載體系統之詳細資訊。ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；CDS=編碼序列；GRK1=人視紫質激酶啟動子；pA=polyA信號；WPRE=土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件。
轉殖基因長度影響AAV包裝效率及因此力價。因此以最大轉殖基因大小4.9kb為目標(表2)。製備六個重疊變體(A至F)及一個經設計不具有介於轉殖基因之間之重疊區的額外變體(X)，以嘗試識別在ABCA4 編碼序列內的最佳重疊區(圖9及30B，表2)。經設計不具有介於轉殖基因之間之重疊區的額外變體(X)作為陰性對照組(表2及圖51)。重疊變體之詳細資訊提供於表2及圖51。製備六個重疊變體(見圖51A至F)，其中重疊自AAV轉殖基因內的最大可能長度(1,173bp)至符合維持特異性的最小長度(23bp)不等。重疊變體B至X共用相同的上游轉殖基因(Up2)，僅在彼等之下游轉殖基因中含有的ABCA4 編碼序列不同。為了獲得變體A之最大重疊區，必須延長上游轉殖基因(Up1)。在達到下游載體的最大編碼能力之後，進一步延長上游轉殖基因的3'方向，以獲得變體A之最大1,173bp重疊區。
在體外及體內(分別為圖7A及7B)評估六個重疊變體之後判定最佳重疊區。這些稱為A、B、C、D、E及F且代表下列重疊區(X代表無重疊)：A，1,173個核苷酸(3259至4430)；B，506個核苷酸(3300至3805)；C，208個核苷酸(3598至3805)；D，99個核苷酸(3707至3805)；E，49個核苷酸(3757至3805)；及F，24個核苷酸(3782至3805)。(此處的重疊區係相對於SEQ ID NO：1編號。)重疊區B至X的下游轉殖基因皆與相同上游轉殖基因配對。重疊變體B及C比起所有其他變體表現較佳且程度類似，但因為許多理由選擇雙載體版本C。首先是因為其限制截短型ABCA4自非重組下游轉殖基因的產生(圖8A)。來自C、D、E、F及X變體之非重組下游轉殖基因比起A或B版本產製減少水準的截短型ABCA4蛋白質。在雙載體情境中，重疊C產製最低比例的截短型ABCA4相較於全長ABCA4(圖8B及8C)。這顯示重疊C轉殖基因設計不僅限制來自非重組轉殖基因之非所要表現，同時比起重疊B亦以較高效率重組。此之進一步證據來自於比較重疊C與B注射ABCA4-/- 視網膜之間的轉錄物倍數變化及蛋白質倍數變化差異。靶向ABCA4 CDS上游部分之引子(因此除了來自重組轉殖基因之全長ABCA4 轉錄物以外偵測來自非重組上游轉殖基因之轉錄物)偵測到非常高水準的轉錄物存在於重疊B及C雙載體注射視網膜中。然而，重疊C產製的轉錄物水準小於重疊B的一半，但產生1.5倍的ABCA4蛋白質水準(圖8D)。由於兩者共用相同上游載體且只在彼等之下游轉殖基因序列有所差異，這表示選擇用於重疊C的重疊區以高於重疊B的效率重組。
選擇的重疊區具有52%的GC含量及-19.60 kcal/mol的自由能預測，幾乎小於重疊區B之-55.60 kcal/mol(53% GC含量)的三倍(圖12B)。此自由能的減少表示由非重組重疊C所形成的二級結構將比重疊B更容易解鏈，因此我們預測這使其較容易發生重疊區在相對轉殖基因上之交互作用。
HEK293T細胞係經各雙載體重疊變體(其中表現由CMV增強子、CBA啟動子元件驅動)以10,000之MOI轉導。在轉導5天後收集細胞且藉由西方墨點轉漬法分析測量ABCA4表現，其中ABCA4偵測水準標準化至GAPDH且呈現為超過未經轉導樣本之背景水準的值。觀察到重疊區對於ABCA4產製水準具有顯著影響(p＜0.0001，圖9A)。AAV2/8 Y733F雙載體轉導HEK293T細胞識別重疊區對於ABCA4產製水準的影響(單因子ANOVA，n=3，p=0.0001, F(6,14)=10.89)。變體B比起變體A、D、E、F及X產製較多ABCA4，而變體C比起變體D、E、F及X產製較多ABCA4(單因子ANOVA的Tukey多重比較檢定，n=3，X***p=0.009/D, E, F**p≤0.009/A*p≤0.04)。雙載體變體B比起變體A、D、E、F及X產製較多ABCA4，而雙載體變體C比起變體D、E、F及X產製較多ABCA4(圖9A)。
HEK293T細胞係經各雙載體重疊變體轉導且ABCA4表現係藉由西方墨點轉漬法分析測量。觀察到重疊區對於ABCA4產製水準具有顯著影響(p＜0.0001，圖9)。重疊變體A、B及C比起重疊X處理細胞分別提供4.2倍(p=0.004)、7.2倍(p＜0.0001)及5.2倍(p=0.0004)的全長ABCA4(圖9E)。這些雙載體變體係經注射至Abca4-/-小鼠視網膜下空間且將神經視網膜移除進行ABCA4偵測。體內療效係經全長ABCA4產生證實，如所有雙載體變體A至F之西方墨點轉漬法明顯可見。
雙載體變體接著經注射至Abca4 -/- 小鼠視網膜下空間且注射後6週將神經視網膜移除進行ABCA4偵測。資料彙總自多個注射組，其中每雙載體共計3至16隻眼。這些視網膜樣本中ABCA4蛋白質水準的比較指示如同體外研究，重疊區影響ABCA4產製水準(p=0.001，圖9B)。Abca4-/- 小鼠接受視網膜下注射AAV2/8 Y733F雙載體變體，且在注射後6週評估ABCA4表現。重疊區影響ABCA4偵測水準(單因子ANOVA，n=5(A/B/C)、6(D/E/X)或3(F)，p=0.001，F(6,36)=4.453)且變體C及D比起對照變體X給出較多ABCA4(單因子ANOVA，Tukey多重比較檢定分別為***p=0.0003及*p=0.04)。雙載體變體C及D比起變體X在體內產製較多ABCA4，但所有變體A至F皆導致可偵測水準的ABCA4，不像體外樣本只有A至D雙載體重疊變體產製可偵測ABCA4(圖9)。啟動子與起始密碼子之間包括內含子亦對ABCA4水準具有顯著影響，載體劑量亦然(分別為p=0.04及p=0.006，圖9B)。
探討將內含子添加至緊接啟動子之後的效應，其可能放大基因表現。在WPRE元件存在下，在啟動子與起始密碼子之間包括內含子(In)對於所達成之全長ABCA4的水準具有顯著影響，其中用重疊載體變體治療之後觀察到偵測最小增加1.5倍(p=0.004)。後續注射最佳化雙載體變體InC顯示在Abca4-/-注射眼一致偵測到全長ABCA4(圖9F)。
收集神經視網膜進行mRNA萃取且後續橫跨重疊區之RT-PCR及定序分析證實自重組轉殖基因產製之ABCA4轉錄物不攜帶突變。進一步RT-PCR證實包括在最佳化雙載體系統(InC)中之內含子已自mRNA轉錄物被成功剪接。因此雙載體系統的殼體、重疊區及轉殖基因調節元件方面經最佳化。
雖然資料證實先前當使用AAV8 Y733F遞送轉殖基因至小鼠視網膜的感光受體細胞相較於野生型殼體改善轉導的發現，重疊雙載體策略之一態樣係二個轉殖基因之間的重組事件。二個轉殖基因之間的重組事件藉由變更重疊區長度致效。比較六個自1.1kb至0.02kb不等之不同重疊區(圖9)。所有重疊變體導致ABCA4表現，其中表現最佳變體係B及C，分別代表0.5kb及0.2kb重疊長度。六個不同重疊區自1,173至23bp不等，經比較後表現最佳係207至505bp。最近一份報告比較重疊雙載體系統中lacZ 基因的1.0kb、0.6kb及0.3kb重疊區且識別最大重疊區係最有效者。然而，在另一份報告中，0.07kb F1噬菌體衍生性序列經證實可在感光受體細胞中有效達成雜交雙載體之間的重組。然而，在沒有具體探討資料集中呈現的重疊長度的情況下，並不瞭解最大1.1kblacZ 重疊提供最佳重構效率的原因。目前對於區域有效重組之特徵並無清楚定義。GC含量是一個可能的因素。最佳重疊變體之GC含量係可相比的54%(變體B)及52%(變體C)，但是兩個區域之間的空間位阻可能有顯著差異。雖然較長重疊區似乎合理地增加分子間交互作用的機會，但是較長亦可能因為二級結構形成而使此類交互作用無法發生，而較短重疊與相對轉殖基因分子的結合強度也可能是問題所在。較短重疊所需之可用於互補結合的核苷酸長度較短，因此較不受二級結構形成的妨礙。較短重疊可能的問題則在於彼等與相對轉殖基因分子結合的強度。此提供了為何本研究所識別之最佳重疊序列經判定為重疊區測試範圍的中間的理由。本研究強調評估多個重疊區以判定給定雙載體系統之最佳序列的重要性。實例 4 - 實驗規程
圖3、7B、8B：Abca4-/- 小鼠接受2μl視網膜下注射雙載體混合物(1：1)，每眼遞送1E+9基因體拷貝數的各載體。注射後6週執行眼摘出術，將神經視網膜自眼杯分割並溶解於RIPA緩衝劑中。將組織均質化並在離心之後萃取上清液。將上清液與變性裝載緩衝劑混合並在變性條件下在7.5% TGX凝膠上運行。將蛋白質轉移至PVDF膜並用兔多株抗-ABCA4(Abcam)偵測ABCA4且用小鼠單株抗-GAPDH(Origene)偵測Gapdh。觀測條帶且使用LICOR造影系統分析。將各樣本的ABCA4水準標準化至Gapdh且接著相對於未注射Abca4-/- 眼表示。
圖7A：所有體外實驗皆使用HEK293T細胞執行，使用標準規程繼代並使用Trans IT-LT1轉染試劑(Mirus Bio, US)以相等莫耳濃度質體轉染至60至70%長滿。將細胞在37℃下以5% CO2 培養48小時，之後將介質移除並用冷PBS溫和潤洗細胞層且抽吸。將細胞鬆開並在新鮮體積的冷PBS中脫壁，接著在4℃下以1,000xg離心10分鐘，然後移除PBS並重新懸浮於新鮮體積的冷PBS中且再次離心。將PBS移除並將細胞團塊冷凍在-80℃下直到需要時。
轉導係藉由下列執行：接種HEK293T細胞接著在接種後24小時使一孔細胞(長滿80至90%)脫壁以計算一孔中的細胞。使用HEK293T細胞以每孔2E5個細胞接種6孔培養板。在24小時之後，將一孔細胞脫壁並計數。此計數係用於判定提供至各孔之適量載體以給出每載體20,000之感染複數(MOI)。各AAV係基於此計數以20,000之MOI施用。各AAV係基於此計數以20,000之MOI施用。AAV載體係以所欲之MOI添加至一半孔體積之不含FBS且含有200nM多柔比星(Sigma-Aldrich, UK)之培養基。將孔抽吸並將含有AAV及多柔比星之體積添加至細胞，細胞已在37℃、5% CO2 下培養一小時。接著將剩餘體積之培養基添加至含有20%FBS之各孔且細胞在37℃、5% CO2 下培養，介質更換在轉導後2及4天進行。轉導後48小時，將介質移除並施用含有10%FBS之新鮮介質。細胞繼續培養48小時，之後發生另一次介質更換。24小時後，收集細胞並使用溫和離心循環於冷PBS中洗滌三次。將最終PBS洗滌液移除並冷凍細胞團塊。將細胞團塊在冰上解凍，接著溶解於RIPA緩衝劑。轉導後一週如上述收集細胞。溶解物如上述之視網膜樣本所示處理進行西方墨點轉漬法分析。
圖8A：使用HEK293T細胞以每孔1E6個細胞接種6孔培養板。在24小時後，將含有1μg質體與轉染試劑LT1(GeneFlow)複合之轉染混合物施用至細胞。測試質體攜帶用於產生AAV載體之下游轉殖基因。轉染後48小時，細胞係如上述經洗滌、收集及西方墨點轉漬法評估。
圖8D：ABCA4蛋白質水準係獲自如圖3所述之西方墨點轉漬法分析並比較重疊變體C與B雙載體處理之間的倍數變化。在轉錄物水準比較方面，將組織樣本收集於RNAlater(Ambion)中並使用Dynabeads-oligodT mRNA DIRECT(Life Technologies)萃取mRNA。使用oligodT引子及SuperScript III(Life Technologies)，以500ng mRNA執行cDNA合成。樣本使用PCR純化離心管(QIAGEN)清潔並以50μl DEPC處理水洗提。cDNA係藉由靶向ABCA4 CDS之上游部分的qPCR評估。將ABCA4 之水準標準化至肌動蛋白(Actin )水準且相對於未注射Abca4-/- 樣本表示。接著比較重疊變體C與B雙載體處理之間ABCA4 轉錄物水準的倍數變化。
活體內實驗：所有動物育種及實驗程序皆在當地及國家倫理及法律主管當局的核准下執行且遵守ARVO眼科及視覺研究動物使用聲明進行。色素Abca4 -/- 小鼠(129S4/SvJae-Abca 4tm1Ght )係由Gabriel Travis(David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, CA)提供且在Biomedical Sciences division, University of Oxford育種。色素WT對照小鼠(129S2/SvHsd)購自ENVIGO(Hillcrest, UK)。動物飼養在12小時光(＜100lux)/暗循環中，提供食物及水任意採食。視網膜下注射藉由使用手術顯微鏡(Leica Microsystems, Germany)在直接視覺引導下遞送2µl試劑執行。早期實驗使用以Hamilton注射器及34號規針頭(ESS labs, UK)經由後極至上方視網膜的鞏膜隧道方案，此注射系統及方法係使用於圖28中評估之眼。所有後續視網膜下注射涉及在使用WPI注射器及斜面35G針頭系統(World Precision Instruments, UK)進行視網膜下注射之前，以33G針頭執行前室腔液穿刺術。動物藉由含有氯胺酮(80mg/kg)及甲苯噻嗪(10mg/kg)之腹膜內注射麻醉且用托吡卡胺眼藥水(Mydriaticum 1%, Bausch & Lomb, Uk)及去羥腎上腺素眼藥水(去羥腎上腺素鹽酸鹽2.5%，Bausch & Lomb, UK)完全擴張瞳孔。丙氧間卡因眼藥水(丙氧間卡因鹽酸鹽0.5%，Bausch & Lomb, UK)亦在視網膜下注射之前施用。注射後，施用氯黴素眼藥水(氯黴素0.5%，Bausch & Lomb, Uk)，且用阿替美唑(2mg/kg)逆轉麻醉及施用卡波姆凝膠(Viscotears, Novartis, UK)以預防白內障形成。
轉錄物分析：樣本係儲存於RNAlater (ThermoFisher Scientific, UK)中之HEK293T冷凍細胞團塊或神經視網膜。神經視網膜樣本藉由在摘出術之後分割眼杯達成及在分割之後立即放入RNA。將樣本在冰上解凍並使用mRNA DIRECT Dynabeads-oligodT(Life Technologies, UK)萃取mRNA，接著依照廠商指南使用500ng的mRNA及oligodT引子於SuperScript III cDNA合成反應。cDNA係於QIAGEN離心管清潔並以50µl DEPC處理水洗提。轉錄物係藉由qPCR評估，使用2µl各cDNA製劑(qPCR引子列出如上)。ABCA4 水準係經標準化至ACTIN/Actin 水準。在RT-PCR方面，2µl的cDNA係用於識別僅上游轉錄物長度(FW 5'GATTACAAAGATGACG(SEQ ID NO：71)、REV 5'GCAATTCAGTCGATAACTA(SEQ ID NO：72))、重疊(FW 5'ACCTTGATCAGGTGTTTCCA(SEQ ID NO：73)、REV 5'ACAGAAGGAGTCTTCCA(SEQ ID NO：74))及5'UTR評估(FW 5'CCACTCCTAAGCGTCCTC、REV 5'CAGGGATTGTTCACATTGC(SEQ ID NO：75))。用於序列分析之擴增子係經PCR純化或選殖且在Sanger定序之前經純化。
西方墨點轉漬法評估：樣本係HEK293T冷凍細胞團塊或冷凍神經視網膜組織。神經視網膜樣本係藉由在摘出術之後分割眼杯達成且在分割之後立即在乾冰上冷凍於裂解緩衝液(RIPA緩衝劑(MerckMillipore, UK)加上蛋白酶體抑制劑(Roche, UK))中。將樣本在冰上解凍且使用手持均質機溶解且在4℃下旋轉一小時，然後在4℃下以17,000xg離心30 mins。上清液移除20µl添加至5µl蛋白質裝載緩衝劑(GeneFlow, UK)。將此留置在室溫下15分鐘，然後裝載7.5% TGX凝膠(BioRad, UK)。使用TransBlotTurbo將蛋白質轉移至PVDF膜，後續ABCA4/Abca4(ab72955, Abcam, UK)及GAPDH/Gapdh偵測(TA802519, Origene, US)使用SNAPiD系統(MerckMillipore, UK) 進行。圖28中之轉漬物使用HRP接合二級抗體(Abcam, UK)且使用Luminata Forte HRP受質(MerckMillipore, UK)顯影。其他轉漬物使用IRDye螢光二級抗體(LI-COR Biosciences, UK)偵測。以Odyssey造影系統(LI-COR Biosciences, UK)記錄膜信號且條帶密度係使用影像Studio Lite軟體評估，將ABCA4/Abca4水準標準化至GAPDH/Gapdh水準且值相對於陰性對照組樣本之背景讀數表示。
評估資料集的常態分布(Shapiro-Wilk檢定)及變異(Brown-Forsythe檢定)。Ff比較資料展現不相等變異(偏態及不成對)接著執行無母數檢定(Mann-WhitneyU 檢定或Kruskal Wallis)。如果變異相等(資料常態分布且成對)，則使用母數檢定(Student'st 檢定或ANOVA)。進行多重比較，使用Tukey's或Sidak's比較檢定(若為ANOVA)或Dunn's比較(若為Kruskal Wallis)校正。圖式簡單說明指示用於分析各特定資料集之檢定，適當時提供n、p及F值。資料以平均值及SEM顯示。實例 5 - 使用重疊雙載體策略之 AAV 媒介遞送 ABCA4 至 Abca4-/- 小鼠之感光受體
在此實例中呈現之資料顯示在視網膜下注射本揭露之重疊雙載體系統之後，ABCA4蛋白質表現特異性侷限於Abca4-/- 小鼠模型之感光受體外節。
轉殖基因設計及產生：重疊ABCA4轉殖基因係包裝於AAV8 Y733F殼體中。上游轉殖基因在AAV2反向末端重複(ITR)之間含有人視紫質激酶(GRK1)啟動子及ABCA4編碼序列(CDS)之上游部分。下游轉殖基因含有ABCA4 CDS之下游部分、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)及polyA信號(pA)。上游及下游轉殖基因皆攜帶ABCA4 CDS重疊區。
注射：Abca4 -/- 小鼠在4至5週齡接受2μl視網膜下注射，注射含有1：1上游及下游載體混合物(1x1013 gc/ml)。注射後6週收集眼進行免疫組織化學(IHC)評估。
初始視網膜下注射遞送2E+9總基因體拷貝數的各種雙載體組合。比較注射2E+9或2E+10總基因體拷貝數之Abca4 -/- 眼所達成的ABCA4蛋白質水準。在接受較高劑量的眼偵測到較多ABCA4(圖11B)，指示增加轉殖基因遞送能夠有更成功的重組事件。所有後續活體內研究以2E+10劑量進行。
免疫組織化學染色：將移除水晶體的全眼杯在室溫下固定在4%聚甲醛(PFA)中20分鐘。將眼杯在4℃下轉移至10%蔗糖溶液一小時，隨後轉移至20%溶液一小時，且接著於30%蔗糖中隔夜培養。將眼杯放入O.C.T化合物(VWR, UK)，培養30 mins接著在乾冰上冷凍且儲存在-80℃下。使用前將眼使用冷凍切片機切片，且在載玻片上在室溫及黑暗條件下乾燥隔夜。組織切片在室溫下乾燥隔夜接著以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)潤洗5分鐘三次。將樣本以0.2% Triton-X-100通透化20分鐘，接著以PBS洗滌三次，用10%驢血清(DS)、10%牛血清白蛋白(BSA)培育一小時。將抗體稀釋1/200於1% DS、0.1% BSA中，施用至切片並在室溫下留置二小時或在4℃下留置隔夜。Abca4/ABCA4偵測係以山羊抗-ABCA4(AntibodiesOnline)達成，過極化活化環狀核苷酸閘控鉀通道1(Hcn1)偵測以小鼠抗-Hcn1(Abcam)達成及視紫質偵測以小鼠抗-1D4(Abcam)達成。將切片用0.05% Tween-20潤洗三次，接著在黑暗條件在室溫下施用二級抗體(稀釋1/400)二小時。將切片用0.05% Tween-20潤洗二次，接著用Hoescht染色(1/1,000)培養半小時。將切片於PBS中潤洗接著風乾。將ProLong Diamond防退色封固劑施用至各切片並使玻片在造影前留置隔夜。所使用的一級抗體為：ABCA4/Abca4偵測(ABIN343052, AntibodiesOnline, Germany)、Hcn1偵測(小鼠單株ab84816，Abcam, UK)、Rho偵測(ab5417, Abcam, UK)。抗-ABCA4特異性係藉由西方墨點轉漬法分析使用pCAG.ABCA4.pA轉染HEK293T溶解物、野生型小鼠視網膜溶解物及市售人ABCA4肽(Abcam, ab114660)證實所使用的二級抗體皆為驢Alexa Fluor：抗山羊488(ab1050129, Abcam, UK)及抗小鼠568(ab175472, Abcam, UK)。 ABCA4表現局限於感光受體細胞外節
圖17顯示野生型(WT)及Abca4 -/- 眼的Abca4/ABCA4(綠色)及Hcn1(紅色)染色。將WT SVEV 129之未注射及注射的Abca4 -/- 眼進行感光受體內節標誌Hcn1及Abca4/ABCA4染色。WT及雙載體治療Abca4 -/- 眼顯示Abca4/ABCA4特異性定位於感光受體細胞外節。
由於ABCA4係經歷轉譯後修飾的大型複雜折疊蛋白質且經移動至感光受體外節特化區室的細胞膜，免疫組織化學定位提供西方墨點轉漬法以外的有關蛋白質結構的額外間接資訊。執行免疫組織化學染色以證實ABCA4在視網膜下注射雙載體轉導之後正確定位在視網膜之感光受體細胞外節。抗-Hcn1係用於強調感光受體內節之界線。影像利用共焦顯微鏡拍攝且聚焦於遮蔽RPE層之外節，這需要在不同焦平面上造影以觀察任何染色，因此RPE影像係分開呈現(圖21)。以圖20而言，注射後6週收集眼且製備用於免疫組織化學染色。抗-Hcn1係用於強調感光受體內節界線，因為預期正確ABCA4主要定位在外節結構。SVEV 129野生型(WT)眼係用來作為陽性對照組且顯示豐富Abca4存在感光受體細胞外節(圖20A)。未注射及該些接受僅上游或下游載體視網膜下注射之Abca4 -/- 眼未展現可偵測之ABCA4染色(分別為圖20B、C及D)。下游載體注射眼不存在染色與最佳化下游載體C變體之西方墨點轉漬法分析所觀察到的截短型ABCA4(tABCA4)減少一致。來自非重組下游轉殖基因之截短型ABCA4(tABCA4)產生的特徵在於由於細胞特異性啟動子不存在，其產製非特異性表現模式。注射後6個月僅注射下游載體小鼠的眼杯中沒有觀察到截短型ABCA4染色(圖21A)。以注射最佳化雙載體系統之Abca4 -/- 眼而言，ABCA4染色在感光受體細胞外節中明顯可見(圖20F)，表現在注射後6個月可偵測到。 ABCA4與視紫質共位
圖18顯示野生型(WT)及Abca4 -/- 眼之感光受體細胞外節中的Abca4/ABCA4(綠色)及視紫質(紅色)染色。WT及雙載體治療Abca4 -/- 眼顯示視紫質與Abca4/ABCA4共位於感光受體細胞外節。
圖19顯示野生型(WT)及Abca4 -/- 眼的Abca4/ABCA4(綠色)及視紫質(紅色)頂端RPE染色。WT及雙載體治療Abca4 -/- 眼顯示視紫質與Abca4/ABCA4共位於RPE細胞頂端區，假設為源自脫落外節盤。未經雙載體治療之Abca4 -/- 眼的RPE細胞頂端區僅顯示視紫質染色。框起影像顯示轉導RPE細胞達成的表現模式(GFP染色為綠色)，顯示不同於Abca4/ABCA4/rho染色之擴散染色模式。
以注射最佳化雙載體系統(5'C)之Abca4 -/- 眼而言，ABCA4染色在感光受體細胞外節中明顯可見(圖20E及20F)，且顯示與視紫質共位(圖20H)且在注射後6個月可偵測到(圖20J)。在一些雙載體注射眼中，觀察到RPE頂端區的ABCA4染色但染色並未擴散整個RPE細胞(圖20F)。如果此ABCA4染色是因為發生在RPE細胞內的表現，我們可以期待ABCA4存在整個細胞中而不是限於頂端區(圖21C)。例如，用CAG.GFP.WPRE.pA AAV2報導子載體轉導RPE細胞導致整個細胞中的擴散GFP染色(圖21A)。因此假設ABCA4的頂端染色係源自與RPE細胞接觸的碎斷或脫落的感光受體外節盤。為了證實此，進行視紫質染色且在WT眼顯示與Abca4共位之相同的染色模式(圖21D)。此共位亦在一些雙載體注射Abca4 -/- 眼中觀察到(圖21E)且在未注射Abca4 -/- 眼觀察到頂端視紫質染色的類似模式(圖21F)。
最佳化重疊雙載體系統可用於產製感光受體細胞的ABCA4表現，其中ABCA4以IHC可偵測之水準被移動至所欲之外節結構。實例 6 - 雙載體治療 Abca4-/- 小鼠中的雙類視色素 /A2E 評估
雙類視色素的累積是斯特格氏症的特徵且一般認為扮演重要角色或是人視網膜退化的主要驅動因素。這些分子的減少提供功能性測定，可評估雙載體AAV系統於Abca4 -/- 小鼠的療效。雙載體遞送之ABCA4特異性定位於Abca4 -/- 感光受體細胞的外節盤暗示全長ABCA4蛋白質的正確折疊，特別是考慮到兩個跨膜結構域(TMD)係由兩個載體編碼，即上游載體編碼TMD1及下游編碼TMD2。本研究使用至少一歲以前沒有顯著喪失感光受體細胞的色素化Abca4 -/- 小鼠模型。本研究使用的色素化小鼠模型不會出現視網膜退化也沒有可偵測的ERG表型。然而，這些小鼠的一致特徵是隨時間廣泛累積可定量的雙類視色素，因此概括人疾病的病理特徵。
Abca4 -/- 小鼠模型展現相較於野生型小鼠隨年齡增加的雙類視色素及A2E水準。然而與人不同的是，雙類視色素的增加不會達到會造成任何顯著視網膜退化所需的水準。這顯示Abca4缺損小鼠眼可能存在其他補償機制。在野生型視網膜中，Abca4促進視網膜移動出感光受體細胞外節盤膜以進行再循環。當功能性Abca4不存在時，如同Abca4 -/- 小鼠模型，視網醛維持在外節盤膜中且在其中經歷生物化學變化成為各種雙類視色素形式(圖23)。感光受體細胞恆常產製新的外節盤且藉此將較老較遠的盤朝向RPE細胞移動，RPE細胞後續藉由吞噬作用將盤降解。在Abca4缺損小鼠中，被吞噬的盤含有上升水準的雙類視色素。在RPE細胞中，這些被進一步轉換成A2E異構體，其累積導致脂褐質。因此雖然雙類視色素在Abca4缺損小鼠中的累積不足以造成視網膜退化，所得之超過基線的上升水準仍可經定量且因此提供Abca4功能之生物標記。
雙類視色素及A2E化合物可藉由高效液相層析法(HPLC)準確測量。因此經ABCA4基因療法治療之小鼠的治療療效指標可為達成雙類視色素及A2E水準相較於未治療眼的減少。然而有兩個考量點必須提出。第一是以臨床應用而言，我們必須使用人ABCA4編碼序列及人感光受體啟動子，然而這在小鼠不太可能那麼有效。另外HPLC測量係以全眼進行而不是只有暴露至視網膜下注射載體的區域。因此Abca4缺損小鼠中的雙類視色素整體減少不太可能達到野生型水準。第二個考量點是視網膜下注射，其可能導致損害外節盤。由於這些結構富含雙類視色素，因此ABCA4基因療法的效應必須與類似的虛假注射比較。理想上應使用相同小鼠的對側眼作為眼大小及終生光暴露的對照，其也可能影響雙類視色素累積。
因此我們比較一個Abca4 -/- 小鼠研究世代的雙類視色素/A2E水準，其中小鼠一眼接受虛假注射及對側眼接受類似治療注射。每隻虛假眼以和成對雙載體治療眼所接受之相同總AAV劑量接受上游載體。每隻小鼠的兩眼因此皆接受2 µl視網膜下注射，形成含有2 x 1010 基因體粒子之AAV載體的泡。
總計13隻Abca4基因剔除小鼠在4至5週齡接受注射並在注射後3個月收集眼。為了探討存在於經治療的Abca4 -/- 小鼠之感光受體外節中的ABCA4是否具有功能及提供治療效應，藉由HPLC分析評估眼的雙類視色素/A2E水準。小鼠在收集組織之前經黑暗調適16小時，組織收集係於黑暗中微弱紅光下進行。
在完全加盲研究中，經治療的Abca4 -/- 小鼠之全眼在收集後經匿名且冷凍運送至Jules Stein Eye Institute，以處理測量Abca4 -/- 小鼠中全反式視網醛二聚體-磷脂醯乙醇胺(atRALdi-PE)、N- 亞視黃基-N -視黃基磷脂醯乙醇胺(A2PE)、二-氫-A2PE(A2PE-H2)、經接合的N -亞視黃基-N -視黃基磷脂醯乙醇胺(A2E)及A2E雙鍵異構物(iso-A2E)之水準13隻Abca4 -/- 小鼠匿名眼的一眼接受僅上游載體(虛假)及對側眼接受雙載體(治療)，且每眼接受相同的總AAV劑量。在黑暗條件中收集眼、進行處理且在另一中心(JSEI)藉由高效液相層析法分析以判定全反式視網醛二聚體-磷脂醯乙醇胺(atRALdi-PE)、N- 亞視黃基-N -視黃基磷脂醯乙醇胺(A2PE)、二-氫-A2PE(A2PE-H2 )、經接合的N -亞視黃基-N -視黃基磷脂醯乙醇胺(A2E)及其主要順式異構物(iso-A2E)之水準。每個全眼不經分割採集及處理。這些評估係在每眼的識別資訊掩蔽下執行。在微弱紅光下進行摘出術，將眼立即冷凍及避免光照儲存在-80℃下。接著利用World Courier Services在-70℃下冷凍運送眼。運輸時間小於48小時且溫度紀錄證實樣本全程維持冷凍。雙類視色素萃取及HPLC評估如先前描述在眼執行。在HPLC評估所有26個眼之後，後續去盲識別資料且比較各治療眼與其成對虛假注射眼之雙類視色素/A2E水準。二因子ANOVA判定治療對於雙類視色素/A2E水準具有效應，其中觀察到雙載體治療眼相較於成對虛假注射眼減少(p=0.0171)，圖24。
初始研究由兩組11隻小鼠組成，第一組具有未注射眼及雙載體治療眼，而第二組具有未注射眼加上虛假注射眼。虛假注射僅含有上游載體，其總劑量與雙載體注射組所接受的總劑量相同(2E+10總基因體拷貝數)。未注射眼中各雙類視色素標誌之水準係與各小鼠成對注射眼中之水準比較且呈現為眼之間的倍數變化，因此「1」代表成對未注射眼中雙類視色素值(圖26)。識別治療組相較於虛假組之雙類視色素水準的倍數變化差異(p=0.05，圖26)。注意到未注射對照眼之間基線雙類視色素水準的變異性，因此進行第二個證實研究。
注意到未注射對照眼之間基線雙類視色素/A2E水準的變異性。為了減少此天然變異性的影響(其可能與不同年齡動物之不同眼杯大小有關)，執行第二個證實研究，其使用各動物的另一眼作為內部對照。在第二個研究中，Abca4 -/- 小鼠的一眼接受上游載體(虛假)及對側眼接受雙載體(治療)，且每眼接受相同的總AAV劑量。13隻小鼠的一眼接受上游載體(虛假)及對側眼接受雙載體(治療)，兩眼接受相同的總載體劑量2E+10基因體拷貝數。評估相同的雙類視色素，資料呈現為成對眼中所偵測之各生物標記水準的比較。觀察到治療對於Abca4 -/- 小鼠眼相較於虛假注射眼之雙類視色素/A2E水準的影響(p=0.03，圖31A)。將來自所進行之兩個實驗之虛假注射及治療眼之資料組合並使用三因子ANOVA檢定比較實驗，治療的影響經識別為具有p=0.0002。這是第一個以雙載體治療用於斯特格氏症影響Abca4 -/- 小鼠模型生物化學之介紹，提供功能性ABCA4遞送至感光受體細胞且誘導正面治療效應之指示。實例 7 - 上游及下游轉殖基因相關表現
使用針對ABCA4蛋白質C端之抗體，西方墨點轉漬評估在Abca4 -/- 小鼠僅注射下游載體之後識別額外的約135kDa之截短型ABCA4(tABCA4)蛋白質(圖28C)。單一載體注射視網膜之QPCR評估證實上游及下游載體產製穩定mRNA轉錄物(圖14)。由於mRNA係使用轉錄物之polyA尾自所有樣本直接萃取，這些資料暗示能夠將polyA尾添加至來自非重組上游轉殖基因之轉錄物的元件之存在。這些上游轉殖基因含有之核苷酸序列的分析顯示二個分別始於ABCA4 編碼序列(SEQ ID NO：11)之核苷酸502及1,750的潛在隱匿polyA信號ATTAAA。如果這些位點的任一個負責穩定轉錄物形成，則可預期短mRNA轉錄物僅來自WT上游載體，因為CO版本係經修飾以移除這些隱匿元件。體外測試WT及COABCA4 載體指示轉錄物存在於經任一變體處理之僅上游載體處理HEK293T細胞樣本(圖13)且體內評估轉錄物長度顯示轉錄物延長超過這些內部隱匿polyA位點(圖13)。這些資料指示在所有上游轉殖基因變體一致的轉殖基因結構之另一隱匿元件能夠將polyA尾添加至轉錄物。判定該可能的特徵係在ABCA4 編碼序列之外的SwaI限制位點(ATTTAAAT，SEQ ID NO：76)且用於選殖過程。雖然AATAAA(SEQ ID NO：77)及ATTAAA(SEQ ID NO：78)係最常見的polyA信號，TTTAAA也是潛在polyA六聚體。此序列在所有上游轉殖基因中一致且由於TTTAAA序列下游10個核苷酸額外存在潛在CA切割點(圖13)，此被視為所有上游轉殖基因中可行的polyA位點。
最佳化雙載體系統的一個態樣係限制非重組轉殖基因的非所要表現。儘管偵測到來自僅上游載體注射眼的ABCA4 mRNA轉錄物，但未偵測到ABCA4蛋白質形式(圖15)。不存在截短型ABCA4蛋白質形式係經含有N端FLAG標籤之建構體證實。然而，西方墨點轉漬法評估使用針對C端之多株抗體在Abca4 -/- 小鼠經雙載體及僅下游載體注射之後識別出約135kDa之截短型ABCA4(tABCA4)蛋白質(圖28C)。截短型ABCA4 轉錄物亦在下游載體轉導之後識別。預期非重組下游轉殖基因之表現係來自AAV2 ITR之天然啟動子活性，其接著可被讀成polyA信號。下游載體轉殖基因A及B含有之ABCA4 編碼序列在距離5'ITR相當距離處攜帶符合讀框ATG密碼子，因此可預期所得mRNA轉錄物轉譯至ABCA4終止密碼子，且A及B非重組下游建構體皆產製tABCA4(在5'ITR D序列之100至200個核苷酸以內的AUG，圖9)。下游轉殖基因含有之ABCA4 編碼序列顯著影響所偵測之截短型ABCA4之水準，其中僅A及B非重組下游建構體一致地產製可偵測之截短型ABCA4(p=0.0003)。原始載體設計係變體A及B，兩者皆產製tABCA4(圖10)。下游建構體C至X係後續設計以使緊接5'ITR下游之ABCA4 編碼序列在符合讀框ATG密碼子之前含有不符讀框ATG密碼子。此不需要改變天然ABCA4 編碼序列且顯著影響tABCA4產生水準(p=0.003，圖9C)。透過仔細評估ABCA4 編碼序列，我們識別出在ABCA4 編碼序列中含有在良好情境中之不符讀框及符合讀框ATG密碼子，即類似Kozak一致序列。基於這些評估選擇待包裝至下游載體的ABCA4 編碼序列片段，且確保5'ITR的100至200個核苷酸以內在任何在良好情境中符合讀框ATG之前存在有在良好情境中之不符讀框ATG密碼子。使用這些標準設計新的下游轉殖基因影響所觀察到的tABCA4水準，因為原始非重組下游A及B轉殖基因比起所有其他變體產製較高tABCA4蛋白質水準(圖10A)。在雙載體情境中，變體A至D產製可偵測的ABCA4形式(圖9A)且在總偵測ABCA4族群中，用變體A及B處理之細胞分別達成21±5%及25±0.8%的tABCA4比例，然而來自變體C及D處理樣本的截短型ABVA4(tABCA4)族群分別為4±2%及3±3%(圖9D)。
所有變體的AAV體外劑量一致且Abca4 -/- 眼接受每眼1×109 基因體拷貝數的各載體，除了雙載體變體A以外，因為其較大的轉殖基因大小包裝效率較低，因此最終劑量為每眼8×108 基因體拷貝數。雙載體變體5'C係經識別為最佳雙載體系統且當以較高劑量每眼1×1010 基因體拷貝數使用時，達成顯著改善ABCA4水準(p=0.006，圖9B)。這些資料指示在下游轉殖基因變體C至X採用的改變限制tABCA4形式自非重組轉殖基因產製。與下游建構體A及B中存在符合讀框ATG密碼子不同的是，變體C至X在5'ITR下游的任何符合讀框ATG密碼子之前含有不符讀框ATG密碼子及Kozak一致序列。
在一例中，為了減少截短型ABCA4自下游載體表現，選擇重疊C(207bp)。重疊C(雖然效率稍微低於B(505bp))給出較純的ABCA4蛋白質，在臨床場景中可能具有安全性優點。因此，將重疊C與含有內含子之上游載體組合並將兩者包裝在AAV8 Y733F殼體中。此雙載體組合係以每眼1×1010 基因體拷貝數用於後續Abca4-/-小鼠體內測試。
基於WPRE增加AAV轉錄物表現水準之證據，我們起初將此元件包括在我們的下游轉殖基因設計中。然而，由於觀察到mRNA轉錄物及截短型蛋白質自非重組下游轉殖基因產製，我們考慮將WPRE移除以潛在地限制此非所要的表現。當WPRE自變體B移除時(變體Bx)，體外截短型ABCA4蛋白質水準減少(圖10A)。另外，僅注射下游載體之Abca4 -/- 眼顯示下游B及Bx治療眼之間的截短型ABCA4 mRNA轉錄物水準減少(圖14B)。移除WPRE因此確實減少截短型ABCA4的表現水準。然而，下游轉殖基因的設計亦使得tABCA4產生能夠減少。
評估雙載體系統的安全性包括識別來自非重組轉殖基因之非所要的副產物使用上游或下游載體(非組合)之評估顯示呈非重組狀態之各載體可產製截短型ABCA4 mRNA轉錄物形式。上游轉殖基因核苷酸序列含有用於選殖目的之SwaI限制位點，其可作用為隱匿polyA信號：TTTAAA(已識別為1至2%之人基因中的polyA信號)。在上游載體治療之後不存在任何蛋白質偵測可能歸因於所得mRNA轉錄物中缺乏符合讀框終止密碼子，此將導致任何產製肽的降解。截短型ABCA4(tABCA4)蛋白質係自原始下游載體設計偵測到(圖9)。一種減少非所要蛋白質自雙載體產生的方案係藉由在轉殖基因設計中包括額外基因序列。另一方案採用編碼區域的序列選擇，在5'ITR的100個鹼基內的任何符合讀框ATG密碼子之前攜帶不符讀框ATG密碼子及Kozak一致序列，將截短型ABCA4(tABCA4)減少至可忽略水準(圖9)。待包括於下游載體中之ABCA4 編碼序列係經分析並選擇在5'ITR的100個鹼基內的任何符合讀框ATG密碼子之前攜帶不符讀框ATG密碼子的特定選擇編碼序列。此序列設計係基於核糖體偏好自它們在良好情境中所遭遇的第一個AUG密碼子起始轉譯的證據。如果核糖體嘗試自非重組下游轉殖基因的不符讀框AUG起始轉譯，我們可預測在達到不符讀框終止密碼子之前僅形成短肽，且此類短肽接著將因為彼等之大小被細胞降解。此策略是成功的，因為以此方式設計的五個新的下游轉殖基因變體顯示tABCA4產生減少至幾乎可忽略水準，儘管提供高劑量的單一載體轉殖基因。相對地，原始下游轉殖基因(A及B)皆產製tABCA4且兩者在任何在良好情境中不符讀框ATG密碼子之前皆攜帶符合讀框ATG密碼子。此轉殖基因設計特徵可被採用於其他雙載體策略。如果給定編碼序列在任何符合讀框密碼子之前不攜帶不符讀框密碼子，則選擇密碼子最佳化可為值得的選項。將來也有可能採用全序列密碼子最佳化，因為此已顯示增加轉譯速率且已開始使用密碼子最佳化基因序列的臨床試驗，包括最近起始的第I/II期X性聯色素沉著性視網膜炎臨床試驗(NCT03116113)。
在改善重組效率及使用WTABCA4 序列判定最佳重疊區之後，顯示增加重組轉殖基因表現之進一步方式。有證據指示在轉殖基因結構中包括WPRE可增加ABCA4自重組轉殖基因的表現。然而，包括此基因元件所新增的複雜性在於在早期轉殖基因設計中，觀察到來自非重組下游載體之非所要的截短型(tABCA4)蛋白質表現，該非重組下游載體確實含有WPRE。移除WPRE減少tABCA4之水準，但考慮到雙載體方案要達成ABCA4治療性水準的機會可能依賴自給定重組轉殖基因產製大多量的蛋白質，保留WPRE也可能有效。後續變更下游轉殖基因設計能夠減少截短型ABCA4至可忽略水準，但仍將WPRE維持在建構體中。
包括可剪接5'UTR元件改善在雙載體治療之後所達成的全長ABCA4蛋白質水準。先前已顯示靠近啟動子的內含子可放大前-mRNA合成並與聚腺苷酸化機轉協同交互作用以增強3'端轉錄物處理。研究顯示經歷剪接之mRNA轉錄物比起等效無內含子轉錄物展現較高轉譯產率且將內含子放置靠近啟動子比起當在編碼序列之內使用時更增強基因表現。此資料支持且強化這些發現，並鼓勵且支持內含子在載體轉殖基因中的標準使用。
其他雙載體方案及奈米粒子遞送已導致ABCA4在成年Abca4 -/- 小鼠的成功表現且提供歸因於ABCA4表現的正面效應證據。本研究首次顯示ABCA4在成年Abca4 -/- 小鼠視網膜注射最佳化重疊雙載體系統之後在感光受體外節中令人信服的表現。此ABCA4藉由減少疾病模型中累積之雙類視色素水準展現功能性活性，該效應在二個獨立的小鼠模型體內研究中證實。在斯特格氏症患者中，雙類視色素累積導致RPE細胞死亡及後續感光受體細胞的退化及死亡，此導致眼盲。考慮到此病症的進行性退化特性，可預期在任何年齡提供治療性介入以保存視網膜之生存細胞而具有好處。藉由最佳化重疊雙載體系統增加遞送至目標細胞之治療蛋白質的水準及很重要的減少通常發生於雙載體策略之非所要產物之表現，斯特格氏症之AAV基因療法臨床試驗前景目前看來越來越可達成。實例 8 - 密碼子最佳化
ABCA4蛋白質水準之初始比較係自野生型及密碼子最佳化ABCA4 編碼序列比較：在一些情況下，蛋白質產生可透過使用密碼子最佳化(CO)ABCA4 編碼序列增強。產製攜帶相同表現卡匣但包括WT或CO編碼序列之質體。轉染後48小時收集樣本且溶解物藉由西方墨點轉漬法分析評估，將ABCA4偵測標準化至GAPDH樣本水準，資料呈現為超過(轉染樣本)背景之值。比較相同但包括野生型(WT)或密碼子最佳化(CO)ABCA4 編碼序列之建構體且顯示CO編碼序列相較於WT編碼序列產製顯著3.1倍增加的ABCA4蛋白質(圖28A)。質體除了WT或CO ABCA4編碼序列之外相同。判定產製ABCA4蛋白質水準之差異(雙尾不成對t檢定，n=4，***p=0.0002，F(3,3)=2.973)。
為了探討藉由密碼子最佳化之ABCA4蛋白質產製增加是否也能在雙載體場景中達成，使用重疊雙載體(相同但包括WT或CO編碼序列)執行AAV2/2體外轉導。這些樣本的蛋白質分析顯示ABCA4水準無差異(圖28B，雙尾不成對t檢定，n=3，F(2,2)=18.74)。
為了判定此類CO編碼序列的正面效應是否可在體內達成，Abca4 -/- 小鼠接受視網膜下注射攜帶相同轉殖基因但編碼序列係WT或CO且由GRK1 啟動子驅動表現之AAV2/8重疊雙載體(轉殖基因詳見表2)。兩個雙載體系統之重疊區始於ABCA4 cDNA之位置3,154且終於核苷酸4,326，WT及CO序列重疊區之GC含量皆為55%(表2)。單離視網膜之ABCA4偵測係於注射後2週及6週評估，觀察到編碼序列的影響(p=0.04，圖28C)。WT或CO重疊雙載體注射眼在注射後2週所偵測到的ABCA4蛋白質水準未見差異。在注射後6週，自WT注射樣本偵測到比CO注射樣本更多的ABCA4蛋白質且WT注射視網膜之ABCA4偵測在此時間點一致地高於注射後2週(p=0.005，圖2C)。這些資料顯示在原本相同的雙載體重疊長度中變更鹼基對導致蛋白質表現的變化。此觀察指示鹼基配對效率可為雙載體重組之貢獻因子(而不只是密碼子偏差)。由於在重疊雙載體系統中使用COABCA4 編碼序列並沒有觀察到增強ABCA4產生，我們選擇在後續最佳化使用WT編碼序列。
完整全長WT及COABCA4 編碼序列的並排比較指示ABCA4 的密碼子最佳化確實允許較高轉譯速率。然而，由於編碼序列係用來作為雙載體系統中的重疊區，CO變體之編碼序列中所做的變更可影響重組的成功。如果CO轉殖基因的重組效率和WT版本一樣，則可預期CO變體將自等效數量的轉殖基因產生較多蛋白質。然而當在體內測試時，含有WT編碼序列之雙載體比起等效CO雙載體系統產製較多ABCA4。這可能指示WT雙載體注射眼比起CO雙載體注射眼含有較多成功重組轉殖基因。替代地，轉殖基因可能以類似程度重組，但COABCA4 編碼序列在小鼠感光受體細胞中的轉譯效率較低。密碼子最佳化傾向於人表現，因此在小鼠的轉譯速率可能受到負面影響。然而，所使用之WT序列係人衍生性且也與理想用於小鼠細胞中具有不同的密碼子偏差偏好，因此兩種序列皆可被認為是不利於在小鼠細胞中轉譯。另一考量是只比較WT及CO雙載體系統的一個重疊區，且重疊區對於重疊雙載體系統成功的重要性自此已被顯示。最後，在此場景中的密碼子變更不僅限於mRNA轉譯，但亦用於DNA修復，因為第二股合成對雙載體策略的成功做出貢獻且某些經暴露的核苷酸可能偏好此變更。
當使用質體形式之密碼子最佳化建構體時有較高的ABCA4偵測，但在雙載體AAV重組中，發現野生型序列較為有效。在一些實施例中，變更密碼子亦影響DNA鹼基配對，且因此對此場景中的雙載體重組具有直接影響。
由於在重疊雙載體系統中使用COABCA4 編碼序列並沒有觀察到增強ABCA4產生，我們選擇在後續最佳化使用WT編碼序列。注意到在僅注射下游載體(不論是WT或CO編碼序列)之視網膜，可偵測到約135kDa之截短型ABCA4(tABCA4)蛋白質(圖28C)。此蛋白質條帶在一些雙載體注射眼中亦明顯可見，但不是在所有樣本中可輕易識別。實例 9 - 減少脂褐質及黑色素相關自體螢光
直接測量Abca4 -/- 小鼠的雙類視色素水準能夠定量評估體內治療療效。除了在注射後三個月直接測量經治療的Abca4 -/- 小鼠之雙類視色素/A2E水準之外，也在注射後3及6個月執行雷射掃描眼底鏡(SLO)評估自體螢光，使用經顯示與黑色素累積相關的790nm波長。也執行使用790nm波長之雷射掃描眼底鏡(SLO)評估自體螢光，作為黑脂褐質累積的體內指標。SLO評估自體螢光係潛在人臨床試驗終點。相較於WT對照小鼠，小鼠模型展現隨時間增加之脂褐質及黑色素相關自體螢光。顯示488nm波長自體螢光測量值反映脂褐質之累積，而790nm波長自體螢光則與黑色素累積相關。
在此研究世代中，小鼠的一眼注射虛假注射(PBS)作為視網膜剝離效應之對照，而對側眼接受最佳化重疊雙載體系統(2E+10總基因體拷貝數)，目標是觀察到治療相關之脂褐質及黑色素相關自體螢光的降低。使用基於先前實驗的標準化SLO規程(52) 且當擷取各影像的平均灰值時，僅自下方視網膜採集標準化測量區域，以避免在上方半視網膜中之注射部位周圍因手術傷害或手術誘導變化造成的自體螢光中斷。十二隻小鼠各接受一眼虛假注射及對側眼治療。相較於成對虛假注射眼，接受治療之眼顯示488nm及790nm波長之平均灰值皆減少(488nm虛假221.4±4.7及治療205.9±6.3；790nm虛假119.9±5.2及治療101.4±7.1)。在注射後3及6個月之間，眼展現790nm自體螢光的增加，但虛假注射眼的增加相較於成對雙載體注射眼較大(p=0.04，圖31B)。在這些眼中，790nm自體螢光水準的增加在ABCA4雙載體注射眼相較於成對虛假注射眼顯著減弱。這些資料反映治療對於Abca4 -/- 小鼠之脂褐質及黑色素相關自體螢光水準的影響(圖27)。
使用共焦雷射掃描眼底術之小鼠眼底自體螢光(AF)造影(cSLO；SpectralisHRA, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)係使用標準化規程執行。螢光使用488nm氬雷射或790nm二極體雷射激發。動物如所述麻醉且瞳孔完全擴張。將客製化隱形眼鏡放在角膜上，使用羥丙基甲基纖維素眼藥水(羥丙基甲基纖維素眼藥水1%，Alcon，UK)作為黏性偶合液。NIR反射影像(820nm二極體雷射)係用於將眼底相機相對於瞳孔對齊且聚焦於外部視網膜中具有最高反射性之共焦平面上。影像使用「自動即時」(ART)模式記錄，設定為即時平均24張連續影像以減少信噪比。藉由使用ImageJ軟體測量距離視神經盤中心250與500像素半徑之間的標準化環狀區域，擷取488nm及790nm AF影像之平均灰值。接著將各影像切割以移除上方視網膜，並將標準化環僅施用至下方視網膜。實例 10 - 殼體變體
初始體內實驗使用AAV2/8血清型。例如，WT相較於CO之比較採用AAV8載體。然而，如果載體維持在細胞內較久，則自二個分開AAV載體釋放之重疊正股及負股的成功同源重組可能是最佳的。在一些實施例中，藉由以苯丙胺酸(F)取代酪胺酸(Y)變更AAV殼體蛋白質胺基酸已顯示延緩蛋白體降解但不影響趨性。在一些實施例中，藉由以苯丙胺酸(F)取代酪胺酸(Y)變更AAV殼體蛋白質胺基酸已顯示改善在Abca4-/- 視網膜中的轉導。比較在Abca4 -/- 視網膜中使用相同轉殖基因包裝於AAV2/8或AAV2/8 Y733F殼體之重疊雙載體方案的成功。圖29比較在Abca4 -/- 視網膜中使用相同轉殖基因包裝於AAV2/8或AAV2/8 Y733F殼體之重疊雙載體方案。ABCA4 轉錄物水準係標準化至每樣本Actin 水準且呈現為相對於未注射眼之增加倍數。較少ABCA4 轉錄物在注射AAV2/8雙載體之Abca4 -/- 視網膜中偵測到(p=0.002，圖29)。31.3±7.8倍較多ABCA4轉錄物在注射AAV8 Y733F雙載體之Abca4-/-視網膜中偵測到。
本研究藉由顯示一步一步地探討以改善斯特格氏症雙載體重疊AAV治療策略的成功來滿足改善雙載體策略之需求，以治療因大型基因突變所造成之病症。先前，所提出的問題是關於這些策略是否能夠導致產生足夠的目標蛋白質以提供治療效應。發展斯特格氏症之治療係評估達成治療效應之可能性的良好實例，因為目標蛋白質ABCA4在視網膜感光受體細胞中有大量需求。本發明所達成的最佳化包括該些可普遍應用於AAV基因療法者，但所呈現之特定增強也可建議用於實施其他雙載體策略。
此資料證實先前當使用AAV8 Y733F相較於AAV8殼體遞送在雙載體轉殖基因中之ABCA4 編碼序列時改善轉導之發現。藉由殼體及劑量選擇增強轉殖基因遞送及在感光受體細胞中之生存，對於雙載體治療成功增加轉殖基因之間分子間交互作用的機會有所影響。此係藉由比較以不同劑量之雙載體注射之眼來進一步強調，其中較高劑量導致全長ABCA4蛋白質偵測增加。先前的雜交雙載體方案已顯示藉由增加劑量來改善雙載體的成功，而此資料使用最佳化重疊雙載體系統顯示類似結果。實例 11 - 在 Abca4 KO 小鼠模型中評估 AAV 雙載體安全性
Abca4 KO小鼠模型除了年齡相關變化之外並未呈現眼動電波圖(ERG)表型或組織學退化，因此毒性徵候可藉由視網膜功能變化及視網膜結構喪失測量。
在加盲研究中，Abca4 KO小鼠在4至5週齡接受右眼上方視網膜的視網膜下注射(每組n=8-11)。測試的注射材料為：AAV稀釋劑(PBS PF68 0.001%)；GRK1.GFP.pA高劑量(2E+10基因體拷貝數)；上游載體低劑量(2E+9基因體拷貝數)；上游載體高劑量(2E+10基因體拷貝數)；下游載體(1E+10基因體拷貝數)；雙載體低劑量(2E+9總基因體拷貝數)；雙載體高劑量(2E+10總基因體拷貝數)。所有載體皆為AAV8 Y733F。在注射後3及6個月執行標準化光學同調斷層掃描(OCT)及ERG評估。
所有研究世代的小鼠顯示各種程度的注射後傷害。相較於注射後3及6個月的未注射成對眼，執行視網膜下注射對於上方總視網膜厚度皆具有顯著影響(3個月二因子ANOVA：眼p＜0.001，研究世代p=0.7012，交互作用p=0.6203；6個月二因子ANOVA：眼p＜0.001，研究世代p=0.6858，交互作用p=0.6230)。總視網膜厚度的減少不受注射材料影響，且在載體注射小鼠相較於僅接受AAV稀釋劑小鼠並未觀察到額外喪失。所有研究世代展現注射眼與未注射眼之間ERG幅值顯著減少1cd.s/m2(3個月二因子ANOVA：眼p＜0.0001，研究世代p=0.0173，交互作用p=0.5954；6個月二因子ANOVA：眼p＜0.0001，研究世代p=0.0102，交互作用p=0.4437)。成對眼之間的反應量值變化在任一時間點的研究世代之間並無顯著不同(二因子ANOVA：時間點p=0.8507，研究世代p=0.4014，交互作用p=0.0491)。
在Abca4 KO小鼠執行視網膜下注射導致總視網膜厚度喪失及ERG幅值下降。此類變化的量值在雙載體注射小鼠比起僅接受AAV稀釋劑小鼠並無不同。
所有在以上說明書提及之出版物係以引用方式併入本文中。本揭露所描述之產品、系統、用途、過程及方法的各種修飾及變化將為所屬技術領域中具有通常知識者所顯見，其不背離本揭露之範圍及精神。雖然本揭露描述特定較佳實施例，當能了解主張權利之本揭露不應被不當限制於該等特定實施例。事實上，用於實施本揭露之所述模式的各種修飾為生化及生技或相關領域之技藝人士所顯見，且意圖屬於以下權利要求範圍之內。
本專利或申請案檔案含有至少一個彩色圖式。在提出申請並支付必要費用後，專利局會提供具有彩色圖式的本專利或專利申請公開案副本。
圖1的示意圖顯示上游及下游轉殖基因結構，彼等組合以形成完全ABCA4 轉殖基因。
圖2A至2C的一系列圖示係用ABCA4 重疊雙載體系統轉導之後的轉殖基因結果。(A)上游及下游轉殖基因單股DNA形式。這些可經由彼等在互補轉殖基因上之同源性區域藉由單股黏合(SSA)黏合(B)，之後可產製完全重組大型轉殖基因(C)。縮寫：CDS=編碼序列；DSB=雙股斷裂；HR=同源重組；ITR=反向末端重複；pA=polyA信號；SSA=單股黏合；WPRE=土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件。
圖3之圖表顯示注射具有(5'C)及不具有(C)額外UTR序列之雙載體變體C後6週，在Abca4-/- 視網膜中之ABCA4蛋白質偵測。單位表示相對於未注射KO樣本之增加倍數。誤差槓表示SEM。單因子 ANOVA 的 Tukey 事後檢定， p=**0.009 。
圖4之示意圖顯示重疊的上游及下游雙載體，凝膠顯示ABCA4 之擴增，該擴增靶向橫跨來自注射Abca4-/- 眼之雙載體變體重疊區之區域(n=4)。使用上游轉殖基因中之前置引子結合ABCA4 CDS及下游轉殖基因中之反置引子結合ABCA4 CDS以自重組轉殖基因擴增轉錄物。將擴增子定序以證實轉錄物之重疊區內含有正確的ABCA4 CDS。B/C=注射雙載體變體B或C之眼(見表2)；5'B=注射其中上游轉殖基因含有5'UTR之雙載體變體B之眼；Bx=注射其中下游轉殖基因不具有WPRE之雙載體變體B之眼；CDS=編碼序列；GFP=注射GRK1.GFP.pA AAV2/8 Y733F之眼；KO=未注射Abca4-/- 眼；Up=僅注射上游B之眼；Up+Do=來自僅注射上游載體眼及僅注射下游載體眼之彙集cDNA；+=ABCA4質體對照組。
圖5係一系列顯示重疊上游及下游雙載體之圖示及PCR產物凝膠證實5'UTR自雙載體5'C注射Abca4-/- 彙集視網膜剪接(n=4)。使用與GRK1轉錄起始位點(TSS)緊接下游結合之前置引子及在上游ABCA4 CDS內結合之反置引子以評估來自雙載體C注射眼及雙載體5'C注射眼之轉錄物形式(上述之變體)。來自雙載體C注射眼之ABCA4轉錄物產製代表原始參考序列之單一擴增子。來自雙載體5'C注射眼之轉錄物產製三種經定序及證實的定義產物：未剪接、部分剪接及完全剪接變體。
圖6的圖表顯示偵測來自經具有及不具有WPRE之雙載體變體B轉導之HEK293T細胞的全長ABCA4蛋白質。用AAV2/8 Y733F雙載體變體B處理的樣本(B)比起用不具有WPRE之雙載體變體B處理的樣本(Bx)產製較多ABCA4(不成對雙尾參數t檢定，n=3，*p=0.01，F(2,2)=17.06)。誤差槓表示SEM。
圖7A至7B係成對圖表，顯示自構成重疊變體A、B、C、D、E、F及X之雙載體上游及下游轉殖基因產生的蛋白質。(A)在用不同重疊區載體變體(A)體外及(B)體內轉導之後的ABCA4蛋白質偵測。單位代表相對於未處理樣本之增加倍數(-=未處理HEK293T細胞；KO=未注射Abca4-/- 視網膜)。誤差槓表示SEM。單因子ANOVA的Tukey事後檢定分析顯示，體外雙載體變體B及C比起所有其他樣本產製較多ABCA4蛋白質，但B與C之間並無顯著差異。體內雙載體變體C比起所有其他變體(除B之外)產製較多ABCA4蛋白質。
圖8A至8D係查看ABCA4表現之一對凝膠、表格及圖表。(A)在用非重組下游載體處理之HEK293T細胞中可偵測到截短型ABCA4蛋白質變體；(B)在注射雙載體5'B或5'C之Abca4-/- 視網膜樣本中偵測到截短型及全長ABCA4蛋白質；(C)表格呈現藉由注射視網膜之西方墨點轉漬法所偵測之存在總ABCA4蛋白質族群中全長ABCA4百分比；(D)重疊C雙載體變體注射視網膜與重疊B雙載體變體注射視網膜之間ABCA4表現在轉錄物及蛋白質層級下的倍數變化差異。誤差槓表示SEM。
圖9A至9F的圖示顯示雙載體上游及下游變體A、B、C、D、E、F、G及X且一系列4個凝膠及5張圖表顯示來自不同雙載體重疊變體之ABCA4表現水準。圖9顯示上游及下游AAV2/8 Y733F ABCA4雙載體最佳組合之評估。全長及截短型ABCA4(tABCA4)的水準受到雙載體系統重疊區的影響。每樣本全長ABCA4蛋白質之偵測係標準化至甘油醛-3-磷酸去氫酶(GAPDH)且呈現為超過未治療陰性對照組樣本的水準。(A、E)雙載體轉導HEK293T細胞成功產製全長ABCA4。AAV2/8 Y733F雙載體轉導HEK293T細胞識別重疊區對於體外ABCA4產製水準的顯著影響(單因子ANOVA，n=6，p＜0.0001，F(6,35)=12.81)。變體A比起變體F及X產製顯著較多ABCA4，而變體B及C比起變體D、E、F及X產製顯著較多ABCA4(單因子ANOVA的Tukey多重比較檢定，A*p≤0.03，B***p≤0.0002，C*p≤0.04)。變體A比起變體X產製顯著較多ABCA4，而變體B及C比起變體X產製顯著較多ABCA4(單因子ANOVA的Tukey多重比較檢定，A**p=0.004，B***p＜0.0001，C***p≤0.0004)。誤差槓表示SEM。(B)Abca4-/- 小鼠接受視網膜下注射AAV2/8 Y733F雙載體變體，且在注射後6週評估ABCA4表現。重疊區影響偵測到的ABCA4水準(單因子ANOVA，n=3-16，p=0.001，F(6,36)=4.453)。將表現良好變體(5'C)的劑量自每眼1×109 增加至1×1010 (5'C+)基因體拷貝數改善ABCA4水準(單因子ANOVA，5'C相較於5'C+**p=0.006)。注射不具有(B、C、D)及具有(5'B、5'C、5'D)內含子變體之眼的分組分析證實重疊區的影響且識別內含子對於ABCA4表現水準的影響(二因子ANOVA，重疊p=0.01，內含子p=0.04，交互作用ns)。C.轉染下游轉殖基因建構體之HEK293T細胞顯示截短型ABCA4(tABCA4)的產製受到轉殖基因變體的影響(Kruskal-Wallis, n=6, p=0.0003)，其中只有變體A及B產生可偵測水準的tABCA4。D.來自(A)之處理細胞中全長及tABCA4形式之百分比。誤差槓表示SEM。ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；Do=下游轉殖基因變體；GAPDH=甘油醛-3-磷酸去氫酶；tABCA4=截短型ABCA4；UTC=未經轉導HEK293T細胞；5'=上游轉殖基因中含有內含子之雙載體變體；5'C+=雙載體變體5'C以10倍於所有其他樣本之劑量(每眼1×1010 基因體拷貝數)。(F)將雙載體重疊變體InC注射至Abca4-/-小鼠之眼，其中注射後6週達成一致偵測到全長ABCA4(n=每通道1眼)。+=轉染pCAG.ABCA4之HEK293T細胞；ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；Do=僅注射下游載體之Abca4-/-眼；GAPDH=甘油醛-3-磷酸去氫酶；In=上游載體含有內含子之雙載體變體；KO=未注射Abca4-/-眼；Up=僅注射上游載體之Abca4-/-眼；UTC=未經轉導HEK293T細胞；WT=SVEV 129野生型眼。
圖10A至10B係凝膠及一對圖表顯示來自非重組下游載體之截短型ABCA4偵測。每樣本截短型ABCA4蛋白質之偵測係標準化至GAPDH且呈現為超過未治療陰性對照組的水準。(A)HEK293T細胞係經攜帶不同下游轉殖基因之質體轉染以評估截短型ABCA4(tABCA4)產生。所偵測之tABCA4水準受到下游轉殖基因變體的影響(單因子ANOVA，n=3，p＜0.0001，F(7,16)=97.04)。下游變體A比起變體Bx、C、D、E、F及X產生較多tABCA4，而變體B比起所有其他下游變體產製較多tABCA4(單因子ANOVA的Tukey多重比較檢定，*p＜0.01/****p＜0.0001)。(B)顯示自經AAV2/8 Y733F雙載體變體A至D轉導之HEK293T細胞所識別之全長ABCA4及tABCA4形式之百分比。誤差槓表示SEM。
圖11A至11B之圖示顯示雙載體重疊變體及凝膠及兩個比較在用四種上游轉殖基因中具有及不具有5'UTR之雙載體變體視網膜下注射Abca4-/- 眼睛之後的ABCA4偵測之圖表。顯示包括在各轉殖基因中ABCA4編碼序列(SEQ ID NO：11)之核苷酸。每樣本全長ABCA4蛋白質之偵測係標準化至GAPDH且呈現為超過未治療陰性對照組樣本的水準。(A)注射AAV2/8 Y733F變體之Abca4-/- 眼係於注射後6週評估且評估當5'UTR添加至上游轉殖基因的ABCA4水準(二因子ANOVA，n=3(Bx/5'D)、5(B/C)、6(5'Bx/D)、7(5'B/5'C)，5'UTR影響p=0.03，重疊影響p=0.005，交互作用不顯著，ns)。(B)相較於接受2E+9總基因體拷貝數之眼，在接受視網膜下注射2E+10總基因體拷貝數之最佳化雙載體變體5'C的Abca4-/- 眼偵測全長ABCA4與截短型ABCA4(不成對無母數Mann Whitney檢定，n=9 & 17，*p=0.01)。
圖12A至12B係一系列圖示。(A)顯示重疊C序列，其在符合讀框AUG密碼子之前具有不符讀框AUG密碼子；(B)顯示重疊區C及B之預測的二級結構。
圖13A至13B係圖示、圖表(13A)及凝膠(13B)顯示自僅上游載體處理樣本單離之ABCA4轉錄物。圖示顯示來自上游轉殖基因變體B之核苷酸序列區段。來自SwaI位點之序列在所有上游轉殖基因變體中一致且強調可能的隱匿polyA信號特徵。(A)顯示偵測來自用WT或密碼子最佳化AAV2/2上游載體處理之HEK293T細胞的ABCA4轉錄物(n=1)。(B)顯示自僅注射上游載體之Abca4-/- 眼(n=4)單離的ABCA4轉錄物，藉由RT PCR評估轉錄物長度。使用結合ABCA4 CDS起始處之前置引子及結合SwaI位點之後的反置引子。CO=用含有密碼子最佳化ABCA4 CDS之上游AAV2/2載體處理之HEK293T細胞；KO=Abca4-/- 眼；Ov=重疊PCR；Up=上游PCR；WT=用含有野生型ABCA4 CDS之上游AAV2/2載體處理之HEK293T細胞。
圖14A至14B的一系列圖表顯示自單一載體注射Abca4-/- 眼偵測ABCA4 mRNA轉錄。(A)自僅注射上游載體變體B或5'B(包括5'UTR)眼偵測ABCA4轉錄物。在上游載體B中包括5'UTR序列減少所偵測的ABCA4轉錄物水準(不成對雙尾t檢定，n=3-4，***p=0.0003)。(B)自下游載體B移除WPRE(Bx)減少自單一載體注射眼所偵測的ABCA4轉錄物水準(Kruskal-Wallis，Dunn's多重比較檢定，n=3，*p=0.03)。B/C=注射上游或下游載體變體B或C之眼(見表2)；5'B=注射具有額外5'UTR序列之上游載體B之眼；Bx=注射不具WPRE之下游載體B之眼。誤差槓表示SEM。
圖15A至15B各為四張凝膠及圖表顯示僅上游載體處理樣本中不存在截短型ABCA4蛋白質。(A)HEK293T樣本係經攜帶FLAG標籤上游轉殖基因之質體轉染且使用針對ABCA4 CDS上游區域之引子評估ABCA4轉錄物存在(圖表及RT-PCR上圖)。ABCA4轉錄物含量豐富(n=3)但西方墨點轉漬法未偵測到截短型蛋白質。pD=經下游轉殖基因質體轉染之HEK293T細胞；pF=經FLAG標籤上游轉殖基因質體轉染之HEK293T細胞；UTC=轉染HEK29T細胞；+=陽性對照。(B)Abca4-/- 眼係經FLAG標籤上游載體AAV2/8 Y733F注射且使用針對ABCA4 CDS上游區域之引子評估ABCA4 mRNA轉錄物存在(圖表及RT-PCR上圖)。ABCA4轉錄物在僅上游載體注射眼中含量豐富(n=2)但西方墨點轉漬法未偵測到截短型蛋白質。誤差槓表示SEM。D=僅下游載體注射眼；F=僅FLAG標籤上游載體注射眼；KO=未注射Abca4-/- 眼；-=空通道；+=陽性對照。
圖16的一系列影像顯示在注射後6週收集之Abca4-/- 視網膜中感光受體細胞外節中的ABCA4染色(綠色)。HCN1(紅色)染色標示內節。亦包括WT視網膜中天然Abca4定位之染色實例加上未注射Abca4-/- 視網膜中染色不存在之證據。
圖17的一系列影像顯示野生型(WT)及Abca4-/- 眼的Abca4/ABCA4(綠色)及Hcn1(紅色)染色。
圖18的一系列影像顯示野生型(WT)及Abca4-/- 眼之感光受體細胞外節中的Abca4/ABCA4(綠色)及視紫質(紅色)染色。
圖19係一系列野生型(WT)及Abca4-/- 眼的abca4/ABCA4(綠色)及視紫質(紅色)頂端RPE染色之影像。右下角的框起影像描繪野生型(WT)及Abca4-/- 眼的GFP(綠色)及視紫質(紅色)頂端RPE染色。
圖20A至20J係一系列使用針對ABCA4 C端之多株抗體染色外節蛋白質ABCA4(綠色)且染色內節標誌蛋白質Hcn1(紅色)(A至F)或rho(紅色)(G至H)或僅ABCA4(I至J)的28個小鼠眼切片影像。細胞核係以Hoescht(藍色)染色。ABCA4標示外節感光受體而Hcn1標示內節。所有眼在4至5週齡注射且在注射後6週收集。(A)WT SVEV 129之感光受體外節中的ABCA4染色；(B)未注射Abca4-/- 眼中不存在ABCA4染色；(C)上游載體注射Abca4-/- 眼中不存在Abca4/ABCA4；(D)下游載體注射Abca4-/ - 眼中不存在ABCA4染色；(E-F)雙載體注射Abca4-/- 眼(二隻不同眼)之感光受體外節中的ABCA4染色；(G)WT SVEV 129之感光受體外節中的Rho與Abca4共位；(H)雙載體注射Abca4-/- 眼之感光受體外節中的Rho與ABCA4共位；(I)下游載體注射Abca4-/- 眼在注射後6個月不存在ABCA4染色；(J)雙載體注射Abca4-/- 之感光受體外節在注射後6個月的ABCA4染色。Abca4/ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；雙=雙載體注射Abca4-/- 眼；下游=下游載體注射Abca4-/- ；Hcn1=過極化活化環狀核苷酸閘控鉀通道1；IS=內節；KO=Abca4-/- ；ONL=外核層；OS=外節；RPE=視網膜色素上皮；上游=上游載體注射Abca4-/- ；WT=SVEV 129野生型。上游KO(單一AAV載體5'端)、下游KO(單一AAV載體3'端)如預期顯示無ABCA4產生，但雙KO(組合AAV載體)導致強健ABCA4蛋白質表現(F及H)。
圖21A至21F的一系列8個影像顯示在注射Abca4-/- 眼中的ABCA4染色(綠色)及視紫質染色(紅色)。細胞核係以Hoescht染色。(A)僅注射下游載體之Abca4-/- 眼在注射後6個月不存在ABCA4染色。(B)雙載體注射Abca4-/- 眼之感光受體外節在注射後6個月的ABCA4染色。(C)AAV2/2 CAG.GFP.WPRE.pA注射Abca4-/- 中的RPE GFP表現。(D)Rho及Abca4共位在WT SVEV 129 RPE細胞的頂端區。(E)Rho及ABCA4共位在雙載體注射Abca4-/-之RPE細胞的頂端區。(F)未注射Abca4-/- 之RPE細胞的頂端區中之Rho染色。Abca4/ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；雙=雙載體注射Abca4-/- ；KO=Abca4-/- ；Rho=視紫質；RPE=視網膜色素上皮；WT=SVEV 129野生型。白色箭頭指示Abca4/ABCA4與Rho在RPE細胞頂端區共位。
圖22的圖示描繪例示性重疊載體。
圖23係描繪正常類視色素循環的圖示，該循環顯示於圖示的左側。右側顯示在Abca4缺乏小鼠及人中發生增強程度的雙類視色素及A2E產製。圖示右側以方框強調之分子係於Abca4-/- 小鼠中評估。(實例6。)
圖24係13隻接受虛假或治療注射之Abca4-/- 小鼠成對眼中雙類視色素及A2E異構體水準的圖表。觀察到虛假與治療眼之間的雙類視色素及A2E水準降低(p=0.017, F=5.849)。另外，所有雙類視色素及A2E測量值的最低水準出現在雙載體治療眼。(實例6。)
圖25A至25D的一系列圖表(A、C及D)及表格(B)顯示注射最佳化雙載體Abca4-/- 眼(治療)相較於成對虛假(A)注射眼的雙類視色素/A2E水準。顯示虛假(A)及治療(C)注射眼之實例層析圖描記線，經標示之尖峰指示於表格(B)。接受雙載體治療之眼相較於接受虛假注射之眼的雙類視色素/A2E水準顯示於(D)。在接受雙載體治療之眼相較於接受虛假注射之眼觀察到雙類視色素/A2E水準的減少(二因子ANOVA匹配值，n=13，治療效應p=0.03，F(1,60)=4.516)。也觀察到成對眼中A2PE-H2水準之間的差異(二因子ANOVA，Sidak's多重比較檢定，n=13，p=0.01)。誤差槓表示SEM。atRALdi-PE=全反式視網醛二聚體-磷脂醯乙醇胺；A2PE-H2=二-氫-A2PE；A2PE=N-亞視黃基-N-視黃基磷脂醯乙醇胺；A2E=經接合的N-亞視黃基-N-視黃基磷脂醯乙醇胺；iso-A2E=A2E之雙鍵異構物；WT=SVEV 129對照。
圖26的圖表顯示注射雙載體之Abca4-/- 眼(治療)相較於注射上游載體劑量對照之眼(虛假)中的雙類視色素及A2E水準減少。二組小鼠(n=11)的一眼接受治療或虛假注射，而成對眼維持未注射。每一眼的雙類視色素及A2E水準係於注射後3個月評估且呈現為每隻小鼠的眼之間的水準倍數變化。識別治療組相較於虛假組之雙類視色素及A2E水準的倍數變化差異(二因子ANOVA，n=11，p=0.05，F(1,100)=3.695)。誤差槓表示SEM。
圖27A至27B的一系列影像(A)及圖表(B)顯示Abca4-/- 小鼠注射後6個月之脂褐質相關之488nm及黑色素相關之790nm自體螢光平均灰值，各小鼠的一眼接受2E+10總基因體拷貝數的雙載體(治療，左側影像)及對側眼接受PBS注射(虛假，右側影像)。(B)平均灰值相較於四隻虛假注射野生型SVEV 129眼的平均灰值平均值之差異。雙載體治療減少Abca4-/- 小鼠注射後6個月的脂褐質及黑色素相關自體螢光(單因子ANOVA，n=12，治療影響p=0.01，F(1,2)=6.762)。誤差槓表示SEM。488nm=脂褐質相關自體螢光；790nm=黑色素相關自體螢光；虛假=PBS注射Abca4-/- ；治療=雙載體注射Abca4-/- 小鼠；WT=野生型SVEV 129小鼠。
圖28A至28C係一系列凝膠及圖表，顯示在經野生型(WT)或密碼子最佳化(CO)ABCA4編碼序列治療之後的ABCA4蛋白質偵測。每樣本全長ABCA4蛋白質之偵測係標準化至GAPDH且呈現為超過未治療陰性對照組樣本的水準。(A)A.相同但含有WT或COABCA4 編碼序列之質體係用於轉染HEK293T細胞，後續判定ABCA4蛋白質水準有差異(雙尾不成對t檢定，n=4，***p=0.0002，F(3,3)=2.973)。(B)相同但含有WT或CO ABCA4編碼序列之AAV2/2重疊雙載體係用於轉染HEK293T細胞，後續觀察到ABCA4蛋白質水準無差異(雙尾不成對t檢定，n=3，F(2,2)=18.74)。(C)Abca4-/- 小鼠接受視網膜下注射含有WT或COABCA4 編碼序列之AAV2/8重疊雙載體。雙載體系統中使用之編碼序列對於所偵測之ABCA4水準具有影響(二因子ANOVA，n=8-9，編碼序列影響p=0.04，時間點影響ns，交互作用p=0.01)。在注射後6週，WT注射眼比起CO注射眼具有較多ABCA4(二因子ANOVA，Sidak's多重比較檢定，**p=0.005)且WT注射眼在注射後6週偵測到的ABCA4高於2週(二因子ANOVA，Sidak's多重比較檢定，*p=0.05)。誤差槓表示SEM。ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；CO=用含有密碼子最佳化ABCA4編碼序列之轉殖基因處理之樣本；COd=注射CO下游載體之眼；COu=注射CO上游載體之眼；GAPDH=甘油醛-3-磷酸去氫酶；KO=未注射Abca4-/- 視網膜溶解物；tABCA4=截短型ABCA4；UTC=未經轉導HKE293T細胞溶解物；WT=用含有野生型ABCA4編碼序列之轉殖基因處理之樣本；WTd=注射WT下游載體之眼；WTu=注射WT上游載體之眼；+=經ABCA4轉染之HEK293T細胞溶解物。
圖29的圖表顯示注射攜帶相同轉殖基因之AAV2/8或AAV2/8 Y773F雙載體之Abca4-/-眼的ABCA4表現水準比較。mRNA轉錄物係在注射後6週自Abca4-/- 注射視網膜單離並以cDNA執行qPCR分析。自AAV2/8 Y733F雙載體注射眼偵測到較多ABCA4 轉錄物(Mann-Whitney雙尾檢定，n=4，***p=0.0002)。誤差槓表示SEM。
圖30A至30B係一對發展ABCA4雙載體系統之圖示。A.考慮及評估載體設計的不同態樣，包括轉殖基因的基因元件及結構以及載體殼體及劑量。B.比較攜帶不同重疊長度之雙載體變體以判定二個轉殖基因之間的最佳重組區域。AAV=腺相關病毒；ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；Do=下游轉殖基因變體；GRK1=人視紫質激酶啟動子；In=內含子；ITR=反向末端重複；pA=polyA信號；Up=上游轉殖基因變體；WPRE=土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件。
圖31A至31D係實驗流程圖(A，上方列)、二個實例層析圖描記線及尖峰表格(A，中間列)、圖表(A，底部)、眼的一系列12個影像(B，上方)及圖表(B，底部)、(C)額外4個虛假及治療眼影像、及(D)額外圖表顯示觀察到的雙載體治療效應為經注射之Abca4-/- 治療眼中雙類視色素累積及眼底自體螢光的減少。資料顯示在Abca4-/- 小鼠模型中雙載體治療效應之證據。A.觀察到的雙載體治療效應為經治療之Abca4-/- 眼在注射後3個月雙類視色素累積的減少。顯示上游載體(虛假)及雙載體(治療)注射眼之實例層析圖描記線。圖中所示之WT眼的雙類視色素水準僅供參考並未包括在分析中。在接受雙載體治療之眼相較於接受虛假注射之眼觀察到雙類視色素水準的顯著減少(二因子ANOVA匹配值，n=13，治療效應p=0.03，F(1,60)=4.516)。也觀察到成對眼中A2PE-H2水準之間的顯著差異(二因子ANOVA，Sidak's多重比較檢定，n=13，*p=0.01)。A-D.自體螢光增加係斯特格氏症之早期特徵。Abca4-/- 眼中之790nm自體螢光隨時間增加，但在接受雙載體(治療)之眼觀察到的增加相較於成對PBS(虛假)注射眼有顯著差異(成對t檢定，n=12，*p=0.04)。觀察到的雙載體治療效應為注射後6個月790 nm自體螢光的減少。Abca4-/- 眼係藉由雷射掃描眼底術(SLO)於注射後3及6個月造影且接受雙載體(治療)之眼的790nm自體螢光變化相較於成對PBS(虛假)注射眼顯著減少(成對t檢定，n=12，*p=0.04)。雙載體治療小鼠相較於鹽水注射對照組顯示視網膜自體螢光減少。小鼠係於早期成年期(＜3個月)治療且視網膜自體螢光造影(Heidelberg Spectralis)係於3及6個月執行。(E)緊臨視神經下之強調區域以高倍數顯示進行比較。atRALdi-PE=全反式視網醛二聚體-磷脂醯乙醇胺；A2PE-H2=二-氫-A2PE；A2PE=N-亞視黃基-N-視黃基磷脂醯乙醇胺；A2E=經接合的N-亞視黃基-N-視黃基磷脂醯乙醇胺；iso-A2E=A2E之雙鍵異構物；SLO=雷射掃描眼底鏡；WT=SVEV 129年齡相符對照。
圖32A至32B各為顯示來自經注射的Abca4-/- 眼睛之ABCA4的RT-PCR之圖示及凝膠(n=4，彙集)，其證實來自重組轉殖基因之轉錄物在重疊區具有正確的成功移除內含子之編碼序列。(A)使用由上游轉殖基因提供之前置引子結合ABCA4 CDS及下游轉殖基因中之反置引子結合ABCA4 CDS以自重組轉殖基因擴增轉錄物。將擴增子定序以證實轉錄物之重疊區內含有正確的ABCA4 CDS。(B)使用與預測的GRK1轉錄起始位點(TSS)下游結合之前置引子及在上游ABCA4 CDS內結合之反置引子以評估來自雙載體C注射眼及雙載體5'C注射眼之轉錄物形式。來自雙載體C注射眼之ABCA4轉錄物產製代表原始參考序列之單一擴增子。來自雙載體5'C注射眼之轉錄物產製三種經定序及證實的定義產物：未剪接、部分剪接及完全剪接變體。ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；B/C=注射雙載體變體B或C之眼(見表2)；5'B=注射其中上游轉殖基因含有內含子之雙載體變體B之眼；CDS=編碼序列；GFP=注射GRK1.GFP.pA AAV2/8 Y733F之眼；ITR=反向末端重複；KO=未注射Abca4-/- 眼；pA=polyA信號；WPRE=土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件；Up=僅注射Up1之眼；Up+Do=來自僅注射上游載體眼及僅注射下游載體眼之彙集cDNA；+=ABCA4質體對照組。
圖33係啟動子及可用於驅動ABCA4上游序列表現之額外序列的圖示。RK=GRK1啟動子；IntEx=內含子及外顯子序列；CMV=巨細胞病毒早期增強子；CBA=雞β肌動蛋白啟動子；SA/SD=剪接受體及剪接供體。
圖34係用於表現ABCA4上游序列或GFP之AAV載體的圖示。ITR=反向末端重複；WPRE=土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件；GFP=綠色螢光蛋白質；IntEx=內含子及外顯子序列；CBA=雞β肌動蛋白啟動子；CMV=巨細胞病毒增強子；RK=視紫質激酶啟動子(GRK1啟動子)；RBG=兔β球蛋白；SA/SD=剪接受體及剪接供體序列。
圖35係CMVCBA.In.GFP.pA載體的序列(SEQ ID NO：17)。
圖36係CMVCBA.GFP.pA載體的序列(SEQ ID NO：18)。
圖37係CBA.IntEx.GFP.pA載體的序列(SEQ ID NO：19)。
圖38係CAG.GFP.pA載體的序列(SEQ ID NO：20)。
圖39係AAV.5'CMVCBA.In.ABCA4.WPRE.kan載體的序列(SEQ ID NO：21)。
圖40係AAV.5'CMVCBA.ABCA4.WPRE.kan載體的序列(SEQ ID NO：22)。
圖41係AAV.5'CBA.IntEx.ABCA4.WPRE.kan載體的序列(SEQ ID NO：23)。
圖42的一系列示意圖描繪本揭露之例示性ABCA4表現建構體。
圖43係pAAV.RK.5'ABCA4.kan之ITR至ITR部分的序列(SEQ ID NO：26)，包含編碼5'ITR之序列(SEQ ID NO：27)、編碼RK啟動子之序列(SEQ ID NO：28)、編碼兔β-球蛋白(RBG)內含子/外顯子(Int/Ex)之序列(SEQ ID NO：39)、編碼ABCA4基因之編碼序列的5'部分之序列(SEQ ID NO：29)及編碼3'ITR之序列(SEQ ID NO：30)。
圖44係pAAV.3'ABCA4.WPRE.kan之ITR至ITR部分的序列(SEQ ID NO：30)，包含編碼5'ITR之序列(SEQ ID NO：27)、編碼ABCA4基因之編碼序列的3'部分之序列(SEQ ID NO：31)、編碼WPRE之序列(SEQ ID NO：32)、編碼bGH polyA之序列及編碼3'ITR之序列(SEQ ID NO：33)。
圖45係中期斯特格氏症患者的眼底影像。
圖46的圖片改編自Sears et al. TVST 6(5)：6(2017)，顯示ABCA4及類視色素循環(有時稱為視覺循環)定位於感光受體細胞。ABCA4定位在桿狀及錐狀細胞感光受體之外節盤膜。OS，光敏感性外節；CC，連接纖毛；IS，內節。
圖47A至47C的一系列圖片顯示由雙股DNA(dsDNA)編碼之轉殖基因轉化成單股同義及反義DNA(ssDNA)及ssDNA包殼於AAV病毒粒子中。
圖48A至48D的一系列圖片顯示核攝取含有同義及反義ssDNA之AAV病毒粒子(A)；自病毒粒子釋放同義及反義股(B)；合成互補股以再生dsDNA(C)；及轉錄轉殖基因(D)。
圖49A至49H的一系列圖片描繪透過單股黏合及第二股合成將大型轉殖基因包殼、轉導及重整於AAV雙載體系統中。大型轉殖基因起初編碼為dsDNA(A-B)。後續，大型轉殖基因之重疊5'及3'片段的ssDNA經AAV病毒粒子包殼(C)。產製包含大型轉殖基因之5'及3'片段的互補股之病毒粒子且這些ssDNA包含互補、重疊序列區(顯示紅色)。在此實例中，描繪5'片段之反義ssDNA及3'之同義股。轉導包含ssDNA之AAV粒子(D)，且ssDNA係自病毒粒子釋放至核中(E)。5'及3'片段在核環境中在互補、重疊序列處雜交(F)，透過第二股合成產製整個大型轉殖基因之dsDNA(G)，且此dsDNA後續經轉錄並表現轉殖基因(H)。
圖50係本揭露之ABCA4重疊雙載體系統的概述。腺相關病毒(AAV)轉殖基因之元件被分割成二個獨立的轉殖基因(「上游」及「下游」)。上游轉殖基因含有啟動子及ABCA4 編碼序列之上游片段，而下游轉殖基因攜帶ABCA4 編碼序列之下游片段加上WPRE及牛生長激素(bGH)pA信號。在所描繪之最佳化重疊雙載體系統中，兩個轉殖基因皆攜帶由ABCA4 編碼序列鹼基3,494至3,701所形成之207bp重疊區。一旦位於相同的宿主細胞核中，兩個轉殖基因經由重疊區對齊及重組。ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；GRK1=人視紫質激酶啟動子；In=內含子；ITR=反向末端重複；pA=polyA信號；WPRE=土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件。
圖51的表格顯示用於雙載體組合測試之轉殖基因詳細資訊。最終列含有最佳化重疊雙載體系統之詳細資訊。ABCA4=ATP結合卡匣轉運子蛋白質家族成員4；bp=鹼基對；CDS=編碼DNA序列；GRK1=人視紫質激酶啟動子；pA=polyA信號；WPRE=土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件。
圖52係例示性質體pAAV.stbIR.3'ABCA4. WPRE.kan之標註序列(SEQ ID NO：40)，包含編碼5'ITR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：41)、編碼3'ABCA4之序列(核苷酸176-3509，SEQ ID NO：42)、編碼WPRE之序列(核苷酸3516-4108，SEQ ID NO：43)、編碼BGH PolyA之序列(核苷酸4115-4278，SEQ ID NO：44)及編碼3'IR之序列(AAV衍生性ITR，核苷酸4422-4542，SEQ ID NO：45)。
圖53係例示性質體pAAV.stbITR.CBA.InEx. 5'ABCA4.kan之標註序列(SEQ ID NO：46)，包含編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：47)、編碼CBA啟動子之序列(核苷酸190-467，SEQ ID NO：48)、編碼內含子之序列(核苷酸468-590，SEQ ID NO：49)、編碼外顯子之序列(核苷酸591-630，SEQ ID NO：50)、編碼5'ABCA4之序列(核苷酸650-4351，SEQ ID NO：51)及編碼3'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸4389-4509，SEQ ID NO：52)。
圖54係例示性質體pAAV.stbITR.CBA.RBG. 5'ABCA4.kan之標註序列(SEQ ID NO：53)，包含編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：54)、編碼CBA啟動子之序列(核苷酸190-467，SEQ ID NO：55)、編碼RGB內含子之序列(核苷酸704-876，SEQ ID NO：56)、編碼5'ABCA4之序列(核苷酸919-4620，SEQ ID NO：57)及編碼3'IR之序列(核苷酸4658-4778，SEQ ID NO：58)。
圖55係例示性質體pAAV.stbITR.CMV. CBA.5'ABCA4.kan之標註序列(SEQ ID NO：59)，包含編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：60)、編碼CMV增強子之序列(核苷酸322-556，SEQ ID NO：61)、編碼CBA啟動子之序列(核苷酸571-849，SEQ ID NO：62)、編碼5'ABCA4之序列(核苷酸856-4557，SEQ ID NO：63)及編碼3'IR之序列(核苷酸4595-4715，SEQ ID NO：64)。
圖56係例示性質體pAAV.stbITR.RK.5' ABCA4.kan之標註序列(SEQ ID NO：65)，包含編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：66)、編碼RK啟動子之序列(核苷酸186-384，SEQ ID NO：67)、編碼5'ABCA4之序列(核苷酸576-4267，SEQ ID NO：68)及編碼3'IR之序列(核苷酸4275-4425，SEQ ID NO：69)。
圖57的示意圖描繪例示性AOSLO系統，用於直接觀測個體的視網膜細胞，包括內節、外節或彼等之組合的感光受體細胞。 序列說明
SEQ ID NO：1 人ABCA4核酸序列。SEQ ID NO：1對應NCBI參考序列NM_000350.2。
SEQ ID NO：2 人ABCA4核酸序列變體。SEQ ID NO：2係與SEQ ID NO：1相同，例外為下列突變：核苷酸1640 G＞T、核苷酸5279 G＞A、核苷酸 6173 T＞C。
SEQ ID NO：3 上游載體序列實例，包含5'ITR、啟動子、CDS、3'ITR。
SEQ ID NO：4 下游載體序列實例，包含5'ITR、CDS、轉錄後反應元件、聚腺苷酸化序列、3'ITR。
SEQ ID NO：5 GRK1啟動子序列。
SEQ ID NO：6 UTR序列。
SEQ ID NO：7 土撥鼠肝炎病毒轉錄後反應元件(WPRE)。
SEQ ID NO：8 牛生長激素聚腺苷酸化序列。
SEQ ID NO：9 部分上游載體序列實例，包含啟動子、CDS。
SEQ ID NO：10 部分下游載體序列實例，包含CDS、轉錄後反應元件、聚腺苷酸化序列。
SEQ ID NO：11 人ABCA4 cDNA序列。此序列對應NM_000350.2(SEQ ID NO：1)之核苷酸105-6926。
SEQ ID NO：12 AAV8殼體蛋白質序列。此序列對應GenBank記錄AF513852.1之AAV8殼體蛋白質序列。
SEQ ID NO：13 內含子。
SEQ ID NO：14 外顯子。
SEQ ID NO：15 CMV增強子。
SEQ ID NO：16 CBA啟動子。
SEQ ID NO：17 CMVCBA.In.GFP.poly(A)載體序列。
SEQ ID NO：18 CMVCBA.GFP.poly(A)載體序列。
SEQ ID NO：19 CBA.IntEx.GFP.poly(A)載體序列。
SEQ ID NO：20 CAG.GFP.poly(A)載體序列。
SEQ ID NO：21 AAV.5'CMVCBA.In.ABCA4. WPRE.kan載體序列。
SEQ ID NO：22 AAV.5'CMVCBA.ABCA4. WPRE.kan載體序列。
SEQ ID NO：23 AAV.5'CBA.IntEx. ABCA4.WPRE.kan載體序列。
SEQ ID NO：24 CBA啟動子。
SEQ ID NO：25 牛生長激素聚腺苷酸化序列。
SEQ ID NO：26 pAAV.RK.5'ABCA4.kan之ITR至ITR部分，包含編碼5'ITR之序列(SEQ ID NO：27)、編碼RK啟動子之序列(SEQ ID NO：28)、編碼兔β-球蛋白(RBG)內含子/外顯子(Int/Ex)之序列(SEQ ID NO：39)、編碼ABCA4基因之編碼序列的5'部分之序列(SEQ ID NO：29)及編碼3'ITR之序列(SEQ ID NO：30)。
SEQ ID NO：27 編碼例示性5'ITR之序列
SEQ ID NO：28 編碼RK啟動子之序列
SEQ ID NO：29 編碼ABCA4基因之編碼序列的5'部分之序列
SEQ ID NO：30 pAAV.3'ABCA4.WPRE. kan之ITR至ITR部分，包含編碼5'ITR之序列(SEQ ID NO：27)、編碼ABCA4基因之編碼序列的3'部分之序列(SEQ ID NO：31)、編碼WPRE之序列(SEQ ID NO：32)、編碼bGH polyA之序列(SEQ Id NO：38)及編碼3'ITR之序列(SEQ ID NO：33)。
SEQ ID NO：31 編碼ABCA4基因之編碼序列的3'部分之序列
SEQ ID NO：32 編碼WPRE之序列
SEQ ID NO：33 編碼例示性3'ITR之序列
SEQ ID NO：34 編碼例示性5'ITR之序列
SEQ ID NO：35 編碼例示性3'ITR之序列
SEQ ID NO：36 編碼例示性5'ITR之序列
SEQ ID NO：37 編碼例示性3'ITR之序列
SEQ ID NO：38 編碼bGH polyA之序列
SEQ ID NO：39 編碼兔β-球蛋白(RBG)內含子/外顯子(Int/Ex)之序列
SEQ ID NO：40 pAAV.stbIR.3'ABCA4. WPRE.kan，包含編碼5'ITR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：41)、編碼3'ABCA4之序列(核苷酸176-3509，SEQ ID NO：42)、編碼WPRE之序列(核苷酸3516-4108，SEQ ID NO：43)、編碼BGH PolyA之序列(核苷酸4115-4278，SEQ ID NO：44)及編碼3'IR之序列(AAV衍生性ITR，核苷酸4422-4542，SEQ ID NO：45)。
SEQ ID NO：41 編碼5'ITR之序列(AAV2衍生性ITR，SEQ ID NO：40之核苷酸16- 130)
SEQ ID NO：42 編碼3'ABCA4之序列(SEQ ID NO：40之核苷酸176-3509)
SEQ ID NO：43 編碼WPRE之序列(SEQ ID NO：40之核苷酸3516-4108)
SEQ ID NO：44 編碼BGH PolyA之序列(SEQ ID NO：40之核苷酸4115-4278)
SEQ ID NO：45 編碼3'IR之序列(AAV衍生性ITR，SEQ ID NO：40之核苷酸4422- 4542)
SEQ ID NO：46 pAAV.stbITR.CBA.InEx. 5'ABCA4.kan，包含編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：47)、編碼CBA啟動子之序列(核苷酸190-467，SEQ ID NO：48)、編碼內含子之序列(核苷酸468-590，SEQ ID NO：49)、編碼外顯子之序列(核苷酸591-630，SEQ ID NO：50)、編碼5'ABCA4之序列(核苷酸650-4351，SEQ ID NO：51)及編碼3'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸4389-4509，SEQ ID NO：52)。
SEQ ID NO：47 編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，SEQ ID NO：46之核苷酸16- 130)
SEQ ID NO：48 編碼CBA啟動子之序列(SEQ ID NO：46之核苷酸190-467)
SEQ ID NO：49 編碼內含子之序列(SEQ ID NO：46之核苷酸468-590)
SEQ ID NO：50 編碼外顯子之序列(SEQ ID NO：46之核苷酸591-630)
SEQ ID NO：51 編碼5'ABCA4之序列(SEQ ID NO：46之核苷酸650-4351)
SEQ ID NO：52 編碼3'IR之序列(AAV2衍生性ITR，SEQ ID NO：46之核苷酸4389-4509)
SEQ ID NO：53 pAAV.stbITR.CBA.RBG. 5'ABCA4.kan，包含編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：54)、編碼CBA啟動子之序列(核苷酸190-467，SEQ ID NO：55)、編碼RGB內含子之序列(核苷酸704-876，SEQ ID NO：56)、編碼5'ABCA4之序列(核苷酸919-4620，SEQ ID NO：57)及編碼3'IR之序列(核苷酸4658-4778，SEQ ID NO：58)。
SEQ ID NO：54 編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，SEQ ID NO：53之核苷酸16- 130)
SEQ ID NO：55 編碼CBA啟動子之序列(SEQ ID NO：53之核苷酸190-467)
SEQ ID NO：56 編碼RGB內含子之序列(SEQ ID NO：53之核苷酸704-876)
SEQ ID NO：57 編碼5'ABCA4之序列(SEQ ID NO：53之核苷酸919-4620)
SEQ ID NO：58 編碼3'IR之序列(SEQ ID NO：53之核苷酸4658-4778)
SEQ ID NO：59 pAAV.stbITR.CMV.CBA. 5'ABCA4.kan，包含編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：60)、編碼CMV增強子之序列(核苷酸322-556，SEQ ID NO：61)、編碼CBA啟動子之序列(核苷酸571-849，SEQ ID NO：62)、編碼5'ABCA4之序列(核苷酸856-4557，SEQ ID NO：63)及編碼3'IR之序列(核苷酸4595-4715，SEQ ID NO：64)。
SEQ ID NO：60 編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，SEQ ID NO：59之核苷酸16- 130)
SEQ ID NO：61 編碼CMV增強子之序列(SEQ ID NO：59之核苷酸322-556)
SEQ ID NO：62 編碼CBA啟動子之序列(SEQ ID NO：59之核苷酸571-849)
SEQ ID NO：63 編碼5'ABCA4之序列(SEQ ID NO：59之核苷酸856-4557)
SEQ ID NO：64 編碼3'IR之序列(SEQ ID NO：59之核苷酸4595-4715)
SEQ ID NO：65 pAAV.stbITR.RK.5'ABCA4. kan，包含編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：66)、編碼RK啟動子之序列(核苷酸186-384，SEQ ID NO：67)、編碼5'ABCA4之序列(核苷酸576-4267，SEQ ID NO：68)及編碼3'IR之序列(核苷酸4275-4425，SEQ ID NO：69)。
SEQ ID NO：66 編碼5'IR之序列(AAV2衍生性ITR，SEQ ID NO：65之核苷酸16-130)
SEQ ID NO：67 編碼RK啟動子之序列(SEQ ID NO：65之核苷酸186-384)
SEQ ID NO：68 編碼5'ABCA4之序列(SEQ ID NO：65之核苷酸576-4267)
SEQ ID NO：69 編碼3'IR之序列(SEQ ID NO：65之核苷酸4275-4425)
SEQ ID NO：70 編碼ABCA4蛋白質之胺基酸序列(如Genbank寄存編號NP_000341.2所示)
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Claims (51)

  1. 一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之腺相關病毒(AAV)載體系統，該AAV載體系統包含第一AAV載體及第二AAV載體，該第一AAV載體包含第一核酸序列且該第二AAV載體包含第二核酸序列； 其中該第一核酸序列包含ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分且該第二核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，且該5'端部分及該3'端部分一起涵蓋整個ABCA4 CDS； 其中該第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3597的毗連核苷酸之序列； 其中該第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3806至6926的毗連核苷酸之序列； 其中該第一核酸序列及該第二核酸序列各包含彼此重疊之序列區；且 其中該序列重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約20個毗連核苷酸。
  2. 如請求項1之AAV載體系統，其中該序列重疊區的長度係介於20與550個核苷酸之間。
  3. 如請求項1之AAV載體系統，其中該序列重疊區的長度係介於50與250個核苷酸之間。
  4. 如請求項1之AAV載體系統，其中該序列重疊區的長度係介於175與225個核苷酸之間。
  5. 如請求項1之AAV載體系統，其中該序列重疊區的長度係介於195與215個核苷酸之間。
  6. 如請求項1至5中任一項之AAV載體系統，其中該序列重疊區包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至3805之核酸序列的至少約50個毗連核苷酸。
  7. 如請求項1至5中任一項之AAV載體系統，其中該序列重疊區包含至少約75個毗連核苷酸。
  8. 如請求項1至5中任一項之AAV載體系統，其中該序列重疊區包含至少約100個毗連核苷酸。
  9. 如請求項1至5中任一項之AAV載體系統，其中該序列重疊區包含至少約150個毗連核苷酸。
  10. 如請求項1至5中任一項之AAV載體系統，其中該序列重疊區包含至少約200個毗連核苷酸。
  11. 如請求項1至5中任一項之AAV載體系統，其中該序列重疊區包含208個毗連核苷酸。
  12. 如前述請求項中任一項之AAV載體系統， 其中該第一核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列；且 其中該第二核酸序列包含對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列。
  13. 如前述請求項中任一項之AAV載體系統，其中該第一核酸序列包含可操作地連接ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分的GRK1啟動子。
  14. 如前述請求項中任一項之AAV載體系統，其中該第一核酸序列包含可操作地連接ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分的CBA啟動子。
  15. 如請求項14之AAV載體系統，其中該第一核酸序列進一步包含CMV增強子。
  16. 如請求項14或15之AAV載體系統，其中該第一核酸序列進一步包含內含子及外顯子。
  17. 如請求項14至16中任一項之AAV載體系統，其中該第一核酸序列包含CAG啟動子。
  18. 如前述請求項中任一項之AAV載體系統，其中該第一核酸序列包含位於ABCA4編碼序列(CDS)之5'端部分上游的非轉譯區(UTR)。
  19. 如前述請求項中任一項之AAV載體系統，其中該第二核酸序列包含轉錄後反應元件(PRE)。
  20. 如前述請求項中任一項之AAV載體系統，其中該第二核酸序列包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後反應元件(WPRE)。
  21. 如前述請求項中任一項之AAV載體系統，其中該第二核酸序列包含牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
  22. 如前述請求項中任一項之AAV載體系統，其中該第一AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列；且其中該第二AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列。
  23. 一種在目標細胞中表現人ABCA4蛋白質之方法，該方法包含下列步驟： 使用如請求項1至22中任一項記載之該第一AAV載體及該第二AAV載體轉導該目標細胞以使功能性ABCA4蛋白質在該目標細胞中表現。
  24. 一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之5'端部分，其中該ABCA4 CDS之5'端部分係由對應SEQ ID NO：1之核苷酸105至3805的毗連核苷酸之序列組成。
  25. 如請求項11之AAV載體，其中該AAV載體包含SEQ ID NO：9之核酸序列。
  26. 一種包含核酸序列之AAV載體，該核酸序列包含ABCA4 CDS之3'端部分，其中該ABCA4 CDS之3'端部分係由對應SEQ ID NO：1之核苷酸3598至6926的毗連核苷酸之序列組成。
  27. 如請求項13之AAV載體，其中該AAV載體包含SEQ ID NO：10之核酸序列。
  28. 如請求項1至27中任一項之AAV載體，該第一核酸序列或該第二核酸序列進一步包含編碼5'反向末端重複(ITR)之序列及編碼3'ITR之序列。
  29. 如請求項28之AAV載體，其中該編碼5'ITR之序列包含單離自或衍生自血清型2AAV(AAV2)之野生型序列。
  30. 如請求項28或29之AAV載體，其中該編碼5'ITR之序列包含SEQ ID NO：27之序列或其刪除變體。
  31. 如請求項28至30中任一項之AAV載體，其中該編碼3'ITR之序列包含單離自或衍生自AAV2之野生型序列。
  32. 如請求項31之AAV載體，其中該編碼3'ITR之序列包含SEQ ID NO：30之序列或其刪除變體。
  33. 如請求項30或32之AAV載體，其中該刪除變體包含下列或由下列所組成：10、20、30、40、50、70、80、90、100、110、120、130、140、144個核苷酸或介於之間的任何數量之核苷酸。
  34. 如請求項30、32及33中任一項之AAV載體，其中該刪除變體包含一或多個刪除。
  35. 如請求項34之AAV載體，其中該刪除變體包含至少二個刪除。
  36. 如請求項35之AAV載體，其中該至少二個刪除並不毗連。
  37. 一種核酸，其包含如請求項1至36中任一項記載之第一核酸序列。
  38. 一種核酸，其包含如請求項1至36中任一項記載之第二核酸序列。
  39. 一種核酸，其包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO：9之核酸序列。
  40. 一種核酸，其包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO：10之核酸序列。
  41. 一種套組，其包含如請求項1至36中任一項記載之第一AAV載體及如請求項1至26中任一項記載之第二AAV載體。
  42. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至36中任一項之AAV載體系統及醫藥上可接受之賦形劑。
  43. 一種如請求項1至42中任一項之AAV載體系統，其係用於基因療法。
  44. 一種如請求項42之醫藥組成物，其係用於基因療法。
  45. 一種如請求項1至36中任一項之AAV載體系統，其係用於預防或治療特徵為視網膜細胞降解之疾病。
  46. 一種如請求項1至36中任一項之AAV載體系統，其係用於預防或治療斯特格(Stargardt)氏症。
  47. 一種如請求項42之醫藥組成物，其係用於預防或治療特徵為視網膜細胞降解之疾病。
  48. 一種如請求項42之醫藥組成物，其係用於預防或治療斯特格氏症。
  49. 一種預防或治療特徵為視網膜細胞降解之疾病的方法，其包含向有此需要之個體投予有效量的如請求項1至36中任一項之AAV載體系統。
  50. 一種預防或治療特徵為視網膜細胞降解之疾病的方法，其包含向有此需要之個體投予有效量的如請求項42之醫藥組成物。
  51. 如請求項49或50的方法，其中該疾病係斯特格氏症。
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